JP2002181708A - Microarray chip reading method and apparatus therefor - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明が属する技術分野】本発明は、蛍光標識によるマ
イクロアレイチップ（ＤＮＡチップ等）の解析のための
蛍光読み取りを高精度に行うマイクロアレイチップの読
取方法及びその装置に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method and a device for reading a microarray chip for performing high-precision fluorescence reading for analyzing a microarray chip (such as a DNA chip) using a fluorescent label.
【０００２】[0002]
【従来の技術】現在、ヒトゲノムプロジェクトによりヒ
ト遺伝子の全塩基配列が解明され、その塩基配列を医療
等の各種の分野に利用しようというポストゲノム時代に
入ろうとしている。そして、多数のヒト遺伝子のうち、
癌や糖尿病等に関連する遺伝子を明らかにすることによ
って、リスク診断や副作用の発現可能性等を高精度で調
べることができる遺伝子診断への応用が切望されてい
る。2. Description of the Related Art At present, the entire base sequence of a human gene has been elucidated by the Human Genome Project, and it is about to enter the post-genome era where the base sequence is to be used in various fields such as medicine. And among many human genes,
By elucidating genes related to cancer, diabetes, and the like, there is a strong demand for application to genetic diagnosis, which can examine risk diagnosis and the possibility of occurrence of side effects with high accuracy.
【０００３】このような遺伝子を解析する方法として
は、組織や末梢血等から抽出したＤＮＡの塩基配列を読
み取るマイクロアレイ技術が注目されている。このマイ
クロアレイ技術は、スライドグラス等の基板上に直径数
百ミクロン程度のスポットでプローブＤＮＡ等を場所を
決めて固定し、ここに蛍光標識を付けた検体ＤＮＡを含
む試料液を流し込み、ハイブリダイゼーションにより結
合させた後、光を照射し、結合した部分から発生する蛍
光を、ＣＣＤ等の二次元カメラを使用して二次元画像と
して読み取るものである。As a method for analyzing such a gene, a microarray technique for reading a base sequence of DNA extracted from a tissue, peripheral blood, or the like has attracted attention. In this microarray technology, a probe DNA or the like is fixed on a substrate such as a slide glass with a spot having a diameter of about several hundred microns, and a sample liquid containing a fluorescently labeled sample DNA is poured into the spot, and hybridization is performed. After the coupling, the light is irradiated, and the fluorescence generated from the coupled portion is read as a two-dimensional image using a two-dimensional camera such as a CCD.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、蛍光標
識を付けた検体ＤＮＡを結合させたＤＮＡチップに光を
照射した際に発生する蛍光には、蛍光標識から発生する
蛍光の他に、ＤＮＡチップ基板自体から発生する蛍光も
含まれるため、これがバックグラウンドとなって蛍光読
み取りの精度が悪くなるという問題がある。However, the fluorescence generated when the DNA chip to which the fluorescently labeled sample DNA is bound is irradiated with light includes not only the fluorescence generated from the fluorescent label but also the DNA chip substrate. Since the fluorescence generated from itself is also included, there is a problem that this becomes a background and the accuracy of the fluorescence reading deteriorates.
【０００５】このような問題点を解決するために、特開
２０００−６９９９８号公報には、ＤＮＡチップ基板上
にプローブＤＮＡを形成しないブランク部分を設けてお
き、この部分からバックグラウンドを測定する技術が示
されている。しかし、この方法では、ＤＮＡチップ基板
上の微細な汚れや凹凸といった部分的な表面状態の影響
を排除することはできず、高精度の測定が必須である遺
伝子解析には不十分であった。In order to solve such a problem, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-69998 discloses a technique in which a blank portion on which a probe DNA is not formed is provided on a DNA chip substrate, and a background is measured from this portion. It is shown. However, this method cannot eliminate the influence of a partial surface state such as minute dirt or unevenness on the DNA chip substrate, and is insufficient for gene analysis that requires high-precision measurement.
【０００６】本発明は、上述したような従来技術の問題
点を解決するために提案されたものであり、その目的
は、検体に付けた蛍光標識から発生する蛍光と、基板自
体から発生するバックグラウンドの蛍光を分離すること
によって、蛍光読み取りを高精度に行うことができるマ
イクロアレイチップの読取方法及びその装置を提供する
ことにある。[0006] The present invention has been proposed to solve the above-mentioned problems of the prior art, and its object is to provide a fluorescent light generated from a fluorescent label attached to a specimen and a back light generated from a substrate itself. It is an object of the present invention to provide a microarray chip reading method and apparatus capable of reading fluorescence with high accuracy by separating ground fluorescence.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の目的
を達成するために鋭意研究を重ねた結果、検体ＤＮＡに
蛍光寿命の長い蛍光標識を付け、その検体ＤＮＡを結合
させたＤＮＡチップに照射する励起光を断続させたとこ
ろ、励起光が遮断した際に生ずる蛍光の減衰時間が、検
体ＤＮＡに付けた蛍光寿命の長い蛍光標識から発生する
蛍光と、ＤＮＡチップ基板自体から発生するバックグラ
ウンドの蛍光で異なることを見出し、本発明を完成する
に至ったものである。すなわち、ＤＮＡチップ基板自体
から発生するバックグラウンドの蛍光が十分に減衰した
後から、検体ＤＮＡに付けた蛍光標識から発生する蛍光
を読み取ることによって、両蛍光を分離して検出するこ
とを可能としたものである。Means for Solving the Problems The inventors of the present invention have conducted intensive studies in order to achieve the above object, and as a result, have attached a fluorescent label having a long fluorescence lifetime to a sample DNA, and bonded the sample DNA to the DNA chip. When the excitation light applied to the sample is interrupted, the decay time of the fluorescence generated when the excitation light is cut off is reduced by the fluorescence generated from the fluorescent label with a long fluorescence lifetime attached to the sample DNA and the back light generated from the DNA chip substrate itself. The present inventors have found that the fluorescence differs in the ground, and have completed the present invention. That is, after the background fluorescence generated from the DNA chip substrate itself is sufficiently attenuated, the fluorescence generated from the fluorescent label attached to the sample DNA is read, so that both the fluorescences can be separated and detected. Things.
