JP2002267669A - Method of analyzing gene, and microarray - Google Patents
Method of analyzing gene, and microarrayInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、遺伝子の
特定塩基配列の検出方法とこれに用いるマイクロアレイ
に関するものであり、特にハイブリダイゼーションによ
り塩基配列を特定したい遺伝子群に特別な標識を施すこ
となく簡便に高感度に検出することのできる、新しい遺
伝子解析方法とそのための遺伝子解析マイクロアレイに
関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for detecting a specific nucleotide sequence of a gene and a microarray used for the method. Particularly, the present invention does not apply a special label to a gene group whose nucleotide sequence is to be identified by hybridization. The present invention relates to a novel gene analysis method which can be easily detected with high sensitivity, and a gene analysis microarray for that purpose.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来の遺伝子検出方法、特に特定の塩基
配列をハイブリダイゼーションにより検出する方法とし
ては、当初、放射性同位体元素を、さらには蛍光色素を
ヌクレオチドの標識剤とする方法がとられていた。2. Description of the Related Art Conventionally, as a method for detecting a gene, in particular, a method for detecting a specific base sequence by hybridization, a method using a radioisotope element and a fluorescent dye as a nucleotide labeling agent has been adopted. Was.
【０００３】初期に利用されていた放射性同位体元素を
利用した標識方法は高感度ではあるが、被爆汚染や廃棄
処理等の問題があり、今日ではその利用も少なくなって
きており、その代替として、蛍光色素を利用した標識法
が採用されている。The labeling method using a radioisotope element that was used at the beginning is highly sensitive, but has problems such as exposure to radiation and disposal, and its use has been reduced today. A labeling method using a fluorescent dye has been adopted.
【０００４】例えば、ビオチン標識したデオキシヌクレ
オチドをニックトランスレーション、ランダムプライマ
ー法等の方法によりヌクレオチドにビオチン標識し、ハ
イブリダイズさせたときにアルカリフォスファターゼで
標識したアビジンとヌクレオチドのビオチンが結合し、
アルカリフォスファターゼが発色することから、これに
より特定塩基配列の遺伝子を検出するようにしている
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｃｈ １３
巻 ７４５頁 １９８５年）。For example, a biotin-labeled deoxynucleotide is biotin-labeled to a nucleotide by a method such as nick translation or a random primer method, and when hybridized, avidin labeled with alkaline phosphatase binds to the nucleotide biotin,
Since alkaline phosphatase develops color, a gene having a specific nucleotide sequence is detected thereby (Nucleic Acids Research 13).
745, 1985).
【０００５】このような発色検出には、ビオチン標識の
ほかにフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、
アロフィコシアニン等の蛍光色素を直接ヌクレオチドに
標識する方法もあり、放射性同位体元素に代わり高感度
に遺伝子を検出可能としている。For such color detection, fluorescein, rhodamine, Texas Red,
There is also a method of directly labeling a nucleotide with a fluorescent dye such as allophycocyanin, which makes it possible to detect a gene with high sensitivity instead of a radioisotope element.
【０００６】また、ヌクレオチドニックトランスレーシ
ョン法等で標識するのではなく、ヌクレオチドの５‘−
あるいは３’−末端に蛍光色素等を共有結合させる方法
も提案されている( 例えば、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
１８３巻 ２３１頁 １９８９年) 。[0006] In addition, instead of labeling by nucleotide nick translation method or the like, the nucleotide 5'-
Alternatively, a method of covalently binding a fluorescent dye or the like to the 3′-terminal has also been proposed (for example, Anal. Biochem).
183, 231 (1989)).
【０００７】以上の方法を応用して近年、チップ上に細
かくヌクレオチドを配列させたＤＮＡマイクロアレイが
開発され、アフィメトリックス社のＧｅｎｅ Ｃｈｉｐ
に代表される高処理能力を有する遺伝子解析装置が市販
されている。In recent years, a DNA microarray in which nucleotides are finely arranged on a chip has been developed by applying the above method, and Gene Chip of Affymetrix has been developed.
Gene analyzers having a high throughput, such as those described in US Pat.
【０００８】しかしながら、上記の蛍光色素を利用する
方法では、測定者がプローブとしようとするオリゴヌク
レオチドを何らかの方法で標識しなくてはならない。こ
れは、生体から抽出した微量の貴重な試料においても同
様であり、測定者の専門性が要求される。また、ヌクレ
オチドの標識、ハイブリダイゼーション、未反応の標識
ヌクレオチドの洗浄と一連の操作が極めて繁雑であり、
だれでも簡便に扱える仕様ではなかった。さらに検体試
料自身に蛍光色素を標識しているため、未反応試料が洗
浄不十分によるバックグラウンドノイズの原因になるこ
と及び蛍光の消光による測定誤差等の問題があった。However, in the above-described method using a fluorescent dye, the measurer must label the oligonucleotide to be used as a probe by some method. This is the same for a trace amount of a valuable sample extracted from a living body, and requires the measurer's specialty. Also, labeling of nucleotides, hybridization, washing of unreacted labeled nucleotides and a series of operations are extremely complicated,
It was not a specification that anyone could handle easily. In addition, since the sample sample itself is labeled with a fluorescent dye, the unreacted sample causes background noise due to insufficient washing, and there are problems such as measurement errors due to quenching of fluorescence.
【０００９】そこで、これらの色素標識による問題を解
決するため、色素標識をしない貴金属微粒子を標識とし
た測定方法が提案されている。Therefore, in order to solve these problems caused by dye labeling, a measuring method using noble metal fine particles without dye labeling has been proposed.
