JP2002234899A - Recombinant medicine acting on thrombosis - Google Patents
Recombinant medicine acting on thrombosisInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】 本発明は、血栓症の予防も
しくは治療に用いるペプチド医療に関する。さらに詳し
くは、本発明は、プロテアーゼ活性が欠除し、かつプロ
トロンビンをトロンビンに変換する内在的Ｘａ因子の性
能を阻害するＸａ因子類似体に関する。さらに本発明
は、血友病の治療に用いる、安定した形態のＸａ因子を
提供するものである。TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to peptide medicine used for prevention or treatment of thrombosis. More particularly, the invention relates to factor Xa analogs that lack protease activity and inhibit the ability of endogenous factor Xa to convert prothrombin to thrombin. The present invention further provides a stable form of factor Xa for use in treating hemophilia.
【０００２】[0002]
【従来の技術】トロンビンは、いくつもの重要な生物学
的プロセスを調節する多機能プロテアーゼである。例え
ばトロンビンは、公知の血小板賦活剤の中で最も有力な
ものである。その上にトロンビンは、フィブリノーゲン
を開裂してフィブリンにして、血餅の形成を開始するの
に必須のものである。上記の２つの成分は、通常の止血
に関与しているが、アテローム性動脈硬化症の動脈内で
は、血栓の形成を開始することがある。この血栓は、心
筋梗塞症、不安定狭心症、血管形成術または血栓崩壊の
治療を行った後の冠状動脈の非出血性発作と再閉塞のよ
うな血管閉塞症状の病因の主要因子である。またトロン
ビンは、平滑細胞増殖の有力な誘導物質でもあり、それ
故、血管形成術後の再狭窄および移植誘発アテローム性
動脈硬化症のような各種の増殖反応に関与している。さ
らにトロンビンはリンパ球に対して走化性なので炎症に
おいて役割を果している（Ｈｏｏｖｅｒ，Ｒ．Ｊ．ら、
Ｃｅｌ１（１９７８）１４：４２３；Ｅｔｉｎｇｉｎ，
Ｏ．Ｒ．ら、Ｃｅｌｌ（１９９０）６１：６５７。）こ
れらの観察結果は、トロンビン形成の阻害またはトロン
ビン自体の阻害を行うと血栓症の予防または治療に有効
であり、再狭窄を制限し、炎症を抑制することを示して
る。BACKGROUND OF THE INVENTION Thrombin is a multifunctional protease that regulates several important biological processes. For example, thrombin is the most potent of the known platelet enhancers. In addition, thrombin is essential for cleaving fibrinogen into fibrin and initiating clot formation. The above two components are involved in normal hemostasis, but may initiate thrombus formation in atherosclerotic arteries. This thrombus is a major factor in the etiology of vasoocclusive symptoms such as non-bleeding attacks and reocclusion of coronary arteries after treatment for myocardial infarction, unstable angina, angioplasty or thrombolysis . Thrombin is also a potent inducer of smooth cell proliferation and is therefore involved in various proliferative responses such as restenosis after angioplasty and transplant-induced atherosclerosis. In addition, thrombin plays a role in inflammation because it is chemotactic for lymphocytes (Hoover, RJ et al.
Cel1 (1978) 14: 423; Etingin,
O. R. Et al., Cell (1990) 61: 657. These observations indicate that inhibition of thrombin formation or inhibition of thrombin itself is effective in preventing or treating thrombosis, limiting restenosis and suppressing inflammation.
【０００３】トロンビンは、その前駆動物質のプロトロ
ンビンが、２７１−２７２位のＡｒｇ−Ｔｈｒ結合部と
３２０−３２１位のＡｒｇ−Ｉｌｅ結合部でタンパク質
分解開裂された結果生成する。この活性化は、プロトロ
ンビナーゼ複合体で触媒され、この複合体は、血小板、
単球および内皮細胞の膜表面で構築される。この複合体
はＸａ因子（セリンプロテアーゼ）、Ｖａ因子（補因
子）、カルシウムイオンおよび酸性リン脂質表面で構成
されている。Ｘａ因子は、その前駆物質Ｘ因子の活性化
された形態であり、このＸ因子は、肝臓により５８ｋｄ
の前駆物質として分泌され、外因性および内因性の血液
凝固経路の両方で、活性化型のＸａ因子に変換される。
Ｘ因子と、Ｖａ因子の前駆物質であるＶ因子の循環レベ
ルは、１０−Ｍのオーダーであることが知られている。
対応する活性因子ｈとＸａのレベルはまだ測定されてい
ない。[0003] Thrombin is produced as a result of proteolytic cleavage of prothrombin, a pro-driving substance, at the Arg-Thr bond at positions 271-272 and the Arg-Ile bond at positions 320-321. This activation is catalyzed by the prothrombinase complex, which is composed of platelets,
It is built on the membrane surface of monocytes and endothelial cells. This complex is composed of factor Xa (serine protease), factor Va (cofactor), calcium ions and acidic phospholipid surface. Factor Xa is an activated form of its precursor factor X, which is 58 kd
And is converted to activated form of factor Xa in both the extrinsic and endogenous blood coagulation pathways.
It is known that circulating levels of Factor X and Factor V, a precursor of Factor Va, are on the order of 10-M.
The corresponding activator h and Xa levels have not yet been determined.
【０００４】ヒトのＸ因子とＸａ因子の完全アミノ酸配
列が知られている。図１は、Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｒ．Ｗ．
ら編集、Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓｉｓ第２版（１９８７）ｐ．２５０にＤａｖｉｅ，
Ｅ．Ｗ．が記載した前駆物質型のＸ因子の完全配列を示
す。Ｘ因子は、カルシウムイオン結合性で、γ一カルボ
キシグルタミル（Ｇｌａ）を含有し、ビタミンＫ依存性
の血液凝固性糖タンパク質ファミリーのメンバーであ
り、このファミリーには、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、プロ
トロンビン、プロテインＣおよびプロテインＳ（Ｆｕｒ
ｉｅ，Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ（１９８８）５３：５０５）も
含まれている。[0004] The complete amino acid sequences of human factor X and factor Xa are known. FIG. 1 shows Coleman, R.A. W.
Editing, Hemostasis and Thromb
osis second edition (1987) p. In 250, Davie,
E. FIG. W. Shows the complete sequence of the precursor type factor X described by E. Factor X is calcium ion binding, contains gamma-carboxyglutamyl (Gla), and is a member of the vitamin K-dependent blood coagulation glycoprotein family, which includes factor VII, factor IX, prothrombin, Protein C and Protein S (Fur
ie, B .; Cell (1988) 53: 505).
【０００５】図１に示すように、成熟Ｘ因子タンパク質
は４０残基のプレープロリーダー配列が先行しており、
この配列は細胞内でのプロセシングおよび分泌中に除去
される。Ｘａ因子の前駆物質の成熟Ｘ因子は、次いで、
軽鎖のＣ末端および活性化ペプチド／重鎖のＮ末端の間
に示されている３つのアミノ酸ＲＫＲの欠失によって開
裂されて二本鎖型になる。最終的に、この二本鎖Ｘ因子
は、図の上部右側の部分に示す「活性化ペプチド」（１
〜５２と番号を付けてある）が欠失してＸａ因子に変換
され、残基１〜１３９として示す軽鎖と残基１〜２５４
として示す重鎖を生成る。これらは、軽鎖の１２８位と
重鎖の１０８位との間の単一のジスルフィド結合を介し
て連結されている。さらに図に示すように、軽鎖はＧｌ
ａドメインと増殖因子ドメインを合有し、一方、プロテ
アーゼ活性部分が重鎖内にあり、４２位にヒスチジン８
８位にアスパラギン酸、および１８５位にセリンがあ
り、図中丸印を付けてある。As shown in FIG. 1, the mature factor X protein is preceded by a 40 residue prepro leader sequence,
This sequence is removed during processing and secretion in the cell. The mature factor X, a precursor of factor Xa, is then
It is cleaved into a double-chain form by deletion of the three amino acids RKR shown between the C-terminus of the light chain and the N-terminus of the activation peptide / heavy chain. Finally, this double-chain factor X is referred to as the "activating peptide" (1
(Numbered ~ 52) and converted to factor Xa, the light chain shown as residues 1-139 and residues 1-254
To produce the heavy chain shown as These are linked via a single disulfide bond between position 128 of the light chain and position 108 of the heavy chain. As further shown in the figure, the light chain is Gl
a domain and a growth factor domain, while the protease active portion is in the heavy chain and histidine 8 at position 42
Aspartic acid at position 8 and serine at position 185 are circled in the figure.
【０００６】二本鎖Ｘ因子のインビボでの活性化につい
ては２っの公知の経路がある。活性化は、プロテアーゼ
がプロトロンビナーゼ複合体に組み込まれる前に起こら
なければならない（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｍ．ら、Ｈｅ
ｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，Ｃｏ
ｌｅｍａｎ，Ｒ．Ｗ．ら編、（１９８７）Ｊ．Ｂ．Ｌｉ
ｐｐｅｎｃｏｔｔ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，
ｐ．１１２に記載）。内因性経路において、Ｘ因子は、
ＩＸａ因子、ＶＩＩＩ因子およびカルシウムイオンから
なり細胞表面上に構築された「テナーゼ」（ｔｅｎａｓ
ｅ）複合体によって開裂されて５２アミノ酸の活性化ペ
プチドを放出する。外因性経路では、この開裂は、膜上
の組織因子に結合されたＶＩＩａ因子で触媒される。し
かし、ここで興味深いことは、ラッセルクサリヘビ毒に
含有されているようなプロテアーゼを用いて、インビト
ロで開裂することによってＸ因子をＸａ因子に変換する
能力である。このプロテアーゼは、ＤｉＳｃｉｐｉｏ，
Ｒ．Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ（１９７７）６：
５２５３に記載されている。There are two known routes for in vivo activation of double-chain factor X. Activation must occur before the protease is incorporated into the prothrombinase complex (Steinberg, M. et al., He.
Mostasis and Thrombosis, Co
Leman, R .; W. (1987) J. et al. B. Li
ppencott, Philadelphia, PA,
p. 112). In the intrinsic pathway, factor X
"Tenase" (tenas) composed of factor IXa, factor VIII and calcium ions and constructed on the cell surface
e) Cleaved by the complex to release the 52 amino acid activation peptide. In the extrinsic pathway, this cleavage is catalyzed by factor VIIa bound to tissue factor on the membrane. However, of interest here is the ability to convert factor X to factor Xa by cleavage in vitro using a protease such as that contained in Russell's viper venom. This protease is DiScipio,
R. G. FIG. Et al., Biomistry (1977) 6:
5253.
【０００７】本発明の薬剤のいくつかでは、過度の凝結
を防止するために、Ｘａ因子が機能するのを阻害するこ
とが望ましい。しかし血友病患者の場合、逆の問題があ
るが、この問題は正常な個体内で起こる活性化プロセス
と無関係にＸａ因子の起源を提供することによって援助
されるであろう。血友病の通常の形態の両方は、活性化
の内因性経路にのみ欠陥を伴うが、外因性経路の作用は
出血を止めるのに成功していないようである。[0007] For some of the agents of the present invention, it is desirable to inhibit the functioning of factor Xa to prevent excessive coagulation. However, in the case of hemophiliacs, the opposite problem, which would be aided by providing a source of factor Xa independent of the activation process occurring in normal individuals. Both the usual forms of hemophilia are defective only in the intrinsic pathway of activation, but the action of the extrinsic pathway does not seem to be successful in stopping bleeding.
【０００８】最も普通の形態の血友病は、ＶＩＩＩ因子
の機能の欠乏を示す血友病ＡとＩＸ因子（クリスマス因
子としても知られている）の機能の欠乏を示す血友病Ｂ
である。これらの形態の血友病は、Ｌｅｖｉｎｅ，Ｐ．
Ｈ．，”Ｐｌａｓｍａ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆａ
ｃｔｏｒｓ”（１９ ）、 編、Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，ｐ．９７−１１０に記載されてい
る。これらの因子のどちらかが欠乏するとＸａ因子の供
給が不充分になるので、Ｘａ因子を与えることは両方の
血友病の治療に有効のはずである。さらに、Ｘ因子自体
では活性のＸａ因子を与えることができないといういく
つかの例が見出されている。この比較的まれな種類の先
天的疾患は、例えばＲａｄｄｙ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｂｌｏｏ
ｄ（１９８９）７４：１４８６−１４９０：Ｗａｔｚｋ
ｅ，Ｈ．Ｈ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９０）
２８５：１１９８２−１１９８９：Ｈａｓｓａｎ，Ｈ．
Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ（１９８８）７１：１３５３−１３
５６；Ｆａｉｒ，Ｄ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ，（１９８
９）７３：２１０８−２１１６；およびＢｅｒｎａｒｄ
ｉ，Ｆ．ら、Ｂｌｏｏｄ（１９８９）７３：２１２３−
２１２７に記載されている。The most common forms of hemophilia are hemophilia A, which exhibits a deficiency in the function of factor VIII, and hemophilia B, which exhibits a deficiency in the function of factor IX (also known as Christmas factor).
It is. These forms of hemophilia are described in Levine, P .;
H. , "Plasma Coagulation Fa
ctors ”(19), edited, Public
shing Co. , P. 97-110. The deficiency of either of these factors results in an inadequate supply of factor Xa, so giving factor Xa should be effective in treating both haemophilia. In addition, some examples have been found in which factor X itself cannot provide active factor Xa. This relatively rare type of congenital disease is described, for example, in Raddy, S .; B. Bloo
d (1989) 74: 1486-1490: Watzk.
e, H .; H. Et al., J Biol Chem (1990).
285: 11982-11989: Hassan, H .;
J. Et al., Blood (1988) 71: 1353-13.
56; S. Et al., Blood, (198
9) 73: 2108-2116; and Bernard
i, F. Et al., Blood (1989) 73: 2123-.
2127.
【０００９】Ｘａ因子は、血清中での半減期が極めて短
くて約３０秒に過ぎないので、従来、医薬として有用で
はなかった。以下に説明する本発明では、この薬剤の血
清中での半減期が除放性アシル化型を提供することによ
って延長され、このアシル化型では、活性部位のセリン
に結合されたアシル基がクリアランスを阻害し、ごくゆ
っくりと加水分解されてＸａ因子の活性型を生成する。Factor Xa has heretofore not been useful as a medicament because its half-life in serum is very short, only about 30 seconds. In the present invention described below, the half-life of the drug in serum is extended by providing a sustained release acylated form in which the acyl group attached to the active site serine is cleared. And is hydrolyzed very slowly to produce the active form of factor Xa.
【００１０】血液凝固因子の半減期を延長するためにア
シル化反応を用いることは開示されている。例えばＣａ
ｓｓｅｌｓ，Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ（１９８７）
２４７：３５９−４００では、種々のアシル化剤がウロ
キナーゼ、ｔＰＡおよびストレプトキナーゼープラスミ
ノーゲン活性化因子複合体とに結合したままで残り、そ
の半減期の期間が、アシル化基の種類と因子の種類によ
るが４０分間から１０００分間を超える範囲にあること
を見出した。ｔＰＡもしくはストレプトキナーゼのアシ
ル化はまた、米国特許第４，３３７，２４４号に記載さ
れている。血清中での安定性を高める目的で、置換ベン
ゾイル基を活性部位に一時的に導入するため、アルギニ
ン類似体として機能するアミジノフェニル基を使用する
ことは、Ｆｅａｒｓ，Ｒ．ら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ
Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄＨｅｍｅｏｓｔａｓｉ
ｓ（１９８９）１５：１２９−１３９で考察されてい
る。このより全般的な概説は、Ｆｅａｒｓ，Ｒ．らのＤ
ｒｕｇｓ（１９８７）３３：Ｓｕｐｐ．３ ５７−６３
での短い報告に続いて行われたものである。Ｓｔｕｒｚ
ｅｂｅｃｈｅｒ，Ｊ．らも、ｔＰＡの安定化されたアシ
ル誘導体を、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ（１９８
７）４７：６９９−７０３に報告した。アシル化された
プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体
（ＡＰＳＡＣ）の使用に関する別の報告が、Ｃｒａｂｂ
ｅ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｐｈａｍａｃｏ−ｔｈｅｒａｐｙ（１
９９０）１０：１１５−１２６によって刊行された。The use of acylation reactions to extend the half-life of blood coagulation factors has been disclosed. For example, Ca
ssels, R.S. Et al., Biochem J (1987).
247: 359-400, various acylating agents remain bound to urokinase, tPA and the streptokinase-plasminogen activator complex, the half-life of which depends on the type and factor of the acylating group. Was found to be in the range of 40 minutes to over 1000 minutes, depending on the type of. Acylation of tPA or streptokinase is also described in US Pat. No. 4,337,244. The use of an amidinophenyl group, which functions as an arginine analog, to temporarily introduce a substituted benzoyl group into the active site for the purpose of increasing stability in serum has been described by Fears, R .; Et al, Seminars in
Thrombosis and Hemeostasis
s (1989) 15: 129-139. For a more general review of this, see Fears, R.A. Our D
rugs (1987) 33: Sup. 3 57-63
Following a brief report at Sturz
ebecher, J .; Have also converted tPA-stabilized acyl derivatives to Thrombosis Res (198).
7) Reported at 47: 699-703. Another report on the use of acylated plasminogen streptokinase activator complex (APSAC) has been published by Crabb.
e, S. J. Et al., Pharmaco-therapy (1
990) 10: 115-126.
