JP2002181822A - Immunoassay reagent and immunoassay method - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an immunoassay reagent hardly causing a nonspecific reaction and using an immune agglutination reaction with excellent detection sensitivity. SOLUTION: This immunoassay reagent is constructed of an insoluble carrier carrying an antibody/antigen corresponding to an antigen/antibody as a specimen and γ-globulin.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、不溶性担体を用い
免疫凝集反応により被測定物質を測定するための免疫測
定試薬及び免疫測定法に関し、より詳細には、非特異反
応が生じ難く、検出感度に優れた免疫測定試薬及び免疫
測定法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an immunoassay reagent and an immunoassay for measuring a substance to be measured by an immunoagglutination reaction using an insoluble carrier, and more particularly, to a method in which a nonspecific reaction hardly occurs and a detection sensitivity. The present invention relates to an immunoassay reagent and an immunoassay method which are excellent in the above.

【０００２】[0002]

【従来の技術】体液中の微量成分などの測定法の１つと
して、被測定物質である抗原または抗体に対応した抗体
または抗原を不溶性担体に担持させ、被測定物質と抗体
または抗原との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の
凝集の程度を検出することにより、被測定物質を測定す
る免疫測定法が広く用いられている。このような免疫測
定法としては、ラテックス凝集反応を利用したものや赤
血球凝集反応を利用したものなどが知られている。2. Description of the Related Art As one method of measuring trace components in a body fluid, an antibody or antigen corresponding to an antigen or an antibody to be measured is supported on an insoluble carrier, and the antigen between the substance to be measured and the antibody or antigen is measured. BACKGROUND ART An immunoassay for measuring a substance to be measured by detecting the degree of aggregation of an insoluble carrier caused by an antibody reaction is widely used. As such immunoassays, those utilizing latex agglutination and those utilizing hemagglutination are known.

【０００３】凝集の程度を検出する方法としては、肉眼
で判定する方法と、反応液に光を照射し散乱光あるいは
透過光を測定する方法とが用いられている。後者の方
法、すなわち光学測定法は、試料中の抗原または抗体の
定量に用いられている。[0003] As a method of detecting the degree of aggregation, a method of determining with the naked eye and a method of irradiating a reaction solution with light and measuring scattered light or transmitted light are used. The latter method, optical measurement, has been used for the quantification of antigens or antibodies in a sample.

【０００４】免疫凝集反応においてより高い感度を得る
ために、増感剤として、例えばポリエチレングリコール
やデキストランなどの水溶性高分子を反応系に添加する
方法が知られている。水溶性高分子の添加により、凝集
反応が促進され、より短時間で反応を進行させることが
できる。しかしながら、水溶性高分子は、被測定物質で
ある抗原または抗体を含まない陰性の検体に対しても凝
集反応を引き起こすことがある。このような反応は、非
特異反応と呼ばれ、誤った診断の原因となる。[0004] In order to obtain higher sensitivity in the immunoagglutination reaction, a method is known in which a water-soluble polymer such as polyethylene glycol or dextran is added to the reaction system as a sensitizer. The addition of the water-soluble polymer promotes the aggregation reaction and allows the reaction to proceed in a shorter time. However, the water-soluble polymer may cause an agglutination reaction even for a negative sample that does not contain the antigen or the antibody to be measured. Such a reaction is called a non-specific reaction and causes an erroneous diagnosis.

【０００５】非特異反応を減少させるために、抗原抗体
反応系に、アルキルセルロース（特開平２−１７３５６
７号公報）またはカルボキシアルキルセルロース（特開
平２−２３８３６０号公報）を添加する方法が提案され
ている。[0005] In order to reduce non-specific reactions, an alkyl-cellulose (Japanese Patent Laid-Open No.
No. 7) or a method of adding carboxyalkylcellulose (JP-A-2-238360).

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】上記アルキルセルロー
スやカルボキシアルキルセルロースを添加した場合、陰
性の検体において凝集反応が生じ難いものの、検体によ
っては非特異反応を引き起こす場合があった。When the above-mentioned alkylcellulose or carboxyalkylcellulose is added, agglutination reaction hardly occurs in a negative sample, but nonspecific reaction may be caused depending on the sample.

【０００７】本発明の目的は、非特異反応が生じ難く、
かつ測定すべき抗原または抗体を高感度で検出すること
を可能とする免疫測定試薬及び免疫測定法を提供するこ
とにある。An object of the present invention is to prevent non-specific reactions from occurring,
Another object of the present invention is to provide an immunoassay reagent and an immunoassay method capable of detecting an antigen or an antibody to be measured with high sensitivity.

