JP2002262889A - Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｂｓｍｉ制限−修飾システムのクローニング及び発現の方法 - Google Patents
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｂｓｍｉ制限−修飾システムのクローニング及び発現の方法Info
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、ｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼ
（エンドヌクレアーゼ）と、２つのｂｓｍＩメチルトラ
ンスフェラーゼ（メチラーゼ、Ｍ１及びＭ２）とをコー
ドする組換えＤＮＡ、並びに組換えＤＮＡを含有する
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からのｂｓｍＩ制限エンドヌクレアー
ゼの発現に関する。 【解決手段】 ｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼをコー
ドする単離されたＤＮＡ、該ＤＮＡセグメントが挿入さ
れているベクターを含む組換えＤＮＡベクター、該単離
されたＤＮＡを含むクローニングベクター、及び該クロ
ーニングベクターによって形質転換された宿主細胞を提
供し、さらに、該ベクターで形質転換された宿主細胞
を、エンドヌクレアーゼの発現に適切な条件下で培養す
ることを含む組換えｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼを
生成する方法を提供する。
（エンドヌクレアーゼ）と、２つのｂｓｍＩメチルトラ
ンスフェラーゼ（メチラーゼ、Ｍ１及びＭ２）とをコー
ドする組換えＤＮＡ、並びに組換えＤＮＡを含有する
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からのｂｓｍＩ制限エンドヌクレアー
ゼの発現に関する。 【解決手段】 ｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼをコー
ドする単離されたＤＮＡ、該ＤＮＡセグメントが挿入さ
れているベクターを含む組換えＤＮＡベクター、該単離
されたＤＮＡを含むクローニングベクター、及び該クロ
ーニングベクターによって形質転換された宿主細胞を提
供し、さらに、該ベクターで形質転換された宿主細胞
を、エンドヌクレアーゼの発現に適切な条件下で培養す
ることを含む組換えｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼを
生成する方法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｂｓｍＩ制限エン
ドヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼ）と、２つのｂｓ
ｍＩメチルトランスフェラーゼ（メチラーゼ、Ｍ１及び
Ｍ２）とをコードする組換えＤＮＡ、並びに組換えＤＮ
Ａを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞からのｂｓｍＩ制限エン
ドヌクレアーゼの発現に関する。
ドヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼ）と、２つのｂｓ
ｍＩメチルトランスフェラーゼ（メチラーゼ、Ｍ１及び
Ｍ２）とをコードする組換えＤＮＡ、並びに組換えＤＮ
Ａを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞からのｂｓｍＩ制限エン
ドヌクレアーゼの発現に関する。
【０００２】
【従来の技術】ｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼは、Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ ＮＵＢ３６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ’ｓｔｒａｉｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ 番号３２
８）の株において見出される。
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ ＮＵＢ３６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ’ｓｔｒａｉｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ 番号３２
８）の株において見出される。
【０００３】これは、２本鎖ＤＮＡ構造： ５’ ＧＡＡＴＧＣＮ↓ ３’ ３’ ＣＴＴＡＣ↑ＧＮ ５’（↓／↑切断の部位） を認識し、並びに上部の鎖におけるその認識配列（Ｎ
１）の下流を切断し、及び／又は下部の鎖における認識
配列内（５’ＧＣＡＴＴＣ ３’配列のＧとＣとの間）
を切断して、２塩基の３’突出末端を生成する。
１）の下流を切断し、及び／又は下部の鎖における認識
配列内（５’ＧＣＡＴＴＣ ３’配列のＧとＣとの間）
を切断して、２塩基の３’突出末端を生成する。
【０００４】ＩＩ及びＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼ
は、細菌及びいくつかのウイルスにおいて天然に存在す
る酵素のクラスである。これらは他の細菌タンパク質か
ら精製して取り出されると、制限エンドヌクレアーゼ
は、ＤＮＡ分子を分子クローニングしたり、遺伝子特徴
づけのため小さなフラグメントに切断するために実験室
において使用され得る。
は、細菌及びいくつかのウイルスにおいて天然に存在す
る酵素のクラスである。これらは他の細菌タンパク質か
ら精製して取り出されると、制限エンドヌクレアーゼ
は、ＤＮＡ分子を分子クローニングしたり、遺伝子特徴
づけのため小さなフラグメントに切断するために実験室
において使用され得る。
【０００５】制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に
沿ったヌクレオチドの特定の配列（「認識配列」）を認
識し、そして結合することによって作用する。一旦結合
すると、これらは分子を認識部位内で、認識部位の片側
で、又は認識部位の両側で切断する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼは、異なる認識配列について親和性を有す
る。独特の特異性を有する２１１個を超える制限エンド
ヌクレアーゼが、今日までに試験された数百の細菌種の
間で同定されている（Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＭａｃｅｌｉ
ｓ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２７：３１２-３
１３（１９９９））。
沿ったヌクレオチドの特定の配列（「認識配列」）を認
識し、そして結合することによって作用する。一旦結合
すると、これらは分子を認識部位内で、認識部位の片側
で、又は認識部位の両側で切断する。異なる制限エンド
ヌクレアーゼは、異なる認識配列について親和性を有す
る。独特の特異性を有する２１１個を超える制限エンド
ヌクレアーゼが、今日までに試験された数百の細菌種の
間で同定されている（Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＭａｃｅｌｉ
ｓ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２７：３１２-３
１３（１９９９））。
【０００６】制限エンドヌクレアーゼは典型的に、それ
らが由来する細菌に従って命名される。従って、種「Ｄ
ｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ」は、
例えば、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩ、及びＤｒａＩＩＩと命
名される、３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを生成
する。これらの酵素は、それぞれ、配列５’ＴＴＴ↓Ａ
ＡＡ３’、５’ＰｕＧ↓ＧＮＣＣＰｙ３’、及び５’Ｃ
ＡＣＮＮＮ↓ＧＴＧ３’を認識し、そして切断する。他
方、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＹ１３は、
１つの酵素ＥｃｏＲＩのみを生成し、これは配列５’Ｇ
↓ＡＡＴＴＣ３’を認識する。
らが由来する細菌に従って命名される。従って、種「Ｄ
ｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ」は、
例えば、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩ、及びＤｒａＩＩＩと命
名される、３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを生成
する。これらの酵素は、それぞれ、配列５’ＴＴＴ↓Ａ
ＡＡ３’、５’ＰｕＧ↓ＧＮＣＣＰｙ３’、及び５’Ｃ
ＡＣＮＮＮ↓ＧＴＧ３’を認識し、そして切断する。他
方、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＹ１３は、
１つの酵素ＥｃｏＲＩのみを生成し、これは配列５’Ｇ
↓ＡＡＴＴＣ３’を認識する。
【０００７】細菌の制限−修飾（Ｒ−Ｍ）系の第２の成
分は、メチルトランスフェラーゼ（メチラーゼ）であ
る。これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼに相補的で
あり、及びこれらは細菌がそれら自身のＤＮＡを保護
し、及び外来の、感染するＤＮＡからこれを区別し得る
手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エン
ドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識し、そしてそれに
結合するが、ＤＮＡを切断する変わりに、これらはメチ
ル基の添加によって配列内の１つの特定のヌクレオチド
を化学的に修飾する（Ｃ５メチルシトシン、Ｎ４メチル
シトシン、又はＮ６メチルアデニン）。メチル化後、認
識部位は同族の制限エンドヌクレアーゼによってもはや
切断されない。細菌細胞のＤＮＡは常に、修飾メチラー
ゼの活性によって完全に修飾される。それゆえ、内因性
制限エンドヌクレアーゼの存在に完全に非感受性であ
る。未修飾の、及び、それゆえ同定可能な外来ＤＮＡの
みが、制限エンドヌクレアーゼ認識及び切断に感受性を
有する。
分は、メチルトランスフェラーゼ（メチラーゼ）であ
る。これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼに相補的で
あり、及びこれらは細菌がそれら自身のＤＮＡを保護
し、及び外来の、感染するＤＮＡからこれを区別し得る
手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エン
ドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識し、そしてそれに
結合するが、ＤＮＡを切断する変わりに、これらはメチ
ル基の添加によって配列内の１つの特定のヌクレオチド
を化学的に修飾する（Ｃ５メチルシトシン、Ｎ４メチル
シトシン、又はＮ６メチルアデニン）。メチル化後、認
識部位は同族の制限エンドヌクレアーゼによってもはや
切断されない。細菌細胞のＤＮＡは常に、修飾メチラー
ゼの活性によって完全に修飾される。それゆえ、内因性
制限エンドヌクレアーゼの存在に完全に非感受性であ
る。未修飾の、及び、それゆえ同定可能な外来ＤＮＡの
みが、制限エンドヌクレアーゼ認識及び切断に感受性を
有する。
【０００８】組換えＤＮＡ技術によって、遺伝子をクロ
ーン化すること、及び大量に酵素を過剰生産することが
今や可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクロ
ーンを単離するための鍵は、「ショットガン」手法によ
って駆動される複雑なゲノムＤＮＡライブラリー、すな
わち、クローンの集団内でこのようなクローンを、それ
らが１０−３〜１０−４ほどの低さの頻度にて存在する
場合に同定するための簡単な及び信頼できる方法を開発
することである。好ましくは、方法は、所望されない大
多数のクローンが破壊されるが、所望される稀なクロー
ンは生存するように、選択的であるべきである。
ーン化すること、及び大量に酵素を過剰生産することが
今や可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクロ
ーンを単離するための鍵は、「ショットガン」手法によ
って駆動される複雑なゲノムＤＮＡライブラリー、すな
わち、クローンの集団内でこのようなクローンを、それ
らが１０−３〜１０−４ほどの低さの頻度にて存在する
場合に同定するための簡単な及び信頼できる方法を開発
することである。好ましくは、方法は、所望されない大
多数のクローンが破壊されるが、所望される稀なクロー
ンは生存するように、選択的であるべきである。
【０００９】多数のＩＩ型制限−修飾系がクローン化さ
れている。第１のクローニング法は、制限エンドヌクレ
アーゼクローンを同定及び選択する手段として、バクテ
リオファージエンドヌクレアーゼ感染を使用した（Ｅｃ
ｏＲＩＩ；Ｋｏｓｙｋｈら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．１７８：７１７-７１９（１９８０）；ＨｈａＩ
Ｉ：Ｍａｎら、Ｇｅｎｅ ３：９７-１１２、（１９７
８）：ＰｓｔＩ：Ｗａｌｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：１５０３-１５０７、（１９
８１））。細菌における制限−修飾系の存在は、バクテ
リオファージによる感染にそれらが耐えることを可能に
するので、クローン化された制限−修飾遺伝子を保有す
る細胞は、主に、ファージに曝露されたゲノムＤＮＡラ
イブラリーからの生存者として選択的に単離され得る。
しかし、この方法は、制限された価値のみを有すること
が見出されている。具体的には、クローン化された制限
−修飾遺伝子は、選択的な生存を付与するために十分な
ファージ耐性を常には示さないことが見出された。
れている。第１のクローニング法は、制限エンドヌクレ
アーゼクローンを同定及び選択する手段として、バクテ
リオファージエンドヌクレアーゼ感染を使用した（Ｅｃ
ｏＲＩＩ；Ｋｏｓｙｋｈら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．１７８：７１７-７１９（１９８０）；ＨｈａＩ
Ｉ：Ｍａｎら、Ｇｅｎｅ ３：９７-１１２、（１９７
８）：ＰｓｔＩ：Ｗａｌｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：１５０３-１５０７、（１９
８１））。細菌における制限−修飾系の存在は、バクテ
リオファージによる感染にそれらが耐えることを可能に
するので、クローン化された制限−修飾遺伝子を保有す
る細胞は、主に、ファージに曝露されたゲノムＤＮＡラ
イブラリーからの生存者として選択的に単離され得る。
しかし、この方法は、制限された価値のみを有すること
が見出されている。具体的には、クローン化された制限
−修飾遺伝子は、選択的な生存を付与するために十分な
ファージ耐性を常には示さないことが見出された。
【００１０】別のクローニングアプローチは、Ｅ．ｃｏ
ｌｉクローニングプラスミドにプラスミド由来として最
初に特徴づけされた系を移行することを包含する（Ｅｃ
ｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ．Ｒｅｓ．１２：３６５９-３６７６、（１９８
４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏｏｋ
ｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ；．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８０：４０２-４０６、（１９８３）；Ｔｈｅｒｉａｕ
ｌｔ及びＲｏｙ、Ｇｅｎｅ １９：３５５-３５９（１
９８２）；ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら、Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：５０１-５０９、（１９
８５）；Ｔｓｐ４５Ｉ：Ｗａｙｎｅら Ｇｅｎｅ ２０
２：８３-８８、（１９９７））。
ｌｉクローニングプラスミドにプラスミド由来として最
初に特徴づけされた系を移行することを包含する（Ｅｃ
ｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ．Ｒｅｓ．１２：３６５９-３６７６、（１９８
４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏｏｋ
ｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ；．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８０：４０２-４０６、（１９８３）；Ｔｈｅｒｉａｕ
ｌｔ及びＲｏｙ、Ｇｅｎｅ １９：３５５-３５９（１
９８２）；ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら、Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：５０１-５０９、（１９
８５）；Ｔｓｐ４５Ｉ：Ｗａｙｎｅら Ｇｅｎｅ ２０
２：８３-８８、（１９９７））。
【００１１】第３のアプローチは、メチラーゼ遺伝子の
活性な発現について選択することである（メチラーゼ選
択）（米国特許第５，２００，３３３号及びＢｕｓＲ
Ｉ：Ｋｉｓｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１
３：６４０３-６４２１、（１９８５））。Ｒ−Ｍ遺伝
子はしばしばともに密接に連鎖されるので、両方の遺伝
子はしばしば同時にクローン化され得る。この選択は完
全な制限系を常には得られないが、その代わりにメチラ
ーゼ遺伝子のみが得られる（ＢｓｐＲＩ：Ｓｚｏｍｏｌ
ａｎｙｉら、Ｇｅｎｅ １０：２１９-２２５（１９８
０）；ＢｃｎＩ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓら、Ｇｅｎｅ
２０：１９７-２０４（１９８２）；ＢｓｕＲＩ；Ｋｉ
ｓｓ及びＢａｌｄａｕｆ、Ｇｅｎｅ ２１：１１１-１
１９、（１９８３）；及びＭｓｐＩ：Ｗａｌｄｅｒら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１２３５-１２４
１、（１９８３））。
活性な発現について選択することである（メチラーゼ選
択）（米国特許第５，２００，３３３号及びＢｕｓＲ
Ｉ：Ｋｉｓｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１
３：６４０３-６４２１、（１９８５））。Ｒ−Ｍ遺伝
子はしばしばともに密接に連鎖されるので、両方の遺伝
子はしばしば同時にクローン化され得る。この選択は完
全な制限系を常には得られないが、その代わりにメチラ
ーゼ遺伝子のみが得られる（ＢｓｐＲＩ：Ｓｚｏｍｏｌ
ａｎｙｉら、Ｇｅｎｅ １０：２１９-２２５（１９８
０）；ＢｃｎＩ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓら、Ｇｅｎｅ
２０：１９７-２０４（１９８２）；ＢｓｕＲＩ；Ｋｉ
ｓｓ及びＢａｌｄａｕｆ、Ｇｅｎｅ ２１：１１１-１
１９、（１９８３）；及びＭｓｐＩ：Ｗａｌｄｅｒら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１２３５-１２４
１、（１９８３））。
【００１２】より最近の方法の、「エンド−ブルー（ｅ
ｎｄｏ−ｂｌｕｅ）法」は、ｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ融合
を含有するＥ．ｃｏｌｉのインディケーター株に基づい
て、Ｅ．ｃｏｌｉにおける制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子の直接的なクローニングのために記載された（Ｆｏｍ
ｅｎｋｏｖら、米国特許第５，４９８，５３５号、（１
９９６）；Ｆｏｍｅｎｋｏｖら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２２：２３９９-２４０３、（１９９
４））。この方法は、制限エンドヌクレアーゼ又は非特
異的ヌクレアーゼによって引き起こされるＤＮＡ障害後
のＥ．ｃｏｌｉ ＳＯＳ応答シグナルを利用する。多く
の熱安定性のヌクレアーゼ遺伝子（ＴａｑＩ、Ｔｔｈ１
１１Ｉ、ＢｓｏＢＩ、Ｔｆヌクレアーゼ）が、この方法
（米国特許第５，４９８，５３５号）によってクローン
化された。
