JP2002181821A - 複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法 - Google Patents

複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法

Info

Publication number
JP2002181821A
JP2002181821A JP2000382783A JP2000382783A JP2002181821A JP 2002181821 A JP2002181821 A JP 2002181821A JP 2000382783 A JP2000382783 A JP 2000382783A JP 2000382783 A JP2000382783 A JP 2000382783A JP 2002181821 A JP2002181821 A JP 2002181821A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
test
labeled
type
types
substance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2000382783A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4755755B2 (ja
Inventor
Masayuki Machida
雅之 町田
Hisako Hagiwara
央子 萩原
Hideji Tajima
秀二 田島
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Precision System Science Co Ltd
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Original Assignee
Precision System Science Co Ltd
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Precision System Science Co Ltd, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST filed Critical Precision System Science Co Ltd
Priority to JP2000382783A priority Critical patent/JP4755755B2/ja
Priority to PCT/JP2001/010994 priority patent/WO2002050542A1/ja
Priority to DE10197053T priority patent/DE10197053T1/de
Priority to US10/450,584 priority patent/US20040096857A1/en
Publication of JP2002181821A publication Critical patent/JP2002181821A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4755755B2 publication Critical patent/JP4755755B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/102—Multiple non-interacting labels

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を
用いた複数検査多重化方法に関し、複数種類の検査を並
行して行うことにより、時間的、空間的に効率的に処理
を行うことができるとともに、各種類間の検査に同一の
条件を設定することができるので、高い信頼性のある検
査を行うことができる複数検査多重化用懸濁液およびそ
の懸濁液を用いた複数検査多重化方法を提供することを
目的とする。 【解決手段】 各検査種類間で相互に識別可能となるよ
うに標識物質で標識化された複数検査種類の検出用物質
群と、各検査種類の検査の内容に応じて検査種類ごとに
前記標識化検出体と結合しまたは結合しないように選ば
れた複数検査種類の結合物質群を、各検査種類ごとに有
する複数検査種類の微粒子群とを含む懸濁液であって、
前記検査種類ごとに、塩基微粒子による標識化検出体の
保持の有無またはその程度を検出することによって、複
数検査種類の検査が前記懸濁液を用いて並行に行われる
ように構成する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、複数検査多重化用
懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法に
関する。本発明は、特に、遺伝子、免疫系、タンパク
質、アミノ酸、糖等の生体高分子に関する検査、解析、
分析が要求される分野、例えば、工学分野、食品、農
産、水産加工等の農学分野、薬学分野、衛生、保健、免
疫、疾病、遺伝等の医学分野、化学もしくは生物学等の
理学分野等、あらゆる分野に関係するものである。
【０００２】本発明は、特に、遺伝子の変異解析、多型
解析、マッピング、塩基配列解析、発現解析等において
適した複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用い
た複数検査多重化方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】従来、遺伝子プローブ（標識化された特
定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列）分析を行うために、遺伝
子増幅技術（例えばＰＣＲ）を用いて目的の遺伝子配列
を増幅し、ハイブリダイゼーション・ライゲーション検
出法を用いて、ターゲット配列にハイブリダイズされた
プローブの配列が分離され且つ検出されるようにするこ
とにより（例えば、プローブは磁性粒子とアクリジニウ
ムエスエルの組み合わせを含有する）特定の配列が存在
するか否かを決定するものがあった（特表平９−５１０
８７８号）。
【０００４】この方法は、詳しくは、ターゲットポリ核
酸配列を同定する方法であって、（ａ）２種類のプロー
ブがライゲーションされたときに、それらのプローブ
が、前記ターゲットポリ核酸の予想配列の一部または全
部に相補的であるようにし、該プローブの一方は、その
プローブが反応混合物から容易に分離され得るようにす
る部分に結合され、さらに、他方のプローブは、ラベル
に結合されるようにし、（ｂ）該プローブをターゲット
ポリ核酸と混合することにより、それらのプローブが該
ターゲットポリ核酸にハイブリダイズするようにし、
（ｃ）ライゲーション用試薬を添加し、（ｄ）反応混合
物を変成することにより、ターゲットポリ核酸からプロ
ーブが分離されるようにし、（ｅ）分離を容易にする前
記部分を利用して、プローブを分離し、さらに、（ｆ）
分離後のプローブを分析して該プローブに前記ラベルが
結合されているか否かを決定するものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ところで、上記の遺伝
子プローブ分析方法にあっては、分析は、常に１種類の
塩基配列の検査に限られるものである。そのために、複
数の分析を行うには、上記の方法を、各種類ごとに別途
行う必要がある。そのために、各種類ごとに、容器や、
反応物質や、試薬の多種類を大量に用意する必要や、各
検査毎に容器等を洗浄する必要や、恒温装置等の設備が
必要になったり、各種類ごとに処理を順次行う必要があ
り、処理時間を長く必要とし、また、大きな処理空間や
処理設備を必要とすることになるという問題点を有して
いた。
【０００６】また、各種類の検査ごとに種々の手間がか
かるため、処理が煩雑になり、使用者に大きな手間がか
かるという問題点をも有していた。
【０００７】さらに、各処理ごとに異なる懸濁液や試薬
等を種類間でクロスコンタミネーションが生じないよう
に用意する必要があるので、処理の管理に大きな手間が
かかることになるという問題点を有していた。
【０００８】そこで、本発明は、以上の問題点を解決す
るためになされたものであり、第１の目的は、複数種類
の検査をまとめて並行して行うことにより、その処理時
間のみならず、その作業空間を省き、効率的に処理を行
うことができる複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁
液を用いた複数検査多重化方法を提供することである。
【０００９】第２の目的は、複数種類の検査をまとめて
並行して行うことにより、各検査ごとには微小な量であ
っても、それらをまとめてバルクな量を扱うことによっ
て、より扱いやすく使い勝手の良い複数検査多重化用懸
濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を提
供することである。
【００１０】第３の目的は、複数種類の検査をまとめて
並行して行うことにより、各検査における共通に必要と
する試薬等の物品や、温度等の環境等の設備、人手を節
約し、検査コストを低下させることができる複数検査多
重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化
方法を提供することである。