【００１０】一つは、貴金属基板上にポリマー粒子を担
持し、そのポリマー粒子の上部を貴金属蒸着させ、その
上にヌクレオチドを固定化し、ハイブリダイゼーション
の検出を表面プラズモン共鳴により測定する方法である
( 例えば、特開平１０−８３３９３９、特開２０００−
０５５９２０) 。この方法は、貴金属基板に貴金属コロ
イド粒子を担持したときに表面プラズモン共鳴変化が増
強する現象( 例えば、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ
Ｂ ２７巻 ７７６５頁 １９８３年、Ｓｏｌｉｄ
Ｓｔａｔｅ Ｃｏｍｍｕｎ． ９３巻 １７１頁 １９
９５年、Ｊ．Ｐｈｙ．Ｃｈｅｍ．Ｂ １０３巻 ５８２
６頁 １９９９年) を応用し、貴金属コロイドの代わり
にポリマー粒子を担持した後、ポリマーを貴金属蒸着し
たものである。もう一つは、貴金属微粒子存在下でのハ
イブリダイゼーションによる二本鎖形成で生じる貴金属
粒子との重合反応を分光学的変化により測定しようとす
るものである（例えば、特開平０７−２２７２９９）。One is a method in which polymer particles are supported on a noble metal substrate, the upper portion of the polymer particles is deposited with a noble metal, nucleotides are immobilized thereon, and the detection of hybridization is measured by surface plasmon resonance.
(For example, JP-A-10-83939, JP-A-2000-
055920). This method is based on the phenomenon that surface plasmon resonance change is enhanced when noble metal colloid particles are supported on a noble metal substrate (for example, Physical Review).
B 27, 7765, 1983, Solid
State Commun. Vol. 93, pp. 171 19
1995, J.M. Phys. Chem. B 103 vol. 582
No. 6, 1999), polymer particles are carried in place of the noble metal colloid, and then the polymer is deposited with a noble metal. The other is to measure a polymerization reaction with noble metal particles generated by duplex formation by hybridization in the presence of noble metal fine particles by a spectroscopic change (for example, JP-A-07-227299).
【００１１】[0011]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、以上の
とおりの改善された方法においても依然として解決すべ
き課題があった。However, there are still problems to be solved in the above-described improved method.
【００１２】それと言うのも、まず、前者のハイブリダ
イゼーションの検出を表面プラズモン共鳴により測定す
る方法の場合には、貴金属基板上にポリマー微粒子を整
列させ、さらに貴金属蒸着させなければならず、工法的
に非常に手間がかかる。また表面プラズモン共鳴を測定
するには担持したポリマー微粒子を加えた貴金属基板の
厚さが高精度に均一でなくてはならないが、ポリマー微
粒子の径を高精度に均一にすることは、極めて困難であ
るため測定精度に問題がある。This is because, first, in the former method of detecting hybridization by surface plasmon resonance, it is necessary to align polymer fine particles on a noble metal substrate and further deposit a noble metal. Is very time-consuming. In order to measure surface plasmon resonance, the thickness of the noble metal substrate to which the supported polymer particles are added must be uniform with high precision, but it is extremely difficult to make the diameter of the polymer particles uniform with high precision. Therefore, there is a problem in the measurement accuracy.
【００１３】一方、後者の貴金属微粒子存在下、ヌクレ
オチドの二本鎖形成で生じる貴金属粒子との重合反応を
分光学的変化により測定しようとする方法では貴金属微
粒子の重合は一本鎖ヌクレオチドにおいても生じるた
め、超遠心分離、ゲルろ過あるいは高速液体クロマトグ
ラフィー等の一本鎖ヌクレオチドの分離操作を施さなく
てはならないので、簡便性に欠けるという問題がある。On the other hand, in the latter method in which the polymerization reaction of the noble metal particles with the noble metal particles formed by the formation of the double strand of nucleotides is measured by spectroscopic change in the presence of the noble metal fine particles, the polymerization of the noble metal fine particles also occurs in single-stranded nucleotides Therefore, a single-stranded nucleotide separation operation such as ultracentrifugation, gel filtration, or high-performance liquid chromatography must be performed, resulting in a problem of lack of simplicity.
【００１４】この出願の発明は、以上のとおりの従来の
技術の問題点を解消し、表面プラズモン共鳴の測定法の
特徴を生かし、塩基配列を特定したい遺伝子群に特別な
標識過程を施すことなく、簡便に、しかも高感度に検出
することのできる、新しい遺伝子解析方法と、これに用
いることのできる遺伝子解析マイクロアレイを提供する
ことを課題としている。The invention of this application solves the above-mentioned problems of the prior art and makes use of the features of the method of measuring surface plasmon resonance, without applying a special labeling process to a group of genes whose base sequence is to be specified. Another object of the present invention is to provide a new gene analysis method which can be detected simply and with high sensitivity, and a gene analysis microarray which can be used for the method.
【００１５】[0015]
【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記
の課題を解決するものとして、第１には、基板に固定し
た特定塩基配列を持つ一本鎖ヌクレオチドと検体の一本
鎖ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを表面プラ
ズモン共鳴の変化により測定することを特徴とする遺伝
子解析方法を提供する。Means for Solving the Problems According to the invention of the present application, first, as a solution to the above problems, firstly, a single-stranded nucleotide having a specific base sequence immobilized on a substrate and a single-stranded nucleotide of a sample are prepared. A method for analyzing a gene, characterized in that hybridization of is measured by a change in surface plasmon resonance.
【００１６】そして、この出願の発明は、上記方法につ
いて、第２には、特定塩基配列を持つ一本鎖ヌクレオチ
ドを予め貴金属コロイドで標識することを特徴とする遺
伝子解析方法を提供し、第３には、基板を貴金属基板も
しくは貴金属薄膜基板とすることを特徴とする遺伝子解
析方法を、第４には、気相中もしくは液相中においてハ
イブリダイゼーションさせることを特徴とする遺伝子解
析方法を提供する。The invention of this application provides a second method of the above-mentioned method, wherein a single-stranded nucleotide having a specific base sequence is labeled in advance with a noble metal colloid. A gene analysis method characterized in that the substrate is a noble metal substrate or a noble metal thin film substrate; and fourthly, a gene analysis method characterized in that hybridization is performed in a gas phase or a liquid phase. .