【００１１】Ｘａ因子自体の機能に戻ると、プロトロン
ビンをトロンビンに変換するＸａ因子の活性は、プロト
ロンビナーゼ複合体内にこの因子が包含されていること
に依存している。プロトロンピナーゼ複合体（プロトロ
ンビンのトロンビンヘの変換が、可溶型のＸａ因子より
も２７８，０００倍速い）の生成が研究されている（Ｎ
ｅｓｈｅｉｍ，Ｈ．Ｅ．ら、Ｊ ＢｉｏｌＣｈｅｍ（１
９７９）２５４：１０９５２）。これらの研究は、活性
部位特異的阻害剤であるダンシルグルタミルグリシルア
ルギニル（ＤＥＧＲ）クロロメチルケトンを利用してお
り、この阻害剤は、蛍光リポーター基をＸａ因子に共有
結合させる。この阻害剤で処理されたＸａ因子はプロテ
アーゼ活性を欠いているが、化学量論的にＸａ因子と同
様にプロトロンビナーゼ複合体に組み込まれ、解離定数
は２．７Ｘ１０-6Ｍである（Ｎｅｓｈｅｉｍ，Ｍ．
Ｅ．，Ｊ Ｂｏｉｌ Ｃｈｅｍ｛１９８１）２５６：６
５３７−６５４０：Ｓｋｏｇｅｎ，Ｗ．Ｆ．ら、Ｊ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８４）２５６：２３０６−２３
１０；Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ，Ｓ．ら、Ｊ Ｂｉｏ
ｌ Ｃｈｅｍ（１９８８）２６３：３８２３−３８２
４：Ｈｕｓｔｅｎ，Ｅ．Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅ
ｍ（１９８７）２６２：１２９５３−１２９６１）。Returning to the function of factor Xa itself, the activity of factor Xa, which converts prothrombin to thrombin, depends on its inclusion in the prothrombinase complex. The formation of a prothrompinase complex (conversion of prothrombin to thrombin is 278,000 times faster than soluble form of factor Xa) has been studied (N
esheim, H .; E. FIG. Et al., J BiolChem (1
979) 254: 10952). These studies utilize an active site-specific inhibitor, dansylglutamylglycylarginyl (DEGR) chloromethyl ketone, which covalently attaches a fluorescent reporter group to factor Xa. Factor Xa treated with this inhibitor lacks protease activity, but is stoichiometrically incorporated into the prothrombinase complex like factor Xa, with a dissociation constant of 2.7 × 10 −6 M (Nesheim). , M .;
E. FIG. , J Boil Chem @ 1981) 256: 6.
537-6540: Skogen, W.C. F. JB
iol Chem (1984) 256: 2306-23.
10; Kishnaswamy, S .; Et al., J Bio
1 Chem (1988) 263: 3823-382.
4: Husten, E .; J. Et al., J Biol Che
m (1987) 262: 12953-12961).
【００１２】プロトロンビナーゼ複合体の形成を阻害す
る公知の方法には、ヘパリンおよびヘパリン様化合物に
よって処理する方法がある。この方法は、ヘパリンとと
もにアンチトロンビンＩＩＩを用いて該複合体の生成を
を阻害する方法である。Ｘａ因子阻害の他の新規な形態
としては、リポタンパク質結合凝固阻害剤（ＬＡＣＩ）
（Ｇｉｒａｒｄ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８
９）３３８：５１８；Ｇｒａｒｄ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ（１９９０）２４８：１４２１）、ヒル由来の
アンチスタチン（Ｄｏｎｗｉｄｄｉｅ，Ｃ．ら、Ｊ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８９）２６４：１６６９４）、
およびマダニ由来のＴＡＰ（Ｗａｘｍａｎ，Ｌ．ら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４８：５９３）がある。あ
るいはクマリンのような、ビタミンＫ依存性Ｇｌａ変換
酵素を阻害する薬剤が使用されている。これらの方法
は、特異性を欠いていること、多量の投与量が必要なこ
と、有毒な副作用、および効力の長期間の遅延などのた
め、満足すべきものではない。Known methods for inhibiting the formation of the prothrombinase complex include treatment with heparin and heparin-like compounds. This method uses antithrombin III together with heparin to inhibit the formation of the complex. Other novel forms of factor Xa inhibition include lipoprotein binding coagulation inhibitors (LACI)
(Girard, TJ et al., Nature (198).
9) 338: 518; Grad, T .; J. Et al., Sci
ence (1990) 248: 1421), an antistatin from leech (Donwiddie, C. et al., JB).
iol Chem (1989) 264: 16694),
And TAP from ticks (Waxman, L. et al., S.
science (1990) 248: 593). Alternatively, drugs that inhibit vitamin K-dependent Gla converting enzyme, such as coumarin, have been used. These methods are unsatisfactory because of their lack of specificity, the need for large doses, toxic side effects, and prolonged delay in efficacy.
【００１３】[0013]
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、活
性プロトロンビナーゼ複合体の形成を阻害する作用の特
異性を増大しかつ作用の持続時間を延長する別の方法を
提供するものである。Accordingly, the present invention provides another method for increasing the specificity of an action that inhibits the formation of an active prothrombinase complex and extending the duration of the action. .
【００１４】[0014]
【課題を解決するための手段】本発明は、血栓形成なら
びに再狭窄および炎症のようなトロンビンで誘発される
血管系での他の病変プロセスの予防および治療に用いる
有効な治療薬剤を提供する。血栓形成は西洋社会では死
亡の第一の原因であり、再狭窄は血管形成術および他の
侵襲性処置の利用が増大するのに伴って拡大している問
題なので、上記のことは非常に重要である。本発明の治
療物質は、不活性化型のヒトＸａ因子であり、それにも
かかわらず、プロトロンビナーゼ複合体に組み込むこと
ができるので、活性プロトンビナーゼ複合体が内因性Ｘ
ａ因子から生成するのを防止することができる。これら
の医薬は、急性の状況において血栓症を予防するのに特
に有用である。これには、安静狭心症の患者の冠状動脈
における血栓形成の予防、血栓崩壊後に再度起こる血栓
症の予防、および複雑な血管形成術中の血栓症の予防が
含まれる。これらの医薬はまた、血管形成術または他の
血管の侵襲性処置の後の平滑筋細胞の増殖を防止するの
にも有用である。本発明の治療法は、ヘパリンを用いる
現在の標準の治療法（Ｈａｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｐｒ
ｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄｓｃｉ（１９８８）８５：３
１８４）を越える著しい利益を与える。本発明の化合物
は、プロトロンビナーゼ複合体に関与できるが不活性化
複合体をもたらす、二本鎖または一本鎖のポリペプチド
である。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides effective therapeutic agents for the prevention and treatment of thrombus formation and other pathological processes in the vasculature induced by thrombin, such as restenosis and inflammation. This is very important as thrombus formation is the leading cause of death in Western societies and restenosis is a growing problem with the increasing use of angioplasty and other invasive procedures It is. Since the therapeutic agent of the present invention is an inactivated form of human factor Xa, which can nevertheless be incorporated into the prothrombinase complex, the active proton binase complex has an endogenous X
Generation from the factor a can be prevented. These medicaments are particularly useful for preventing thrombosis in acute situations. This includes prevention of thrombosis in the coronary arteries of patients with resting angina, prevention of thrombosis occurring again after thrombolysis, and prevention of thrombosis during complex angioplasty. These medicaments are also useful for preventing smooth muscle cell proliferation after angioplasty or other invasive procedures of blood vessels. The treatments of the present invention are based on current standard treatments using heparin (Hanson, RS et al., Pr.
oc Natl Acadsci (1988) 85: 3
184). The compounds of the present invention are double- or single-chain polypeptides that can participate in the prothrombinase complex but result in an inactivated complex.
【００１５】１つの局面において、本発明は、Ｘａｉ因
子と呼称される二本鎖ポリペプチドに関し、そのポリペ
プチドはプロトロンビナーゼ複合体を形成できるが、タ
ンパク質分解活性を欠いた複合体をもたらすものであ
る。この二本鎖ポリペプチドは、２種の新規な前駆物質
のうちの１つから生成され得る。一方の種類は、本願で
はＸｉ因子と呼称されるが、実質的にＸ因子のアミノ酸
配列を有するが、通常の凝固処理プロテアーゼによる
か、またはクサリヘビの毒液由来のＸ因子の活性化因子
を用いるインビトロでの処理によって開裂すると、不活
性化二本鎖ポリペプチドであるＸａｉ因子を生成するよ
うに、本願に記載されているように改変されている。他
方の種類は、本願ではＸ’ｉ因子と呼称されるが、一本
鎖Ｘ因子の切形の形態であり、ここで図１にＲＫＲとし
て示す軽鎖のＣ末端におけるタンパク質分解開裂部位
（またはその一部もしくは延長部）は、図３の１つの実
施態様に示す重鎖の活性化された形態のＮ末端に、（１
つもしくはいくつかのアミノ残基を任意に付加するとと
もに）直接結合している。開裂すると、Ｘ’ｉ因子もま
た、本発明の二本鎖Ｘａｉ因子になり、このＸａｉ因子
はタンパク質分解活性を欠いたプロトロンビナーゼ複合
体になる。もちろん、活性補因子のＸａ因子はまた、図
２に示す、Ｘ’因子タイプの類似の前駆物質を用いて生
成され得る。In one aspect, the present invention relates to a double-chain polypeptide termed factor Xai, which polypeptide can form a prothrombinase complex but results in a complex lacking proteolytic activity. It is. The double-chain polypeptide can be produced from one of two novel precursors. One type, referred to in the present application as Factor Xi, has substantially the amino acid sequence of Factor X, but is in vitro using a normal coagulation protease or an activator of Factor X from the venom of the viper. Has been modified as described herein to produce an inactivated double-chain polypeptide, factor Xai, upon cleavage by treatment with. The other type, referred to herein as factor X'i, is a truncated form of single-chain factor X, where the proteolytic cleavage site at the C-terminus of the light chain, shown as RKR in FIG. 1 (or The part or extension) is added to the N-terminus of the activated form of the heavy chain shown in one embodiment of FIG.
(With optional addition of one or several amino residues). Upon cleavage, factor X′i also becomes a double-chain factor Xai of the invention, which becomes a prothrombinase complex that lacks proteolytic activity. Of course, the active cofactor Factor Xa can also be produced using similar precursors of the Factor X 'type, shown in FIG.
【００１６】従って、他の局面において、本発明は、Ｘ
ａｉ因子の二本鎖プロトロンビナーゼ複合体およびＸａ
ｉ因子の治療用タンパク質の新規な前駆物質に関し、な
らびにこれらをコードするＤＮＡ配列、および一般にこ
れらを生成することができる組換え物質および方法に関
する。本発明のその他の局面には、治療するのに有用な
Ｘａｉ因子タンパク質の医薬組成物、および血栓症また
はトロンビンによって開始される他の病理学的事象を、
これらの組成物を用いて予防もしくは治療する方法が含
まれる。Accordingly, in another aspect, the present invention provides
Double-stranded prothrombinase complex of factor ai and Xa
The present invention relates to novel precursors of therapeutic proteins for factor i, and to DNA sequences encoding them, and generally to recombinant materials and methods by which they can be produced. Other aspects of the invention include pharmaceutical compositions of Factor Xai proteins useful for treating and thrombosis or other pathological events initiated by thrombin.
Methods of preventing or treating using these compositions are included.
【００１７】組換え法で生成したＸａ因子は利用し易い
ので、この物質は血友病の治療に用いるのに便利な原料
になる。Ｘａ因子は、組換え法で直接生成したり、組換
え法で生成したＸ因子を、例えばラッセルクサリヘビ毒
を用いて活性化して得たり、または血漿から単離して同
様にＸａ因子に変換したりすることのいかんにかかわら
ず、その血清中での半減期を延長することによって使用
可能な医薬を生成するように変換し得る。この変換は、
活性部位におけるセリンをアシル化することによって達
成され、その結果徐放形態の活性因子が得られる。The availability of recombinant Factor Xa makes it a convenient source for use in treating hemophilia. Factor Xa can be produced directly by recombinant methods, obtained by activating factor X produced by recombinant methods using, for example, Russell's viper venom, or isolated from plasma and similarly converted to factor Xa. Regardless of what they do, they can be converted to produce usable drugs by extending their half-life in serum. This conversion is
Achieved by acylating serine in the active site, resulting in a sustained release form of the active agent.
【００１８】従って、別の局面において、本発明は、適
切な時間に活性Ｘａ因子に変換する薬剤で、重鎖の１８
５位のセリン残基がアシル化されているＸａ因子に関す
る。本発明の他の局面には、本発明のアシル化Ｘａ因子
を含有する血友病治療用の製薬組成物、およびこれらの
組成物を用いて血友病を治療する方法が含まれる。Thus, in another aspect, the present invention is directed to an agent which converts active factor Xa at an appropriate time, comprising 18
It concerns Factor Xa, wherein the serine residue at position 5 is acylated. Other aspects of the present invention include pharmaceutical compositions containing the acylated factor Xa of the present invention for the treatment of hemophilia, and methods of treating haemophilia using these compositions.
【００１９】本発明は、以下の項１〜２９を提供するも
のである。 １．図１に示す軽鎖の１−１３９位および重鎖の１−２
５４位のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有
する二本鎖Ｘａｉ因子ペプチドであって、該Ｘａｉ因子
がプロトロンビナーゼ複合体の形成時にＸａ因子と競合
することが可能であり、そして、該Ｘａｉ因子が該複合
体に含有されているときにはタンパク質が水分解活性を
もたらさない、二本鎖Ｘａｉ因子ペプチド。 ２．図１に示す軽鎖の１８５位の残基に相当するセリン
残基が、異なるアミノ酸で置換されているか、および／
または図１に示す重鎖の８８位の残基に相当するアスパ
ラギン酸残基が他のアミノ酸で置換されている、項１に
記載のＸａｉ因子。 ３．セリンの置換がアラニル残基で、アスパラギン酸の
置換がアスパラギン残基である、項２に記載のＸａｉ因
子。 ４．タンパク質加水分解反応によってＸａｉ因子に変換
し得る一本鎖前駆物質ポリペプチドであって、該Ｘａｉ
因子が図１に示す軽鎖の１−１３９位および重鎖の１−
２５４位のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を
有し、該Ｘａｉ因子がプロトロンビナーゼ複合体の形成
時にＸａ因子と競合することが可能であり、そして、該
Ｘａ因子が該複合体に含有されているときにはタンパク
質加水分解活性をもたらさない、一本鎖前駆物質ポリペ
プチド。 ５．Ｘ因子に対して生成する抗体と反応性である、項４
に記載のポリペプチド前駆物質。 ６．図１に示す重鎖の１８５位の残基に相当するセリン
残基が他のアミノ酸で置換されているか、および／また
は図１に示す重鎖の８８位の残基に相当するアスパラギ
ン酸残基が他のアミノ酸で置換されている、項４に記載
のポリペプチド前駆物質。 ７．改変されていない型で、図１に示す軽鎖の１−１３
９位のアミノ酸および重鎖の１−２５４位のアミノ酸の
アミノ酸配列を有する、項６に記載のポリペプチド前駆
物質。 ８．前記軽鎖および重鎖が、図１に示す活性化ペプチド
と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列によ
って連結されている、項６に記載のポリペプチド前駆物
質。 ９．前記軽鎖および重鎖が、本質的にプロテアーゼ開裂
部位からなるアミノ酸配列で連結されている、項６に記
載のポリペプチド。 １０．前記開裂部位がＲＫＲＲＫＲであって、前記軽鎖
および重鎖が、本質的にプロテアーゼ開裂部位からなる
アミノ酸配列で連結されている、項９に記載のポリペプ
チド。 １１．項４に記載の前駆物質ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列。 １２．発現系が宿主細胞にトランスフェクトし、形質転
換させ、そして、該宿主細胞を該発現に好ましい条件下
で培養した時に、項４に記載の前駆物質ポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列を発現可能な組み換え発現ベクタ
ーであって、該発現系が該ＤＮＡを発現させるための制
御配列に作動可能に連結された、項４に記載の前駆物質
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する、組み
換え発現ベクター。 １３．項１２に記載の発現系で形質転換された組み換え
宿主細胞。 １４．タンパク質過水分解反応によってＸａｉ因子に変
換可能な一本鎖前駆物質ポリペプチドの生成方法であっ
て、該一本鎖前駆物質ポリペプチドをコードするＤＮＡ
を発現させるのに好ましい条件下で項１３に記載の細胞
を培養し、そして産生された該前駆物質ポリペプチドま
たはそのタンパク質分解生成物を回収することを包含す
る、方法。 １５．動物被検体における血栓症を予防または治療する
のに用いる製薬組成物であって、血栓症を緩和するかま
たは予防するのに有効な量の項１に記載のＸａｉ因子
を、製薬的に受容可能な賦形剤と混合した状態で含有す
る、製薬組成物。 １６．動物被検体における炎症を予防または治療するの
に用いる製薬組成物であって、炎症を緩和するかまたは
予防するのに有効な量の項１に記載のＸａｉ因子を、製
薬的に受容可能な賦形剤と混合した状態で含有する、製
薬組成物。 １７．動物被検体における再狭窄を予防または治療する
のに用いる製薬組成物であって、再狭窄を緩和するかま
たは予防するのに有効な量の項１に記載のＸａｉ因子
を、製薬的に受容可能な賦形剤と混合した状態で含有す
る、製薬組成物。 １８．動物被検体における移植手術時の合併症の予防ま
たは治療に用いる製薬組成物であって、移植手術時の合
併症を緩和するかまたは予防するのに有効な量の項１に
記載のＸａｉ因子を、製薬的に受容可能な賦形剤と混合
した状態で含有する、製薬組成物。 １９．血栓症を治療するのに有用なＸａｉ因子の調製方
法であって、項４に記載の前駆物質ポリペプチドを、該
前駆物質を開裂するのに有効な量のプロテアーゼと接触
させ、そして生成したＸａｉ因子を回収することを含有
する、方法。 ２０．前記プロテアーゼが、ラッセルクサリヘビ毒の抽
出物中に含有されている、項１９に記載の方法。 ２１．項１９に記載の方法で製造されるＸａｉ因子。 ２２．血清中での半減期を延長するように改変されたＸ
ａ因子であって、該改変された型のＸａ因子が血清の存
在下で活性Ｘａ因子を生成する、Ｘａ因子。 ２３．前記改変されたＸａ因子がアシル化Ｘａ因子であ
る、項２２記載の改変されたＸａ因子。 ２４．血友病の治療に用いる製薬組成物であって、項２
２に記載の改変されたＸａ因子を、製薬的に受容可能な
賦形剤と混合した状態で含有する、製薬組成物。 ２５．動物被検体における血栓症を予防または治療する
方法であって、そのような治療を要する被検体に、項１
に記載のＸａｉ因子またはその製薬組成物の有効量を投
与することを包含する、方法。 ２６．動物被検体における炎症を予防または治療する方
法であって、そのような治療を要する被検体に、項１に
記載のＸａｉ因子またはその製薬組成物の有効量を投与
することを包含する、方法。 ２７．動物被検体における再狭窄を予防または治療する
方法であって、そのような治療を要する被検体に、項１
に記載のＸａｉ因子またはその製薬組成物の有効量を投
与することを包含する、方法。 ２８．動物被検体における移植手術時の合併症を予防ま
たは治療する方法であって、そのような治療を要する被
検体に、項１に記載のＸａｉ因子またはその製薬組成物
の有効量を投与することを包含する、方法。 ２９．ヒト被検体の血友病を治療する方法であって、そ
のような治療を要する被検体に、該被検体における血友
病の作用を相殺するのに有効な量の、改変されて血清中
での半減期を延長されたＸａ因子を投与することを包含
する、方法。The present invention provides the following items 1 to 29. 1. Position 1-139 of the light chain and 1-2 of the heavy chain shown in FIG.
