JP2002218997A - Method for detecting risk factor for onset of bronchial asthma - Google Patents

Method for detecting risk factor for onset of bronchial asthma

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JP2002218997A
JP2002218997A JP2001017076A JP2001017076A JP2002218997A JP 2002218997 A JP2002218997 A JP 2002218997A JP 2001017076 A JP2001017076 A JP 2001017076A JP 2001017076 A JP2001017076 A JP 2001017076A JP 2002218997 A JP2002218997 A JP 2002218997A
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mutation
bronchial asthma
gene
leu
detecting
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Yusuke Nakamura
祐輔 中村
Mayumi Tamatoshi
真由美 玉利
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Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a means for detecting a risk factor for onset of human bronchial asthma, especially a means for detecting a risk factor for onset of infantile bronchial asthma. SOLUTION: This method for detecting the risk factor for onset of bronchial asthma is characterized by detecting a specific polymorphism or haplotype of human Iκβ-related protein gene.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト気管支喘息に
関連する遺伝子の変異を伴う多型、特に小児気管支喘息
発症の危険因子としての該遺伝子の多型、その検出方
法、該検出方法に利用するオリゴヌクレオチドおよび検
出用キットに関する。The present invention relates to a polymorphism associated with a mutation in a gene associated with human bronchial asthma, in particular, a polymorphism of the gene as a risk factor for the development of bronchial asthma in children, a method for detecting the polymorphism, and a method for detecting the polymorphism. And a detection kit.

【０００２】[0002]

【従来の技術】現在、日本人成人の約3％および子供の
約6％は、喘鳴、咳、息切れなどを伴う慢性の可逆的気
道閉塞によって臨床的に特徴付けられる気管支喘息に罹
患しているといわれている。この気管支喘息（複合疾
患）の病因には、種々の遺伝因子と環境因子が複雑に関
与することが示唆されている。At present, about 3% of Japanese adults and about 6% of children suffer from bronchial asthma clinically characterized by chronic reversible airway obstruction with wheezing, coughing, shortness of breath, etc. It is said that. It has been suggested that various genetic and environmental factors are involved in the pathogenesis of bronchial asthma (complex disease) in a complex manner.

【０００３】気管支喘息の病因に関与する遺伝的素因を
解析する手段としてDNA多型マーカーを用いて、多くの
研究者がこれまで連鎖解析および患者対照関連解析を実
施してきた。例えば、マニアン(Manian)は、従来行われ
てきた第11染色体におけるアトピーとの連鎖および第5
染色体長腕と第12染色体長腕におけるアトピーと気道過
敏性との連鎖について総説を述べている(Manian, P., C
hest, 112, 1397-1407(1997))。他の研究者らも、下記
それぞれの因子における遺伝子多型が気管支喘息の発症
に相関する旨報告している。 (1)β2アドレノレセプター(Hopes, E., et al., B. M.
J., 316, 664(1998))、(2)腫瘍壊死因子(tumor necrosi
s factor: TNF; Moffatt, et al., M.F., Cookson, W.
O., Hum. Molec. Genet, 6(4) 551-554 (1997))、(3)血
小板活性化因子(platelet-activating factor; Staffor
ini,D.M. et al., J. Clin. Invest., 103,989-997(199
9)、(4)顆粒球／マクロファージ-コロニー刺激因子(gra
nulocyte/macrophage-colony stimulating factor; Roh
rbach, M., et al., J. Allergy Clin. Immunol. 104,
(1) 247-248(1999))、(5)インターロイキン-4レセプタ
ー(Interleukin-4 receptor; Ober, C., et al., Am.
J. Hum. Genet., 66, 517-526(2000))。[0003] Many researchers have performed linkage analysis and patient-control association analysis using DNA polymorphism markers as a means of analyzing the genetic predisposition involved in the pathogenesis of bronchial asthma. For example, Manian has been linked to atopy on chromosome 11 and
A review of the link between atopy and airway hyperreactivity in the long arm of chromosomes and chromosome 12 (Manian, P., C
hest, 112, 1397-1407 (1997)). Other researchers have also reported that polymorphisms in each of the following factors correlate with the development of bronchial asthma. (1) β2-adrenoceptor (Hopes, E., et al., BM
J., 316, 664 (1998)), (2) tumor necrosi
s factor: TNF; Moffatt, et al., MF, Cookson, W.
O., Hum.Molec.Genet, 6 (4) 551-554 (1997)), (3) Platelet-activating factor; Staffor
ini, DM et al., J. Clin. Invest., 103, 989-997 (199
9), (4) granulocyte / macrophage-colony stimulating factor (gra
nulocyte / macrophage-colony stimulating factor; Roh
rbach, M., et al., J. Allergy Clin. Immunol. 104,
(1) 247-248 (1999)), (5) Interleukin-4 receptor; Ober, C., et al., Am.
J. Hum. Genet., 66, 517-526 (2000)).

【０００４】これまで行われた喘息とアトピー感受性に
対する全ゲノムスクリーニングは、幾つかの染色体上の
候補領域を明らかにしてきた(前記Manian(1997)参照)。
そのような候補遺伝子のひとつは第9染色体長腕上に位
置している。例えばジャスト(Wjst)らは、ドイツおよび
スウェーデンの156兄弟を含む97家系、415人で行った連
鎖解析において、第9染色体長腕に、喘息感受性(p=0.00
73)、血清免疫グロブリンEの上昇(IgE;p=0.0098)および
RAST(p=0.0025)との連鎖を見出している(Wist, M.F., e
t al., Genomics, 58, 1-8(1999))。染色体9q34に存在
しているIKAP遺伝子(Ｉκβ関連蛋白(Ｉκβ-associate
d Protein: IKAP)をコードする遺伝子)は、この連鎖の
見られた領域に存在しており、気管支喘息に関与する候
補遺伝子であると考えられた。[0004] Whole genome screening for asthma and atopic susceptibility performed to date has revealed several candidate regions on the chromosome (see Manian (1997), supra).
One such candidate gene is located on the long arm of chromosome 9. For example, Wjst et al. Found that asthma susceptibility (p = 0.000) was detected in the long arm of chromosome 9 in linkage analysis performed on 415 individuals from 97 families, including 156 siblings in Germany and Sweden.
73), elevated serum immunoglobulin E (IgE; p = 0.0098) and
Chain with RAST (p = 0.0025) (Wist, MF, e
tal., Genomics, 58, 1-8 (1999)). IKAP gene present on chromosome 9q34 (Iκβ-associated protein (Iκβ-associate
d Protein: gene encoding IKAP) is present in the region where this linkage was found and was considered to be a candidate gene involved in bronchial asthma.

【０００５】ヒトゲノムにおいて、一塩基多型(Single
nucleotide polymorphisms: SNPs)は、最も頻度の高い
遺伝子多型マーカーであり、これまでにありふれた疾
患、薬剤応答などの関連解析で有用であることが示され
てきた(Brookes, A.J., Gene,234, 177-186(1999); Car
gill, M, et al., Nature Genet., 22, 231-238(1999);
Evans, W.E., & Relling, M.V., Science, 286,487-49
1(1999))。また、複数のSNPsを用いたハプロタイプ解析
が遺伝的に複雑な疾患における疾患感受性を解析する上
で有用であることが示されており(Stephens, J.C., et
al., Am. J. Hum. Genet., 62, 1507-1515(1998); Tish
koff, S.A., et al., Am. J. Hum. Genet., 67, 518-52
2(2000))、実際に、アルツハイマー病および高血圧症の
ような疾患は、この方法で既に集中的に解析されている
(Jeunemaitre, X., et al., Am.J. Hum. Genet., 60, 1
448-1460(1997); Martin, E.R., Am. J. Hum. Genet.,
67, 383-394(2000))。In the human genome, single nucleotide polymorphisms (Single
nucleotide polymorphisms (SNPs) are the most frequent genetic polymorphism markers and have been shown to be useful in association analysis of common diseases and drug responses (Brookes, AJ, Gene, 234, 177-186 (1999); Car
gill, M, et al., Nature Genet., 22, 231-238 (1999);
Evans, WE, & Relling, MV, Science, 286,487-49
1 (1999)). Haplotype analysis using multiple SNPs has been shown to be useful for analyzing disease susceptibility in genetically complex diseases (Stephens, JC, et al.
al., Am. J. Hum.Genet., 62, 1507-1515 (1998); Tish
koff, SA, et al., Am. J. Hum. Genet., 67, 518-52.
2 (2000)) In fact, diseases like Alzheimer's disease and hypertension have already been intensively analyzed in this way
(Jeunemaitre, X., et al., Am.J.Hum.Genet., 60, 1
448-1460 (1997); Martin, ER, Am. J. Hum. Genet.,
67, 383-394 (2000)).

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒトにおけ
る気管支喘息発症を引き起こすかまたは将来子孫に先天
的に気管支喘息発症を伝達する可能性を有する遺伝的変
異を含む遺伝子の多型、即ち、気管支喘息を発症する危
険因子(変異遺伝子)を検出する手段、特に小児の気管支
喘息発症危険因子を検出する手段を提供することをその
主な課題とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to polymorphisms in genes containing genetic mutations that have the potential to cause bronchial asthma in humans or to transmit inbornly to the progeny future bronchial asthma. It is a main object of the present invention to provide a means for detecting a risk factor (mutant gene) for developing bronchial asthma, particularly a means for detecting a risk factor for developing bronchial asthma in children.

【０００７】本発明者らは、気管支喘息、虚血性心疾
患、慢性関節リウマチのような複合的疾患においてゲノ
ムワイドで疾患感受性と相関するSNPsのスクリーニング
を開始した(Ohnishi, Y., et al., Hum. Genet., 106,
288-292(2000); Unoki, M., etal., Hum. Genet., 106,
440-446(2000); Yamada, R., et al., Hum．Genet．,1
06, 293-297(2000))。The present inventors have begun screening for SNPs that are genome-wide and correlate with disease susceptibility in complex diseases such as bronchial asthma, ischemic heart disease and rheumatoid arthritis (Ohnishi, Y., et al. , Hum. Genet., 106,
288-292 (2000); Unoki, M., etal., Hum. Genet., 106,
440-446 (2000); Yamada, R., et al., Hum. Genet. , 1
06, 293-297 (2000)).

【０００８】その過程において、気管支喘息の病態に関
与する可能性のあるSNPsを同定するために、IKAPをコー
ドする遺伝子のSNPsを広範囲に亘って検索した。[0008] In the process, in order to identify SNPs that may be involved in the pathogenesis of bronchial asthma, SNPs of the gene encoding IKAP were extensively searched.

【０００９】その結果、IKAP遺伝子のコード領域内に6
つの単一のSNPsを同定し、これらSNPsとヒト気管支喘息
の疾患感受性との間に相関を見出した。また、本発明者
らは、これら特異的な6つのSNPsからなるハプロタイプ
と特に小児気管支喘息の発症との間に相関があることを
見出した。更に、これら特定されたSNPsの解析によって
ヒト気管支喘息発症危険因子、特に小児の気管支喘息発
症の危険因子が検出でき、検体におけるこれらSNPsの検
出、解析によってヒト気管支喘息、特に小児気管支喘息
発症の予測診断が可能となることを見出した。本発明は
かかる知見を基礎として完成されたものである。[0009] As a result, 6 in the coding region of the IKAP gene
Two single SNPs were identified and a correlation was found between these SNPs and human bronchial asthma disease susceptibility. The present inventors have also found that there is a correlation between the haplotype consisting of these six specific SNPs and the development of bronchial asthma, especially in children. Furthermore, the analysis of these identified SNPs enables the detection of risk factors for the development of human bronchial asthma, in particular, the risk factors for the development of bronchial asthma in children. It has been found that diagnosis is possible. The present invention has been completed based on such findings.

【００１０】[0010]

【課題を解決するための手段】本発明は、下記(1)〜(1
1)に示される気管支喘息発症危険因子の検出方法を提供
する。 (1) ヒトにおける気管支喘息発症を引き起こすかまた
は当該ヒトの子孫に先天性に気管支喘息発症性を伝達す
る可能性を有する変異を含む遺伝子の多型を検出する方
法であって、（a）検体からヒトIKAPをコードする遺伝
子を含む核酸を得、（b）当該核酸のDNA配列を決定し
て、ヒトIKAP遺伝子の多型を検出する、気管支喘息発症
危険因子の検出方法。 (2) 気管支喘息が小児気管支喘息である上記(1)に記載
の気管支喘息発症危険因子の検出方法。 (3) 遺伝子の多型が、配列番号1に記載のヒトIKAPのア
ミノ酸配列番号816番目のIleのLeuへの変異、830番目の
IleのMetへの変異、1072番目のCysのSerへの変異および
1158番目のProのLeuへの変異からなる群から選ばれる少
なくとも1種のアミノ酸変異わ伴うものである上記(1)に
記載の気管支喘息発症危険因子の検出方法。 (4) 遺伝子の多型が、配列番号1に記載のヒトIKAPのア
ミノ酸配列番号の1072番目のCysのSerへの変異および／
または1158番目のProのLeuへの変異を伴うものである上
記(2)に記載の小児気管支喘息発症危険因子の検出方
法。 (5) 気管支喘息が成人気管支喘息である上記(1)に記載
の気管支喘息発症危険因子の検出方法。 (6) 遺伝子の多型が、配列番号1に記載のヒトIKAPのア
ミノ酸配列番号の1072番目のCysのSerへの変異を伴うも
のである上記(5)に記載の成人気管支喘息発症危険因子
の検出方法。 (7) 遺伝子の多型が、配列番号2に記載のヒトIKAP遺伝
子のコード領域の819番目のTのCへの変異、2295番目のG
のAへの変異、2446番目のAのCへの変異、2490番目のAの
Gへの変異、3214番目のTのAへの変異および3473番目のC
のTへの変異からなる群から選ばれる少なくとも1種の核
酸変異を有するものである上記(1)に記載の気管支喘息
発症危険因子の検出方法。 (8) 配列番号2に記載のヒトIKAP遺伝子のコード領域の
819番目、2295番目、2446番目および2490番目の核酸が
それぞれT、G、AおよびAであり且つ3214番目のTのAへの
変異および3473番目のCのTへの変異を有するTGAAATハプ
ロタイプを検出する上記(2)に記載の小児気管支喘息発
症危険因子の検出方法。 (9) 遺伝子の多型の検出が、ヌクレオチド直接配列決
定法、PCR-対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)
とドットブロットハイブリダイゼーション分析、一塩基
伸長法、PCR-単鎖高次構造多型(SSCP)分析、PCR-RFLP分
析、インベーダー(Invader)法及び定量的リアルタイムP
CR検出法(TaqMan法)からなる群から選ばれる少なくとも
一つを含む方法によって行われる上記(1)に記載の気管
支喘息発症危険因子の検出方法。The present invention provides the following (1) to (1)
A method for detecting a risk factor for developing bronchial asthma shown in 1) is provided. (1) A method for detecting a polymorphism in a gene containing a mutation that causes the onset of bronchial asthma in a human or congenitally transmits the onset of bronchial asthma to the progeny of the human, comprising: And (b) determining the DNA sequence of the nucleic acid to detect a polymorphism of the human IKAP gene, thereby detecting a bronchial asthma onset risk factor. (2) The method for detecting a risk factor for developing bronchial asthma according to the above (1), wherein the bronchial asthma is childhood bronchial asthma. (3) gene polymorphism, human IKAP described in SEQ ID NO: 1 amino acid SEQ ID NO: 816 Ile mutation to Leu, 830th
Mutation of Ile to Met, mutation of Cys at position 1072 to Ser, and
The method for detecting a bronchial asthma development risk factor according to the above (1), which is accompanied by at least one amino acid mutation selected from the group consisting of mutation of Pro at position 1158 into Leu. (4) the polymorphism of the gene is a mutation of Cys at position 1072 of the amino acid sequence number of human IKAP of SEQ ID NO: 1 to Ser and / or
Or the method for detecting a childhood bronchial asthma development risk factor according to the above (2), which is accompanied by mutation of Pro at position 1158 to Leu. (5) The method for detecting a risk factor for developing bronchial asthma according to (1), wherein the bronchial asthma is adult bronchial asthma. (6) the polymorphism of the gene, the mutation of the amino acid sequence number of the human IKAP of SEQ ID NO: 1 is a mutation of the amino acid sequence No. 1072 Cys to Ser, the risk factor for the development of adult bronchial asthma according to the above (5) Detection method. (7) polymorphism of the gene, the mutation of the coding region of the human IKAP gene of SEQ ID NO: 2 from T to C at position 819, G at position 2295
Mutation of A, mutation of C at position 2446, mutation of A at position 2490
Mutation to G, mutation of T to A at position 3214, and C to position 3473
The method for detecting a bronchial asthma development risk factor according to the above (1), wherein the method has at least one nucleic acid mutation selected from the group consisting of mutations to T. (8) of the coding region of the human IKAP gene described in SEQ ID NO: 2
TGAAAT haplotypes in which the nucleic acids at positions 819, 2295, 2446, and 2490 are T, G, A, and A, respectively, and have a mutation at position A of T at position 3214 and a mutation at position T of C at position 3473 The method for detecting a childhood bronchial asthma development risk factor according to the above (2). (9) Detection of gene polymorphism by direct nucleotide sequencing, PCR-allele-specific oligonucleotide (ASO)
And dot blot hybridization analysis, single base extension method, PCR-single stranded conformation polymorphism (SSCP) analysis, PCR-RFLP analysis, Invader method and quantitative real-time P
The method for detecting a risk factor for developing bronchial asthma according to the above (1), which is performed by a method including at least one selected from the group consisting of a CR detection method (TaqMan method).

【００１１】更に、本発明は、上記遺伝子変異の検出
が、PCR-(DGGE)法、PCR-DGGE/GC-クランプ法、PCR-SSO
法、蛍光in situハイブリダゼーション(FISH)法、サザ
ンブロット法およびRNase保護アッセイ法からなる群か
ら選ばれる少なくとも一つを含む方法によって行われる
上記(1)に記載の気管支喘息発症危険因子の検出する方
法をも提供する。 (10) 遺伝子の多型の検出が、制限酵素認Nla IVを用い
たPCR-RFLP分析により行われる上記(9)に記載の気管支
喘息発症危険因子の検出方法。Furthermore, the present invention provides a method for detecting the above-mentioned gene mutation, which comprises the PCR- (DGGE) method, the PCR-DGGE / GC-clamp method, the PCR-SSO
Method, fluorescence in situ hybridization (FISH) method, detection of a bronchial asthma development risk factor according to (1), which is performed by a method including at least one selected from the group consisting of a Southern blot method and an RNase protection assay method. It also provides a way to do that. (10) The method for detecting a bronchial asthma onset risk factor according to the above (9), wherein the detection of the gene polymorphism is performed by PCR-RFLP analysis using restriction enzyme Nla IV.

