JP2002214237A

JP2002214237A - 検出方法

Info

Publication number: JP2002214237A
Application number: JP2001389544A
Authority: JP
Inventors: Carsten Schelp; カーステン・シェルプ; Hans-Erwin Pauly; ハンス−エルヴィーン・パウリ
Original assignee: Dade Behring Marburg GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2001-12-21
Publication date: 2002-07-31
Anticipated expiration: 2021-12-21
Also published as: US7867781B2; DE50109428D1; CA2365565C; ATE322686T1; US20100311185A1; EP1219964A1; EP1219964B1; CA2365565A1; DE10064827A1; JP4163869B2; ES2258503T3

Abstract

(57)【要約】【課題】サンプル中の分析物を定量的または定性的に
検出する新規な方法の提供。【解決手段】本方法では、高用量フック効果を回避、
減少および／または検出する目的で、サンプルを分析物
特異的結合パートナーＲ１（これは固相と結合してい
る）、分析物特異的結合パートナーＲ２（これは標識Ｌ
１と結合している）、および分析物特異的結合パートナ
ーＲ３（これは標識Ｌ２と結合している）とインキュベ
ーションし、さらに、Ｌ１依存測定シグナルをＬ２依存
もしくはＬ１プラスＬ２依存測定シグナルと異なる時間
に測定するか、または異なる測定方法を用いて測定す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、サンプル中の分析物を定量的ま
たは定性的に検出する方法に関する。

【０００２】

【従来技術】多様な検査方法（例えばサンドイッチイム
ノアッセイと呼ばれるもの）が分析物の検出に用いられ
ている。そのようなイムノアッセイでは、２つの抗体が
検出されるべき分析物上の２つのエピトープと結合し、
その結果“サンドイッチ複合体”が形成される。

【０００３】不均一系サンドイッチイムノアッセイで
は、抗体の１つは固相（例えばマクロ定量プレート、磁
性粒子など）に結合され、サンドイッチ複合体を液相か
ら分離させるために用いられる。一方、他方の抗体は、
免疫複合体を検出する目的で検出可能標識（例えば酵
素、蛍光標識、化学発光標識など）を含んでいる。これ
らの検査方法はさらに、一工程サンドイッチイムノアッ
セイと呼ばれるものおよび二工程サンドイッチイムノア
ッセイと呼ばれるものにさらに細分される。一工程サン
ドイッチイムノアッセイでは、２つの抗体試薬は同時に
サンプルとインキュベーションされ、二工程サンドイッ
チイムノアッセイでは、サンプルは先ず固相試薬とイン
キュベーションされ、分離および洗浄工程の後で固相に
結合した抗体−抗原複合体は検出試薬とインキュベーシ
ョンされる。

【０００４】均一系サンドイッチイムノアッセイ（例え
ば比濁ラテックス検査）では、抗体試薬はサンプルとと
もにインキュベーションされ、工程中のいずれの時点で
も分離または洗浄工程が実施されることなく測定が行わ
れる。換言すれば、遊離分析物から抗体結合分析物の分
離は実施されない。

【０００５】均一系サンドイッチイムノアッセイと同様
に、一工程イムノアッセイは、より迅速に実施できるこ
とおよび自動化がより簡単であることが利点である。し
かしながら、サンプル中の分析物の濃度が非常に高いと
き、このような検査方法の場合は根源的な問題が発生す
る。例えば、アルブミン、免疫グロブリン、β２−ミク
ログロブリン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣ
Ｇ）、フェリチンおよびα−フェトプロテイン（ＡＦ
Ｐ）のような分析物はサンプル中に非常に高濃度で存在
することが知られている。標識抗体とのインキュベーシ
ョン前に未結合分析物が除去されないとき（二工程サン
ドイッチイムノアッセイの場合のように）、抗体の結合
部位はサンドイッチ複合体を形成する前に飽和されてし
まう。分析物の濃度が増加するサンプルの場合には、測
定シグナルは最初増加し、続いてその先の特定の限界濃
度からもう一度減少し始める。“プロゾーン効果”また
は“高用量フック効果”としても知られ、以下に示すよ
うに、非常に高濃度の分析物を含むサンプルから得られ
る測定シグナルは標準曲線の領域内に見出され、このよ
うなサンプルの分析物濃度を不正確に特定し、すなわち
過小に見積もることとから“フック効果”と呼ばれる。

【０００６】したがって、一工程イムノアッセイまたは
均一系サンドイッチイムノアッセイを、限界濃度が可能
なかぎり高い分析物濃度範囲、または望ましくは自然に
存在する分析物濃度範囲へシフトするようにデザインす
ることが重要である。さらに別の対策または選択肢は、
サンプルを適当に希釈した後で分析物濃度を決定できる
ようにフックサンプルを登録するという処理工程を導入
することである。比濁度分析試験に関連して、Papik 等
は、反応動力学の分析のために非常に精巧なコンピュー
ター解析を用いて前記の目的を達成することを提唱して
いる。

【０００７】EP-A1-0 787 986 では、アフィニティーク
ロマトグラフィーで精製したポリクローナル抗体をその
ような試験で使用することが提唱された。しかしなが
ら、前記の方法は全ての検査方法で用いることができる
わけではなく、特に非免疫化学的検査では適用できな
い。さらに、ポリクローナル抗体は検出しようとする全
ての分析物について利用可能なわけではない。

【０００８】US 4,590,169 および US 4,595,661 に
は、異なる親和性をもつ抗体を使用することによってフ
ック効果を減少させることが記載されている。US 4,59
5,661によれば、サンプルはポリスチレン球結合抗体お
よび２つのセイヨウワサビペルオキシダーゼ抗体共役
物、すなわち検出されるべき蛋白質上の異なるエピトー
プと結合する３種の抗体および互いに顕著に異なる親和
性を示す２種の酵素標識抗体とともにインキュベーショ
ンされる。インキュベーション後、未結合物質は洗浄に
よって除去され、ポリスチレン球に結合した酵素活性が
測定される。このような方法の欠点は、異なる親和性を
もつ抗体を必要とするということである。さらに別の欠
点は、親和性の低い抗体を含む共役物の使用が固相への
高い非特異的結合のためにバックグラウンドシグナルの
増加をもたらすので、このような検査の検出感度が低下
することである。

【０００９】EP-A2-0 617 285 は均一系比濁度分析ｈＣ
Ｇ試験を開示し、この試験ではフック効果を減少させる
ために、サンプルは先ず最初に可溶性抗ｈＣＧ抗体フラ
グメント（分析物に対して少なくとも２つの結合部位を
もつ）とインキュベーションされ；続いて異なるエピト
ープ特異性をもつ抗ｈＣＧ抗体のラテックス結合フラグ
メントが添加され、吸収における変化が測定される。非
標識可溶性抗体の添加によって更なるラテックス粒子の
架橋がもたらされ、結果としてより高い分析物濃度へと
フック効果がシフトされる。しかしながら、均一系比濁
度分析法には、ある種のパラメーターについて要求され
る検出感度が得られないという欠点がある。したがって
当業者にとって、検出方法の開発、特にフック効果を回
避、減少させまたは少なくともフック効果を認識できる
高検出感度を示す検出方法を開発することが必要であ
る。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題および課題を解決する手
段】上記の目的は、請求項１に記載の本発明の方法を提
供することによって達成される。サンプル中の分析物Ａ
を定性的または定量的に検出する本方法では、被検サン
プルは、フック効果を回避および／または減少させるた
めに、分析物Ａ特異的結合パートナーＲ１（固相に結合
されている）、分析物Ａ特異的結合パートナーＲ２（標
識Ｌ１と結合している）、および分析物Ａ特異的パート
ナーＲ３（標識Ｌ２と結合している）とインキュベーシ
ョンされる。結合パートナーＲ２およびＲ３は、インキ
ュベーション混合物中に存在するＲ２結合パートナーの
分析物Ａ結合部位の飽和が、インキュベーション混合物
中に存在するＲ３結合パートナーの分析物Ａ結合部位が
飽和するよりも高い分析物Ａの濃度で発生するかおよび
／またはより後の保温時間で発生するように選択され
る。Ｌ１依存測定シグナルは、Ｌ２依存またはＬ１プラ
スＬ２依存測定シグナルから時間的に離して決定する
か、または別の測定方法を用いて決定する。好ましく
は、それぞれの測定シグナルが、形成されたサンドイッ
チ複合体と結合している標識によって測定されるのが好
ましい。

【００１１】本発明の検査方法は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ
３の添加順序またはサンプルおよびそれぞれの結合パー
トナーとの個々のインキュベーション時間にかかわりな
く実施できる。未結合試薬成分および／またはサンプル
構成成分はまた、測定シグナル計測前に分離工程または
洗浄工程によって除去できる。前記分離および／または
洗浄工程は、例えばＬ１依存測定シグナルの計測後、ま
たはいずれかの測定シグナルの計測前にもまた実施する
ことができる。

【００１２】測定シグナルはいずれの場合にも、例えば
単一の測定値として、平均値として、いくつかの個々の
測定値の中間値またはそれらの合計値として、および／
または速度論の形態で検出できる。“異なる測定方法”
とは、Ｌ２依存測定シグナルまたはＬ１プラスＬ２依存
測定シグナルとは別個にＬ１依存測定シグナルを検出で
きる方法を指す。例えば、標識Ｌ１は微粒子であって比
濁法を用いて測定し、標識Ｌ２は酵素であってその活性
を例えば光量測定によって求めるものであってもよい。
別の検査系では、Ｌ１およびＬ２は２種の蛍光標識であ
って、各々の蛍光は異なる波長で測定される。更なる分
析のためには、例えば、“Ｌ１値”と“Ｌ２値”または
“Ｌ２プラスＬ１値”との比を算出することができ、そ
の場合“値”が測定シグナルを直接意味するか、または
測定シグナルを基準にしてさらに修正を施し前記測定シ
グナルと比例する値を意味することも可能である。この
ようにして求められた比は検査に固有の特徴的な値と比
較することができ、それによって検査実施者または自動
化機械が、フック効果が存在するか否か、および／また
はサンプルを再度適切な希釈で測定するべきかを迅速に
知ることができる。