【００１１】第４の目的は、複数種類の検査をまとめて
並行して行うことにより、各種類の検査に同一の条件を
設定することが可能となり、各種類間で同一条件での検
査結果の比較を行うことができ、これによって各種類間
の本質的な相違点の発見や、信頼性のある精度の高い検
査結果を得ることができる複数検査多重化用懸濁液およ
びその懸濁液を用いた複数検査多重化方法を提供するこ
とである。
【００１２】第５の目的は、特に、遺伝物質の塩基配列
の決定等のように大量の情報を得る必要があるために、
多数の単純な処理を繰り返す必要があるような検査や処
理に適した複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を
用いた複数検査多重化方法を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】以上の課題を解決するた
めに、第１の発明は、各検査種類間で相互に識別可能と
なるように標識化された複数検査種類の標識化検出体群
と、各検査種類の検査内容に応じて検査種類ごとに前記
標識化検出体と結合しまたは結合しないように選ばれた
複数検査種類の結合物質を、各検査種類ごとに有する複
数検査種類の微粒子群とを含む懸濁液であって、前記検
査種類ごとに、前記微粒子による前記標識化検出体の保
持の有無またはその程度を検出することによって、複数
検査種類の検査が前記懸濁液を用いて並行して行われる
複数検査多重化用懸濁液である。
【００１４】ここで、「検査種類」とは、並行して行お
うとする複数の検査の種類をいう。検査種類は、例え
ば、検査対象物の種類、同一検査対象物における検査部
位の種類によって区別することができる。
【００１５】また、「標識化検出体」とは、標識化され
た検出体であり、「検出体」とは、検出に用いられる微
小な固体であって、各検査種類ごとに前記懸濁液中に多
数含まれる。「標識化」は、例えば標識物質と結合する
ことによって行う。標識物質は、光学物質のみならず、
種々の瞬時に定量可能な他の物理量、化学量をもつ物質
によって行っても良い。「保持の程度」は、保持量の多
少、すなわち検出の際の標識の程度を意味し、標識化が
光学的に行われる場合には、例えば光の強度である。
「結合物質を有する」態様としては、結合物質が結合
し、結合物質が付着し、もしくは固定し、結合物質を吸
着し、結合物質を微粒子の表面にコーティングしている
場合、または他物質を媒介にして結合物質を有する場合
を含む。
【００１６】本発明によれば、各微粒子ごとに前記結合
物質を介して保持された前記標識化検出体による標識化
の状態を検出しまた検出できないことによって、その標
識によって識別しようとする検査種類を特定し、その検
査種類について種々の情報を容易に得ることができる。
【００１７】第２の発明は、第１の発明において、前記
各検査種類の前記標識化検出体は各検査種類の標識物質
とのみ結合することによって標識化され、各検査種類ご
との標識物質の全体は、所定の種類が所定の量比含まれ
たものであって、その種類またはその量比は、各検査種
類ごとに相互に識別可能となるように異なる複数検査多
重化用懸濁液である。ここで、「標識物質」には、例え
ば、蛍光物質等の発光物質、電磁波を発する物質、磁場
を発する物質、電荷をもつ物質等がある。
【００１８】第３の発明は、第２の発明において、各検
査種類ごとの標識物質の全体は、各検査種類ごとに前記
標識化検出体の略全てに分配され、１個の標識化検出体
は１種類の標識物質とのみ結合したものである複数検査
多重化用懸濁液である。
【００１９】第４の発明は、第１の発明ないし第３の発
明のいずれかにおいて、複数検査種類の検査対象物の構
造の当否を検査する場合には、前記標識化検出体群は、
その検査種類ごとに異なるように標識化された前記検査
対象物群であり、前記結合物質群はその標識化検査対象
物が所定構造を持つ場合のみ結合しうる物質である。
「検査対象物」には遺伝物質、免疫系、タンパク質、ア
ミノ酸、糖等の生体高分子等を含む。
【００２０】第５の発明は、第１の発明ないし第３の発
明のいずれかにおいて、各検査種類における検査対象物
の未知の構造の決定を行う検査の場合には、前記標識化
検出体は、未知の前記構造が存在する場合にのみ、前記
結合物質との結合が予想され、相互に異なるように標識
化されたら既知の複数種類の構造体であって、前記結合
物質と結合した該既知の構造体から前記未知の構造の決
定を行う複数検査多重化用懸濁液である。
【００２１】第６の発明は、第１の発明ないし第３の発
明のいずれかにおいて、複数検査種類の検査対象物の存
在の有無、またはその存在の程度を検査する場合には、
前記標識化検出体および結合物質は、前記検査対象物を
介してのみ互いに結合するように選ばれた物質である。
【００２２】第７の発明は、第４の発明において、遺伝
物質の複数検査種類の所定検査部位の構造の当否を検査
する場合には、前記標識化検出体は、各々、一本鎖の検
査部位が１検査種類ずつ含まれるように切断され、か
つ、標識化されたＤＮＡ断片等の遺伝物質であり、各検
査種類の前記結合物質は、正常なまたは異常な構造であ
れば、前記遺伝物質の前記検査部位と結合しまたは結合
しないように選ばれた一本鎖の塩基配列を有する遺伝物
質である。
【００２３】第８の発明は、第４の発明または第６の発
明のいずれかにおいて、所定の固定化部位を有する複数
検査種類のタンパク質の所定の検査部位についての構造
の当否、その存在の有無またはその存在の程度を検査す
る場合には、前記標識化検出体は、前記タンパク質であ
って、前記検査部位と特異的に結合しまたは結合しない
ように選ばれた物質を介して前記標識物質で各複数検査
種類毎に相互に識別可能となるように標識化され、前記
結合物質は、前記固定化部位と特異的に結合するように
選ばれた物質である。「物質」には、例えば抗体を含
む。
【００２４】第９の発明は、第６の発明において、複数
検査種類の所定塩基配列をもつ遺伝物質について、未知
のＤＮＡを懸濁するＤＮＡ抽出液中での存在の有無、ま
たは存在の程度を検査する場合には、前記標識化検出体
群は、各検査種類ごとに多数含まれ、各検査種類ごとに
識別可能となるように標識化され、各検査種類ごとに該
当する塩基配列の合成、増幅を開始する既知の多数の複
数検査種類のプライマー群であり、前記結合物質は、そ
のプライマー群と対をなす複数検査種類のプライマー群
である。
【００２５】第１０の発明は、第５の発明において、変
異が予想される変異部位を有する遺伝物質の塩基配列を
決定する検査の場合には、前記標識化検出体の各構造体
は、前記プライマーの３’末端もしくはその近傍であっ
て前記変異部位に相当する位置において変異もしくは挿
入が予想される塩基若しくは塩基配列を有しまたは相当
する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーであっ
て、その構造の異なるものを互いに識別可能に標識化さ
せたものであり、前記結合物質は、前記プライマーの
３’末端もしくはその近傍もしくは上流側に離れた前記
変異部位に相当する位置において変異もしくは挿入が予
想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩
基もしくは塩基配列を有しないプライマーであり、前記
微粒子は、前記構造ごとに前記標識化されたプライマー
を前記プライマーを介して保持する複数検査多重化懸濁
液である。
【００２６】ここで、「プライマーの３’末端もしくは
その近傍」としたのは、プライマーの３’末端から離れ
れば離れるほど、その変異部位に相当する位置における
塩基または塩基配列がＰＣＲ法による合成、増幅におけ
る影響が小さくなり、その塩基または塩基配列の相違に
拘わらず合成、増幅されるおそれがあるからである。ま
た、「相当する塩基もしくは塩基配列を有しない」と
は、検査対象であるＤＮＡの対応する位置に欠失が存在
する場合のプライマーを意味する。
【００２７】第１１の発明は、第１の発明ないし第１０
の発明のいずれかにおいて、前記微粒子は、磁場等によ
り遠隔操作可能となる複数検査多重化用懸濁液である。
【００２８】第１２の発明は、第１の発明、第４の発明
または第６の発明のいずれかにおいて、前記標識化検出
体は、複数の検査部位をもつ二本鎖のＤＮＡを、各検査
部位ごとに認識部位と切断部位とにある塩基が重複せ
ず、ＰＣＲプライマーに影響を及ぼさない程度に離れて
いるＴｙｐｅII Ｓ制限酵素認識配列を３’末端の上流
側に設けるとともに、標識化された複数検査種類のプラ
イマーと、それと対をなす複数検査種類のプライマーと
を用いてＴｙｐｅII Ｓ制限酵素で処理することによっ
て得られた一端が標識化され、他端に検査部位の突出末
端を有するＤＮＡ断片である。
【００２９】ここで、「各検査部位ごとに認識部位と切
断部位とにある塩基が重複せず、ＰＣＲプライマーに影
響を及ぼさない程度に離れている」とは、好ましくは１
０塩基以上離れている場合をいう。理想的には、２０〜
３０塩基程度離れているのが良い。しかし、現在知られ
ているＴｙｐｅII Ｓ制限酵素では、最大１０〜２０塩
基程度である。
【００３０】第１３の発明は、各検査種類間で相互に識
別可能となるように標識化された複数検査種類の標識化
検出体群を生成する生成工程と、少なくとも、生成され
た複数検査種類の標識化検出体群、および、各検査種類
の検査の内容に応じて検査種類ごとに前記標識化検出体
と結合しまたは結合しないように選ばれた複数検査種類
の結合物質を、各検査種類ごとに有する複数検査種類の