【００１７】また、この出願の発明は、第５には、遺伝
子解析のためのマイクロアレイであって、基板上に特定
塩基配列を持つ一本鎖ヌクレオチドが固定されており、
検体の一本鎖ヌクレオチドとのハイブリダイゼーション
を表面のプラズモン共鳴の変化により測定することを特
徴とする遺伝子解析マイクロアレイを提供し、第６に
は、上記のマイクロアレイであって、基板上に固定され
ている特定塩基配列を持つ一本鎖ヌクレオチドは、予め
貴金属コロイドで標識されていることを特徴とする遺伝
子解析マイクロアレイを、第７には、基板は、貴金属基
板もしくは貴金属薄膜基板であることを特徴とする遺伝
子解析マイクロアレを提供する。Fifth, the invention of this application is directed to a microarray for gene analysis, in which a single-stranded nucleotide having a specific base sequence is fixed on a substrate,
Provided is a gene analysis microarray characterized in that hybridization with a single-stranded nucleotide of a sample is measured by a change in plasmon resonance on the surface, and sixthly, the microarray described above, which is immobilized on a substrate. A single-stranded nucleotide having a specific base sequence is preliminarily labeled with a noble metal colloid, and a seventh embodiment is characterized in that the substrate is a noble metal substrate or a noble metal thin film substrate. To provide a genetic analysis microarray.
【００１８】以上のとおりのこの出願の発明の遺伝子解
析方法は、前処理過程が非常に繁雑な色素標識検出法で
はなく、ヌクレオチド、もしくは貴金属微粒子で標識し
たヌクレオチドを予め基板上に固定化しておき、生体か
ら抽出したヌクレオチドに何も処理を施さずに特定塩基
配列を表面プラズモン共鳴により検出することを特徴と
したものである。The gene analysis method of the present invention as described above is not a dye labeling detection method in which the pretreatment process is very complicated. Instead, nucleotides or nucleotides labeled with noble metal fine particles are immobilized on a substrate in advance. The present invention is characterized in that a specific base sequence is detected by surface plasmon resonance without performing any treatment on nucleotides extracted from a living body.
【００１９】この出願の発明によれば、検体となる一本
鎖ヌクレオチドの標識や過度な洗浄、あるいは、分離操
作による未反応の一本鎖ヌクレオチドの除去等の従来法
のような繁雑な処理をすることがなく、操作は簡便であ
り、精度よく特定塩基配列をもつ遺伝子を解析すること
ができる。According to the invention of the present application, a complicated process such as a conventional method such as labeling of a single-stranded nucleotide serving as a sample, excessive washing, or removal of an unreacted single-stranded nucleotide by a separation operation is performed. The operation is simple, and a gene having a specific base sequence can be accurately analyzed.
【００２０】[0020]
【発明の実施の形態】この出願の発明は上記のとおりの
特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態につい
て説明する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The invention of this application has the features as described above, and embodiments thereof will be described below.
【００２１】この出願の第１の発明における遺伝子解析
方法は、特定塩基配列を持つ一本鎖ヌクレオチドと検体
の一本鎖ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを表
面プラズモン共鳴の変化により測定することを特徴とす
るものであり、特定塩基配列を持つ一本鎖のヌクレオチ
ドとそれと相補的な一本鎖ヌクレオチドが２本鎖を形成
することが表面プラズモン共鳴の共鳴角の変化に影響を
及ぼすことで特定塩基配列の検出を実現しうるものであ
る。The gene analysis method according to the first invention of the present application is characterized in that hybridization between a single-stranded nucleotide having a specific base sequence and a single-stranded nucleotide of a sample is measured by a change in surface plasmon resonance. The formation of a double-stranded single-stranded nucleotide having a specific base sequence and a single-stranded nucleotide complementary thereto affects the change in the resonance angle of surface plasmon resonance, thereby causing a change in the specific base sequence. Detection can be realized.
【００２２】すなわち、たとえば図１に例示したよう
に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の測定は、通常、入
射角度ｑと反射光強度の変化として観測されるが、この
ような変化は、図２に例示したように、たとえば金属膜
基板に固定した特定塩基配列を持つ一本鎖のヌクレオチ
ド（プローブＤＮＡ）が、これと相補的な、検体の一本
鎖ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションで二本鎖を
形成する際のＤＮＡ単分子膜の構造、物性の変化にとも
なって観察されることになる。That is, as shown in FIG. 1, for example, the measurement of surface plasmon resonance (SPR) is usually observed as a change in the incident angle q and the intensity of the reflected light. As exemplified, for example, a single-stranded nucleotide (probe DNA) having a specific base sequence immobilized on a metal film substrate forms a double strand by hybridization with a single-stranded nucleotide complementary to the single-stranded nucleotide. This is observed along with the change in the structure and physical properties of the DNA monolayer during the process.
【００２３】反射光強度が最小となるＳＰＲの角度のシ
フトには、膜厚や表面密度の変化および吸着量の増大等
が反映される。The shift in the SPR angle at which the reflected light intensity is minimized reflects changes in film thickness and surface density, an increase in the amount of adsorption, and the like.
【００２４】このような変化、特にＳＰＲの角度のシフ
トは、この出願の第２の発明のように、特定塩基配列を
持つ一本鎖ヌクレオチドが予め貴金属コロイドで標識し
てあることで、図３のように増強され、感度が向上され
ることになる。Such a change, particularly a shift in the angle of SPR, is caused by the fact that a single-stranded nucleotide having a specific base sequence is previously labeled with a noble metal colloid as in the second invention of this application. And the sensitivity is improved.
【００２５】たとえば図３のように、金コロイドの凝集
状態や金コロイド−金薄膜表面間の距離変化も反映さ
れ、一定入射角度での反射強度の変化はより大きく増幅
されることになる。これによって、表面プラズモン共鳴
（ＳＰＲ）による検出精度の向上を実現することができ
る。For example, as shown in FIG. 3, the state of aggregation of the gold colloid and the change in the distance between the gold colloid and the surface of the gold thin film are also reflected, and the change in the reflection intensity at a constant incident angle is greatly amplified. Thereby, it is possible to improve the detection accuracy by surface plasmon resonance (SPR).