ｎｄｏ−ｂｌｕｅ）法」は、ｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ融合
を含有するＥ．ｃｏｌｉのインディケーター株に基づい
て、Ｅ．ｃｏｌｉにおける制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子の直接的なクローニングのために記載された（Ｆｏｍ
ｅｎｋｏｖら、米国特許第５，４９８，５３５号、（１
９９６）；Ｆｏｍｅｎｋｏｖら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２２：２３９９-２４０３、（１９９
４））。この方法は、制限エンドヌクレアーゼ又は非特
異的ヌクレアーゼによって引き起こされるＤＮＡ障害後
のＥ．ｃｏｌｉ ＳＯＳ応答シグナルを利用する。多く
の熱安定性のヌクレアーゼ遺伝子（ＴａｑＩ、Ｔｔｈ１
１１Ｉ、ＢｓｏＢＩ、Ｔｆヌクレアーゼ）が、この方法
（米国特許第５，４９８，５３５号）によってクローン
化された。
【００１３】精製された制限エンドヌクレアーゼ、及び
より少ない程度に、修飾メチラーゼは、実験室において
組換え分子を作製するための有用な道具であるので、大
量の制限酵素を生成する組換えＤＮＡ技術を介して、細
菌株を得るという商業的な誘因がある。このような過剰
発現株はまた、酵素精製の課題を単純にするべきであ
る。
より少ない程度に、修飾メチラーゼは、実験室において
組換え分子を作製するための有用な道具であるので、大
量の制限酵素を生成する組換えＤＮＡ技術を介して、細
菌株を得るという商業的な誘因がある。このような過剰
発現株はまた、酵素精製の課題を単純にするべきであ
る。
【００１４】
【発明の解決しようとする課題】本発明は、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＮＵ
Ｂ３６からｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をク
ローニングするための方法に関する。最初にメチラーゼ
選択法が、ｂｓｍＩメチラーゼ遺伝子をクローン化する
ために使用された。メチラーゼポジティブクローンはｂ
ｓｍＩゲノムＤＮＡを含有するプラスミドライブラリー
に由来した。しかし、明白なｂｓｍＩ活性は、Ｍ＋クロ
ーンの細胞抽出物において検出されなかった。
ｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＮＵ
Ｂ３６からｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をク
ローニングするための方法に関する。最初にメチラーゼ
選択法が、ｂｓｍＩメチラーゼ遺伝子をクローン化する
ために使用された。メチラーゼポジティブクローンはｂ
ｓｍＩゲノムＤＮＡを含有するプラスミドライブラリー
に由来した。しかし、明白なｂｓｍＩ活性は、Ｍ＋クロ
ーンの細胞抽出物において検出されなかった。
【００１５】
【課題を解決するための手段】Ｍ＋クローンにおけるＤ
ＮＡインサートは、プライマーウォーキングによって配
列決定された。クローンは、完全なｂｓｍＩＭ１遺伝子
及びｂｓｍＩＭ２遺伝子の小さな部分（１３１ｂｐ）を
含むことが見出された。ｂｓｍＩＭ１遺伝子及びｂｓｍ
ＩＭ２の左側に、ＤＮＡ分配化タンパク質（ＰａｒＡフ
ァミリー）に約３０％のアミノ酸配列同一性を示した１
つのＯＲＦがあった。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子が
しばしば、メチラーゼ遺伝子の近傍に位置するので、ｂ
ｓｍＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｂｓｍＩＲ）はおそ
らくｂｓｍＩＭ１遺伝子及びｂｓｍＩＭ２の右側に位置
されることが推定された（図１）。逆ＰＣＲ及びＰＣＲ
によってｂｓｍＩＭ２の残り及び完全なｂｓｍＩＲ遺伝
子をクローン化する試みがなされた。５回の逆ＰＣＲ及
び逆ＰＣＲ産物の配列決定後、ｂｓｍＩＭ２の完全な配
列が得られた。２０３１ｂｐのオープンリーディングフ
レーム（ＯＲＦ）が、ｂｓｍＩＭ２遺伝子の下流で見出
され、及びこのＯＲＦはｂｓｍＩＲ遺伝子と命名された
（図１、４及び５）。プラスミドｐＢＲ−ｂｓｍＩＭ１
はｂｓｍＩ消化に部分的にのみ耐性であったが、ｐＢＲ
−ｂｓｍＩＭ２は、ｂｓｍＩ消化に完全に耐性であっ
た。ｂｓｍＩＭ１及びＭ２の両方をＰＣＲによって増幅
し、そしてベクターｐＢＲ３２２にクローン化してプラ
スミドｐＲ−ｂｓｍＩＭ１及びＭ２を作製した。ｂｓｍ
ＩＭ１及びＭ２遺伝子の両方は、ＴｃＲプロモーターの
制御下にあり、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて構成的に発現され
た。プラスミドｐＢＲ−ｂｓｍＩＭ１及びＭ２は、ｂｓ
ｍＩ消化に完全に耐性であり、ＴｃＲプロモーターから
の十分な発現を示した。
ＮＡインサートは、プライマーウォーキングによって配
列決定された。クローンは、完全なｂｓｍＩＭ１遺伝子
及びｂｓｍＩＭ２遺伝子の小さな部分（１３１ｂｐ）を
含むことが見出された。ｂｓｍＩＭ１遺伝子及びｂｓｍ
ＩＭ２の左側に、ＤＮＡ分配化タンパク質（ＰａｒＡフ
ァミリー）に約３０％のアミノ酸配列同一性を示した１
つのＯＲＦがあった。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子が
しばしば、メチラーゼ遺伝子の近傍に位置するので、ｂ
ｓｍＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｂｓｍＩＲ）はおそ
らくｂｓｍＩＭ１遺伝子及びｂｓｍＩＭ２の右側に位置
されることが推定された（図１）。逆ＰＣＲ及びＰＣＲ
によってｂｓｍＩＭ２の残り及び完全なｂｓｍＩＲ遺伝
子をクローン化する試みがなされた。５回の逆ＰＣＲ及
び逆ＰＣＲ産物の配列決定後、ｂｓｍＩＭ２の完全な配
列が得られた。２０３１ｂｐのオープンリーディングフ
レーム（ＯＲＦ）が、ｂｓｍＩＭ２遺伝子の下流で見出
され、及びこのＯＲＦはｂｓｍＩＲ遺伝子と命名された
（図１、４及び５）。プラスミドｐＢＲ−ｂｓｍＩＭ１
はｂｓｍＩ消化に部分的にのみ耐性であったが、ｐＢＲ
−ｂｓｍＩＭ２は、ｂｓｍＩ消化に完全に耐性であっ
た。ｂｓｍＩＭ１及びＭ２の両方をＰＣＲによって増幅
し、そしてベクターｐＢＲ３２２にクローン化してプラ
スミドｐＲ−ｂｓｍＩＭ１及びＭ２を作製した。ｂｓｍ
ＩＭ１及びＭ２遺伝子の両方は、ＴｃＲプロモーターの
制御下にあり、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて構成的に発現され
た。プラスミドｐＢＲ−ｂｓｍＩＭ１及びＭ２は、ｂｓ
ｍＩ消化に完全に耐性であり、ＴｃＲプロモーターから
の十分な発現を示した。
【００１６】ｂｓｍＩＲ遺伝子は、ＰＣＲによって増幅
され、そして適合性の末端を有する、低コピー数Ｔ７発
現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにクローン化され
た。発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒはｐＡＣＹＣ
１８４に由来し、及び細胞当たり５〜８コピーを有す
る。これは、Ｔ７プロモーターの上流に４コピーのＥ．
ｃｏｌｉ転写ターミネーターを含む。転写ターミネータ
ーはベクター上の潜在性Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターから
のランオフ転写を減少することが予測される。細胞抽出
物が調製され、そしてｂｓｍＩエンドヌクレアーゼ活性
についてアッセイされた。２つの単離物（番号１１及び
番号３３）は、十分なｂｓｍＩ活性を示した。組換えｂ
ｓｍＩの収量は、湿潤細胞の１グラム当たり２×１０６
単位であると決定された（活性アッセイについて、図６
を参照のこと）。完全なｂｓｍＩＲ遺伝子を配列決定し
て、番号１１が野生型ｂｓｍＩＲ遺伝子配列を保有する
ことを確認した。
され、そして適合性の末端を有する、低コピー数Ｔ７発
現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにクローン化され
た。発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒはｐＡＣＹＣ
１８４に由来し、及び細胞当たり５〜８コピーを有す
る。これは、Ｔ７プロモーターの上流に４コピーのＥ．
ｃｏｌｉ転写ターミネーターを含む。転写ターミネータ
ーはベクター上の潜在性Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターから
のランオフ転写を減少することが予測される。細胞抽出
物が調製され、そしてｂｓｍＩエンドヌクレアーゼ活性
についてアッセイされた。２つの単離物（番号１１及び
番号３３）は、十分なｂｓｍＩ活性を示した。組換えｂ
ｓｍＩの収量は、湿潤細胞の１グラム当たり２×１０６
単位であると決定された（活性アッセイについて、図６
を参照のこと）。完全なｂｓｍＩＲ遺伝子を配列決定し
て、番号１１が野生型ｂｓｍＩＲ遺伝子配列を保有する
ことを確認した。
【００１７】ｂｓｍＩエンドヌクレアーゼは熱安定性酵
素であるので、ｂｓｍＩを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞抽
出物を６５℃で加熱し、そして変性されたタンパク質を
遠心分離によって除去した。可溶性タンパク質をヘパリ
ンセファロースカラム上にロードした。タンパク質は、
５０ｍＭ〜１Ｍ ＮａＣｌの塩勾配で溶出された。ｂｓ
ｍＩ活性が、各画分についてアッセイされた。最も活性
な画分がまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析された（図
７）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのｂｓｍＩエンドヌクレア
ーゼの観察された分子量は、７７．９ｋＤａであり、７
８．１ｋＤａの予測される分子量と密接に一致した。
素であるので、ｂｓｍＩを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞抽
出物を６５℃で加熱し、そして変性されたタンパク質を
遠心分離によって除去した。可溶性タンパク質をヘパリ
ンセファロースカラム上にロードした。タンパク質は、
５０ｍＭ〜１Ｍ ＮａＣｌの塩勾配で溶出された。ｂｓ
ｍＩ活性が、各画分についてアッセイされた。最も活性
な画分がまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析された（図
７）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのｂｓｍＩエンドヌクレア
ーゼの観察された分子量は、７７．９ｋＤａであり、７
８．１ｋＤａの予測される分子量と密接に一致した。
【００１８】
【発明の実施の形態】２つのｂｓｍＩメチラーゼ遺伝子
及びｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子が好ましく
はＥ.ｃｏｌｉにおいてクローン化され、そして発現さ
れる本明細書中に記載される方法は、以下の工程を包含
する。
及びｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子が好ましく
はＥ.ｃｏｌｉにおいてクローン化され、そして発現さ
れる本明細書中に記載される方法は、以下の工程を包含
する。
【００１９】１．ｂｓｍＩゲノムＤＮＡライブラリーの
構築及びｂｓｍＩＭ１遺伝子のクローニング。 ゲノムＤＮＡをＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓＮＵＢ３６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂａｉｏｌａｂｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ番号３２
８）から標準的な手順により調製する。１０μｇのゲノ
ムＤＮＡをＡａｔＩＩ、ＢｓｐＥＩ、ＣｌａＩ、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ、ＮｄｅＩ、及びＥｃｏＲＩでそれぞれ消化
し、そして適合性の末端を有する改変されたｐＢＲ３２
２（２つのｂｓｍＩ部位）にライゲーションする。ライ
ゲーションされたＤＮＡを、エレクトロポレーションに
よってＲＲ１コンピテントセルにトランスファーする。
１０４ＡｐＲよりも多いコロニーを、ＡａｔＩＩ、Ｂｓ
ｐＥＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｄｅＩ、及びＥ
ｃｏＲＩライブラリーからプールし、そして細胞を２リ
ットルＬＢ＋Ａｐ中で一晩増殖した。プラスミドＤＮＡ
を一晩細胞から調製する。プラスミドライブラリーＤＮ
ＡをｂｓｍＩで一晩消化し、そして課題のＤＮＡを、Ｅ
Ｒ２６８３コンピテントセル（ＭｃｒＢＣ−、Ｍｒ
ｒ−、ＭｃｒＡ−）を形質転換するために使用する。生
存する形質転換体を３７℃で一晩Ａｐプレート上でプレ
ートした。プラスミドミニ調製物を作製し、そしてｂｓ
ｍＩで消化して、それらがｂｓｍＩ消化に耐性であった
か否かを確認した。５４個のコロニーのうちの２つのプ
ラスミド（番号２２及び番号５４）が、ｂｓｍＩ消化に
部分的に耐性であることが見出され、ｂｓｍＩＭ遺伝子
がクローン化され、そしてＥ.ｃｏｌｉ細胞において妥
当なレベルにおいて発現されたことを示す。しかし、Ｍ
＋クローンの細胞抽出物において、明白なｂｓｍＩ活性
は何も検出されなかった。
構築及びｂｓｍＩＭ１遺伝子のクローニング。 ゲノムＤＮＡをＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓＮＵＢ３６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂａｉｏｌａｂｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ番号３２
８）から標準的な手順により調製する。１０μｇのゲノ
ムＤＮＡをＡａｔＩＩ、ＢｓｐＥＩ、ＣｌａＩ、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ、ＮｄｅＩ、及びＥｃｏＲＩでそれぞれ消化
し、そして適合性の末端を有する改変されたｐＢＲ３２
２（２つのｂｓｍＩ部位）にライゲーションする。ライ
ゲーションされたＤＮＡを、エレクトロポレーションに
よってＲＲ１コンピテントセルにトランスファーする。
１０４ＡｐＲよりも多いコロニーを、ＡａｔＩＩ、Ｂｓ
ｐＥＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｄｅＩ、及びＥ
ｃｏＲＩライブラリーからプールし、そして細胞を２リ
ットルＬＢ＋Ａｐ中で一晩増殖した。プラスミドＤＮＡ
を一晩細胞から調製する。プラスミドライブラリーＤＮ
ＡをｂｓｍＩで一晩消化し、そして課題のＤＮＡを、Ｅ
Ｒ２６８３コンピテントセル（ＭｃｒＢＣ−、Ｍｒ
ｒ−、ＭｃｒＡ−）を形質転換するために使用する。生
存する形質転換体を３７℃で一晩Ａｐプレート上でプレ
ートした。プラスミドミニ調製物を作製し、そしてｂｓ
ｍＩで消化して、それらがｂｓｍＩ消化に耐性であった
か否かを確認した。５４個のコロニーのうちの２つのプ
ラスミド（番号２２及び番号５４）が、ｂｓｍＩ消化に
部分的に耐性であることが見出され、ｂｓｍＩＭ遺伝子
がクローン化され、そしてＥ.ｃｏｌｉ細胞において妥
当なレベルにおいて発現されたことを示す。しかし、Ｍ
＋クローンの細胞抽出物において、明白なｂｓｍＩ活性
は何も検出されなかった。
【００２０】Ｍ＋クローン番号５４におけるＤＮＡイン
サートを、ＡｐｏＩ、ＮｄｅＩ，及びＰｖｕＩＩで消化
し、そしてＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１９にサブクロ
ーン化した。次いで、挿入されたフラグメントをｐＵＣ
１９ユニバーサルプライマー及び逆方向プライマーを使
用して配列決定した。残りのインサートを、プライマー
ウォーキングによって配列決定した。クローンがＮｄｅ
Ｉ部位において終結し、並びに完全なｂｓｍＩＭ１遺伝
子及びｂｓｍＩＭ２遺伝子の小さな部分（１３１ｂｐ）
を含むことが見出された。ｂｓｍＩＭ１及びｂｓｍＩＭ
２遺伝子の左側に、ＤＮＡ分配化タンパク質（ＰａｒＡ
ファミリー）に３０％のアミノ酸配列同一性を示す１つ
のＯＲＦがあった。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子がメ
チラーゼ遺伝子の近傍に通常位置されたので、ｂｓｍＩ
エンドヌクレアーゼ（ｂｓｍＩＲ）がｂｓｍＩＭ１及び
ｂｓｍＩＭ２遺伝子の右側におそらく位置されることが
結論付けられた（図１）。逆ＰＣＲ及びＰＣＲによっ
て、Ｍ２遺伝子の残り及び完全なｂｓｍＩＲ遺伝子をク
ローン化するための試みがなされた。
サートを、ＡｐｏＩ、ＮｄｅＩ，及びＰｖｕＩＩで消化
し、そしてＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１９にサブクロ
ーン化した。次いで、挿入されたフラグメントをｐＵＣ
１９ユニバーサルプライマー及び逆方向プライマーを使
用して配列決定した。残りのインサートを、プライマー
ウォーキングによって配列決定した。クローンがＮｄｅ
Ｉ部位において終結し、並びに完全なｂｓｍＩＭ１遺伝
子及びｂｓｍＩＭ２遺伝子の小さな部分（１３１ｂｐ）
を含むことが見出された。ｂｓｍＩＭ１及びｂｓｍＩＭ
２遺伝子の左側に、ＤＮＡ分配化タンパク質（ＰａｒＡ
ファミリー）に３０％のアミノ酸配列同一性を示す１つ
のＯＲＦがあった。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子がメ
チラーゼ遺伝子の近傍に通常位置されたので、ｂｓｍＩ
エンドヌクレアーゼ（ｂｓｍＩＲ）がｂｓｍＩＭ１及び
ｂｓｍＩＭ２遺伝子の右側におそらく位置されることが
結論付けられた（図１）。逆ＰＣＲ及びＰＣＲによっ
て、Ｍ２遺伝子の残り及び完全なｂｓｍＩＲ遺伝子をク
ローン化するための試みがなされた。
【００２１】２．逆ＰＣＲ及びＰＣＲによるｂｓｍＩＭ
２遺伝子及びｂｓｍＩＲ遺伝子のクローニング。 ２つの逆ＰＣＲプライマー（２３０〜１１９及び２２９
〜１５９）を合成した。ｂｓｍＩゲノムＤＮＡを、それ
ぞれ、ＢｓａＷＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ、ＭｆｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＮｓｐＩ、Ｓｓｐ
Ｉ、及びＴａｑＩで消化した。消化されたＤＮＡを精製
し、そして低い濃度で自己ライゲーションした。Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを熱不活性化し、そしてライゲーションさ
れたＤＮＡの一部分を逆ＰＣＲの鋳型として使用した。
ＰＣＲ産物は、ＢｓａＷＩ、ＥｃｏＲＩ、ＭｆｅＩ、Ｎ
ｌａＩＩＩ、及びＴａｑＩ鋳型において見出され、及び
低融点アガロースゲルからゲル精製した。精製されたＤ
ＮＡを、クローニング工程を伴わずに、プライマー２３
０〜１１９及び２２９〜１５９を使用して直接的に配列
決定した。この逆ＰＣＲは、ｂｓｍＩＭ２遺伝子におけ
る約５４０ｂｐの新規なＤＮＡ配列を生じた。
２遺伝子及びｂｓｍＩＲ遺伝子のクローニング。 ２つの逆ＰＣＲプライマー（２３０〜１１９及び２２９
〜１５９）を合成した。ｂｓｍＩゲノムＤＮＡを、それ
ぞれ、ＢｓａＷＩ、ＢｓｐＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ、ＭｆｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＮｓｐＩ、Ｓｓｐ
Ｉ、及びＴａｑＩで消化した。消化されたＤＮＡを精製
し、そして低い濃度で自己ライゲーションした。Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを熱不活性化し、そしてライゲーションさ
れたＤＮＡの一部分を逆ＰＣＲの鋳型として使用した。
ＰＣＲ産物は、ＢｓａＷＩ、ＥｃｏＲＩ、ＭｆｅＩ、Ｎ
ｌａＩＩＩ、及びＴａｑＩ鋳型において見出され、及び
低融点アガロースゲルからゲル精製した。精製されたＤ
ＮＡを、クローニング工程を伴わずに、プライマー２３
０〜１１９及び２２９〜１５９を使用して直接的に配列
決定した。この逆ＰＣＲは、ｂｓｍＩＭ２遺伝子におけ
る約５４０ｂｐの新規なＤＮＡ配列を生じた。
【００２２】２つの逆ＰＣＲプライマー（２３２〜１８
８及び２３２〜１８９）を合成した。ｂｓｍＩゲノムＤ
ＮＡをＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、ＤｒａＩ、
ＮｄｅＩ、ＲｓａＩ、及びＸｂａＩで消化した、消化さ
れたＤＮＡを精製し、そして低い濃度で自己ライゲーシ
ョンした。リガーゼを熱不活性化し、そしてライゲーシ
ョンされたＤＮＡの一部分を逆ＰＣＲの鋳型として使用
した。ＰＣＲ産物が、ＤｒａＩ、及びＲｓａＩ鋳型にお
いて見出され、そして低融点アガロースゲルからゲル精
製した。精製されたＤＮＡを、クローニング工程を伴わ
ずに、プライマー２３２〜１８８及び２３２〜１８９を
使用して直接的に配列決定した。この逆ＰＣＲはｂｓｍ
ＩＭ２遺伝子において約１２０ｂｐの新規なＤＮＡ配列
を生じた。