微粒子群を、液中に懸濁させて処理を行う処理工程と、
前記検査種類ごとに、前記微粒子による標識化検出体の
保持の有無またはその程度を検出する検出工程とを有す
ることによって、複数検査種類の検査を並行して行う複
数検査多重化方法である。
【００３１】第１４の発明は、第１３の発明において、
前記生成工程は、各検査種類ごとに、多数の検出体と、
所定の種類が所定の量比含まれた各検査種類の標識物質
とを液中に懸濁させて結合させる工程を有し、前記種類
またはその量比は、各検査種類ごとに相互に識別可能と
なるように異なる複数検査多重化方法である。
【００３２】第１５の発明は、第１４の発明において、
前記生成工程において、各検査種類の標識物質の全体
は、各検査種類ごとの前記標識化検出体の略全てに分配
され、１個の前記標識化検出体は１種類の標識物質との
み結合する工程を有する複数検査多重化方法である。
【００３３】第１６の発明は、第１３の発明ないし第１
５の発明のいずれかにおいて、複数検査種類の検査対象
物の構造の当否を検査する場合には、前記生成工程にお
いて、前記標識化検出体は、各々前記検査対象物を標識
化したものであり、前記検査工程において、前記結合物
質はその検査対象物が所定構造をもつ場合のみ結合しう
る物質である。
【００３４】第１７の発明は、第１３の発明ないし第１
５の発明のいずれかにおいて、各検査種類における検査
対象物の未知の構造の決定を行う検査の場合には、前記
生成工程において、前記標識化検出体は、未知の前記構
造が存在する場合にのみ、前記結合物質との結合が予想
される既知の複数種類の構造体であって、相互に異なる
ように標識化されたものであり、前記結合物質と結合し
た前記既知の構造体から前記未知の構造を決定する複数
検査多重化方法である。
【００３５】第１８の発明は、第１３の発明ないし第１
５の発明のいずれかにおいて、前記検査対象物の存在の
有無および存在の程度を検査する場合には、前記生成工
程および前記検査工程における前記検出体および結合物
質は、前記検査対象物が存在する場合のみ互いに結合す
るように選ばれた物質であり、前記処理工程において
は、前記検査対象物をも懸濁する複数検査多重化方法で
ある。
【００３６】第１９の発明は、第１３の発明ないし第１
５の発明のいずれかにおいて、遺伝物質の複数検査種類
の所定検査部位の構造の当否を検査する場合には、生成
工程において、前記標識化検出体として一本鎖の検査部
位が１検査種類ずつ含まれるように切断され、かつ、標
識化されたＤＮＡ断片等の遺伝物質を生成し、各検査種
類の前記結合物質は、正常または異常な構造であれば、
前記遺伝物質の前記検査部位と結合しまたは結合しない
ように選ばれた一本鎖の塩基配列を有する遺伝物質であ
る複数検査多重化方法である。
【００３７】第２０の発明は、第１６の発明において、
前記生成工程は、複数検査種類の検査部位をもつ二本鎖
のＤＮＡと、各検査種類ごとに、一端に結合した標識物
質で標識化され、プライマーの３’末端の下流側にある
検査部位が突出末端となる切断部位をもつＴｙｐｅII
Ｓ制限酵素の認識部位が挿入されたプライマー群と、そ
れと対をなすプライマー群と、を混合してＰＣＲにより
２本鎖ＤＮＡ断片を増幅する増幅工程と、増幅された前
記ＤＮＡ断片をＴｙｐｅII Ｓ制限酵素で処理すること
によって、前記標識化検出体として、他端に検査部位の
突出末端を有するＤＮＡ断片を生成する酵素反応工程と
を有し、前記処理工程は、各検査種類毎に、前記標識化
検出体の突出末端の塩基配列が正常型である場合に結合
可能な塩基配列をもつ突出末端を有するＤＮＡ断片を有
する複数検査種類の微粒子群、および前記標識化検出体
を液中に懸濁して混合しライゲーション反応を行う複数
検査多重化方法である。
【００３８】第２１の発明は、第１８の発明において、
前記生成工程は、各検査種類ごとに識別可能となるよう
に標識化され、各検査種類ごとに、未知の多数のＤＮＡ
を懸濁するＤＮＡ抽出液中にその塩基配列が存在するか
否かの検査の対象となる既知の複数検査種類のＤＮＡ合
成を開始するプライマー群と、それと対をなす複数検査
種類のプライマー群を各検査種類ごとに多数有する微粒
子とを、未知の多数のＤＮＡを懸濁するＤＮＡ抽出液中
に懸濁してＰＣＲ法により増幅する増幅工程を有する複
数検査多重化方法である。
【００３９】第２２の発明は、第１７の発明において、
各検査種類における変異が予想される変異部位を有する
遺伝物質の塩基配列を決定する検査の場合には、前記増
幅工程は、前記標識化検出体の各構造体として、前記プ
ライマー３’末端もしくはその近傍であって前記変異部
位に相当する位置において変異もしくは挿入が予想され
る塩基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もし
くは塩基配列を有しないプライマーであって、その構造
が異なるものを互いに識別可能に標識化させ、前記結合
物質は、前記プライマーの３’末端もしくはその近傍も
しくは上流側に離れた前記変異部位に相当する位置にお
いて変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配
列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しな
いプライマーを多数有する微粒子とを、未知の多数のＤ
ＮＡを懸濁するＤＮＡ抽出液中に懸濁してＰＣＲ法によ
り増幅する複数検査多重化方法である。
【００４０】第２３の発明は、第１３の発明ないし第１
５の発明のいずれかにおいて、所定の固定化部位を有す
る複数検査種類のタンパク質の所定の検査部位について
の構造の当否、その存在の有無またはその存在の程度を
検査する場合には、前記生成工程および前記処理工程に
おける前記標識化検出体は、複数検査種類のタンパク質
であって、前記検査部位と特異的に結合しまたは結合し
ないように選ばれた物質を介して前記標識物質で各複数
検査種類毎に相互に識別可能となるように標識化され、
前記結合物質は、前記固定化部位と特異的に結合するよ
うに選ばれた物質である複数検査多重化方法である。な
お、以上の第１３から第２３の発明において、前記微粒
子は、例えば、磁性粒子を有し、磁場等により遠隔操作
可能となるものが好ましい。
【００４１】
【発明の実施の形態】本発明の実施の形態に係る複数検
査多重化用懸濁液、およびその懸濁液を用いた複数検査
多重化方法を、図面に基づいて以下に説明する。なお、
この実施の形態は特に指定のない限り本発明を制限する
ものと解してはならない。
【００４２】図１は、第１の実施の形態に係るその懸濁
液を用いた複数検査多重化方法を示すものである。図１
（ａ）に示すように、本実施の形態では、例えば、一人
の患者から抽出した遺伝物質である特定の二本鎖の検体
ＤＮＡ１１の複数箇所の検査部位１２、１３にある塩基
配列をもつ各検査対象の構造が予想される構造と一致す
るか否か、すなわち構造の当否の検査を行うものであ
る。
【００４３】前記「検査種類」とは、ここでは検体ＤＮ
Ａ１１上の位置およびその塩基配列が異なる検査部位１
２、１３の種類を意味する。この例では、説明上簡単の
ため、２種類の前記検査部位１２、１３のみを示し、ま
た、各検査部位１２、１３の塩基数は２塩基の場合のみ
を示しているが、この種類数およびこの塩基数に限定さ
れるものではない。
【００４４】図１（ａ）は、さらに、一端が２つの種類
の標識物質１４、１５のどちらかのみと結合し、３’末
端の上流側に設けられ前記検査部位１２に切断部位をも
つように、認識部位と切断部位にある塩基とが１０塩基
以上離れたＴｙｐｅII Ｓ制限酵素認識配列１６を含有
するプライマー１７からなるプライマー群１８を有す
る。
【００４５】また、このプライマー１７と対をなし、標
識化のされていないプライマー２０からなるプライマー
群２１を有している。ここで、前記標識物質１４、１５
は例えば種類の異なる２種類の蛍光物質である。蛍光物
質には、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレッセイン イソチ
オシアネート）、ローダミン、イソチオシアネート、Ｉ
ＲＤ４０，Ｃｙ３等の誘起物質またはユウロピウム錯体
等の無機物質がある。
【００４６】前記検査部位１３に対しても、同様にし
て、標識化がされ、前記ＴｙｐｅIIＳ制限酵素認識配列
を含有するプライマー１９からなるプライマー群２２を
有する。また、このプライマー１９と対をなし、標識化
のされていないプライマー２３からなるプライマー群２
４を有する。
【００４７】ここで、前記プライマー群１８では、前記
標識物質１４と結合したプライマー１７と、標識物質１
５と結合したプライマー１７との量比（各プライマーに
標識物質が略均等に分配されるとすれば、個数比に略相
当する）とは、２対１である。それに対して、プライマ
ー群２２では、前記標識物質１４と結合したプライマー
１９と、標識物質１５と結合したプライマー１９との量
比は、１対２である。
【００４８】次に、図１（ｂ）において、これらの検体
ＤＮＡ１１、プライマー群１８およびプライマー群２
１、プライマー群２２、およびプライマー群２４を混合
し、ＰＣＲを実行する。
【００４９】すると、図１（ｂ）に示すように、標識化
されたプライマー側末端の近傍にＴｙｐｅII Ｓ制限酵
素認識部位を有する２種類の二本鎖ＤＮＡ断片群２５、
２６が並行して合成される。
【００５０】次に、図１（ｃ）に示すように、増幅され
た前記ＤＮＡ断片群２５、２６をＴｙｐｅII Ｓ制限酵
素で処理することによって、末端に標識物質を有し、他