A double-chain factor Xai peptide having at least 80% homology with the amino acid sequence at position 54, wherein the factor Xai is capable of competing with factor Xa during formation of a prothrombinase complex, and A double chain factor Xai peptide, wherein the protein does not provide hydrolytic activity when factor Xai is contained in the complex. 2. Whether the serine residue corresponding to residue 185 of the light chain shown in FIG. 1 has been replaced with a different amino acid, and / or
Or the factor Xai according to item 1, wherein the aspartic acid residue corresponding to the residue at position 88 of the heavy chain shown in FIG. 1 has been substituted with another amino acid. 3. Item 3. The Xai factor according to Item 2, wherein the substitution of serine is an alanyl residue and the substitution of aspartic acid is an asparagine residue. 4. A single-chain precursor polypeptide that can be converted to factor Xai by a proteolysis reaction,
The factors are positions 1-139 of the light chain and 1-
Has at least 80% homology to the amino acid sequence at position 254, the factor Xai is capable of competing with factor Xa during formation of the prothrombinase complex, and the factor Xa is contained in the complex; A single-chain precursor polypeptide that does not confer proteolytic activity when performed. 5. Item 4. Reactive with an antibody raised against factor X.
2. The polypeptide precursor according to 1. 6. A serine residue corresponding to residue 185 of the heavy chain shown in FIG. 1 has been substituted with another amino acid, and / or an aspartic acid residue corresponding to residue 88 of the heavy chain shown in FIG. The polypeptide precursor according to item 4, wherein is substituted with another amino acid. 7. The unmodified version of light chain 1-13 shown in FIG.
Item 7. The polypeptide precursor according to Item 6, which has an amino acid sequence of the amino acid at position 9 and the amino acids at positions 1-254 of the heavy chain. 8. Item 7. The polypeptide precursor according to Item 6, wherein the light and heavy chains are linked by an amino acid sequence having at least 80% homology with the activation peptide shown in FIG. 9. Item 7. The polypeptide according to Item 6, wherein the light and heavy chains are linked by an amino acid sequence consisting essentially of a protease cleavage site. 10. Item 10. The polypeptide according to Item 9, wherein the cleavage site is RKRRRK, and the light chain and the heavy chain are linked by an amino acid sequence consisting essentially of a protease cleavage site. 11. Item 6. A DNA sequence encoding the precursor polypeptide according to Item 4. 12. A recombinant capable of expressing a DNA sequence encoding the precursor polypeptide according to item 4, when the expression system is transfected into a host cell, transformed, and the host cell is cultured under conditions favorable for the expression. Item 6. An expression vector comprising a DNA sequence encoding the precursor polypeptide according to Item 4, wherein the expression system is operably linked to a control sequence for expressing the DNA. 13. Item 13. A recombinant host cell transformed with the expression system according to Item 12. 14． A method for producing a single-chain precursor polypeptide convertible to factor Xai by a protein perhydrolysis reaction, comprising a DNA encoding the single-chain precursor polypeptide
14. culturing the cell according to item 13 under conditions preferable for expressing, and recovering the produced precursor polypeptide or a proteolytic product thereof. 15. A pharmaceutical composition for use in preventing or treating thrombosis in an animal subject, wherein the pharmaceutically acceptable amount of the factor Xai according to item 1 is effective for ameliorating or preventing thrombosis. A pharmaceutical composition comprising a mixture with various excipients. 16. A pharmaceutical composition used for preventing or treating inflammation in an animal subject, which comprises administering an effective amount of the factor Xai according to item 1 to reduce or prevent inflammation in a pharmaceutically acceptable amount. A pharmaceutical composition which is contained in a mixture with a form. 17． A pharmaceutical composition for use in preventing or treating restenosis in an animal subject, wherein the pharmaceutically acceptable amount of the factor Xai according to item 1 is effective for reducing or preventing restenosis. A pharmaceutical composition comprising a mixture with various excipients. 18. A pharmaceutical composition for preventing or treating complications at the time of transplantation surgery in an animal subject, which comprises an effective amount of the factor Xai according to item 1 for alleviating or preventing the complications at the time of transplantation surgery. , A pharmaceutical composition comprising a mixture with a pharmaceutically acceptable excipient. 19. A method for preparing factor Xai useful for treating thrombosis, comprising contacting the precursor polypeptide of item 4 with an amount of a protease effective to cleave the precursor, and forming the Xai product A method comprising recovering the factor. 20. Item 20. The method according to Item 19, wherein the protease is contained in an extract of Russell's viper venom. 21. Item 20. An Xai factor produced by the method according to item 19. 22. X modified to increase half-life in serum
Factor a, wherein the modified form of factor Xa produces active factor Xa in the presence of serum. 23. 23. The modified factor Xa according to item 22, wherein the modified factor Xa is an acylated factor Xa. 24. Claims 1. A pharmaceutical composition for treating hemophilia, which comprises:
3. A pharmaceutical composition comprising the modified factor Xa according to 2 in admixture with a pharmaceutically acceptable excipient. 25. A method for preventing or treating thrombosis in an animal subject, the subject requiring such treatment comprising:
A method comprising administering an effective amount of the factor Xai or a pharmaceutical composition thereof according to the above. 26. A method for preventing or treating inflammation in an animal subject, comprising administering to a subject in need of such treatment an effective amount of the factor Xai according to item 1 or a pharmaceutical composition thereof. 27. A method for preventing or treating restenosis in an animal subject, comprising the steps of:
A method comprising administering an effective amount of the factor Xai or a pharmaceutical composition thereof according to the above. 28. A method for preventing or treating complications at the time of transplantation surgery in an animal subject, comprising administering to a subject in need of such treatment an effective amount of factor Xai or a pharmaceutical composition thereof according to item 1. Including, methods. 29. A method of treating hemophilia in a human subject, comprising providing the subject in need of such treatment with an amount of modified serum that is effective to offset the effects of hemophilia in the subject. Administering factor Xa having an increased half-life.
【００２０】[0020]
【発明の実施の形態】一般に、本発明の１つの局面に
は、本願においてＸａｉ因子と呼称される、治療に用い
るのに有用な二本鎖ポリペプチド、およびこの二本鎖タ
ンパク質の一本鎖前駆物質が含まれる。これらのペプチ
ドは、図１中で１−１３９位（軽鎖）および１−２５４
位（重鎖）に示すアミノ酸配列に約８０％相同であり、
好ましくは約９０％相同である。図１において、プレ−
プロリーダー配列は、軽鎖のＮ末端で始まる番号付けの
前に、−４０から−１の番号を付けて示してあることに
留意しなけらばならない。軽鎖には１−１３９の番号が
付けてある。介在トリペプチドＲＫＲは、成熟Ｘ因子に
は欠失しており、番号を付けていない。この介在トリペ
プチドに続いて始まる活性化ペプチドには、１−５２の
番号が付けてある；活性化ペプチドの「５３位」と以後
呼称されるイソロイシンは、実際には、活性化型の重鎖
の第１アミノ酸である。図中の番号付けはこのアミノ酸
から再出発するので、重鎖には１−２５４の番号が付け
てある。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION In general, one aspect of the present invention includes a double-chain polypeptide useful for therapy, referred to herein as Factor Xai, and a single chain of the double-chain protein. Precursors are included. These peptides are shown in Figure 1 at positions 1-139 (light chain) and 1-254.
About 80% homologous to the amino acid sequence shown at position (heavy chain),
Preferably it is about 90% homologous. In FIG.
It should be noted that the proleader sequence is numbered from -40 to -1 before the numbering beginning at the N-terminus of the light chain. The light chains are numbered 1-139. The intervening tripeptide RKR is missing in mature factor X and is not numbered. The activating peptide beginning following this intervening tripeptide is numbered 1-52; isoleucine, hereafter referred to as "position 53" of the activating peptide, is actually an activated heavy chain Is the first amino acid. Since the numbering in the figure restarts from this amino acid, the heavy chains are numbered 1-254.
【００２１】二本鎖ペプチドＸａｉ因子の実施態様は、
プロトロンビナーゼ複合体を形成するのに有効であり、
Ｘａ因子を含有する天然のプロトロンビナーゼ複合体の
形成を阻害（またはその生成と競合）するそれらの能力
によって決定される。プロトロンビナーゼ複合体の形成
を阻害するそれらの能力は、上で引用されたＫｒｉｓｈ
ｎａｓｗａｍｙ，Ｓ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９
８８）２６３：３８２３−３８３４の方法によって簡便
に測定することができる。しかしながら、このＸａｉ因
子がプロトロンビナーゼ複合体に組み込まれると、その
複合体はタンパク質分解活性を示すことができない。こ
れは、ｖａｎ．Ｄｉｅｉｊｅｎ，Ｇ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ（１９８１）２５６：３４３３、またはＳｋ
ｏｇｅｎ，Ｗ．Ｆ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９
８４）２５６：２３０６の方法で測定できる。これらの
Ｘａｉ因子タンパク質は、ヒトＸ因子に特異的な市販の
抗体を含めて、天然のＸａ因子またはＸ因子に対して生
じた抗体と免疫反応性であるかまたは免疫反応性でな
い。Ｘａｉ因子タンパク質は抗体血栓性物質である。An embodiment of the double-chain peptide factor Xai comprises:
Effective in forming a prothrombinase complex,
Determined by their ability to inhibit (or compete with) the formation of the native prothrombinase complex containing factor Xa. Their ability to inhibit the formation of the prothrombinase complex is described by Krish, cited above.
naswamy, S.M. , J Biol Chem (19
88) 263: 3823-3834. However, when this factor Xai is incorporated into the prothrombinase complex, the complex cannot show proteolytic activity. This is the van. Dieijen, G .; Et al., J Biol
Chem (1981) 256: 3433, or Sk.
Ogen, W.C. F. Et al., J Biol Chem (19
84) It can be measured by the method of 256: 2306. These Factor Xai proteins are immunoreactive or not immunoreactive with native Factor Xa or antibodies raised against Factor X, including commercially available antibodies specific for human Factor X. Factor Xai protein is an antibody thrombotic substance.
【００２２】本発明はまた、Ｘａ因子に対する上記の不
活性競合体の前駆物質に関する。これらの前駆物質一群
は、Ｘ’因子と呼称される、新規な改変型のＸ因子であ
り、ここでその重鎖の４２、８８または１８５位の残基
の１つ以上が別のアミノ酸残基に変換され、その結果そ
のペプチドのタンパク質分解特性が不活性化される。こ
のＸ因子改変型は、活性化ペプチドに結合された軽鎖配
列および重鎖配列を少なくとも含んでいる。介在トリペ
プチド（軽鎖のＣ末端と活性化ペプチドのＮ末端との
間）とプレ−プロリーダー配列はあってもなくてもよ
い。従ってＸ’因子は、一本鎖タンパク質であるか（ト
リペプチドが含まれている場合）、またはＸａ因子の二
本鎖前駆物質である（トリペプチドが欠失している場
合）。The present invention also relates to precursors of the above-mentioned inactive competitors for factor Xa. One group of these precursors is a novel, modified form of factor X, termed factor X ', wherein one or more of the residues at positions 42, 88 or 185 of the heavy chain is another amino acid residue. Which results in inactivation of the proteolytic properties of the peptide. The modified factor X comprises at least a light chain sequence and a heavy chain sequence linked to the activation peptide. The intervening tripeptide (between the C-terminus of the light chain and the N-terminus of the activation peptide) and the pre-proleader sequence may or may not be present. Thus, factor X 'is a single-chain protein (if a tripeptide is included) or a double-chain precursor of factor Xa (if the tripeptide is deleted).
【００２３】好ましくは、プロテアーゼ活性部位の残基
の変更は、欠失か、または、二本鎖タンパク質の三次元
コンホメーションを維持するために、保存的な、置換し
たアミノ酸への変換である。「保存的」という用語によ
って、適正な活性を保持する置換というよりはむしろ、
適正なコンホメーションを保持する置換を意味する。従
って４２位のヒスチジン残基は、好ましくはフェニルア
ラニンで置換され；８８位のアスパラギン酸は、好まし
くはアスパラギンまたはグルタミンで置換され、そして
１８５位のセリン残基は、好ましくはアラニンもしくは
グリシンで置換される。Preferably, the alteration of a residue in the protease active site is a deletion or conversion to a conservative, substituted amino acid in order to maintain the three-dimensional conformation of the double-stranded protein. . By the term "conservative", rather than a substitution that retains the correct activity,
It refers to a substitution that retains the proper conformation. Thus, the histidine residue at position 42 is preferably substituted with phenylalanine; the aspartic acid at position 88 is preferably substituted with asparagine or glutamine, and the serine residue at position 185 is preferably substituted with alanine or glycine. .
【００２４】本発明の抗血栓性二量体ペプチドの前駆物
質の他の群は、Ｘ’ｉ因子と呼称される。Ｘ’ｉ因子前
駆物質には、活性化ペプチドの少なくともかなりの部
分、好ましくは活性化ペプチド全体が欠失している。し
かしながら、二本鎖型のＸ’ｉ因子の前駆物質は、軽鎖
と重鎖との間にタンパク質分解開裂部位を保持していな
ければならない。それゆえに、内因性タンパク質分解を
受けるアミノ酸は、軽鎖のカルボキシ末端を、開裂部位
によって重鎖のＮ末端へ延ばす、一本鎖前駆物質型に便
宜上含まれる。二本鎖Ｘ’ｉ因子の一本鎖前駆物質（プ
レ−プロリーダーを含む）の代表的な実施態様は、活性
化ペプチド配列がないこと（従ってＸａｉ因子になる）
によって自動的に活性化され、図３に示されている。こ
の実施態様では、ヘキサペプチド配列の腿ＲＫＲＲＫＲ
が、軽鎖のＣ末端を重鎖のＮ末端のイソロイシン残基に
直接結合している。この一本鎖Ｘ’ｉ因子が開裂して
Ｘ’ａｉになる。このような改変Ｘ’ｉ型前駆物質を構
築する際には、疎水性アミノ酸を重鎖のＮ末端に保持し
なけらばならない（天然の場合はイソロイシン）。例え
ば、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，”Ａｔｌａｓ ｏｆ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ”（１９７２）５：８８−８９（Ｂｉｏｍｅ
ｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈ．Ｄ．
Ｃ．）およびＧｒｅｅｒ，Ｊ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉ
ｏｌ．（１９８１）１５３：１０４３−１０５３を参照
せよ。Another group of precursors of the antithrombotic dimeric peptide of the present invention is called factor X'i. The factor X'i precursor lacks at least a substantial portion of the activation peptide, preferably the entire activation peptide. However, the precursor of the double-chain form of factor X'i must retain a proteolytic cleavage site between the light and heavy chains. Therefore, amino acids that undergo endogenous proteolysis are conveniently included in the single-chain precursor form, which extends the carboxy terminus of the light chain to the N-terminus of the heavy chain by a cleavage site. An exemplary embodiment of a single-chain precursor (including a pre-proleader) of a double-chain factor X′i is the absence of an activating peptide sequence (and thus becomes factor Xai).
Activated automatically by the system as shown in FIG. In this embodiment, the hexapeptide sequence thigh RKRRRKR
Has the C-terminus of the light chain directly linked to the isoleucine residue at the N-terminus of the heavy chain. This single-chain factor X'i is cleaved to X'ai. In constructing such modified X'i-type precursors, a hydrophobic amino acid must be retained at the N-terminus of the heavy chain (isoleucine in the natural case). See, for example, Dayhoff, M .; O. , "Atlas of
Protein Sequence and Stru
culture "(1972) 5: 88-89 (Biome
d. Res. Foundation, Wash. D.
C. ) And Greer, J. et al. , J. et al. Molec. Bi
ol. (1981) 153: 1043-1053.
【００２５】一本鎖Ｘ’因子前駆物質もまた新規である
ことは明らかであり、タンパク質分解によって開裂され
ると、通常の、酵素的に活性な型の二量体タンパク質で
あるＸａ因子が得られる。これの対応する構成を図２に
示す。It is clear that the single-chain Factor X 'precursor is also novel, and when proteolytically cleaved, Factor Xa, a normal, enzymatically active form of the dimeric protein is obtained. Can be The corresponding configuration is shown in FIG.
【００２６】従って、Ｘａ因子またはＸａｉ因子のいず
れかの一本鎖前駆物質が、組換え法によって適切な宿主
細胞中に産生されると、その宿主細胞の内在性酵素が
（１）一本鎖前駆物質Ｘ因子またはＸ’因子を開裂して
二本鎖型にし、一本鎖Ｘ因子またはＸ’因子の場合、さ
らに活性化ペプチドを開裂することによってその因子を
活性化し；Ｘ’因子一本鎖前駆物質の場合、活性化ペプ
チドが存在しないので、その一本鎖前駆物質は開裂され
て二量体ペプチドになったときに自動的に活性化され
る。Ｘ因子前駆物質については、活性化ペプチドを含む
二本鎖型もまた、ラッセルクサリヘビ毒のＸ因子の活性
化因子のような適切なプロテアーゼを用いて、インビト
ロで開裂され得る。Ｘａ因子またはＸａｉ因子のいずれ
かは、さらに以下に述べるように、適当なコドンを変更
することによって活性部位が不活性化されるか否かによ
って得られる。Therefore, when a single-chain precursor of either factor Xa or factor Xai is produced in a suitable host cell by recombinant methods, the endogenous enzyme of the host cell will be (1) single-stranded Cleaving the precursor factor X or factor X 'to a double-stranded form and, in the case of single-chain factor X or factor X', activating the factor by further cleaving the activation peptide; In the case of a chain precursor, since there is no activating peptide, the single-chain precursor is automatically activated when it is cleaved to a dimeric peptide. For Factor X precursors, the double-chain form containing the activating peptide can also be cleaved in vitro using a suitable protease, such as the Factor X activator of Russell's viper venom. Either factor Xa or factor Xai is obtained as described below, depending on whether the active site is inactivated by changing the appropriate codons.
【００２７】本願中に用いられる用語を要約するため
に、以下の用語解が有用であり得る：「Ｘｉ因子」は、
天然のもしくは組換え法で生成した、一本鎖または二本
鎖のＸ因子配列を意味し、図１に示すように、本質的
に、少なくともそのＮ末端に活性化ペプチドを結合した
重鎖、および軽鎖を含む。これらは図中に示すように、
開裂配列によって連結されていてもいなくてもよい。
「ｒＸ」は、特に組換え法で生成した型のこの因子を意
味する。To summarize the terms used in this application, the following terminology may be useful: "Factor Xi"
A single or double chain factor X sequence, natural or recombinantly produced, as shown in FIG. 1, essentially a heavy chain having an activation peptide attached at least to its N-terminus, And light chains. These are shown in the figure,
It may or may not be linked by a cleavage sequence.
