JP2002253071A - Plant body having disrupted gene encoding cell membrane proton-atpase and method for using the same - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a monitoring material capable of simply evaluating the state of a plant growth medium such as soil in situ and to provide a method for evaluating the growth medium. SOLUTION: This plant having a disrupted gene encoding a cell membrane proton-ATPase is obtained. Thereby, the state of the plant growth medium such as soil can simply be evaluated in situ.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、植物生育媒体の状
態、特に，降雨、化学肥料、植物遺体による土壌の酸性
化をモニタリングする技術に関し、特に、細胞膜プロト
ン−ＡＴＰアーゼ遺伝子が破壊あるいは当該酵素活性を
有するタンパク質の生成が抑制された植物体をモニタリ
ング材料として使用して、簡易に、そしてその場評価可
能に生育媒体の状態をモニタリングする技術に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a technique for monitoring the condition of a plant growth medium, particularly, the acidification of soil by rainfall, chemical fertilizers, and plant remains, and more particularly, to the disruption of a cell membrane proton-ATPase gene or the enzyme concerned. The present invention relates to a technique for monitoring a state of a growth medium in a simple and in-situ manner using a plant in which the production of an active protein is suppressed as a monitoring material.

【０００２】[0002]

【従来の技術】世界の農業において利用可能な耕地面積
の３１％（３４億ha）は、作物の生育を著しく阻害する
酸性土壌であり、深刻な農業問題を引き起こしている。
土壌の酸性化は、降雨、化学肥料による施肥、植物遺体
による有機酸の影響等によって引き起こされる。酸性化
した土壌では、土壌粒子に吸着しているMg²⁺、Ca²⁺、Ｋ
⁺などのイオンがＨ⁺に置換されて溶脱され、またリン酸
の供給も低下することから、植物にとって栄養量の減少
をもたらす。さらに、土壌の酸性化がpH４以下に進む
と、土壌中のアルミニウムが可溶化（イオン化）し、植
物の根の伸長反応にも著しい影響を与える。従って、こ
のような土壌酸性ストレスは、作物等の生育全般に悪影
響を及ぼし、収量減をもたらす結果となる。作物の栽培
において、多収を得るためには、健全な土壌条件が必要
であり、そのような土壌条件を維持するためには、土壌
の状態を生物学的にモニタリングする技術の開発が必要
である。BACKGROUND OF THE INVENTION The area of arable land available in world agriculture
31% (3.4 billion hectares) significantly inhibit crop growth
Acidic soil, causing serious agricultural problems.
Soil acidification includes rainfall, fertilizer application, plant remains
It is caused by the influence of organic acids. Acidification
In the soil that has been removed, the Mg adsorbed on the soil particles²⁺, Ca²⁺, K
⁺Ions such as H⁺Is replaced by leaching and phosphoric acid
Nutrients are reduced for plants as the supply of
Bring. Furthermore, soil acidification progresses below pH4
And the aluminum in the soil is solubilized (ionized) and planted.
It also has a significant effect on the elongation reaction of the root of a product. Therefore,
Soil acid stress such as
Impact, resulting in reduced yield. Cultivation of crops
, Healthy soil conditions are needed to obtain high yields
And to maintain such soil conditions, the soil
Need to develop biological monitoring technology
It is.

【０００３】化学的な測定法としては、例えば、土壌の
酸性度を、土壌粒子を水、あるいはＫＣｌ溶液、あるい
はCaCl₂溶液に一定量の割合でけん濁させてpHを測定す
る方法が定められている。生物を利用した土壌モニタリ
ング方法には、例えば、微生物の生育度を指標として、
土壌特性（病害阻止性）を評価する方法（特開2000-157
258）がある。遺伝子工学手法を利用した方法では、ス
トレス誘導性プロモーター配列の制御下に発現可能な遺
伝子を配置させた検出用微生物を用いた環境ストレス検
出方法（特表平8-504101）がある。[0003] As a chemical measurement method, for example, a method of measuring the acidity of soil by measuring the pH by suspending soil particles in water, a KCl solution, or a CaCl ₂ solution at a fixed rate is defined. ing. In the soil monitoring method using living organisms, for example, using the growth degree of microorganisms as an index,
Method for evaluating soil properties (disease inhibiting properties) (JP-A-2000-157)
258). Among methods using genetic engineering techniques, there is an environmental stress detection method using a detection microorganism in which a gene that can be expressed is placed under the control of a stress-inducible promoter sequence (Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-504101).

【０００４】しかしながら、従来の土壌モニタリングで
は、測定機材を必要とし、測定に時間および手間がかか
る、また、土壌の状態（季節、天候等）によって測定結
果にばらつきがあり、土壌の性質を正しく評価するため
には、測定回数を増やす必要がある。However, the conventional soil monitoring requires measuring equipment, which requires time and labor for the measurement, and the measurement results vary depending on the state of the soil (season, weather, etc.), and the properties of the soil are correctly evaluated. In order to perform this, it is necessary to increase the number of measurements.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、土
壌等の植物生育媒体の状態を簡易にかつその場評価でき
るモニタリング材料及び生育媒体評価方法を提供するこ
とを目的とする。また、本発明は、土壌等の植物生育媒
体の状態を簡易にかつその場評価しながら、植物を栽培
し製造する方法を提供することも、その目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to provide a monitoring material and a method for evaluating a growth medium which can easily and in-situ evaluate the state of a plant growth medium such as soil. Another object of the present invention is to provide a method for cultivating and producing plants while easily and in-situ evaluating the state of a plant growth medium such as soil.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、細胞膜プ
ロトン−ＡＴＰアーゼに着目し、独自に保有するイネ遺
伝子破壊ライブラリーより、細胞膜プロトン−ＡＴＰア
ーゼ遺伝子が破壊された変異体（遺伝子破壊個体）を見
出した。細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼは、ＡＴＰのエ
ネルギーを利用してプロトンの能動輸送を行うタンパク
質である。そのプロトンポンプによって、細胞内に流入
してきたプロトン（Ｈ⁺）を細胞外に汲み出し、細胞内
のpHを調整する機能を有している。細胞膜プロトン−Ａ
ＴＰアーゼ遺伝子が耐酸性に関与していることを調べた
実験例として、酵母を用いた報告がある。この報告で
は、細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼ遺伝子の発現を抑制
した酵母において耐酸性が失われること、タバコの細胞
膜プロトン−ＡＴＰアーゼ遺伝子を酵母に導入し、発現
させることによって耐酸性が付与されることを確認して
いる(Marc Boutry，Plant Physiol. 119:627-634(199
9))。Means for Solving the Problems The present inventors have focused on cell membrane proton-ATPase, and found a mutant (gene disruption) in which the cell membrane proton-ATPase gene has been disrupted from a rice gene disruption library possessed uniquely. Individual). Cell membrane proton-ATPase is a protein that performs active transport of protons using the energy of ATP. The proton pump has the function of pumping protons (H ⁺ ) that have flowed into the cells to the outside of the cells and adjusting the pH of the cells. Cell membrane proton-A
As an example of an experiment in which the TPase gene was involved in acid resistance, there is a report using yeast. In this report, it is reported that acid resistance is lost in yeast in which expression of the cell membrane proton-ATPase gene is suppressed, and that acid resistance is imparted by introducing and expressing the cell membrane proton-ATPase gene of tobacco in yeast. (Marc Boutry, Plant Physiol. 119: 627-634 (199
9)).

