JP2002241400A - Blood coagulation-preventing medicinal composition for blood extracorporeal circulation route - Google Patents
Blood coagulation-preventing medicinal composition for blood extracorporeal circulation routeInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、特定のアミノ酸配列か
らなるトロンボモジュリンを有効成分とする血液体外循
環回路用の血液凝固防止のための医薬組成物に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a pharmaceutical composition containing thrombomodulin having a specific amino acid sequence as an active ingredient for preventing blood coagulation for an extracorporeal blood circulation circuit.
【０００２】[0002]
【従来の技術】血液透析、血液濾過、血液透析濾過、血
漿交換及び免疫吸着などの血液浄化療法の際、開心術時
における心肺バイパスの際などにおいて、血液体外循環
と呼ばれる処置が必要とされることがある。血液体外循
環とは、血液を生体内から体外への人工血流路により、
一定の処置を行う装置、例えば人工心肺装置、血液浄化
装置等を経て、生体内に再送入する循環回路からなるも
のである。血液浄化装置としては、典型的には人工腎臓
が挙げられる。これらの血液体外循環は、シャントや人
工血管等のように恒常的に体内に移植する医用器材とは
異なり、一時的に処置されるものであって、特に血液浄
化療法の際に用いられる血液透析においては、定期的な
処置毎に、または必要に応じて、体外循環回路の設置、
取り外しを繰り返すものである。2. Description of the Related Art In blood purification treatments such as hemodialysis, hemofiltration, hemodiafiltration, plasma exchange and immunoadsorption, and during cardiopulmonary bypass during open heart surgery, a treatment called extracorporeal blood is required. Sometimes. Blood extracorporeal circulation is an artificial blood flow path from inside the living body to outside the body,
It comprises a circulating circuit for re-introducing the living body through a device for performing a certain treatment, for example, a heart-lung machine, a blood purification device, or the like. A blood purification device typically includes an artificial kidney. These extracorporeal blood circulations are temporarily treated, unlike medical equipment that is permanently transplanted into the body, such as shunts and artificial blood vessels. In the setting of extracorporeal circulation circuit, at the time of regular treatment or as necessary,
The removal is repeated.
【０００３】血液は異物と接触すると、普通、内因系の
血液凝固カスケードが活性化され、最終的には流動性を
失い凝固する。血液体外循環時における人工血流路や各
種装置からなる血液体外循環回路は、異物であり、血液
はそれらに接触すると凝固することから、何らかの方法
により血液体外循環回路における血液凝固を防ぐ処置が
必要である。[0003] When blood comes into contact with foreign matter, it normally activates the endogenous blood coagulation cascade, eventually losing fluidity and coagulating. The extracorporeal blood circulation circuit consisting of artificial blood flow paths and various devices during extracorporeal blood circulation is a foreign substance, and blood coagulates when it comes into contact with them, so it is necessary to take measures to prevent blood coagulation in the extracorporeal blood circulation circuit by some method. It is.
【０００４】通常上記の方法としては、医用器材の表面
に血液凝固防止薬を固定する方法と、循環血液中に血液
凝固防止薬を投与する方法の２つに大別されるが、恒常
的に体内に移植する医用器材においては、体内に一旦移
植した場合に取り外しが容易でないことから、その医用
器材の表面を血液凝固を防止する処理を行う必要があ
り、例えばその医用器材の表面に血液凝固を防止する薬
剤等を固定化する方法を用いることが一般的である。[0004] Usually, the above-mentioned methods are roughly classified into two methods: a method of fixing an anticoagulant on the surface of medical equipment and a method of administering an anticoagulant to the circulating blood. In medical equipment to be implanted in the body, since it is not easy to remove once implanted in the body, it is necessary to perform a treatment to prevent blood coagulation on the surface of the medical equipment, for example, blood coagulation on the surface of the medical equipment It is common to use a method of immobilizing a drug or the like for preventing the occurrence of illness.
【０００５】これに対して、血液体外循環においても上
記と同様に、体外循環回路の表面に血液凝固を防止する
薬剤等を固定化する方法も試みられているが、使い捨て
が基本となることから、コスト的に見合うものとはなり
得ず、またそれ以上の問題として、血液凝固を防止する
薬剤を終始全く添加せずに血液体外循環を行いえるのか
についての確実性は、一般の臨床の場において保証され
ておらず、仮に体外循環回路の表面に血液凝固を防止す
る薬剤等を固定化してあっても、血液体外循環において
は、体外循環回路内に、血液凝固を防止する薬剤を投与
する方法が行われている。On the other hand, in the extracorporeal circulation of blood, a method of immobilizing a drug or the like for preventing blood coagulation on the surface of the extracorporeal circuit has been attempted in the same manner as described above. However, it cannot be cost-effective, and furthermore, the certainty of whether extracorporeal blood circulation can be performed without adding any anticoagulant drug at all times is a matter of general clinical practice. In the extracorporeal blood circulation, even if a drug or the like for preventing blood coagulation is fixed on the surface of the extracorporeal circuit, the agent for preventing blood coagulation is administered in the extracorporeal circuit. The way has been done.
【０００６】従来、血液体外循環時に投与される血液凝
固防止薬として、例えば未分画ヘパリンや低分子ヘパリ
ンが使用されている。しかしながら、これらの血液凝固
防止薬においては、脂質代謝への悪影響が問題視されて
おり、また出血のリスクも懸念されている。また、いく
つかのセリンプロテアーゼ阻害剤もまた抗凝固作用を有
しており、例えば、フサン（一般名：メシル酸ナファモ
スタット）は、血液透析などの一部の血液体外循環時に
使用されている。しかしながら、フサンは、抗凝固効果
が弱く、血液体外循環終了後の回路内には多くの凝固が
見られることが報告されている。さらに、フサンは医薬
品としての安全性の面で懸念される。フサンは副作用の
頻度が多く（血液体外循環用抗凝固薬としての臨床試験
時における副作用頻度は８．４％）、またフサンの長期
間の使用によりその代謝物が生体内に蓄積することも問
題視されている。Conventionally, unfractionated heparin and low-molecular-weight heparin have been used as anticoagulants administered during extracorporeal blood circulation. However, these anticoagulants are considered to have an adverse effect on lipid metabolism, and the risk of bleeding is also a concern. Some serine protease inhibitors also have an anticoagulant effect; for example, Fusan (generic name: nafamostat mesilate) is used during some extracorporeal blood circulations such as hemodialysis. However, it has been reported that Fusan has a weak anticoagulant effect, and that a large amount of coagulation is observed in the circuit after the end of extracorporeal blood circulation. Furthermore, Fusan is concerned about its safety as a pharmaceutical. Fusan has many side effects (the frequency of side effects in clinical trials as an anticoagulant for extracorporeal blood circulation is 8.4%), and its prolonged use may cause its metabolites to accumulate in vivo. Have been watched.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】血液透析をはじめとす
る血液体外循環回路用の、さらに安全性の高い血液凝固
防止のための医薬組成物が求められていた。There is a need for a more safe pharmaceutical composition for use in extracorporeal blood circulation circuits such as hemodialysis for preventing blood coagulation.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決するために鋭意研究した結果、特定のアミノ酸配
列からなるトロンボモジュリンを有効成分とする医薬組
成物が、血液透析をはじめとする血液体外循環回路用の
血液凝固防止効果に優れ、従来の未分画ヘパリンや低分
子ヘパリンと比較して安全性に優れ、さらに通常のトロ
ンボモジュリンである本発明の特定のアミノ酸配列以外
のトロンボモジュリンと比較しても処置や観察等の取扱
いに優れることを確認して本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、少なくともアミノ酸配列として、式
（１）Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, a pharmaceutical composition containing thrombomodulin having a specific amino acid sequence as an active ingredient has been found to be useful for hemodialysis and the like. Excellent anticoagulant effect for extracorporeal blood circulation, superior in safety compared to conventional unfractionated heparin and low-molecular-weight heparin, and compared to thrombomodulin other than the specific amino acid sequence of the present invention, which is a normal thrombomodulin of the present invention However, the present inventors have confirmed that they are excellent in handling such as treatment and observation, and have completed the present invention.
That is, the present invention relates to at least the amino acid sequence of formula (1)
【０００９】[0009]
【化２】 〔式中、（Ｗ）は、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−
Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−Ａｓｐ、Ｖａｌ−Ａｓｐ、またはＡｓｐのいずれ
かのペプチド残基またはアミノ酸残基であり、（Ｘ）と
（Ｙ）は、互いに異なる、又は同一の、Ａｓｎ、Ｇｌ
ｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＧｌｙのいずれかのアミノ
酸残基を、（Ｚ）は、Ｖａｌ、またはＡｌａのいずれか
のアミノ酸残基を示す。〕で表されるアミノ酸配列から
なるトロンボモジュリンを有効成分とする血液体外循環
回路用の血液凝固防止のための医薬組成物である。Embedded image [Wherein (W) is Val-Glu-Pro-Val-
Asp, Glu-Pro-Val-Asp, Pro-V
a peptide residue or an amino acid residue of any of al-Asp, Val-Asp, or Asp, wherein (X) and (Y) are different from or the same as Asn, GI
The amino acid residue of any of n, Ser, Ala, or Gly, and (Z) the amino acid residue of Val, or Ala. And a thrombomodulin having an amino acid sequence represented by the following formula:
【００１０】トロンボモジュリンは、種々のものが知ら
れているが、もともと血管内皮細胞上に発現している糖
蛋白質であり、トロンビンと特異的に結合しトロンビン
の向凝固活性を阻害すると同時にトロンビンのプロテイ
ンＣ活性化能を著しく促進するコファクター活性を有し
ている物質として発見された。同様なコファクター活性
を有する物質を、本願では、同じくトロンボモジュリン
と呼ぶ。本発明者らは、遺伝子工学的手法を用いてヒト
肺ｃＤＮＡライブラリーから、シグナルペプチドを含む
ヒトトロンボモジュリン前駆体の遺伝子をクローニング
し、そしてトロンボモジュリンの全遺伝子配列を解析
し、シグナルペプチドを含む５７５残基のアミノ酸配列
を明らかにしている〔特開平１−６２１９号公報〕。ま
た、この公報において、膜結合部位を削除した可溶型の
ペプチドを開示するとともに、これらの全長トロンボモ
ジュリンを含む種々のトロンボモジュリンを人工血管、
人工臓器、カテーテルなどの医用人工材料に結合させる
旨についての記載がある。Although various types of thrombomodulin are known, thrombomodulin is a glycoprotein originally expressed on vascular endothelial cells, and specifically binds to thrombin to inhibit thrombin's procoagulant activity and, at the same time, to inhibit thrombin protein. It was discovered as a substance having cofactor activity that significantly promotes C-activating ability. Substances having similar cofactor activity are also referred to herein as thrombomodulin. The present inventors cloned a human thrombomodulin precursor gene containing a signal peptide from a human lung cDNA library using genetic engineering techniques, analyzed the entire gene sequence of thrombomodulin, and analyzed the 575 residues containing the signal peptide. The amino acid sequence of the group has been clarified [Japanese Patent Laid-Open No. 1-6219]. In this publication, a soluble peptide from which a membrane-binding site has been deleted is disclosed, and various thrombomodulins including these full-length thrombomodulins are introduced into artificial blood vessels,
There is a description about binding to artificial medical materials such as artificial organs and catheters.
【００１１】シグナルペプチドが切断されたトロンボモ
ジュリンは、Ｎ末端側よりＮ末端領域（ドメイン１）、
６つのＥＧＦ様構造をもつ領域（ドメイン２）、Ｏ型糖
鎖付加領域（ドメイン３）、膜貫通領域（ドメイン４）
そして細胞質内領域（ドメイン５）の５つの領域から構
成されており、そしてトロンボモジュリンの最小活性単
位は、６つのＥＧＦ様構造をもつ領域（ドメイン２）の
中のＮ末端側から４、５、６番目であることが知られて
いる〔Ｍ．Ｚｕｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２６４，１０３５１−１０３５３（１９８９）、特開平
５−２１３９９８〕。また類似のトロンボモジュリンも
知られている（特開平２−２５５６９９、特開平５−３
１０７８７）。細胞外領域（ドメイン１、ドメイン２、
およびドメイン３）のみからなるトロンボモジュリン
は、組換え技術の応用により取得できること、そしてそ
の組換え体トロンボモジュリンは、天然のトロンボモジ
ュリンの活性を有していることが確認されている。The thrombomodulin from which the signal peptide has been cleaved has an N-terminal region (domain 1) from the N-terminal side,
6 regions with EGF-like structure (domain 2), O-glycosylated region (domain 3), transmembrane region (domain 4)
It is composed of five regions in the cytoplasmic region (domain 5), and the minimum activity unit of thrombomodulin is 4, 5, 6 from the N-terminal side in the region having six EGF-like structures (domain 2). Is known [M. Zushi et al. Biol. Chem. ,
264, 10351-10353 (1989), JP-A-5-213998]. Similar thrombomodulins are also known (JP-A-2-255699, JP-A-5-3).
10787). Extracellular region (domain 1, domain 2,
It has been confirmed that thrombomodulin comprising only domain 3) can be obtained by application of recombinant technology, and that the recombinant thrombomodulin has the activity of natural thrombomodulin.
【００１２】本発明で、トロンボモジュリンとは、トロ
ンビンによるプロテインＣの活性化を促進させる性質を
有するものであり、少なくともアミノ酸配列として、式
（１）で表されるアミノ酸配列からなる本発明のトロン
ボモジュリンは、このトロンビンによるプロテインＣの
活性化を促進させる性質を勿論有している。式（１）中
の（Ｗ）は、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｐ、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ
−Ａｓｐ、Ｖａｌ−Ａｓｐ、またはＡｓｐのいずれかの
ペプチド残基またはアミノ酸残基のいずれであっても、
（Ｗ）の部分のアミノ酸配列は、公知である天然のトロ
ンボモジュリンのアミノ酸配列の部分配列と一致し、本
発明のトロンボモジュリンとしては、式（１）中の
（Ｗ）は、上述に記載したいずれであってもかまわない
が、特にＶａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、ま
たはＡｓｐが好ましい。In the present invention, thrombomodulin has the property of promoting the activation of protein C by thrombin. The thrombomodulin of the present invention comprising at least the amino acid sequence represented by the formula (1) Of course, it has the property of promoting the activation of protein C by thrombin. (W) in the formula (1) is Val-Glu-Pro-Val-As
p, Glu-Pro-Val-Asp, Pro-Val
-Asp, Val-Asp, or Asp, any peptide residue or amino acid residue;
The amino acid sequence of the portion (W) is identical to the known partial sequence of the amino acid sequence of natural thrombomodulin. As the thrombomodulin of the present invention, (W) in the formula (1) may be any of those described above. Although it may be present, Val-Glu-Pro-Val-Asp or Asp is particularly preferable.
【００１３】式（１）中の、（Ｘ）および（Ｙ）は、互
いに異なる、叉は同一の、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａ
ｌａ、またはＧｌｙのいずれかであってもよい。好まし
くは、天然のトロンボモジュリンのアミノ酸配列の部分
配列と同一のアミノ酸、すなわち（Ｘ）および（Ｙ）が
ともにＡｓｎである式（１）に記載のアミノ酸配列から
なる本発明のトロンボモジュリンが好ましい。(X) and (Y) in the formula (1) are different from each other or are the same as Asn, Gln, Ser, A
It may be either la or Gly. Preferably, the thrombomodulin of the present invention comprises the same amino acid as the partial sequence of the amino acid sequence of natural thrombomodulin, that is, the amino acid sequence according to the formula (1) in which both (X) and (Y) are Asn.
【００１４】式（１）中の（Ｚ）は、Ｖａｌ、Ａｌａの
どちらであってもよいが、Ｖａｌであることが好まし
い。また、本発明のトロンボモジュリンは、糖鎖を含ん
でいても含まなくてもよい。本発明のトロンボモジュリ
ンは、血液体外循環回路内での血液凝固を有効に防止
し、血液の流動性が低下することはなく、血液体外循環
回路内の血液凝固防止のための医薬組成物たりえること
が確認された。(Z) in the formula (1) may be either Val or Ala, but is preferably Val. Further, the thrombomodulin of the present invention may or may not contain a sugar chain. The thrombomodulin of the present invention effectively prevents blood coagulation in the extracorporeal blood circulation circuit, does not reduce blood fluidity, and can be a pharmaceutical composition for preventing blood coagulation in the extracorporeal blood circulation circuit. Was confirmed.
【００１５】血液体外循環とは、血液を生体内から体外
へと人工血流路により導き出され、一定の処置を行う装
置、例えば人工心肺装置、血液浄化装置等を経て、生体
内に再送入する循環回路からなるものであって、シャン
トや人工血管等のように恒常的に体内に移植する医用器
材とは異なり、一時的に処置されるものであって、特に
血液浄化療法の際に用いられる血液透析においては、定
期的な処置毎に、または必要に応じて、体外循環回路の
設置、取り外しを繰り返すものである。前述の血液浄化
装置としては、人工腎臓が典型的な例として挙げられ、
その他に、血漿交換装置、免疫吸着装置等も挙げられ
る。In the extracorporeal blood circulation, blood is guided from the inside of a living body to the outside of the body by an artificial blood flow path, and is re-introduced into the living body through a device for performing a certain treatment, such as an artificial heart-lung machine and a blood purification device. It is composed of a circulatory circuit, unlike medical equipment that is permanently transplanted into the body, such as a shunt or an artificial blood vessel, and is temporarily treated, and is used particularly in blood purification therapy. In hemodialysis, installation and removal of an extracorporeal circulation circuit are repeated at regular intervals or as necessary. A typical example of the aforementioned blood purification device is an artificial kidney.
Other examples include a plasma exchange device and an immunoadsorption device.