"RX" means this factor, especially in a recombinantly produced form.
【００２８】「Ｘｉ因子」は、上記のように活性部位を
改変することによって、タンパク質分解活性を欠いた、
組換え法で生成した型のＸ因子を意味する。「ｒＸｉ」
という表示もまたこのタンパク質に用いられる。"Factor Xi" lacks proteolytic activity by modifying the active site as described above.
It means the type X factor produced by recombinant methods. "RXi"
Is also used for this protein.
【００２９】「Ｘａ因子」は、軽鎖および重鎖だけを含
む、天然のもしくは組換え法で生成した、酵素として活
性な二量体を意味する。この複合体中には活性化ペプチ
ドは存在しない。「ｒＸａ」は特に組換え法で生成した
ときのこの複合体を意味する。"Factor Xa" means a naturally occurring or recombinantly produced enzymatically active dimer containing only the light and heavy chains. No activating peptide is present in this complex. "RXa" refers to this complex, especially when produced by recombinant methods.
【００３０】「Ｘａｉ因子」は、改変された型のＸａ因
子を意味し、結合してプロトロンビナーゼ複合体を形成
するという意味で活性化されているが、その活性部位の
改変によってセリンプロテアーゼ活性を有しない。この
タンパク質が組換え法によってのみ生成されるとき、
「ｒＸａｉ」もまたこの複合体を呼ぶのに用いられる。"Factor Xai" means a modified form of factor Xa, which is activated in the sense that it binds to form a prothrombinase complex, but whose serine protease activity is altered by modification of its active site. Does not have. When this protein is produced only by recombinant methods,
"RXai" is also used to refer to this complex.
【００３１】「Ｘ’因子」は、改変された一本鎖型のＸ
因子を意味し、図２に示すように、軽鎖、重鎖、および
中間の特異的なタンパク質分解開裂部位だけを有してい
る。この一本鎖前駆物質はまた、プレ−プロ配列を含ん
でいることもある。この因子も組換え法だけで得られる
場合、それもまた「ｒＸ’」と呼称される。活性化させ
るためにプロテアーゼで開裂されるとき、その生成物は
Ｘａ因子（またはｒＸａ）と区別できないので、この用
語を再度使用する。"Factor X '" is a modified single-chain form of X
Meaning factor, as shown in FIG. 2, has only a light chain, a heavy chain, and an intermediate specific proteolytic cleavage site. The single-stranded precursor may also include a pre-pro sequence. If this factor is also obtained by recombinant methods alone, it is also called "rX '". This term is used again because when cleaved with a protease to activate the product is indistinguishable from factor Xa (or rXa).
【００３２】同様に「Ｘ’ｉ因子」は、上記のようにそ
の触媒部位でが不活性化された改変型のＸ’因子を意味
する。１つの型を図３に示す。二本鎖型に変換すると、
活性化ペプチドが前駆物質中に存在しないので、生成物
はＸａｉまたはｒＸａｉと区別できない。Similarly, "Factor X'i" means a modified form of Factor X 'in which the catalytic site has been inactivated as described above. One version is shown in FIG. When converted to double-stranded form,
The product is indistinguishable from Xai or rXai because the activating peptide is not present in the precursor.
【００３３】「アシル化Ｘａ因子」または「ＡｃＸａ」
は、特に断わりがなけらば、組換え法で生成されるかさ
れないかにかかわらず、次のようなＸａ因子を意味す
る。すなわち、１８５位のセリン残基が、血清中での半
減期が少なくとも５〜１０分間、好ましくは１５分間を
越えるＸａ因子を与え、かつこの期間にわたって活性型
であるＸａ因子を放出する置換基でブロックされている
Ｘａ因子を意味する。血清中での半減期は、適切に標識
された型を用いて、インビボで直接測定され得る。しか
しながら、寿命を延長されたＡｃＸａが、必要な時間枠
内で活性因子をインビトロで生成する能力は、Ｘａ因子
が触媒であるインビトロ検定法を基準として用いて評価
するのが好ましい。これらの条件下で、本発明で用いる
適切な型のＡｃＸａには、約５分間から数時間の半減期
が達成できるような、ｐＨが７．４で３７℃の等張水性
媒体中における加水分解の速度定数を有するものが含ま
れる。その半減期は、所望により、凝固を活性化するそ
の能力、またはＸａ形成に対する基準としてプロトロン
ビナーゼ反応を用いて、アシル化Ｘａ因子の加水分解速
度を測定することによって、インビトロで直接決定され
得る。"Acylated factor Xa" or "AcXa"
Means, unless otherwise indicated, factor Xa, whether produced by recombinant methods or not: That is, the serine residue at position 185 is a substituent that provides factor Xa with a half-life in serum of at least 5 to 10 minutes, preferably greater than 15 minutes, and releases active factor Xa over this period. Means blocked factor Xa. Half-life in serum can be measured directly in vivo using appropriately labeled forms. However, the ability of extended life AcXa to produce an active agent in vitro within the required time frame is preferably assessed using an in vitro assay in which factor Xa is a catalyst. Under these conditions, a suitable type of AcXa for use in the present invention has a hydrolysis in an isotonic aqueous medium at pH 7.4 and 37 ° C. such that a half-life of about 5 minutes to several hours can be achieved. Having a rate constant of Its half-life can be determined directly in vitro, if desired, by measuring its ability to activate coagulation, or the rate of hydrolysis of acylated factor Xa, using the prothrombinase reaction as a measure for Xa formation. .
【００３４】（本発明のペプチドの調製）ヒトのＸ因子
のゲノム構成およびコーディング配列は公知であり、そ
のｃＤＮＡは検索され配列が決定されている（Ｌｅｙｔ
ｕｓ，Ｓ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉＵＳＡ（１９８４）８１：３６９９；Ｋａｕｌ，
Ｒ．ら、Ｇｅｎｅ（１９８６）４１：３１１−３１
４）。その全ｃＤＮＡ配列を図４に示す。(Preparation of Peptide of the Present Invention) The genomic constitution and coding sequence of human factor X are known, and its cDNA has been searched and sequenced (Leyt
us, S.M. P. Et al., Proc Natl Acad S
ciUSA (1984) 81: 3699; Kaul,
R. Et al., Gene (1986) 41: 311-31.
4). The entire cDNA sequence is shown in FIG.
【００３５】全長のＸ因子をｃＤＭの挿入物は、部位特
異的変異誘発を行うためにＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３
ｍｐ１９のベクター中にサブクローニングされる。（Ｘ
因子をコードする正しい配列はジデオキシ配列決定法で
確認される。）標準の改変法は現在、当該技術分野では
容易に利用司能なので、Ｘ因子をコードする配列を改変
して、Ｘ’因子、Ｘｉ因子、Ｘ’ｉ因子をコードするＤ
ＮＡが得られる。The full length factor X was inserted into the cDM insert using either M13mp18 or M13 to perform site-directed mutagenesis.
Subcloned into mp19 vector. (X
The correct sequence encoding the factor is confirmed by dideoxy sequencing. ) Since standard modifications are currently readily available in the art, the sequence encoding factor X can be modified to modify the sequence encoding factor X ', factor Xi, factor X'i.
NA is obtained.
【００３６】Ｘ’因子、Ｘｉ因子およびＸ’ｉ因子の改
変コーディング配列を、次いで、ポリペプチドを組換え
法で産生させるために、適切な発現ベクターに結合す
る。その発現ベクター中には、哺乳類宿主のような適合
性宿主細胞中で発現させるために、プレプロリーダー配
列を保持させる方が好ましい。細菌または酵母での発現
が所望の場合、細菌中のペニシリナーゼ配列または酵母
中のα因子配列のような適合性リーダー配列を置換する
ことが望ましい。あるいは、細胞内タンパク質を産生さ
せるために、ＡＴＧ開始コドンを、軽鎖をコードする配
列のアミノ酸１の前に直接配置してもよい。The factor X ', factor Xi and the modified coding sequence of factor X'i are then ligated into a suitable expression vector in order to produce the polypeptide recombinantly. The expression vector preferably retains a preproleader sequence for expression in a compatible host cell, such as a mammalian host. If expression in bacteria or yeast is desired, it may be desirable to replace a compatible leader sequence such as a penicillinase sequence in bacteria or an α-factor sequence in yeast. Alternatively, the ATG start codon may be placed directly before amino acid 1 of the light chain encoding sequence to produce an intracellular protein.
【００３７】宿主および発現制御系の選択は、所望の結
果の性質で支配される。タンパク質分解による開裂によ
り内因性活性化が所望の場合は、哺乳類系が好ましい。
しかしながら、培養の簡便さを提供する微生物内での生
成は、必要なカルボキシグルタミル残基を産生させるた
めにカルボキシル化のインビトロ系が使用するか、ある
いはこの翻訳後のプロセシング系を本来欠いている微生
物または他の宿主が形質転換されてそれを提供するなら
ば、除外されない。組換えＤＮＡ配列の種々の発現系
は、当該技術分野で公知である。The choice of host and expression control system will be governed by the nature of the desired result. If endogenous activation is desired by proteolytic cleavage, mammalian systems are preferred.
However, production in microorganisms that provides the convenience of cultivation can be achieved by using in vitro systems of carboxylation to produce the necessary carboxyglutamyl residues, or by microorganisms that naturally lack this post-translational processing system. Or if another host is transformed to provide it. Various expression systems for recombinant DNA sequences are known in the art.
【００３８】Ｘ’因子、Ｘｉ因子またはＸ’ｉ因子をコ
ードする改変ＤＮＡは、好ましくはクローニングベクタ
ーおよび発現ベクターに結合するためのリンカーを備え
ている。このようなベクターを調製する方法は当該技術
分野では充分に理解されている。所望のＸ’因子、Ｘｉ
因子またはＸ’ｉ因子をコードするＤＮＡは、予定の組
換え宿主細胞の性質によって、プロモーター、上流のエ
ンハンサー、終止配列などを含む制御配列と、作動可能
な結合で連結されている。酵母、哺乳類または鳥類また
は昆虫の細胞および植物細胞を含む、原核生物の宿主と
各種の真核生物を含めた各種の宿主内に、異種の遺伝子
を発現させる方法は、現在利用することができる。発現
ベクター中の制御配列およびマーカーの種類は、これら
の宿主に対して適当に選択される。The modified DNA encoding factor X ', factor Xi or factor X'i preferably comprises a cloning vector and a linker for binding to an expression vector. Methods for preparing such vectors are well understood in the art. Desired X 'factor, Xi
The DNA encoding the factor or factor X'i is operably linked to control sequences, including promoters, upstream enhancers, termination sequences, and the like, depending on the nature of the intended recombinant host cell. Methods for expressing heterologous genes in various hosts, including prokaryotic hosts and various eukaryotes, including yeast, mammalian or bird or insect cells and plant cells, are currently available. The types of control sequences and markers in the expression vector are appropriately selected for these hosts.
【００３９】例えば、原核生物の宿主には、ｔｒｐプロ
モーターおよびλファージＰLプロモーターのような誘
導プロモーターを含む各種プロモーターが使用され得
る。ｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモー
ターが用いられ得るが、このプロモーターは、ｌａｃオ
ペレーターと共同でｔｒｐポリメラーゼ結合領域を含有
している。適切なマーカーは、一般に、構成物質耐性に
関するマーカーである。一方、哺乳類の細胞培養に通常
用いられるプロモーターは、ウィルス由来のものであ
り、例えば初期および後期のＳＶ４０プロモーターおよ
びアデノウィルスプロモーターがある。メタロチオネイ
ン−ＩＩプロモーターのような、哺乳類の調節可能なプ
ロモーターもまた使用され得る。このメタロチオネイン
−ＩＩプロモーターは、グルココルチコイド類または重
金属類によって調節される。これらのプロモーター系
は、典型的な哺乳類宿主に対して適合性であり、そのう
ち最も普通に用いられるのは、チャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）細胞である。For example, for prokaryotic hosts, various promoters may be used, including inducible promoters such as the trp promoter and the phage lambda P L promoter. A hybrid promoter such as the tac promoter can be used, but this promoter contains a trp polymerase binding region in cooperation with the lac operator. Suitable markers are generally markers for component resistance. On the other hand, promoters commonly used for mammalian cell culture are derived from viruses, such as the early and late SV40 promoter and adenovirus promoter. Mammalian regulatable promoters, such as the metallothionein-II promoter, may also be used. The metallothionein-II promoter is regulated by glucocorticoids or heavy metals. These promoter systems are compatible with typical mammalian hosts, of which the most commonly used are Chinese hamster ovary (CHO) cells.
【００４０】他の普通に使用される系は、昆虫細胞と適
合性のバキュロウィルス発現系である。例えばノパリン
シンテナーゼプロモーターとともに用いられる植物細
胞、および解糖経路において重要な酵素に関連するプロ
モーターとともに用いられる酵母細胞もまた使用され得
る。”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ１ｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ａｕｓｕｂｅ
ｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎ
ｃｅ出版、最新版の適当な章に、多数の適切な発現系が
記載されている。Another commonly used system is a baculovirus expression system that is compatible with insect cells. For example, plant cells used with the nopaline synthetase promoter and yeast cells used with promoters associated with enzymes important in the glycolytic pathway can also be used. "Current Protocols in M
olecular Biology, "Ausube
1, F. M. Hen, Wiley Interscience
A number of suitable expression systems are described in the appropriate section of the latest edition of ce publication.
【００４１】本発明のＡｃＸａは、例えば、先に引用し
たＣａｓｓｅｌｓ，Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ（１９
８７）２４７：３９５−４００または米国特許第４，３
３７，２４４号に記載もしくは参照されているのと類似
の方法に従って、組換え法で生成されているかまたは血
漿から単離されているかにかかわらず、Ｘａ因子を標準
のアシル化反応によって調製する。適切なエステルに
は、４−トルオイルエステル、３，３−ジメチルアクリ
リルエステル、シクロヘキシリジンアセチルエステル、
シクロヘキシ−１−エンカルボニルエステル、１−メチ
ルシクロヘキシリジンアセチルエステル、４−アミノベ
ンゾイルエステル、γ−グアニジノベンゾイルエステ
ル、４−アニソイルエステル、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルア
ミノベンゾイルエステル、およびＰＤＡＥＢ（４−Ｎ一
（２−Ｎ’（３−（２−ピリジルジチオ）−プロペニ
ル）アミノ−エチル）アミノベンゾイルエステルが含ま
れる。一般に、アシル化剤は、活性化型の無毒の酸であ
り、これは１つのカルボキシルが置換されている飽和、
不飽和もしくは芳香族の５または６炭素環を与える。こ
の環は、アミノ、アルコキシ、アルキル、追加の環系、
または他の非干渉性の無毒の置換基のような置換基を、
さらに含み得る。セリンのヒドロキシル基をアシル化で
きるか、さもなければセリンを可逆的な様式でブロック
できる任意の化合物が、ＡｃＸａを合成するのに適切で
ある。米国特許第４，３３７，２４４号に記載されるよ
うに、一般に直接アシル化剤または逆アシル化剤が用い
られ得る。直接アシル化剤の場合、アシル化部分はそれ
自体がＸａ因子の触媒部位に引きつけられるが、逆アシ
ル化接近の場合は、従って脱離基が引きつけられる。ア
シル化型のＸａは、次いで、標準の精製法、例えば透
析、クロマトグラフィー、選択抽出法などを用いて反応
混合物から精製される。The AcXa of the present invention is described, for example, in Cassels, R .; Et al., Biochem J (19
87) 247: 395-400 or U.S. Pat.
Factor Xa, whether recombinantly produced or isolated from plasma, is prepared by standard acylation reactions according to methods analogous to those described or referenced in 37,244. Suitable esters include 4-toluoyl ester, 3,3-dimethylacrylyl ester, cyclohexylidine acetyl ester,
Cyclohex-1-enecarbonyl ester, 1-methylcyclohexylidine acetyl ester, 4-aminobenzoyl ester, γ-guanidinobenzoyl ester, 4-anisoyl ester, 4-N, N-dimethylaminobenzoyl ester, and PDAEB (4 -N- (2-N '(3- (2-pyridyldithio) -propenyl) amino-ethyl) aminobenzoyl esters Generally, the acylating agent is an activated, non-toxic acid which comprises Saturated wherein one carboxyl is substituted,
Provides an unsaturated or aromatic 5 or 6 carbocycle. The ring may be an amino, alkoxy, alkyl, additional ring system,
Or other substituents, such as non-interfering non-toxic substituents,
It may further include. Any compound capable of acylating the hydroxyl group of serine or otherwise blocking serine in a reversible manner is suitable for synthesizing AcXa. Generally, direct or reverse acylating agents can be used, as described in US Patent No. 4,337,244. In the case of direct acylating agents, the acylating moiety itself is attracted to the catalytic site of factor Xa, whereas in the case of reverse acylation access, the leaving group is therefore attracted. The acylated form of Xa is then purified from the reaction mixture using standard purification methods such as dialysis, chromatography, selective extraction, and the like.
【００４２】ＡｃＸａの医薬として役立つ本発明の化合
物は、インビボで適当なクリアランス時間を保証する適
当な脱アクリル化速度を有しなければならない。この脱
アクリル化速度は、緩衝液中、インビトロで少なくとも
５分間の半減期を有している場合、プロトロンビナーゼ
検定法および／または凝固検定法を用いて、測定され得
る。脱アクリル化反応は、Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．Ｇ．
ら、”Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎ Ｆｉｂｒｏｎｏｌｏｓｉ
ｓ（１９８５）ＶＩＩ巻、ｐｐ．２２７−２３１（Ｃｈ
ｕｒｃｈｉｌｌＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ）に記載されて
いるようにして直接測定され得る。プロトロンビナーゼ
および凝固検定法は、Ｗｏｌｆ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ Ｂｉ
ｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９１）（印刷中）に記載されてい
る。The compounds of the invention which serve as medicaments of AcXa must have a suitable deacrylation rate to ensure a suitable clearance time in vivo. This deacrylation rate can be measured using a prothrombinase assay and / or a coagulation assay if it has a half-life of at least 5 minutes in vitro in buffer. The deacrylation reaction is described in Smith, R .; A. G. FIG.
Et al., "Progressin Fibronolosi
s (1985) Vol. 227-231 (Ch
urchill Livingstone) can be measured directly. Prothrombinase and coagulation assays are described in Wolf, D .; L. Et al., J Bi
ol Chem (1991) (during printing).