【０００７】本発明者らは、細胞膜プロトン−ＡＴＰア
ーゼをコードする遺伝子が破壊等されて、当該酵素が適
切に発現されない植物体は、プロトンポンプが適切に機
能しないために、土壌等の植物生育媒体の酸性化に伴
い、細胞内のpHを正常に維持することができず、生育が
阻害され、該植物体の生育状態をモニタリングすること
によって、土壌の酸性度を評価できることを見出し、本
発明を完成するに至った。すなわち、本発明によれば、
細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子が破
壊された植物体が提供される。また、細胞膜プロトン−
ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子の発現が阻害された植
物体が提供される。さらに、これらの植物体を用いて、
その生育状態をモニタリングすることを特徴とする植物
生育媒体の評価方法が提供される。これらの発明によれ
ば、土壌等の植物生育媒体の状態を簡易にまたその場評
価することができる。[0007] The present inventors have found that plants in which the gene encoding the cell membrane proton-ATPase is disrupted and the enzyme is not properly expressed are not suitable for plant growth in soil or the like because the proton pump does not function properly. With the acidification of the medium, it was found that the intracellular pH could not be maintained normally, the growth was inhibited, and the acidity of the soil could be evaluated by monitoring the growth state of the plant. Was completed. That is, according to the present invention,
Provided is a plant in which a gene encoding a cell membrane proton-ATPase has been disrupted. In addition, cell membrane proton-
Provided is a plant in which expression of a gene encoding ATPase is inhibited. Furthermore, using these plants,
There is provided a method for evaluating a plant growth medium, characterized by monitoring the growth state. According to these inventions, the state of a plant growth medium such as soil can be easily and in-situ evaluated.

【０００８】また、このような植物体の生育状態をモニ
タリングしつつ、維持しようとする植物体を栽培するこ
とを特徴とする、植物体の製造方法が提供される。この
方法によると、植物生育媒体の状態を簡易にまたその場
評価によってモニタリングしながら、維持しようとする
植物体を適切に栽培し製造できる。Further, there is provided a method for producing a plant, characterized by cultivating a plant to be maintained while monitoring the growth state of such a plant. According to this method, the plant to be maintained can be appropriately cultivated and manufactured while monitoring the state of the plant growth medium simply and in-situ.

【０００９】[0009]

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て詳細に説明する。本発明は、細胞膜プロトン−ＡＴＰ
アーゼ遺伝子の発現が阻害された植物体、あるいは細胞
膜プロトン−ＡＴＰアーゼ活性が阻害された植物体であ
り、また、かかる植物体を、土壌等の植物生育媒体の状
態を評価するためのモニタリング材料として使用するも
のである。かかる植物体としては、好ましくは、細胞膜
プロトン−ＡＴＰアーゼ遺伝子が破壊された植物体であ
り、より好ましくは変異により当該遺伝子は破壊された
植物体である。Embodiments of the present invention will be described below in detail. The present invention relates to cell membrane proton-ATP
A plant in which the expression of the ase gene is inhibited, or a plant in which the cell membrane proton-ATPase activity is inhibited; and such a plant as a monitoring material for evaluating the state of a plant growth medium such as soil. To use. Such a plant is preferably a plant in which the cell membrane proton-ATPase gene has been disrupted, and more preferably a plant in which the gene has been disrupted by mutation.

【００１０】本明細書において細胞膜プロトン−ＡＴＰ
アーゼ遺伝子とは、真核細胞の細胞膜に存在する、プロ
トン−ＡＴＰアーゼ（Proton−Translocating ATPase）
である。真核細胞には、各種の細胞膜プロトン−ATPア
ーゼ遺伝子が存在しており、特に限定するものではな
く、少なくとも１つの細胞膜プロトン−ATPアーゼ遺伝
子が破壊されていればよいが、好ましくは、耐酸性に関
連する細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼ遺伝子である。細
胞膜プロトン−ATPアーゼ遺伝子は、各種植物体のｃＤ
ＮＡライブラリーから分離することができる。たとえ
ば、既知の細胞膜プロトン−ATPアーゼのアミノ酸配列
（Wadaら, Plant Physiol. (1992) 99, 794-795）に基
づいて得られたＤＮＡ配列における共通配列をもとに作
製したプライマーを用いて、各種植物体のｃＤＮＡライ
ブラリーに対してＰＣＲを行うことにより、その植物体
の細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼのｃＤＮＡ断片（ある
いはｃＤＮＡの一部分）を得ることができる。このｃＤ
ＮＡ断片（またはｃＤＮＡの一部分）をプローブとして
用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、細胞
膜プロトン−ＡＴＰアーゼ遺伝子をクローニングするこ
とができる。多くの細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼ遺伝
子は、膜貫通部分と親水性の頭部とを備えており、その
分子量はおおよそ１００，０００Ｄである。As used herein, cell membrane proton-ATP
An ase gene is a proton-ATPase (Proton-Translocating ATPase) present in the cell membrane of eukaryotic cells.
It is. In eukaryotic cells, various cell membrane proton-ATPase genes are present, and are not particularly limited, as long as at least one cell membrane proton-ATPase gene is disrupted, preferably acid-resistant. Is a cell membrane proton-ATPase gene associated with. The cell membrane proton-ATPase gene is used for the cD of various plants.
It can be separated from NA libraries. For example, using a primer prepared based on a common sequence in a DNA sequence obtained based on an amino acid sequence of a known cell membrane proton-ATPase (Wada et al., Plant Physiol. (1992) 99, 794-795), By performing PCR on cDNA libraries of various plants, cDNA fragments (or a part of cDNA) of cell membrane proton-ATPase of the plants can be obtained. This cD
The cDNA library can be screened using the NA fragment (or a portion of the cDNA) as a probe to clone the cell membrane proton-ATPase gene. Many cell membrane proton-ATPase genes have a transmembrane portion and a hydrophilic head, and have a molecular weight of approximately 100,000D.