【００１６】したがって、体外循環回路を設置させた患
者は、その回路を用いる場合にのみ血液凝固の問題を抱
くのであって、常時、血液凝固を防止しなければならな
い患者とは異なることが多いものである。上述の従来公
知のいずれのトロンボモジュリンも全て同様に、血液体
外循環回路用の血液凝固防止のための医薬組成物として
都合よく使用し得るかについては、従来全く予想されな
いものであって、本願によれば、本発明のトロンボモジ
ュリンが、通常のトロンボモジュリン（ドメイン１、ド
メイン２、およびドメイン３からなるトロンボモジュリ
ン）に比べ、血液体外循環終了後の止血の処置や注意が
明らかに少なくてすむものであるという極めて特徴的な
性質であることを確認した。 実施例に示した如く、カ
ニクイザル体外循環モデルにおいて、その血液体外循環
回路内の血液凝固を防止するために、通常のトロンボモ
ジュリン（ドメイン１、ドメイン２、およびドメイン３
からなるトロンボモジュリン）を用いた場合、体外循環
終了後も長く、血液中には、その血液凝固抑制活性が残
存しており、したがって、通常のトロンボモジュリンを
血液体外循環回路の血液凝固防止に用いた場合には、そ
の体外循環終了後も長く、出血の注意を必要としなけれ
ばならないと考えることができる。ところが、本発明の
式（１）に示されるアミノ酸配列からなるトロンボモジ
ュリンを用いた場合、血液体外循環回路内の血液凝固を
有効に防止するが、その体外循環終了後の血液中には血
液凝固抑制活性が認められなかった。したがって、体外
循環終了後の止血等のための特別な観察や処置がほとん
どいらないことを意味する。Therefore, a patient having an extracorporeal circulation circuit has a blood coagulation problem only when the circuit is used, and is often different from a patient who must always prevent blood coagulation. It is. Similarly, it has not been predicted at all whether any of the above-mentioned conventionally known thrombomodulins can be conveniently used as a pharmaceutical composition for preventing blood coagulation for a blood extracorporeal circuit. For example, the thrombomodulin of the present invention has a very characteristic feature that it requires significantly less treatment and attention for hemostasis after the end of extracorporeal blood circulation, compared to normal thrombomodulin (thrombomodulin composed of domain 1, domain 2 and domain 3). It was confirmed that it was a characteristic. As shown in the examples, in a cynomolgus monkey extracorporeal circulation model, normal thrombomodulin (domain 1, domain 2 and domain 3) was used to prevent blood coagulation in the extracorporeal blood circulation circuit.
), The blood coagulation inhibitory activity remains in the blood for a long time even after the end of extracorporeal circulation, and therefore, when normal thrombomodulin is used to prevent blood coagulation in the blood extracorporeal circulation circuit May be considered longer after the end of extracorporeal circulation and require attention to bleeding. However, when thrombomodulin having the amino acid sequence represented by the formula (1) of the present invention is used, blood coagulation in the extracorporeal blood circulation circuit is effectively prevented. No activity was observed. Therefore, it means that there is almost no need for special observation or treatment for hemostasis after the end of extracorporeal circulation.
【００１７】上記の点とは別に、本発明のトロンボモジ
ュリンは、通常のトロンボモジュリンとは異なる性質を
有することを見い出した。通常のトロンボモジュリン
は、血栓溶解物質であるティシュ・プラスミノゲンアク
チベーター（ｔ−ＰＡ）のフィブリン（血栓）溶解の阻
害作用があり、この線溶阻害作用は、通常のトロンボモ
ジュリンとトロンビンの複合体による、血漿中のカルボ
キシペプチダーゼＢの活性化を介したものであると考え
られている。何らかの原因にて微小な血栓が生ずること
は健常人においても考えられ、通常は生体が有する線溶
機構により除去されていると考えられる。一旦何らかの
原因にて血栓が生じた状況において、線溶阻害作用を有
する薬剤を使用していた場合には、理論的には、血栓が
除去され得ないのであって、何らかの特別な処置を必要
とし、まして、血栓溶解物質であるティシュ・プラスミ
ノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）等により治療されて
いる重篤な血栓症患者に血液体外循環を行う場合に、線
溶阻害作用を有する血液体外循環回路用の血液凝固防止
のための医薬組成物を用いる場合には、やはり何らかの
特別な処置や観察を必要とする不便さがある。しかしな
がら、本発明の式（１）で表されるアミノ酸配列からな
るトロンボモジュリンは、通常のトロンボモジュリンと
は異なり、特別な処置や観察が不可欠となる原因とな
る、線溶阻害作用が認められなかった。実施例に示すよ
うに、通常のトロンボモジュリは、血栓溶解物質である
ｔ−ＰＡのフィブリン（血栓）溶解の阻害作用があるの
に対し、本発明のトロンボモジュリンは、その作用は全
く見られなかった。Apart from the above points, it has been found that the thrombomodulin of the present invention has different properties from ordinary thrombomodulin. Ordinary thrombomodulin has an inhibitory effect on fibrin (thrombotic) dissolution of tissue plasminogen activator (t-PA), which is a thrombolytic substance, and this fibrinolytic inhibitory effect is caused by a normal complex of thrombomodulin and thrombin. It is believed that this is through activation of carboxypeptidase B in the cell. The occurrence of minute thrombus for some reason is also considered to be possible in healthy individuals, and is usually considered to be eliminated by the fibrinolytic mechanism of the living body. Once a drug that has a fibrinolytic inhibitory action is used in a situation where a thrombus has occurred for some reason, the thrombus cannot be removed in theory, and some special treatment is required. In addition, when performing extracorporeal blood circulation in patients with severe thrombosis treated with tissue plasminogen activator (t-PA) or the like, which is a thrombolytic substance, a blood extracorporeal circulation circuit having a fibrinolytic inhibitory action is used. When a pharmaceutical composition for preventing blood coagulation is used, there is still inconvenience that requires some special treatment or observation. However, unlike the normal thrombomodulin, the thrombomodulin having the amino acid sequence represented by the formula (1) of the present invention did not exhibit a fibrinolytic inhibitory effect, which would require special treatment or observation. As shown in Examples, ordinary thrombomodulin has an inhibitory effect on the dissolution of fibrin (thrombosis) of t-PA, a thrombolytic substance, whereas the thrombomodulin of the present invention did not show any effect.
【００１８】以上のように、本発明のトロンボモジュリ
ンは、他の薬剤、あるいは通常のトロンボモジュリの問
題点を悉くクリアーし、体外循環終了後の出血等の観察
が生じないという予想外の効果を示すものである。本発
明のトロンボモジュリンを調製するには、公知の方法、
すなわち遺伝子組換え技術、またはペプチド合成技術を
用いることにより、製造することができる。通常は、遺
伝子組換え技術を用いて製造することが望ましい。As described above, the thrombomodulin of the present invention clears all the problems of other drugs or ordinary thrombomodulin, and exhibits an unexpected effect of not observing bleeding after the end of extracorporeal circulation. It is. Known methods for preparing the thrombomodulin of the present invention,
That is, it can be produced by using a gene recombination technique or a peptide synthesis technique. Usually, it is desirable to produce using a gene recombination technique.
【００１９】遺伝子組換え技術に用いるトロンボモジュ
リンの遺伝子は、クローニングされており、そしてトロ
ンボモジュリン、さらには本発明のトロンボモジュリン
のようなトロンボモジュリン断片物もまた、遺伝子組換
え技術を用いた製造例が開示されており、さらにはその
精製品を得るための精製方法も知られている（特開平１
−６２１９、特開平２−２５５６９９、特開平５−２１
３９９８、特開平５−３１０７８７、特開平７−１５５
１７６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１０３５
１−１０３５３，１９８９）。したがって、本発明のト
ロンボモジュリンは、上記の報告に記載されている方法
を用いることにより、あるいはそれらに記載の方法に準
じることにより製造することができる。例えば、特開平
１−６２１９では、全長のトロンボモジュリンをコード
するＤＮＡを含むプラスミドｐＳＶ２ＴＭＪ２を含む、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｓｔｒ
ａｉｎ ＤＨ５（ＡＴＣＣ 寄託番号６７２８３号）を
開示しているが、出願人らは、再度、同じ菌株（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５／ｐＳＶ２ＴＭＪ
２）を生命研に寄託した（ＦＥＲＭ ＢＰ−５５７
０）。この全長のトロンボモジュリンをコードするＤＮ
Ａを原料として、公知の遺伝子操作技術によって、本発
明のトロンボモジュリンを調製することができる。The gene for thrombomodulin used in the gene recombination technique has been cloned, and thrombomodulin, and also thrombomodulin fragments such as the thrombomodulin of the present invention, have been disclosed in the production examples using the gene recombination technique. Further, a purification method for obtaining the purified product is also known (Japanese Patent Laid-Open No.
-6219, JP-A-2-255699, JP-A-5-21
3998, JP-A-5-310787, JP-A-7-155
176, J.M. Biol. Chem. , 264,1035
1-10353, 1989). Therefore, the thrombomodulin of the present invention can be produced by using the method described in the above report or according to the method described therein. For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-6219 discloses a plasmid pSV2TMJ2 containing a DNA encoding full-length thrombomodulin.
Escherichia coli K-12 str
ain DH5 (ATCC Deposit No. 67283) has been disclosed, but Applicants again have the same strain (Esc
herichia coli DH5 / pSV2TMJ
2) was deposited with Life Science Research Institute (FERM BP-557)
0). DN encoding this full-length thrombomodulin
Using A as a raw material, the thrombomodulin of the present invention can be prepared by a known genetic engineering technique.
【００２０】従来技術である部位特異的変異の手法によ
り、あるＤＮＡ中の任意の塩基配列領域のみを削除した
り、またあるＤＮＡ中の任意の塩基を他の異なる塩基に
置換することができる。例えば、Ｍ１３ベクターを用い
た部位特異的変異の手法を用いて、あるＤＮＡ中の任意
の塩基配列領域のみを削除せしめたい場合には、その削
除せしめたい塩基配列領域を含むＤＮＡ断片がプラスミ
ドＭ−１３ｍｐ１８、もしくはＭ−１３ｍｐ１９に挿入
された組換え体プラスミドを得、該プラスミドのシング
ルストランド（一本鎖）ＤＮＡに、５’末端をリン酸化
した、削除せしめる塩基配列領域の両端の塩基配列を直
接に結合せしめた塩基配列に対して相補的な塩基配列か
らなるオリゴヌクレオチド（以下、デリーターと称す）
とＭ−１３プライマー（ユニバーサルプライマー、宝酒
造（株）、カタログ番号３８３１）をアニールさせ、次
いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩとＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを加えることにより、削除せしめる塩基配列
領域のみが一本鎖ＤＮＡのループ状となった、二本鎖の
環状ＤＮＡをその反応液中に形成させる。上記の二本鎖
の環状ＤＮＡを含む反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５
（ファルマシア、カタログ番号２７ー１５５０）に加
え、寒天培地上にプラークを形成させ、次いで 32Ｐでラ
ベル化した上記のデリーターを用いてプラークハイブリ
ダイゼーションをすることにより、目的の塩基配列から
なるＤＮＡ断片が挿入されている組換え体プラスミドを
含むクローンを選択することができる。また、あるＤＮ
Ａ中の任意の塩基を他の異なる塩基に置換したＤＮＡを
得る場合には、上記のデリーターの代わりに、置換せし
めたい塩基が目的の塩基に置換してある、置換せしめた
い塩基の前後の塩基配列に対して相補的な塩基配列から
なるオリゴヌクレオチド（以下、ミューテーターと称
す）を用いればよい。部位特異的変異の手法の応用によ
り、２箇所以上の任意の塩基配列領域を削除したり、あ
るいは２箇所以上の任意の塩基を他の異なる塩基に置換
したりすることもできる。According to the conventional site-specific mutation technique,
Therefore, only an arbitrary nucleotide sequence region in a certain DNA was deleted.
Or any base in one DNA to another different base
Can be replaced. For example, using M13 vector
Using a site-directed mutation technique
If you want to delete only the base sequence region of
The DNA fragment containing the nucleotide sequence region to be
Insert into M-13mp18 or M-13mp19
Obtained recombinant plasmid, and the plasmid
Phosphorylation of 5 'end to rustrand (single-stranded) DNA
The base sequences at both ends of the base sequence region to be deleted.
Is the nucleotide sequence complementary to the directly bound nucleotide sequence?
Oligonucleotide (hereinafter referred to as "deleter")
And M-13 primer (Universal primer, Takara Shu
Announce Catalog No. 3831)
E. coli DNA polymerase I and T4DN
Nucleotide sequence that can be deleted by adding A ligase
Only the region became a single-stranded DNA loop,
A circular DNA is formed in the reaction. Double strand above
The reaction solution containing the circular DNA of coli JM105
(Pharmacia, catalog number 27-1550)
To form plaques on the agar medium, 32P is la
Plaque hybridization using the belled above deleater
By performing dimerization, the target base sequence
The recombinant plasmid into which the DNA fragment
Containing clones can be selected. Also, a DN
DNA obtained by replacing any base in A with another different base
If you do, substitute
The desired base has been replaced with the desired base
From the base sequence complementary to the base sequence before and after the base
Oligonucleotide (hereinafter referred to as mutator)
) May be used. Application of site-specific mutation technique
Or delete any two or more base sequence regions,
Or replace two or more arbitrary bases with other different bases
You can also do.
【００２１】特開平１−６２１９を参考として、前述の
全長のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを出発材
料として、上記の部位特異的変異の手法を用い、（Ｗ）
が、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐであり、
（Ｘ）と（Ｙ）がともにＡｓｎであり、（Ｚ）がＶａｌ
である式（１）に記載のアミノ酸配列からなる本発明の
トロンボモジュリンをコードするＤＮＡを作成すればよ
く、例えば、以下の方法が挙げられる。全長のトロンボ
モジュリンをコードするＤＮＡをファージＭ−１３ｍｐ
１９に挿入した、組換え体プラスミドを得、続いて、該
プラスミドのシングルストランドＤＮＡに、５’末端を
リン酸化した配列番号４の１ー２５の塩基配列からなる
デリターターとＭ−１３プライマー（ユニバーサルプラ
イマー、宝酒造（株）、カタログ番号３８３１）をアニ
ールさせ、さらに続いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメ
ラーゼＩとＴ４ＤＮＡリガーゼを加えて、その混合物中
に組換え体プラスミドを生成させる。その混合物をＥ．
ｃｏｌｉ ＪＭ１０５（ファルマシア、カタログ番号２
７ー１５５０）に加え、寒天培地上にプラークを形成さ
せ、32Ｐでラベル化した配列番号４の１ー２５の塩基配
列からなるオリゴヌクレオチドを用いてプラークハイブ
リダイゼーションをすることにより、所望の組換え体プ
ラスミドを含むクローンを選択する。このようにして得
られた組換え体プラスミドには、天然の全長のトロンボ
モジュリンからトロンボモジュリンのドメイン３、ドメ
イン４、およびドメイン５をコードするＤＮＡ領域を削
除したＤＮＡ（ドメイン１とドメイン２からなるトロン
ボモジュリンをコードするＤＮＡ）を含有する。続い
て、デリターターとしては配列番号５の１ー２５の塩基
配列からなるデリターターを用いて、上記で調製した組
換え体プラスミド中に含有されているドメイン１とドメ
イン２からなるトロンボモジュリンをコードするＤＮＡ
からドメイン１とドメイン２の一部をコードするＤＮＡ
を削除することにより、（Ｗ）が、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐであり、（Ｘ）と（Ｙ）がともに
Ａｓｎであり、（Ｚ）がＶａｌである式（１）に記載の
アミノ酸配列からなる本発明のトロンボモジュリンをコ
ードするＤＮＡを含有する組換え体プラスミドを作成す
ることができる。With reference to Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-6219, the above-mentioned site-directed mutagenesis method was used, using the above-described DNA encoding full-length thrombomodulin as a starting material, and
Is Val-Glu-Pro-Val-Asp,
(X) and (Y) are both Asn, and (Z) is Val
It is sufficient to prepare a DNA encoding the thrombomodulin of the present invention, which comprises the amino acid sequence represented by the formula (1), and includes, for example, the following method. DNA encoding full-length thrombomodulin was transferred to phage M-13mp.
No. 19, a recombinant plasmid was obtained. Subsequently, a single-strand DNA of the plasmid was combined with a delimiter consisting of the nucleotide sequence of 1 to 25 of SEQ ID NO: 4 phosphorylated at the 5 ′ end and an M-13 primer (Universal). Primer, Takara Shuzo Co., Ltd., catalog number 3831), followed by E. coli. E. coli DNA polymerase I and T4 DNA ligase are added to generate a recombinant plasmid in the mixture. The mixture is
coli JM105 (Pharmacia, catalog number 2
7-1550), a plaque is formed on an agar medium, and plaque hybridization is performed using an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of 1 to 25 of SEQ ID NO: 4 labeled with 32 P to obtain a desired group. Select a clone containing the recombinant plasmid. The recombinant plasmid thus obtained contains DNA (thrombomodulin consisting of domain 1 and domain 2) obtained by deleting the DNA regions encoding domain 3, domain 4 and domain 5 of thrombomodulin from natural full-length thrombomodulin. Encoding DNA). Subsequently, a DNA encoding thrombomodulin comprising domain 1 and domain 2 contained in the recombinant plasmid prepared above is used, using a delimiter consisting of the nucleotide sequence of 1 to 25 of SEQ ID NO: 5 as a delimiter.
Encoding domain 1 and part of domain 2
Is deleted, (W) becomes Val-Glu-P
a DNA encoding the thrombomodulin of the present invention comprising the amino acid sequence according to formula (1), which is ro-Val-Asp, (X) and (Y) are both Asn, and (Z) is Val. Recombinant plasmids can be made.
【００２２】また、特開平５−３１０７８７を参考とし
て、ミューテーターを用いて、天然のトロンボモジュリ
ンのアミノ酸配列の中でひとつのアミノ酸が置換され
た、変異型のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを
作成することができる。例えば、（Ｚ）がＶａｌである
式（１）に記載のアミノ酸配列からなる本発明のトロン
ボモジュリンをコードする上記のＤＮＡから、例えば、
（Ｚ）がＡｌａである式（１）に記載のアミノ酸配列か
らなる本発明のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡ
にするためには、ミューテーターとして配列番号８の１
ー２１の塩基配列からなるミューテーターを用いればよ
い。Also, with reference to JP-A-5-310787, it is possible to use a mutator to prepare a DNA encoding a mutant thrombomodulin in which one amino acid is substituted in the amino acid sequence of a natural thrombomodulin. it can. For example, from the above-mentioned DNA encoding the thrombomodulin of the present invention consisting of the amino acid sequence of formula (1) wherein (Z) is Val, for example,
A DNA encoding the thrombomodulin of the present invention comprising the amino acid sequence of formula (1) wherein (Z) is Ala
In order to achieve this, as a mutator, 1 of SEQ ID NO: 8
A mutator having a base sequence of -21 may be used.
【００２３】このように、部位特異的変異の手法を用い
ることにより、式（１）中の（Ｗ）が、Ｖａｌ−Ｇｌｕ
−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−
Ａｓｐ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｖａｌ−Ａｓｐ、ま
たはＡｓｐのいずれかのペプチド残基またはアミノ酸残
基であっても、また（Ｘ）や（Ｙ）が、Ａｓｎ、Ｇｌ
ｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＧｌｙのいずれかのアミノ
酸残基であっても、またさらには（Ｚ）が、Ｖａｌ、ま
たはＡｌａのいずれかのアミノ酸残基であっても、本発
明のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを作成する
ことができる。また、部位特異的変異の手法を用いるこ
となく、有機化学合成によっても、本発明のトロンボモ
ジュリンをコードするＤＮＡを得ることができる。As described above, by using the site-directed mutagenesis method, (W) in the formula (1) becomes Val-Glu
-Pro-Val-Asp, Glu-Pro-Val-
Regardless of the peptide or amino acid residue of Asp, Pro-Val-Asp, Val-Asp, or Asp, (X) or (Y) may be any of Asn, GI
the thrombomodulin of the present invention, whether it is any amino acid residue of n, Ser, Ala, or Gly, or even if (Z) is any amino acid residue of Val or Ala. Can be prepared. Further, a DNA encoding the thrombomodulin of the present invention can be obtained by organic chemical synthesis without using a site-specific mutation technique.