【００４３】（投与および用途）本発明のＸａｉ因子ペ
プチドはプロトロンビナーゼ阻害剤であるので、血栓症
によって複雑になった処置法、および病因がトロンビン
生成を伴う症状に有用である。これらの症状には、冠状
および末梢の血管形成術およびアテレクトミーを含む血
管介入中、および血管バイパス処置（末梢および冠状
の）の前後での不安定狭心症（すなわち安静狭心症）お
よび急性血管閉鎖、心筋梗塞形成に対する血栓崩壊治療
後の再閉塞、血栓による発作（徐々にひどくなる発
作）、および脈管炎による血栓症（川崎病）のような動
脈血栓症を伴う症状が含まれる。また下肢の深部静脈の
血栓症、肺塞栓症、腎静脈、肝静脈および下大静脈の血
栓症、ならびに海綿静脈洞の血栓症のような静脈血栓症
を伴う症状も含まれる。他の標的症状としては、散在し
た脈管内凝固を伴う敗血症、他の状況における散在した
脈管内凝固、血栓性血小板減少性紫斑病、および未知の
病因によるまれな症状（抗凝血性ループス（Ｌｕｐｕｓ
ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ））のような凝固系の散
在性活性化を伴う症状である。(Administration and Use) Since the factor Xai peptide of the present invention is a prothrombinase inhibitor, it is useful for a treatment method complicated by thrombosis and a condition whose etiology involves thrombin generation. These conditions include unstable angina (ie, resting angina) and acute vasculature during vascular interventions, including coronary and peripheral angioplasty and atherectomy, and before and after vascular bypass procedures (peripheral and coronary). Includes symptoms associated with arterial thrombosis such as closure, reocclusion after thrombolytic treatment for myocardial infarction, thrombotic attacks (gradually worsening attacks), and thrombosis due to vasculitis (Kawasaki disease). Also included are conditions associated with venous thrombosis, such as deep vein thrombosis of the lower limbs, pulmonary embolism, renal vein, hepatic vein and inferior vena cava, and cavernous sinus thrombosis. Other target symptoms include sepsis with interspersed intravascular coagulation, interspersed intravascular coagulation in other settings, thrombotic thrombocytopenic purpura, and rare symptoms of unknown etiology (anticoagulant lupus (Lupus)
anticoagulant)), which are accompanied by diffuse activation of the coagulation system.
【００４４】本発明のＸａｉの因子はまた、心肺バイパ
ス、器官の採取時、血液製品または血液試料の調製時、
器官の輸送時および移植時および受容者の関連する治療
時において、抗凝固剤および抗炎症剤としても有用であ
る。徐放型のＸａｉ因子は、留置血管内器具（ｉ．ｖ．
ｓ、カテーテル、移植片、パッチ）に特に有用である。
血栓症はまた、血管形成術、アテレクトミーまたは血
管内膜切除術のような血管介入に続いて、直接的または
間接的に平滑筋細胞の増殖を起こすことによって起こる
再狭窄にも関与しているので、本発明のＸａｉ因子はま
たこの症状の治療にも有用である。The factor of Xai according to the invention may also be used for cardiopulmonary bypass, for organ collection, for the preparation of blood products or blood samples,
It is also useful as an anticoagulant and anti-inflammatory during organ transport and transplantation and during related treatment of the recipient. Sustained release factor Xai is available in indwelling intravascular devices (iv.
s, catheters, implants, patches).
Thrombosis is also involved in restenosis caused by the proliferation of smooth muscle cells, directly or indirectly, following vascular interventions such as angioplasty, atherectomy or endarterectomy. The factor Xai of the present invention is also useful for treating this condition.
【００４５】成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）は、プロ
血栓（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ）内皮が炎症および
増殖の成分とともに存在していると思われる「内毒素」
疾患であると考えられる；従って、Ｘａｉ因子はまたＡ
ＲＤＳの治療にも有用である。治療に用いる本発明のＸ
ａｉ因子ペプチドは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，
最新版、Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されているように、
典型的に注射によってタンパク質を投与するのに通常用
いられる賦形剤を用いて、投与用に調剤される。抗血栓
症効果を与えるために、Ｘａｉ因子タンパク質は、好ま
しくは注射により、および好ましくは静脈注射によって
全身に投与される。投与量のレベルは、被検者の症状お
よび選択される特定のＸａｉ因子の実施態様を含む、多
くの因子に依存している。しかしながら、適切な投与量
の範囲は、連続注射投与量当り１人の患者に対して１〜
５０ｍｇのオーダーである。注射を行うために、このタ
ンパク質は、例えばハンクス液、リンゲル液、ブドウ糖
溶液、および各種の緩衝液のような液体媒体に溶解させ
るかまたは懸濁させる。安定剤のような追加の賦形剤も
また使用され得る。[0045] Adult respiratory distress syndrome (ARDS) is a "endotoxin" in which prothrombotic endothelium appears to be present with components of inflammation and proliferation.
It is considered a disease; therefore, factor Xai also
It is also useful for treating RDS. X of the invention for use in therapy
The ai factor peptide is, for example, Remington's
Pharmaceutical Sciences,
Mack Publishing Company,
As described in the latest edition, Easton, PA,
It is typically formulated for administration using excipients commonly used to administer the protein by injection. To provide an antithrombotic effect, the Factor Xai protein is administered systemically, preferably by injection, and preferably by intravenous injection. Dosage levels will depend on many factors, including the condition of the subject and the particular Factor Xai embodiment selected. However, the appropriate dosage range is from 1 to 1 patient per continuous injection dose.
It is on the order of 50 mg. For injection, the protein is dissolved or suspended in a liquid medium such as Hanks's solution, Ringer's solution, dextrose solution, and various buffers. Additional excipients such as stabilizers may also be used.
【００４６】本発明のペプチドは、注射の他に、坐剤、
経口投与、鼻腔内噴霧法を含む経粘膜投与、および徐放
性製剤によって全身に投与され得る。他の製剤には、リ
ポソームのような被包製剤が含まれる。The peptide of the present invention can be used, in addition to injection, for suppositories,
It can be administered orally, transmucosally, including intranasal spraying, and systemically via sustained release formulations. Other formulations include encapsulated formulations such as liposomes.
【００４７】Ｘａｉ因子は、治療剤としての用途に加え
て、ポリクローナル抗血清を生成させるか、または不朽
化パートナーに融合させて、このペプチドに特異的なモ
ノクローナル抗体の起源が得られ得る細胞を作るために
使用され得る。これらの抗体は、受動的治療または診断
の手段として有用である。改変されてインビボでの半減
期が延長された、本発明のＸａ因子は、血友病の原因が
Ｘ因子の遺伝子にあるのか、またはさらに広く蔓延して
いる種類の血友病ＡおよびＢにあるのかにかかわらず、
血友病を治療するのに有用である。この用途では、半減
期を延長されたＸａ因子を、Ｘａｉ因子について先に述
べたのと類似の投与量レベルおよび製剤を用いて、非経
口でまたは全身に投与される。投与は典型的に注射によ
って行われるが、経粘膜法、経皮法などのような他の全
身系の方法もまた利用され得る。これらの投与経路に用
いる製剤は、上記のものと同様でる。特に、当該技術分
野で広く知られているような各種の小胞または徐放系を
利用するのが有利である。例えばＧｉｌｅｓ，Ａ．Ｒ．
ら、Ｂｒｉｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ（１９８８）６９：
４９１−４９７には、ホスファチジルコリン−ホスファ
チジルセリンの小胞にＸａ因子を配合することが記載さ
れている。同様に、寿命を延長されたＸａ因子はこの方
式で投与され得る。Factor Xai, in addition to its use as a therapeutic, generates polyclonal antisera or is fused to an immortalizing partner to create cells from which a source of monoclonal antibodies specific for this peptide may be obtained. Can be used for These antibodies are useful as passive therapeutic or diagnostic tools. The factor Xa of the present invention, which has been modified to have an increased half-life in vivo, has been shown to contribute to the hemophilia A and B, whether the cause of haemophilia is in the gene of factor X or the more widespread type. Regardless of whether
Useful for treating hemophilia. In this use, extended half-life Factor Xa is administered parenterally or systemically, using dosage levels and formulations similar to those described above for Factor Xai. Administration is typically by injection, but other systemic methods such as transmucosal, transdermal, and the like may also be employed. The formulations used for these administration routes are the same as those described above. In particular, it is advantageous to utilize various vesicles or sustained release systems as are widely known in the art. See, for example, Giles, A .; R.
Et al., Brit J Hematol (1988) 69:
491-497 describes blending factor Xa with phosphatidylcholine-phosphatidylserine vesicles. Similarly, extended life factor Xa can be administered in this manner.
【００４８】以下に述べる実施例は本発明を例示するの
を目的とし、本発明を限定するものではない。The following examples are intended to illustrate, but not limit, the invention.
【００４９】[0049]
【実施例】（実施例１） （触媒として、不活性型の組換えヒトＸ因子（ｒＸｉ）
をコードするＤＮＡの構築）ヒトＸ因子の全長ｃＤＮＡ
クローンを、Ｗ．Ｒ．Ｃｈｕｒｃｈ博士、Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｅｒｍｏｎｔから入手した（図
４）。このｃＤＮＡは図１のアミノ酸配列また対立遺伝
子の変異型をコードする。このヒトＸ因子のｃＤＮＡ
を、ベクターｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥ
ｃｏＲＩ部位にクローニングしてｐＢＳＸを得た。全Ｘ
因子のコーディング領域を含有するｐＢＳＸのＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントを、ベクターＭ１３ｍｐ
１９（Ｍｐ１９Ｘ）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位に
サブクローニングした。次に、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８
７）１５４：３６７に記載されているようにして、オリ
ゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発を行った。EXAMPLES (Example 1) (As a catalyst, inactive recombinant human factor X (rXi)
Of DNA encoding human factor X)
The clone was designated R. Dr. Church, Univer
Obtained from the city of Vermont (FIG. 4). This cDNA encodes the amino acid sequence of FIG. 1 or a variant of the allele. This human factor X cDNA
With the E of the vector pBSII (Stratagene)
Cloning into the coRI site yielded pBSX. All X
Hind of pBSX containing the coding region of the factor
The III-XbaI fragment was transformed with the vector M13mp
19 (Mp19X) at the HindIII-XbaI site. Next, Kunkel, T .; A.
Et al., Methods in Enzymol (198
7) Oligonucleotide site-directed mutagenesis was performed as described in 154: 367.
【００５０】下記の形態のものが生成した。The following forms were produced:
【００５１】オリゴマーＴＧＣ ＣＧＡ ＧＧＧ ＧＡ
Ｃ ＧＣＣ ＧＧＧ ＧＧＣ ＣＣＧ ＣＡＣを用い
て、Ｘ因子の重鎖の１８５ａａ位置におけるセリン（Ｓ
185）をアラニン（Ａ185）に変換してｒＸｉＡ185を得
た。Oligomer TGC CGA GGG GA
Using the C GCC GGG GGC CCG CAC, the serine (S
185 ) was converted to alanine (A 185 ) to give rXiA 185 .
【００５２】オリゴマーＡＣＣ ＴＡＴ ＧＡＣ ＴＴ
Ｃ ＡＡＣ ＡＴＣ ＧＣＣ ＧＴＧ ＣＴＣを用い
て、Ｘ因子の重鎖の８８ａａ位置におけるアスパラギン
酸（Ｄ 88）をアスパラギン（Ｎ％）に変換してｒＸｉＮ
88をコードする遺伝子を得た。Oligomer ACC TAT GAC TT
Using C AAC ATC GCC GTG CTC
Asparagine at position 88aa of the heavy chain of factor X
Acid (D 88) Is converted to asparagine (N%) to give rXiN
88Was obtained.
【００５３】両方のオリゴマーを使って、ｒＸｉＮ88Ａ
185をコードする遺伝子を得た（これらの部位の位置に
ついては図１参照）。オリゴヌクレオチド特異的突然変
異誘発の確認は、ジデオキシ配列決定法で行った。Using both oligomers, rXiN 88 A
The gene encoding 185 was obtained (see FIG. 1 for the location of these sites). Confirmation of oligonucleotide-directed mutagenesis was performed by dideoxy sequencing.
【００５４】（実施例２） （ヒトＸａ因子の端を切り取った前駆物質（ｒＸ’）を
コードするＤＮＡの構築）活性化ペプチドを欠失させ、
オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発（Ｋｕｎｋ
ｅ１，Ｔ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ（１９８７）１５４：３６７）によって、ヒトＸ因
子（Ｍｐ１９Ｘ）のｃＤＮＡを、種々の切り形の形態の
ヒトＸａ因子（集合的にｒＸ’と称する）をコードする
ように変換した。対応するアミノ酸の変更において採用
された次に続くオリゴヌクレオチドは次のとおりであ
る。Example 2 (Construction of DNA Encoding Precursor (rX ') Truncating Human Factor Xa) The activating peptide was deleted,
Oligonucleotide site-directed mutagenesis (Kunk
e1, T. A. Et al, Methods in Enzym
ol (1987) 154: 367), the cDNA of human factor X (Mp19X) was converted to encode various truncated forms of human factor Xa (collectively referred to as rX's). Subsequent oligonucleotides employed in the corresponding amino acid changes are as follows:
【００５５】ｒＸ’△０：ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＡ Ｃ
ＧＣ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＧＧ ＡＴＣ ＧＴＧ ＧＧ
Ａ ＧＧＣ ＣＡＧ ＧＡＡ ＴＧＣ、これはＸ因子の
軽鎖のＣ末端に続くアルギニン（Ｒ142）と、Ｘ因子の
活性化ペプチドの５３ａａのイソロイシン（Ｉ53）（連
鎖の１ａａ）とを一直線上に配列した。RX '△ 0: ACC CTG GAAC
GC AGG AAG AGG ATC GTG GG
A GGC CAG GAA TGC, which is arginine (R 142) following the C-terminus of the light chain of Factor X, 53aa isoleucine (I 53) of the activation peptide of factor X (1aa chain) and arranged on a straight line the did.
【００５６】ｒＸ’△１：ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＡ Ｃ
ＧＣ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＧＧ ＡＧＡ ＡＴＣ ＧＴ
Ｇ ＧＧＡ ＧＧＣ ＣＡＧ ＧＡＡ ＴＧＣ、これは
上記のＲ142と、Ｘ因子の活性化ペプチドのアルギニン
（Ｒ５２）とを一直線上に配列した。RX ′ △ 1: ACC CTG GAAC
GC AGG AAG AGG AGA ATC ATC GT
G GGA GGC CAG GAA TGC, which is the above R 142, arranged in a straight line and arginine (R52) of the activation peptide of Factor X.
【００５７】ｒＸ’△２：ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＡ Ｃ
ＧＣ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＧＧ ＣＧＧ ＣＧＧ ＡＡ
Ａ ＡＧＡ ＡＴＣ ＧＴＧ ＧＧＡ ＧＧＣ ＣＡＧ
ＧＡＡ ＴＧＣ、これはＸ因子の軽鎖に続くＲ142を
２つのアミノ酸、アルギニン（Ｒ１４３）とリシン（Ｋ
144）で延長し、この末端とＸ因子の活性化ペプチドの
Ｒ52とを一直線上に配列した（図２）。RX ′ △ 2: ACC CTG GAAC
GC AGG AAG AGG CGG CGG AA
A AGA ATC GTG GGA GGC CAG
GAA TGC, which is two amino acid R 142 following the light chain of Factor X, arginine (R143) and lysine (K
Extended by 144), an array of the R 52 of the activation peptide of the terminal and Factor X in a straight line (Figure 2).
【００５８】ｒＸ’△３：ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＡＡ Ｃ
ＧＣ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＧＧ ＣＣＴ ＡＧＧ ＣＣ
Ａ ＴＣＴ ＣＧＧ ＡＡＡ ＣＧＣ ＡＧＧ ＡＴＣ
ＧＴＧ ＧＧＡ ＧＧＣ ＣＡＧ ＧＡＡ ＴＧＣ、
これはＥｈｒｉｌｉｃｈ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ（１９８９）２６４：１４２９８に記載されて
いるようにしてＸ因子の軽鎖に続くＲ142を７ｔｓｕの
アミノ酸、プロリン（Ｐ143）、アルギニン（Ｒ144）、
プロリン（Ｐ145）、セリン（Ｓ146）、アルギニン（Ｒ
147）、リシン（Ｋ148）、アルギニン（Ｒ149）で延長
し、次いでこの末端とＸ因子の活性化ポリペプチドのＲ
52とを一直線上に配列した。RX ′ △ 3: ACC CTG GAAC
GC AGG AAG AGG CCT AGG CC
A TCT CGG AAA CGC AGG ATC
GTG GGA GGC CAG GAA TGC,
This is described in Ehrich, H .; J. Et al., J Biol
Chem (1989) 264: 14298 followed light chain of Factor X R 142 a 7tsu amino acids as described in, proline (P 143), arginine (R 144),
Proline (P 145 ), Serine (S 146 ), Arginine (R
147 ), lysine (K 148 ), arginine (R 149 ) and then extend this terminus and the factor X activation polypeptide R
52 and were arranged in a straight line.
【００５９】上記のオリゴヌクレオチド特異的突然変異
誘発の確認はジデオキシ配列決定法で行った。Confirmation of the oligonucleotide-directed mutagenesis described above was made by dideoxy sequencing.
【００６０】さらに以下に説明するように、ｒＸ’△２
由来の前駆物質は、ＣＨＯ細胞内で組み換え法により産
生されると内因的に開裂されて、直接、活性型のｒＸａ
が得られた。ｒＸ’△０由来の前駆物質は、組み換え法
により産生された場合、ＣＨＯ細胞内で内因的に開裂さ
れることはなかった。ｒＸ’△１またはｒＸ’△３由来
の前駆物質は不完全に開裂された。ｒＸ’△０、ｒＸ’
△１およびｒＸ’△３由来の二量体ペプチドは酵素とし
て活性ではなかった。As described further below, rX ′ △ 2
Precursor derived from the recombinant form of rXa is directly cleaved endogenously when produced recombinantly in CHO cells.
was gotten. The precursor from rX '△ 0 was not cleaved endogenously in CHO cells when produced by recombinant methods. The precursor from rX '△ 1 or rX' △ 3 was incompletely cleaved. rX '△ 0, rX'
Dimeric peptides from Δ1 and rX′Δ3 were not active as enzymes.