８及び２３２〜１８９）を合成した。ｂｓｍＩゲノムＤ
ＮＡをＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、ＤｒａＩ、
ＮｄｅＩ、ＲｓａＩ、及びＸｂａＩで消化した、消化さ
れたＤＮＡを精製し、そして低い濃度で自己ライゲーシ
ョンした。リガーゼを熱不活性化し、そしてライゲーシ
ョンされたＤＮＡの一部分を逆ＰＣＲの鋳型として使用
した。ＰＣＲ産物が、ＤｒａＩ、及びＲｓａＩ鋳型にお
いて見出され、そして低融点アガロースゲルからゲル精
製した。精製されたＤＮＡを、クローニング工程を伴わ
ずに、プライマー２３２〜１８８及び２３２〜１８９を
使用して直接的に配列決定した。この逆ＰＣＲはｂｓｍ
ＩＭ２遺伝子において約１２０ｂｐの新規なＤＮＡ配列
を生じた。
【００２３】次いで、２つの逆ＰＣＲプライマー（２３
３〜１２５及び２３３〜１２６）を合成した。ｂｓｍＩ
ゲノムＤＮＡを、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｔＵ１、ＢｓｔＹ
１，ＣｌａＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＮｄｅＩ、ＮｓｐＩ、Ｒｓａ
Ｉ、ＳｓｐＩ、及びＸｂａＩで消化した。消化されたＤ
ＮＡを精製し、そして低い濃度（２μｇ／ｍｌ最終）で
自己ライゲーションした。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを６５℃
で３０分間、熱不活性化し、そしてライゲーションされ
たＤＮＡの一部分を逆ＰＣＲの鋳型として使用した。Ｐ
ＣＲ産物が、ＣｌａＩ、ＲｓａＩ、ＳｓｐＩ、及びＸｂ
ａＩ鋳型において見出され、そして低融点アガロースゲ
ルからゲル精製した。精製されたＤＮＡを、クローニン
グ工程を伴わずに、プライマー２３３〜１２５及び２３
３〜１２６を使用して配列決定した。内部プライマーを
また使用して１６００ｂｐ ＸｂａＩフラグメントを配
列決定した。この逆ＰＣＲ工程は、ｂｓｍＩＭ２及びｂ
ｓｍＩＲ遺伝子における約１４４０ｂｐの新規なＤＮＡ
配列を生じた。
３〜１２５及び２３３〜１２６）を合成した。ｂｓｍＩ
ゲノムＤＮＡを、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｔＵ１、ＢｓｔＹ
１，ＣｌａＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＮｄｅＩ、ＮｓｐＩ、Ｒｓａ
Ｉ、ＳｓｐＩ、及びＸｂａＩで消化した。消化されたＤ
ＮＡを精製し、そして低い濃度（２μｇ／ｍｌ最終）で
自己ライゲーションした。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを６５℃
で３０分間、熱不活性化し、そしてライゲーションされ
たＤＮＡの一部分を逆ＰＣＲの鋳型として使用した。Ｐ
ＣＲ産物が、ＣｌａＩ、ＲｓａＩ、ＳｓｐＩ、及びＸｂ
ａＩ鋳型において見出され、そして低融点アガロースゲ
ルからゲル精製した。精製されたＤＮＡを、クローニン
グ工程を伴わずに、プライマー２３３〜１２５及び２３
３〜１２６を使用して配列決定した。内部プライマーを
また使用して１６００ｂｐ ＸｂａＩフラグメントを配
列決定した。この逆ＰＣＲ工程は、ｂｓｍＩＭ２及びｂ
ｓｍＩＲ遺伝子における約１４４０ｂｐの新規なＤＮＡ
配列を生じた。
【００２４】２つの逆ＰＣＲプライマー（２３４〜１６
７及び２３４〜１６８）を合成した。ｂｓｍＩゲノムＤ
ＮＡを、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｔＵ１、ＢｓｔＹ１，Ｃｌａ
Ｉ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｍｆｅ
Ｉ、ＭｌｕＩ、ＮｄｅＩ、ＮｓｐＩ、ＲｓａＩ、Ｓｓｐ
Ｉ、及びＸｂａＩで消化した。消化されたＤＮＡを精製
し、そして低い濃度で自己ライゲーションした。リガー
ゼを熱不活性化し、そしてライゲーションされたＤＮＡ
の一部分を逆ＰＣＲについての鋳型として使用した。Ｐ
ＣＲ産物が、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ、及びＴａｑＩ
鋳型において見出され、そして低融点アガロースゲルか
らゲル精製した。精製されたＤＮＡを、クローニング工
程を伴わずに、プライマー２３４〜１６７及び２３４〜
１６８を使用して直接的に配列決定した。この逆ＰＣＲ
工程は、ｂｓｍＩＲ遺伝子における約３００ｂｐの新規
なＤＮＡ配列を生じた。
７及び２３４〜１６８）を合成した。ｂｓｍＩゲノムＤ
ＮＡを、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｔＵ１、ＢｓｔＹ１，Ｃｌａ
Ｉ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｍｆｅ
Ｉ、ＭｌｕＩ、ＮｄｅＩ、ＮｓｐＩ、ＲｓａＩ、Ｓｓｐ
Ｉ、及びＸｂａＩで消化した。消化されたＤＮＡを精製
し、そして低い濃度で自己ライゲーションした。リガー
ゼを熱不活性化し、そしてライゲーションされたＤＮＡ
の一部分を逆ＰＣＲについての鋳型として使用した。Ｐ
ＣＲ産物が、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ、及びＴａｑＩ
鋳型において見出され、そして低融点アガロースゲルか
らゲル精製した。精製されたＤＮＡを、クローニング工
程を伴わずに、プライマー２３４〜１６７及び２３４〜
１６８を使用して直接的に配列決定した。この逆ＰＣＲ
工程は、ｂｓｍＩＲ遺伝子における約３００ｂｐの新規
なＤＮＡ配列を生じた。
【００２５】２つの逆ＰＣＲプライマー（２３８〜１７
９及び２３８〜１８０）を合成した。ｂｓｍＩゲノムＤ
ＮＡを、ＡｐｏＩ、ＢｇｌＩＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＲｓａＩ、及びＸｂａ
Ｉで消化した。消化されたＤＮＡを精製し、そして低い
濃度で自己ライゲーションした。リガーゼを熱不活性化
し、そしてライゲーションされたＤＮＡの一部分を逆Ｐ
ＣＲについての鋳型として使用した。ＰＣＲ産物は、Ｋ
ｐｎＩ及びＲｓａＩ鋳型において見出され、そして低融
点アガロースゲルからゲル精製した。精製されたＤＮＡ
をクローニング工程を伴わずにプライマー２３８〜１７
９、２３８〜１８０を使用して直接的に配列決定した。
この逆ＰＣＲ工程は、ｂｓｍＩＲ遺伝子における約５０
０ｂｐの新規なＤＮＡ配列を生じた。２０３１ｂｐのＯ
ＲＦが、ｂｓｍＩＭ２遺伝子の下流で見出され、そして
このＯＲＦは、ｂｓｍＩＲ遺伝子と命名された（図１、
４及び５）。
９及び２３８〜１８０）を合成した。ｂｓｍＩゲノムＤ
ＮＡを、ＡｐｏＩ、ＢｇｌＩＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＲｓａＩ、及びＸｂａ
Ｉで消化した。消化されたＤＮＡを精製し、そして低い
濃度で自己ライゲーションした。リガーゼを熱不活性化
し、そしてライゲーションされたＤＮＡの一部分を逆Ｐ
ＣＲについての鋳型として使用した。ＰＣＲ産物は、Ｋ
ｐｎＩ及びＲｓａＩ鋳型において見出され、そして低融
点アガロースゲルからゲル精製した。精製されたＤＮＡ
をクローニング工程を伴わずにプライマー２３８〜１７
９、２３８〜１８０を使用して直接的に配列決定した。
この逆ＰＣＲ工程は、ｂｓｍＩＲ遺伝子における約５０
０ｂｐの新規なＤＮＡ配列を生じた。２０３１ｂｐのＯ
ＲＦが、ｂｓｍＩＭ２遺伝子の下流で見出され、そして
このＯＲＦは、ｂｓｍＩＲ遺伝子と命名された（図１、
４及び５）。
【００２６】３．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｂｓｍＩＭ１及
びＭ２遺伝子の発現 ２つのプライマー（２３０〜２９及び２３０〜３２）
を、ｂｓｍＩＭ１遺伝子のＰＣＲ増幅のために合成し
た。ｂｓｍＩＭ１遺伝子をプライマー２３０〜２９及び
２３０〜３２を使用してＰＣＲによって増幅した。ＰＣ
Ｒ産物を精製し、そしてＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩで消化
した。ＰＣＲ ＤＮＡをスピンカラムを介して再度精製
し、そして適合性の末端を有するｐＢＲ３２２にライゲ
ーションした。ＥＲ２６８３コンピテントセルへの形質
転換後、ミニ調製物を作製し、そしてプラスミドＤＮＡ
をｂｓｍＩで試みた。１２個の単離物が、ｂｓｍＩ消化
に部分的に耐性であった。第２のペプチドが至適なＭ１
メチラーゼ活性に必要とされる可能性があった。２２８
ｂｐ（７５アミノ酸残基）の小さなＯＲＦがｂｓｍＩＭ
１とＭ２との間にあった。この７５アミノ酸ペプチド
は、至適なＭ１活性に寄与し得る。ｂｓｍＩＭ１は非対
称なｂｓｍＩ認識配列（５’ＧＡＡＴＧＣ ３’又は相
補的な鎖５’ＧＣＡＴＴＣ ３’）の一方の鎖のみをメ
チル化し得るので、第２のメチラーゼが他方の鎖をメチ
ル化するために必要とされ得る（下記のＭ２発現を参照
のこと）。
びＭ２遺伝子の発現 ２つのプライマー（２３０〜２９及び２３０〜３２）
を、ｂｓｍＩＭ１遺伝子のＰＣＲ増幅のために合成し
た。ｂｓｍＩＭ１遺伝子をプライマー２３０〜２９及び
２３０〜３２を使用してＰＣＲによって増幅した。ＰＣ
Ｒ産物を精製し、そしてＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩで消化
した。ＰＣＲ ＤＮＡをスピンカラムを介して再度精製
し、そして適合性の末端を有するｐＢＲ３２２にライゲ
ーションした。ＥＲ２６８３コンピテントセルへの形質
転換後、ミニ調製物を作製し、そしてプラスミドＤＮＡ
をｂｓｍＩで試みた。１２個の単離物が、ｂｓｍＩ消化
に部分的に耐性であった。第２のペプチドが至適なＭ１
メチラーゼ活性に必要とされる可能性があった。２２８
ｂｐ（７５アミノ酸残基）の小さなＯＲＦがｂｓｍＩＭ
１とＭ２との間にあった。この７５アミノ酸ペプチド
は、至適なＭ１活性に寄与し得る。ｂｓｍＩＭ１は非対
称なｂｓｍＩ認識配列（５’ＧＡＡＴＧＣ ３’又は相
補的な鎖５’ＧＣＡＴＴＣ ３’）の一方の鎖のみをメ
チル化し得るので、第２のメチラーゼが他方の鎖をメチ
ル化するために必要とされ得る（下記のＭ２発現を参照
のこと）。
【００２７】２つのプライマー（２４７〜３２２及び２
４７〜３２３）をｂｓｍＩＭ２遺伝子のＰＣＲ増幅のた
めに合成した。ｂｓｍＩＭ２遺伝子を、プライマー２４
７〜３２２及び２４７〜３２３を使用するＰＣＲによっ
て増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、そしてＳｐｈＩ及び
ＳａｌＩで一晩３７℃にて消化した。ＰＣＲ ＤＮＡを
再度精製し、そして適合性の末端を有するｐＢＲ３２２
にライゲーションした。１３個のプラスミドを調製し、
そしてｂｓｍＩで消化した。１つの単離物番号９のもの
は、ｂｓｍＩ消化に耐性であることが示された。ｂｓｍ
ＩＭ２遺伝子を含有するＳｐｈＩ−ＳａｌＩフラグメン
トを、低融点アガロースゲルからゲル精製した。精製さ
れたＭ２ ＤＮＡフラグメントを適合性の末端を有する
ｐＢＲ−ｂｓｍＭ１にライゲーションした。得られたプ
ラスミドはｐＢＲ−ｂｓｍＩＭ１及びＭ２であった。ｂ
ｓｍＩＭ１及びＭ２遺伝子の両方は、ＴｃＲプロモータ
ーの制御下にあり、及びＥ．ｃｏｌｉにおいて構成的に
発現される。プラスミドｐＢＲ−ｂｓｍＩＭ１及びＭ２
はｂｓｍＩ消化に完全に耐性であり、ＴｃＲプロモータ
ーからの十分な発現を示す。本発明に従って、２つのメ
チラーゼがｂｓｍＩ部位の完全な保護のために要求され
たことが決定された。
４７〜３２３）をｂｓｍＩＭ２遺伝子のＰＣＲ増幅のた
めに合成した。ｂｓｍＩＭ２遺伝子を、プライマー２４
７〜３２２及び２４７〜３２３を使用するＰＣＲによっ
て増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、そしてＳｐｈＩ及び
ＳａｌＩで一晩３７℃にて消化した。ＰＣＲ ＤＮＡを
再度精製し、そして適合性の末端を有するｐＢＲ３２２
にライゲーションした。１３個のプラスミドを調製し、
そしてｂｓｍＩで消化した。１つの単離物番号９のもの
は、ｂｓｍＩ消化に耐性であることが示された。ｂｓｍ
ＩＭ２遺伝子を含有するＳｐｈＩ−ＳａｌＩフラグメン
トを、低融点アガロースゲルからゲル精製した。精製さ
れたＭ２ ＤＮＡフラグメントを適合性の末端を有する
ｐＢＲ−ｂｓｍＭ１にライゲーションした。得られたプ
ラスミドはｐＢＲ−ｂｓｍＩＭ１及びＭ２であった。ｂ
ｓｍＩＭ１及びＭ２遺伝子の両方は、ＴｃＲプロモータ
ーの制御下にあり、及びＥ．ｃｏｌｉにおいて構成的に
発現される。プラスミドｐＢＲ−ｂｓｍＩＭ１及びＭ２
はｂｓｍＩ消化に完全に耐性であり、ＴｃＲプロモータ
ーからの十分な発現を示す。本発明に従って、２つのメ
チラーゼがｂｓｍＩ部位の完全な保護のために要求され
たことが決定された。
【００２８】４．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｂｓｍＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ（ｂｓｍＩＲ）遺伝子の発現 ２つのプライマー（２４１〜２１２及び２３５〜２９
３）を、ｂｓｍＩＲ遺伝子のＰＣＲ増幅のために合成し
た。ｂｓｍＩＲ遺伝子を２４１〜２１２及び２３５〜２
９３を使用するＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を
精製し、そしてＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで３７℃で一
晩、消化した。ＰＣＲ ＤＮＡを再度精製し、そして適
合性の末端を有する、低コピー数のＴ７発現ベクターｐ
ＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにライゲーションした。発現ベク
ターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒは、ｐＡＣＹＣ１８４に由
来し、及び細胞あたり５〜８コピーを有する。これは、
Ｔ７プロモーターの上流に４コピーのＥ．ｃｏｌｉ転写
ターミネーターを有する。転写ターミネーターはベクタ
ー上の潜在性Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターからのランオフ
転写を減少することが予測された。ｂｓｍＩＲ＋ｐＡＣ
ＹＣ−Ｔ７ｔｅｒのライゲーションされたＤＮＡを、ｂ
ｓｍＩメチラーゼで予め修飾された宿主ＥＲ２５６６
［ｐＢＲ−ｂｓｍＩＭ１＆Ｍ２］に形質転換した。３６
個のプラスミドミニ調製物を作製し、そして６個の単離
物は、エンドヌクレアーゼ遺伝子インサートを含むこと
が示された。１０ｍｌの細胞培養物を、ＩＰＴＧ誘導後
にこれらの６つの単離物について作製した。超音波処理
による細胞溶解後、細胞抽出物をｂｓｍＩエンドヌクレ
アーゼ活性についてアッセイした。２つの単離物（番号
１１及び番号３３）が完全なｂｓｍＩ活性を示した。３
つの単離物は部分的なｂｓｍＩ活性を示し、及び１つの
単離物は活性を有さず、おそらくｂｓｍＩＲ遺伝子にＰ
ＣＲによって導入された変異に起因する。ｂｓｍＩ発現
クローン番号１１を５００ｍｌ培養のために使用して、
湿潤細胞の１グラムあたりのｂｓｍＩ単位の数を決定し
た。組換えｂｓｍＩ収量は、湿潤細胞の１グラムあたり
２×１０６単位であることが決定された（活性アッセイ
について図６を参照のこと）。完全なｂｓｍＩＲ遺伝子
を配列決定して、番号１１が野生型ｂｓｍＩＲ遺伝子配
列を保有することを確認した。
ンドヌクレアーゼ（ｂｓｍＩＲ）遺伝子の発現 ２つのプライマー（２４１〜２１２及び２３５〜２９
３）を、ｂｓｍＩＲ遺伝子のＰＣＲ増幅のために合成し
た。ｂｓｍＩＲ遺伝子を２４１〜２１２及び２３５〜２
９３を使用するＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を
精製し、そしてＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで３７℃で一
晩、消化した。ＰＣＲ ＤＮＡを再度精製し、そして適
合性の末端を有する、低コピー数のＴ７発現ベクターｐ
ＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにライゲーションした。発現ベク
ターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒは、ｐＡＣＹＣ１８４に由
来し、及び細胞あたり５〜８コピーを有する。これは、
Ｔ７プロモーターの上流に４コピーのＥ．ｃｏｌｉ転写
ターミネーターを有する。転写ターミネーターはベクタ
ー上の潜在性Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターからのランオフ
転写を減少することが予測された。ｂｓｍＩＲ＋ｐＡＣ
ＹＣ−Ｔ７ｔｅｒのライゲーションされたＤＮＡを、ｂ
ｓｍＩメチラーゼで予め修飾された宿主ＥＲ２５６６
［ｐＢＲ−ｂｓｍＩＭ１＆Ｍ２］に形質転換した。３６
個のプラスミドミニ調製物を作製し、そして６個の単離
物は、エンドヌクレアーゼ遺伝子インサートを含むこと
が示された。１０ｍｌの細胞培養物を、ＩＰＴＧ誘導後
にこれらの６つの単離物について作製した。超音波処理
による細胞溶解後、細胞抽出物をｂｓｍＩエンドヌクレ
アーゼ活性についてアッセイした。２つの単離物（番号
１１及び番号３３）が完全なｂｓｍＩ活性を示した。３
つの単離物は部分的なｂｓｍＩ活性を示し、及び１つの
単離物は活性を有さず、おそらくｂｓｍＩＲ遺伝子にＰ
ＣＲによって導入された変異に起因する。ｂｓｍＩ発現
クローン番号１１を５００ｍｌ培養のために使用して、
湿潤細胞の１グラムあたりのｂｓｍＩ単位の数を決定し
た。組換えｂｓｍＩ収量は、湿潤細胞の１グラムあたり
２×１０６単位であることが決定された（活性アッセイ
について図６を参照のこと）。完全なｂｓｍＩＲ遺伝子
を配列決定して、番号１１が野生型ｂｓｍＩＲ遺伝子配
列を保有することを確認した。
【００２９】５．ｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼの部
分精製 ｂｓｍＩエンドヌクレアーゼが熱安定性酵素であるの
で、ｂｓｍＩを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞抽出物を６５
℃で３０分間加熱し、そして変性されたタンパク質を遠
心分離によって除去した。可溶性タンパク質をヘパリン
セファロースカラム上にロードした。カラムを低塩緩衝
液で徹底的に洗浄した。タンパク質を５０ｍＭ〜１Ｍ
ＮａＣｌの塩勾配で溶出した。ｂｓｍＩ活性を各画分に
ついてアッセイした。最も活性な画分をまた、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ上で分析した（図７）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で
のｂｓｍＩエンドヌクレアーゼの観察された分子量は、
７７．９ｋＤａであり、７８．１ｋＤａの予測される分
子量と密接に一致する。
分精製 ｂｓｍＩエンドヌクレアーゼが熱安定性酵素であるの
で、ｂｓｍＩを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞抽出物を６５
℃で３０分間加熱し、そして変性されたタンパク質を遠
心分離によって除去した。可溶性タンパク質をヘパリン
セファロースカラム上にロードした。カラムを低塩緩衝
液で徹底的に洗浄した。タンパク質を５０ｍＭ〜１Ｍ
ＮａＣｌの塩勾配で溶出した。ｂｓｍＩ活性を各画分に
ついてアッセイした。最も活性な画分をまた、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ上で分析した（図７）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で
のｂｓｍＩエンドヌクレアーゼの観察された分子量は、
７７．９ｋＤａであり、７８．１ｋＤａの予測される分
子量と密接に一致する。
【００３０】６．ｂｓｍＩエンドヌクレアーゼの長い形
態の発現 ｂｓｍＩＲ遺伝子の開始コドンの上流に２つのインフレ
ームコドン（ＡＴＧ及びＣＡＧ）がある。これらの２つ
のコドンは、アミノ酸残基Ｍ（Ｍｅｔ）及びＱ（Ｇｌ
ｎ）をコードする。通常のｂｓｍＩエンドヌクレアーゼ
は６７６アミノ酸長である。ｂｓｍＩエンドヌクレアー
ゼの長い形態は、６７８アミノ酸長である。ｂｓｍＩエ
ンドヌクレアーゼの長い形態を発現するために、２つの
プライマー（２４４〜１８６及び２３５〜２９３）をｂ
ｓｍＩＲ遺伝子（長い形態）のＰＣＲ増幅のために合成
した。ｂｓｍＩＲ遺伝子（長い形態）を２４４〜１８６
及び２３５〜２９３を使用するＰＣＲによって増幅し
た。ＰＣＲ産物を精製し、そしてＮｄｅＩ及びＢａｍＨ
Ｉで一晩３７℃にて増幅した。ＰＣＲ ＤＮＡを再度精
製し、そして適合性の末端を有する低コピー数のＴ７発
現ベクターのｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにライゲーション
した。ｂｓｍＩＲ（長い形態）＋ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅ
ｒのライゲーションされたＤＮＡをｂｓｍＩメチラーゼ
で予め修飾された宿主ＥＲ２５６６［ｐＢＲ−ｂｓｍＩ
Ｍ１＆Ｍ２］に形質転換した。１つの単離物（番号４）
は、エンドヌクレアーゼ遺伝子（長い形態）インサート