【００２４】本発明のトロンボモジュリンをコードする
ＤＮＡは、特開平１ー６２１９に代表される公知の方法
にて、複製可能な発現ベクターと結合せしめて、複製可
能な組換え体ＤＮＡとなすことができる。さらに、該組
換え体ＤＮＡは、それによって形質転換された微生物ま
たは細胞中で、所望のペプチドを発現させ、その培養物
またはその培養上澄液から所望のペプチドを得ることが
できる。The DNA encoding the thrombomodulin of the present invention can be ligated to a replicable expression vector by a known method such as that described in JP-A-1-21919 to obtain a replicable recombinant DNA. . Further, the recombinant DNA can express a desired peptide in a microorganism or cell transformed thereby, and obtain the desired peptide from the culture or the culture supernatant.
【００２５】微生物または細胞を形質転換させる該組換
え体ＤＮＡにおいて、本発明のトロンボモジュリンをコ
ードするＤＮＡの５’末端側にシグナルペプチドをコー
ドするＤＮＡを接続することにより、所望のペプチド、
すなわち本発明のトロンボモジュリンは、分泌された形
態で、その培養上澄液中から得ることができる。形質転
換された微生物または細胞中で、シグナルペプチドをＮ
末端側に付加されたペプチドからシグナルペプチドが切
断されるが、その切断は、その微生物または細胞の培養
条件により、所望の位置で切断されないこともありえる
ので、そのような場合にはシグナルペプチドとしては、
公知である天然のトロンボモジュリン由来のシグナルペ
プチドでなくともよい。例えば、天然のトロンボモジュ
リンのシグナルペプチドより２つアミノ酸が少ない、配
列番号３の１ー１６のアミノ酸配列からなるシグナルペ
プチドをコードする塩基配列を用いることができる。ま
た、その具体的な塩基配列としては配列番号６の１ー４
８の塩基配列が例示される。In the recombinant DNA for transforming a microorganism or a cell, a DNA encoding a signal peptide is connected to the 5 'end of a DNA encoding the thrombomodulin of the present invention, whereby a desired peptide,
That is, the thrombomodulin of the present invention can be obtained in a secreted form from the culture supernatant. In a transformed microorganism or cell, the signal peptide
Although the signal peptide is cleaved from the peptide added to the terminal side, the signal peptide may not be cleaved at a desired position depending on the culture conditions of the microorganism or cell. ,
It may not be a known signal peptide derived from natural thrombomodulin. For example, a base sequence encoding a signal peptide consisting of the amino acid sequence of 1 to 16 of SEQ ID NO: 3 having two amino acids less than that of a natural thrombomodulin signal peptide can be used. The specific nucleotide sequence is 1-4 of SEQ ID NO: 6.
8 are exemplified.
【００２６】遺伝子組換え技術を用い、本発明のトロン
ボモジュリンが発現するように形質転換した細胞の培養
物、またはその細胞の培養上澄液中に含まれる本発明の
トロンボモジュリンを精製するには、一般的なタンパク
質の精製方法、例えば、硫安沈澱、各種のカラムクロマ
トグラフィー（イオン交換カラムクロマトグラフィ、ア
フィニティーカラムクロマトグラフィーなど）等を用い
ることにより、その精製品を取得することができる。ま
た、公知の方法、例えば、特開平１−６２１９の実施例
１７に記載の方法である、ＤＩＰ−トロンビン（ジイソ
プロピルホスホロトロンビン）アガロースクロマトグラ
フィーにより精製することができる。また、特開平５−
２１３９９８の実施例８に記載の方法である、抗トロン
ボモジュリン抗体カラムクロマトグラフィーにより精製
できることも知られている。In order to purify the thrombomodulin of the present invention contained in a culture of a cell transformed to express the thrombomodulin of the present invention or a culture supernatant of the cell using a gene recombination technique, generally, By using a typical protein purification method, for example, ammonium sulfate precipitation, various column chromatography (ion exchange column chromatography, affinity column chromatography, etc.), the purified product can be obtained. Further, it can be purified by a known method, for example, DIP-thrombin (diisopropyl phosphorothrombin) agarose chromatography, which is a method described in Example 17 of JP-A-1-6219. Further, Japanese Unexamined Patent Publication No.
It is also known that purification can be performed by anti-thrombomodulin antibody column chromatography, which is the method described in Example 8 of 213998.
【００２７】式（１）のアミノ酸配列からなる本発明の
トロンボモジュリンを血液体外循環時における体外回路
内の血液凝固防止薬として用いる際には、薬剤として一
般的に用いられる適当な担体叉は媒体、例えば滅菌水や
生理食塩水、ショ糖やマンニトール、植物油、無害性有
機溶媒等、さらには必要に応じて賦形剤、着色剤、乳化
剤、安定化剤または保存剤等と適宜組み合わせることが
できる。すなわち、上記における血液凝固を防止するの
に、有効な量の本発明のトロンボモジュリンを適当な量
の担体叉は媒体と混ぜて、血液体外循環用回路内に、ま
たは患者に効果的に投与するのに適した医薬組成物を調
製することができる。通常、凍結乾燥を行うことも好ま
しく、その場合には、用時溶解して用いることができ
る。When the thrombomodulin of the present invention comprising the amino acid sequence of the formula (1) is used as an anticoagulant in an extracorporeal circuit during extracorporeal blood circulation, a suitable carrier or medium generally used as a drug includes: For example, it can be appropriately combined with sterile water, physiological saline, sucrose, mannitol, vegetable oil, harmless organic solvent and the like, and if necessary, excipient, colorant, emulsifier, stabilizer or preservative. That is, an effective amount of the thrombomodulin of the present invention is mixed with an appropriate amount of a carrier or medium to prevent blood clotting as described above, and is effectively administered to a circuit for extracorporeal blood circulation or to a patient. A suitable pharmaceutical composition can be prepared. Usually, freeze-drying is also preferred, in which case it can be dissolved and used before use.
【００２８】本発明の医薬組成物は、従来技術で説明し
た医用器材に固定化させることなく、組成物として、血
液体外循環用回路内に、または患者に投与するものであ
る。本発明の医薬組成物は、血液体外循環用回路内に、
またはペプチド医薬が一般に使用されている投与法、す
なわち、非経口投与法、例えば、静脈内投与、筋肉内投
与、皮下投与などによって投与することが望ましく、通
常は、血液体外循環用回路内に直接投与することが特に
好ましい。また場合によっては、経口投与、直腸内投
与、鼻内投与、舌下投与することも可能である。血液体
外循環用回路内に直接投与する場合には、血液を体外に
導き出す循環用回路の出来るだけ体内に近い部位におい
て投与することが好ましいが、血液透析等においては、
通常設けられている注入口が利用できる。The pharmaceutical composition of the present invention is to be administered as a composition into a circuit for extracorporeal blood circulation or to a patient without being immobilized on medical equipment described in the prior art. The pharmaceutical composition of the present invention, in a circuit for extracorporeal blood circulation,
Alternatively, it is desirable to administer the peptide drug by a commonly used administration method, that is, a parenteral administration method, for example, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, etc., and usually, it is directly injected into the circuit for extracorporeal blood circulation. It is particularly preferred to administer. In some cases, oral administration, rectal administration, nasal administration, and sublingual administration are also possible. When administered directly into the blood extracorporeal circuit, it is preferable to administer the blood at a site as close to the body as possible in the circuit for guiding blood outside the body, but in hemodialysis and the like,
Normally provided inlets can be used.
【００２９】本発明の医薬組成物は、１回の血液体外循
環施行にあたり、１回または必要に応じて数回に分割し
て、一度にあるいは持続的に投与される。また、血液体
外循環施行時間が２４時間（一日）以上を要する場合に
は、一日あたり、１回または必要に応じて数回に分割し
て、一度にあるいは持続的に投与される。また、通常、
血液体外循環施行開始直前に、体外循環回路内へ、適量
を一括投与し、引き続いて血液体外循環施行中に、血液
凝固を防止し得る適量を持続注入をすることが好まし
い。例えば透析においては、透析開始直前に、体外循環
回路内へ、０．５〜７ｍｇを一括投与し、引き続いて透
析施行中に、１〜７ｍｇ／ｈｒの持続注入を行うことが
例示される。The pharmaceutical composition of the present invention is administered once or continuously in a single extracorporeal blood circulation once or divided into several times as necessary. If the extracorporeal blood circulation time is 24 hours (one day) or more, the drug is administered once or continuously once a day or divided into several times as necessary. Also, usually
Immediately before the start of blood extracorporeal circulation, it is preferable to administer an appropriate amount at once into the extracorporeal circuit, and then to continuously inject an appropriate amount capable of preventing blood coagulation during the extracorporeal blood circulation. For example, in dialysis, it is exemplified that 0.5 to 7 mg is collectively administered into the extracorporeal circulation circuit immediately before the start of dialysis, and then continuous infusion of 1 to 7 mg / hr is performed during dialysis.
【００３０】本発明の医薬組成物の投与量は、１回の血
液体外循環施行、または一日あたり、１ｍｇ〜１，００
０ｍｇが好ましいが、患者の年齢、体重、症状等に応じ
て適宜増減することができる。式（１）のアミノ酸配列
からなる本発明のトロンボモジュリンは血液凝固を防止
する作用を有するので、本発明の医薬組成物は、血液体
外循環回路の血液凝固防止のため以外の方法として、種
々の血栓症の治療や予防をすることも期待できる。ま
た、輸血用血液の凝固防止薬として用いることもでき
る。更に、式（１）のアミノ酸配列からなる本発明のト
ロンボモジュリンは、血液中からの消失がはやく、線溶
阻害作用がないことから、本発明の医薬組成物は、血液
体外循環以外の場合、例えば、経皮経管冠動脈拡張術
（ＰＴＣＡ）や血栓溶解療法などのような血液再灌流療
法時の場合などにおいても使用価値が高いと考えられ
る。本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は
これらの実施例に限定されるものではない。The dose of the pharmaceutical composition of the present invention can be adjusted by one extracorporeal blood circulation or 1 mg to 1,000 mg per day.
0 mg is preferable, but it can be appropriately increased or decreased according to the patient's age, weight, symptoms, and the like. Since the thrombomodulin of the present invention having the amino acid sequence of the formula (1) has an action of preventing blood coagulation, the pharmaceutical composition of the present invention may be used for various methods of preventing blood coagulation in the extracorporeal circuit. It can also be expected to treat and prevent the disease. It can also be used as an anticoagulant for blood for transfusion. Furthermore, the thrombomodulin of the present invention comprising the amino acid sequence of the formula (1) is rapidly eliminated from the blood and has no fibrinolytic inhibitory action. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention may be used in cases other than extracorporeal blood circulation, for example. It is considered to be highly useful also in the case of blood reperfusion therapy such as percutaneous transluminal coronary artery dilatation (PTCA) or thrombolytic therapy. The present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
【００３１】[0031]
【実施例１】本発明のトロンボモジュリンの発現ベクタ
ーの構築 （１）（Ｗ）が、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａ
ｓｐであり、（Ｘ）と（Ｙ）がともにＡｓｎであり、
（Ｚ）がＶａｌである本発明のトロンボモジュリン（Ｅ
４５６ＮＮＶ−１１８）の発現ベクターの構築 特開平１−６２１９の参考例３および実施例１に記載さ
れた方法に準じて、該公開公報に開示されたプラスミド
ｐＳＶ２ＴＭＪ２を得、再度寄託をした［Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５／ｐＳＶ２ＴＭＪ２）Ｆ
ＥＲＭ ＢＰー５５７０）］。特開平１−６２１９の実
施例１−（４）−（ａ）に記載の方法に従って、該プラ
スミドｐＳＶ２ＴＭＪ２（生命研、ＦＥＲＭ ＢＰー５
５７０）に含有する全長トロンボモジュリンをコードす
るＤＮＡをプラスミドＭ−１３ｍｐ１９（宝酒造
（株））に挿入し、そして配列番号４の１ー２５の塩基
配列からなるデリターターを用い、組換え体プラスミド
Ｍ−１３ＴＭＤ３を得た。該プラスミドＭ−１３ＴＭＤ
３は、特開平１−６２１９の実施例１−（４）−（ａ）
に記載されているように、開始コドン（ＡＴＧ）から始
まる１８残基のアミノ酸からなる天然のトロンボモジュ
リンのシグナルペプチドに続いて４６２残基のアミノ酸
からなる天然のトロンボモジュリンの部分ペプチドをコ
ードする塩基配列を含有するＤＮＡ断片を有することを
確認した。続いて、上記のプラスミドＭ−１３ＴＭＤ３
と配列番号５の１ー２５の塩基配列からなるデリタータ
ーを用いて、特開平１−６２１９の実施例１−（５）−
（ａ）に記載の方法に従い、組換え体プラスミドＭ−１
３ＴＭＤ５を得た。該プラスミドＭ−１３ＴＭＤ５は、
特開平１−６２１９の実施例１−（５）−（ａ）に記載
されているように、開始コドン（ＡＴＧ）から始まる１
８残基のアミノ酸からなる天然のトロンボモジュリンの
シグナルペプチドに続いて本発明トロンボモジュリンＥ
４５６ＮＮＶ−１１８をコードする塩基配列を含有する
ＤＮＡ断片を有することを確認した。さらに続いて、特
開平１−６２１９の実施例１−（５）−（ｂ）に記載の
方法により、上記のＤＮＡ断片をプラスミドｐＳＶ２−
ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）に挿入し、本発明ト
ロンボモジュリンＥ４５６ＮＮＶ−１１８の発現ベクタ
ーｐＳＶ２ＴＭＤ５を構築した。Example 1 Construction of Expression Vector for Thrombomodulin of the Present Invention (1) (W) was replaced with Val-Glu-Pro-Val-A
sp, (X) and (Y) are both Asn,
The thrombomodulin of the present invention wherein (Z) is Val (E
Construction of Expression Vector of 456NNV-118) The plasmid pSV2TMJ2 disclosed in the publication was obtained and deposited again according to the method described in Reference Example 3 and Example 1 of JP-A-1-6219 [Escher
ichia coli DH5 / pSV2TMJ2) F
ERM BP-5570)]. According to the method described in Example 1- (4)-(a) of JP-A-1-6219, the plasmid pSV2TMJ2 (manufactured by Life Research, FERM BP-5)
570) was inserted into plasmid M-13mp19 (Takara Shuzo Co., Ltd.), and a recombinant plasmid M-13TMD3 was obtained using a deterator consisting of the nucleotide sequence of 1-25 of SEQ ID NO: 4. I got The plasmid M-13TMD
No. 3 is Example 1- (4)-(a) of JP-A-1-6219.
As described in the above, a nucleotide sequence encoding a natural thrombomodulin partial peptide consisting of 462 amino acids followed by a natural thrombomodulin partial peptide consisting of 18 amino acids starting from the initiation codon (ATG) is described. It was confirmed that the DNA fragment contained the DNA fragment. Subsequently, the above plasmid M-13TMD3
And Example 1- (5)-of JP-A No. 1-6219 using a detarter consisting of the nucleotide sequence of 1 to 25 of SEQ ID NO: 5.
According to the method described in (a), the recombinant plasmid M-1
3TMD5 was obtained. The plasmid M-13TMD5 is
As described in Example 1- (5)-(a) of JP-A-1-6219, 1 starting from the start codon (ATG)
The native thrombomodulin signal peptide consisting of 8 amino acids is followed by the thrombomodulin E of the present invention.
It was confirmed to have a DNA fragment containing the nucleotide sequence encoding 456NNV-118. Subsequently, the above DNA fragment was ligated to the plasmid pSV2- by the method described in Example 1- (5)-(b) of JP-A-1-6219.
dhfr (ATCC 37146) to construct the thrombomodulin E456NNV-118 expression vector pSV2TMD5 of the present invention.
【００３２】（２）（Ｗ）が、Ａｓｐであり、（Ｘ）と
（Ｙ）がともにＡｓｎであり、（Ｚ）がＶａｌである本
発明のトロンボモジュリン（Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４）
の発現ベクターの構築 実施例１ー（１）で得られた組換え体プラスミドＭ−１
３ＴＭＤ３と、配列番号７の１ー２５の塩基配列からな
るデリターターを用い、特開平５−２１３９９８の実施
例１−（１）−（ｂ）に記載の方法により、組換え体プ
ラスミドＭ−１３ＴＭＤ７を得た。該プラスミドＭ−１
３ＴＭＤ７は、特開平５−２１３９９８の実施例１−
（１）−（ｂ）に記載されているように、開始コドン
（ＡＴＧ）から始まる１８残基のアミノ酸からなる天然
のトロンボモジュリンのシグナルペプチドに続いて本発
明トロンボモジュリンＥ４５６ＮＮＶ−１１４をコード
する塩基配列を含有するＤＮＡ断片を有することを確認
した。続いて、特開平５−２１３９９８の実施例１−
（１）−（ｂ）に記載の方法により、上記のＤＮＡ断片
をプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４
６）に挿入し、本発明トロンボモジュリンＥ４５６ＮＮ
Ｖ−１１４の発現ベクターｐＳＶ２ＴＭＤ７を構築し
た。 （３）（Ｗ）が、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａ
ｓｐであり、（Ｘ）と（Ｙ）がともにＡｓｎであり、
（Ｚ）がＡｌａである本発明のトロンボモジュリン（Ｅ
４５６ＮＮＡ−１１８）の発現ベクターの構築 実施例１−（１）で得られた組換え体プラスミドＭ−１
３ＴＭＤ５と配列番号８の１ー２１の塩基配列からなる
ミューテーターを用いる以外は、特開平１−６２１９の
実施例１−（４）−（ａ）と実質的に同様の方法を用い
ることにより、上記のプラスミドＭ−１３ＴＭＤ５の一
部の塩基を他の塩基に置換した組換え体プラスミドＭ−
１３ＴＭＭ１を得た。該プラスミドＭ−１３ＴＭＭ１
は、開始コドン（ＡＴＧ）から始まる１８残基のアミノ
酸からなる天然のトロンボモジュリンのシグナルペプチ
ドに続いて本発明のトロンボモジュリンＥ４５６ＮＮＡ
−１１８をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ断片を
有することを確認した。すなわち、該プラスミドＭ−１
３ＴＭＭ１は、式（１）中の（Ｚ）のアミノ酸に相当す
るコドン以外は、実施例１ー（１）で得られたプラスミ
ドＭ−１３ＴＭＤ５と同一の塩基配列を有するものであ
った。続いて、プラスミドＭ−１３ＴＭＤ５の代わりに
プラスミドＭ−１３ＴＭＭ１を用いること以外は、特開
平１−６２１９の実施例１−（５）−（ｂ）に記載の方
法に従い、本発明トロンボモジュリンＥ４５６ＮＮＡ−
１１８の発現ベクターｐＳＶ２ＴＭＭ１を構築した。(2) Thrombomodulin of the present invention (E456NNV-114) wherein (W) is Asp, (X) and (Y) are both Asn, and (Z) is Val.