【００１２】また、本発明は下記(11)〜(17)に示す、本
発明検出法に用いられるオリゴヌクレオチド、検出用キ
ットおよび変異を有するヒトIKAP遺伝子を提供する。 (11) 上記(1)から(8)のいずれかに記載の検出方法に用
いられるPCR反応用プライマーまたはプローブとしての
オリゴヌクレオチド。 (12) 配列番号19から36のいずれかから選択される上記
(11)に記載のPCR反応用プライマーまたはプローブとし
てのオリゴヌクレオチド。 (13) 上記(11)または(12)に記載のオリゴヌクレオチド
を有効成分として含有する、前記(1)に記載の気管支喘
息発症危険因子の検出方法のためのキット。 (14) 制限酵素Nla IVを有効成分として含有する、前記
(10)に記載の気管支喘息発症危険因子の検出方法のため
のキット。 (15) 配列番号1に記載のヒトIKAPのアミノ酸配列番号
の816番目のIleのLeuへの変異、830番目のIleのMetへの
変異、1072番目のCysのSerへの変異および1158番目のPr
oのLeuへの変異からなる群から選ばれる少なくとも1種
のアミノ酸変異を有するヒトIKAP遺伝子。 (16) 配列番号2に記載のヒトIKAP遺伝子のコード領域
の819番目のTのCへの変異、2295番目のGのAへの変異、2
446番目のAのCへの変異、2490番目のAのGへの変異、321
4番目のTのAへの変異および3473番目のCのTへの変異か
らなる群から選ばれる少なくとも1種の核酸変異を有す
るヒトIKAP遺伝子。 (17) 配列番号2に記載のヒトIKAP遺伝子のコード領域
の819番目、2295番目、2446番目および2490番目の核酸
がそれぞれT、G、AおよびAであり且つ3214番目のTのAへ
の変異および3473番目のCのTへの変異を有するTGAAATハ
プロタイプであるヒトIKAP遺伝子。Further, the present invention provides an oligonucleotide, a detection kit and a human IKAP gene having a mutation, which are used in the detection method of the present invention as shown in the following (11) to (17). (11) An oligonucleotide as a primer or probe for a PCR reaction used in the detection method according to any one of (1) to (8). (12) The above selected from any one of SEQ ID NOs: 19 to 36
The oligonucleotide as a primer or probe for a PCR reaction according to (11). (13) The kit for detecting a bronchial asthma onset risk factor according to (1), comprising the oligonucleotide according to (11) or (12) as an active ingredient. (14) containing the restriction enzyme Nla IV as an active ingredient,
A kit for the method for detecting a risk factor for developing bronchial asthma according to (10). (15) Mutation of the amino acid sequence number of human IKAP according to SEQ ID NO: 1 at position 816 at Ile to Leu, at 830 at Ile at Met, at 1072 at Cys at Ser and at 1158 at Pr
A human IKAP gene having at least one amino acid mutation selected from the group consisting of mutation of o into Leu. (16) Mutation of T to C at position 819, mutation of G to A at position 2295 of the coding region of the human IKAP gene described in SEQ ID NO: 2, 2
446th A to C mutation, 2490th A to G mutation, 321
A human IKAP gene having at least one nucleic acid mutation selected from the group consisting of the fourth T mutation to A and the 3473 th C mutation to T. (17) the nucleic acid at positions 819, 2295, 2446 and 2490 of the coding region of the human IKAP gene described in SEQ ID NO: 2 are T, G, A and A, respectively, and the mutation of T at position 3214 to A is And a human IKAP gene that is a TGAAAT haplotype having a C to T mutation at position 3473.

【００１３】[0013]

【発明の実施の形態】本明細書におけるアミノ酸、ペプ
チド、塩基配列、核酸などの略号による表示は、IUPAC-
IUBの規定〔IUPAc-IUB communication on Biological N
omenclature,Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、
「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のた
めのガイドライン」（特許庁編）および当該分野におけ
る慣用記号に従うものとする。尚、本明細書中に示され
るヒトIKAP遺伝子のコード領域における核酸の番号は、
配列番号2に示されるIKAPcDNA配列情報（GenBank acces
sion number AF044195に記載の配列情報を、日本人の主
要対立遺伝子を参照して一部修正したもの）を基準とし
て、そのコード領域の開始コドンであるATG中のAを1番
目として3'下流側に向かって連続して数えるものとし、
アミノ酸配列番号は、当該ATGによってコードされるMet
を1番目としてC末端側に向かって連続して数えるものと
する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In the present specification, abbreviations for amino acids, peptides, base sequences, nucleic acids and the like are expressed by IUPAC-
IUB regulations (IUPAc-IUB communication on Biological N
omenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)),
The guidelines shall be in accordance with “Guidelines for Preparing Specifications and the Like Containing Base Sequence or Amino Acid Sequence” (edited by the Patent Office) and conventional symbols in the art. Incidentally, the number of the nucleic acid in the coding region of the human IKAP gene shown in the present specification,
IKAP cDNA sequence information shown in SEQ ID NO: 2 (GenBank acces
sion number AF044195, partially modified with reference to the major alleles of Japanese), with the A in the ATG, which is the start codon of the coding region, as the first 3 'downstream Count continuously towards
The amino acid sequence number corresponds to the Met encoded by the ATG.
, And count continuously toward the C-terminal side.

【００１４】本明細書において「遺伝子」なる語は、2
本鎖DNAのみならず、それを構成する各1本鎖DNA（セン
ス鎖およびアンチセンス鎖）を包含する。即ち、本発明
遺伝子（DNA）は、特に言及しない限り、ヒトゲノムDNA
を含む2本鎖DNA、cDNAを含む1本鎖DNA（センス鎖）、該
センス鎖と相補的な配列を有する1本鎖DNAおよびそれら
の断片を含む。また、上記遺伝子（DNA）は、調節領
域、コード領域、エキソンおよびイントロンを含むこと
ができる。ポリヌクレオチドは、RNAおよびDNAを包含す
る。DNAは、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを含む。ポ
リペプチドは、その断片、同族体、誘導体および変異体
を含む。更に、変異体は、天然に存在するアレル変異
体、天然に存在しない変異体、改変(欠失、置換、付加
および挿入)のなされた変異体およびコードするポリペ
プチドの機能を実質的に変更しないポリヌクレオチド配
列を意味する。尚、アミノ酸配列における改変は、天然
において例えば突然変異、翻訳後の修飾などにより生じ
ることもあり、天然由来の遺伝子を利用して人為的にこ
れを行うこともできる。In the present specification, the term “gene” is 2
It includes not only single-stranded DNA but also single-stranded DNAs constituting it (sense strand and antisense strand). That is, unless otherwise specified, the gene (DNA) of the present invention is a human genomic DNA
And a single-stranded DNA (sense strand) including cDNA, a single-stranded DNA having a sequence complementary to the sense strand, and fragments thereof. Further, the gene (DNA) can include a regulatory region, a coding region, exons, and introns. Polynucleotides include RNA and DNA. DNA includes cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. Polypeptides include fragments, homologs, derivatives and variants thereof. Furthermore, variants do not substantially alter the function of naturally occurring allelic variants, non-naturally occurring variants, modified (deletion, substitution, addition and insertion) variants and encoded polypeptides. Means a polynucleotide sequence. The alteration in the amino acid sequence may be caused in nature by, for example, a mutation or a post-translational modification, and may be artificially performed using a naturally-derived gene.

【００１５】また、本明細書において、SNP（Single nu
cleotide polymorphism: 一塩基多型）とは、ある遺伝
子乃至遺伝子群における一塩基の核酸の変異として表わ
され、複数箇所に存在する上記一塩基の核酸の変異(SN
P)をSNPsとして表す。ハプロタイプとは、連続した遺伝
子領域または遺伝子群中の複数箇所の変異部位における
対立遺伝子の種類と数とによって表される上記変異（SN
Ps）のタイプを示す。その具体例は、例えば後記実施例
に示される。In this specification, SNP (Single nu)
A cleotide polymorphism (single nucleotide polymorphism) is expressed as a mutation of a single nucleotide nucleic acid in a certain gene or gene group, and the mutation (SN
P) is represented as SNPs. The haplotype refers to the mutation (SN) represented by the type and number of alleles at a plurality of mutation sites in a continuous gene region or a group of genes.
Ps). Specific examples thereof will be shown in the examples below.

【００１６】[0016]

【発明の実施の形態】本発明は、IKAP遺伝子のコード領
域内の特定位置における変異を含む多型、殊にSNPsがヒ
ト気管支喘息の疾患感受性と強く相関しており、特定の
SNPsを検出し、そのハプロタイプを解析すれば、気管支
喘息、特に小児気管支喘息の発症を予測診断できるとい
う事実の発見に基づいて完成されている。本発明に係わ
る検出方法は、検体におけるこれらの多型、即ちSNPsお
よびハプロタイプの検出を行うことを必須の要件とす
る。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention shows that polymorphisms including mutations at specific positions in the coding region of the IKAP gene, particularly SNPs, are strongly correlated with human bronchial asthma disease susceptibility.
It has been completed based on the discovery that the detection of SNPs and analysis of their haplotypes can predict and diagnose the onset of bronchial asthma, especially childhood bronchial asthma. The detection method according to the present invention has an essential requirement to detect these polymorphisms, that is, SNPs and haplotypes in a sample.

【００１７】本発明方法によって検出、解析される、ヒ
トにおける気管支喘息発症を引き起こすかまたは当該ヒ
トの子孫に先天性に気管支喘息発症性を伝達する可能性
を有する遺伝的変異を含むSNPs（即ち、気管支喘息発症
危険因子）としては、ヒトIKAP遺伝子のコード領域内の
以下のものであることができる。SNPs containing genetic mutations that have the potential to cause bronchial asthma development in humans or congenitally transmit bronchial asthma development to human progeny detected and analyzed by the method of the present invention (ie, (Bronchial asthma development risk factor) may be the following in the coding region of the human IKAP gene.

【００１８】配列番号1に記載のヒトIKAPのアミノ酸配
列をコードする遺伝子（配列番号2に記載のヒトIKAP遺
伝子のDNA配列）の819番目のTのCへの変異［以下、「T8
19C(Leu273Leu)」と表示する］、2295番目のGのAへの変
異［以下、「G2295A(Gly765Gly)」と表示する］、2446
番目のAのCへの変異［以下、「A2446C(Ile816Leu)」と
表示する］、2490番目のAのGへの変異［以下、「A2490G
(Ile830Met)」と表示する］、3214番目のTのAへの変異
［以下、「T3214A(Cys1072Ser)」と表示する］および34
73番目のCのTへの変異［以下、「C3473T(Pro1158Leu)」
と表示する］。Mutation of T to C at position 819 of the gene encoding the amino acid sequence of human IKAP of SEQ ID NO: 1 (DNA sequence of the human IKAP gene of SEQ ID NO: 2) [hereinafter referred to as "T8
19C (Leu273Leu) ", the 2295th G to A mutation [hereinafter, referred to as" G2295A (Gly765Gly) "], 2446
Mutation of A to C [hereinafter referred to as “A2446C (Ile816Leu)”], Mutation of A to G at 2490 [hereinafter “A2490G
(Ile830Met)], the mutation of T at position 3214 to A [hereinafter, referred to as “T3214A (Cys1072Ser)”] and 34
73th C mutation to T [hereinafter, "C3473T (Pro1158Leu)"
Is displayed.]

【００１９】ところで、ヒトIKAP遺伝子は、コーエン(C
ohen)らによって、GenBankアクセッション番号：AF0441
95として報告された全長4803塩基長の遺伝子である。該
遺伝子の概略および本発明に係わる方法によって検出さ
れる遺伝子の多型（SNPs）の具体例を図1に示す。Meanwhile, the human IKAP gene is known as Cohen (C
ohen) et al., GenBank accession number: AF0441
It is a gene with a total length of 4803 bases, reported as 95. FIG. 1 shows an outline of the gene and specific examples of gene polymorphisms (SNPs) detected by the method according to the present invention.

【００２０】図1に示すように、IKAP遺伝子は1〜5の5つ
の番号で示されるWD（Trp-Asp）様反復配列、NF-κβ誘
導キナーゼ結合部位(NIK binding site)、Ｉκβキナー
ゼ−α結合部位(IKKαbinding site)、IKK-β結合部位
(IKKβbinding site)およびセリン・リッチドメイン(図
中、Serと表示)を有する構造からなっている。該遺伝子
のコード領域は、配列番号2に示す配列番号の304番目か
ら4299番目（4300-4302番目に終止コドンtgaを有する）
であり、これによってコードされるアミノ酸配列は配列
番号1に示す1332個のアミノ酸からなっている。尚、該I
KAP遺伝子は染色体9q34上にマップされる(Cohen, L.,et
al., Nature, 395(6699), 292-296(1998)。As shown in FIG. 1, the IKAP gene has WD (Trp-Asp) -like repetitive sequence, NF-κβ-induced kinase binding site (NIK binding site), Iκβ kinase-α Binding site (IKKα binding site), IKK-β binding site
(IKKβbinding site) and a structure having a serine-rich domain (denoted as Ser in the figure). The coding region of the gene is from position 304 to position 4299 (having a stop codon tga at positions 4300-4302) of SEQ ID NO: 2 shown in SEQ ID NO: 2.
The amino acid sequence encoded thereby is composed of 1332 amino acids shown in SEQ ID NO: 1. The I
The KAP gene maps to chromosome 9q34 (Cohen, L., et.
al., Nature, 395 (6699), 292-296 (1998).

【００２１】本発明方法によって検出される前記6つのS
NPsは、それぞれ図1に矢印にて表示されており、IKAP遺
伝子を示す棒の上に表示したSNPsは、同義的置換（蛋白
産物の配列に変化を生じないもの）であり、棒の下に表
示したSNPsは蛋白のミスセンス置換を生じるものであ
る。気管支喘息と強い相関の認められる一つのSNPであ
る3214番目のTのAへの変異［T3214A(Cys1072Ser)］は、
IKKαおよびIKKβ結合ドメイン内に位置しており、また
3473番目のCのTへの変異［C3473T(Pro1158Leu)］は、セ
リン・リッチドメインをコードする領域内に位置してい
る。The above-mentioned six Ss detected by the method of the present invention
The NPs are indicated by arrows in FIG. 1, respectively. The SNPs indicated above the bar indicating the IKAP gene are synonymous substitutions (those that do not change the sequence of the protein product) and are indicated below the bar. The indicated SNPs result in missense substitutions of the protein. One SNP that is strongly correlated with bronchial asthma, the mutation of T to A at position 3214 [T3214A (Cys1072Ser)]
Located within the IKKα and IKKβ binding domains, and
The 3473rd C to T mutation [C3473T (Pro1158Leu)] is located in the region encoding the serine-rich domain.

【００２２】本発明に係る遺伝子多型の検出方法および
これによって検出される変異を有するIKAP遺伝子（SNPs
およびハプロタイプ）の提供は、ヒト気管支喘息、特に
早期発症の気管支喘息における発症危険因子の解明、把
握、診断、予防および治療に極めて有用な情報乃至手段
を与える。また、本発明に係るIKAP遺伝子多型（SNPsお
よびハプロタイプ)の検出は、気管支喘息の治療または
処置に有効と考えられる新規薬剤、例えばIKAP遺伝子の
多型部位の作用点を標的とした薬剤などの開発の上でも
有用である。更に、個体或は組織における本発明遺伝子
多型またはハプロタイプの検出は、気管支喘息、特に小
児気管支喘息の解明、喘息発症前の早期診断にも有用で
ある。The method for detecting a genetic polymorphism according to the present invention and the IKAP gene (SNPs
And haplotypes) provide extremely useful information or means for elucidating, understanding, diagnosing, preventing and treating human asthma, particularly risk factors for early-onset bronchial asthma. The detection of the IKAP gene polymorphism (SNPs and haplotypes) according to the present invention is a novel drug that is considered to be effective for the treatment or treatment of bronchial asthma, such as a drug targeting the action point of the polymorphic site of the IKAP gene. It is also useful in development. Further, the detection of the gene polymorphism or haplotype of the present invention in an individual or tissue is useful for elucidation of bronchial asthma, particularly childhood bronchial asthma, and early diagnosis before asthma onset.

【００２３】以下、本発明方法によって検出される変異
を有するヒトIKAP遺伝子（SNPsおよびハプロタイプ）に
つき詳述すれば、該遺伝子（SNPs）の具体例としては、
ヒトIKAPのアミノ酸配列番号の816番目のIleからLeuへ
の変異、830番目のIleからMetへの変異、1072番目のCys
からSerへの変異および1158番目のProからLeuへの変異
からなる群より選ばれる少なくとも1種のアミノ酸変異
を有するヒトIKAP遺伝子多型を例示できる。Hereinafter, the human IKAP gene (SNPs and haplotype) having the mutation detected by the method of the present invention will be described in detail. Specific examples of the gene (SNPs) include:
Mutation from Ile at position 816 to Leu of amino acid sequence of human IKAP, mutation from Ile at position 830 to Met, Cys at position 1072
And a human IKAP gene polymorphism having at least one amino acid mutation selected from the group consisting of a mutation from Ser to Ser and a mutation from Pro to Leu at position 1158.

【００２４】上記具体例としては、また、ヒトIKAPをコ
ードする遺伝子のコード領域の819番目のTからCへの変
異、2295番目のGからAへの変異、2446番目のAからCへの
変異、2490番目のAからGへの変異、3214番目のTからAへ
の変異および3473番目のCからTへの変異からなる群より
選ばれる少なくとも1種の核酸変異を有するヒトIKAP遺
伝子多型も例示できる。Examples of the above-mentioned examples include mutations from T to C at position 819, mutation from G to A at position 2295, and mutations from A to C at position 2446 in the coding region of the gene encoding human IKAP. Human IKAP gene polymorphism having at least one nucleic acid mutation selected from the group consisting of 2490th A to G mutation, 3214th T to A mutation and 3473th C to T mutation Can be illustrated.

【００２５】本発明遺伝子は、上記例示のヒトIKAP遺伝
子多型のDNA配列の相補鎖を有するDNA配列も包含する。The gene of the present invention also includes a DNA sequence having a complementary strand to the DNA sequence of the human IKAP gene polymorphism exemplified above.

【００２６】また、本発明遺伝子（ハプロタイプ）とし
ては、IKAP遺伝子の特定の6ヶ所の核酸によって類型化
されたハプロタイプを挙げることができる。その具体例
は後記実施例に示される通りである。主なハプロタイプ
の例は下記表に示される。The gene (haplotype) of the present invention includes a haplotype typified by six specific nucleic acids of the IKAP gene. Specific examples thereof are as shown in Examples below. Examples of major haplotypes are shown in the table below.

【００２７】[0027]

【表１】 [Table 1]

【００２８】これらの中では、ヒトIKAP遺伝子のコード
領域の819番目、2295番目、2446番目および2490番目の
核酸がそれぞれT、G、AおよびAであり且つ3214番目の核
酸TのAへの変異および3473番目の核酸CのTへの変異を有
する、TGAAATハプロタイプが好ましいものとして例示さ
れる。In these, the nucleic acids at positions 819, 2295, 2446 and 2490 of the coding region of the human IKAP gene are T, G, A and A, respectively, and the mutation T at the position 3214 is mutated to A. The TGAAAT haplotype, which has a mutation of T of the nucleic acid C at position 3473, is exemplified as preferred.