を含むことが示された。１０ｍｌの細胞培養物を、単離
物について作製し、そしてＩＰＴＧで誘導し、そして細
胞抽出物をｂｓｍＩエンドヌクレアーゼ活性についてア
ッセイする。番号４細胞抽出物は、完全なｂｓｍＩ活性
を示した。２つのさらなるアミノ酸残基を有するｂｓｍ
Ｉエンドヌクレアーゼの長い形態はまた、ＤＮＡ切断に
おいて活性であったことが決定された。
態の発現 ｂｓｍＩＲ遺伝子の開始コドンの上流に２つのインフレ
ームコドン（ＡＴＧ及びＣＡＧ）がある。これらの２つ
のコドンは、アミノ酸残基Ｍ（Ｍｅｔ）及びＱ（Ｇｌ
ｎ）をコードする。通常のｂｓｍＩエンドヌクレアーゼ
は６７６アミノ酸長である。ｂｓｍＩエンドヌクレアー
ゼの長い形態は、６７８アミノ酸長である。ｂｓｍＩエ
ンドヌクレアーゼの長い形態を発現するために、２つの
プライマー（２４４〜１８６及び２３５〜２９３）をｂ
ｓｍＩＲ遺伝子（長い形態）のＰＣＲ増幅のために合成
した。ｂｓｍＩＲ遺伝子（長い形態）を２４４〜１８６
及び２３５〜２９３を使用するＰＣＲによって増幅し
た。ＰＣＲ産物を精製し、そしてＮｄｅＩ及びＢａｍＨ
Ｉで一晩３７℃にて増幅した。ＰＣＲ ＤＮＡを再度精
製し、そして適合性の末端を有する低コピー数のＴ７発
現ベクターのｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにライゲーション
した。ｂｓｍＩＲ（長い形態）＋ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅ
ｒのライゲーションされたＤＮＡをｂｓｍＩメチラーゼ
で予め修飾された宿主ＥＲ２５６６［ｐＢＲ−ｂｓｍＩ
Ｍ１＆Ｍ２］に形質転換した。１つの単離物（番号４）
は、エンドヌクレアーゼ遺伝子（長い形態）インサート
を含むことが示された。１０ｍｌの細胞培養物を、単離
物について作製し、そしてＩＰＴＧで誘導し、そして細
胞抽出物をｂｓｍＩエンドヌクレアーゼ活性についてア
ッセイする。番号４細胞抽出物は、完全なｂｓｍＩ活性
を示した。２つのさらなるアミノ酸残基を有するｂｓｍ
Ｉエンドヌクレアーゼの長い形態はまた、ＤＮＡ切断に
おいて活性であったことが決定された。
【００３１】本発明は以下の実施例によってさらに説明
される。これらの実施例は本発明を理解することを助け
るために提供され、本発明の制限として解釈されるもの
ではない。
される。これらの実施例は本発明を理解することを助け
るために提供され、本発明の制限として解釈されるもの
ではない。
【００３２】上記及び下記に引用される参考文献は、本
明細書中に参考として組み込まれている。
明細書中に参考として組み込まれている。
【００３３】
【実施例】実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｂｓｍＩ制
限-修飾系のクローニング １．ｂｓｍＩゲノムＤＮＡライブラリーの構築及びｂｓ
ｍＩＭ１遺伝子のクローニング。 ゲノムＤＮＡを、以下の工程からなる標準的な手順によ
って、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ ＮＵＢ３６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ 番号３２８）か
ら調製した： （ａ）リゾチーム（２ｍｇ／ｍｌ最終）、スクロース
（１％最終）、及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
８．０の添加による細胞溶解； （ｂ）１０％ ＳＤＳ（最終濃度０．１％）の添加によ
る細胞溶解； （ｃ）１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び６２ｍＭ
ＥＤＴＡ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の添
加による細胞溶解； （ｄ）３回のＤＮＡのフェノール−ＣＨＣｌ３抽出（等
容量）及び１回のＣＨＣｌ３抽出； （ｅ）４リットルのＴＥ緩衝液中でのＤＮＡ透析、３回
の交換；及び （ｆ）ＲＮＡをＲＮＡ分解酵素処理によって除去し、そ
してゲノムＤＮＡをエタノール中に沈殿して、ＴＥ緩衝
液中に再浮遊した。
限-修飾系のクローニング １．ｂｓｍＩゲノムＤＮＡライブラリーの構築及びｂｓ
ｍＩＭ１遺伝子のクローニング。 ゲノムＤＮＡを、以下の工程からなる標準的な手順によ
って、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ ＮＵＢ３６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ 番号３２８）か
ら調製した： （ａ）リゾチーム（２ｍｇ／ｍｌ最終）、スクロース
（１％最終）、及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
８．０の添加による細胞溶解； （ｂ）１０％ ＳＤＳ（最終濃度０．１％）の添加によ
る細胞溶解； （ｃ）１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び６２ｍＭ
ＥＤＴＡ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の添
加による細胞溶解； （ｄ）３回のＤＮＡのフェノール−ＣＨＣｌ３抽出（等
容量）及び１回のＣＨＣｌ３抽出； （ｅ）４リットルのＴＥ緩衝液中でのＤＮＡ透析、３回
の交換；及び （ｆ）ＲＮＡをＲＮＡ分解酵素処理によって除去し、そ
してゲノムＤＮＡをエタノール中に沈殿して、ＴＥ緩衝
液中に再浮遊した。
【００３４】１０μｇのゲノムＤＮＡを、それぞれ、Ａ
ａｔＩＩ、ＢｓｐＥＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎ
ｄｅＩ、及びＥｃｏＲＩで２時間３７℃で消化した。ベ
クタープラスミドｐＢＲ３２２をまた、それぞれ、Ａａ
ｔＩＩ、ＢｓｐＥＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｄ
ｅＩ、及びＥｃｏＲＩで消化し、そして１時間３７℃に
てＣＩＰでさらに処理した。ベクター及びゲノムＤＮＡ
サンプルをＱｉａｇｅｎスピンカラムを介して精製し
た。消化されたゲノムＤＮＡを適合性の末端を有するｐ
ＢＲ３２２にライゲーションし、そして１６℃で一晩イ
ンキュベートした。一晩のライゲーション後、ＤＮＡを
滴下透析によってニトロセルロースメンブレンに対して
４Ｌの蒸留水中で透析した。次いで、ＲＲＩコンピテン
トセルをエレクトロポレーションによってトランスファ
ーした。１０４ＡｐＲを超えるコロニーをＡａｔＩＩ、
ＢｓｐＥＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｄｅＩ、及
びＥｃｏＲＩライブラリーからプールし、そして細胞を
２リットルのＬＢ＋Ａｐ中で一晩増殖した。プラスミド
ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐカラムによ
って一晩細胞から調製した。０．２、０．４、０．８、
１．６、３．２μｇのライブラリーＤＮＡを、ｂｓｍＩ
（２５単位）で一晩消化し、そして課題のＤＮＡをＥＲ
２６８３コンピテントセル（メチル化依存性制限マイナ
ス株、ＭｃｒＢＣ−、Ｍｒｒ−、ＭｃｒＡ−）を形質転
換するために使用した。生存する形質転換体をＡｐプレ
ート上に３７℃で一晩プレートした。合計５４個のプラ
スミドミニ調製物を作製し、そしてｂｓｍＩで消化し
て、それらがｂｓｍＩ消化に耐性であるか否かを確認し
た。５４個のクローンのうちの２つのプラスミド（番号
２２及び５４）がｂｓｍＩ消化に部分的に耐性であり、
ｂｓｍＩＭ遺伝子がクローン化され、及びＥ．ｃｏｌｉ
において妥当なレベルで発現されたことを示す。番号５
４プラスミドＤＮＡを含有する１０ｍｌの細胞を一晩培
養し、そして、細胞抽出物を調製してＬａｍｂｄａ Ｄ
ＮＡにおけるｂｓｍＩ活性をアッセイするために使用し
た。明白なｂｓｍＩ活性は細胞抽出物において何も検出
されなかった。ｂｓｍＩＲ遺伝子がおそらくメチラーゼ
ポジティブクローン（番号５４）に不在であったか、も
しくはｂｓｍＩＲ遺伝子の小さな部分のみしか存在なか
ったか、又はｂｓｍＩＲ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉにおいて
十分に発現されなかったことが結論付けられた（後に、
このＭ＋クローンにおいてｂｓｍＩＲ遺伝子が何も存在
しなかったことが実証された、以下のｂｓｍＩＲ遺伝子
のクローニング及び発現の節を参照のこと）。
ａｔＩＩ、ＢｓｐＥＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎ
ｄｅＩ、及びＥｃｏＲＩで２時間３７℃で消化した。ベ
クタープラスミドｐＢＲ３２２をまた、それぞれ、Ａａ
ｔＩＩ、ＢｓｐＥＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｄ
ｅＩ、及びＥｃｏＲＩで消化し、そして１時間３７℃に
てＣＩＰでさらに処理した。ベクター及びゲノムＤＮＡ
サンプルをＱｉａｇｅｎスピンカラムを介して精製し
た。消化されたゲノムＤＮＡを適合性の末端を有するｐ
ＢＲ３２２にライゲーションし、そして１６℃で一晩イ
ンキュベートした。一晩のライゲーション後、ＤＮＡを
滴下透析によってニトロセルロースメンブレンに対して
４Ｌの蒸留水中で透析した。次いで、ＲＲＩコンピテン
トセルをエレクトロポレーションによってトランスファ
ーした。１０４ＡｐＲを超えるコロニーをＡａｔＩＩ、
ＢｓｐＥＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｄｅＩ、及
びＥｃｏＲＩライブラリーからプールし、そして細胞を
２リットルのＬＢ＋Ａｐ中で一晩増殖した。プラスミド
ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐカラムによ
って一晩細胞から調製した。０．２、０．４、０．８、
１．６、３．２μｇのライブラリーＤＮＡを、ｂｓｍＩ
（２５単位）で一晩消化し、そして課題のＤＮＡをＥＲ
２６８３コンピテントセル（メチル化依存性制限マイナ
ス株、ＭｃｒＢＣ−、Ｍｒｒ−、ＭｃｒＡ−）を形質転
換するために使用した。生存する形質転換体をＡｐプレ
ート上に３７℃で一晩プレートした。合計５４個のプラ
スミドミニ調製物を作製し、そしてｂｓｍＩで消化し
て、それらがｂｓｍＩ消化に耐性であるか否かを確認し
た。５４個のクローンのうちの２つのプラスミド（番号
２２及び５４）がｂｓｍＩ消化に部分的に耐性であり、
ｂｓｍＩＭ遺伝子がクローン化され、及びＥ．ｃｏｌｉ
において妥当なレベルで発現されたことを示す。番号５
４プラスミドＤＮＡを含有する１０ｍｌの細胞を一晩培
養し、そして、細胞抽出物を調製してＬａｍｂｄａ Ｄ
ＮＡにおけるｂｓｍＩ活性をアッセイするために使用し
た。明白なｂｓｍＩ活性は細胞抽出物において何も検出
されなかった。ｂｓｍＩＲ遺伝子がおそらくメチラーゼ
ポジティブクローン（番号５４）に不在であったか、も
しくはｂｓｍＩＲ遺伝子の小さな部分のみしか存在なか
ったか、又はｂｓｍＩＲ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉにおいて
十分に発現されなかったことが結論付けられた（後に、
このＭ＋クローンにおいてｂｓｍＩＲ遺伝子が何も存在
しなかったことが実証された、以下のｂｓｍＩＲ遺伝子
のクローニング及び発現の節を参照のこと）。
【００３５】Ｍ＋クローン番号５４におけるＤＮＡイン
サートを、ＡｐｏＩ、ＮｄｅＩ、及びＰｖｕＩＩで消化
し、そしてＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１９にサブクロ
ーン化した。次いで挿入されたフラグメントをｐＵＣ１
９ユニバーサルプライマー及び逆方向プライマーを使用
して配列決定した。インサートの残りをプライマーウォ
ーキングによって配列決定した。クローンは、ＮｄｅＩ
部位において終結し、及び完全なｂｓｍＩＭＩ遺伝子及
びｂｓｍＩＭ２遺伝子の小さな部分（１３１ｂｐ）を含
んだ。ｂｓｍＩＭ１及びｂｓｍＩＭ２遺伝子の左側に、
ＤＮＡ分配化タンパク質（ＰａｒＡファミリー）に３０
％のアミノ酸配列同一性を示す１つのＯＲＦがある。制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子は通常、メチラーゼ遺伝子
の近傍に位置されるので、ｂｓｍＩエンドヌクレアーゼ
遺伝子（ｂｓｍＩＲ）はおそらく、ｂｓｍＩＭ１及びｂ
ｓｍＩＭ２遺伝子の右側に位置されることが結論付けら
れる（図１）。逆ＰＣＲ及びＰＣＲによって、残りのＭ
２遺伝子及び完全なｂｓｍＩＲ遺伝子をクローン化する
ための試みがなされた。
サートを、ＡｐｏＩ、ＮｄｅＩ、及びＰｖｕＩＩで消化
し、そしてＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１９にサブクロ
ーン化した。次いで挿入されたフラグメントをｐＵＣ１
９ユニバーサルプライマー及び逆方向プライマーを使用
して配列決定した。インサートの残りをプライマーウォ
ーキングによって配列決定した。クローンは、ＮｄｅＩ
部位において終結し、及び完全なｂｓｍＩＭＩ遺伝子及
びｂｓｍＩＭ２遺伝子の小さな部分（１３１ｂｐ）を含
んだ。ｂｓｍＩＭ１及びｂｓｍＩＭ２遺伝子の左側に、
ＤＮＡ分配化タンパク質（ＰａｒＡファミリー）に３０
％のアミノ酸配列同一性を示す１つのＯＲＦがある。制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子は通常、メチラーゼ遺伝子
の近傍に位置されるので、ｂｓｍＩエンドヌクレアーゼ
遺伝子（ｂｓｍＩＲ）はおそらく、ｂｓｍＩＭ１及びｂ
ｓｍＩＭ２遺伝子の右側に位置されることが結論付けら
れる（図１）。逆ＰＣＲ及びＰＣＲによって、残りのＭ
２遺伝子及び完全なｂｓｍＩＲ遺伝子をクローン化する
ための試みがなされた。
【００３６】２．逆ＰＣＲ及びＰＣＲによるｂｓｍＩＭ
２及びｂｓｍＩＲ遺伝子のクローニング。 以下の逆ＰＣＲプライマーを合成した。 ５’ｔａｔｃｇｔａａｔａｔｔｃｃｔｔｇｔｔａａｔｔ
ｔ３’（２３０〜１１９）（配列番号７） ５’ｃｔｔａａａｃｇｔａｔａｇａａｔｃｔａｃｔｃａ
ｇ３’（２２９〜１５９）（配列番号８）
２及びｂｓｍＩＲ遺伝子のクローニング。 以下の逆ＰＣＲプライマーを合成した。 ５’ｔａｔｃｇｔａａｔａｔｔｃｃｔｔｇｔｔａａｔｔ
ｔ３’（２３０〜１１９）（配列番号７） ５’ｃｔｔａａａｃｇｔａｔａｇａａｔｃｔａｃｔｃａ
ｇ３’（２２９〜１５９）（配列番号８）
【００３７】ｂｓｍＩゲノムＤＮＡを、ＢｓａＷＩ、Ｂ
ｓｐＨＩ，ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｆｅＩ、Ｎ
ｌａＩＩＩ、ＮｓｐＩ、ＳｓｐＩ、及びＴａｑＩで消化
した。消化されたＤＮＡをＱｉａｇｅｎミニプレップス
ピンカラムを介して精製し、そして低い濃度（２μｇ／
ｍｌ最終）で自己ライゲーションした。リガーゼを６５
℃で３０分間、熱不活性化し、そしてライゲーションさ
れたＤＮＡの一部分（２０〜４０ｎｇ）を逆ＰＣＲの鋳
型として使用した。逆ＰＣＲ条件は、９５℃１分間、５
５℃１分間、及び７２℃１分間を３５サイクル、５単位
のＴａｑ＋Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ
（５０：１の比率）であった。ＰＣＲ産物は、ＢｓａＷ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＭｆｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、及びＴａｑ
Ｉ鋳型において見出され、そして低融点アガロースゲル
からゲル精製した。精製されたＤＮＡを、クローニング
工程を伴わないで、プライマー２３０〜１１９及び２２
９〜１５９を使用して直接的に配列決定した。
ｓｐＨＩ，ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｆｅＩ、Ｎ
ｌａＩＩＩ、ＮｓｐＩ、ＳｓｐＩ、及びＴａｑＩで消化
した。消化されたＤＮＡをＱｉａｇｅｎミニプレップス
ピンカラムを介して精製し、そして低い濃度（２μｇ／
ｍｌ最終）で自己ライゲーションした。リガーゼを６５
℃で３０分間、熱不活性化し、そしてライゲーションさ
れたＤＮＡの一部分（２０〜４０ｎｇ）を逆ＰＣＲの鋳
型として使用した。逆ＰＣＲ条件は、９５℃１分間、５
５℃１分間、及び７２℃１分間を３５サイクル、５単位
のＴａｑ＋Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ
（５０：１の比率）であった。ＰＣＲ産物は、ＢｓａＷ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＭｆｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、及びＴａｑ
Ｉ鋳型において見出され、そして低融点アガロースゲル
からゲル精製した。精製されたＤＮＡを、クローニング
工程を伴わないで、プライマー２３０〜１１９及び２２
９〜１５９を使用して直接的に配列決定した。
【００３８】逆ＰＣＲ工程は、ｂｓｍＩＭ２遺伝子にお
いて約５４０ｂｐの新規なＤＮＡ配列を生じた。
いて約５４０ｂｐの新規なＤＮＡ配列を生じた。
【００３９】以下の逆ＰＣＲプライマーを合成した。 ５’ｃｔａｇａｔｃｃｔｃｃｇｔａｃｔｔｔａａｔａｃ
ｇ３’（２３２〜１８８）（配列番号９） ５’ａａｔｔｇｔｃｃｃａｔａｇｔａｔｃｔｔｃｃａｃ
ｇ３’（２３２〜１８９）（配列番号１０）
ｇ３’（２３２〜１８８）（配列番号９） ５’ａａｔｔｇｔｃｃｃａｔａｇｔａｔｃｔｔｃｃａｃ
ｇ３’（２３２〜１８９）（配列番号１０）
【００４０】ｂｓｍＩゲノムＤＮＡをＢｓｔＵＩ、Ｂｓ
ｔＹＩ、ＣｌａＩ、ＤｒａＩ、ＮｄｅＩ、ＲｓａＩ、及
びＸｂａＩで消化した。消化されたＤＮＡをＱｉａｇｅ
ｎミニプレップスピンカラムを介して精製し、そして低
い濃度（２μｇ／ｍｌ最終）で自己ライゲーションし
た。リガーゼを６５℃で３０分間、熱不活性化し、そし
てライゲーションされたＤＮＡの一部分（２０〜４０ｎ
ｇ）を逆ＰＣＲの鋳型として使用した。逆ＰＣＲ条件
は、９５℃１分間、５５℃１分間、及び７２℃１分間を
３５サイクルであった。ＰＣＲ産物は、ＤｒａＩ及びＲ
ｓａＩ鋳型において見出され、そして低融点アガロース
ゲルからゲル精製した。精製されたＤＮＡを、クローニ
ング工程を伴わないで、プライマー２３２〜１８８及び
２３２〜１８９を使用して直接的に配列決定した。この
逆ＰＣＲ工程はｂｓｍＩＭ２遺伝子において約１２０ｂ
ｐの新規なＤＮＡ配列を生じた。
ｔＹＩ、ＣｌａＩ、ＤｒａＩ、ＮｄｅＩ、ＲｓａＩ、及
びＸｂａＩで消化した。消化されたＤＮＡをＱｉａｇｅ
ｎミニプレップスピンカラムを介して精製し、そして低
い濃度（２μｇ／ｍｌ最終）で自己ライゲーションし
た。リガーゼを６５℃で３０分間、熱不活性化し、そし
てライゲーションされたＤＮＡの一部分（２０〜４０ｎ
ｇ）を逆ＰＣＲの鋳型として使用した。逆ＰＣＲ条件
は、９５℃１分間、５５℃１分間、及び７２℃１分間を
３５サイクルであった。ＰＣＲ産物は、ＤｒａＩ及びＲ
ｓａＩ鋳型において見出され、そして低融点アガロース
ゲルからゲル精製した。精製されたＤＮＡを、クローニ
ング工程を伴わないで、プライマー２３２〜１８８及び
２３２〜１８９を使用して直接的に配列決定した。この
逆ＰＣＲ工程はｂｓｍＩＭ２遺伝子において約１２０ｂ
ｐの新規なＤＮＡ配列を生じた。
【００４１】以下の逆ＰＣＲプライマーを合成した。 ５’ｃｔｔｔｃｇａｔｇｇｔａａａｃｇａｇａａｇａｔ
ｇ３’（２３３〜１２５）（配列番号１１） ５’ａｔｔｔｔａｔｔｃｃｔｃｔｇｇａｇｔｔｔａｇｃ
ｇ３’（２３３〜１２６）（配列番号１２）
ｇ３’（２３３〜１２５）（配列番号１１） ５’ａｔｔｔｔａｔｔｃｃｔｃｔｇｇａｇｔｔｔａｇｃ
ｇ３’（２３３〜１２６）（配列番号１２）
【００４２】ｂｓｍＩゲノムＤＮＡを、ＢｓｐＨＩ、Ｂ
ｓｔＵＩ、ＢｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＮｄｅＩ、
ＮｓｐＩ、ＲｓａＩ、ＳｓｐＩ、及びＸｂａＩで消化し
た。消化されたＤＮＡをＱｉａｇｅｎミニプレップスピ
ンカラムを介して精製し、そして低い濃度（２μｇ／ｍ
ｌ最終）で自己ライゲーションした。Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを６５℃で３０分間、熱不活性化し、そしてライゲー
ションされたＤＮＡの一部分（２０〜４０ｎｇ）を逆Ｐ
ＣＲの鋳型として使用した。逆ＰＣＲ条件は、９５℃１
分間、５５℃１分間、及び７２℃１分間を３５サイク
ル、５単位のＴａｑ＋Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリ
メラーゼ（５０：１の比率）であった。ＰＣＲ産物は、
ＣｌａＩ、ＲｓａＩ、ＳｓｐＩ、及びＸｂａＩ鋳型にお
いて見出され、そして低融点アガロースゲルからゲル精
製した。精製されたＤＮＡを、クローニング工程を伴わ
ないで、プライマー２３３〜１２５及び２３３〜１２６
を使用して直接的に配列決定した。内部プライマーをま
た使用して、１６００ｂｐのＸｂａＩフラグメントを配
列決定した。この逆ＰＣＲ工程は、ｂｓｍＩＭ２及びｂ
ｓｍＩＲ遺伝子において約１４４０ｂｐの新規なＤＮＡ
配列を生じた。