端に検査部位１２の突出末端６を有する多数のＤＮＡ断
片からなるＤＮＡ断片群２７、同様に、他端に検査部位
１３の突出末端２８を有する多数のＤＮＡ断片からなる
ＤＮＡ断片群２９が生成される。このＤＮＡ断片群２
７、２９が前記複数検査種類の標識化検出体群に相当す
る。以上説明した、図１（ａ），（ｂ），（ｃ）の各工
程が、前記生成工程に対応する。
【００５１】次に、図１（ｄ）に示すように、前記結合
物質として、末端に突出末端３０を有するＤＮＡ断片３
１を有する微粒子３２を用意する。このＤＮＡ断片３１
の突出末端３０は、前記検査部位１２の塩基配列が正常
型（検査部位１２が正常であった場合にはGAとする）で
あった場合には、それと相補的な突出末端を有する（T
C）。
【００５２】これを多数集めたものが前記検査部位１２
に対応する微粒子群３６である。同様にして、前記結合
物質として、末端に突出末端３３をもつＤＮＡ断片３４
を有する微粒子３５を用意する。このＤＮＡ断片３４の
突出末端３３は、前記検査部位１３の塩基配列が正常型
（検査部位１３が正常であった場合にはACとする)であ
った場合には、それと相補的な突出末端を有する(GT)。
これを多数集めたものが前記検査部位１３に対応する微
粒子群３７である。なお、前記微粒子３２、３５には、
各々同種のＤＮＡ断片３１、３４のみを有している。
【００５３】図１（ｃ）で生成された，ＤＮＡ断片群２
７、２９と、前記図１（ｄ）において生成された前記微
粒子群３６、３７を混合し、ライゲーション反応を行
う。これにより、いずれの検査部位１２、１３も正常型
である場合には、前記微粒子群３６、３７の各々が有す
る多数の結合物質であるＤＮＡ断片３１およびＤＮＡ断
片３４は、各々標識化検出体である多数のＤＮＡ断片群
２７およびＤＮＡ断片群２９と結合する。この図１
（ｄ）が前記処理工程に対応する。
【００５４】その結合は、多数の物質同士でランダムに
行われるため、統計的誤差を除き検出体の前記標識物質
１４および前記標識物質１５との量比が維持された状態
で、結合可能な結合物質と結合する。この誤差は、個数
が増加すればするほど小さくなる。
【００５５】したがって、図１（ｅ）に示すように、各
々標識物質１４および標識物質１５は、各検査種類毎に
異なる量比、すなわち、Ｆ１：Ｆ２＝２：１，およびＦ
１：Ｆ２＝２：１に限りなく近いいずれかの状態で標識
化された複合粒子３８および複合粒子３９が得られるこ
とになる。
【００５６】一方、いずれかの検査部位１２、１３が変
異型である場合（ｄでの配列と異なる場合）には、それ
ぞれ、各複合粒子３８または複合粒子３９は検出されな
いことになる。
【００５７】したがって、１本の反応容器中で上記の反
応を行い、フローサイトメータで検出を行うことによ
り、２種類以上の変異部位を同時に検出することが可能
である。このフローサイトメータによる検出が、前記検
出工程に相当する。
【００５８】以上の実施の形態の説明では、検査部位１
２のまたは検査部位１３の構造（各々AT,CA)が正常か異
常かであるかを調べるのみであった。もし、各検査部位
１２、検査部位１３の構造をも特定しようとするのであ
れば、前記構造体として予想される全検査部位の構造に
対応する塩基配列の組み合わせを、前記プライマー群１
８の３’末端またはその近傍に含むプライマー群１８を
形成し、相互に識別可能とするように標識化したものを
各検査部位（１２、１３）ごとに全て互いに異なるよう
に標識化したものを用いることによって行うことができ
る。
【００５９】また、以上の説明で用いられた２塩基突出
は、例えばFok I等のＴｙｐｅII Ｓ制限酵素による４塩
基突出末端など、３塩基以上の突出末端を用いることが
可能である。例えば、４塩基突出末端の場合には、異な
る配列として認識が可能な場合の数は２５６種類とな
り、同時に検出可能な変異部位ある変異からなる検出の
種類の数を増加させることができる。
【００６０】続いて、第２の実施の形態に係る複数検査
多重化用懸濁液、およびその懸濁液を用いた複数検査多
重化方法を、図２に基づいて説明する。本実施の形態
は、食品等に汚染されている複数の微生物種の存在を、
その微生物種毎に、１本の反応容器中で反応させること
によって検出するものである。
【００６１】図２（ａ）で、複数の微生物種を含むと予
想される含微生物試料４０を用意する。図２（ｂ）にお
いて、この含微生物試料４０から、その含微生物試料４
０に含有されている様々な未知の各種検体ＤＮＡ（ＤＮ
Ａ(1)、ＤＮＡ(2)、ＤＮＡ(3)等）４１を抽出する。
【００６２】次に、図２（ｃ）に示すように、前記含微
生物試料４０に含有されているか否かの検査の対象とな
る検査対象物が、例えば、２種類（もちろん、３種類以
上の微生物種であっても良い）の微生物種であるとす
る。この２種類が前記検査種類に相当する。
【００６３】また、第１の微生物種および第２の微生物
種に各々特有となるように、前記２種類の標識物質を結
合することによって標識化（コード化）されたプライマ
ー４３、４６を用意する。前記プライマー４３、４６
は、例えば、一端が２種類の標識物質（例えば蛍光物
質）４２、４４の一方のみと結合したものを多数用意
し、各々プライマー群４５とプライマー群４７とする。
このプライマー群４５、４７が標識化された複数検査種
類の標識化検出体群に相当する。
【００６４】但し、プライマー群４５では、前記標識物
質４２と結合したプライマー４３と、標識物質４４と結
合したプライマー４３との量比（各プライマーに標識物
質が略均等に分配されるとすれば、個数比に略相当す
る）は、２対１である。それに対して、プライマー群４
７では、前記標識物質４２と結合したプライマー４６
と、標識物質４４と結合したプライマー４６との量比
は、１対２として互いに異なるように標識化する。この
標識化を行うまでの工程である図２（ｃ）は前記生成工
程に相当する。
【００６５】前記結合物質として、前記プライマー４
３、４６と対をなすプライマー４８、４９を微粒子５
０、５１に各々固定化されたものを用意する。その際、
同一の前記微粒子５０または微粒子５１には、同一の配
列を有するプライマー４８、またはプライマー４９のみ
が固定化されるようにした多数の微粒子５０、５１から
なる２検査種類の微粒子群５２、５３を用意する。
【００６６】次に、これらのプライマー群４５、４７お
よび微粒子群５２、５３を懸濁させた懸濁液に、検査対
象物として図２（ｂ）で示した抽出されたＤＮＡ試料を
混合し、ＰＣＲを行う。すると、前記試料中に、第１の
微生物種および第２の微生物種が存在していた場合に
は、ＰＣＲ法により、前記微粒子５０、５１が有するプ
ライマー４８、４９と標識化されたプライマー４３、４
６によって、図２（ｄ）に示すように標識化された二本
鎖のＤＮＡ断片が形成される。
【００６７】多数のプライマー４３、４６と多数のプラ
イマー４８、４９による二本鎖の形成はランダムに行わ
れるため、統計的誤差を除き標識化検出体の前記標識物
質４２および前記標識化検出体の前記標識物質４４との
量比が維持された状態で二本鎖が形成される。
【００６８】この誤差は、個数が増加すればするほど小
さくなる。したがって、図２（ｄ）に示すように、各々
標識物質４２および標識物質４４は、各微生物種毎に異
なる量比、すなわち、Ｆ１：Ｆ２＝２：１、およびＦ
１：Ｆ２＝２：１に限りなく近いいずれかの状態で標識
化された複合粒子５４、５５が得られることになる。し
たがって、フローサイトメータを用いた分析によって、
前記量比を検出することによって、これらの複合粒子５
４、５５の存在を確認することができる。
【００６９】この図２（ｄ）（ｅ）が前記処理工程に相
当し、前記フローサイトメータによる分析が前記検出工
程に相当する。
【００７０】一方、いずれかの微生物種が前記試料中に
存在しない場合には、それぞれ、各複合粒子５４または
複合粒子５５は検出されないことになる。
【００７１】続いて、第３の実施の形態に係る複数検査
多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重
化方法を図３に基づいて説明する。
【００７２】この実施の形態では、試料中に存在する複
数の異なるタンパク質について、それぞれ構造の変異を
有するか否かの検査を１個の容器中での反応によって可
能とするものである。
【００７３】図３（ａ）に示すように、ヒト等の組織よ
り、タンパク質（Ｐ１）６０および異なる種類のタンパ
ク質（Ｐ２）６３を含む粗抽出液を用意する。
【００７４】各タンパク質６０、６３には、後述する微
粒子群７７、７９に固定化されるべき所定の固定化部位
６１、６４と、変異があるか否かの構造の当否、もしく
はそれが存在するか否か、またはどのくらい存在するか
否かの存在の程度の検査の対象となる部位である検査部
位６２、６５とを有する。
【００７５】図３（ｂ）に示すように、タンパク質６
０、６３の前記検査部位６２、６５が正常型である場合
に、その検査部位６２、６５と特異的に結合する標識化
された多数の抗体６８、７０からなる抗体群６９、７１
を示す。
【００７６】各抗体群６９では、前記標識物質６６と結
合した抗体６８と、標識物質６７と結合した抗体６８と
の個数の比は、２対１である。それに対して、抗体群７
１では、前記標識物質６６と結合した抗体７０と、前記
標識物質６７と結合した抗体７０との個数の比は、１対
２である。
【００７７】次に、これらのタンパク質６０、６３を、
抗体群６９、７１が懸濁されている懸濁液中に投入して
混合し、反応させる。
【００７８】すると図３（ｃ）に示すように、タンパク
