JP2002247983A - Human vascular ibp-like growth factor - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。本発
明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害するこ
とに関する。The present invention relates to newly identified polynucleotides, polypeptides encoded by such polynucleotides, the use of such polynucleotides and polypeptides, and the use of such polynucleotides and polypeptides. For the production of peptides. The invention also relates to inhibiting the action of such polypeptides.
【０００２】本発明のポリペプチドは、ｃｅｆ１０／ｃ
ｙｒ６１、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、およびｎｏ
ｖを含む成長レギュレーターファミリー、ならびにイン
シュリン様成長因子（ＩＧＦ）の活性を調節するインシ
ュリン様成長因子結合タンパク質（ＩＢＰ）ファミリー
に関する。本発明のポリペプチドに対応するｍＲＮＡ
は、血管細胞型において高度に発現される。従って、本
ポリペプチドは、本明細書中以下においてヒト血管ＩＢ
Ｐ様成長因子、または「ＶＩＧＦ」と呼ばれる。[0002] The polypeptide of the present invention comprises cef10 / c
yr61, connective tissue growth factor (CTGF), and no
v as well as the insulin-like growth factor binding protein (IBP) family that regulates the activity of insulin-like growth factor (IGF). MRNA corresponding to the polypeptide of the present invention
Is highly expressed in vascular cell types. Accordingly, the polypeptides are referred to hereinafter as human vascular IB
Called P-like growth factor, or "VIGF".
【０００３】[0003]
【従来の技術】成長因子および他の***促進因子（形質
転換するガン遺伝子を含む）は、一定の細胞により発現
されるべき複合セットの遺伝子を急速に誘導し得る（Ｌ
ａｕ，Ｌ．Ｆ．およびＮａｔｈａｎｓ，Ｄ．，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，６：１６５−２０２（１９９
１））。即時型遺伝子または初期応答遺伝子と名付けら
れたこれらの遺伝子は、新たなタンパク質合成から独立
して、成長因子または***促進因子との接触後、数分以
内に転写的に活性化される。これらの即時型遺伝子のグ
ループは、複雑な生物学的プロセス（例えば、増殖およ
び成長、再生および創傷治癒）の調整に必要とされる分
泌される細胞外タンパク質をコードする（Ｒｙｓｅｃ
ｋ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅ
ｒ．，２：２３５−２３３（１９９１））。BACKGROUND OF THE INVENTION Growth factors and other mitogens, including transforming oncogenes, can rapidly induce a complex set of genes to be expressed by certain cells (L
au, L .; F. And Nathans, D.M. , Mole
cultural Aspectsof Cellular
Regulation, 6: 165-202 (199
1)). These genes, termed immediate or early response genes, are transcriptionally activated within minutes after contact with growth or mitogens, independent of new protein synthesis. These groups of immediate genes encode secreted extracellular proteins required for the regulation of complex biological processes such as proliferation and growth, regeneration and wound healing (Rysec
k, R. P. Et al., Cell Growth Diffe
r. , 2: 235-233 (1991)).
【０００４】このグループに属する、高度に関連するタ
ンパク質は、ウイルスガン遺伝子ｐｐ６０v-srcによる
誘導の後に検出された、ニワトリ由来のｃｅｆ１０を含
む（Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｄ．Ｌ．ら、ＰＮＡＳ，Ｕ．Ｓ．
Ａ．，８６：１１７８−１１８２（１９８９））。密接
に関連するタンパク質であるｃｙｒ６１は、血清または
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）により急速に活性化さ
れる（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｔ．Ｐ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．，１０：３５６９−３５７７（１９９
０））。ｃｅｆ１０とｃｙｒ６１との間の全アミノ酸同
一性は、８３％と同じくらいの高さである。第３のメン
バーは、ヒト結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）である（Ｂ
ｒａｄｈａｍ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１１４：１２８５−１２９４（１９９１）。ＣＴ
ＧＦは、トランスホーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）
により活性化した後、高レベルでヒト血管内皮細胞によ
り分泌されるシステインリッチなペプチドである。ＣＴ
ＧＦは、ＰＤＧＦ様生物学的活性およびＰＤＧＦ様免疫
学的活性を示し、そして特定の細胞表面レセプターに対
してＰＤＧＦと競合する。A highly related protein belonging to this group includes cef10 from chicken, which was detected after induction by the viral oncogene pp60 v-src (Simons, DL et al., PNAS, USA). .
A. , 86: 1178-1182 (1989)). A closely related protein, cyr61, is rapidly activated by serum or platelet derived growth factor (PDGF) (O'Brien, TP et al., Mol. Cell.
Biol. , 10: 3569-3577 (199).
0)). The total amino acid identity between cef10 and cyr61 is as high as 83%. A third member is human connective tissue growth factor (CTGF) (B
radham, D .; M. J. et al. Cell. Bio
l. , 114: 1285-1294 (1991). CT
GF is transforming growth factor β (TGF-β)
Is a cysteine-rich peptide secreted by human vascular endothelial cells at high levels after activation. CT
GF exhibits PDGF-like biological activity and PDGF-like immunological activity, and competes with PDGF for specific cell surface receptors.
【０００５】即時型タンパク質の第４のメンバーは、血
清により誘導されることが示され、そしてマウスゲノム
のある領域にマップされているｆｉｓｐ−１２である
（Ｒｙｓｅｃｋ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ
Ｄｉｆｆｅｒ．，２：２３５−２３３（１９９
１））。このファミリーのなお別のメンバーは、骨髄芽
球症関連ウイルス１型により誘導された腎芽細胞腫にお
いて過剰発現されることが見出され、成体腎臓細胞にお
いて通常抑制される、ニワトリ遺伝子ｎｏｖである。さ
らに、ニワトリ胚線維芽細胞におけるアミノ末端が切断
されたｎｏｖ産物の発現は、形質転換を誘導するのに十
分であった（Ｊｏｌｉｏｔ，Ｖ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：１０−２１（１９９２））。[0005] A fourth member of the immediate form protein is fisp-12, which has been shown to be induced by serum and has been mapped to a region of the mouse genome (Ryseck, RP et al., Cell Growth).
Differ. , 2: 235-233 (199).
1)). Yet another member of this family is the chicken gene nov, which is found to be overexpressed in nephroblastomas induced by myeloblastosis-associated virus type 1 and is normally repressed in adult kidney cells. . Furthermore, the expression of the amino-terminal truncated nov product in chicken embryo fibroblasts was sufficient to induce transformation (Joliot, V. et al., Mol. Cel).
l. Biol. , 12: 10-21 (1992)).
【０００６】これらの即時型遺伝子の発現は、成長因子
により引き起こされる事象のカスケードでの「第３のメ
ッセンジャー」として作用する。即時型遺伝子の発現
は、複雑な生物学的プロセス（例えば、細胞増殖が共通
の事象である分化および創傷治癒）の統合および調整に
必要とされることもまた考えられる。[0006] The expression of these immediate genes acts as a "third messenger" in a cascade of events caused by growth factors. It is also conceivable that immediate gene expression is required for the integration and regulation of complex biological processes, such as differentiation and wound healing, where cell proliferation is a common event.
【０００７】この成長レギュレーターの新生のファミリ
ーは、ＣＴＧＦ；ｃｅｆ１０／ｃｙｒ６１；およびｎｏ
ｖのためにＣＣＮファミリーと呼ばれる。本発明のＶＩ
ＧＦポリペプチドは、成長レギュレーターのこのファミ
リーのメンバーであると考えられる。ＶＩＧＦポリペプ
チドはまた、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タ
ンパク質に高度に相同である、一連のシステインを含
む。This emerging family of growth regulators includes CTGF; cef10 / cyr61; and no.
v for the CCN family. VI of the present invention
GF polypeptides are believed to be members of this family of growth regulators. VIGF polypeptides also include a series of cysteines that are highly homologous to insulin-like growth factor (IGF) binding proteins.
【０００８】少なくとも２つの異なる結合タンパク質、
すなわちＩＧＦ結合タンパク質５３およびＩＧＦ結合タ
ンパク質１が、成人ヒト血清において同定されている。
ＩＧＦ結合タンパク質は、ＩＧＦに対して刺激効果およ
び抑制効果の両方を有する。Ｃｌｅｍｍｏｎｓら、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７７：１５４８（１９８
６）は、ＩＧＦ結合タンパク質との複合体におけるＩＧ
Ｆの線維芽細胞表面レセプターおよび平滑筋細胞表面レ
セプターへの増大した結合を示した。インビトロでの種
々のＩＧＦ作用に対するＩＧＦ結合タンパク質の阻害効
果が示されており、その阻害効果として、脂肪細胞によ
るグルコース輸送、軟骨細胞による硫酸塩の取り込み、
および線維芽細胞におけるチミジンの取り込みの刺激が
挙げられる（Ｚａｐｆら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．，６３：１０７７（１９７９））。さらに、正常細
胞における成長因子媒介性***促進因子活性に対するＩ
ＧＦ結合タンパク質の阻害効果が示されている。[0008] At least two different binding proteins,
That is, IGF binding protein 53 and IGF binding protein 1 have been identified in adult human serum.
IGF binding proteins have both stimulatory and inhibitory effects on IGF. Clemmons et al.
Clin. Invest. , 77: 1548 (198
6) shows IG in complex with IGF binding protein
F showed increased binding to fibroblast and smooth muscle cell surface receptors. Inhibitory effects of IGF binding proteins on various IGF actions in vitro have been shown, including glucose transport by adipocytes, sulfate uptake by chondrocytes,
And stimulation of thymidine incorporation in fibroblasts (Zapf et al., J. Clin. Inves).
t. , 63: 1077 (1979)). In addition, I for growth factor-mediated mitogen activity in normal cells
The inhibitory effect of GF binding protein is shown.
【０００９】[0009]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒト血管Ｉ
ＢＰ様成長因子ポリペプチド（ＶＩＧＦ）、およびこの
ようなポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）、な
らびに組換え技術によりこのようなポリペプチドを産生
するための手順を提供すること、ならびにこれらのポリ
ペプチドの作用を阻害することを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a human vascular I
Providing BP-like growth factor polypeptides (VIGF), and DNA (RNA) encoding such polypeptides, and procedures for producing such polypeptides by recombinant techniques, and these polypeptides The purpose is to inhibit the action of.
【００１０】[0010]
【課題を解決するための手段】本発明の１つの局面によ
れば、ＶＩＧＦならびに生物学的に活性で、かつ診断ま
たは治療に有用なそのフラグメント、アナログおよび誘
導体である、新規の成熟ポリペプチドが提供される。According to one aspect of the present invention, there is provided a novel mature polypeptide, VIGF, and fragments, analogs and derivatives thereof that are biologically active and useful for diagnosis or therapy. Provided.
【００１１】本発明の別の局面によれば、ｍＲＮＡ、Ｄ
ＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびにそのアナロ
グ、および生物学的に活性で、かつ診断または治療に有
用なそのフラグメントおよび誘導体を含む、ヒトＶＩＧ
Ｆをコードする単離された核酸分子が提供される。According to another aspect of the present invention, mRNA, D
Human VIG comprising NA, cDNA, genomic DNA, and analogs thereof, and fragments and derivatives thereof that are biologically active and useful for diagnosis or therapy
An isolated nucleic acid molecule encoding F is provided.
【００１２】本発明のなおさらなる局面によれば、前記
タンパク質の発現およびその後の前記タンパク質の回収
を促進する条件下で、ヒトＶＩＧＦ核酸配列を含む、組
換え原核宿主細胞および／または真核宿主細胞を培養す
る工程を包含する、組換え技術によりこのようなポリペ
プチドを産生するためのプロセスが提供される。According to a still further aspect of the present invention, a recombinant prokaryotic and / or eukaryotic host cell comprising a human VIGF nucleic acid sequence under conditions that promote expression of said protein and subsequent recovery of said protein. There is provided a process for producing such a polypeptide by recombinant techniques, comprising the step of culturing
【００１３】本発明のなおさらなる局面によれば、治療
目的（例えば、筋肉消耗病、骨粗しょう症の処置、移植
片固定の扶助、創傷治癒または組織再生の刺激、脈管形
成の促進ならびに血管平滑筋生成および血管内皮細胞生
成の増加）のために、このようなポリペプチド、または
このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を使用するプロセスが提供される。In accordance with yet a further aspect of the present invention, therapeutic objectives (eg, treating muscle wasting disease, osteoporosis, assisting graft fixation, stimulating wound healing or tissue regeneration, promoting angiogenesis and vascular smoothing). Processes using such polypeptides, or polynucleotides encoding such polypeptides, are provided for the production of muscle and vascular endothelial cells.
【００１４】本発明のなおさらなる局面によれば、この
ようなポリペプチドに対する抗体が提供される。According to yet a further aspect of the present invention, there are provided antibodies against such polypeptides.
【００１５】本発明のなお別の局面によれば、このよう
なポリペプチドに対するアンタゴニストが提供される。
これは、このようなポリペプチドの作用を阻害するため
（例えば、創傷治癒または肺線維症の間の過剰な結合組
織の生成を制限するため）に使用され得る。[0015] According to yet another aspect of the present invention, there are provided antagonists to such polypeptides.
This can be used to inhibit the action of such polypeptides (eg, to limit the production of excess connective tissue during wound healing or pulmonary fibrosis).
【００１６】本発明のなおさらなる局面によれば、ＶＩ
ＧＦ配列に特異的にハイブリダイズするために十分な長
さの核酸分子を含有する核酸プローブもまた提供され
る。According to a still further aspect of the present invention, VI
Nucleic acid probes containing nucleic acid molecules of sufficient length to specifically hybridize to a GF sequence are also provided.
【００１７】本発明のなお別の局面によれば、ＶＩＧＦ
ポリペプチドの発現低下および過剰発現ならびにこのよ
うなポリペプチドをコードする核酸配列中の変異に関す
る疾患を検出するための診断アッセイが提供される。According to yet another aspect of the present invention, a VIGF
Diagnostic assays are provided for detecting diseases involving reduced and over-expression of polypeptides and mutations in nucleic acid sequences encoding such polypeptides.
【００１８】１つの局面において、本発明は単離された
ポリヌクレオチドに関し、このポリヌクレオチドは、
（ａ）図１の推定のアミノ酸配列を有するＶＩＧＦポリ
ペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、ア
ナログまたは誘導体をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号７５８７４に含まれるｃＤＮＡ
によりコードされるアミノ酸配列を有するＶＩＧＦポリ
ペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、ア
ナログまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドから
なる群から選択される。In one aspect, the invention relates to an isolated polynucleotide, wherein the polynucleotide comprises:
(A) a polynucleotide encoding a VIGF polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIG. 1, or a fragment, analog or derivative of the polypeptide;
(B) cDNA contained in ATCC accession number 75874
Selected from the group consisting of a VIGF polypeptide having an amino acid sequence encoded by or a polynucleotide encoding a fragment, analog or derivative of the polypeptide.
【００１９】１つの実施形態において、上記ポリヌクレ
オチドはＤＮＡである。[0019] In one embodiment, the polynucleotide is DNA.
【００２０】別の実施形態において、上記ポリヌクレオ
チドはＲＮＡである。[0020] In another embodiment, the polynucleotide is RNA.
【００２１】別の実施形態において、上記ポリヌクレオ
チドはゲノムＤＮＡである。[0021] In another embodiment, the polynucleotide is genomic DNA.
【００２２】好ましい実施形態において、上記ポリヌク
レオチドは、図１の推定アミノ酸配列を有するＶＩＧＦ
をコードする。In a preferred embodiment, the polynucleotide comprises a VIGF having the deduced amino acid sequence of FIG.
Code.
【００２３】好ましい実施形態において、上記ポリヌク
レオチドは、ＡＴＣＣ受託番号７５８７４のｃＤＮＡに
よりコードされるＶＩＧＦポリペプチドをコードする。In a preferred embodiment, the polynucleotide encodes a VIGF polypeptide encoded by the cDNA at ATCC Accession No. 75874.
【００２４】さらなる実施形態において、上記ポリヌク
レオチドは、図１に示されるＶＩＧＦのコード配列を有
する。In a further embodiment, the polynucleotide has the coding sequence for VIGF shown in FIG.
【００２５】さらなる別の実施形態において、上記ポリ
ヌクレオチドは、ＡＴＣＣ受託番号７５８７４として寄
託されるＶＩＧＦのコード配列を有する。In yet another embodiment, the polynucleotide has the coding sequence for VIGF deposited as ATCC Accession No. 75874.
【００２６】別の局面において、本発明は、上記のＤＮ
Ａを含有するベクターを提供する。In another aspect, the present invention provides the above-mentioned DN
A vector containing A is provided.
【００２７】さらなる局面において、本発明は、上記の
ベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞を提供す
る。[0027] In a further aspect, the present invention provides a host cell genetically engineered with the above-described vector.
【００２８】１つの局面において、本発明は、ポリペプ
チドを生産するプロセスを提供し、このプロセスは、上
記の宿主細胞から、上記ＤＮＡによりコードされる上記
ポリペプチドを発現させる工程を包含する。[0028] In one aspect, the present invention provides a process for producing a polypeptide, comprising expressing the polypeptide encoded by the DNA from the host cell.
【００２９】別の局面において、本発明は、ポリペプチ
ドを発現し得る細胞を産生するプロセスを提供し、この
プロセスは上記のベクターを用いて細胞を遺伝子操作す
る工程を包含する。In another aspect, the invention provides a process for producing a cell capable of expressing a polypeptide, the process comprising the step of genetically engineering the cell using the above-described vector.
【００３０】別の局面において、本発明は、上記ＤＮＡ
とハイブリダイズ可能であり、かつＶＩＧＦ活性を有す
るポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡを提供す
る。In another aspect, the present invention relates to the above DNA
And DNA encoding a polypeptide having VIGF activity.
【００３１】１つの局面において、本発明はポリペプチ
ドを提供し、このポリペプチドは（ｉ）図１の推定アミ
ノ酸配列を有するＶＩＧＦポリペプチド、ならびにその
フラグメント、アナログおよび誘導体、および（ｉｉ）
ＡＴＣＣ受託番号７５８７４のｃＤＮＡによりコードさ
れるＶＩＧＦポリペプチド、ならびにこのポリペプチド
のフラグメント、アナログ、および誘導体からなる群よ
り選択される。In one aspect, the invention provides a polypeptide, which comprises (i) a VIGF polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIG. 1, and fragments, analogs and derivatives thereof; and (ii)
The polypeptide is selected from the group consisting of a VIGF polypeptide encoded by the cDNA of ATCC Accession No. 75874, and fragments, analogs, and derivatives of this polypeptide.
【００３２】１つの実施形態において、上記ポリペプチ
ドは、図１の推定アミノ酸配列を有するＶＩＧＦであ
る。In one embodiment, the polypeptide is VIGF having the deduced amino acid sequence of FIG.
【００３３】１つの局面において、本発明は、上記のポ
リペプチドに対する抗体を提供する。In one aspect, the present invention provides an antibody against the above-described polypeptide.
【００３４】他の局面において、本発明は、上記のポリ
ペプチドに対するアンタゴニストを提供する。In another aspect, the present invention provides an antagonist to the above-mentioned polypeptide.
【００３５】別の局面において、本発明は、上記のポリ
ペプチドに対するアゴニストを提供する。In another aspect, the present invention provides an agonist for the above-mentioned polypeptide.
【００３６】１つの局面において、本発明は、ＶＩＧＦ
を必要とする患者の処置のための方法を提供し、この方
法は、この患者に治療的有効量の上記ポリペプチドを投
与する工程を包含する。[0036] In one aspect, the present invention provides
Provides a method for the treatment of a patient in need of, comprising administering to said patient a therapeutically effective amount of said polypeptide.
【００３７】別の局面において、本発明は、ＶＩＧＦを
阻害する必要を有する患者の処置のための方法を提供
し、この方法は、患者に治療的有効量の上記アンタゴニ
ストを投与する工程を包含する。In another aspect, the present invention provides a method for treating a patient in need of inhibiting VIGF, the method comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of the above antagonist. .
【００３８】さらなる局面において、本発明は、上記ポ
リペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有す
る薬学的組成物を提供する。[0038] In a further aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the above polypeptide and a pharmaceutically acceptable carrier.
【００３９】１つの実施形態において、本発明は、上記
治療的有効量のポリペプチドが、このポリペプチドをコ
ードするＤＮＡを患者に提供し、そしてインビボでポリ
ペプチドを発現させることにより投与される方法を提供
する。In one embodiment, the present invention provides a method wherein a therapeutically effective amount of a polypeptide is administered by providing a DNA encoding the polypeptide to a patient and expressing the polypeptide in vivo. I will provide a.