ｓｔＵＩ、ＢｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＮｄｅＩ、
ＮｓｐＩ、ＲｓａＩ、ＳｓｐＩ、及びＸｂａＩで消化し
た。消化されたＤＮＡをＱｉａｇｅｎミニプレップスピ
ンカラムを介して精製し、そして低い濃度（２μｇ／ｍ
ｌ最終）で自己ライゲーションした。Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを６５℃で３０分間、熱不活性化し、そしてライゲー
ションされたＤＮＡの一部分（２０〜４０ｎｇ）を逆Ｐ
ＣＲの鋳型として使用した。逆ＰＣＲ条件は、９５℃１
分間、５５℃１分間、及び７２℃１分間を３５サイク
ル、５単位のＴａｑ＋Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリ
メラーゼ（５０：１の比率）であった。ＰＣＲ産物は、
ＣｌａＩ、ＲｓａＩ、ＳｓｐＩ、及びＸｂａＩ鋳型にお
いて見出され、そして低融点アガロースゲルからゲル精
製した。精製されたＤＮＡを、クローニング工程を伴わ
ないで、プライマー２３３〜１２５及び２３３〜１２６
を使用して直接的に配列決定した。内部プライマーをま
た使用して、１６００ｂｐのＸｂａＩフラグメントを配
列決定した。この逆ＰＣＲ工程は、ｂｓｍＩＭ２及びｂ
ｓｍＩＲ遺伝子において約１４４０ｂｐの新規なＤＮＡ
配列を生じた。
【００４３】以下の逆ＰＣＲプライマーを合成した。 ５’ａｔｇｔｇａａｇｔｔａｔｔａｔｃａｔｔｔｔｔｔ
ｇ３’（２３４〜１６７）（配列番号１３） ５’ｔｔｃａｇａａｔｇｇｇａｇａｇｔａｔｃｔａｃａ
ａ３’（２３４〜１６８）（配列番号１４）
ｇ３’（２３４〜１６７）（配列番号１３） ５’ｔｔｃａｇａａｔｇｇｇａｇａｇｔａｔｃｔａｃａ
ａ３’（２３４〜１６８）（配列番号１４）
【００４４】ｂｓｍＩゲノムＤＮＡを、ＢｓｐＨＩ、Ｂ
ｓｔＵＩ、ＢｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＮｄｅＩ、
ＮｓｐＩ、ＲｓａＩ、ＳｓｐＩ、及びＸｂａＩで消化し
た。消化されたＤＮＡをＱｉａｇｅｎミニプレップスピ
ンカラムを介して精製し、そして低い濃度（２μｇ／ｍ
ｌ最終）で自己ライゲーションした。リガーゼを６５℃
で３０分間、熱不活性化し、そしてライゲーションされ
たＤＮＡの一部分（２０〜４０ｎｇ）を逆ＰＣＲの鋳型
として使用した。逆ＰＣＲ条件は、９５℃１分間、５５
℃１分間、及び７２℃１分間を３５サイクル、５単位の
Ｔａｑ＋Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（５０：１の比
率）であった。ＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓｓｐ
Ｉ、及びＴａｑＩ鋳型において見出され、そして低融点
アガロースゲルからゲル精製した。精製されたＤＮＡ
を、クローニング工程を伴わないで、プライマー２３４
〜１６７及び２３４〜１６８を使用して直接的に配列決
定した。この逆ＰＣＲ工程は、ｂｓｍＩＲ遺伝子におい
て約３００ｂｐの新規なＤＮＡ配列を生じた。
ｓｔＵＩ、ＢｓｔＹＩ、ＣｌａＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＮｄｅＩ、
ＮｓｐＩ、ＲｓａＩ、ＳｓｐＩ、及びＸｂａＩで消化し
た。消化されたＤＮＡをＱｉａｇｅｎミニプレップスピ
ンカラムを介して精製し、そして低い濃度（２μｇ／ｍ
ｌ最終）で自己ライゲーションした。リガーゼを６５℃
で３０分間、熱不活性化し、そしてライゲーションされ
たＤＮＡの一部分（２０〜４０ｎｇ）を逆ＰＣＲの鋳型
として使用した。逆ＰＣＲ条件は、９５℃１分間、５５
℃１分間、及び７２℃１分間を３５サイクル、５単位の
Ｔａｑ＋Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（５０：１の比
率）であった。ＰＣＲ産物は、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓｓｐ
Ｉ、及びＴａｑＩ鋳型において見出され、そして低融点
アガロースゲルからゲル精製した。精製されたＤＮＡ
を、クローニング工程を伴わないで、プライマー２３４
〜１６７及び２３４〜１６８を使用して直接的に配列決
定した。この逆ＰＣＲ工程は、ｂｓｍＩＲ遺伝子におい
て約３００ｂｐの新規なＤＮＡ配列を生じた。
【００４５】以下の逆ＰＣＲプライマーを合成した。 ５’ｇａａａｃｔｃｃａｇａｔｇｔａａｔａａｔｔａｃ
ｃ３’（２３８〜１７９）（配列番号１５） ５’ｔａｃａａａａａａｃｔｔｃｃｔｔｔｔｔｇａｃｔ
ｔ３’（２３８〜１８０）（配列番号１６）
ｃ３’（２３８〜１７９）（配列番号１５） ５’ｔａｃａａａａａａｃｔｔｃｃｔｔｔｔｔｇａｃｔ
ｔ３’（２３８〜１８０）（配列番号１６）
【００４６】ｂｓｍＩゲノムＤＮＡを、ＡｐｏＩ、Ｂｇ
ｌＩＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｋｐ
ｎＩ，ＲｓａＩ、及びＸｂａＩで消化した。消化された
ＤＮＡをＱｉａｇｅｎミニプレップスピンカラムを介し
て精製し、そして低い濃度（２μｇ／ｍｌ最終）で自己
ライゲーションした。リガーゼを６５℃で３０分間、熱
不活性化し、そしてライゲーションされたＤＮＡの一部
分（２０〜４０ｎｇ）を逆ＰＣＲの鋳型として使用し
た。逆ＰＣＲ条件は、９５℃１分間、５５℃１分間、及
び７２℃１分間を３５サイクル、５単位のＴａｑ＋Ｖｅ
ｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（５０：１の比
率）であった。ＰＣＲ産物は、ＫｐｎＩ及びＲｓａＩ鋳
型において見出され、そして低融点アガロースゲルから
ゲル精製した。精製されたＤＮＡを、クローニング工程
を伴わないで、プライマー２３８〜１７９及び２３８〜
１８０を使用して直接的に配列決定した。この逆ＰＣＲ
工程は、ｂｓｍＩＲ遺伝子において約５００ｂｐの新規
なＤＮＡ配列を生じた。２０３１ｂｐのＯＲＦが、ｂｓ
ｍＩＭ２遺伝子の下流に見出され、及びこのＯＲＦはｂ
ｓｍＩＲ遺伝子と命名された（図１、４及び５）。
ｌＩＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｋｐ
ｎＩ，ＲｓａＩ、及びＸｂａＩで消化した。消化された
ＤＮＡをＱｉａｇｅｎミニプレップスピンカラムを介し
て精製し、そして低い濃度（２μｇ／ｍｌ最終）で自己
ライゲーションした。リガーゼを６５℃で３０分間、熱
不活性化し、そしてライゲーションされたＤＮＡの一部
分（２０〜４０ｎｇ）を逆ＰＣＲの鋳型として使用し
た。逆ＰＣＲ条件は、９５℃１分間、５５℃１分間、及
び７２℃１分間を３５サイクル、５単位のＴａｑ＋Ｖｅ
ｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（５０：１の比
率）であった。ＰＣＲ産物は、ＫｐｎＩ及びＲｓａＩ鋳
型において見出され、そして低融点アガロースゲルから
ゲル精製した。精製されたＤＮＡを、クローニング工程
を伴わないで、プライマー２３８〜１７９及び２３８〜
１８０を使用して直接的に配列決定した。この逆ＰＣＲ
工程は、ｂｓｍＩＲ遺伝子において約５００ｂｐの新規
なＤＮＡ配列を生じた。２０３１ｂｐのＯＲＦが、ｂｓ
ｍＩＭ２遺伝子の下流に見出され、及びこのＯＲＦはｂ
ｓｍＩＲ遺伝子と命名された（図１、４及び５）。
【００４７】３．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｂｓｍＩＭ１及
びＭ２遺伝子の発現 ２つのプライマーをｂｓｍＩＭ１遺伝子のＰＣＲ増幅の
ために合成した。 ５’ｃｇｃｇｇａｔｃｃｇｇａｇｇｔａａａｔａａａｔ
ｇｃｔｔｔｃａｇａａｔｇｇａｔｔａａｔａｃｃａｔｃ
３’（２３０〜２９）（配列番号１７） ５’ｔａｔｃａａｇｃａｔｇｃｔｔａｔａａａｔｔｃａ
ｔａｃａａａｔｔｔｇｃｔｃａａｔ３’（２３０〜３
２）（配列番号１８）
びＭ２遺伝子の発現 ２つのプライマーをｂｓｍＩＭ１遺伝子のＰＣＲ増幅の
ために合成した。 ５’ｃｇｃｇｇａｔｃｃｇｇａｇｇｔａａａｔａａａｔ
ｇｃｔｔｔｃａｇａａｔｇｇａｔｔａａｔａｃｃａｔｃ
３’（２３０〜２９）（配列番号１７） ５’ｔａｔｃａａｇｃａｔｇｃｔｔａｔａａａｔｔｃａ
ｔａｃａａａｔｔｔｇｃｔｃａａｔ３’（２３０〜３
２）（配列番号１８）
【００４８】ｂｓｍＩＭ１遺伝子を、９５℃３０秒間、
５５℃３０秒間、及び７２℃1分間を２５サイクル、２
単位のＶｅｎｔ(登録商標)ＤＮＡポリメラーゼの条件下
で、プライマー２３０〜２９及び２３０〜３２を使用す
るＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎ
スピンカラムを介して精製し、そしてＢａｍＨＩ及びＳ
ｐｈＩで一晩３７℃にて消化した。ＰＣＲ ＤＮＡをス
ピンカラムを介して再度精製し、そして適合性の末端を
有するｐＢＲ３２２にライゲーションした。ＥＲ２６８
３コンピテントセルへの形質転換後、３６個のプラスミ
ドミニ調製物を作製し、そしてプラスミドＤＮＡをｂｓ
ｍＩで試みた。１２個の単離物が、ｂｓｍＩ消化に対し
て部分的に耐性であった。いくつかの考えられ得る説明
があった。１つの説明は、ｂｓｍＩＭ１遺伝子がＴｃＲ
プロモーターから効率的に発現されなかった、又はｂｓ
ｍＩＭ１タンパク質の半減期が非常に短かった。第２の
説明は、第２のペプチドが至適なＭ１メチラーゼ活性に
必要とされた。２２８ｂｐ（７５アミノ酸残基）の小さ
なＯＲＦが、ｂｓｍＩＭ１とＭ２遺伝子との間にある。
この７５アミノ酸ペプチドは、至適なＭ１活性に寄与し
得る。ｂｓｍＩＭ１メチラーゼは非対称なｂｓｍＩ認識
配列（５’ＧＡＡＴＧＣ ３’及び５’ＧＣＡＴＴＣ
３’）の一方の鎖のみをメチル化し得るので、第２のメ
チラーゼが他方の鎖をメチル化するために必要とされ得
る（以下のＭ２発現を参照のこと）。
５５℃３０秒間、及び７２℃1分間を２５サイクル、２
単位のＶｅｎｔ(登録商標)ＤＮＡポリメラーゼの条件下
で、プライマー２３０〜２９及び２３０〜３２を使用す
るＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎ
スピンカラムを介して精製し、そしてＢａｍＨＩ及びＳ
ｐｈＩで一晩３７℃にて消化した。ＰＣＲ ＤＮＡをス
ピンカラムを介して再度精製し、そして適合性の末端を
有するｐＢＲ３２２にライゲーションした。ＥＲ２６８
３コンピテントセルへの形質転換後、３６個のプラスミ
ドミニ調製物を作製し、そしてプラスミドＤＮＡをｂｓ
ｍＩで試みた。１２個の単離物が、ｂｓｍＩ消化に対し
て部分的に耐性であった。いくつかの考えられ得る説明
があった。１つの説明は、ｂｓｍＩＭ１遺伝子がＴｃＲ
プロモーターから効率的に発現されなかった、又はｂｓ
ｍＩＭ１タンパク質の半減期が非常に短かった。第２の
説明は、第２のペプチドが至適なＭ１メチラーゼ活性に
必要とされた。２２８ｂｐ（７５アミノ酸残基）の小さ
なＯＲＦが、ｂｓｍＩＭ１とＭ２遺伝子との間にある。
この７５アミノ酸ペプチドは、至適なＭ１活性に寄与し
得る。ｂｓｍＩＭ１メチラーゼは非対称なｂｓｍＩ認識
配列（５’ＧＡＡＴＧＣ ３’及び５’ＧＣＡＴＴＣ
３’）の一方の鎖のみをメチル化し得るので、第２のメ
チラーゼが他方の鎖をメチル化するために必要とされ得
る（以下のＭ２発現を参照のこと）。
【００４９】２つのプライマーをｂｓｍＩＭ２遺伝子の
ＰＣＲ増幅のために合成した。 ５’ｔｇａａｇａｇｃａｔｇｃｇｇａｇｇｔａａａｔａ
ａａｔｇａａｃａａａａｔｃｔｃｔｔｔｔｃａａｃｃｔ
ｇｃｔ（２４７〜３２２）（配列番号１９） ５’ｃｃｃｔｃｔｇｔｃｇａｃｔｃａｃｃａａｔｔａａ
ｇａｔａｔａａｇｇａｔｔｃｇａａ３’（２４７〜３２
３）（配列番号２０）
ＰＣＲ増幅のために合成した。 ５’ｔｇａａｇａｇｃａｔｇｃｇｇａｇｇｔａａａｔａ
ａａｔｇａａｃａａａａｔｃｔｃｔｔｔｔｃａａｃｃｔ
ｇｃｔ（２４７〜３２２）（配列番号１９） ５’ｃｃｃｔｃｔｇｔｃｇａｃｔｃａｃｃａａｔｔａａ
ｇａｔａｔａａｇｇａｔｔｃｇａａ３’（２４７〜３２
３）（配列番号２０）
【００５０】ｂｓｍＩＭ２遺伝子を、９５℃３０秒間、
５５℃１．５分間、及び７２℃２．２５分間を２０サイ
クル、４単位のＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラー
ゼの条件下で、プライマー２４７〜３２２及び２４７〜
３２３を使用するＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物
をＱｉａｇｅｎスピンカラムを介して精製し、そしてＳ
ｐｈＩ及びＳａｌＩで一晩３７℃にて消化した。ＰＣＲ
ＤＮＡをスピンカラムを介して再度精製し、そして適
合性の末端を有するｐＢＲ３２２にライゲーションし
た。１３個のプラスミドを調製し、そしてｂｓｍＩで消
化した。１つの単離物番号９のものがｂｓｍＩ消化に耐
性であることが示された。ｂｓｍＩ Ｍ２遺伝子を含有
するＳｐｈＩ−ＳａｌＩフラグメントを低融点アガロー
スゲルからゲル精製した。精製されたＭ２ＤＮＡフラグ
メントを、適合性の末端を有するｐＢＲ−ｂｓｍＩＭ１
にライゲーションした。得られたプラスミドはｐＢＲ−
ｂｓｍＩＭ１＆Ｍ２であった。ｂｓｍＩＭ１及びＭ２遺
伝子の両方は、ＴｃＲプロモーターの制御下にあり、及
びＥ．ｃｏｌｉにおいて構成的に発現された。プラスミ
ドｐＢＲ−ｂｓｍＩＭ１＆Ｍ２はｂｓｍＩ消化に完全に
耐性であり、ＴｃＲプロモーターからの十分な発現を示
す。
５５℃１．５分間、及び７２℃２．２５分間を２０サイ
クル、４単位のＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラー
ゼの条件下で、プライマー２４７〜３２２及び２４７〜
３２３を使用するＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物
をＱｉａｇｅｎスピンカラムを介して精製し、そしてＳ
ｐｈＩ及びＳａｌＩで一晩３７℃にて消化した。ＰＣＲ
ＤＮＡをスピンカラムを介して再度精製し、そして適
合性の末端を有するｐＢＲ３２２にライゲーションし
た。１３個のプラスミドを調製し、そしてｂｓｍＩで消
化した。１つの単離物番号９のものがｂｓｍＩ消化に耐
性であることが示された。ｂｓｍＩ Ｍ２遺伝子を含有
するＳｐｈＩ−ＳａｌＩフラグメントを低融点アガロー
スゲルからゲル精製した。精製されたＭ２ＤＮＡフラグ
メントを、適合性の末端を有するｐＢＲ−ｂｓｍＩＭ１
にライゲーションした。得られたプラスミドはｐＢＲ−
ｂｓｍＩＭ１＆Ｍ２であった。ｂｓｍＩＭ１及びＭ２遺
伝子の両方は、ＴｃＲプロモーターの制御下にあり、及
びＥ．ｃｏｌｉにおいて構成的に発現された。プラスミ
ドｐＢＲ−ｂｓｍＩＭ１＆Ｍ２はｂｓｍＩ消化に完全に
耐性であり、ＴｃＲプロモーターからの十分な発現を示
す。
【００５１】４．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｂｓｍＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ（ｂｓｍＩＲ）遺伝子の発現 ２つのプライマーを、ｂｓｍＩＲ遺伝子のＰＣＲ増幅の
ために合成した。プライマーは以下の配列を有した。 ５’ａｇａｔａａａｔｇｃａｔａｔｇａａｔｇｔｔｔｔ
ｔａｇａａｔｔｃａｔｇｇｔｇａｔａａｔ３’（２４１
-２１２）（配列番号２１） ５’ｃｇｃｇｇａｔｃｃｔｔａｔｃｃｃｔｃｔａｔａｔ
ｇａａａａａａｔｃｃｔｇｔ３’（２３５〜２９３）
（配列番号２２）
ンドヌクレアーゼ（ｂｓｍＩＲ）遺伝子の発現 ２つのプライマーを、ｂｓｍＩＲ遺伝子のＰＣＲ増幅の
ために合成した。プライマーは以下の配列を有した。 ５’ａｇａｔａａａｔｇｃａｔａｔｇａａｔｇｔｔｔｔ
ｔａｇａａｔｔｃａｔｇｇｔｇａｔａａｔ３’（２４１
-２１２）（配列番号２１） ５’ｃｇｃｇｇａｔｃｃｔｔａｔｃｃｃｔｃｔａｔａｔ
ｇａａａａａａｔｃｃｔｇｔ３’（２３５〜２９３）
（配列番号２２）
【００５２】ｂｓｍＩＲ遺伝子を、９５℃１分間を１サ
イクル；９５℃４５秒間、５５℃４５秒間、及び７２℃
２分間を２０サイクル、２単位のＶｅｎｔ（登録商標）
ＤＮＡポリメラーゼの条件下で、プライマー２４１〜２
１２及び２３５〜２９３を使用するＰＣＲによって増幅
した。ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎスピンカラムを介して
精製し、そしてＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで一晩３７℃に
て消化した。ＰＣＲＤＮＡをスピンカラムを介して再度
精製し、そして適合性の末端を有する低コピー数のＴ７
発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにライゲーション
した。発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒはｐＡＣＹ
Ｃ１８４に由来し、及び細胞当たり５〜８コピーを有し
た。これは、Ｔ７プロモーターの上流で４コピーのＥ．
ｃｏｌｉ転写ターミネーターを含んだ。転写ターミネー
ターはベクター上の潜在性Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターか
らのランオフ転写を減少することが予測された。ｂｓｍ
ＩＲ＋ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒのライゲーションされた
ＤＮＡをｂｓｍＩメチラーゼで予め修飾された宿主ＥＲ
２５６６に形質転換した［ｐＢＲ-ｂｓｍＩＭ１＆Ｍ
２］。３６個のプラスミドのミニ調製物を作製し、そし
て６個の単離物がエンドヌクレアーゼ遺伝子インサート
を含むことが示された。１０ｍｌの細胞培養物をこれら
の６個の単離物について作製し、そして０．５ｍＭ Ｉ
ＰＴＧで３時間誘導した。超音波処置による細胞溶解
後、細胞残渣を遠心分離によって除去し、そして細胞抽
出物をｂｓｍＩエンドヌクレアーゼ活性についてアッセ
イした。２つの単離物（番号１１及び番号３３）は、十
分なｂｓｍＩ活性を示した。３つの単離物は部分的なｂ
ｓｍＩ活性を示し、そして１つの単離物は活性を示さ
ず、おそらくｂｓｍＩＲ遺伝子にＰＣＲによって導入さ
れた変異に起因した。ｂｓｍＩ発現クローン番号１１
を、５００ｍｌの培養に使用して、湿潤細胞の１グラム
当たりのｂｓｍＩ単位の数を決定した。
イクル；９５℃４５秒間、５５℃４５秒間、及び７２℃
２分間を２０サイクル、２単位のＶｅｎｔ（登録商標）
ＤＮＡポリメラーゼの条件下で、プライマー２４１〜２
１２及び２３５〜２９３を使用するＰＣＲによって増幅
した。ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎスピンカラムを介して
精製し、そしてＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで一晩３７℃に
て消化した。ＰＣＲＤＮＡをスピンカラムを介して再度
精製し、そして適合性の末端を有する低コピー数のＴ７
発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにライゲーション
した。発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒはｐＡＣＹ
Ｃ１８４に由来し、及び細胞当たり５〜８コピーを有し
た。これは、Ｔ７プロモーターの上流で４コピーのＥ．
ｃｏｌｉ転写ターミネーターを含んだ。転写ターミネー
ターはベクター上の潜在性Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターか
らのランオフ転写を減少することが予測された。ｂｓｍ
ＩＲ＋ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒのライゲーションされた
ＤＮＡをｂｓｍＩメチラーゼで予め修飾された宿主ＥＲ
２５６６に形質転換した［ｐＢＲ-ｂｓｍＩＭ１＆Ｍ
２］。３６個のプラスミドのミニ調製物を作製し、そし
て６個の単離物がエンドヌクレアーゼ遺伝子インサート
を含むことが示された。１０ｍｌの細胞培養物をこれら
の６個の単離物について作製し、そして０．５ｍＭ Ｉ
ＰＴＧで３時間誘導した。超音波処置による細胞溶解
後、細胞残渣を遠心分離によって除去し、そして細胞抽
出物をｂｓｍＩエンドヌクレアーゼ活性についてアッセ
イした。２つの単離物（番号１１及び番号３３）は、十
分なｂｓｍＩ活性を示した。３つの単離物は部分的なｂ
ｓｍＩ活性を示し、そして１つの単離物は活性を示さ
ず、おそらくｂｓｍＩＲ遺伝子にＰＣＲによって導入さ
れた変異に起因した。ｂｓｍＩ発現クローン番号１１
を、５００ｍｌの培養に使用して、湿潤細胞の１グラム
当たりのｂｓｍＩ単位の数を決定した。
【００５３】２０ｍｌの細胞ＥＲ２５６６［ｐＢＲ−ｂ
ｓｍＩＭ１＆Ｍ２、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ｂｓｍＩ
Ｒ］を、ＬＢ＋Ａｐ（１００μｇ／ｍｌ）及びＣｍ（３
３μｇ／ｍｌ）中で一晩３７℃にて増殖した。２０ｍｌ
の一晩細胞を５００ｍｌの新鮮なＬＢ＋Ａｐ（１００μ
ｇ／ｍｌ）及びＣｍ（３３μｇ／ｍｌ）に接種した。細
胞を約３時間、対数後期に増殖し、そしてＩＰＴＧを
０．５ｍＭの最終濃度に添加し、そして３時間誘導し
た。細胞を採集し、そして超音波処理によって溶解し
た。細胞残渣を遠心分離によって除去し、そして細胞抽
出物を希釈して、６５℃にてＬａｍｂｄａ ＤＮＡにお
いて１時間、ｂｓｍＩ活性についてアッセイした。組換