質６０によって、前記標識物質６６、６７が２対１とな
るように標識化されたタンパク質群７２が得られ、タン
パク質６３によって、標識物質６６、６７が１対２とな
るように標識化されたタンパク質群７３が得られる。こ
のタンパク質群７２、７３は前記標識化検出体群に相当
する。すなわち、図３（ａ），（ｂ），（ｃ）が前記生
成工程に相当する。
【００７９】一方、図３（ｄ）に示すように、前記結合
物質として、前記固定化部位６１、６４と結合可能な多
数の抗体７６、７８を多数の微粒子７４、７５に固定化
させた微粒子群７７、７９を用意する。但し、同一の粒
子には、同一の抗体のみが固定化されるようにする。
【００８０】次にその微粒子群７７、７９が懸濁する懸
濁液中に、前記標識化されたタンパク質群７２、７３を
懸濁させて混合する。もし、前記タンパク質６０、６３
の検査部位６２、６５が正常型である場合には、図３
（ｅ）に示すような、標識化された複合粒子８０、８１
が形成される。
【００８１】多数の抗体６８、７１と、多数のタンパク
質６０、６３との結合はランダムに行われるため、統計
的誤差を除き検出体の前記標識物質６６および前記検出
体の前記標識物質６７との量比が維持された状態で複合
粒子８０、８１が形成される。この誤差は、個数が増大
すればする程小さくなる。
【００８２】したがって、図３（ｅ）に示すように、各
々標識物質６６および６７は、各タンパク質毎に異なる
量比、すなわち、Ｆ１：Ｆ２＝２：１、およびＦ１：Ｆ
２＝２：１に限りなく近いいずれかの状態で標識化され
ることになる。したがって、フローサイトメータを用い
た１粒子ごとに、前記量比を検出することによって、こ
れらの複合粒子８０、８１の存在を確認することができ
る。この図３（ｄ）（ｅ）の工程が前記処理工程に相当
し、フローサイトメータによる検出が前記検出工程に相
当する。
【００８３】さらに、第３の実施の形態に係る複数検査
多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重
化方法の他の例として、前記抗体６８、７０に代えて、
発癌に関連するタンパク質の変異した検査部位に特異的
に結合する抗体６８、７０を選択し、変異の有無によっ
て結合の可否が決定されるようにする。
【００８４】この例では、そのような抗体群によって結
合された各複合粒子８０、８１の蛍光強度を測定するこ
とによって、変異された（発癌に関係する）タンパク質
の有無、そのタンパク質の種類間の量の相違や比若しく
は１タンパク質あたりの変異部位の個数の相違や比を検
出することができる。
【００８５】第４の実施の形態に係る複数検査多重化用
懸濁液、およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法
を、図４に基づいて説明する。
【００８６】本実施の形態は、第２の実施の形態とし
て、図２で説明した複数検査種類の所定塩基配列をもつ
遺伝物質に、変異が予想される変異部位を有する遺伝物
質が含まれている場合にその変異の構造をも特定するた
めのものである。
【００８７】図４（ａ）は、説明の簡単のために、検体
ＤＮＡ９０に検査部位として１塩基の変異部位９１が存
在する場合に、その構造を決定する方法を示す。
【００８８】前記標識化検出体の各構造体として、プラ
イマー９３の３’末端もしくはその近傍９５、９７であ
って前記変異部位９１に相当する位置において変異が予
想される１塩基Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃを各々有する（図４では
説明の簡単のためにＡとＧのみについて図示している）
多数のプライマー９３からなる４種類のプライマー群９
６、９８を液中に懸濁したものを用いる。
【００８９】各Ａ，Ｇ（Ｔ，Ｃ）を有する各プライマー
群９６、９８に属する各プライマー９３は、１の種類の
標識物質９２、９４とのみ結合し、各種類ごとに、前記
標識物質９２，９４と結合した各プライマー群９６、９
８は、予め定めた量比、例えば、プライマー群９６につ
いては、Ｆ１：Ｆ２＝２：１であり、プライマー群９８
についてはＦ１：Ｆ２＝１：２である。
【００９０】なお、結合物質として、前記プライマー９
３と対をなすプライマー１００を用いる。この多数のプ
ライマー１００を有する多数の微粒子９９は微粒子群１
０１を構成する。
【００９１】これらのプライマー群９６、９８、前記微
粒子群１０１を液中に懸濁させて、ＰＣＲ法により増幅
し、前記プライマー群９６、９８のいずれかと結合して
微粒子９９に形成された複合体を検出することによっ
て、前記変異部位９１の構造を特定することができる。
【００９２】図４（ｂ）は、２種類の検体ＤＮＡ(1)１
０２，検体ＤＮＡ(2)１１１の各々に変異部位１０３、
１１２（説明の簡単上、１塩基の構造をもつとする）が
ある場合に、その変異部位の構造の当否を決定するもの
である。
【００９３】本例では、標識化検出体として、標識化さ
れたプライマー１０５、１０９とを用意する。前記プラ
イマー１０５、１０９は、例えば、一端が２種類の標識
物質（例えば蛍光物質）９２、９４の一方のみと結合し
たものを多数用意し、各々プライマー群１０４と、プラ
イマー群１１０とする。
【００９４】プライマー群１０４では、前記標識物質９
２と結合したプライマー１０５と、標識物質９４と結合
したプライマー１０５との個数の比は、１対２であり、
標識物質９２と結合したプライマー１０９と、標識物質
９４と結合したプライマー１０９との個数の比は２対１
として互いに異なるように標識化する。
【００９５】また、前記結合物質としては、前記プライ
マー１０５、１０９と各々対をなすプライマー１０６、
１１３であり、その３’末端もしくはその近傍１０７、
１１７の前記変異部位１０３、１１２に相当する位置に
おいて、変異が予想される１塩基Ａ、Ｇを各々もつ多数
のプライマー１０６、１１３を有する２種類の微粒子９
９からなる微粒子群１０８、１１５を用意する。
【００９６】この前記プライマー群１０４、１１０、検
体ＤＮＡ(1)１０２，ＤＮＡ(2)１１１、微粒子群１０
８、１１５を液中に懸濁させてＰＣＲ法で増幅させる。
その結果、前記ＤＮＡ(1)またはＤＮＡ(2)の変異部位１
０３、１１２が該当する塩基を有する場合のみフローサ
イトメータで前記量比を持った蛍光が観測され、前記変
異部位の構造の当否を決定することができる。
【００９７】図４（ｃ）は、説明の簡単のために、検体
ＤＮＡ１２１に検査部位として１塩基の変異部位１２２
が存在する場合に、その構造を決定する方法を示す。
【００９８】前記標識化検出体の各構造体として、プラ
イマー１１６の３’末端もしくはその近傍１１７、１１
９であって、前記変異部位１２２に相当する位置１１
７、１１９において変異が予想される変異が予想される
塩基Ａ，Ｇ，Ｔ，Ｃ（説明の簡単のためＡ，Ｇのみ図
示）を各々有する多数のプライマー１１６からなる４種
類のプライマー群１１８、１２０を用いる。各プライマ
ー群１１８、１２０に属する各プライマー１１６は、１
の種類の標識物質９２、９４とのみ結合し、各種類ごと
に、前記標識物質９２、９４と結合した各プライマー群
１１８、１２０は、予め定めた量比、例えば、プライマ
ー群１１８については、Ｆ１：Ｆ２＝２：１であり、プ
ライマー群１２０についてはＦ１：Ｆ２＝２：１であ
る。
【００９９】また、第１の微粒子群の例としては、前記
プライマー１１６と対をなし、その３’末端もしくはそ
の近傍の前記変異部位１２２に相当する位置１２４、１
２５において、変異が予想される塩基Ａ，Ｇ（Ｔ、Ｃ）
を有する多数のプライマー１２３を結合物質として用い
る。この多数のプライマー１２３を有する４種類の微粒
子９９からなる微粒子群１２６、１２７を用いる。これ
らのプライマー群１１８、１２０、検体ＤＮＡ１２１，
及び微粒子群１２６、１２７を液中に懸濁させてＰＣＲ
法により増幅を行うことにより、変異部位１２２の構造
に対応する蛍光強度比が検出されることになる。また、
全体としての強度を測定することにより、その変異部位
を有するＤＮＡが試料中でどの程度の割合で存在するか
を解析することができる。
【０１００】第２の微粒子群の例として、前記プライマ
ー１１６と対をなし、その３’末端もしくはその近傍の
前記変異部位１２２に相当する位置１２４、１２５にお
いて、変異が予想される塩基Ａ，Ｇ（Ｔ、Ｃ）を有する
多数のプライマー１２３を結合物質として用いる。この
４種類の多数のプライマー１２３が同一量比となるよう
に有する１種類の微粒子９９からなる微粒子群１２９を
用いる。これらのプライマー群１１８、１２０、検体Ｄ
ＮＡ１２１，及び微粒子群１２９を液中に懸濁させてＰ
ＣＲ法により増幅を行うことにより、変異部位１２２に
対応する蛍光強度比が検出されることになる。また、全
体としての強度を測定することにより、その変異部位を
有するＤＮＡが試料中でどの程度の割合で存在するかを
解析することができる。
【０１０１】第３の微粒子群の例として、前記プライマ
ー１１６と対をなし、その３’末端から離れた内部にあ
って前記変異部位１３１に相当する位置１３１におい
て、適当な塩基、例えば、Ａ（Ｇ、Ｔ、Ｃでも可、また
はイノシン）を有する１種類の多数のプライマー１３２
を結合物質として用いる。この多数のプライマー１３２
を有する微粒子９９からなる微粒子群１３０を用いる。
この例では、変異部位に相当する位置が３’末端から離
れているので、その変異部位に相当する位置にくる塩基
または塩基配列はＰＣＲ法による増幅に大きな影響を与
えないので、結合物質を共通のものを用いることができ