Of the recombinant plasmid M-1 obtained in Example 1- (1)
The recombinant plasmid M-13TMD7 was prepared by the method described in Example 1- (1)-(b) of JP-A-5-213998, using 3TMD3 and a delimiter consisting of the nucleotide sequence of 1-25 of SEQ ID NO: 7. Obtained. The plasmid M-1
3TMD7 is disclosed in Example 1 of JP-A-5-213998.
As described in (1)-(b), a nucleotide sequence encoding a natural thrombomodulin E456NNV-114 of the present invention followed by a natural thrombomodulin signal peptide consisting of 18 amino acids starting from the initiation codon (ATG). It was confirmed that the DNA fragment contained the DNA fragment. Then, Example 1 of JP-A-5-213998
According to the method described in (1)-(b), the above DNA fragment was converted into the plasmid pSV2-dhfr (ATCC 3714).
6) and inserted into the thrombomodulin E456NN of the present invention.
An expression vector pSV2TMD7 for V-114 was constructed. (3) (W) is Val-Glu-Pro-Val-A
sp, (X) and (Y) are both Asn,
The thrombomodulin of the present invention wherein (Z) is Ala (E
456NNA-118) Construction of Expression Vector Recombinant Plasmid M-1 Obtained in Example 1- (1)
By using a method substantially similar to that of Example 1- (4)-(a) of JP-A-1-6219 except that a mutator consisting of 3TMD5 and the nucleotide sequence of 1-21 of SEQ ID NO: 8 is used, Recombinant plasmid M- obtained by substituting some bases of the above-mentioned plasmid M-13 TMD5 with other bases
13 TMM1 was obtained. The plasmid M-13TMM1
Is a natural thrombomodulin signal peptide consisting of 18 amino acids starting from the start codon (ATG), followed by the thrombomodulin E456NNA of the present invention.
It was confirmed to have a DNA fragment containing the base sequence encoding -118. That is, the plasmid M-1
3TMM1 had the same base sequence as the plasmid M-13TMD5 obtained in Example 1- (1) except for the codon corresponding to the amino acid of (Z) in the formula (1). Then, according to the method described in Example 1- (5)-(b) of JP-A-6219, except that the plasmid M-13TMD1 is used instead of the plasmid M-13TMD5, the thrombomodulin E456NNA-
118 expression vectors pSV2TMM1 were constructed.
【００３３】（４）（Ｗ）が、Ａｓｐであり、（Ｘ）と
（Ｙ）がともにＡｓｎであり、（Ｚ）がＡｌａである本
発明のトロンボモジュリン（Ｅ４５６ＮＮＡ−１１４）
の発現ベクターの構築 プラスミドＭ−１３ＴＭＤ５の代わりに実施例１ー
（２）で得られた組換え体プラスミドＭ−１３ＴＭＤ７
を用いること以外は、実施例１ー（３）の方法に従い、
組換え体プラスミドＭ−１３ＴＭＭ２を得た。該プラス
ミドＭ−１３ＴＭＭ２は、開始コドン（ＡＴＧ）から始
まる１８残基のアミノ酸からなる天然のトロンボモジュ
リンのシグナルペプチドに続いて本発明のトロンボモジ
ュリンＥ４５６ＮＮＡ−１１４をコードする塩基配列を
含有するＤＮＡ断片を有することを確認した。続いて、
プラスミドＭ−１３ＴＭＤ５の代わりにプラスミドＭ−
１３ＴＭＭ２を用いること以外は、特開平１−６２１９
の実施例１−（５）−（ｂ）に記載の方法に従い、本発
明トロンボモジュリンＥ４５６ＮＮＡ−１１４の発現ベ
クターｐＳＶ２ＴＭＭ２を構築した。 （５）（Ｗ）が、Ｖａｌ−Ａｓｐであり、（Ｘ）と
（Ｙ）がともにＡｓｎであり、（Ｚ）がＶａｌである本
発明のトロンボモジュリン（Ｅ４５６ＮＮＶ−１１５）
の発現ベクターの構築 特開平２ー２５５６９９の実施例（１）−（ａ）に記載
の方法により、組換え体プラスミドＭ−１３ＴＭＤ６を
得た。すなわち、部位特異的変異の手法により、配列番
号９の１ー２５の塩基配列からなるデリーターを用い
て、実施例１ー（１）で得られたプラスミドＭ−１３Ｔ
ＭＤ５の一部のＤＮＡ断片が削除された該プラスミドＭ
−１３ＴＭＤ６を得た。続いて、特開平２ー２５５６９
９の実施例（１）−（ｂ）に記載の方法により、（Ｗ）
が、Ｖａｌ−Ａｓｐであり、（Ｘ）と（Ｙ）がともにＡ
ｓｎであり、（Ｚ）がＶａｌである本発明のトロンボモ
ジュリン（Ｅ４５６ＮＮＶ−１１５）の発現ベクターｐ
ＳＶ２ＴＭＤ６を構築した。(4) The thrombomodulin (E456NNA-114) of the present invention wherein (W) is Asp, (X) and (Y) are both Asn, and (Z) is Ala.
Construction of the Expression Vector of Example 1 Instead of the plasmid M-13TMD5, the recombinant plasmid M-13TMD7 obtained in Example 1- (2) was used.
According to the method of Example 1- (3) except that
The recombinant plasmid M-13TMM2 was obtained. The plasmid M-13TMM2 has a natural thrombomodulin signal peptide consisting of 18 amino acids starting from the initiation codon (ATG), followed by a DNA fragment containing a nucleotide sequence encoding the thrombomodulin E456NNA-114 of the present invention. It was confirmed. continue,
Plasmid M-13 Instead of TMD5, plasmid M-
Except that 13TMM2 is used.
According to the method described in Example 1- (5)-(b), an expression vector pSV2TMM2 for thrombomodulin E456NNA-114 of the present invention was constructed. (5) Thrombomodulin of the present invention (E456NNV-115) wherein (W) is Val-Asp, (X) and (Y) are both Asn, and (Z) is Val.
Construction of Expression Vector (1) A recombinant plasmid M-13TMD6 was obtained by the method described in Examples (1)-(a) of JP-A-2-255699. That is, the plasmid M-13T obtained in Example 1- (1) was obtained by a site-specific mutagenesis method using a deleter consisting of the nucleotide sequence of 1-25 of SEQ ID NO: 9.
The plasmid M from which a partial DNA fragment of MD5 has been deleted
-13 TMD6 was obtained. Subsequently, Japanese Patent Application Laid-Open No. 25569/1990
According to the method described in Example 9 (1)-(b), (W)
Is Val-Asp, and (X) and (Y) are both A
The expression vector p of the thrombomodulin (E456NNV-115) of the present invention, wherein sn and (Z) are Val
SV2TMD6 was constructed.
【００３４】（６）（Ｗ）が、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ
であり、（Ｘ）と（Ｙ）がともにＡｓｎであり、（Ｚ）
がＶａｌである本発明のトロンボモジュリン（Ｅ４５６
ＮＮＶ−１１６）の発現ベクターの構築 配列番号１０の１ー２５の塩基配列からなるデリーター
を用いること以外は、上記の実施例１ー（５）と実質的
に同様の方法により、組換え体プラスミドＭ−１３ＴＭ
Ｄ９を得、続いて、プラスミドＭ−１３ＴＭＤ９をプラ
スミドＭ−１３ＴＭＤ６の代わりに用いること以外は、
上記の実施例１ー（５）の方法により、（Ｗ）が、Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐであり、（Ｘ）と（Ｙ）がともにＡ
ｓｎであり、（Ｚ）がＶａｌである本発明のトロンボモ
ジュリン（Ｅ４５６ＮＮＶ−１１６）の発現ベクターｐ
ＳＶ２ＴＭＤ９を構築した。 （７） （Ｗ）が、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐで
あり、（Ｘ）と（Ｙ）がともにＡｓｎであり、（Ｚ）が
Ｖａｌである本発明のトロンボモジュリン（Ｅ４５６Ｎ
ＮＶ−１１７）の発現ベクターの構築 配列番号１１の１ー２５の塩基配列からなるデリーター
を用いること以外は、上記の実施例１ー（５）と実質的
に同様の方法により、組換え体プラスミドＭ−１３ＴＭ
Ｄ１０を得、続いて、プラスミドＭ−１３ＴＭＤ１０を
プラスミドＭ−１３ＴＭＤ６の代わりに用いること以外
は、上記の実施例１ー（５）の方法により、（Ｗ）が、
Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐであり、（Ｘ）と
（Ｙ）がともにＡｓｎであり、（Ｚ）がＶａｌである本
発明のトロンボモジュリン（Ｅ４５６ＮＮＶ−１１７）
の発現ベクターｐＳＶ２ＴＭＤ１０を構築した。 （８）（Ｗ）が、Ａｓｐであり、（Ｘ）がＡｓｎであ
り、（Ｙ）がＧｌｎ、またはＳｅｒ、またはＡｌａ、ま
たはＧｌｙであり、（Ｚ）がＶａｌである本発明のトロ
ンボモジュリン（Ｅ４５６ＮＱＶ−１１４、またはＥ４
５６ＮＳＶ−１１４、またはＥ４５６ＮＡＶ−１１４、
またはＥ４５６ＮＧＶ−１１４）の発現ベクターの構築 配列番号１２の１ー２１の塩基配列からなるミューテー
ターを用いること以外は、上記の実施例１ー（４）と実
質的に同様の方法により、プラスミドＭ−１３ＴＭＤ７
の一部の塩基を他の塩基に置換した組換え体プラスミド
Ｍ−１３ＴＭＭ３を得た。該プラスミドＭ−１３ＴＭＭ
３をプラスミドＭ−１３ＴＭＭ２の代わりに用いること
以外は、上記の実施例１ー（４）の方法により、（Ｗ）
が、Ａｓｐであり、（Ｘ）がＡｓｎであり、（Ｙ）がＧ
ｌｎであり、（Ｚ）がＶａｌである本発明のトロンボモ
ジュリン（Ｅ４５６ＮＱＶ−１１４）の発現ベクターｐ
ＳＶ２ＴＭＭ３を構築した。(6) (W) is Pro-Val-Asp
(X) and (Y) are both Asn, and (Z)
Is Val and the thrombomodulin of the present invention (E456)
Construction of Expression Vector of NNV-116) A recombinant plasmid was prepared in substantially the same manner as in Example 1- (5) above, except that a deleter consisting of the nucleotide sequence of 1 to 25 of SEQ ID NO: 10 was used. M-13TM
D9, and subsequently using plasmid M-13 TMD9 instead of plasmid M-13 TMD6,
According to the method of Example 1- (5) above, (W) was changed to Pr
o-Val-Asp, (X) and (Y) are both A
The expression vector p of the thrombomodulin (E456NNV-116) of the present invention, wherein the expression is
SV2TMD9 was constructed. (7) Thrombomodulin of the present invention (E456N) wherein (W) is Glu-Pro-Val-Asp, (X) and (Y) are both Asn, and (Z) is Val
Construction of expression vector of NV-117) A recombinant plasmid was prepared in substantially the same manner as in Example 1- (5) above, except that a deleter consisting of the nucleotide sequence of 1 to 25 of SEQ ID NO: 11 was used. M-13TM
According to the method of Example 1- (5) above, except that plasmid D-13 was obtained and subsequently plasmid M-13TMD10 was used instead of plasmid M-13TMD6, (W) was
Glu-Pro-Val-Asp, the thrombomodulin of the present invention (E456NNV-117) wherein (X) and (Y) are both Asn and (Z) is Val
Expression vector pSV2TMD10 was constructed. (8) The thrombomodulin of the present invention (E456NQV) wherein (W) is Asp, (X) is Asn, (Y) is Gln or Ser or Ala or Gly, and (Z) is Val. -114 or E4
56NSV-114, or E456NAV-114,
Or construction of E456NGV-114) expression vector Plasmid M was prepared in substantially the same manner as in Example 1- (4) above, except that a mutator consisting of the nucleotide sequence of 1-21 of SEQ ID NO: 12 was used. -13 TMD7
A recombinant plasmid M-13TMM3 in which a part of the base was replaced with another base was obtained. The plasmid M-13TMM
3 in place of plasmid M-13TMM2, by the method of Example 1- (4) above,
Is Asp, (X) is Asn, (Y) is G
ln and the expression vector p of the thrombomodulin (E456NQV-114) of the present invention wherein (Z) is Val
SV2TMM3 was constructed.
【００３５】上記に習い、配列番号１３の１ー２１の塩
基配列からなるミューテーター、または配列番号１４の
１ー２１の塩基配列からなるミューテーター、または配
列番号１５の１ー２１の塩基配列からなるミューテータ
ーを用いることにより、プラスミドＭ−１３ＴＭＤ７の
一部の塩基を他の塩基に置換した組換え体プラスミドＭ
−１３ＴＭＭ４、またはＭ−１３ＴＭＭ５、またはＭ−
１３ＴＭＭ６を得、続いて、本発明のトロンボモジュリ
ンＥ４５６ＮＳＶ−１１４、またはＥ４５６ＮＡＶ−１
１４、またはＥ４５６ＮＧＶ−１１４の発現ベクターｐ
ＳＶ２ＴＭＭ４、またはｐＳＶ２ＴＭＭ５、またはｐＳ
Ｖ２ＴＭＭ６を構築した。 （９）（Ｗ）が、Ａｓｐであり、（Ｘ）がＧｌｎ、また
はＳｅｒ、またはＡｌａ、またはＧｌｙであり、（Ｙ）
がＡｓｎであり、（Ｚ）がＶａｌである本発明のトロン
ボモジュリン（Ｅ４５６ＱＮＶ−１１４、またはＥ４５
６ＳＮＶ−１１４、またはＥ４５６ＡＮＶ−１１４、ま
たはＥ４５６ＧＮＶ−１１４）の発現ベクターの構築 上記の実施例１ー（８）に習い、配列番号１６の１ー２
１、または配列番号１７の１ー２１、または配列番号１
８の１ー２１、または配列番号１９の１ー２１の塩基配
列からなるミューテーターを用いて、（Ｗ）が、Ａｓｐ
であり、（Ｘ）がＧｌｎ、またはＳｅｒ、またはＡｌ
ａ、またはＧｌｙであり、（Ｙ）がＡｓｎであり、
（Ｚ）がＶａｌである本発明のトロンボモジュリン（Ｅ
４５６ＱＮＶ−１１４、またはＥ４５６ＳＮＶ−１１
４、またはＥ４５６ＡＮＶ−１１４、またはＥ４５６Ｇ
ＮＶ−１１４）の発現ベクターｐＳＶ２ＴＭＭ７、また
はｐＳＶ２ＴＭＭ８、またはｐＳＶ２ＴＭＭ９、または
ｐＳＶ２ＴＭＭ１０を構築した。 （１０）（Ｗ）が、Ａｓｐであり、（Ｘ）がＳｅｒであ
り、（Ｙ）がＧｌｙであり、（Ｚ）がＶａｌである本発
明のトロンボモジュリン（Ｅ４５６ＳＧＶ−１１４）の
発現ベクターの構築 プラスミドＭ−１３ＴＭＭ６（上記の実施例１ー（８）
で得られたもの）と配列番号１７の１ー２１の塩基配列
からなるミューテーターを用いること以外は、上記の実
施例１ー（４）と実質的に同様の方法により、組換え体
プラスミドＭ−１３ＴＭＭ１１を得、続いて上記の実施
例１ー（１）の要領で、（Ｗ）が、Ａｓｐであり、
（Ｘ）がＳｅｒであり、（Ｙ）がＧｌｙであり、（Ｚ）
がＶａｌである本発明のトロンボモジュリン（Ｅ４５６
ＳＧＶ−１１４）の発現ベクターｐＳＶ２ＴＭＭ１１を
構築した。 （１１）Ｅ４５６ＮＮＶ−１１８、またはＥ４５６ＮＮ
Ｖ−１１４、またはＥ４５６ＳＧＶ−１１４の本発明の
トロンボモジュリンを、配列番号３の１ー１６のアミノ
酸配列からなるシグナルペプチドを利用して発現そして
分泌させるための発現ベクター 配列番号２０の１ー２５の塩基配列からなるデリーター
を用いること以外は、上記の実施例１ー（３）と実質的
に同様の方法により、組換え体プラスミドＭ−１３ＳＴ
ＭＤ５を得た。該プラスミドＭ−１３ＳＴＭＤ５をプラ
スミドＭ−１３ＴＭＤ５の代わりに用いること以外は、
上記の実施例１ー（１）の方法により、本発明のトロン
ボモジュリンＥ４５６ＮＮＶ−１１８を、配列番号３の
１ー１６のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドを利
用して発現そして分泌させるための発現ベクターの発現
ベクターｐＳＶ２ＳＴＭＤ５を構築した。As described above, the mutator consisting of the nucleotide sequence 1-21 of SEQ ID NO: 13, the mutator consisting of the nucleotide sequence 1-21 of SEQ ID NO: 14, or the nucleotide sequence 1-21 of SEQ ID NO: 15 By using a mutator, a recombinant plasmid M obtained by substituting some bases of plasmid M-13 TMD7 with other bases
-13TMM4, or M-13TMM5, or M-
13 TMM6, followed by the thrombomodulin E456NSV-114 or E456NAV-1 of the invention.
14, or E456NGV-114 expression vector p
SV2TMM4, or pSV2TMM5, or pS
V2TMM6 was constructed. (9) (W) is Asp, (X) is Gln, or Ser, or Ala, or Gly, and (Y)
Is Asn and (Z) is Val (E456QNV-114 or E45).