【００６１】（実施例３） （触媒として不活性な切形の前駆物質（ｒＸ’ｉ）をコ
ードするＤＮＡの構築）実施例２に記載したｃＤＮＡ
Ｘ’因子構造体を、実施例１に記載のオリゴヌクレオチ
ド部位特異的突然変異誘発によって、触媒として不活性
型のＸ’（ｒＸ’ｉ）をコードするように変換した。こ
れらの構造体には、図３に示すようなｒＸ’ｉ（△２）
Ｎ88およびｒＸ’ｉ（△２）Ｎ88Ａ185が含まれる。Example 3 (Construction of DNA Encoding Truncated Precursor (rX'i) Inactive as Catalyst) cDNA described in Example 2
The factor X 'construct was converted to encode a catalytically inactive form of X'(rX'i) by oligonucleotide site-directed mutagenesis as described in Example 1. These structures include rX′i (△ 2) as shown in FIG.
N 88 and rX'i (△ 2) include N 88 A 185.
【００６２】（実施例４） （前駆物質（ｒＸおよびｒＸ’）をコードする遺伝子の
発現）発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）を、そのＣＭＶプロモーターをＳＲαプロモータ
ー（Ｔａｋａｂｅ，Ｙ．ら、Ｍｏｌｅｃ ＣｅｌｌＢｉ
ｏｌ（１９８８）８：４６６）で置換して改変した。Ｓ
Ｒαプロモーターを含有するＣｌａＩ部位にクレノウポ
リメラーゼによって満たされたＣｌａＩ−ＸｂａＩフラ
グメントを発現ベクターｐＢＪ１（Ｌｉｎ，Ａ．ら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：６７７およびＭ．Ｄ
ａｖｉｓ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙか
ら入手可能）から単離し、発現ベクターｐＢＮを生成す
るｐＲＣ／ＣＭＶのＮｒｕＩ−Ｘｂａｌ部位にサブクロ
ーニングした。ＳＲαプロモーター、ウシ成長ホルモン
ポリアデニル化部位およびＭ１３複製起点を含有するｐ
ＢＮのＳｔｕＩフラグメントを、発現ベクターｐＢＤを
生成するｐＳＶ２ＤＨＦＲのＳｔｕＩ部位にサブクロー
ニングした。実施例に記載した前駆物質ＤＮＡのＭｐ１
９ＳｍａＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントは、クレノウポリ
メラーゼによって満たされたｐＢＮおよびｐＢＤのＸｂ
ａＩ部位にサブクローニングした。(Example 4) (Expression of genes encoding precursors (rX and rX ')) Expression vector pRC / CMV (Invitrog)
en) and its CMV promoter by the SRα promoter (Takabe, Y. et al., Molec Cell Bi).
ol (1988) 8: 466). S
The ClaI-XbaI fragment filled into the ClaI site containing the Rα promoter with Klenow polymerase was expressed in the expression vector pBJ1 (Lin, A. et al.
science (1990) 249: 677 and M.C. D
avis, available from Stanford University) and subcloned into the NruI-Xbal site of pRC / CMV to generate the expression vector pBN. P containing the SRα promoter, bovine growth hormone polyadenylation site and M13 origin of replication
The StuI fragment of BN was subcloned into the StuI site of pSV2DHFR generating the expression vector pBD. Mp1 of the precursor DNA described in the Examples
The 9SmaI-EcoRV fragment was constructed from XBN of pBN and pBD filled with Klenow polymerase.
It was subcloned into the aI site.
【００６３】得られた発現ベクターを、リポフェクショ
ン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）（ＢＲＬ）によって、Ｃ
ＨＯ中にトランスフェクトした。トランスフェクトされ
たクローンの選択は、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８ネオマイ
シン（Ｇｉｂｃｏ）または２５ｎｇ／ｍｌのメトトレキ
セート（Ｓｉｇｍａ）によって行った。シングルクロー
ンをクローニングシリンダーによって単離し広げ、発現
レベルを、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．，
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１９８８），ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋに記載のようにして標準的な固相抗体捕獲検定
法（ＥＬＩＳＡ）によって、２４時間、血清を除去した
培地上で測定した。このＥＬＩＳＡ法では、ウサギポリ
クローナル抗ヒトＸ因子（ＳＴＡＧＯ，Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＩｎｃ．）の一次抗体、お
よびペルオキジダーゼ複合ヤギＩｇＧのウサギ特異的二
次抗体を利用した。構造体ｐＢＮＸ、ｐＢＮＸ’△０、
ｐＢＮＸ’△１、ｐＢＮＸ’２およびＰＢＮＸ’ △３
由来のクローンを１０％仔ウシ血清、ペニシリン、スト
レプトマイシン、グルタミンおよび１０μｇ／ｍｌのビ
タミンＫを補ったＲＰＭＩ培地を入れたＴ−７５組織培
養フラスコ中で密集状態になるまで広げ、血清を除去し
た培地で４回洗浄し、血清を除去した培地とともに一夜
インキュベートした。The resulting expression vector was ligated with lipofection (BRL)
Transfected in HO. Selection of transfected clones was performed with 1 mg / ml G418 neomycin (Gibco) or 25 ng / ml methotrexate (Sigma). Single clones were isolated and expanded by cloning cylinders and expression levels were determined by Harlow, E. et al. And Lane, D.M. ,
Antibodies (1988), ColdSpri
ng Harbor Laboratory, New
Measured for 24 hours on serum-free media by standard solid phase antibody capture assay (ELISA) as described in York. In this ELISA method, rabbit polyclonal anti-human factor X (STAGO, America)
n Diagnostics Inc. ) And a rabbit-specific secondary antibody of peroxidase-conjugated goat IgG. Structures pBNX, pBNX ′ △ 0,
pBNX '△ 1, pBNX'2 and PBNX' △ 3
The derived clones were expanded to confluence in T-75 tissue culture flasks containing RPMI medium supplemented with 10% calf serum, penicillin, streptomycin, glutamine and 10 μg / ml vitamin K, and serum-free medium And incubated overnight with serum-free medium.
【００６４】インキュベート後、培地を収穫し、３００
０ｒｐｍで遠心分離し、２ｍｌを１０％トリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）で沈澱させた。そのＴＣＡペレットを１００
％アセトンで３回洗浄し、０．０５ｍ１のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ試料緩衝液、または１Ｍのβメルカプトエタノール
含有ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液０．０５ｍに再懸濁さ
せた。得られた懸濁液の１０μ１ずつの２つを，１２％
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、Ｉｍｍ
ｏｂｉｌｏｎフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移行
した。一次ヒトＸ因子ポリクローナルウサギ血清（ＳＴ
ＡＧＯ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，
Ｉｎｃ．）の、１％脱脂乾燥乳、０．１％ＮＰ４０、１
０ＭＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、および１５０ｍｍ
ＮａＣｌからなる液による１／４０００希釈液について
ウェスタンブロット分析を行った。二次抗体は125Ｉで
標識したＦａｂロバ抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）であった。オートラジオグラフィーを増感スクリー
ンを用いて−７０℃で一夜実施した。After incubation, the medium is harvested and
Centrifugation was performed at 0 rpm, and 2 ml was precipitated with 10% trichloroacetic acid (TCA). 100 times the TCA pellet
Wash with 3% acetone and 0.05 ml SDS-PA
Resuspended in GE sample buffer or 0.05m SDS-PAGE sample buffer containing 1M β-mercaptoethanol. Two of each 10 μl of the resulting suspension was added to 12%
After electrophoresis on SDS polyacrylamide gel, Imm
Obilon filter (Millipore). Primary human factor X polyclonal rabbit serum (ST
AGO, American Diagnostics,
Inc. ), 1% nonfat dry milk, 0.1% NP40, 1
0MM Tris-HCl pH 7.5, and 150 mm
Western blot analysis was performed on a 1/4000 dilution with a solution consisting of NaCl. The secondary antibody was a 125 I-labeled Fab donkey anti-rabbit IgG (Amersha
m). Autoradiography was performed overnight at -70 ° C using an intensifying screen.
【００６５】抗体反応性のパターンが、予想した生成物
が生成したことを示した。５つの全生成物、すなわちｒ
Ｘ、ｒＸ’△０、ｒＸ’△１、ｒＸ’△２およびｒＸ’
△３由来の生成物は、ウサギ多価ヒトＸ因子抗血清に基
づいた上記ＥＬＩＳＡ法で陽性であった。ＥＬＩＳＡ法
は、マウスのモノクローナル抗体であるＭａｂ３２３、
Ｍａｂ７４３およびＭａｂ３２５についても実施した。
Ｍａｂ３２３は特に活性化ペプチドに対して反応性であ
る。Ｍａｂ７４３は、活性型または不活性型のヒトＸ因
子のいずれに対しても反応性である。Ｍａｂ３２５はカ
ルシウム依存性でかつ軽鎖に対して特異的であり、この
抗体はγカルボキシル化領域と反応する。The pattern of antibody reactivity indicated that the expected product had been formed. All five products, r
X, rX '△ 0, rX' △ 1, rX '△ 2, and rX'
The product from Δ3 was positive in the above ELISA based on rabbit polyvalent human Factor X antiserum. The ELISA method uses a mouse monoclonal antibody, Mab323,
Mab743 and Mab325 were also performed.
Mab 323 is particularly reactive towards the activating peptide. Mab743 is reactive to either active or inactive human factor X. Mab325 is calcium-dependent and specific for the light chain, and this antibody reacts with the γ-carboxylated region.
【００６６】上記５つの構造体を含有する培養由来のど
の上澄み液も、ＥＬＩＳＡ法で、Ｍａｂ７４３とＭａｂ
３２５に対して陽性であった。従って、翻訳後のＧＬＡ
プロセシングがすべての場合に示された。ｒＸ’変異体
はすべてＭａｂ３２３と反応できなかったが、このこと
はこの変異体には活性化ペプチドが存在しないことを確
証している。[0066] Any supernatant from the culture containing the above five structures was subjected to ELISA with Mab743 and Mab743.
325 was positive. Therefore, the translated GLA
Processing was shown in all cases. All of the rX 'mutants failed to react with Mab323, confirming the absence of the activating peptide in this mutant.
【００６７】図５は、ｒＸ、ｒＸ’△０、ｒＸ’△１、
ｒＸ’△２、ｒＸ’△３およびＣＨＯ対照培地由来の生
成物について、ポリクローナルウサギ抗血清を用いて行
ったウェスタンブロット分析の結果を示す。Ｘに対する
ウサギポリクローナル抗血清は、ヒトＸａ因子の十分に
処理した重鎖を局在化させるのに有効でなかった。その
ためすべての場合において、活性化重鎖によって占めら
れると予想された位置が現れていない。図５ａはこれら
の組み換えタンパク質の還元型を示し、図５ｂは同タン
パク質の非還元型を示す。レーン１は０．７μｇの天然
のヒトＸ因子（Ｃ．Ｅｓｍｏｍ博士、ＯＭＲＦ，Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｋｌａｈｏｍａ）；レーン２
はｒＸ；レーン３はｒＸ’△０；レーン４はｒＸ’△
１；レーン５はｒＸ’△２；レーン６はｒＸ’△３；レ
ーン７はＣＨＯ対照培地をそれぞれ示す。FIG. 5 shows that rX, rX ′ △ 0, rX ′ △ 1,
Figure 3 shows the results of Western blot analysis performed with polyclonal rabbit antisera on products from rX '△ 2, rX' △ 3 and CHO control medium. Rabbit polyclonal antiserum to X was not effective in localizing the fully processed heavy chain of human factor Xa. Thus, in all cases, the position expected to be occupied by the activated heavy chain is not shown. FIG. 5a shows the reduced forms of these recombinant proteins, and FIG. 5b shows the non-reduced forms of these proteins. Lane 1 shows 0.7 μg of native human factor X (Dr. C. Esom, OMRF, Uni).
lane 2 (version of Oklahoma);
Is rX; lane 3 is rX '△ 0; lane 4 is rX' △
1; lane 5 shows rX '△ 2; lane 6 shows rX' △ 3; and lane 7 shows a CHO control medium.
【００６８】図５ａは、ｒＸとｒＸ’△２の組み換え生
成物が、還元条件下で分離可能な二量体タンパク質であ
ることを示している。ｒＸ’△０、ｒｒＸ’△１および
ｒＸ’△３の発現生成物は、明らかに大部分が一本鎖の
生成物である。処理されていないＸ’因子一本鎖は、レ
ーン３−７に示されているように、重鎖と変則的に共移
動（ｃｏｍｉｇｒａｔｅ）するようであり，これは明か
に、新規な開裂部位のタンパク質分解プロセシングの度
合が原因である。これらのＸ’前駆物質タンパク質が適
切に処理されないことは、実施例８に記載した凝固検定
法の結果と一致した。実施例８は、Ｘａ因子、ＲＶＶで
活性化されたＸ因子もしくは組み換えＸ因子、および
Ｘ’△２は同等に活性であるが、一方残りのＸ’が分泌
した生成物は、効率が劇的に低く、少なくとも５桁ほど
低い。酵素活性に関するデータを表１に示す。FIG. 5 a shows that the recombinant product of rX and rX ′ △ 2 is a dimeric protein that can be separated under reducing conditions. The expression products of rX '△ 0, rrX' △ 1 and rX '△ 3 are clearly largely single-stranded products. The untreated factor X 'single strand appears to irregularly co-migrate with the heavy chain, as shown in lanes 3-7, clearly indicating a new cleavage site. This is due to the degree of proteolytic processing. The lack of proper processing of these X 'precursor proteins was consistent with the results of the coagulation assay described in Example 8. Example 8 shows that Factor Xa, RVV-activated or recombinant Factor X, and X '△ 2 are equally active, while the products secreted by the remaining X' are dramatically more efficient. Low, at least about five orders of magnitude lower. Table 1 shows data on the enzyme activities.
【００６９】[0069]
【表１】 「触媒効率」と記載した表１の欄は、必，要に応じてＲ
ＶＶで活性化された各種の因子、アミド分解性基質活性
（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ ｓｕｂａｔｒａｔｅａｃｔｉ
ｖｉｔｙ）を示す。提示した触媒効率はｋｃａｔ／Ｋｍ
の比率であり、血漿のＸ因子に対する結果に標準化し
た。表に示すように、組み換えＸ因子およびＸ’△２の
両方は、Ｘ因子依存性２ＰＴ凝固検定法では活性であっ
たが、残りの組み換えタンパク質の酵素活性は４桁低か
った。[Table 1] The column of Table 1 described as "catalyst efficiency" indicates that R
Various factors activated by VV, amidolytic subatrateactivities
v.). The proposed catalyst efficiency is kcat / Km
And normalized to the results for plasma Factor X. As shown in the table, both recombinant factor X and X '△ 2 were active in the factor X-dependent 2PT coagulation assay, while the enzymatic activity of the remaining recombinant proteins was four orders of magnitude lower.
【００７０】図５ｂからみて、Ｘ’をコードする遺伝子
の発現生成物は、分子量がｒＸもしくは天然のＸ因子よ
り低いことは明らかである。From FIG. 5b, it is clear that the expression product of the gene encoding X 'has a lower molecular weight than rX or native factor X.
【００７１】（実施例５） （ｒＸおよびＸ’△２の精製）組み換えＸ因子および
Ｘ’△２の両方は、均質になるまで次のように精製し
た。すなわち密集状態まで増殖させた後、ｐＢＮＸもし
くはｐＢＮＸ’△２でトランスフェクトされたＣＨＯ細
胞を血清を除去した培地で４〜５回洗浄した。次にその
細胞を、４μｇ／ｍｌのビタミンＫ３を補った血清を除
去した培地中、３７℃で連続２４時間培養した。Example 5 (Purification of rX and X ′ △ 2) Both recombinant factor X and X ′ △ 2 were purified to homogeneity as follows. That is, after growing to a confluent state, CHO cells transfected with pBNX or pBNX '# 2 were washed 4 to 5 times with a serum-free medium. Next, the cells were cultured continuously at 37 ° C. for 24 hours in a medium from which serum supplemented with 4 μg / ml of vitamin K3 had been removed.
【００７２】収穫した培地を１５，０００Ｘｇで２０分
間遠心分離し、次いで０．２μｍのフィルターで上澄み
液を濾過した。培地に、トリスＨＣｌｐＨ７．５を２０
ｍＭまでおよびＮａＥＤＴＡを１０ｍＭまで添加し、得
られたものをＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌ
ｏｗ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でクロマトグラフィーを
行った。クロマトグラフィーの全工程を４℃で行った。
カラムを、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌで徹底的に洗浄し、タン
パク質を、２０ｍＭトリス ｐＨ７．５、０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ2で溶離した。ピーク画分を
プールし、−２０℃で凍結して貯蔵するか、またはＣｈ
ｕｒｃｈ，Ｗ，Ｒ．ら、Ｔｈｒｏｍ Ｒｅｓ（１９８
５）３８：４１７−４２４に記載されているようにし
て、抗Ｘ因子モノクローナル抗体アフィニティーカラム
に直接加えた。単離に用いた抗体（ａＨＦＸ−１ｄ，Ｍ
ａｂＢ１２−Ａ３）はヒトＸ因子に対して特異的であ
り、Ｃａ2＋によって影響されず、かっＸ因子およびＸ
ａ因子の両方に結合する（未発表データ）。ｒＸ’因子
を、さらに、Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙら、Ｊ Ｂｉｏ
ｌ Ｃｈｅｍ（１９８７）２６２：３２９１−３２９９
に記載されているようにして、ベンズアミジンーセファ
ロース カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）で精製した。タンパク
質の濃度は、定量ＥＬＩＳＡ法、タンパク質比色検定法
（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ら、”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（１９８
８），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）および吸光係数が１１．６、
そしてＸ因子については分子量５８，９００、および
Ｘ’△２については分子量４６，０００を用いた２８０
ｎｍにおける吸光度測定法で測定した。The harvested medium was centrifuged at 15,000 × g for 20 minutes, and the supernatant was filtered through a 0.2 μm filter. Add Tris HCl pH 7.5 to the medium for 20 minutes.
mM and NaEDTA up to 10 mM, and the resulting product is Q-Sepharose Fast Fl.
ow (Pharmacia). All steps of the chromatography were performed at 4 ° C.
The column was loaded with 20 mM Tris, pH 7.5, 10 mM E
Wash thoroughly with DTA, 0.15 M NaCl and remove proteins from 20 mM Tris pH 7.5, 0.5 M N
aCl, and eluted with 5mM CaCl 2. The peak fractions are pooled and stored frozen at -20 ° C or Ch
urch, W, R.A. Et al., Throm Res (198
5) Directly applied to an anti-Factor X monoclonal antibody affinity column as described in 38: 417-424. The antibody used for isolation (aHFX-1d, M
abB12-A3) is specific for human factor X, not affected by Ca 2 +, cut Factor X and X
Binds to both factor a (unpublished data). The rX 'factor was further analyzed by Krishnaswamy et al., J Bio.
