JP2002233376A - New protein and its dna - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なＮａ+／Ｈ+
交換輸送体（ＮＨＥ）蛋白質、該蛋白質をコードするＤ
ＮＡ、該蛋白質の活性を促進または阻害する化合物のス
クリーニング方法、該スクリーニング方法で得られる化
合物などを提供する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel Na + / H +
Exchange transporter (NHE) protein, D encoding the protein
Provided are a method for screening a compound that promotes or inhibits the activity of NA, the protein, and a compound obtained by the screening method.
【０００２】[0002]
【従来の技術】Ｎａ+の流入とカップルしてＨ+を排出す
る機能を持つのがＮａ+／Ｈ+交換輸送体（ＮＨＥ）であ
る。ＮＨＥは、現在までに６種のアイソフォームが知ら
れている。各アイソフォームごとにその発現分布、調節
機構、阻害剤の作用が異なっている。ＮＨＥ１は広範な
組織に分布し、細胞内ｐＨ、細胞容積の調節に関わって
いる。ＮＨＥ１の活性は増殖因子や高浸透圧刺激により
亢進し、その結果、細胞内のｐＨが上昇する。ＮＨＥ３
は、腎臓や小腸に発現しており、Ｎａ+吸収に重要な役
割を果たしている。これらのＮＨＥは10個から12個の膜
貫通ドメインを有する膜蛋白質である。That BACKGROUND ART flows into the couple of Na + has the function of discharging the H + is Na + / H + antiporter (NHE). NHE has six known isoforms to date. Each of the isoforms has a different expression distribution, regulatory mechanism, and inhibitor action. NHE1 is distributed in a wide range of tissues and is involved in regulating intracellular pH and cell volume. The activity of NHE1 is enhanced by growth factors or hyperosmotic stimuli, resulting in an increase in intracellular pH. NHE3
Is expressed in the kidney and small intestine and plays an important role in Na + absorption. These NHEs are membrane proteins with 10 to 12 transmembrane domains.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】ＮＨＥ１は虚血後の細
胞内のＮａ+濃度の上昇に関与しており、心筋の障害を
引き起こす要因の一つと考えられている。さらに、高血
圧の患者では、ＮＨＥ１の活性が正常者に比較して優位
に高いことも報告されている。また、てんかんの自然発
症マウスにおいてＮＨＥの変異が原因になっていること
が確認されている（Cell 91: 139-148，1997）。このよ
うに、ＮＨＥは多くの病態に関与しており、ＮＨＥの各
アイソフォームの活性化と調節のメカニズムを解明する
ことが、治療薬開発につながる。[0009] NHE1 is involved in the increase of intracellular Na + concentration after ischemia, and is considered to be one of the factors causing myocardial damage. Furthermore, it has been reported that NHE1 activity is significantly higher in hypertensive patients than in normal subjects. In addition, it has been confirmed that mutations in NHE are responsible for spontaneous epilepsy mice (Cell 91: 139-148, 1997). As described above, NHE is involved in many disease states, and elucidation of the mechanism of activation and regulation of each isoform of NHE leads to development of a therapeutic drug.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｎａ+／Ｈ+
交換輸送体蛋白質（ヒトＮＨＥ３ホモログ）を見出し
た。該ヒトＮＨＥ３ホモログはアミノ酸レベルで、ヒト
ＮＨＥ３と部分的に６３％の相同性を示し、Ｎａ+／Ｈ+
交換輸送体として機能し得るものである。ヒトＮＨＥ３
ホモログを抑制する方法としては、例えば、Ｎａ+とＨ+
の交換輸送を阻害したり、ヒトＮＨＥ３ホモログの転写
を抑制して発現レベルを低下させることが考えられる。
ヒトＮＨＥ３ホモログを賦活化する方法としては、例え
ばＮａ, Ｎａ+とＨ+の交換輸送を促進したり、ＮＨＥ３
ホモログのプロモーターを活性化したり、ｍＲＮＡを安
定化することで発現レベルを亢進することが考えられ
る。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに検
討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventors have made intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that Na + / H +
An exchange transporter protein (human NHE3 homolog) was found. The human NHE3 homolog partially shows 63% homology with human NHE3 at the amino acid level, and Na + / H +
It can function as an exchange transporter. Human NHE3
As a method for suppressing homologues, for example, Na + and H +
It is conceivable to inhibit the exchange transport of DNA or to suppress the transcription of human NHE3 homolog to reduce the expression level.
Methods for activating human NHE3 homologues include, for example, promoting exchange transport of Na, Na + and H + , NHE3
It is considered that the expression level is enhanced by activating the promoter of the homolog or stabilizing the mRNA. The present inventors have further studied based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
【０００５】すなわち、本発明は、（１）配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（２）上記（１）項記載のタンパク質の部分ペプチドま
たはその塩、（３）上記（１）項記載のタンパク質また
は上記（２）項記載の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
を含有するＤＮＡ、（４）配列番号：２で表わされる塩
基配列を有する上記（３）項記載のＤＮＡ、（５）上記
（４）項記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（６）上記（５）項記載の組換えベクターで形質転換さ
れた形質転換体、（７）上記（６）項記載の形質転換体
を培養し、上記（１）項記載のタンパク質または上記
（２）項記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とする上記（１）項記載のタンパ
ク質もしくは上記（２）項記載の部分ペプチドまたはそ
の塩の製造法、（８）上記（１）項記載のタンパク質も
しくは上記（２）項記載の部分ペプチドまたはその塩を
含有してなる医薬、（９）上記（３）項記載のＤＮＡを
含有してなる医薬、（１０）上記（１）項記載のタンパ
ク質もしくは上記（２）項記載の部分ペプチドまたはそ
の塩に対する抗体、（１１）上記（１）項記載のタンパ
ク質もしくは上記（２）項記載の部分ペプチドまたはそ
の塩を用いることを特徴とする、上記（１）項記載のタ
ンパク質もしくは上記（２）項記載の部分ペプチドまた
はその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその
塩のスクリーニング方法、（１２）上記（１）項記載の
タンパク質もしくは上記（２）項記載の部分ペプチドま
たはその塩を含有してなる、上記（１）項記載のタンパ
ク質もしくは上記（２）項記載の部分ペプチドまたはそ
の塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩の
スクリーニング用キット、（１３）上記（１１）項記載
のスクリーニング方法または上記（１２）項記載のスク
リーニング用キットを用いて得られる、上記（１）項記
載のタンパク質もしくは上記（２）項記載の部分ペプチ
ドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物また
はその塩、（１４）上記（１１）項記載のスクリーニン
グ方法または上記（１２）項記載のスクリーニング用キ
ットを用いて得られる上記（１）項記載のタンパク質も
しくは上記（２）項記載の部分ペプチドまたはその塩の
活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含有し
てなる医薬、（１５）糖尿病、高血圧、虚血後再灌流障
害、てんかんの予防・治療剤である上記（８）項または
（９）項記載の医薬、（１６）糖尿病、高血圧、虚血後
再灌流障害、てんかんの予防・治療剤である上記（１
４）項記載の医薬などを提供する。That is, the present invention relates to (1) SEQ ID NO: 1.
A protein or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by
(2) a partial peptide of the protein of (1) or a salt thereof; (3) a DNA encoding the protein of (1) or the partial peptide of (2)
(4) a DNA according to the above (3) having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2, (5) a recombinant vector containing the DNA according to the above (4),
(6) A transformant transformed with the recombinant vector according to the above (5), (7) A transformant described in the above (6) is cultured, and the protein according to the above (1) or the above ( (2) a method for producing the protein according to the above (1), the partial peptide according to the above (2) or a salt thereof, wherein the partial peptide according to the above (2) is produced, accumulated, and collected. A pharmaceutical comprising the protein according to the above (1) or the partial peptide according to the above (2) or a salt thereof; (9) a pharmaceutical comprising the DNA according to the above (3); (1) An antibody against the protein described in (1) or the partial peptide described in (2) or a salt thereof, (11) Use of the protein described in (1) or the partial peptide described in (2) or a salt thereof To A method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the protein according to the above (1) or the partial peptide or the salt thereof according to the above (2), and (12) the method according to the above (1). A compound that promotes or inhibits the activity of the protein of (1) or the partial peptide of (2) or a salt thereof, comprising the protein or the partial peptide of (2) or a salt thereof; (13) The protein according to (1) or (2) above, which is obtained using the screening kit for a salt thereof, (13) the screening method according to (11) or the screening kit according to (12). A compound or a salt thereof, which promotes or inhibits the activity of the partial peptide or a salt thereof according to the above (14); Or a compound that promotes or inhibits the activity of the protein of (1) or the partial peptide of (2) or a salt thereof obtained by using the screening method of (1) or the screening kit of (12). A medicine comprising a salt, (15) the medicine according to the above (8) or (9), which is a preventive or therapeutic agent for diabetes, hypertension, post-ischemic reperfusion injury, epilepsy, (16) diabetes, hypertension (1) which is a prophylactic / therapeutic agent for post-ischemic reperfusion injury and epilepsy
4) The drug described in the item is provided.
【０００６】[0006]
【発明の実施の形態】本発明で用いられる配列番号：１
で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の
アミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、本発明のタ
ンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称する
こともある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモッ
ト、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツ
ジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細
胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メ
サンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮
細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊
維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファ
ージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細
胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜
細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細
胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆
細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの
細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位
（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下
部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵
臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副
腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血
管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾
丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来す
るタンパク質であってもよく、合成タンパク質であって
もよい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION SEQ ID NO: 1 used in the present invention
A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by (hereinafter, sometimes referred to as the protein of the present invention or the protein used in the present invention) is a human or a warm-blooded animal (for example, Cells of guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, sheep, cows, monkeys, etc. (eg, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermis) Cell, epithelial cell, goblet cell, endothelial cell, smooth muscle cell, fibroblast, fiber cell, muscle cell, adipocyte, immune cell (eg, macrophage, T cell, B cell, natural killer cell, mast cell, neutrophil Spheres, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stroma Vesicles, or precursor cells of these cells, stem cells or cancer cells) or any tissue in which these cells are present, such as the brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, thalamus) Lower, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary, stomach, pancreas, kidney, liver, gonads, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels Or a protein derived from the heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testis, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, or the like, or may be a synthetic protein.
【０００７】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実
質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約７
５％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましく
は約８５％以上、最も好ましくは約９０％以上の相同性
を有するアミノ酸配列などが挙げられる。配列番号：１
で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番
号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ
酸配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列
を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタン
パク質などが好ましい。実質的に同質の活性としては、
例えば、Ｎａ+とＨ+の交換輸送活性などが挙げられる。
実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理
学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。し
たがって、Ｎａ+とＨ+の交換輸送活性が同等（例、約
０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、よ
り好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、
これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要
素は異なっていてもよい。Ｎａ+とＨ+の交換輸送活性な
どの活性の測定は、公知の方法に準じて行うことが出来
るが、例えば、J. Biol. Chem. 274: 3978-3987, 1998
に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定する
ことができる。The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 70% or more, preferably about 7% or more, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
An amino acid sequence having a homology of 5% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 85% or more, and most preferably about 90% or more can be mentioned. SEQ ID NO: 1
As a protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by, for example, a protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 1; A protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by 1 is preferred. As substantially the same activity,
For example, the activity of exchange transport of Na + and H + can be mentioned.
Substantially homogenous indicates that the properties are homogenous (eg, physiologically or pharmacologically). Therefore, it is preferable that the exchange transport activities of Na + and H + are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). ,
Quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different. The activity such as the exchange transport activity between Na + and H + can be measured according to a known method. For example, J. Biol. Chem. 274: 3978-3987, 1998
Can be measured according to the method described in (1) or a method analogous thereto.
