JP2002191380A - Human stanniocalcin-alpha - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】本発明は、新たに同定されたポリヌクレオ
チド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされる
ポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの製造に関する。とりわけ、
本発明のポリペプチドは、ヒトスタニオカルシン−αと
して推定的に同定されている。本発明はまた、そのよう
なポリペプチドの作用を阻害することにも関する。The present invention relates to newly identified polynucleotides, polypeptides encoded by such polynucleotides, the use of such polynucleotides and polypeptides, and also the use of such polynucleotides and polypeptides. Related to the manufacture of. Above all,
The polypeptide of the present invention has been putatively identified as human stanniocalcin-α. The invention also relates to inhibiting the action of such polypeptides.
【０００２】スタニオカルシン(以前は、テレオカルシ
ンおよびハイポカルシンの両方として知られていた)
は、硬骨魚のスタニウス小体、内分泌腺により産生され
る、抗高カルシウム血性の糖タンパク質ホルモンであ
る。ヒトもまた、スタニオカルシン糖タンパク質を産生
する。[0002] Staniocalcin (formerly known as both teleocalcin and hypocalcin)
Is an anti-hypercalcemic glycoprotein hormone produced by the teleost Stannius body and endocrine glands. Humans also produce stanniocalcin glycoprotein.
【０００３】スタニオカルシン−αは、上皮小体ホルモ
ン(ＰＴＨ)と同様な、報告された生物学的活性を有し、
またこれらのタンパク質は両方とも、哺乳動物において
二元機能を示す。それらは、魚において、恐らく骨吸収
の刺激によるものであろう高カルシウム血活性(Ｅndocr
inology １１９：２２４９−２２５５（１９８６）)お
よび低カルシウム血活性を発揮する。該低カルシウム血
活性は、恐らく鰓のカルシウム流入の阻害によるもので
あろう(Ｊ.Ｅxp.Ｂiol.、１４０：１９９−２０８（１
９８８）)。さらに、ＰＴＨは、骨代謝に対して二相的
作用を有する、すなわち、低用量では骨形成を増加させ
る一方、高用量では骨吸収を増加させる。従って、その
ポリペプチド自体およびアンタゴニストは両方とも、様
々な状況の下、骨粗鬆症を治療するために使用すること
ができる。[0003] Staniocalcin-α has a reported biological activity similar to parathyroid hormone (PTH),
Also, both of these proteins exhibit dual functions in mammals. They are associated with hypercalcemic activity (Endocr) in fish, probably due to stimulation of bone resorption.
inology 119: 2249-2255 (1986)) and hypocalcemic activity. The hypocalcemic activity is probably due to inhibition of gill calcium influx (J. Exp. Biol., 140: 199-208 (1).
988)). In addition, PTH has a biphasic effect on bone metabolism, ie, it increases bone formation at low doses while increasing bone resorption at high doses. Thus, both the polypeptide itself and the antagonist can be used to treat osteoporosis under various circumstances.
【０００４】ヒト由来ではないスタニウス小体のタンパ
ク質は、広範囲にわたって研究されている。最近、スタ
ニウス小体のタンパク質が、Ａnguilla australisから
精製されてクローン化された。硬骨魚の腎臓は、分泌顆
粒、スタニウス小体を含むことが見い出されている。電
子顕微鏡は、その顆粒がタンパク質様の性質のものであ
って、生理学的および生化学的機能が確認されていない
ホルモンまたは酵素を表し得ることを示す(Ｂutkus,Ａ.
ら、Ｍol.Ｃell Ｅndocrinol、５４：１２３−３３（１
９８７）)。[0004] Stannius body proteins that are not of human origin have been extensively studied. Recently, Stannius body proteins have been purified and cloned from Anguilla australis . The teleost fish kidney has been found to contain secretory granules, Stannius bodies. Electron microscopy shows that the granules are of proteinaceous nature and may represent hormones or enzymes whose physiological and biochemical functions have not been identified (Butkus, A. et al.
Cell Endocrinol, 54: 123-33 (1).
987)).
【０００５】鱒のスタニウス小体から得られる糖タンパ
ク質もまた、単離されて精製されており、これは、ハイ
ポカルシン、魚の主要な低カルシウム血性ホルモンであ
ると考えられている。この産物は、幾つかの種(すなわ
ち、欧州鰻、ティラピア(tilapia)金魚、および鯉)のス
タニウス小体に比較的多量に存在する。ハイポカルシン
は、典型的には、実験的に誘発された血液カルシウム濃
度の増加に応じて、スタニウス小体から放出される。超
微細構造の観察は、この処置後、スタニウス小体のハイ
ポカルシン産生細胞種がほとんど完全に脱顆粒すること
を示す。単離された糖タンパク質は、５４kＤaという見
掛けの分子量を有する(Ｌafeber Ｆ.Ｐ.ら、Ｇen Ｃom
p.Ｅndocrinol、６９：１９−３０（１９８８）)。[0005] Glycoproteins derived from Trunnus Stanius bodies have also been isolated and purified, which is thought to be hypocalcin, the major hypocalcemic hormone in fish. This product is relatively abundant in Stannius bodies of several species (ie, European eel, tilapia goldfish, and carp). Hypocalcin is typically released from Stannius bodies in response to an experimentally induced increase in blood calcium concentration. Ultrastructural observations indicate that after this treatment, the hypocalcin-producing cell types of Stanius bodies are almost completely degranulated. The isolated glycoprotein has an apparent molecular weight of 54 kDa (Lafeber FP et al., Gen Com.
p. Endocrinol, 69: 19-30 (1988)).
【０００６】さらに、最近、テレオカルシンの幾つかの
合成ペプチドフラグメントが稚魚の虹鱒(Ｓalmo Ｇaird
neri)においてカルシウム吸収を阻害することが示され
た。鰻および鮭の両方のテレオカルシンのＮ末端ペプチ
ド(アミノ酸１〜２０)は、４ ５Ｃa吸収をカルシウム吸
収サイクルの高い時点で有意に阻害する(７５％まで)
が、モルを基準としての該ペプチドの有効用量は、完全
な分子の有効用量の２０〜２００倍であった。対照的
に、鰻テレオカルシンのＣ末端フラグメント(アミノ酸
２０２〜２３１)には、カルシウム吸収に対する阻害効
果がなかった(Ｍilliken Ｃ.Ｅ.ら、Ｇen.Ｃomp.Ｅndoc
rinol、７７：４１６−２２（１９９０）)。[0006] In addition, recently, several synthetic peptide fragments of teleocalcin have been introduced into juvenile Salmo Gaird.
neri ) was shown to inhibit calcium absorption. Eel and salmon both Tereokarushin the N-terminal peptide (amino acids 1-20) are significantly inhibit 4 5 Ca absorption with a high point of the calcium absorption cycle (up to 75%)
However, the effective dose of the peptide on a molar basis was 20-200 times the effective dose of the complete molecule. In contrast, the C-terminal fragment of eel tereocalcin (amino acids 202-231) had no inhibitory effect on calcium absorption (Milliken CE et al., Gen. Comp. Endoc.
rinol, 77: 416-22 (1990)).
【０００７】２つの鮭スタニオカルシンの精製および特
性決定、並びにインビトロおよびインビボの両方におけ
るモデルシステムを用いての、カルシウムに応じてのホ
ルモン分泌調節の実験に関してもまた記載されている。
鮭 ＣＳ λ gt１０ cＤＮＡライブラリーから得られる
コホ(coho)鮭スタニオカルシンメッセンジャーＲＮＡ(m
ＲＮＡ)の分子クローニングおよびcＤＮＡ配列分析が記
載されている。鮭におけるスタニオカルシンmＲＮＡ
は、長さ約２kＤaであって、２５６個のアミノ酸からな
る一次翻訳産物をコードする。最初の３３個の残基は、
ホルモンのプレタンパク質領域を含むが、残りの２２３
個の残基は、成熟型のホルモンを作り上げる。(Ｗagner
Ｇ.Ｆ.ら、Ｍol.Ｃell Ｅndocrinol、９０：７−１５
（１９９２）)。[0007] The purification and characterization of two salmon stanniocalcins and experiments on the regulation of hormone secretion in response to calcium using both in vitro and in vivo model systems have also been described.
Coho salmon stanniocalcin messenger RNA (m) obtained from the salmon CS λgt10 cDNA library
Molecular cloning and cDNA sequence analysis of RNA) have been described. Staniocalcin mRNA in salmon
Encodes a primary translation product of about 2 kDa and consisting of 256 amino acids. The first 33 residues
Contains the hormonal preprotein region but retains the remaining 223
Residues make up the mature form of the hormone. (Wagner
GF et al., Mol. Cell Endocrinol, 90: 7-15.
(1992)).
【０００８】本発明のポリペプチドは、ヒトスタニオカ
ルシン−αとして推定的に同定された。この同定は、ア
ミノ酸配列の相同性の結果として成された。[0008] The polypeptide of the present invention has been putatively identified as human stanniocalcin-α. This identification was made as a result of amino acid sequence homology.
【０００９】本発明の一態様により、ヒトスタニオカル
シン−αである新規な推定成熟ポリペプチド、さらには
また、生物学的に活性であって、診断上または治療上有
用な、そのフラグメント、アナログおよび誘導体を提供
する。According to one aspect of the present invention, a novel putative mature polypeptide that is human stanniocalcin-α, and also fragments, analogs thereof that are biologically active and diagnostically or therapeutically useful. And derivatives.
【００１０】本発明の別の態様により、mＲＮＡ、ＤＮ
Ａ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含め、ヒトスタニオカル
シン−αをコードする、単離された核酸分子、さらには
また、そのアンチセンスアナログ、および生物学的に活
性であって、診断上または治療上有用な、そのフラグメ
ントを提供する。According to another aspect of the present invention, there are provided mRNA, DN,
A. Isolated nucleic acid molecules encoding human stanniocalcin-α, including cDNA, genomic DNA, and also antisense analogs thereof, and biologically active, diagnostic or therapeutic Provides useful fragments thereof.
【００１１】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチドを組換え技術により製造する方法であ
って、当該タンパク質の発現、およびその後の当該タン
パク質の回収を促進する条件下、ヒトスタニオカルシン
−αの核酸配列を含む組換え原核および／または真核宿
主細胞を培養することを含んでなる方法を提供する。According to a still further aspect of the present invention, there is provided a method of recombinantly producing such a polypeptide, comprising the steps of: providing human stanniocalcin under conditions that promote expression of the protein and subsequent recovery of the protein. -A method comprising culturing a recombinant prokaryotic and / or eukaryotic host cell comprising the nucleic acid sequence of -α.
【００１２】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを、治療目的に、例えば、腎
疾患および心疾患をもたらす電解質障害を治療するため
に利用する方法を提供し、また該ポリペプチドの二相的
作用により、該ポリペプチドは、骨粗鬆症、パジェット
病および大理石骨病を治療するために使用することがで
きる。In accordance with yet a further aspect of the present invention, such polypeptides, or polynucleotides encoding such polypeptides, may be used for therapeutic purposes, eg, to treat electrolyte disorders resulting in kidney and heart disease. Providing methods of use and the biphasic action of the polypeptide, the polypeptide can be used to treat osteoporosis, Paget's disease and osteopetrosis.
【００１３】本発明のまたさらなる態様により、そのよ
うなポリペプチドに対する抗体を提供する。[0013] According to yet a further aspect of the present invention, there are provided antibodies against such polypeptides.
【００１４】本発明のまた別の態様により、そのような
ポリペプチドに対するアンタゴニストを提供し、これ
は、そのようなポリペプチドの作用を阻害するために、
例えば、骨粗鬆症および低カルシウム血症の治療におい
て使用することができる。低カルシウム血症は、カルシ
ウムを細胞内液から捕集する、腎不全、上皮小体機能亢
進症、重篤な感染、膵不全または熱傷を含め、多くの様
々な原因から起こり得る。低カルシウム血症は、テタニ
ー、痙攣、および他の関連障害を起こす。In accordance with yet another aspect of the present invention, there are provided antagonists to such polypeptides, which are used to inhibit the action of such polypeptides.
For example, it can be used in the treatment of osteoporosis and hypocalcemia. Hypocalcemia can result from a number of different causes, including renal failure, hyperparathyroidism, severe infection, pancreatic insufficiency or burns that collect calcium from intracellular fluids. Hypocalcemia causes tetany, convulsions, and other related disorders.
【００１５】本発明のさらに別の態様により、ヒトスタ
ニオカルシン−α配列へ特異的にハイブリダイズするの
に十分な長さの核酸分子を含んでなる核酸プローブを提
供する。According to yet another aspect of the present invention, there is provided a nucleic acid probe comprising a nucleic acid molecule of sufficient length to specifically hybridize to a human stanniocalcin-α sequence.
【００１６】本発明のこれらの態様および他の態様は、
本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。[0016] These and other aspects of the invention include:
It will be apparent to those skilled in the art from the teachings herein.
【００１７】以下の図面は、本発明の態様を説明するも
のであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲
を限定しようとするものではない。The following drawings illustrate embodiments of the invention and are not intended to limit the scope of the invention, which is encompassed by the claims.
【００１８】第１図及び第２図は、ヒトスタニオカルシ
ン−αタンパク質のcＤＮＡ配列および対応する推定ア
ミノ酸配列を示す。アミノ酸に関する標準的な３文字略
号を使用する。FIGS. 1 and 2 show the cDNA sequence and corresponding deduced amino acid sequence of human stanniocalcin-α protein. The standard three letter abbreviation for amino acids is used.
【００１９】第３図は、Ａnguilla Ａustralisから得ら
れたスタニオカルシン(下の列)およびヒトスタニオカル
シン−α(上の列)のアミノ酸比較である。１７０個のア
ミノ酸重複部分および５５％の総類似性において、同一
アミノ酸残基が３５％ある。FIG. 3 is an amino acid comparison of stanniocalcin (bottom row) and human stanniocalcin-α (top row) obtained from Anguilla Australis. At 170 amino acid overlaps and 55% overall similarity, there are 35% identical amino acid residues.
【００２０】第４図は、ヒトスタニオカルシン(上の列)
およびヒトスタニオカルシン−α(下の列)のアミノ酸配
列比較である。FIG. 4 shows human stanniocalcin (upper row)
And amino acid sequence comparison of human stanniocalcin-α (lower row).
【００２１】第５図は、細菌発現および精製後のヒトス
タニオカルシン−αを示すゲルの写真である。レーン１
は、標準分子量マーカーであって、レーン２およびレー
ン３は、両方ともヒトスタニオカルシン−αタンパク質
であるが、レーン３は、より高い濃度のタンパク質を有
する。FIG. 5 is a photograph of a gel showing human stanniocalcin-α after bacterial expression and purification. Lane 1
Is a standard molecular weight marker, lanes 2 and 3 are both human stanniocalcin-α proteins, but lane 3 has a higher concentration of protein.
【００２２】第６図は、ヒトスタニオカルシン−αのバ
キュロウイルス発現の結果を示すゲルである。FIG. 6 is a gel showing the results of baculovirus expression of human stanniocalcin-α.