【００２６】上記いずれの場合にも、検体の一本鎖ヌク
レオチドは一切標識する必要がない。もちろん特別な目
的のために標識されていてもよいが、この出願の発明に
おいては必須ではない。In any of the above cases, it is not necessary to label the single-stranded nucleotide of the specimen at all. Of course, it may be labeled for a special purpose, but is not essential in the invention of this application.
【００２７】また、この出願の発明における基板に固定
された一本鎖ヌクレオチドは、貴金属コロイド以外のも
のによって、ＳＰＲ変化を増強するようにしてもよい。
ただ、貴金属コロイドは、この増強効果が極めて顕著な
ものとしてこの出願の発明により推奨される。貴金属コ
ロイドの代表的なものとしては金コロイドが例示される
ことになる。もちろん、これ以外の銀等の貴金属のコロ
イドであってもよい。The single-stranded nucleotide immobilized on the substrate in the invention of this application may be made of a material other than a noble metal colloid to enhance the SPR change.
However, noble metal colloids are recommended by the invention of this application because this enhancing effect is extremely remarkable. A typical example of the noble metal colloid is a gold colloid. Of course, other colloids of noble metals such as silver may be used.
【００２８】このような、貴金属コロイド（粒子）は、
通常は、その粒径として５〜２００ｍｍ程度の範囲のも
のが考慮されている。なかでも、１０〜５０ｍｍの粒径
が好適である。Such noble metal colloids (particles)
Usually, a particle size of about 5 to 200 mm is considered. Among them, a particle size of 10 to 50 mm is preferable.
【００２９】また、プローブＤＮＡとしての、特定の塩
基配列を持つ一本鎖ヌクレオチドが固定される基板につ
いては、ＳＰＲの変化を的確に観測できるものであれ
ば、金や銀等の貴金属、アルミニウム等の各種のもので
あってよいが、なかでも、この出願の第３の発明のよう
に、貴金属の基板、もしくは貴金属の薄膜基板であるこ
とが望ましい。特に、貴金属としては金が例示される。For a substrate on which a single-stranded nucleotide having a specific base sequence as a probe DNA is immobilized, a noble metal such as gold or silver, aluminum, or the like may be used as long as a change in SPR can be accurately observed. Of these, the substrate is preferably a noble metal substrate or a noble metal thin film substrate, as in the third invention of this application. In particular, gold is exemplified as the noble metal.
【００３０】特定塩基配列を持つ一本鎖ヌクレオチドと
検体の一本鎖ヌクレオチドとのハイブリダイゼーション
による二本鎖の形成にともなう二重らせん構造をとるヌ
クレオチドの構造変化は、予め標識してある貴金属コロ
イドと貴金属基板もしくは貴金属薄膜基板との相互作用
を誘起することになる。この相互作用が表面プラズモン
共鳴の変化に反映し、未反応の一本鎖ヌクレオチドの検
体とハイブリダイズした二本鎖ヌクレオチドの検出の向
上が実現されることになる。The change in the structure of a double-stranded nucleotide resulting from the formation of a double strand due to the hybridization between a single-stranded nucleotide having a specific nucleotide sequence and a single-stranded nucleotide of a sample is determined by a pre-labeled precious metal colloid. Interaction with the noble metal substrate or the noble metal thin film substrate. This interaction is reflected in the change in surface plasmon resonance, and improved detection of a double-stranded nucleotide hybridized with an unreacted single-stranded nucleotide sample is realized.
【００３１】以上のような基板、特に貴金属基板や貴金
属薄膜基板については、その表面が平滑であることが望
ましい。表面平滑な基板とすることで、特定塩基配列を
持つ貴金属コロイドで標識した一本鎖ヌクレオチドを基
板表面上に容易に整列させることができ、ヌクレオチド
の二本鎖形成による二重らせん構造変化による表面プラ
ズモン共鳴の変化の再現性の向上を図ることができる。It is desirable that the surface of the above-mentioned substrate, particularly a noble metal substrate or a noble metal thin film substrate, is smooth. By using a substrate with a smooth surface, single-stranded nucleotides labeled with a noble metal colloid having a specific base sequence can be easily aligned on the substrate surface, and the surface is changed by a double helical structure change due to the formation of double-stranded nucleotides. The reproducibility of the change of the plasmon resonance can be improved.
【００３２】そして、この出願の発明は、以上のとおり
の遺伝子解析法を実現するためのマイクロアレイをも提
供する。このマイクロアレイは、前記のとおりの特定の
塩基配列を持つ一本鎖ヌクレオチドであって、貴金属コ
ロイド等で標識化したもの、もしくは標識化していない
ものを上記のとおりの基板に固定したものであることを
特徴としている。The invention of this application also provides a microarray for realizing the above-described gene analysis method. This microarray is a single-stranded nucleotide having the specific base sequence as described above, which is labeled with a noble metal colloid or the like, or is not labeled and is fixed to the substrate as described above. It is characterized by.
【００３３】このようなマイクロアレイについては、こ
れまで公知の方法をはじめとして各種の手段を採用する
ことで形成することができる。Such a microarray can be formed by employing various means including a known method.
【００３４】たとえば、貴金属としての金の薄膜基板に
特定塩基配列を持つ一本鎖ヌクレオチドを固定する場合
について例示的に説明すると、まず、透明性の支持基板
としての石英やガラス、あるいは樹脂等の表面に、気相
蒸着、たとえばスパッタリング、イオンプレーティン
グ、ＣＶＤ等の手段によって金薄膜を形成することがで
きる。この場合、支持基板と金薄膜との密着性を向上さ
せるために、たとえばガラスや石英の表面の場合にはＣ
ｒ（クロム）薄膜層を下地層として介在させておくこと
や、シラン化合物によって表面修飾しておくこと等が適
宜に考慮されてよい。For example, a case where a single-stranded nucleotide having a specific base sequence is immobilized on a gold thin film substrate as a noble metal will be described as an example. First, quartz, glass, resin, or the like as a transparent support substrate is used. A gold thin film can be formed on the surface by means of vapor deposition, for example, sputtering, ion plating, CVD or the like. In this case, in order to improve the adhesion between the support substrate and the gold thin film, for example, in the case of a glass or quartz surface, C
It may be appropriately considered that an r (chromium) thin film layer is interposed as an underlayer, or that the surface is modified with a silane compound.