【０００８】また、本発明で用いられるタンパク質とし
ては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列
中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、
好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜
５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（好
ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程
度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付
加したアミノ酸配列、配列番号：１で表されるアミノ
酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程
度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数
（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２
個以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜
１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミ
ノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または
それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパ
ク質などのいわゆるムテインも含まれる。上記のように
アミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、
その挿入、欠失または置換の位置は、とくに限定されな
い。The protein used in the present invention includes, for example, one or more (preferably about 1 to 30) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
Preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to
5) amino acids, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 1 or more (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably An amino acid sequence to which a number (1 to 5) of amino acids are added, 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10) to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, More preferably, an amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids have been inserted,
1 or 2 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
Or more (preferably about 1 to 30, preferably 1 to 30)
A so-called mutein such as a protein containing an amino acid sequence in which about 10 amino acids are substituted, and more preferably about 1 to 5 amino acids, or an amino acid sequence obtained by combining them is also included. When the amino acid sequence is inserted, deleted or substituted as described above,
The position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
【０００９】本明細書におけるタンパク質は、ペプチド
標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端
がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で
表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめ
とする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端が通
常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレー
ト(−ＣＯＯ-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ
2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。こ
こでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エ
チル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどの
Ｃ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘ
キシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニ
ル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベ
ンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基
もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ
1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基、ピバロイル
オキシメチル基などが用いられる。本発明で用いられる
タンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカル
ボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がア
ミド化またはエステル化されているものも本発明で用い
られるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとし
ては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられ
る。さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末
端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が
保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−
６アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護され
ているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグル
タミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のア
ミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミ
ノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基な
ど）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基
などのＣ1-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）
で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆ
る糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例え
ば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するヒ
ト肝臓由来のタンパク質などがあげられる。In the present specification, the left end is the N-terminus (amino terminal) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) according to the convention of peptide labeling. SEQ ID NO: including the protein containing the amino acid sequence represented by the protein used in the present invention, C-terminal, usually a carboxyl group (-COOH) or carboxylate (-COO -) is a, C-terminal, Is an amide (-CONH
2 ) or an ester (—COOR). Here, as R in the ester, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl and n-butyl, for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl and cyclohexyl, for example, phenyl And C 6-12 aryl groups such as α-naphthyl, for example, phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl or α-naphthyl-C such as α-naphthylmethyl.
A C 7-14 aralkyl group such as a 1-2 alkyl group and a pivaloyloxymethyl group are used. When the protein used in the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, a protein in which the carboxyl group is amidated or esterified is also included in the protein used in the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used. Furthermore, in the protein used in the present invention, the amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) has a protective group (for example, C1-C1 such as a formyl group or an acetyl group).
6 protected by C 1-6 acyl group such as alkanoyl), N-terminal glutamine residue formed by cleavage in vivo, pyroglutamine oxidation, Substitution on side chain of amino acid in molecule Groups (for example, -OH, -SH, amino group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc.) are suitable protecting groups (for example, C 1-6 acyl groups such as C 1-6 alkanoyl groups such as formyl group and acetyl group). Group)
Or a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a sugar chain is bound.
Specific examples of the protein used in the present invention include, for example, a human liver-derived protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
【００１０】本発明で用いられるタンパク質の部分ペプ
チドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質
の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明
で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであ
ればいずれのものでもよい。例えば、本発明で用いられ
るタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０
個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０
個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは
２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用
いられる。また、本発明で用いられる部分ペプチドは、
そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、
１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）の
アミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１また
は２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好まし
くは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）
個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に
１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より
好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜
５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸
配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程
度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程
度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよ
い。本発明の部分ペプチドとしては、配列番号：１で表
されるアミノ酸配列において例えば第176番目〜201番
目、第471番目〜491番目のアミノ酸配列が好ましい。[0010] The partial peptide of the protein used in the present invention is a partial peptide of the protein used in the present invention described above, and preferably has the same properties as the protein used in the present invention described above. Any one may be used. For example, at least 20 of the constituent amino acid sequences of the protein used in the present invention.
Or more, preferably 50 or more, more preferably 70
Peptides having an amino acid sequence of at least 100, more preferably at least 100, most preferably at least 200 are used. Further, the partial peptide used in the present invention is:
1 or 2 or more (preferably,
About 1 to 10, more preferably number (1 to 5) amino acids are deleted, or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20, more preferably 1 to 2) About 10, more preferably number (1 to 5)
Amino acids) or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 2 amino acids) in the amino acid sequence.
5) amino acids, or one or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and still more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence. It may be substituted with another amino acid. The partial peptide of the present invention is preferably, for example, the amino acid sequence at positions 176 to 201 and 471 to 491 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
【００１１】また、本発明で用いられる部分ペプチドは
Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカル
ボキシレート（−ＣＯＯ-）であるが、前記した本発明
で用いられるタンパク質のごとく、Ｃ末端がアミド（−
ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であっても
よい。さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、
前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｃ末
端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を
有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニ
ン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ
端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピロ
グルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の
置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは
糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチド
なども含まれる。本発明で用いられる部分ペプチドは抗
体作成のための抗原としても用いることができる。たと
えば、後述する本発明の抗体を調製する目的には、例え
ば配列番号：１で表されるアミノ酸配列において第399
〜417番目, 第500〜649番目のアミノ酸配列を有するペ
プチドなどがあげられる。The partial peptide used in the present invention usually has a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (—COO − ) at the C-terminus. (-
CONH 2 ) or an ester (—COOR). Further, the partial peptide used in the present invention includes
Similar to the protein used in the present invention described above, those having a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, and the amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) is a protecting group. Protected, N
Glutamine residue generated by cleavage at the end in vivo is pyroglutamine-oxidized, substituent on the side chain of amino acid in the molecule is protected by an appropriate protecting group, or so-called sugar to which sugar chain is bonded Complex peptides such as peptides are also included. The partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for producing an antibody. For example, to prepare the antibody of the present invention described below, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:
Peptides having the amino acid sequence at positions 417-500 and 500-649.
【００１２】本発明で用いられるタンパク質または部分
ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、
無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などと
の塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加
塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸
（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、
あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、
フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、
リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼ
ンスルホン酸）との塩などが用いられる。本発明で用い
られるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその
塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から公
知のタンパク質の精製方法によって製造することもでき
るし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転
換体を培養することによっても製造することができる。
また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもで
きる。ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場
合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズし
た後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロ
マトグラフィーを組み合わせることにより精製単離する
ことができる。The salt of the protein or partial peptide used in the present invention may be a physiologically acceptable acid (eg,
Salts with inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metal salts) are used, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid),
Alternatively, organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid,
Fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid,
For example, salts with malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid) are used. The protein or its partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced from the above-mentioned method for purifying a protein from human or warm-blooded animal cells or tissues. It can also be produced by culturing the transformant.
Further, it can be produced according to the peptide synthesis method described later. When producing from human or mammalian tissues or cells, the homogenized human or mammalian tissues or cells are extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.
【００１３】本発明で用いられるタンパク質もしくは部
分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成に
は、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることがで
きる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル
樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセ
トアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェ
ノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocア
ミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができ
る。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基
を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の
配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合
させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペ
プチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに
高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施
し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれ
らのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合
に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試
薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類が
よい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ,Ｎ'-ジ
イソプロピルカルボジイミド、Ｎ-エチル-Ｎ'-(3-ジメ
チルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられ
る。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例え
ば、ＨＯＢｔ, ＨＯＯＢｔ)とともに保護アミノ酸を直
接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢ
ｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじ
め保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加する
ことができる。For the synthesis of the protein or partial peptide or a salt thereof or an amide thereof used in the present invention, a commercially available resin for protein synthesis can be usually used. Such resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin,
PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4-
(2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods. At the end of the reaction, the protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.In addition, an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein or partial peptide or an amide thereof. I do. For the condensation of the above protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As carbodiimides, DCC, N, N'-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N '-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. Activation by these involves adding a protected amino acid directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, HOOBt) or using a symmetrical acid anhydride or HOB
The protected amino acid can be added as a t-ester or HOOBt ester to the resin after activation of the protected amino acid in advance.
【００１４】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより
十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても
十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセ
チルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化
することによって、後の反応に影響を与えないようにす
ることができる。The solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol,
Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; and an appropriate mixture thereof are used. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about -20 ° C to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be carried out by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When a sufficient condensation cannot be obtained by repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole so as not to affect the subsequent reaction.
【００１５】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソ
ボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキ
シカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキ
シカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホ
ルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニル
ホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。カル
ボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、
メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シク
ロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロ
オクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もし
くは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化
（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエス
テル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベン
ジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシ
ルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド
化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒ
ドラジド化などによって保護することができる。セリン
の水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によ
って保護することができる。このエステル化に適する基
としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ1-6）ア
ルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジ
ルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭
酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル
化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒ
ドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。チロシンの
フェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚ
ｌ、Ｃｌ2−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、
ｔ−ブチルなどが用いられる。ヒスチジンのイミダゾー
ルの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４-メトキシ-2,
3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジル
オキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなど
が用いられる。Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, Trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used. Carboxyl groups can be, for example, alkyl esterified (eg,
Linear, branched or cyclic alkyl esterification such as methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl), aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide, etc. Can be. The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. Examples of groups suitable for the esterification include lower (C 1-6 ) alkanoyl groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, and groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group. Used. Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group. Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bz
1, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z,
T-butyl and the like are used. Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 4-methoxy-2,
3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
【００１６】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノ
ール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、ＨＯＮＢ、Ｎ-ヒドロキシスクシミド、Ｎ-ヒドロキ
シフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用い
られる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、
例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。保護基の
除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいは
Ｐｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触
還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、ト
リフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるい
はこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピル
エチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラ
ジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリ
ウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱
離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれ
るが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノ
ール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾー
ル、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-
エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が
有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基と
して用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノー
ル処理により除去され、トリプトファンのインドール保
護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジ
チオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理
による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アン
モニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。Examples of the activated carboxyl group of the raw material include, for example, a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and an ester with HOBt). As the activated amino group of the raw material,
For example, the corresponding phosphoric amide is used. As a method for removing (eliminating) the protecting group, for example, catalytic reduction in a stream of hydrogen in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, trifluoromethane, etc. Acid treatment with dichloromethane, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the above acid treatment is generally performed at a temperature of about -20 ° C to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethylsulfide, 1,4 -Butanedithiol, 1,2-
Addition of a cation scavenger such as ethanedithiol is effective. In addition, the 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane described above. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
【００１７】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質または部分ペプチドの
アミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カル
ボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化し
て保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖
を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端の
α−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部
分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除
去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これ
らのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶
媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同
様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペ
プチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を
除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ること
ができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各
種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥する
ことで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得
ることができる。タンパク質またはペプチドのエステル
体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−
カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸
エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド
体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエ
ステル体を得ることができる。The protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means. . As another method for obtaining an amide form of a protein or partial peptide, for example, first, after amidating and protecting the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid, a peptide (protein) chain is added to the amino group side to a desired chain length. After the elongation, a protein or partial peptide from which only the protecting group for the N-terminal α-amino group of the peptide chain has been removed, and a protein or partial peptide from which only the protecting group for the C-terminal carboxyl group has been removed, are produced. The protein or peptide is condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein or peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude protein or peptide. This crude protein or peptide is purified by various known purification means, and the main fraction is lyophilized to obtain an amide of the desired protein or peptide. To obtain an ester of a protein or peptide, for example, α-
After condensing the carboxyl group with a desired alcohol to form an amino acid ester, the desired protein or peptide ester can be obtained in the same manner as the protein or peptide amide.
【００１８】本発明で用いられる部分ペプチドまたはそ
れらの塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるい
は本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼ
で切断することによって製造することができる。ペプチ
ドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法
のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられ
る部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミ
ノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する
場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製
造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離と
しては、例えば、以下の〜に記載された方法が挙げ
られる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合
成、広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペ
プチドを精製単離することができる。上記方法で得られ
る部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法ある
いはそれに準じる方法によって適当な塩に変換すること
ができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法ある
いはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変
換することができる。The partial peptide used in the present invention or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving the protein used in the present invention with an appropriate peptidase. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the partial peptide used in the present invention with the remaining portion, and removing the protecting group when the product has a protecting group. it can. Known methods for condensation and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in (1) to (4) below. M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publisher
s, New York (1966) Schroeder and Luebke, The Peptid
e), Academic Press, NewYork (1965) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and experiments of peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd.
(1975) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory of Biochemistry 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977) Supervised by Haruaki Yajima, Development of Continuing Pharmaceuticals, Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten Thereafter, the partial peptide used in the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the partial peptide is obtained as a salt, a known method or analogous method It can be converted into a free form or another salt by a method.