【００２３】本発明の一態様により、第１図及び第２図
の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または
１９９４年７月１５日にＡＴＣＣ寄託番号第７５８３１
号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードさ
れる成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸
(ポリヌクレオチド)を提供する。According to one aspect of the present invention, the mature polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIGS. 1 and 2 or ATCC Deposit No. 75831 on Jul. 15, 1994.
Nucleic acid encoding a mature polypeptide encoded by the cDNA of a clone deposited as
(Polynucleotide).
【００２４】本発明のポリヌクレオチドは、肺線維芽細
胞から得られたcＤＮＡライブラリー中で発見された。
それは、構造上、ヒトスタニオカルシンファミリーに関
係がある。それは、約２５１個のアミノ酸残基のタンパ
ク質をコードするオープンリーディングフレームを含
み、このうち、最初の約４０個のアミノ酸残基は推定さ
れるリーダー配列であることから、成熟タンパク質は２
１１個のアミノ酸を含んでなる。そのタンパク質は、ヒ
トスタニオカルシンに対し、アミノ酸範囲全体にわた
り、２８％の同一性および６４％の類似性をもって、最
も高い程度の相同性を示す。The polynucleotide of the present invention has been found in a cDNA library obtained from lung fibroblasts.
It is structurally related to the human stanniocalcin family. It contains an open reading frame encoding a protein of about 251 amino acid residues, of which the first about 40 amino acid residues are the predicted leader sequence, so the mature protein is 2
It comprises 11 amino acids. The protein exhibits the highest degree of homology to human stanniocalcin with 28% identity and 64% similarity over the entire amino acid range.
【００２５】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形
で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該
ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖で
あるなら、コード鎖または非コード(アンチ−センス)鎖
であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列
は、第１図及び第２図に示すコード配列または寄託され
たクローンのコード配列と同じであってよく、あるいは
遺伝コードの重複または縮重の結果として、第１図及び
第２図のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポ
リペプチドをコードする異なったコード配列であっても
よい。The polynucleotides of the present invention can be in the form of RNA or in the form of DNA, wherein the DNA comprises cD
NA, genomic DNA, and synthetic DNA. The DNA can be double-stranded or single-stranded, and if single-stranded, can be the coding strand or the non-coding (anti-sense) strand. The coding sequence encoding the mature polypeptide may be the same as the coding sequence shown in FIGS. 1 and 2 or the coding sequence of the deposited clone, or as a result of duplication or degeneracy of the genetic code, It may be a different coding sequence that encodes the same mature polypeptide as the DNA of the figures and FIG. 2 or the deposited cDNA.
【００２６】第１図及び第２図の成熟ポリペプチドまた
は寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドには、以下のものが
含まれ得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟
ポリペプチドのコード配列、およびリーダーもしくは分
泌配列またはプロタンパク質配列といったような付加的
コード配列；成熟ポリペプチドのコード配列(また場合
により、付加的コード配列)、および成熟ポリペプチド
のコード配列のイントロンまたは非コード配列５’およ
び／または３’といったような非コード配列。The polynucleotide encoding the mature polypeptide of FIGS. 1 and 2 or the mature polypeptide encoded by the deposited cDNA may include: only the coding sequence of the mature polypeptide; The coding sequence of the mature polypeptide, and additional coding sequences such as a leader or secretory sequence or a proprotein sequence; the coding sequence of the mature polypeptide (and, optionally, additional coding sequences); and introns of the coding sequence of the mature polypeptide. Or a non-coding sequence such as the non-coding sequence 5 'and / or 3'.
【００２７】従って、「ポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配
列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付
加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリ
ヌクレオチドを包含する。Thus, the term "polynucleotide encoding a polypeptide" encompasses a polynucleotide that includes only the coding sequence of the polypeptide, as well as a polynucleotide that includes additional coding and / or non-coding sequences. I do.
【００２８】本発明はさらに、第１図及び第２図の推定
アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたク
ローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上記
のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチ
ドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレ
ル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない
変異体であり得る。The present invention further relates to the above polynucleotides, which encode fragments, analogs and derivatives of the polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIGS. 1 and 2 or the cDNA encoded by the cDNA of the deposited clone. Related to the mutant. A variant of a polynucleotide can be a naturally occurring allelic variant of the polynucleotide or a non-naturally occurring variant of the polynucleotide.
【００２９】従って、本発明には、第１図及び第２図に
示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクロー
ンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのよ
うなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異
体は、第１図及び第２図のポリペプチドまたは寄託され
たクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチド
のフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。
そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換
変異体並びに付加および挿入変異体が含まれる。Thus, the present invention provides a polynucleotide encoding the same mature polypeptide as shown in FIGS. 1 and 2 or the same mature polypeptide encoded by the cDNA of the deposited clone, Variants of such polynucleotides are included, and these variants encode fragments, derivatives or analogs of the polypeptides encoded by the polypeptides of FIGS. 1 and 2 or the cDNA of the deposited clone. .
Such nucleotide variants include deletion variants, substitution variants, and addition and insertion variants.
【００３０】先に示したように、該ポリヌクレオチド
は、第１図及び第２図に示すコード配列の天然に存在す
るアレル変異体または寄託されたクローンのコード配列
の天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有し
得る。当業界で知られているように、アレル変異体は、
１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または
付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、
これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的には
変えない。As indicated above, the polynucleotide may be a naturally occurring allelic variant of the coding sequence shown in FIGS. 1 and 2 or a naturally occurring allelic variant of the coding sequence of the deposited clone. . As is known in the art, allelic variants
Another form of a polynucleotide sequence that may have one or more nucleotide substitutions, deletions or additions,
This does not substantially alter the function of the encoded polypeptide.
【００３１】本発明にはまた、成熟ポリペプチドのコー
ド配列が、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分
泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば、細胞からの
ポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機
能するリーダー配列に、同じ読み枠内で融合し得るポリ
ヌクレオチドも含まれる。リーダー配列を有するポリペ
プチドがプレタンパク質であり、また宿主細胞により切
断されて、成熟型のポリペプチドを形成したリーダー配
列を有することがある。該ポリヌクレオチドはまた、付
加的５’アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプ
ロタンパク質もコードし得る。プロ配列を有する成熟タ
ンパク質がプロタンパク質であり、また不活性型のタン
パク質である。プロ配列が一度切断されると、活性成熟
タンパク質が残る。The present invention also provides that the coding sequence for the mature polypeptide is a polynucleotide sequence that aids in the expression and secretion of the polypeptide from the host cell, for example, a secretory sequence for controlling the transport of the polypeptide from the cell. Functional leader sequences also include polynucleotides that can be fused in the same reading frame. A polypeptide having a leader sequence is a preprotein and may have a leader sequence that has been cleaved by a host cell to form a mature polypeptide. The polynucleotide may also encode a proprotein that is a mature protein with additional 5 'amino acid residues. A mature protein having a prosequence is a proprotein and an inactive form of the protein. Once the prosequence is cleaved, the active mature protein remains.
【００３２】従って、例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパ
ク質、またはプロ配列およびプレ配列(リーダー配列)の
両方を有するタンパク質をコードし得る。Thus, for example, the polynucleotide of the present invention may encode a mature protein, or a protein having a prosequence, or a protein having both a prosequence and a presequence (leader sequence).
【００３３】本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明
のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内
で融合したコード配列も有し得る。細菌宿主の場合に
は、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリ
ペプチドの精製を提供するための、ベクター、例えば、
pＱＥ−９またはpＱＥ−６０ベクターにより与えられる
ヘキサ−ヒスチジンタグ(tag)であるのが好ましく、ま
たは、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞
を使用する場合には、そのマーカー配列は、赤血球凝集
素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、インフルエン
ザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対
応する(Ｗilson,Ｉ.ら、Ｃell、３７：７６７（１９８
４）)。The polynucleotide of the present invention may also have the coding sequence fused in frame to a marker sequence that allows for purification of the polypeptide of the present invention. In the case of a bacterial host, the marker sequence may be a vector, such as a vector, to provide for purification of the mature polypeptide fused to the marker.
Preferably, it is a hexa-histidine tag provided by the pQE-9 or pQE-60 vector, or, for example, when using a mammalian host, for example, COS-7 cells, the marker sequence is: It may be a hemagglutinin (HA) tag. The HA tag corresponds to an epitope derived from the influenza hemagglutinin protein (Wilson, I. et al., Cell, 37: 767 (198
4)).
【００３４】本発明はさらに、配列間に少なくとも５０
％、また好ましくは７０％の同一性がある場合に、上記
の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポ
リヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド
に関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェ
ント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、
また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合に
のみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを
意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチド
にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、第１図及び
第２図のcＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡによりコード
される成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性
を実質的には保有するポリペプチドをコードする。The present invention further provides that at least 50
%, And preferably 70% identity, to polynucleotides that hybridize to the above sequences. The invention particularly relates to polynucleotides that hybridize under stringent conditions to the above-described polynucleotides. As used herein, the term "stringent conditions" refers to at least 95%
It also preferably means that hybridization will only occur if there is at least 97% identity. In a preferred embodiment, the polynucleotide that hybridizes to the above-described polynucleotide has substantially the same biological function or activity as the mature polypeptide encoded by the cDNA of FIGS. 1 and 2 or the deposited cDNA. Encodes a retained polypeptide.
【００３５】本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微
生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の
下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者
への便宜として与えられるものであって、寄託が３５
Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１２下に要求されることを承認するもの
ではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチ
ドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成し
て、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際は
いつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用
し、または販売するには、実施許諾が要求され得、また
そのような実施許諾は、ここでは付与されない。The deposit referred to herein will be kept under the terms of the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for Patent Procedure. These deposits are provided merely as a convenience to those skilled in the art, and
It is not an admission that it is required under U.S.C. §112. The sequence of the polynucleotide contained in the deposited material, and also the amino acid sequence of the polypeptide encoded thereby, form part of the present specification and may include any of the sequences herein. Whenever it conflicts with the description, it is checked. A license may be required to make, use, or sell the deposited material, and no such license is granted herein.
【００３６】本発明はさらに、第１図及び第２図の推定
アミノ酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡによ
りコードされるアミノ酸配列を有するヒトスタニオカル
シン−αポリペプチド、さらにはまた、そのようなポリ
ペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関す
る。The present invention further provides a human stanniocalcin-α polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIGS. 1 and 2 or having the amino acid sequence encoded by the deposited cDNA, and Polypeptide fragments, analogs and derivatives.
【００３７】第１図及び第２図のポリペプチドまたは寄
託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示
す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナロ
グ」という用語は、そのようなポリペプチドと実質的に
同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチドを
意味する。従って、アナログには、プロプロテイン部分
を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプ
チドを製造することができるプロプロテインが含まれ
る。When referring to the polypeptides of FIGS. 1 and 2 or the polypeptide encoded by the deposited cDNA, the terms "fragment,""derivative," and "analog" refer to such polypeptides substantially. Polypeptides that have the same biological function or activity. Thus, analogs include protein that can be activated by cleavage of the protein portion to produce an active mature polypeptide.
【００３８】本発明のポリペプチドは、組換えポリペプ
チド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ま
しくは組換ポリペプチドであってよい。[0038] The polypeptide of the present invention may be a recombinant, natural or synthetic polypeptide, preferably a recombinant polypeptide.
【００３９】第１図及び第２図のポリペプチドまたは寄
託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまた
はそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸
残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されてお
り、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによ
りコードされるものであってもよく、またはコードされ
たものでなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上
のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（ii
i）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増
加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のよ
うな、他の化合物と融合しているもの、または（iv）リ
ーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精
製に使用される配列、またはプロプロテイン配列といっ
たような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合し
ているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導
体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範
囲内であると思われる。Fragments, derivatives or analogs of the polypeptides of FIGS. 1 and 2 or of the deposited cDNA may include (i) one or more amino acid residues having the same or different Residues, which are preferably replaced by residues (preferably homologous amino acid residues), and in which such substituted amino acid residues may or may not be encoded by the genetic code. (Ii) one or more amino acid residues containing a substituent, or (ii)
i) the mature polypeptide is fused to another compound, such as a compound that increases the half-life of the polypeptide (eg, polyethylene glycol); or (iv) a leader or secretory sequence, or the mature polypeptide Additional amino acids may be fused to the mature polypeptide, such as a sequence used for purification of a polypeptide, or a protein sequence. Such fragments, derivatives and analogs are deemed to be within the skill of the art in light of the teachings herein.
【００４０】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ま
しくは、均一となるまで精製される。The polypeptides and polynucleotides of the present invention are preferably provided in an isolated form, and preferably are purified to homogeneity.
【００４１】「単離された」という用語は、物質がその
元の環境(例えば、それが天然に存在するなら、天然の
環境)から除去されていることを意味する。例えば、生
きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドま
たはポリペプチドは単離されていないが、天然の系にお
ける共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じ
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されてい
る。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分とな
り得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのよう
なベクターまたは組成物はその天然の環境の部分ではな
いという点で、なお単離されている。The term "isolated" means that the substance has been removed from its original environment (eg, the natural environment if it occurs naturally). For example, a naturally occurring polynucleotide or polypeptide in a living animal has not been isolated, but the same polynucleotide or polypeptide isolated from some or all of the coexisting materials in the natural system has been isolated. ing. Such polynucleotides can be part of a vector, and / or such polynucleotides or polypeptides can be part of a composition, and such vectors or compositions are not part of their natural environment. And still isolated.
【００４２】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド
が含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作
された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え
技術による製造にも関する。The present invention also relates to vectors containing the polynucleotides of the present invention, host cells genetically engineered with vectors of the present invention, and recombinant production of the polypeptides of the present invention.
【００４３】宿主細胞は、例えば、クローニングベクタ
ーまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺
伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトラ
ンスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。
該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、フ
ァージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロ
モーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、
またはヒトスタニオカルシン−α遺伝子を増幅するのに
適するよう改変された従来の栄養培地で培養することが
できる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現
用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であっ
て、当業者に明らかであろう。A host cell is genetically engineered (transduced or transformed or transfected) with a vector of the invention which can be, for example, a cloning vector or an expression vector.
The vector can be, for example, in the form of a plasmid, virus particle, phage, and the like. The engineered host cell activates the promoter, selects for the transformant,
Alternatively, it can be cultured in a conventional nutrient medium that has been modified to be suitable for amplifying the human stanniocalcin-α gene. Culture conditions, such as temperature, pH, etc., are those previously used in the host cell selected for expression and will be apparent to those skilled in the art.
【００４４】本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを
組換え技術により製造するのに使用することができる。
従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチド
を発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに
含ませることができる。そのようなベクターには、染色
体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０
の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロ
ウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮ
Ａとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデ
ノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったような
ウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベク
ターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能で
ある限り、使用することができる。The polynucleotides of the present invention can be used to produce peptides by recombinant techniques.
Thus, for example, the polynucleotide can be included in any one of various expression vectors for expressing the polypeptide. Such vectors include chromosomal, non-chromosomal and synthetic DNA sequences such as SV40.
Bacterial plasmid; phage DNA; baculovirus; yeast plasmid; plasmid and phage DN
A vector obtained from the combination with A; viral DNA such as vaccinia, adenovirus, fowlpox virus, and pseudorabies. However, any other vector can be used as long as it is replicable and viable in the host.