1 Chem (1987) 262: 3291-3299.
Purified on a benzamidine-sepharose column (Pierce) as described in. Protein concentrations were determined by quantitative ELISA, protein colorimetric assay (Harlow, E. et al., Antibodies, A.
Laboratory Manual "(198
8), ColdSpring Harbor Labo
ratories, Cold Spring Har
bor, New York) and an extinction coefficient of 11.6,
280 using molecular weight of 58,900 for factor X and 46,000 for X '△ 2.
Measured by absorbance at nm.
【００７３】精製された因子を、還元条件下でＳＤＳ−
ＰＡＧＥを行って銀で染色したところ、組み換え法で生
成したＸ因子は、全長の前駆物質（７５ｋＤ）、活性化
ペプチドを含有する重鎖（４５ｋＤ）および軽鎖（２２
ｋＤ）を表す３つのバンドにに分離されていることを示
した。ナイロンフィルターにエレクトロトランスファー
（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）を行ってからアミ
ノ末端の配列分析を行ったところ、軽鎖は、不均質で、
２７％がＶａｌ37で始まり、そして７３％がＡｌａ41で
始まり、一方７５ＫＤの種も不均質で、４１％がＶａｌ
37で始まり、そして５９％がＡｌａ41で始まることが分
かった。The purified factor was subjected to SDS-reducing under reducing conditions.
When PAGE was performed and stained with silver, the recombinantly produced factor X contained the full-length precursor (75 kD), the heavy chain (45 kD) containing the activation peptide and the light chain (22 kD).
kD). Electrotransfer of the nylon filter followed by sequence analysis of the amino terminus revealed that the light chain was heterogeneous,
27% start with Val 37 and 73% start with Ala 41 , while the 75 KD species is also heterogeneous, 41% Val
It begins with a 37, and 59% has been found that starting with Ala 41.
【００７４】（実施例６） （不活性化組換えヒトＸ因子（ｒＸｉおよびｒＸ’ｉ）
をコードする遺伝子の発現）不活性型に変換するために
選択したＸ’型は、図４に示すｒＸ’△２型であった。
ｒＸ、ｒＸ’（△２）、ｒＸｉＮ88Ａ185、ｒＸｉ
Ａ185、ｒＸ’ｉ（△２）Ｎ88Ａ185およびｒＸ’ｉ（△
２）Ｎ88のためにｐＢＮで誘導された細胞系を、実施例
４に記載したようにして８００ｃｍ2ローラビン内で密
集状態にまで増殖させ、血清を除去した培養液で４回洗
浄し、５０ｍ１の血清を除去した培養液とともに一夜イ
ンキュベートした。その培養液は毎日補充して収穫し
た。Example 6 Inactivated Recombinant Human Factor X (rXi and rX'i)
(Expression of the gene encoding) The X ′ type selected for conversion to the inactive type was the rX ′ △ 2 type shown in FIG.
rX, rX ′ (△ 2), rXiN 88 A 185 , rXi
A 185 , rX′i (△ 2) N 88 A 185 and rX′i (△ 2)
2) The cell lines induced with pBN for N 88, were grown to confluence in 800 cm 2 Rorabin as described in Example 4, was washed 4 times with serum was removed culture broth, 50M1 Was incubated overnight with the culture medium from which the serum was removed. The culture was replenished and harvested daily.
【００７５】連続収穫物をプールして、３０００ｒｐｍ
で遠心分離し、次に、Ｃ・Ｅsmon博士（０ＭＲＦ，Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｋｌａｈｏｍａ）より提供
されたＸ因子特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ）アフ
ィニティーカラム（Ｍａｂ７１７）に直接通過させた。
結合した「Ｘ因子」を８０％のエチレングリコールでＭ
ａｂ７１７カラムから溶出し、１０ｍＭ トリス ＨＣ
ｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌに対して透析
し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０透過装置（Ａｍｉｃｏｎ）
で濃縮した。「Ｘ因子」タンパク質の濃度は、実施例４
に記載されているように連続希釈液を用いて、ヒトＸ因
子の標準製剤（ＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃ． Ｅｓｍｏｎ，ＯＭＲ
Ｆ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｋｌａｈｏｍａ）
と比較して、ＥＬＩＳＡ法で測定した。The continuous crop was pooled and 3000 rpm
In centrifugation, then, C · E SMON Dr. (0MRF, Un
The cells were directly passed through a factor X-specific monoclonal antibody (Mab) affinity column (Mab717) provided by the University of Oklahoma.
The bound "Factor X" is treated with 80% ethylene glycol in M
Elution from ab717 column, 10 mM Tris HC
l Dialysis against pH 7.5, 150 mM NaCl, Centricon 10 permeator (Amicon)
And concentrated. The concentration of the "Factor X" protein was determined in Example 4
A standard formulation of human factor X (HaematologicTechno) using serial dilutions as described in
logs, Inc. , C.I. Esmon, OMR
F, University of Oklahoma)
Was measured by an ELISA method in comparison with
【００７６】精製したタンパク質は、実施例４に概説し
たウェスタンブロット分析法で特性を決定した。図６
は、これらのβ−ルカプトエタノールで還元され、Ｍａ
ｂ７１７で精製された組換えヒトＸ因子類似体のウェス
タンブロットを示す。レーン１は、０．１μｇのヒトＸ
（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．）；レーン２は０．１μｇのヒトＸａ（Ｈ
ａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．）；レーン３は０．１μｇのｒＸレーン４は０．
１６μｇのｒＸ’△２；レーン５は０．１３μｇのｒＸ
ｉＮ88ｒＡ185；レーン６は０．１５μｇのｒＸｉ
Ａ185；レーン７は０．１８７μｇのｒＸ’ｉ（△２）
Ｎ88；レーン８は０，０５μｇのｒＸ’ｉ（△２）Ｎ88
Ａ185である。The purified protein was characterized by Western blot analysis as outlined in Example 4. FIG.
Is reduced by these β-lecaptoethanols and Ma
Figure 5 shows a Western blot of recombinant human factor X analog purified in b717. Lane 1 contains 0.1 μg of human X
(Haematologic Technology
s, Inc. ); Lane 2 shows 0.1 μg of human Xa (H
aematologic Technologies, I
nc. ); Lane 3 is 0.1 μg rX Lane 4 is 0.
16 μg of rX ′ △ 2; Lane 5 is 0.13 μg of rX
iN 88 rA 185 ; lane 6 contains 0.15 μg of rXi
A 185 ; Lane 7 is 0.187 μg of rX′i (△ 2)
N 88 ; lane 8 contains 0.05 μg of rX′i (△ 2) N 88
A 185 .
【００７７】還元条件で、ヒトＸおよびヒトＸａは二量
体型であり；ヒトＸａは、活性化ペプチドがないため、
低分子量型の重鎖を示すことは明らかである。レーン３
の組換えヒトＸは天然のヒトＸに類似しているが、ある
種の一本鎖前駆物質であることは明らかである。レーン
４には、組み換えｒＸ’△２も重鎖と軽鎖に開裂するこ
とが示されている。レーン５および６においては、改変
された組み換えＸｉタンパク質が組み換えヒトＸと類似
の様式で挙動している。予想されるように、レーン７お
よび８は、Ｘ’ｉのタンパク質分解開裂によって誘導さ
れたモノマー、重鎖および軽鎖が存在していることを示
す。Under reducing conditions, human X and human Xa are in dimeric form; human Xa has no activating peptide,
It is clear that it shows a low molecular weight form of the heavy chain. Lane 3
Of human X is similar to natural human X, but is clearly a single-chain precursor. Lane 4 shows that recombinant rX ′ △ 2 also cleaves into heavy and light chains. In lanes 5 and 6, the modified recombinant Xi protein behaves in a manner similar to recombinant human X. As expected, lanes 7 and 8 show the presence of monomers, heavy and light chains induced by proteolytic cleavage of X'i.
【００７８】（実施例７） （組み換えヒトＸ因子の酸素分析）天然のヒトＸ因子；
Ｘａ因子、組み換えＸ（ｒＸ）、ｒＸ’△０、ｒＸ’△
１、ｒＸ’△２、ｒＸ’△３、ｒＸｉＮ88Ａ185、ｒＸ
ｉＮ88、ｒＸ’ｉ（△２）Ｎ88Ａ185、および不活性の
ウシＸａ、Ｃ．Ｅｍｏｎ博士（ＯＭＲＦ，Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｋｌａｈｏｍａ）から提供されたＸ
ａｉ−ＡＰＭＳＦ（Ｓｋｏｇｅｎ，Ｗ．Ｆ，ら、Ｊ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８４）２５９：２３０６）によ
る、クロモジムＸ（ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ Ｘ）（Ｎ−メ
トキシカルボニル−Ｄ−ノルロイシ−グリシル−アルギ
ニン−４−ニトラニリドアセテート、Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の加水分解の動力学的測定
を、室温で、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｖ
ｍａｘ分光光度計の肺９６のマイクロタイタープレート
中で試験した。４０５ｎＭの吸光度を連続的にモニター
して、反応速度をその機械によって直接測定し、Ｅｎｚ
ｆｉｔｔｅｒプログラム（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｒｅｓ
ｓ）によってプロットした。タンパク質の濃度はＥＬＩ
ＳＡ法（実施例６）によって測定した。酵素はすべて、
Ｏ．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５０ｍＭトリ
スＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで適当な
濃度に希釈した。５０ｍＭトリスＨＣ１、ｐＨ８．０、
１５０ｍＭ ＮａＣ１および２．５ｍＭ ＣａＣｌ２中
で反応は２回行った。すべの組み換えヒトＸ’因子は、
ＱＡＥ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて
精製され濃縮されたｒＸ’△０、ｒＸ’△１およびｒ
Ｘ’△３を除いて、すべてＭａｂ７１７で精製された
（実施例６）（Ｓｋｏｇｅｎ，Ｗ．Ｆら．Ｊ Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ（１９８４）２５９：２３０６）。Example 7 Oxygen Analysis of Recombinant Human Factor X Natural Human Factor X;
Factor Xa, recombinant X (rX), rX ′ {0, rX ′}
1, rX '△ 2, rX' △ 3, rXiN 88 A 185 , rX
iN 88 , rX′i (△ 2) N 88 A 185 , and inactive bovine Xa, C.I. Dr. Emon (OMRF, Univer
X provided by the site of Oklahoma)
ai-APMSF (Skogen, WF, et al., JB
iol Chem (1984) 259: 2306), Chromozym X (N-methoxycarbonyl-D-norleuc-glycyl-arginine-4-nitranilidoacetate, Boehring)
The kinetic measurement of the hydrolysis of E. Mannheim was determined at room temperature by Molecular Devices V
The max spectrophotometer was tested in lung 96 microtiter plates. The absorbance at 405 nM was continuously monitored and the reaction rate was measured directly by the machine,
Fitter program (Elsevier Pres
s). Protein concentration is ELI
It was measured by the SA method (Example 6). All enzymes are
O. It was diluted to an appropriate concentration with 1% bovine serum albumin (BSA), 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl. 50 mM Tris HC1, pH 8.0,
The reaction was performed twice in 150 mM NaCl and 2.5 mM CaCl2. All recombinant human factor X '
RX ′ △ 0, rX ′ △ 1 and rX′-purified and concentrated using QAE-Sepharose (Pharmacia)
Except for X ′ △ 3, all were purified by Mab717 (Example 6) (Skogen, WF et al. J Biol.
Chem (1984) 259: 2306).
【００７９】ｒＸ、ｒＸｉＮ88Ａ185、ｒＸｉＮ88およ
びｒＸｉＮ88Ａ185を含有するベクター由来の組み換え
法で生成したペプチドをラッセルクサリヘビ毒とともに
５分間予備インキュベーションを行って処理して、これ
らをＸａ型またはＸａｉ型に変換した。ｒＸ’△０、ｒ
Ｘ’△１、ｒＸ’△２およびｒＸ’△３含有のベクター
由来のペプチドは、この方法では処理されなかった。Recombinantly produced peptides derived from vectors containing rX, rXiN 88 A 185 , rXiN 88 and rXiN 88 A 185 are treated with a Russell's viper venom for 5 minutes prior to treatment to form Xa or Xa Converted to Xai type. rX '△ 0, r
Peptides from vectors containing X '△ 1, rX' △ 2 and rX '△ 3 were not treated in this manner.
【００８０】図７は、天然のヒトＸ因子およびＸａ因子
と組み換えヒトｒＸおよびｒＸ’由来の活性化型とを比
較するラインウィーバ一−バークプロットである。図７
ａはヒトＸ；図７ｂはヒトＸａ；図７ｃはヒトｒＸ（ラ
ッセルクサリヘビ毒のプロテアーゼで処理した）；図７
ｄはヒトｒＸ’（プロテアーゼで処理しなかった）であ
る。FIG. 7 is a Lineweaver-Burk plot comparing native human factor X and factor Xa with activated forms derived from recombinant human rX and rX '. FIG.
FIG. 7b is human Xa; FIG. 7c is human rX (treated with Russell's viper venom protease); FIG.
d is human rX '(not treated with protease).
【００８１】表２は、ＫｃａｔとＫｍの値について、組
み換え法で生成したヒトＸ因子類と、Ｈａｅｍａｔｏｌ
ｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から供
給された天然のヒトＸ因子およびＸａ因子との比較を示
す。Table 2 shows the values of Kcat and Km for human factor Xs produced by the recombinant method and Haematol.
organic Technologies, Inc. 3 shows a comparison with native human factor X and factor Xa supplied by S.A.
【００８２】[0082]
【表２】 もちろん不活性化型はいずれも値を示さず；ｒＸ’型の
なかのｒＸ’△２だけが活性を示した。[Table 2] Of course, none of the inactivated forms showed a value; only rX '△ 2 among the rX' forms showed activity.
【００８３】（実施例８） （ヒトＸ、Ｘａならびに組換えヒトｒＸおよびｒＸ’の
Ｘ因子依存性プロトロンビナーゼ複合体の一活性）Ｘ因
子依存性プロトロンビナーゼ複合体の活性を、トロンビ
ンによるクロモジムＴＨ（トシル−グリシル−プロリル
−アルギニン−４−ニトロアニリドアセテート、Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の加水分解の速度
を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｖｍａｘ分
光光度計の９６ウェルのマイクロタイタープレート中
で、室温で測定することによって決定した。４０５ｎＭ
の吸光度を連続的にモニターし、最初の１分間の反応速
度を、その機械で直接測定し、Ｅｎｚｆｉｔｔｅｒプロ
グラム（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）を用いてプロットした。反
応混合物は３つずつ次の組成で作った。すなわちＥＬＩ
ＳＡ法（実施例６）で測定された０．０５Ｘ１０-4Ｍか
ら１．５Ｘ１０-9Ｍの「Ｘ因子」、０．５Ｘ１０ -6Ｍヒ
トプロトロンビン（ＳＴＡＧＯ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、７．５Ｘ１０-9Ｍ
ヒトＶａ因子（ＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、２０Ｘ１０-6Ｍホスホコリ
ン／ホスホセリン７５％／２５％（ＰＣＰＳ）（Ｗ．
Ｒ．Ｃｈｕｒｃｈ博士、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｖｅｒｍｏｎｔにより提供）または等量のウサギ脳セフ
ァリン（Ｓｉｇｍａ）（実施例９）、０．１％ＢＳＡ
（Ｓｉｇｍａ）、０．１Ｘ１０ -3ＭクロモジムＴＨ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、２５Ｍ ト
リス ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ Ｎａｃｌお
よび５ｍＭ ＣａＣｌ2の組成である。Example 8 (Human X, Xa and recombinant human rX and rX ')
One activity of factor X-dependent prothrombinase complex) factor X
Activity of the child-dependent prothrombinase complex
Chromodim TH (tosyl-glycyl-prolyl)
-Arginine-4-nitroanilide acetate, Boe
(Hringer Mannheim)
To the Molecular Devices Vmax
In a 96-well microtiter plate of a photometer
And was determined by measuring at room temperature. 405 nM
Of the reaction for the first minute.
Is measured directly on the machine and the Enzfitter
Plotted using gram (Elsevier). Anti
The reaction mixtures were made in triplicate with the following composition. That is, ELI
0.05 × 10 measured by SA method (Example 6)-FourM
1.5X10-9"Factor X" of M, 0.5X10 -6M hee
Toprothrombin (STAGO, American D
iagnostics, Inc. ), 7.5X10-9M
Human Va factor (HaematologicTechno)
logs, Inc. ), 20X10-6M phosphoricoli
/ Phosphoserine 75% / 25% (PCPS) (W.
R. Dr. Church, University of
(Provided by Vermont) or an equivalent amount of rabbit brain sef
(Sigma) (Example 9), 0.1% BSA
(Sigma), 0.1X10 -3M Chromodymium TH (B
oehringer Mannheim), 25M
Squirrel HCl pH 7.5, 150 mM NaCl
And 5 mM CaClTwoThe composition of
【００８４】ヒトｒＸ因子およびｒＸ’因子依存性のプ
ロトロンビナーゼ複合体の活性はＰＣＰＳを利用し、ヒ
トＸ因子およびＸａ因子依存性のプロトロンビナーゼ複
合体の活性はセファリンを利用した。ヒトＸ因子および
ｒＸ因子は、ラッセルクサリヘビ毒（Ｈａｅｍａｔｏｌ
ｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）とと
もに５分間予備インキュベートした。蛍光シグナルの増
大によって測定した、クロモジムＴＨのトロンビンによ
る加水分解は、実験プロトコル全体を通じて通じて直線
的であった。５９．２Ｘ１０-4Ｍの濃度のｒＸｉＮ88Ａ
185、１０．２Ｘ１０一9Ｍ濃度のｂＸａｉ−ＡＰＭＳＦ
の場合は観察可能な速度を示さなかった。図８ａ〜８ｄ
は、ヒトＸ（図８ａ）、ヒトＸａ（図８ｂ）（Ｈａｅｍ
ａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．）、組換えヒトｒＸ（プロテアーゼで処理した後）
（図８ｃ）および組換えヒトｒＸ’△２（プロテアーゼ
で処理しなかった後）（図８ｄ）の、Ｘ因子依存性プロ
トロンビナーゼ複合体活性を比較している。すべて同等
に活性を有する。The activity of the prothrombinase complex dependent on human rX and rX 'factors utilized PCPS, and the activity of the prothrombinase complex dependent on human factor X and factor Xa utilized cephalin. Human factor X and rX are Russell's viper venom (Haematol).
organic Technologies, Inc. ) For 5 minutes. The hydrolysis of chromozym TH by thrombin, as measured by the increase in the fluorescence signal, was linear throughout the experimental protocol. RXiN 88 A at a concentration of 59.2 × 10 −4 M
185 , 10.2 × 10 19 M concentration of bXai-APMSF
Did not show an observable rate. 8a to 8d
Are human X (FIG. 8a), human Xa (FIG. 8b) (Haem
atologic Technologies, In
c. ), Recombinant human rX (after treatment with protease)
(FIG. 8c) and Factor X-dependent prothrombinase complex activity of recombinant human rX ′ お よ び 2 (after no treatment with protease) (FIG. 8d). All have equal activity.