えｂｓｍＩ収量は、湿潤細胞の１グラム当たり２×１０
６単位であったことが決定された（活性アッセイについ
て図６を参照のこと）。完全なｂｓｍＩＲ遺伝子を配列
決定して、番号１１が野生型ｂｓｍＩＲ遺伝子配列を保
有することを確認した。
ｓｍＩＭ１＆Ｍ２、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ｂｓｍＩ
Ｒ］を、ＬＢ＋Ａｐ（１００μｇ／ｍｌ）及びＣｍ（３
３μｇ／ｍｌ）中で一晩３７℃にて増殖した。２０ｍｌ
の一晩細胞を５００ｍｌの新鮮なＬＢ＋Ａｐ（１００μ
ｇ／ｍｌ）及びＣｍ（３３μｇ／ｍｌ）に接種した。細
胞を約３時間、対数後期に増殖し、そしてＩＰＴＧを
０．５ｍＭの最終濃度に添加し、そして３時間誘導し
た。細胞を採集し、そして超音波処理によって溶解し
た。細胞残渣を遠心分離によって除去し、そして細胞抽
出物を希釈して、６５℃にてＬａｍｂｄａ ＤＮＡにお
いて１時間、ｂｓｍＩ活性についてアッセイした。組換
えｂｓｍＩ収量は、湿潤細胞の１グラム当たり２×１０
６単位であったことが決定された（活性アッセイについ
て図６を参照のこと）。完全なｂｓｍＩＲ遺伝子を配列
決定して、番号１１が野生型ｂｓｍＩＲ遺伝子配列を保
有することを確認した。
【００５４】Ｅ.ｃｏｌｉ株ＥＲ２５６６［ｐＢＲ−ｂ
ｓｍＩＭ１＆Ｍ２、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ-ｂｓｍＩ
Ｒ］は、２０００年１０月２０日に、ブダペスト条約の
期間及び条件の下に、アメリカンタイプカルチャーコレ
クション（ＡＴＣＣ）に寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託
番号「ＰＴＡ−２６１９」を受けた。
ｓｍＩＭ１＆Ｍ２、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ-ｂｓｍＩ
Ｒ］は、２０００年１０月２０日に、ブダペスト条約の
期間及び条件の下に、アメリカンタイプカルチャーコレ
クション（ＡＴＣＣ）に寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託
番号「ＰＴＡ−２６１９」を受けた。
【００５５】５．ｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼの部
分精製 ｂｓｍＩエンドヌクレアーゼは熱安定性酵素であるの
で、ｂｓｍＩを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞抽出物を６５
℃で３０分間加熱し、そして変性されたタンパク質を遠
心分離によって除去した。可溶性タンパク質をヘパリン
セファロースカラム上にロードした。カラムを低塩緩衝
液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．８、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、
１ｍＭ ＥＤＴＡ）で徹底的に洗浄した。タンパク質を
５０ｍＭ〜１Ｍ ＮａＣｌの塩勾配で溶出した。各画分
におけるタンパク質の量を測定し、そしてｂｓｍＩ活性
をＬａｍｂｄａ ＤＮＡにおいてアッセイした。最も活
性な画分をまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した（図
７）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのｂｓｍＩエンドヌクレア
ーゼの観察された分子量は、７７．９ｋＤａであり、７
８．１ｋＤａの予測される分子量と密接に一致した。
分精製 ｂｓｍＩエンドヌクレアーゼは熱安定性酵素であるの
で、ｂｓｍＩを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞抽出物を６５
℃で３０分間加熱し、そして変性されたタンパク質を遠
心分離によって除去した。可溶性タンパク質をヘパリン
セファロースカラム上にロードした。カラムを低塩緩衝
液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．８、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、
１ｍＭ ＥＤＴＡ）で徹底的に洗浄した。タンパク質を
５０ｍＭ〜１Ｍ ＮａＣｌの塩勾配で溶出した。各画分
におけるタンパク質の量を測定し、そしてｂｓｍＩ活性
をＬａｍｂｄａ ＤＮＡにおいてアッセイした。最も活
性な画分をまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した（図
７）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのｂｓｍＩエンドヌクレア
ーゼの観察された分子量は、７７．９ｋＤａであり、７
８．１ｋＤａの予測される分子量と密接に一致した。
【００５６】６．ｂｓｍＩエンドヌクレアーゼの長い形
態の発現 ｂｓｍＩＲ遺伝子の開始コドンの上流に２つのインフレ
ームコドン（ＡＴＧ及びＣＡＧ）がある。これらの２つ
のコドンは、アミノ酸残基Ｍ（Ｍｅｔ）及びＱ（Ｇｌ
ｎ）をコードする。通常のｂｓｍＩエンドヌクレアーゼ
は６７６アミノ酸長である。ｂｓｍＩエンドヌクレアー
ゼの長い形態は、６７８アミノ酸長である。ｂｓｍＩエ
ンドヌクレアーゼの長い形態を発現するために、２つの
プライマーをｂｓｍＩＲ遺伝子（長い形態）のＰＣＲ増
幅のために合成した。
態の発現 ｂｓｍＩＲ遺伝子の開始コドンの上流に２つのインフレ
ームコドン（ＡＴＧ及びＣＡＧ）がある。これらの２つ
のコドンは、アミノ酸残基Ｍ（Ｍｅｔ）及びＱ（Ｇｌ
ｎ）をコードする。通常のｂｓｍＩエンドヌクレアーゼ
は６７６アミノ酸長である。ｂｓｍＩエンドヌクレアー
ゼの長い形態は、６７８アミノ酸長である。ｂｓｍＩエ
ンドヌクレアーゼの長い形態を発現するために、２つの
プライマーをｂｓｍＩＲ遺伝子（長い形態）のＰＣＲ増
幅のために合成した。
【００５７】プライマーは以下の配列を有した： ５’ａｇｇｇａｇａｇａｃａｔａｔｇｃａｇａｔｇａａ
ｔｇｔｔｔｔｔａｇａａｔｔｃａｔｇｇｔ３’（２４４
〜１８６）。 （ａｔｇ及びｃａｇはさらなるコドンである）（配列番
号２３） ５’ｃｇｃｇｇａｔｃｃｔｔａｔｃｃｃｔｃｔａｔａｔ
ｇａａａａａａｔｃｃｔｇｔ３’（２３５〜２９３）
（配列番号２４）
ｔｇｔｔｔｔｔａｇａａｔｔｃａｔｇｇｔ３’（２４４
〜１８６）。 （ａｔｇ及びｃａｇはさらなるコドンである）（配列番
号２３） ５’ｃｇｃｇｇａｔｃｃｔｔａｔｃｃｃｔｃｔａｔａｔ
ｇａａａａａａｔｃｃｔｇｔ３’（２３５〜２９３）
（配列番号２４）
【００５８】ｂｓｍＩＲ遺伝子（長い形態）を、９５℃
１分間を１サイクル；９５℃４５秒間、５５℃４５秒
間、及び７２℃２分間を２０サイクル、２単位のＶｅｎ
ｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼの条件下、２４４〜
１８６及び２３５〜２９３を使用するＰＣＲによって増
幅した。ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎスピンカラムを介し
て精製し、そしてＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで一晩３７℃
にて消化した。ＰＣＲＤＮＡをスピンカラムを介して再
度精製し、そして適合性の末端を有する、低コピー数の
Ｔ７発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにライゲーシ
ョンした。ｂｓｍＩＲ（長い形態）＋ｐＡＣＹＣ−Ｔ７
ｔｅｒのライゲーションされたＤＮＡをｂｓｍＩメチラ
ーゼで予め修飾された宿主ＥＲ２５６６［ｐＢＲ−ｂｓ
ｍＩＭ１＆Ｍ２］に形質転換した。１８個のプラスミド
ミニ調製物を作製し、１つの単離物（番号４）は、エン
ドヌクレアーゼ遺伝子（長い形態）インサートを含むこ
とが示された。１０ｍｌの細胞培養物を、単離物につい
て作製し、そして０．５ｍＭ ＩＰＴＧで３時間誘導し
た。超音波処理による細胞溶解後、細胞残渣を遠心分離
によって除去し、そして細胞抽出物をｂｓｍＩエンドヌ
クレアーゼ活性についてアッセイした。番号４細胞抽出
物は、完全なｂｓｍＩ活性を示した。２つのさらなるア
ミノ酸残基を有するｂｓｍＩエンドヌクレアーゼの長い
形態はまた、ＤＮＡ切断に活性であったことが結論付け
られた。
１分間を１サイクル；９５℃４５秒間、５５℃４５秒
間、及び７２℃２分間を２０サイクル、２単位のＶｅｎ
ｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼの条件下、２４４〜
１８６及び２３５〜２９３を使用するＰＣＲによって増
幅した。ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎスピンカラムを介し
て精製し、そしてＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで一晩３７℃
にて消化した。ＰＣＲＤＮＡをスピンカラムを介して再
度精製し、そして適合性の末端を有する、低コピー数の
Ｔ７発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにライゲーシ
ョンした。ｂｓｍＩＲ（長い形態）＋ｐＡＣＹＣ−Ｔ７
ｔｅｒのライゲーションされたＤＮＡをｂｓｍＩメチラ
ーゼで予め修飾された宿主ＥＲ２５６６［ｐＢＲ−ｂｓ
ｍＩＭ１＆Ｍ２］に形質転換した。１８個のプラスミド
ミニ調製物を作製し、１つの単離物（番号４）は、エン
ドヌクレアーゼ遺伝子（長い形態）インサートを含むこ
とが示された。１０ｍｌの細胞培養物を、単離物につい
て作製し、そして０．５ｍＭ ＩＰＴＧで３時間誘導し
た。超音波処理による細胞溶解後、細胞残渣を遠心分離
によって除去し、そして細胞抽出物をｂｓｍＩエンドヌ
クレアーゼ活性についてアッセイした。番号４細胞抽出
物は、完全なｂｓｍＩ活性を示した。２つのさらなるア
ミノ酸残基を有するｂｓｍＩエンドヌクレアーゼの長い
形態はまた、ＤＮＡ切断に活性であったことが結論付け
られた。
【００５９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Zhou, Jing Zhu, Zhenyu Xu, Shuang-yong <120> Method For Cloning And Expression Of BsmI Restriction Endonuclease In E. coli <130> NEB-184 <140> <141> <160> 24 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 828 <212> DNA <213> Bacillus stearothermophilus <220> <221> CDS <222> (1)..(828) <400> 1 atg ctt tca gaa tgg att aat acc atc caa aat aca gaa tgt ata caa 48 Met Leu Ser Glu Trp Ile Asn Thr Ile Gln Asn Thr Glu Cys Ile Gln 1 5 10 15 tca atg aaa aaa tta ccg gat aac tca att gac tta gta att gct gat 96 Ser Met Lys Lys Leu Pro Asp Asn Ser Ile Asp Leu Val Ile Ala Asp 20 25 30 ccc cca tat aat ttg tca aaa gga ggt aaa tgg aaa tgg gat aat agt 144 Pro Pro Tyr Asn Leu Ser Lys Gly Gly Lys Trp Lys Trp Asp Asn Ser 35 40 45 aaa aag ttg gtt ggt atg ggt ggt aat tgg aat aaa gta atg gaa aat 192 Lys Lys Leu Val Gly Met Gly Gly Asn Trp Asn Lys Val Met Glu Asn 50 55 60 tgg gat gat atg aca ttc gaa gag tat tgg gaa ttc acg gag tct tgg 240 Trp Asp Asp Met Thr Phe Glu Glu Tyr Trp Glu Phe Thr Glu Ser Trp 65 70 75 80 cta ttg gag gta aag cgt att tta aaa cca acg ggt tct cta tgg ata 288 Leu Leu Glu Val Lys Arg Ile Leu Lys Pro Thr Gly Ser Leu Trp Ile 85 90 95 ttt ggt act tat cat aat atg gga ata ata aat gtc gtt tgt cag aag 336 Phe Gly Thr Tyr His Asn Met Gly Ile Ile Asn Val Val Cys Gln Lys 100 105 110 ctt gga ata gaa att ata aat gag att ata tgg tat aag aga aat gca 384 Leu Gly Ile Glu Ile Ile Asn Glu Ile Ile Trp Tyr Lys Arg Asn Ala 115 120 125 ttt cca aat tta tcg ggt cgt aga ttc act gct agt cat gaa aca att 432 Phe Pro Asn Leu Ser Gly Arg Arg Phe Thr Ala Ser His Glu Thr Ile 130 135 140 ctt tgg tgt cat gtt ggc cag aaa aaa agg gaa tat tat ttt aac tat 480 Leu Trp Cys His Val Gly Gln Lys Lys Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Tyr 145 150 155 160 gag tat gtg aaa aat gct tct ttc cct gag gat atg cta aaa tcc cct 528 Glu Tyr Val Lys Asn Ala Ser Phe Pro Glu Asp Met Leu Lys Ser Pro 165 170 175 gga aaa caa atg aga act gtt tgg gat atc cct aat aac aaa caa aaa 576 Gly Lys Gln Met Arg Thr Val Trp Asp Ile Pro Asn Asn Lys Gln Lys 180 185 190 gac gag tta aag ttt gga aaa cat cca act caa aaa cct ctt aga tta 624 Asp Glu Leu Lys Phe Gly Lys His Pro Thr Gln Lys Pro Leu Arg Leu 195 200 205 ctt cat aga ata ata tta gca aca agt aaa gag ggc gat att tgt ctg 672 Leu His Arg Ile Ile Leu Ala Thr Ser Lys Glu Gly Asp Ile Cys Leu 210 215 220 gca ccg ttt agt gga gtt ggt agt gaa tgc gtt gcg gct aag gaa cta 720 Ala Pro Phe Ser Gly Val Gly Ser Glu Cys Val Ala Ala Lys Glu Leu 225 230 235 240 ggg cgg aat ttt ata ggt ttt gaa att aac aag gaa tat tac gat att 768 Gly Arg Asn Phe Ile Gly Phe Glu Ile Asn Lys Glu Tyr Tyr Asp Ile 245 250 255 tct ctt aaa cgt ata gaa tct act cag aaa aaa att gag caa att tgt 816 Ser Leu Lys Arg Ile Glu Ser Thr Gln Lys Lys Ile Glu Gln Ile Cys 260 265 270 atg aat tta taa 828 Met Asn Leu 275 <210> 2 <211> 275 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <400> 2 Met Leu Ser Glu Trp Ile Asn Thr Ile Gln Asn Thr Glu Cys Ile Gln 1 5 10 15 Ser Met Lys Lys Leu Pro Asp Asn Ser Ile Asp Leu Val Ile Ala Asp 20 25 30 Pro Pro Tyr Asn Leu Ser Lys Gly Gly Lys Trp Lys Trp Asp Asn Ser 35 40 45 Lys Lys Leu Val Gly Met Gly Gly Asn Trp Asn Lys Val Met Glu Asn 50 55 60 Trp Asp Asp Met Thr Phe Glu Glu Tyr Trp Glu Phe Thr Glu Ser Trp 65 70 75 80 Leu Leu Glu Val Lys Arg Ile Leu Lys Pro Thr Gly Ser Leu Trp Ile 85 90 95 Phe Gly Thr Tyr His Asn Met Gly Ile Ile Asn Val Val Cys Gln Lys 100 105 110 Leu Gly Ile Glu Ile Ile Asn Glu Ile Ile Trp Tyr Lys Arg Asn Ala 115 120 125 Phe Pro Asn Leu Ser Gly Arg Arg Phe Thr Ala Ser His Glu Thr Ile 130 135 140 Leu Trp Cys His Val Gly Gln Lys Lys Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Tyr 145 150 155 160 Glu Tyr Val Lys Asn Ala Ser Phe Pro Glu Asp Met Leu Lys Ser Pro 165 170 175 Gly Lys Gln Met Arg Thr Val Trp Asp Ile Pro Asn Asn Lys Gln Lys 180 185 190 Asp Glu Leu Lys Phe Gly Lys His Pro Thr Gln Lys Pro Leu Arg Leu 195 200 205 Leu His Arg Ile Ile Leu Ala Thr Ser Lys Glu Gly Asp Ile Cys Leu 210 215 220 Ala Pro Phe Ser Gly Val Gly Ser Glu Cys Val Ala Ala Lys Glu Leu 225 230 235 240 Gly Arg Asn Phe Ile Gly Phe Glu Ile Asn Lys Glu Tyr Tyr Asp Ile 245 250 255 Ser Leu Lys Arg Ile Glu Ser Thr Gln Lys Lys Ile Glu Gln Ile Cys 260 265 270 Met Asn Leu 275 <210> 3 <211> 813 <212> DNA <213> Bacillus stearothermophilus <220> <221> CDS <222> (1)..