【００１１】本発明に使用できる細胞膜プロトン−ＡＴ
Ｐアーゼ遺伝子としては、例えば、イネ（典型的にはOr
yza sativaである）においては、ＯＳＡ１（Wadaら, Pl
antPhysiol. (1992) 99, 794-795）、ＯＳＡ２（Kasamo
ら, Plant Cell Physiol. (1994)35, 1251-1256）等を
挙げることができる。また、トマトにおいては、ＬＨＡ
１（Ewingら, Plant Physiol. (1990)94, 1874-1881）
を挙げることができる。さらに、シロイヌナズナにおい
てはＡＨＡ１（Harperら, Proc. Natl. Acad.Sci. USA
(1989) 86, 1234-1238）、タバコにおいてはＰｍａ３
（Perezら, J. Biol. Chem. (1992)267, 1204-1211）を
挙げることができる。Cell membrane proton-AT usable in the present invention
As the Pase gene, for example, rice (typically Or
yza sativa), OSA1 (Wada et al., Pl
antPhysiol. (1992) 99, 794-795), OSA2 (Kasamo
Plant Cell Physiol. (1994) 35, 1251-1256). In tomatoes, LHA
1 (Ewing et al., Plant Physiol. (1990) 94, 1874-1881)
Can be mentioned. Furthermore, in Arabidopsis thaliana, AHA1 (Harper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1989) 86, 1234-1238), and Pma3 in tobacco.
(Perez et al., J. Biol. Chem. (1992) 267, 1204-1211).

【００１２】細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼ遺伝子が破
壊された植物体の形態としては、外来ＤＮＡ配列の導入
によって破壊された組換え体でもよいが、自然発生的あ
るいは人工的に発生させた突然変異によって破壊された
変異体であることが好ましい。この遺伝子は、相同染色
体においてヘテロの状態で遺伝子が破壊されていてもよ
いが、好ましくは、ホモの状態で破壊されている。The form of the plant in which the cell membrane proton-ATPase gene has been disrupted may be a recombinant disrupted by the introduction of a foreign DNA sequence, but may be disrupted by a naturally or artificially generated mutation. Preferably, the mutant is a modified mutant. The gene may be disrupted in a homologous chromosome in a heterologous state, but is preferably disrupted in a homologous state.

【００１３】本明細書の対象となる植物体とは、特に限
定しない。単子葉植物でも双子葉植物であってもよい。
植物体としては、各種栽培作物種から選択することもで
きる。例えば、イネ、ライムギ、コムギ、トウモロコ
シ、オオムギ、モロコシ等の穀類、オレンジ等の各種果
実類、キャベツ、ダイコン、ニンジン等の野菜類、タバ
コ、サトウキビ、ナタネ、ダイズ、ヒマワリ等の工芸作
物を挙げることができる。さらに、シロイヌナズナ等、
緑藻類、紅藻類、ヒメツリガネゴケ等のコケ植物等を挙
げることができる。また、本発明は、本発明の植物体か
ら得た繁殖媒体（例えば、種子、根茎、切穂等）も対象
とする。また、本明細書において植物細胞とは、前記し
た植物の培養細胞、植物器官（例えば、葉、花弁、茎、
根、根茎、種子等）、又は植物組織（例えば、表皮、師
部、柔組織、木部、維管束等）のいずれを意味するもの
である。[0013] The target plant in the present specification is not particularly limited. It may be a monocotyledon or a dicotyledon.
Plants can also be selected from various cultivated crop species. For example, cereals such as rice, rye, wheat, corn, barley, sorghum, various fruits such as oranges, vegetables such as cabbage, radish, carrots, tobacco, sugarcane, rapeseed, soybeans, and craft products such as sunflowers. Can be. In addition, Arabidopsis and the like,
Examples include moss plants such as green algae, red algae, and moss. The present invention is also directed to a propagation medium (eg, seeds, rhizomes, cuttings, etc.) obtained from the plant of the present invention. In the present specification, a plant cell refers to a cultured cell of a plant or a plant organ (for example, leaf, petal, stem,
Root, rhizome, seed, etc.) or plant tissue (eg, epidermis, phloem, parenchyma, xylem, vascular bundle, etc.).

【００１４】一方、変異体は、各種公知の突然変異誘発
処理により変異を誘発させることにより得ることができ
る。例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、５−
ブロモウラシル、２−アミノプリン、ヒドロキシルアミ
ン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン、アジ化ナトリウム、エチレンイミン等の突然変異を
誘発する化合物を用いた処理、ガンマ線、ベータ線、Ｘ
線、速中性子、熱中性子等の各種照射処理、トランスポ
ゾン等を利用できる。On the other hand, the mutant can be obtained by inducing mutation by various known mutagenesis treatments. For example, ethyl methanesulfonic acid (EMS), 5-
Treatment with a mutagenic compound such as bromouracil, 2-aminopurine, hydroxylamine, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, sodium azide, ethyleneimine, gamma rays, beta rays, X
Various irradiation treatments such as radiation, fast neutrons and thermal neutrons, and transposons can be used.

【００１５】トランスポゾンを利用する例として、組織
培養や各種ストレスなどにより活性化することが知られ
ているトランスポゾンの転移挿入を利用することができ
る。例えば、使用するトランスポゾンが活性化すること
が知られている条件下に植物細胞を生育させ、突然変異
を誘発することができる。イネにおいては、Tos１７等
を使用できる。また、トウモロコシでは、Ac/Ds、Mutat
or、Spm/dSpm、En/Spm等を使用できる。シロイヌナズナ
では、Ac/Ds、En/Spmt、タバコにおいてはTnt１を使用
できる。以下、イネのレトロトランスポゾンの一種であ
るTos１７による遺伝子破壊変異体の作製方法について
説明する。As an example of using a transposon, transposable transposons, which are known to be activated by tissue culture or various stresses, can be used. For example, plant cells can be grown and mutagenized under conditions known to activate the transposon used. In rice, Tos17 or the like can be used. In corn, Ac / Ds, Mutat
or, Spm / dSpm, En / Spm, etc. can be used. In Arabidopsis, Ac / Ds and En / Spmt can be used, and in tobacco, Tnt1 can be used. Hereinafter, a method for producing a gene disruption mutant using Tos17, a kind of rice retrotransposon, will be described.