【００４５】適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベク
ターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を
当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアー
ゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、
当業者の範囲内であると思われる。[0045] The appropriate DNA sequence can be inserted into the vector by various methods. Generally, the DNA sequence is inserted into an appropriate restriction endonuclease site by methods known in the art. Such and other methods are:
It is believed to be within the purview of those skilled in the art.
【００４６】発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現
制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ
合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例とし
て、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プ
ロモーター、Ｅ.coli. lacまたはtrp、ファージラムダ
ＰＬプロモーター、および原核もしくは真核細胞または
それらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知
られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻
訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も
含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配
列も含み得る。The DNA sequence of the expression vector is operably linked to an appropriate expression control sequence (promoter), and
Let the composition take place. As representative examples of such promoters include the following:. LTR or SV40 promoter, E. coli lac or trp, the phage lambda P L promoter, and expression of genes in prokaryotic or eukaryotic cells or their viruses Other promoters that are known to control. The expression vector also contains a ribosome binding site for translation initiation and a transcription terminator. The vector may also include appropriate sequences for amplifying expression.
【００４７】さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の
場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマ
イシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラ
サイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、ト
ランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特
性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマ
ーカー遺伝子を含むのが好ましい。In addition, expression vectors may be used to select for transformed host cells, such as dihydrofolate reductase or neomycin resistance in eukaryotic cell culture, or tetracycline or ampicillin resistance in E. coli . It is preferred to include one or more selectable marker genes to confer phenotypic characteristics.
【００４８】上記のような適当なＤＮＡ配列、さらには
また、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクタ
ーを、適当な宿主をトランスフォームするために使用し
て、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にするこ
とができる。A suitable DNA sequence, as described above, as well as a vector containing a suitable promoter or control sequence, can be used to transform a suitable host to allow that host to express the protein. Can be
【００４９】適当な宿主の代表例として、以下のものが
挙げられる：Ｅ.coli、Ｓtreptomyces、Ｓalmonella ty
phimuriumといったような細菌細胞；酵母のような真菌
細胞；Ｄrosophila Ｓ２およびＳf９といったような昆
虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowesメラノーマといっ
たような動物細胞；アデノウイルス；植物細胞等。適当
な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内
であると思われる。とりわけ、本発明にはまた、先に広
く記載した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え
構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順ま
たは逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウイル
スベクターといったようなベクターを含んでなる。この
実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例え
ば、該配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、
制御配列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモー
ターが多数、当業者に知られていて、市販されている。
以下のベクターを例として挙げる。細菌用: pＱＥ７
０、pＱＥ６０、pＱＥ−９(Ｑiagen)、pＢＳ、pＤ１
０、ファージスクリプト(phagescript)、psiＸ１７４、
pbluescript ＳＫ、pＢＳＫＳ、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６
a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６Ａ(Ｓtratagene)；ptrc９９
a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、
pＲＩＴ５(Ｐharmacia)。真核生物用: pＷＬＮＥＯ、p
ＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagen
e)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmaci
a)。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクター
も、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能であ
る限り、使用することができる。Representative examples of suitable hosts include the following: E. coli , Streptomyces , Salmonella ty
bacterial cells such as phimurium ; fungal cells such as yeast; insect cells such as Drosophila S2 and Sf9 ; animal cells such as CHO, COS or Bowes melanoma; adenovirus; The selection of a suitable host will be within the skill of the art in light of the teachings herein. In particular, the present invention also includes a recombinant construct comprising one or more of the sequences broadly described above. The construct comprises a vector, such as a plasmid or viral vector, into which the sequences of the invention have been inserted in forward or reverse orientation. In a preferred aspect of this embodiment, the construct further comprises, for example, a promoter operably linked to the sequence.
Comprising a control sequence. Many suitable vectors and promoters are known to those of skill in the art, and are commercially available.
The following vectors are given as examples. For bacteria: pQE7
0, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD1
0, phagescript, psiX174,
pbluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16
a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99
a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540,
pRIT5 (Pharmacia). For eukaryotes: pWLNEO, p
SV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagen
e), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmaci
a). However, any other plasmid or vector can be used as long as they are replicable and viable in the host.
【００５０】プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マ
ーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望
の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベク
ターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々
に名付けられた細菌プロモーターには、lacＩ、lacＺ、
Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰＲ、ＰＬおよびtrpが含まれ
る。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate
early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期Ｓ
Ｖ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスの
メタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよ
びプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲
内である。The promoter region can be selected from any desired gene using a CAT (chloramphenicol transferase) vector or another vector having a selectable marker. Two suitable vectors are PKK232-8 and PCM7. Individually named bacterial promoters include lacI, lacZ,
T3, T7, gpt, lambda P R, include P L and trp. Eukaryotic promoters include CMV immediate early
early), HSV thymidine kinase, early and late S
V40, LTR from retrovirus, and mouse metallothionein-I. Selection of the appropriate vector and promoter is well within the level of ordinary skill in the art.
【００５１】さらなる態様では、本発明は、上記の構築
物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物
細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核
細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような
原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リ
ン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキ
ストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポ
レーションにより行うことができる。(Ｄavis,Ｌ.、Ｄi
bner,Ｍ.、Ｂattey,Ｌ.、Ｂasic Ｍethods inＭolecula
r Ｂiology（１９８６）)。In a further aspect, the present invention relates to a host cell comprising the above-described construct. The host cell can be a higher eukaryotic cell, such as a mammalian cell, a lower eukaryotic cell, such as a yeast cell, or the host cell can be a prokaryotic cell, such as a bacterial cell. Introduction of the construct into host cells can be by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, or electroporation. (Davis, L., Di
bner, M., Battey, L., Basic Methods in Molecula
r Biology (1986)).
【００５２】宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用し
て、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造す
ることができる。あるいはまた、本発明のポリペプチド
は、従来のペプチド合成装置により合成的に製造するこ
とができる。The construct in the host cell can be used in a conventional manner to produce the gene product encoded by the recombinant sequence. Alternatively, the polypeptide of the present invention can be produced synthetically using a conventional peptide synthesizer.
【００５３】成熟タンパク質は、適当なプロモーターの
制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中
で発現させることができる。そのようなタンパク質を、
本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造
するために、無細胞翻訳系もまた使用することができ
る。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニ
ングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular
Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual, 第２版、Ｃold Ｓ
pring Ｈarbor、ニューヨーク、（１９８９)により記載
されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。The mature protein can be expressed in mammalian cells, yeast, bacteria, or other cells under the control of a suitable promoter. Such a protein,
Cell-free translation systems can also be used for production with RNA obtained from the DNA constructs of the present invention. Cloning and expression vectors suitable for use in prokaryotic and eukaryotic hosts are described in Sambrook et al., Molecular.
Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold S
Spring Harbor, New York, (1989), the disclosure of which is hereby incorporated by reference.
【００５４】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ
の高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベク
ターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、
プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、
約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。
例には、bp １００〜２７０の、複製開始点の後期側に
あるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期
プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にある
ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハ
ンサーが含まれる。DNA encoding the polypeptide of the present invention
Transcription by higher eukaryotes is increased by inserting an enhancer sequence into the vector. The enhancer is
Acts on a promoter to increase its transcription, usually
It is a cis-acting element of DNA of about 10-300 bp.
Examples include the SV40 enhancer on the late side of the replication origin, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and adenovirus enhancers at bp 100-270.
【００５５】通例、組換え発現ベクターには、複製開始
点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能
にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピ
シリン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝
子、並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度
に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれ
るであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３
−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系
酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショック
タンパク質をコードするオペロンから得ることができ
る。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配
列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺
腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリ
ーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場
合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例え
ば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易
化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパ
ク質をコードすることができる。Typically, the recombinant expression vector contains an origin of replication and a selectable marker that allows for transformation of the host cell, such as the ampicillin resistance gene of E. coli and the S. cerevisiae TRP1 gene, and the downstream gene. A promoter derived from a highly expressed gene to drive transcription of the structural sequence would be included. Such promoters include, inter alia, 3
-It can be obtained from operons encoding glycolytic enzymes such as phosphoglycerate kinase (PGK), alpha factor, acid phosphatase or heat shock proteins. The heterologous structural sequence is assembled in an appropriate phase, with translation initiation and termination sequences, and preferably, a leader sequence capable of directing secretion of the translated protein into the periplasmic space or extracellular medium. . Optionally, the heterologous sequence can encode a fusion protein that includes an N-terminal identification peptide that confers desired properties, such as stabilization or purification of the expressed recombinant product.
【００５６】細菌で使用するのに有用な発現ベクター
は、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、
適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプ
ロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入す
ることにより構築される。そのベクターは、ベクターの
維持を確実なものとするために、また所望により、宿主
内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現
型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなる
であろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主
には、Ｅ.coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typ
himurium、並びにＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、
およびＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれ
るが、他のものもまた、選択物質として使用することが
できる。代表的であるが、非限定的な例として、細菌で
使用するのに有用なベクターは、周知のクローニングベ
クター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ ３７０１７)の遺伝要素
を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能
なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得る。
そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３
−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、スウェ
ーデン)およびＧＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadison、
ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部
分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列
と組み合わせる。Expression vectors useful for use in bacteria include structural DNA sequences encoding the desired protein;
It is constructed by insertion into an operable reading phase with a functional promoter, with appropriate translation initiation and termination signals. The vector includes one or more phenotypic selectable markers and an origin of replication to ensure maintenance of the vector and, if desired, to provide for amplification in the host. Will be. Prokaryotic hosts suitable for transformation include E. coli , Bacillus subtilis , Salmonella typ.
himurium , genus Pseudomonas, genus Streptomyces,
And various species within the genus Staphylococcus, but others can also be used as selection agents. As a representative, but non-limiting example, a vector useful for use in bacteria is a selectable vector obtained from a commercially available plasmid comprising the genetic elements of the well-known cloning vector pBR322 (ATCC 37017). It may comprise a marker and a bacterial origin of replication.
Such commercially available vectors include, for example, pKK223
-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) and GEM1 (Promega Biotec, Madison,
WI, USA). These pBR322 "bone nuclei" portions are combined with an appropriate promoter and the structural sequence to be expressed.
【００５７】適当な宿主株をトランスフォーメーション
して、その宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、
選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シ
フトまたは化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる
期間培養する。After transforming a suitable host strain and growing the host strain to a suitable cell density,
The selected promoter is induced by a suitable method (eg, temperature shift or chemical induction) and the cells are cultured for an additional period.
【００５８】細胞を、典型的には、遠心分離により収集
し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果
得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。The cells are typically collected by centrifugation, disrupted by physical or chemical methods, and the resulting crude extract is retained for further purification.
【００５９】タンパク質の発現に使用される微生物細胞
は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、また
は細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても
破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。The microbial cells used for protein expression can be disrupted by any conventional method, including freeze-thaw cycling, sonication, mechanical disruption, or the use of cell lysing agents. It is well known to those skilled in the art.
【００６０】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。
哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１
７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線
維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを
発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２
７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含ま
れる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプ
ロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス
ドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および
５’に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。
ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、お
よびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転
写遺伝要素を与えることができる。[0060] A variety of mammalian cell culture systems can also be used to express the recombinant protein.
Examples of mammalian expression systems include Gluzman, Cell, 23: 1.
75 (1981), COS-7 line of monkey kidney fibroblasts, and other cell lines capable of expressing compatible vectors, such as C12
7, 3T3, CHO, HeLa and BHK cell lines are included. Mammalian expression vectors contain an origin of replication, a suitable promoter and enhancer, as well as any necessary ribosome binding sites, polyadenylation sites, splice donor and acceptor sites, transcription termination sequences, and non-transcribed sequences flanking the 5 '. Will also comprise.
The DNA sequence obtained from SV40 splicing, and the polyadenylation site can be used to provide the required non-transcribed genetic elements.
【００６１】ヒトスタニオカルシン−αポリペプチド
は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、
陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホス
ホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレ
クチンクロマトグラフィーが含まれる方法により、組換
え細胞培養物から回収して、精製することができる。必
要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質
の立体配置を完成するのに使用することができる。最後
に、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精
製工程に使用することができる。Human stanniocalcin-α polypeptide can be prepared by ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction,
Anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography,
It can be recovered from recombinant cell culture and purified by methods including hydroxylapatite chromatography and lectin chromatography. If desired, a protein regeneration step can be used to complete the configuration of the mature protein. Finally, high performance liquid chromatography (HPLC) can be used for the final purification step.
【００６２】本発明のポリペプチドは、天然に精製され
た産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、また
は原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細
菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によっ
て)組換え技術により製造することができる。組換え製
造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され
得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオ
ニンアミノ酸残基が含まれ得る。The polypeptides of the present invention may be naturally purified products, or products of chemical synthesis, or may be obtained from prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, bacteria, yeast, higher plants, insects in culture). (And by mammalian cells). Depending on the host used in the recombinant production method, the polypeptide of the present invention may be glycosylated or not glucosylated. The polypeptides of the present invention may also include a first methionine amino acid residue.
【００６３】ヒトスタニオカルシン−αの投与は、多く
の電解質に基づく疾患の治療的処置に使用することがで
きる。動脈性高血圧症の原因の１つは、Ｎa＋−Ｋ＋ポ
ンプの欠陥または阻害による、血管平滑筋細胞の細胞壁
を挟んでの異常なＮa＋輸送であり、もう１つは、幾つ
かの型のヒト高血圧症に記載されているような、Ｎa ＋
の透過性の増加である。最終的な結果は細胞内Ｎa＋の
増加であり、このことは、その細胞を血管収縮剤に対し
てより感受性の強いものとする。Ｃa＋＋がＮa ＋の後に
続くことから、交感神経刺激に対する感受性の増加の原
因となるのは、細胞内Ｃa＋＋の蓄積であって、本質的
にはＮa＋ではないと仮定される。従って、ヒトスタニ
オカルシン−αは、低カルシウム血性物質として機能し
得ることから、この細胞内Ｃa＋＋の増加を相殺して、
高血圧症を減少させる、または予防するのに役立ち得
る。The administration of human stanniocalcin-α is
Can be used for therapeutic treatment of electrolyte-based diseases
Wear. One of the causes of arterial hypertension is Na+-K+Po
Cell wall of vascular smooth muscle cells due to pump defect or inhibition
Abnormal Na sandwiching+Transport and the other is how many
Na as described in this type of human hypertension +
Is an increase in permeability. The end result is intracellular Na+of
Increase, which causes the cells to respond to vasoconstrictors.
More sensitive. Ca++Is Na +After the
Following on, the source of increased sensitivity to sympathetic stimulation
The cause is intracellular Ca++Accumulation of
Has Na+Not assumed. Therefore, human stani
Ocalcin-α functions as a hypocalcemic substance
To obtain this intracellular Ca++Offset the increase in
Can help reduce or prevent hypertension
You.
【００６４】さらに、高カルシウム血症は、心律動異
常、昏睡、および心停止に直接関係している。従って、
ヒトスタニオカルシン−αは、遊離Ｃa＋＋の濃度を低
下させることにより、これらの障害の処置に対する治療
的価値を有し得る。In addition, hypercalcemia is directly related to cardiac dysrhythmia, coma, and cardiac arrest. Therefore,
Human stanniocalcin-α may have therapeutic value for the treatment of these disorders by lowering the concentration of free Ca ++ .