【０００８】[0008]

【課題を解決するための手段】本願発明者は、上記課題
を達成すべく鋭意検討した結果、抗原抗体反応系にγ−
グロブリンを存在させれば、非特異反応を起こすことな
く、感度を高め得ることを見出し、本発明をなすに至っ
た。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventor has found that a γ-
The present inventors have found that the presence of globulin can increase sensitivity without causing a nonspecific reaction, and have accomplished the present invention.

【０００９】すなわち、本発明に係る免疫測定試薬は、
被測定物質である抗原または抗体に対応した抗体または
抗原が担持されている不溶性担体と、γ−グロブリンと
から構成されることを特徴とする。That is, the immunoassay reagent according to the present invention comprises:
It is characterized by comprising an insoluble carrier carrying an antibody or an antigen corresponding to an antigen or an antibody to be measured, and γ-globulin.

【００１０】また、本発明に係る免疫測定法は、被測定
物質である抗原または抗体に対応した抗体または抗原が
担持されている不溶性担体と、被測定物質との抗原抗体
反応により生じた不溶性担体の凝集の程度を検出するこ
とにより、被測定物質を検出する免疫測定法であって、
前記抗原抗体反応の反応系に０．０１〜５００ｍｇ／ｍ
ｌの濃度でγ−グロブリンを存在させることを特徴とす
る。The immunoassay according to the present invention is characterized in that an insoluble carrier carrying an antibody or an antigen corresponding to the antigen to be measured or an insoluble carrier generated by an antigen-antibody reaction with the substance to be measured is used. An immunoassay for detecting a substance to be measured by detecting the degree of aggregation of
0.01 to 500 mg / m in the reaction system of the antigen-antibody reaction
1 is characterized by the presence of γ-globulin.

【００１１】以下、本発明の詳細を説明する。本発明に
おいて用いられるγ−グロブリンとしては、人または動
物（例えばウマ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシな
ど）由来のものを適宜用いることができ、特に限定され
るものではない。γ−グロブリンの精製方法としては、
特に限定されず、例えば塩析やエタノール分画などの公
知の方法で精製されたものを用いることができ、また、
市販されているγ−グロブリンを用いることも可能であ
る。さらに、本発明においては、加熱変性したγ−グロ
ブリンを用いることもできる。Hereinafter, the present invention will be described in detail. As the γ-globulin used in the present invention, those derived from humans or animals (for example, horses, rabbits, sheep, pigs, goats, cows, etc.) can be used as appropriate, and are not particularly limited. As a method for purifying γ-globulin,
There is no particular limitation, for example, those purified by a known method such as salting out or ethanol fractionation can be used.
It is also possible to use a commercially available γ-globulin. Furthermore, in the present invention, heat-denatured γ-globulin can be used.

【００１２】上記不溶性担体としては、抗体または抗原
を担持し得る適宜の不溶性担体を用いることができる。
このような不溶性担体の例としては、有機高分子粉末、
無機物質粉末、微生物、血球及び細胞膜片などが挙げら
れる。有機高分子粉末としては、不溶性アガロース、セ
ルロース、不溶性デキストランなどが例示でき、好まし
くはラテックス懸濁液がよい。ラテックスとしては、例
えばポリスチレン、ポリスチレン−スチレンスルホン酸
塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、
アクリルニトリル−ブタジエンスチレン共重合体、塩化
ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニル
アクリレート等が挙げられる。用いるラテックスの平均
粒径は、測定対象物の検出濃度あるいは測定機器によっ
て０．０５〜１．０μｍのものが適宜選択される。無機
物質粉末としては、シリカ、アルミナ、あるいは金、チ
タン、鉄、ニッケル等の金属片などが例示される。As the above-mentioned insoluble carrier, any suitable insoluble carrier capable of carrying an antibody or an antigen can be used.
Examples of such insoluble carriers include organic polymer powder,
Examples include inorganic substance powders, microorganisms, blood cells, and cell membrane fragments. Examples of the organic polymer powder include insoluble agarose, cellulose, and insoluble dextran, and a latex suspension is preferable. As latex, for example, polystyrene, polystyrene-styrene sulfonate copolymer, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer,
An acrylonitrile-butadiene styrene copolymer, a vinyl chloride-acrylate copolymer, a polyvinyl acetate acrylate, and the like can be given. The average particle size of the latex to be used is appropriately selected from the range of 0.05 to 1.0 μm depending on the detection concentration of the object to be measured or the measuring instrument. Examples of the inorganic substance powder include silica, alumina, and metal pieces such as gold, titanium, iron, and nickel.