【００１９】本発明で用いられるタンパク質をコードす
るＤＮＡとしては、前述した本発明で用いられるタンパ
ク質をコードする塩基配列を含有するものであればいか
なるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮ
Ａ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、
合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用する
ベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミ
ド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前
記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分
を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Po
lymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略
称する）によって増幅することもできる。本発明で用い
られるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例え
ば、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮ
Ａ、または配列番号：２で表される塩基配列とハイスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を
有し、本発明で用いられるタンパク質と実質的に同質の
性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何
れのものでもよい。The DNA encoding the protein used in the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein used in the present invention. In addition, genomic DNA, genomic DNA library, cDN derived from the above-described cells and tissues
A, a cDNA library derived from the cells and tissues described above,
Any of synthetic DNAs may be used. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. In addition, reverse transcriptase Po is directly used by preparing a total RNA or mRNA fraction from the cells and tissues described above.
It can also be amplified by a lymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method). The DNA encoding the protein used in the present invention includes, for example, DN containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
A or a DNA encoding a protein having a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having substantially the same properties as the protein used in the present invention. Any one may be used.
【００２０】配列番号：２で表される塩基配列とハイス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡ
としては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列と
約７０％以上、好ましくは約７５％以上、より好ましく
は約８０％以上、特に好ましくは約８５％以上、最も好
ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有
するＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーション
は、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モ
レキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd
（J. Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Pres
s, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができ
る。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の
使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って
行なうことができる。ハイストリンジェントな条件と
は、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ま
しくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好
ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウ
ム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ま
しい。より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ
酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとして
は、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ
などが用いられる。DNA capable of hybridizing with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringent conditions
For example, about 70% or more, preferably about 75% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 85% or more, most preferably about 90% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. DNA containing a base sequence having the above homology is used. Hybridization may be performed by a known method or a method analogous thereto, for example, Molecular Cloning 2nd.
(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Pres
s, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
More preferably, it can be performed under high stringency conditions. The high stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. Particularly, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable. More specifically, the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2
Are used.
【００２１】本発明で用いられる部分ペプチドをコード
するＤＮＡとしては、前述した本発明で用いられる部分
ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであれば
いかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲ
ノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃ
ＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリ
ー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。本発明で用いられる
部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配
列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡの一部分
を有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配
列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
る塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同
質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部
分を含有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：２で
表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前
記と同意義を示す。ハイブリダイゼーションの方法およ
びハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用
いられる。The DNA encoding the partial peptide used in the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide used in the present invention. In addition, genomic DNA, genomic DNA library, c
It may be any of DNA, cDNA library derived from the above-mentioned cells and tissues, and synthetic DNA. Examples of the DNA encoding the partial peptide used in the present invention include a DNA having a part of the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and high stringency For example, DNAs containing a part of DNA encoding a protein having a base sequence that hybridizes under a simple condition and having substantially the same activity as the protein of the present invention can be used. The DNA hybridizable to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 has the same significance as described above. The same hybridization method and high stringency conditions as described above are used.
【００２２】本発明で用いられるタンパク質、部分ペプ
チド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニング
および発現の説明においては、これらを単に本発明のタ
ンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤ
ＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク
質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプ
ライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または
適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク
質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしく
は合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼ
ーションによって選別することができる。ハイブリダイ
ゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニ
ング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al.,
Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法
などに従って行なうことができる。また、市販のライブ
ラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法
に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換
は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、MutanTM-superExp
ress Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））
等を用いて、ODA-LAPCR法やGapped duplex法やKunkel法
等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行
なうことができる。クローン化されたタンパク質をコー
ドするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により
制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用
することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開
始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻
訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有
していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コ
ドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加する
こともできる。本発明のタンパク質の発現ベクターは、
例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ
から目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ
断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連
結することにより製造することができる。The protein and partial peptide used in the present invention (hereinafter, in the description of the cloning and expression of DNAs encoding them, these may be simply abbreviated as the protein of the present invention) are completely encoded by D
As a means for cloning NA, the DNA may be amplified by a PCR method using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, or the DNA incorporated into an appropriate vector may be a part of the protein of the present invention. Alternatively, selection can be carried out by hybridization with a DNA fragment encoding the entire region or labeled with a synthetic DNA. Hybridization methods are described, for example, in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al.,
Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Conversion of the base sequence of DNA can be performed by PCR or a known kit, for example, Mutan ™ -superExp.
ress Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.)
The method can be performed according to a known method such as the ODA-LAPCR method, the gapped duplex method, the Kunkel method, or a method analogous thereto. The DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or it can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using a suitable synthetic DNA adapter. The expression vector of the protein of the present invention is
For example, (a) DNA encoding the protein of the present invention
From (b) the DNA
It can be produced by ligating the fragment downstream of the promoter in an appropriate expression vector.
【００２３】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で
用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用い
る宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなる
ものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場
合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、Ｌ
ＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫ
プロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶ
（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモ
ーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア
属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモ
ーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、
ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主が
バチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、Ｓ
ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主
が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプ
ロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター
などが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘ
ドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好まし
い。As a vector, a plasmid derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12,
UC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB11)
0, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), bacteriophages such as phage λ, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc.
A1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RS
V, pcDNAI / Neo, etc. are used. The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when animal cells are used as hosts, SRα promoter, SV40 promoter, L
TR promoter, CMV promoter, HSV-TK
Promoters and the like. Of these, CMV
(Cytomegalovirus) promoter, SRα promoter and the like are preferably used. When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter,
When the host is a bacterium of the genus Bacillus, the SPO1 promoter, the S7 promoter,
When the host is yeast, such as a PO2 promoter and a penP promoter, a PHO5 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, and the like are preferable. When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
【００２４】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイ
ニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マ
ーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含
まない培地によっても選択できる。また、必要に応じ
て、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質
のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である
場合は、ＰｈｏＡシグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列
などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラ
ーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列などが、
宿主が酵母である場合は、ＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ
２シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、
インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグ
ナル配列、抗体分子シグナル配列などがそれぞれ利用で
きる。このようにして構築された本発明のタンパク質を
コードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転
換体を製造することができる。[0024] In addition to the above, an expression vector optionally containing an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori) and the like may be used. Can be used. As a selection marker, for example, dihydrofolate reductase (hereinafter, dhfr)
Gene (sometimes abbreviated as “methotrexate (M
TX) resistance], an ampicillin resistance gene (hereinafter referred to as Amp
r ), a neomycin resistance gene (hereinafter sometimes referred to as Neo r , G418 resistance) and the like. In particular, when the dhfr gene is used as a selection marker using dhfr gene-deficient Chinese hamster cells, the target gene can be selected using a thymidine-free medium. If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, a PhoA signal sequence, an OmpA signal sequence, and the like. When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, an α-amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, and the like,
When the host is yeast, the MFα signal sequence, SUC
When the host is an animal cell, such as a 2 signal sequence,
Insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule signal sequence, etc. can be used, respectively. A transformant can be produced using the vector containing the DNA encoding the protein of the present invention thus constructed.
【００２５】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１
２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユー
エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０
巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・
アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９
巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecul
ar Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ
１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネテ
ィックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕な
どが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチ
ルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４
〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１
〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of
Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用
いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，Ａ
Ｈ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ
−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccha
romyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３
６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１
などが用いられる。As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used. Specific examples of Escherichia bacteria include
For example, Escherichia coli K1
2. DH1 [Procedures of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60]
Vol. 160 (1968)], JM103 [Nukuirek
Acids Research, (Nucleic Acids Research), 9
309 (1981)], JA 221 [Journal of Molecule Biology (Journal of Molecul)
ar Biology)], 120, 517 (1978)], HB
101 [Journal of Molecular Biology, Vol. 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, Vol. 39, 440 (1954)] and the like are used. Examples of Bacillus spp. Include, for example, Bacillus subtilis MI114
[Gene, 24, 255 (1983)], 207-21
[Journal of Biochemistry
Biochemistry), 95, 87 (1984)]. As yeast, for example, Saccharomyces
Saccharomyces cerevisiae AH22, A
H22R -, NA87-11A, DKD-5D , 20B
-12, Schizosacchamyces pombe
romyces pombe) NCYC1913, NCYC203
6. Pichia pastoris KM71
Are used.
【００２６】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞
としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ
２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In V
ivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫と
しては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以
下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆ
ｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２
０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細
胞などが用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換する
には、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９
巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１
０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことが
できる。As insect cells, for example, virus is A
In the case of cNPV, a cell line derived from night larvae of moth (Spodop
tera frugiperda cell (Sf cell), Trichoplusia ni
MG1 cells from the midgut, H from the eggs of Trichoplusia ni
igh Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or
Estigmena acrea-derived cells and the like are used. When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mor
iN cells; BmN cells) and the like. As the Sf cells, for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf9
21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo
ivo), 13, 213-217, (1977)). As insects, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (198).
5)]. As animal cells, for example, monkey cells COS-
7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter, CHO (dhf)
r − ) cells), mouse L cells, mouse AtT-2
0, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, and the like. In order to transform Escherichia, for example, Processings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69
Vol. 2110 (1972) and Gene, Vol. 17, 1
07 (1982).
【００２７】バチルス属菌を形質転換するには、例え
ば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，
１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうこと
ができる。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ
・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７
８）などに記載の方法に従って行なうことができる。昆
虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ
／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）
などに記載の方法に従って行なうことができる。動物細
胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細
胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）
（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，
４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことがで
きる。このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡ
を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を
得ることができる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス
属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される
培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質
転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が
含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコー
ス、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源と
しては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーン
スチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大
豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無
機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素
ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。ま
た、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加
してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。For transformation of Bacillus sp., For example, Molecular & General Genetics, Vol.
111 (1979). To transform yeast, for example, Methods in Enzymolog
y), 194, 182-187 (1991), Processings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Na)
Acad. Sci. USA), 75, 1929 (197).
8) and the like. In order to transform insect cells or insects, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988))
And the like. To transform animal cells, for example, see Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995)
(Published by Shujunsha), Virology, Volume 52,
456 (1973). Thus, the DNA encoding the protein
A transformant transformed with an expression vector containing When culturing a transformant whose host is a genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culturing, and a carbon source necessary for growth of the transformant is used therein. Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. As a carbon source, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc.As a nitrogen source, for example, ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract and the like Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5 to 8.
【００２８】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエ
シェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質
転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホ
ールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー
（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０
５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培
地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ
・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳ
Ａ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。
培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は
通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要
に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞または昆
虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grac
e's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Natur
e）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の
添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨ
は約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通
常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や
撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養
する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛
血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２
２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジ
ー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ
１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・
メディカル・アソシエーション（The Journal of the A
merican Medical Association）１９９巻，５１９(１９
６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソ
サイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Proceeding ofthe Society for the Biological Medi
cine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐ
Ｈは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃
〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気
や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞
内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せ
しめることができる。As a medium for culturing the genus Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics (Journa)
l of Experiments in Molecular Genetics), 431-
433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1
972] is preferred. If necessary, an agent such as 3β-indolylacrylic acid can be added in order to make the promoter work efficiently. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually carried out at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added. When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added. When culturing a transformant in which the host is yeast, for example, Burkholder's minimum medium [Bostian, KL
Processings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77, 450
5 (1980)] and an SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Processings of the.
National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. US
A), 81, 5330 (1984)].
Preferably, the pH of the medium is adjusted to about 5-8. The cultivation is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and if necessary, aeration and stirring are added. When culturing a transformant whose host is an insect cell or an insect, the medium used is Grac.
e's Insect Medium (Grace, TCC, Nature (Natur
e), 195, 788 (1962)) to which an additive such as immobilized 10% bovine serum is appropriately added. Medium pH
Is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The cultivation is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and if necessary, aeration and / or stirring are added. When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 12
2, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI
1640 medium [Journal of the American
Medical Association (The Journal of the A
American Medical Association) 199, 519 (19
67)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine]
cine), 73, 1 (1950)]. p
H is preferably about 6-8. Culture is usually about 30 ° C
Perform at １５40 ° C. for about 15-60 hours, adding aeration and stirring as needed. As described above, the protein of the present invention can be produced in the cell, in the cell membrane, or outside the cell of the transformant.