【００６５】高血圧症はまた、腎障害にも直接関係があ
る。従って、正常濃度より高い、または低い電解質は、
腎機能不全を引き起こして、他の障害を直接もたらし得
る。例として、Ｃa＋＋−リンの不均衡は、筋肉および
骨の疼痛、骨の脱ミネラル化、並びに脳、眼、心筋、お
よび血管を含め、様々な器官におけるカルシウム沈着を
引き起こし得る。従って、本発明のポリペプチドは、Ｃ
a＋＋−リンの不均衡による障害を相殺するために使用
することができる。腎不全自体は、血液中に異常に高濃
度のホスフェートをもたらすが、これは、ヒトスタニオ
カルシン−αにより正常な濃度まで減少させることがで
きる。[0065] Hypertension is also directly related to renal impairment. Therefore, electrolytes higher or lower than the normal concentration
It can cause renal insufficiency and directly lead to other disorders. By way of example, Ca ++ -phosphorus imbalance can cause muscle and bone pain, bone demineralization, and calcium deposition in various organs, including the brain, eyes, myocardium, and blood vessels. Therefore, the polypeptide of the present invention has a C
a ++ -can be used to offset impairments due to phosphorus imbalance. Renal failure itself results in abnormally high concentrations of phosphate in the blood, which can be reduced to normal levels by human stanniocalcin-α.
【００６６】ヒトスタニオカルシン−αはまた、骨代謝
に対して二相的作用を有し得る、すなわち、低用量では
骨形成を増加させる一方、高用量では骨吸収を増加させ
るという点で、ある骨疾患の治療にも有用である。従っ
て、低用量のヒトスタニオカルシン−αの投与は、骨粗
鬆症を治療するために使用することができ、また高用量
の投与は、骨皮質の著しい肥厚化、および骨髄腔の狭窄
化または充填を伴う、骨の過剰増殖および硬化である、
大理石骨病を治療するために使用することができる。Human stanniocalcin-α may also have a biphasic effect on bone metabolism, ie, increasing bone formation at low doses while increasing bone resorption at high doses. It is also useful for treating certain bone disorders. Thus, administration of low doses of human stanniocalcin-α can be used to treat osteoporosis, and high doses can result in significant thickening of the bone cortex and narrowing or filling of the medullary cavity. Accompanied by bone overgrowth and stiffening,
Can be used to treat osteopetrosis.
【００６７】高カルシウム血症の原因はまた、上皮小体
機能亢進症、ビタミン過剰症Ｄ、骨を破壊することによ
り血清Ｃa＋＋レベルを上昇させる腫瘍、サルコイドー
シス、甲状腺機能亢進症、副腎不全、血清アルブミンの
損失、二次性腎疾患、過剰な胃腸カルシウム吸着、およ
び血漿タンパク質濃度の上昇を含め、多くの様々な障害
でもあり得る。従って、ヒトスタニオカルシン−αは、
高カルシウム血症およびその関連障害を減少させるのに
有効である。The causes of hypercalcemia are also hyperparathyroidism, hypervitaminosis D, tumors that increase serum Ca ++ levels by destroying bone, sarcoidosis, hyperthyroidism, adrenal insufficiency, serum There can be many different disorders, including albumin loss, secondary kidney disease, excessive gastrointestinal calcium adsorption, and elevated plasma protein levels. Thus, human stanniocalcin-α is
It is effective in reducing hypercalcemia and its related disorders.
【００６８】ヒトスタニオカルシン−αはまた、異常な
電解質濃度および体液の不均衡に関係がある他の障害、
例えば、片頭痛の治療にも使用することができる。Human stanniocalcin-α is also known to have abnormal electrolyte concentrations and other disorders related to fluid imbalance.
For example, it can be used to treat migraine.
【００６９】完全な長さのヒトスタニオカルシン−α遺
伝子のフラグメントは、完全な長さの遺伝子を単離する
ために、また該遺伝子に対する高い配列類似性、または
類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するため
に、cＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーシ
ョンプローブとして使用することができる。この種類の
プローブは、例えば、２０〜２０００塩基であり得る。
好ましくは、しかし、該プローブは、３０〜５０塩基対
を有する。該プローブはまた、完全な長さの転写物、並
びにゲノムクローン、または調節およびプロモーター領
域、エキソン、およびイントロンが含まれる、完全なヒ
トスタニオカルシン−α遺伝子を含むクローンに対応す
るcＤＮＡクローンを同定するのに使用することもでき
る。スクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプロー
ブを合成するための既知のＤＮＡ配列を使用することに
よって、該遺伝子のコード領域を単離することを含んで
なる。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標
識化オリゴヌクレオチドを、ヒトcＤＮＡ、ゲノムＤＮ
ＡまたはmＲＮＡのライブラリーをスクリーニングする
ために使用して、プローブがハイブリダイズするライブ
ラリーのメンバーを決定する。Fragments of the full-length human stanniocalcin-α gene have high sequence similarity or similar biological activity to the full-length gene to isolate it. It can be used as a hybridization probe to a cDNA library to isolate other genes. This type of probe can be, for example, 20-2000 bases.
Preferably, however, the probe has 30 to 50 base pairs. The probe also identifies full length transcripts and cDNA clones corresponding to genomic clones or clones containing the complete human stanniocalcin-α gene, including regulatory and promoter regions, exons and introns. It can also be used to An example of a screen comprises isolating the coding region of the gene by using a known DNA sequence to synthesize an oligonucleotide probe. A labeled oligonucleotide having a sequence complementary to the sequence of the gene of the present invention was used for human cDNA, genomic DN.
Used to screen libraries of A or mRNA to determine the members of the library to which the probe hybridizes.
【００７０】本発明は、ヒトスタニオカルシン−α受容
体の同定方法を提供する。該受容体をコードする遺伝子
は、当業者に知られている多数の方法、例えば、リガン
ドパニング(panning)およびＦＡＣＳソーティングによ
り同定することができる(Ｃoliganら、Ｃurrent Ｐroto
cols in Ｉmmun.、１（２）、第５章（１９９１）)。好
ましくは、発現クローニングを利用し、ここでは、ポリ
アデニル化ＲＮＡをヒトスタニオカルシン−αに応答す
る細胞から調製して、このＲＮＡから作られるcＤＮＡ
ライブラリーをプールに分けて、ＣＯＳ細胞またはヒト
スタニオカルシン−αタンパク質に応答しない他の細胞
をトランスフェクトするために使用する。ガラススライ
ド上で増殖させた、トランスフェクトされた細胞を、標
識化ヒトスタニオカルシン−αにさらす。該スタニオカ
ルシン−αは、ヨウ素化または部位特異的プロテインキ
ナーゼに対する認識部位の包含を含め、様々な方法によ
り標識化することができる。固定およびインキュベーシ
ョンに続いて、そのスライドをオートラジオグラフ分析
にかける。陽性のプールを同定して、サブプールを調製
し、反復サブプーリングおよび再スクリーニング方法を
利用して、再びトランスフェクトし、最終的には、推定
される受容体をコードする単一クローンを得る。The present invention provides a method for identifying a human stanniocalcin-α receptor. The gene encoding the receptor can be identified by a number of methods known to those skilled in the art, for example, ligand panning and FACS sorting (Coligan et al., Current Proto).
cols in Immun., 1 (2), Chapter 5 (1991)). Preferably, expression cloning is utilized, in which polyadenylation RNA is prepared from cells responsive to human stanniocalcin-α and the cDNA produced from this RNA is prepared.
The library is divided into pools and used to transfect COS cells or other cells that do not respond to human stanniocalcin-α protein. The transfected cells grown on glass slides are exposed to labeled human stanniocalcin-α. The stanniocalcin-α can be labeled by a variety of methods, including iodination or inclusion of a recognition site for a site-specific protein kinase. Following fixation and incubation, the slides are subjected to autoradiographic analysis. Positive pools are identified, subpools are prepared, and re-transfected using iterative subpooling and rescreening methods, ultimately resulting in a single clone encoding the putative receptor.
【００７１】受容体を同定するための他の方法として、
標識化ヒトスタニオカルシン−αを細胞膜と光親和性に
より結合させるか、または受容体分子を発現する調製物
を抽出することができる。橋かけ(cross-linked)物質を
ＰＡＧＥにより分けて、Ｘ線フィルムにさらす。リガン
ド−受容体を含む標識化複合体を切除し、ペプチドフラ
グメントに分けて、タンパク質ミクロ配列決定にかける
ことができる。ミクロ配列決定から得られるアミノ酸配
列を使用して、一組の変性オリゴヌクレオチドプローブ
を設計し、cＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
て、推定される受容体をコードする遺伝子が同定される
であろう。Another method for identifying the receptor is
Labeled human stanniocalcin-α can be bound to the cell membrane with photoaffinity, or a preparation expressing the receptor molecule can be extracted. The cross-linked material is separated by PAGE and exposed to X-ray film. The labeled complex containing the ligand-receptor can be excised, split into peptide fragments and subjected to protein microsequencing. Using the amino acid sequences obtained from microsequencing, a set of degenerate oligonucleotide probes will be designed and a cDNA library will be screened to identify the gene encoding the putative receptor.
【００７２】本発明はまた、化合物をスクリーニングし
て、ヒトスタニオカルシン−αのアゴニストおよびアン
タゴニストを同定する方法も提供する。例として、バイ
オアッセイを行うことができ、ここでは、そのアッセイ
成分が、その表面上にヒトスタニオカルシン−α受容体
を発現する哺乳動物細胞または膜調製物、標識化カルシ
ウム、例えば、４５Ｃa＋＋、およびスクリーニングす
べき化合物を含んでなる。その化合物が有効なヒトスタ
ニオカルシン−αアゴニストであるならば、それはヒト
スタニオカルシン−α受容体リガンドによく似ているで
あろうことから、ヒトスタニオカルシン−αの不存在下
でも、その細胞または膜による４５Ｃa ＋＋吸収があ
る。その４５Ｃa＋＋吸収量は、放射性標識を利用する
ことにより測定することができる。アンタゴニストに関
してスクリーニングする場合には、ヒトスタニオカルシ
ン−αをバイオアッセイに加えて、その化合物が、ヒト
スタニオカルシン−αとその受容体との相互作用を妨げ
ることにより４５Ｃa＋＋吸収を阻害する能力を同じ方
法で測定することができる。The present invention also provides for screening compounds.
Agonists and antagonists of human stanniocalcin-α
Also provided is a method of identifying a agonist. As an example,
The assay can be performed
The component has a human stanniocalcin-α receptor on its surface.
Mammalian cells or membrane preparations expressing
Um, for example45Ca++And screening
A compound to be prepared. A human star on which the compound is effective
If it is a niocalcin-α agonist, it is a human
Very similar to stanniocalcin-α receptor ligand
In the absence of human stanniocalcin-α,
But depending on the cell or membrane45Ca ++Absorption
You. That45Ca++For the amount of absorption, use a radioactive label
Can be measured. Antagonist
When screening by human stanniocalci
Is added to the bioassay and the compound is
Prevents interaction between stanniocalcin-α and its receptor
By45Ca++Same ability to inhibit absorption
Method.
【００７３】あるいはまた、ヒトスタニオカルシン−α
とその受容体との相互作用に続いて起こる、既知の第二
メッセンジャーシステムの応答は、該化合物の存在下ま
たは不存在下に測定して比較されるであろう。そのよう
な第二メッセンジャーシステムには、これらに限定され
るものではないが、cＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イ
オンチャンネルまたはホスホイノシチド加水分解が含ま
れる。Alternatively, human stanniocalcin-α
The response of the known second messenger system following interaction with and its receptor will be measured and compared in the presence or absence of the compound. Such second messenger systems include, but are not limited to, cAMP guanylate cyclase, ion channels or phosphoinositide hydrolysis.
【００７４】可能性のあるヒトスタニオカルシン−αア
ンタゴニストには、ヒトスタニオカルシン−αに結合し
て、その機能を排除する抗体、または幾つかの場合に
は、オリゴヌクレオチドが含まれる。アンタゴニストに
はまた、ヒトスタニオカルシン−α受容体に結合して、
その受容体をヒトスタニオカルシン−αから有効にブロ
ックするポリペプチドも含まれる。これらのポリペプチ
ドは、ヒトスタニオカルシン−αと密接に関係している
が、天然の生物学的機能を失ってしまっているタンパク
質であり、一例は、変異型のヒトスタニオカルシン−α
である。[0074] Potential human stanniocalcin-α antagonists include antibodies, or in some cases, oligonucleotides, that bind to and abolish the function of human stanniocalcin-α. Antagonists also bind to human stanniocalcin-α receptor,
Also included are polypeptides that effectively block the receptor from human stanniocalcin-α. These polypeptides are proteins that are closely related to human stanniocalcin-α, but have lost their natural biological functions, and one example is a mutant form of human stanniocalcin-α.
It is.
【００７５】ヒトスタニオカルシン−αアンタゴニスト
にはまた、アンチセンス構築物も含まれる。アンチセン
ス技術を利用して、三重らせん形成またはアンチセンス
ＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御するこ
とができ、この方法は両方とも、ポリヌクレオチドのＤ
ＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、本発明の
成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列
の５’コード部分を使用して、長さ約１０〜４０塩基対
のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。
ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子領
域に対して相補的であるよう設計し(三重らせん−Ｌee
ら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.、６：３０７３（１９７９）；
Ｃooneyら、Ｓcience、２４１：４５６（１９８８）；
およびＤervanら、Ｓcience、２５１：１３６０（１９
９１）を参照)、そのことによって、転写およびヒトス
タニオカルシン−αの産生を妨げる。アンチセンスＲＮ
Ａオリゴヌクレオチドは、インビボにおいてmＲＮＡに
ハイブリダイズして、mＲＮＡ分子のヒトスタニオカル
シン−αポリペプチドへの翻訳をブロックする(アンチ
センス−Ｏkano、Ｊ.Ｎeurochem.、５６：５６０（１９
９１）；Ｏligodeoxynucleotides as Ａntisense Ｉnhi
bitors of Ｇene Ｅxpression、ＣＲＣ Ｐress、Ｂoca
Ｒaton、ＦＬ（１９８８）)。上記のオリゴヌクレオチ
ドをまた、細胞に送り込むことから、アンチセンスＲＮ
ＡまたはＤＮＡをインビボにおいて発現させて、ヒトス
タニオカルシン−αタンパク質の産生を阻害することが
できる。[0075] Human stanniocalcin-α antagonists also include antisense constructs. Antisense technology can be used to control gene expression by triple helix formation or by antisense DNA or RNA, both methods that use the D
Based on binding to NA or RNA. For example, an antisense RNA oligonucleotide of about 10-40 base pairs in length is designed using the 5 'coding portion of a polynucleotide sequence, which encodes a mature polypeptide of the invention.
DNA oligonucleotides were designed to be complementary to the gene region involved in transcription (triple helix-Lee).