【００１６】Tos１７は、組織培養によってその転移活
動が活性化することが知られている。このため、植物体
から採取した器官や組織をカルス誘導する。カルス誘導
は、採取した、例えば、玄米（種子）等の植物器官を滅
菌、洗浄後、公知のカルス誘導培地に移植し、一定期
間、培養することにより実施することができる。さら
に、得られた細胞塊の一部を採取し、これを例えばＮ６
基本培地等の液体培養に適した培地に移植し、さらに、
継代培養することができる。液体培養期間は、通常２、
３ヶ月から５ヶ月程度とすることができる。[0016] Tos17 is known to activate its metastatic activity by tissue culture. For this reason, calli are induced in organs and tissues collected from the plant. Callus induction can be performed by sterilizing and washing the collected plant organs, for example, brown rice (seed), transplanting it into a known callus induction medium, and culturing it for a certain period of time. Further, a part of the obtained cell mass is collected and is
Transfer to a medium suitable for liquid culture such as a basic medium, and further,
It can be subcultured. The liquid culture period is usually 2,
It can be about three to five months.

【００１７】Tos１７は、特に、液体培養期において転
移活動が活発化するとされている。Tos１７による挿入
転移を有する細胞系統では、再分化個体とすることによ
り保存され、安定した変異植物体を得ることができる。
Tos１７の転移により細胞膜プロトン−ATPアーゼ遺伝子
の破壊された変異体を分離するには、公知のTos１７配
列（Hirochika et al., Proc. Natl. Sci. USA93:7783-
7788(1996)）に基づいて作製したPCRプライマーを用い
て、TAIL-PCR(Liu and Whittier，GENOMICS 25:674-681
(1995))等を実施して、Tos１７挿入部位に隣接するゲノ
ムDNA領域を増幅し、細胞膜プロトン−ATPアーゼ遺伝子
に基づいて作製したプローブによるスクリーニング、当
該増幅断片について塩基配列の決定・相同性検索等を実
施することにより可能である。It is said that Tos17 activates metastatic activity particularly during the liquid culture period. In a cell line having an insertion transfer by Tos17, it is possible to obtain a stable mutant plant which is preserved by being a regenerated individual.
To isolate mutants in which the cell membrane proton-ATPase gene has been disrupted by Tos17 transfer, a known Tos17 sequence (Hirochika et al., Proc. Natl. Sci. USA 93: 7783-
7788 (1996)), using TAIL-PCR (Liu and Whittier, GENOMICS 25: 674-681).
(1995)) to amplify the genomic DNA region adjacent to the Tos17 insertion site, screen with a probe prepared based on the cell membrane proton-ATPase gene, determine the nucleotide sequence of the amplified fragment, and search for homology It is possible by implementing the above.

【００１８】細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼをコードす
る遺伝子の発現が阻害された植物体、あるいは細胞膜プ
ロトン−ＡＴＰアーゼ遺伝子の活性が阻害された植物体
は、上記した当該遺伝子の破壊体の他、植物細胞におい
てアンチセンスＲＮＡを発現させたり、不完全な細胞膜
プロトン−ＡＴＰアーゼを発現させたり、あるいはコサ
プレッション現象（Montgomeryら(1998)、Trends Gene
t., 14,255-）を利用するような形質転換細胞を得て、
植物体に再生することにより取得できる。Plants in which the expression of the gene encoding the cell membrane proton-ATPase is inhibited, or plants in which the activity of the cell membrane proton-ATPase gene is inhibited, may be plant cells other than the above-mentioned disrupted gene. Expression of antisense RNA, incomplete expression of cell membrane proton-ATPase, or cosuppression (Montgomery et al. (1998), Trends Gene
t., 14,255-) to obtain transformed cells,
It can be obtained by regenerating the plant.

【００１９】このような形質転換細胞は、プロモーター
配列、プロモーター配列の下流にセンスあるいはアンチ
センス方向に連結した細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼ遺
伝子の全部あるいは一部、さらに必要に応じてポリアデ
ニレーション配列を含むターミネーター配列を含むＤＮ
Ａコンストラクトを植物細胞に導入することにより行
う。ＤＮＡコンストラクトに含めることのできるプロモ
ーター配列としては、下流に連結されたコード配列を恒
常的又は誘導的に発現させることのできるものを使用で
きる。好ましくは、恒常的発現型プロモーターである。
恒常発現型プロモーターとしては、恒常発現型プロモー
ターとしては、たとえば、カリフラワーモザイクウイル
スの３５Ｓプロモーター(Odell et al.1985 Nature 31
3:810)、イネのアクチンプロモーター(Zhang et al.199
1 Plant Cell 3:1155)、トウモロコシのユビキチンプロ
モーター（Cornejo et al.1993 Plant Mol.Biol.23:56
7）などが挙げられる。Such a transformed cell contains a promoter sequence, all or a part of a cell membrane proton-ATPase gene linked in a sense or antisense direction downstream of the promoter sequence, and further, if necessary, a polyadenylation sequence. DN containing terminator sequence
This is performed by introducing the A construct into a plant cell. As a promoter sequence that can be included in the DNA construct, a promoter sequence that can constitutively or inducibly express a coding sequence linked downstream can be used. Preferably, it is a constitutively expressed promoter.
Examples of the constitutively expressed promoter include, for example, the cauliflower mosaic virus 35S promoter (Odell et al. 1985 Nature 31).
3: 810), rice actin promoter (Zhang et al. 199).
1 Plant Cell 3: 1155), corn ubiquitin promoter (Cornejo et al. 1993 Plant Mol. Biol. 23:56
7) and the like.

【００２０】アンチセンスＲＮＡを発現させるには、細
胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼをコードするＤＮＡの全部
又は一部を、植物細胞内で恒常的あるいは誘導的に転写
可能に作用するプロモーターの下流にアンチセンス方向
に連結する。細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼの転写産物
に相補的なアンチセンスＲＮＡを発現させることによ
り、植物細胞内で細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼの発現
が阻害され、結果として、植物体で生育媒体のｐＨ変化
による傷害を引き起こすことができるようになる。ま
た、コサプレッション現象を利用する場合、植物細胞で
作用可能な強力なプロモーター下に細胞膜プロトン−Ａ
ＴＰアーゼ遺伝子をセンス方向に連結する。これによ
り、この導入した遺伝子と内在する当該遺伝子の発現が
阻害され、結果として、植物細胞内で細胞膜プロトン−
ＡＴＰアーゼの発現が阻害されることになる。さらに、
植物細胞内で作用可能なプロモーターの下流に、不完全
な細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼを発現するように、細
胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼ遺伝子の一部あるいは改変
したＤＮＡ配列を連結する。これにより、不完全な当該
酵素が蓄積した場合には、植物細胞内において内在する
完全な酵素の機能を阻害し、結果として、細胞膜プロト
ン−ＡＴＰアーゼの発現が阻害されることになる。In order to express the antisense RNA, all or a part of the DNA encoding the cell membrane proton-ATPase is transferred to the antisense direction in a plant cell in a manner that is constitutively or inducibly transcribed downstream of a promoter. Connect to By expressing an antisense RNA complementary to a transcript of a cell membrane proton-ATPase, the expression of a cell membrane proton-ATPase is inhibited in a plant cell, and as a result, damage due to a change in the pH of a growth medium in a plant is prevented. Will be able to cause. In addition, when utilizing the cosuppression phenomenon, cell membrane proton-A is placed under a strong promoter capable of acting on plant cells.
The TPase gene is ligated in the sense direction. As a result, the expression of the introduced gene and the endogenous gene is inhibited, and as a result, the cell membrane proton-
ATPase expression will be inhibited. further,
A part of the cell membrane proton-ATPase gene or a modified DNA sequence is ligated downstream of the promoter capable of acting in plant cells so as to express incomplete cell membrane proton-ATPase. As a result, when the incomplete enzyme accumulates, the function of the complete enzyme inherent in the plant cell is inhibited, and as a result, the expression of cell membrane proton-ATPase is inhibited.