【００２９】上記培養物から本発明のタンパク質を分離
精製するには、例えば、下記の方法により行なうことが
できる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ
る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変
性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含ま
れていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場
合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と
上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られ
た培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の
精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行な
うことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透
析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの
荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラ
フィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液
体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方
法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法
などが用いられる。The protein of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method. When the protein of the present invention is extracted from cultured cells or cells, after culturing, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to sonication, lysozyme, and / or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is used as appropriate. The buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 ™ . When the protein is secreted into the culture solution, after the culture is completed, the supernatant is separated from the cells or cells by a known method, and the supernatant is collected. The protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be purified by appropriately combining known separation and purification methods. These known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight. Method using difference in charge, method using charge difference such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, and use of difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography A method utilizing a difference between isoelectric points, such as an isoelectric focusing method, is used.
【００３０】かくして得られるタンパク質が遊離体で得
られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法
によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場
合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊
離体または他の塩に変換することができる。なお、組換
え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適
当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾
を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもで
きる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キ
モトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテ
インキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かく
して生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を
用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッテ
ィングなどにより測定することができる。When the protein thus obtained is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained as a salt, a known method or analogous method Depending on the method, it can be converted into a free form or other salts. The protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification. As the protein modifying enzyme, for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used. The presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by an enzyme immunoassay using a specific antibody, Western blotting, or the like.
【００３１】本発明で用いられるタンパク質もしくは部
分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明で用い
られるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を
認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体の何れであってもよい。本発明で用いられ
るタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以
下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタン
パク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明
のタンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血
清の製造法に従って製造することができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血
動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げら
れるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モ
ノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免
疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種ま
たは異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することが
できる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標
識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結
合した標識剤の活性を測定することにより行なうことが
できる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミ
ルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1
975)〕に従い実施することができる。融合促進剤として
は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセン
ダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが
用いられる。The antibody against the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention. Is also good. Antibodies against the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof (hereinafter, these may be simply abbreviated to the protein of the present invention in the description of the antibody) can be obtained by using the protein of the present invention as an antigen and a known antibody. It can be produced according to a method for producing an antibody or antiserum. [Preparation of Monoclonal Antibody] (a) Preparation of Monoclonal Antibody-Producing Cell The protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal by itself or together with a carrier or a diluent at a site where the antibody can be produced by administration. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, about 2 to 10 times in total. Examples of the warm-blooded animal to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats and chickens, and mice and rats are preferably used. When preparing monoclonal antibody-producing cells, a warm-blooded animal immunized with an antigen, for example, an individual having an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and contained in the spleen or lymph node. By fusing the antibody-producing cells thus obtained with myeloma cells of the same or different species, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody. The fusion operation is performed by known methods, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1
975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
【００３２】骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄
腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられ
る。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細
胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、
ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）
が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、
好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベート
することにより効率よく細胞融合を実施できる。モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには
種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を
直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイク
ロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に
放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体
（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス
免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡ
を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する
方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着
させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性
物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結
合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げら
れる。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれ
に準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ
（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加
した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および
育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるもの
ならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２
０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰ
ＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧ
ＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドー
マ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬
（株））などを用いることができる。培養温度は、通常
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。Examples of myeloma cells include NS-1,
Examples include warm-blooded animal myeloma cells such as P3U1, SP2 / 0, and AP-1, but P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1,
PEG (preferably PEG1000-PEG6000)
Is added at a concentration of about 10 to 80%,
Preferably, cell fusion can be carried out efficiently by incubating at 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes. Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein antigen is adsorbed directly or together with a carrier, and then radioactive substances or An anti-immunoglobulin antibody labeled with an enzyme or the like (if the cell used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A
A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase, adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, adding a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme, and A method for detecting a monoclonal antibody bound to a phase is exemplified. Selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a method analogous thereto. Normal HAT
(Hypoxanthine, aminopterin, thymidine) in an animal cell culture medium. As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as a hybridoma can grow. For example, 1-2
RP containing 0%, preferably 10-20% fetal calf serum
MI 1640 medium, G containing 1-10% fetal calf serum
An IT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or a serum-free medium for hybridoma culture (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used. The culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. The culture can be usually performed under 5% carbon dioxide. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
【００３３】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例え
ば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコ
ール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体
（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過
法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテ
インＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合
を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なう
ことができる。(B) Purification of Monoclonal Antibody Separation and purification of monoclonal antibodies can be performed by known methods, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method). , Ion-exchanger (eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-bound solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G to collect only antibody and dissociate the antibody Specific purification method for obtaining
【００３４】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に
従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タン
パク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質と
の複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法
と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発
明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の
分離精製を行なうことにより製造することができる。温
血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリア
ー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類お
よびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに
架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くで
きれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよ
いが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブ
リン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約
０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせ
る方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカ
プリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、
グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性
エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活
性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動
物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは
担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産
生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完
全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、
通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行な
われる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫され
た温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取
することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の
測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測
定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモ
ノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの
分離精製法に従って行なうことができる。[Preparation of Polyclonal Antibody] The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to known methods or modifications thereof. For example, an immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting a substance and separating and purifying the antibody. With respect to the complex of the immunizing antigen and the carrier protein used for immunizing a warm-blooded animal, the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten are such that the antibody is efficiently cross-linked to the hapten immunized by crosslinking the carrier. If possible, any material may be cross-linked at any ratio. For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 20, relative to hapten 1. A method of coupling at a rate of ５5 is used. Further, for coupling of the hapten and the carrier, various condensing agents can be used,
Glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, and the like are used. The condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is
Usually, once every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total. The polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method. The measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. The polyclonal antibody can be separated and purified according to the same method for separating and purifying immunoglobulins as in the above-described method for separating and purifying a monoclonal antibody.
【００３５】本発明で用いられるタンパク質または部分
ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、アンチセンスヌク
レオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明の
ＤＮＡと略記する場合がある）の塩基配列に相補的な、
または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンス
ヌクレオチドとしては、本発明のＤＮＡの塩基配列に相
補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有し、該Ｄ
ＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、い
ずれのアンチセンスヌクレオチドであってもよいが、ア
ンチセンスＤＮＡが好ましい。本発明のＤＮＡに実質的
に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相
補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）
の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好
ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、
最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列
などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全
塩基配列うち、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコー
ドする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基
配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０
％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは
約９５％以上の相同性を有するアンチセンスヌクレオチ
ドが好適である。具体的には、配列番号：２で表わされ
る塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もし
くは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有
するアンチセンスヌクレオチド、好ましくは例えば、配
列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基
配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアン
チセンスヌクレオチドなどが挙げられる。アンチセンス
ヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１
５〜３０個程度の塩基から構成される。ヌクレアーゼな
どの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセン
スＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホス
フェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホ
スホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん
酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンス
ヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製
造することができる。A DNA that is complementary to the base sequence of DNA encoding the protein or partial peptide used in the present invention (hereinafter, these DNAs may be abbreviated to the DNA of the present invention in the description of antisense nucleotides).
Alternatively, the antisense nucleotide having a substantially complementary nucleotide sequence includes a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of the DNA of the present invention.
Any antisense nucleotide may be used as long as it has an effect of suppressing the expression of NA, but antisense DNA is preferable. The base sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, a base sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, a complementary strand of the DNA of the present invention).
About 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more,
Most preferably, a nucleotide sequence having about 95% or more homology is exemplified. In particular, of the entire base sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention, the base sequence of the portion encoding the N-terminal portion of the protein of the present invention (for example, a base sequence near the start codon, etc.) is at least about 70% or more of the complementary strand. Preferably about 80
%, More preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more antisense nucleotides are preferred. Specifically, a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or an antisense nucleotide having a part thereof, preferably, for example, SEQ ID NO: : 2, a base sequence complementary to the base sequence of the DNA having the base sequence represented by 2, or an antisense nucleotide having a part thereof. The antisense nucleotide is usually about 10 to 40, preferably 1 to 40.
It is composed of about 5 to 30 bases. In order to prevent degradation by a hydrolase such as nuclease, the phosphate residue (phosphate) of each nucleotide constituting the antisense DNA is replaced with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate, methylphosphonate or phosphorodithionate. It may be substituted. These antisense nucleotides can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
【００３６】以下に、本発明のタンパク質もしくは部分
ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略
記する場合がある）、本発明のタンパク質または部分ペ
プチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略
記する場合がある）、本発明のタンパク質もしくは部分
ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗
体と略記する場合がある）、および本発明のＤＮＡのア
ンチセンスヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンス
ヌクレオチドと略記する場合がある）の用途を説明す
る。Hereinafter, the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention), the DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention (hereinafter referred to as the DNA of the present invention) Abbreviated), antibodies against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention), and antisense nucleotides of the DNA of the present invention (hereinafter referred to as the antisense nucleotide of the present invention). (May be abbreviated as sense nucleotide).
【００３７】本発明のタンパク質の活性を阻害する化合
物もしくはその塩を含有する医薬は、Ｎａ+とＨ+の交換
輸送を抑制することができるので例えば、糖尿病、高血
圧、虚血後再灌流障害、てんかんなどの治療・予防剤と
して使用することができる。一方、本発明のタンパク質
の活性を促進する化合物もしくはその塩を含有する医薬
は、Ｎａ+とＨ+の交換輸送を促進することができるの
で、例えば、糖尿病、高血圧、虚血後再灌流障害、てん
かんなどの治療・予防剤として使用することができる。The drug containing the compound or its salt that inhibits the activity of the protein of the present invention can suppress the exchange transport of Na + and H + , and thus can be used, for example, for diabetes, hypertension, post-ischemic reperfusion injury, It can be used as an agent for treating and preventing epilepsy. On the other hand, a drug containing a compound or a salt thereof that promotes the activity of the protein of the present invention can promote exchange transport of Na + and H + , for example, diabetes, hypertension, reperfusion injury after ischemia, It can be used as an agent for treating and preventing epilepsy.
【００３８】〔１〕本発明のタンパク質が関与する各種
疾病の治療・予防剤 本発明のタンパク質は、Ｎａ, Ｋ−ＡＴＰａｓｅ活性を
有し、細胞内のｐＨの調節、細胞容積調節に腎臓や小腸
におけるＮａ+の再吸収などの重要な役割を果たしてい
る。したがって、本発明のタンパク質をコードするＤＮ
Ａに異常があったり、欠損している場合あるいは本発明
のタンパク質の発現量が減少している場合には、例え
ば、糖尿病、高血圧、虚血後再灌流障害、てんかんなど
の種々の疾患が発症する。したがって、本発明のタンパ
ク質および本発明のＤＮＡは、例えば、糖尿病、高血
圧、虚血後再灌流障害、てんかんなどの疾患の治療・予
防剤などの医薬として使用することができる。例えば、
生体内において本発明のタンパク質が減少あるいは欠損
しているために、Ｎａ+とＨ+の交換輸送が十分に、ある
いは正常に発揮されない患者がいる場合に、（イ）本発
明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のタンパ
ク質を発現させることによって、（ロ）細胞に本発明の
ＤＮＡを挿入し、本発明のタンパク質を発現させた後
に、該細胞を患者に移植することによって、または
（ハ）本発明のタンパク質を該患者に投与することなど
によって、該患者における本発明のタンパク質の役割を
十分に、あるいは正常に発揮させることができる。本発
明のＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場合
は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、
アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテ
ッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した
後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与する
ことができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるい
は摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる
担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテー
テルのようなカテーテルによって投与できる。本発明の
タンパク質を上記の治療・予防剤として使用する場合
は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好
ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精
製されたものを使用するのが好ましい。[1] Therapeutic / prophylactic agent for various diseases related to the protein of the present invention The protein of the present invention has Na, K-ATPase activity, and regulates intracellular pH, cell volume and regulation of kidney and small intestine. Plays an important role such as re-absorption of Na + . Therefore, the DN encoding the protein of the present invention
When A is abnormal or deficient, or when the expression level of the protein of the present invention is reduced, various diseases such as diabetes, hypertension, ischemia-reperfusion injury, and epilepsy develop. I do. Therefore, the protein of the present invention and the DNA of the present invention can be used as a medicament such as an agent for treating or preventing diseases such as diabetes, hypertension, post-ischemic reperfusion injury and epilepsy. For example,
When there is a patient in whom exchange of Na + and H + is not sufficiently or normally exerted because the protein of the present invention is reduced or deficient in a living body, (a) the DNA of the present invention By expressing the protein of the present invention in vivo, (b) inserting the DNA of the present invention into cells, expressing the protein of the present invention, and then transplanting the cells into a patient. Alternatively, (c) by administering the protein of the present invention to the patient, the role of the protein of the present invention in the patient can be sufficiently or normally exerted. When the DNA of the present invention is used as the therapeutic or prophylactic agent, the DNA may be used alone or in a retroviral vector,
After insertion into an appropriate vector such as an adenovirus vector or an adenovirus associated virus vector, it can be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means. The DNA of the present invention can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. When the protein of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, it is preferable to use a protein which has been purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. preferable.