Et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979);
Cooney et al., Science, 241: 456 (1988);
And Dervan et al., Science, 251: 1360 (19
91)), thereby preventing transcription and production of human stanniocalcin-α. Antisense RN
The A oligonucleotide hybridizes to the mRNA in vivo and blocks translation of the mRNA molecule into a human stanniocalcin-α polypeptide (antisense-Okano, J. Neurochem., 56: 560 (19).
91); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhi
bitors of Gene Expression, CRC Press, Boca
Raton, FL (1988)). The above oligonucleotides are also delivered to cells, thus providing antisense RNs.
A or DNA can be expressed in vivo to inhibit the production of human stanniocalcin-α protein.
【００７６】ヒトスタニオカルシン−αアンタゴニスト
にはまた、ポリペプチドの活性部位に結合して、そのポ
リペプチドが生物学的機能を与えることができないよう
にする小さな分子も含まれる。小さな分子の例には、こ
れらに限定されるものではないが、小さなペプチドまた
はペプチド様分子が含まれる。[0076] Human stanniocalcin-α antagonists also include small molecules that bind to the active site of a polypeptide so that the polypeptide cannot confer biological function. Examples of small molecules include, but are not limited to, small peptides or peptide-like molecules.
【００７７】該アンタゴニストは、高濃度のヒトスタニ
オカルシン−αによる骨吸収の刺激をブロックするため
に使用することができ、また従って、骨粗鬆症を治療す
るために使用することができる。The antagonists can be used to block the stimulation of bone resorption by high concentrations of human stanniocalcin-α, and can therefore be used to treat osteoporosis.
【００７８】該ヒトスタニオカルシン−αアンタゴニス
トはまた、カルシウムレベルの増加が望ましい他の障害
のうち、低カルシウム血症およびパジェット病を治療す
るために使用することもできる。該アンタゴニストは、
以下に記載するような薬学上許容され得る担体と共に、
組成物中で使用することができる。The human stanniocalcin-α antagonists can also be used to treat hypocalcemia and Paget's disease, among other disorders where increased calcium levels are desirable. The antagonist is
With a pharmaceutically acceptable carrier as described below,
It can be used in compositions.
【００７９】該ヒトスタニオカルシン−αアンタゴニス
トはまた、カルシウムレベルの増加が望ましい他の障害
のうち、低カルシウム血症およびパジェット病を治療す
るために使用することもできる。該アンタゴニストは、
以下に記載するような薬学上許容され得る担体と共に、
組成物中で使用することができる。The human stanniocalcin-α antagonists can also be used to treat hypocalcemia and Paget's disease, among other disorders where increased calcium levels are desirable. The antagonist is
With a pharmaceutically acceptable carrier as described below,
It can be used in compositions.
【００８０】本発明のヒトスタニオカルシン−αポリペ
プチド、並びにアゴニストおよびアンタゴニスト化合物
は、適当な薬学的担体と組み合わせて使用することがで
きる。そのような医薬組成物は、治療上有効な量の該ポ
リペプチド、および薬学上許容され得る担体または賦形
剤を含んでなる。そのような担体には、これに限定され
るものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デ
キストロース、水、グリセロール、エタノール、および
それらの組み合わせが含まれる。その製剤は、投与方法
に適合すべきである。The human stanniocalcin-α polypeptides of the present invention, as well as agonist and antagonist compounds, can be used in combination with a suitable pharmaceutical carrier. Such pharmaceutical compositions comprise a therapeutically effective amount of the polypeptide, and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Such carriers include, but are not limited to, saline, buffered saline, dextrose, water, glycerol, ethanol, and combinations thereof. The formulation should suit the mode of administration.
【００８１】本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分
を１つまたはそれ以上充填した、１つまたはそれ以上の
容器を含んでなる医薬品パックまたはキットも提供す
る。そのような容器に関連して、薬学的または生物学的
製品の製造、使用または販売を規制する政府当局により
規定された形の通知を付してもよく、この通知は、ヒト
への投与のための製造、使用または販売の、該当局によ
る承認を表わす。さらに、該医薬組成物は、他の治療化
合物と共に使用することができる。The present invention also provides a pharmaceutical pack or kit comprising one or more containers filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the present invention. In connection with such containers, a notice may be provided in the form prescribed by governmental authorities that regulate the manufacture, use or sale of pharmaceutical or biological products, the notice being provided for administration to humans. Represents the approval of the relevant bureau of manufacture, use or sale for Further, the pharmaceutical compositions can be used with other therapeutic compounds.
【００８２】該医薬組成物は、経口、局所、静脈内、腹
腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路といったよ
うな、便利な方法で投与することができる。該医薬組成
物は、具体的な徴候を治療および／または予防するのに
有効な量で投与される。一般に、該医薬組成物は、少な
くとも約１０μg／kg(体重)の量で投与され、最も多く
の場合、それらは、１日当り約８mg／kg(体重)を超えな
い量で投与されるであろう。最も多くの場合、投与経路
および症状等を考慮に入れて、投薬量は、毎日約１０μ
g／kg〜約１mg／kg(体重)である。The pharmaceutical compositions can be administered in a convenient manner, such as orally, topically, intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously, intranasally or intradermally. The pharmaceutical compositions are administered in an amount effective to treat and / or prevent the particular indication. Generally, the pharmaceutical compositions will be administered in an amount of at least about 10 μg / kg (body weight), and most often they will be administered in an amount not to exceed about 8 mg / kg (body weight) per day. . Most often, taking into account the route of administration and the symptoms, etc., the dosage is about 10 μl daily.
g / kg to about 1 mg / kg (body weight).
【００８３】該ヒトスタニオカルシン−αポリペプチ
ド、並びにこれもまたポリペプチドであるアゴニストお
よびアンタゴニストは、「遺伝子治療」と呼ばれること
が多い、そのようなポリペプチドのインビボにおける発
現により、本発明に従って使用することができる。The human stanniocalcin-α polypeptides, as well as agonists and antagonists, which are also polypeptides, are used in accordance with the present invention by the in vivo expression of such polypeptides, often referred to as “gene therapy”. Can be used.
【００８４】従って、例えば、患者由来の細胞を、エク
スビボにおいてポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞
を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方
法は、当業界で周知である。例えば、本発明のポリペプ
チドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使
用によって、当業界で既知の方法により、細胞を操作す
ることができる。Thus, for example, cells from a patient are engineered ex vivo with a polynucleotide (DNA or RNA) encoding a polypeptide, and the engineered cells are then provided to a patient to be treated with the peptide. Such methods are well-known in the art. For example, cells can be engineered by methods known in the art by use of retroviral particles comprising RNA encoding a polypeptide of the invention.
【００８５】同様に、例えば、当業界で既知の方法によ
り、ポリペプチドのインビボにおける発現のために、細
胞をインビボにおいて操作することができる。当業界で
知られているように、細胞をインビボにおいて操作し
て、ポリペプチドをインビボにおいて発現させるため
に、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレ
トロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投
与することができる。そのような方法により本発明のポ
リペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方
法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例え
ば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイ
ルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合
わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用
することができるアデノウイルスであってもよい。[0085] Similarly, cells can be engineered in vivo for expression of the polypeptide in vivo, eg, by methods known in the art. As is known in the art, cells are engineered in vivo to produce a polypeptide in vivo, and a producer cell for producing a retroviral particle comprising RNA encoding a polypeptide of the invention is produced. It can be administered to a patient. These and other methods for administering a polypeptide of the present invention by such methods will be apparent to those skilled in the art from the teachings of the present invention. For example, an expression vehicle for manipulating cells may be other than a retrovirus, for example, an adenovirus that can be used to manipulate cells in vivo after being combined with a suitable delivery vehicle.
【００８６】本発明はまた、疾患、または変異したヒト
スタニオカルシン−αの存在に関係のある疾患に対する
感受率を検出するための診断アッセイの一部としての、
スタニオカルシン−α遺伝子の使用にも関する。そのよ
うな疾患、例えば、高血圧症は、ヒトスタニオカルシン
−αの発現不足と関係がある。The present invention also provides a diagnostic assay for detecting susceptibility to a disease, or a disease associated with the presence of mutated human stanniocalcin-α.
It also relates to the use of the stanniocalcin-α gene. Such diseases, for example, hypertension, are associated with an underexpression of human stanniocalcin-α.
【００８７】ヒトスタニオカルシン−α遺伝子において
変異が起こっている個体は、様々な技術により、ＤＮＡ
レベルで検出することができる。診断用の核酸は、患者
の細胞から、例えば、血液、尿、唾液、組織生検および
剖検材料から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、検出
のために直接使用することができ、または分析前にＰＣ
Ｒ(Ｓaikiら、Ｎature、３２４：１６３−１６６（１９
８６）)を利用することにより、酵素的に増幅すること
ができる。ＲＮＡまたはcＤＮＡもまた、同じ目的に使
用することができる。例として、ヒトスタニオカルシン
−αをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを使
用して、ヒトスタニオカルシン−αの変異を同定して分
析することができる。例えば、欠失および挿入は、正常
な遺伝子型と比較しての増幅産物のサイズにおける変化
により検出することができる。点変異は、増幅されたＤ
ＮＡが、放射能標識化ヒトスタニオカルシン−α ＲＮ
Ａ、あるいはまた、放射能標識化ヒトスタニオカルシン
−α アンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズするこ
とにより同定することができる。完全に対合している配
列は、ＲＮアーゼ Ａ 消化により、または融解温度の相
違により、対合していない複式物(duplexes)と区別する
ことができる。An individual having a mutation in the human stanniocalcin-α gene can be obtained by various techniques using DNA.
Can be detected at the level. Diagnostic nucleic acids can be obtained from cells of a patient, for example, from blood, urine, saliva, tissue biopsy, and autopsy material. Genomic DNA can be used directly for detection, or
R (Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (19
86)), amplification can be performed enzymatically. RNA or cDNA can also be used for the same purpose. As an example, mutations in human stanniocalcin-α can be identified and analyzed using PCR primers complementary to the nucleic acid encoding human stanniocalcin-α. For example, deletions and insertions can be detected by a change in the size of the amplification product relative to the normal genotype. The point mutation is the amplified D
NA is radiolabeled human stanniocalcin-α RN
A, or alternatively, it can be identified by hybridizing to a radiolabeled human stanniocalcin-α antisense DNA sequence. Perfectly matched sequences can be distinguished from unpaired duplexes by RNase A digestion or by differences in melting temperatures.
【００８８】ＤＮＡ配列の相違に基づいた遺伝試験は、
変性剤を含む、または含まないゲルでのＤＮＡフラグメ
ントの電気泳動移動度における変化の検出により成し遂
げることができる。小さな配列の欠失および挿入は、高
分解能ゲル電気泳動により視覚化することができる。Ｄ
ＮＡフラグメントの様々な配列は、ホルムアミジングラ
ジエントゲルを変性することで区別することができ、こ
こでは、様々なＤＮＡフラグメントの移動度が、それら
の特異的な融解または部分的な融解温度により、ゲルに
おける様々な位置で遅延される(例えば、Ｍyersら、Ｓc
ience、２３０：１２４２（１９８５）を参照)。Genetic testing based on DNA sequence differences
This can be accomplished by detecting a change in electrophoretic mobility of the DNA fragment on a gel with or without denaturing agents. Small sequence deletions and insertions can be visualized by high resolution gel electrophoresis. D
The different sequences of the NA fragments can be distinguished by denaturing the formamidine gradient gel, where the mobility of the different DNA fragments depends on their specific or partial melting temperature. Are delayed at various positions in (eg, Myers et al., Sc
ience, 230: 1242 (1985)).
【００８９】特定の位置での配列変化もまた、ＲＮアー
ゼおよびＳ１保護といったようなヌクレアーゼ保護アッ
セイ、または化学切断法により示すことができる(例え
ば、Ｃottonら、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−
４４０１（１９８５）)。Sequence changes at specific positions may also be indicated by nuclease protection assays, such as RNase and S1 protection, or by chemical cleavage methods (eg, Cotton et al., PNAS, USA, 85: 4397-).
4401 (1985)).
【００９０】従って、特異的なＤＮＡ配列の検出は、ゲ
ノムＤＮＡのハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保
護、化学切断、直接ＤＮＡ配列決定、または制限酵素の
使用(例えば、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）)、およ
びサザンブロッティングといったような方法により成し
遂げることができる。Thus, detection of specific DNA sequences can be accomplished by genomic DNA hybridization, RNase protection, chemical cleavage, direct DNA sequencing, or the use of restriction enzymes (eg, restriction fragment length polymorphism (RFLP)). , And Southern blotting.
【００９１】さらに従来的なゲル電気泳動およびＤＮＡ
配列決定に加えて、変異はまた、insitu 分析により検
出することもできる。Further conventional gel electrophoresis and DNA
In addition to sequencing, mutations can also be detected by insitu analysis.
【００９２】本発明の配列はまた、染色体同定にも有益
である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に
対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせること
ができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同
定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基
づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色***置をマ
ークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤ
ＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と
関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。The sequences of the present invention are also useful for chromosome identification. The sequence can be specifically targeted to a particular location on an individual human chromosome and hybridized. Moreover, there is currently a need to identify specific sites on the chromosome. Chromosome marking reagents based on actual sequence data (repetitive polymorphisms) are currently scarcely available for marking chromosomal locations. D according to the invention
Mapping NAs to chromosomes is an important first step in relating their sequences to genes associated with disease.
【００９３】簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプラ
イマー(好ましくは、１５−２５bp)を調製することによ
り、配列を染色体にマップすることができる。配列の
３’の翻訳されていない領域のコンピューター分析を利
用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエキソンをスパン
(span)しないプライマーを迅速に選択することから、増
幅過程を複雑なものとする。次いで、これらのプライマ
ーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰ
ＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応する
ヒト遺伝子を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅
されたフラグメントを与えるであろう。[0093] Briefly, sequences can be mapped to chromosomes by preparing cDNA-derived PCR primers (preferably 15-25 bp). Using computer analysis of the 3 'untranslated region of the sequence to span one or more exons in genomic DNA
The rapid selection of primers that do not (span) complicates the amplification process. These primers are then used to identify the Ps of somatic cell hybrids containing individual human chromosomes.
Used for CR screening. Only those hybrids containing the human gene corresponding to the primer will give the amplified fragment.
【００９４】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅
速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを
用いての本発明を利用して、サブローカリゼーション
は、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプー
ル由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達
成することができる。その染色体へマップするのに同様
に利用することができる他のマッピング方法には、in s
itu ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティ
ッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニン
グ、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築す
るためのハイブリダイゼーションによるプレセレクショ
ンが含まれる。[0094] PCR mapping of somatic cell hybrids is a rapid method for assigning specific DNA to specific chromosomes. Utilizing the present invention with the same oligonucleotide primers, sublocalization can be achieved in a similar manner using panels of fragments from a pool of specific chromosomes or large genomic clones. Other mapping methods that can also be used to map to that chromosome include in s
It includes itu hybridization, prescreening using labeled flow-sorted chromosomes, and preselection by hybridization to construct a chromosome-specific cDNA library.