【００１３】本方法は、フック効果によって種々の程度
で影響を受けるサンドイッチ複合体Ｒ１−Ａ−Ｒ２およ
びＲ１−Ａ−Ｒ３の形成を基にしている。すなわち、測
定シグナルの減少は、Ｒ１−Ａ−Ｒ３サンドイッチ複合
体形成の場合よりもＲ１−Ａ−Ｒ２サンドイッチ複合体
形成の場合により高いサンプル分析物濃度で先ず発生す
る。当業者は、それぞれの事例で先ず第一にＲ１−Ａ−
Ｒ２サンドイッチ複合体形成を測定し、さらにＲ１−Ａ
−Ｒ３サンドイッチ複合体形成を別個の検査方法で測定
することによって、適当な結合パートナーおよび反応条
件を比較的簡単に決定できる。

【００１４】本発明の好ましい実施態様では、結合パー
トナーＲ２およびＲ３は同じ結合パートナーである。こ
の場合には、Ｒ２は、Ｒ２凝集物および／または多数の
Ｒ２分子（これらは分散性固相と結合している）の形で
用いられ、一方、Ｒ３は（少なくともインキュベーショ
ンの初期相では）単独分子として用いられる。

【００１５】Ｒ２およびＲ３はまた異なる結合パートナ
ーでもよい。例えば、Ｒ２として、分析物上にただ１つ
存在する結合部位に対して誘導される結合パートナーを
用い、一方、Ｒ３は分析物上に数回生じる結合部位を認
識するものでもよい。さらにまた、分析物との結合能力
が結合パートナーＲ３よりも弱い結合パートナーＲ２を
用いることも可能である。

【００１６】一般に、検査系の固相Ｒ１および標識Ｒ２
の検出感度（すなわち検出に信頼性がある最低分析物濃
度）は、検査系の固相Ｒ１および標識Ｒ３の検出感度よ
り低いであろう。しかしながら、検査系の固相Ｒ１およ
び標識Ｒ２は、比較的高い分析物濃度においても正確な
濃度値を示すであろう。換言すれば、検査系の“固相Ｒ
１および標識Ｒ２”は、上限測定範囲のカバーに優れ、
検査系の“固相Ｒ１および標識Ｒ３”は下方の測定範囲
のカバーに優れている。Ｌ２依存測定シグナルまたはＬ
１プラスＬ２依存測定シグナルとは別個にＬ１測定シグ
ナル（これはＲ１−Ａ−Ｒ２複合体の形成に比例する）
を検出することによって、本発明の検査方法の測定範囲
の拡大および／またはフック効果の認識が可能になる。
例えば、Ｌ１測定シグナルが標準曲線の最高値よりも高
く、さらにＬ２測定シグナルが標準曲線（検量線とも称
される）内に存在する場合は、それは明らかに“高用量
フックサンプル”の徴候である。フック効果が検出され
たときには、サンプルを再度適正な希釈で検査し、正確
な分析物濃度を決定する。

【００１７】これまでに知られている方法とは対照的
に、本発明の方法はまたイムノアッセイ分野全般、例え
ば特異的結合パートナーとして核酸分子を用いる結合試
験で広く適用可能である。本発明の方法は特別に精製さ
れた抗体または種々の親和性をもつ抗体のいずれも必要
としない。反対に、本発明の方法は好ましい変法では、
Ｒ２およびＲ３は同じ特異的結合パートナーである。さ
らにまた、本発明の方法はより容易に自動化することが
できる。

【００１８】本発明の方法のまた別の利点は測定範囲拡
大の可能性である。したがって、Ｌ１依存測定シグナル
は例えばより高い濃度をもつサンプルの濃度の決定に用
いることができ、一方、Ｌ２依存測定シグナルはより低
い濃度をもつサンプルの濃度を決定するために用いられ
る。結果として、希釈を必要とするサンプルの数は減少
する。

【００１９】Ｌ１およびＬ２および／または他の方法パ
ラメーター（例えばインキュベーション混合物中のＲ２
および／またはＲ３の濃度）を適切に選択することによ
って、測定範囲の広さおよびフック効果の検出の確かさ
にもかかわらず、固相へのＲ２−Ｌ１の非特異的結合が
検出感度に影響を与えないように（これはＲ１−固相お
よびＲ３−Ｌ２系によって確認できる）、本発明の方法
を最適化することができる。

【００２０】本発明の方法はまた、特定の結合パートナ
ーと分析物が交差反応するために、均一系サンドイッチ
アッセイおよび／または一工程サンドイッチアッセイを
用いた場合測定が非常に困難な分析物の場合に特に有利
に用いることができる。したがって、α鎖に対する抗体
およびβ鎖の黄体形成ホルモン（ＬＨ）特異的部分に対
する抗体を利用するイムノアッセイを用いてＬＨを測定
するのが一般的である。ｈＣＧがたまたまサンプル中に
大量に存在する場合は、一工程サンドイッチ試験および
／または均一系検査ではα鎖に対して作製された抗体の
全てまたはほとんど全ての結合部位がｈＣＧ分子で封鎖
されることになる。結果として抗体−ＬＨ−抗体サンド
イッチ複合体は形成されず、サンプル中のＬＨの濃度は
不正確に決定される。本発明の方法を用いれば、これま
でのような二工程サンドイッチ試験を用いるよりはるか
に迅速な一工程サンドイッチ試験を用いて前記のような
分析物を測定することができる。このような事例では、
Ｒ１は、この結合パートナーが分析物と交差反応物質を
等しく良好に認識できるように選ばれ、Ｒ２およびＲ３
はそれぞれ、分析物または交差反応物質のいずれかを特
異的に認識する。本発明の例証のために上記の例を続け
ると、本発明では例えばＲ１としてα鎖に対して作製さ
れた抗体、Ｒ２として特定の抗ｈＣＧ抗体、およびＲ３
として特定の抗ＬＨ抗体が使用される。Ｌ１シグナル
（Ｒ１−ｈＣＧ−Ｒ２サンドイッチの形成に依存する）
は、ＬＨの濃度を正確に決定するためにサンプルを例え
ば二工程免疫アッセイで再度測定する必要があるのか否
かを示す。本発明のこの方法はまた、抗体の測定、特に
特定の免疫グロブリンクラス（例えばＩｇＭ）（特定
の、例えばウイルスまたは細菌抗原に対して作製された
もの）の測定に類似の態様で用いることができ、サンプ
ル中に存在する他の抗体が極めて過剰に存在することを
許容する。本発明の方法を上記のように使用すること
も、“フック効果の検出、回避および／または減少のた
めに”という表現で本発明の範囲内に包含される。

【００２１】本発明の好ましい実施態様は請求の範囲第
２項〜１９項に記載されている。これらの実施態様およ
び他の実施態様をさらに詳細に説明する前に、本発明の
理解を深めるためにいくつかの用語を明らかにしよ
う。。“定量的検出”では、サンプル中の分析物の量ま
たは濃度が測定される。“定量的検出”という用語はま
た、サンプル中の分析物のおおよその量または濃度のみ
を検出するか、または相対的な量または濃度値を提供す
るために用いることができる半定量法を包含する。“定
性的検出”とは、分析物がサンプル中に存在しているか
否かを検出するか、またはサンプル中の分析物の濃度が
ある閾値またはいくつかの閾値以下または以上であるこ
とを示すと理解されるべきである。

【００２２】“分析物”と言う用語は、本検査方法で検
出されるべき物質を指す。分析物の例は EP-A2-0 515 1
94 の８〜１５ページに挙げられている。分析物は特異
的結合対の構成成分の１つとなることができる。分析物
は１つの結合部位（一価、通常はハプテン）をもつか、
または複数の結合部位（多価）をもつことができる。免
疫化学的検査では、そのような結合部位はしばしばエピ
トープとも称される。さらにまた、分析物は単独の物質
でも、共同で少なくとも１つの結合部位をもつ物質群で
もよい。

【００２３】通常は一価の分析物は約１００から２００
０、特に１２５から１０００の分子量をもつ。多くのオ
リゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴサッカライ
ド、薬剤、医薬、代謝物質、殺虫剤などは“一価分析
物”という用語に包含される。多価分析物は通常は５０
００以上、通常１００００以上の分子量をもつ。多価分
析物の例は、ポリペプチド、多糖類、核酸、細胞、細胞
構成成分（染色体、遺伝子、ミトコンドリアおよびその
他のの細胞小器官、細胞膜などを含む）である。検出さ
れるべき物質はしばしば蛋白質である。そのような蛋白
質は１つの蛋白質族に属し、前記蛋白質族の構成員の蛋
白質は、類似の構造的特性および／または類似の生物学
的機能を有することを特徴とする。分析物として重要な
蛋白質族の例は、病原体、免疫グロブリン、サイトカイ
ン、酵素、ホルモン、腫瘍マーカー、代謝マーカー、組
織特異的抗原、ヒストン、アルブミン、グロブリン、硬
蛋白質、ホスホプロテイン、ムチン、色素蛋白質、リポ
蛋白質、核蛋白質、糖蛋白質、プロテオグリカン、レセ
プター、ＨＬＡ、凝固因子、心筋梗塞マーカーなどであ
る。分析物として重要なその他の例は、一本鎖および二
本鎖オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドであ
る。

【００２４】本発明では、“サンプル”とは、おそらく
検出されるべき物質（分析物）を含んでいると推定され
る素材を指す。サンプルという用語は、例えば生物学的
液体または組織、特に人間および動物に由来するもの、
例えば血液、血漿、血清、喀痰、滲出物、気管支肺胞洗
浄液、リンパ液、滑液、***、膣粘液、糞便、尿、脊髄
液、毛髪、皮膚および組織サンプルまたは切片を包含す
る。前記用語はまた、細胞培養サンプル、植物液または
組織、法医学的サンプル、水および廃液サンプル、食品
および医薬品を包含する。サンプルは、本検出方法が分
析物に到達し易いように、またはサンプル中の干渉成分
を除去するために前以て処理を施す必要があるかもしれ
ない。そのようなサンプルの予備処理には、細胞の分離
および／または溶解、沈殿、サンプル構成成分（例えば
蛋白質）の加水分解もしくは変性、サンプルの遠心、有
機溶媒（例えばアルコール（特にメタノール))によるサ
ンプルの処理、または洗剤によるサンプルの処理が含ま
れよう。サンプルはしばしば、検出方法にできるかぎり
干渉しない別の（通常は水性）媒体に移される。分析物
はまた増幅させてもよい。例えば、核酸の増幅は検出さ
れるべき核酸の１つまたは２つ以上のコピーの生成をも
たらす。そのような増幅方法は当業者には周知で、例え
ば“ポリメラーゼ連鎖反応”（ＰＣＲ）、“リガーゼ連
鎖反応”（ＬＣＲ）、“Ｑベータレプリカーゼによる増
幅”、“核酸配列依存増幅”（ＮＡＳＢＡ）、“シング
ルプライマー増幅”（ＡＳＰＰ）および他の方法であ
る。