【００３９】本発明のタンパク質等は、例えば、必要に
応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、
マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水も
しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶
液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用
できる。例えば、本発明のタンパク質等を生理学的に認
められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安
定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に
要求される単位用量形態で混和することによって製造す
ることができる。これら製剤における有効成分量は指示
された範囲の適当な用量が得られるようにするものであ
る。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加
剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラ
ガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロー
スのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギ
ン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムの
ような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような
甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのよ
うな香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセル
である場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のよう
な液状担体を含有することができる。注射のための無菌
組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻
油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解また
は懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ
とができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食
塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例え
ば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリ
ウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例え
ば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアル
コール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレン
グリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポ
リソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用し
てもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油な
どが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベ
ンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤
（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液な
ど）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸
プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミ
ン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、
ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤な
どと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当
なアンプルに充填される。本発明のＤＮＡが挿入された
ベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に
使用される。The protein and the like of the present invention include, for example, tablets, capsules, elixirs,
It can be used orally as microcapsules or the like, or parenterally in the form of injections such as sterile solutions or suspensions with water or other pharmaceutically acceptable liquids. For example, the protein or the like of the present invention is mixed with physiologically acceptable carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in the unit dosage form generally required for the practice of the formulation. Can be manufactured. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a proper dosage in the specified range can be obtained. Examples of additives that can be mixed with tablets, capsules, and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid. Useful bulking agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry and the like are used. When the preparation unit form is a capsule, a liquid carrier such as oil and fat can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. Aqueous liquids for injection include, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and suitable solubilizing agents. For example, it may be used in combination with an alcohol (eg, ethanol or the like), a polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, or the like), a nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 ™ , HCO-50, or the like). Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with a solubilizing agent such as benzyl benzoate or benzyl alcohol. In addition, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), Preservatives (for example,
Benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like. The prepared injection is usually filled in a suitable ampoule. The vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also formulated in the same manner as described above, and is usually used parenterally.
【００４０】このようにして得られる製剤は、安全で低
毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、ラ
ット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーな
ど）に対して投与することができる。本発明のタンパク
質等の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなど
により差異はあるが、例えば、腎臓疾患の治療目的で本
発明のタンパク質等を経口投与する場合、一般的に成人
（６０ｋｇとして）においては、一日につき該タンパク
質等を約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０
〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与す
る。非経口的に投与する場合は、該タンパク質等の１回
投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、
例えば、腎臓疾患の治療目的で本発明のタンパク質等を
注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場
合、一日につき該タンパク質等を約０．０１〜３０ｍｇ
程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好まし
くは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することによ
り投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０
ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, warm-blooded animals (eg, human, rat, mouse, guinea pig, rabbit, bird, sheep, pig, cow, horse, cat, Dogs, monkeys, chimpanzees, etc.). The dose of the protein or the like of the present invention may vary depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like. )), The protein or the like is used in an amount of about 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 mg per day.
５０50 mg, more preferably about 1.0-20 mg. When administered parenterally, the single dose of the protein or the like varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
For example, when the protein or the like of the present invention is administered to an adult (with a body weight of 60 kg) in the form of an injection for the purpose of treating kidney disease, about 0.01 to 30 mg of the protein or the like per day is administered.
It is convenient to administer the drug by injecting into the affected part, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg. For other animals, 60
An amount converted per kg can be administered.
【００４１】〔２〕疾病に対する医薬候補化合物のスク
リーニング 本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を促
進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング
のための試薬として有用である。すなわち、本発明は、
（１）本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本
発明のタンパク質の活性（例えば、Ｎａ+とＨ+の交換輸
送など）を促進または阻害する化合物またはその塩（以
下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある）の
スクリーニング方法を提供し、より具体的には、例え
ば、（２）（ｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を
有する細胞のＮａ+とＨ+の交換輸送活性と（ii）本発明
のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物
の混合物のＮａ+とＨ+の交換輸送活性の比較を行なうこ
とを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方
法を提供する。具体的には、上記スクリーニング方法に
おいては、例えば、（ｉ）と（ii）の場合において、Ｎ
ａ+とＨ+の交換輸送活性を蛍光色素を用いた方法で測定
し、Ｎａ+とＨ+の交換輸送活性の指標として比較するこ
とを特徴とするものである。[2] Screening of Candidate Drug Compounds for Disease The protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention. That is, the present invention
(1) A compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention (for example, exchange transport of Na + and H + ) characterized by using the protein of the present invention (hereinafter referred to as a promoter or an inhibitor, respectively) And may be abbreviated as an agent), and more specifically, for example, (2) (i) the exchange transport activity of Na + and H + of cells having the ability to produce the protein of the present invention. And (ii) a method of screening for a promoter or inhibitor, comprising comparing the exchange transport activity of Na + and H + between a mixture of cells having the ability to produce the protein of the present invention and a test compound. . Specifically, in the above screening method, for example, in cases (i) and (ii), N
The present invention is characterized in that the exchange transport activity between a + and H + is measured by a method using a fluorescent dye, and is compared as an index of the exchange transport activity between Na + and H + .
【００４２】試験化合物としては、例えば、ペプチド、
タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産
物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙
げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよい
し、公知の化合物であってもよい。上記のスクリーニン
グ方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する
能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファー
に浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０
（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほ
う酸バッファーなどの、本発明のタンパク質のＮａ+と
Ｈ+の交換輸送活性を阻害しないバッファーであればい
ずれでもよい。本発明のタンパク質を産生する能力を有
する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク
質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換さ
れた宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、
例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられ
る。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養
することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発
現させた形質転換体が好ましく用いられる。As the test compound, for example, peptide,
Examples include proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.These compounds may be novel compounds or known compounds. Is also good. To carry out the above screening method, cells having the ability to produce the protein of the present invention are prepared by suspending them in a buffer suitable for screening. The buffer has a pH of about 4 to 10
Any buffer, such as a phosphate buffer (preferably about 6 to 8) or a borate buffer, which does not inhibit the Na + and H + exchange transport activity of the protein of the present invention may be used. As a cell having the ability to produce the protein of the present invention, for example, a host (transformant) transformed with a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention described above is used. As a host,
For example, animal cells such as CHO cells are preferably used. For the screening, for example, a transformant in which the protein of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing by the method described above is preferably used.
【００４３】本発明のタンパク質のＮａ+とＨ+の交換輸
送活性は、公知の方法、例えば、J.Biol. Chem. 274: 3
978-3987, 1998 に記載の方法あるいはそれに準じる方
法に従って測定することができる。例えば、上記（ii）
の場合におけるＮａ+とＨ+の交換輸送活性を、上記
（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０
％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合
物を本発明のタンパク質の活性を促進する化合物または
その塩として選択することができる。また、例えば、上
記（ii）の場合におけるＮａ+とＨ+の交換輸送活性を、
上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは
３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害（または
抑制）する試験化合物を本発明のタンパク質の活性を阻
害する化合物またはその塩として選択することができ
る。また、本発明のタンパク質ヒトＮＨＥ３ホモログ遺
伝子のプロモーター下流に分泌型アルカリホスファター
ゼ、ルシフェラーゼなどの遺伝子を挿入し、上記の各種
細胞に発現させ、該細胞に上記試験化合物を接触させた
場合における酵素活性を賦活化または阻害する化合物ま
たはその塩を探索することによって本発明のタンパク質
（ヒトＮＨＥ３ホモログ）の発現を促進または抑制（す
なわち、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害）
する化合物またはその塩をスクリーニングすることがで
きる。The exchange transport activity between Na + and H + of the protein of the present invention can be determined by a known method, for example, J. Biol. Chem. 274: 3.
It can be measured according to the method described in 978-3987, 1998 or a method analogous thereto. For example, the above (ii)
The exchange transport activity between Na + and H + in the case of (i) is about 20% or more, preferably 30
The test compound that promotes the activity of the protein of the present invention or a salt thereof can be selected as a compound that promotes the activity of the protein of the present invention. Further, for example, the exchange transport activity between Na + and H + in the case of (ii) is
A compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention by a test compound that inhibits (or suppresses) about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more of the case of the above (i). Can be selected as In addition, a gene such as secreted alkaline phosphatase or luciferase is inserted downstream of the promoter of the protein human NHE3 homolog gene of the protein of the present invention, expressed in the above-mentioned various cells, and the enzyme activity when the above-mentioned test compound is brought into contact with the cells is measured. Promote or suppress the expression of the protein of the present invention (human NHE3 homolog) by searching for a compound that activates or inhibit or a salt thereof (ie, promote or inhibit the activity of the protein of the present invention)
Or a salt thereof can be screened.
【００４４】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたは
その塩、または本発明で用いられるタンパク質もしくは
部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するも
のである。The screening kit of the present invention contains the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof, or a cell capable of producing the protein or partial peptide used in the present invention.
【００４５】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから
選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のタンパク
質の活性（例、Ｎａ+とＨ+の交換輸送活性など）を促進
または阻害する化合物またはその塩である。該化合物の
塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様の
ものが用いられる。本発明のタンパク質の活性を促進す
る化合物またはその塩は、例えば、糖尿病、高血圧、虚
血後再灌流障害、てんかんに対する治療・予防剤などの
医薬として有用である。また、本発明のタンパク質の活
性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、糖尿病、
高血圧、虚血後再灌流障害、てんかんに対する治療・予
防剤などの医薬として有用である。The compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention or a salt thereof may be a test compound such as a peptide, protein, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, A compound or a salt thereof selected from a plant extract, an animal tissue extract, plasma, or the like, and a compound or a compound thereof that promotes or inhibits the activity of the protein of the present invention (eg, the activity of exchanging Na + and H + for transport). Salt. As the salt of the compound, those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used. The compound or its salt that promotes the activity of the protein of the present invention is useful as a medicament such as a therapeutic or preventive agent for diabetes, hypertension, post-ischemic reperfusion injury, epilepsy. Further, a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention includes, for example, diabetes,
It is useful as a drug such as a therapeutic / prophylactic agent for hypertension, post-ischemic reperfusion injury and epilepsy.
【００４６】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に
従って製剤化することができる。例えば、錠剤、カプセ
ル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶
液、懸濁液剤などとすることができる。このようにして
得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒト
または温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒ
ツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チ
ンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投
与することができる。該化合物またはその塩の投与量
は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどに
より差異はあるが、例えば、腎臓疾患治療の目的で本発
明のタンパク質の活性を促進する化合物またはその塩を
経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとし
て）においては、一日につき該化合物またはその塩を約
０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、
より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的
に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量
は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例え
ば、腎臓疾患治療の目的で本発明のタンパク質の活性を
促進する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人
（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該
化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ま
しくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．
１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合
である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算
した量を投与することができる。When a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, it can be formulated into a preparation according to a conventional method. For example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions and the like can be used. The preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, human or warm-blooded animals (eg, mouse, rat, rabbit, sheep, pig, cow, horse, bird, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc.) ) Can be administered orally or parenterally. The dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject of administration, administration route and the like. When administered orally, generally, in an adult (with a body weight of 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg of the compound or a salt thereof per day is used.
More preferably, about 1.0 to 20 mg is administered. When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like. When the salt is usually administered to an adult (with a body weight of 60 kg) in the form of an injection, the compound or a salt thereof is about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg per day. About 0.