Construction of expression vector of 6SNV-114, or E456ANV-114, or E456GNV-114) Following Example 1- (8) above, 1-2 of SEQ ID NO: 16
1, or 1-21 of SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 1
Using a mutator consisting of the nucleotide sequence 1-21-2 of No. 8 or 1-21 of SEQ ID NO: 19, (W) was converted to Asp
And (X) is Gln, or Ser, or Al
a or Gly, (Y) is Asn,
The thrombomodulin of the present invention wherein (Z) is Val (E
456QNV-114 or E456SNV-11
4, or E456ANV-114, or E456G
NV-114) expression vector pSV2TMM7, or pSV2TMM8, or pSV2TMM9, or pSV2TMM10 was constructed. (10) Construction of expression vector for thrombomodulin (E456SGV-114) of the present invention in which (W) is Asp, (X) is Ser, (Y) is Gly, and (Z) is Val M-13TMM6 (Example 1- (8) above)
) And a mutator consisting of the nucleotide sequence of 1-21 of SEQ ID NO: 17, except that a mutator consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 is used. -13 TMM11 was obtained, and then (W) was Asp as in Example 1- (1) above,
(X) is Ser, (Y) is Gly, and (Z)
Is Val and the thrombomodulin of the present invention (E456)
SGV-114) expression vector pSV2TMM11 was constructed. (11) E456NNV-118 or E456NN
An expression vector for expressing and secreting the thrombomodulin of the present invention of V-114 or E456SGV-114 by using a signal peptide consisting of the amino acid sequence of 1-16 of SEQ ID NO: 3, 1-25 bases of SEQ ID NO: 20 A recombinant plasmid M-13ST was prepared in substantially the same manner as in Example 1- (3) above except that a deleter consisting of a sequence was used.
MD5 was obtained. Except that the plasmid M-13STMD5 is used instead of the plasmid M-13TMD5,
Expression of an expression vector for expressing and secreting the thrombomodulin E456NNV-118 of the present invention using the signal peptide consisting of the amino acid sequence of 1-16 of SEQ ID NO: 3 by the method of Example 1- (1) described above. The vector pSV2STMD5 was constructed.
【００３６】上記の要領で、配列番号２１の１ー２５の
塩基配列からなるデリーターを用いること以外は、上記
の実施例１ー（４）と実質的に同じ方法により、組換え
体プラスミドＭ−１３ＳＴＭＤ７を得た。続いて、該プ
ラスミドＭ−１３ＳＴＭＤ７をプラスミドＭ−１３ＴＭ
Ｄ７の代わりに用いること以外は、上記の実施例１ー
（２）の方法により、本発明のトロンボモジュリンＥ４
５６ＮＮＶ−１１４を、配列番号３の１ー１６のアミノ
酸配列からなるシグナルペプチドを利用して発現そして
分泌させるための発現ベクターの発現ベクターｐＳＶ２
ＳＴＭ７を構築した。In the same manner as described above, except that a deleter consisting of the nucleotide sequence of 1-25 of SEQ ID NO: 21 was used, the recombinant plasmid M- 13STMD7 was obtained. Subsequently, the plasmid M-13STMD7 was replaced with the plasmid M-13TM.
Except for using it in place of D7, the method of Example 1- (2) above was used to prepare the thrombomodulin E4 of the present invention.
Expression vector pSV2 for expression and secretion of 56NNV-114 using a signal peptide consisting of the amino acid sequence of 1-16 of SEQ ID NO: 3
STM7 was constructed.
【００３７】また、上記の要領で、配列番号２１の１ー
２５の塩基配列からなるデリーターとプラスミドＭ−１
３ＴＭＭ１１を用いること以外は、上記の実施例１ー
（４）と実質的に同じ方法により、組換え体プラスミド
Ｍ−１３ＳＴＭＭ１１を得た。さらに引き続いて、該プ
ラスミドＭ−１３ＳＴＭＭ１１をプラスミドＭ−１３Ｔ
ＭＤ７の代わりに用いること以外は、上記の実施例１ー
（２）の方法に従い、本発明のトロンボモジュリンＥ４
５６ＳＧＶ−１１４を、配列番号３の１ー１６のアミノ
酸配列からなるシグナルペプチドを利用して発現そして
分泌させるための発現ベクターの発現ベクターｐＳＶ２
ＳＴＭＭ１１を構築した。In the same manner as described above, a deleter consisting of the nucleotide sequence of 1-25 of SEQ ID NO: 21 and plasmid M-1
Except for using 3TMM11, a recombinant plasmid M-13STMM11 was obtained in substantially the same manner as in Example 1- (4) above. Subsequently, the plasmid M-13STMM11 was replaced with plasmid M-13T.
The thrombomodulin E4 of the present invention was prepared according to the method of Example 1- (2) above, except that it was used instead of MD7.
Expression vector pSV2 for expressing and secreting 56SGV-114 using a signal peptide consisting of the amino acid sequence of 1-16 of SEQ ID NO: 3
STMM11 was constructed.
【００３８】[0038]
【実施例２】本発明のトロンボモジュリンの生産 （１）本発明のトロンボモジュリンのＣＯＳ−１細胞に
よる生産 実施例１ー（１）から実施例１ー（１１）で得られた、
本発明のトロンボモジュリンの発現ベクターを用い、特
開平７−１５５１７６の実施例２に記載の方法に従い、
本発明のトロンボモジュリンを生産させた。また、その
培養上澄液を一部サンプリングし、特開平７−１５５１
７６の参考例１に記載の方法で、トロンボモジュリンの
コファクター活性、すなわちトロンビンによるプロテイ
ンＣの活性化を促進する作用を測定した。Example 2 Production of thrombomodulin of the present invention (1) Production of thrombomodulin of the present invention by COS-1 cells Obtained in Examples 1- (1) to 1- (11)
Using the thrombomodulin expression vector of the present invention, according to the method described in Example 2 of JP-A-7-155176,
The thrombomodulin of the present invention was produced. Further, a part of the culture supernatant was sampled and disclosed in JP-A-7-1551.
76, the cofactor activity of thrombomodulin, ie, the effect of promoting the activation of protein C by thrombin, was measured by the method described in Reference Example 76.
【００３９】実施例１ー（１）から実施例１ー（１１）
で得られた、それぞれの発現ベクターで形質転換された
それぞれのＣＯＳ−１細胞の培養上澄液には、全て、ト
ロンボモジュリンのコファクター活性、すなわちトロン
ビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用が検出
された。このように、実施例１ー（１）から実施例１ー
（１１）で得られた発現ベクター中にコードされた、そ
れぞれの本発明のトロンボモジュリンは、それぞれの発
現ベクターで形質転換された細胞によって生産され、そ
して生産されたそれぞれの本発明のトロンボモジュリン
の全ては、トロンボモジュリンの活性、すなわちトロン
ビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有し
ていることが確認された。Examples 1- (1) to 1- (11)
In all the culture supernatants of the respective COS-1 cells transformed with the respective expression vectors obtained in the above, the cofactor activity of thrombomodulin, that is, the effect of promoting the activation of protein C by thrombin, was detected. Was done. Thus, each of the thrombomodulins of the present invention, encoded in the expression vectors obtained in Examples 1- (1) to 1- (11), depends on the cells transformed with the respective expression vectors. It was confirmed that all of the produced and produced thrombomodulins of the present invention had an activity of promoting thrombomodulin activity, ie, activation of protein C by thrombin.
【００４０】したがって、式（１）中の（Ｗ）が、Ｖａ
ｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ
−Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｖａｌ−
Ａｓｐ、またはＡｓｐのいずれかのペプチド残基または
アミノ酸残基であっても、また（Ｘ）や（Ｙ）が、互い
に異なる、又は同一の、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｌ
ａ、またはＧｌｙのいずれかのアミノ酸残基であって
も、またさらには（Ｚ）が、Ｖａｌ、またはＡｌａのい
ずれかのアミノ酸残基であっても、式（１）に記載のア
ミノ酸配列からなる本発明のトロンボモジュリンは、ト
ロンボモジュリンの活性、すなわちトロンビンによるプ
ロテインＣの活性化を促進する作用を有しているものと
判断された。 （２）本発明のトロンボモジュリンのＣＨＯ細胞による
生産 実施例１で得た発現ベクターを用い、特開平７−１５５
１７６の実施例７に記載の方法に従った。Therefore, (W) in the equation (1) becomes Va
l-Glu-Pro-Val-Asp, Glu-Pro
-Val-Asp, Pro-Val-Asp, Val-
Even if Asp or any peptide or amino acid residue of Asp, (X) or (Y) is different from or the same as Asn, Gln, Ser, Al
a or any amino acid residue of Gly, or even if (Z) is any amino acid residue of Val or Ala, the amino acid residue represented by the formula (1) Thus, the thrombomodulin of the present invention was determined to have an activity of promoting thrombomodulin, that is, an action of promoting the activation of protein C by thrombin. (2) Production of the thrombomodulin of the present invention by CHO cells. Using the expression vector obtained in Example 1,
176 The method described in Example 7 was followed.
【００４１】[0041]
【実施例３】 本発明のトロンボモジュリンの精製 実施例２で生産させた本発明のトロンボモジュリン、す
なわち本発明のトロンボモジュリンの発現ベクターでト
ランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞、または本発明のト
ロンボモジュリンの発現ベクターでトランスフォームし
たＣＨＯ細胞が生産した、培養上澄液中に存在する本発
明のトロンボモジュリンの精製は、本発明のトロンボモ
ジュリンが含まれるその培養上澄液を、ＤＩＰ−トロン
ビン−アガロースのカラムクロマトグラフィーにかけて
調製した。Example 3 Purification of Thrombomodulin of the Present Invention Transformation with the thrombomodulin of the present invention produced in Example 2, that is, COS-1 cells transfected with the expression vector of the thrombomodulin of the present invention, or with the expression vector of the thrombomodulin of the present invention. Purification of the thrombomodulin of the invention present in the culture supernatant produced by the formed CHO cells was prepared by subjecting the culture supernatant containing the thrombomodulin of the invention to DIP-thrombin-agarose column chromatography. .
【００４２】すなわち、エヌ エル・エスモン（Ｎ．
Ｌ．Ｅｓｍｏｎ）ら（ザ ジャーナルオブ バイオロジ
カル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２
５７巻、８５９頁（１９８２年））の方法に準じて作製
したＤＩＰ−トロンビン（ジイソプロピルホスホロトロ
ンビン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔ
ｈｒｏｍｂｉｎ）を、ピー クオトレカサス（Ｐ．Ｃｕ
ａｔｒｅｃａｓａｓ）の方法（ザ ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、２４５巻、３５９頁（１９７０年））に準じて
ブロムシアン化したアガロースに結合させてＤＩＰ−ト
ロンビン−アガロースを作製した。That is, N.E.S.
L. Esmon) et al. (The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 2).
57, p. 859 (1982)), DIP-thrombin (diisopropylphosphorothrombin).
rombin) is replaced by Peek Otrecasas (P. Cu
atrecasas) method (The Journal of
Biological chemistry (J. Biol. Che
m. 245, p. 359 (1970)) to produce DIP-thrombin-agarose.
【００４３】次にＤＩＰ−トロンビン−アガロースをカ
ラムに充填してＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラム
を作製して室温で０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ
塩化カルシウム、１ｍＭベンズアミジン塩酸を含む０．
０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを平衡
化した。次いで、上記の本発明のトロンボモジュリンを
含む培養上澄液をカラムに供した。カラムを０．２Ｍ塩
化ナトリウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭベン
ズアミジン塩酸を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で洗浄した後、１Ｍ塩化ナトリウム、０．１
ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭベンズアミジン塩酸を含む０．
０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出してフラ
クション化した。溶出によって得られる各フラクション
について、特開平１−６２１９の参考例１に記載の方法
で、トロンビンのプロテインＣの活性化を促進させる作
用を測定した。同時に島津製作所（日本）製スペクトロ
フォトメーターＵＶ−２４０を用いて各フラクションの
波長２８０ｎｍにおける吸収度を測定した。活性のある
画分を回収し、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ塩
化カルシウムを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で透析した。Next, DIP-thrombin-agarose was packed in a column to prepare a DIP-thrombin-agarose column, and 0.1 M sodium chloride, 0.5 mM
0.1% containing calcium chloride, 1 mM benzamidine hydrochloride.
The column was equilibrated with 02M Tris-HCl buffer (pH 7.5). Next, the culture supernatant containing the above-described thrombomodulin of the present invention was applied to a column. The column was washed with a 0.02 M Tris-HCl buffer containing 0.2 M sodium chloride, 0.5 mM calcium chloride, and 1 mM benzamidine hydrochloride (p.
H7.5), and then washed with 1M sodium chloride, 0.1M
0.1 mM containing 1 mM EDTA, 1 mM benzamidine hydrochloride.
The fraction was eluted with a 02M Tris-HCl buffer (pH 7.5). For each fraction obtained by elution, the effect of promoting the activation of protein C by thrombin was measured by the method described in Reference Example 1 of JP-A-1-6219. At the same time, the absorbance of each fraction at a wavelength of 280 nm was measured using a spectrophotometer UV-240 manufactured by Shimadzu Corporation (Japan). The active fraction was collected, and 0.02 M Tris-HCl buffer containing 0.1 M sodium chloride and 0.5 mM calcium chloride (pH
Dialysis was performed at 7.5).
【００４４】得られた透析液を２回目のＤＩＰ−トロン
ビン−アガロースカラムクロマトグラフィーに供した。
すなわち、透析液をＤＩＰ−トロンビン−アガロースカ
ラムに通し、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ塩化
カルシウムを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で洗浄後、さらに０．２Ｍ塩化ナトリウム、
０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）で洗浄し、次いで、１Ｍ塩化ナトリウ
ム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．０２Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。活性画分を回収し、
凍結乾燥して、−８０℃で凍結保存し、以下精製品とし
て用いた。この製品の分子吸光係数を一般的な蛋白質の
分子吸光係数にならい、１０．０と規定して、それに基
づき精製品の量を決定した。The dialysate obtained was subjected to a second DIP-thrombin-agarose column chromatography.
That is, the dialysate is passed through a DIP-thrombin-agarose column, and a 0.02 M Tris-HCl buffer solution (pH 0.2) containing 0.2 M sodium chloride and 0.5 mM calcium chloride is used.
7.5) After washing in), further 0.2 M sodium chloride,
The column was washed with a 0.02 M Tris-HCl buffer containing 0.5 mM EDTA (pH 7.5), and then eluted with a 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1 M sodium chloride and 0.5 mM EDTA. Collecting the active fraction,
It was freeze-dried and stored frozen at -80 ° C, and was used as a purified product below. The molecular extinction coefficient of this product was determined to be 10.0 in accordance with the molecular extinction coefficient of a general protein, and the amount of the purified product was determined based on it.
【００４５】[0045]
【実施例４】本発明のトロンボモジュリンのトロンビン
に対する親和性 本発明のトロンボモジュリンのトロンビンに対する親和
性は、本発明のトロンボモジュリンとトロンビンをいく
つかの比で存在させ、それぞれの時に形成される本発明
のトロンボモジュリン・トロンビン複合体の量を求める
ことによって調べた。本発明トロンボモジュリン・トロ
ンビン複合体の形成量は、活性化プロテインＣ生成速度
を指標として求めた。Example 4 Affinity of the Thrombomodulin of the Present Invention for Thrombin The affinity of the thrombomodulin of the present invention for thrombin was determined by allowing the thrombomodulin of the present invention and thrombin to exist in several ratios and forming the thrombomodulin of the present invention at each ratio. -Checked by determining the amount of thrombin complex. The formation amount of the thrombomodulin-thrombin complex of the present invention was determined using the activated protein C production rate as an index.
【００４６】０．１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン
（以下、ＢＳＡ）、１００ｍＭ塩化ナトリウム並びに５
ｍＭ塩化カルシウムを含むｐＨ７．４の２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（以下、緩衝液Ａ）中にて、本発明のトロン
ボモジュリンとヒト・トロンビン（ Ｓｉｇｍａ社）、
およびヒト・プロテインＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｄｉａ
ｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を混合後、直ちに３７℃で保温し
た。その混合液中には、０．６５ｎＭ ヒト・トロンビ
ン、６５ｎＭヒト・プロテインＣ、および種々の濃度の
本発明のトロンボモジュリンを含むようにした。５分、
１０分、そして２０分後、この混合液１００μｌに２０
μｌのノバスタン（アルガトロバン１０ｍｇ／２０ｍｌ
／バイアル、三菱化学）を加え３７℃で３０秒間保温
し、続いて１００μｌの５ｍＭ Ｓ−２３６６（第一化
学薬品）を含む緩衝液Ａを加え、さらに３７℃で保温し
た。１０分後５０μｌの酢酸を加え、波長４０５ｎｍの
吸光度を測定し、既知濃度の活性化ヒトプトテインＣを
用いて作成した検量線より、生成された活性化プロテイ
ンＣの濃度を求め、その生成速度を算出した。活性化プ
ロテインＣは、プロテインＣを終濃度１０Ｕ／ｍｌのＰ
ＲＯＴＡＣ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ社）で３７℃、５分
間処置することによって調製した。活性化プロテインＣ
の生成速度は、時間に比例して活性化プロテインＣ濃度
が上昇している範囲内で求めた。0.1% (W / V) bovine serum albumin (BSA), 100 mM sodium chloride and 5%
a thrombomodulin of the present invention and human thrombin (Sigma) in a 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing mM calcium chloride at pH 7.4;
And human protein C (American dia)
(gnostics) was immediately mixed and kept at 37 ° C. The mixture contained 0.65 nM human thrombin, 65 nM human protein C, and various concentrations of the thrombomodulin of the present invention. 5 minutes,
After 10 and 20 minutes, 20 μl of this mixture
μl of Novastan (Argatroban 10mg / 20ml
/ Vial, Mitsubishi Chemical) and incubated at 37 ° C. for 30 seconds, followed by addition of 100 μl of buffer A containing 5 mM S-2366 (Daiichi Pure Chemicals), and further incubation at 37 ° C. Ten minutes later, 50 μl of acetic acid was added, the absorbance at a wavelength of 405 nm was measured, and the concentration of the activated protein C generated was determined from a calibration curve prepared using activated human putein C of a known concentration, and the generation rate was calculated. did. Activated protein C is obtained by converting protein C to a final concentration of 10 U / ml P
It was prepared by treating with ROTAC (Pentapharm) at 37 ° C. for 5 minutes. Activated protein C
Was determined within a range in which the activated protein C concentration was increased in proportion to time.
【００４７】横軸には反応液中の本発明のトロンボモジ
ュリン濃度の逆数、そして縦軸にはその時における活性
化プロテインＣ生成速度の逆数をプロットし、その相関
直線が交差する横軸の点より、本発明のトロンボモジュ
リンのトロンビンに対する親和性（Ｋｄ値）を算出し
た。その結果、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１８、Ｅ４５６ＮＮ
Ｖ−１１４のトロンビンに対する親和性（Ｋｄ値）は、
それぞれ８ｎＭ、１０ｎＭであり、また、式（１）中の
（Ｗ）は、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、
Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａ
ｓｐ、Ｖａｌ−Ａｓｐ、またはＡｓｐのいずれかであっ
てもトロンビンに対する親和性には、相違はなかった。The abscissa plots the reciprocal of the thrombomodulin concentration of the present invention in the reaction mixture, and the ordinate plots the reciprocal of the activated protein C production rate at that time. From the point on the abscissa at which the correlation line intersects, The affinity (Kd value) of the thrombomodulin of the present invention for thrombin was calculated. As a result, E456NNV-118, E456NN
The affinity (Kd value) of V-114 for thrombin was
They are 8 nM and 10 nM, respectively, and (W) in the formula (1) is Val-Glu-Pro-Val-Asp,
Glu-Pro-Val-Asp, Pro-Val-A
There was no difference in affinity for thrombin whether sp, Val-Asp, or Asp.