【００２５】“特異的結合パートナー”とは、特異的結
合対の構成員の１つであると解されるべきである。特異
的結合対の構成員は２つの分子で、前記分子は、それぞ
れの事例で、相手の分子がもつ構造に対して相補的な少
なくとも１つの構造を有し、これら２つの分子は互いに
結合する相補性構造によって互いに結合することができ
る。分子という用語はまた分子複合体、例えばアポ酵素
および補酵素で構成される酵素、いくつかのサブユニッ
トで構成される蛋白質、蛋白質および脂質で構成される
リポ蛋白質などを包含する。特異的結合パートナーは自
然に存在する物質でも、またはその他のもの、例えば化
学合成によって、もしくは微生物学的技術および／また
は遺伝子組み換え法によって製造される物質でもよい。
したがって、特異的結合パートナーは、ファージディス
プレーライブラリーによって、合成ペプチドデータベー
スによって、または“遺伝子組み換え抗体ライブラリ
ー”（Larrick & Fry, Human Antibodies and Hybridom
as, 2:172-189(1991)）によって選択することができ
る。

【００２６】特異的結合パートナーという用語の説明の
ために以下のものが例示されよう（ただしこれらに限定
されない）：チロキシン結合グロブリン、ステロイド結
合蛋白質、抗体、抗原、ハプテン、酵素、レクチン、核
酸、リプレッサー、オリゴヌクレオチドおよびポリヌク
レオチド、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ス
トレプトアビジン、ビオチン、補体成分Ｃ１ｑ、核酸結
合蛋白質など。特異的結合対の例は以下のとおりであ
る：抗体／抗原、抗体／ハプテン、オペレーター／リプ
レッサー、ヌクレアーゼ／ヌクレオチド、ビオチン／ア
ビジン、レクチン／多糖類、ステロイド／−ステロイド
結合蛋白質、活性化合物／活性化合物レセプター、ホル
モン／ホルモンレセプター、酵素／基質、ＩｇＧ／プロ
テインＡ、相補性オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレ
オチドなど。

【００２７】本発明では、“抗体”という用語は、免疫
グロブリン、例えば以下のクラスまたはサブクラスの免
疫グロブリンを指す：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ
₁、ＩｇＧ_2a、ＩｇＧ_2b、ＩｇＧ₃、ＩｇＧ₄、ＩｇＭ。
抗体は、抗原またはハプテン上のエピトープ（しばしば
抗原決定基とも呼ばれる）に対して少なくとも１つの結
合部位を有する。前記エピトープはその空間的構造およ
び／または極性および／または非極性基の存在において
特徴を有する。抗体の結合部位はエピトープと相補的で
ある。抗原抗体反応またはハプテン抗体反応は、“鍵と
鍵穴の法則”と呼ばれるものにしたがって機能し、一般
に極めて特異的である。すなわち、抗体は、抗原または
ハプテンの一次構造、荷電、空間的構造、立体的配置に
おける小さな相違を識別できる。抗体の”相補性決定領
域”と称されるものは、抗原またはハプテンと抗体の結
合に対して特別な働きをする。

【００２８】“抗原”という用語は一価および多価抗原
を包含する。多価抗原は、２つ以上の免疫グロブリンが
同時に結合できる分子または分子複合体で、一方、一価
抗原の場合はそれぞれの事例で一時にただ１つの抗体だ
けが結合できる。ハプテンとは通常は、それ自身では免
疫原性をもたず、免疫を誘発するためには通常は担体に
結合させられる分子に与えられた名称である。

【００２９】本発明では、“抗体”という用語は、完全
な抗体だけではなく特に抗体フラグメント（例えばＦａ
ｂ、Ｆｖ、Ｆ(ａｂ′)₂およびＦａｂ′）も意味し、さ
らにまたキメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異的抗体、複
数特異的抗体、または”一本鎖”抗体も意味し、さらに
また、抗原またはハプテンと結合する特性を提供する免
疫グロブリンおよび／またはそのフラグメントの凝集
物、ポリマーおよび共役物も含まれる。抗体フラグメン
トは、例えば抗体の酵素（例えばペプシンまたはパパイ
ン）による切断によって製造できる。抗体凝集物、抗体
ポリマーおよび抗体共役物は、多様な方法、例えば熱処
理によって、グルタールアルデヒドのような物質と反応
させることによって、免疫グロブリン結合分子との反応
によって、ビオチン付加抗体と反応させ続いてストレプ
トアビジンまたはアビジンと反応させることによって、
または他の方法によって製造できる。

【００３０】本発明では、抗体はモノクローナル抗体で
もポリクローナル抗体でもよい。抗体は、通常の方法、
例えば人間または動物（例えばマウス、ラット、モルモ
ット、ウサギ、ラクダ、ウマ、ヒツジ、ヤギまたはニワ
トリ）を免疫し（以下の文献もまた参照されたい：Mess
erschmid, BIOforum, 11:500-502(1996))、続いて坑血
清を単離することによって、またはハイブリドーマ細胞
を樹立し、続いて分泌抗体を精製することによって、ま
たは、抗原および／またはハプテンに天然の抗体を結合
させるために必須のアミノ酸配列をコードするヌクレオ
チド配列またはその改変形のクローニングおよび発現に
よって製造できる。適当な場合には、遺伝子組み換え手
法を用いて植物細胞（例えば酵母細胞）（Fischer et a
l., Biol. Chem., 380:825-839(1999); Hiatt et al.,
Genetic Engineering, 14:49-64(1992))、動物細胞およ
び原核細胞（例えばWO95/25172を参照されたい）、並び
に単離ヒト細胞で抗体を製造できる。

【００３１】本発明では、“固相”という用語は、多孔
性および／または無孔性で、一般的に水に不溶性の素材
で構成され、極めて多様な形状をもつことができる物
体、例えば器、管、微量定量プレート、球体、微粒子、
ロッド、細片、濾紙またはクロマトグラフィーペーパー
などを包含する。一般に、固相の表面は親水性である
か、または親水性にすることができる。固相は極めて多
様な素材、例えば無機および／または有機素材、合成素
材、天然に存在する素材および／または改変された天然
素材で構成できる。固相素材の例は、ポリマー、例えば
セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテー
ト、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、架橋デキス
トラン分子、アガロース、ポリスチレン、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリメタクリレートおよびナイロ
ン；セラミック；ガラス；金属（特に貴金属、例えば金
および銀）；磁鉄鉱；それらの混合物および組み合わせ
などである。固相という用語はまた細胞、リポソームお
よびリン脂質小胞を含む。

【００３２】固相は、例えばサンプルの構成成分が固相
に非特異的に結合することを抑制または防止するため
に、または分散状態の粒子化固相の安定性を改善するた
めに、または貯蔵安定性、形成安定性の改善のために、
または紫外線、微生物もしくは破壊作用をもつ他の因子
に対する抵抗性の改善のために、１つまたは２つ以上の
層で構成された、例えば蛋白質、炭水化物、親油性物
質、生物系ポリマーまたは有機ポリマー、またはその混
合物で構成された被覆をもつことができる。

【００３３】“結合している”という用語は広く解釈さ
れ、例えば共有結合および非共有結合、直接結合および
間接結合、表面への吸着および陥凹もしくは空洞内への
封入などを包含するものと理解されるべきである。共有
結合の場合、抗体または結合パートナーは固相または標
識と化学結合によって結合される。通常は、共有結合
は、分子の一方の少なくとも１つの原子核が第二の分子
の少なくとも１つの原子核と電子を共有するときに２つ
の分子間で存在するものと考えられる。非共有結合の例
は、表面吸着、空洞内への封入または２つの特異的結合
パートナーの結合である。固相または標識への直接結合
の他に、抗体または結合パートナーはまた、他の特異的
結合パートナーとの特異的相互作用によって固相または
標識に間接的に結合させることができる（例えば EP-A2
-0 411 945 を参照されたい）。このことは実施例を用
いてさらに詳細に説明されるであろう：すなわち、ビオ
チン付加抗体は標識結合アビジンによって標識に結合さ
せることができ、また蛍光抗体共役物は固相に結合させ
た抗フルオレセイン抗体によって固相に結合させること
ができ、また抗体は、免疫グロブリン結合性蛋白質によ
って固相または標識に結合させることができる。

【００３４】“シグナル発生系”は１つまたは２つ以上
の成分を有し、ここで少なくとも１つの成分は検出可能
な標識である。標識とは、それ自体でシグナルを発生さ
せるか、またはシグナル発生を誘発できる任意の分子、
例えば蛍光物質、放射能物質、酵素または化学発光物質
と理解されるべきである。シグナルは、例えば酵素活
性、発光、光の吸収、放出電磁波もしくは放射能放射、
または化学反応によって検出もしくは測定できる。

【００３５】“標識”はそれ自体で検出可能なシグナル
を発生させる能力をもち、その結果更なる成分を必要と
しない。多くの有機分子が紫外光および可視光を吸収
し、光の吸収によってエネルギーが移動した結果、これ
らの分子は励起エネルギー状態に入ることができ、入射
光の波長とは異なる波長をもつ光として吸収エネルギー
を放出する。次に他の標識、例えば放射性同位元素、染
料、並びに磁性および非磁性微粒子は検出可能なシグナ
ルを直接的に発生させることができる。さらに他の標識
は、シグナル発生のためにさらに別の成分を必要とす
る。すなわち、そのような場合にはシグナル発生系はシ
グナル発生に必要な全成分、例えば基質、補酵素、停止
剤、促進剤、付加酵素、酵素生成物と反応する物質、触
媒、活性化物質、補助因子、抑制物質、イオンなどを含
む。