【００４０】別の局面において、本発明は、ＶＩＧＦに
対するアンタゴニストを同定するためのプロセスを提供
し、このプロセスは、ＶＩＧＦによる細胞増殖の刺激に
適切な条件下で、ＶＩＧＦの存在下でスクリーニングさ
れるべき化合物と細胞とを接触させる工程、およびこの
化合物が有効なアンタゴニストであるかどうかを決定す
るために、この細胞の増殖を測定する工程を包含する。In another aspect, the invention provides a process for identifying an antagonist to VIGF, the process being screened in the presence of VIGF under conditions suitable for stimulating cell growth by VIGF. Contacting the compound with the compound to be treated and measuring the proliferation of the cell to determine if the compound is an effective antagonist.
【００４１】さらなる局面において、本発明は、ＶＩＧ
Ｆに対するアゴニストを同定するためのプロセスを提供
し、このプロセスは、ＶＩＧＦによる細胞増殖の刺激に
適切な条件下で、スクリーニングされるべき化合物と細
胞とを接触させる工程、およびこの化合物が有効なアゴ
ニストであるかどうかを決定するために、この細胞の増
殖を測定する工程を包含する。In a further aspect, the present invention provides a VIG
A process for identifying an agonist for F is provided, comprising contacting a cell with a compound to be screened under conditions suitable for stimulating cell proliferation by VIGF, and wherein the compound is an effective agonist. Measuring the proliferation of the cells to determine if
【００４２】別の局面において、本発明は、ＶＩＧＦ核
酸配列中の変異に関する疾患、またはそのような疾患に
対する感受性を診断するためのプロセスを提供し、この
プロセスは、宿主に由来するサンプルからＶＩＧＦをコ
ードする核酸配列を単離する工程、およびＶＩＧＦ核酸
配列中の変異を決定する工程を包含する。[0042] In another aspect, the invention provides a process for diagnosing a disease associated with a mutation in a VIGF nucleic acid sequence, or susceptibility to such a disease, wherein the process converts VIGF from a sample derived from a host. Isolating the encoding nucleic acid sequence and determining the mutation in the VIGF nucleic acid sequence.
【００４３】さらなる別の局面において、本発明は診断
プロセスを提供し、このプロセスは、宿主由来のサンプ
ル中の上記ポリペプチドの存在について分析する工程を
包含する。In yet another aspect, the invention provides a diagnostic process, comprising the step of analyzing for the presence of the polypeptide in a sample derived from a host.
【００４４】本発明のこれらおよび他の局面は、本明細
書中の教示から当業者に明らかであるはずである。[0044] These and other aspects of the present invention should be apparent to those skilled in the art from the teachings herein.
【００４５】[0045]
【発明の実施の形態】本発明の局面によれば、図１の推
定のアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドまたは１９
９４年８月２５日にＡＴＣＣ受託番号第７５８７４号と
して寄託されたクローンのｃＤＮＡによりコードされる
成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌ
クレオチド）が提供される。In accordance with aspects of the present invention, a mature polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIG.
Provided is an isolated nucleic acid (polynucleotide) encoding a mature polypeptide encoded by the cDNA of the clone deposited on Aug. 25, 1994 as ATCC Accession No. 75874.
【００４６】本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドは、ヒト臍帯静脈内皮細胞、大動脈内皮細
胞、大動脈平滑筋細胞、ならびに肺動脈から得られ得
る。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト臍帯静脈内皮細
胞由来のｃＤＮＡライブラリー中で発見された。これ
は、ＩＢＰおよびＣＣＮファミリーに構造的に関連して
いる。これは、１８４アミノ酸残基のタンパク質をコー
ドするオープンリーディングフレームを含む。この最初
のおよそ２１アミノ酸残基が推定リーダー配列であり、
その結果成熟タンパク質は１６３アミノ酸を含む。The polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention can be obtained from human umbilical vein endothelial cells, aortic endothelial cells, aortic smooth muscle cells, and pulmonary arteries. The polynucleotide of the present invention has been found in a cDNA library derived from human umbilical vein endothelial cells. It is structurally related to the IBP and CCN families. It contains an open reading frame encoding a protein of 184 amino acid residues. This first approximately 21 amino acid residues are the predicted leader sequence,
As a result, the mature protein contains 163 amino acids.
【００４７】ＣＣＮ成長因子およびＩＢＰファミリーの
両方のハイブリッドメンバーとしてのＶＩＧＦの指定
は、主としてアミノ酸配列の保存に基づく。ＣＣＮファ
ミリーに対するＶＩＧＦの類似性は、全ポリペプチドに
わたる４０〜４５％の類似性、合計１８個のＶＩＧＦの
システインのうち１２個のシステインが保存されている
こと、そしてＣＣＮファミリーの全てのメンバーに完全
に保存されているＩＢＰサイン（ＧＣＧＣＣＸＸＣＡＸ
ＸＸＸＸＸＣ）との９４％の同一性のため推論される。The designation of VIGF as a hybrid member of both the CCN growth factor and the IBP family is based primarily on amino acid sequence conservation. The similarity of VIGF to the CCN family is 40-45% similar across all polypeptides, with 12 conserved cysteines out of a total of 18 cysteines of VIGF, and complete with all members of the CCN family. Signature (GCGCCCXXCAX) stored in
XXXXXXC) due to its 94% identity.
【００４８】ＶＩＧＦポリペプチドはまた、ＩＢＰファ
ミリーに対して著しい類似性を有する。２つの近接した
領域、アミノ酸５１〜６４（ＩＢＰサイン）およびアミ
ノ酸７６〜９１において、ＩＢＰファミリーに対して少
なくとも８０％の同一性が存在する。これらの領域は、
ＩＢＰの推定ＩＧＦ結合ドメイン中に含まれる。ヒト組
織特異的発現および細胞型特異的発現が、ノーザンブロ
ット解析により決定されている。２．３〜２．４ｋｂ
ＶＩＧＦ ｍＲＮＡは、実施例４の手順を用いて示され
たように、成人の肺および腎臓に局在している。ＶＩＧ
Ｆ遺伝子発現は、心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、およ
び膵臓において検出されなかった。培養ヒト臍帯静脈内
皮細胞および大動脈平滑筋細胞は、高レベルのＶＩＧＦ
ｍＲＮＡを発現する細胞型であるが、皮膚***線維芽
細胞は、非常に低レベルのＶＩＧＦ ｍＲＮＡ発現を示
す。あわせて、これらの結果は、ＶＩＧＦが主に血管起
源であることを示す。[0048] VIGF polypeptides also have significant similarities to the IBP family. In two contiguous regions, amino acids 51-64 (IBP signature) and amino acids 76-91, there is at least 80% identity to the IBP family. These areas are
Included in the putative IGF binding domain of IBP. Human tissue-specific expression and cell type-specific expression have been determined by Northern blot analysis. 2.3 to 2.4 kb
VIGF mRNA is localized in the lung and kidney of adults, as shown using the procedure of Example 4. VIG
F gene expression was not detected in heart, brain, placenta, liver, skeletal muscle, and pancreas. Cultured human umbilical vein endothelial cells and aortic smooth muscle cells have high levels of VIGF
Although a cell type that expresses mRNA, skin foreskin fibroblasts show very low levels of VIGF mRNA expression. Together, these results indicate that VIGF is primarily of vascular origin.
【００４９】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
態またはＤＮＡ（このＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａ、および合成ＤＮＡを包む）の形態であり得る。ＤＮ
Ａは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖の場合
にはコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり
得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図
１に示すコード配列または寄託したクローンのコード配
列と同一であり得、あるいはそのコード配列が、遺伝コ
ードの重複または縮重の結果として、図１のＤＮＡまた
は寄託したｃＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードす
る異なるコード配列であり得る。The polynucleotide of the present invention may be in the form of RNA or DNA (this DNA is cDNA, genomic DN).
A, and synthetic DNA). DN
A can be double-stranded or single-stranded, and if single-stranded, can be the coding strand or the non-coding (antisense) strand. The coding sequence encoding the mature polypeptide may be identical to the coding sequence shown in FIG. 1 or the coding sequence of the deposited clone, or the coding sequence may be altered as a result of duplication or degeneracy of the genetic code. Or a different coding sequence encoding the same mature polypeptide as the deposited cDNA.
【００５０】図１の成熟ポリペプチドまたは寄託したｃ
ＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドは、以下を包含し得る：成熟ポリペ
プチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配
列、およびリーダー配列または分泌配列またはプロタン
パク質配列のようなさらなるコード配列；成熟ポリペプ
チドのコード配列（および随意のさらなるコード配列）
および非コード配列（例えば、イントロンあるいは成熟
ポリペプチドのコード配列の５’および／または３’非
コード配列）。The mature polypeptide of FIG. 1 or the deposited c
Polynucleotides encoding the mature polypeptide encoded by the DNA may include: only the coding sequence of the mature polypeptide; the coding sequence of the mature polypeptide, and additional sequences such as leader or secretory or proprotein sequences. Coding sequence; coding sequence for mature polypeptide (and optional additional coding sequence)
And non-coding sequences (eg, 5 'and / or 3' non-coding sequences of the coding sequence of an intron or mature polypeptide).
【００５１】従って、用語「ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみ
を含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列
および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを
包含する。Thus, the term "polynucleotide encoding a polypeptide" includes polynucleotides that include only the coding sequence of the polypeptide, as well as polynucleotides that include additional coding and / or non-coding sequences.
【００５２】本発明はさらに、図１の推定のアミノ酸配
列を有するポリペプチド、または寄託したクローンのｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメン
ト、アナログおよび誘導体をコードする本明細書中上記
のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリヌクレオチ
ドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立
遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在しな
い改変体であり得る。The present invention further relates to a polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIG.
The present invention relates to variants of the polynucleotides described herein which encode fragments, analogs and derivatives of polypeptides encoded by DNA. A variant of a polynucleotide can be a naturally occurring allelic variant of the polynucleotide or a non-naturally occurring variant of the polynucleotide.
【００５３】従って本発明は、図１に示すものと同じ成
熟ポリペプチド、または寄託したクローンのｃＤＮＡに
よりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドの
改変体を包含する。この改変体は、図１のポリペプチド
または寄託したクローンのｃＤＮＡによりコードされる
ポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログを
コードする。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改
変体、置換改変体、および付加または挿入改変体を包含
する。Thus, the present invention encompasses polynucleotides encoding the same mature polypeptide as shown in FIG. 1, or the same mature polypeptide encoded by the cDNA of the deposited clone, and variants of such polynucleotides. I do. This variant encodes a fragment, derivative or analog of the polypeptide encoded by the polypeptide of FIG. 1 or the cDNA of the deposited clone. Such nucleotide variants include deletion variants, substitution variants, and addition or insertion variants.
【００５４】本明細書中上記で示したように、ポリヌク
レオチドは、図１に示すコード配列または寄託したクロ
ーンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子改変体で
あるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、
対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌクレオチドの置換、
欠失または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の
形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を
実質的に変化させない。As indicated hereinabove, the polynucleotide may have a coding sequence that is a naturally occurring allelic variant of the coding sequence shown in FIG. 1 or of the deposited clone. As known in the art,
An allelic variant is a substitution of one or more nucleotides,
Another form of polynucleotide sequence that may have deletions or additions, which does not substantially alter the function of the encoded polypeptide.
【００５５】本発明はまたポリヌクレオチドを包含し、
ここで成熟ポリペプチドのコード配列は宿主細胞からの
ポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチ
ド配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御
するのための分泌配列として機能するリーダー配列）に
同じリーディングフレーム内で融合され得る。リーダー
配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、
そしてポリペプチドの成熟形態を形成するために宿主細
胞により切断されるリーダー配列を有し得る。ポリヌク
レオチドはまた、さらなる５’アミノ酸残基を加えた成
熟タンパク質であるプロタンパク質をコードし得る。プ
ロ配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質であ
り、そしてそれはタンパク質の不活性形態である。一旦
プロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残
る。The present invention also includes polynucleotides,
Here, the coding sequence for the mature polypeptide is the same as a polynucleotide sequence that assists in the expression and secretion of the polypeptide from the host cell (eg, a leader sequence that functions as a secretory sequence for controlling transport of the polypeptide from the cell). Can be fused within the reading frame. The polypeptide having a leader sequence is a preprotein,
And may have a leader sequence that is cleaved by the host cell to form a mature form of the polypeptide. A polynucleotide may also encode a proprotein that is a mature protein with the addition of an additional 5 'amino acid residue. A mature protein having a prosequence is a proprotein, which is an inactive form of the protein. Once the prosequence is cleaved, the active mature protein remains.
【００５６】従って、例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパ
ク質、またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）
の両方を有するタンパク質をコードし得る。Thus, for example, the polynucleotide of the present invention may be a mature protein, a protein having a prosequence, or a prosequence and a presequence (leader sequence).
May be encoded.
【００５７】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン
フレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー
配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成
熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクター
により供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あ
るいは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例え
ば、ＣＯＳ−７細胞）が使用される場合は、血球凝集素
（ＨＡ）タグであり得る。ＨＡタグは、インフルエンザ
血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致する
（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７（１
９８４））。The polynucleotides of the present invention may also have the coding sequence fused in frame to a marker sequence that allows for purification of the polypeptide of the present invention. The marker sequence may be, in the case of a bacterial host, a hexahistidine tag provided by the pQE-9 vector, which provides for purification of the mature polypeptide fused to the marker. Alternatively, for example, the marker sequence can be a hemagglutinin (HA) tag when a mammalian host (eg, COS-7 cells) is used. The HA tag is consistent with an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein (Wilson, I. et al., Cell, 37: 767 (1.
984)).
【００５８】本発明はさらに、配列間に少なくとも５０
％および好ましくは７０％の同一性が存在する場合、本
明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオ
チドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌ
クレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いら
れる用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイ
ゼーションが配列間に少なくとも９５％および好ましく
は少なくとも９７％の同一性が存在する場合のみに生じ
ることを意味する。好ましい実施態様において本明細書
中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌ
クレオチドは、図１のｃＤＮＡまたは寄託したｃＤＮＡ
によりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生
物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコード
する。The present invention further provides that at least 50
% And preferably 70% identity, relates to polynucleotides that hybridize to the sequences herein above. The invention particularly relates to polynucleotides that hybridize under stringent conditions to the herein above-described polynucleotides. The term "stringent conditions" as used herein means that hybridization occurs only when there is at least 95% and preferably at least 97% identity between the sequences. In a preferred embodiment, the polynucleotide that hybridizes to the polynucleotide herein above is the cDNA of FIG. 1 or the deposited cDNA.
Encodes a polypeptide that retains substantially the same biological function or activity as the mature polypeptide encoded by
【００５９】本明細書中でいう寄託物は、特許手続き上
の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の
下に維持される。これらの寄託物は、単に便宜上当業者
に提供されるのみであり、そして米国特許法第１１２条
の下で寄託が必要とされることを認めたわけではない。
寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそ
れによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、
本明細書中に参考として援用されており、そして本明細
書中の配列の記載とのいかなる矛盾も抑えている。寄託
物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾
が必要とされ得、そしてそのような実施許諾はこれによ
って与えられるわけではない。The deposits referred to herein are maintained under the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for Patent Procedure. These deposits are provided merely for convenience to those skilled in the art and do not acknowledge that a deposit is required under 35 USC 112.
The sequence of the polynucleotide contained in the deposit, as well as the amino acid sequence of the polypeptide encoded thereby,
It is incorporated herein by reference and suppresses any inconsistencies with the sequence descriptions herein. A license may be required to make, use, or sell the deposit, and no such license is granted by this.
【００６０】本発明はさらに、図１の推定のアミノ酸配
列を有するか、または寄託したｃＤＮＡによりコードさ
れるアミノ酸配列を有するＶＩＧＦポリペプチド、およ
びそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログお
よび誘導体に関する。The present invention further relates to VIGF polypeptides having the deduced amino acid sequence of FIG. 1 or having the amino acid sequence encoded by the deposited cDNA, and fragments, analogs and derivatives of such polypeptides.
【００６１】用語「フラグメント」、「誘導体」および
「アナログ」は、図１のポリペプチドまたは寄託したｃ
ＤＮＡにコードされるポリペプチドをいう場合は、その
ようなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または
活性を保持するポリペプチドを意味する。従ってアナロ
グは、プロタンパク質部分の切断により活性化されて活
性な成熟ポリペプチドを生じ得るプロタンパク質を包含
する。The terms “fragment,” “derivative,” and “analog” refer to the polypeptide of FIG.
When referring to a polypeptide encoded by DNA, it is meant a polypeptide that retains essentially the same biological function or activity as such a polypeptide. Thus, analogs include proproteins that can be activated by cleavage of the proprotein portion to yield an active mature polypeptide.
【００６２】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであ
り得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。[0062] The polypeptide of the present invention can be a recombinant polypeptide, a natural polypeptide or a synthetic polypeptide, preferably a recombinant polypeptide.
【００６３】図１のポリペプチドまたは寄託したｃＤＮ
Ａによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘
導体またはアナログは、（ｉ）そこで１つ以上のアミノ
酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基
（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこ
のような置換されるアミノ酸残基がこの遺伝コードによ
りコードされるアミノ酸残基であるかもしれないし、ま
たはそうではないかもしれないもの、あるいは（ｉｉ）
そこで１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含有するも
の、あるいは（ｉｉｉ）そこで成熟ポリペプチドがポリ
ペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエ
チレングリコール）のような別の化合物に融合されてい
るもの、あるいは（ｉｖ）そこでリーダー配列もしくは
分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に用いられる
配列またはプロタンパク質配列のようなさらなるアミノ
酸が成熟ポリペプチドに融合されるものであり得る。こ
のようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明
細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられ
る。The polypeptide of FIG. 1 or the deposited cDN
A fragment, derivative or analog of the polypeptide encoded by A is (i) wherein one or more amino acid residues are replaced with conserved or non-conserved amino acid residues (preferably conserved amino acid residues); Such a substituted amino acid residue may or may not be an amino acid residue encoded by the genetic code, or (ii)
There, one or more amino acid residues contains a substituent, or (iii) the mature polypeptide is fused to another compound such as a compound that increases the half-life of the polypeptide (eg, polyethylene glycol). Or (iv) an additional amino acid such as a leader or secretory sequence, or a sequence used to purify the mature polypeptide or a proprotein sequence, is fused to the mature polypeptide. Such fragments, derivatives and analogs are deemed to be within the skill of the art in light of the teachings herein.
【００６４】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして
好ましくは均質に精製される。The polypeptides and polynucleotides of the present invention are preferably provided in an isolated form, and preferably are purified to homogeneity.
【００６５】用語「単離された」は、物質がその本来の
環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）か
ら取り出されていることを意味する。例えば、生きてい
る動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチド
またはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系
において共存する物質の幾らかまたは全てから分離され
ている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、
単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクタ
ーの一部であり得、そして／またはこのようなポリヌク
レオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり
得、そしてそのようなベクターまたは組成物がその天然
の環境の一部ではないためなお単離され得る。The term "isolated" means that the substance has been removed from its original environment (eg, the natural environment, if it occurs naturally). For example, a naturally occurring polynucleotide or polypeptide present in a living animal is the same polynucleotide that has not been isolated, but has been separated from some or all of the coexisting materials in the natural system. Or the polypeptide
Has been isolated. Such a polynucleotide or polypeptide may be part of a vector, and / or such a polynucleotide or polypeptide may be part of a composition, and such a vector or composition may be part of its natural environment. It is not part and can still be isolated.
【００６６】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
を含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作
される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの産生に関する。The present invention also relates to vectors containing the polynucleotides of the present invention, host cells that are genetically engineered with vectors of the present invention, and the production of polypeptides of the present invention by recombinant techniques.
【００６７】宿主細胞は、本発明のベクター（これは例
えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり
得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入されるか、
または形質転換されるか、またはトランスフェクトされ
る）。ベクターは例えば、プラスミド、ウイルス粒子、
ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞
は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択す
るか、またはＶＩＧＦ遺伝子を増幅するために適切に改
変した従来の栄養培地中において培養され得る。培養条
件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現のために選択さ
れる宿主細胞に以前使用された条件であり、そして当業
者には明らかである。The host cell is genetically engineered (transduced, or
Or transformed or transfected). Vectors include, for example, plasmids, viral particles,
It may be in the form of a phage or the like. The engineered host cells can be cultured in a conventional nutrient medium suitably modified to activate the promoter, select for transformants, or amplify the VIGF gene. Culture conditions (eg, temperature, pH, etc.) are those previously used for the host cell selected for expression, and will be apparent to those skilled in the art.