【００２９】本発明IKAP遺伝子(SNPsおよびハプロタイ
プ)は、本発明により開示された本発明遺伝子の具体的
配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容
易に製造・取得することができる〔Molecular Cloning
2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生
化学実験講座「遺伝子研究法I、II、III」、日本生化学
会編（1986）など参照〕。より具体的には、IKAP遺伝子
のSNPsまたはハプロタイプを有するヒトまたは気管支喘
息患者より、常法に従ってcDNAまたはゲノムDNAを抽出
し、本発明IKAP遺伝子に特有の変異を含む適当なプロー
ブ、制限酵素、抗体などを用いて、所望クローンを選択
する。かかるクローンの選択も常法に従うことができる
〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；S
cience, 222, 778 (1983)など参照〕。The IKAP gene (SNPs and haplotypes) of the present invention can be easily produced and obtained by general genetic engineering techniques based on the specific sequence information of the gene of the present invention disclosed by the present invention [Molecular Cloning
2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); see Seismic Chemistry Laboratory Course, "Gene Research Methods I, II, III", edited by The Biochemical Society of Japan (1986), etc.). More specifically, from a human or a bronchial asthma patient having SNPs or a haplotype of the IKAP gene, cDNA or genomic DNA is extracted according to a conventional method, and a suitable probe containing a mutation specific to the IKAP gene of the present invention, a restriction enzyme, an antibody The desired clone is selected using, for example, Selection of such clones can be performed according to a conventional method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981);
cience, 222, 778 (1983)).

【００３０】上記において、cDNAまたはゲノムDNAの起
源としては、本発明IKAP遺伝子(SNPs)を有する各種細
胞、組織、これらに由来する培養細胞などを例示でき
る。具体的には、血清または血漿のごとき血液、唾液、
リンパ液、気道粘液、尿、***などの体液を例示するこ
とができる。これら起源材料からのRNAの分離、mRNAの
分離および精製、cDNAの取得、そのクローニングなど
は、いずれも常法に従うことができる。また、cDNAライ
ブラリーは市販されており、本発明においてはそれらcD
NAライブラリー、例えばクローンテック社（Clontech L
ab.Inc.）などより市販されている各種cDNAライブラリ
ーなどを用いることもできる。In the above description, examples of the source of cDNA or genomic DNA include various cells and tissues having the IKAP gene (SNPs) of the present invention, and cultured cells derived therefrom. Specifically, blood, saliva, such as serum or plasma,
Examples include bodily fluids such as lymph, airway mucus, urine, and semen. Isolation of RNA from these source materials, isolation and purification of mRNA, acquisition of cDNA, cloning thereof, and the like can all be performed according to a conventional method. CDNA libraries are commercially available, and in the present invention, these cDNA
NA libraries, such as Clontech L
ab. Inc.) can also be used.

【００３１】本発明遺伝子をcDNAライブラリーからスク
リーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に
従うことができる。具体的には、目的のSNPsまたはハプ
ロタイプDNA配列に選択的に結合し得る変異部分を含む
プローブを作成し、これを用いてプラークハイブリダイ
ゼーション、コロニーハイブリダイゼーションなどを実
施するかこれらを組合せて実施すればよい。The method for screening the gene of the present invention from a cDNA library is not particularly limited, either, and any conventional method can be used. Specifically, a probe containing a mutated portion capable of selectively binding to a target SNPs or haplotype DNA sequence is prepared, and plaque hybridization, colony hybridization, or the like is performed using the probe or a combination thereof. I just need.

【００３２】上記スクリーニング用プライマーとして
は、本発明遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したフォ
ワード・プライマーおよびリバース・プライマーを用い
ることができる。これらは常法に従い、例えば自動合成
装置を用いて合成することができる。該スクリーニング
用プローブは、通常、標識したプローブであるが、直接
的または間接的に標識したリガンドと特異的結合できる
ものであれば、非標識のものであってもよい。プローブ
およびリガンドの標識剤および標識法は、既にこの種技
術分野でよく知られている。その例としては、例えばニ
ック・トランスレーション、ランダム・プライミングム
またはキナーゼ処理のような既知の方法によって取り込
ませることができる放射性標識剤、ビオチン、蛍光性色
素、化学発光剤、ルシフェラーゼなどの酵素、抗体など
を例示できる。As the above-mentioned screening primer, a forward primer and a reverse primer set based on the nucleotide sequence information of the gene of the present invention can be used. These can be synthesized according to a conventional method, for example, using an automatic synthesizer. The screening probe is usually a labeled probe, but may be an unlabeled probe as long as it can directly or indirectly specifically bind to a labeled ligand. Probe and ligand labeling agents and methods are already well known in the art. Examples include radiolabels, biotin, fluorescent dyes, chemiluminescent agents, enzymes such as luciferase, antibodies, which can be incorporated by known methods, such as nick translation, random priming or kinase treatment. And the like.

【００３３】さらに、抽出した遺伝子あるいはmRNAは、
遺伝子増幅法によって増幅することができる。この増幅
によれば、本発明検出方法における検出をより容易に且
つ精度の高いものとすることができる。遺伝子増幅法の
例としては、PCR法（Saiki,R.K., Bugawan, T.L., et a
l., Nature, 324, 163-166(1986))、NASBA法（Comptom,
J., Nature, 650, 91-92(1991)）、TMA法（Kacian, D.
L., and Fultz, T.J., 米国特許第5,399,491号 (199
5)）、SDA法（Walker, G.T., Little, M.C., etal, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392-396 (1992)）など
が挙げられる。Further, the extracted gene or mRNA is
It can be amplified by a gene amplification method. According to this amplification, the detection in the detection method of the present invention can be more easily and accurately performed. Examples of the gene amplification method include the PCR method (Saiki, RK, Bugawan, TL, et a
l., Nature, 324, 163-166 (1986)), NASBA method (Comptom,
J., Nature, 650, 91-92 (1991)), TMA method (Kacian, D.
L., and Fultz, TJ, U.S. Pat.No. 5,399,491 (199
5)), SDA method (Walker, GT, Little, MC, etal, Pro
Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392-396 (1992)).

【００３４】尚、かかるPCR法などで増幅させた遺伝子
断片の単離精製は、常法に従うことができ、例えばゲル
電気泳動法などによればよく、またカラムにて精製して
もよい。その確認は例えばマススペクトルによることが
できる。The isolation and purification of the gene fragment amplified by the PCR method or the like can be carried out according to a conventional method, for example, by gel electrophoresis or by a column. The confirmation can be based on, for example, a mass spectrum.

【００３５】これらの方法により増幅された遺伝子は、
その増幅物の特性に応じて、本発明に係るIKAP遺伝子
（SNPsまたはハプロタイプ）の検出に供される。The genes amplified by these methods are:
Depending on the characteristics of the amplified product, it is used for detecting the IKAP gene (SNPs or haplotype) according to the present invention.

【００３６】以下、本発明検出方法につき詳述する。Hereinafter, the detection method of the present invention will be described in detail.

【００３７】本発明検出方法において、検体としてはヒ
トまたは気管支喘息患者由来のDNAまたはゲノムDNAを好
ましいものとして例示できる。かかる検体はヒトまたは
気管支喘息患者の組織、細胞など、好ましくは血液、患
者の標的組織細胞などより常法に従い抽出して調製でき
る。 (1) ヌクレオチド直接塩基決定法 まず第一に、本発明に係るIKAP遺伝子の検出は、この種
遺伝子の塩基配列決定に慣用されている、例えばダイデ
オキシ法(Sanger, et al., Proc. Natl. Acad.Sci. US
A, 74, 5463-5467 (1977))、マキサム−ギルバート法
〔Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕などの直
接塩基配列決定法に従って実施することができる。In the detection method of the present invention, as the sample, DNA or genomic DNA derived from a human or a patient with bronchial asthma can be preferably exemplified. Such a sample can be prepared by extracting from a tissue or cells of a human or bronchial asthma patient, preferably blood, a target tissue cell of the patient or the like according to a conventional method. (1) Nucleotide direct base determination method First of all, the detection of the IKAP gene according to the present invention is commonly used for base sequence determination of this kind of gene, for example, dideoxy method (Sanger, et al., Proc. Acad.Sci. US
A, 74, 5463-5467 (1977)) and the direct base sequencing method such as the Maxam-Gilbert method [Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)].

【００３８】また、これらの方法とPCR法などのDNA増幅
法を組合せた方法に従って実施することもできる。特
に、少量のDNA試料を用いて簡便かつ容易にしかも感度
および精度の高い検出が可能である観点からは、PCR法
もしくはそれに準じたDNA増幅法を組合せた方法が好ま
しい。Further, the method can be carried out according to a method in which these methods are combined with a DNA amplification method such as a PCR method. In particular, from the viewpoint that simple and easy detection can be performed with high sensitivity and high accuracy using a small amount of a DNA sample, a method combining a PCR method or a DNA amplification method according to the method is preferable.

【００３９】この好ましい方法は、最も基本的には、例
えばPCR法で増幅させた遺伝子断片（検体）をプラスミ
ドにクローニングし、次いでダイデオキシ法、マキサム
−ギルバート法などに従って、直接塩基配列をシーケン
スすることにより、また簡便には市販のシークエンスキ
ットなどを用いてヌクレオチド配列を決定することによ
り実施できる。かくして、ヒトIKAP遺伝子のコード領域
における前述した特定部位の変異の存在を決定でき、ま
たそのハプロタイプを決定できる。In this preferred method, most basically, for example, a gene fragment (sample) amplified by, for example, PCR is cloned into a plasmid, and then the nucleotide sequence is directly sequenced according to the dideoxy method, the Maxam-Gilbert method, or the like. This can be carried out by simply determining the nucleotide sequence using a commercially available sequencing kit or the like. Thus, the presence of the aforementioned mutation at the specific site in the coding region of the human IKAP gene can be determined, and its haplotype can be determined.

【００４０】上記方法および以下に示す各方法におい
て、検体としてのPCR法で増幅させるDNA断片は、前述し
た変異の存在が想定される特定部位の少なくとも1つを
含む限り特に限定されるものではないが、通常、約50か
ら数千塩基の長さ、好ましくは50から数百塩基の長さを
有するものであるのがよく、特に少なくとも前記変異箇
所の全てを含むものであるのが好ましい。 (2) 対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド−ドットプ
ロット分析 本発明に係る検出方法の別法としては、対立遺伝子特異
的オリゴヌクレオチド(ASO)ドットブロット法(Conner,
B.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 80,278-282(1
983))に従う方法を挙げることができる。該方法は、例
えば目的とするSNPを挟むように設計したフォワード・
プライマーおよびリバース・プライマーを利用して、PC
R増幅した遺伝子断片に対する対立遺伝子特異的オリゴ
ヌクレオチド・プローブにハイブリダイズするDNA断片
を、ドット・ブロット分析することにより実施できる。
かくして、該断片中にSNPが存在するか否かを決定する
ことができる。 (3) 一塩基伸長法 本発明IKAP遺伝子多型（SNPsまたはハプロタイプ）の検
出は、また、スナップショット法、ピロシーケンス法、
特開平2000-279197号に開示の点変異検出法のような一
塩基伸長法を用いて実施することもできる。これらの場
合、目的の変異(SNP)の直前の塩基または数塩基前の塩
基に対応するように設定したプローブ、即ち、その3'末
端を検出目的である変異の1塩基上流または近傍に設定
したプローブをDNA検体にアニーリングさせることがで
きる。上記各方法は、市販のSNPs検出用キットおよび該
キットに添付のソフトウエアを利用して実施することが
できる。In the above method and each of the following methods, the DNA fragment to be amplified by the PCR method as a specimen is not particularly limited as long as it contains at least one of the specific sites where the above-mentioned mutation is assumed to be present. However, it is usually preferable to have a length of about 50 to several thousand bases, preferably 50 to several hundred bases, and particularly preferable to include at least all of the above mutation sites. (2) Allele-specific oligonucleotide-dot plot analysis As another method of the detection method according to the present invention, allele-specific oligonucleotide (ASO) dot blot method (Conner,
BJ, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 278-282 (1
983)). The method is, for example, a forward SNP designed to sandwich the target SNP.
Using primer and reverse primer, PC
This can be done by dot blot analysis of DNA fragments that hybridize to the allele-specific oligonucleotide probe for the R-amplified gene fragment.
Thus, it can be determined whether an SNP is present in the fragment. (3) Single nucleotide extension method The detection of the polymorphism (SNPs or haplotype) of the IKAP gene of the present invention can be performed by a snapshot method, a pyrosequence method,
It can also be carried out using a single base extension method such as the point mutation detection method disclosed in JP-A-2000-279197. In these cases, the probe was set to correspond to the base immediately before the target mutation (SNP) or the base several bases before, that is, the 3 ′ end was set one base upstream or near the mutation to be detected. The probe can be annealed to the DNA sample. Each of the above methods can be carried out using a commercially available kit for detecting SNPs and software attached to the kit.

【００４１】例えばスナップショット法は、ABI PRISM
SNaPshot ddNTP Primer ExtensionKit(ABIバイオシステ
ムズ社製)を用いて実施できる。SNPsは、反応後に生成
した蛍光フラグメントを、ABI PRISM310/337/3100/3700
DNA Analyzer(いずれもABIバイオシステムズ社製)とGen
eScanソフトウエアを用いて検出・解析できる。For example, ABI PRISM
It can be performed using SNaPshot ddNTP Primer Extension Kit (manufactured by ABI Biosystems). SNPs convert the fluorescent fragments generated after the reaction into ABI PRISM310 / 337/3100/3700
DNA Analyzer (both from ABI Biosystems) and Gen
Can be detected and analyzed using eScan software.

【００４２】ピロシーケンス法は、例えば、以下のごと
くして実施できる。即ち、血液サンプルなどから常法に
よりゲノムDNAを単離し、ビオチン標識したプライマー
を用いて変異を含む数十から数百塩基をPCR増幅させ、
マグネットビーズを用いて一本鎖DNAを精製し、この精
製DNAを検体とする。該検体に、所望の変異の数塩基上
流からシーケンスするように設定したプライマーをアニ
リングさせ、次いでソフトウェアに入力された変異付近
のシーケンスに従って装置に1種類ずつdNTPを添加す
る。DNAポリメラーゼが塩基伸長するとピロリン酸(PPi)
を生成するので、該PPiをスルフリラーゼ(Sulfurylase)
によりATPに返還させ、これをルシフェラーゼの基質と
して発光検出器、CCDカメラなどを用いて化学発光を検
出する。かくして、添加したdNTPに応じて得られる発光
のピークを解析することによって遺伝子のタイピングが
可能となる。該方法を用いれば、96サンプルを15分ほど
でタイピングすることができる。The pyrosequence method can be implemented, for example, as follows. That is, genomic DNA is isolated by a conventional method from a blood sample or the like, and tens to hundreds of bases containing mutations are amplified by PCR using biotin-labeled primers,
Single-stranded DNA is purified using magnet beads, and this purified DNA is used as a sample. The sample is annealed with a primer set to sequence from several bases upstream of the desired mutation, and then dNTPs are added to the device one by one according to the sequence near the mutation input to the software. Pyrophosphate (PPi) when DNA polymerase base elongates
To produce the PPi, sulfurylase (Sulfurylase)
And chemiluminescence is detected using a luminescence detector or a CCD camera as a substrate for luciferase. Thus, gene typing becomes possible by analyzing the luminescence peak obtained according to the added dNTP. Using this method, 96 samples can be typed in about 15 minutes.

【００４３】上記方法において試薬および装置として
は、通常のもの、例えばDNAポリメラーゼ、ATP-スルフ
リラーゼ、ルシフェラーゼおよびアピラーゼ(apyrase)
の4種の酵素混合液、ルシフェリンおよびAPS（アデノシ
ン5'硫酸リン酸）からなる基質液、dATP(デオキシアデ
ノシンα−チオ・３リン酸)、dCTP、dGTPおよびdTTPか
らなるdNTPを構成要素とする市販のSNP Reagent Kits(P
yrosequencing AB社製)などの試薬、並びに自動DNA配列
分析のためのPSQ96システム(Pyrosequencing AB社製)お
よびその使用のためのSNPソフトウェア(Pyrosequencing
AB社製)を用いることができる。In the above-mentioned method, the reagents and the equipment used are usually those such as DNA polymerase, ATP-sulfurylase, luciferase and apyrase.
A mixture of four kinds of enzymes, a substrate solution composed of luciferin and APS (adenosine 5 'sulfate phosphate), a dNTP composed of dATP (deoxyadenosine α-thiotriphosphate), dCTP, dGTP and dTTP. Commercially available SNP Reagent Kits (P
reagents such as yrosequencing AB) and PSQ96 system (Pyrosequencing AB) for automatic DNA sequence analysis and SNP software (Pyrosequencing) for its use
AB) can be used.

【００４４】また、上記ピロシーケンス法は、例えば米
国特許第6,159,693号の記載に従って、核酸を単離後、
増幅し、増幅したPCR産物を精製後、READITTM System
(プロメガ・コーポレーション社製)を用いて、これにピ
ロリン酸を反応させ、得られデータを分析することによ
っても実施できる。このデータ分析には、例えば市販の
READIT技術(プロメガ・コーポレーション社製)を利用し
たExcel分析を採用できる。 (4) PCR-単鎖高次構造多型(SSCP)分析法 更に、本発明に係る検出法には、前述したPCR増幅産物
(一本鎖DNA）を非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
して、その移動度の差異により一塩基変異の有無を識別
するPCR-SSCP法（Orita, M., Iwahara, H., et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2776-2770(1989)）を
採用することもできる。 (5) PCR-制限酵素断片長多型（RFLP）分析法 本発明IKAP遺伝子のSNPsまたはハプロタイプの検出にあ
たり、検出目的とする変異を含む核酸配列が制限酵素認
識部位を含んでいる場合には、該検出は、制限酵素断片
長多型分析法（RFLP法: Botstein, D. R. , et al., A
m. J. Hum. Gen., 32, 314-331(1980)）によることもで
きる。Further, the above-mentioned pyrosequencing method can be used, for example, after isolating a nucleic acid as described in US Pat. No. 6,159,693.
After amplifying and purifying the amplified PCR product, the READIT ™ System
(Promega Corporation), and pyrophosphoric acid is reacted therewith, and the obtained data is analyzed. For this data analysis, for example,
Excel analysis using READIT technology (promega corporation) can be adopted. (4) PCR-single-chain higher-order structural polymorphism (SSCP) analysis method Furthermore, the detection method according to the present invention includes the PCR amplification product described above.
(Single-stranded DNA) by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, and PCR-SSCP method (Orita, M., Iwahara, H., et al., Pr
Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2776-2770 (1989)). (5) PCR-restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP) analysis method In the detection of SNPs or haplotypes of the present IKAP gene, when the nucleic acid sequence containing the mutation to be detected contains a restriction enzyme recognition site, The detection was performed by restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP method: Botstein, DR, et al., A
m. J. Hum. Gen., 32, 314-331 (1980)).