【００３５】金薄膜への一本鎖ヌクレオチドの固定は、
ヌクレオチドを構成する官能基としてのチオール基との
結合によって形成することができる。Immobilization of single-stranded nucleotides on a gold thin film
It can be formed by bonding with a thiol group as a functional group constituting a nucleotide.
【００３６】たとえば以上のようにして、各種の基板へ
のＤＮＡプローブとしての一本鎖ヌクレオチドの固定が
可能とされる。また、金コロイド等による貴金属コロイ
ド標識も公知の方法等により行うことができる。For example, as described above, single-stranded nucleotides as DNA probes can be immobilized on various substrates. Also, noble metal colloid labeling with gold colloid or the like can be performed by a known method or the like.
【００３７】作成された遺伝子解析マイクロアレイにつ
いては、検体となる一本鎖ヌクレオチドとのハイブリダ
イゼーションさせるが、このハイブリダイゼーション
は、検体の一本鎖ヌクレオチドの緩衝液等との溶液をマ
イクロアレイ上に滴下することにより実施することがで
きる。The prepared gene analysis microarray is hybridized with a single-stranded nucleotide as a sample. In this hybridization, a solution of the sample with a single-stranded nucleotide buffer or the like is dropped on the microarray. Can be carried out.
【００３８】ハイブリダイゼーションにともなって表面
プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化が測定されるが、この
際には、たとえば図４の構成の測定装置が使用される。The change in surface plasmon resonance (SPR) is measured with the hybridization. In this case, for example, a measuring device having the structure shown in FIG. 4 is used.
【００３９】たとえば金属膜基板のマイクロアレイの場
合には、光源として波長６３２．８ｎｍのＨｅ−Ｎｅレ
ーザーを用い、光チョッパーに透過させ、次に偏光子、
λ／２板に透過させることで、レーザー光をｐ−偏光と
し、三角プリズムや半円筒プリズム等のプリズムを介し
て、支持基板の裏側から照射する。なおプリズムと支持
基板は、両者と同等の屈折率を有する屈折率整合剤によ
り密着させる。反射光は光電子倍増管、ロックインアン
プを用いて検出する。光源の入射角はプリズムを稼動さ
せることにより変化させる。For example, in the case of a microarray of a metal film substrate, a He-Ne laser having a wavelength of 632.8 nm is used as a light source and transmitted through an optical chopper.
The laser beam is converted into p-polarized light by passing through a λ / 2 plate, and is irradiated from the back side of the support substrate through a prism such as a triangular prism or a semi-cylindrical prism. The prism and the support substrate are brought into close contact with each other with a refractive index matching agent having the same refractive index as the both. The reflected light is detected using a photomultiplier tube and a lock-in amplifier. The incident angle of the light source is changed by operating the prism.
【００４０】もちろん、上記のＨｅ−Ｎｅレーザーに限
定されることはない。また、表面プラズモン共鳴（ＳＰ
Ｒ）の測定では、白色光を用いることもできる。この白
色光による測定では、単色光の光強度に代わって、色の
変化を観察することが可能となる。Of course, the present invention is not limited to the above He-Ne laser. Surface plasmon resonance (SP
In the measurement of R), white light can be used. In the measurement using white light, it is possible to observe a change in color instead of the light intensity of monochromatic light.
【００４１】そこで以下に実施例を示し、さらに詳しく
この出願の発明について説明する。もちろん以下の例に
よって発明が限定されることはない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. Of course, the invention is not limited by the following examples.
【００４２】[0042]
【実施例】１）特定塩基配列を持つ一本鎖ヌクレオチド 一本鎖ヌクレオチドは、特開昭５９−１４８７９８ある
いはＣｈｏｌｌｅｔＡ．らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３巻 １５２９頁１９８５年）
に従い、５′末端側からＣＡＧＡＣＧＴＴＧＴＴＧＴＡ
ＡＡＡＣＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＡＴの塩基配
列を持ち（Ａはアデニン、Ｔはシトシン、Ｇはグアニ
ン、Ｃはチミンをそれぞれ示す）、５′末端の水酸基に
リン酸基を付加し、１−アミノ−５−ヒドロキシヘキシ
ルの６位の炭素と結合させることで５′末端にビオチン
を結合し、さらに３′末端には末端のリン酸基に３―メ
ルカプトプロピルの３位の炭素と結合させたものを化学
合成した。EXAMPLES 1) Single-stranded nucleotides having a specific base sequence Single-stranded nucleotides are described in JP-A-59-148798 or Cholet A. (Nucleic A
cids Res. 13, 1329 (1985)
From the 5 'end according to the following formula: CAGACGTTGTTGTGTA
It has the nucleotide sequence of AAACGACGACGGGCCAGATCAT (A is adenine, T is cytosine, G is guanine, and C is thymine, respectively). A phosphate group is added to the hydroxyl group at the 5 'end, and 6-amino-1-hydroxyhexyl Biotin was bonded to the 5'-terminal by bonding to the carbon at the 3rd position, and further, a compound in which the terminal phosphate group was bonded to the 3-position carbon of 3-mercaptopropyl at the 3'-terminal was chemically synthesized.