【００６８】本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術
によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従
って例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現
するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ
得る。このようなベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非染
色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を包含する。こ
のようなベクターは、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌
性プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵
母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み
合わせに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ（例えば、
ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮
性狂犬病）である。しかし、宿主において複製可能で、
かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使用さ
れ得る。[0068] The polynucleotides of the present invention can be used to produce polypeptides by recombinant techniques. Thus, for example, a polynucleotide can be included in any one of a variety of expression vectors for expressing a polypeptide. Such vectors include chromosomal, non-chromosomal and synthetic DNA sequences. Such vectors include, for example, SV40 derivatives; bacterial plasmids; phage DNA; baculovirus; yeast plasmids; vectors derived from combinations of plasmid and phage DNA, viral DNA (eg,
Vaccinia, adenovirus, fowlpox virus, and pseudorabies). However, it is replicable in the host,
Any other vector can be used as long as it is viable.
【００６９】適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によりベ
クターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡ配列は当該分野
で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位
に挿入される。このような手順および他の手順は、当業
者の範囲内であると考えられる。[0069] The appropriate DNA sequence can be inserted into the vector by a variety of procedures. Generally, the DNA sequence is inserted into an appropriate restriction endonuclease site by procedures known in the art. Such and other procedures are deemed to be within the purview of those skilled in the art.
【００７０】発現ベクター中のＤＮＡ配列は、適切な発
現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、ｍ
ＲＮＡの合成を指示する。このようなプロモーターの代
表的な例としては、以下が挙げられ得る：ＬＴＲまたは
ＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃまたはｔ
ｒｐ、λファージＰLプロモーター、および原核細胞ま
たは真核細胞あるいはそのウイルス内で遺伝子の発現を
制御することが知られている他のプロモーター。発現ベ
クターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位お
よび転写ターミネーターを含有し得る。ベクターはま
た、発現を増幅するための適切な配列を含有し得る。The DNA sequence in the expression vector is operably linked to an appropriate expression control sequence (promoter), and
Directs RNA synthesis. Representative examples of such promoters may include: LTR or SV40 promoter, E. coli. coli lac or t
rp, lambda phage P L promoter, and other promoters known to control gene expression in prokaryotic or eukaryotic cells or their viruses. The expression vector may also contain a ribosome binding site for translation initiation and a transcription terminator. Vectors may also contain appropriate sequences for amplifying expression.
【００７１】さらに、発現ベクターは、好ましくは、形
質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例え
ば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクター
ゼまたはネオマイシン耐性、あるいはＥ．ｃｏｌｉにお
けるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を
提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。In addition, the expression vector is preferably a phenotypic trait for selection of transformed host cells (eg, dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture, or tetracycline resistance in E. coli). (Or ampicillin resistance).
【００７２】本明細書中上記のような適切なＤＮＡ配列
ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有
するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタン
パク質を発現させるために用いられ得る。A vector containing a suitable DNA sequence as described herein above and a suitable promoter or control sequence can be used to transform a suitable host to express the protein in the host.
【００７３】適切な宿主の代表的な例としては、以下が
挙げられ得る：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細
胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｆ
９）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗ
ｅｓ黒色腫）；アデノウイルス；植物細胞など。適切な
宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内で
あると考えられる。Representative examples of suitable hosts include the following: bacterial cells (eg, E. coli, St.
reptomyces, Salmonella type
fungus cells (eg, yeast); insect cells (eg, Drosophila S2 and Sf)
9); animal cells (eg, CHO, COS or Bow)
es melanoma); adenovirus; plant cells and the like. Selection of an appropriate host is considered to be within the skill of the art in light of the teachings herein.
【００７４】さらに詳細には、本発明はまた、上記で広
範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含
する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクタ
ーまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの
中には本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されて
いる。この実施態様の好ましい局面において、構築物は
さらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例え
ば、プロモーターを包含する）を含む。多数の適切なベ
クターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そ
して購入可能である。以下のベクターが例として提供さ
れる。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９
（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃ
ｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ、ｐＢＳＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ
１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴ
ＲＣ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐ
ＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核
性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸ
Ｔ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、
ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）。しかし、他の任意のプラスミドまたはベクター
も、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能で
ある限り、使用され得る。More particularly, the present invention also encompasses a recombinant construct comprising one or more of the sequences broadly described above. The constructs include a vector (eg, a plasmid vector or a viral vector) into which the sequence of the invention has been inserted in a forward or reverse orientation. In a preferred aspect of this embodiment, the construct further comprises a regulatory sequence operably linked to the sequence, including, for example, a promoter. Large numbers of suitable vectors and promoters are known to those of skill in the art, and are commercially available. The following vectors are provided as examples. Bacterial: pQE70, pQE60, pQE-9
(Qiagen), pBS, pD10, phasesc
Rip, psiX174, pbluescript
SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH
18A, pNH46A (Stratagene); pT
RC99a, pKK223-3, pKK233-3, p
DR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryotic: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pX
T1, pSG (Stratagene); pSVK3,
pBPV, pMSG, pSVL (Pharmaci
a). However, any other plasmid or vector can be used as long as they are replicable and viable in the host.
【００７５】プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の
遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、Ｐ
ＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。特によく知られ
た細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ
７、ｇｐｔ、λＰR、ＰLおよびｔｒｐを包含する。真核
プロモーターは、ＣＭＶ即時型、ＨＳＶチミジンキナー
ゼ、初期ＳＶ４０および後期ＳＶ４０、レトロウイルス
由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネインＩを包含
する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十
分に当業者のレベルの範囲内である。The promoter region can be selected from any desired gene using a CAT (chloramphenicol transferase) vector or other vector having a selectable marker. Two suitable vectors are P
KK232-8 and PCM7. Particularly well-known bacterial promoters include lacI, lacZ, T3, T3.
7, including gpt, λP R , P L and trp. Eukaryotic promoters include CMV immediate early, HSV thymidine kinase, early and late SV40, LTRs from retrovirus, and mouse metallothionein I. Selection of the appropriate vector and promoter is well within the level of ordinary skill in the art.
【００７６】さらなる実施態様では、本発明は上記の構
築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真
核細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核細胞
（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞
は原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の
宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェク
ション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクシ
ョン、またはエレクトロポレーションにより達成され得
る（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，Ｂａｔｔ
ｅｙ，Ｉ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９８６）。In a further embodiment, the present invention relates to host cells containing the above-described constructs. The host cell can be a higher eukaryotic cell (eg, a mammalian cell) or a lower eukaryotic cell (eg, a yeast cell), or the host cell can be a prokaryotic cell (eg, a bacterial cell). Introduction of the construct into host cells can be accomplished by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, or electroporation (Davis, L., Dibner, M., Batt).
ey, I .; , Basic Methods in Mo
(Regular Biology, 1986).
【００７７】宿主細胞中の構築物は、組換え配列により
コードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法
において使用され得る。あるいは、本発明のポリペプチ
ドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得
る。The construct in a host cell can be used in a conventional manner to produce the gene product encoded by the recombinant sequence. Alternatively, the polypeptide of the present invention can be produced synthetically by a conventional peptide synthesizer.
【００７８】成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、
細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下
で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ
構築物に由来するＲＮＡを使用して、このようなタンパ
ク質を産生するために用いられ得る。原核宿主および真
核宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび
発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）（この開示は、本明細書
中に参考として援用されている）に記載されている。[0078] Mature proteins include mammalian cells, yeast,
It can be expressed in bacteria, or other cells, under the control of a suitable promoter. The cell-free translation system is also a DNA of the present invention.
RNA from the construct can be used to produce such proteins. Suitable cloning and expression vectors for use in prokaryotic and eukaryotic hosts are described in Sambrook et al., Molecule.
ar Cloning: A Laboratory M
annual, 2nd edition, Cold SpringHarb
or, N. Y. , (1989), the disclosure of which is incorporated herein by reference.
【００７９】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー
配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは
ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は約１０〜約
３００ｂｐであり、これはプロモーターに作用してその
転写を増大させる。例として、複製起点（ｂｐ１００〜
２７０）の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガ
ロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点
の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイ
ルスエンハンサーが挙げられる。DNA encoding the polypeptide of the present invention
Is increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers are cis-acting elements of DNA, usually about 10 to about 300 bp, which act on a promoter to increase its transcription. As an example, the origin of replication (bp100-
270), the SV40 enhancer on the late side, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and adenovirus enhancers.
【００８０】一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞
の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー
（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およ
びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）、なら
びに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来
のプロモーターを含有する。このようなプロモーター
は、特に解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸キ
ナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、酸性ホスファターゼ、ま
たは熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来
し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止
配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質のペリプ
ラズム空間または細胞外の培地への分泌を指示し得るリ
ーダー配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じ
て、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換
え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末
端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。In general, the recombinant expression vectors contain an origin of replication and a selectable marker (eg, the ampicillin resistance gene of E. coli and the TRP1 gene of S. cerevisiae) that allow transformation of the host cell, as well as downstream structural sequences. Contains a promoter from a highly expressed gene that directs transcription. Such promoters may be derived from operons encoding glycolytic enzymes (eg, 3-phosphoglycerate kinase (PGK)), α-factor, acid phosphatase, or heat shock proteins, among others. The heterologous structural sequence is assembled in appropriate phase with translation initiation and termination sequences, and preferably a leader sequence capable of directing secretion of the translated protein into the periplasmic space or extracellular medium. Optionally, the heterologous sequence can encode a fusion protein that includes an N-terminal identification peptide that provides the desired characteristics (eg, stabilization or simplified purification of the expressed recombinant product).
【００８１】細菌での使用に有用な発現ベクターは、機
能的なプロモーターと作動可能なリーディングフレーム
で、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を適
切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に挿
入することにより構築される。ベクターは、１つ以上の
表現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実に
し、かつ所望により宿主内での増幅を提供するための複
製起点を含有する。形質転換のために適切な原核宿主
は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、
ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内
の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として
用いられ得る。Expression vectors useful for bacterial use are prepared by inserting a structural DNA sequence encoding the desired protein, with appropriate translation initiation and termination signals, in a functional promoter and operable reading frame. Be built. The vector contains one or more phenotypic selectable markers, and an origin of replication to ensure maintenance of the vector and, if desired, provide for amplification in the host. Prokaryotic hosts suitable for transformation include E. coli. E. coli, Bacillus subtili
s, Salmonella typhimurium,
And Pseudomonas genus, Streptom
yces, and various species within the genus Staphylococcus, but other species can also be used as selections.
【００８２】代表的な、しかし限定しない例として、細
菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニン
グベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺
伝子エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択
マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このよ
うな市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕ
ｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ
Ａ）を包含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分
は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列
と組み合わされる。As a representative, but non-limiting example, expression vectors useful for bacterial use include selectable markers derived from commercially available plasmids containing the genetic elements of the well-known cloning vector pBR322 (ATCC 37017) and bacterial markers. It may contain an origin of replication. Such commercially available vectors are, for example, pKK223-3 (P
harmcia Fine Chemicals, U
ppsala, Sweden, and GEM1 (Pro
mega Biotec, Madison, WI, US
A). These pBR322 "backbone" portions are combined with an appropriate promoter and the structural sequence to be expressed.
【００８３】適切な宿主株の形質転換および適切な細胞
密度への宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモータ
ーは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘
導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養さ
れる。Following transformation of the appropriate host strain and propagation of the host strain to an appropriate cell density, the selected promoter is induced by appropriate means (eg, temperature shifting or chemical induction), and the cells are transformed. Incubate for an additional period.
【００８４】細胞は、代表的には遠心分離により収集さ
れ、物理的手段または化学的手段により破砕され、そし
て得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持され
る。The cells are typically collected by centrifugation, disrupted by physical or chemical means, and the resulting crude extract is retained for further purification.
【００８５】タンパク質の発現において用いられる微生
物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破
砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方
法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知
である。The microbial cells used in expressing the protein can be disrupted by any convenient method, including freeze-thaw cycling, sonication, mechanical disruption, or use of cell lysing agents. Such methods are well-known to those skilled in the art.
【００８６】種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換
えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物
発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１
７５（１９８１）に記載されるサル腎臓線維芽細胞のＣ
ＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現し得る他の
細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬ
ａ、およびＢＨＫ細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベ
クターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハ
ンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポ
リアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプラ
イスアクセプター部位、転写終結配列、および５’フラ
ンキング非転写配列を含有する。ＳＶ４０スプライス部
位、およびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列
は、必要な非転写遺伝子エレメントを提供するために使
用され得る。[0086] Various mammalian cell culture systems can also be used to express the recombinant protein. Examples of mammalian expression systems include Gluzman, Cell, 23: 1.
75 (1981), C of monkey kidney fibroblasts.
The OS-7 strain and other cell lines capable of expressing compatible vectors (eg, C127, 3T3, CHO, HeL
a, and BHK cell lines). Mammalian expression vectors contain an origin of replication, a suitable promoter and enhancer, and any necessary ribosome binding, polyadenylation, splice donor and splice acceptor sites, transcription termination sequences, and 5 'flanking non-transcribed sequences. contains. DNA sequences derived from the SV40 splice site, and polyadenylation site, can be used to provide the necessary non-transcribed genetic elements.
【００８７】ＶＩＧＦポリペプチドは、以下を包含する
方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製
され得る。硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰
イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホ
セルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒ
ドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレク
チンクロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク質の
再折りたたみ（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）工程が、成熟タン
パク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的
に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、最終
的な精製工程に用いられ得る。[0087] VIGF polypeptides can be recovered and purified from recombinant cell culture by methods including the following. Ammonium sulfate precipitation or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography, and lectin chromatography. If desired, a protein refolding step can be used to complete the configuration of the mature protein. Finally, high performance liquid chromatography (HPLC) can be used for the final purification step.
【００８８】本発明のポリペプチドは、天然の精製され
た産物、または化学合成手順の産物であり得るか、ある
いは原核宿主または真核宿主（例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から
組換え技術により産生され得る。組換え産生手順に用い
られる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリ
コシル化されるかもしれないし、またはグリコシル化さ
れないかもしれない。本発明のポリペプチドはまた、最
初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。The polypeptides of the present invention may be natural purified products, or products of chemical synthesis procedures, or may be prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, bacteria, yeast, higher plants, insects in culture). , And mammalian cells). Depending on the host used in the recombinant production procedure, the polypeptides of the present invention may or may not be glycosylated. The polypeptides of the present invention may also include an initial methionine amino acid residue.
【００８９】本発明のこのＶＩＧＦポリペプチドは、組
織（例えば、結合組織、皮膚、骨、軟骨、筋肉、肺また
は腎臓）の再増殖に関する創傷治癒および関連治療にお
いて使用され得る。The VIGF polypeptides of the present invention can be used in wound healing and related treatments involving tissue (eg, connective tissue, skin, bone, cartilage, muscle, lung or kidney) regrowth.
【００９０】ＶＩＧＦポリペプチドはまた、血管平滑筋
細胞および血管内皮細胞の増殖を増強させ、脈管形成の
刺激に導くのに使用され得る。脈管形成においてＶＩＧ
Ｆにより媒介された増加は、虚血組織および冠状狭窄に
続く心臓における副行冠状発生に対して有益である。[0102] VIGF polypeptides can also be used to enhance the proliferation of vascular smooth muscle cells and vascular endothelial cells, leading to stimulation of angiogenesis. VIG in angiogenesis
The F-mediated increase is beneficial for collateral coronary development in the heart following ischemic tissue and coronary stenosis.
【００９１】ＶＩＧＦポリペプチドはまた、移植片固定
の間、移植片の周囲の細胞増殖を刺激し、従って、その
意図される部位へのその接着を促進するために使用され
得る。[0091] The VIGF polypeptide can also be used to stimulate cell proliferation around the graft during graft fixation, and thus promote its adhesion to its intended site.
【００９２】ＶＩＧＦポリペプチドはまた、組織中また
は血清中のＩＧＦの安定性を増加させるために使用され
得る。これはまた、ＩＧＦレセプターに対する結合を増
大させる。ＩＧＦはインビトロで、ヒト骨髄赤血球およ
び顆粒球先祖細胞増殖を増大させることが示されている
ので、ＶＩＧＦポリペプチドはまた、赤血球形成または
顆粒球形成を刺激するために用いられ得る。[0092] VIGF polypeptides can also be used to increase the stability of IGF in tissue or serum. This also increases binding to the IGF receptor. Since IGF has been shown to increase human bone marrow erythroid and granulocyte progenitor cell proliferation in vitro, VIGF polypeptides can also be used to stimulate erythropoiesis or granulocyte formation.
【００９３】本発明のさらなる局面によれば、ヒトの疾
患の処置用の治療および診断を開発する目的のために、
科学的研究、ＤＮＡの合成、およびＤＮＡベクターの作
製に関するインビトロでの目的のための研究試薬とし
て、そのようなポリペプチド、または、このようなポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する方法
が提供される。According to a further aspect of the present invention, for the purpose of developing therapies and diagnostics for the treatment of human diseases,
Methods are provided that utilize such polypeptides, or polynucleotides encoding such polypeptides, as research reagents for in vitro purposes for scientific research, DNA synthesis, and production of DNA vectors. You.
【００９４】全長ＶＩＧＦ遺伝子のフラグメントは、全
長ＶＩＧＦ遺伝子を単離するためおよびＶＩＧＦ遺伝子
に高い配列類似性を有する他の遺伝子または類似した生
物学的活性を有する他の遺伝子を単離するためのｃＤＮ
Ａライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとし
て使用され得る。このタイプのプローブは、例えば、２
０と２０００塩基対との間であり得る。しかし、好まし
くは、このプローブは、３０と５０塩基との間を有す
る。このプローブは、全長転写物と一致するｃＤＮＡク
ローン、および調節領域およびプロモーター領域、エキ
ソン、ならびにイントロンを含む完全ＶＩＧＦ遺伝子を
含むゲノムクローンまたはクローンを同定するために使
用され得る。スクリーニングの実施例は、オリゴヌクレ
オチドプローブを合成するための公知のＤＮＡ配列を使
用することによるＶＩＧＦ遺伝子のコード領域を単離す
る工程を包含する。本発明の遺伝子の配列と相補的な配
列を有する標識化オリゴヌクレオチドは、ヒトｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、またはプローブがｍＲＮＡのライブ
ラリーをスクリーニングし、ハイブリダイズするライブ
ラリーのメンバーを決定するために使用される。Fragments of the full-length VIGF gene are used to isolate the full-length VIGF gene and to isolate other genes with high sequence similarity to the VIGF gene or other genes with similar biological activity.
It can be used as a hybridization probe for the A library. Probes of this type are, for example, 2
It can be between 0 and 2000 base pairs. However, preferably, the probe has between 30 and 50 bases. This probe can be used to identify cDNA clones that match the full-length transcript, and genomic clones or clones that contain the complete VIGF gene, including regulatory and promoter regions, exons, and introns. An example of a screening involves isolating the coding region of the VIGF gene by using a known DNA sequence to synthesize an oligonucleotide probe. The labeled oligonucleotide having a sequence complementary to the sequence of the gene of the present invention is human cDN.
A, genomic DNA, or probes are used to screen a library of mRNAs and determine the members of the library that hybridize.
【００９５】本発明は、ＶＩＧＦのレセプターを同定す
るための方法を提供する。このレセプターをコードする
遺伝子は、当業者に公知の数多くの方法により同定され
得る。例えば、リガンドパンニングおよびＦＡＣＳソー
ティング（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．、１（２）、５章、
（１９９１））。好ましくは、発現クローニングが使用
される。ここで、ポリアデニル化ＲＮＡは、ＶＩＧＦに
応答する細胞から調製される、そしてこのＲＮＡから作
製されたｃＤＮＡライブラリーは、プールへ分注され、
そしてＣＯＳ細胞またはＶＩＧＦに応答しないその他の
細胞をトランスフェクトするのに使用される。ガラスス
ライド上で増殖させられるトランスフェクト細胞が、標
識化ＶＩＧＦに曝露される。ＶＩＧＦは、ヨウ素化また
は部位特異性プロテインキナーゼへの認識部位の封入を
含む種々の手段によって標識され得る。固定およびイン
キュベーションの後、そのスライドは、オートラジオグ
ラフィー分析に供される。陽性のプールが同定され、な
らびにサブプールが、繰り返しのサブプーリングおよび
再スクリーニング方法を用いて調製、および再トランス
フェクトされ、最終的に、推定レセプターをコードする
単一クローンを生じる。The present invention provides a method for identifying a receptor for VIGF. The gene encoding this receptor can be identified by a number of methods known to those skilled in the art. For example, ligand panning and FACS sorting (Coligan et al., Current Pro).
tocols in Immun. , 1 (2), 5 chapters,
(1991)). Preferably, expression cloning is used. Here, polyadenylated RNA is prepared from cells that respond to VIGF, and a cDNA library made from this RNA is dispensed into a pool,
It is then used to transfect COS cells or other cells that do not respond to VIGF. Transfected cells grown on glass slides are exposed to labeled VIGF. VIGF can be labeled by a variety of means, including iodination or inclusion of a recognition site on a site-specific protein kinase. After fixation and incubation, the slides are subjected to autoradiographic analysis. Positive pools are identified, and subpools are prepared and retransfected using iterative subpooling and rescreening methods, ultimately resulting in a single clone encoding the putative receptor.