【００９５】cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッ
ドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳ
Ｈ)を利用して、正確な染色***置を一工程で与えるこ
とができる。この技術は、５００または６００塩基とい
う短いcＤＮＡで利用することができる；しかし、２,０
００bpより大きいクローンは、簡単な検出に十分なシグ
ナル強度を有する独自の染色***置へ結合する可能性が
高い。ＦＩＳＨは、発現配列タグ(ＥＳＴ)が得られるク
ローンの使用を必要とし、また長ければ長いほどよい。
例えば、２,０００bpが良好であり、４,０００はより良
好であって、４,０００以上は、恐らく、良好な結果を
妥当な時間割合で得るのに必要ない。この技術の復習に
は、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂ
asic Ｔechniques、Ｐergamon Ｐress、ニューヨーク
（１９８８）を参照。Fluorescence in situ hybridization of cDNA clones to metaphase chromosomal spreads (FIS
Using H), the exact chromosome location can be provided in one step. This technique can be used with cDNAs as short as 500 or 600 bases;
Clones larger than 00 bp are more likely to bind to unique chromosomal locations with sufficient signal intensity for easy detection. FISH requires the use of clones from which expressed sequence tags (ESTs) are obtained, and the longer the better.
For example, 2,000 bp is better, 4,000 is better, and 4,000 or more is probably not necessary to get good results at a reasonable time rate. For a review of this technique, see Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of B
See asic Technologies, Pergamon Press, New York (1988).
【００９６】ある配列が正確な染色***置に一度マップ
されると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデ
ータと関連付けることができる。そのようなデータは、
例えば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in
Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕniversity Ｗelch Ｍedical
Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出さ
れる。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝
子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺
伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical location of the sequence on the chromosome can be associated with genetic map data. Such data is
For example, V. McKusick, Mendelian Inheritance in
Man (Johns Hopkins University Welch Medical)
(Available online via Library). The relationship between the gene and the disease mapped to the same chromosomal region is then confirmed by binding analysis (coinheritance of physically adjacent genes).
【００９７】次に、病気に冒された個体と冒されていな
い個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定
する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまた
は全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体にお
いても認められないなら、その変異は疾患の原因となる
ものであるらしい。Next, it is necessary to determine the differences in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals. If the mutation is found in some or all of the affected individuals but not in any normal individuals, then the mutation is likely to be disease-causing.
【００９８】現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッ
ピングの分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に
局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因とな
る遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガ
ベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子
を仮定する)。At present, from physical and genetic mapping analyses, a cDNA that is correctly localized to a chromosomal region associated with a disease could be one of 50-500 possible causative genes. . (This assumes a 1 megabase mapping analysis and one gene per 20 kb).
【００９９】ポリペプチド、それらのフラグメントもし
くは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそ
れらを発現する細胞を免疫源として使用して、それらに
対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、
例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であ
り得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化
抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発
現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様
々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造
に使用することができる。[0099] The polypeptides, their fragments or other derivatives, or analogs thereof, or cells expressing them can be used as immunogens to produce antibodies thereto. These antibodies are
For example, it can be a polyclonal or monoclonal antibody. The present invention also includes chimeric, single chain, and humanized antibodies, as well as Fab fragments, or the products of a Fab expression library. Various methods known in the art can be used for the production of such antibodies and fragments.
【０１００】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入
することにより、またはポリペプチドを動物、好ましく
はヒトでない動物に投与することにより得ることができ
る。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリ
ペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリ
ペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、
完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するの
に使用することができる。次いで、そのような抗体を使
用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプ
チドを単離することができる。Antibodies raised against a polypeptide corresponding to a sequence of the present invention can be obtained by injecting the polypeptide directly into an animal or by administering the polypeptide to an animal, preferably a non-human animal. Can be. The antibody so obtained will then bind to the polypeptide itself. In this way, even a sequence encoding only a fragment of a polypeptide,
It can be used to produce antibodies that bind the whole naturally occurring polypeptide. Such an antibody can then be used to isolate the polypeptide from tissues expressing the polypeptide.
【０１０１】モノクローナル抗体を調製するには、連続
的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全
て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術
(ＫohlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５
６:４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ
細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmmun
ology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗
体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃole
ら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer
Ｔherapy、Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.、７７−９６頁におい
て)が含まれる。For preparing monoclonal antibodies, any technique which provides antibodies produced by continuous cell line cultures can be used. Examples include hybridoma technology
(Kohler and Milstein, 1975, Nature, 25
6: 495-497), trioma technology, human B
Cell hybridoma technology (Kozbor et al., 1983, Immun
ology Today 4:72), and EBV-hybridoma technology (Cole) for producing human monoclonal antibodies.
Et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).
【０１０２】単鎖抗体の産生に関して記載されている技
術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免疫原
性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を製造するのに適
合し得る。また、トランスジェニックマウスを使用し
て、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化
抗体を発現させることもできる。The techniques described for producing single-chain antibodies (US Pat. No. 4,946,778) may be adapted for producing single-chain antibodies against the immunogenic polypeptide products of the invention. Also, transgenic mice can be used to express humanized antibodies to the immunogenic polypeptide products of the invention.
【０１０３】本発明をさらに、以下の実施例に関して記
載する；しかし、本発明は、そのような実施例に限定さ
れないことを理解すべきである。部または量は全て、特
にことわらない限り、重量単位である。The present invention is further described with reference to the following examples; however, it is to be understood that the present invention is not limited to such examples. All parts or amounts are by weight unless otherwise indicated.
【０１０４】以下の実施例の理解を容易にするために、
幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載
する。In order to facilitate understanding of the following embodiment,
Some frequently occurring methods and / or terms are described.
【０１０５】「プラスミド」は、前置きする小文字のp
および／または続けて大文字および／または数字により
示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されてい
て、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、ま
たは公開された方法により入手可能なプラスミドから構
築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラス
ミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろ
う。"Plasmid" is a lowercase p
And / or followed by capital letters and / or numbers. The starting plasmids herein are either commercially available, publicly available on a non-limiting basis, or can be constructed from plasmids available by published methods. In addition, plasmids equivalent to the described plasmids are known in the art and will be apparent to those skilled in the art.
【０１０６】ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列に
のみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示
す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されて
おり、それらの反応条件、補因子および他の必要条件
は、当業者に知られているように使用した。分析目的に
は、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使
用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを
単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮ
Ａ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。
特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者
により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベ
ーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従っ
て変えることができる。消化後、その反応物をポリアク
リルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメン
トを単離する。“Digestion” of DNA refers to catalytic cleavage of the DNA with a restriction enzyme that acts only at certain sequences in the DNA. The various restriction enzymes used herein are commercially available and their reaction conditions, cofactors and other requirements were used as would be known to one of skill in the art. For analytical purposes, typically 1 μg of plasmid or DNA fragment is used with about 2 units of enzyme in about 20 μl of buffer solution. For the purpose of isolating DNA fragments for plasmid construction, DN
Digest 5-50 μg of A with 20-250 units of enzyme.
Appropriate buffers and substrate amounts for particular restriction enzymes are specified by the manufacturer. Incubation times of about 1 hour at 37 ° C. are usually utilized, but can be varied according to the supplier's instructions. After digestion, the reaction is directly electrophoresed on a polyacrylamide gel to isolate the desired fragment.
【０１０７】切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇ
oeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、８：４０５７
（１９８０）により記載されている８％ ポリアクリル
アミドゲルを用いて行う。The size separation of the cleaved fragments
oeddel, D et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057.
Performed using 8% polyacrylamide gel as described by (1980).
【０１０８】「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成
することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、
または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのよ
うな合成オリゴヌクレオチドは５’ホスフェートを有さ
ないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェー
トを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにラ
イゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、
脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートする
であろう。“Oligonucleotide” is a single-stranded polydeoxynucleotide that can be chemically synthesized.
Or two complementary polynucleotide strands. Since such a synthetic oligonucleotide does not have a 5 'phosphate, it will not ligate to another oligonucleotide without adding a phosphate with ATP in the presence of a kinase. Synthetic oligonucleotides are
Will ligate to fragments that have not been dephosphorylated.
【０１０９】「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸
フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過
程をいう(Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にこ
とわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせる
べきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り
１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、
既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができ
る。"Ligation" refers to the process of forming a phosphodiester bond between two double-stranded nucleic acid fragments (Maniatis, T. et al., Ibid., P. 146). Unless otherwise stated, ligation was performed with 10 units of T4 DNA ligase (“ligase”) per 0.5 μg of approximately equimolar amount of the DNA fragment to be ligated.
This can be accomplished using known buffers and conditions.
【０１１０】特にことわらない限り、トランスフォーメ
ーションは、Ｇraham,Ｆ.およびＶan der Ｅb,Ａ.、Ｖi
rology、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記
載されているようにして行った。Unless otherwise stated, transformations were performed according to Graham, F. and Van der Eb, A., Vi.
rology, 52: 456-457 (1973).
【０１１１】実施例 １ ヒトスタニオカルシン−αの細菌発現および精製 最初に、ヒトスタニオカルシン−αをコードするＤＮＡ
配列、ＡＴＣＣ第７５８３１号を、スタニオカルシン−
αコード配列の５’および３’配列に対応するＰＣＲオ
リゴヌクレオチドプライマーを利用して増幅する。５’
オリゴヌクレオチドプライマーは、配列： を有し、Ａfl III制限酵素部位、および推定されるメチ
オニン開始コドンから始まるスタニオカルシン−αコー
ド配列の２０ヌクレオチドを含む。３’配列： は、Ｂgl II部位に対する相補的配列、続いて、スタニ
オカルシン−αの２０ヌクレオチドを含む。pＱＥ−６
０ベクター(Ｑiagen,Ｉnc. ９２５９ Ｅton Ａvenue、
Ｃhatsworth、ＣＡ、９１３１１)は、抗生物質耐性(Ａm
pｒ)、細菌の複製開始点(ori)、ＩＰＴＧ−調節可能な
プロモーターオペレーター(Ｐ／Ｏ)、リボソーム結合部
位(ＲＢＳ)、６−Ｈisタグおよび制限酵素部位をコード
する。pＱＥ−６０をＡfl IIIおよびＢgl IIで消化す
る。増幅された配列を、Ａfl IIIおよびＢgl IIで消化
した後、pＱＥ−６０にライゲートして、ヒスチジンタ
グおよびＲＢＳをコードする配列と共に枠内に挿入す
る。次いで、そのライゲーション混合物を使用して、Ｓ
ambrook,Ｊ.ら、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory
Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress（１９８
９）に記載されている手順により、Ｑiagenから入手可
能なＥ.coli株 Ｍ１５／rep４をトランスフォームす
る。Ｍ１５／rep４はプラスミドpＲＥＰ４の多重コピー
を含み、これは、lacＩリプレッサーを発現して、また
カナマイシン耐性(Ｋanｒ)も与える。トランスフォーマ
ントを、それらがＬＢプレートで増殖する能力により同
定して、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選
択する。プラスミドＤＮＡを単離して、制限分析により
確認する。所望の構築物を含むコロニーを、Ａmp(１０
０ug／ml)とＫan(２５ug／ml)の両方を補ったＬＢ培地
中での液体培養で一晩増殖させる(Ｏ／Ｎ)。そのＯ／Ｎ
培養物を使用して、大きな培養物に１：１００〜１：２
５０の割合で播種する。細胞が、０.４〜０.６の光学密
度６００(Ｏ.Ｄ.６００)まで増殖する。次いで、ＩＰＴ
Ｇ(「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド」)を、最終濃度が１mＭとなるまで加える。ＩＰＴＧ
は、lacＩリプレッサーを不活性化し、Ｐ／Ｏをクリア
リングし、遺伝子発現を増加させることにより誘導す
る。細胞をさらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞
を遠心分離(６０００×ｇで２０分)により収集する。細
胞ペレットをカオトロピック剤である６モルのグアニジ
ンＨＣl中で可溶化する。清澄後、この溶液から、６−
ヒスチジンタグを含むタンパク質による強固な結合を可
能にする条件下、ニッケル−キレートカラムでのクロマ
トグラフィーにより、可溶化したスタニオカルシン−α
を精製する(Ｈochuli,Ｅ.ら、Ｇenetic Ｅngineering、
Ｐrinciples ＆ Ｍethods、１２：８７−９８（１９９
０）)。ＧnＨＣlからのタンパク質の再生は、幾つかの
プロトコルにより成し遂げることができる。(Ｊaenick
e,Ｒ.およびＲudolph,Ｒ.、Ｐrotein Ｓtructure−Ａ
Ｐractical Ａpproach、ＩＲＬ Ｐress、ニューヨーク
（１９９０）)。まず最初に、段階透析を利用して、Ｇn
ＨＣＬを除去する。あるいはまた、Ｎi−キレートカラ
ムから単離される精製タンパク質を、減少型リニアＧn
ＨＣＬグラジエントを通す第２カラムに結合させること
ができる。そのタンパク質をカラムに結合させる間に再
生した後、２５０mＭのイミダゾール、１５０mＭのＮa
Ｃl、２５mＭのトリス−ＨＣl(pＨ ７.５)および１０％
のグリセロールを含む緩衝液で溶出する。最後に、可溶
性タンパク質を、５mＭの重炭酸アンモニウムを含む貯
蔵緩衝液に対して透析する。精製したタンパク質をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより分析した(第５図)。 Example 1 Bacterial Expression and Purification of Human Staniocalcin-α First, DNA encoding human stanniocalcin-α
The sequence, ATCC No. 75831, is replaced with stanniocalcin-
Amplification is performed using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' sequences of the alpha coding sequence. 5 '
The oligonucleotide primer has the sequence: And contains the Afl III restriction enzyme site and 20 nucleotides of the stanniocalcin-α coding sequence starting from the putative methionine start codon. 3 'sequence: Contains the complementary sequence to the Bgl II site, followed by 20 nucleotides of stanniocalcin-α. pQE-6
0 vector (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue,
Chatsworth, CA, 91311) shows that antibiotic resistance (Am
p r ), encodes the bacterial origin of replication (ori), IPTG-regulatable promoter operator (P / O), ribosome binding site (RBS), 6-His tag and restriction enzyme sites. pQE-60 is digested with Afl III and Bgl II. The amplified sequence is digested with AflIII and BglII and then ligated into pQE-60 and inserted in frame with the histidine tag and the sequence encoding RBS. Then, using the ligation mixture, S
ambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory.
Manual, Cold Spring Laboratory Press (198
Transform E. coli strain M15 / rep4 available from Qiagen by the procedure described in 9). M15 / rep4 contains multiple copies of plasmid pREP4, which expresses the lacI repressor and also confers kanamycin resistance (Kan r ). Transformants are identified by their ability to grow on LB plates to select for ampicillin / kanamycin resistant colonies. Plasmid DNA is isolated and confirmed by restriction analysis. Colonies containing the desired construct are selected for Amp (10
Grow overnight (O / N) in liquid culture in LB medium supplemented with both 0 ug / ml and Kan (25 ug / ml). Its O / N
Using cultures, large cultures from 1: 100 to 1: 2
Seed at a rate of 50. Cells grow to an optical density 600 (OD 600 ) of 0.4-0.6. Then, IPT
G ("isopropyl-BD-thiogalactopyranoside") is added to a final concentration of 1 mM. IPTG
Is induced by inactivating the lacI repressor, clearing P / O, and increasing gene expression. The cells are grown for an additional 3-4 hours. The cells are then harvested by centrifugation (6000 × g for 20 minutes). The cell pellet is solubilized in the chaotropic agent 6M guanidine HCl. After clarification, 6-
The solubilized stanniocalcin-α was chromatographed on a nickel-chelate column under conditions that allowed for strong binding by the protein containing the histidine tag.