【００４３】２）金薄膜基板 まず、よく洗浄した合成石英基板を１０％アミノプロピ
ルトリエトキシシランに３０分浸漬した後、スパッタ装
置により金薄膜を蒸着し、３００度に加熱して、表面を
平滑にした膜厚５０ｎｍの金薄膜基板を得た。この金属
膜の厚さは、ＳＰＲ測定に有効な（共鳴角で反射率が０
になる）厚みとして、入射光の波長に依存する。一般的
には、１０〜１００ｎｍ程度の厚さとして考慮すること
ができる。2) Gold Thin Film Substrate First, a well-washed synthetic quartz substrate was immersed in 10% aminopropyltriethoxysilane for 30 minutes, and then a gold thin film was deposited by a sputtering apparatus and heated to 300 ° C. to smooth the surface. A 50 nm thick gold thin film substrate was obtained. The thickness of this metal film is effective for SPR measurement (the reflectance is 0 at the resonance angle).
The thickness depends on the wavelength of the incident light. Generally, it can be considered as a thickness of about 10 to 100 nm.
【００４４】３）特定塩基配列の一本鎖ヌクレオチドの
固定と金コロイド標識 以上のようにして作成した金薄膜基板を濃硫酸に浸漬し
て洗浄した後、前記のとおりの合成した一本鎖ヌクレオ
チドを滴下し、一晩放置後貴金属とチオール基とが自発
的に結合する性質を利用し、金薄膜に一本鎖ヌクレオチ
ドを固定化した。3) Immobilization of Single-Stranded Nucleotide of Specific Base Sequence and Labeling with Colloidal Gold The gold thin-film substrate prepared as described above is immersed in concentrated sulfuric acid, washed, and then synthesized as described above. Was dropped, and after standing overnight, a single-stranded nucleotide was immobilized on a gold thin film using the property of spontaneous bonding between a noble metal and a thiol group.
【００４５】次に１０ミリモル（以下、ｍＭと略す）塩
化ナトリウム、５ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメ
タン（以下、Ｔｒｉｓと略す）−塩酸、（ピーエッチ
（以下、ｐＨと略す）７．４）の溶液に懸濁させたスト
レプトアビジンで標識した直径１０ナノメートルの金コ
ロイド（シグマ社製）を適下し、２時間放置すること
で、ストレプトアビジンとビオチンの親和性を利用して
金基板に固定化した一本鎖ヌクレオチドを金コロイド標
識した。Next, suspended in a solution of 10 mmol (hereinafter abbreviated as “mM”) sodium chloride, 5 mM trishydroxymethylaminomethane (hereinafter abbreviated as “Tris”)-hydrochloric acid (PET (hereinafter abbreviated as “pH”) 7.4). A 10-nm-diameter gold colloid (manufactured by Sigma) labeled with turbid streptavidin was dropped and allowed to stand for 2 hours to immobilize it on a gold substrate using the affinity between streptavidin and biotin. Single-stranded nucleotides were labeled with colloidal gold.
【００４６】４）ハイブリダイゼーション 上記の通りに作成した金薄膜基板に固定した金コロイド
標識の一本鎖ヌクレオチドと、検体となる一本鎖ヌクレ
オチドとのハイブリダイゼーションは、１Ｍ塩化ナトリ
ウム、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ
７．４）の溶液溶解した検体の一本鎖ヌクレオチドを滴
下し、一晩放置することで行った。放置後、１０ｍＭ塩
化ナトリウム、５ｍＭＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．４）に
て検体を洗浄除去した後、基板表面に窒素ガスを軽く吹
き付け乾燥させたのち、図２の表面プラズモン共鳴測定
装置の三角プリズム上に設置した。4) Hybridization Hybridization of a single-stranded nucleotide labeled as a colloidal gold immobilized on a gold thin-film substrate prepared as described above with a single-stranded nucleotide as a sample was performed using 1 M sodium chloride, 1 mM EDTA, and 10 mM Tris- Hydrochloric acid (pH
The solution was prepared by dropping a single-stranded nucleotide dissolved in the solution of 7.4) and leaving it to stand overnight. After standing, the sample was washed and removed with 10 mM sodium chloride and 5 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.4), and then the substrate surface was lightly blown with nitrogen gas and dried, and then placed on a triangular prism of the surface plasmon resonance measurement apparatus shown in FIG. installed.
【００４７】５）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の測定 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、前記の図４の装置を
用いて行った。そして、この実施例では、三角プリズム
と支持基板の石英板との密着には、屈折率整合剤として
のグリセリンを用いている。5) Measurement of Surface Plasmon Resonance (SPR) Surface plasmon resonance (SPR) was carried out using the apparatus shown in FIG. In this embodiment, glycerin as a refractive index matching agent is used for the close contact between the triangular prism and the quartz plate of the support substrate.
【００４８】図５は、この装置による表面プラズモン共
鳴測定の結果である。検体として金基板に固定化したヌ
クレオチドとパーフェクトマッチする５′末端からＡＴ
ＧＴＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧ
ＴＧの塩基配列をもつ化学合成した一本鎖ヌクレオチド
を用いた。実線は、ヌクレオチド未標識の金薄膜基板の
みの表面プラズモン共鳴を測定したものである。三角プ
リズムを回転させ、光源の入射角度を変化させると次第
に光源の反射率が低下し、４６．０度の入射角度で反射
率が極小値となり（これを共鳴角と称す）、さらに入射
角度を変化させると再び反射率が回復していく。次に金
薄膜基板に固定化した金コロイド標識一本鎖ヌクレオチ
ドのみでの表面プラズモン共鳴を測定したのが、白丸
（Ａ１）のプロットである。金基板単独の時と同様、入
射角度を変化させると反射率が低下し、共鳴角が出現す
るが、その値は、４６．５７度に増加した。さらに検体
の一本鎖ヌクレオチド滴下し、ハイブリダイゼーション
を実施し、表面プラズモン共鳴を測定したのが、黒丸
（Ｂ１）のプロットである。入射角を変化させると反射
率が低下するが、共鳴角は金基板に一本鎖ヌクレオチド
を固定化した時よりもさらに角度が増加し、４７．０４
度を示した。FIG. 5 shows the results of surface plasmon resonance measurement using this apparatus. AT from the 5 'end that perfectly matches the nucleotide immobilized on the gold substrate as a sample
GTCTGGCCGTTCGTTTTACAACGTCG
A chemically synthesized single-stranded nucleotide having a TG base sequence was used. The solid line is a result of measuring the surface plasmon resonance of only the gold thin film substrate not labeled with nucleotides. When the angle of incidence of the light source is changed by rotating the triangular prism, the reflectance of the light source gradually decreases, and the reflectance becomes a minimum value at an incident angle of 46.0 degrees (this is called a resonance angle). When changed, the reflectance is restored again. Next, the white circle (A1) plots the surface plasmon resonance measured with only the gold colloid-labeled single-stranded nucleotides immobilized on the gold thin film substrate. As in the case of the gold substrate alone, when the incident angle was changed, the reflectance decreased and a resonance angle appeared, but the value increased to 46.57 degrees. Further, single-stranded nucleotides of the sample were dropped, hybridization was carried out, and surface plasmon resonance was measured. The plot of the black circle (B1) is shown. When the incident angle is changed, the reflectance decreases, but the resonance angle increases further than when the single-stranded nucleotide is immobilized on the gold substrate, and is 47.04.