【００９６】レセプター同定のための別のアプローチと
して、標識化ＶＩＧＦは、細胞膜またはレセプター分子
を発現する抽出調製物と光親和性連結され得る。架橋さ
れた物質は、ＰＡＧＥおよびＸ線フィルムに曝露するこ
とにより分析される。ＶＩＧＦレセプターを含む標識化
複合体は、切除され得、ペプチドフラグメントに分解さ
れ得、そしてタンパク質微量配列決定に供される。微量
配列決定より得られたアミノ酸配列は、推定レセプター
をコードする遺伝子を同定するために、ｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングするための１組の変性オリゴヌ
クレオチドプローブを設計することに使用される。As an alternative approach to receptor identification, labeled VIGF can be photoaffinity linked to cell membranes or to an extract preparation expressing the receptor molecule. The crosslinked material is analyzed by exposure to PAGE and X-ray film. The labeled complex containing the VIGF receptor can be excised, broken down into peptide fragments, and subjected to protein microsequencing. The amino acid sequence obtained from the microsequencing is used to design a set of degenerate oligonucleotide probes to screen a cDNA library to identify the gene encoding the putative receptor.
【００９７】本発明はまた、ＶＩＧＦに似ている（アゴ
ニスト）かまたはＶＩＧＦの効果を妨害するものを同定
するために、化合物をスクリーニングする方法に関す
る。このような方法の例は、コマイトジェン（ｃｏｍｉ
ｔｏｇｅｎ）Ｃｏｎ Ａの存在下で、内皮細胞の増殖を
刺激するためのＶＩＧＦの能力を利用する。ヒト臍帯静
脈内皮細胞を入手し、そして９６ウェルの平底培養プレ
ート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）中で
培養し、そして細胞の増殖を促進するのに適切な反応混
合物 （Ｃｏｎ−Ａ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｊ
ｏｌｌａ、ＣＡ）を含む）を補充する。Ｃｏｎ−Ａおよ
びスクリーニングされる化合物が添加され、そして３７
℃でインキュベーションの後、培養物は、3［Ｈ］チミ
ジンでパルスされ、グラスファイバーフィルター（Ｐｈ
Ｄ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗａ
ｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）上に収穫される。３連の培養物
の平均の3［Ｈ］チミジンの取り込み（ｃｐｍ）が、液
体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を用いて測
定される。有意な3［Ｈ］チミジンの取り込みは、内皮
細胞増殖の刺激を示す。The present invention also relates to a method of screening compounds to identify those that mimic (agonists) or interfere with the effects of VIGF. An example of such a method is comitogen
(togen) Take advantage of the ability of VIGF to stimulate endothelial cell proliferation in the presence of Con A. Human umbilical vein endothelial cells were obtained and cultured in 96-well flat bottom culture plates (Costar, Cambridge, Mass.) And a suitable reaction mixture (Con-A (Calbiochem, La. J.) to promote cell growth.
ola, CA)). Con-A and the compound to be screened are added and 37
℃ After incubation, the cultures were pulsed with 3 [H] thymidine, glass fiber filters (Ph
D; Cambridge Technology, Wa
tertown, MA). The average 3 [H] thymidine incorporation (cpm) of triplicate cultures was measured by a liquid scintillation counter (Beckman Inc.
instruments, Irvine, CA). Significant 3 [H] thymidine incorporation indicates stimulation of endothelial cell proliferation.
【００９８】アンタゴニストをアッセイするために、上
記のアッセイが行われるが、しかしこのアッセイにおい
て、ＶＩＧＦがスクリーニングされるべき化合物と共に
添加され、そしてＶＩＧＦの存在下での3［Ｈ］チミジ
ンの取り込みを阻害する化合物の能力は、その化合物が
ＶＩＧＦのアンタゴニストであることを示している。あ
るいは、ＶＩＧＦアンタゴニストは、ＶＩＧＦおよび潜
在的アンタゴニストを、競合阻害アッセイのための適切
な条件下で、膜結合性ＶＩＧＦレセプターまたは組換え
レセプターと結合させることにより検出され得る。ＶＩ
ＧＦは、そのレセプターと結合するＶＩＧＦ分子の数が
潜在的なアンタゴニストの効果を同定し得るので、例え
ば放射活性で、標識され得る。To assay for antagonists, the above assay is performed, but in this assay, VIGF is added with the compound to be screened and inhibits the incorporation of 3 [H] thymidine in the presence of VIGF. The ability of a compound to act indicates that the compound is an antagonist of VIGF. Alternatively, a VIGF antagonist may be detected by binding VIGF and a potential antagonist to a membrane-bound or recombinant receptor under appropriate conditions for a competitive inhibition assay. VI
GF can be labeled, for example, with radioactivity, because the number of VIGF molecules that bind to its receptor can identify the effect of a potential antagonist.
【００９９】また、ＶＩＧＦレセプターを発現する哺乳
動物細胞または膜調製物が、その化合物の存在下で、標
識化ＶＩＧＦとともにインキュベートされる。次いで、
この相互作用を促進またはブロックする化合物の能力が
測定される。あるいは、ＶＩＧＦ、標識ＩＧＦ、および
潜在的化合物は、ＶＩＧＦが自然にＩＧＦに結合する条
件下でインキュベートされ得る。この相互作用の程度
が、その化合物が効果的なアンタゴニストまたはアゴニ
ストであるかどうかを決定するために測定され得る。A mammalian cell or membrane preparation expressing the VIGF receptor is also incubated with labeled VIGF in the presence of the compound. Then
The ability of the compound to promote or block this interaction is measured. Alternatively, VIGF, labeled IGF, and a potential compound can be incubated under conditions in which VIGF naturally binds to IGF. The extent of this interaction can be measured to determine whether the compound is an effective antagonist or agonist.
【０１００】潜在的なＶＩＧＦアンタゴニストの例とし
て、抗体、またはいくつかの場合には、そのポリペプチ
ドに結合するオリゴヌクレオチドが挙げられる。あるい
は、潜在的なアンタゴニストは、近縁なタンパク質（そ
れは、ＶＩＧＦレセプターを認識するがその効果を伝達
せず、それにより、ＶＩＧＦの作用を競合的に阻害す
る）例えば、変異した形態のＶＩＧＦであり得る。Examples of potential VIGF antagonists include antibodies, or, in some cases, oligonucleotides that bind to the polypeptide. Alternatively, a potential antagonist is a closely related protein, which recognizes the VIGF receptor but does not transmit its effects, thereby competitively inhibiting the action of VIGF, eg, a mutated form of VIGF obtain.
【０１０１】別の潜在的なＶＩＧＦアンタゴニストは、
アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンス構築
物である。アンチセンス技術は、トリプルヘリックス形
態あるいはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡによる遺伝
子発現を調節するために使用され得、この方法の両方と
も、ＤＮＡまたはＲＮＡにポリヌクレオチドが結合する
ことに基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、長
さにおいて約１０から４０塩基対の形態のアンチセンス
ＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するのに用いられる。
ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の
領域に相補的になるように設計され（トリプルヘリック
ス、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、６：
３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３６０（１９９
１））、それにより、ＶＩＧＦの転写および産生が妨害
される。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはイン
ビボでそのｍＲＮＡとハイブリダイズし、そのｍＲＮＡ
分子のＶＩＧＦへの翻訳をブロックする（アンチセンス
−Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６：５６
０（１９９１）；遺伝子発現のアンチセンス阻害剤とし
てのオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ
ｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８８））。上記
のオリゴヌクレオチドはまた、そのアンチセンスＲＮＡ
またはアンチセンスＤＮＡがＶＩＧＦの産生を阻害する
ためにインビボで発現され得るように、細胞に送達され
得る。[0101] Another potential VIGF antagonist is
Antisense construct prepared using antisense technology. Antisense technology can be used to regulate gene expression by triple helix forms or antisense DNA or RNA, both of which methods are based on the binding of a polynucleotide to DNA or RNA. For example, the 5 'coding portion of a polynucleotide sequence encoding a mature polypeptide of the present invention can be used to design antisense RNA oligonucleotides in the form of about 10 to 40 base pairs in length.
DNA oligonucleotides are designed to be complementary to the region of the gene involved in transcription (triple helix, Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:
3073 (1979); Cooney et al., Science.
e, 241: 456 (1988); and Dervan
Et al., Science, 251: 1360 (199
1)), thereby interfering with the transcription and production of VIGF. The antisense RNA oligonucleotide hybridizes to the mRNA in vivo and the mRNA
Block the translation of the molecule into VIGF (antisense-Okano, J. Neurochem., 56:56
0 (1991); oligodeoxynucleotides as antisense inhibitors of gene expression, CRC Pres
s, Boca Raton, FL (1988)). The oligonucleotides described above also include their antisense RNAs.
Alternatively, the antisense DNA can be delivered to cells such that it can be expressed in vivo to inhibit the production of VIGF.
【０１０２】潜在的なＶＩＧＦアンタゴニストとして、
活性部位、レセプター結合部位、ＩＧＦ、またはそのポ
リペプチドの他の成長因子結合部位に結合する小分子が
挙げられ、それによりＶＩＧＦの正常な生物学的活性は
ブロックされる。小分子の例として、小ペプチドまたは
ペプチド様分子が挙げられるが、これに限定されない。As potential VIGF antagonists,
Small molecules that bind to the active site, receptor binding site, IGF, or other growth factor binding site of the polypeptide are included, thereby blocking the normal biological activity of VIGF. Examples of small molecules include, but are not limited to, small peptides or peptide-like molecules.
【０１０３】このアンタゴニストは、バルーン血管形成
後のアテローム性動脈硬化症および再狭窄において広く
見られる、腫瘍新生血管形成および平滑筋細胞の新生内
膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ）の増殖を阻害するために用
いられ得る。The antagonists can be used to inhibit tumor neovascularization and neointimal proliferation of smooth muscle cells, which are common in atherosclerosis and restenosis following balloon angioplasty. .
【０１０４】このアンタゴニストは、手術後に形成され
るケロイド、心筋梗塞後の線維症、または肺線維症と結
びついた線維の損傷に見られる瘢痕組織の過剰産生を阻
害するために用いられ得る。このアンタゴニストは、薬
学的に受容可能なキャリア（例えば、以降の本明細書に
記載の）とともに組成物中で用いられ得る。The antagonist can be used to inhibit the overproduction of scar tissue seen in fibrotic damage associated with keloids formed after surgery, fibrosis after myocardial infarction, or pulmonary fibrosis. The antagonist may be used in a composition with a pharmaceutically acceptable carrier (eg, as described herein below).
【０１０５】本発明のＶＩＧＦポリペプチドおよびアン
タゴニストまたはアゴニストは、適切な薬学的キャリア
と組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治
療的に有効な量のポリペプチド、および薬学的に受容可
能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリア
として、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロー
ス、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組
み合わせが挙げられるが、これに限定されない。処方
は、投与様式に合わせるべきである。The VIGF polypeptides and antagonists or agonists of the present invention can be used in combination with a suitable pharmaceutical carrier. Such compositions comprise a therapeutically effective amount of the polypeptide, and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Such carriers include, but are not limited to, saline, buffered saline, dextrose, water, glycerol, ethanol, and combinations thereof. The formulation should suit the mode of administration.
【０１０６】本発明はまた、１つ以上の本発明の薬学的
組成物の成分で満たされた１つ以上の容器を含む薬学的
パックまたはキットを提供する。このような容器は、薬
剤または生物製品の製造、使用、または販売を統制する
政府機関により規定された形式の注意を伴い得、この注
意はヒトへの投与についての製造、使用、または販売の
政府機関による認可を反映する。さらに、薬学的組成物
は、他の治療的化合物と結びつけて用いられ得る。The present invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the present invention. Such containers may be accompanied by a notice in the form prescribed by a government agency that controls the manufacture, use, or sale of the drug or biological product, and this notice may contain governmental notices of manufacture, use, or sale for administration to humans. Reflects agency approval. Further, the pharmaceutical compositions can be used in connection with other therapeutic compounds.
【０１０７】この薬学的組成物は、経口、局所、静脈
内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻内、皮内経路のような便
利な様式で投与され得る。この薬学的組成物は、特定の
適応の処置および／または予防に有効な量で投与され
る。一般的に、それらは、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ
体重の量で投与され、そしてほとんどの場合、１日あた
り約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与される。ほと
んどの場合、投与量は、投与経路、症状などを考慮し
て、１日あたり約１０μｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ
体重である。The pharmaceutical compositions may be administered in a convenient manner, such as by the oral, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intranasal, or intradermal route. The pharmaceutical composition is administered in an amount effective to treat and / or prevent the particular indication. Generally, they will have at least about 10 μg / kg
It is administered in body weight amounts and, in most cases, no more than about 8 mg / kg body weight per day. In most cases, the dosage should be about 10 μg / kg body weight to about 1 mg / kg per day, taking into account the route of administration, symptoms, etc.
Weight.
【０１０８】これに限らないが、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、Ｆ
ＧＦ、ＥＧＦ、またはＴＧＦ−βを含む他の成長因子と
組合せたＶＩＧＦは、損傷治癒において見られる生理学
的応答を促進し得る。Although not limited to this, PDGF, IGF, FGF
VIGF in combination with other growth factors, including GF, EGF, or TGF-β, can enhance the physiological response seen in wound healing.
【０１０９】本発明のＶＩＧＦポリペプチドおよびポリ
ペプチドであるアゴニストまたはアンタゴニストがま
た、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により
本発明に従って用いられ得、これはしばしば、「遺伝子
治療」といわれる。The VIGF polypeptides of the invention and agonists or antagonists that are polypeptides can also be used in accordance with the invention by expression of such polypeptides in vivo, which is often referred to as "gene therapy".
【０１１０】従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたは
ＲＮＡ）を用いてエクソビボで操作され得、次いで、操
作された細胞はポリペプチドで処置される患者に提供さ
れる。このような方法は当該分野で周知である。例え
ば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡ
を含むレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公
知の手順によって操作され得る。Thus, for example, cells from a patient can be engineered ex vivo with a polynucleotide (DNA or RNA) encoding a polypeptide, and the engineered cells can then be provided to a patient to be treated with the polypeptide. Is done. Such methods are well-known in the art. For example, a cell may comprise an RNA encoding a polypeptide of the invention.
Can be manipulated by procedures known in the art by use of retroviral particles comprising
【０１１１】同様に、細胞は、インビボでのポリペプチ
ドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によ
りインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、
本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレ
トロウイルス粒子を産生するための産生細胞は、インビ
ボで細胞を操作するためおよびインビボでのポリペプチ
ドの発現のために患者に投与され得る。このような方法
により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの
方法および他の方法は、本発明の教示により当業者には
明らかである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒ
クルは、レトロウイルス以外のもの（例えば、アデノウ
イルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒクルと組
み合わせた後インビボで細胞を操作するために使用され
得る。Similarly, cells can be engineered in vivo for expression of the polypeptide in vivo, for example, by procedures known in the art. As known in the art,
Producer cells for producing retroviral particles containing RNA encoding a polypeptide of the invention can be administered to a patient for engineering cells in vivo and for expression of the polypeptide in vivo. These and other methods for administering the polypeptides of the invention by such methods will be apparent to those skilled in the art from the teachings of the present invention. For example, an expression vehicle for manipulating cells can be other than a retrovirus (eg, an adenovirus). This can be used to manipulate cells in vivo after combining with a suitable delivery vehicle.
【０１１２】本発明はまた、診断としてのＶＩＧＦ遺伝
子の使用に関する。ＶＩＧＦの変異した形態の検出は、
ＶＩＧＦにおける変異が癌を引き起こすために、癌のよ
うな疾患の診断または疾患に対する感受性の診断を可能
にする。The present invention also relates to the use of the VIGF gene as a diagnostic. Detection of a mutated form of VIGF
Mutations in VIGF cause cancer, thus allowing the diagnosis of a disease such as cancer or the diagnosis of susceptibility to a disease.
【０１１３】ヒトＶＩＧＦ遺伝子における変異を有する
個体は、種々の技術によりＤＮＡレベルで検出され得
る。診断のための核酸は、患者の細胞（例えば、血液、
尿、唾液、組織生検、および剖検物質由来）より得られ
得る。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用され得、
または分析前にＰＣＲを用いることにより酵素的に増幅
され得る（Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４：１６
３−１６６（１９８６））。ＲＮＡあるいはｃＤＮＡ
が、また同じ目的のために使用され得る。例として、Ｖ
ＩＧＦをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマー
が、ＶＩＧＦ変異を同定および分析するのに使用され得
る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型との比
較における増幅された産物のサイズの変化により検出さ
れ得る。点突然変異は、放射性標識されたＶＩＧＦ Ｒ
ＮＡまたは、あるいは、放射性標識されたＶＩＧＦアン
チセンスＤＮＡ配列に、増幅させたＤＮＡをハイブリダ
イズさせることにより検出され得る。完全に対合した配
列は、リボヌクレアーゼＡ消化または融解温度の差によ
り、誤対合した二重らせんから区別され得る。An individual having a mutation in the human VIGF gene can be detected at the DNA level by various techniques. Nucleic acids for diagnosis can be obtained from patient cells (eg, blood,
Urine, saliva, tissue biopsy, and autopsy material). Genomic DNA can be used directly for detection,
Alternatively, it can be amplified enzymatically by using PCR before analysis (Saiki et al., Nature, 324: 16).
3-166 (1986)). RNA or cDNA
Can also be used for the same purpose. As an example, V
PCR primers complementary to the nucleic acid encoding IGF can be used to identify and analyze VIGF mutations. For example, deletions and insertions can be detected by a change in the size of the amplified product in comparison to the normal genotype. The point mutation was a radiolabeled VIGF®
It can be detected by hybridizing the amplified DNA to NA or, alternatively, to a radiolabeled VIGF antisense DNA sequence. Perfectly matched sequences can be distinguished from mismatched duplexes by ribonuclease A digestion or by differences in melting temperatures.
【０１１４】ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝子試験
は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるＤＮＡ
フラグメントの電気泳動的移動度における変化の検出に
より達成され得る。小さな配列の欠損または挿入は、高
分離能ゲル電気泳動により視覚化され得る。異なる配列
のＤＮＡフラグメントは、変性ホルムアミジングラジエ
ントゲル上で区別され得る。このゲル中で、異なるＤＮ
Ａフラグメントの移動度は、それらの特異的な融解温度
または部分的融解温度に従い、異なる位置に、ゲル中
で、遅滞される（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２３０：１２４２（１９８５））。Genetic testing based on DNA sequence differences can be performed on DNA in gels with or without denaturing agents.
This can be achieved by detecting a change in the electrophoretic mobility of the fragment. Small sequence deletions or insertions can be visualized by high resolution gel electrophoresis. DNA fragments of different sequences can be distinguished on a denaturing formamidine gradient gel. In this gel, different DNs
The mobility of A fragments is delayed in the gel at different locations according to their specific or partial melting temperature (eg, Myers et al., Sciencec).
e, 230: 1242 (1985)).
【０１１５】特定の位置で配列の変化はまた、ヌクレア
ーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護およびＳ１
保護または化学的切断法（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐ
ＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８
５）））により明らかにされ得る。Sequence changes at specific positions may also be detected in nuclease protection assays (eg, RNase protection and S1
Protective or chemical cleavage methods (eg, Cotton et al., P
NAS, USA, 85: 4397-4401 (198
5))).
【０１１６】従って、特定のＤＮＡ配列の検出は、例え
ば、ハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、化学的
切断、直接的なＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用
（例えば、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ））、お
よびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングのような方法
により達成され得る。Thus, detection of specific DNA sequences includes, for example, hybridization, RNase protection, chemical cleavage, direct DNA sequencing or the use of restriction enzymes (eg, restriction fragment length polymorphism (RFLP)), and It can be achieved by methods such as Southern blotting of genomic DNA.