【００４５】即ち、例えば本発明で特定された小児気管
支喘息と連鎖不平衡を示したヒトIKAP遺伝子の変異（C3
473T(Pro1158Leu)）の場合、ヒトIKAP遺伝子の塩基配列
3468〜3473位の領域に制限酵素Nla IVの特異的切断サイ
ト（GGNNCC）を生じさせるため、この変異はRFLP法によ
って検出することができる。That is, for example, a mutation in the human IKAP gene showing linkage disequilibrium with the childhood bronchial asthma specified in the present invention (C3
473T (Pro1158Leu)), the nucleotide sequence of the human IKAP gene
This mutation can be detected by the RFLP method in order to generate a specific cleavage site (GGNNCC) for the restriction enzyme Nla IV in the region at positions 3468 to 3473.

【００４６】かかるRFLP法に用いられる酵素は、目的と
するそれぞれの変異箇所の前後配列を認識し得る各種公
知の制限酵素であればよい。その具体例としては、例え
ばNla IVが例示できる。The enzyme used in the RFLP method may be any of various known restriction enzymes capable of recognizing the sequence before and after each target mutation site. A specific example thereof is, for example, Nla IV.

【００４７】該RFLP法は、より好適には、PCR-RFLP法、
即ち、予めPCR法またはその変法などによって検体DNAを
増幅・調製後、多量に調製され且つ濃縮された検体DNA
についてRFLP法を実施する方法によることができる。か
くして、特異的切断サイトの存在の有無を検出すること
ができる。The RFLP method is more preferably a PCR-RFLP method,
That is, after amplifying and preparing the sample DNA in advance by the PCR method or a modification thereof, a large amount of the sample DNA is prepared and concentrated.
For the RFLP method. Thus, the presence or absence of a specific cleavage site can be detected.

【００４８】PCR-RFLP法による本発明IKAP遺伝子のSNPs
またはハプロタイプの検出は、より具体的には例えば次
の方法に従って行われる。即ち、まず、ヒト生体試料か
らIKAP遺伝子のDNAを抽出し、該遺伝子のコード領域の
塩基配列番号3473番の位置を含む数十から数百塩基長の
DNA断片を増幅し、多量に且つ濃縮された検体サンプル
を得る。次いで、増幅DNA検体を制限酵素Nla IVを用い
て消化し、DNAの切断様式（切断の有無、切断フラグメ
ントの塩基長など）を常法に従って確認する。所望の変
異（C3473T(Pro1158Leu)）を有する増幅DNAは、上記Nla
IV消化により２つのフラグメントを生じるが、この変
異を有しない増幅DNAはかかるフラグメントを生じない
ため、当該方法によって本発明遺伝子の変異を検出でき
る。 (6) インベーダー法 本発明IKAP遺伝子のSNPsまたはハプロタイプの検出は、
また以下に示すインベーダー(Invader)法および定量的
リアルタイムPCR検出法(TaqMan法)により実施すること
もできる。SNPs of IKAP gene of the present invention by PCR-RFLP method
Alternatively, the detection of the haplotype is more specifically performed, for example, according to the following method. That is, first, DNA of the IKAP gene is extracted from a human biological sample, and several tens to several hundreds of nucleotides in length including the position of the nucleotide sequence No. 3473 in the coding region of the gene are extracted.
Amplify the DNA fragment to obtain a large and concentrated specimen sample. Next, the amplified DNA sample is digested with the restriction enzyme Nla IV, and the mode of DNA cleavage (presence or absence of cleavage, base length of the cleavage fragment, etc.) is confirmed according to a conventional method. The amplified DNA having the desired mutation (C3473T (Pro1158Leu)) was
Although two fragments are generated by IV digestion, amplified DNA not having this mutation does not generate such a fragment, and thus the mutation of the gene of the present invention can be detected by this method. (6) Invader method Detection of SNPs or haplotypes of the IKAP gene of the present invention,
It can also be carried out by the Invader method and the quantitative real-time PCR detection method (TaqMan method) described below.

【００４９】インベーダー法の実施には、以下の文献が
参照できる。 ・Lyamichev, V., et al., Nat. Bioltechnol., 17(3)2
92-296(1999)および ・国際特許公開WO9823774号(98/6/4)。The following documents can be referred to for implementing the invader method.・ Lyamichev, V., et al., Nat.Bioltechnol., 17 (3) 2
92-296 (1999) and WO9823774 (98/6/4).

【００５０】該方法は、ゲノムDNAのSNPsを分析するの
に予め標的DNAを増幅する必要がない方法であって、以
下のごとくして実施される。This method does not require the amplification of the target DNA in advance to analyze SNPs of genomic DNA, and is carried out as follows.

【００５１】目的とするIKAP遺伝子のSNPsが存在するか
どうかを検出するために、先ずゲノムDNAを単離した
後、15から50塩基長からなる5'フラップと検出したい核
酸(本発明ではSNP)を5'フラップの3'端に配し、変異核
酸以外は標的ゲノムDNAに相補するように合成された30
から数百塩基のオリゴヌクレオチドからなる第一の標的
プローブと、検出したい核酸に相補的な核酸を3'端に配
する以外は、標的ゲノムDNAに相補するように合成され
た15から数十塩基長のオリゴヌクレオチドからなるイン
ベーダー・オリゴヌクレオチド・プローブとを、例えば
自動合成機により合成する。これらのプローブに、単離
したゲノムDNAおよび第一のプローブの5'フラップを切
断する酵素を同時に加えて適当な反応液中で反応させ
る。In order to detect whether or not SNPs of the desired IKAP gene are present, genomic DNA is first isolated, and then a 5 ′ flap having a length of 15 to 50 bases and a nucleic acid to be detected (SNP in the present invention) Was placed at the 3 'end of the 5' flap, and was synthesized to complement the target genomic DNA except for the mutant nucleic acid.
A first target probe consisting of an oligonucleotide of several hundred bases, and a nucleic acid complementary to the nucleic acid to be detected is arranged at the 3 ′ end, except that the nucleic acid is synthesized to complement the target genomic DNA with 15 to several tens of bases. An invader oligonucleotide probe consisting of a long oligonucleotide is synthesized by, for example, an automatic synthesizer. An isolated genomic DNA and an enzyme that cleaves the 5 ′ flap of the first probe are simultaneously added to these probes and reacted in an appropriate reaction solution.

【００５２】もし検体中のゲノムDNAが所望の変異核酸
(本発明の場合は、SNP)を有している場合は、変異核酸
を3'端に有する5'フラップを遊離する第一の反応が終了
する。もし、検体中のゲノムDNAが変異核酸配列を有し
ていない場合は、前記制限酵素による切断が生じない。If the genomic DNA in the sample is a desired mutant nucleic acid
(SNP in the case of the present invention), the first reaction for releasing the 5 ′ flap having the mutant nucleic acid at the 3 ′ end is terminated. If the genomic DNA in the sample does not have a mutant nucleic acid sequence, cleavage by the restriction enzyme does not occur.

【００５３】制限酵素で切断された第一のプローブから
遊離した5'フラップは、標的として蛍光共鳴エネルギー
移転(FRET)プローブに相補的に結合し、5'フラップの3'
端がFRETプローブ内に侵入(invasion)する。同様に、制
限酵素による反応が起こり、蛍光色素が遊離する。The 5 ′ flap released from the first probe cleaved by the restriction enzyme binds complementarily to the fluorescence resonance energy transfer (FRET) probe as a target, and 3 ′ of the 5 ′ flap.
The ends invasion into the FRET probe. Similarly, the reaction by the restriction enzyme occurs, releasing the fluorescent dye.

【００５４】次いで第二の反応に用いられる各FRETプロ
ーブは、検出される標的にもかかわらず、同一の配列を
含んでいて、本質的に2つのエレメントからなるように
構築される：(1)第一の反応から割裂した産物に相補す
る3'領域、(2)一本鎖プローブを模倣するために複式を
形成し、そして標的が共にハイブリダイズして、それら
がレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素を含んで
いる自家相補的領域。Each FRET probe used in the second reaction is then constructed to contain the same sequence, regardless of the target to be detected, and consist essentially of two elements: (1) The 3 'region complementary to the product cleaved from the first reaction, (2) forming a duplex to mimic a single-stranded probe, and the targets hybridizing together, resulting in a reporter fluorescent dye and quencher fluorescence Self-complementary regions containing the dye.

【００５５】前記レポーター蛍光色素は、該レポーター
蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブ
に結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によ
りその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素
と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度
が抑制されないものである。従って、切断された第一の
プローブ・オリゴからの遊離した5'フラップが、FRETプ
ローブにハイブリダイズしたとき、それは第二の反応に
おいてインベーダー・オリゴとして作用し、制限酵素に
よって認識された侵入複合物を産生する。かくして、FR
ETプローブの制限酵素による切断が、二つの蛍光色素を
分離し、検出可能な蛍光シグナルを産生する。このよう
にして標準蛍光マイクロタイタープレート読み取り機器
が産物を読み取り検出することができる。第一と第二の
反応の組み合わせにより、シグナルを1から1×106倍ま
で増幅することができる。本発明においては所望のSNPs
の有無についてあるいはハプロタイプについて、インベ
ーダー・アッセイ法を用いることによっても検出するこ
とが可能である。 (7) 定量的リアルタイムPCR検出法 本発明IKAP遺伝子多型の検出は、また定量的リアルタイ
ムPCR検出法(TaqMan法)によっても簡便に実施すること
ができる。When the reporter fluorescent dye is bound to the same probe as the quencher fluorescent dye, the fluorescence intensity of the reporter fluorescent dye is suppressed by fluorescence resonance energy transfer, and the same as the quencher fluorescent dye. When the probe is not bound to the probe, the fluorescence intensity is not suppressed. Thus, when the free 5 'flap from the cleaved first probe oligo hybridizes to the FRET probe, it acts as an invader oligo in the second reaction and the invading complex recognized by the restriction enzyme To produce Thus, FR
Restriction cleavage of the ET probe separates the two fluorescent dyes and produces a detectable fluorescent signal. In this way, a standard fluorescence microtiter plate reader can read and detect the product. The combination of the first and second reactions can amplify the signal from 1 to 1 × 10 6 -fold. In the present invention, the desired SNPs
The presence or absence of haplotype can also be detected by using an invader assay. (7) Quantitative real-time PCR detection method The polymorphism of the IKAP gene of the present invention can be easily detected by a quantitative real-time PCR detection method (TaqMan method).

【００５６】該方法は、以下のごとくして実施できる。
即ち、まず、目的とする変異の有無を検出する核酸部位
を含むDNA断片を15塩基ないし39塩基からなるフォワー
ド側プライマーとリバース側プライマーを作成する。但
し、フォワード側プライマーとリバース側プライマーと
も目的とする変異の有無を検出する核酸部位を含むまな
いように作成する。次いで、15塩基ないし50塩基からな
る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドにレポーター蛍
光色素とクエンチャー蛍光色素とが結合されており且つ
フォワード側プライマーがハイブリダイズする領域とプ
ローブがハイブリダイズする領域が互いに重複すること
がない組み合わせを選択したプローブを作成する。該プ
ローブは、目的とする一塩基の核酸変異の有無を検出す
るための対立遺伝子特異的配列に相補的な配列を有する
ように作成する。該プローブを用いて、検体中の測定す
べきIKAP遺伝子の所望のDNA断片領域を鋳型として逆転
写PCR(RT-PCR)を行い、反応液からの蛍光をリアルタイ
ムに測定する。かくして、変異の有無を検出することが
できる。The method can be carried out as follows.
That is, first, a DNA fragment containing a nucleic acid site for detecting the presence or absence of a target mutation is prepared with a forward primer and a reverse primer consisting of 15 to 39 bases. However, both the forward primer and the reverse primer are prepared so as not to include a nucleic acid site for detecting the presence or absence of a target mutation. Next, a reporter fluorescent dye and a quencher fluorescent dye are bound to an oligonucleotide having a base sequence consisting of 15 to 50 bases, and the region where the forward primer hybridizes and the region where the probe hybridizes overlap each other. Create a probe with a combination that has never been selected. The probe is prepared so as to have a sequence complementary to an allele-specific sequence for detecting the presence or absence of a target single-base nucleic acid mutation. Using the probe, reverse transcription PCR (RT-PCR) is performed using the desired DNA fragment region of the IKAP gene to be measured in the sample as a template, and the fluorescence from the reaction solution is measured in real time. Thus, the presence or absence of the mutation can be detected.

【００５７】上記インベーダーアッセイやTaqMan法に用
いられるレポーター蛍光色素としては、FAM(6-カルボキ
シ-フルオレッセイン)のようなフルオレッセイン系蛍光
色素が好ましく、クエンチャー蛍光色素としては、TAMR
A(6-カルボキシ-テトラメチル-ローダミン）のようなロ
ーダミン系蛍光色素が好ましい。これらの蛍光色素は公
知であり、市販のリアルタイム検出PCR用キットに含ま
れているのでそれを用いることができる。レポーター蛍
光色素及びクエンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定
されないが、通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の
一端（好ましくは5'末端）にレポーター蛍光色素が、他
端にクエンチャー蛍光色素が結合される。なお、オリゴ
ヌクレオチドに蛍光色素を結合する方法は公知であり、
例えばNoble et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:3387
-3403及びIyer et al., (1990)J. Am. Chem. Soc. 112:
1253-1254 に記載されている。As a reporter fluorescent dye used in the above invader assay or TaqMan method, a fluorescein-based fluorescent dye such as FAM (6-carboxy-fluorescein) is preferable, and as a quencher fluorescent dye, TAMR is used.
Rhodamine-based fluorescent dyes such as A (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) are preferred. These fluorescent dyes are known and can be used because they are contained in a commercially available kit for real-time detection PCR. The binding positions of the reporter fluorescent dye and the quencher fluorescent dye are not particularly limited, but usually, the reporter fluorescent dye is bound to one end (preferably the 5 'end) of the oligonucleotide portion of the probe, and the quencher fluorescent dye is bound to the other end. . Incidentally, a method of binding a fluorescent dye to the oligonucleotide is known,
For example, Noble et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12: 3387
-3403 and Iyer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:
1253-1254.

【００５８】リアルタイム検出PCR法自体は公知であ
り、そのための装置及びキットも市販されているので、
本発明ではこのような市販の装置及びキットを用いるこ
ともできる。例えば特許第2825976号に記載の方法に従
うか、PEバイオシステムズ社製のABI PRISM 7700配列決
定システム・ユーザーマニュアルに従い実施できる。 (7) その他の検出法 本発明IKAP遺伝子のSNPsまたはハプロタイプの検出は、
更に従来より一般にDNAについてその塩基配列の決定法
として、また変異の検出法として知られている、以下に
挙げる如き各種の方法によって実施することもできる。 (a) 配列特異的オリゴヌクレオチドを用いるPCR-SSO
法；各変異に対するプローブを担体に固相化し、これに
検体(遺伝子増幅産物)をハイブリダイズさせ、ミスマッ
チの有無によるハイブリダゼーションの効率の差を判定
するもの。 (b) 点変異を検出するPCR-SSP法；点変異に対応する塩
基を3'末端に設定した遺伝子増幅用配列特異的プライマ
ーを用いて、プライマーの3'末端が相補的であるか否か
によってPCRによる増幅効率に著しい差が生じることを
利用したもの。 (c) PCR-DGGE(変性剤濃度勾配ゲル電気泳動)法；変異D
NA断片と正常DNA断片とを混合してハイブリッド結合さ
せた後、尿素、ホルムアミドなどの変性剤の濃度が徐々
に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動
すると、ミスマッチのないホモ2本鎖に比べて、より低
い濃度の変性剤の位置で1本鎖に解離する。1本鎖DNA
は、2本鎖DNAに比べて泳動速度が速いため、移動度の差
を比較することで1塩基の変異を検出することができ
る。 (d) PCR-DGGE/GCクランプ法(Shefield,V.C.,et al., P
roc. Natl. Acad. Sci.USA,86,232-236(1989))；上記PC
R-DGGE法に加えて、GC含量の高い領域を変異核酸の検出
対象であるDNA断片につなげることにより複数の塩基置
換、欠失、付加および挿入がある場合の検出の欠点を補
った方法である。該方法は特に変異検出の対象DNA断片
にGCクランプを付加する工程を必要とする。 (e) RNase保護アッセイ法(Finkelstein,J., et al., G
enomics, 7, 167-172(1990)) (f) in situ RT-PCR(Nucl. Acids Res., 21, 3159-316
6 (1993)) (g) in situ ハイブリダイゼーション (h) サザンブロッティング(Sambrook, J., et al., Mo
lecular Cloning a Laboratory Manual. Cold Spring H
arbor Laboratory Press:NY.(1989)) (i)ドットハイブリダイゼーション法（Southern, E. M.
, J. Mol. Biol., 98:503-517 (1975)など参照）、 (j) 蛍光in situ ハイブリダイゼーション(FISH:Takah
ashi E., et al., Hum.Genet., 86, 1416 (1990)) (k) 競合的ゲノミック・ハイブリダイゼーション(Comp
arative Genomic Hybridization:CGH: Kallioneimi,
A.,et al., Science, 258,818-821(1992))、(Spectral
karyotyping: SKY: Rowley,J.D., et al.,Blood, 93, 2
038-2042(1999)) (l) 酵母人工染色体（YAC）ベクターのクローンをプロ
ーブとする方法(Lengauer, C., et al., Cancer Res.,
52, 2590-2596(1992))。Since the real-time detection PCR method itself is known, and an apparatus and a kit therefor are commercially available,
In the present invention, such commercially available devices and kits can also be used. For example, the method can be carried out according to the method described in Japanese Patent No. 2825976 or according to the ABI PRISM 7700 Sequencing System User Manual manufactured by PE Biosystems. (7) Other detection methods Detection of SNPs or haplotypes of the IKAP gene of the present invention,
Furthermore, it can also be carried out by the following various methods conventionally known generally as a method for determining the base sequence of DNA and a method for detecting mutation. (a) PCR-SSO using sequence-specific oligonucleotide
Method: A method in which a probe for each mutation is immobilized on a carrier, and a sample (gene amplification product) is hybridized to the carrier to determine a difference in hybridization efficiency depending on the presence or absence of a mismatch. (b) PCR-SSP method for detecting a point mutation; using a sequence-specific primer for gene amplification in which a base corresponding to the point mutation is set at the 3 ′ end, whether or not the 3 ′ end of the primer is complementary This method utilizes a significant difference in the amplification efficiency by PCR. (c) PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) method; mutation D
After mixing and hybridizing the NA fragment and the normal DNA fragment, electrophoresis in a polyacrylamide gel in which the concentration of denaturing agents such as urea and formamide is gradually increasing yields a homoduplex without mismatch. In comparison, dissociation into single strands occurs at lower denaturant locations. Single-stranded DNA
Has a higher electrophoretic speed than double-stranded DNA, so that a single-base mutation can be detected by comparing the difference in mobility. (d) PCR-DGGE / GC clamp method (Shefield, VC, et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 232-236 (1989));
In addition to the R-DGGE method, a method that compensates for the shortcomings of detection when there are multiple base substitutions, deletions, additions, and insertions by connecting a region with a high GC content to the DNA is there. The method particularly requires a step of adding a GC clamp to a DNA fragment to be subjected to mutation detection. (e) RNase protection assay (Finkelstein, J., et al., G
enomics, 7, 167-172 (1990)) (f) In situ RT-PCR (Nucl. Acids Res., 21, 3159-316)
6 (1993)) (g) In situ hybridization (h) Southern blotting (Sambrook, J., et al., Mo.
lecular Cloning a Laboratory Manual. Cold Spring H
arbor Laboratory Press: NY. (1989)) (i) Dot hybridization method (Southern, EM
, J. Mol. Biol., 98: 503-517 (1975)), (j) Fluorescence in situ hybridization (FISH: Takah
ashi E., et al., Hum.Genet., 86, 1416 (1990)) (k) Competitive genomic hybridization (Comp.
arative Genomic Hybridization: CGH: Kallioneimi,
A., et al., Science, 258, 818-821 (1992)), (Spectral
karyotyping: SKY: Rowley, JD, et al., Blood, 93, 2
038-2042 (1999)) (l) Method using a yeast artificial chromosome (YAC) vector clone as a probe (Lengauer, C., et al., Cancer Res.,
52, 2590-2596 (1992)).