Degree indicated.
【００４９】図６は、図５に対する比較対称測定をした
結果である。比較対称として金薄膜基板に固定化した一
本鎖ヌクレオチドに金コロイド標識せずに図５と同様の
測定をした。白四角（Ａ２）は、基板に一本鎖ヌクレオ
チドを固定化したのみでの、黒四角（Ｂ２）はハイブリ
ダイゼーション後の表面プラズモン共鳴を測定した結果
である。一本鎖ヌクレオチドのみでの共鳴角は４６．１
４度、ハイブリダイゼーション後の二本鎖ヌクレオチド
の共鳴角は４６．２７度であった。これは、金薄膜基板
単独での値、４６．０度に対し、角度シフトが比較的非
常に小さく、またハイブリダイゼーション前後の角度シ
フトも０．１３度と金コロイド標識した時のハイブリダ
イゼーション前後の角度シフト０．４７度に比べ約２５
％の変化であった。FIG. 6 shows the result of comparative symmetry measurement for FIG. For comparison, the same measurement as in FIG. 5 was performed without labeling the single-stranded nucleotides immobilized on the gold thin film substrate with colloidal gold. The open square (A2) is the result of measuring the surface plasmon resonance after hybridization, only when the single-stranded nucleotide was immobilized on the substrate, and the open square (B2). The resonance angle for single-stranded nucleotides alone was 46.1.
The resonance angle of the double-stranded nucleotide after hybridization at 4 degrees was 46.27 degrees. This is because, compared to the value of 46.0 degrees for the gold thin film substrate alone, the angle shift is relatively very small, and the angle shift before and after hybridization is 0.13 degrees. Approx. 25 compared to an angle shift of 0.47 degrees
% Change.
【００５０】以上のことから、ヌクレオチドへの金コロ
イド標識によりハイブリダイゼーションの結果が明瞭と
なり、検体の特定塩基配列を表面プラズモン共鳴により
測定した時の信頼性を大幅に向上させることがわかる。
これは中性子反射測定により本発明と同様に基板に固定
化されたヌクレオチドのハイブリダイゼーション前後で
の基板表面の膜圧が１．４ｎｍから７．５ｎｍに変化し
た結果から（Ｊ．ＡｍＣｈｅｍ．Ｓｏｃ． １２０巻
９７８７頁 １９９８年）、ヌクレオチドのハイブリダ
イゼーションによるヌクレオチドの構造変化が、ヌクレ
オチドに標識してある金コロイドと金薄膜との距離の変
化に反映され表面プラズモン共鳴に影響すると推察され
る。From the above, it can be seen that the result of hybridization becomes clear by colloidal gold labeling to nucleotides, and that the reliability when a specific base sequence of a sample is measured by surface plasmon resonance is greatly improved.
This is based on the result of a change in the film pressure on the substrate surface from 1.4 nm to 7.5 nm before and after hybridization of nucleotides immobilized on the substrate as in the present invention by neutron reflection measurement (J. AmChem. Soc. 120). roll
9787 (1998)). It is presumed that the change in nucleotide structure due to nucleotide hybridization is reflected in the change in the distance between the gold colloid labeled with the nucleotide and the gold thin film and affects surface plasmon resonance.
【００５１】なお、図７は、空気中での測定と、水中で
の測定との結果を対比して示したものであるが、水中に
おいても空気中と同様な応答が観察されている。このこ
とから、この発明の方法が、気相中、液相中のいずれに
おいても適用されることがわかる。FIG. 7 shows the results of measurement in air and measurement in water in comparison, and a response similar to that in air is observed in water. This indicates that the method of the present invention is applicable in both the gas phase and the liquid phase.
【００５２】図７に見られる結果の差異は、空気中での
金コロイド粒子と金薄膜表面との距離が、水中ではＤＮ
Ａ鎖が伸びてより拡大していることによるものと推察さ
れる。The difference between the results shown in FIG. 7 is that the distance between the colloidal gold particles and the surface of the gold thin film in air is DN
This is presumed to be due to the fact that the A chain is extended and expanded.
【００５３】[0053]
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明の遺伝子解析方法によれば、一本鎖ヌクレオチドを
基板に固定化し、検体のヌクレオチドとのハイブリダイ
ゼーションによる表面プラズモン共鳴の変化を測定する
ことで、使用者に繁雑な前処理をすることなく簡便さら
に精度よく特定塩基配列を持つヌクレオチドの検出がで
きる遺伝子解析方法を提供することが可能となる。さら
に、検体のヌクレオチドには標識等の前処理をする必要
がないだけでなく、未反応のヌクレオチドを洗浄、除去
するのもきわめて容易であるため、使用者の負担を大幅
に軽減することが可能である。As described above in detail, according to the gene analysis method of the present invention, a single-stranded nucleotide is immobilized on a substrate, and a change in surface plasmon resonance due to hybridization with a nucleotide of a sample is measured. Thus, it is possible to provide a gene analysis method capable of simply and accurately detecting a nucleotide having a specific base sequence without complicated pretreatment for the user. Furthermore, not only does the nucleotide of the sample need not be subjected to pretreatment such as labeling, but also it is extremely easy to wash and remove unreacted nucleotides, greatly reducing the burden on the user. It is.