【００８５】（実施例９） （血漿の凝固）Ｍａｂ７１７で精製したｒＸａおよびｒ
Ｘａを、ＭＬＡ Ｅｌｅｃｔｒａ８００フィブロメ一夕
ーを用い自動２段階プロトロンビン検定法で血漿凝固活
性について検定した。酵素タンパク質の濃度はＥＬＩＳ
Ａ法（実施例６）によって測定し、使用する前に０．１
％ＢＳＡ、１５０ｍＭ Ｎａｃｌで希釈した。ウシＸ因
子およびＶＩＩ因子が不足している血漿（Ｓｉｇｍａ）
ならびにウサギ脳セファリン（Ｓｉｇｍａ）を、メーカ
ーの説明書にしたがって調製した。ラッセルクサリヘビ
毒０．１μｇ／ｍｌをヒトＸおよびｒＸの検定液に添加
した。反応混合物は、０．１ｍｌのＸ因子、０．１ｍｌ
の１５０ｍＭ Ｎａｃｌ、０．１ｍｌのセファリンおよ
び０．１ｍｌの２５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有した。各濃
度について２回ずつ試験し、２回の実験結果の平均値を
計算した。図９は、ヒトＸ、ヒトＸａ、ヒトｒＸおよび
ヒトｒＸａの血漿凝固活性を比較している。計算の結
果、ヒトｒＸは活性がヒトＸの４５％であり、ヒトｒＸ
ａは活性がヒトＸａの３２％であった。(Example 9) (Coagulation of plasma) rXa and rXa purified by Mab717
Xa was assayed for plasma clotting activity in an automated two-step prothrombin assay using MLA Electra 800 fibrome overnight. Enzyme protein concentration is ELIS
Measured by Method A (Example 6), 0.1
% BSA, diluted in 150 mM NaCl. Bovine factor X and factor VII deficient plasma (Sigma)
As well as rabbit brain cephalin (Sigma) was prepared according to the manufacturer's instructions. Russell's viper venom 0.1 μg / ml was added to the human X and rX assays. The reaction mixture contains 0.1 ml of factor X, 0.1 ml
150 mM NaCl, 0.1 ml cephalin and 0.1 ml 25 mM CaCl2. Each concentration was tested twice and the average of the results of the two experiments was calculated. FIG. 9 compares the plasma clotting activity of human X, human Xa, human rX and human rXa. As a result of the calculation, the activity of human rX is 45% of that of human X,
a had an activity of 32% of human Xa.
【００８６】（実施例１０） （ｒＸｉＮ88Ａ185、ヒトｒＸ’ｉ（△２）Ｎ88Ａ185お
よびウシｂＸａｉ−ＡＰＭＳＦによるプロトロンビナー
ゼ複合体活性の阻害）ヒトｒＸｉＮ88Ａ185による、天
然ヒトＸ因子依存性プロトロビナーゼ複合体活性の阻
害、ならびにヒトｒＸ’ｉ（△２）Ｎ88Ａ185およびウ
シｂＸａｉ−ＡＰＭＳＦ（Ｃ．Ｅｓｍｏｎ，ＯＭＲＦ，
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｋｌａｈｏｍａ）によ
る、天然Ｘａ因子（５Ｘ１０-9Ｍ）依存性のプロトロン
ビナーゼ複合体活性の阻害を、実施例８に詳細に述べた
ようにして試験した。動力学的因子および１度形成され
た複合体の強度のために、ＸとＸｉおよびＸａとＸａｉ
を直接比較する必要がある。ヒトｒＸｉＮ88Ａ185は、
０．１μｇ／ｍｌのラッセルクサリヘビ毒とともに５分
間予備インキュベートした。ヒトＸ因子およびＸａ因子
の濃度は１ＸｌＯ-9Ｍであった。[0086] (Example 10) (rXiN 88 A 185, human rX'i (△ 2) N 88 A 185 and inhibition of prothrombinase complex activity by bovine bXai-APMSF) by human rXiN 88 A 185, native human inhibition of factor X dependent proto lobby kinase complex activity, as well as human rX'i (△ 2) N 88 a 185 and bovine bXai-APMSF (C.Esmon, OMRF,
The inhibition of native factor Xa (5 × 10 −9 M) -dependent prothrombinase complex activity by University of Oklahoma was tested as described in detail in Example 8. Because of the kinetic factors and the strength of the complex formed once, X and Xi and Xa and Xai
Need to be compared directly. Human rXiN 88 A 185
Preincubation for 5 minutes with 0.1 μg / ml Russell's viper venom. The concentration of human factor X and factor Xa was 1 × 10 −9 M.
【００８７】図１０は、ｂＸａｉ−ＡＰＭＳＦおよびｒ
Ｘ’ｉ（△２）Ｎ88Ａによる、ヒトＸａ因子依存性プロ
トロンビナーゼ複合体の濃度依存性阻害、ならびにｒＸ
ｉＮ 88Ａ185によるヒトＸ因子依存性プロトロンビナー
ゼ複合体の阻害を示す。ｂＸａｉ一ＡＰＭＳＦによる５
０％阻害は０．９Ｘ１０-9Ｍの濃度で得られ、ｒＸ’ｉ
（△２）Ｎ88Ａ185による５０％阻害は６Ｘ１０-9Ｍの
濃度で得られ、およびｒＸｉＮ88Ａ185による５０％阻
害は１０．６Ｘ１０一9Ｍの濃度で得られた。FIG. 10 shows that bXai-APMSF and r
X'i (△ 2) N88A, human factor Xa-dependent pro
Concentration-dependent inhibition of thrombinase complex, and rX
iN 88A185Factor X-dependent prothrombiner by
4 shows inhibition of the zeta complex. 5 by bXai-APMSF
0% inhibition is 0.9 × 10-9RX'i
(△ 2) N88A18550% inhibition by 6X10-9M's
Concentration, and rXiN88A18550% blocking by
Harm is 10.6X10One nineM concentration.
【００８８】（実施例１１） （アシル化Ｘａ因子の調製）ヒト組換えＸａ（ｒＸａ）
を実施例５に記載されているように調製し、ラッセルク
サリヘビ毒で開裂した。ｒＸａを生理食塩水溶液（２μ
ｍｏｌ／２５ｍｌ）に溶解し、４℃で２０分間攪拌しな
がら、ｐ−トルオイル酸のｐ−ニトロフェニルエステル
５μｍｏｌで処理した。得られた反応混合物を、グリセ
リン／生理食塩水に対して透析し、得られた透析液は０
℃で貯蔵する。Example 11 Preparation of Acylated Factor Xa Human Recombinant Xa (rXa)
Was prepared as described in Example 5 and cleaved with Russell's viper venom. rXa was added to physiological saline solution (2μ
mol / 25 ml) and treated with 5 μmol of p-nitrophenyl ester of p-toluoyl acid while stirring at 4 ° C. for 20 minutes. The resulting reaction mixture was dialyzed against glycerin / saline and the resulting dialysate was
Store at ° C.
【００８９】プロトロンビナーゼ反応においてプロテア
ーゼとして不活性なＸａ因子（Ｘａｉ因子）の類似体
は、血栓症で特徴づけられる疾患を治療するのに有用で
ある。これらの抗血栓剤は組換え技術を用いて簡便に調
製することができる。さらに、血清中でＸａ因子を生成
するが半減期を延長された改変型のＸａ因子は、血友病
の症状を治療するのに有用である。これらの改変型のＸ
ａ因子は、典型的に、活性部位のセリン残基がアシル化
された形態であり、インビボで徐々に脱アシル化され
る。Analogs of factor Xa (factor Xai), which are inactive as proteases in the prothrombinase reaction, are useful for treating diseases characterized by thrombosis. These antithrombotic agents can be conveniently prepared using recombinant techniques. In addition, modified forms of factor Xa that produce factor Xa in serum but have an extended half-life are useful for treating the symptoms of hemophilia. These modified forms of X
Factor a is typically an acylated form of the active site serine residue and is slowly deacylated in vivo.
【００９０】[0090]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> COR Therapeutics, Inc. WOLF, David <120> Recombinant Agents Affecting Thrombosis <130> 44481-5002-JP <140> JP 3-517527 <141> 1991-09-04 <150> PCT/US91/06337 <151> 1991-09-04 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutant Factor Xa: Light Chain <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> X can be beta-hydroxy aspartic acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(39) <223> X can be gamma-carboxy glutamic acid <400> 1 Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Met Lys Lys Gly His Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Met Xaa Xaa Thr Cys Ser Tyr Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe Xaa 20 25 30 Asp Ser Asp Lys Thr Asn Xaa Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Xaa Gly 50 55 60 Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn 65 70 75 80 Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys 85 90 95 Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala 100 105 110 Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly 115 120 125 Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg 130 135 <210> 2 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutant Factor Xa: Heavy Chain <400> 2 Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu 20 25 30 Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys 35 40 45 Arg Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly 50 55 60 Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe 65 70 75 80 Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asn Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr 85 90 95 Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg 100 105 110 Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser 115 120 125 Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys 130 135 140 Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser 145 150 155 160 Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys 165 170 175 Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ala Gly Gly Pro His Val Thr Arg 180 185 190 Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly 195 200 205 Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe 210 215 220 Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala 225 230 235 240 Lys Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 245 250[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> COR Therapeutics, Inc.WOLF, David <120> Recombinant Agents Affecting Thrombosis <130> 44481-5002-JP <140> JP 3-517527 <141> 1991-09-04 <150> PCT / US91 / 06337 <151> 1991-09-04 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutant Factor Xa: Light Chain <220> <221> misc_feature <222> (63) .. (63) <223> X can be beta-hydroxy aspartic acid <220> <221> misc_feature <222> (6) .. (39) < 223> X can be gamma-carboxy glutamic acid <400> 1 Ala Asn Ser Phe Leu Xaa Xaa Met Lys Lys Gly His Leu Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 Cys Met Xaa Xaa Thr Cys Ser Tyr Xaa Xaa Ala Arg Xaa Val Phe Xaa 20 25 30 Asp Ser Asp Lys Thr Asn Xaa Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Gln Gly Lys Cys Lys Xaa Gly 50 55 60 Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn 65 70 75 80 Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys 85 90 95 Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Glu Gln Asn Se r Val Val Cys Ser Cys Ala 100 105 110 Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly 115 120 125 Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg 130 135 <210> 2 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Mutant Factor Xa: Heavy Chain <400> 2 Ile Val Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu 20 25 30 Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys 35 40 45 Arg Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Glu Gly 50 55 60 Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe 65 70 75 80 Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asn Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr 85 90 95 Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg 100 105 110 Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser 115 120 125 Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys 130 135 140 Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser 145 150 155 160 Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys 165 170 175 Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ala Gly Gly Pro His Val Thr Arg 180 185 190 Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly 195 200 205 Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe 210 215 220 Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala 225 230 235 240 Lys Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 245 250
【図１】 図１は、ヒトＸ因子の構造および従来技術に
記載されているその関連する開裂部位を示す。FIG. 1 shows the structure of human factor X and its associated cleavage sites as described in the prior art.
【図２】 図２は、プロトロンビナーゼ複合体の形成に
関与する二本鎖開裂生成物を得るための前駆物質である
一本鎖Ｘ’因子の１つの実施態様の構造を示す。この図
に示す形態は、複合体内にタンパク質分解活性を保持す
る二本鎖ペプチドを生成する；以下に示す改変された形
態は触媒として不活性である。FIG. 2 shows the structure of one embodiment of a single-chain factor X ′, which is a precursor to obtain a double-strand cleavage product involved in the formation of a prothrombinase complex. The form shown in this figure produces a double-stranded peptide that retains proteolytic activity in the complex; the modified form shown below is catalytically inactive.
【図３】 図３は、Ｘ’ｉ因子の１つの実施態様を示
す。FIG. 3 shows one embodiment of factor X′i.
【図４】 図４は、Ｘ因子をコードするｃＤＮＡ配列を
示す。FIG. 4 shows the cDNA sequence encoding factor X.
【図５】 図５は、組換え法によって生成した、潜在的
に活性のＸ因子およびＸａ因子のウエスタンプロットで
ある。FIG. 5 is a Western plot of potentially active factor X and factor Xa produced by recombinant methods.
【図６】 図６は、組換え法によって生成した、不活性
型のＸ因子とＸａ因子のウエスタンプロットである。FIG. 6 is a Western plot of inactive Factor X and Factor Xa produced by recombinant methods.
【図７ａ】 図７ａ〜７ｄは、活性化型に変換された天
然のＸ因子および組換え法で生成したＸ因子の酵素活性
性を示す一連のラインウィーバー−バークプロットであ
る。FIGS. 7a-7d are a series of Lineweaver-Burk plots showing the enzymatic activity of native Factor X converted to the activated form and Factor X produced by recombinant methods.
【図７ｂ】 図７ａ〜７ｄは、活性化型に変換された天
然のＸ因子および組換え法で生成したＸ因子の酵素活性
性を示す一連のラインウィーバー−バークプロットであ
る。Figures 7a-7d are a series of Lineweaver-Burk plots showing the enzymatic activity of native Factor X converted to the activated form and recombinantly produced Factor X.
【図７ｃ】 図７ａ〜７ｄは、活性化型に変換された天
然のＸ因子および組換え法で生成したＸ因子の酵素活性
性を示す一連のラインウィーバー−バークプロットであ
る。Figures 7a-7d are a series of Lineweaver-Burk plots showing the enzymatic activity of native Factor X converted to the activated form and Factor X produced by recombinant methods.
【図７ｄ】 図７ａ〜７ｄは、活性化型に変換された天
然のＸ因子および組換え法で生成したＸ因子の酵素活性
性を示す一連のラインウィーバー−バークプロットであ
る。Figures 7a-7d are a series of Lineweaver-Burk plots showing the enzymatic activity of native Factor X converted to the activated form and Factor X produced by recombinant methods.
【図８ａ】 図８ａ〜８ｄは、各種のＸ因子型のプロト
ロンビナーゼ複合体の活性を比較する図である。8a-8d compare the activity of various factor X-type prothrombinase complexes.
【図８ｂ】 図８ａ〜８ｄは、各種のＸ因子型のプロト
ロンビナーゼ複合体の活性を比較する図である。8a-8d compare the activity of various factor X-type prothrombinase complexes.
【図８ｃ】 図８ａ〜８ｄは、各種のＸ因子型のプロト
ロンビナーゼ複合体の活性を比較する図である。8a to 8d compare the activity of various factor X-type prothrombinase complexes.
【図８ｄ】 図８ａ〜８ｄは、各種のＸ因子型のプロト
ロンビナーゼ複合体の活性を比較する図である。8a to 8d compare the activity of various factor X-type prothrombinase complexes.
【図９】 図９は、各種の型のＸ因子について２段階プ
ロトロンビン凝固検定を行った結果を示す。FIG. 9 shows the results of performing a two-step prothrombin coagulation assay on various types of factor X.
【図１０】 図１０は、不活性型のＸ因子による、プロ
トロンビン複合体形成の阻害を示す。FIG. 10 shows the inhibition of prothrombin complex formation by an inactive form of factor X.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA07 CA04 DA02 EA04 GA13 HA06 4C084 AA02 BA01 BA08 BA21 BA22 BA23 BA44 CA53 CA59 CA62 DC10 NA14 ZA362 ZA392 ZA512 ZA542 4H045 AA10 BA10 BA32 BA35 CA42 DA65 EA24 FA74 GA26 HA06──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme coat ゛ (reference) // C12N 15/09 C12N 15/00 A F term (reference) 4B024 AA01 AA11 BA07 CA04 DA02 EA04 GA13 HA06 4C084 AA02 BA01 BA08 BA21 BA22 BA23 BA44 CA53 CA59 CA62 DC10 NA14 ZA362 ZA392 ZA512 ZA542 4H045 AA10 BA10 BA32 BA35 CA42 DA65 EA24 FA74 GA26 HA06
Claims (7)
うに改変された血液因子であるＸａ因子であって、該改
変された血液因子が血清の存在下で該血液因子の活性形
態を生成する、Ｘａ因子。Claims 1. A factor Xa which is a blood factor modified to transiently prolong its half-life in serum, wherein the modified blood factor has an activity of the blood factor in the presence of serum. Factor Xa that produces the morphology.
の改変された血液因子。2. The modified blood factor according to claim 1, which is an acylated blood factor.
る、請求項２記載の血液因子。3. The blood factor according to claim 2, wherein said modified blood factor is factor Xa.
された血液因子であるＸａ因子を製薬的に受容可能な賦
形剤と混合した状態で含有する血友病の治療に用いる製
薬組成物であって、該改変された血液因子が、血清の存
在下で該血液因子の活性形態を生成する、製薬組成物。4. A pharmaceutical composition for treating hemophilia, comprising factor Xa, which is a blood factor modified to increase the half-life in serum, in admixture with a pharmaceutically acceptable excipient. A composition, wherein the modified blood factor produces an active form of the blood factor in the presence of serum.
たＸａ因子であって、該改変が、該改変されたＸａ因子
のタンパク質分解活性部位に可逆的にブロックされたセ
リン残基を含み、そして該改変されたＸａ因子が血漿の
存在下で活性なＸａ因子を生成する、改変されたＸａ因
子。5. A modified factor Xa having an extended plasma half-life, said modification comprising a serine residue reversibly blocked in the proteolytic active site of said modified factor Xa, And a modified factor Xa, wherein the modified factor Xa produces an active factor Xa in the presence of plasma.
５記載の改変されたＸａ因子。6. The modified factor Xa according to claim 5, which is an acylated factor Xa.
る、請求項５記載の血液因子。7. The blood factor according to claim 5, wherein said modified blood factor is factor Xa.
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|---|---|---|---|
| US57864691A | 1991-09-04 | 1991-09-04 | |
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Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP3517527A Division JPH06503950A (en) | 1990-09-04 | 1991-09-04 | Recombinant drugs that act on thrombosis |
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|---|---|
| JP2002234899A true JP2002234899A (en) | 2002-08-23 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001395485A Pending JP2002234899A (en) | 1991-09-04 | 2001-12-26 | Recombinant medicine acting on thrombosis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002234899A (en) |
-
2001
- 2001-12-26 JP JP2001395485A patent/JP2002234899A/en active Pending
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