【００４８】また、（Ｚ）がＥ４５６ＮＮＶ−１１８や
Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４とは異なる本発明のトロンボモ
ジュリン、Ｅ４５６ＮＮＡ−１１８（（Ｗ）が、Ｖａｌ
−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐであり、（Ｘ）と
（Ｙ）がともにＡｓｎであり、（Ｚ）がＡｌａである式
（１）のアミノ酸配列で表される本発明のトロンボモジ
ュリン）、並びにＥ４５６ＮＮＡ−１１４（（Ｗ）が、
Ａｓｐであり、（Ｘ）と（Ｙ）がともにＡｓｎであり、
（Ｚ）がＡｌａである式（１）のアミノ酸配列で表され
る本発明のトロンボモジュリン）のトロンビンに対する
親和性は、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１８やＥ４５６ＮＮＶ−
１１４のトロンビンに対する親和性と同程度のものであ
った。The thrombomodulin of the present invention, (Z), which differs from E456NNV-118 and E456NNV-114, E456NNA-118 ((W) is Val
-Glu-Pro-Val-Asp, (X) and (Y) are both Asn, and (Z) is Ala, the thrombomodulin of the present invention represented by the amino acid sequence of the formula (1)), and E456NNA −114 ((W)
Asp, (X) and (Y) are both Asn,
The affinity of thrombin of the present invention (thrombomodulin of the present invention represented by the amino acid sequence of the formula (1) wherein (Z) is Ala) to thrombin is determined by E456NNV-118 or E456NNV-
114 had an affinity for thrombin.
【００４９】さらには、（Ｘ）と（Ｙ）がＥ４５６ＮＮ
Ｖ−１１４とは異なる本発明のトロンボモジュリン、Ｅ
４５６ＳＧＶ−１１４（（Ｗ）が、Ａｓｐであり、
（Ｘ）がＳｅｒであり、（Ｙ）がＧｌｙであり、（Ｚ）
がＶａｌである本発明のトロンボモジュリン）のトロン
ビンに対する親和性（Ｋｄ値）は、１５ｎＭであり、そ
れは上記の本発明のトロンボモジュリンと同程度のもの
であった。Further, (X) and (Y) are E456NN
A thrombomodulin of the invention different from V-114, E
456 SGV-114 ((W) is Asp,
(X) is Ser, (Y) is Gly, and (Z)
The affinity (Kd value) for thrombin of the present invention, which is Val, is 15 nM, which is comparable to the above-mentioned thrombomodulin of the present invention.
【００５０】[0050]
【実施例５】 本発明のトロンボモジュリン・トロンビ
ン複合体のプロテインＣ活性化反応における速度論的パ
ラメーター 本発明のトロンボモジュリン（終濃度２０ｎＭ）とトロ
ンビン（終濃度２．３ｎＭ）、そしてプロテインＣ（終
濃度２〜１２μM）を混合後、直ちに３７℃で保温し
た。１、２、３、４分後（反応系内プロテインＣ濃度が
５μＭ以上の場合）もしくは１、３、５、７分後（反応
系内プロテインＣ濃度が５μＭ以下の場合）、その混合
液１０μｌに５０μｌのノバスタンを含む溶液（０．１
ｍｇ／ｍｌとなるように緩衝液Ａで希釈した）を加え３
７℃３０秒間保温し、続いて１００μｌの５ｍＭ Ｓ−
２３６６（第一化学薬品）を含む緩衝液Ａを加え、さら
に３７℃で保温した。１０分後５０μｌの酢酸を加え、
波長４０５ｎｍの吸光度を測定し、上記の実施例４と同
様にして種々のプロテインＣ濃度における時の活性化プ
ロテインＣ生成速度を算出した。Example 5 Kinetic Parameters in the Protein C Activation Reaction of the Thrombomodulin-Thrombin Complex of the Present Invention Thrombomodulin of the present invention (final concentration 20 nM), thrombin (final concentration 2.3 nM), and protein C (final concentration 2 １２12 μM), and then immediately incubated at 37 ° C. After 1, 2, 3, 4 minutes (when the concentration of protein C in the reaction system is 5 μM or more) or 1, 3, 5, 7 minutes (when the concentration of protein C in the reaction system is 5 μM or less), 10 μl of the mixed solution Solution containing 50 μl of Novastan (0.1
mg / ml).
Incubate at 7 ° C. for 30 seconds, followed by 100 μl of 5 mM S-
Buffer A containing 2366 (first chemical) was added, and the mixture was further kept at 37 ° C. After 10 minutes, 50 μl of acetic acid was added,
The absorbance at a wavelength of 405 nm was measured, and activated protein C generation rates at various protein C concentrations were calculated in the same manner as in Example 4 above.
【００５１】種々のプロテインＣ濃度（Ｓ）で求めた、
活性化プロテインＣ生成速度（Ｖ）の測定値を用い、１
／Ｓ ｖ．ｓ．１／Ｖのプロット（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅ
ｒ−Ｂｕｒｋの逆数プロット Ｓ：反応系内プロテイン
Ｃ濃度、Ｖ：活性化プロテインＣ生成速度）をし、本発
明のトロンボモジュリン・トロンビン複合体のプロテイ
ンＣ活性化反応における速度論的パラメーター、Ｋｍ値
（本発明トロンボモジュリン・トロンビン複合体のプロ
テインＣに対する親和性）および速度定数ｋｃａｔを求
めた。その結果、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４・トロンビン
複合体のプロテインＣ活性化反応における速度論的パラ
メーター、Ｋｍ値およびｋｃａｔは、それぞれ１２μ
Ｍ、３５ｍｉｎ-1であった。Determined at various protein C concentrations (S),
Using the measured value of activated protein C production rate (V), 1
/ S v. s. 1 / V plot (Lineweave
Reciprocal plot of r-Burk: S: protein C concentration in the reaction system, V: activated protein C production rate), and a kinetic parameter, Km value, in the protein C activation reaction of the thrombomodulin-thrombin complex of the present invention ( The affinity of the thrombomodulin-thrombin complex of the present invention for protein C) and the rate constant kcat were determined. As a result, the kinetic parameters, the Km value and the kcat in the protein C activation reaction of the E456NNV-114 thrombin complex were each 12 μm.
M was 35 min -1 .
【００５２】式（１）中の（Ｗ）がＥ４５６ＮＮＶ−１
１４とは異なる本発明のトロンボモジュリン、Ｅ４５６
ＮＮＶ−１１８においては、Ｋｍ値、ｋｃａｔは、１３
μＭ、４５ｍｉｎ-1であった。また、式（１）中の
（Ｘ）、（Ｙ）並びに（Ｚ）はＥ４５６ＮＮＶ−１１４
やＥ４５６ＮＮＶ−１１８と同じであり、（Ｗ）のみが
Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４やＥ４５６ＮＮＶ−１１８とは
異なる本発明のトロンボモジュリン（Ｅ４５６ＮＮＶ−
１１５、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１６、Ｅ４５６ＮＮＶ−１
１７）においても、それぞれのＫｍ値、およびｋｃａｔ
の値は、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４やＥ４５６ＮＮＶ−１
１８のＫｍ値、およびｋｃａｔの値と同程度であった。(W) in the equation (1) is E456NNV-1
Thrombomodulin of the invention different from E14, E456
In NNV-118, the Km value and kcat are 13
μM, 45 min −1 . Further, (X), (Y) and (Z) in the formula (1) are E456NNV-114.
And E456NNV-118, and only the (W) is different from E456NNV-114 or E456NNV-118 in the thrombomodulin of the present invention (E456NNV-118).
115, E456NNV-116, E456NNV-1
Also in 17), the respective Km values and kcat
Is the value of E456NNV-114 or E456NNV-1
Km values of 18 and kcat were comparable.
【００５３】さらに、式（１）中の（Ｚ）がＥ４５６Ｎ
ＮＶ−１１８やＥ４５６ＮＮＶ−１１４（（Ｚ）がＶａ
ｌ）とは異なる本発明のトロンボモジュリン、Ｅ４５６
ＮＮＡ−１１８、並びにＥ４５６ＮＮＡ−１１４
（（Ｚ）がＡｌａ）においても、それぞれのＫｍ値、及
びｋｃａｔの値は、上記の値と同程度であった。またさ
らには、式（１）中の（Ｘ）がＳｅｒであり、（Ｙ）が
Ｇｌｙである本発明のトロンボモジュリン（Ｅ４５６Ｓ
ＧＶ−１１４）のＫｍ値、ｋｃａｔは、それぞれ１５μ
Ｍ、４９ｍｉｎ-1であり、アミノ酸配列が全て天然の公
知のトロンボモジュリンと同一である本発明のトロンボ
モジュリン（Ｅ４５６ＮＮＶ−１１８、Ｅ４５６ＮＮＶ
１１４、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１５、Ｅ４５６ＮＮＶ−１
１６、およびＥ４５６ＮＮＶ−１１７）のそれと同程度
であった。Further, (Z) in the formula (1) is E456N
NV-118 or E456NNV-114 ((Z) is Va
a thrombomodulin according to the invention, different from l), E456
NNA-118 and E456NNA-114
Also in ((Z) is Ala), the respective Km values and kcat values were almost the same as the above values. Furthermore, the thrombomodulin of the present invention (E456S) wherein (X) in the formula (1) is Ser and (Y) is Gly.
The Km value and kcat of GV-114) are each 15 μm.
M, 49 min -1 , and the thrombomodulins of the present invention (E456NNV-118, E456NNV
114, E456NNV-115, E456NNV-1
16, and E456NNV-117).
【００５４】実施例４並びに実施例５で示したように、
式（１）中の（Ｗ）は、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｐｒｏ
−Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｖａｌ−Ａｓｐ、またはＡｓｐもい
ずれであっても、トロンビンに対する親和性、プロテイ
ンＣ活性化反応におけるパラメーター（Ｋｍ値やｋｃａ
ｔ）には違いはなかった。また、（Ｚ）がＶａｌ、また
はＡｌａのいずれであっても、トロンビンに対する親和
性、プロテインＣ活性化反応におけるパラメーター（Ｋ
ｍ値やｋｃａｔ）には違いはなかった。これらのことか
ら、式（１）中の（Ｗ）は、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−
Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｐ
ｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｖａｌ−Ａｓｐ、またはＡｓｐ
もいずれであっても、さらには（Ｚ）は、Ｖａｌまたは
Ａｌａのいずれであっても、本発明のトロンボモジュリ
ンの、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進す
る作用の強さは同じであることがわかった。As shown in Examples 4 and 5,
(W) in the formula (1) is Val-Glu-Pro-Va.
l-Asp, Glu-Pro-Val-Asp, Pro
Regardless of the type of Val-Asp, Val-Asp, or Asp, the affinity for thrombin and the parameters (Km value and kca
There was no difference in t). Further, regardless of whether (Z) is Val or Ala, the affinity for thrombin and the parameter (K
There was no difference in m value or kcat). From these facts, (W) in the formula (1) is Val-Glu-Pro-
Val-Asp, Glu-Pro-Val-Asp, P
ro-Val-Asp, Val-Asp, or Asp
Regardless of whether or not (Z) is Val or Ala, the thrombomodulin of the present invention may have the same effect of promoting the activation of protein C by thrombin. all right.
【００５５】さらには、（Ｘ）がＳｅｒであり、（Ｙ）
がＧｌｙである本発明のトロンボモジュリン（Ｅ４５６
ＳＧＶ−１１４）においても、アミノ酸配列が全て天然
の公知のトロンボモジュリンと同一である本発明のトロ
ンボモジュリン（Ｅ４５６ＮＮＶ−１１８やＥ４５６Ｎ
ＮＶ１１４など）と同様に、トロンビンによるプロテイ
ンＣの活性化を促進する作用を有し、その作用の程度は
同等なものであることがわかった。Further, (X) is Ser, and (Y)
Is Gly (E456
SGV-114), the thrombomodulins of the present invention (E456NNV-118 and E456N) whose amino acid sequences are all identical to natural known thrombomodulins.
Like NV114), it has an action to promote the activation of protein C by thrombin, and the degree of the action was found to be equivalent.
【００５６】[0056]
【実施例６】本発明のトロンボモジュリンの血液体外循
環モデルにおける効果 ペントバルビタール麻酔下（２５ｍｇ／ｋｇ 静脈内投
与）のカニクイザル（体重３−５ｋｇ）の外頸動静脈に
カニューレを挿入し、動物用ダイアライザー（ＭＣＡ−
０．０５Ｌ、膜面積０．０５ｍ2 、泉工医科工業
（株））を組み込んだ血液回路（プライミング容量約２
５ｍｌ、泉工医科工業（株））に接続した。血液体外循
環は、ポンプを用い頸動脈より血液を毎分１５ｍｌの速
度で導き、ダイアライザーを経て、頸静脈へ返血した。
透析液にはキンダリー液ＡＦ−２号（扶桑薬品）を用
い、毎分５０ｍｌの速度で循環した。透析時間は１２０
分間とした。Example 6 Effect of Thrombomodulin of the Present Invention in Blood Extracorporeal Circulation Model A cannula was inserted into an external jugular artery and vein of a cynomolgus monkey (body weight 3-5 kg) under pentobarbital anesthesia (intravenous administration of 25 mg / kg), and an animal dialyzer ( MCA-
Blood circuit (priming capacity approx. 2 liters) incorporating 0.05L, membrane area 0.05m 2 , Izumi Kogyo Kogyo Co., Ltd.
5 ml, Izumi Kogyo Kogyo Co., Ltd.). For extracorporeal blood circulation, blood was guided from the carotid artery at a rate of 15 ml / min using a pump, and returned to the jugular vein via a dialyzer.
The dialysate was circulated at a rate of 50 ml / min using Kinderly AF-2 (Fuso Pharmaceutical). Dialysis time is 120
Minutes.
【００５７】本発明のトロンボモジュリンは、体外循環
開始直前に、血液回路の頸動脈に近い箇所より回路内へ
投与し、引き続いて血液体外循環中は同箇所より回路内
に持続投与し、回路内循環中の血液の凝固時間（活性化
部分トロンボプラスチン時間、以下ＡＰＴＴと略す）
が、血液体外循環開始前のカニクイザル体内血液のＡＰ
ＴＴの１５０％前後となるようにした。通常のトロンボ
モジュリン（ドメイン１、ドメイン２、およびドメイン
３からなるトロンボモジュリン）についても、血液体外
循環中における回路内循環中の血液のＡＰＴＴが、血液
体外循環開始前の１５０％前後となるように回路内に投
与した。本発明のトロンボモジュリン、および通常のト
ロンボモジュリンの回路内の血液凝固防止効果をみるた
めに、血液体外循環中の回路内圧を測定した。The thrombomodulin of the present invention is administered immediately before the start of extracorporeal circulation into the circuit from a location near the carotid artery of the blood circuit, and then continuously administered into the circuit from the same location during extracorporeal blood circulation. Coagulation time of blood in the cell (activated partial thromboplastin time, abbreviated as APTT)
Is the AP of cynomolgus monkey blood prior to the start of extracorporeal blood circulation
It was set to be about 150% of TT. Also for normal thrombomodulin (thrombomodulin composed of domain 1, domain 2 and domain 3), the APTT of blood in the circuit during extracorporeal blood circulation is set to be around 150% before the start of extracorporeal blood circulation. Was administered. In order to examine the blood coagulation-preventing effect of the thrombomodulin of the present invention and ordinary thrombomodulin in the circuit, the pressure in the circuit during extracorporeal blood circulation was measured.
【００５８】血液体外循環開始前のカニクイザル体内血
液のＡＰＴＴを測定するための血液は、大腿静脈より、
そして血液体外循環中における回路内循環中の血液のＡ
ＰＴＴを測定するための血液は、ダイアライザー通過後
の血液回路部位（頸静脈へ返血する手前に位置するとこ
ろ）より採血した。採血した血液は９分の１量の３．８
％クエン酸ナトリウムと混合し、続いて遠心により血漿
を得、その血漿を用い、ＡＰＴＴを測定した。また、血
液体外循環終了後においても、カニクイザルの大腿静脈
より採血し、体外循環終了後のカニクイザル体内血液の
ＡＰＴＴを調べた。ＡＰＴＴは、体外診断用医薬品デー
タファイ・ＡＰＴＴ（国際試薬（株））を用い、添付の
操作方法に準じて測定した。Blood for measuring the APTT of cynomolgus monkey internal blood before the start of extracorporeal blood circulation was obtained from the femoral vein through the femoral vein.
A of blood in the circuit circulation during extracorporeal blood circulation
Blood for measuring PTT was collected from the blood circuit site after passing through the dialyzer (located before returning to the jugular vein). The collected blood was 1/9 of 3.8
% Sodium citrate, followed by centrifugation to obtain plasma, which was used to measure APTT. In addition, even after the end of extracorporeal blood circulation, blood was collected from the femoral vein of cynomolgus monkeys, and the APTT of cynomolgus monkey internal blood after the end of extracorporeal circulation was examined. APTT was measured using in vitro diagnostic drug data file APTT (International Reagents Co., Ltd.) according to the attached operation method.
【００５９】本試験に用いた、本発明のトロンボモジュ
リン、及び上記の通常のトロンボモジュリンは、特開平
１ー６２１９に記載の方法、または本願の実施例３に示
した方法により、それぞれの形質転換細胞の培養上澄液
より精製した。通常のトロンボモジュリンは、血液体外
循環中の回路内圧の上昇を抑制した（図２）。しかしな
がら、その終了後６０分においても、カニクイザル体内
血液の凝固時間（ＡＰＴＴ）の延長が見られた（図
３）。このように、通常のトロンボモジュリンを用いた
場合、体外循環終了後も長く、血液中には、その血液凝
固抑制活性が残存しており、したがって、通常のトロン
ボモジュリンを血液体外循環回路の血液凝固防止に用い
た場合には、出血の注意を必要としなければならないと
考えられた。一方、本発明のトロンボモジュリン、Ｅ４
５６ＮＮＶ−１１４またはＥ４５６ＮＮＶ−１１８を用
いた場合、血液体外循環中の回路内圧の上昇を抑制し
（図２）、そして体外循環終了３０分後のカニクイザル
体内血液の凝固時間（ＡＰＴＴ）は、すでに体外循環開
始前のレベル（基礎値）に回復していた（図３）。The thrombomodulin of the present invention and the above-mentioned ordinary thrombomodulin used in this test were prepared by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-6219 or the method described in Example 3 of the present application. Purified from the culture supernatant. Ordinary thrombomodulin suppressed an increase in circuit pressure during extracorporeal blood circulation (FIG. 2). However, even after 60 minutes, the coagulation time (APTT) of cynomolgus monkey blood was prolonged (FIG. 3). As described above, when normal thrombomodulin is used, it is long after the end of extracorporeal circulation, and its blood coagulation inhibitory activity remains in the blood.Therefore, normal thrombomodulin is used for preventing blood coagulation in the blood extracorporeal circuit. If used, it was considered that bleeding attention should be required. On the other hand, the thrombomodulin of the present invention, E4
When 56NNV-114 or E456NNV-118 was used, the increase in intra-circuit pressure during extracorporeal blood circulation was suppressed (FIG. 2), and the coagulation time (APTT) of the cynomolgus monkey internal blood 30 minutes after the end of extracorporeal circulation was already determined. The level had returned to the level before the start of circulation (basal value) (FIG. 3).