【００２１】なお、細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼ遺伝
子が破壊された植物体は、例えば、植物細胞において当
該遺伝子を外来核酸配列によってノックアウトすること
によって得ることもできる。ヒメツリガネゴケ等の相同
組換えが可能な植物では、当該遺伝子をターゲィテング
してノックアウトできる。このために導入される外来核
酸配列は、当該遺伝子領域に相同なＤＮＡ配列を有する
他は、特に限定しない。また、その植物細胞に対して外
来性であるトランスポゾン（レトロトランスポゾンを含
む）やＴ−ＤＮＡを利用して、当該遺伝子をノックアウ
トすることもできる。この場合の核酸配列は、ＤＮＡで
あってもＲＮＡであってもよい。これらの外来核酸配列
によるノックアウトでは、導入のための外来核酸配列と
して、染色体への組み込みを選別するのに有効な選択マ
ーカー遺伝子を含めることもできる。選択マーカー遺伝
子としては、各種公知の抗生物質耐性遺伝子やレポータ
ー遺伝子を使用できる。また、これらのマーカー遺伝子
を発現させるためのプロモーターも外来核酸配列に含め
ることができる。The plant in which the cell membrane proton-ATPase gene has been disrupted can also be obtained, for example, by knocking out the gene in a plant cell with a foreign nucleic acid sequence. In plants capable of homologous recombination such as Physcomitrella patens, the gene can be targeted and knocked out. The foreign nucleic acid sequence introduced for this purpose is not particularly limited, except that it has a DNA sequence homologous to the gene region. The gene can also be knocked out using a transposon (including a retrotransposon) or T-DNA that is exogenous to the plant cell. The nucleic acid sequence in this case may be DNA or RNA. In the knockout using these foreign nucleic acid sequences, a selectable marker gene effective for selecting integration into a chromosome can be included as a foreign nucleic acid sequence for introduction. As the selectable marker gene, various known antibiotic resistance genes and reporter genes can be used. In addition, a promoter for expressing these marker genes can be included in the foreign nucleic acid sequence.

【００２２】上記したＤＮＡコンストラクト又はこのよ
うな核酸配列を有するプラスミドやファージ等のベクタ
ーを、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール
法、リポソーム法、マイクロインジェクション法等によ
り植物細胞に直接導入することができる。また、形質転
換因子として、アグロバクテリウム属菌であるアグロバ
クテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefa
ciens）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacte
rium rhizogenes）を用いたＴ−ＤＮＡによる形質転換
法も用いることができる。この場合、導入すべきＤＮＡ
配列を中間ベクターあるいはバイナリーベクターの中に
クローニングする。例えば、外来遺伝子は、採取した植
物切片に、適当な外来遺伝子を含むベクターをアグロバ
クテリウム感染法等で処理して、前記植物細胞に導入さ
れる。The above-described DNA construct or a vector such as a plasmid or phage having such a nucleic acid sequence can be directly introduced into plant cells by a particle gun method, a polyethylene glycol method, a liposome method, a microinjection method, or the like. In addition, Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefa
ciens), Agrobacterium rhizogenes (Agrobacte)
Transformation method using T-DNA using Rium rhizogenes) can also be used. In this case, the DNA to be introduced
The sequence is cloned into an intermediate or binary vector. For example, the exogenous gene is introduced into the plant cell by treating a collected plant section with a vector containing an appropriate exogenous gene by an Agrobacterium infection method or the like.

【００２３】変異処理後の細胞や形質転換した植物細胞
は、再生過程を経ることにより植物体に変換することが
できる。再生の方法は、植物の種類によって異なるが、
例えば、イネでは、Fujimuraら（Fujimuraら（1995）、
Plant Tissue Culture Lett.,vol.2:p74-）の方法、ト
ウモロコシでは、Shillitoら（Shillitoら(1989), Bio/
Technology, vol. 7:p581-）の方法、シロイヌナズナで
はAkamaら（Akamaら（1992）、Plant Cell Rep., vol.1
2：7-）の方法が挙げられる。なお、再生された植物体
を他の品種と交配して、好ましい品種において細胞膜プ
ロトン−ＡＴＰアーゼ遺伝子が破壊され、その発現が阻
害等された植物体を得ることもできる。例えば、細胞膜
プロトン−ATPアーゼ遺伝子(OSA1)が破壊された植物体
が水稲である場合、これを適当な陸稲品種と交配し、細
胞膜プロトン−ATPアーゼ遺伝子(OSA1)が破壊された陸
稲を作成することにより、水田以外の畑作地等でも使用
可能となり、より実用的になる。The cells after the mutation treatment and the transformed plant cells can be converted into plants by undergoing a regeneration process. The method of regeneration depends on the type of plant,
For example, in rice, Fujimura et al. (Fujimura et al. (1995)
In the method of Plant Tissue Culture Lett., Vol. 2: p74-) and corn, Shillito et al. (Shillito et al. (1989), Bio /
Technology, vol. 7: p581-). In Arabidopsis, Akama et al. (Akama et al. (1992), Plant Cell Rep., Vol. 1)
2: 7-). The regenerated plants can be crossed with other varieties to obtain plants in which the cell membrane proton-ATPase gene is disrupted in preferred varieties and whose expression is inhibited. For example, when the plant in which the cell membrane proton-ATPase gene (OSA1) is disrupted is rice, this is crossed with an appropriate upland rice variety to produce upland rice in which the cell membrane proton-ATPase gene (OSA1) is disrupted. This makes it possible to use it in upland fields other than paddy fields, which makes it more practical.