(813) <400> 3 atg aac aaa atc tct ttt caa cct gct ata aaa tgg agt ggc agt aaa 48 Met Asn Lys Ile Ser Phe Gln Pro Ala Ile Lys Trp Ser Gly Ser Lys 1 5 10 15 aga agc caa gca tgg aat ata ata aaa ttg ttt cct aaa ttt gat cga 96 Arg Ser Gln Ala Trp Asn Ile Ile Lys Leu Phe Pro Lys Phe Asp Arg 20 25 30 tat tat gaa ccg ttt gtt ggg ggg gca tcc ata aca tat gct tta aac 144 Tyr Tyr Glu Pro Phe Val Gly Gly Ala Ser Ile Thr Tyr Ala Leu Asn 35 40 45 cca aat aga ggt ata tgc ggt gat ata tgc aaa cca cta att gaa att 192 Pro Asn Arg Gly Ile Cys Gly Asp Ile Cys Lys Pro Leu Ile Glu Ile 50 55 60 tgg aaa att atc aaa agt gat cct cta agt att gta aat gag tat aaa 240 Trp Lys Ile Ile Lys Ser Asp Pro Leu Ser Ile Val Asn Glu Tyr Lys 65 70 75 80 aaa aga tgg ata cta ctt caa gag caa gga cat act gta tat tac gaa 288 Lys Arg Trp Ile Leu Leu Gln Glu Gln Gly His Thr Val Tyr Tyr Glu 85 90 95 att cgc gac aat ttt aac aaa act caa aat ccg tat gac tta ttt ttc 336 Ile Arg Asp Asn Phe Asn Lys Thr Gln Asn Pro Tyr Asp Leu Phe Phe 100 105 110 ctc aca aga act tgt gta aat ggg ctt ata aga ttt aat aaa gat ggt 384 Leu Thr Arg Thr Cys Val Asn Gly Leu Ile Arg Phe Asn Lys Asp Gly 115 120 125 tta ttc aac aat tca ttc cat cat aca aga aaa ggg ata cac cct gat 432 Leu Phe Asn Asn Ser Phe His His Thr Arg Lys Gly Ile His Pro Asp 130 135 140 aag tta cat aaa att atc ttg aat tgg tca tat aga tta aag aat ata 480 Lys Leu His Lys Ile Ile Leu Asn Trp Ser Tyr Arg Leu Lys Asn Ile 145 150 155 160 gaa ttt agg cac ggc gat tat aga gta aca act gaa gat ata aca aaa 528 Glu Phe Arg His Gly Asp Tyr Arg Val Thr Thr Glu Asp Ile Thr Lys 165 170 175 aat gac ttt att tat cta gat cct ccg tac ttt aat acg cgt gga aga 576 Asn Asp Phe Ile Tyr Leu Asp Pro Pro Tyr Phe Asn Thr Arg Gly Arg 180 185 190 tac tat ggg aca att gat ttt aat gaa ttc ctt gaa ttt ctt tat tcg 624 Tyr Tyr Gly Thr Ile Asp Phe Asn Glu Phe Leu Glu Phe Leu Tyr Ser 195 200 205 cta aac tcc aga gga ata aaa ttt gct tta tct ttc gat ggt aaa cga 672 Leu Asn Ser Arg Gly Ile Lys Phe Ala Leu Ser Phe Asp Gly Lys Arg 210 215 220 gaa gat gta aat tac atg gtt gaa tta cca aag gat ttg tat aaa aga 720 Glu Asp Val Asn Tyr Met Val Glu Leu Pro Lys Asp Leu Tyr Lys Arg 225 230 235 240 cat ata tta ata gaa tcc ggt aac tca agt ttc aaa aag gta atg gat 768 His Ile Leu Ile Glu Ser Gly Asn Ser Ser Phe Lys Lys Val Met Asp 245 250 255 aaa gat cct caa aaa gtc ttc gaa tcc tta tat ctt aat tgg tga 813 Lys Asp Pro Gln Lys Val Phe Glu Ser Leu Tyr Leu Asn Trp 260 265 270 <210> 4 <211> 270 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <400> 4 Met Asn Lys Ile Ser Phe Gln Pro Ala Ile Lys Trp Ser Gly Ser Lys 1 5 10 15 Arg Ser Gln Ala Trp Asn Ile Ile Lys Leu Phe Pro Lys Phe Asp Arg 20 25 30 Tyr Tyr Glu Pro Phe Val Gly Gly Ala Ser Ile Thr Tyr Ala Leu Asn 35 40 45 Pro Asn Arg Gly Ile Cys Gly Asp Ile Cys Lys Pro Leu Ile Glu Ile 50 55 60 Trp Lys Ile Ile Lys Ser Asp Pro Leu Ser Ile Val Asn Glu Tyr Lys 65 70 75 80 Lys Arg Trp Ile Leu Leu Gln Glu Gln Gly His Thr Val Tyr Tyr Glu 85 90 95 Ile Arg Asp Asn Phe Asn Lys Thr Gln Asn Pro Tyr Asp Leu Phe Phe 100 105 110 Leu Thr Arg Thr Cys Val Asn Gly Leu Ile Arg Phe Asn Lys Asp Gly 115 120 125 Leu Phe Asn Asn Ser Phe His His Thr Arg Lys Gly Ile His Pro Asp 130 135 140 Lys Leu His Lys Ile Ile Leu Asn Trp Ser Tyr Arg Leu Lys Asn Ile 145 150 155 160 Glu Phe Arg His Gly Asp Tyr Arg Val Thr Thr Glu Asp Ile Thr Lys 165 170 175 Asn Asp Phe Ile Tyr Leu Asp Pro Pro Tyr Phe Asn Thr Arg Gly Arg 180 185 190 Tyr Tyr Gly Thr Ile Asp Phe Asn Glu Phe Leu Glu Phe Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Asn Ser Arg Gly Ile Lys Phe Ala Leu Ser Phe Asp Gly Lys Arg 210 215 220 Glu Asp Val Asn Tyr Met Val Glu Leu Pro Lys Asp Leu Tyr Lys Arg 225 230 235 240 His Ile Leu Ile Glu Ser Gly Asn Ser Ser Phe Lys Lys Val Met Asp 245 250 255 Lys Asp Pro Gln Lys Val Phe Glu Ser Leu Tyr Leu Asn Trp 260 265 270 <210> 5 <211> 2031 <212> DNA <213> Bacillus stearothermophilus <220> <221> CDS <222> (1)..(2031) <400> 5 atg aat gtt ttt aga att cat ggt gat aat att att gag tgt gag aga 48 Met Asn Val Phe Arg Ile His Gly Asp Asn Ile Ile Glu Cys Glu Arg 1 5 10 15 gtt ata gat ttg ata tta tca aaa atc aat ccc cag aaa gta aaa aga 96 Val Ile Asp Leu Ile Leu Ser Lys Ile Asn Pro Gln Lys Val Lys Arg 20 25 30 ggg ttt att tca tta tca tgc cct ttt ata gaa att ata ttc aaa gag 144 Gly Phe Ile Ser Leu Ser Cys Pro Phe Ile Glu Ile Ile Phe Lys Glu 35 40 45 ggt cat gat tat ttt cac tgg cgt ttt gat atg ttt cct gga ttc aat 192 Gly His Asp Tyr Phe His Trp Arg Phe Asp Met Phe Pro Gly Phe Asn 50 55 60 aaa aat act aac gac aga tgg aat agc aat att tta gat ttg tta agt 240 Lys Asn Thr Asn Asp Arg Trp Asn Ser Asn Ile Leu Asp Leu Leu Ser 65 70 75 80 caa aaa gga agt ttt ttg tat gaa act cca gat gta ata att acc agt 288 Gln Lys Gly Ser Phe Leu Tyr Glu Thr Pro Asp Val Ile Ile Thr Ser 85 90 95 tta 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200 205 gat gac att gca gac tat ata att gca aag cta cag cat cgc gat acc 672 Asp Asp Ile Ala Asp Tyr Ile Ile Ala Lys Leu Gln His Arg Asp Thr 210 215 220 agc aat ata gaa caa tta ttg ata aac aaa aac tta aaa atg gtt gaa 720 Ser Asn Ile Glu Gln Leu Leu Ile Asn Lys Asn Leu Lys Met Val Glu 225 230 235 240 ttc tta tca aaa aat aca aaa aat gat aat aac ttc aca tat tca gaa 768 Phe Leu Ser Lys Asn Thr Lys Asn Asp Asn Asn Phe Thr Tyr Ser Glu 245 250 255 tgg gag agt atc tac aat ggt aca tat aga ata aca aat tta cct agt 816 Trp Glu Ser Ile Tyr Asn Gly Thr Tyr Arg Ile Thr Asn Leu Pro Ser 260 265 270 tta ggg aga ttt aaa ttt agg aaa aag att gct gaa aag tct ctt tca 864 Leu Gly Arg Phe Lys Phe Arg Lys Lys Ile Ala Glu Lys Ser Leu Ser 275 280 285 gga aaa gtt aag gaa ttt aac aat att gtt cag aga tat agt gta ggt 912 Gly Lys Val Lys Glu Phe Asn Asn Ile Val Gln Arg Tyr Ser Val Gly 290 295 300 ctt gct tca agt gat tta cct ttt gga gtt ata aga aaa gaa tca aga 960 Leu Ala Ser Ser Asp Leu Pro Phe Gly Val Ile Arg Lys Glu Ser Arg 305 310 315 320 aat gat ttt att aac gat gta tgt aaa ctt tat aat ata aat gat atg 1008 Asn Asp Phe Ile Asn Asp Val Cys Lys Leu Tyr Asn Ile Asn Asp Met 325 330 335 aaa ata att aaa gag cta aaa gaa gat gcg gac ctt att gtc tgt atg 1056 Lys Ile Ile Lys Glu Leu Lys Glu Asp Ala Asp Leu Ile Val Cys Met 340 345 350 ctt aag gga ttt aaa cct aga gga gat gat aat cga ccg gat aga gga 1104 Leu Lys Gly Phe Lys Pro Arg Gly Asp Asp Asn Arg Pro Asp Arg Gly 355 360 365 gcg tta ccc ctt gtt gct atg cta gcc gga gaa aat gca caa att ttt 1152 Ala Leu Pro Leu Val Ala Met Leu Ala Gly Glu Asn Ala Gln Ile Phe 370 375 380 aca ttt att tat gga cca tta ata aaa ggg gct ata aat ttg att gac 1200 Thr Phe Ile Tyr Gly Pro Leu Ile Lys Gly Ala Ile Asn Leu Ile Asp 385 390 395 400 cag gat atc aat aag ctt gca aaa cgt aac ggg ctt tgg aaa tcc ttt 1248 Gln Asp Ile Asn Lys Leu Ala Lys Arg Asn Gly Leu Trp Lys Ser Phe 405 410 415 gta agt tta agt gac ttt att gtt ttg gac tgt cct att atc gga gaa 1296 Val Ser Leu Ser Asp Phe Ile Val Leu Asp Cys Pro Ile Ile Gly Glu 420 425 430 tct tat aat gaa ttt cgt tta atc ata aat aag aac aat aaa gag tcc 1344 Ser Tyr Asn Glu Phe Arg Leu Ile Ile Asn Lys Asn Asn Lys Glu Ser 435 440 445 att tta cgc aaa act agc aaa caa caa aat att ttg gtt gat cca aca 1392 Ile Leu Arg Lys Thr Ser Lys Gln Gln Asn Ile Leu Val Asp Pro Thr 450 455 460 cct aat cat tat caa gaa aat gat gtg gat aca gtt ata tac tct ata 1440 Pro Asn His Tyr Gln Glu Asn Asp Val Asp Thr Val Ile Tyr Ser Ile 465 470 475 480 ttt aaa tat att gta cct aat tgt ttt agt ggg atg tgt aat cca cct 1488 Phe Lys Tyr Ile Val Pro Asn Cys Phe Ser Gly Met Cys Asn Pro Pro 485 490 495 gga gga gac tgg agt ggc cta tca ata ata aga aat ggt cat gaa ttt 1536 Gly Gly Asp Trp Ser Gly Leu Ser Ile Ile Arg Asn Gly His Glu Phe 500 505 510 agg tgg tta tca ctt cct cga gtt agt gag aat gga aaa aga ccc gac 1584 Arg Trp Leu Ser Leu Pro Arg Val Ser Glu Asn Gly Lys Arg Pro Asp 515 520 525 cat gta ata caa ata ctt gat ctt ttt gaa aaa ccc ctt tta tta agt 1632 His Val Ile Gln Ile Leu Asp Leu Phe Glu Lys Pro Leu Leu Leu Ser 530 535 540 att gag tca aaa gaa aaa cct aat gat ctt gaa cca aaa ata ggg gtg 1680 Ile Glu Ser Lys Glu Lys Pro Asn Asp Leu Glu Pro Lys Ile Gly Val 545 550 555 560 cag tta ata aaa tac ata gag tat cta ttt gat ttt act cct agt gtt 1728 Gln Leu Ile Lys Tyr Ile Glu Tyr Leu Phe Asp Phe Thr Pro Ser Val 565 570 575 caa aga aag ata gcc ggg gga aat tgg gag ttt ggt aat aaa agc ctg 1776 Gln Arg Lys Ile Ala Gly Gly Asn Trp Glu Phe Gly Asn Lys Ser Leu 580 585 590 gtt cct aac gat ttt att cta ttg tct gca ggt gca ttc atc gat tat 1824 Val Pro Asn Asp Phe Ile Leu Leu Ser Ala Gly Ala Phe Ile Asp Tyr 595 600 605 gac aat ctt aca gaa aat gat tat gaa aaa att ttt gaa gtc act ggt 1872 Asp Asn Leu Thr Glu Asn Asp Tyr Glu Lys Ile Phe Glu Val Thr Gly 610 615 620 tgt gat tta ctg att gct att aaa aac cag aat aac cct cag aag tgg 1920 Cys Asp Leu Leu Ile Ala Ile Lys Asn Gln Asn Asn Pro Gln Lys Trp 625 630 635 640 gtg att aaa ttc aaa cct aaa aat act ata gca gag aaa tta gtt aac 1968 Val Ile Lys Phe Lys Pro Lys Asn Thr Ile Ala Glu Lys Leu Val Asn 645 650 655 tat ata aag ctt aat ttt aaa agt aat ata ttt gat aca gga ttt ttt 2016 Tyr Ile Lys Leu Asn Phe Lys Ser Asn Ile Phe Asp Thr Gly Phe Phe 660 665 670 cat ata gag gga taa 2031 His Ile Glu Gly 675 <210> 6 <211> 676 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <400> 6 Met Asn Val Phe Arg Ile His Gly Asp Asn Ile Ile Glu Cys Glu Arg 1 5 10 15 Val Ile Asp Leu Ile Leu Ser Lys Ile Asn Pro Gln Lys Val Lys Arg 20 25 30 Gly Phe Ile Ser Leu Ser Cys Pro Phe Ile Glu Ile Ile Phe Lys Glu 35 40 45 Gly His Asp Tyr Phe His Trp Arg Phe Asp Met Phe Pro Gly Phe Asn 50 55 60 Lys Asn Thr Asn Asp Arg Trp Asn Ser Asn Ile Leu Asp Leu Leu Ser 65 70 75 80 Gln Lys Gly Ser Phe Leu Tyr Glu Thr Pro Asp Val Ile Ile Thr Ser 85 90 95 Leu Asn Asn Gly Lys Glu Glu Ile Leu Met Ala Ile Glu Phe Cys Ser 100 105 110 Ala Leu Gln Ala Gly Asn Gln Ala Trp Gln Arg Ser Gly Arg Ala Tyr 115 120 125 Ser Val Gly Arg Thr Gly Tyr Pro Tyr Ile Tyr Ile Val Asp Phe Val 130 135 140 Lys Tyr Glu Leu Asn Asn Ser Asp Arg Ser Arg Lys Asn Leu Arg Phe 145 150 155 160 Pro Asn Pro Ala Ile Pro Tyr Ser Tyr Ile Ser His Ser Lys Asn Thr 165 170 175 Gly Asn Phe Ile Val Gln Ala Tyr Phe Arg Gly Glu Glu Tyr Gln Pro 180 185 190 Lys Tyr Asp Lys Lys Leu Lys Phe Phe Asp Glu Thr Ile Phe Ala Glu 195 200 205 Asp Asp Ile Ala Asp Tyr Ile Ile Ala Lys Leu Gln His Arg Asp Thr 210 215 220 Ser Asn Ile Glu Gln Leu