【００１３】本発明により測定される測定対象物質は、
一般に抗原抗体反応を利用して測定され得る生理活性物
質である限り特に限定されず、例えば、タンパク、脂質
などが挙げられ、より詳細には、各種抗原、抗体、レセ
プターまたは酵素などが挙げられる。さらに具体的に
は、ＣＲＰ、ヒトフィブリノーゲン、ＦＤＰ、リウマチ
因子、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、抗ストレプト
リジンＯ抗体、梅毒トレポネーマ抗体、梅毒脂質抗原に
対する抗体、ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原、Ｈ
Ｂｅ抗体などが例示される。The substances to be measured according to the present invention are:
Generally, there is no particular limitation as long as it is a physiologically active substance that can be measured using an antigen-antibody reaction, and examples thereof include proteins and lipids, and more specifically, various antigens, antibodies, receptors, and enzymes. More specifically, CRP, human fibrinogen, FDP, rheumatoid factor, α-fetoprotein (AFP), anti-streptolysin O antibody, treponema syphilis antibody, antibody to syphilis lipid antigen, HBs antibody, HBs antigen, HBe antigen, HBe
Be antibody and the like are exemplified.

【００１４】本発明により被測定物質を測定する場合の
測定系としては、例えばラテックス凝集反応や血液凝集
反応などの従来より公知の各種凝集法を用いることがで
きる。As a measuring system for measuring a substance to be measured according to the present invention, various conventionally known agglutination methods such as a latex agglutination reaction and a blood agglutination reaction can be used.

【００１５】本発明に係る免疫測定試薬に用いられる、
抗原または抗体が担持された不溶性担体は、公知の方法
に従って用意される。すなわち、不溶性担体に抗原また
は抗体を物理的あるいは化学的結合により感作させる方
法が用いられる。使用する抗原または抗体は特に限定さ
れない。なお、抗体を感作させる場合、免疫グロブリン
あるいはその断片、例えばＦ（ａｂ′）を抗体として用
いてもよい。[0015] The immunoassay reagent according to the present invention,
The insoluble carrier carrying the antigen or antibody is prepared according to a known method. That is, a method of sensitizing an insoluble carrier with a physical or chemical bond of an antigen or antibody is used. The antigen or antibody used is not particularly limited. When sensitizing an antibody, immunoglobulin or a fragment thereof, for example, F (ab ') may be used as the antibody.

【００１６】次に、本発明に係る免疫測定法の詳細を説
明する。例えば、ラテックス試薬を用いた抗原抗体反応
により被測定物質を測定する場合には、被測定物質であ
る抗原または抗体に対応した抗体または抗原を感作した
ラテックス試薬に、予めγ−グロブリンを添加してお
く。あるいはγ−グロブリンを含まないラテックス試薬
を使用してもよく、この場合には、抗原抗体反応時に、
反応系にγ−グロブリンを存在させればよい。例えば、
検体に予めγ−グロブリンを添加しておく方法、使用す
る緩衝液にγ−グロブリンを加えておく方法などがあ
り、特に限定されるものではない。Next, details of the immunoassay according to the present invention will be described. For example, when the analyte is measured by an antigen-antibody reaction using a latex reagent, γ-globulin is added in advance to a latex reagent sensitized with an antigen or an antibody corresponding to the antigen to be assayed. Keep it. Alternatively, a latex reagent containing no γ-globulin may be used.In this case, during the antigen-antibody reaction,
It is sufficient that γ-globulin is present in the reaction system. For example,
There are a method in which γ-globulin is added to the sample in advance, a method in which γ-globulin is added to the buffer used, and the like, and are not particularly limited.

【００１７】言い換えれば、本発明に係る免疫測定試薬
は、例えば、抗体または抗原を感作した不溶性担体とγ
−グロブリンを含む１液系の試薬；抗体または抗原を感
作した不溶性担体を含む第１試薬と、γ−グロブリンを
含む緩衝液からなる第２試薬の組み合わせとして構成さ
れる２液系の試薬；など様々な形態とすることができ
る。In other words, the immunoassay reagent according to the present invention comprises, for example, an insoluble carrier sensitized with an antibody or an antigen and γ.
A one-component reagent containing globulin; a two-component reagent comprising a combination of a first reagent containing an insoluble carrier sensitized with an antibody or an antigen and a second reagent containing a buffer containing γ-globulin; And various other forms.

【００１８】上記のような免疫測定試薬を用いて凝集反
応を行い、生じた凝集の程度を光学的に観察もしくは目
視観察することにより、被測定物質を測定することがで
きる。具体的には、不溶性担体の凝集の程度を光学的に
検出する方法では、散乱光強度、吸光度または透過光強
度を光学機器で測定することにより被測定物質が測定さ
れる。測定波長は、特に限定されず、３００〜２４００
ｎｍの波長を用いることができる。The substance to be measured can be measured by performing an agglutination reaction using the above immunoassay reagent and optically or visually observing the degree of agglutination that has occurred. Specifically, in the method of optically detecting the degree of aggregation of the insoluble carrier, the substance to be measured is measured by measuring the scattered light intensity, the absorbance, or the transmitted light intensity with an optical instrument. The measurement wavelength is not particularly limited, and is 300 to 2400.
nm wavelength can be used.