【００２４】これらの方法により作出された植物体又は
その繁殖媒体（種子、根茎、切穂等）は、正常型（野生
型を含む）の植物体を比較して、生育媒体のｐＨ変化、
特に酸性化した場合において、その形態、成長等が変化
する。The plants produced by these methods or the propagation medium (seed, rhizome, cuttings, etc.) of these plants are compared with those of normal (including wild-type) plants to obtain a change in pH of the growth medium,
Especially when acidified, its morphology, growth and the like change.

【００２５】本発明の植物体は、出芽後、育苗した苗を
評価する生育媒体に正常植物体とともに移植して用いる
ことができる。これにより、生育媒体評価用のモニタリ
ング材料として使用できる。植物体の生育媒体として
は、土壌が一般的であるが、植物体の種類、生育方法、
収穫形態によって、水耕等とすることができる。本発明
における植物体の生育状態のモニタリング゛は、地上部
である草丈、葉の姿勢、葉色、分げつの程度を主に、ま
た地下部においては根の伸長具合を、正常個体と比較す
ることにより行う。本発明の植物体において生育阻害が
観察された生育媒体では、酸性化が起こっていると予測
される。After emergence, the plant of the present invention can be transplanted together with a normal plant into a growth medium for evaluating the grown seedlings. Thereby, it can be used as a monitoring material for evaluating a growth medium. As a growth medium for plants, soil is generally used, but the types of plants, growth methods,
Depending on the form of harvesting, hydroponics can be used. In the present invention, the monitoring of the growth state of the plant is performed by comparing the height of the above-ground portion, the posture of the leaves, the color of the leaves, the degree of tillering, and the degree of root elongation in the underground portion with that of a normal individual. Performed by It is predicted that acidification has occurred in the growth medium in which growth inhibition was observed in the plant of the present invention.

【００２６】あらかじめ、評価対象である生育媒体（典
型的には土壌である）における低ｐＨの影響、あるいは
塩高濃度の影響を、数段階の条件を設定して、それぞれ
の生育状態の変化を観察しておくことにより、定性のみ
ならず定量的な生育媒体の特性評価も可能となる。例え
ば、pHを3.5,4.0,4.5,5.0.5.5,6.0にそれぞれ調整した
生育媒体に本発明の植物体および正常植物体を移植し、
草丈、葉の姿勢、葉色、および根の伸長等を比較観察
し、低pHが及ぼす影響を調べておく。このような定量的
予備評価は、評価対象の生育媒体の種類ごとに実施して
おくのが望ましい。The effect of low pH or the effect of high salt concentration on the growth medium to be evaluated (typically, soil) is set in advance in several stages to determine the change in each growth state. Observation makes it possible to evaluate not only qualitatively but also quantitatively the characteristics of the growth medium. For example, transplanting the plant and normal plant of the present invention into a growth medium whose pH is adjusted to 3.5, 4.0, 4.5, 5.0.5.5, 6.0 respectively,
Comparative observation of plant height, leaf posture, leaf color, root elongation, etc. is conducted to examine the effects of low pH. Such a quantitative preliminary evaluation is desirably performed for each type of growth medium to be evaluated.

【００２７】これらの発明によれば、本発明の植物体を
評価対象の生育媒体に植生させ、その生育状態を目視に
よって観察するという非常に簡便な方法で、特に測定機
材、測定操作等の手間を必要としないところに最大のメ
リットがあり、利用価値が高い。また、植物体が変異体
である場合には、組換え体の制限を受けないため、使用
場所に制限はなく、評価対象生育媒体に直接植生させ、
栽培現場での評価を可能にする方法を提供できる。特
に、生育媒体の酸性化は、作物の生育に悪影響を及ぼ
し、収量減をもたらしうる。本発明を用いることによ
り、簡便で迅速な土壌等の酸性ストレスのモニタリング
が可能となり、土壌等の生育媒体ストレスに早急に対処
することができ、作物の減収を未然に防ぐことが可能に
なる。According to these inventions, the plant of the present invention is vegetated on a growth medium to be evaluated, and the state of growth is visually observed. It has the greatest advantage where it is not required and is highly useful. In addition, when the plant is a mutant, since there is no restriction on the recombinant, there is no restriction on the place of use, and the plant is directly vegetated on the growth medium to be evaluated.
It is possible to provide a method that enables evaluation at a cultivation site. In particular, acidification of the growth medium can adversely affect the growth of the crop and result in reduced yield. ADVANTAGE OF THE INVENTION By using this invention, monitoring of the acidic stress of soil etc. is attained easily and quickly, it is possible to cope with the growth medium stress of soil etc. immediately, and it becomes possible to prevent a decrease in crop yield beforehand.

【００２８】[0028]

【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものでは
ない。なお、DNAの切断、連結、大腸菌の形質転換、遺
伝子の塩基配列決定等一般の遺伝子組換えに必要な方法
は、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に添付さ
れている説明書や、実験書（例えば「Molecular clonin
g (Maniatis T. et al. Cold Spring Harbor Laborator
y Press)」）に基本的に従った。また、イネの寒天培地
や土壌を用いた育成、交配、ゲノムDNAの調製は実験書
（例えば「モデル植物の実験プロトコール（秀潤
社）」）に基本的に従った。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples. The methods required for general gene recombination such as DNA cutting, ligation, transformation of E. coli, and sequencing of genes are described in commercially available reagents used in each operation, instructions attached to mechanical devices, and the like. , Experiment book (for example, "Molecular clonin
g (Maniatis T. et al. Cold Spring Harbor Laborator
y Press) "). The growth, crossing, and preparation of genomic DNA of rice using an agar medium or soil basically followed an experiment book (for example, “Experimental protocol of model plant (Shujunsha)”).

【００２９】細胞膜プロトン―ATPアーゼ遺伝子（OSA
1）破壊個体の作製 発明者らは、レトロトランスポゾンTos17による遺伝子
破壊変異体を得るために、以下の方法を実施した。カル
ス誘導は以下に述べる方法で実施した。台中65号種籾か
ら籾を手で取り除いた。未熟なもの、変色したもの、ひ
び割れのある玄米は省き、充実した玄米を選び、滅菌操
作に移した。滅菌シャーレ内に玄米を入れ、70%エタノ
ールにて1分間ロータリーシェーカーで振とうさせ、表
面殺菌を行った。エタノール殺菌後、滅菌水にて表面を
洗浄し、10％次亜塩素酸ナトリウム溶液にて1時間表面
殺菌を行った。カルス誘導は表１に示す組成のMS基本培
地を使用した。ゲル化剤としてゲランガムを用いた。 Cell membrane proton-ATPase gene (OSA
1) Production of disrupted individuals The inventors carried out the following method to obtain a gene disruption mutant by the retrotransposon Tos17. Callus induction was performed by the method described below. Paddy was removed from Taichung No. 65 paddy by hand. Immature, discolored, and cracked brown rice were omitted, and a fuller brown rice was selected for sterilization. Brown rice was placed in a sterile petri dish and shaken with a 70% ethanol for 1 minute on a rotary shaker to sterilize the surface. After sterilization with ethanol, the surface was washed with sterilized water, and sterilized with a 10% sodium hypochlorite solution for 1 hour. For callus induction, an MS basal medium having the composition shown in Table 1 was used. Gellan gum was used as a gelling agent.