【００５９】かくして、本発明方法によれば、検体にお
ける気管支喘息発症を引き起こすかまたは当該ヒトの子
孫に先天性に気管支喘息発症性を伝達する可能性を有す
る遺伝的変異を含む多型、即ち気管支喘息発症危険因子
の存在を検出することができる。特に、本発明に従うヒ
トIKAP遺伝子のTGAAATハプロタイプの検出は、ヒト小児
気管支喘息発症危険因子の存在の検出に有効であり、該
ハプロタイプの検出によってヒト小児気管支喘息の発症
危険因子の早期検出が可能である。Thus, according to the method of the present invention, a polymorphism comprising a genetic mutation which has the potential to cause bronchial asthma in a subject or to congenitally transmit bronchial asthma to a progeny of the human, ie bronchial The presence of asthma risk factors can be detected. In particular, the detection of the TGAAAT haplotype of the human IKAP gene according to the present invention is effective for detecting the presence of a human childhood bronchial asthma development risk factor, and the detection of the human pediatric bronchial asthma development risk factor can be performed early by the detection of the haplotype. is there.

【００６０】尚、本発明検出方法において、PCR法を採
用する場合、該方法に用いられるプライマーまたはプロ
ーブは、本発明遺伝子における変異部分(SNPsまたはハ
プロタイプ)を含む領域のみを特異的に増幅できるもの
である限り、特に制限はなく、本発明遺伝子の配列情報
に基いて常法に従って適宜合成、構築することができ
る。例えば、ホスホルアミダイト法またはリン酸トリエ
ステル法による化学合成によることもでき、市販されて
いる自動オリゴヌクレオチド合成装置、例えば(Pharmac
ia LKB Gene Assembler Plus: ファルマシア社製)など
を使用して合成することもできる。二本鎖断片は、相補
鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさ
せるかまたは適当なプライマー配列と共にDNAポリメラ
ーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した
一本鎖生成物から得ることができる。When the PCR method is employed in the detection method of the present invention, primers or probes used in the PCR method can specifically amplify only a region containing a mutated portion (SNPs or haplotype) in the gene of the present invention. There is no particular limitation, as long as it can be synthesized and constructed appropriately according to a conventional method based on the sequence information of the gene of the present invention. For example, chemical synthesis by the phosphoramidite method or the phosphate triester method can be used, and a commercially available automatic oligonucleotide synthesizer such as (Pharmac
ia LKB Gene Assembler Plus: manufactured by Pharmacia) or the like. Double-stranded fragments are chemically synthesized single-stranded products, either by synthesizing the complementary strand and either annealing the strands together under appropriate conditions or adding the complementary strand using a DNA polymerase with appropriate primer sequences. Can be obtained from

【００６１】通常、プライマーまたはプローブは、少な
くとも10個の連続した塩基を有するものであることがで
きる。通常、10〜35塩基程度の長さを有するのが好まし
い。またプライマー対は、本発明遺伝子のハプロタイプ
配列のSNPを挟むように設計、合成されたヌクレオチド
配列を有するものであることができる。プローブとして
用いられるヌクレオチド配列としては、これらの部分ヌ
クレオチド配列を含む陽性クローンそれ自体を用いるこ
ともできる。Usually, a primer or a probe can have at least 10 consecutive bases. Usually, it is preferable to have a length of about 10 to 35 bases. Further, the primer pair may have a nucleotide sequence designed and synthesized so as to sandwich the SNP of the haplotype sequence of the gene of the present invention. As a nucleotide sequence used as a probe, a positive clone itself containing these partial nucleotide sequences can also be used.

【００６２】前記プローブまたはプライマーとして用い
られるヌクレオチドの好適なものとしては、ヒトIKAP遺
伝子のコード領域の819番目のTがCに変異した変異、229
5番目のGがAに変異した変異、2446番目のAがCに変異し
た変異、2490番目のAがGに変異した変異、3214番目のT
がAに変異した変異および3473番目のCがTに変異した変
異のいずれかの変異を含むように設定されたDNAに対応
する部分ヌクレオチドであって、少なくとも10個、より
好ましくは少なくとも15個の連続した塩基を有するもの
を挙げることができる。Preferable nucleotides used as the probe or primer include mutations in which T at position 819 in the coding region of the human IKAP gene has been mutated to C,
Mutation in which the fifth G is mutated to A, mutation in which the 2446th A is mutated to C, mutation in which the 2490th A is mutated to G, and 3214th T
Is a partial nucleotide corresponding to the DNA set to include any mutation of the mutation mutated to A and the mutation of the 3473th C was mutated to T, at least 10, more preferably at least 15 Those having a continuous base can be mentioned.

【００６３】このように、本発明は、IKAP遺伝子のSNPs
またはハプロタイプを検出するための特異プライマーお
よび／または特異プローブとして使用されるDNA断片を
も提供するものである。その具体例としては、後記実施
例に示される配列番号19から30のフォワード・プライマ
ーおよびリバース・プライマー並びに配列番号30から36
で示される対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド・プロ
ーブを例示できる。As described above, the present invention relates to the SNPs of the IKAP gene.
Alternatively, the present invention also provides a DNA fragment used as a specific primer and / or a specific probe for detecting a haplotype. Specific examples thereof include forward primers and reverse primers of SEQ ID NOs: 19 to 30 and SEQ ID NOs: 30 to 36 shown in Examples described later.
Can be exemplified.

【００６４】また、本発明方法は、気管支喘息発症の危
険因子、特に小児気管支喘息発症の危険因子としてのIK
AP遺伝子多型の検出を行うものであり、従って、検出用
の遺伝子特異的プローブは、T819C(Leu273Leu)、G2295A
(Gly765Gly)、A2446C(Ile816Leu)、A2490G(Ile830Me
t)、T3214A(Cys1072Ser)およびC3473T(Pro1158Leu)のい
ずれかのSNPを検出できるものであるのがよい。本発明
遺伝子にはかかる検出用遺伝子特異的プローブも包含さ
れる。In addition, the method of the present invention provides a risk factor for the development of bronchial asthma, particularly IK as a risk factor for the development of bronchial asthma in children.
AP gene polymorphism is to be detected, and therefore, a gene-specific probe for detection is T819C (Leu273Leu), G2295A
(Gly765Gly), A2446C (Ile816Leu), A2490G (Ile830Me
t), T3214A (Cys1072Ser) and C3473T (Pro1158Leu) can be detected. The gene of the present invention also includes such a gene-specific probe for detection.

【００６５】特に小児気管支喘息の検出のためのプロー
ブは、T3214A(Cys1072Ser)およびC3473T(Pro1158Leu)の
いずれかのSNPを検出できるものが好ましく、成人気管
支喘息の検出のためのプローブは、T3214A(Cys1072Ser)
を検出できるものが好ましい。In particular, a probe for detecting bronchial asthma in children is preferably a probe capable of detecting either SNP of T3214A (Cys1072Ser) or C3473T (Pro1158Leu), and a probe for detection of adult bronchial asthma is T3214A (Cys1072Ser )
Is preferable.

【００６６】また、別の本発明遺伝子特異的プローブと
しては、ヒトIKAP遺伝子のコード領域の819番目、2295
番目、2446番目および2490番目の核酸がそれぞれT、G、
AおよびAであり且つ3214番目のTがAに変異した変異およ
び3473番目のCがTに変異した変異からなるTGAAATハプロ
タイプを検出するように作成した遺伝子特異的プローブ
を挙げることができる。Further, another gene-specific probe of the present invention includes 2295, 2295 in the coding region of the human IKAP gene.
, The 2446th and 2490th nucleic acids are T, G,
A gene-specific probe prepared to detect a TGAAAT haplotype comprising A and a mutation in which the T at position 3214 was mutated to A and a mutation at position 3347 where C was mutated to T can be mentioned.

【００６７】本発明検出方法は、検体中のヒトIKAP遺伝
子のSNPsまたはヒトIKAP遺伝子のTGAAATハプロタイプの
検出のための試薬キットを利用することによって、より
簡便に実施することができる。本発明はかかる検出用キ
ットをも提供する。The detection method of the present invention can be carried out more easily by using a reagent kit for detecting SNPs of the human IKAP gene or TGAAAT haplotype of the human IKAP gene in a sample. The present invention also provides such a kit for detection.

【００６８】本発明キットは、少なくともヒトIKAP遺伝
子の6つのSNPsまたはヒトIKAP遺伝子のTGAAATハプロタ
イプのDNA断片塩基配列もしくはその相補的塩基配列の
一部または全てに、あるいは変異部位の1塩基前または
数塩基前の配列からなる配列に、ハイブリダイズするDN
A断片または変異部位を含む数塩基の核酸配列を認識す
る制限酵素を必須構成成分として含むことを必須とす
る。The kit of the present invention comprises at least six or more SNPs of the human IKAP gene or the nucleotide sequence of the DNA fragment of the TGAAAT haplotype of the human IKAP gene or its complementary nucleotide sequence, or one or a few nucleotides before or at the mutation site. DN that hybridizes to the sequence consisting of the base sequence
It is essential that an A fragment or a restriction enzyme that recognizes a nucleic acid sequence of several bases including a mutation site be included as an essential component.

【００６９】本発明キットにおける他の成分としては、
標識剤、PCR法に必須な試薬（例えば、TaqDNAポリメラ
ーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、DNA増幅用プラ
イマーなど）を例示することができる。標識剤として
は、放射性同位元素または発光または蛍光物質などの化
学修飾物質などが挙げられ、DNA断片自身が予め該標識
剤でコンジュゲートされていてもよい。更に当該試薬キ
ットには、測定の実施の便益のために適当な反応希釈
液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応停止液などが含ま
れていてもよい。Other components in the kit of the present invention include:
Labeling agents and reagents essential for the PCR method (eg, Taq DNA polymerase, deoxynucleotide triphosphate, primers for DNA amplification, etc.) can be exemplified. Examples of the labeling agent include a radioisotope or a chemically modified substance such as a luminescent or fluorescent substance, and the DNA fragment itself may be conjugated with the labeling agent in advance. Further, the reagent kit may contain a suitable reaction diluent, a standard antibody, a buffer, a detergent, a reaction stop solution, etc., for the benefit of performing the measurement.

【００７０】更に、本発明によれば、前記検出方法を利
用してヒトにおける気管支喘息発症を引き起こす可能性
がある遺伝子の多型を検出する、ヒト気管支喘息発症危
険因子の検出方法、特に成人または小児気管支喘息の検
出方法に用いる診断剤並びに診断用キットも提供するこ
とができる。Further, according to the present invention, a method for detecting a human bronchial asthma-onset risk factor, particularly an adult or a human, for detecting a polymorphism in a gene that may cause the onset of bronchial asthma in a human using the above-described detection method A diagnostic agent and a diagnostic kit for use in the method of detecting bronchial asthma in children can also be provided.

【００７１】[0071]

【発明の効果】本発明によれば、ヒト気管支喘息発症危
険因子の検出方法、その検出用キット、それらに利用さ
れる変異検出用プライマーまたはプローブおよびヒト気
管支喘息発症の危険因子に関連する遺伝子が提供され
る。これらはヒト気管支喘息発症危険因子の新しい検出
手段として、殊に小児における気管支喘息発症危険因子
の検出手段として有用である。Industrial Applicability According to the present invention, a method for detecting a human bronchial asthma development risk factor, a kit for the detection thereof, a mutation detection primer or probe used therein, and a gene relating to a human bronchial asthma development risk factor are provided. Provided. These are useful as a new means for detecting human bronchial asthma development risk factors, particularly as detection means for bronchial asthma development risk factors in children.

【００７２】[0072]

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、実
施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.

【００７３】[0073]

【実施例１】a) 対象患者 対象患者は、大阪府立羽曳野病院の小児気管支喘息外来
患者235人である。これらの患者の平均年齢は9.75歳(1-
17歳、男性：女性比＝1.47：1.0、平均IgEレベル1005.9
U/ml)である。これらの患者の多くは、アトピー性喘息
と診断されている。また、大阪府立羽曳野病院の内科か
らの103人、宮武喘息クリニックからの167人を含む全体
で270人の成人気管支喘息患者(平均年齢45.9歳、18-83
歳；男性：女性比＝1.0：1.16）も対象患者とした。成
人患者の20％はアトピー性であったが、血清IgEレベル
は得られなかった。この成人気管支喘息患者には子供の
頃喘息の既往歴が報告されたものは含まれていない。更
に、コントロール（対照）として、人口比率に基づいた
個々から無作為に372人の健常者を選択した。[Example 1] a) Target patients The target patients were 235 outpatients with bronchial asthma in Osaka's Habikino Hospital. The average age of these patients was 9.75 years (1-
17 years old, male: female ratio = 1.47: 1.0, average IgE level 1005.9
U / ml). Many of these patients have been diagnosed with atopic asthma. In addition, a total of 270 adult patients with bronchial asthma (mean age 45.9 years, 18-83), including 103 from the Internal Medicine of Osaka Prefecture Habikino Hospital and 167 from Miyatake Asthma Clinic
Age; male: female ratio = 1.0: 1.16) was also included in the study. Twenty percent of adult patients were atopic but did not have serum IgE levels. This adult bronchial asthma patient does not include those with a reported history of asthma as a child. In addition, 372 healthy individuals were randomly selected from controls based on population ratio as controls.

【００７４】上記対象患者および健常者から、それぞれ
末梢血を採血して、以下の試験に利用した。[0074] Peripheral blood was collected from each of the subject patients and healthy subjects and used for the following tests.

【００７５】尚、すべての気管支喘息患者は、日本アレ
ルギー学会のガイドラインに沿う気管支喘息として診断
されたものであり、疾患の病態は以下の4つのカテゴリ
ーに分類された。1)無投薬、2)クロモグリケート(DSCG)
および／またはテオフィリン、3)400μg/日以下の吸入
グルココルチコイドおよび4)400μg/日以上の吸入グル
ココルチコイド。Incidentally, all patients with bronchial asthma were diagnosed as bronchial asthma in accordance with the guidelines of the Japanese Society of Allergology, and the disease states were classified into the following four categories. 1) no medication, 2) cromoglycate (DSCG)
And / or theophylline, 3) inhaled glucocorticoids of 400 μg / day or less and 4) inhaled glucocorticoids of 400 μg / day or more.

【００７６】また、前記健常者中の51人からcDNAを得、
また、すべての参加者からゲノムDNAsを調製した。 b) 多型のスクリーニング方法：SNPsのスクリーニング
は、大西らの方法(Ohnishi, Y., et al., Hum. Genet.,
106, 288-292 (2000))に従い実施した。Also, cDNA was obtained from 51 of the healthy subjects,
Genomic DNAs were prepared from all participants. b) Screening method for polymorphism: Screening of SNPs was performed according to the method of Onishi et al. (Ohnishi, Y., et al., Hum. Genet.,
106, 288-292 (2000)).

【００７７】ヒトIKAPcDNAの全体のコード領域をスクリ
ーニングするためにGenBank(accession number AF04419
5)から入手したIKAPcDNAの配列情報を参考とする配列番
号2に記載の配列情報に基づいて、配列番号：3から配列
番号：18に示すF1-R1〜F8-R8の8つのプライマー・セッ
トを設定し、各プライマーを自動DNA合成機により合成
した。In order to screen the entire coding region of human IKAP cDNA, GenBank (accession number AF04419) was used.
Based on the sequence information described in SEQ ID NO: 2 with reference to the sequence information of IKAP cDNA obtained from 5), eight primer sets F1-R1 to F8-R8 shown in SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 18 were prepared. After setting, each primer was synthesized by an automatic DNA synthesizer.

【００７８】各PCR反応は、40ngの3つの検体を混合した
cDNAで実施した（3人分のcDNAを1つのチューブでシーク
エンスする方法）。50μlの反応液は、dNTPs(25mM)、塩
化マグネシウム(6.68mM)、16.6mM 硫酸アンモニウム、
6.7mMトリス塩酸(pH8.8)、10mMβ−メルカプトエタノー
ル、2セットのプライマー(各50pmolのF1およびR4とF4お
よびR8)およびEX-Taq(2.5U;タカラ社製)を含んでいた。
各サンプルはGeneAmpPCRシステム9600(PEアプライド・
バイオシステムズ社製)によって増幅した。In each PCR reaction, 40 ng of the three samples were mixed.
The method was performed on cDNA (sequencing of three cDNAs in one tube). 50 μl of the reaction solution contained dNTPs (25 mM), magnesium chloride (6.68 mM), 16.6 mM ammonium sulfate,
It contained 6.7 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM β-mercaptoethanol, two sets of primers (50 pmol each of F1 and R4 and F4 and R8) and EX-Taq (2.5 U; manufactured by Takara).
Each sample was prepared using the GeneAmpPCR System 9600 (PE Applied
Biosystems).

【００７９】PCR反応は、94℃2分の後、94℃30秒、56℃
30秒および72℃30秒を36サイクル行った後、72℃10分間
にて最終の伸長反応を行った。The PCR reaction was carried out at 94 ° C. for 2 minutes, at 94 ° C. for 30 seconds and at 56 ° C.
After 36 cycles of 30 seconds and 72 ° C. for 30 seconds, a final extension reaction was performed at 72 ° C. for 10 minutes.

【００８０】得られた各PCR産物について、ビッグダイ
・ターミネーターRRミックス(BigDye TM Terminator RR
mix:PEアプライド・バイオシステムズ社製)および配列
番号3〜18に示す16のプライマーの中から一つの内側用
プライマーと反応させた。For each of the obtained PCR products,
・ Terminator RR mix (BigDye TM Terminator RR
mix: PE Applied Biosystems) and sequence
For inside one of 16 primers shown in numbers 3 to 18
Reacted with primer.