【００６０】式（１）中の（Ｚ）が、上記のＥ４５６Ｎ
ＮＶ−１１４やＥ４５６ＮＮＶ−１１８とは異なる本発
明のトロンボモジュリン、Ｅ４５６ＮＮＡ−１１４、ま
たはＥ４５６ＮＮＡ−１１８を用いた場合においても、
Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４やＥ４５６ＮＮＶ−１１８と同
様に血液体外循環中の回路内圧の上昇を抑制した。そし
て、図４に示すように、Ｅ４５６ＮＮＡ−１１４、また
はＥ４５６ＮＮＡ−１１８を用いた体外循環において
も、サル体内血液の凝固時間（ＡＰＴＴ）は、体外循環
終了３０分後ですでに体外循環開始前のレベル（基礎
値）に回復していた。(Z) in the formula (1) is the same as E456N
Even when using the thrombomodulin of the present invention, E456NNA-114, or E456NNA-118 different from NV-114 or E456NNV-118,
Like E456NNV-114 and E456NNV-118, the increase in circuit pressure during extracorporeal blood circulation was suppressed. As shown in FIG. 4, in extracorporeal circulation using E456NNA-114 or E456NNA-118, the coagulation time (APTT) of blood in the monkey body was 30 minutes after the end of extracorporeal circulation and before the start of extracorporeal circulation. Had recovered to the level (base value).
【００６１】このように、本発明のトロンボモジュリン
は、血液体外循環回路内の血液凝固を効果的に防止し、
そして体外循環終了後の止血の処置や注意が、通常のト
ロンボモジュリンよりも少ないことがわかった。As described above, the thrombomodulin of the present invention effectively prevents blood coagulation in the extracorporeal blood circulation circuit,
And it was found that the treatment and attention of hemostasis after the end of extracorporeal circulation were less than that of normal thrombomodulin.
【００６２】[0062]
【実施例７】 本発明のトロンボモジュリンの静脈内投
与後の血中濃度推移 （１）カニイクザルにおける血中濃度推移 無麻酔下のカニクイザル（体重２．５−３．５ｋｇ）の
後肢小伏在静脈内に本発明のトロンボモジュリン、また
は通常のトロンボモジュリン（１００ｍＭ塩化ナトリウ
ムを含むｐＨ７．４の２０ｍＭリン酸緩衝液で０．５ｍ
ｇ／ｍｌに調製した）を０．１ｍｇ／ｋｇ単回投与し
た。投与後、図（図５）中に示した時間に、後肢小伏在
静脈もしくは大腿静脈より採血した。血液は９分の１量
の３．８％クエン酸ナトリウムと混合し、続いて遠心に
より血漿を得、血漿中の本発明のトロンボモジュリン、
または通常のトロンボモジュリンの濃度を測定した。 （２）ラットにおける血中濃度推移 麻酔下のラット（ＳＤ系、雄、体重１８０−２５０ｇ）
の尾静脈内に本発明のトロンボモジュリン（生理食塩水
で０．１ｍｇ／ｍｌに濃度調製した）を０．１ｍｇ／ｋ
ｇ単回投与した。投与後２、５、１５、３０、６０分
に、頸静脈よりヘパリン採血した。ヘパリン添加血は遠
心し、血漿を得、血漿中の本発明のトロンボモジュリン
の濃度を測定した。Example 7 Changes in Blood Concentration after Intravenous Administration of Thrombomodulin of the Present Invention (1) Changes in Blood Concentration in Cynomolgus Monkeys In anaesthetized cynomolgus monkeys (body weight 2.5-3.5 kg), in the small saphenous vein of hind legs The thrombomodulin of the present invention or ordinary thrombomodulin (0.5 mM with 20 mM phosphate buffer of pH 7.4 containing 100 mM sodium chloride)
g / ml) was administered in a single dose of 0.1 mg / kg. After administration, blood was collected from the hind limb saphenous vein or femoral vein at the times shown in FIG. 5 (FIG. 5). The blood is mixed with one-ninth volume of 3.8% sodium citrate, followed by centrifugation to obtain plasma, the thrombomodulin of the invention in plasma,
Alternatively, the concentration of normal thrombomodulin was measured. (2) Changes in blood concentration in rats Rats under anesthesia (SD strain, male, weight 180-250g)
0.1 mg / k of the thrombomodulin of the present invention (concentration adjusted to 0.1 mg / ml with physiological saline) in the tail vein of
g was administered once. Heparin blood was collected from the jugular vein at 2, 5, 15, 30, and 60 minutes after administration. Heparinized blood was centrifuged to obtain plasma, and the concentration of the thrombomodulin of the present invention in the plasma was measured.
【００６３】血漿中の本発明のトロンボモジュリン、ま
たは通常のトロンボモジュリンの濃度は、エンザイムイ
ンムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。ＥＬＩ
ＳＡは、特開平５ー２１３９９８の実施例１ー（４）に
記載の方法に準じて行った。投与前のカニクイザル、ま
たはラット血漿中には、本発明のトロンボモジュリン、
または通常のトロンボモジュリンは検出されなかった。The concentration of the thrombomodulin of the present invention in plasma, or normal thrombomodulin, was measured by enzyme immunoassay (ELISA). ELI
SA was carried out according to the method described in Example 1- (4) of JP-A-5-213998. The cynomolgus monkey or rat plasma before administration contains the thrombomodulin of the present invention,
Or, normal thrombomodulin was not detected.
【００６４】図５には、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４、また
は通常トロンボモジュリンをカニクイザル静脈内に投与
した後の血中濃度推移を示した。通常トロンボモジュリ
ンは、血液中からの消失が遅いのに対して、Ｅ４５６Ｎ
ＮＶ−１１４は、血液中から速やかに消失された。最初
の採血時点（投与２分後）での血中濃度からその半分に
低下するまでの時間は、通常のトロンボモジュリンで
は、約４時間であるのに対して、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１
４では、約１０分であった。尚、通常のトロンボモジュ
リンのカニクイザルにおける上記の結果は、以前に報告
されているラットにおける結果と同様であった（Ｔｈｒ
ｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，６７，３６６−３７０，１
９９２）。FIG. 5 shows the time course of blood concentration after intravenous administration of E456NNV-114 or normal thrombomodulin to cynomolgus monkeys. Usually, thrombomodulin is slowly cleared from the blood, whereas E456N
NV-114 was rapidly eliminated from the blood. The time required for the blood concentration at the time of the first blood collection (two minutes after administration) to decrease to half of the blood concentration is about 4 hours for ordinary thrombomodulin, whereas that for E456NNV-11
In No. 4, it took about 10 minutes. It should be noted that the above results in normal thrombomodulin in cynomolgus monkeys were similar to those previously reported in rats (Thr.
omb. Haemost. , 67, 366-370, 1
992).
【００６５】Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４は、図５で示した
カニクイザルにおける結果と同様に、ラットにおいても
血中から速やかに消失された（図６）。また、式（１）
中の（Ｗ）が、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４とは異なる本発
明のトロンボモジュリン、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１８もま
た、同様に血中からの消失が速かった（図６）。さらに
は、式（１）中の（Ｘ）並びに（Ｙ）のアミノ酸が、Ｅ
４５６ＮＮＶ−１１４とは異なる本発明のトロンボモジ
ュリン、Ｅ４５６ＳＧＶ−１１４もまた、血中からの消
失が速かった（図６）。Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４、Ｅ４
５６ＮＮＶ−１１８、そしてＥ４５６ＳＧＶ−１１４の
すべては、ラット血中より速やかに消失し、最初の採血
時点（投与２分後）での血中濃度からその半分に低下す
るまでの時間は、６−８分の間にあった。E456NNV-114 was rapidly eliminated from the blood of rats as in the case of cynomolgus monkeys shown in FIG. 5 (FIG. 6). Equation (1)
In (W), the thrombomodulin of the present invention, E456NNV-118, which is different from E456NNV-114, also rapidly disappeared from the blood (FIG. 6). Furthermore, the amino acids of (X) and (Y) in the formula (1)
The thrombomodulin of the present invention, E456SGV-114, which is different from 456NNV-114, also rapidly disappeared from the blood (FIG. 6). E456NNV-114, E4
All of 56NNV-118 and E456SGV-114 disappeared more rapidly than in the blood of rats, and the time required to decrease from the blood concentration at the time of the first blood sampling (2 minutes after administration) to half of that was 6-8. Was in a minute.
【００６６】またさらには、式（１）中の（Ｚ）が、Ｅ
４５６ＮＮＶ−１１４やＥ４５６ＮＮＶ−１１８とは異
なる本発明のトロンボモジュリン、Ｅ４５６ＮＮＡ−１
１４やＥ４５６ＮＮＡ−１１８においても、ラット血中
より速やかに消失し、最初の採血時点（投与２分後）で
の血中濃度からその半分に低下するまでの時間は、６−
８分の間にあった。Further, (Z) in the equation (1) is expressed by E
Thrombomodulin of the present invention, which is different from E456NNV-114 and E456NNV-118, E456NNA-1
14 and E456NNA-118 also disappeared more rapidly than in the blood of rats, and the time required for the blood concentration at the time of the first blood sampling (2 minutes after administration) to drop to half of the blood concentration was 6-
It was during 8 minutes.
【００６７】このように、本発明のトロンボモジュリン
は、通常のトロンボモジュリン（ドメイン１、ドメイン
２およびドメイン３からなるトロンボモジュリン）とは
異なり、血中からの消失がはやい性質を有していた。そ
して、式（１）中の（Ｗ）、（Ｘ）、（Ｙ）、および
（Ｚ）が、本願に記載したペプチド、またはアミノ酸の
いずれであっても、式（１）で表されるアミノ酸配列か
らなる本発明のトロンボモジュリンは、血中からの消失
がはやい性質を有するものと考えられた。Thus, unlike the normal thrombomodulin (thrombomodulin composed of domain 1, domain 2 and domain 3), the thrombomodulin of the present invention had a property of rapidly disappearing from the blood. And, even if (W), (X), (Y) and (Z) in the formula (1) are any of the peptides or amino acids described in the present application, the amino acid represented by the formula (1) The thrombomodulin of the present invention consisting of a sequence was considered to have a property of rapidly disappearing from the blood.
【００６８】[0068]
【実施例８】 本発明のトロンボモジュリンの線溶系に
及ぼす影響 組織プラスミノーゲンアクチベーター（以下、ｔ−Ｐ
Ａ）のフィブリンクロット溶解に及ぼす影響は、以下の
ようにして調べた。すなわち、ヒト乏血小板血漿を０．
１５Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．３の２０ｍＭＨＥ
ＰＥＳ緩衝液（以下、ＨＢＳ）で３．２倍に希釈した血
漿希釈液を９６穴マイクロプレートの各ウエルに１６０
μｌずつ分注し、さらに本発明のトロンボモジュリン、
または通常のトロンボモジュリン（ドメイン１、ドメイ
ン２およびドメイン３からなるトロンボモジュリン）を
含む溶液（０．１％ＢＳＡを含むＨＢＳで濃度調製し
た。）２０μｌを加えて混合した。３７℃で２−３分保
温後、ｔ−ＰＡと塩化カルシウムを含む溶液、２０μｌ
を加えて混合した（ｔ−ＰＡと塩化カルシウムの終濃度
は、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｍＭである）。そ
の混合液は、３７℃で保温し、同時にマイクロプレート
リーダーＭ−Ｔｍａｘを用い、各ウエルの波長４０５ｎ
ｍの吸光度を、１分毎に１２０分間測定した。Example 8 Effect of thrombomodulin of the present invention on fibrinolytic system Tissue plasminogen activator (hereinafter referred to as tP
The effect of A) on the dissolution of fibrin clot was examined as follows. That is, human platelet poor plasma was added to 0.
20 mM HE at pH 7.3 with 15 M sodium chloride
A plasma diluent 3.2-fold diluted with PES buffer (hereinafter, HBS) was added to each well of a 96-well microplate by 160
of the thrombomodulin of the present invention,
Alternatively, 20 μl of a solution containing normal thrombomodulin (thrombomodulin composed of domain 1, domain 2 and domain 3) (concentration adjusted with HBS containing 0.1% BSA) was added and mixed. After keeping it at 37 ° C for 2-3 minutes, a solution containing t-PA and calcium chloride, 20 µl
(The final concentrations of t-PA and calcium chloride are 100 ng / ml and 10 mM, respectively). The mixture was kept at 37 ° C., and simultaneously, using a microplate reader M-Tmax, the wavelength of each well was set at 405 n.
m was measured every minute for 120 minutes.
【００６９】吸光度ははじめフィブリンクロットの形成
に伴って上昇し、その後、ｔ−ＰＡの存在によりフィブ
リンクロットは溶解されるため、吸光度は低下する。図
７には、フィブリンクロット形成後からクロットが完全
に溶解するまでの時間、すなわち吸光度が最大を示した
時点から吸光度が基礎値（測定開始直後の吸光度）まで
に低下するまでの時間について、本発明のトロンボモジ
ュリン（Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４）、または通常のトロ
ンボモジュリンの各々の濃度における結果を示した。Ｅ
４５６ＮＮＶ−１１４は、通常のトロンボモジュリンで
みられる、ｔ−ＰＡによるフィブリン溶解を阻害する作
用が欠如していた（図７）。The absorbance initially increases with the formation of the fibrin clot, and thereafter decreases because the fibrin clot is dissolved by the presence of t-PA. FIG. 7 shows the time from the formation of the fibrin clot to the complete dissolution of the clot, that is, the time from when the absorbance showed the maximum to when the absorbance decreased to the basal value (absorbance immediately after the start of measurement). The results at the respective concentrations of the thrombomodulin of the invention (E456NNV-114) or normal thrombomodulin are shown. E
456NNV-114 lacked the inhibitory effect of normal thrombomodulin on fibrinolysis by t-PA (FIG. 7).
【００７０】また、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１８、Ｅ４５６
ＮＮＡ−１１４、Ｅ４５６ＮＮＡ−１１８、Ｅ４５６Ｓ
ＧＶ−１１４についても試験したところ、Ｅ４５６ＮＮ
Ｖ−１１４と同様にｔ−ＰＡによるフィブリン溶解を阻
害する作用が欠如していた（図８）。このように、本発
明のトロンボモジュリンは、通常のトロンボモジュリン
（ドメイン１、ドメイン２およびドメイン３からなるト
ロンボモジュリン）とは異なり、ｔ−ＰＡによるフィブ
リン溶解を阻害する作用が欠如している、すなわち線溶
阻害作用が欠如しているという性質を有していることが
わかった。そして、式（１）中の（Ｗ）、（Ｘ）、
（Ｙ）、および（Ｚ）が、本願に記載したペプチド、ま
たはアミノ酸のいずれであっても、式（１）で表される
アミノ酸配列からなる本発明のトロンボモジュリンは、
線溶阻害作用が欠如しているものと考えられた。Further, E456NNV-118, E456
NNA-114, E456NNA-118, E456S
When GV-114 was also tested, E456NN
Like V-114, it lacked the effect of inhibiting fibrinolysis by t-PA (FIG. 8). Thus, unlike the normal thrombomodulin (thrombomodulin composed of domain 1, domain 2 and domain 3), the thrombomodulin of the present invention lacks the effect of inhibiting fibrinolysis by t-PA, ie, fibrinolysis inhibition. It was found to have the property of lacking action. Then, (W), (X),
Regardless of whether (Y) and (Z) are any of the peptides or amino acids described in the present application, the thrombomodulin of the present invention comprising the amino acid sequence represented by the formula (1)
It was considered that the fibrinolytic inhibitory action was lacking.
【００７１】[0071]
【実施例９】 本発明のトロンボモジュリン断片物の急
性毒性 本発明のトロンボモジュリンの急性毒性を調べた。各群
３匹の雄性ＳＤラット（５週令）を用いて、Ｅ４５６Ｎ
ＮＶ−１１４を９０ｍｇ／ｋｇ、１８０ｍｇ／ｋｇの用
量にて静脈内投与し、１４日後までの観察を行ったが、
毒性や死亡例は１例も認められなかった。また、Ｅ４５
６ＮＮＶ−１１８、Ｅ４５６ＮＮＡ−１１４、Ｅ４５６
ＮＮＡ−１１８、Ｅ４５６ＳＧＶ−１１４についても試
験したところ、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４と同様に、毒性
や死亡例は１例も認められなかった。Example 9 Acute toxicity of the thrombomodulin fragment of the present invention The acute toxicity of the thrombomodulin of the present invention was examined. Using three male SD rats (5 weeks old) in each group, E456N
NV-114 was administered intravenously at a dose of 90 mg / kg and 180 mg / kg, and observation was performed up to 14 days later.
No toxicity or death was observed. Also, E45
6NNV-118, E456NNA-114, E456
When NNA-118 and E456SGV-114 were also tested, as in E456NNV-114, no toxicity or death cases were found.
【００７２】したがって、本発明のトロンボモジュリン
は、毒性のない、安全性の高いものであることが確認さ
れた。Therefore, it was confirmed that the thrombomodulin of the present invention is non-toxic and highly safe.
【００７３】[0073]
【実施例１０】 本発明のトロンボモジュリンの抗原性
試験 Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４の免疫原性を調べた。カニクイ
ザル（雄性、体重約３．５ｋｇ）を用いて、Ｅ４５６Ｎ
Ｎ−１１４を０．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇの用量に
て、一日一回、２週間、０．６６ｍｌ／ｋｇ／ｈｒの投
与速度で３時間静脈内持続投与した（各投与群２匹）。
投与開始前、投与開始６、１３日目、２週間の連投終了
後６、１３日目に採血し、血清を得、その血清は抗体価
測定用に供した。その結果、抗体産出能は陰性であっ
た。Example 10 Antigenicity test of thrombomodulin of the present invention The immunogenicity of E456NNV-114 was examined. Using a cynomolgus monkey (male, about 3.5 kg in weight), E456N
N-114 was continuously administered intravenously at a dose of 0.5 mg / kg and 5 mg / kg once a day for 2 weeks at a dose rate of 0.66 ml / kg / hr for 3 hours (two animals in each administration group). ).