【０１１７】更なる慣習的なゲル電気泳動およびＤＮＡ
配列決定に加えて、変異はまた、インサイチュ分析によ
り検出され得る。Further Customary Gel Electrophoresis and DNA
In addition to sequencing, mutations can also be detected by in situ analysis.
【０１１８】ＶＩＧＦタンパク質発現は、血管疾患また
は腫瘍形態に関連する新生血管形成と関連し得る。ＶＩ
ＧＦは、シグナルペプチドを有し、そしてそのｍＲＮＡ
は、内皮細胞中で高度に発現し、そして平滑筋細胞中で
はより低い程度に発現しており、このことは、そのタン
パク質が血清中で存在することを示す。従って、抗ＶＩ
ＧＦ抗体は、このポリペプチドのレベルの変化が、その
ような障害を示唆し得るので、血管疾患または腫瘍形成
に関連する新生血管形成を診断するのに使用し得る。VIGF protein expression may be associated with neovascularization associated with vascular disease or tumor morphology. VI
GF has a signal peptide and its mRNA
Is highly expressed in endothelial cells and to a lesser extent in smooth muscle cells, indicating that the protein is present in serum. Therefore, anti-VI
GF antibodies may be used to diagnose neovascularization associated with vascular disease or tumor formation, as altered levels of this polypeptide may indicate such a disorder.
【０１１９】競合アッセイが用いられ得る。ここでＶＩ
ＧＦに特異的な抗体が、固体の支持体に接着され、そし
て標識化ＶＩＧＦおよび宿主由来のサンプルが、固体の
支持体上を通過し、そして固体の支持体に接着した検出
された標識の量は、サンプル中のＶＩＧＦの量に相関さ
れ得る。A competition assay can be used. Where VI
An antibody specific for GF is attached to a solid support, and the amount of labeled VIGF and host-derived sample passed over the solid support and the amount of detected label attached to the solid support. Can be correlated to the amount of VIGF in the sample.
【０１２０】本発明の配列はまた、染色体の同定に有益
である。この配列は、個々のヒト染色体の特定の位置を
特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし
得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する
必要がある。現在、染色***置の標識に利用可能な実際
の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識試薬は
ほとんどない。本発明に従うＤＮＡの染色体へのマッピ
ングは、これらの配列と疾患に関する遺伝子とを相関さ
せることにおける重要な第１段階である。The sequences of the present invention are also valuable for chromosome identification. This sequence can specifically target a particular location on an individual human chromosome and hybridize to that location. In addition, it is now necessary to identify specific sites on the chromosome. Currently, there are few chromosome labeling reagents based on actual sequence data (repetitive polymorphisms) available for labeling chromosomal locations. The mapping of DNA to chromosomes according to the present invention is an important first step in correlating these sequences with genes for disease.
【０１２１】簡潔に述べれば、配列は、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製す
ることにより染色体にマップされ得る。３’非翻訳領域
のコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡ内で１より多い
エキソンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化
しないプライマーを迅速に選択するために使用される。
次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含
む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用さ
れる。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリ
ッドのみが増幅フラグメントを生じる。[0121] Briefly, the sequence was converted from cDNA to P
The chromosome can be mapped by preparing a CR primer (preferably 15-25 bp). Computer analysis of the 3 'untranslated region is used to quickly select primers that do not span more than one exon in the genomic DNA and thus do not complicate the amplification process.
These primers are then used for PCR screening of somatic cell hybrids containing individual human chromosomes. Only those hybrids containing the human gene corresponding to the primer will yield an amplified fragment.
【０１２２】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定の染色体に特定のＤＮＡを割り当てるための迅
速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いる本発明を使用して、特定の染色体由来のフラグメ
ントのパネルまたは類似の様式の大きなゲノムクローン
のプールを用いて部分的局在性の決定（ｓｕｂｌｏｃａ
ｌｉｚａｔｉｏｎ）が達成され得る。染色体にマップす
るために同様に使用され得る他のマッピング計画は、イ
ンサイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー選別
した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリ
ーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを
構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択を
包含する。[0122] PCR mapping of somatic cell hybrids is a rapid procedure for assigning specific DNA to specific chromosomes. Using the present invention with the same oligonucleotide primers, sublocalization is determined using a panel of fragments from a particular chromosome or a pool of large genomic clones in a similar fashion (subloca).
lization) can be achieved. Other mapping schemes that can also be used to map to chromosomes include in situ hybridization, pre-screening on labeled flow-sorted chromosomes, and high-level techniques for constructing chromosome-specific cDNA libraries. Preselection by hybridization is included.
【０１２３】ｃＤＮＡクローンの中期染色体スプレッド
への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）は、１工程で正確な染色***置を提供するために使
用され得る。この技術は、５００または６００塩基とい
う短いｃＤＮＡで使用され得る；しかし、２，０００ｂ
ｐよりも長いクローンの方が、簡便な検出のために充分
なシグナル強度でユニークな染色***置に結合しやす
い。ＦＩＳＨは、ＥＳＴが由来するクローンの使用を必
要とし、そしてこのクローンはより長いことが好まし
い。例えば、２，０００ｂｐが良好であり、４，０００
ｂｐはより良好であり、そして４，０００ｂｐを超える
長さは、良好な結果に時間の合理的な割合を得るために
おそらく必要でない。この技術の総説としては、Ｖｅｒ
ｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍ
ａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８８）を参照のこと。Fluorescence in situ hybridization of cDNA clones to metaphase chromosomal spreads (FIS
H) can be used to provide a precise chromosomal location in one step. This technique can be used with cDNAs as short as 500 or 600 bases;
Clones longer than p are more likely to bind to unique chromosomal locations with sufficient signal intensity for convenient detection. FISH requires the use of a clone from which the EST is derived, and it is preferred that this clone be longer. For example, 2,000 bp is good and 4,000 bp
bp is better, and lengths greater than 4,000 bp are probably not necessary to get a reasonable percentage of time for good results. For a review of this technology, see Ver.
Ma et al., Human Chromosomes: a M
annual of Basic Technique
s, Pergamon Press, New York
(1988).
【０１２４】一旦配列が正確な染色***置にマップされ
ると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝的地図の
データと相関させられ得る。このようなデータは、例え
ば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎＭａｎに見出される（Ｊｏｈ
ｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌ
ｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙからオンライン
で入手可能である）。次いで、同一の染色体領域にマッ
プされる遺伝子と疾患との関係が、連鎖解析（物理的に
隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical location of the sequence on the chromosome can be correlated with genetic map data. Such data is described, for example, in V.A. McKusick, Mendelian In
found in heritance in Man (Joh
ns Hopkins University Wel
ch Online available from the Medical Library). Then, the relationship between the gene mapped to the same chromosomal region and the disease is identified by linkage analysis (simultaneous inheritance of physically adjacent genes).
【０１２５】次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤ
ＮＡまたはゲノム配列の差異を決定する必要がある。変
異がいくつかまたはすべての罹患個体に観察されるが正
常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因
因子でありそうである。Next, the cD between affected and unaffected individuals
It is necessary to determine NA or genomic sequence differences. If the mutation is observed in some or all affected individuals but not in normal individuals, then the mutation is likely to be a causative agent of the disease.
【０１２６】物理的マッピング技術および遺伝的マッピ
ング技術の現在の解像度では、疾患に関する染色体領域
に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０と５００との
間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１
メガベースのマッピング解像度で、そして２０ｋｂあた
り１遺伝子と仮定する。） このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導
体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現す
る細胞は、それらに対する抗体を産生させるための免疫
原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリ
クローナル抗体、またはモノクローナル抗体であり得
る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化
抗体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現
ライブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々
の手順が、このような抗体およびフラグメントの産生の
ために使用され得る。At the current resolution of physical and genetic mapping techniques, a cDNA correctly located in a chromosomal region for a disease may be one of between 50 and 500 potential causative genes. (This is 1
Assuming a megabase mapping resolution and one gene per 20 kb. The polypeptides, fragments or other derivatives thereof, or analogs thereof, or cells expressing them can be used as an immunogen to raise antibodies against them. These antibodies can be, for example, polyclonal or monoclonal antibodies. The invention also encompasses chimeric, single chain and humanized antibodies, as well as Fab fragments, or the products of a Fab expression library. Various procedures known in the art can be used for the production of such antibodies and fragments.
【０１２７】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注
射により、または動物へのポリペプチドの投与により得
られ得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次い
で、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体
に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグメ
ントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチ
ド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。
次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現す
る組織からポリペプチドを単離するために使用され得
る。Antibodies raised against polypeptides corresponding to the sequences of the present invention can be obtained by direct injection of the polypeptide into an animal or by administration of the polypeptide to an animal. The animal is preferably non-human. The antibody thus obtained then binds to the polypeptide itself. In this way, even sequences encoding only fragments of the polypeptide can be used to generate antibodies that bind to the entire native polypeptide.
Such antibodies can then be used to isolate the polypeptide from a tissue that expresses the polypeptide.
【０１２８】モノクローナル抗体の調製のために、細胞
株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技
術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術
（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技
術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，
１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７
２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するための
ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５，Ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）が挙げられる。For preparation of monoclonal antibodies, any technique which provides antibodies produced by continuous cell line cultures can be used. Examples include the hybridoma technology (Kohler and Milstein, 1975, N.
ature, 256: 495-497), trioma technology, human B cell hybridoma technology (Kozbor et al.,
1983, Immunology Today 4: 7
2), and EBV hybridoma technology for producing human monoclonal antibodies (Cole et al., 1985, M
onclonal Antibodies and
Cancer Therapy, Alan R.A. Lis
s, Inc. , Pp. 77-96).
【０１２９】単鎖抗体を産生するために記載された技術
（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫
原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するため
に適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、
本発明の免疫原性のポリペプチド産物に対するヒト化抗
体の発現に使用され得る。The techniques described for producing single-chain antibodies (US Pat. No. 4,946,778) can be adapted to generate single-chain antibodies to the immunogenic polypeptide products of the invention. Also, transgenic mice
It can be used to express humanized antibodies against the immunogenic polypeptide products of the invention.
【０１３０】本発明を以下の実施例を参照にしてさらに
記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定さ
れないことが理解されるべきである。すべての部または
量は、他に明記しない限り重量基準である。The invention will be further described with reference to the following examples; however, it is to be understood that the invention is not limited to such examples. All parts or amounts are by weight unless otherwise specified.
【０１３１】以下の実施例の理解を容易にするために、
現れる頻度の高い所定の方法および／または用語が記載
される。In order to facilitate understanding of the following examples,
Certain methods and / or terms that appear frequently are described.
【０１３２】「プラスミド」は、小文字のｐの前および
／またはそれに続く大文字および／または数字を示すこ
とにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、
市販であり、制限無く公的に入手可能であるか、または
公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築
され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラ
スミドが当該分野で公知であり、そして当業者には通常
明らかである。"Plasmids" are designated by a lower case p preceded and / or followed by capital letters and / or numbers. The starting plasmid herein is
It is commercially available, publicly available without limitation, or can be constructed from available plasmids according to published procedures. In addition, plasmids equivalent to the described plasmids are known in the art, and will usually be apparent to those skilled in the art.
【０１３３】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配
列でのみ作用する制限酵素でそのＤＮＡを触媒反応的に
切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制
限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、
補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使
用された。分析目的には、代表的には１μｇのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントには、約２単位の酵素が約
２０μｌの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築の
ためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、代表的
には５〜５０μｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素
で、より大きな容量中で消化される。特定の制限酵素の
ための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定
される。３７℃にての約１時間のインキュベーション時
間が通常使用されるが、しかしこれは供給者の説明書に
従って変わり得る。消化後、反応物をポリアクリルアミ
ドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離す
る。“Digestion” of DNA refers to catalytic cleavage of the DNA with a restriction enzyme that acts only at certain sequences in the DNA. The various restriction enzymes used herein are commercially available and their reaction conditions,
Cofactors and other requirements used were known to those skilled in the art. For analytical purposes, typically for 1 μg of plasmid or DNA fragment, about 2 units of enzyme are used in about 20 μl of buffer solution. For the purpose of isolating DNA fragments for plasmid construction, typically 5-50 μg of DNA is digested with 20-250 units of enzyme in a larger volume. Appropriate buffers and substrate amounts for particular restriction enzymes are specified by the manufacturer. Incubation times of about 1 hour at 37 ° C. are usually used, but this can vary according to the supplier's instructions. After digestion, the reaction is electrophoresed directly on a polyacrylamide gel to isolate the desired fragment.
【０１３４】切断フラグメントのサイズ分離は、Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ，Ｄ．ら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，８：４０５７（１９８０）により記載された８％
ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。The size separation of the cleavage fragments was performed according to Goe
ddel, D.E. Et al., Nucleic Acids Re
s. , 8: 4057 (1980).
This is performed using a polyacrylamide gel.
【０１３５】「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシ
ヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合
成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、
５’リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でリン酸
とＡＴＰとを添加しなければ別のオリゴヌクレオチドと
連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化さ
れていないフラグメントに連結する。“Oligonucleotide” refers to either a single-stranded polydeoxynucleotide or two complementary polydeoxynucleotide chains, which can be chemically synthesized. Such synthetic oligonucleotides are
It has no 5 'phosphate and therefore will not ligate to another oligonucleotide without the addition of phosphate and ATP in the presence of the kinase. Synthetic oligonucleotides ligate to fragments that have not been dephosphorylated.
【０１３６】「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメン
トの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをい
う（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら、前出、１４６頁）。他に
提供されていなければ、連結は公知の緩衝液および条件
で、大体等モル量の連結されるべきＤＮＡフラグメント
０．５μｇあたり１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。“Ligation” refers to the process of forming a phosphodiester bond between two double-stranded nucleic acid fragments (Maniatis, T et al., Supra, p. 146). Unless otherwise provided, ligation can be accomplished using known buffers and conditions, using approximately equimolar amounts of 10 units of T4 DNA ligase per 0.5 μg of DNA fragment to be ligated (“ligase”). .
【０１３７】記載しない限り、形質転換はＧｒａｈａ
ｍ，Ｆ．およびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．，Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に
記載のように実施された。Unless otherwise stated, transformations were performed using Graha
m, F. And Van der Eb, A .; , Viro
logic, 52: 456-457 (1973).
【０１３８】従って、本発明において、ヒト血管ＩＢＰ
様成長因子ポリペプチド（ＶＩＧＦ）、およびこのよう
なポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）、ならび
に組換え技術によりこのようなポリペプチドを産生する
ための手順が開示される。創傷治癒または組織再生のた
め、移植片固定および脈管形成を刺激するために、この
ようなポリペプチドを使用する方法もまた開示される。
このようなポリペプチドに対するアンタゴニスト、およ
びアテローム性動脈硬化症、腫瘍およびはん痕を処置す
るための治療物としてのその使用もまた開示される。Ｖ
ＩＧＦ核酸配列中の変異および変化したＶＩＧＦポリペ
プチドレベルを同定するための診断アッセイもまた開示
される。Therefore, in the present invention, human vascular IBP
Disclosed are growth-like growth factor polypeptides (VIGF), and DNA (RNA) encoding such polypeptides, as well as procedures for producing such polypeptides by recombinant techniques. Also disclosed are methods of using such polypeptides to stimulate graft fixation and angiogenesis for wound healing or tissue regeneration.
Also disclosed are antagonists to such polypeptides and their use as therapeutics for treating atherosclerosis, tumors and scars. V
Diagnostic assays for identifying mutations in IGF nucleic acid sequences and altered VIGF polypeptide levels are also disclosed.
【０１３９】以下の図面は、本発明の実施態様の例示で
あり、そして請求の範囲により包含されるような本発明
の範囲を限定することを意味しない。The following drawings are illustrative of embodiments of the present invention, and are not meant to limit the scope of the invention as encompassed by the claims.
【０１４０】[0140]
【実施例】（実施例１） （ＶＩＧＦの細菌発現および精製）ＶＩＧＦをコードす
るＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番号第７５８７４号）を、
ＶＩＧＦタンパク質の５’配列（シグナルペプチド配列
を除く）およびプロセスされたＶＩＦＧ遺伝子に対して
３’のベクター配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いて最初に増幅する。ＶＩＧＦに対応
するさらなるヌクレオチドを、それぞれ５’および３’
配列に添加した。５’オリゴヌクレオチドプライマー
は、配列EXAMPLES Example 1 Bacterial Expression and Purification of VIGF The DNA sequence encoding VIGF (ATCC Accession No. 75874) was
It is first amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'sequence of the VIGF protein (excluding the signal peptide sequence) and the vector sequence 3' to the processed VIFG gene. Additional nucleotides corresponding to VIGF were 5 'and 3', respectively.
Added to the sequence. The 5 'oligonucleotide primer has the sequence
【０１４１】[0141]
【数１】 を有し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位（太字）、それに
続くプロセスされたタンパク質コドンの推定末端アミノ
酸（下線）から始まる２１ヌクレオチドのＶＩＧＦコー
ド配列を含む。３’オリゴヌクレオチドプライマー、(Equation 1) And contains the 21 nucleotide VIGF coding sequence beginning with the HindIII restriction enzyme site (bold), followed by the putative terminal amino acids of the processed protein codon (underlined). 3 'oligonucleotide primer,
【０１４２】[0142]
【数２】 は、ＸｂａＩ制限部位（太字）、それに続くカルボキシ
末端の５アミノ酸に対応する逆相補性ヌクレオチドおよ
び翻訳停止コドン（下線）を含む。制限酵素部位は、細
菌発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、
Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）上の制限酵素部位に対応
する。ｐＱＥ−９は、抗生物質耐性（Ａｍｐr）、細菌
の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ調節可能プロモーター
オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢ
Ｓ）、６−Ｈｉｓタグ、および制限酵素部位をコードす
る。次いで、ＶＩＧＦ ＰＣＲ産物およびｐＱＥ−９を
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、そしてＴ４
ＤＮＡリガーゼで共に連結した。所望の組換え体は、ヒ
スチジンタグをコードしたｐＱＥ−９およびリボゾーム
結合部位から下流に挿入されたＶＩＧＦコード配列含
む。次いで、連結混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１
５［ｐＲＥＰ４］（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ）をＳａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，
（１９８９）に記載の手順により形質転換した。Ｍ１５
［ｐＲＥＰ４］は、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、そ
してカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を付与するプラスミ
ドｐＲＥＰ４の多数のコピーを含む。形質転換体をＬＢ
プレート上で増殖するそれらの能力により同定し、そし
てアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択し
た。プラスミドＤＮＡを単離して、制限酵素分析により
確認する。所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１
００μｇ／ｍｌ）とＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）との両方
を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させた。Ｏ／Ｎ培養物を用いて１：１００〜１：２
５０の比で大きな培養物に接種する。細胞を、６００の
光学密度（Ｏ．Ｄ．600）が０．４と０．６との間にな
るまで増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（「イソプロピル
−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド」）を加えて１ｍＭ
の最終濃度にした。ＩＰＴＧはｌａｃＩリプレッサーを
不活性化することにより、Ｐ／Ｏを解放し遺伝子発現の
増加を誘導する。指数関数的成長のため、細胞をさらに
３〜４時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離により
収穫した。ＶＩＧＦ／６−ヒスチジン含有Ｍ１５［ｐＲ
ＥＰ４］細胞は、ｐＨ８．０で、６ＭグアニジンＨＣ
ｌ、５０ｍＭ ＮａＰＯ 4で溶解した。この溶解物をニ
ッケルキレートカラムにロードし、そしてそのフロース
ルーを回収した。カラムを、ｐＨ８．０、ｐＨ６．０、
およびｐＨ５．０で６ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭ
ＮａＰＯ4により洗浄した。ＶＩＧＦ融合タンパク質
（９０％を超える純度）を、ｐＨ２．０で溶出した。プ
レカラム溶解物由来のサンプル（図３、レーン２）、フ
ロースルー由来のサンプル（レーン３）、ｐＨ５．０で
の洗浄由来のサンプル（レーン４）、およびｐＨ２．０
での溶出物由来のサンプル（レーン５）を、デオキシコ
ール酸ナトリウムおよびトリクロロ酢酸で沈殿させた。
再天然化型の目的で、ｐＨ２．０での溶出物を３Ｍグア
ニジンＨＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ
グルタチオン（還元型）、および２ｍＭグルタチオン
（酸化型）に調整した。この溶液中での１２時間のイン
キュベーションの後、タンパク質を１０ｍＭリン酸ナト
リウムに対して透析した。ゲルに通すために、このペレ
ットを、ＳＤＳ／ＮａＯＨおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥロー
ディング緩衝液で再懸濁し、熱変性させ、次いで、１５
％変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。Ｇｉ
ｂｒｏ ＢＲＬ ｌｏｗ ｒａｎｇｅ分子量スタンダー
ドもまた、電気泳動した（レーン１）。このタンパク質
をコマシーブリリアントブルーＲ−２５０染色で視覚化
した。図３は、ＶＩＧＦ精製の結果を示すＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲルを示す。(Equation 2)Is the Xbal restriction site (bold) followed by the carboxy
Reverse complementary nucleotides corresponding to the terminal 5 amino acids and
And translation stop codons (underlined). Restriction enzyme sites
The bacterial expression vector pQE-9 (Qiagen, Inc.,
Chatsworth, CA)
I do. pQE-9 is resistant to antibiotics (Ampr), Bacteria
Origin of replication (ori), IPTG regulatable promoter
Operator (P / O), ribosome binding site (RB
S), encoding a 6-His tag and a restriction enzyme site
You. The VIGF PCR product and pQE-9 were then
Digest with HindIII and XbaI and T4
They were ligated together with DNA ligase. The desired recombinant is
PQE-9 and ribosome encoding a stidine tag
Contains the VIGF coding sequence inserted downstream from the binding site
No. The ligation mixture was then used to make E. coli. coli strain M1
5 [pREP4] (Qiagen, Inc) to Samb
look, J.M. Et al., Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual, Col
d Spring Laboratory Press,
(1989). M15
[PREP4] expresses the lacI repressor and
Kanamycin resistance (Kanr) To give plasmy
Includes multiple copies of pREP4. Transformants into LB
Identified by their ability to grow on plates, and
To select ampicillin / kanamycin resistant colonies
Was. Isolate plasmid DNA and perform restriction analysis
Confirm. A clone containing the desired construct is designated Amp (1
00 μg / ml) and Kan (25 μg / ml)
Overnight in liquid culture in LB medium supplemented with O / N (O / N)
Propagated. 1: 100 to 1: 2 using O / N culture
Inoculate a large culture at a ratio of 50. Cells
Optical density (OD600) Is between 0.4 and 0.6
Until grown. Then IPTG ("Isopropyl
-BD-thiogalactopyranoside ") and 1 mM
To a final concentration of IPTG has a lacI repressor
Inactivation releases P / O and reduces gene expression
Induce increase. Add cells further for exponential growth
Grow for 3-4 hours. The cells are then centrifuged.