【００３６】適当な標識の例（以下の文献もまた参照さ
れたい：EP-A2-0 515 194；US 5,340,716；US 5,549,83
4；Bailey et al., J. Pharmaceutical & Biomedical A
nalysis 5:649-658(1987)）は、酵素（セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコー
ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラク
トシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼおよびアセチ
ルコリンエステラーゼを含む）；染料；蛍光物質（フル
オレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエ
リトリン、フィコシアニン、臭化エチジウム、５−ジメ
チルアミノナフタレン−１−スルホニルクロリド、およ
び希土類の蛍光キレートを含む）；化学発光物質（ルミ
ノール、イソルミノール、アクリジウム化合物、オレフ
ィン、エノール、エーテル、エナミン、アリールビニル
エーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、ルシゲ
ニン、ルシフェリンおよびエクオリンを含む）；増感剤
（エオシン、９,１０−ジブロモアントラセン、メチレ
ンブルー、ポルフィリン、フタロシアニン、クロロフィ
ル、ローズベンガルを含む）；補酵素；酵素基質；放射
性同位元素（¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹⁴Ｃ、³Ｈ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、
⁵¹Ｃｒ、⁵⁹Ｆ、⁵⁷Ｃｏおよび⁷⁵Ｓｅを含む）；粒子（以
下を含む：磁性粒子または非磁性粒子、好ましくはラテ
ックス粒子でそれ自体例えば染料、増感剤、蛍光物質、
化学発光物質、同位元素または検出可能な他の標識で標
識できるもの）；ゾル粒子（金および銀ゾルを含む）；
それ自体検出可能な標識で標識できるリポソームおよび
細胞などである。

【００３７】シグナル発生系はまた、互いに空間的に近
傍に存在し、検出可能な相互反応に例えばエネルギー供
与体およびエネルギー受容体として加わることができる
成分を包含する。例えば感光剤および化学発光物質（EP
-A2-0 515 194）、感光剤および蛍光発光団（WO 95/068
77）、放射性¹²⁵Ｉおよび蛍光発光団（Udenfriend et a
l., Pro. Natl. Acad. Sci. 82:8672-8676(1985)）、蛍
光発光団および発光団（Mathis Clin. Chem. 39:1953-1
959(1993)）、または蛍光発光団および蛍光消光剤（US
3,996,345）である。

【００３８】成分間の相互反応には、例えば光もしくは
電子放射による、および短命の反応性化学分子による成
分間のエネルギーの直接移動が含まれる。さらにまた、
この用語は、１つまたは２つ以上の他の成分によってあ
る成分の活性が抑制または増強される過程もまた包含す
る。前記過程は例えば、酵素活性の抑制もしくは増強、
または影響を受けた成分によって放出される電磁波の抑
制、強化もしくは変化（例えば波長シフト、極性化）で
ある。成分間の相互反応はまた酵素カスケードを包含す
る。この場合成分とは酵素であり、そのうちの少なくと
も１つは別の酵素のための基質を供給し、最大または最
低速度の基質共役変換をもたらす。

【００３９】一般的に、成分間の効果的な相互反応は、
これら成分が空間的に近接しているとき、すなわち、例
えば数μｍの距離範囲内、特に６００nm未満の距離範囲
内、好ましくは４００nm未満の、極めて好ましくは２０
０nm未満の距離範囲内にあるとき発生する。

【００４０】微粒子はしばしば固相および／または標識
として用いられる。本発明では、“微粒子”という用語
は、直径が少なくとも約２０nmで２０μｍを越えない、
通常は４０nm〜１０μｍ、好ましくは０.１〜１０μ
ｍ、特に好ましくは０.１〜５μｍ、極めて好ましくは
０.１５〜２μｍである粒子を指す。微粒子は規則的な
形状でも不規則な形状でもよい。微粒子は球体でも、球
体様でも、種々の大きさの空洞を含む球体または気孔体
でもよい。微粒子は、有機素材または無機素材、または
それら２つのタイプの素材の混合物もしくは結合物で構
成することができる。微粒子は、多孔性もしくは非多孔
性素材、または膨潤性もしくは非膨潤性素材で構成する
ことができる。微粒子は基本的に任意の密度をもつこと
ができるが、好ましくは水の密度に近い密度、例えば約
０.７〜１.５ｇ／mLの密度をもつ。好ましい微粒子は水
溶液中に分散させることが可能で、かなりの長時間分散
物として安定である。微粒子は透明でも部分的に透明で
も、または不透明でもよい。微粒子はいくつかの層で構
成されていてもよい。それは、例えば“殻付きコア”と
称されるもので、コアと１つまたは２つ以上の外皮層を
有する。微粒子という用語は、例えば染料結晶、金属ゾ
ル、シリカ粒子、ガラス粒子、磁性粒子、ポリマー粒
子、油滴、脂質粒子、デキストラン蛋白凝集物を包含す
る。

【００４１】好ましい微粒子は、水溶液に分散でき、さ
らに水に不溶性のポリマー材、特に置換ポリエチレンで
構成されている粒子である。特に好ましいものは、例え
ばポリスチレン、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポ
リマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル
−ブタジエン−スチレン、ポリビニルアセテート−アク
リレート、ポリビニルピリジンまたはビニルクロリド−
アクリレートで構成されたラテックス粒子である。例え
ば特異的結合パートナーをラテックス粒子に共有結合さ
せることができる反応基、例えばカルボキシル、アミノ
またはアルデヒド基をもつラテックス粒子は特に重要で
ある。ラテックス粒子の製造は、例えばEP 0 080 614、
EP 0 227 054 および EP 0 246 446 に記載されてい
る。

【００４２】好ましいものは、サンドイッチ様式の不均
一系または均一系結合試験である本発明の方法である。
“均一系結合試験”では、遊離分析物と複合体結合分析
物との分離は実施されない。多くの濁度測定法または比
濁法が以下のアッセイ例で用いられている：これらの方
法で検出に用いられる特異的結合パートナーのラテック
ス粒子への結合を可能にした均一系イムノアッセイ（以
下の文献もまた参照されたい：Boguslaski & Li, Appli
ed Biochemistry and Bio-technology, 7:401-414(198
2)）；ＥＭＩＴ(登録商標)検査；ＣＥＤＩＡ(登録商標)
検査；蛍光偏光イムノアッセイ；発光酸素チャネリング
イムノアッセイ（EP-A2-0 515 194；Ullman et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci., 91:5426-5430(1994); Ullman e
t al., Clinical Chemistry, 42:1518-1526(1996)）な
ど。遺伝子プローブ検査と称されるものでは、特異的結
合パートナーは一般に核酸で、これらは検出されるべき
核酸の部分に対して少なくとも部分的に相補的である。

【００４３】“不均一系結合試験”の特徴は１つまたは
２つ以上の分離工程および／または洗浄工程である。分
離は、例えば免疫沈殿、ポリエチレングリコールまたは
硫安のような物質による沈殿、濾過、磁性分離または固
相（例えば管、球体、微量定量プレートのウェルまたは
濾紙もしくはクロマトグラフィー紙）への結合によって
実施できる。

【００４４】“サンドイッチ様式の不均一試験”では、
通常は分析物は、固相に結合した特異的結合パートナー
およびシグナル発生系の成分に結合している特異的結合
パートナーと結合する。この場合、特異的結合パートナ
ーは例えばサンドイッチイムノアッセイでは同一でも異
なっていてもよく、分析物に特異的なモノクローナル抗
体を捕捉剤（例えば固相抗体として）および標識抗体の
両方に用いることができる（分析物がこの抗体に対して
２つ以上のエピトープをもつ場合）。サンドイッチイム
ノアッセイの場合には、特異的結合パートナーは分析物
特異的抗体であるか、または分析物それ自体が抗体であ
る場合は抗原および／または“改変抗原”（例えば標識
抗原、抗原フラグメントまたは抗原類似体）であろう。
そのようなサンドイッチ複合体の例は以下のとおりであ
る：固相−抗体＜＞分析物＜＞抗体−標識、または固相
−抗原＜＞分析物（＝抗体）＜＞抗原−標識。

【００４５】本発明では、“間接イムノアッセイ”は不
均一イムノアッセイの特別な実施態様である：すなわ
ち、この場合は分析物は抗体である。特異的結合パート
ナーの１つはその抗原および／または改変抗原で、他方
の特異的結合パートナーは一般に、分析物および／また
は免疫グロブリン結合性蛋白質と結合する抗体である。
間接イムノアッセイで形成されるそのような複合体の例
は以下のとおりである：固相−抗ＩｇＭ抗体＜＞分析物
（＝抗ＨｂｓＡｇＩｇＭ）＜＞ＨｂｓＡｇ−標識または
固相−ＨｂｓＡｇ＜＞分析物（＝抗ＨｂｓＡｇＩｇＧ）
＜＞蛋白Ａ−標識。間接イムノアッセイを含む上記のサ
ンドイッチ試験はまた均一試験法としても実施できる
（例えば EP-A2-0 515 194 を参照されたい）。

【００４６】本発明の方法の好ましい実施態様は以下の
とおりである：（ｉ）サンプルは分析物Ａに特異的な結
合パートナーＲ１（これは固相に結合されている）、分
析物Ａ特異的結合パートナーＲ２（これは標識Ｌ１と結
合されている）、および分析物Ａ特異的結合パートナー
Ｒ３（これは特異的結合対構成員Ｘと結合している）と
インキュベーションされ；（ii）その後、標識Ｌ２（こ
れは特異的結合対の結合対構成員Ｙ（Ｘに対応してい
る）と結合している）が検査混合物に添加され；（ii
i）測定シグナルが少なくとも２度、時間Ｔ１および時
間Ｔ２で測定されが、ここでより早い時間Ｔ１は遅くと
も標識Ｌ２（これは結合対構成員Ｙに結合している）の
添加後まもなくで、後の時間Ｔ２は標識Ｌ２（結合対構
成員Ｙに結合している）の添加後である。

【００４７】“標識Ｌ２の添加後まもなく”と定義され
る時間は、“標識Ｌ２の添加からＬ１の測定まで”の時
間が、“標識Ｌ２の添加から標識Ｌ２の測定まで”の時
間と比較して短いものと理解されるべきである。すなわ
ち、前記時間は、“標識Ｌ２の添加から標識Ｌ２の測定
まで”の時間の好ましくは３０％未満、特に好ましくは
１５％未満である。特に好ましい方法では、時間Ｔ１は
標識Ｌ２の添加前である。