【表１】 [Table 1]

【００３０】培地を滅菌後、シャーレにてプレートを作
製した。籾を除去した玄米を表面殺菌した後、カルス誘
導培地プレート上に無菌的に玄米の胚の部分を上部に
し、置床した。プレート上には5、6粒の玄米を等間隔に
置床した。置床後、30℃、暗条件のインキュベータにて
3週間から一カ月培養を行った。After the medium was sterilized, a plate was prepared in a petri dish. After the surface of the brown rice from which the paddy had been removed was sterilized, the brown rice embryo portion was aseptically placed on a callus induction medium plate with the embryo portion as the upper part. Five or six grains of brown rice were placed on the plate at equal intervals. After placing, in an incubator at 30 ° C in the dark
Culture was performed for three weeks to one month.

【００３１】液体培養は表２に示す組成のN6基本培地を
用いた。培地の液量は100ml三角フラスコ(植物培養用リ
ム無し)の場合30ml ,200m三角フラスコの場合は50mlと
した。カルスをN6基本培地に移植後、30℃、暗条件下で
旋回培養(100rpm)を行った。1〜2週間毎に新しい培地に
交換し継代培養を行った。For liquid culture, an N6 basic medium having the composition shown in Table 2 was used. The volume of the medium was 30 ml for a 100 ml Erlenmeyer flask (without a rim for plant culture) and 50 ml for a 200 m Erlenmeyer flask. After transplanting the callus into the N6 basal medium, swirling culture (100 rpm) was performed at 30 ° C. in the dark. The medium was replaced with a fresh medium every 1-2 weeks, and subculture was performed.

【表２】 [Table 2]

【００３２】継代培養後、再分化個体（遺伝子破壊個
体）を得るため、カルスを再分化培地へ移植した。再分
化には表３に示す組成のＲ2基本培地を用いた。ゲル化
剤としてゲランガムを用い、シャーレにてプレートを作
製した。After the subculture, calli were transplanted to a regeneration medium to obtain a regeneration individual (gene-disrupted individual). R2 basal medium having the composition shown in Table 3 was used for regeneration. A plate was prepared in a petri dish using gellan gum as a gelling agent.

【表３】 植物細胞からの再分化は通常植物ホルモンのバランスを
変えることが刺激となる。カルス段階の維持にはオーキ
シン濃度がサイトカイニン濃度より高い状態で加えられ
ているが、再分化時はサイトカイニン濃度がオーキシン
濃度より高い状態で加えられることにより植物体が再生
するといわれている。オーキシンとしてインドール酢酸
(IAA)、サイトカイニンとしてカイネチン(kinetin)を用
いた。IAAについては熱に弱いため濾過滅菌し、オート
クレーブ後添加した。[Table 3] Regeneration from plant cells is usually stimulated by altering the balance of plant hormones. It is said that the auxin concentration is higher than the cytokinin concentration for maintaining the callus stage, but it is said that during regeneration, the plant is regenerated by adding the cytokinin concentration higher than the auxin concentration. Indole acetic acid as auxin
(IAA), kinetin was used as cytokinin. IAA was sterilized by filtration because it was weak to heat, and added after autoclaving.

【００３３】カルスは約1〜2mmの大きさに切断し、再分
化培地上に無菌的に置床した。1プレートに4〜10個のカ
ルスを等間隔に置床した。置床後30℃、6000Lxの連続照
明下で培養した。2週間後、グリーンスポット（緑点）
が観察された。グリーンスポットおよび白色カルスを再
分化培地上に移植した。カルスの移植は2週間毎に行っ
た。芽が2cm程度に生育したら、付着した寒天培地を除
去後、ホルモンフリーのR2基本培地(培養用丸ポット)に
移植した。再生された植物体を土壌に移植する際、培地
容器内の環境から外部の栽培環境に適応できるように馴
化を行った。植物体が丸ポットの蓋につくまで生育させ
た後、植物体に付着した寒天培地を水道水で洗浄、除去
した後、50%バーミキュライトと50%くみあい肥鉄培土(
水田土)を混合したミニポットに移植した。ビニール袋
を上部にかぶせ、30℃6000Lxの連続照明下で栽培した。
数日後、ビニール袋に小さな穴を10カ所ほどあけ、環境
に徐々に馴れさせた。馴化後、植物体はくみあい肥鉄培
土のみ入ったミニポットへ移植した。The calli were cut to a size of about 1 to 2 mm, and aseptically placed on a regeneration medium. Four to ten calli were placed on one plate at equal intervals. After the placement, the cells were cultured at 30 ° C. under continuous lighting of 6000 Lx. Two weeks later, a green spot (green dot)
Was observed. Green spots and white calli were implanted on regeneration medium. Callus transplantation was performed every two weeks. When the buds grew to about 2 cm, the attached agar medium was removed and transplanted to a hormone-free R2 basic medium (round pot for culture). When transplanting the regenerated plants to the soil, they were adapted from the environment in the culture vessel to the external cultivation environment. After the plant was grown until it stuck to the lid of the round pot, the agar medium attached to the plant was washed with tap water and removed, and then 50% vermiculite and 50% mixed fertilizer soil (
(Mizuta soil) was transplanted to a mini pot. The plastic bag was put on the top and cultivated under continuous lighting of 30 ° C and 6000Lx.
A few days later, about 10 small holes were made in the plastic bag to gradually adjust to the environment. After acclimation, the plants were transplanted into a minipot containing only fertilizer soil.