It is convenient to administer about 1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
【００４７】〔３〕本発明のタンパク質、その部分ペプ
チドまたはその塩の定量本発明のタンパク質に対する抗
体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、本
発明のタンパク質を特異的に認識することができるの
で、被検液中の本発明のタンパク質の定量、特にサンド
イッチ免疫測定法による定量などに使用することができ
る。すなわち、本発明は、（ｉ）本発明の抗体と、被検
液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に
反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタン
パク質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本
発明のタンパク質の定量法、および（ii）被検液と担体
上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明
の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、
不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とす
る被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体が本発明の
タンパク質のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本
発明のタンパク質のＣ端部に反応する抗体であることが
望ましい。[3] Quantification of the protein of the present invention, its partial peptide or its salt An antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) specifically recognizes the protein of the present invention. Therefore, it can be used for quantification of the protein of the present invention in a test solution, particularly for quantification by a sandwich immunoassay. That is, the present invention relates to (i) the ratio of the labeled protein of the present invention bound to the antibody of the present invention competitively reacted with the test solution and the labeled protein of the present invention. And (ii) a test solution and an antibody of the present invention insolubilized on a carrier and another antibody of the present invention labeled with the test solution. After reacting simultaneously or continuously,
It provides a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution, which comprises measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier.
In the quantitative method (ii), it is desirable that one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the protein of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the protein of the present invention.
【００４８】また、本発明のタンパク質に対するモノク
ローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称
する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を
行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともで
きる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いても
よく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')２ 、Ｆａｂ'、ある
いはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる
本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきも
のではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質
量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の
量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知
量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算
出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよ
い。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリッ
ク法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感
度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるの
が特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる
標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光
物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素とし
ては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14
Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活
性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダ
ーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用い
られる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられ
る。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノー
ル誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられ
る。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオ
チン−アビジン系を用いることもできる。The protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like. . For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2, Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used. The method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited. Any measurement method may be used as long as the amount is detected by chemical or physical means and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use the sandwich method described later. As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Examples of the radioisotope include [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], and [ 14 H].
C] is used. As the above enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
【００４９】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵
素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用
いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキス
トラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレ
ン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、ある
いはガラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては
不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応
させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノ
クローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化
担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の
本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反
応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行な
ってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤
および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができ
る。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、
固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず
しも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等
の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本
発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定
法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明
のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合す
る部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわ
ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例え
ば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質
のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体
は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗
体が用いられる。For insolubilization of the antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing proteins or enzymes may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass. In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the labeling agent, the amount of the protein of the present invention in the test solution can be determined. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. The labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above. In addition, in the immunoassay by the sandwich method,
The antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies may be used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. In the method for measuring the protein of the present invention by the sandwich method of the present invention, as the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction, an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds is preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably For example, an antibody that recognizes an N-terminal other than the C-terminal is used.
【００５０】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原
(Ｆ)と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ
／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液
中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶
性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、
前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、およ
び、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、
第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗
体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック
法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識
化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する
か、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体と
を反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体
を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次
に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を
定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは
溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量
を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈
降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用する
レーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。The monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry. In the competition method, an antigen in a test solution and a labeled antigen are allowed to react competitively with an antibody, and then the unreacted labeled antigen is reacted.
(F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated (B
/ F separation), the labeling amount of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody was used as an antibody, B / F separation was performed using polyethylene glycol,
A liquid phase method using a second antibody or the like to the antibody, and using an immobilized antibody as the first antibody, or
A solid-phase method using a soluble first antibody and a solid-phased antibody as the second antibody is used. In the immunometric method, an antigen in a test solution and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of a labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. And an excess amount of the labeled antibody, and then immobilized antigen is added to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution. In nephelometry, the amount of insoluble precipitates generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
【００５１】これら個々の免疫学的測定法を本発明の定
量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一
般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参
照することができる。例えば、入江 寛編「ラジオイム
ノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編
「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochem
ical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochem
ical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochem
ical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochem
ical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、
同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Mono
clonal Antibodies and General Immunoassay Method
s))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part
I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照する
ことができる。以上のようにして、本発明の抗体を用い
ることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量す
ることができる。さらには、本発明の抗体を用いて本発
明のタンパク質の濃度を定量することによって、（１）
本発明のタンパク質の濃度の減少が検出された場合、例
えば、糖尿病、高血圧、虚血後再灌流障害、てんかんな
どの可能性が高いと診断することができる。（２）反対
に、例えば、本発明のタンパク質の濃度の上昇が検出さ
れた場合、糖尿病、高血圧、虚血後再灌流障害、てんか
んの可能性が高いと診断することが出来る。また、本発
明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発
明のタンパク質を検出するために使用することができ
る。また、本発明のタンパク質を精製するために使用す
る抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタン
パク質の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質
の挙動の分析などのために使用することができる。In applying these individual immunoassays to the quantification method of the present invention, there is no need to set special conditions, operations, and the like. What is necessary is just to construct the protein measurement system of the present invention by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, and the like. For example, Hiroe Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie, "Sequence Radioimmunoassay" (Kodansha, published in 1974), Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (Medical Shoin, Showa Ed. Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (Second Edition) (Issue Shoin, 1982) Published in 1962, "Methods in ENZYMOLOGY" Vol. 70 (Immunochem
ical Techniques (Part A)), ibid.Vol. 73 (Immunochem
ical Techniques (Part B)), ibid.Vol. 74 (Immunochem
ical Techniques (Part C)), ibid.Vol. 84 (Immunochem
ical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)),
Ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Mono
clonal Antibodies and General Immunoassay Method
s)), ibid.Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part
I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s)) (above, published by Academic Press). As described above, the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention. Furthermore, by quantifying the concentration of the protein of the present invention using the antibody of the present invention, (1)
When a decrease in the concentration of the protein of the present invention is detected, it can be diagnosed that the possibility of diabetes, hypertension, post-ischemic reperfusion injury, epilepsy and the like is high, for example. (2) Conversely, for example, when an increase in the concentration of the protein of the present invention is detected, it can be diagnosed that there is a high possibility of diabetes, hypertension, reperfusion injury after ischemia, and epilepsy. Further, the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue. Further, for preparation of an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells, etc. Can be used.
【００５２】〔４〕遺伝子診断剤 本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用するこ
とにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウ
ス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードす
るＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出す
ることができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡ
の損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたは
ｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤と
して有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子
診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーショ
ンやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），
第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of t
heNational Academy of Sciences of the United State
s of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１
９８９年））などにより実施することができる。例え
ば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現増加が
検出された場合、糖尿病、高血圧、虚血後再灌流障害、
てんかんの可能性が高いと診断することが出来る。反対
に、発現低下が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法に
よりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、糖
尿病、高血圧、虚血後再灌流障害、てんかんである可能
性が高いと診断することができる。[4] Gene Diagnostic Agent The DNA of the present invention can be used, for example, as a probe to produce a human or warm-blooded animal (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, bird, sheep, pig, cow,
DNA or mRNA abnormalities (genetic abnormalities) encoding the protein of the present invention or its partial peptide in horses, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.) can be detected.
It is useful as an agent for genetic diagnosis such as damage, mutation or decreased expression of DNA, and increase or excessive expression of the DNA or mRNA. The above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics,
5, 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of USA
heNational Academy of Sciences of the United State
s of America), Vol. 86, pp. 2766-2770 (1
989)). For example, if increased expression is detected by Northern hybridization, diabetes, hypertension, post-ischemic reperfusion injury,
It can be diagnosed that the possibility of epilepsy is high. Conversely, when a decrease in the expression is detected or a mutation in the DNA is detected by the PCR-SSCP method, it is diagnosed that there is a high possibility of diabetes, hypertension, reperfusion injury after ischemia, or epilepsy, for example. be able to.
【００５３】〔５〕アンチセンスヌクレオチドを含有す
る医薬 本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑
制することができる本発明のアンチセンスヌクレオチド
は低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質ま
たは本発明のＤＮＡの機能（例、Ｎａ+とＨ+の交換輸送
活性）を抑制することができるので、例えば、糖尿病、
高血圧、虚血後再灌流障害、てんかんなどの治療・予防
剤として使用することができる。上記アンチセンスヌク
レオチドを上記の治療・予防剤として使用する場合、公
知の方法に従って製剤化し、投与することができる。例
えば、該アンチセンスヌクレオチドを用いる場合、該ア
ンチセンスヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルス
ベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスア
ソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクター
に挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物
（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イ
ヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与す
ることができる。該アンチセンスヌクレオチドは、その
ままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学
的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイ
ドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与で
きる。該アンチセンスヌクレオチドの投与量は、対象疾
患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例
えば、腎臓疾患の治療の目的で本発明のアンチセンスヌ
クレオチドを肝臓に局所投与する場合、一般的に成人
（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセン
スヌクレオチドを約０．１〜１００ｍｇ投与する。さら
に、該アンチセンスヌクレオチドは、組織や細胞におけ
る本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための
診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用すること
もできる。[5] Pharmaceuticals Containing Antisense Nucleotides The antisense nucleotides of the present invention, which can complementarily bind to the DNA of the present invention and suppress the expression of the DNA, have low toxicity, and Since the function of the protein of the present invention or the DNA of the present invention (eg, the activity of exchanging and transporting Na + and H + ) can be suppressed, for example, diabetes,
It can be used as a therapeutic / prophylactic agent for hypertension, post-ischemic reperfusion injury, epilepsy and the like. When the antisense nucleotide is used as the therapeutic or prophylactic agent, it can be formulated and administered according to a known method. For example, when the antisense nucleotide is used, the antisense nucleotide is inserted alone or into a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector or the like, and then inserted into a human or mammal ( For example, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.) can be administered orally or parenterally. The antisense nucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and administered with a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. The dose of the antisense nucleotide varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.For example, when the antisense nucleotide of the present invention is locally administered to the liver for the purpose of treating a kidney disease, it is generally used. In an adult (body weight 60 kg), about 0.1 to 100 mg of the antisense nucleotide is administered per day. Furthermore, the antisense nucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of its expression.
【００５４】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すもの
とする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸In the present specification and drawings, when bases, amino acids and the like are represented by abbreviations, IUPAC-IUB
It is based on the abbreviation by the Commission on Biochemical Nomenclature or the abbreviation commonly used in the relevant field, examples of which are described below. When an amino acid can have an optical isomer, the L-form is indicated unless otherwise specified. DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate Phosphate dCTP: Deoxycytidine triphosphate ATP: Adenosine triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid SDS: Sodium dodecyl sulfate Gly: Glycine Ala: Alanine Val: Valine Leu: Leucine Ile: Isoleucine Ser: Serine Thr: thyronine : Methionine Glu: Glutamic acid Asp: Aspartic acid Lys: Lysine Arg: Arginine His: Histidine Phe Phenylalanine Tyr: tyrosine Trp: tryptophan Pro: proline Asn: asparagine Gln: glutamine pGlu: pyroglutamic acid
【００５５】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｃｌ2−Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェニル Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドThe substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols. Me: methyl group Et: ethyl group Bu: butyl group Ph: phenyl group TC: thiazolidine -4 (R) - carboxamide group Tos: p-toluenesulfonyl CHO: formyl Bzl: benzyl Cl 2 -Bzl: 2,6-dichlorobenzyl Bom: benzyloxymethyl Z: benzyloxycarbonyl Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl Br-Z: 2-bromobenzyloxycarbonyl Boc: t-butoxycarbonyl DNP: dinitrophenyl Trt: trityl Bum: t-butoxymethyl Fmoc : N-9-fluorenylmethoxycarbonyl HOBt: 1-hydroxybenztriazole HOOBT: 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo- 1,2,3-benzotriazine HONB: 1-hydro Shi-5-norbornene-2,3-dicarboximide DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide
【００５６】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕ヒトＴＣＨ０８２タンパク質のアミノ
酸配列を示す。 〔配列番号：２〕配列番号：１で表されるアミノ酸配列
を有するＴＣＨ０８２タンパク質をコードするＤＮＡの
塩基配列を示す。The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences. [SEQ ID NO: 1] This shows the amino acid sequence of human TCH082 protein. [SEQ ID NO: 2] This shows the base sequence of DNA encoding TCH082 protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
【００５７】[0057]
【発明の効果】配列番号：１で表されるアミノ酸配列と
同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタン
パク質は糖尿病、高血圧、虚血後再灌流障害、てんかん
の診断マーカー等として有用であり、該タンパク質を用
いるスクリーニング法により得られる該タンパク質の活
性を促進または阻害する化合物は、例えば、糖尿病、高
血圧、虚血後再灌流障害、てんかんなどの疾病の予防・
治療剤として使用することができる。The protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is useful as a diagnostic marker for diabetes, hypertension, post-ischemic reperfusion injury, epilepsy, etc. Compounds that promote or inhibit the activity of the protein obtained by the screening method using the protein include, for example, diabetes, hypertension, reperfusion injury after ischemia, prevention of diseases such as epilepsy, etc.