【００４８】本発明の別の好ましい実施態様は以下のよ
うなものである：（ｉ）サンプルは分析物Ａ特異的結合
パートナーＲ１（これは固相に結合されている）、分析
物Ａ特異的結合パートナーＲ２（これは標識Ｌ１と結合
されている）、および分析物Ａ特異的結合パートナーＲ
３（これは特異的結合対構成員物質Ｘと結合している）
と保温され；（ii）その後、標識Ｌ２（これは特異的結
合対の結合対構成員物質Ｙ（Ｘに対応している）と結合
している）が検査混合物に添加され；（iii）Ｌ１の測
定シグナルおよびＬ２の測定シグナルが異なる測定方法
を用いて決定される。

【００４９】標識Ｌ１は例えば微粒子で、標識Ｌ２は蛍
光標識または化学発光標識であろう。この場合、測定シ
グナルＬ１は濁度測定または比濁法によって決定でき、
Ｌ２の測定シグナルは蛍光測定装置または化学発光測定
装置を用いて決定できるであろう。本発明の別の実施態
様では、Ｌ１およびＬ２は、例えば異なる蛍光標識で、
その蛍光はそれぞれ異なる波長で検出される。

【００５０】上記の方法で特に好ましい結合対Ｘ＜＞Ｙ
は、特にビオチン＜＞アビジン、ビオチン＜＞ストレプ
トアビジン、またはハプテン＜＞抗ハプテン抗体（例え
ばフルオレセイン＜＞抗フルオレセイン、ジゴキシン＜
＞抗ジゴキシン）、または抗原＜＞抗抗原抗体（例えば
ペルオキシダーゼ＜＞抗ペルオキシダーゼ）、または核
酸対である。

【００５１】本発明の特に好ましい実施態様はＬＯＣＩ
(登録商標)法による検査である。この場合、サンプルは
分析物Ａ特異的結合パートナーＲ１（これは増感粒子に
結合されている）、分析物Ａ特異的結合パートナーＲ２
（これは化学発光粒子と結合されている）、および分析
物Ａ特異的結合パートナーＲ３（これは特異的結合対構
成員物質Ｘ、好ましくはビオチンと結合している）と保
温され；（ii）その後、化学発光粒子（これは特異的結
合対の結合対構成員物質Ｙ（Ｘに対応している）、好ま
しくはストレプトアビジンおよび／またはアビジンと結
合している）が検査混合物に添加され；さらに（iii）
測定シグナルを少なくとも２度、時間Ｔ１および時間Ｔ
２で測定するが、ここでより早い時間Ｔ１は遅くとも化
学発光粒子（これは結合対構成員物質Ｙに結合してい
る）の添加後まもなくで、後の時間Ｔ２は化学発光粒子
（結合対構成員物質Ｙに結合している）の添加後であ
る。増感粒子と結合する増感剤分子は、励起状態のとき
一重項酸素を発生させることができる。この一重項酸素
は、閃光の発生で再度分解して形成される準安定化合物
により化学発光粒子と結合している化学発光物質と反応
することができる。一重項酸素は水溶液中でのみ短時間
安定であるので、光を放出するために励起される化学発
光粒子は、例えば免疫複合体の形成の結果として、励起
された増感粒子のすぐ近傍にあるものだけである。測定
できる放出光の波長は、化学発光粒子で適当な蛍光染料
を用いることによって変えることができる。ＬＯＣＩ
(登録商標)法の詳細な記述は例えば EP-A2-0 515 194
で見いだすことができる。“増感粒子"という用語は、
特に、光を照射されたときに一重項酸素を産生する１つ
または２つ以上の染料で標識された微粒子を指す。“化
学発光粒子”という用語は、特に、光を放出しながら一
重項酸素と反応する染料を含む微粒子を指す。

【００５２】本発明の方法では、Ｒ１およびＲ２、Ｒ１
およびＲ３、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３、またはＲ２および
Ｒ３は同じ結合パートナーであってもよい。これは、特
に、検出されるべき分析物が少なくとも２つの同一の結
合部位をもつ場合に適用される。例えば、多くの細菌抗
原または多くの腫瘍マーカーは反復エピトープをもち、
その結果、いくつかのモノクローナル抗体コピーがこれ
らの抗原に結合できる。そのような抗原を検出する本発
明の検査方法では、したがってそのようなモノクローナ
ル抗体を結合パートナー、“Ｒ１およびＲ２”、“Ｒ１
およびＲ３”、“Ｒ２およびＲ３”または“Ｒ１、Ｒ２
およびＲ３”として用いられる。特に好ましい実施態様
では、Ｒ２およびＲ３は同じ結合パートナーでＲ２は好
ましくは分散性固相に結合されている必要がある。

【００５３】さらにまた、本発明の方法では、Ｌ１およ
びＬ２は同じ標識、例えば化学発光粒子であってもよ
い。したがって、そのような場合には化学発光粒子の測
定シグナルは標識Ｌ１として濁度測定または比濁法によ
って決定され、化学発光粒子の測定シグナルは、標識Ｌ
２プラスＬ１としてルミノメーターを用いて決定でき
る。別の実施態様では、化学発光粒子の測定シグナルは
標識Ｌ１として測定され、化学発光粒子の測定シグナル
は、標識Ｌ２プラスＬ１としてそれぞれ異なる時間にル
ミノメーターを用いて決定できる。

【００５４】本発明の特に好ましい方法では、固相は分
散性固相、例えばラテックス粒子または磁性粒子であ
る。分散性固相はまた、それが微粒子から成る場合は標
識として機能する。ラテックス粒子、磁性粒子および増
感粒子は特に好ましい固相の例である。結合パートナー
Ｒ２が分散性固相に結合している本発明の方法はまた、
特にそれらが前記固相に共有結合によって結合している
場合は非常に好ましい。この場合、特に分散性固相は微
粒子、特に好ましくは標識Ｌ１を構成する微粒子で構成
され、または極めて好ましくは化学発光粒子で構成され
る。

【００５５】本発明の別の好ましい方法は、サンドイッ
チ形成の結果として、シグナル発生系の成分（標識Ｌ１
および／または標識Ｌ２を含む）が互いに、これら成分
間における相互作用（特にエネルギー移転）を可能にす
る距離に置かれ、さらに相互作用の程度が測定される方
法、例えばＬＯＣＩ(登録商標)を基にした上記および実
施例で述べる方法である。本発明の特に好ましい方法で
は、シグナル発生系は、微粒子に結合した感光剤および
微粒子に結合した化学発光物質を包含する。

【００５６】さらにまた、本発明は、サンプル中の分析
物Ａを定量的または定性的に検出する方法、特に均一系
サンドイッチ試験でフック効果を検出、回避および／ま
たは減少させるために、分析物Ａ特異的結合パートナー
Ｒ１（これは固相に結合している）、分析物Ａ特異的結
合パートナーＲ２（これは標識Ｌ１に結合している）お
よび分析物Ａ特異的結合パートナーＲ３（これは標識Ｌ
２に結合している）を使用することを包含する。この場
合、インキュベーション混合物中に存在する結合パート
ナーＲ２の分析物Ａ結合部位の飽和は、より高い分析物
Ａ濃度で生じるか、および／または、結合パートナーＲ
３（インキュベーション混合物中に存在する）の分析物
Ａ結合部位の飽和よりも後のインキュベーション時間で
生じ、Ｌ１依存測定シグナルは、Ｌ２依存もしくはＬ１
プラスＬ２依存測定シグナルとは異なる時間に決定され
るか、または、異なる測定方法を用いて決定される。

【００５７】本発明はまた、サンプル中の分析物Ａを定
量的または定性的に検出する方法、特に均一系サンドイ
ッチ試験でフック効果を検出、回避および／または減少
させるために、分析物Ａ特異的結合パートナーＲ１（こ
れは固相に結合している）、分析物Ａ特異的結合パート
ナーＲ２（これは標識Ｌ１に結合している）、分析物Ａ
特異的結合パートナーＲ３（これは特異的結合対の構成
員物質Ｘに結合している）、および標識Ｌ２（これは特
異的結合対の結合対構成員物質Ｙ（Ｘに対応する）に結
合している）を使用することを含む。インキュベーショ
ン混合物中に存在する結合パートナーＲ２の分析物Ａ結
合部位の飽和は、より高い分析物Ａの濃度で生じるか、
および／または、結合パートナーＲ３（インキュベーシ
ョン混合物中に存在する）の分析物Ａ結合部位の飽和よ
りも後のインキュベーション時間で生じる。

【００５８】本発明の別の特徴は、サンプル中の分析物
Ａを定量的または定性的に検出するための不均一系また
は均一系サンドイッチ試験用テストキットである。本キ
ットは、分析物Ａ特異的結合パートナーＲ１（これは固
相に結合している）、分析物Ａ特異的結合パートナーＲ
２（これは標識Ｌ１に結合している）および分析物Ａ特
異的結合パートナーＲ３（これは標識Ｌ２に結合してい
る）を、好ましくは別々の容器に含み、さらに本サンド
イッチ試験では、インキュベーション混合物中に存在す
る結合パートナーＲ２の分析物Ａ結合部位の飽和は、よ
り高い分析物Ａ濃度で生じるか、および／または、結合
パートナーＲ３（インキュベーション混合物中に存在す
る）の分析物Ａ結合部位の飽和よりも後のインキュベー
ション時間で生じる。

【００５９】サンプル中の分析物Ａを定量的または定性
的に検出するための本発明のまた別の不均一系または均
一系サンドイッチ試験用テストキットは、分析物Ａ特異
的結合パートナーＲ１（これは固相に結合している）、
分析物Ａ特異的結合パートナーＲ２（これは標識Ｌ１に
結合している）、分析物Ａ特異的結合パートナーＲ３
（これは特異的結合対の構成員物質Ｘに結合してい
る）、および標識Ｌ２（これは特異的結合対の結合対構
成員物質Ｙ（Ｘに対応する）に結合している）を、好ま
しくは別々の容器に含み、さらに本サンドイッチ試験で
は、インキュベーション混合物中に存在する結合パート
ナーＲ２の分析物Ａ結合部位の飽和は、より高い分析物
Ａの濃度で生じるか、および／または、結合パートナー
Ｒ３（インキュベーション混合物中に存在する）の分析
物Ａ結合部位の飽和よりも後のインキュベーション時間
で生じる。特に好ましいものは、分析物Ａ特異的結合パ
ートナーＲ２（標識Ｌ１に結合している）および分析物
Ａ特異的結合パートナーＲ３（特異的結合対の構成員物
質Ｘに結合している）が１つの容器に一緒に収納されて
いる試験キットである。