Harvested. VIGF / 6-histidine containing M15 [pR
EP4] cells were treated with 6M guanidine HC at pH 8.0.
1, 50 mM NaPO FourAnd dissolved. Dissolve this lysate
Load into the chelkel column and flow
Lou was recovered. The column was adjusted to pH 8.0, pH 6.0,
And 6M guanidine HCl, 50 mM at pH 5.0
NaPOFourAnd washed. VIGF fusion protein
(> 90% purity) eluted at pH 2.0. Step
Samples from recolumn lysates (Figure 3, lane 2)
Sample from low through (lane 3) at pH 5.0
From the wash (lane 4) and pH 2.0
The sample (lane 5) derived from the eluate at
Precipitated with sodium oxalate and trichloroacetic acid.
For renaturalization purposes, elute at pH 2.0 with 3M guar.
Niidine HCl, 100 mM sodium phosphate, 10 mM
Glutathione (reduced) and 2 mM glutathione
(Oxidized type). 12 hours in this solution
After incubation, remove the protein from 10 mM sodium phosphate
Dialyzed against lium. Use this pellet to pass through the gel.
Check the SDS / NaOH and SDS-PAGE rows
Re-suspended in loading buffer, heat denatured, and then
Electrophoresis was performed on a% denaturing polyacrylamide gel. Gi
bro BRL low range molecular weight stander
Was also electrophoresed (lane 1). This protein
Is visualized with Coomassie Brilliant Blue R-250 staining
did. FIG. 3 shows SDS-poly which shows the results of VIGF purification.
1 shows an acrylamide gel.
【０１４３】（実施例２） （バキュロウイルス発現系を用いるＶＩＧＦのクローニ
ングおよび発現）全長ＶＩＧＦタンパク質をコードする
ＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番号７５８７４）を、制限酵
素ＰｖｕＩＩおよびＸｂａＩで消化する。６３９ヌクレ
オチドのＰｖｕＩＩおよびＸｂａＩフラグメントは、全
ＶＩＧＦコード領域に加えて、５’および３’非翻訳Ｄ
ＮＡのそれぞれ１１および７７ヌクレオチドを含む。Ｆ
２と命名したこのフラグメントを、市販されているキッ
ト（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０１ Ｉｎ
ｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ）を用いて１％アガロー
スゲルから単離する。Example 2 Cloning and Expression of VIGF Using Baculovirus Expression System The DNA sequence encoding the full-length VIGF protein (ATCC Accession No. 75874) is digested with restriction enzymes PvuII and XbaI. The 639 nucleotide PvuII and XbaI fragments, in addition to the entire VIGF coding region, 5 ′ and 3 ′ untranslated D
It contains 11 and 77 nucleotides of NA, respectively. F
This fragment, designated No. 2, was purchased from a commercially available kit ("Geneclean", BIO 101 In).
c. , La Jolla, Ca) using a 1% agarose gel.
【０１４４】ベクターｐＡ２をバキュロウイルス発現系
を用いるＶＩＧＦタンパク質の発現のために用いる（総
説について、Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．およびＳｍｉｔ
ｈ，Ｇ．Ｅ．１９８７，Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃ
ｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔ
ｕｒｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａ
ｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５を参照の
こと）。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ
ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮ
ＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、それに続く
制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩおよびＸｂａＩの認識
部位を含む。シミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデ
ニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用い
る。組換えウイルスの容易な選択のために、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポリヘドリン
遺伝子のポリアデニル化シグナルに続くポリヘドリンプ
ロモーターと同方向に挿入した。ポリヘドリン配列の両
端には、コトランスフェクトされた野生型ウイルスＤＮ
Ａの細胞媒介性相同組換えのためのウイルス配列が隣接
している。多くの他のバキュロウイルスベクターが、ｐ
Ａ２の代わりに用いられ得る。例えば、ｐＲＧ１、ｐＡ
ｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐＡｃＩＭ１である
（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．
Ｄ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７０：３１−３９）。The vector pA2 is used for the expression of the VIGF protein using the baculovirus expression system (for a review, see Summers, MD and Smit).
h, G. E. FIG. 1987, A manual of me
things for baculovirus vec
tors and insect cell culture
ure procedures, Texas Agri
cultural Experimental Sta
Tion Bulletin No. 1555). This expression vector is Autographa
californica nuclear polyhedrosis virus (AcMN)
PV), which contains the strong polyhedrin promoter, followed by recognition sites for the restriction endonucleases SmaI and XbaI. The simian virus (SV) 40 polyadenylation site is used for efficient polyadenylation. For easy selection of recombinant viruses, E. coli. col
The β-galactosidase gene from i was inserted in the same direction as the polyhedrin promoter following the polyadenylation signal of the polyhedrin gene. At both ends of the polyhedrin sequence, the co-transfected wild-type virus DN
The viral sequence for cell-mediated homologous recombination of A is flanked. Many other baculovirus vectors contain p
Can be used instead of A2. For example, pRG1, pA
c373, pVL941, and pAcIM1 (Luckow, VA and Summers, M.C.).
D. , Virology, 170: 31-39).
【０１４５】プラスミドを制限酵素ＳｍａＩおよびＸｂ
ａＩで消化し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウ
シ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、
そのＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」
ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ
ａ．）を用いて１％アガロースゲルから単離する。この
ベクターＤＮＡをＶ２と命名する。The plasmid was replaced with the restriction enzymes SmaI and Xb.
digested with aI and then dephosphorylated with calf intestinal phosphatase by procedures known in the art. Then
The DNA was converted to a commercially available kit (“Geneclean”).
BIO 101 Inc. , La Jolla, C
a. ) To isolate from a 1% agarose gel. This vector DNA is designated as V2.
【０１４６】フラグメントＦ２および脱リン酸化プラス
ミドＶ２を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。
次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ Ｂｌｕｅ株（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１１
０１１ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏ
ａｄ Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．９２０３７）に形質転
換し、そして、酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを用いる
ＶＩＧＦ ｃＤＮＡを有するプラスミド（ｐＢａｃ Ｖ
ＩＧＦ）を含む細菌を同定した。クローン化したフラグ
メントの配列を、ＤＮＡ配列によって確認する。Fragment F2 and dephosphorylated plasmid V2 are ligated using T4 DNA ligase.
Then, E. coli XL1 Blue strain (Stra
tagene Cloning Systems, 11
011 North Torrey Pines Ro
ad La Jolla, Ca. 92037) and a plasmid (pBacV) carrying the VIGF cDNA using the enzymes BamHI and XbaI.
Bacteria containing (IGF) were identified. The sequence of the cloned fragment is confirmed by DNA sequence.
【０１４７】５μｇのプラスミドｐＢａｃ ＶＩＧＦ
を、リポフェクション法（Ｆｅｌｇｎｅｒら Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７
４１３−７４１７（１９８７））を用いて、１．０μｇ
の市販の線状化したバキュロウイルス（「Ｂａｃｕｌｏ
ＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈ
ａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）とと
もにコトランスフェクトする。5 μg of plasmid pBac VIGF
By the lipofection method (Felgner et al. Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7
413-7417 (1987)).
Commercially available linearized baculovirus ("Baculo").
Gold ™ baculovirus DNA ”, Ph
armingen, San Diego, CA. ) And co-transfect.
【０１４８】１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルス
ＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃ ＶＩＧＦ
を、５０μｌの無血清Ｇｒａｃｅ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ，ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの無菌
ウェル中で混合する。その後、１０μｌリポフェクチン
と９０μｌのＧｒａｃｅ培地を添加し、混合し、そして
室温にて１５分間インキュベートした。次いで、そのト
ランスフェクション混合物を、無血清Ｇｒａｃｅ培地１
ｍｌを有する３５ｍｍ組織培養プレート内に播種された
Ｓｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下
する。プレートを、新たに加えられた溶液を混合するた
めに、前後に振盪する。次いでプレートを、２７℃で５
時間インキュベートする。５時間後、トランスフェクシ
ョン溶液をプレートから除去し、そして１０％ウシ胎児
血清を補充した１ｍｌのＧｒａｃｅ昆虫培地を添加す
る。プレートをインキュベーターに戻し、そして２７℃
で４日間培養を続けた。1 μg of BaculoGold ™ viral DNA and 5 μg of plasmid pBac VIGF
With 50 μl of serum-free Grace's medium (Life Te)
channels Inc. , Gaithersb
urge, MD) in a sterile well of a microtiter plate. Thereafter, 10 μl Lipofectin and 90 μl Grace medium were added, mixed and incubated at room temperature for 15 minutes. The transfection mixture was then added to serum-free Grace's medium 1
Drip into Sf9 insect cells (ATCC CRL 1711) seeded in a 35 mm tissue culture plate with ml. The plate is shaken back and forth to mix the newly added solution. The plate is then placed at 27 ° C. for 5
Incubate for hours. After 5 hours, the transfection solution is removed from the plate and 1 ml of Grace insect medium supplemented with 10% fetal calf serum is added. Return plate to incubator and put at 27 ° C
For 4 days.
【０１４９】４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅ
ｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）による記載と同様にプラ
ークアッセイを行う。改変法として、青く染まったプラ
ークの容易な単離を可能にする、「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」
（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するアガロースゲルを用
いる。（「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇにより配布される昆虫細胞培養およ
びバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜１０頁）に
おいても見い出され得る）。After 4 days, the supernatant was collected and the Summe
The plaque assay is performed as described by rs and Smith (supra). As a modification, "Blue Gal" allows easy isolation of blue-stained plaques
(Life Technologies Inc., G
An agarose gel having an aisersburg) is used. (A detailed description of the “plaque assay” is also provided by L.
if Technologies Inc. , Gai
(It can also be found in the Insect Cell Culture and Baculovirology User's Guide distributed by thersburg (pages 9-10)).
【０１５０】連続希釈の４日後に、ウイルスをその細胞
に添加し、そして青く染まったプラークをエッペンドル
フピペットのチップで拾う。次いで、組換えウイルスを
含む寒天を、２００μｌのＧｒａｃｅ培地を含むエッペ
ンドルフチューブに再懸濁する。寒天を、簡単な遠心分
離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む
上清を、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細胞に
感染させるために用いる。４日後、これらの培養ディッ
シュの上清を回収し、次いで４℃で保存する。Four days after serial dilution, the virus is added to the cells and the blue stained plaque is picked up with the tip of an Eppendorf pipette. The agar containing the recombinant virus is then resuspended in an Eppendorf tube containing 200 μl Grace's medium. The agar is removed by simple centrifugation and the supernatant containing the recombinant baculovirus is used to infect Sf9 cells seeded in a 35 mm dish. Four days later, the supernatants of these culture dishes are collected and then stored at 4 ° C.
【０１５１】Ｓｆ９細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳを補
充したＧｒａｃｅ培地中で増殖させる。細胞に、感染多
重度（ＭＯＩ）２で組換えバキュロウイルスＶ−ＶＩＧ
Ｆを感染させる。６時間後、その培地を除去し、そして
メチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００ ＩＩ
培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）に置換する。４２時
間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの35
Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加する。細胞
を、さらに１６時間インキュベートし、その後細胞を遠
心分離により採集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオ
ートラジオグラフィーにより標識化タンパク質を可視化
した。The Sf9 cells are grown in Grace's medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS. Cells were treated with recombinant baculovirus V-VIG at a multiplicity of infection (MOI) of 2
Infect F. After 6 hours, the medium was removed and SF900 II free of methionine and cysteine.
Medium (Life Technologies In
c. , Gaithersburg). 42 hours later, 5 μCi 35 S-methionine and 5 μCi 35
Add S cysteine (Amersham). Cells were incubated for an additional 16 hours, after which cells were harvested by centrifugation and labeled proteins visualized by SDS-PAGE and autoradiography.
【０１５２】（実施例３） （ＣＨＯ細胞における組換えＶＩＧＦの発現）ベクター
ｐＮ３４６を、ＶＩＧＦタンパク質の発現のために使用
する。プラスミドｐＮ３４６は、プラスミドｐＳＶ２−
ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号第３７１４６号）の誘導体
である。両方のプラスミドはＳＶ４０初期プロモーター
の制御下で、マウスｄｈｆｒ遺伝子を含む。これらのプ
ラスミドでトランスフェクトしたチャイニーズハムスタ
ーの卵巣またはジヒドロ葉酸活性を欠く他の細胞は、化
学療法剤メトトレキセートを補充した選択培地（ａｌｐ
ｈａ ｍｉｎｕｓ ＭＥＭ、Ｌｉｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ）中で細胞を増殖させることにより選択し得
る。メトトレキセート（ＭＴＸ）耐性の細胞におけるＤ
ＨＦＲ遺伝子の増幅は、非常に詳細に記述されている
（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．、Ｋｅｌｌｅｍｓ，Ｒ．
Ｍ．、Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．、およびＳｃｈｉｍｋ
ｅ，Ｒ．Ｔ．、１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
５３：１３５７−１３７０、Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．お
よびＭａ，Ｃ．１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７−１４３、Ｐ
ａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．１
９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第９巻：６４−
６８を参照のこと）。増加させた濃度のＭＴＸ中で増幅
させた細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標
的酵素、ＤＨＦＲを過産生することにより、薬物に対す
る耐性が増加する。第２の遺伝子が、ｄｈｆｒ遺伝子に
連結される場合、たいてい同時増幅および過発現を起こ
す。続いて、メトトレキセートが取り下げられる場合、
細胞株は、染色体（単数または複数）に組み込まれた増
幅された遺伝子を含む。Example 3 Expression of Recombinant VIGF in CHO Cells The vector pN346 is used for the expression of the VIGF protein. Plasmid pN346 is identical to plasmid pSV2-
dhfr (ATCC Accession No. 37146). Both plasmids contain the mouse dhfr gene under the control of the SV40 early promoter. Ovarian or other cells lacking dihydrofolate activity of Chinese hamsters transfected with these plasmids were selected from selective media (alp, supplemented with the chemotherapeutic agent methotrexate).
ha minus MEM, Lift Technology
ogies) can be selected by growing the cells. D in methotrexate (MTX) resistant cells
Amplification of the HFR gene has been described in great detail (eg, Alt, FW, Kellems, R .;
M. Bertino, J .; R. , And Shimk
e, R. T. 1978; Biol. Chem. 2
53: 1357-1370, Hamlin, J. Mol. L. And Ma, C.I. 1990, Biochem. et Bi
ophys. Acta, 1097: 107-143, P
age, M .; J. And Sydenham, M .; A. 1
991, Biotechnology Volume 9: 64-
68). Cells amplified in increased concentrations of MTX have increased resistance to drugs by overproducing the target enzyme, DHFR, as a result of amplification of the DHFR gene. When the second gene is linked to the dhfr gene, it often results in co-amplification and overexpression. Subsequently, if methotrexate is withdrawn,
The cell line contains the amplified gene integrated into the chromosome (s).
【０１５３】プラスミドｐＮ３４６は、目的の遺伝子の
発現のために、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴ
Ｒ）の強力プロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、１９８５年３月、４３８−４７７）とヒトサイトメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）の即時型遺伝子のエンハンサー
より単離したフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌ
ｌ ４１：５２１−５３０、１９８５）とを含む。プロ
モーターの下流には、遺伝子の組み込みが可能な以下の
単一の制限酵素：ＢａｍＨＩ、Ｐｖｕｌｌ、およびＮｒ
ｕｌの切断部位がある。これらのクローニング部位の後
ろに、そのプラスミドは、全部で３つのリーディングフ
レーム中に翻訳停止コドンを含み、その後に３’イント
ロンおよびラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデ
ニル化部位が続く。他の高効率プロモーター（例えば、
ヒトβ−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期または後
期プロモーターまたは他のレトロウイルス（例えば、Ｈ
ＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反復）がまた、発
現のために使用し得る。ｍＲＮＡのポリアデニル化のた
めに、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモン由来の
またはグロビン遺伝子由来の）が同様に使用し得る。The plasmid pN346 contains the Rous sarcoma virus long terminal repeat (LTT) for expression of the gene of interest.
R) strong promoter (Cullen et al., Molec)
ullar and Cellular Biolog
y, March 1985, 438-479) and a fragment isolated from an enhancer of the immediate-early gene of human cytomegalovirus (CMV) (Boshart et al., Cel.
41: 521-530, 1985). Downstream of the promoter are the following single restriction enzymes that allow for gene integration: BamHI, Pvull, and Nr
There is a ul cleavage site. Behind these cloning sites, the plasmid contains a translation stop codon in all three reading frames, followed by a 3 'intron and a polyadenylation site of the rat preproinsulin gene. Other high efficiency promoters (eg,
The human β-actin promoter, the SV40 early or late promoter or other retroviruses (eg, H
IV and HTLVI)) can also be used for expression. For polyadenylation of mRNA, other signals can be used as well, such as from human growth hormone or from the globin gene.
【０１５４】染色体に組み込まれた目的の遺伝子を保有
する安定な細胞株はまた、選択可能なマーカー（例え
ば、ｇｐｔ、Ｇ４１８、またはハイグロマイシン）を用
いるこの同時トランスフェクションにより選択し得る。
これは、まず始めに、１つより多い選択可能なマーカー
（例えば、Ｇ４１８＋メトトレキセート）を使用するの
に有利である。[0154] Stable cell lines carrying the gene of interest integrated into the chromosome can also be selected by this co-transfection with a selectable marker (eg, gpt, G418, or hygromycin).
This is advantageous, first of all, for using more than one selectable marker (eg, G418 + methotrexate).
【０１５５】プラスミドｐＮ３４６を制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで消化し、そして、次いで当該分野で公知の手順によ
り仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次
いでそのベクターを１％アガロースゲルから単離する。Plasmid pN346 was replaced with the restriction enzyme BamH.
I and then dephosphorylated using calf intestinal phosphatase by procedures known in the art. The vector is then isolated from a 1% agarose gel.