Leu Ile Asn Lys Asn Leu Lys Met Val Glu 225 230 235 240 Phe Leu Ser Lys Asn Thr Lys Asn Asp Asn Asn Phe Thr Tyr Ser Glu 245 250 255 Trp Glu Ser Ile Tyr Asn Gly Thr Tyr Arg Ile Thr Asn Leu Pro Ser 260 265 270 Leu Gly Arg Phe Lys Phe Arg Lys Lys Ile Ala Glu Lys Ser Leu Ser 275 280 285 Gly Lys Val Lys Glu Phe Asn Asn Ile Val Gln Arg Tyr Ser Val Gly 290 295 300 Leu Ala Ser Ser Asp Leu Pro Phe Gly Val Ile Arg Lys Glu Ser Arg 305 310 315 320 Asn Asp Phe Ile Asn Asp Val Cys Lys Leu Tyr Asn Ile Asn Asp Met 325 330 335 Lys Ile Ile Lys Glu Leu Lys Glu Asp Ala Asp Leu Ile Val Cys Met 340 345 350 Leu Lys Gly Phe Lys Pro Arg Gly Asp Asp Asn Arg Pro Asp Arg Gly 355 360 365 Ala Leu Pro Leu Val Ala Met Leu Ala Gly Glu Asn Ala Gln Ile Phe 370 375 380 Thr Phe Ile Tyr Gly Pro Leu Ile Lys Gly Ala Ile Asn Leu Ile Asp 385 390 395 400 Gln Asp Ile Asn Lys Leu Ala Lys Arg Asn Gly Leu Trp Lys Ser Phe 405 410 415 Val Ser Leu Ser Asp Phe Ile Val Leu Asp Cys Pro Ile Ile Gly Glu 420 425 430 Ser Tyr Asn Glu Phe Arg Leu Ile Ile Asn Lys Asn Asn Lys Glu Ser 435 440 445 Ile Leu Arg Lys Thr Ser Lys Gln Gln Asn Ile Leu Val Asp Pro Thr 450 455 460 Pro Asn His Tyr Gln Glu Asn Asp Val Asp Thr Val Ile Tyr Ser Ile 465 470 475 480 Phe Lys Tyr Ile Val Pro Asn Cys Phe Ser Gly Met Cys Asn Pro Pro 485 490 495 Gly Gly Asp Trp Ser Gly Leu Ser Ile Ile Arg Asn Gly His Glu Phe 500 505 510 Arg Trp Leu Ser Leu Pro Arg Val Ser Glu Asn Gly Lys Arg Pro Asp 515 520 525 His Val Ile Gln Ile Leu Asp Leu Phe Glu Lys Pro Leu Leu Leu Ser 530 535 540 Ile Glu Ser Lys Glu Lys Pro Asn Asp Leu Glu Pro Lys Ile Gly Val 545 550 555 560 Gln Leu Ile Lys Tyr Ile Glu Tyr Leu Phe Asp Phe Thr Pro Ser Val 565 570 575 Gln Arg Lys Ile Ala Gly Gly Asn Trp Glu Phe Gly Asn Lys Ser Leu 580 585 590 Val Pro Asn Asp Phe Ile Leu Leu Ser Ala Gly Ala Phe Ile Asp Tyr 595 600 605 Asp Asn Leu Thr Glu Asn Asp Tyr Glu Lys Ile Phe Glu Val Thr Gly 610 615 620 Cys Asp Leu Leu Ile Ala Ile Lys Asn Gln Asn Asn Pro Gln Lys Trp 625 630 635 640 Val Ile Lys Phe Lys Pro Lys Asn Thr Ile Ala Glu Lys Leu Val Asn 645 650 655 Tyr Ile Lys Leu Asn Phe Lys Ser Asn Ile Phe Asp Thr Gly Phe Phe 660 665 670 His Ile Glu Gly 675 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 7 tatcgtaata ttccttgtta attt 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 8 cttaaacgta tagaatctac tcag 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 9 ctagatcctc cgtactttaa tacg 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 10 aattgtccca tagtatcttc cacg 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 11 ctttcgatgg taaacgagaa gatg 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 12 attttattcc tctggagttt agcg 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 13 atgtgaagtt attatcattt tttg 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 14 ttcagaatgg gagagtatct acaa 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 15 gaaactccag atgtaataat tacc 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 16 tacaaaaaac ttcctttttg actt 24 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 17 cgcggatccg gaggtaaata aatgctttca gaatggatta ataccatc 48 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 18 tatcaagcat gcttataaat tcatacaaat ttgctcaat 39 <210> 19 <211> 51 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 19 tgaagagcat gcggaggtaa ataaatgaac aaaatctctt ttcaacctgc t 51 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 20 ccctctgtcg actcaccaat taagatataa ggattcgaa 39 <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 21 agataaatgc atatgaatgt ttttagaatt catggtgata at 42 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 22 cgcggatcct tatccctcta tatgaaaaaa tcctgt 36 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 23 agggagagac atatgcagat gaatgttttt agaattcatg gt 42 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 24 cgcggatcct tatccctcta tatgaaaaaa tcctgt 36
【図１】ｂｓｍＩ制限−修飾系の遺伝子機構を示す。遺
伝子ｂｓｍＩＭ１及びｂｓｍＩＭ２は、それぞれ、ｂｓ
ｍＩメチラーゼのＭ１及びＭ２をコードする。遺伝子ｂ
ｓｍＩＲは、ｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼをコード
する。ＯＲＦはＭ１とＭ２との間の小さなオープンリー
ディングフレームである。
伝子ｂｓｍＩＭ１及びｂｓｍＩＭ２は、それぞれ、ｂｓ
ｍＩメチラーゼのＭ１及びＭ２をコードする。遺伝子ｂ
ｓｍＩＲは、ｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼをコード
する。ＯＲＦはＭ１とＭ２との間の小さなオープンリー
ディングフレームである。
【図２】ｂｓｍＩＭ１メチラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列
（配列番号１）（ｂｓｍＩＭ１）及びそのコードされる
アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
（配列番号１）（ｂｓｍＩＭ１）及びそのコードされる
アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】ｂｓｍＩＭ２メチラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列
（配列番号３）（ｂｓｍＩＭ２）及びそのコードされる
アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
（配列番号３）（ｂｓｍＩＭ２）及びそのコードされる
アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図４】ｂｓｍＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のＤＮＡ配
列（配列番号５）（ｂｓｍＩＲ）及びそのコードされる
アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
列（配列番号５）（ｂｓｍＩＲ）及びそのコードされる
アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図５】ｂｓｍＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のＤＮＡ配
列（配列番号５）（ｂｓｍＩＲ）及びそのコードされる
アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
列（配列番号５）（ｂｓｍＩＲ）及びそのコードされる
アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図６】細胞抽出物における組換えｂｓｍＩエンドヌク
レアーゼ活性を示す。レーン１、１ｋｂ ＤＮＡサイズ
マーカー；レーン２、精製されたネイティブなｂｓｍＩ
によって切断されたＬａｍｂｄａ ＤＮＡ；レーン３〜
１２；組換えｂｓｍＩを含有する細胞抽出物によって切
断されたＬａｍｂｄａ ＤＮＡ。レーン３〜１２におけ
る希釈率は以下のようであった：１／１００、１／２０
０、１／４００、１／８００、１／１６００、１／３２
００、１／６４００、１／／１２８００、１／２５６０
０、及び１／５１２００。
レアーゼ活性を示す。レーン１、１ｋｂ ＤＮＡサイズ
マーカー；レーン２、精製されたネイティブなｂｓｍＩ
によって切断されたＬａｍｂｄａ ＤＮＡ；レーン３〜
１２；組換えｂｓｍＩを含有する細胞抽出物によって切
断されたＬａｍｂｄａ ＤＮＡ。レーン３〜１２におけ
る希釈率は以下のようであった：１／１００、１／２０
０、１／４００、１／８００、１／１６００、１／３２
００、１／６４００、１／／１２８００、１／２５６０
０、及び１／５１２００。
【図７】部分的に精製されたｂｓｍＩ制限エンドヌクレ
アーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ｂｓｍＩエンドヌク
レアーゼの予測される分子量は７８．１ｋＤａである。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で観察された分子量は、７７．９ｋ
Ｄａである。レーン１、タンパク質サイズマーカー；レ
ーン２〜１２、ヘパリンセファロースカラムから溶出さ
れた画分（１９〜２９）。
アーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ｂｓｍＩエンドヌク
レアーゼの予測される分子量は７８．１ｋＤａである。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で観察された分子量は、７７．９ｋ
Ｄａである。レーン１、タンパク質サイズマーカー；レ
ーン２〜１２、ヘパリンセファロースカラムから溶出さ
れた画分（１９〜２９）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/16 5/00 Ａ (71)出願人 501425360 32 Ｔｏｚｅｒ Ｒｏａｄ， Ｂｅｖｅｒ ｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ 01915 Ｕ．Ｓ．Ａ. (72)発明者 シュアン・ヨン・シュ アメリカ合衆国 02173 マサチューセッ ツ州 レキシントン グレイプバイン・ア ベニュー 30 (72)発明者 ジェンユー・ジュ アメリカ合衆国 01915 マサチューセッ ツ州 ベバーリイ アパートメント３ ベ ックフォード・ストリート 42 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA10 BA11 CA01 DA06 GA11 HA09 4B050 CC01 CC03 CC08 DD02 EE10 LL03 LL10 4B065 AA18Y AA26X AC14 BA02 CA29 CA31 CA46 CA60
Claims (6)
- 【請求項１】 ｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼをコー
ドする単離されたＤＮＡであって、ここで単離されたＤ
ＮＡはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ ＮＵＢ３６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ 番号３２８）から
得ることが可能である、単離されたＤＮＡ。 - 【請求項２】 ｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼをコー
ドするＤＮＡセグメントが挿入されているベクターを含
む組換えＤＮＡベクター。 - 【請求項３】 ｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼ並びに
ｂｓｍＩメチラーゼＭ１及びＭ２をコードする単離され
たＤＮＡであって、ここで単離されたＤＮＡがＡＴＣＣ
寄託番号「ＰＴＡ−２６１９」から得ることが可能であ
る、単離されたＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項３に記載の単離されたＤＮＡを含
むクローニングベクター。 - 【請求項５】 請求項２又は４に記載のクローニングベ
クターによって形質転換された宿主細胞。 - 【請求項６】 組換えｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼ
を生成する方法であって、請求項２又は４に記載のベク
ターで形質転換された宿主細胞を、該エンドヌクレアー
ゼの発現に適切な条件下で培養する工程を包含する、組
換えｂｓｍＩ制限エンドヌクレアーゼを生成する方法。
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| US09/693,147 US6335190B1 (en) | 2000-10-20 | 2000-10-20 | Method for cloning and producing the BsmI restriction endonuclease in E. coli |
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| JP2001337072A Pending JP2002262889A (ja) | 2000-10-20 | 2001-09-28 | Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｂｓｍｉ制限−修飾システムのクローニング及び発現の方法 |
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| US9427922B2 (en) | 2013-03-14 | 2016-08-30 | Acufocus, Inc. | Process for manufacturing an intraocular lens with an embedded mask |
| EP3220859B8 (en) | 2014-11-19 | 2020-06-10 | AcuFocus, Inc. | Fracturable mask for treating presbyopia |
| EP3359987B1 (en) | 2015-10-05 | 2024-02-28 | AcuFocus, Inc. | Methods of molding intraocular lenses |
| JP7055747B2 (ja) | 2015-11-24 | 2022-04-18 | アキュフォーカス・インコーポレーテッド | 焦点深度の拡張を伴うトーリック小開口眼内レンズ |
| WO2019217471A1 (en) | 2018-05-09 | 2019-11-14 | Acufocus, Inc. | Intraocular implant with removable optic |
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| JP2000050884A (ja) * | 1998-05-06 | 2000-02-22 | F Hoffmann La Roche Ag | 向上したイソプレノイドの生産 |
| JP2000262294A (ja) * | 1999-03-09 | 2000-09-26 | F Hoffmann La Roche Ag | アスタキサンチンシンターゼ |
| US6133008A (en) * | 1999-05-07 | 2000-10-17 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the TfiI Restriction endonuclease in E. coli |
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| US5200333A (en) | 1985-03-01 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Cloning restriction and modification genes |
| DE3751923T2 (de) * | 1986-06-06 | 1997-04-03 | New England Biolabs Inc | Verfahren zur Klonierung von Restriktions-Modifikationssystemen |
| US5498535A (en) | 1994-05-24 | 1996-03-12 | New England Biolabs, Inc. | Method for direct cloning of nuclease genes in E. coli |
-
2000
- 2000-10-20 US US09/693,147 patent/US6335190B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-09-28 JP JP2001337072A patent/JP2002262889A/ja active Pending
- 2001-10-10 EP EP01203827A patent/EP1199366B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-10 DE DE60126217T patent/DE60126217T2/de not_active Expired - Lifetime
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