【００６０】さらにまた、本発明は、本発明の方法を実
施するために必要な成分を含む試験キットに関する。本
発明の試験キットはまた、説明書、希釈緩衝液、標準物
質、コントロール、検査系用試薬および／または検査の
実施に必要な他の構成部材を含むことができる。本発明
の特に好ましい試験キットは、本発明の方法を説明する
説明書を含む。

【００６１】添付図面において：図１は、本発明の好ま
しい検査方法の模式図である（“Ｓ”＝固相）。第一の
工程では、固相−Ｒ１、分析物（“Ａ”；それがサンプ
ルに存在することを条件とする）、Ｒ２−Ｌ１、および
Ｒ３−Ｌ２（またはＲ３−Ｘ）を一緒に混合し、この保
温混合物を時間Ｔ１まで保温する。時間Ｔ１で、結合複
合物である固相−Ｒ１−分析物−Ｒ２−Ｌ１の標識Ｌ１
の測定シグナルを決定する。その後、Ｙ−Ｌ２（Ｒ３−
Ｘの場合のみ）を添加し、インキュベーション混合物を
時間Ｔ２までインキュベーションする。その後、結合複
合体、固相−Ｒ１−分析物−Ｒ３−Ｘ−Ｙ−Ｌ２に存在
する標識Ｌ２の測定シグナルを決定する。Ｌ１およびＬ
２が同じ標識の場合、好ましくは、結合複合体に存在す
る標識Ｌ１およびＬ２の両方の測定シグナルが時間Ｔ２
に決定される。結合標識の測定シグナルを測定する代わ
りに、それぞれの事例で、または選択肢として、標識の
未結合部分の測定シグナル（すなわち、結合複合体には
存在しない保温混合物中の標識）を測定することもまた
可能である。

【００６２】図２は、高用量フックサンプルの決定を示
す。そのようなサンプルは、図のような“Ｔ２シグナル
／Ｔ１シグナル値”に対してプロットされる時間Ｔ２の
シグナルの大きさをもつ。下記に示す実施例は本発明の
いくつかの特徴を実施態様として説明するものであっ
て、制限と解されるべきではない。

【００６３】

【実施例】使用略語：ＡＤＸ＝アミノデキストランビオチン−Ｘ−ＮＨＳ＝スルホスクシンイミジル−６−
（ビオチンアミド）−ヘキサノエートＢＳＡ＝ウシ血清アルブミンＣ−ビーズ−ＡＤｘ＝アミノデキストラン被覆化学発光
粒子Ｃ−ビーズ−ＡＤｘ−ＤｘＡｌ＝アミノデキストランお
よびデキストランアルデヒド被覆化学発光粒子ＣＭＯ＝カルボキシメチルオキシムまたはカルボキシメ
トキシル−アミンヘミヒドロクロリドＤＭＡＰ＝４−ジメチルアミノピリジンＤＭＦ＝ジメチルホルムアミドＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシドＤｘＡｌ＝デキストランアルデヒドＥＤＡＣ＝１−エチル−３−（ジメチルプロピル）カル
ボジイミドＭＥＳ＝２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸ＭＯＰＳ＝３−Ｎ−（モルフォリノ）プロパンスルホン
酸ＮａＢＨ₃ＣＮ＝水素化シアノホウ素ナトリウムＮａＨＣＯ₃＝炭酸水素ナトリウムＮａＯＨ＝水酸化ナトリウムＮＨ₂＝アミノ基スルホ−ＳＭＣＣ＝スルホスクシンイミジル−４−（マ
レイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ートＳＣ−ＡＤｘ＝一重被覆アミドデキストランＳ−ビーズ−ＡＤｘ＝デキストランアルデヒド被覆増感
粒子Ｓ−ビーズ−ＤｘＡｌ−ＳＡＶ＝ストレプトアビジン被
覆Ｓ−ビーズ−ＤｘＡｌＳＴＵＴ＝Ｏ−（Ｎ−スルホスクシンイミジル）−Ｎ,
Ｎ,Ｎ′−テトラメチル−ウロニウムテトラフルオロボ
レートＴＡＰＳ＝３−［Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メ
チルアミノ］−プロパンスルホン酸ナトリウム塩ＴＡＲ＝チオキセン、アントラセン、ルブレントリス＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンＺｎ(ＢＦ₄)₂＝フッ化ホウ素酸亜鉛

【００６４】実施例１：ラテックス粒子の染色１）化学発光粒子ラテックス粒子（Seradyn, カタログ番号8300055010089
0；直径約０.２μｍ）をエチレングリコール、２−メト
キシエタノールおよびＮａＯＨ（６５.４％、３２.２％
および２.３％）で構成された混合物に分散させ、９５
℃±３℃で４０分撹拌する。チオキセン（２０３mg／ｇ
粒子）、１−クロロ−９,１０−ビス（フェニルエチニ
ル）アントラセン（１６mg／ｇ粒子）およびルブレン
（２７mg／ｇ粒子）を２−エトキシ−エタノール溶液中
で３０分、９５℃±３℃でインキュベーションする。前
記２つの混合物を一緒にし、撹拌しながらさらに２０分
インキュベーションする。２０分後、この粒子分散物を
４０℃±１０℃に冷却する。染色された粒子を４３ミク
ロンのメッシュポリエステルフィルターに通し、洗浄す
る（Microgen Lab System）。粒子を先ず最初に、エチ
レングリコールおよび２−エトキシエタノールで構成さ
れた溶媒混合物（７０％および３０％、５００mL／ｇ粒
子）で洗浄し、続いて１０％エタノール（pH１０〜１
１、４００mL／ｇ粒子）で洗浄する。

【００６５】２）増感粒子ラテックス粒子（Seradyn, カタログ番号8300055010089
0；直径約０．２μｍ）を２−エトキシエタノール、エ
チレングリコールおよびＮａＯＨ（６５.４％、３２.２
％および２.３％）で構成された混合物に分散させ、９
５℃±３℃で４０分撹拌する。増感染料（ｔ−ブチルシ
リコーンフタロシアニン）をベンジルアルコールに溶解
し（９２ｇの染料／５mL／ｇ粒子）、９５℃±３℃で３
０分過熱する。この２つのインキュベーション時間が終
了した後、前記混合物を一緒にし、さらに２０分撹拌す
る。この粒子分散物を４０℃±１０℃に冷却し、４３ミ
クロンのメッシュポリエステルフィルターに通し、洗浄
する。粒子を先ず最初に、エチルアルコール（７００mL
／ｇ粒子）で洗浄し、続いて１０％エタノール（pH１０
〜１１、６００mL／ｇ粒子）で洗浄する。

【００６６】実施例２：アミノデキストラン（ＡＤｘ）
の製造アミノデキストランを製造するいくつかの方法が知られ
ている。ここでは１つの方法を示す。撹拌装置および滴
下用ロートを備えた球形のガラス容器に入れた１５０mL
の水にデキストランＴ−５００（Pharmacia, Uppsala,
Sweden；５０ｇ）を溶解してヒドロプロピルデキストラ
ン（１ＮＨ₂／７グルコース）を調製する。前記溶液に
１８.８ｇのＺｎ(ＢＦ₄)₂を添加し、続いて水浴を用い
てこれを８７℃にする。この溶液にエピクロロヒドリン
（３５０mL）を撹拌しながら一滴ずつ３０分以内に添加
する。混合物を８５℃から９５℃でさらに４時間撹拌
し、続いて室温に冷却する。生じたクロロデキストリン
を撹拌しながら３Ｌのメタノールに前記溶液を加えるこ
とによって沈殿させ、その後濾過し、真空オーブンで一
晩乾燥させる。

【００６７】クロロデキストランを２００mLの水に溶解
し、この溶液を２Ｌの３６％アンモニアに添加する。前
記溶液を室温で４日間撹拌し、続いて回転蒸発装置で１
９０mLに濃縮する。濃縮物を二等分し、それぞれゆっく
りと２Ｌのメタノールに添加する。沈殿物を濾過して真
空オーブンで乾燥させる。乾燥沈殿物を５０ｍＭのＭＯ
ＰＳ（pH７.２；１２.５mg／mL）に溶解する。この溶液
を室温で８時間撹拌し、続いて冷却し（４〜８℃）、１
５０００rpmで４５分、Sorvall RC-5B 遠心機で遠心す
る。水１mL中の２３.１ｇの Sulfo-SMCCを１０mLの上清
に添加する。混合物を１時間保温し、その後さらに予備
処理を施すことなく前記染色化学発光粒子の被覆に用い
る（実施例４を参照）。

【００６８】実施例３：デキストランアルデヒド（Ｄｘ
Ａｌ）の製造４リットルのフラスコに入れた水１.５Ｌ中で４００ｇ
のデキストランＴ−５００（Pharmacia, Uppsala, Swed
en）を７０℃で撹拌することによってデキストランアル
デヒドを製造する。この溶液を濾過し、Ｚｎ(ＢＦ₄)₂溶
液（４００mL；水で２５重量％、pH１.８）をアルゴン
下で添加する。アリル−２,３−エポキシプロピルを数
回に分けて（３×５００mL；８〜１０mL／分）７０℃で
添加する。溶液をアルゴン下でさらに１２〜１３時間、
８０℃で撹拌する。その後、反応混合物を冷却し、６Ｌ
の水に添加する。この希釈混合物をミクロゲン（Microg
en）の接線方向流による濾過システムを用いて限外濾過
し、さらに１.０〜１.５Ｌに濃縮する。

【００６９】続いて撹拌しながらアリルオキシデキスト
ランをオゾン化する。オゾンはオゾン発生装置で生成さ
れ、２リットル／分の流速で加圧下（９.０psi）でアリ
ルオキシデキストラン溶液に送られる。１０mLのヘプタ
ノールを泡立ち防止剤として添加する。約１０時間後に
溶液を１０℃に冷却する。５０mLの硫化ジメチルをアル
ゴン下で加える。持続的に１０時間撹拌した後、このデ
キストランアルデヒドをマイクロジェン（Microgen）限
外濾過を用いて精製する。