【０１５６】全長ＶＩＧＦタンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列（ＡＴＣＣ受託番号第７５８７４号）を、遺伝子
の５’配列および３’配列に相当するＰＣＲオリゴヌク
レオチドプライマーを用いて増幅する：５’プライマー
は、配列DN encoding full-length VIGF protein
The A sequence (ATCC Accession No. 75874) is amplified using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' sequences of the gene:
【０１５７】[0157]
【数３】 を有し、そしてＢｇｌＩＩ制限酵素部位（太字）を含
み、その後ろには真核細胞中での翻訳の開始のための効
率的なシグナルに類似する８ヌクレオチドが続く（Ｋｏ
ｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９４
７−９５０、（１９８７））。残存するヌクレオチド
は、翻訳開始コドン（下線）を含むアミノ末端の７アミ
ノ酸に一致する。３’プライマーは、配列(Equation 3) And contains a BglII restriction site (bold) followed by 8 nucleotides similar to an efficient signal for initiation of translation in eukaryotic cells (Ko).
zak, M .; J. Mol. Biol. 196: 94
7-950, (1987)). The remaining nucleotides correspond to the amino-terminal 7 amino acids including the translation initiation codon (underlined). The 3 'primer has the sequence
【０１５８】[0158]
【数４】 を有し、そしてＢｇｌＩＩ制限部位（太字）および翻訳
停止コドンから７ヌクレオチド下流から始まる３’非翻
訳ＤＮＡの逆相補体である２１ヌクレオチドを含む。Ｐ
ＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩで消化し、そして市販されてい
るキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０１
Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ 、Ｃａ）を用いて１％ア
ガロースゲル上で精製する。次いで、このフラグメント
を、ＢａｍＨＩ消化し、ホスファターゼ処理したｐＮ３
４６プラスミドにＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結さ
せる。Ｘｌ１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）Ｅ．ｃ
ｏｌｉを形質転換し、ＬＢ、５０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンプレート上に播種する。適切な方向に所望の組換え
体を有するコロニーが、ラウス肉腫ウイルスプロモータ
ーに一致する５’プライマーおよびＶＩＧＦコドン７３
〜７９の逆相補体に相当する３’プライマーを用いるＰ
ＣＲによりスクリーニングする。クローン化されたフラ
グメントの配列を、ＤＮＡ配列決定により確認する。(Equation 4) And contains 21 nucleotides which are the reverse complement of 3 'untranslated DNA beginning 7 nucleotides downstream from the BglII restriction site (bold) and translation stop codon. P
The CR product is digested with BglII and a commercially available kit (“Geneclean”, BIO 101
Inc. , La Jolla, Ca) on a 1% agarose gel. This fragment was then digested with BamHI and phosphatase treated pN3.
Ligation to 46 plasmids using T4 DNA ligase. Xl1Blue (Stratagene) E.I. c
The oli is transformed and seeded on LB, 50 μg / ml ampicillin plate. Colonies with the desired recombinant in the proper orientation are identified with a 5 'primer matching the Rous sarcoma virus promoter and VIGF codon 73.
P using the 3 'primer corresponding to the reverse complement of ~ 79
Screen by CR. The sequence of the cloned fragment is confirmed by DNA sequencing.
【０１５９】（ＣＨＯ−ｄｈｆｒ細胞のトランスフェク
ション）活性なＤＨＦＲ酵素を欠くチャイニーズハムス
ターの卵巣細胞をトランスフェクションに用いる。５μ
ｇの発現プラスミドｐＮ３４６ＶＩＧＦが、０．５μｇ
のプラスミドｐＳＶｎｅｏリポフェクチン法（Ｆｅｌｇ
ｎｅｒら、前出）を用いて同時にトランスフェクトす
る。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性選択可能なマ
ーカー、およびＧ４１８を含む抗生物質の群に対して耐
性を付与する酵素をコードするＴｎ５由来の遺伝子ｎｅ
ｏを含む。この細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充
したαマイナスＭＥＭ中に接種する。２日後、細胞をト
リプシン処理し、そしてハイブリドーマクローニングプ
レート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に接種し、
そして１０〜１４日培養する。この期間の後、単一のク
ローンをトリプシン処理し、そして次いで、異なった濃
度のメトトレキセート（２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎ
Ｍ、２００ｎＭ、４００ｎＭ）を用いた６ウェルのペト
リ皿に接種する。次いで、もっとも高濃度のメトトレキ
セートで増幅するクローンを、より高濃度のメトトレキ
セート（５００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ）を含有
する新たな６ウェルプレートに移す。クローンが１００
μＭの濃度で増殖するまで同じ手順を繰り返す。(Transfection of CHO-dhfr cells) Chinese hamster ovary cells lacking the active DHFR enzyme are used for transfection. 5μ
g of the expression plasmid pN346VIGF
Plasmid pSVneo lipofectin method (Felg
ner et al., supra). Plasmid pSV2-neo contains a dominant selectable marker and a gene ne from Tn5 encoding an enzyme that confers resistance to a group of antibiotics including G418.
o. The cells are inoculated in α minus MEM supplemented with 1 mg / ml G418. Two days later, cells were trypsinized and seeded on hybridoma cloning plates (Greiner, Germany)
Then, the cells are cultured for 10 to 14 days. After this period, a single clone was trypsinized and then different concentrations of methotrexate (25 nM, 50 nM, 100 nM).
M, 200 nM, 400 nM) into 6-well petri dishes. The clone that amplifies with the highest concentration of methotrexate is then transferred to a new 6-well plate containing higher concentrations of methotrexate (500 nM, 1 μM, 2 μM, 5 μM). 100 clones
Repeat the same procedure until growing at a concentration of μM.
【０１６０】所望の遺伝子産物の発現を、ウエスタンブ
ロット分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。The expression of the desired gene product is analyzed by Western blot analysis and SDS-PAGE.
【０１６１】（実施例４） （ノーザンブロット分析によるＶＩＧＦ遺伝子発現の組
織の局在性）レーンあたり２μｇのヒト成人脳、心臓、
胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および膵臓ポリＡ+ｍ
ＲＮＡを含む多数の組織のノーザンブロット（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、４０
３０ Ｆａｂｉａｎ Ｗａｙ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４３０３）を、Ｃｈｕｒｃｈ緩
衝液（Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．＆Ｇｉｌｂｅｒｔ，
Ｗ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８１、１９９１−１９９５（１９８４））中で６０℃
で１時間プレハイブリダイズさせる。ＶＩＧＦをコード
するＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番号第７５８７４号）
を、Ｍ１３の正方向（５’ＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴ
ＣＡＣＧＡＣ３’）プライマーおよび逆方向（５’ＡＴ
ＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧ３’）プライマーを
用いたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）中でクロー
ン化された全長ｃＤＮＡから増幅する。２５ナノグラム
のＰＣＲ産物を、32Ｐ−ｄＣＴＰでランダムプライマー
標識する（Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩ、Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１１０１１
Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｄ．；Ｌａ
Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９２０３７）。
熱変性させたＶＩＧＦプローブをプレハイブリダイゼー
ション緩衝液に直接添加し、そして６０℃で１６時間イ
ンキュベートした。６０℃で０．２ＸＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ中で１０分間洗浄を２回行った。−８０℃でオー
トラジオグラフィーを行った。Example 4 Tissue Localization of VIGF Gene Expression by Northern Blot Analysis 2 μg of human adult brain, heart,
Placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, and pancreatic poly A + m
Northern blot (Clon) of many tissues containing RNA
tech Laboratories, Inc. , 40
30 Fabian Way; Palo Alto, C
alionia 94303) in Church buffer (Church, GM & Gilbert,
W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81, 1991-1995 (1984)).
And prehybridize for 1 hour. DNA sequence encoding VIGF (ATCC Accession No. 75874)
In the positive direction of M13 (5′GGGTTTTCCCAGT)
CACGAC3 ') primer and reverse (5'AT)
Amplify from full-length cDNA cloned in pBluescript SK (-) using GCTTCCGGCTCGTATG3 ') primer. Random primer labeling of 25 nanograms of PCR product with 32 P-dCTP (Prime-It II, Stratage)
ne Cloning Systems, 11011
North Torrey Pines Rd. La
Jolla, California 92037).
The heat denatured VIGF probe was added directly to the prehybridization buffer and incubated at 60 ° C. for 16 hours. 0.2X SSC at 60 ° C, 0.1%
Washing was performed twice in SDS for 10 minutes. Autoradiography was performed at -80 ° C.
【０１６２】２．３ｋｂの転写物が、４日間の曝露の
後、肺および腎臓で見られる（図４）。A 2.3 kb transcript is found in lung and kidney after 4 days of exposure (FIG. 4).
【０１６３】（実施例５） （ノーザンブロット分析によるＶＩＧＦ遺伝子発現の細
胞型分析）ヒト臍帯静脈内皮細胞、大動脈平滑筋細胞、
皮膚***線維芽細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、９６２０、
Ｃｈｅｓａｐｅａｋｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｓｕｉｔｅ ＃２
０１；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９
２１２３）を７５〜９０％ので密集状態まで増殖させ
た。全ＲＮＡをＲＮＡｚｏｌ（Ｂｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ、６０２３ Ｓｏｕｔｈ
Ｌｏｏｐ ＥａｓｔＨｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓ ７７
０３３）で抽出する。１．２％アガロースホルムアルデ
ヒドゲルを調製し、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８
９）に従って、１レーンにつき２０μｇのトータルＲＮ
ＡおよびＲＮＡラダーサイズマーカー（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、８４００ Ｈｅｌｇ
ｅｒｍａｎ Ｃｔ．、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ６００９ Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８８
４）で泳動する。このＲＮＡは、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ
+（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．、２６３６ Ｓｏｕ
ｔｈ ＣｌｅａｒｂｒｏｏｋＤｒｉｖｅ；Ａｒｌｉｎｇ
ｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６０００
５）に一晩転移させ、そしてＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ
ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒでメンブラン（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌ
ａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に結合させ
る。このブロットを、Ｃｈｕｒｃｈ緩衝液（Ｃｈｕｒｃ
ｈ，Ｇ．Ｍ．＆Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．、ＰＮＡＳ，ＵＳ
Ａ ８１、１９９１−１９９５（１９８４））中で６０
℃で１時間プレハイブリダイズする。ＶＩＧＦをコード
するＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ受託番号第７５８７４号）
を、Ｍ１３正方向（５’ＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣ
ＡＣＧＡＣ３’）プライマーおよび逆方向（５’ＡＴＧ
ＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧ３’）プライマーを用
いるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）中にクローン
化した全長ｃＤＮＡから増幅する。２５ナノグラムのＰ
ＣＲ産物を、32Ｐ−ｄＣＴＰでランダムプライマー放射
性標識する（Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩ、Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）。熱変性させたＶＩＧＦプローブを、プレハイ
ブリダイゼーション緩衝液に直接添加し、そして６０℃
で１６時間インキュベートする。６０℃で０．２ＸＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳ中で１０分間洗浄を２回行った。−
８０℃でオートラジオグラフィーを行った。２．３〜
２．４ｋｂの転写物は、２時間の曝露の後（図５Ａ）、
ヒト臍帯静脈内皮細胞（レーン１）および大動脈平滑筋
細胞（レーン２）で見られ、そしてまた３６時間の曝露
後（図５Ｂ）、皮膚***線維芽細胞（レーン３）で見ら
れる。Example 5 Cell Type Analysis of VIGF Gene Expression by Northern Blot Analysis Human umbilical vein endothelial cells, aortic smooth muscle cells,
Skin foreskin fibroblasts (Clonetics, 9620;
Chesapeake Drive, Suite # 2
01; San Diego, California 9
2123) was grown to confluency at 75-90%. Total RNA was converted to RNAzol (Biotecx Lab
oratories, Inc., 6023 South
Loop East Houston, Texas 77
033). A 1.2% agarose formaldehyde gel was prepared and prepared according to Sambrook et al.
According to 9), 20 μg total RN per lane
A and RNA ladder size markers (Life Te
channels, Inc. , 8400 Helg
erman Ct. , P. O. Box 6009 Ga
othersburg, Maryland 2088
Run in step 4). This RNA is Hybond N
+ (Amersham Corp., 2636 Sou
the ClearbookDrive; Arling
ton Heights, Illinois 6000
5) transferred overnight and Stratalinker
Membrane with UV Crosslinker (Str
atagene Cloning Systems, L
a Jolla, California). The blot was used in a Church buffer (Churc).
h, G. M. & Gilbert, W.C. , PNAS, US
A 81, 1991-1995 (1984)).
Prehybridize at ℃ for 1 hour. DNA sequence encoding VIGF (ATCC Accession No. 75874)
To the M13 positive direction (5′GGGTTTTCCCAGTC
ACGAC 3 ′) primer and reverse (5 ′ ATG)
Amplify from full-length cDNA cloned into pBluescript SK (-) using CTTCCGGCTCGTATG3 ') primer. 25 nanograms of P
The CR product is radiolabeled with a random primer with 32 P-dCTP (Prime-It II, Stratag).
ene). Heat denatured VIGF probe was added directly to the prehybridization buffer and
For 16 hours. 0.2XSS at 60 ° C
C, washing twice in 0.1% SDS for 10 minutes. −
Autoradiography was performed at 80 ° C. 2.3 ~
The 2.4 kb transcript, after 2 hours of exposure (FIG. 5A),
Seen in human umbilical vein endothelial cells (lane 1) and aortic smooth muscle cells (lane 2), and also after 36 hours exposure (FIG. 5B) in skin foreskin fibroblasts (lane 3).
【０１６４】本発明の多くの改善および変形が、上記の
教示を考慮すれば可能であり、従って、特に記載がなけ
れば、添付の範囲の範囲内で、本発明は実施され得る。Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, and, unless otherwise indicated, the present invention may be practiced within the scope of the appended claims.
【０１６５】[0165]
【発明の効果】本発明により、ヒト血管ＩＢＰ様成長因
子ポリペプチド（ＶＩＧＦ）、およびこのようなポリペ
プチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）、ならびに組換え
技術によりこのようなポリペプチドを産生するための手
順が提供される。また、このようなポリペプチドの作用
の阻害が提供される。Industrial Applicability According to the present invention, a human vascular IBP-like growth factor polypeptide (VIGF), a DNA (RNA) encoding such a polypeptide, and a method for producing such a polypeptide by recombinant techniques. Instructions are provided. Also provided is inhibition of the action of such polypeptides.
【０１６６】[0166]
【配列表】 <110> Human Genome Sciences, Inc. Hastings, Gregg A. Rosen, Craig A. <120> Human Vascular IBP-Like Growth Factor <130> PF147PCT <140> PCT/US94/14388 <141> 1994-12-09 <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1271 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (58)..(609) <220> <221> misc_feature <222> (1212) <223> n equals a, t, g or c <220> <221> misc_feature <222> (1255) <223> n equals a, t, g or c <220> <221> misc_feature <222> (1259) <223> n equals a, t, g or c <220> <221> misc_feature <222> (1261) <223> n equals a, t, g or c <220> <221> misc_feature <222> (1265) <223> n equals a, t, g or c <400> 1 ctgcttccca ccagcaaaga ccacgactgg agagccgagc cggagcagct gggaaac 57 atg aag agc gtc ttg ctg ctg acc acg ctc ctc gtg cct gca cac ctg 105 Met Lys Ser Val Leu Leu Leu Thr Thr Leu Leu Val Pro Ala His Leu 1 5 10 15 gtg gcc gcc tgg agc aat aat tat gcg gtg gac tgc cct caa cac tgt 153 Val Ala Ala Trp Ser Asn Asn Tyr Ala Val Asp Cys Pro Gln His Cys 20 25 30 gac agc agt gag tgc aaa agc agc ccg cgc tgc aag agg aca gtg ctc 201 Asp Ser Ser Glu Cys Lys Ser Ser Pro Arg Cys Lys Arg Thr Val Leu 35 40 45 gac gac tgt ggc tgc tgc cga gtg tgc gct gca ggg cgg gga gaa act 249 Asp Asp Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Ala Gly Arg Gly Glu Thr 50 55 60 tgc tac cgc aca gtc tca ggc atg gat ggc atg aag tgt ggc ccg ggg 297 Cys Tyr Arg Thr Val Ser Gly Met Asp Gly Met Lys Cys Gly Pro Gly 65 70 75 80 ctg agg tgt cag cct tct aat ggg gag gat cct ttt ggt gaa gag ttt 345 Leu Arg Cys Gln Pro Ser Asn Gly Glu Asp Pro Phe Gly Glu Glu Phe 85 90 95 ggt atc tgc aaa gac tgt ccc tac ggc acc ttc ggg atg gat tgc aga 393 Gly Ile Cys Lys Asp Cys Pro Tyr Gly Thr Phe Gly Met Asp Cys Arg 100 105 110 gag acc tgc aac tgc cag tca ggc atc tgt gac agg ggg acg gga aaa 441 Glu Thr Cys Asn Cys Gln Ser Gly Ile Cys Asp Arg Gly Thr Gly Lys 115 120 125 tgc ctg aaa ttc ccc ttc ttc caa tat tca gta acc aag tct tcc aac 489 Cys Leu Lys Phe Pro Phe Phe Gln Tyr Ser Val Thr Lys Ser Ser Asn 130 135 140 aga ttt gtt tct ctc acg gag cat gac atg gca tct gga gat ggc aat 537 Arg Phe Val Ser Leu Thr Glu His Asp Met Ala Ser Gly Asp Gly Asn 145 150 155 160 att gtg aga gaa gaa gtt gtg aaa gag aat gct gcc ggg tct ccc gta 585 Ile Val Arg Glu Glu Val Val Lys Glu Asn Ala Ala Gly Ser Pro Val 165 170 175 atg agg aaa tgg tta aat cca cgc tgatcccggc tgtgatttct gagagaaggc 639 Met Arg Lys Trp Leu Asn Pro Arg 180 tctattttcg tgaytgttca acacacagcc aacattttag gaactttcta gattatagca 699 taaggacatg taatttttga agaccaaatg tgatgcatgg tggatccaga aaacaaaaag 759 taggatactt acaatccata acatccatat gactgaacac ttgtatgtgt ttgttaaata 819 ttcgaatgca tgtagatttg ttaaatgtgt gtgtatagta acactgaaga actaaaaatg 879 caatttaggt aatcttacat ggagacaggt caaccaaaga gggagctagg caaagctgaa 939 gaccgcagtg agtcaaatta gttctttgac tttgatgtac attaatgttg ggatatggaa 999 tgaagactta agagcaggag aagatgggga gggggtggga gtgggaaata aaatatttag 1059 cccttccttg gtaggtagct tctctagaat ttaattrtgc tttttttttt ttttttgggc 1119 tttgggaaaa gtcaaaataa aacaaccaga aaacccctga aggaagtaag atgtttgaag 1179 cttatggaaa tttgagtaac aaacagcttt ganctgagag caattycaaa aggctgctga 1239 tgtagccccc gggttncctn tntctnaagg ac 1271 <210> 2 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Ser Val Leu Leu Leu Thr Thr Leu Leu Val Pro Ala His Leu 1 5 10 15 Val Ala Ala Trp Ser Asn Asn Tyr Ala Val Asp Cys Pro Gln His Cys 20 25 30 Asp Ser Ser Glu Cys Lys Ser Ser Pro Arg Cys Lys Arg Thr Val Leu 35 40 45 Asp Asp Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Ala Gly Arg Gly Glu Thr 50 55 60 Cys Tyr Arg Thr Val Ser Gly Met Asp Gly Met Lys Cys Gly Pro Gly 65 70 75 80 Leu Arg Cys Gln Pro Ser Asn Gly Glu Asp Pro Phe Gly Glu Glu Phe 85 90 95 Gly Ile Cys Lys Asp Cys Pro Tyr Gly Thr Phe Gly Met Asp Cys Arg 100 105 110 Glu Thr Cys Asn Cys Gln Ser Gly Ile Cys Asp Arg Gly Thr Gly Lys 115 120 125 Cys Leu Lys Phe Pro Phe Phe Gln Tyr Ser Val Thr Lys Ser Ser Asn 130 135 140 Arg Phe Val Ser Leu Thr Glu His Asp Met Ala Ser Gly Asp Gly Asn 145 150 155 160 Ile Val Arg Glu Glu Val Val Lys Glu Asn Ala Ala Gly Ser Pro Val 165 170 175 Met Arg Lys Trp Leu Asn Pro Arg 180 <210> 3 <211> 90 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gly Ser Ala Gly Ala Arg Pro Ala Leu Ala Ala Ala Leu Leu Cys 1 5 10 15 Leu Ala Arg Leu Ala Leu Gly Ser Pro Cys Pro Ala Val Cys Gln Cys 20 25 30 Pro Ala Ala Ala Pro Gln Cys Ala Pro Gly Val Gly Leu Val Pro Asp 35 40 45 Gly Cys Gly Cys Cys Lys Val Cys Ala Lys Gln Leu Asn Glu Asp Cys 50 55 60 Ser Arg Thr Gln Pro Cys Asp His Thr Lys Gly Leu Glu Cys Asn Arg 65 70 75 80 Leu Val Asn Asp Ile His Lys Phe Arg Asp 85 90 <210> 4 <211> 90 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ser Ser Ser Thr Phe Arg Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Ala 1 5 10 15 His Leu Thr Arg Leu Ala Leu Ser Thr Cys Pro Ala Ala Cys His Cys 20 25 30 Pro Leu Glu Ala Pro Lys Cys Ala Pro Gly Val Gly Leu Val Arg Asp 35 40 45 Gly Cys Gly Cys Cys Lys Val Cys Ala Lys Gln Leu Asn Glu Asp Cys 50 55 60 Se r Lys Thr Gln Pro Cys Asp His Thr Lys Gly Leu Glu Cys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Phe Asn Asp Ile His Lys Phe Arg Asp 85 90 <210> 5 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Val Arg Val Ala Phe Val Val Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Val Gly Gln Asn Cys Ser Gly Pro 20 25 30 Cy s Arg Cys Pro Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser 35 40 45 Leu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu 50 55 60 Gly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu 65 70 75 80 Phe Cys Asp Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala 85 90 <210> 6 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Leu Ala Ser Val Ala Gly Pro Ile Ser Leu Ala Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Cys Thr Arg Thr Ala Thr Gly Gln Asp Cys Ser Ala Gln Cys 20 25 30 Gln Cys Ala Ala Glu Ala Ala Pro His Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly 35 40 45 Asp Met Ala 50 <210> 7 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Glu Thr Gly Gly Gly Gln Gly Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Arg Pro Cys Glu Val Ser Gly Arg Glu Ala Ala Cys Pro 20 25 30 Arg Pro Cys Gly Gly Arg Cys Pro Ala Glu Pro Pro Arg Asp Pro Met 35 40 45 Ser Ser Glu Ala Lys Ile 50 <210> 8 <211> 50 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Gln Arg Ala Arg Pro Thr Leu Trp Ala Ala Ala Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Val Leu Leu Arg Gly Pro Pro Val Ala Arg Ala Gly Ala Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Leu Gly Pro Val Val Arg Cys Glu Pro Cys Val Ala Arg Ala Leu 35 40 45 Ala Arg 50 <210> 9 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Lys Ser Val Leu Leu Leu Thr Thr Leu Leu Val Pro Ala His Leu 1 5 10 15 Val Ala Ala Trp Ser Asn Met Tyr Ala Val Asp Cys Pro Gln His Cys 20 25 30 Asp Ser Ser Glu Cys Lys Ser Ser Pro Arg 35 40 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n equals a, t, g or c <220> <221> misc_feature <222> (7) <22 3> n equals a, t, g or c <220> <221> misc_feature <222> (10)..