る。したがって、第３の微粒子群を用いた場合には第１
の微粒子群の場合に比較して検査処理を簡単化すること
ができる。なお、第１の微粒子群および第３の微粒子群
を用いることによって、他のＤＮＡが存在した状態での
並行検査が可能となる。
【０１０２】これらのプライマー群１１８、１２０、検
体ＤＮＡ１２１，及び微粒子群１３０を液中に懸濁させ
てＰＣＲ法により増幅を行うことにより、変異部位１２
２の構造に対応する蛍光強度比が検出されることにな
る。また、全体としての強度を測定することにより、そ
の変異部位を有するＤＮＡが試料中でどの程度の割合で
存在するかを解析することができる。
【０１０３】以上の実施の形態は、本発明をより良く理
解させるために具体的に説明したものであって、別形態
を制限するものではない。したがって、発明の主旨を変
更しない範囲で変更可能である。例えば、以上の説明で
は、説明の便宜上、２検査種類の検査を、２種類の標識
化検出体を用いて検査を多並行して行い、２種類の標識
物質によって標識化したものについて説明したが、この
場合に限られず、３検査種類以上の検査、および３以上
の種類の標識物質を用いて検査を行うことができる。
【０１０４】以上の例では、標識物質が発光物質の場合
について説明したが、標識物質は、この例に限られず、
磁場、核スピン状態等、種々の瞬時に定量可能な物理量
をもつ物質であっても良い。また、発光物質であって
も、発光波長および発光強度のみならず、発光偏光度、
発光位相、発光寿命等を検出するようにしても良い。
【０１０５】以上の検査は、ＤＮＡに関する多型、微生
物種類の検査、タンパク質の変異に関する場合について
行われているが、これらの例に限られることなく、糖や
アミノ酸等に関する検査にも用いることができるのはい
うまでもない。
【０１０６】また、抗体以外にも、レクチン、その他の
タンパク質、低分子物質など、検査物質に特異的に結合
する物質を用いることができる。この場合、糖、脂質、
その他の低分子量および高分子量からなる、特異的結合
が可能な種々の物質の検査を行うことが可能である。
【０１０７】また、以上の例では、変異部位は１塩基ま
たは２塩基の変異の場合についてのみ説明したが、この
例に限られることなく、例えば、３以上の塩基からなる
塩基配列をもつ変異の場合、欠失、挿入がある場合につ
いても適用できることはいうまでもない。さらに、変異
部位の解析方法は、必ずしも複数検査種類の並行検査を
行う場合に限られず、１検査種類の検査のみを行う際に
も使用することができる。
【０１０８】
【発明の効果】第１の発明または第１３の発明によれ
ば、複数検査種類の検査を多重化することによって並行
して実行することができる。したがって、処理時間を短
縮化し、かつ効率化することができるとともに、処理に
必要な作業面積を省略化し、使用する装置はコンパクト
なもので済むことになる。
【０１０９】また、各検査ごとには微小な量であって
も、それらをまとめてバルクな量を扱うことによって、
より扱いやすく使い勝手が良い。さらに、各検査におけ
る共通に必要とする試薬等の物品や、温度等の環境等の
設備、人手を節約し、検査コストを低下させることがで
きる。
【０１１０】さらに、各種類の検査に同一の条件を設定
することが可能となり、各種類間で同一条件での検査結
果の比較を行うことができる。これによって各種類間の
本質的な相違点の発見や、信頼性のある精度の高い検査
結果を得ることができる。また、遺伝物質の塩基配列の
決定等のように大量の情報を得る必要があるために、多
数の単純な処理を繰り返す必要があるような検査や処理
を効率的に行う場合に適している。
【０１１１】第２の発明または第１４の発明によれば、
所定の種類が所定の量比含まれた標識物質が各検査種類
間で識別可能となるように異ならせることによって標識
化している。したがって、前述した効果の他に、少数の
種類の標識物質を用いて多数の検査種類間（例えば、数
百、数千、数万種以上）を識別することができるという
効果を奏する。また、各検査種類ごとに多数の関係物質
を懸濁させることによって容易にかつ統計誤差内の正確
で精密な標識化を実現することができる。
【０１１２】第３の発明または第１５の発明によれば、
前述した効果の他に、各検出体ごとに１種類の種類の標
識物質とのみ結合するようにしている。したがって、量
比は個々の微粒子に特異的に結合した標識物質の検出強
度になるので、単に存在の有無のみならず、存在の程度
をも容易に検出することができる。
【０１１３】第４の発明または第１６の発明は、前述し
た効果の他に、例えば、ＤＮＡの塩基配列等の構造につ
いて、高い信頼性をもって高い精度で決定することがで
きる。
【０１１４】第５の発明、第１０の発明、第１７の発明
または第２２の発明によると、前述した効果の他に、複
数検査種類の検査対象物質の未知の構造をも高い精度で
決定することができる。
【０１１５】第６の発明または第１８の発明は、前述し
た効果の他に、例えば、ある試料中に微生物種が存在す
るか否かに関する検査に適用しやすい。これによって、
大腸菌、Ｏ-157等の有無の検査を容易かつ確実に実行す
ることができる。
【０１１６】第７の発明または第１９の発明は、前述し
た効果の他に、標識化検出体として、１種類のＤＮＡ等
の構造の当否の検査が行われる１本鎖の検査部位が含ま
れるように切断したものを用いている。したがって、Ｄ
ＮＡの塩基配列にある複数の変異を並行して効率的にか
つ正確に特定することができる。
【０１１７】第８の発明または第２３の発明によると、
前述した効果の他に、標識化検出体として、１種類のタ
ンパク質の構造の当否、その存在の有無、その存在の程
度の検査が行われるように、検査部位と結合しまたは結
合しないように選ばれた抗体群を介して標識物質で標識
化したものである。これによって、複数種類のタンパク
質の検査部位について、迅速かつ効率的にタンパク質の
変異型の検査を並行して行うことができる。
【０１１８】第９の発明または第２１の発明によれば、
前述した効果の他に、複数検査種類の検査対象物である
未知のＤＮＡが懸濁するＤＮＡ抽出液中に遺伝物質が存
在するか否かの検査を並行して迅速かつ効率的に行うこ
とができる。
【０１１９】第１１の発明によれば、前述した効果の他
に、磁性粒子等の遠隔操作可能となる微粒子を用いるこ
とによって、処理を一層効率的かつ容易に行うことがで
きる。
【０１２０】第１２の発明または第２０の発明によれ
ば、前述した効果の他に、前記検出体として、複数の検
査部位をもつ二本鎖のＤＮＡを、各検査部位ごとに認識
部位と切断部位とが１０塩基対以上離れたＴｙｐｅII
Ｓ制限酵素認識配列を３’末端の上流側に設けるととも
に、標識化された複数の検査種類のプライマーと、それ
と対をなす複数検査種類のプライマーとを用いてＴｙｐ
ｅII Ｓ制限酵素で処理することによって得られた一端
が標識化され、他端に検査部位の突出末端を有するＤＮ
Ａ断片である。本発明によれば、ＴｙｐｅII Ｓ制限酵
素認識配列を用いることによって、検査部位に悪影響を
与えることなく、任意の位置で二本鎖のＤＮＡを切断す
ることができるので、多様性または汎用性のある検査を
行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る懸濁液および
方法の説明図である。
【図２】本発明の第２の実施の形態に係る懸濁液および
方法の説明図である。
【図３】本発明の第３の実施の形態に係る懸濁液および
方法の説明図である。
【図４】本発明の第４の実施の形態に係る懸濁液および
方法の説明図である。
【符号の説明】
１１、４１、９０、１０２、１１１、１２１…検体ＤＮ
Ａ １２、１３…検査部位 １４、１５、４２、４４、６６、６７、９２、９４…標
識物質（蛍光物質） １７、１９、２０、２３、４３、４６、９３、１０５、
１０９、１１６…プライマー １８、２１、２２、２４、…プライマー群 ２５、２６、…ＤＮＡ断片群 ３１、３４…ＤＮＡ断片（結合物質） ２７、２９…ＤＮＡ断片群（標識化検出体群） ３２、３５、５０、５１、７４、７５…微粒子 ３６、３７、５２、５３、７７、７９…微粒子群 ３８、３９、５４、５５、８０、８１…複合粒子 ４０…含微生物試料 ４５、４７、９６、９８、１０４、１１０、１１８、１
２０…プライマー群（標識化検出体群または構造体群） ４８、４９、１００、１０６、１１３、１２３、１３２
…プライマー（結合物質） ６０、６３…タンパク質 ６１、６４…固定化部位 ６２、６５…検査部位 ６８、７０…抗体 ６９、７１…抗体群 ７２、７３…タンパク質群（標識化検出体群） ７６、７８…抗体（結合物質）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (74)上記２名の代理人 100075199 弁理士 土橋 皓 (72)発明者 町田 雅之 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 萩原 央子 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 田島 秀二 東京都稲城市矢野口1843番地１ プレシジ ョン・システム・サイエンス株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA19 CA01 CA04 CA09 FA10 HA13 HA19 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR32 QR55 QR62 QS03 QS22 QS32 QX02