【００５４】特に、基板に固定した一本鎖ヌクレオチド
を金等の貴金属のコロイドにより標識し、基板を金等の
貴金属もしくはその薄膜とすることで、検出精度はより
大きく向上し、検出信頼性を顕著に高めることができ
る。In particular, by labeling single-stranded nucleotides fixed on a substrate with a colloid of a noble metal such as gold and forming the substrate with a noble metal such as gold or a thin film thereof, detection accuracy is greatly improved and detection reliability is improved. Can be significantly increased.
【図１】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の測定を示した
概要図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing measurement of surface plasmon resonance (SPR).
【図２】ハイブリダイゼーションの前後の表面プラズモ
ン共鳴（ＳＰＲ）の変化について示した概要図である。FIG. 2 is a schematic diagram showing changes in surface plasmon resonance (SPR) before and after hybridization.
【図３】図２において、金コロイド修飾系の場合につい
ても示した概要図である。FIG. 3 is a schematic diagram also showing the case of a colloidal gold modification system in FIG.
【図４】表面プラズモン共鳴測定装置の構成を例示した
図である。FIG. 4 is a diagram illustrating a configuration of a surface plasmon resonance measurement device.
【図５】金コロイド標識したヌクレオチドの場合の表面
プラズモン共鳴を測定した結果を例示した図である。FIG. 5 is a diagram exemplifying a result of measurement of surface plasmon resonance in the case of a nucleotide labeled with colloidal gold.
【図６】金コロイド標識していないヌクレオチドの場合
の表面プラズモン共鳴を測定した結果を例示した図であ
る。FIG. 6 is a diagram exemplifying a result of measurement of surface plasmon resonance in the case of nucleotides not labeled with colloidal gold.
【図７】空気中と水中での測定結果を対比して例示した
図である。FIG. 7 is a diagram illustrating a comparison between measurement results in air and water.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 21/27 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５９５ 33/543 ５９５ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ Ｆターム(参考） 2G057 AB01 AB04 AB07 AC01 BA01 BA03 BB01 BB02 BB06 2G059 AA05 BB12 CC16 EE02 EE05 FF07 GG01 GG04 HH02 HH06 JJ12 JJ19 JJ20 JJ24 KK02 NN01 4B024 AA11 AA19 CA04 CA09 CA11 HA12 4B029 AA23 BB20 CC03 CC08 FA12 4B063 QA01 QA13 QQ42 QQ52 QR32 QR55 QS32 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) G01N 21/27 G01N 33/543 595 33/543 595 33/566 33/566 C12N 15/00 F F term ( (Reference) 2G057 AB01 AB04 AB07 AC01 BA01 BA03 BB01 BB02 BB06 2G059 AA05 BB12 CC16 EE02 EE05 FF07 GG01 GG04 HH02 HH06 JJ12 JJ19 JJ20 JJ24 KK02 NN01 4B024 AA11 AA19 CA04 CA09 CA11 QA12QB12AQ3QAQ3QBQAQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQ either
Claims (7)
鎖ヌクレオチドと検体の一本鎖ヌクレオチドとのハイブ
リダイゼーションを表面プラズモン共鳴の変化により測
定することを特徴とする遺伝子解析方法。1. A gene analysis method comprising measuring the hybridization between a single-stranded nucleotide having a specific base sequence immobilized on a substrate and a single-stranded nucleotide of a sample by a change in surface plasmon resonance.
を持つ一本鎖ヌクレオチドを予め貴金属コロイドで標識
することを特徴とする遺伝子解析方法。2. The method according to claim 1, wherein a single-stranded nucleotide having a specific base sequence is labeled in advance with a noble metal colloid.
を貴金属基板もしくは貴金属薄膜基板とすることを特徴
とする遺伝子解析方法。3. The gene analysis method according to claim 1, wherein the substrate is a noble metal substrate or a noble metal thin film substrate.
ダイゼーションさせることを特徴とする請求項１ないし
３のいずれかの遺伝子解析方法。4. The method according to claim 1, wherein hybridization is performed in a gas phase or a liquid phase.
って、基板上に特定塩基配列を持つ一本鎖ヌクレオチド
が固定されており、検体の一本鎖ヌクレオチドとのハイ
ブリダイゼーションを表面のプラズモン共鳴の変化によ
り測定することを特徴とする遺伝子解析マイクロアレ
イ。5. A microarray for gene analysis, wherein a single-stranded nucleotide having a specific base sequence is fixed on a substrate, and hybridization with a single-stranded nucleotide of a sample is changed by a change in plasmon resonance on the surface. A microarray for gene analysis, characterized in that the microarray is measured by:
板上に固定されている特定塩基配列を持つ一本鎖ヌクレ
オチドは、予め貴金属コロイドで標識されていることを
特徴とする遺伝子解析マイクロアレイ。6. The gene analysis microarray according to claim 5, wherein the single-stranded nucleotide having a specific base sequence immobilized on the substrate is labeled in advance with a noble metal colloid.
って、基板は、貴金属基板もしくは貴金属薄膜基板であ
ることを特徴とする遺伝子解析マイクロアレイ。7. The gene analysis microarray according to claim 5, wherein the substrate is a noble metal substrate or a noble metal thin film substrate.
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|---|---|---|---|---|
| JP2007205732A (en) * | 2006-01-31 | 2007-08-16 | Sysmex Corp | Sheath liquid for particle analyzer |
| JP2007538256A (en) * | 2004-05-17 | 2007-12-27 | メイバン・テクノロジーズ・エルエルシー | Imaging method and apparatus |
| JP2011106928A (en) * | 2009-11-16 | 2011-06-02 | Niigata Univ | Sensor and apparatus for detecting hydrogen adsorption |
-
2001
- 2001-03-14 JP JP2001072278A patent/JP2002267669A/en active Pending
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