【００７０】実施例４：アミノデキストラン被覆ＴＡＲ
粒子（Ｃ−ビーズ−ＡＤｘ）の製造１mL（２２mg／mL）の染色した化学発光粒子（実施例
１、パラグラフ１）を０.０５ＭＥＳ（pH６.０）中の１
mLのアミノデキストラン溶液（２０mg／mL；ＭＷ５００
Ｋ，実施例２参照）１mLとＥＤＡＣ３.８mg／mLと混合
する。暗所で室温（“ＲＴ”）で１６時間保温した後、
粒子を０.０５ＭのＭＥＳ２mLで洗浄し、その後、０.
０５ＭのＭＥＳ（１ＭのＮａＣｌ；pH６.０）６mLで洗
浄する。粒子を０.０５ＭのＭＥＳ（pH６.０）１mLに加
える（ＳＣ−ＡＤｘ粒子２２mg／mL）。この粒子を遠心
（Sorval RC-5B Plus または Eppendorf 5415C 遠心
機）により洗浄し、超音波処理（Branson Sonifier 45
0）によって再分散させる。

【００７１】実施例５：Ｃ−ビーズ−ＡＤｘのデキスト
ランアルデヒドによる被覆１mLのデキストランアルデヒド溶液（２０mg／mL；実施
例３参照；ＭＷ５００Ｋ）および２２mg Ｃ−ビーズ−
ＡＤｘ／mLの溶液（０.０５ＭのＭＥＳ；pH６）１mLを
一緒に２mg ＮａＢＨ₃ＣＮ／mLと保温する。３７℃で２
０時間暗所で保温した後、この粒子を５mLのＭＥＳ緩衝
液で２回洗浄する。続いて粒子を０.０５ＭのＭＥＳ、
０.４％Tween 20（pH６）の０.５mLに分散させる（４０
mg Ｃ−ビーズ−ＡＤｘ−ＤｘＡｌ／mL）。

【００７２】実施例６：Ｃ−ビーズ−ＡＤｘ−ＤｘＡｌ
の抗ヒトＩｇＧ抗体による被覆等容積の抗体溶液（０.０５ＭのＭＥＳ（pH５.０）中の
２０mgの抗ヒトＩｇＧ抗体／mL）および粒子分散液
（０.０５ＭのＭＥＳ、０.４％ Tween-20（pH６）中の
４０mg Ｃ−ビーズ−ＡＤｘ−ＤｘＡｌ／mL）を０.５mg
ＮａＢＨ₃ＣＮ／mLの存在下で混合して抗体被覆粒子を
製造する。室温で１６時間保温した後、残りのアルデヒ
ド基を０.０８ＭのＣＭＯ（カルボキシメチルオキシム
またはカルボキシメトキシル−アミン）と３７℃で９０
分反応させる。続いて粒子を適当な緩衝液（トリス緩衝
液、１％ＢＳＡ、０.１％ Zwittergent 3-14）で３〜４
回洗浄する。最後の再分散の後、粒子濃度は１mg／mLで
ある。

【００７３】実施例７：デキストランアルデヒド被覆増
感粒子（Ｓ−ビーズ−ＤｘＡｌ）の製造実施例１、パラグラフ２の増感粒子を水で２０mg／mLに
希釈する。続いて３００mMのＴＡＰＳ緩衝液（pH９.
０）で前記の濃度を１８mg／mLに調節する。ヒドラジン
（３６.３μＬ／ｇ粒子）、ＳＴＵＴ（０.４５６ｇ／ｇ
粒子）およびＤＭＡＰ（２３.２mg／ｇ粒子）を添加す
る。ＳＴＵＴ（ＤＭＦ（１０％）で新しく調製）を１５
分毎に１／４ずつ添加する。ＤＭＡＰ（ＤＭＦ（１０
％）で新しく調製）はＳＴＵＴの第一回目の添加後に加
える。ＳＴＵＴの各添加後にｐＨを９.０に調節する。
室温で１時間撹拌した後、粒子をその容積の１０倍のＴ
ＡＰＳ緩衝液（pH９.０）で洗浄する（Microgen システ
ム）。

【００７４】粒子を１mMのＴＡＰＳ緩衝液（２０mg／m
L）に取り、激しく撹拌しながらこの分散液をゆっくり
と酢酸緩衝液（pH５.０）中のデキストランアルデヒド
４０mg／mLに加える。３０分後、反応温度を５０℃に調
節し、撹拌しながら混合物をさらに１８時間インキュベ
ーションする。続いて粒子をその容積の２５倍の水で洗
浄する（Microgen システム)。

【００７５】実施例８：ストレプトアビジン被覆増感粒
子（Ｓ−ビーズ−ＤｘＡｌ−ＳＡｖ）の製造デキストランアルデヒド被覆粒子（Ｓ−ビーズ−ＤｘＡ
ｌ、１００mg／mL）をストレプトアビジン溶液（１０mM
のリン酸緩衝液（pH７）中の３０mg／mL）に添加する。
この溶液を３７℃で１時間撹拌する。その後、水素化シ
アノホウ素ナトリウム（水にＮａＢＨ₃ＣＮ５０mg／m
L、全容積の２％）を撹拌しながら加え、混合物全体を
３７℃でさらに４０〜７２時間撹拌する。その後、酢酸
緩衝液（pH５）中の１Ｍのカルボキシメトキシルアミン
（ＣＭＯ）を添加し（全混合物の１.５％）、全体をさ
らに２時間インキュベーションする。その後、粒子をそ
の２５倍の容積の蛋白質非含有緩衝液（０.１Ｍトリ
ス、０.３ＭのＮａＣｌ、２５mMのＥＤＴＡ（pH８.
２)）で洗浄する。

【００７６】実施例９：風疹抗原被覆増感粒子の製造風疹抗原被覆増感粒子を製造するために、デキストラン
アルデヒド被覆粒子（Ｓ−ビーズ−ＤｘＡｌ）を第一回
目の工程でＬ−リジンと、第二回目の工程で無水コハク
酸と反応させる。続いて風疹抗原をカルボキシル基に結
合させる。１０mLのリジン溶液（ＭＥＳ中で４０mg／m
L、pH６.０）を１０mLのＳ−ビーズ−ＤｘＡｌ粒子（５
０mMのＭＥＳ、０.２％ Tween 20（pH６.０）中で１０
０mg／mL）に加える。１０％ Tween 20 溶液２００μＬ
を続いて添加する。新しく調製した水素化シアノホウ素
ナトリウム溶液（水で２５mg／mL）２mLを添加する。混
合物を３７℃で４時間インキュベーションする。その
後、さらに２mLの新しく調製した水素化シアノホウ素ナ
トリウム溶液（水で２５mg／mL）を添加する。反応混合
物をローラー型ミキサー上でさらに１６時間３７℃でイ
ンキュベーションする。その後、１０mLのホウ酸緩衝液
（２００mM，pH９.０）を添加し、混合物を３０分間遠
心し（１６０００rpm，１０℃）、上清を廃棄する。ペ
レットを取り、１５mLのホウ酸緩衝液に再度分散させ
る。続いて、この混合物を Sonifier 250（２０パル
ス、出力５、ＤＣ５０％）を用いて水浴中で超音波処理
する。

【００７７】１０mL（５００mg）のＳ−ビーズ−ＤｘＡ
ｌ−リジン粒子を３４.５mLのホウ酸緩衝液と混合す
る。以下のものを続いて混合物に添加する：０.５mLの
１０％Tween 20 溶液および１mLの無水コハク酸溶液
（１００mLのＤＭＳＯ中で１０mg）。この混合物を室温
で２時間撹拌する。さらに１mLの無水コハク酸溶液（１
００mLのＤＭＳＯ中で１０mg）を添加し、混合物を撹拌
しながら１６時間室温で保温する。続いて、１０mLのＭ
ＥＳ緩衝液（５０mMのＭＥＳ、pH５.０）を添加し、混
合物を遠心する（１６０００rpmで３０分、１０℃）。
上清を捨て、ペレットを４０mLに再分散させる。洗浄操
作を２から３回繰り返す。最後に、ペレットを約８mLの
ＭＥＳ緩衝液（５０mM、０.１％ Tween 20、pH５.０）
に再分散させ、Sonifier 250（３０パルス、出力５、Ｄ
Ｃ５０％）で均質にする。

【００７８】実施例１０：ビオチン付加風疹抗原の製造ビオチン付加風疹抗原を製造するために、６.５mLの風
疹抗原溶液（０.１ＭのＮａＣＯ₃／０.２５％ Tween 中
で風疹抗原０.６mg／mL）を６５０μＬのビオチン−Ｘ
−ＮＨＳ（Pierce から供給、ＤＭＳＯ中で１.２mg／m
L）と撹拌しながら混合する。２２時間後、混合物をピ
アースの脱塩カラム（Presto(登録商標)）で０.０５Ｍ
リン酸緩衝液、０.１５ＭＮａＣｌ、０.２５％ Tween
20（pH７.６）を用いて脱塩する。

【００７９】実施例１１：本発明のイムノアッセイ
（“高用量フックアッセイ”の実施１０μＬのサンプルを以下のものと混合する：５０μＬ
の粒子分散液（抗ヒトＩｇＧ抗体で被覆されたＣ−ビー
ズ−ＡＤｘ−ＤｘＡｌ、５０μｇ／mL、実施例６）、お
よび５０μＬの風疹抗原被覆粒子分散液（風疹抗原で被
覆されたＳ−ビーズ−ＤｘＡｌ、０.２mg／mL；実施例
９）、および５０μＬのビオチン付加風疹抗原溶液（５
μｇ／mL）。混合物を３７℃で１９６秒（または３５９
秒）インキュベーションする。この１９６秒（３５９
秒）後に、第一のシグナル（時間Ｔ１）を記録する。さ
らに８１秒後に（またはＴ１直後に）、前記混合物に５
０μＬのＳ−ビーズ−ＤｘＡｌ−ＳＡｖ分散液（０.２m
g／mL）および７５μＬのアッセイ緩衝液（０.１Ｍトリ
ス緩衝液、０.３ＭのＮａＣｌ、２５mMのＥＤＴＡ、Ｂ
ＳＡ１mg／mL（pH８.２)）を添加し、全体を３７℃で
２６４秒インキュベーションする。その後、第二のシグ
ナル（時間Ｔ２）を記録する。