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 各検査種類間で相互に識別可能となるよ
    うに標識化された複数検査種類の標識化検出体群と、 各検査種類の検査内容に応じて検査種類ごとに前記標識
    化検出体と結合しまたは結合しないように選ばれた複数
    検査種類の結合物質を、各検査種類ごとに有する複数検
    査種類の微粒子群とを含む懸濁液であって、 前記検査種類ごとに、前記微粒子による前記標識化検出
    体の保持の有無またはその程度を検出することによっ
    て、複数検査種類の検査が前記懸濁液を用いて並行して
    行われることを特徴とする複数検査多重化用懸濁液。
  2. 【請求項２】 前記各検査種類の前記標識化検出体は各
    検査種類の標識物質とのみ結合することによって標識化
    され、各検査種類ごとの前記標識物質の全体は、所定の
    種類が所定の量比含まれたものであって、その種類また
    はその量比は、各検査種類ごとに相互に識別可能となる
    ように異なることを特徴とする請求項１に記載の複数検
    査多重化用懸濁液。
  3. 【請求項３】 各検査種類ごとの標識物質の全体は、各
    検査種類ごとに前記標識化検出体の略全てに分配され、
    １個の標識化検出体は１種類の標識物質とのみ結合した
    ものであることを特徴とする請求項２に記載の複数検査
    多重化用懸濁液。
  4. 【請求項４】 複数検査種類の検査対象物の構造の当否
    を検査する場合には、前記標識化検出体群は、その検査
    種類ごとに異なるように標識化された前記検査対象物群
    であり、前記結合物質群はその標識化検査対象物群が所
    定構造をもつ場合のみ結合しうる物質であることを特徴
    とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の複数
    検査多重化用懸濁液。
  5. 【請求項５】 各検査種類における検査対象物の未知の
    構造の決定を行う検査の場合には、前記標識化検出体
    は、未知の前記構造が存在する場合にのみ、前記結合物
    質との結合が予想され、相互に異なるように標識化され
    た既知の複数種類の構造体であって、前記結合物質と結
    合した該既知の前記構造体から前記未知の構造の決定を
    行うことを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれ
    かに記載の複数検査多重化用懸濁液。
  6. 【請求項６】 複数検査種類の検査対象物の存在の有
    無、またはその存在の程度を検査する場合には、前記標
    識化検出体および結合物質は、前記検査対象物を介して
    のみ互いに結合するように選ばれた物質であることを特
    徴とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の複
    数検査多重化用懸濁液。
  7. 【請求項７】 遺伝物質の複数検査種類の所定検査部位
    の構造の当否を検査する場合には、前記標識化検出体
    は、各々、一本鎖の検査部位が１検査種類ずつ含まれる
    ように切断され、かつ、標識化されたＤＮＡ断片等の遺
    伝物質であり、各検査種類の前記結合物質は、正常また
    は異常な構造であれば、前記遺伝物質の前記検査部位と
    結合しまたは結合しないように選ばれた一本鎖の塩基配
    列を有する遺伝物質であることを特徴とする請求項４に
    記載の複数検査多重化用懸濁液。
  8. 【請求項８】 所定の固定化部位を有する複数検査種類
    のタンパク質の所定の検査部位についての構造の当否、
    その存在の有無またはその存在の程度を検査する場合に
    は、前記標識化検出体は、前記タンパク質であって、前
    記検査部位と特異的に結合しまたは結合しないように選
    ばれた物質を介して前記標識物質で各複数検査種類毎に
    相互に識別可能となるように標識化され、前記結合物質
    は、前記固定化部位と特異的に結合するように選ばれた
    物質であることを特徴とする請求項４または請求項６の
    いずれかに記載の複数検査多重化用懸濁液。
  9. 【請求項９】 複数検査種類の所定塩基配列をもつ遺伝
    物質について、未知のＤＮＡを懸濁するＤＮＡ抽出液中
    での存在の有無、または存在の程度を検査する場合に
    は、前記標識化検出体群は、各検査種類ごとに多数含ま
    れ、各検査種類ごとに識別可能となるように標識化さ
    れ、各検査種類ごとに該当する塩基配列の合成、増幅を
    開始する既知の多数の複数検査種類のプライマー群であ
    り、 前記結合物質は、そのプライマー群と対をなす複数検査
    種類のプライマー群であることを特徴とする請求項６に
    記載の複数検査多重化用懸濁液。
  10. 【請求項１０】 変異が予想される変異部位を有する遺
    伝物質の塩基配列を決定する検査の場合には、前記標識
    化検出体の各構造体は、前記プライマーの３’末端もし
    くはその近傍であって前記変異部位に相当する位置にお
    いて変異もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配
    列を有しまたは相当する塩基もしくは塩基配列を有しな
    いプライマーであって、その構造の異なるものを互いに
    識別可能に標識化させたものであり、前記結合物質は、
    前記プライマーの３’末端もしくはその近傍もしくは上
    流側に離れた前記変異部位に相当する位置において変異
    もしくは挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有し
    または相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライ
    マーであり、前記微粒子は、前記構造ごとに前記標識化
    されたプライマーを前記プライマーを介して保持するこ
    とを特徴とする請求項５に記載の複数検査多重化懸濁
    液。
  11. 【請求項１１】 前記微粒子は、磁場等により遠隔操作
    可能となるものであることを特徴とする請求項１ないし
    請求項１０のいずれかに記載の複数検査多重化用懸濁
    液。
  12. 【請求項１２】 前記標識化検出体は、複数の検査部位
    をもつ二本鎖のＤＮＡを、各検査部位ごとに認識部位と
    切断部位とにある塩基が重複せず、ＰＣＲプライマーに
    影響を及ぼさない程度に離れているＴｙｐｅII Ｓ制限
    酵素認識配列を３’末端の上流側に設けるとともに、標
    識化された複数検査種類のプライマーと、それと対をな
    す複数検査種類のプライマーとを用いてＴｙｐｅII Ｓ
    制限酵素で処理することによって得られた一端が標識化
    され、他端に検査部位の突出末端を有するＤＮＡ断片で
    あることを特徴とする請求項１、請求項４または請求項
    ６のいずれかに記載の複数検査多重化用懸濁液。
  13. 【請求項１３】 各検査種類間で相互に識別可能となる
    ように標識化された複数検査種類の標識化検出体群を生
    成する生成工程と、少なくとも、生成された複数検査種
    類の標識化検出体群、および、各検査種類の検査の内容
    に応じて検査種類ごとに前記標識化検出体と結合しまた
    は結合しないように選ばれた複数検査種類の結合物質
    を、各検査種類ごとに有する複数検査種類の微粒子群
    を、液中に懸濁させて処理を行う処理工程と、前記検査
    種類ごとに、前記微粒子による標識化検出体の保持の有
    無またはその程度を検出する検出工程とを有することに
    よって、複数検査種類の検査を並行して行うことを特徴
    とする複数検査多重化方法。
  14. 【請求項１４】 前記生成工程は、各検査種類ごとに、
    多数の検出体と、所定の種類が所定の量比含まれた各検
    査種類の標識物質とを液中に懸濁させて結合させる工程
    を有し、その種類またはその量比は、各検査種類ごとに
    相互に識別可能となるように異なるものであることを特
    徴とする請求項１３に記載の複数検査多重化方法。
  15. 【請求項１５】 前記生成工程において、各検査種類の
    標識物質の全体は、各検査種類ごとの前記標識化検出体
    の略全てに分配され、１個の前記標識化検出体は１種類
    の標識物質とのみ結合する工程を有することを特徴とす
    る請求項１４に記載の複数検査多重化方法。
  16. 【請求項１６】 複数検査種類の検査対象物の構造の当
    否を検査する場合には、前記生成工程において、前記標
    識化検出体は、各々前記検査対象物を標識化したもので
    あり、前記検出工程において、前記結合物質はその検査
    対象物が所定構造をもつ場合のみ結合しうる物質である
    ことを特徴とする請求項１３ないし請求項１５のいずれ
    かに記載の複数検査多重化方法。
  17. 【請求項１７】 各検査種類における検査対象物の未知
    の構造の決定を行う検査の場合には、前記生成工程にお
    いて、前記標識化検出体は、未知の前記構造が存在する
    場合にのみ、前記結合物質との結合が予想される既知の
    複数種類の構造体であって、相互に異なるように標識化
    されたものであり、前記結合物質と結合した前記既知の
    構造体から前記未知の構想を決定することを特徴とする
    請求項１３ないし請求項１５のいずれかに記載の複数検
    査多重化方法。
  18. 【請求項１８】 前記検査対象物の存在の有無および存
    在の程度を検査する場合には、前記生成工程および前記
    検査工程における前記標識化検出体および結合物質は、
    前記検査対象物が存在する場合のみ互いに結合するよう
    に選ばれた物質であり、前記処理工程においては、前記
    検査対象物をも懸濁して処理することを特徴とする請求
    項１３ないし請求項１５のいずれかに記載の複数検査多
    重化方法。
  19. 【請求項１９】 遺伝物質の複数検査種類の所定検査部
    位の構造の当否を検査する場合には、生成工程におい
    て、前記標識化検出体として一本鎖の検査部位が１検査
    種類ずつ含まれるように切断され、かつ、標識化された
    ＤＮＡ断片等の遺伝物質を生成し、各検査種類の前記結
    合物質は、正常または異常な構造であれば、前記遺伝物
    質の前記検査部位と結合しまたは結合しないように選ば
    れた一本鎖の塩基配列を有する遺伝物質であることを特
    徴とする請求項１３ないし請求項１５のいずれかに記載
    の複数検査多重化方法。
  20. 【請求項２０】 前記生成工程は、複数検査種類の検査
    部位をもつ二本鎖のＤＮＡと、各検査種類ごとに、一端
    に結合した標識物質で標識化され、プライマーの３’末
    端の下流側にある検査部位が突出末端となる切断部位を
    もつＴｙｐｅII Ｓ制限酵素の認識部位が挿入されたプ
    ライマー群と、それと対をなすプライマー群と、を混合
    してＰＣＲにより２本鎖ＤＮＡ断片を増幅する増幅工程
    と、増幅された前記ＤＮＡ断片をＴｙｐｅII Ｓ制限酵
    素で処理することによって、前記標識化検出体として、
    他端に検査部位の突出末端を有するＤＮＡ断片を生成す
    る酵素反応工程とを有し、 前記処理工程は、各検査種類毎に、前記標識化検出体の
    突出末端の塩基配列が正常型である場合に結合可能な塩
    基配列をもつ突出末端を有するＤＮＡ断片を有する複数
    検査種類の微粒子群、および前記標識化検出体群を液中
    に懸濁して混合しライゲーション反応を行うものである
    ことを特徴とする請求項１６に記載の複数検査多重化方
    法。
  21. 【請求項２１】 前記生成工程は、各検査種類ごとに識
    別可能となるように標識化され、各検査種類ごとに、未
    知の多数のＤＮＡを懸濁するＤＮＡ抽出液中にその塩基
    配列が存在するか否かの検査の対象となる既知の複数検
    査種類のＤＮＡ合成を開始するプライマー群と、それと
    対をなす複数検査種類のプライマー群を各検査種類ごと
    に多数有する微粒子とを、未知の多数のＤＮＡを懸濁す
    るＤＮＡ抽出液中に懸濁してＰＣＲ法により増幅する増
    幅工程を有することを特徴とする請求項１８に記載の複
    数検査多重化方法。
  22. 【請求項２２】 各検査種類における変異が予想される
    変異部位を有する遺伝物質の塩基配列を決定する検査の
    場合には、前記増幅工程は、前記標識化検出体の各構造
    体として、前記プライマー３’末端もしくはその近傍で
    あって前記変異部位に相当する位置において変異もしく
    は挿入が予想される塩基もしくは塩基配列を有しまたは
    相当する塩基もしくは塩基配列を有しないプライマーで
    あって、その構造が異なるものを互いに識別可能に標識
    化させ、前記結合物質は、前記プライマーの３’末端も
    しくはその近傍もしくは上流側に離れた前記変異部位に
    相当する位置において変異もしくは挿入が予想される塩
    基もしくは塩基配列を有しまたは相当する塩基もしくは
    塩基配列を有しないプライマーを多数有する微粒子と
    を、未知の多数のＤＮＡを懸濁するＤＮＡ抽出液中に懸
    濁してＰＣＲ法により増幅することを特徴とする請求項
    １７に記載の複数検査多重化方法。
  23. 【請求項２３】 所定の固定化部位を有する複数検査種
    類のタンパク質の所定の検査部位についての構造の当
    否、その存在の有無またはその存在の程度を検査する場
    合には、前記生成工程および前記処理工程における前記
    標識化検出体は、複数検査種類のタンパク質であって、
    前記検査部位と結合しまたは結合しないように選ばれた
    物質を介して前記標識物質で各複数検査種類毎に相互に
    識別可能となるように標識化され、前記結合物質は、前
    記固定化部位と特異的に結合するように選ばれた物質で
    あることを特徴とする請求項１３ないし請求項１５のい
    ずれかに記載の複数検査多重化方法。
JP2000382783A 2000-12-15 2000-12-15 複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法 Expired - Lifetime JP4755755B2 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000382783A JP4755755B2 (ja) 2000-12-15 2000-12-15 複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法
PCT/JP2001/010994 WO2002050542A1 (fr) 2000-12-15 2001-12-14 Examens multiples a multicriteres et suspension a cet effet
DE10197053T DE10197053T1 (de) 2000-12-15 2001-12-14 Multiplexverfahren zur multiplen Untersuchung und Suspension für ein Multiplexverfahren zur multiplen Untersuchung
US10/450,584 US20040096857A1 (en) 2000-12-15 2001-12-14 Multiple-inspection multiplexing method and suspension for multiple-inspection multiplexing