It can be used as a therapeutic.
【００５８】[0058]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Novel Protein and its DNA <130> P2001-027 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 619 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Gly Gly Cys Cys Val Leu Trp Ser Arg Gly Ala Ala Pro Thr Pro 1 5 10 15 Gln Trp Arg Ser Ala Gln Gly Arg Pro Phe Gly His Ser Glu Glu Leu 20 25 30 Gln Ala Asn Lys Met Pro Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Asp Ala Val 35 40 45 Met Val Ala Trp Lys Ala Glu Gly Thr Thr Ile Thr Leu Gly Met Lys 50 55 60 Thr Ala Thr Pro Ser Lys Gln Arg Asn Thr Ser Thr Arg Ser Ser Val 65 70 75 80 Leu His Ser Phe Thr His Thr Leu Ile Gln Gln Thr Leu Ser Glu His 85 90 95 Ser Cys Gly Pro Gly Ala Gly Ala Arg Pro Gly Pro Pro Ala Leu Glu 100 105 110 Lys Leu Met Ser Trp Arg Thr Thr Gly Arg His His Cys Thr Pro Leu 115 120 125 Ser Ser Ser Pro Gln Ala Ile Ala Gln His Met Trp Gly Pro Met Arg 130 135 140 Asn Glu Ser Gly Glu Thr Thr Gly Phe Arg Glu Asn Val Ser Met Arg 145 150 155 160 Gln Val Gln Glu Pro Val Ser Met Phe Ser Ile Pro Phe Asn Leu His 165 170 175 Thr His Gly Gln Asn Gln Pro Gly Gln Asp Trp Phe Tyr Leu Ser His 180 185 190 Lys Val Thr Ser Ile Val Pro Glu Ser Thr Leu Leu Ile Ile Leu Gly 195 200 205 Leu Val Leu Gly Ser Ile Ile Trp Val Ala Lys His Ile Thr Ser Phe 210 215 220 Met Met Met Ser Leu Ile Met Leu Asp Ala Ser Tyr Phe Ile Pro Asn 225 230 235 240 Trp Leu Phe Phe Gly Asn Leu Gly Thr Ile Leu Leu Tyr Lys Val Ile 245 250 255 Ser Thr Met Trp Asn Ala Ser Thr Thr Ile Leu Ser Leu Tyr Asp Val 260 265 270 Ser Leu Ser Arg Leu Met Gly Tyr Leu Gln Ile Gly Leu Leu Asp Phe 275 280 285 Leu Leu Phe Gly Ser Leu Ile Thr Thr Val Asp Pro Ala Ala Val Leu 290 295 300 Val Val Phe Glu Glu Val His Gly Asn Glu Val Leu Phe Ile Ile Ile 305 310 315 320 Phe Arg Glu Leu Leu Leu Asn Asp Ser Val Ile Met Val Leu Tyr Asn 325 330 335 Val Phe Gln Ser Phe Val Thr Leu Gly Gly Asp Asn Val Thr Ser Met 340 345 350 Asn Ser Val Glu Gly Val Val Ser Phe Leu Val Val Ser Leu Gly Gly 355 360 365 Met Leu Val Gly Met Val Phe Ala Phe Leu Leu Ser Leu Val Thr His 370 375 380 Leu Thr Lys His Val His Ile Ile Glu Pro Gly Phe Met Leu Ala Ile 385 390 395 400 Leu Ala Ile Ile Phe Cys Gly Ile Cys Cys His Lys Tyr Met Lys Ala 405 410 415 Asn Ile Ser Glu Gln Leu Ala Pro Thr Met Cys Tyr Thr Met Lys Met 420 425 430 Leu Thr Ser Gly Thr Asn Pro Ile Phe Met Ser Leu Gly Thr Leu Ala 435 440 445 Met Asn Leu Leu Ile Trp Thr Trp Asn Lys Ala Phe Ile Arg Leu His 450 455 460 Trp Pro Ser Ser Ser Gly Thr Glu Ala Ile Ser Val Ile His Ser Trp 465 470 475 480 Leu Leu Asp Cys Tyr Trp Met Val Trp Leu Glu Ile Ile Gly Gln Val 485 490 495 Val Met Ser Cys Gly Gly Leu His Gly Ala Met Ala Phe Ile Leu Val 500 505 510 Ile Leu Leu Asn Gly Asn Lys Val Lys Glu Lys Asn Leu Phe Val Ser 515 520 525 Thr Thr Val Asn Ile Phe Lys Trp Leu Lys Val Lys Arg Ser Glu His 530 535 540 Trp Glu Pro Lys Phe His Glu Lys Leu Gln Cys His Pro Leu Asp His 545 550 555 560 Ile Leu Leu Ala Ile Lys Asp Ile Ser Arg His Ile Arg His Asn Asp 565 570 575 Leu Lys Asp Met Trp Ser His Phe Asp Arg Asn Phe Leu Ser Gly Val 580 585 590 Leu Met Arg Arg Leu Ala Gln Lys Ser Pro Glu Gly Ile Leu Asn Val 595 600 605 Phe His Ala Leu Asn Leu Lys Asp Ala Ile Ser 610 615 <210> 2 <211> 1857 <212> DNA <213> Human <400> 2 ATGGGGGGCT GCTGTGTCCT GTGGTCCAGG GGAGCAGCCC CAACACCACA GTGGAGGTCT 60 GCCCAAGGCC GCCCCTTTGG ACACTCTGAG GAACTCCAAG CCAACAAGAT GCCTCTCATT 120 AGTGACTTCT ACCCTGATGC CGTGATGGTG GCCTGGAAGG CAGAGGGCAC CACCATCACC 180 CTGGGCATGA AGACTGCCAC ACCCTCCAAA CAGAGAAACA CAAGTACACG CTCCTCAGTC 240 CTTCATTCAT TCACTCACAC ACTCATTCAG CAAACCCTCA GTGAGCACAG CTGTGGGCCA 300 GGTGCTGGTG CAAGACCAGG ACCACCTGCC CTGGAGAAGC TCATGAGCTG GAGGACAACA 360 GGGAGACACC ACTGCACCCC CCTGTCCTCA AGTCCCCAAG CGATAGCACA GCACATGTGG 420 GGACCAATGA GAAATGAGTC TGGGGAGACC ACGGGCTTCA GGGAGAATGT TTCGATGAGG 480 CAAGTACAAG AGCCAGTGAG CATGTTTTCC ATCCCCTTCA ATCTCCACAC TCACGGGCAA 540 AACCAGCCTG GCCAAGACTG GTTCTACCTG TCCCACAAGG TCACCAGCAT AGTCCCTGAG 600 AGCACCCTGC TCATCATCCT GGGCCTGGTG CTGGGCAGCA TCATCTGGGT GGCCAAACAC 660 ATAACATCCT TCATGATGAT GTCCCTCATC ATGCTAGATG CCAGCTACTT CATCCCCAAC 720 TGGCTCTTCT TCGGCAACCT GGGCACCATC CTGCTGTACA AGGTCATCAG CACCATGTGG 780 AATGCATCCA CCACCATCCT GTCCCTCTAT GACGTCTCTC TTAGTAGGCT CATGGGCTAC 840 CTGCAGATAG GGCTGCTGGA CTTCCTCCTG TTCGGCAGCC TGATCACCAC TGTGGACCCA 900 GCAGCTGTCC TGGTTGTGTT TGAGGAGGTT CATGGCAATG AGGTCCTGTT CATCATCATC 960 TTCAGGGAGT TGCTACTGAA TGACTCTGTC ATCATGGTTC TGTACAATGT GTTTCAATCT 1020 TTTGTGACAC TGGGTGGTGA CAACGTGACC AGCATGAACT CTGTGGAAGG TGTAGTCTCC 1080 TTCCTTGTGG TGAGCCTGGG GGGCATGCTG GTGGGAATGG TCTTTGCCTT TCTGTTGTCA 1140 CTGGTGACCC ACCTCACCAA GCATGTGCAC ATCATCGAGC CTGGTTTCAT GTTGGCCATC 1200 CTGGCCATCA TCTTCTGTGG CATCTGCTGC CATAAGTACA TGAAGGCCAA CATCTCAGAG 1260 CAGTTGGCCC CCACCATGTG CTACACCATG AAGATGCTGA CCAGTGGCAC CAATCCCATC 1320 TTCATGTCCC TGGGCACCTT AGCCATGAAC CTGCTCATCT GGACGTGGAA CAAGGCATTC 1380 ATCCGCCTGC ACTGGCCTTC ATCTTCAGGT ACTGAGGCCA TCAGTGTCAT CCACTCCTGG 1440 CTCCTGGACT GCTATTGGAT GGTGTGGCTG GAAATCATAG GCCAGGTGGT CATGTCCTGT 1500 GGAGGCCTGC ATGGGGCCAT GGCTTTCATC CTGGTCATAC TTCTGAATGG AAACAAGGTC 1560 AAGGAGAAGA ACCTGTTTGT CAGCACCACC GTCAACATCT TCAAGTGGCT GAAGGTGAAG 1620 AGGAGTGAGC ACTGGGAGCC TAAGTTCCAT GAGAAGCTGC AATGCCACCC TCTCGACCAC 1680 ATCCTCTTGG CCATCAAGGA CATATCGAGG CATATCAGGC ACAATGATCT CAAAGACATG 1740 TGGTCCCACT TTGACAGGAA TTTCCTCAGT GGAGTCCTCA TGAGAAGGCT GGCCCAGAAG 1800 TCTCCAGAAG GGATCCTCAA TGTCTTCCAT GCACTGAACC TGAAGGATGC CATCAGC 1857[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Novel Protein and its DNA <130> P2001-027 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 619 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Gly Gly Cys Cys Val Leu Trp Ser Arg Gly Ala Ala Pro Thr Pro 1 5 10 15 Gln Trp Arg Ser Ala Gln Gly Arg Pro Phe Gly His Ser Glu Glu Leu 20 25 30 Gln Ala Asn Lys Met Pro Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Asp Ala Val 35 40 45 Met Val Ala Trp Lys Ala Glu Gly Thr Thr Thr Ile Thr Leu Gly Met Lys 50 55 60 Thr Ala Thr Pro Ser Lys Gln Arg Asn Thr Ser Thr Arg Ser Ser Val 65 70 75 80 Leu His Ser Phe Thr His Thr Leu Ile Gln Gln Thr Leu Ser Glu His 85 90 95 Ser Cys Gly Pro Gly Ala Gly Ala Arg Pro Gly Pro Pro Ala Leu Glu 100 105 110 Lys Leu Met Ser Trp Arg Thr Thr Gly Arg His His Cys Thr Pro Leu 115 120 125 Ser Ser Ser Pro Gln Ala Ile Ala Gln His Met Trp Gly Pro Met Arg 130 135 140 Asn Glu Ser Gly Glu Thr Thr Gly Phe Arg Glu Asn Val Ser Met Arg 145 150 155 160 Gln Val Gln Glu Pro Val Ser Met Phe Se r Ile Pro Phe Asn Leu His 165 170 175 Thr His Gly Gln Asn Gln Pro Gly Gln Asp Trp Phe Tyr Leu Ser His 180 185 190 Lys Val Thr Ser Ile Val Pro Glu Ser Thr Leu Leu Ile Ile Leu Gly 195 200 205 Leu Val Leu Gly Ser Ile Ile Trp Val Ala Lys His Ile Thr Ser Phe 210 215 220 Met Met Met Ser Leu Ile Met Leu Asp Ala Ser Tyr Phe Ile Pro Asn 225 230 235 240 Trp Leu Phe Phe Gly Asn Leu Gly Thr Ile Leu Leu Tyr Lys Val Ile 245 250 255 Ser Thr Met Trp Asn Ala Ser Thr Thr Ile Leu Ser Leu Tyr Asp Val 260 265 270 Ser Leu Ser Arg Leu Met Gly Tyr Leu Gln Ile Gly Leu Leu Asp Phe 275 280 285 285 Leu Leu Phe Gly Ser Leu Ile Thr Thr Val Asp Pro Ala Ala Val Leu 290 295 300 Val Val Phe Glu Glu Val His Gly Asn Glu Val Leu Phe Ile Ile Ile 305 310 315 320 Phe Arg Glu Leu Leu Leu Asn Asp Ser Val Ile Met Val Leu Tyr Asn 325 330 335 Val Phe Gln Ser Phe Val Thr Leu Gly Gly Asp Asn Val Thr Ser Met 340 345 350 Asn Ser Val Glu Gly Val Val Ser Phe Leu Val Val Ser Leu Gly Gly 355 360 365 Met Leu Val Gly Met Val Phe Ala Phe Leu L eu Ser Leu Val Thr His 370 375 380 Leu Thr Lys His Val His Ile Ile Glu Pro Gly Phe Met Leu Ala Ile 385 390 395 400 Leu Ala Ile Ile Phe Cys Gly Ile Cys Cys His Lys Tyr Met Lys Ala 405 410 415 Asn Ile Ser Glu Gln Leu Ala Pro Thr Met Cys Tyr Thr Met Lys Met 420 425 430 Leu Thr Ser Gly Thr Asn Pro Ile Phe Met Ser Leu Gly Thr Leu Ala 435 440 445 Met Asn Leu Leu Ile Trp Thr Trp Asn Lys Ala Phe Ile Arg Leu His 450 455 460 Trp Pro Ser Ser Ser Gly Thr Glu Ala Ile Ser Val Ile His Ser Trp 465 470 475 480 Leu Leu Asp Cys Tyr Trp Met Val Trp Leu Glu Ile Ile Gly Gln Val 485 490 495 Val Met Ser Cys Gly Gly Leu His Gly Ala Met Ala Phe Ile Leu Val 500 505 510 Ile Leu Leu Asn Gly Asn Lys Val Lys Glu Lys Asn Leu Phe Val Ser 515 520 525 Thr Thr Val Val Asn Ile Phe Lys Trp Leu Lys Val Lys Arg Ser Glu His 530 535 540 Trp Glu Pro Lys Phe His Glu Lys Leu Gln Cys His Pro Leu Asp His 545 550 555 560 Ile Leu Leu Ala Ile Lys Asp Ile Ser Arg His Ile Arg His