【００１９】測定方法については、公知の方法に従っ
て、用いられる不溶性担体の大きさもしくは濃度、反応
時間を設定することにより、散乱光強度、吸光度または
透過光強度の増加もしくは減少を測定することにより行
われ、これらの方法を２種以上併用してもよい。The measurement is carried out by setting the size or concentration of the insoluble carrier to be used and the reaction time in accordance with a known method, and measuring the increase or decrease of the scattered light intensity, the absorbance or the transmitted light intensity. However, two or more of these methods may be used in combination.

【００２０】不溶性担体の凝集の程度を肉眼で判定する
場合には、通常、検体と、抗原もしくは抗体が感作され
た不溶性担体とγ−グロブリンとを含む溶液を判定板上
で混合し、１〜５分間揺り動かした後、凝集の有無を判
定する。凝集判定には、単に肉眼で判定する方法の他、
ビデオカメラで凝集状態を撮影し、画像処理を行うこと
により判定する方法も用いることができる。When the degree of agglomeration of the insoluble carrier is visually determined, a sample, a solution containing an insoluble carrier sensitized with an antigen or an antibody and γ-globulin are usually mixed on a determination plate. After rocking for ~ 5 minutes, the presence or absence of aggregation is determined. Agglomeration is determined by simply using the naked eye,
It is also possible to use a method in which the cohesion state is photographed with a video camera and determined by performing image processing.

【００２１】本発明の免疫測定法において、抗原抗体反
応系に存在させるγ−グロブリンの濃度は、０．０１〜
５００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜２００ｍｇ／ｍ
ｌとされる。γ−グロブリン濃度が０．０１ｍｇ／ｍｌ
を下回ると、γ−グロブリンと抗原または抗体との相互
作用が小さくなり、増感効果が得られない。逆に、５０
０ｍｇ／ｍｌを上回ると、不溶性担体が非特異的に凝集
し易くなる。In the immunoassay of the present invention, the concentration of γ-globulin to be present in the antigen-antibody reaction system is from 0.01 to 0.01.
500 mg / ml, preferably 0.1 to 200 mg / m
l. γ-globulin concentration is 0.01mg / ml
If it is lower than the above, the interaction between γ-globulin and the antigen or antibody becomes small, and the sensitizing effect cannot be obtained. Conversely, 50
If it exceeds 0 mg / ml, the insoluble carrier tends to aggregate nonspecifically.

【００２２】上記抗原抗体反応の条件は、通常の免疫測
定法の場合と同様であり、反応媒体として、被測定物質
の種類に応じた各種緩衝液が適宜用いられる。緩衝液
は、被測定物質を失活させることなく、かつ抗原抗体反
応を阻害しないようなイオン強度やｐＨを有するもので
あればよい。例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、
またはトリス緩衝液を用いることができる。反応のｐＨ
は５〜１０、特に６〜８が好ましい。反応温度は０〜５
０℃、特に２０〜４０℃が好ましい。反応時間は適宜定
められる。The conditions for the above antigen-antibody reaction are the same as in the case of ordinary immunoassay, and various buffers depending on the type of the substance to be measured are appropriately used as a reaction medium. The buffer may have any ionic strength or pH that does not deactivate the substance to be measured and does not inhibit the antigen-antibody reaction. For example, phosphate buffer, glycine buffer,
Alternatively, a Tris buffer can be used. Reaction pH
Is preferably 5 to 10, particularly preferably 6 to 8. Reaction temperature is 0-5
0 ° C, especially 20 to 40 ° C, is preferred. The reaction time is appropriately determined.

【００２３】さらに、反応時に特異性を高めるために、
測定系に塩化コリンなどの第４級アンモニウム塩、ＥＤ
ＴＡ、ポリアニオン、カオトロピックイオンまたはゼラ
チンなどを添加してもよい。Further, in order to increase the specificity during the reaction,
Quaternary ammonium salt such as choline chloride, ED
TA, polyanions, chaotropic ions or gelatin may be added.

【００２４】[0024]

【発明の実施の形態】以下、本発明の具体的な実施例を
説明することにより、本発明を明らかにする。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be clarified by describing specific embodiments of the present invention.