【００８０】実施例１２：標準アッセイの実施１０μＬのサンプルを以下のものと混合する：５０μＬ
の粒子分散液（抗ヒトＩｇＧ抗体で被覆されたＣ−ビー
ズ−ＡＤｘ−ＤｘＡｌ、５０μｇ／mL、実施例６）、お
よび５０μＬのビオチン付加風疹抗原溶液（５μｇ／m
L）。混合物を３７℃で２７７秒インキュベーションす
る。その後、１００μＬのＳ−ビーズ−ＤｘＡｌ−ＳＡ
ｖ分散液（０.１mg／mL）および２５μＬのアッセイ緩
衝液を混合物に添加し、全体を３７℃で２６４秒インキ
ュベーションする。その後、シグナル（時間Ｔ２）を記
録する。前記異なるイムノアッセイ様式の結果を下記表
１で比較する。

【００８１】

【表１】

【００８２】高用量フックサンプルは、今や時間Ｔ１の
シグナルの大きさを参考にして、またはＴ２：Ｔ１シグ
ナル比に対応する時間Ｔ２のシグナルの大きさを参考に
して決定することができる。図２はこの関係を明らかに
する。比較的高力価のサンプルの場合、時間Ｔ１のシグ
ナルもまた高用量フック領域に到達するまでこの事例で
もまた増加するであろう。結果として、時間Ｔ２のシグ
ナルの大きさを示す値が減少するように、Ｔ２：Ｔ１の
値は減少を続けるであろう。短いインキュベーション時
間（Ｔ１）が高用量フックサンプルをより効率的に特定
するために有利であろう（図２もまた参照されたい）。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の好ましい検査方法の模式図である
（“Ｓ”＝固相）。

【図２】高用量フックサンプルの決定を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ 33/566 33/566 33/58 33/58 ＡＺ (72)発明者ハンス−エルヴィーン・パウリドイツ連邦共和国デー−35232ダウトフェタール．フンケンシュトラーセ１

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サンプル中の分析物Ａを定量的または定
性的に検出する方法であって、前記サンプルが分析物Ａ
特異的結合パートナーＲ１（これは固相と結合してい
る）、分析物Ａ特異的結合パートナーＲ２（これは標識
Ｌ１と結合している）、および分析物Ａ特異的結合パー
トナーＲ３（これは標識Ｌ２と結合している）とインキ
ュベーションされ、さらに前記インキュベーション混合
物中に存在する結合パートナーＲ２の分析物Ａとの結合
部位の飽和が、前記インキュベーション混合物中に存在
する結合パートナーＲ３の分析物Ａとの結合部位の飽和
が生じるより高い分析物Ａ濃度および／またはより後の
インキュベーション時間で生じ、またＬ１依存測定シグ
ナルを、Ｌ２依存またはＬ１プラスＬ２依存測定シグナ
ルとは異なる時間に決定するか、または異なる測定方法
を用いて決定することを含む前記分析物Ａの定量的また
は定性的検出方法。
【請求項２】フック効果を検出、回避および／または
減少させるための請求項１に記載の方法。
【請求項３】請求項１または２に記載の方法であっ
て、（ｉ）サンプルを分析物Ａ特異的結合パートナーＲ
１（これは固相と結合している）、分析物Ａ特異的結合
パートナーＲ２（これは標識Ｌ１と結合している）、お
よび分析物Ａ特異的結合パートナーＲ３（これは特異的
結合対構成物質Ｘと結合している）とインキュベーショ
ンし；（ii）その後、標識Ｌ２（これは特異的結合対の
結合対構成物質Ｙ（Ｘに対応している）と結合してい
る）を検査混合物に添加し；さらに（ｉｉｉ）測定シグ
ナルを少なくとも２度、時間Ｔ１および時間Ｔ２で測定
し、より早い時間Ｔ１は遅くとも標識Ｌ２（これは結合
対構成物質Ｙに結合している）の添加後まもなくで、後
の時間Ｔ２は標識Ｌ２（結合対構成物質Ｙに結合してい
る）の添加後である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】（ｉ）サンプルを分析物Ａ特異的結合パ
ートナーＲ１（これは固相と結合している）、分析物Ａ
特異的結合パートナーＲ２（これは標識Ｌ１と結合して
いる）、および分析物Ａ特異的結合パートナーＲ３（こ
れは特異的結合対構成物質Ｘと結合している）とインキ
ュベーションし；（ii）その後、標識Ｌ２（これは特異
的結合対の結合対構成物質Ｙ（Ｘに対応している）と結
合している）を検査混合物に添加し；さらに（iii）Ｌ
１の測定シグナルおよびＬ２の測定シグナルを異なる測
定方法を用いて決定する請求項１または２に記載の方
法。
【請求項５】方法が不均一系または均一系サンドイッ
チ試験である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】Ｒ１およびＲ２、Ｒ１およびＲ３、Ｒ
１、Ｒ２およびＲ３、またはＲ２およびＲ３が同じ結合
パートナーである請求項１〜５のいずれかに記載の方
法。
【請求項７】Ｌ１およびＬ２が同じ標識である請求項
１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】固相が分散性固相、好ましくは微粒子で
ある請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】微粒子が標識として機能する請求項８に
記載の方法。
【請求項１０】結合パートナーＲ２が分散性固相、好
ましくは微粒子に結合している請求項１〜９のいずれか
に記載の方法。
【請求項１１】微粒子が標識Ｌ１を構成する請求項１
０に記載の方法。
【請求項１２】サンドイッチ形成の結果として、標識
１および／または標識２を含むシグナル発生系の成分
が、これら成分間の相互作用、特にエネルギー移転が可
能な距離に互いに配置され、前記相互作用の範囲が測定
される請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】シグナル発生系が、微粒子に結合して
いる増感剤、および微粒子に結合している化学発光剤を
含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】サンプル中の分析物Ａを定量的または
定性的に検出する方法における、特に均一系サンドイッ
チ試験でフック効果を検出、回避および／または減少さ
せるための分析物Ａ特異的結合パートナーＲ１（これは
固相と結合している）、分析物Ａ特異的結合パートナー
Ｒ２（これは標識Ｌ１と結合している）、および分析物
Ａ特異的結合パートナーＲ３（これは標識Ｌ２と結合し
ている）の使用であって、前記インキュベーション混合
物中に存在する結合パートナーＲ２の分析物Ａとの結合
部位の飽和が、前記インキュベーション混合物中に存在
する結合パートナーＲ３の分析物Ａとの結合部位の飽和
が生じるより高い分析物Ａ濃度および／またはより後の
インキュベーション時間で生じ、Ｌ１依存測定シグナル
が、Ｌ２依存またはＬ１プラスＬ２依存測定シグナルと
は異なる時間に決定されるか、または異なる測定方法を
用いて決定される前記Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の使用。
【請求項１５】サンプル中の分析物Ａを定量的または
定性的に検出する方法における、特に均一系サンドイッ
チ試験でフック効果を検出、回避および／または減少さ
せるための分析物Ａ特異的結合パートナーＲ１（これは
固相と結合している）、分析物Ａ特異的結合パートナー
Ｒ２（これは標識Ｌ１と結合している）、分析物Ａ特異
的結合パートナーＲ３（これは特異的結合対構成物質Ｘ
と結合している）、および標識Ｌ２（これは特異的結合
対の結合対構成物質Ｙ（Ｘに対応している）と結合して
いる）の使用であって、前記インキュベーション混合物
中に存在する結合パートナーＲ２の分析物Ａとの結合部
位の飽和が、前記インキュベーション混合物中に存在す
る結合パートナーＲ３の分析物Ａとの結合部位の飽和が
生じるより高い分析物Ａ濃度および／またはより後のイ
ンキュベーション時間で生じる前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３お
よびＬ２の使用。
【請求項１６】サンプル中の分析物Ａを定量的または
定性的に検出する不均一系または均一系サンドイッチ試
験のための試験キットであって、前記キットが、分析物
Ａ特異的結合パートナーＲ１（これは固相と結合してい
る）、分析物Ａ特異的結合パートナーＲ２（これは標識
Ｌ１と結合している）、および分析物Ａ特異的結合パー
トナーＲ３（これは標識Ｌ２と結合している）を好まし
くは別々の容器に含み、さらに、サンドイッチ試験にお
いて前記インキュベーション混合物中に存在する結合パ
ートナーＲ２の分析物Ａとの結合部位の飽和が、前記イ
ンキュベーション混合物中に存在する結合パートナーＲ
３の分析物Ａとの結合部位の飽和が生じるより高い分析
物Ａ濃度および／またはより後のインキュベーション時
間で生じる前記試験キット。
【請求項１７】サンプル中の分析物Ａを定量的または
定性的に検出する不均一系または均一系サンドイッチ試
験のための試験キットであって、前記キットが、分析物
Ａ特異的結合パートナーＲ１（これは固相と結合してい
る）、分析物Ａ特異的結合パートナーＲ２（これは標識
Ｌ１と結合している）、分析物Ａ特異的結合パートナー
Ｒ３（これは特異的結合対構成物質Ｘと結合してい
る）、および標識Ｌ２（これは特異的結合対の結合対構
成物質Ｙ（Ｘに対応している）と結合している）を好ま
しくは別々の容器に含み、さらに、サンドイッチ試験に
おいて前記インキュベーション混合物中に存在する結合
パートナーＲ２の分析物Ａとの結合部位の飽和が、前記
インキュベーション混合物中に存在する結合パートナー
Ｒ３の分析物Ａとの結合部位の飽和が生じるより高い分
析物Ａ濃度および／またはより後のインキュベーション
時間で生じる前記試験キット。
【請求項１８】分析物Ａ特異的結合パートナーＲ２
（これは標識Ｌ１と結合している）、および前記分析物
Ａ特異的結合パートナーＲ３（これは特異的結合対構成
物質Ｘと結合している）が１つの容器に一緒に収納され
ている請求項１７に記載の試験キット。
【請求項１９】請求項１〜１５のいずれかに記載の方
法を実施するための請求項１６〜１８のいずれかに記載
の試験キット。