Asn Asp 565 570 575 Leu Lys Asp Met Trp Ser His Phe Asp Arg A sn Phe Leu Ser Gly Val 580 585 590 Leu Met Arg Arg Leu Ala Gln Lys Ser Pro Glu Gly Ile Leu Asn Val 595 600 605 Phe His Ala Leu Asn Leu Lys Asp Ala Ile Ser 610 615 <210> 2 <211> 1857 < 212> DNA <213> Human <400> 2 ATGGGGGGCT GCTGTGTCCT GTGGTCCAGG GGAGCAGCCC CAACACCACA GTGGAGGTCT 60 GCCCAAGGCC GCCCCTTTGG ACACTCTGAG GAACTCCAAG CCAACAAGAT GCCTCTCATT 120 AGTGACTTCT ACCCTGATGC CGTGATGGTG GCCTGGAAGG CAGAGGGCAC CACCATCACC 180 CTGGGCATGA AGACTGCCAC ACCCTCCAAA CAGAGAAACA CAAGTACACG CTCCTCAGTC 240 CTTCATTCAT TCACTCACAC ACTCATTCAG CAAACCCTCA GTGAGCACAG CTGTGGGCCA 300 GGTGCTGGTG CAAGACCAGG ACCACCTGCC CTGGAGAAGC TCATGAGCTG GAGGACAACA 360 GGGAGACACC ACTGCACCCC CCTGTCCTCA AGTCCCCAAG CGATAGCACA GCACATGTGG 420 GGACCAATGA GAAATGAGTC TGGGGAGACC ACGGGCTTCA GGGAGAATGT TTCGATGAGG 480 CAAGTACAAG AGCCAGTGAG CATGTTTTCC ATCCCCTTCA ATCTCCACAC TCACGGGCAA 540 AACCAGCCTG GCCAAGACTG GTTCTACCTG TCCCACAAGG TCACCAGCAT AGTCCCTGAG 600 AGCACCCTGC TCATCATCCT GGGCCTGGTG CTGGGCAGCA TCATCTGGGT GGCCAAACAC 660 ATAACATCCT TCATGAT GAT GTCCCTCATC ATGCTAGATG CCAGCTACTT CATCCCCAAC 720 TGGCTCTTCT TCGGCAACCT GGGCACCATC CTGCTGTACA AGGTCATCAG CACCATGTGG 780 AATGCATCCA CCACCATCCT GTCCCTCTAT GACGTCTCTC TTAGTAGGCT CATGGGCTAC 840 CTGCAGATAG GGCTGCTGGA CTTCCTCCTG TTCGGCAGCC TGATCACCAC TGTGGACCCA 900 GCAGCTGTCC TGGTTGTGTT TGAGGAGGTT CATGGCAATG AGGTCCTGTT CATCATCATC 960 TTCAGGGAGT TGCTACTGAA TGACTCTGTC ATCATGGTTC TGTACAATGT GTTTCAATCT 1020 TTTGTGACAC TGGGTGGTGA CAACGTGACC AGCATGAACT CTGTGGAAGG TGTAGTCTCC 1080 TTCCTTGTGG TGAGCCTGGG GGGCATGCTG GTGGGAATGG TCTTTGCCTT TCTGTTGTCA 1140 CTGGTGACCC ACCTCACCAA GCATGTGCAC ATCATCGAGC CTGGTTTCAT GTTGGCCATC 1200 CTGGCCATCA TCTTCTGTGG CATCTGCTGC CATAAGTACA TGAAGGCCAA CATCTCAGAG 1260 CAGTTGGCCC CCACCATGTG CTACACCATG AAGATGCTGA CCAGTGGCAC CAATCCCATC 1320 TTCATGTCCC TGGGCACCTT AGCCATGAAC CTGCTCATCT GGACGTGGAA CAAGGCATTC 1380 ATCCGCCTGC ACTGGCCTTC ATCTTCAGGT ACTGAGGCCA TCAGTGTCAT CCACTCCTGG 1440 CTCCTGGACT GCTATTGGAT GGTGTGGCTG GAAATCATAG GCCAGGTGGT CATGTCCTGT 1500 GGAGGCCTGC ATGGGGCCAT GGCTTTC ATC CTGGTCATAC TTCTGAATGG AAACAAGGTC 1560 AAGGAGAAGA ACCTGTTTGT CAGCACCACC GTCAACATCT TCAAGTGGCT GAAGGTGAAG 1620 AGGAGTGAGC ACTGGGAGCC TAAGTTCCAT GAGAAGCTGC AATGCCACCC TCTCGACCAC 1680 ATCCTCTTGG CCATCAAGGA CATATCGAGG CATATCAGGC ACAATGATCT CAAAGACATG 1740 TGGTCCCACT TTGACAGGAA TTTCCTCAGT GGAGTCCTCA TGAGAAGGCT GGCCCAGAAG 1800 TCTCCAGAAG GGATCCTCAA TGTCTTCCAT GCACTGAACC TGAAGGATGC CATCAGC 1857
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 25/08 ４Ｃ０８４ 9/12 43/00 １１１ ４Ｈ０４５ 25/08 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １１１ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA36 FB02 FB03 FB05 FB06 FB07 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA17 QA18 QA19 QQ20 QQ42 QQ53 QR55 QR69 QR80 QS05 QS24 QS34 4B064 AG01 AG27 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA01 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 CA17 CA25 DC50 MA01 NA14 ZA061 ZA401 ZA421 ZC022 ZC351 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 DA86 EA21 EA23 EA27 FA72 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 9/10 A61P 25/08 4C084 9/12 43/00 111 4H045 25/08 C07K 14/47 43/00 111 16/18 C07K 14/47 C12N 1/15 16/18 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12P 21/02 C 1/21 C12Q 1/02 5/10 G01N 33/15 Z C12P 21 / 02 33/50 Z C12Q 1/02 C12P 21/08 G01N 33/15 C12N 15/00 ZNAA 33/50 A61K 37/02 // C12P 21/08 C12N 5/00 A F term (reference) 2G045 AA40 DA12 DA13 DA36 FB02 FB03 FB05 FB06 FB07 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA17 QA18 QA19 QQ20 QQ42 QQ53 QR55 QR69 QR80 QS05 QS24 QS34 4B064 AG01 BA27 ACOA ABAA23A02 A24 CA44 4C084 AA01 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 CA17 CA25 DC50 MA01 NA14 ZA061 ZA401 ZA421 ZC022 ZC351 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 DA86 EA21 EA23 EA27 FA72 FA74
Claims (16)
と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
タンパク質またはその塩。1. A protein comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof.
ドまたはその塩。2. A partial peptide of the protein according to claim 1, or a salt thereof.
２記載の部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するＤ
ＮＡ。3. A D-containing DNA encoding the protein according to claim 1 or the partial peptide according to claim 2.
NA.
する請求項３記載のＤＮＡ。4. The DNA according to claim 3, which has the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
ベクター。5. A recombinant vector containing the DNA according to claim 4.
換された形質転換体。6. A transformant transformed with the recombinant vector according to claim 5.
求項１記載のタンパク質または請求項２記載の部分ペプ
チドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
する請求項１記載のタンパク質もしくは請求項２記載の
部分ペプチドまたはその塩の製造法。7. The method according to claim 1, wherein the transformant according to claim 6 is cultured to produce and accumulate the protein according to claim 1 or the partial peptide according to claim 2, and collect the protein. 3. A method for producing a protein according to claim 2, or a partial peptide according to claim 2, or a salt thereof.
項２記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医
薬。8. A pharmaceutical comprising the protein according to claim 1, the partial peptide according to claim 2, or a salt thereof.
薬。9. A pharmaceutical comprising the DNA according to claim 3.
求項２記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。10. An antibody against the protein according to claim 1, the partial peptide according to claim 2, or a salt thereof.
求項２記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを
特徴とする、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項
２記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または
阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。11. The activity of the protein according to claim 1, the partial peptide according to claim 2, or a salt thereof, wherein the protein according to claim 1 or the partial peptide according to claim 2 or a salt thereof is used. A method of screening for a compound that promotes or inhibits or a salt thereof.
求項２記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してな
る、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項２記載の
部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する
化合物またはその塩のスクリーニング用キット。12. The activity of the protein according to claim 1, the partial peptide according to claim 2, or a salt thereof, comprising the protein according to claim 1 or the partial peptide according to claim 2, or a salt thereof. A kit for screening a compound to be inhibited or a salt thereof.
または請求項１２記載のスクリーニング用キットを用い
て得られる、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項
２記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または
阻害する化合物またはその塩。(13) promoting or inhibiting the activity of the protein of (1), the partial peptide of (2), or a salt thereof obtained by using the screening method of (11) or the screening kit of (12); Or a salt thereof.
または請求項１２記載のスクリーニング用キットを用い
て得られる請求項１記載のタンパク質もしくは請求項２
記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻
害する化合物またはその塩を含有してなる医薬。14. The protein according to claim 1, which is obtained by using the screening method according to claim 11 or the screening kit according to claim 12.
A medicament comprising a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the partial peptide or a salt thereof described above.
てんかんの予防・治療剤である請求項８または請求項９
記載の医薬。15. Diabetes, hypertension, post-ischemic reperfusion injury,
10. The prophylactic / therapeutic agent for epilepsy according to claim 8 or claim 9.
The medicament according to claim.
てんかんの予防・治療剤である請求項１４記載の医薬。16. Diabetes, hypertension, post-ischemic reperfusion injury,
The medicament according to claim 14, which is a prophylactic / therapeutic agent for epilepsy.
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|---|---|---|---|
| JP2001030446A JP2002233376A (en) | 2001-02-07 | 2001-02-07 | New protein and its dna |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP2001030446A JP2002233376A (en) | 2001-02-07 | 2001-02-07 | New protein and its dna |
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| Country | Link |
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| JP (1) | JP2002233376A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
2001
- 2001-02-07 JP JP2001030446A patent/JP2002233376A/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003068263A1 (en) * | 2002-02-15 | 2003-08-21 | Taisho Pharmaceutical Co.,Ltd. | Remedy for hypertension |
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