(Hochuli, E. et al., Genetic Engineering,
Principles & Methods, 12: 87-98 (199
0)). Regeneration of the protein from GnHCl can be accomplished by several protocols. (Jaenick
e, R. and Rudolph, R., Protein Structure-A
Practical Approach, IRL Press, New York (1990)). First of all, using stage dialysis, Gn
Remove HCL. Alternatively, the purified protein isolated from the Ni-chelate column is converted to reduced linear Gn.
It can be bound to a second column through an HCL gradient. After regeneration of the protein while binding to the column, 250 mM imidazole, 150 mM Na
Cl, 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 10%
Elute with a buffer containing glycerol. Finally, the soluble protein is dialyzed against a storage buffer containing 5 mM ammonium bicarbonate. Purified protein into SD
It was analyzed by S-PAGE (FIG. 5).
【０１１２】実施例 ２ ＣＯＳ細胞における組換えヒトスタニオカルシン−αの
発現 プラスミド、スタニオカルシン−α ＨＡの発現は、
１）ＳＶ４０ 複製開始点、２）アンピリシン耐性遺伝
子、３）Ｅ.coli 複製開始点、４）ポリリンカー領域、
ＳＶ４０ イントロンおよびポリアデニル化部位が続く
ＣＭＶプロモーターを含む、ベクター pcＤＮＡＩ／Ａm
p(Ｉnvitrogen)から得られる。完全なスタニオカルシン
−α前駆体およびその３’末端に枠内で融合したＨＡタ
グ(tag)をコードするＤＮＡフラグメントを、そのベク
ターのポリリンカー領域にクローン化したことから、組
換えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターの下に指示
される。ＨＡタグは、前記のようなインフルエンザ赤血
球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する
(Ｉ.Ｗilson、Ｈ.Ｎiman、Ｒ.Ｈeighten、Ａ.Ｃherenso
n、Ｍ.Ｃonnolly、およびＲ.Ｌerner、１９８４、Ｃell
３７、７６７)。ＨＡタグを標的タンパク質へ融合させ
ることにより、組換えタンパク質を、ＨＡエピトープを
認識する抗体で容易に検出することが可能となる。プラ
スミド構築方法を以下に記載する：スタニオカルシン−
αをコードするＤＮＡ配列を、２つのプライマーを用い
てクローン化した、もとの発現配列タグ(ＥＳＴ)でのＰ
ＣＲにより構築した： ５’プライマー： は、Ｈind III部位、続いて、開始コドンから始まるス
タニオカルシン−αコード配列の２１ヌクレオチドを含
む； ３’配列： は、ＸbaＩ部位に対する相補的配列、翻訳終止コドン、
ＨＡタグ、およびスタニオカルシン−αコード配列の最
後の２０ヌクレオチド(終止コドンは含まれていない)を
含む。従って、ＰＣＲ産物は、Ｈind III部位、スタニ
オカルシン−αコード配列、続いて、枠内で融合したＨ
Ａタグ、そのＨＡタグの隣の翻訳終了終止コドン、およ
びＸbaＩ部位を含む。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡフ
ラグメントおよびベクター、pcＤＮＡＩ／Ａmpを、Ｈin
d IIIおよびＸbaＩ制限酵素で消化して、ライゲートさ
せた。そのライゲーション混合物をＥ.coli株 ＳＵＲＥ
(Ｓtratagene Ｃloning Ｓystems、１１０９９ Ｎorth
Ｔorrey Ｐines Ｒoad、ＬaＪolla、ＣＡ ９２０３７か
ら入手可能である)にトランスフォームし、そのトラン
スフォームされた培養物をアンピシリン培地プレート上
に置いて、耐性コロニーを選択した。プラスミド ＤＮ
Ａをトランスフォーマントから単離して、正しいフラグ
メントの存在に関して制限分析により試験した。組換え
スタニオカルシン−αの発現のために、ＤＥＡＥ−ＤＥ
ＸＴＲＡＮ方法により、ＣＯＳ細胞を発現ベクターでト
ランスフェクトした(Ｊ.Ｓambrook、Ｅ.Ｆritsch、Ｔ.
Ｍaniatis、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍa
nual、Ｃold Ｓpring ＬaboratoryＰress、（１９８
９）)。スタニオカルシン−α ＨＡタンパク質の発現
を、放射能標識および免疫沈降法により検出した。(Ｅ.
Ｈarlow、Ｄ.Ｌane、Ａntibodies：Ａ Ｌaboratory Ｍa
nual、Ｃold Ｓpring Ｌaboratory Ｐress、（１９８
８）)。トランスフェクションから２日後、細胞を３５
Ｓ−システインで８時間標識化した。次いで、細胞培地
を集めて、細胞を界面活性剤(ＲＩＰＡ緩衝液(１５０m
Ｍ ＮaＣl、１％ ＮＰ−４０、０.１％ ＳＤＳ、１％
ＮＰ−４０、０.５％ＤＯＣ、５０mＭ トリス、pＨ ７.
５))で溶菌した。(Ｗilson,Ｉ.ら、同上 ３７：７６７
（１９８４）)。細胞溶菌液および培養培地の両者を、
ＨＡに特異的なモノクローナル抗体で沈降させた。沈降
したタンパク質を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分
析した。 Example 2 Recombinant human stanniocalcin-α in COS cells
Expression of the expression plasmid, stanniocalcin-α HA,
1) SV40 replication origin, 2) ampicillin resistance gene, 3) E. coli replication origin, 4) polylinker region,
Vector pcDNAI / Am containing the CMV promoter followed by the SV40 intron and polyadenylation site
p (Invitrogen). Since the DNA fragment encoding the complete stanniocalcin-α precursor and the HA tag fused in frame to its 3 ′ end was cloned into the polylinker region of the vector, recombinant protein expression was determined by CMV Directed under the promoter. The HA tag corresponds to an epitope obtained from the influenza hemagglutinin protein as described above.
(I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenso
n, M. Connolly, and R. Lerner, 1984, Cell
37, 767). By fusing the HA tag to the target protein, the recombinant protein can be easily detected with an antibody that recognizes the HA epitope. The plasmid construction method is described below: stanniocalcin-
The DNA sequence coding for α was cloned using two primers and was cloned using the original expressed sequence tag (EST).
Constructed by CR: 5 'primer: Contains a Hind III site followed by 21 nucleotides of the stanniocalcin-α coding sequence starting from the start codon; 3 ′ sequence: Is the sequence complementary to the XbaI site, a translation stop codon,
Includes the HA tag and the last 20 nucleotides of the stanniocalcin-α coding sequence (not including the stop codon). Thus, the PCR product was composed of a Hind III site, a stanniocalcin-α coding sequence, followed by the H-frame fused in frame.
Includes the A tag, a translation termination stop codon next to the HA tag, and an XbaI site. The DNA fragment and vector, pcDNAI / Amp, amplified by PCR were
Digested with dIII and XbaI restriction enzymes and ligated. The ligation mixture was transferred to E. coli strain SURE.
(Stratagene Cloning Systems, 11099 North
(Available from Torrey Pines Road, La Jolla, Calif. 92037) and the transformed cultures were placed on ampicillin medium plates to select for resistant colonies. Plasmid DN
A was isolated from transformants and tested by restriction analysis for the presence of the correct fragment. For expression of recombinant stanniocalcin-α, DEAE-DE
COS cells were transfected with the expression vector by the XTRAN method (J. Sambrook, E. Fritsch, T. et al.
Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, Cold Spring Laboratory Press, (198
9)). The expression of stanniocalcin-α HA protein was detected by radiolabeling and immunoprecipitation. (E.
Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Ma
nual, Cold Spring Laboratory Press, (198
8)). Two days after transfection, cells were harvested at 35
Labeled with S-cysteine for 8 hours. Then, the cell culture medium was collected and the cells were washed with detergent (RIPA buffer (150 mM).
M NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1%
NP-40, 0.5% DOC, 50 mM Tris, pH 7.
The cells were lysed in 5)). (Wilson, I. et al., Supra at 37: 767.
(1984)). Both cell lysate and culture medium
Precipitated with a monoclonal antibody specific for HA. The precipitated proteins were analyzed on a 15% SDS-PAGE gel.
【０１１３】実施例 ３ バキュロウイルス発現システムを用いての ヒトスタニオ
カルシン−αのクローニングおよび発現 完全な長さのスタニオカルシン−αタンパク質をコード
するＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ第７５８３１号を、遺伝子の
５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチ
ドプライマーを利用して増幅する。 Example 3 Human Stanio Using the Baculovirus Expression System
Cloning and Expression of Calcin-α The DNA sequence encoding the full-length stanniocalcin-α protein, ATCC 75831, is amplified utilizing PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 ′ and 3 ′ sequences of the gene.
【０１１４】その５’プライマーは、配列： を有し、またＢam ＨＩ制限酵素部位(肉太の活字)、続
いて、真核細胞における翻訳の開始に有効なシグナルに
似ている６ヌクレオチド(Ｋozak,Ｍ.、Ｊ.Ｍol.Ｂio
l.、１９６、９４７−９５０（１９８７）)、この直ぐ
後に、スタニオカルシン−α遺伝子の最初の２１ヌクレ
オチド(翻訳開始コドン「ＡＴＧ」に下線を引く)を含
む。The 5 'primer has the sequence: And 6 nucleotides (Kozak, M., J. Mol. Bio) which have a Bam HI restriction enzyme site (bold print) followed by a signal effective for initiation of translation in eukaryotic cells.
l., 196, 947-950 (1987)), immediately followed by the first 21 nucleotides of the stanniocalcin-α gene (the translation initiation codon "ATG" is underlined).
【０１１５】その３’プライマーは、配列： を有し、また制限エンドヌクレアーゼ Ａsp ７１８の切
断部位、およびスタニオカルシン−α遺伝子の３’配列
に対して相補的な２１ヌクレオチドを含む。増幅された
配列を、市販のキット(「Ｇeneclean」、ＢＩＯ １０１
Ｉnc.、Ｌa Ｊolla、Ｃa.)を使用して、１％ アガロー
スゲルから単離する。次いで、そのフラグメントをエン
ドヌクレアーゼ Ｂam ＨＩおよびＡsp ７１８で消化し
た後、１％アガロースゲル上で再び精製する。このフラ
グメントをＦ２と名付ける。The 3 'primer has the sequence: And contains a cleavage site for the restriction endonuclease Asp 718, and 21 nucleotides complementary to the 3 'sequence of the stanniocalcin-α gene. The amplified sequence was converted to a commercially available kit (“Geneclean”, BIO101).
(Inc., La Jolla, Ca.) using a 1% agarose gel. The fragment is then digested with the endonucleases Bam HI and Asp 718 and then purified again on a 1% agarose gel. This fragment is named F2.
【０１１６】ベクター pＲＧ１(pＶＬ９４１ベクターの
修飾、以下に論ずる)を、バキュロウイルス発現システ
ムを用いてのスタニオカルシン−αタンパク質の発現に
使用する(レビューには、Ｓummers,Ｍ.Ｄ.およびＳmit
h,Ｇ.Ｅ. １９８７、Ａ manual of methods for baculo
virus vectors and insect cell culture procedures、
Ｔexas Ａgricultural Ｅxperimental Ｓtation Ｂulle
tin Ｎo.１５５５を参照)。この発現ベクターは、オー
トグラファ(Ａutographa)カリフォルニアポリヘドロシ
スウイルス(ＡcＭＮＰＶ)の強力なポリヘドリンプロモ
ーター、続いて、制限エンドヌクレアーゼ Ｂam ＨＩお
よびＡsp ７１８の認識部位を含む。シミアンウイルス
(ＳＶ) ４０のポリアデニル化部位を、有効なポリアデ
ニル化に使用する。組換えウイルスを容易に選択するた
め、Ｅ.coli由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ポ
リヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続くポリ
ヘドリンプロモーターと同じ向きに挿入する。同時トラ
ンスフェクトした(cotransfected)野生型ウイルスＤＮ
Ａの、細胞により媒介される相同組換えのためのウイル
ス配列をポリヘドリン配列の両側に隣接させる。多くの
他のバキュロウイルスベクターを、例えば、pＡc３７
３、pＶＬ９４１、およびpＡcＩＭ１を、pＲＧ１の代わ
りに使用することができるであろう(Ｌuckow,Ｖ.Ａ.お
よびＳummers,Ｍ.Ｄ.、Ｖirology、１７０：３１−３
９)。The vector pRG1 (modification of the pVL941 vector, discussed below) is used for the expression of stanniocalcin-α protein using a baculovirus expression system (for reviews, see Summers, MD and Smit).
h, GE 1987, A manual of methods for baculo
virus vectors and insect cell culture procedures,
Texas Agricultural Experimental Station Bullet
tin No. 1555). This expression vector contains the strong polyhedrin promoter of the Autographa California Polyhedrovirus (AcMNPV), followed by recognition sites for the restriction endonucleases BamHI and Asp718. Simian virus
The (SV) 40 polyadenylation site is used for efficient polyadenylation. To facilitate selection of recombinant viruses, the β-galactosidase gene from E. coli is inserted in the same orientation as the polyhedrin promoter followed by the polyadenylation signal of the polyhedrin gene. Cotransfected wild-type virus DN
The viral sequence for cell-mediated homologous recombination of A is flanked by polyhedrin sequences. Many other baculovirus vectors, for example, pAc37
3, pVL941 and pAcIM1 could be used in place of pRG1 (Luckow, VA and Summers, MD, Virology, 170: 31-3).
9).
【０１１７】プラスミドを制限酵素Ｂam ＨＩおよびＡs
p ７１８で消化した後、当業界で既知の方法により、仔
ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次い
で、市販のキット(「Ｇeneclean」 ＢＩＯ １０１ Ｉn
c.、Ｌa Ｊolla、Ｃa.)を使用して、ＤＮＡを１％ アガ
ロースゲルから単離する。このベクター ＤＮＡをＶ２
と名付ける。The plasmid was replaced with the restriction enzymes Bam HI and As.
After digestion with p718, it is dephosphorylated using calf intestinal phosphatase by methods known in the art. Then, a commercially available kit (“Geneclean” BIO 101 In)
c., La Jolla, Ca.) to isolate DNA from a 1% agarose gel. This vector DNA was
Name it.