【００８１】遺伝子多型（SNPs）は、ABIプリズム377DN
A自動シーケンサー(ABI Prism 377DNA autosequencer:
PEアプライド・バイオシステムズ社製)において得られ
た塩基配列情報をもとに、ポリフレッド・プログラム(P
olyphred program: Nickerson, D.A., et al., Nucleic
Acids Res., 25, 2745-2751 (1997))によって確認し
た。 c) 検体の増幅と遺伝子型判定法：すべてのゲノムDNA検
体は、各PCR産物が1または2のSNPsを含んでいるように
配列番号19〜30に示されるフォワード・プライマーおよ
びリバース・プライマーを用いて、GeneAmp PCRシステ
ム9600(PEアプライド・バイオシステムズ社製)において
増幅した。各PCRの温度条件とハイブリダゼーションの
温度と条件は、表2に示される通りである。The gene polymorphisms (SNPs) were analyzed using ABI prism 377DN
A Automatic sequencer (ABI Prism 377 DNA autosequencer:
Based on the nucleotide sequence information obtained at PE Applied Biosystems, the Polyfred Program (P
olyphred program: Nickerson, DA, et al., Nucleic
Acids Res., 25, 2745-2751 (1997)). c) Specimen amplification and genotyping: All genomic DNA specimens should use the forward and reverse primers shown in SEQ ID NOs: 19-30 so that each PCR product contains one or two SNPs. And amplified in GeneAmp PCR System 9600 (manufactured by PE Applied Biosystems). Table 2 shows the temperature conditions and the hybridization temperature and conditions for each PCR.

【００８２】[0082]

【表２】 [Table 2]

【００８３】かくして得られたPCR産物を、製品の手順
書に従いバイオダイン膜(PALL社製)上にドット・ブロッ
トし、UVクロスリンキングによって固定し、その後配列
番号31〜36に示す32P標識した対立遺伝子特異的オリゴ
ヌクレオチド(ASO)を用いてハイブリダイズした。The PCR product thus obtained was dot-blotted on a Biodyne membrane (manufactured by PALL) according to the protocol of the product, fixed by UV cross-linking, and then labeled with 32 P shown in SEQ ID NOs: 31 to 36. Hybridization was performed using an allele-specific oligonucleotide (ASO).

【００８４】対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（AS
O）法の結果を確認するために、同じ材料に対して、PCR
-制限酵素断片長多型(RFLP)分析を実施して、IKAP遺伝
子の3473番目のCからTへの変異を同定した。Allele-specific oligonucleotides (AS
O) To confirm the results of the method, PCR
-Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis was performed to identify the 3473 C to T mutation in the IKAP gene.

【００８５】尚、用いた各反応混合液組成は10μlのPCR
産物、3単位の制限酵素Nla IV(1U/μl;バイオ・ラボInc.
製)、2μlの10×Buffer K(タカラ社製)および15μlの0.
01％BSA(タカラ社製)である。37℃で1時間のインキュベ
ーション後、反応産物は、2％アガロース・ゲル上で電
気泳動した。 d) 結果 51人の日本人対象者において、IKAP遺伝子上の遺伝子多
型をスクリーニングし、翻訳領域内で6つのSNPs、即
ち、［T819C(Leu273Leu)］、［G2295A(Gly765Gly)］、
［A2446C(Ile816Leu)］、［A2490G(Ile830Met)］、［T3
214A(Cys1072Ser)］および［C3473T(Pro1158Leu)］を特
定した。The composition of each reaction mixture used was 10 μl of PCR.
Product, 3 units of restriction enzyme Nla IV (1 U / μl; Bio Lab Inc.
2 μl of 10 × Buffer K (Takara) and 15 μl of 0.
01% BSA (Takara). After incubation at 37 ° C. for 1 hour, the reaction products were electrophoresed on a 2% agarose gel. d) Results In 51 Japanese subjects, a genetic polymorphism on the IKAP gene was screened, and six SNPs in the translation region, namely [T819C (Leu273Leu)], [G2295A (Gly765Gly)],
[A2446C (Ile816Leu)], [A2490G (Ile830Met)], [T3
214A (Cys1072Ser)] and [C3473T (Pro1158Leu)] were identified.

【００８６】それらの6つのSNPsの位置は、図1に示され
ているとおりである。The positions of the six SNPs are as shown in FIG.

【００８７】IKAP遺伝子によってコードされるアミノ酸
配列番号の273番目のLeu→Leuは、WD様反復配列に位置
したサイレント置換である。 IKAP遺伝子によってコー
ドされるアミノ酸配列番号の816番目のIle→Leuのアミ
ノ酸変異およびIKAP遺伝子によってコードされるアミノ
酸配列番号の830番目のIle→Metのアミノ酸変異は、IKK
α結合サイトにあり、IKAP遺伝子によってコードされる
アミノ酸配列番号の1072番目のCys→Serのアミノ酸変異
は、IKKα/IKKβ結合サイトに位置しており、IKAP遺伝
子によってコードされるアミノ酸配列番号の1158番目の
Pro→Leuの変異は、セリン・リッチドメインに位置して
いた。これら遺伝子多型の2つは、サイレント置換であ
ったが、4つの非同義置換は、蛋白産物におけるミスセ
ンス変異であった。[0087] Leu → Leu at position 273 of the amino acid sequence number encoded by the IKAP gene is a silent substitution located in the WD-like repeat sequence. The amino acid mutation of Ile → Leu at position 816 of the amino acid sequence number encoded by the IKAP gene and the amino acid mutation of Ile → Met at position 830 of the amino acid sequence number encoded by the IKAP gene are IKK
In the α-binding site, the amino acid mutation of Cys → Ser at position 1072 of the amino acid sequence number encoded by the IKAP gene is located at the IKKα / IKKβ binding site and is located at position 1158 of the amino acid sequence number encoded by the IKAP gene. of
The Pro → Leu mutation was located in the serine-rich domain. Two of these polymorphisms were silent substitutions, while the four non-synonymous substitutions were missense mutations in the protein product.

【００８８】[0088]

【実施例２】統計的分析方法：気管支喘息患者とコント
ロール（対照）との対立遺伝子頻度を、スタットビュJ
4.02ソフトウェア(StatView-J4.02 software: Abacus C
oncepts社製)を使用するcontingencyχ二乗テストによ
って比較した。[Example 2] Statistical analysis method: The allele frequency between a bronchial asthma patient and a control (control) was determined by Statview J.
4.02 software (StatView-J4.02 software: Abacus C
oncepts) was used for comparison.

【００８９】オッズ比はブラウン(Brown)法に従い評価
した(Brown, C.C., Am. J. Epidemiol., 113(4), 474-4
80 (1981))。The odds ratio was evaluated according to the Brown method (Brown, CC, Am. J. Epidemiol., 113 (4), 474-4).
80 (1981)).

【００９０】ハプロタイプ分析は、一般集団からの207
のコントロール、235の小児気管支喘息および90の成人
気管支喘息患者由来検体について、最大尤度法に基づい
たARLEQUINソフトウェア・バージョン2.0(スイス、ジェ
ネバ大学人類学部門、遺伝学・生物測定学研究所：Gene
tics and Biometry Laboratory, Department of Anthro
pology, University of Geneva, Geneva)を用いて行っ
た。気管支喘息患者とコントロール間のハプロタイプ頻
度の差を、χ二乗テストによって評価した。この際、一
つのハプロタイプとその他のハプロタイプを比較し、自
由度は1であった。p値は、比較したたハプロタイプの数
(Bonferroniの補正)を乗じることによって補正した。Haplotype analysis was performed on 207
ARLEQUIN software version 2.0 based on maximum likelihood method for Genetic Control, 235 pediatric bronchial asthma and 90 adult bronchial asthma patients (Genetics and Biometrics Laboratory: Geneva University, Switzerland)
tics and Biometry Laboratory, Department of Anthro
pology, University of Geneva, Geneva). The difference in haplotype frequency between bronchial asthma patients and controls was evaluated by the chi-square test. At this time, one haplotype was compared with another haplotype, and the degree of freedom was 1. p-value is the number of haplotypes compared
(Bonferroni's correction).

【００９１】更に、トンプソンらの方法(Thompson, E.
A., et al., Am. J. Hum. Genet., 42, 113-124 (198
8))に従い、ペア・ワイズ連鎖不平衡係数（D'=D/Dmaxま
たはD/Dmin）を計算した。 結果：対立遺伝子頻度の比較のために、372人のコント
ロールと共に、235人の小児気管支喘息検体および270人
の成人気管支喘息検体について、本発明方法に従い検出
された遺伝子多型を解析した結果は次の通りである。Further, the method of Thompson et al.
A., et al., Am. J. Hum.Genet., 42, 113-124 (198
According to 8)), the pair-wise linkage disequilibrium coefficient (D '= D / Dmax or D / Dmin) was calculated. Results: For comparison of allele frequencies, the results of analyzing the polymorphisms detected according to the method of the present invention in 235 pediatric bronchial asthma samples and 270 adult bronchial asthma samples together with 372 controls are as follows. It is as follows.

【００９２】尚、気管支喘息患者は、喘息発症年齢に従
い、18歳未満（小児）および18歳以上（成人）の2つの
グループに分けた。18歳未満のグループは、アトピー気
管支喘息で代表され、18歳以上のグループは非アトピー
の気管支喘息が多かった気管支喘息表現型に対するIKAP
遺伝子のSNPsを利用して対象関連解析を行った結果、検
出された6つのSNPsは、全てコントロール群においてハ
ーディ−ワインバーグ平衡の法則に従うことが確認され
た。The patients with bronchial asthma were divided into two groups according to the age of onset of asthma: children under the age of 18 (children) and 18 years or older (adults). Groups under the age of 18 were represented by atopic bronchial asthma, and those aged 18 and over were IKAPs for the bronchial asthma phenotype, which was predominantly non-atopic bronchial asthma
As a result of subject association analysis using SNPs of the gene, it was confirmed that all of the detected six SNPs obeyed the Hardy-Weinberg equilibrium rule in the control group.

【００９３】これらSNPs間に連鎖不平衡が成り立つか否
かを検討した結果を下記表3に示す。Table 3 below shows the results of examination as to whether linkage disequilibrium is established between these SNPs.

【００９４】[0094]

【表３】 [Table 3]

【００９５】SNPsの多くは、表3に示されるようにお互
いに連鎖不平衡にあった。特にIKAP遺伝子の2295番目の
GがAに変異したSNPと2490番目のAがGに変異したSNP(G22
95AおよびA2490G)およびIKAP遺伝子の3214番目のTがAに
変異したSNPと3473番目のCがTに変異したSNP(T3214Aお
よびC3473T)とは、ほぼ完全な連鎖不平衡を示した(D'=
0.966,χ2=124.0およびD'=0.884,χ2=256.1)。Many of the SNPs were in linkage disequilibrium with each other as shown in Table 3. Especially the 2295th of IKAP gene
SNP with G mutated to A and SNP with 2490th A mutated to G (G22
95A and A2490G) and the SNP in which the 3214th T of the IKAP gene was mutated to A, and the SNP in which the 3473th C was mutated to T (T3214A and C3473T) showed almost complete linkage disequilibrium (D ′ =
0.966, χ 2 = 124.0 and D ′ = 0.884, χ 2 = 256.1).

【００９６】上記6つのSNPsに関する遺伝子型決定の結
果を表4に示す。Table 4 shows the results of genotyping the six SNPs.

【００９７】[0097]

【表４】 [Table 4]

【００９８】表4に示されるように、小児気管支喘息に
おいて、IKAP遺伝子の3214番目のTがAに変異したSNP（T
3214A(Cys1072Ser)）と3473番目のCがTに変異したSNP(C
3473T(Pro1158Leu))とに強い対立遺伝子の関連を観察し
た(T3214A(Cys1072Ser)に関して、χ2=16.29, df=1, P=
0.000004およびC3473T(Pro1158Leu)に関して、χ2=11.0
9, df=1, P=0.0009)。前記表3に既に示されたように、
これら2つのサイトは、互いに強く関連していた。ま
た、上記T3214A(Cys1072Ser)対立遺伝子は、成人気管支
喘息の発症にも関連していた(χ2=21.88, df=1, P=0.00
0002)。As shown in Table 4, in childhood bronchial asthma, the SNP in which T at position 3214 of the IKAP gene was mutated to A (T
3214A (Cys1072Ser)) and SNP (C
3473T (Pro1158Leu)) and a strong allele association was observed (for T3214A (Cys1072Ser), χ 2 = 16.29, df = 1, P =
Χ 2 = 11.0 for 0.000004 and C3473T (Pro1158Leu)
9, df = 1, P = 0.0009). As already shown in Table 3 above,
These two sites were strongly related to each other. The T3214A (Cys1072Ser) allele was also associated with the development of adult bronchial asthma (χ 2 = 21.88, df = 1, P = 0.00
0002).

【００９９】これらの結果は、前記２つのサイトにおけ
る変異に基づくIKAP遺伝子がコードする1072番目のSer
と1158番目のLeuが、気管支喘息の病因学において、特
に気管支喘息の早期発症において重要な役割を有してい
るかもしれないことを強く示唆している。These results indicate that the IKAP gene based on the mutation at the two sites encodes the 1072th Ser.
Leu at position 1158 strongly suggests that it may have an important role in the pathogenesis of bronchial asthma, especially in the early onset of bronchial asthma.

【０１００】小児気管支喘息においては、その殆どがア
トピーがあり、ハウスダスト、ダニ、花粉に感作されて
おり、約90％の患者に血清IgEレベルの上昇が認められ
る(Woolcock, A.J. and Peat, J.K., Ciba Found Sym
p., 206, 122 (1997))。In childhood bronchial asthma, most are atopic, sensitized to house dust, mites, and pollen, and about 90% of patients have elevated serum IgE levels (Woolcock, AJ and Peat, JK, Ciba Found Sym
p., 206, 122 (1997)).

【０１０１】成人と小児の気管支喘息の病態の違いに関
して、幾つかの遺伝的および環境的要因が報告されてい
る(Hopes,E. et al.,(1998))。本試験において対象とし
た小児気管支喘息患者は、殆どの症例において血清IgE
レベルの上昇がみられ、アトピー性喘息として診断され
ていた。また成人気管支喘息患者は、小児喘息の既往歴
のあるものを除いたため多くが非アトピー性であった。Several genetic and environmental factors have been reported for differences in the pathology of bronchial asthma in adults and children (Hopes, E. et al., (1998)). The pediatric patients with bronchial asthma included in this study had serum IgE in most cases.
She had elevated levels and had been diagnosed with atopic asthma. In addition, many patients with adult bronchial asthma were non-atopic because they had no history of childhood asthma.

【０１０２】本試験では、成人の気管支喘息発症と3214
番目のTからAへの変異との間に相関が認められ、3473番
目のCからTへの変異との間には相関は認められなかっ
た。これは、おそらく成人気管支喘息群中にアトピー性
の表現型と非アトピー性の表現型が混じっているためと
考えられる。In this study, the incidence of bronchial asthma in adults
No correlation was found between the 3rd T to A mutation and no correlation was found between the 3473th C to T mutation. This is probably due to the mixed atopic and non-atopic phenotypes in the adult bronchial asthma group.

【０１０３】尚、気管支喘息患者を、日本アレルギー疾
患協会のガイドラインに従って、重症度によって更に副
分類したとき、これらの各SNPsは、臨床的な重症度との
関連においては違いを確認することができなかった。When bronchial asthma patients were further sub-classified according to their severity according to the guidelines of the Japan Allergic Disease Association, a difference between these SNPs in terms of clinical severity could be confirmed. Did not.

【０１０４】更に、IKAP遺伝子の6つのサイトにおける
ハプロタイプの見積られた頻度を、気管支喘息（小児お
よび成人）とコントロールとの間で比較検討した。その
結果を表5に示す。In addition, the estimated frequencies of haplotypes at the six sites of the IKAP gene were compared between bronchial asthma (children and adults) and controls. Table 5 shows the results.

【０１０５】[0105]

【表５】 [Table 5]

【０１０６】表5に示す結果より、26の異なったハプロ
タイプ（表記した9つの主要なハプロタイプおよびその
他として17種のマイナーなハロタイプ）が検出された。
表記した9つの優勢なハプロタイプは、連鎖不平衡を表
わした(コントロールに対して頻度＞1％)。17種のマイ
ナーなハプロタイプを1個として組合せて見積もられた
ｐ値を、試験したハプロタイプ数を乗じることによって
調整した(ボーンフェロニーの調整)。From the results shown in Table 5, 26 different haplotypes (the 9 major haplotypes indicated and 17 other minor haplotypes) were detected.
The nine dominant haplotypes indicated represented linkage disequilibrium (frequency> 1% relative to controls). The estimated p-value for the combination of 17 minor haplotypes as one was adjusted by multiplying the number of haplotypes tested (Bone Ferrony adjustment).

【０１０７】すべてのグループにおいて、最も一般的な
ハプロタイプは、TGAATCであった。In all groups, the most common haplotype was TGAATC.

【０１０８】また、TGAAATハプロタイプで、前記したよ
うに小児気管支喘息と強い関連が認められた2つのアミ
ノ酸の変異(1072番目のCysのSerへの変異と1158番目のP
roのLeuへの変異)が観察された(χ2=22.34 (df=1), P=
0.00004,予測比率=2.94, 95%CI=2.48-3.4)。しかしなが
ら、このTGAAATハプロタイプの後ろの5つのヌクレオチ
ドが異なるTACGTCハプロタイプは、小児気管支喘息にお
いては大変まれで、気管支喘息表現型と逆に相関してい
た(χ2=13.65 (df=1), P=0.002,予測比率=9.83,95%CI=
8.35-11.31)。両者の対比から、TGAAATハプロタイプを
生じている個人間の気管支喘息に対する相対的な危険度
は、TACGTCハプロタイプを持っている個人のそれと比べ
て25倍近く高いことが明らかとなった(χ2=23.38 (df=
1), P=0.002,予測比率=25.12, 95%CI=23.56-26.68)。
尚、このTGAAATハプロタイプは、コントロール群におい
てより多く認められており、防御的または喘息の発症に
抵抗性のアレルと考えることができる。また、このハプ
ロタイプは、IKAPのIKK-β結合ドメインおよびセリン・
リッチドメインにおいて2箇所のアミノ酸置換と関連し
ているので、このタイプの対立遺伝子は、NF-Bのシグナ
ル伝達を促進または抑制したり、構成蛋白としてのIKAP
蛋白の働きを変化させるかもしれない。In addition, as described above, in the TGAAAT haplotype, two amino acid mutations that were strongly associated with pediatric bronchial asthma (the mutation of Cys at position 1072 to Ser and the mutation of Ps at position 1158)
ro to Leu) was observed (χ 2 = 22.34 (df = 1), P =
0.00004, prediction ratio = 2.94, 95% CI = 2.48-3.4). However, the TACGTC haplotype, which differs in the five nucleotides after this TGAAAT haplotype, is very rare in childhood bronchial asthma and inversely correlates with the bronchial asthma phenotype (χ 2 = 13.65 (df = 1), P = 0.002, prediction ratio = 9.83,95% CI =
8.35-11.31). A comparison of the two revealed that the relative risk for bronchial asthma among individuals who had a TGAAAT haplotype was nearly 25-fold higher than that of individuals who had a TACGTC haplotype (χ 2 = 23.38). (df =
1), P = 0.002, prediction ratio = 25.12, 95% CI = 23.56-26.68).
In addition, this TGAAAT haplotype is more frequently observed in the control group, and can be considered as an allele that is protective or resistant to onset of asthma. This haplotype also contains the IKK-β binding domain of IKAP and the serine
This type of allele promotes or suppresses NF-B signaling and is associated with IKAP as a constituent protein, as it is associated with two amino acid substitutions in the rich domain.
It may alter the way proteins work.