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000382783A JP4755755B2 (ja) 2000-12-15 2000-12-15 複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2002181821A true JP2002181821A (ja) 2002-06-26
JP4755755B2 JP4755755B2 (ja) 2011-08-24

Family

ID=18850549

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000382783A Expired - Lifetime JP4755755B2 (ja) 2000-12-15 2000-12-15 複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20040096857A1 (ja)
JP (1) JP4755755B2 (ja)
DE (1) DE10197053T1 (ja)
WO (1) WO2002050542A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014041122A (ja) * 2012-08-21 2014-03-06 Astrium Gmbh 特に宇宙空間における、生化学分析の実施方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102006005287B4 (de) * 2006-02-06 2012-12-27 Siemens Ag Verfahren zum Nachweis von Zielnukleinsäuren

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61191964A (ja) * 1984-12-13 1986-08-26 アプライド　バイオシステムズ　インコ−ポレイテツド 目標核酸配列の試験方法およびキット
JPH0712731A (ja) * 1993-05-06 1995-01-17 Ciba Corning Diagnostics Corp 発光接合体を用いた検出または定量方法
JPH09510878A (ja) * 1994-04-04 1997-11-04 チバ コーニング ダイアグノスティクス コーポレイション 特定の核酸配列を検出するためのハイブリダイゼーション−ライゲーション分析
US5736330A (en) * 1995-10-11 1998-04-07 Luminex Corporation Method and compositions for flow cytometric determination of DNA sequences
JPH10511460A (ja) * 1994-12-22 1998-11-04 アボツト・ラボラトリーズ 被験サンプル中の複数分析物の時差式検出方法
WO1998053093A1 (en) * 1997-05-23 1998-11-26 Bioarray Solutions Llc Color-encoding and in-situ interrogation of matrix-coupled chemical compounds
US6027894A (en) * 1994-09-16 2000-02-22 Affymetrix, Inc. Nucleic acid adapters containing a type IIs restriction site and methods of using the same

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5981180A (en) * 1995-10-11 1999-11-09 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61191964A (ja) * 1984-12-13 1986-08-26 アプライド　バイオシステムズ　インコ−ポレイテツド 目標核酸配列の試験方法およびキット
JPH0712731A (ja) * 1993-05-06 1995-01-17 Ciba Corning Diagnostics Corp 発光接合体を用いた検出または定量方法
JPH09510878A (ja) * 1994-04-04 1997-11-04 チバ コーニング ダイアグノスティクス コーポレイション 特定の核酸配列を検出するためのハイブリダイゼーション−ライゲーション分析
US6027894A (en) * 1994-09-16 2000-02-22 Affymetrix, Inc. Nucleic acid adapters containing a type IIs restriction site and methods of using the same
JPH10511460A (ja) * 1994-12-22 1998-11-04 アボツト・ラボラトリーズ 被験サンプル中の複数分析物の時差式検出方法
US5736330A (en) * 1995-10-11 1998-04-07 Luminex Corporation Method and compositions for flow cytometric determination of DNA sequences
WO1998053093A1 (en) * 1997-05-23 1998-11-26 Bioarray Solutions Llc Color-encoding and in-situ interrogation of matrix-coupled chemical compounds

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014041122A (ja) * 2012-08-21 2014-03-06 Astrium Gmbh 特に宇宙空間における、生化学分析の実施方法
JP2016011961A (ja) * 2012-08-21 2016-01-21 エアバス デーエス ゲーエムベーハー 宇宙空間に適した、生化学分析の実施方法
US9921214B2 (en) 2012-08-21 2018-03-20 Airbus Ds Gmbh Method for performing a biochemical analysis, especially in outer space

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002050542A1 (fr) 2002-06-27
US20040096857A1 (en) 2004-05-20
DE10197053T1 (de) 2003-10-16
JP4755755B2 (ja) 2011-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240003892A1 (en) Heterogeneous single cell profiling using molecular barcoding
US11161087B2 (en) Methods and compositions for tagging and analyzing samples
KR101378214B1 (ko) 검체 해석 방법 및 그것에 사용하는 분석 키트
WO2006126570A1 (ja) 生体反応又は生体内状態変化の複数同時解析法
Sethi et al. Direct detection of conserved viral sequences and other nucleic acid motifs with solid-state nanopores
CN109385469A (zh) 一种高灵敏度双链循环肿瘤dna检测方法及试剂盒
EP2829614A1 (en) Method for detecting target nucleic acid molecule
CN115927565A (zh) 基于mNGS检测CAR-T细胞制品中病原微生物的方法建立及应用
CN113444773B (zh) 一种基于液相芯片检测蜱虫病原体核酸的方法及试剂盒
EP1041160A1 (en) Methods for detecting mutation in base sequence
CN109628573A (zh) 一种用于无创产前检测12种染色体微缺失微重复综合征的试剂盒及其专用探针组
JP2010524459A (ja) 未知の生体分子と一本鎖核酸の結合プロファイルを生成するための核酸チップ、核酸チップの製造方法、及び核酸チップを利用した未知の生体分子分析方法
JPH07508407A (ja) 分子生物学的診断のための方法およびシステム
JP4755755B2 (ja) 複数検査多重化用懸濁液およびその懸濁液を用いた複数検査多重化方法
Wang et al. Label-free cross-priming amplification coupled with endonuclease restriction and nanoparticles-based biosensor for simultaneous detection of nucleic acids and prevention of carryover contamination
JP2004012343A (ja) 複数検査並行方法および複数検査並行用混合液
US20230375538A1 (en) Dual barcode indexes for multiplex sequencing of assay samples screened with multiplex insolution protein array
US20050239078A1 (en) Sequence tag microarray and method for detection of multiple proteins through DNA methods
WO2008004706A1 (fr) Procédé de détection d'une substance cible à l'aide d'un procédé d'amplification de l'acide nucléique, disponible dans des conditions thermostatiques
KR100607901B1 (ko) 분자비콘을 이용한 특정물질의 동정 및 분석방법
Sagoe et al. Application of Hybridization Chain Reaction/CRISPR-Cas12a for the Detection of SARS-CoV-2 Infection. Diagnostics 2023, 13, 1644
JPH09168400A (ja) 核酸の定量方法
Barea et al. Droplet microfluidics for single-molecule and single-cell analysis in research, diagnosis, and therapy
JP2006081416A (ja) Ｄｎａ定量方法
JPH06113896A (ja) 核酸の測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20071212

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100413

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100611

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20101130

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110126

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20110510

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20110530

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140603

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Ref document number: 4755755

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

EXPY Cancellation because of completion of term