【０１１８】フラグメント Ｆ２および脱リン酸化プラ
スミド Ｖ２をＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートさせ
る。次いで、Ｅ.coli ＨＢ１０１細胞をトランスフォー
ムして、スタニオカルシン−α遺伝子を有するプラスミ
ド(pＢac−スタニオカルシン−α)を含む細菌を、酵素
Ｂam ＨＩおよびＡsp ７１８を使用して同定する。クロ
ーン化されたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定に
より確認する。リポフェクション法(Ｆelgnerら、Ｐro
c.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１
７（１９８７）)を利用して、プラスミド pＢac−スタ
ニオカルシン−α ５μgを市販の線形化バキュロウイル
ス(「ＢaculoＧoldＴＭ バキュロウイルス ＤＮＡ」、
Ｐharmingen、Ｓan Ｄiego、ＣＡ)１.０μgと共に同時
トランスフェクトする。The fragment F2 and the dephosphorylated plasmid V2 are ligated with T4 DNA ligase. The E. coli HB101 cells are then transformed and bacteria containing the plasmid with the stanniocalcin-α gene (pBac-staniocalcin-α) are identified using the enzymes BamHI and Asp718. The sequence of the cloned fragment is confirmed by DNA sequencing. Lipofection method (Felgner et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-741.
7 (1987)), 5 μg of plasmid pBac-stanniocalcin-α was converted to a commercially available linearized baculovirus (“BaculoGold ™ baculovirus DNA”,
(Pharmingen, San Diego, Calif.) With 1.0 μg.
【０１１９】ＢaculoＧoldＴＭ ウイルス ＤＮＡ １μg
およびプラスミド pＢac−スタニオカルシン−α ５μg
を、無血清グレイス(Ｇrace’s)培地(Ｌife Ｔechnolog
iesＩnc.、Ｇaithersburg、ＭＤ)５０μlを含むマイク
ロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する。その
後、リポフェクチン(Ｌipofectin)１０μlとグレイス培
地９０μlを加え、混合して、室温で１５分間インキュ
ベートする。次いで、トランスフェクション混合物を、
無血清グレイス培地１mlを含む、３５mmの組織培養プレ
ートに播種したＳf９昆虫細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１
１)に滴加する。そのプレートを前後に揺り動かして、
新たに加えた溶液を混合する。次いで、そのプレートを
２７℃で５時間インキュベートする。５時間後、そのト
ランスフェクション溶液をプレートから除去して、１０
％ ウシ胎児血清を補ったグレイス昆虫培地１mlを加え
る。そのプレートをインキュベーターに戻して、２７℃
で４日間培養し続ける。1 μg of BaculoGold ™ virus DNA
And plasmid pBac-stanniocalcin-α 5 μg
With serum-free Grace's medium (Life Technolog
(iesInc., Gaithersburg, MD) in a sterile well of a microtiter plate containing 50 μl. Thereafter, 10 μl of Lipofectin and 90 μl of Grace's medium are added, mixed, and incubated at room temperature for 15 minutes. The transfection mixture is then
Sf9 insect cells (ATCC CRL 171) seeded on 35 mm tissue culture plates containing 1 ml of serum-free Grace's medium
Add dropwise to 1). Rock the plate back and forth,
Mix the newly added solution. The plate is then incubated at 27 ° C. for 5 hours. After 5 hours, the transfection solution was removed from the plate and
Add 1 ml of Grace's insect medium supplemented with% fetal bovine serum. Return the plate to the incubator at 27 ° C.
For 4 days.
【０１２０】４日後、上清を集めて、ＳummersおよびＳ
mith(上記)により記載されたようにして、プラークアッ
セイを行う。変法として、「Ｂlue Ｇal」(Ｌife Ｔech
nologies Ｉnc.、Ｇaithersburg)を含むアガロースゲル
を使用するが、このことにより、青色に染色されたプラ
ークを容易に単離することが可能となる。(「プラーク
アッセイ」の詳細な記述はまた、昆虫細胞培養に関する
利用者のガイド、およびＬife Ｔechnologies Ｉnc.、
Ｇaithersburgにより配布されたバキュロウイルス学、
９−１０頁にも見い出すことができる)。After 4 days, the supernatant was collected and collected with Summers and S
The plaque assay is performed as described by mith (supra). As a variant, "Blue Gal" (Life Tech
agarose gels, including Biotechnologies Inc., Gaithersburg), which allows easy isolation of blue-stained plaques. (A detailed description of the "plaque assay" is also available from the user's guide to insect cell culture, and from Life Technologies Inc.,
Baculovirology distributed by Gaithersburg,
It can also be found on pages 9-10).
【０１２１】連続希釈の４日後に、ウイルスを細胞に加
えて、青色に染色されたプラークをエッペンドルフピペ
ットの先端で採取する。次いで、組換えウイルスを含む
寒天を、グレイス培地２００μlを含むエッペンドルフ
管内で再び懸濁させる。その寒天を短時間の遠心分離に
より除去して、組換えバキュロウイルスを含む上清を、
３５mmの皿に播種したＳf９細胞を感染させるのに使用
する。４日後、これらの培養皿の上清を収集した後、４
℃で保存する。Four days after serial dilution, the virus is added to the cells and blue-stained plaques are collected with the tip of an Eppendorf pipette. The agar containing the recombinant virus is then resuspended in an Eppendorf tube containing 200 μl of Grace's medium. The agar was removed by brief centrifugation and the supernatant containing the recombinant baculovirus was
It is used to infect Sf9 cells seeded on 35 mm dishes. Four days later, after collecting the supernatants of these culture dishes,
Store at ° C.
【０１２２】Ｓf９細胞を、１０％ 熱不活性化ＦＢＳを
補ったグレイス培地で増殖させる。その細胞に、感染多
重度(ＭＯＩ) ２で組換えバキュロウイルス Ｖ−スタニ
オカルシン−αを感染させる。６時間後、その培地を除
去して、メチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９
００ II 培地(Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.、Ｇaithersb
urg)に替える。４２時間後、５μＣiの３５Ｓ−メチオ
ニンおよび５μＣiの３ ５Ｓ システイン５μＣi(Ａmers
ham)を加える。その細胞をさらに１６時間インキュベー
トした後、それらを遠心分離により収集して、標識化タ
ンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラ
フィーにより視覚化する(第６図)。第６図において、ゲ
ルは、スタニオカルシン−αがホモダイマーとして存在
することを示す。先の教示から見て、本発明の多数の変
更および変化が可能であることから、後記する請求の範
囲内で、特に記載した以外の方法で、本発明を行うこと
ができる。Sf9 cells are grown in Grace's medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS. The cells are infected with recombinant baculovirus V-staniocalcin-α at a multiplicity of infection (MOI) of 2. After 6 hours, the medium was removed and SF9 without methionine and cysteine was removed.
00 II medium (Life Technologies Inc., Gaithersb
urg). After 42 hours, 3 5 S-cysteine 5 .mu.Ci of 35 S- methionine and 5 .mu.Ci of 5μCi (Amers
ham). After incubating the cells for an additional 16 hours, they are collected by centrifugation and the labeled proteins are visualized by SDS-PAGE and autoradiography (FIG. 6). In FIG. 6, the gel shows that stanniocalcin-α exists as a homodimer. Since many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, the present invention can be practiced otherwise than as specifically described within the scope of the following claims.
【０１２３】[0123]
（１） 一般的情報 ： （i） 特許出願人 ： オルセン等 （ii） 発明の名称 ： ヒトスタニオカルシン−α （iii） 配列の数 ： ８ （iv） 連絡先 ： （Ａ） 住所 ： カレラ，バーン，ベーン，ギルフィラ
ン，セッチ，ステュアート・アンド・オルステイン （Ｂ） 通り ： ベッカー・ファーム・ロード６番 （Ｃ） 市 ： ローズランド （Ｄ） 州 ： ニュージャージー （Ｅ） 国 ： アメリカ合衆国 （Ｆ） ＺＩＰ ： ０７０６８ （v） コンピューター解読書式 ： （Ａ） 媒体型 ： ３.５インチ ディスケット （Ｂ） コンピューター ： ＩＢＭ ＰＳ／２ （Ｃ） オペレーティング・システム ： ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ） ソフトウエア ： ワードパーフェクト ５.１ （vi） 本出願のデータ ： （Ａ） 出願番号 ： （Ｂ） 出願日 ： 同日 （Ｃ） 分類 ： （vii） 先行技術データ ： （Ａ） 出願番号 ： （Ｂ） 出願日 ： （viii） 弁理士／代理人情報 ： （Ａ） 氏名 ： フェルラロ，グレゴリー・ディ （Ｂ） 登録番号 ： ３６,１３４ （Ｃ） 参照／整理番号 ： ３２５８００−２００ （ix） 電話連絡先情報 ： （Ａ） 電話番号 ： ２０１−９９４−１７００ （Ｂ） ファックス番号 ： ２０１−９９４−１７４４ （２） 配列番号１の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ８９２塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： cＤＮＡ （xi） 配列の記述 ： 配列番号１ ： （２） 配列番号２の情報 ： （i） 配列の特徴 ： （Ａ） 長さ ： ２５１アミノ酸 （Ｂ） 型 ： アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数 ： （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 配列の種類 ： タンパク質 （xi） 配列の記述 ： 配列番号２ ： （２） 配列番号３の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ２６塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号３ ： （２） 配列番号４の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３０塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号４ ： （２） 配列番号５の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３１塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号５ ： （２） 配列番号６の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ６０塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号６ ： （２） 配列番号７の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３７塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号７ ： （２） 配列番号８の情報 ： （i） 配列の特徴 （Ａ） 長さ ： ３１塩基対 （Ｂ） 型 ： 核酸 （Ｃ） 鎖の数 ： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー ： 直鎖状 （ii） 分子の種類 ： オリゴヌクレオチド （xi） 配列の記述 ： 配列番号８ ： (1) General information: (i) Patent applicant: Olsen, etc. (ii) Title of the invention: Human stanniocalcin-α (iii) Number of sequences: 8 (iv) Contact: (A) Address: Carrera, Baan, Vane, Gilfiran, Sech, Stuart and Olstein (B) Street: Becker Farm Road 6 (C) City: Roseland (D) State: New Jersey (E) Country: United States (F) ZIP: 07068 (v) Computer reading / reading ceremony: (A) Media type: 3.5 inch diskette (B) Computer: IBM PS / 2 (C) Operating system: MS-DOS (D) Software: Word Perfect 5.1 ( vi) Data of this application: (A) Application number: (B) Filing date: Same date (C) Classification: (vii) Prior Technical data: (A) Application number: (B) Filing date: (viii) Patent attorney / agent information: (A) Name: Ferraro, Gregory di (B) Registration number: 36,134 (C) Reference / organization No .: 325800-200 (ix) Telephone contact information: (A) Telephone number: 201-994-1700 (B) Fax number: 201-994-1744 (2) Information of sequence number 1: (i) Sequence characteristics (A) Length: 892 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: linear (ii) Type of molecule: cDNA (xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 1: (2) Information of SEQ ID NO: 2: (i) Sequence characteristics: (A) Length: 251 amino acids (B) Type: amino acids (C) Number of chains: (D) Topology: linear (ii) Sequence Type: protein (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 2 (2) Information of SEQ ID NO: 3: (i) Sequence characteristics (A) Length: 26 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single strand (D) Topology: linear (ii) ) Type of molecule: oligonucleotide (xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 3 (2) Information of SEQ ID NO: 4: (i) Sequence characteristics (A) Length: 30 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single strand (D) Topology: linear (ii) ) Type of molecule: oligonucleotide (xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 4 (2) Information of SEQ ID NO: 5: (i) Sequence characteristics (A) Length: 31 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single-stranded (D) Topology: linear (ii) ) Type of molecule: oligonucleotide (xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 5 (2) Information of SEQ ID NO: 6: (i) Sequence characteristics (A) Length: 60 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single strand (D) Topology: linear (ii) ) Type of molecule: oligonucleotide (xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 6: (2) Information of SEQ ID NO: 7: (i) Sequence characteristics (A) Length: 37 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single strand (D) Topology: linear (ii) ) Type of molecule: Oligonucleotide (xi) Description of sequence: SEQ ID NO: 7: (2) Information of SEQ ID NO: 8: (i) Sequence characteristics (A) Length: 31 base pairs (B) Type: nucleic acid (C) Number of chains: single strand (D) Topology: linear (ii) ) Type of molecule: oligonucleotide (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 8:
【図１】 ヒトスタニオカルシン−αタンパク質のcＤ
ＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミ
ノ酸に関する標準的な３文字略号を使用する。FIG. 1. cD of human stanniocalcin-α protein
1 shows the NA sequence and the corresponding deduced amino acid sequence. The standard three letter abbreviation for amino acids is used.
【図２】 ヒトスタニオカルシン−αタンパク質のcＤ
ＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。FIG. 2 cD of human stanniocalcin-α protein
1 shows the NA sequence and the corresponding deduced amino acid sequence.
【図３】 Ａnguilla Ａustralisから得られたスタニオ
カルシン(下の列)およびヒトスタニオカルシン−α(上
の列)のアミノ酸比較である。１７０個のアミノ酸重複
部分および５５％の総類似性において、同一アミノ酸残
基が３５％ある。FIG. 3 is an amino acid comparison of stanniocalcin (bottom row) and human stanniocalcin-α (top row) obtained from Anguilla Australis. At 170 amino acid overlaps and 55% overall similarity, there are 35% identical amino acid residues.
【図４】 ヒトスタニオカルシン(上の列)およびヒトス
タニオカルシン−α(下の列)のアミノ酸配列比較であ
る。FIG. 4 is an amino acid sequence comparison of human stanniocalcin (top row) and human stanniocalcin-α (bottom row).
【図５】 細菌発現および精製後のヒトスタニオカルシ
ン−αを示すゲルの写真である。レーン１は、標準分子
量マーカーであって、レーン２およびレーン３は、両方
ともヒトスタニオカルシン−αタンパク質であるが、レ
ーン３は、より高い濃度のタンパク質を有する。FIG. 5 is a photograph of a gel showing human stanniocalcin-α after bacterial expression and purification. Lane 1 is a standard molecular weight marker; lanes 2 and 3 are both human stanniocalcin-α proteins, while lane 3 has a higher concentration of protein.
【図６】 ヒトスタニオカルシン−αのバキュロウイル
ス発現の結果を示すゲルである。FIG. 6 is a gel showing the results of baculovirus expression of human stanniocalcin-α.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 19/00 13/12 19/10 19/00 25/06 19/10 Ｃ０７Ｋ 14/575 25/06 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/575 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ヘンリック・オルセン アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ ザーズバーグ、ケンドリック・プレイス 182番 (72)発明者 ロバート・ディ・フレイシュマン アメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイ ザーズバーグ、チフリー・スクエア・ロー ド470番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA01 CA04 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 HA01 4B064 AG15 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA90X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 DB31 ZA972 4H045 AA10 BA10 CA40 DA30 EA27 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 9/00 A61P 19/00 13/12 19/10 19/00 25/06 19/10 C07K 14/575 25/06 C12N 1/15 C07K 14/575 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12P 21/02 C 1/21 C12N 15/00 ZNAA 5/10 5/00 A C12P 21/02 A61K 37 / 02 (72) Inventor Henrik Olsen Kendrick Place, No. 182, Gay Saarsburg, Maryland, United States 20878 (72) Inventor Robert Di Fleischman United States 20878 Gay Saarsburg, Maryland, Chifley Square Road 470 No. F term (reference) 4B024 AA01 BA01 CA04 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 HA01 4B064 AG15 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA9 0X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA01 BA08 BA22 BA23 DB31 ZA972 4H045 AA10 BA10 CA40 DA30 EA27 FA74
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