【０１０９】[0109]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. <120> A method for detecting risk factors of bronchial asthma <130> 1601JP <160> 36 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1332 <212> PRT <213> Human pheripheral blood of bronchial asthma <400> 1 Met Arg Asn Leu Lys Leu Phe Arg Thr Leu Glu Phe Arg Asp Ile Gln 1 5 10 15 Gly Pro Gly Asn Pro Gln Cys Phe Ser Leu Arg Thr Glu Gln Gly Thr 20 25 30 Val Leu Ile Gly Ser Glu His Gly Leu Ile Glu Val Asp Pro Val Ser 35 40 45 Arg Glu Val Lys Asn Glu Val Ser Leu Val Ala Glu Gly Phe Leu Pro 50 55 60 Glu Asp Gly Ser Gly Arg Ile Val Gly Val Gln Asp Leu Leu Asp Gln 65 70 75 80 Glu Ser Val Cys Val Ala Thr Ala Ser Gly Asp Val Ile Leu Cys Ser 85 90 95 Leu Ser Thr Gln Gln Leu Glu Cys Val Gly Ser Val Ala Ser Gly Ile 100 105 110 Ser Val Met Ser Trp Ser Pro Asp Gln Glu Leu Val Leu Leu Ala Thr 115 120 125 Gly Gln Gln Thr Leu Ile Met Met Thr Lys Asp Phe Glu Pro Ile Leu 130 135 140 Glu Gln Gln Ile His Gln Asp Asp Phe Gly Glu Ser Lys Phe Ile Thr 145 150 155 160 Val Gly Trp Gly Arg Lys Glu Thr Gln Phe His Gly Ser Glu Gly Arg 165 170 175 Gln Ala Ala Phe Gln Met Gln Met His Glu Ser Ala Leu Pro Trp Asp 180 185 190 Asp His Arg Pro Gln Val Thr Trp Arg Gly Asp Gly Gln Phe Phe Ala 195 200 205 Val Ser Val Val Cys Pro Glu Thr Gly Ala Arg Lys Val Arg Val Trp 210 215 220 Asn Arg Glu Phe Ala Leu Gln Ser Thr Ser Glu Pro Val Ala Gly Leu 225 230 235 240 Gly Pro Ala Leu Ala Trp Lys Pro Ser Gly Ser Leu Ile Ala Ser Thr 245 250 255 Gln Asp Lys Pro Asn Gln Gln Asp Ile Val Phe Phe Glu Lys Asn Gly 260 265 270 Leu Leu His Gly His Phe Thr Leu Pro Phe Leu Lys Asp Glu Val Lys 275 280 285 Val Asn Asp Leu Leu Trp Asn Ala Asp Ser Ser Val Leu Ala Val Arg 290 295 300 Leu Glu Asp Leu Gln Arg Glu Lys Ser Ser Ile Pro Lys Thr Cys Val 305 310 315 320 Gln Leu Trp Thr Val Gly Asn Tyr His Trp Tyr Leu Lys Gln Ser Leu 325 330 335 Ser Phe Ser Thr Cys Gly Lys Ser Lys Ile Val Ser Leu Met Trp Asp 340 345 350 Pro Val Thr Pro Tyr Arg Leu His Val Leu Cys Gln Gly Trp His Tyr 355 360 365 Leu Ala Tyr Asp Trp His Trp Thr Thr Asp Arg Ser Val Gly Asp Asn 370 375 380 Ser Ser Asp Leu Ser Asn Val Ala Val Ile Asp Gly Asn Arg Val Leu 385 390 395 400 Val Thr Val Phe Arg Gln Thr Val Val Pro Pro Pro Met Cys Thr Tyr 405 410 415 Gln Leu Leu Phe Pro His Pro Val Asn Gln Val Thr Phe Leu Ala His 420 425 430 Pro Gln Lys Ser Asn Asp Leu Ala Val Leu Asp Ala Ser Asn Gln Ile 435 440 445 Ser Val Tyr Lys Cys Gly Asp Cys Pro Ser Ala Asp Pro Thr Val Lys 450 455 460 Leu Gly Ala Val Gly Gly Ser Gly Phe Lys Val Cys Leu Arg Thr Pro 465 470 475 480 His Leu Glu Lys Arg Tyr Lys Ile Gln Phe Glu Asn Asn Glu Asp Gln 485 490 495 Asp Val Asn Pro Leu Lys Leu Gly Leu Leu Thr Trp Ile Glu Glu Asp 500 505 510 Val Phe Leu Ala Val Ser His Ser Glu Phe Ser Pro Arg Ser Val Ile 515 520 525 His His Leu Thr Ala Ala Ser Ser Glu Met Asp Glu Glu His Gly Gln 530 535 540 Leu Asn Val Ser Ser Ser Ala Ala Val Asp Gly Val Ile Ile Ser Leu 545 550 555 560 Cys Cys Asn Ser Lys Thr Lys Ser Val Val Leu Gln Leu Ala Asp Gly 565 570 575 Gln Ile Phe Lys Tyr Leu Trp Glu Ser Pro Ser Leu Ala Ile Lys Pro 580 585 590 Trp Lys Asn Ser Gly Gly Phe Pro Val Arg Phe Pro Tyr Pro Cys Thr 595 600 605 Gln Thr Glu Leu Ala Met Ile Gly Glu Glu Glu Cys Val Leu Gly Leu 610 615 620 Thr Asp Arg Cys Arg Phe Phe Ile Asn Asp Ile Glu Val Ala Ser Asn 625 630 635 640 Ile Thr Ser Phe Ala Val Tyr Asp Glu Phe Leu Leu Leu Thr Thr His 645 650 655 Ser His Thr Cys Gln Cys Phe Cys Leu Arg Asp Ala Ser Phe Lys Thr 660 665 670 Leu Gln Ala Gly Leu Ser Ser Asn His Val Ser His Gly Glu Val Leu 675 680 685 Arg Lys Val Glu Arg Gly Ser Arg Ile Val Thr Val Val Pro Gln Asp 690 695 700 Thr Lys Leu Val Leu Gln Met Pro Arg Gly Asn Leu Glu Val Val His 705 710 715 720 His Arg Ala Leu Val Leu Ala Gln Ile Arg Lys Trp Leu Asp Lys Leu 725 730 735 Met Phe Lys Glu Ala Phe Glu Cys Met Arg Lys Leu Arg Ile Asn Leu 740 745 750 Asn Pro Ile Tyr Asp His Asn Pro Lys Val Phe Leu Gly Asn Val Glu 755 760 765 Thr Phe Ile Lys Gln Ile Asp Ser Val Asn His Ile Asn Leu Phe Phe 770 775 780 Thr Glu Leu Lys Glu Glu Asp Val Thr Lys Thr Met Tyr Pro Ala Pro 785 790 795 800 Val Thr Ser Ser Val Tyr Leu Ser Arg Asp Pro Asp Gly Asn Lys Ile 805 810 815 Asp Leu Val Cys Asp Ala Met Arg Ala Val Met Glu Ser Ile Asn Pro 820 825 830 His Lys Tyr Cys Leu Ser Ile Leu Thr Ser His Val Lys Lys Thr Thr 835 840 845 Pro Glu Leu Glu Ile Val Leu Gln Lys Val His Glu Leu Gln Gly Asn 850 855 860 Ala Pro Ser Asp Pro Asp Ala Val Ser Ala Glu Glu Ala Leu Lys Tyr 865 870 875 880 Leu Leu His Leu Val Asp Val Asn Glu Leu Tyr Asp His Ser Leu Gly 885 890 895 Thr Tyr Asp Phe Asp Leu Val Leu Met Val Ala Glu Lys Ser Gln Lys 900 905 910 Asp Pro Lys Glu Tyr Leu Pro Phe Leu Asn Thr Leu Lys Lys Met Glu 915 920 925 Thr Asn Tyr Gln Arg Phe Thr Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Arg Tyr Glu 930 935 940 Lys Ala Ile Gly His Leu Ser Lys Cys Gly Pro Glu Tyr Phe Pro Glu 945 950 955 960 Cys Leu Asn Leu Ile Lys Asp Lys Asn Leu Tyr Asn Glu Ala Leu Lys 965 970 975 Leu Tyr Ser Pro Ser Ser Gln Gln Tyr Gln Asp Ile Ser Ile Ala Tyr 980 985 990 Gly Glu His Leu Met Gln Glu His Met Tyr Glu Pro Ala Gly Leu Met 995 1000 1005 Phe Ala Arg Cys Gly Ala His Glu Lys Ala Leu Ser Ala Phe Leu Thr 1010 1015 1020 Cys Gly Asn Trp Lys Gln Ala Leu Cys Val Ala Ala Gln Leu Asn Phe 1025 1030 1035 1040 Thr Lys Asp Gln Leu Val Gly Leu Gly Arg Thr Leu Ala Gly Lys Leu 1045 1050 1055 Val Glu Gln Arg Lys His Ile Asp Ala Ala Met Val Leu Glu Glu Cys 1060 1065 1070 Ala Gln Asp Tyr Glu Glu Ala Val Leu Leu Leu Leu Glu Gly Ala Ala 1075 1080 1085 Trp Glu Glu Ala Leu Arg Leu Val Tyr Lys Tyr Asn Arg Leu Asp Ile 1090 1095 1100 Ile Glu Thr Asn Val Lys Pro Ser Ile Leu Glu Ala Gln Lys Asn Tyr 1105 1110 1115 1120 Met Ala Phe Leu Asp Ser Gln Thr Ala Thr Phe Ser Arg His Lys Lys 1125 1130 1135 Arg Leu Leu Val Val Arg Glu Leu Lys Glu Gln Ala Gln Gln Ala Gly 1140 1145 1150 Leu Asp Asp Glu Val Pro His Gly Gln Glu Ser Asp Leu Phe Ser Glu 1155 1160 1165 Thr Ser Ser Val Val Ser Gly Ser Glu Met Ser Gly Lys Tyr Ser His 1170 1175 1180 Ser Asn Ser Arg Ile Ser Ala Arg Ser Ser Lys Asn Arg Arg Lys Ala 1185 1190 1195 1200 Glu Arg Lys Lys His Ser Leu Lys Glu Gly Ser Pro Leu Glu Asp Leu 1205 1210 1215 Ala Leu Leu Glu Ala Leu Ser Glu Val Val Gln Asn Thr Glu Asn Leu 1220 1225 1230 Lys Asp Glu Val Tyr His Ile Leu Lys Val Leu Phe Leu Phe Glu Phe 1235 1240 1245 Asp Glu Gln Gly Arg Glu Leu Gln Lys Ala Phe Glu Asp Thr Leu Gln 1250 1255 1260 Leu Met Glu Arg Ser Leu Pro Glu Ile Trp Thr Leu Thr Tyr Gln Gln 1265 1270 1275 1280 Asn Ser Ala Thr Pro Val Leu Gly Pro Asn Ser Thr Ala Asn Ser Ile 1285 1290 1295 Met Ala Ser Tyr Gln Gln Gln Lys Thr Ser Val Pro Val Leu Asp Ala 1300 1305 1310 Glu Leu Phe Ile Pro Pro Lys Ile Asn Arg Arg Thr Gln Trp Lys Leu 1315 1320 1325 Ser Leu Leu Asp 1330 <210> 2 <211> 4803 <212> DNA <213> Human pheripheral blood of bronchia asthma <400> 2 gcggctgcct agttgacgca cccattgagt cgctggcttc tttgcagcgc ttcagcgttt 60 tcccctggag ggcgcctcca tccttggagg cctagtgccg tcggagaaga gagcgggagc 120 cgcggacaga gacgcgtgcg caattcggag ccgactctgg gtgcggactg tgggagctga 180 ctctgggtag ccggctgcgc gtggctgggg aggcgaggcc ggacgcacct ctgtttgggg 240 gtcctcagag attaatgatt catcaaggga tagttgtact gttctcgtgg gaatcacttc 300 atcatgcgaa atctgaaatt atttcggacc ctggagttca gggatattca aggtccaggg 360 aatcctcagt gcttctctct ccgaactgaa caggggacgg tgctcattgg ttcagaacat 420 ggcctgatag aagtagaccc tgtctcaaga gaagtgaaaa atgaagtttc tttggtggca 480 gaaggctttc ttccagagga tggaagtggc cgcattgttg gtgttcagga cttgctggat 540 caggagtctg tgtgtgtggc cacagcctct ggagacgtca tactctgcag tctcagcaca 600 caacagctgg agtgtgttgg gagtgtagcc agtggtatct ctgttatgag ttggagtcct 660 gaccaagagc tggtgcttct tgccacaggt caacagaccc tgattatgat gacaaaagat 720 tttgagccaa tcctggagca gcagatccat caggatgatt ttggtgaaag caagtttatc 780 actgttggat ggggtaggaa ggagacacag ttccatggat cagaaggcag acaagcagct 840 tttcagatgc aaatgcatga gtctgctttg ccctgggatg accatagacc acaagttacc 900 tggcgggggg atggacagtt ttttgctgtg agtgttgttt gcccagaaac aggggctcgg 960 aaggtcagag tgtggaaccg agagtttgct ttgcagtcaa ccagtgagcc tgtggcagga 1020 ctgggaccag ccctggcttg gaaaccctca ggcagtttga ttgcatctac acaagataaa 1080 cccaaccagc aggatattgt gttttttgag aaaaatggac ttcttcatgg acactttaca 1140 cttcccttcc ttaaagatga ggttaaggta aatgacttgc tctggaatgc agattcctct 1200 gtgcttgcag tccggctgga agaccttcag agagaaaaaa gctccattcc gaaaacctgt 1260 gttcagctct ggactgttgg aaactatcac tggtatctca agcaaagttt atccttcagc 1320 acctgtggga agagcaagat tgtgtctctg atgtgggacc ctgtgacccc ataccggctg 1380 catgttctct gtcagggctg gcattacctc gcctatgatt ggcactggac gactgaccgg 1440 agcgtgggag ataattcaag tgacttgtcc aatgtggctg tcattgatgg aaacagggtg 1500 ttggtgacag tcttccggca gactgtggtt ccgcctccca tgtgcaccta ccaactgctg 1560 ttcccacacc ctgtgaatca agtcacattc ttagcacacc ctcaaaagag taatgacctt 1620 gctgttctag atgccagtaa ccagatttct gtttataaat gtggtgattg tccaagtgct 1680 gaccctacag tgaaactggg agctgtgggt ggaagtggat ttaaagtttg ccttagaact 1740 cctcatttgg aaaagagata caaaatccag tttgagaata atgaagatca agatgtaaac 1800 ccgctgaaac taggccttct cacttggatt gaagaagacg tcttcctggc tgtaagccac 1860 agtgagttca gcccccggtc tgtcattcac catttgactg cagcttcttc tgagatggat 1920 gaagagcatg gacagctcaa tgtcagttca tctgcagcgg tggatggggt cataatcagt 1980 ctatgttgca attccaagac caagtcagta gtattacagc tggctgatgg ccagatattt 2040 aagtaccttt gggagtcacc ttctctggct attaaaccat ggaagaactc tggtggattt 2100 cctgttcggt ttccttatcc atgcacccag accgaattgg ccatgattgg agaagaggaa 2160 tgtgtccttg gtctgactga caggtgtcgc tttttcatca atgacattga ggttgcgtca 2220 aatatcacgt catttgcagt atatgatgag tttttattgt tgacaaccca ttcccatacc 2280 tgccagtgtt tttgcctgag ggatgcttca tttaaaacat tacaggccgg cctgagcagc 2340 aatcatgtgt cccatgggga agttctgcgg aaagtggaga ggggttcacg gattgtcact 2400 gttgtgcccc aggacacaaa gcttgtatta cagatgccaa ggggaaactt agaagttgtt 2460 catcatcgag ccctggtttt agctcagatt cggaagtggt tggacaaact tatgtttaaa 2520 gaggcatttg aatgcatgag aaagctgaga atcaatctca atccgattta tgatcataac 2580 cctaaggtgt ttcttgggaa tgtggaaacc ttcattaaac agatagattc tgtgaatcat 2640 attaacttgt tttttacaga attgaaagaa gaagatgtca cgaagaccat gtaccctgca 2700 ccagttacca 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ccgaactgaa caggggacgg tgctcattgg ttcagaacat 420 ggcctgatag aagtagaccc tgtctcaaga gaagtgaaaa atgaagtttc tttggtggca 480 gaaggctttc ttccagagga tggaagtggc cgcattgttg gtgttcagga cttgctggat 540 caggagtctg tgtgtgtggc cacagcctct ggagacgtca tactctgcag tctcagcaca 600 caacagctgg agtgtgttgg gagtgtagcc agtggtatct ctgttatgag ttggagtcct 660 gaccaagagc tggtgcttct tgccacaggt caacagaccc tgattatgat gacaaaagat 720 tttgagccaa tcctggagca gcagatccat caggatgatt ttggtgaaag caagtttatc 780 actgttggat ggggtaggaa ggagacacag ttccatggat cagaaggcag acaagcagct 840 tttcagatgc aaatgcatga gtctgctttg ccctgggatg accatagacc acaagttacc 900 tggcgggggg atggacagtt ttttgctgtg agtgttgttt gcccagaaac aggggctcgg 960 aaggtcagag tgtggaaccg agagtttgct ttgcagtcaa ccagtgagcc tgtggcagga 1020 ctgggaccag ccctgg cttg gaaaccctca ggcagtttga ttgcatctac acaagataaa 1080 cccaaccagc aggatattgt gttttttgag aaaaatggac ttcttcatgg acactttaca 1140 cttcccttcc ttaaagatga ggttaaggta aatgacttgc tctggaatgc agattcctct 1200 gtgcttgcag tccggctgga agaccttcag agagaaaaaa gctccattcc gaaaacctgt 1260 gttcagctct ggactgttgg aaactatcac tggtatctca agcaaagttt atccttcagc 1320 acctgtggga agagcaagat tgtgtctctg atgtgggacc ctgtgacccc ataccggctg 1380 catgttctct gtcagggctg gcattacctc gcctatgatt ggcactggac gactgaccgg 1440 agcgtgggag ataattcaag tgacttgtcc aatgtggctg tcattgatgg aaacagggtg 1500 ttggtgacag tcttccggca gactgtggtt ccgcctccca tgtgcaccta ccaactgctg 1560 ttcccacacc ctgtgaatca agtcacattc ttagcacacc ctcaaaagag taatgacctt 1620 gctgttctag atgccagtaa ccagatttct gtttataaat gtggtgattg tccaagtgct 1680 gaccctacag tgaaactggg agctgtgggt ggaagtggat ttaaagtttg ccttagaact 1740 cctcatttgg aaaagagata caaaatccag tttgagaata atgaagatca agatgtaaac 1800 ccgctgaaac taggccttct cacttggatt gaagaagacg tcttcctggc tgtaagccac 1860 agtgagttca gcccccggtc t gtcattcac catttgactg cagcttcttc tgagatggat 1920 gaagagcatg gacagctcaa tgtcagttca tctgcagcgg tggatggggt cataatcagt 1980 ctatgttgca attccaagac caagtcagta gtattacagc tggctgatgg ccagatattt 2040 aagtaccttt gggagtcacc ttctctggct attaaaccat ggaagaactc tggtggattt 2100 cctgttcggt ttccttatcc atgcacccag accgaattgg ccatgattgg agaagaggaa 2160 tgtgtccttg gtctgactga caggtgtcgc tttttcatca atgacattga ggttgcgtca 2220 aatatcacgt catttgcagt atatgatgag tttttattgt tgacaaccca ttcccatacc 2280 tgccagtgtt tttgcctgag ggatgcttca tttaaaacat tacaggccgg cctgagcagc 2340 aatcatgtgt cccatgggga agttctgcgg aaagtggaga ggggttcacg gattgtcact 2400 gttgtgcccc aggacacaaa gcttgtatta cagatgccaa ggggaaactt agaagttgtt 2460 catcatcgag ccctggtttt agctcagatt cggaagtggt tggacaaact tatgtttaaa 2520 gaggcatttg aatgcatgag aaagctgaga atcaatctca atccgattta tgatcataac 2580 cctaaggtgt ttcttgggaa tgtggaaacc ttcattaaac agatagattc tgtgaatcat 2640 attaacttgt tttttacaga attgaaagaa gaagatgtca cgaagaccat gtaccctgca 2700 ccagttacca gcagtgtcta cctgtcc agg gatcctgacg ggaataaaat agaccttgtc 2760 tgcgatgcta tgagagcagt catggagagc ataaatcctc ataaatactg cctatccata 2820 cttacatctc atgtaaagaa gacaacccca gaactggaaa ttgtactgca aaaagtacac 2880 gagcttcaag gaaatgctcc ctctgatcct gatgctgtga gtgctgaaga ggccttgaaa 2940 tatttgctgc atctggtaga tgttaatgaa ttatatgatc attctcttgg cacctatgac 3000 tttgatttgg tcctcatggt agctgagaag tcacagaagg atcccaaaga atatcttcca 3060 tttcttaata cacttaagaa aatggaaact aattatcagc ggtttactat agacaaatac 3120 ttgaaacgat atgaaaaagc cattggccac ctcagcaaat gtggacctga gtacttccca 3180 gaatgcttaa acttgataaa agataaaaac ttgtataacg aagctctgaa gttatattca 3240 ccaagctcac aacagtacca ggatatcagc attgcttatg gggagcacct gatgcaggag 3300 cacatgtatg agccagcggg gctcatgttt gcccgttgcg gtgcccacga gaaagctctc 3360 tcagcctttc tcacatgtgg caactggaag caagccctct gtgtggcagc ccagcttaac 3420 tttaccaaag accagctggt gggcctcggc agaactctgg caggaaagct ggttgagcag 3480 aggaagcaca ttgatgcggc catggttttg gaagagtgtg cccaggatta tgaagaagct 3540 gtgctcttgc tgttagaagg agctgcctgg ga agaagctt tgaggctggt atacaaatat 3600 aacagactgg atattataga aaccaacgta aagccttcca ttttagaagc ccagaaaaat 3660 tatatggcat ttctggactc tcagacagcc acattcagtc gccacaagaa acgtttattg 3720 gtagttcgag agctcaagga gcaagcccag caggcaggtc tggatgatga ggtaccccac 3780 gggcaagagt cagacctctt ctctgaaact agcagtgtcg tgagtggcag tgagatgagt 3840 ggcaaatact cccatagtaa ctccaggata tcagcgagat catccaagaa tcgccgaaaa 3900 gcggagcgga agaagcacag cctcaaagaa ggcagtccgc tggaggacct ggccctcctg 3960 gaggcactga gtgaagtggt gcagaacact gaaaacctga aagatgaagt ataccatatt 4020 ttaaaggtac tctttctctt tgagtttgat gaacaaggaa gggaattaca gaaggccttt 4080 gaagatacgc tgcagttgat ggaaaggtca cttccagaaa tttggactct tacttaccag 4140 cagaattcag ctaccccggt tctaggtccc aattctactg caaatagtat catggcatct 4200 tatcagcaac agaagacttc ggttcctgtt cttgatgctg agctttttat accaccaaag 4260 atcaacagaa gaacccagtg gaagctgagc ctgctagact gagtgactgc agttaggagg 4320 gatccgacag agaagaccat ttccactcat tcctgttgtc ctaccacccc ttgctctttg 4380 agggctggct attgagaact ggaaagagta aaatgata ac ttaccttagc attgccaaga 4440 acttcagcag acaacaagca attctattta ttttatgttg tgtatacatc ttgatcatta 4500 gcaagacatt aagctttaac cattatggca ccattttgtg agaatgattg ttctttcact 4560 tgggctgttt gagagcataa ttatggtaat catgagatta atgtttcatg atttctacct 4620 ccaaagtgtg aagacaagta aaacaatgtt tctaaattgt cttattttgt tggcggagaa 4680 gattacaatg gctattagtg ctacatttgg tcaaatgtaa tcacttaaat agcttcttgt 4740 caccttaaac taaagcagaa taaaaagtat cctttgaaat taaaaaaaac aaaaaagcta 4800 aaa 4803 <210 > 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (F1) for PCR <400> 3 gtactgttct cgtgggaatc actt 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (R1) for PCR <400> 4 cttctgatcc atggaactgt gtc 23 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (F2) for PCR <400> 5 actgttggat ggggtaggaa g 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (R2) for PCR <400> 6 ccacaggtgc tgaaggataa act 23 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Art ificial Sequence <213> Primer sequence (F3) for PCR <400> 7 ggaaactatc actggtatct caagc 25 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (R3) for PCR <400> 8 atccaagtga gaaggcctag ttt 23 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (F4) for PCR <400> 9 tgaagatcaa gatgtaaacc cg 22 <210> 10 <211> 22 <212 > DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (R4) for PCR <400> 10 ccggcctgta atgttttaaa tg 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (F5) for PCR <400> 11 ccatacctgc cagtgttttt g 21 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (R5) for PCR <400> 12 catgagatgt aagtatggat aggca 25 <210> 13 < 211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (F6) for PCR <400> 13 ggatcctgac gggaataaaa tag 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (R6) for PCR <400> 14 acatgtgaga aaggctgaga gag 23 <210> 15 <211> 23 <212> DN A <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (F7) for PCR <400> 15 acaacagtac caggatatca gca 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (R7) for PCR <400> 16 ggagtatttg ccactcatct cac 23 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (F8) for PCR <400> 17 gcaggtctgg atgatgaggt a 21 <210> 18 <211 > 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (R8) for PCR <400> 18 tgagtggaaa tggtcttctc tgt 23 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (819f) for PCR <400> 19 caggcagttt gattgcatct a 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (819r) for PCR <400> 20 ctcatcttta aggaagggaa g 21 < 210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (2295f) for PCR <400> 21 aaactaatat gatctgaacg aag 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (2295r) for PCR <400> 226 aaactatgga aaagatacac atg 23 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (2446f) for PCR <400> 23 ccagttacca gcagtgtcca 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213 > Primer sequence (2246r) for PCR <400> 24 tttccagttc tggggttgtc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (2490f) for PCR <400> 25 ccagttacca gcagtgtcca 20 < 210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (2490r) for PCR <400> 26 tttccagttc tggggttgtc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (3214f) for PCR <400> 27 caggaaagct ggttgagcag 20 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (3214r) for PCR <400> 28 caattgagaa gaccttgctt g 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (3473f) for PCR <400> 29 gtagttcgag agctcaagga 20 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213 > Artificial Sequence <213> Primer sequence (3473r) for PCR <400> 30 tgccactcac gacactgct 19 <210> 31 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (819aso) for PCR <400> 31 tggactyctt catg 14 <210> 32 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (2295aso) for PCR <400> 32 cacattycca agaaac 16 <210> 33 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (2446aso) for PCR <400> 33 gaataaamta gacct 15 <210> 34 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (2490aso) for PCR <400> 34 agagcatraa tcctc 15 <210> 35 <211> 13 <212> DNA < 213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (3214aso) for PCR <400> 35 gaagagwgtg ccc 13 <210> 36 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <213> Primer sequence (3473aso) for PCR <400 > 36 ggtacyccac gg 12