【００２５】〔実施例１〕 塩析によるγ−グロブリンの精製 ヤギ血清１０ｍｌに５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ８．
５）（以下、グリシン緩衝液と略す）１０ｍｌを加え、
３Ｍ硫酸アンモニウム溶液１０ｍｌを滴下した。１５℃
で３０分間攪拌した後、４℃で５０００ｒｐｍ及び１０
分間の条件で遠心分離した。遠心分離により得られた上
澄みに、３Ｍ硫酸アンモニウム溶液７．５ｍｌを滴下
し、１５℃で３０分間攪拌した後、４℃で８０００ｒｐ
ｍ及び１５分間の条件で遠心分離した。遠心分離後に、
得られた沈澱にグリシン緩衝液２．５ｍｌを加え、沈澱
を溶解させ、γ−グロブリン溶液を得た。[Example 1] Purification of γ-globulin by salting out 10 ml of goat serum was added to a 50 mM glycine buffer (pH 8.
5) Add 10 ml (hereinafter abbreviated as glycine buffer),
10 ml of a 3M ammonium sulfate solution was added dropwise. 15 ℃
At 4 ° C. and 5000 rpm and 10 rpm.
The mixture was centrifuged under the conditions of minutes. 7.5 ml of a 3M ammonium sulfate solution was added dropwise to the supernatant obtained by centrifugation, and the mixture was stirred at 15 ° C for 30 minutes, and then 8000 rpm at 4 ° C.
Centrifugation was performed at m and for 15 minutes. After centrifugation,
To the obtained precipitate, 2.5 ml of glycine buffer was added to dissolve the precipitate to obtain a γ-globulin solution.

【００２６】次に、上記γ−グロブリン溶液を透析膜に
入れ、グリシン緩衝液２５０ｍｌに対し、３日間透析し
た。透析後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、タンパク質
濃度を求めた。Next, the γ-globulin solution was placed in a dialysis membrane and dialyzed against 250 ml of glycine buffer for 3 days. After dialysis, the absorbance at 280 nm was measured to determine the protein concentration.

【００２７】〔実施例２〕 ヒトＣＲＰ測定試薬及び測定法−凝集像の肉眼観察によ
る検出方法 （１）抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液の調製 抗ヒトＣＲＰ抗体を０．５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度でグ
リシン緩衝液に溶解した液１０ｍｌに、平均粒径が０．
８μｍのポリスチレンラテックス（積水化学社製、固形
分１０重量％）１ｍｌを添加し、３７℃で６０分攪拌し
た。次に、この液に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を１
重量％含有するグリシン緩衝液１１ｍｌを添加し、３７
℃にて６０分間攪拌した後、４℃にて、１８０００ｒｐ
ｍ×６０分間の条件で遠心分離した。得られた沈澱にＢ
ＳＡを０．５重量％含有するグリシン緩衝液１０ｍｌを
添加し、ラテックスを懸濁させ、抗ＣＲＰ抗体感作ラテ
ックスを調製した。Example 2 Human CRP Measurement Reagent and Measurement Method-Detection Method by Visual Observation of Aggregation Image (1) Preparation of Anti-CRP Antibody-Sensitized Latex Solution Anti-human CRP antibody was prepared at an IgG concentration of 0.5 mg / ml. In 10 ml of a solution dissolved in a glycine buffer, the average particle diameter is 0.1.
1 ml of 8 μm polystyrene latex (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd., solid content: 10% by weight) was added, and the mixture was stirred at 37 ° C. for 60 minutes. Next, 1 ml of bovine serum albumin (BSA) was added to this solution.
11 ml of a glycine buffer solution containing
After stirring at 60 ° C for 60 minutes, at 4 ° C, 18000 rpm
Centrifugation was performed under the conditions of mx60 minutes. B in the resulting precipitate
10 ml of a glycine buffer containing 0.5% by weight of SA was added, and the latex was suspended to prepare an anti-CRP antibody-sensitized latex.

【００２８】（２）γ−グロブリン溶液の調製 実施例１で調製したγ−グロブリン溶液をグリシン緩衝
液で希釈し、γ−グロブリン濃度が２０ｍｇ／ｍｌとな
るように濃度を調整した。(2) Preparation of γ-globulin solution The γ-globulin solution prepared in Example 1 was diluted with a glycine buffer, and the concentration was adjusted so that the γ-globulin concentration became 20 mg / ml.

【００２９】（３）ヒトＣＲＰ測定試薬 本実施例のヒトＣＲＰ測定試薬は、（１）で得た抗ＣＲ
Ｐ抗体感作ラテックスからなる第２試薬と、（２）で得
たγ−グロブリン溶液からなる第１試薬とからなる、２
液型試薬である。(3) Reagent for measuring human CRP The reagent for measuring human CRP in this example is the anti-CR obtained in (1).
A second reagent consisting of a P antibody-sensitized latex and a first reagent consisting of the γ-globulin solution obtained in (2);
It is a liquid type reagent.