Before the start of administration, on the 6th and 13th days after the start of the administration, blood was collected on the 6th and 13th days after the end of continuous administration for 2 weeks, and serum was obtained. The serum was used for antibody titer measurement. As a result, the antibody production ability was negative.
【００７４】したがって、本発明のトロンボモジュリン
には、抗原性はないことが確認された。Therefore, it was confirmed that the thrombomodulin of the present invention has no antigenicity.
【００７５】[0075]
【実施例１１】 本発明のトロンボモジュリンのラット
血中脂質レベルに及ぼす影響 本発明のトロンボモジュリン、またはフラグミン（フラ
グミンは、血液透析時の回路内の血液凝固防止のため
に、臨床的に用いられている低分子ヘパリンである。一
般名：ダルテパリンナトリウム）を、麻酔下のラットに
静脈内投与した。投与前、投与後５、１０、３０分に、
ラットの静脈より採血し、血中のトリグリセライド（Ｔ
Ｇ）、並びに遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を測定した。ＴＧ、
並びにＦＦＡの測定は、それぞれ体外診断用医薬品アナ
ソルブＴＧー２（第一化学薬品（株））、体外診断用医
薬品アナソルブＮＥＦＡ（第一化学薬品（株））を用い
て行った。本発明のトロンボモジュリン、またはフラグ
ミン投与後のラット血中ＴＧ、およびＦＦＡレベルの変
化は、投与前の血中ＴＧ、およびＦＦＡレベルを１００
％として表示した。Example 11 Influence of Thrombomodulin of the Present Invention on Lipid Levels in Rat Blood Thrombomodulin of the present invention or fragmin (fragmin is used clinically to prevent blood coagulation in a circuit during hemodialysis. Low molecular weight heparin (generic name: dalteparin sodium) was intravenously administered to anesthetized rats. Before administration, 5, 10, 30 minutes after administration,
Blood is collected from the vein of the rat, and triglyceride (T
G), as well as free fatty acids (FFA). TG,
In addition, the measurement of FFA was performed using an in vitro diagnostic drug Anasolve TG-2 (Daiichi Pure Chemical Co., Ltd.) and an in vitro diagnostic drug Anasolve NEFA (Daiichi Pure Chemical Co., Ltd.), respectively. Changes in rat blood TG and FFA levels after administration of the thrombomodulin or fragmin of the present invention were determined by reducing blood TG and FFA levels before administration by 100%.
%.
【００７６】図９、および図１０に示すように、フラグ
ミン（２０単位／ｋｇ）の投与は、ラット血中のＴＧを
低下させ、ＦＦＡを上昇させた。尚、フラグミンの投与
量２０単位／ｋｇは、１回の血液透析に使用される量の
約３分の１に相当するものである。一方、Ｅ４５６ＮＮ
Ｖ−１１４は、実施例６の体外循環モデルにおいて回路
内血液凝固を防止できた量よりも多い量（１ｍｇ／ｋ
ｇ）を投与しても、ラット血中のＴＧ、並びにＦＦＡの
レベルに全く影響を及ぼさなかった。As shown in FIGS. 9 and 10, administration of fragmin (20 units / kg) decreased TG in rat blood and increased FFA. In addition, the dose of 20 units / kg of fragmin corresponds to about one third of the amount used for one hemodialysis. On the other hand, E456NN
V-114 was in an amount (1 mg / k) larger than the amount that could prevent blood coagulation in the circuit in the extracorporeal circulation model of Example 6.
Administration of g) had no effect on the levels of TG in rat blood, as well as FFA.
【００７７】したがって、本発明のトロンボモジュリン
は、既存薬であるフラグミンとは異なり、血中の脂質レ
ベルに何ら影響をもたらさないことが確認できた。Thus, it was confirmed that the thrombomodulin of the present invention did not affect blood lipid levels at all, unlike the existing drug fragmin.
【００７８】[0078]
【実施例１２】 組成例 塩化ナトリウム８．７８ｍｇ／ｍｌおよびリン酸二水素
ナトリウム２．４０ｍｇ／ｍｌを含有する水溶液のｐＨ
を水酸化ナトリウムにてｐＨ７．３とし、この水溶液に
て、精製した本発明トロンボモジュリンを溶解し（トロ
ンボモジュリンとして３．３５ｍｇ／ｍｌ）、本発明の
組成物（溶液）を調製した。Example 12 Composition Example pH of an aqueous solution containing 8.78 mg / ml of sodium chloride and 2.40 mg / ml of sodium dihydrogen phosphate
Was adjusted to pH 7.3 with sodium hydroxide, and the purified thrombomodulin of the present invention was dissolved in this aqueous solution (3.35 mg / ml as thrombomodulin) to prepare a composition (solution) of the present invention.
【００７９】上記の本発明のトロンボモジュリンを含有
する組成物は、投与前に、生理食塩水にて、本発明トロ
ンボモジュリン１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、例えば透
析においては、透析開始直前に、体外循環回路内へ、３
ｍｇ（トロンボモジュリン量として）を一括投与し、引
き続いて透析施行中に、２ｍｇ／ｈｒ（トロンボモジュ
リン量として）の持続注入を行う。The above-mentioned composition containing the thrombomodulin of the present invention is diluted with physiological saline to a concentration of 1 mg / ml of the thrombomodulin of the present invention before administration. Into the circuit, 3
mg (as thrombomodulin amount) is administered in a lump, followed by a continuous infusion of 2 mg / hr (as thrombomodulin amount) during dialysis.
【００８０】[0080]
【効果】本発明により、有効であって安全性の高い血液
体外循環回路用の血液凝固防止のための医薬組成物を提
供できる。According to the present invention, a pharmaceutical composition for preventing blood coagulation for an extracorporeal blood circulation circuit which is effective and highly safe can be provided.
【図１】 図１は、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４・トロンビ
ン複合体のプロテインＣ活性化反応の速度論的解析の結
果（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋの逆数プロット）
を示す図である。図中のＳは、反応系内プロテインＣ濃
度を、Ｖは活性化プロテインＣ生成速度を示す。FIG. 1 shows the results of kinetic analysis of the protein C activation reaction of the E456NNV-114 / thrombin complex (Lineweaver-Burk reciprocal plot).
FIG. S in the figure indicates the protein C concentration in the reaction system, and V indicates the activated protein C generation rate.
【図２】 図２は、通常のトロンボモジュリン、Ｅ４５
６ＮＮＶ−１１４、並びにＥ４５６ＮＮＶ−１１８を用
いた時における、血液体外循環中の体外回路内圧の推移
を示した図である。FIG. 2 shows that normal thrombomodulin, E45.
It is a figure showing transition of the extracorporeal circuit internal pressure during extracorporeal blood circulation when 6NNV-114 and E456NNV-118 were used.
【図３】 図３は、通常のトロンボモジュリン、Ｅ４５
６ＮＮＶ−１１４、並びにＥ４５６ＮＮＶ−１１８を用
いた血液体外循環中の回路内血液のＡＰＴＴ延長率、並
びに体外循環終了後のカニクイザル体内血液のＡＰＴＴ
延長率を示した結果である。FIG. 3 shows normal thrombomodulin, E45.
APTT elongation rate of blood in the circuit during extracorporeal circulation using 6NNV-114 and E456NNV-118, and APTT of cynomolgus monkey internal blood after termination of extracorporeal circulation
It is the result which showed the extension rate.
【図４】 図４は、Ｅ４５６ＮＮＡ−１１４、並びにＥ
４５６ＮＮＡ−１１８を用いた血液体外循環中の回路内
血液のＡＰＴＴ延長率、並びに体外循環終了後のカニク
イザル体内血液のＡＰＴＴ延長率を示した結果である。FIG. 4 shows E456NNA-114 and E456NNA-114.
It is the result which showed the APTT elongation rate of the blood in a circuit in the extracorporeal blood circulation using 456NNA-118, and the APTT elongation rate of the cynomolgus monkey internal blood after the end of extracorporeal circulation.
【図５】 図５は、通常のトロンボモジュリン、並びに
Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４投与後のカニクイザル血中濃度
推移を示した結果である。FIG. 5 shows the results of changes in cynomolgus monkey blood levels after administration of normal thrombomodulin and E456NNV-114.
【図６】 図６は、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４、Ｅ４５６
ＮＮＶ−１１８、並びにＥ４５６ＳＧＶ−１１４投与後
のラット血中濃度推移を示した結果である。FIG. 6 shows E456NNV-114, E456
It is the result which showed the rat blood concentration transition after NNV-118 and E456SGV-114 administration.
【図７】 図７は、通常のトロンボモジュリン、並びに
Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４のｔ−ＰＡによるフィブリン溶
解に及ぼす影響を調べた結果である。FIG. 7 shows the results of examining the effects of normal thrombomodulin and E456NNV-114 on fibrinolysis by t-PA.
【図８】 図８は、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１８、Ｅ４５６
ＮＮＡ−１１４、Ｅ４５６ＮＮＡ−１１８、並びにＥ４
５６ＳＧＶ−１１４のｔ−ＰＡによるフィブリン溶解に
及ぼす影響を調べた結果である。FIG. 8 shows E456NNV-118, E456
NNA-114, E456 NNA-118, and E4
It is a result of examining the effect of 56SGV-114 on fibrinolysis by t-PA.
【図９】図９は、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４、並びにフラ
グミンのラット血中ＴＧレベルに及ぼす影響をみた結果
である。FIG. 9 is a graph showing the effects of E456NNV-114 and fragmin on TG levels in rat blood.
【図１０】図１０は、Ｅ４５６ＮＮＶ−１１４、並びに
フラグミンのラット血中ＦＦＡレベルに及ぼす影響をみ
た結果である。FIG. 10 shows the results of the effects of E456NNV-114 and fragmin on FFA levels in rat blood.
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys 1 5 10 15 Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln 35 40 45 Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu 50 55 60 Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile 65 70 75 80 Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu 85 90 95 Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg 100 105 110 His Ile Gly Thr Asp Cys 115 配列番号：２ 配列の長さ：１１４ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn 1 5 10 15 Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro 20 25 30 His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro 35 40 45 Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly 50 55 60 Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu 65 70 75 80 Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe 85 90 95 Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr 100 105 110 Asp Cys 114 配列番号：３ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GGAGGCCGCT CAACAGTCGG TGCCA 25 配列番号：５ 配列の長さ：２５ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CACGGGCTCC ACGGGGAACC CCAGG 25 配列番号：６ 配列の長さ：４８ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATGCTTGGGG TCCTGGTCCT TGGCGCGCTG GCCCTGGCCG GCCTGGGG 48 配列番号：７ 配列の長さ：２５ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GAAGCACGGG TCGGGGAACC CCAGG 25 配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 AATGTGGCGG GCAAGGGCCG A 21 配列番号：９ 配列の長さ：２５ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCACGGGTCC ACGGGGAACC CCAGG 25 配列番号：１０ 配列の長さ：２５ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CGGGTCCACG GGGGGGAACC CCAGG 25 配列番号：１１ 配列の長さ：２５ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GTCCACGGGC TCGGGGAACC CCAGG 25 配列番号：１２ 配列の長さ：２１ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GGCAGTCTGT TGGCAAAACA T 21 配列番号：１３ 配列の長さ：２１ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GGCAGTCTGG CTGCAAAACA T 21 配列番号：１４ 配列の長さ：２１ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GGCAGTCTGG GCGCAAAACA T 21 配列番号：１５ 配列の長さ：２１ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GGCAGTCTGG CCGCAAAACA T 21 配列番号：１６ 配列の長さ：２１ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCTAGTTTGC TGCAGGGGCT G 21 配列番号：１７ 配列の長さ：２１ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCTAGTTTGG CTCAGGGGCT G 21 配列番号：１８ 配列の長さ：２１ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCTAGTTTGG GCCAGGGGCT G 21 配列番号：１９ 配列の長さ：２１ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCTAGTTTGG CCCAGGGGCT G 21 配列番号：２０ 配列の長さ：２５ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CACGGGCTCC ACCCCCAGGC CGGCC 25 配列番号：２１ 配列の長さ：２５ 配列の型：塩基配列 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GAAGCACGGG TCCCCCAGGC CGGCC 25[Sequence list] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 118 Sequence type: Amino acid Sequence type: Protein sequence Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys 1 5 10 15 Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe 20 25 30 Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln 35 40 45 Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu 50 55 60 Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile 65 70 75 80 Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu 85 90 95 Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg 100 105 110 His Ile Gly Thr Asp Cys 115 SEQ ID NO: 2 Sequence length: 114 Sequence type: Amino acid Sequence type: Protein Sequence Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn 1 5 10 15 Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro 20 25 30 His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro 35 40 4 5 Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly 50 55 60 Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu 65 70 75 80 Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe 85 90 95 Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr 100 105 110 Asp Cys 114 SEQ ID NO: 3 Sequence length: 16 Sequence type: Amino acid Sequence type: Peptide sequence Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 SEQ ID NO: 4 Sequence length: 25 Sequence type: Base sequence Sequence type: DNA sequence GGAGGCCGCT CAACAGTCGG TGCCA 25 SEQ ID NO: : 5 Sequence length: 25 Sequence type: Base sequence Sequence type: DNA sequence CACGGGCTCC ACGGGGAACC CCAGG 25 SEQ ID NO: 6 Sequence length: 48 Sequence type: Base sequence Sequence type: DNA sequence ATGCTTGGGG TCCTGGTCCT TGGCGCGCTG GCCCTGGCCG GCCTGGGG 48 SEQ ID NO: 7 Sequence length: 25 Sequence type: Base Sequence Sequence type: DNA sequence GAAGCACGGG TCGGGGAACC CCAGG 25 SEQ ID NO: 8 Sequence length: 21 Sequence type: Base sequence Sequence type: DNA sequence AATGTGGCGG GCAAGGGCCG A 21 SEQ ID NO: 9 Sequence length: 25 Sequence type : Base sequence Sequence type: DNA sequence GCACGGGTCC ACGGGGAACC CCAGG 25 SEQ ID NO: 10 Sequence length: 25 Sequence type: Base sequence Sequence type: DNA sequence CGGGTCCACG GGGGGGAACC CCAGG 25 SEQ ID NO: 11 Sequence length: 25 Sequence Type: Nucleotide sequence Type of sequence: DNA sequence GTCCACGGGC TCGGGGAACC CCAGG 25 SEQ ID NO: 12 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleotide sequence Sequence type: DNA sequence GGCAGTCTGT TGGCAAAACA T 21 SEQ ID NO: 13 Sequence length: 21 Sequence type: base sequence Sequence type: DNA sequence GGCAGTCTGG CTGCAAAACA T 21 SEQ ID NO: 14 Sequence length: 21 Sequence type: base sequence Sequence type: D A sequence GGCAGTCTGG GCGCAAAACA T 21 SEQ ID NO: 15 Sequence length: 21 Sequence type: base sequence Sequence type: DNA sequence GGCAGTCTGG CCGCAAAACA T 21 SEQ ID NO: 16 Sequence length: 21 Sequence type: Base sequence Sequence Type: DNA sequence GCTAGTTTGC TGCAGGGGCT G 21 SEQ ID NO: 17 Sequence length: 21 Sequence type: base sequence Sequence type: DNA sequence GCTAGTTTGG CTCAGGGGCT G 21 SEQ ID NO: 18 Sequence length: 21 Sequence type: Base sequence Sequence type: DNA sequence GCTAGTTTGG GCCAGGGGCT G 21 SEQ ID NO: 19 Sequence length: 21 Sequence type: base sequence Sequence type: DNA sequence GCTAGTTTGG CCCAGGGGCT G 21 SEQ ID NO: 20 Sequence length: 25 Sequence type: Base sequence Sequence type: DNA sequence CACGGGCTCC ACCCCCAGGC CGGCC 25 SEQ ID NO: 21 Sequence length: 25 Sequence type: Base sequence Sequence type: DNA sequence GAAGCACGGG TCCCCCAGGC CGG CC 25
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＢ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA02 DA02 EA04 FA18 GA11 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA03 4C077 AA01 AA02 AA05 BB01 BB02 BB03 EE01 KK02 NN09 PP30 4C084 AA02 BA21 BA44 CA25 CA53 CA59 DC10 MA01 MA66 NA20 ZA512 ZA542 4H045 AA30 BA10 BA53 DA65 EA24 FA74 ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI theme coat ゛ (reference) (C12P 21/02 C12N 15/00 A C12R 1:91) A61K 37/02 ACB F-term (reference) 4B024 AA01 BA80 CA02 DA02 EA04 FA18 GA11 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA03 4C077 AA01 AA02 AA05 BB01 BB02 BB03 EE01 KK02 NN09 PP30 4C084 AA02 BA21 BA44 CA25 CA53 CA59 DC10 MA01 MA66 NA20 ZA512 ZA542 4H045 A65
Claims (5)
（１） 【化１】 〔式中、（Ｗ）は、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−
Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ、Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−Ａｓｐ、Ｖａｌ−Ａｓｐ、またはＡｓｐのいずれ
かのペプチド残基またはアミノ酸残基であり、（Ｘ）と
（Ｙ）は、互いに異なる、又は同一の、Ａｓｎ、Ｇｌ
ｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＧｌｙのいずれかのアミノ
酸残基を、（Ｚ）は、Ｖａｌ、またはＡｌａのいずれか
のアミノ酸残基を示す。〕で表されるアミノ酸配列から
なるトロンボモジュリンを有効成分とする血液体外循環
回路用の血液凝固防止のための医薬組成物。(1) at least an amino acid sequence of the formula (1): [Wherein (W) is Val-Glu-Pro-Val-
Asp, Glu-Pro-Val-Asp, Pro-V
a peptide residue or an amino acid residue of any of al-Asp, Val-Asp, or Asp, wherein (X) and (Y) are different from or the same as Asn, GI
The amino acid residue of any of n, Ser, Ala, or Gly, and (Z) indicates the amino acid residue of Val, or Ala. ] A pharmaceutical composition for preventing blood coagulation for an extracorporeal blood circulation circuit, comprising thrombomodulin having an amino acid sequence represented by the following formula:
ある請求項１に記載の医薬組成物。2. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein (X) and (Y) are both Asn.
２に記載の医薬組成物。3. The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein (Z) is Val.
ａｌ−Ａｓｐ、またはＡｓｐのいずれかのペプチド残基
またはアミノ酸残基であり、（Ｘ）および（Ｙ）が、と
もにＡｓｎであり、（Ｚ）が、Ｖａｌである請求項１〜
３のいずれかに記載の医薬組成物。4. (W) is Val-Glu-Pro-V
Al-Asp or any peptide residue or amino acid residue of Asp, (X) and (Y) are both Asn, and (Z) is Val.
4. The pharmaceutical composition according to any one of 3.
れかに記載の医薬組成物。5. The pharmaceutical composition according to claim 1, for continuous infusion.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20031007 |