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】IKAP遺伝子の6つのSNPsの位置を示す図面であ
る。FIG. 1 is a drawing showing the positions of six SNPs of the IKAP gene.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA02 CA04 CA09 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ42 QR08 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02  ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page F term (reference) 4B024 AA11 BA80 CA02 CA04 CA09 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ42 QR08 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02

Claims (17)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】ヒトにおける気管支喘息発症を引き起こす
かまたは当該ヒトの子孫に先天性に気管支喘息発症性を
伝達する可能性を有する変異を含む遺伝子の多型を検出
する方法であって： （a）検体からヒトＩκβ関連蛋白をコードする遺伝子
を含む核酸を得、（b）当該核酸のDNA配列を決定して、
ヒトＩκβ関連蛋白遺伝子の多型を検出する、気管支喘
息発症危険因子の検出方法。1. A method for detecting a polymorphism in a gene containing a mutation that has the potential to cause bronchial asthma onset in a human or to congenitally transmit bronchial asthma onset to a human offspring: A) obtaining a nucleic acid containing a gene encoding a human Iκβ-related protein from a sample; (b) determining the DNA sequence of the nucleic acid;
A method for detecting a bronchial asthma development risk factor, comprising detecting a polymorphism in a human Iκβ-related protein gene. 【請求項２】気管支喘息が小児気管支喘息である請求項
1に記載の気管支喘息発症危険因子の検出方法。2. The bronchial asthma is pediatric bronchial asthma.
2. The method for detecting a bronchial asthma development risk factor according to 1. 【請求項３】遺伝子の多型が、配列番号1に記載のヒト
Ｉκβ関連蛋白のアミノ酸配列番号816番目のIleのLeu
への変異、830番目のIleのMetへの変異、1072番目のCys
のSerへの変異および1158番目のProのLeuへの変異から
なる群から選ばれる少なくとも1種のアミノ酸変異を伴
うものである請求項1に記載の気管支喘息発症危険因子
の検出方法。The polymorphism of the gene is Leu of Ile at amino acid sequence number 816 of human Iκβ-related protein of SEQ ID NO: 1.
Mutation, 830th Ile mutation to Met, 1072th Cys
2. The method for detecting a bronchial asthma development risk factor according to claim 1, wherein the method involves at least one amino acid mutation selected from the group consisting of a mutation of Ser into Ser and a mutation of Pro at position 1158 into Leu. 【請求項４】遺伝子の多型が、配列番号1に記載のヒト
Ｉκβ関連蛋白のアミノ酸配列番号の1072番目のCysのS
erへの変異および／または1158番目のProのLeuへの変異
を伴うものである請求項2に記載の小児気管支喘息発症
危険因子の検出方法。The polymorphism of the gene is S107 of Cys at position 1072 of the amino acid sequence number of the human Iκβ-related protein of SEQ ID NO: 1.
3. The method for detecting a childhood bronchial asthma development risk factor according to claim 2, which is accompanied by mutation to er and / or mutation of Pro at position 1158 to Leu. 【請求項５】気管支喘息が成人気管支喘息である請求項
1に記載の気管支喘息発症危険因子の検出方法。5. The bronchial asthma is adult bronchial asthma.
2. The method for detecting a bronchial asthma development risk factor according to 1. 【請求項６】遺伝子の多型が、配列番号1に記載のヒト
Ｉκβ関連蛋白のアミノ酸配列番号の1072番目のCysのS
erへの変異を伴うものである請求項5に記載の成人気管
支喘息発症危険因子の検出方法。6. A polymorphism of the gene, wherein the amino acid sequence of human Iκβ-related protein of SEQ ID NO: 1
6. The method for detecting a risk factor for the development of adult bronchial asthma according to claim 5, which is accompanied by mutation to er. 【請求項７】遺伝子の多型が、配列番号2に記載のヒト
Ｉκβ関連蛋白遺伝子のコード領域の819番目のTのCへ
の変異、2295番目のGのAへの変異、2446番目のAのCへの
変異、2490番目のAのGへの変異、3214番目のTのAへの変
異および3473番目のCのTへの変異からなる群から選ばれ
る少なくとも1種の核酸変異を有するものである請求項1
に記載の気管支喘息発症危険因子の検出方法。7. The polymorphism of the gene is a mutation of T to C at position 819, mutation of G to A at position 2295, and A of position 2446 of the coding region of the human Iκβ-related protein gene set forth in SEQ ID NO: 2. Having at least one nucleic acid mutation selected from the group consisting of a mutation of C to A, a mutation of A at position 2490 to G, a mutation of T at position 3214 to T, and a mutation of T 3473 at position C to T Claim 1 which is
4. The method for detecting a risk factor for developing bronchial asthma according to the above. 【請求項８】配列番号2に記載のヒトＩκβ関連蛋白遺
伝子のコード領域の819番目、2295番目、2446番目およ
び2490番目の核酸がそれぞれT、G、AおよびAであり且つ
3214番目のTのAへの変異および3473番目のCのTへの変異
を有するTGAAATハプロタイプを検出する請求項2記載の
小児気管支喘息発症危険因子の検出方法。8. The nucleic acids at positions 819, 2295, 2446 and 2490 of the coding region of the human Iκβ-related protein gene of SEQ ID NO: 2 are T, G, A and A, respectively, and
3. The method for detecting a childhood bronchial asthma development risk factor according to claim 2, wherein a TGAAAT haplotype having a mutation at position A of T at position 3214 and a mutation at position T of C at position 3473 is detected. 【請求項９】遺伝子の多型の検出が、ヌクレオチド直接
配列決定法、PCR-対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド
(ASO)とドットブロットハイブリダイゼーション分析、
一塩基伸長法、PCR-単鎖高次構造多型(SSCP)分析、PCR-
制限酵素断片長多型(RFLP)分析、インベーダー法および
定量的リアルタイムPCR検出法からなる群から選ばれる
少なくとも一つを含む方法によって行われる請求項1に
記載の気管支喘息発症危険因子の検出方法。9. A method for detecting a gene polymorphism, comprising: a direct nucleotide sequencing method; a PCR-allele-specific oligonucleotide.
(ASO) and dot blot hybridization analysis,
Single nucleotide extension method, PCR-Single-chain higher order structural polymorphism (SSCP) analysis, PCR-
2. The method for detecting a bronchial asthma onset risk factor according to claim 1, which is performed by a method including at least one selected from the group consisting of restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP) analysis, invader method and quantitative real-time PCR detection method. 【請求項１０】遺伝子の多型の検出が、制限酵素Nla IV
を用いたPCR-RFLP分析により行われる請求項9に記載の
気管支喘息発症危険因子の検出方法。10. The method for detecting a polymorphism in a gene comprises detecting the restriction enzyme Nla IV.
10. The method for detecting a risk factor for developing bronchial asthma according to claim 9, wherein the method is carried out by PCR-RFLP analysis using PCR. 【請求項１１】請求項1から8のいずれかに記載の検出方
法に用いられるPCR反応用プライマーまたはプローブと
してのオリゴヌクレオチド。An oligonucleotide as a primer or probe for a PCR reaction used in the detection method according to any one of claims 1 to 8. 【請求項１２】配列番号19から36のいずれかから選択さ
れる請求項11に記載のPCR反応用プライマーまたはプロ
ーブとしてのオリゴヌクレオチド。12. The oligonucleotide as a primer or probe for a PCR reaction according to claim 11, which is selected from any one of SEQ ID NOs: 19 to 36. 【請求項１３】請求項11または12に記載のオリゴヌクレ
オチドを有効成分として含有する、請求項1に記載の気
管支喘息発症危険因子の検出方法のためのキット。13. A kit for detecting a bronchial asthma onset risk factor according to claim 1, comprising the oligonucleotide according to claim 11 or 12 as an active ingredient. 【請求項１４】制限酵素Nla IVを有効成分として含有す
る、請求項10に記載の気管支喘息発症危険因子の検出方
法のためのキット。14. The kit for detecting a bronchial asthma onset risk factor according to claim 10, comprising the restriction enzyme Nla IV as an active ingredient. 【請求項１５】配列番号1に記載のヒトＩκβ関連蛋白
のアミノ酸配列番号の816番目のIleのLeuへの変異、830
番目のIleのMetへの変異、1072番目のCysのSerへの変異
および1158番目のProのLeuへの変異からなる群から選ば
れる少なくとも1種のアミノ酸変異を有するアミノ酸配
列をコードするヒトＩκβ関連蛋白遺伝子。15. A mutation of Ile at position 816 of the human Iκβ-related protein of SEQ ID NO: 1 to Leu, 830.
A human Iκβ-encoding amino acid sequence having at least one amino acid mutation selected from the group consisting of a mutation of the Ile to Met, a mutation of the 1072 Cys to Ser, and a mutation of the 1158 th Pro to Leu Protein gene. 【請求項１６】配列番号2に記載のヒトＩκβ関連蛋白
遺伝子のコード領域の819番目のTのCへの変異、2295番
目のGのAへの変異、2446番目のAのCへの変異、2490番目
のAのGへの変異、3214番目のTのAへの変異および3473番
目のCのTへの変異からなる群から選ばれる少なくとも1
種の核酸変異を有するヒトＩκβ関連蛋白遺伝子。16. A mutation of T to C at position 819, a mutation of G to A at position 2295, a mutation of A to C at position 2446 of the coding region of the human Iκβ-related protein gene set forth in SEQ ID NO: 2, At least one selected from the group consisting of 2490th A mutation to G, 3214th T to A mutation, and 3473th C to T mutation
A human Iκβ-related protein gene having a species nucleic acid mutation. 【請求項１７】配列番号2に記載のヒトＩκβ関連蛋白
遺伝子のコード領域の819番目、2295番目、2446番目お
よび2490番目の核酸がそれぞれT、G、AおよびAであり且
つ3214番目のTのAへの変異および3473番目のCのTへの変
異を有するTGAAATハプロタイプであるヒトＩκβ関連蛋
白遺伝子。17. The nucleic acids at positions 819, 2295, 2446 and 2490 of the coding region of the human Iκβ-related protein gene set forth in SEQ ID NO: 2 are T, G, A and A, respectively, and A human Iκβ-related protein gene which is a TGAAAT haplotype having a mutation at A and a mutation at C at position 3473.
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