【００３０】（４）標準液 ＣＲＰを、０、１、５、１０及び２０ｍｇ／ｄｌ濃度で
含むヒト血清を標準液として用意した。(4) Standard solution Human serum containing CRP at 0, 1, 5, 10, and 20 mg / dl concentrations was prepared as a standard solution.

【００３１】（５）検体 ＣＲＰ陽性及び陰性のヒト血清を検体とした。なお、Ｃ
ＲＰの判定には「抗ＣＲＰ血清‘栄研’」（栄研化学社
製）を用いた。(5) Samples CRP positive and negative human sera were used as samples. Note that C
For determination of RP, "anti-CRP serum 'Eiken'" (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) was used.

【００３２】（６）抗原抗体反応 標準液または検体を、（２）で得たγ−グロブリン溶液
で体積比で１：１の割合となるように希釈し、試料を得
た。試料５０μｌを判定板上に取り、（１）の抗ＣＲＰ
抗体感作ラテックス液５０μｌを滴下し、混和した。混
和は、判定板を手に持ち、ゆるやかに揺動させることに
より行い、３分後に凝集の度合いを肉眼で観察した。(6) Antigen-Antibody Reaction The standard solution or specimen was diluted with the γ-globulin solution obtained in (2) so as to have a volume ratio of 1: 1 to obtain a sample. A sample (50 μl) was placed on a determination plate, and the anti-CRP of (1) was
50 μl of the antibody-sensitized latex solution was added dropwise and mixed. The mixing was carried out by holding the judgment plate in hand and gently rocking, and the degree of aggregation was visually observed after 3 minutes.

【００３３】〔比較例１〕実施例２におけるγ−グロブ
リン溶液に代えて、平均分子量５００００のポリエチレ
ングリコールをグリシン緩衝液に３０重量％の濃度とな
るように溶解して得られたＰＥＧ溶液を用いたことを除
いては、実施例と同様にして、ヒトＣＲＰ測定試薬を作
製し、抗原抗体反応を行った。実施例及び比較例の結果
を下記の表１に示す。Comparative Example 1 Instead of the γ-globulin solution in Example 2, a PEG solution obtained by dissolving polyethylene glycol having an average molecular weight of 50,000 in a glycine buffer to a concentration of 30% by weight was used. A human CRP measurement reagent was prepared and subjected to an antigen-antibody reaction in the same manner as in Example, except that the reagent was used. The results of Examples and Comparative Examples are shown in Table 1 below.

【００３４】[0034]

【表１】 [Table 1]

【００３５】表１から明らかなように、増感剤としてポ
リエチレングリコールを用いた比較例では、ＣＲＰ陰性
の検体にもかかわらず、非特異反応が起こり、陽性と判
定されることがあった。これに対して、γ−グロブリン
を用いた実施例では、陰性の検体が陽性と判定されるこ
とはなかった。As is clear from Table 1, in the comparative example using polyethylene glycol as the sensitizer, a non-specific reaction occurred in spite of a CRP-negative sample, and the sample was sometimes judged to be positive. On the other hand, in Examples using γ-globulin, a negative specimen was not determined to be positive.

【００３６】〔実施例３〕 ＦＤＰ測定試薬及び測定法−光学的検出方法 （１）抗フィブリノーゲン抗体感作ラテックス液の調製 抗フィブリノーゲン抗体を１０ｍｇ／ｍｌ濃度となるよ
うに０．０３６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）（以下、
リン酸緩衝液と略す）に溶解し、抗フィブリノーゲン抗
体溶液を得た。この抗フィブリノーゲン抗体溶液２．５
ｍｌに、平均粒径０．１μｍのポリスチレンラテックス
（積水化学工業社製、固形分１０重量％）１ｍｌを添加
し、３０℃で６０分間攪拌した。次に、この液にＢＳＡ
を２重量％含有するリン酸緩衝液１１ｍｌを添加し、３
０℃にて６０分間攪拌した後、１８０００ｒｐｍ×４０
分の条件で遠心分離した。得られた沈澱にＢＳＡ１重量
％を含有するリン酸緩衝液６５ｍｌを添加し、懸濁さ
せ、抗フィブリノーゲン抗体感作ラテックス液を調製し
た。[Example 3] FDP measurement reagent and measurement method-optical detection method (1) Preparation of anti-fibrinogen antibody-sensitized latex solution 0.036 M phosphate buffer solution of anti-fibrinogen antibody so as to have a concentration of 10 mg / ml (PH 6.6) (Hereinafter,
Phosphate buffer) to obtain an anti-fibrinogen antibody solution. This anti-fibrinogen antibody solution 2.5
1 ml of polystyrene latex (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd., solid content: 10% by weight) having an average particle size of 0.1 μm was added to the resulting mixture, and the mixture was stirred at 30 ° C. for 60 minutes. Next, add BSA to this solution.
11 ml of a phosphate buffer containing 2% by weight of
After stirring at 0 ° C. for 60 minutes, 18000 rpm × 40
Centrifugation was performed under the conditions of minutes. To the obtained precipitate, 65 ml of a phosphate buffer containing 1% by weight of BSA was added and suspended to prepare an anti-fibrinogen antibody-sensitized latex solution.