【００３４】Tos17の転移により破壊された遺伝子を分
離するために、公知のTos17の配列（Hirochika et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7783-7788(1996)）に
基づいて作製したPCRプライマーを用いて、TAIL-PCR（L
iu and Whittier, GENOMICS25:674-681(1995)）を行っ
た。具体的には、Tos17の挿入部位に隣接するゲノムDNA
領域を増幅することがきる3種類のPCRプライマー「配列
番号：１／5-ACTGTATAGTTGGCCCATGTCCAG-3」、「配列番
号：２／5-CCCATCGGATGTCCAGTCCATTGG-3」、「配列番
号：３／5-GCTAATACTATTGTTAGGTTGCAA-3」を合成し、こ
れらを用いて、Tos17挿入部位に隣接したゲノムDNAをTA
IL-PCR法を用いて増幅させ、アガロース電気泳動で調べ
た。該断片をベクターにサブクローニング（TOPO TA cl
oning kit：Invitorogen社）し、塩基配列の決定（ABI
PRISMTM 310 Genetic Analyser）を行ったところ、Tos1
7の3'LTR側の配列とそれに続く染色体ゲノムDNAと思わ
れる領域を含んでいた。次に、該断片についてデータベ
ース解析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/）を行っ
たところ、染色体ゲノムDNAと思われる領域の一部が、
「細胞膜プロトン―ATPアーゼ遺伝子（OSA1）」と一致
した系統を一系統（T4-7#16）を見出した。細胞膜プロ
トン―ATPアーゼ遺伝子OSA1は、Kasamo, Kらによって、
イネの培養細胞（品種日本晴）から単離された（Plant.
Physiol.99:794-795 (1992)）。これまでにイネの細胞
膜プロトン−ATPアーゼ遺伝子は3個のisoformsが報告さ
れている。アミノ酸配列で比較して、OSA１は、OSA2と8
9％の相同性を、OSA3とは92％の相同性を有している。
また、他の植物のプロトン−ATPアーゼ遺伝子と比較す
ると、トマト（Lycopersicon esculentum）のLHA1で88
%、のタバコ（Nicotianaplumbaginifolia）のPma3で87%
と非常に高い相同性を有している。OSA1のコードするタ
ンパク質は、956個のアミノ酸残基より成り、300番目に
位置するアミノ酸残基の上流に存在するイントロン領域
に、レトロトランスポゾンTos17が転移挿入し、本遺伝
子を完全に破壊した変異体を作出できた。To isolate a gene disrupted by Tos17 transposition, a known Tos17 sequence (Hirochika et al.,
Natl. Acad. Sci. USA 93: 7783-7788 (1996)), using TAIL-PCR (L
iu and Whittier, GENOMICS 25: 674-681 (1995)). Specifically, genomic DNA adjacent to the insertion site of Tos17
Three types of PCR primers that can amplify the region “SEQ ID NO: 1 / 5-ACTGTATAGTTGGCCCATGTCCAG-3”, “SEQ ID NO: 2 / 5-CCCATCGGATGTCCAGTCCATTGG-3”, “SEQ ID NO: 3 / 5-GCTAATACTATTGTTAGGTTGCAA-3” And use them to transform genomic DNA adjacent to the Tos17 insertion site into TA.
It was amplified using the IL-PCR method and examined by agarose electrophoresis. The fragment was subcloned into a vector (TOPO TA cl
oning kit: Invitorogen) and determination of nucleotide sequence (ABI
PRISMTM 310 Genetic Analyzer), Tos1
It contained the sequence on the 3'LTR side of 7, followed by a region thought to be chromosomal genomic DNA. Next, the fragment was subjected to database analysis (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/).
One strain (T4-7 # 16) was found that matched the “cell membrane proton-ATPase gene (OSA1)”. The cell membrane proton-ATPase gene OSA1 has been described by Kasamo, K et al.
Isolated from cultured rice cells (variety Nipponbare) (Plant.
Physiol. 99: 794-795 (1992)). So far, three isoforms have been reported for the rice cell membrane proton-ATPase gene. Compared to the amino acid sequence, OSA1 is compared to OSA2 and 8
It has 9% homology and 92% homology with OSA3.
In addition, when compared to the proton-ATPase gene of other plants, LHA1 of tomato (Lycopersicon esculentum) was 88%.
%, 87% of cigarettes (Nicotianaplumbaginifolia) Pma3
And has very high homology. The protein encoded by OSA1 consists of 956 amino acid residues, and a retrotransposon Tos17 is transposed and inserted into the intron region upstream of the amino acid residue at position 300, resulting in the complete disruption of this gene. Could be created.

【００３５】[0035]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KABUSHIKI KAISHA TOYOTA CHUO KENKYUSHO <120> Proton-ATPase Gene Knock-out Plants <160> 3 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Primer <400> 1 actgtatagt tggcccatgt ccag 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Primer <400> 2 cccatcggat gtccagtcca ttgg 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Primer <400> 3 gctaatacta ttgttaggtt gcaa 24 [Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> KABUSHIKI KAISHA TOYOTA CHUO KENKYUSHO <120> Proton-ATPase Gene Knock-out Plants <160> 3 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> < 223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer <400> 1 actgtatagt tggcccatgt ccag 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer <400> 2 cccatcggat gtccagtcca ttgg 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR Primer <400> 3 gctaatacta ttgttaggtt gcaa 24

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 宮崎 力 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 平井 正名 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD09 CD13 CD17 4B065 AA88X AB10 AC20 BA16 BB01 BB35 BC01 BC31 BC46 BD50 CA46 CA53  ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing from the front page (72) Inventor Miyazaki Riki 41-Yokomichi, Nagakute-cho, Aichi-gun, Aichi-gun, Toyota-Chuo Research Institute Co., Ltd. (72) Inventor Masana Hirai, Nagakute-cho, Aichi-gun, Aichi-gun 41, Yokomichi, No. 1 Inside Toyota Central R & D Laboratories F term (reference) 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD09 CD13 CD17 4B065 AA88X AB10 AC20 BA16 BB01 BB35 BC01 BC31 BC46 BD50 CA46 CA53

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼをコードす
る遺伝子が破壊された植物体。1. A plant in which a gene encoding a cell membrane proton-ATPase has been disrupted. 【請求項２】細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼをコードす
る遺伝子の発現が阻害されたか、あるいは当該酵素の活
性が阻害された植物体。2. A plant in which the expression of a gene encoding a cell membrane proton-ATPase is inhibited or the activity of the enzyme is inhibited. 【請求項３】前記植物体はイネである請求項１又は２記
載の植物体。3. The plant according to claim 1, wherein the plant is rice. 【請求項４】請求項１〜３のいずれかに記載の植物体の
生育状態をモニタリングすることを特徴とする植物生育
媒体の評価方法。4. A method for evaluating a plant growth medium, comprising monitoring the growth state of the plant according to claim 1. 【請求項５】請求項１〜３のいずれかに記載の植物体の
生育状態をモニタリングしつつ、維持しようとする植物
体を栽培することを特徴とする、植物体の製造方法。5. A method for producing a plant, comprising cultivating a plant to be maintained while monitoring the growth state of the plant according to claim 1.