(15) <223> n equals a, t, g or c <400> 10 gcgccnncan nnnnnc 16 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cgcaagctta aataattatg cggtggactg c 31 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 cgctctagat cagcgtggat ttaacca 27 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 cgcagatctc cgccaccatg aagagcgtct tgctgctg 38 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 cgcagatcta gccttctctc agaaatcaca 30 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gggttttccc agtcacgac 19 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 atgcttccgg ctcgtatg 18[Sequence List] <110> Human Genome Sciences, Inc. Hastings, Gregg A. Rosen, Craig A. <120> Human Vascular IBP-Like Growth Factor <130> PF147PCT <140> PCT / US94 / 14388 <141> 1994- 12-09 <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1271 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (58) .. (609) < 220> <221> misc_feature <222> (1212) <223> n equals a, t, g or c <220> <221> misc_feature <222> (1255) <223> n equals a, t, g or c < 220> <221> misc_feature <222> (1259) <223> n equals a, t, g or c <220> <221> misc_feature <222> (1261) <223> n equals a, t, g or c < 220> <221> misc_feature <222> (1265) <223> n equals a, t, g or c <400> 1 ctgcttccca ccagcaaaga ccacgactgg agagccgagc cggagcagct gggaaac 57 atg aag agc gtc ttg ctg ctg acc acg gtc acc acg gtc ctg cac gcc ctg acc acg gtc ctg 105 Met Lys Ser Val Leu Leu Leu Thr Thr Leu Leu Val Pro Ala His Leu 1 5 10 15 gtg gcc gcc tgg agc aat aat tat gcg gtg gac tgc cct caa cac tgt 153 Val Ala Ala Trp Ser Asn Asn Tyr Ala Val Asp Cys Pro Gln His Cys 20 25 30 gac agc agt gag tgc aaa agc agc ccg cgc tgc aag agg aca gtg ctc 201 Asp Ser Ser Glu Cys Lys Ser Ser Pro Arg Cys Lys Arg Thr Val Leu 35 40 45 gac gac tgt ggc tgc tgc cga gtg tgc gct gca ggg cgg gga gaa act Asp Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Ala Gly Arg Gly Glu Thr 50 55 60 tgc tac cgc aca gtc tca ggc atg gat ggc atg aag tgt ggc ccg ggg 297 Cys Tyr Arg Thr Val Ser Gly Met Asp Gly Met Lys Cys Pro Gly 65 70 75 80 ctg agg tgt cag cct tct aat ggg gag gat cct ttt ggt gaa gag ttt 345 Leu Arg Cys Gln Pro Ser Asn Gly Glu Asp Pro Phe Gly Glu Glu Plu 85 90 95 ggt atc tgc aaa gac tgt ccc tac ggc acc ttc ggg atg gat tgc aga 393 Gly Ile Cys Lys Asp Cys Pro Tyr Gly Thr Phe Gly Met Asp Cys Arg 100 105 110 gag acc tgc aac tgc cag tca ggc atc tgt gac agg ggg acg gga aaa 441 Glu Thr Cys Asn Cys Gln Ser Gly Ile Cys Asp Arg Gly Thr Gly Lys 115 120 125 tgc ctg aaa ttc ccc ttc ttc caa tat tca gta acc aag tct tcc aac 489 Cys Leu Lys Phe Pro Phe Phe Gln Tyr Ser Val Thr Lys Ser Ser Asn 130 135 140 aga ttt gtt tct c tc acg gag cat gac atg gca tct gga gat ggc aat 537 Arg Phe Val Ser Leu Thr Glu His Asp Met Ala Ser Gly Asp Gly Asn 145 150 155 160 att gtg aga gaa gaa gaa gtt gtg aaa gag aat gct gcc ggg tct ccc gta 585 Ile Val Arg Glu Glu Val Val Lys Glu Asn Ala Ala Gly Ser Pro Val 165 170 175 atg agg aaa tgg tta aat cca cgc tgatcccggc tgtgatttct gagagaaggc 639 Met Arg Lys Trp Leu Asn Pro Arg 180 tctattttcg tgaytgtagcac tgaytgcatact tattgaccac tgaytgca tacttagtactactacg tgatgcatgg tggatccaga aaacaaaaag 759 taggatactt acaatccata acatccatat gactgaacac ttgtatgtgt ttgttaaata 819 ttcgaatgca tgtagatttg ttaaatgtgt gtgtatagta acactgaaga actaaaaatg 879 caatttaggt aatcttacat ggagacaggt caaccaaaga gggagctagg caaagctgaa 939 gaccgcagtg agtcaaatta gttctttgac tttgatgtac attaatgttg ggatatggaa 999 tgaagactta agagcaggag aagatgggga gggggtggga gtgggaaata aaatatttag 1059 cccttccttg gtaggtagct tctctagaat ttaattrtgc tttttttttt ttttttgggc 1119 tttgggaaaa gtcaaaataa aacaaccaga aaacccctga aggaagtaag atg tttgaag 1179 cttatggaaa tttgagtaac aaacagcttt ganctgagag caattycaaa aggctgctga 1239 tgtagccccc gggttncctn tntctnaagg ac 1271 <210> 2 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Le Aru Val Val Leu 1 5 10 15 Val Ala Ala Trp Ser Asn Asn Tyr Ala Val Asp Cys Pro Gln His Cys 20 25 30 Asp Ser Ser Glu Cys Lys Ser Ser Pro Arg Cys Lys Arg Thr Val Leu 35 40 45 Asp Asp Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Ala Gly Arg Gly Glu Thr 50 55 60 Cys Tyr Arg Thr Val Ser Gly Met Asp Gly Met Lys Cys Gly Pro Gly 65 70 75 80 Leu Arg Cys Gln Pro Ser Asn Gly Glu Asp Pro Phe Gly Glu Glu Glu Phe 85 90 95 Gly Ile Cys Lys Asp Cys Pro Tyr Gly Thr Phe Gly Met Asp Cys Arg 100 105 110 Glu Thr Cys Asn Cys Gln Ser Gly Ile Cys Asp Arg Gly Thr Gly Lys 115 120 125 Cys Leu Lys Phe Pro Phe Phe Gln Tyr Ser Val Thr Lys Ser Ser Asn 130 135 140 Arg Phe Val Ser Leu Thr Glu His Asp Met Ala Ser Gly Asp Gly Asn 145 150 155 160 Ile Val Arg Glu Glu Val Val Lys Glu Asn Ala Ala Gly Ser Pro Val 165 17 0 175 Met Arg Lys Trp Leu Asn Pro Arg 180 <210> 3 <211> 90 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gly Ser Ala Gly Ala Arg Pro Ala Leu Ala Ala Ala Leu Leu Cys 15 10 15 Leu Ala Arg Leu Ala Leu Gly Ser Pro Cys Pro Ala Val Cys Gln Cys 20 25 30 Pro Ala Ala Ala Pro Gln Cys Ala Pro Gly Val Gly Leu Val Pro Asp 35 40 45 Gly Cys Gly Cys Cys Lys Val Cys Ala Lys Gln Leu Asn Glu Asp Cys 50 55 60 Ser Arg Thr Gln Pro Cys Asp His Thr Lys Gly Leu Glu Cys Asn Arg 65 70 75 80 Leu Val Asn Asp Ile His Lys Phe Arg Asp 85 90 <210> 4 <211> 90 < 212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ser Ser Ser Thr Phe Arg Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Ala 1 5 10 15 His Leu Thr Arg Leu Ala Leu Ser Thr Cys Pro Ala Ala Cys His Cys 20 25 30 Pro Leu Glu Ala Pro Lys Cys Ala Pro Gly Val Gly Leu Val Arg Asp 35 40 45 Gly Cys Gly Cys Cys Lys Val Cys Ala Lys Gln Leu Asn Glu Asp Cys 50 55 60 Ser Lys Thr Gln Pro Cys Asp His Thr Lys Gly Leu Glu Cys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Phe Asn Asp Ile His Lys Phe Arg Asp 85 90 <210> 5 <211> 93 <2 12> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Val Arg Val Ala Phe Val Val Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Val Gly Gln Asn Cys Ser Gly Pro 20 25 30 Cy s Arg Cys Pro Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser 35 40 45 Leu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu 50 55 60 Gly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu 65 70 75 80 Phe Cys Asp Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala 85 90 <210> 6 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Leu Ala Ser Val Ala Gly Pro Ile Ser Leu Ala Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Cys Thr Arg Thr Ala Thr Gly Gln Asp Cys Ser Ala Gln Cys 20 25 30 Gln Cys Ala Ala Glu Ala Ala Pro His Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly 35 40 45 Asp Met Ala 50 <210> 7 <211> 54 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Glu Thr Gly Gly Gly Gly Gln Gly Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Arg Pro Cys Glu Val Ser Gly Arg Glu Ala Ala Cys Pro 20 25 30 Arg Pro Cys Gly Gly Arg Cys Pro Ala Glu Pro Pro Arg Asp Pro Met 35 40 45 Ser Ser Glu Ala Lys Ile 50 <210> 8 <211> 50 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Gln Arg Ala Arg Pro Thr Leu Trp Ala Ala Ala Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Val Leu Leu Arg Gly Pro Pro Val Ala Arg Ala Gly Ala Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Leu Gly Pro Val Val Arg Cys Glu Pro Cys Val Ala Arg Ala Leu 35 40 45 Ala Arg 50 <210> 9 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Lys Ser Val Leu Leu Leu Thr Thr Leu Leu Val Pro Ala His Leu 1 5 10 15 Val Ala Ala Trp Ser Asn Met Tyr Ala Val Asp Cys Pro Gln His Cys 20 25 30 Asp Ser Ser Glu Cys Lys Ser Ser Pro Arg 35 40 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (6) <223 > n equals a, t, g or c <220> <221> misc_feature <222> (7) <22 3> n equals a, t, g or c <220> <221> misc_feature <222> (10). . (15) <223> n equals a, t, g or c <400> 10 gcgccnncan nnnnnc 16 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cgcaagctta aataattatg cggtggactg c 31 < 210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 cgctctagat cagcgtggat ttaacca 27 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 cgcagatctc cgccaccatg aagagcgtct tgctgctg 38 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 cgcagatcta gccttctctc agaaatcaca 30 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gggttttccc agtcacgac 19 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 atgcttccgg ctcgtatg 18
【図１Ａ】図１は、ＶＩＧＦポリペプチドのｃＤＮＡ、
および対応する推定アミノ酸配列を示す。その最初の２
１アミノ酸は推定のリーダー配列を示し、その結果、成
熟ポリペプチドは１６３アミノ酸を含む。アミノ酸の標
準１文字略語を使用する。配列決定を、３７３自動ＤＮ
Ａシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。配列決定の精度は、９
７％の精度より大きいことが予想される。FIG. 1 shows the cDNA of the VIGF polypeptide,
And the corresponding deduced amino acid sequence. The first two
One amino acid indicates the putative leader sequence, so that the mature polypeptide contains 163 amino acids. Use the standard one-letter abbreviations for amino acids. Sequencing was performed using 373 automated DNs.
A Sequencer (Applied Biosystem)
s, Inc. ). Sequencing accuracy is 9
It is expected to be greater than 7% accuracy.
【図１Ｂ】図１は、ＶＩＧＦポリペプチドのｃＤＮＡ、
および対応する推定アミノ酸配列を示す。その最初の２
１アミノ酸は推定のリーダー配列を示し、その結果、成
熟ポリペプチドは１６３アミノ酸を含む。アミノ酸の標
準１文字略語を使用する。配列決定を、３７３自動ＤＮ
Ａシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。配列決定の精度は、９
７％の精度より大きいことが予想される。FIG. 1 shows the cDNA of the VIGF polypeptide,
And the corresponding deduced amino acid sequence. The first two
One amino acid indicates the putative leader sequence, so that the mature polypeptide contains 163 amino acids. Use the standard one-letter abbreviations for amino acids. Sequencing was performed using 373 automated DNs.
A Sequencer (Applied Biosystem)
s, Inc. ). Sequencing accuracy is 9
It is expected to be greater than 7% accuracy.
【図１Ｃ】図１は、ＶＩＧＦポリペプチドのｃＤＮＡ、
および対応する推定アミノ酸配列を示す。その最初の２
１アミノ酸は推定のリーダー配列を示し、その結果、成
熟ポリペプチドは１６３アミノ酸を含む。アミノ酸の標
準１文字略語を使用する。配列決定を、３７３自動ＤＮ
Ａシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。配列決定の精度は、９
７％の精度より大きいことが予想される。FIG. 1 shows the cDNA of the VIGF polypeptide,
And the corresponding deduced amino acid sequence. The first two
One amino acid indicates the putative leader sequence, so that the mature polypeptide contains 163 amino acids. Use the standard one-letter abbreviations for amino acids. Sequencing was performed using 373 automated DNs.
A Sequencer (Applied Biosystem)
s, Inc. ). Sequencing accuracy is 9
It is expected to be greater than 7% accuracy.
【図１Ｄ】図１は、ＶＩＧＦポリペプチドのｃＤＮＡ、
および対応する推定アミノ酸配列を示す。その最初の２
１アミノ酸は推定のリーダー配列を示し、その結果、成
熟ポリペプチドは１６３アミノ酸を含む。アミノ酸の標
準１文字略語を使用する。配列決定を、３７３自動ＤＮ
Ａシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。配列決定の精度は、９
７％の精度より大きいことが予想される。FIG. 1 shows the cDNA of the VIGF polypeptide,
And the corresponding deduced amino acid sequence. The first two
One amino acid indicates the putative leader sequence, so that the mature polypeptide contains 163 amino acids. Use the standard one-letter abbreviations for amino acids. Sequencing was performed using 373 automated DNs.
A Sequencer (Applied Biosystem)
s, Inc. ). Sequencing accuracy is 9
It is expected to be greater than 7% accuracy.
【図１Ｅ】図１は、ＶＩＧＦポリペプチドのｃＤＮＡ、
および対応する推定アミノ酸配列を示す。その最初の２
１アミノ酸は推定のリーダー配列を示し、その結果、成
熟ポリペプチドは１６３アミノ酸を含む。アミノ酸の標
準１文字略語を使用する。配列決定を、３７３自動ＤＮ
Ａシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。配列決定の精度は、９
７％の精度より大きいことが予想される。FIG. 1E shows the cDNA of the VIGF polypeptide,
And the corresponding deduced amino acid sequence. The first two
One amino acid indicates the putative leader sequence, so that the mature polypeptide contains 163 amino acids. Use the standard one-letter abbreviations for amino acids. Sequencing was performed using 373 automated DNs.
A Sequencer (Applied Biosystem)
s, Inc. ). Sequencing accuracy is 9
It is expected to be greater than 7% accuracy.
【図２】図２は、ＶＩＧＦとＣＣＮファミリーのメンバ
ーである他のタンパク質との間のアミノ酸配列の相同性
を示す。FIG. 2 shows the amino acid sequence homology between VIGF and other proteins that are members of the CCN family.
【図３】図３は、ＶＩＧＦ細菌精製および電気泳動の結
果を表示するＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。FIG. 3 shows an SDS polyacrylamide gel displaying the results of VIGF bacterial purification and electrophoresis.
【図４】図４は、ＶＩＧＦに対して行われたノーザンブ
ロット解析の結果を表示するゲルを示す。FIG. 4 shows a gel displaying the results of a Northern blot analysis performed on VIGF.
【図５】図５は、示された種々の組織におけるＶＩＧＦ
遺伝子発現の細胞型分析の結果を表示するゲルを示す。
レーン１は、臍帯静脈内皮細胞であり、レーン２は、大
動脈平滑筋細胞であり、そしてレーン３は、皮膚***線
維芽細胞である。図５Ａは２時間曝露した後の結果を示
し、そして図５Ｂは３６時間曝露した後の結果を示す。FIG. 5. VIGF in various tissues shown.
Figure 3 shows a gel displaying the results of a cell type analysis of gene expression.
Lane 1 is umbilical vein endothelial cells, lane 2 is aortic smooth muscle cells, and lane 3 is dermal foreskin fibroblasts. FIG. 5A shows the results after 2 hours exposure and FIG. 5B shows the results after 36 hours exposure.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 43/00 １０５ Ａ６１Ｋ 37/36 (71)出願人 597018381 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ, Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 グレッグ エイ． ハスティングス アメリカ合衆国 メリーランド 20850, ロックビル， ゲイブル リッジ テラ ス 9913， アパートメント エイチ (72)発明者 クレイグ エイ． ローゼン アメリカ合衆国 メリーランド 20882, レイトンズビル， ローリング ヒル ロード 22400 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA02 EA02 GA11 HA01 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA08 BA18 BA19 BA21 BA22 BA23 CA25 CA53 CA56 DB55 NA14 ZA892 ZA962 ZA972 ZB212 ZC032 ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 21/00 C12N 15/00 ZNAA 43/00 105 A61K 37/36 (71) Applicant 597018381 9410 Key West Avenue Greg A., Rockville, Maryland 20850, United States of America (72). Hastings United States Maryland 20850, Rockville, Gable Ridge Terras 9913, Apartment H (72) Inventor Craig A. Rosen USA Maryland 20882, Leightonsville, Rolling Hill Road 22400 F-term (reference) 4B024 AA01 BA21 CA04 DA02 EA02 GA11 HA01 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA08 BA18 BA19 BA21 BA22 BA23 CA25 CA53 CA56 DB55 NA14 ZA892 ZA212 ZA972 Z
Claims (1)
ペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、ア
ナログまたは誘導体をコードするポリヌクレオチド； （ｂ）ＡＴＣＣ受託番号７５８７４に含まれるｃＤＮＡ
によりコードされるアミノ酸配列を有するＶＩＧＦポリ
ペプチド、あるいは該ポリペプチドのフラグメント、ア
ナログまたは誘導体をコードするポリヌクレオチド；か
らなる群から選択される、ポリヌクレオチド。1. An isolated polynucleotide comprising: (a) a polynucleotide encoding a VIGF polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIG. 1, or a fragment, analog or derivative of said polypeptide; (b) CDNA contained in ATCC accession number 75874
A polynucleotide encoding a VIGF polypeptide having the amino acid sequence encoded by the above, or a polynucleotide encoding a fragment, analog or derivative of said polypeptide.
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Applications Claiming Priority (1)
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Family Applications (1)
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2001
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