【００３７】（２）γ−グロブリン溶液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するリン酸緩衝液に、実施例１で
調製されたγ−グロブリン溶液を添加し、γ−グロブリ
ン濃度が５ｍｇ／ｍｌであるγ−グロブリン溶液を得
た。(2) Preparation of γ-globulin solution The γ-globulin solution prepared in Example 1 is added to a phosphate buffer containing 1% by weight of BSA, and the γ-globulin concentration is 5 mg / ml. A γ-globulin solution was obtained.

【００３８】（３）ＦＤＰ測定試薬 本実施例のＦＤＰ測定試薬は、（１）で得た抗フィブリ
ノーゲン抗体感作ラテックス液からなる第２の試薬と、
上記（２）で用意したγ−グロブリン溶液からなる第１
試薬とにより構成される２液型試薬である。(3) FDP Measurement Reagent The FDP measurement reagent of this example comprises a second reagent comprising the anti-fibrinogen antibody-sensitized latex solution obtained in (1),
The first solution comprising the γ-globulin solution prepared in (2) above
This is a two-part reagent composed of a reagent and a reagent.

【００３９】（４）標準液 フィブリノーゲンを０、５、１０、２０、３０及び４０
μｇ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を標準液として用いた。(4) Standard solution Fibrinogen was added to 0, 5, 10, 20, 30, and 40
Human serum at a concentration of μg / ml was used as a standard solution.

【００４０】（５）検体 ヒト血清を検体とした。なお、ＦＤＰ濃度は「エルピア
・ＦＤＰ」（帝国臓器社製）により測定した。ＦＤＰの
参考正常値は１０μｇ／ｍｌ以下である。(5) Sample Human serum was used as a sample. The FDP concentration was measured by "Elpia FDP" (manufactured by Teikoku Organs). The reference normal value of FDP is 10 μg / ml or less.

【００４１】（６）測定方法 標準液４μｌに、上記（２）で得たγ−グロブリン溶液
２００μｌを添加し、３７℃で４５分保持した後、
（１）で得た抗フィブリノーゲン抗体感作ラテックス液
２００μｌを添加し攪拌した。抗フィブリノーゲン抗体
感作ラテックス液を添加した後１分後及び５分後の波長
５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。１分後の吸光度
と５分後の吸光度との間の変化量を吸光度変化量ΔＯＤ
とする。測定は日立自動分析装置７１５０型を用いた。(6) Measurement method 200 μl of the γ-globulin solution obtained in the above (2) was added to 4 μl of the standard solution, and the mixture was kept at 37 ° C. for 45 minutes.
200 μl of the anti-fibrinogen antibody-sensitized latex solution obtained in (1) was added and stirred. One minute and 5 minutes after the addition of the anti-fibrinogen antibody-sensitized latex solution, the absorbance at a wavelength of 570 nm was measured. The amount of change between the absorbance after 1 minute and the absorbance after 5 minutes is defined as the absorbance change amount ΔOD.
And The measurement was performed using a Hitachi automatic analyzer 7150 type.

【００４２】〔比較例２〕実施例３におけるγ−グロブ
リン溶液に代えて、平均分子量６０００のポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）を３重量％の濃度となるようにＢ
ＳＡを１重量％含有する上記リン酸緩衝液に溶解して得
られたＰＥＧ溶液を用いたことを除いては、実施例３と
同様にしてＦＤＰ測定試薬を作製し、実施例３と同様に
検体を測定した。実施例３及び比較例２の結果を下記の
表２及び表３並びに図１に示す。[Comparative Example 2] Instead of the γ-globulin solution in Example 3, polyethylene glycol (PEG) having an average molecular weight of 6000 was used so that the concentration of B was adjusted to 3% by weight.
An FDP measurement reagent was prepared in the same manner as in Example 3 except that a PEG solution obtained by dissolving in the above phosphate buffer containing 1% by weight of SA was used. Specimens were measured. The results of Example 3 and Comparative Example 2 are shown in Tables 2 and 3 below and FIG.

【００４３】[0043]

【表２】 [Table 2]

【００４４】[0044]

【表３】 [Table 3]

【００４５】表２及び図１から明らかなように、実施例
３では、γ−グロブリン溶液を用いることにより、反応
性の高いＦＤＰ測定試薬の得られることがわかる。ま
た、表３から、検体３では、フィブリノーゲン濃度が３
μｇ／ｍｌと正常値以下であるにもかかわらず、ＰＥＧ
溶液を増感剤として用いた比較例２では２７μｇ／ｍｌ
と正常値を超える結果が表れており、非特異反応が生じ
ていることがわかるのに対し、実施例３では、検体３を
測定した結果が４μｇ／ｍｌと正常値以下となり、非特
異反応が生じていないことがわかる。As is clear from Table 2 and FIG. 1, in Example 3, it is found that a highly reactive FDP measuring reagent can be obtained by using a γ-globulin solution. In addition, from Table 3, in the case of the sample 3, the fibrinogen concentration was 3%.
Despite being below the normal value of μg / ml,
In Comparative Example 2 using the solution as a sensitizer, 27 μg / ml
And a result exceeding the normal value, indicating that a nonspecific reaction has occurred. In Example 3, the result of measurement of the sample 3 was 4 μg / ml, which was lower than the normal value, and the nonspecific reaction was It can be seen that it has not occurred.

【００４６】[0046]

【発明の効果】本発明に係る免疫測定試薬では、被測定
物質である抗原または抗体に対応した抗体または抗原が
担持されている不溶性担体と、γ−グロブリンとからな
るため、被測定物質と不溶性担体に担持されている抗体
または抗原との反応により生じた凝集の程度を検出する
にあたり、反応系にγ−グロブリンを存在させることが
できるので、上記γ−グロブリンの作用により非特異反
応を抑制しつつ、検出感度を効果的に高めることができ
る。The immunoassay reagent according to the present invention comprises an insoluble carrier carrying an antibody or an antigen corresponding to the antigen or antibody to be measured, and γ-globulin. In detecting the degree of aggregation caused by the reaction with the antibody or antigen carried on the carrier, γ-globulin can be present in the reaction system, so that the non-specific reaction is suppressed by the action of γ-globulin. In addition, the detection sensitivity can be effectively increased.

【００４７】本発明に係る免疫測定法では、本発明に係
る免疫測定試薬を用い、γ−グロブリンが反応系に０．
０１〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在されることになる
ため、同様に、非特異反応を抑制しつつ、検出感度を大
幅に高めることが可能となる。In the immunoassay according to the present invention, the reagent for immunoassay according to the present invention is used, and γ-globulin is added to the reaction system in an amount of 0.
Since it is present at a concentration of 01 to 500 mg / ml, it is also possible to significantly increase the detection sensitivity while suppressing non-specific reactions.

【００４８】よって、本発明によれば、非特異反応が生
じ難く、検出感度に優れた免疫凝集反応を利用した免疫
測定試薬及び免疫測定法を提供することが可能となる。Thus, according to the present invention, it is possible to provide an immunoassay reagent and an immunoassay method utilizing an immunoagglutination reaction which is less likely to cause a non-specific reaction and has excellent detection sensitivity.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】実施例３の試薬及び比較例２の試薬を用いた場
合のフィブリノーゲン濃度と吸光度変化量との関係を示
す図。FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the fibrinogen concentration and the change in absorbance when the reagent of Example 3 and the reagent of Comparative Example 2 are used.

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 被測定物質である抗原または抗体に対応
した抗体または抗原が担持されている不溶性担体と、γ
−グロブリンとから構成されることを特徴とする免疫測
定試薬。1. An insoluble carrier carrying an antibody or an antigen corresponding to an antigen or an antibody to be measured, and γ
-An immunoassay reagent comprising: globulin. 【請求項２】 被測定物質である抗原または抗体に対応
した抗体または抗原が担持されている不溶性担体と、被
測定物質との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝
集の程度を検出することにより、被測定物質を検出する
免疫測定法であって、 前記抗原抗体反応の反応系に０．０１〜５００ｍｇ／ｍ
ｌの濃度でγ−グロブリンを存在させることを特徴とす
る免疫測定法。2. A method for detecting the degree of aggregation of an insoluble carrier carrying an antibody or an antigen corresponding to an antigen or antibody as a substance to be measured and an insoluble carrier produced by an antigen-antibody reaction with the substance to be measured. An immunoassay for detecting a substance to be measured, wherein the reaction system for the antigen-antibody reaction comprises 0.01 to 500 mg / m
An immunoassay, wherein γ-globulin is present at a concentration of 1.