【０００８】すなわち、請求項１に記載の発明は、蛍光
標識を用いたマイクロアレイチップの読取方法におい
て、マイクロアレイチップの基板自体から発生するバッ
クグラウンドの蛍光と、検体に付けた蛍光標識から発生
する蛍光を、両蛍光の検出時間をずらすことによって分
離して検出するようにしたことを特徴とするものであ
る。That is, the invention according to claim 1 is a method for reading a microarray chip using a fluorescent label, wherein the background fluorescent light generated from the substrate of the microarray chip itself and the fluorescent light generated from the fluorescent label attached to the specimen. Are separated and detected by staggering the detection time of both fluorescences.
【０００９】請求項２に記載の発明は、蛍光標識を用い
たマイクロアレイチップの読取方法において、マイクロ
アレイチップの基板自体から発生するバックグラウンド
の蛍光が減衰する時間を求め、その減衰時間が経過した
後で、検体に付けた蛍光標識から発生する蛍光を測定す
るようにしたことを特徴とするものである。According to a second aspect of the present invention, in the method for reading a microarray chip using a fluorescent label, a time required for background fluorescence generated from the substrate itself of the microarray chip to decay is determined, and after the decay time has elapsed. Wherein the fluorescence generated from the fluorescent label attached to the sample is measured.
【００１０】請求項３に記載のマイクロアレイチップの
読取方法は、検体に付けた蛍光標識の種類に基づいてそ
の蛍光標識に最適な励起波長を選択して、その波長の光
を透過する第１のフィルタを所定位置にセットすると共
に、その蛍光標識に最適な検出波長を選択して、その波
長の光を透過する第２のフィルタを所定位置にセット
し、ブランクのマイクロアレイチップの基板に前記第１
のフィルタを透過した励起光を照射し、前記基板自体か
ら発生する蛍光を前記第２のフィルタを介して蛍光検出
器で検出し、ブランクのマイクロアレイチップの基板か
ら発生するバックグラウンドの蛍光強度が減衰する時間
を求め、測定対象となるマイクロアレイチップに前記第
１のフィルタを透過した励起光を照射し、前記マイクロ
アレイチップから発生する蛍光を、前記バックグラウン
ドの蛍光が減衰する時間を経過した後で、前記第２のフ
ィルタを介して蛍光検出器で検出することを特徴とする
ものである。According to a third aspect of the present invention, there is provided a method of reading a microarray chip, comprising selecting an excitation wavelength optimum for a fluorescent label based on the type of the fluorescent label attached to the sample, and transmitting the light of the wavelength. The filter is set at a predetermined position, a detection wavelength optimal for the fluorescent label is selected, a second filter that transmits light of the wavelength is set at a predetermined position, and the first filter is mounted on a blank microarray chip substrate.
The excitation light transmitted through the filter is irradiated, and the fluorescence generated from the substrate itself is detected by the fluorescence detector through the second filter, and the intensity of the background fluorescence generated from the substrate of the blank microarray chip is attenuated. Determine the time to perform, irradiate the excitation light transmitted through the first filter to the microarray chip to be measured, the fluorescence generated from the microarray chip, after elapse of the time the background fluorescence is attenuated, The detection is performed by a fluorescence detector via the second filter.
【００１１】請求項４に記載の発明は、蛍光標識を用い
たマイクロアレイチップの読取装置であって、測定対象
となるマイクロアレイチップに励起光を照射する励起光
源と、検体に付けた蛍光標識を励起するのに適する波長
の光を選択的に透過する第１のフィルタと、検体に付け
た蛍光標識を検出するのに適する波長の光を選択的に透
過する第２のフィルタと、前記測定対象となるマイクロ
アレイチップから発生した蛍光を前記第２のフィルタに
導くためのハーフミラーと、マイクロアレイチップから
発生した蛍光を検出する蛍光検出器と、測定対象となる
マイクロアレイチップの基板自体から発生するバックグ
ラウンドの蛍光と、検体に付けた蛍光標識から発生する
蛍光とを、両蛍光の検出時間をずらすことによって分離
して検出するように制御する制御部とを備えたことを特
徴とするものである。According to a fourth aspect of the present invention, there is provided a microarray chip reader using a fluorescent label, wherein an excitation light source for irradiating a microarray chip to be measured with excitation light and a fluorescent label attached to a sample are excited. A first filter that selectively transmits light having a wavelength suitable for performing the measurement, a second filter that selectively transmits light having a wavelength that is suitable for detecting a fluorescent label attached to the specimen, A half mirror for guiding the fluorescence generated from the microarray chip to the second filter, a fluorescence detector for detecting the fluorescence generated from the microarray chip, and a background generated from the substrate of the microarray chip to be measured. Fluorescence and fluorescence generated from the fluorescent label attached to the sample are detected separately by staggering the detection time of both fluorescence. It is characterized in that a control unit for controlling.
【００１２】請求項５に記載の発明は、請求項４に記載
のマイクロアレイチップの読取装置において、前記制御
部が、測定対象となるマイクロアレイチップから発生す
る蛍光を、前記バックグラウンドの蛍光が減衰する時間
を経過した後で測定するように制御することを特徴とす
るものである。According to a fifth aspect of the present invention, in the microarray chip reader according to the fourth aspect, the control unit attenuates the fluorescence generated from the microarray chip to be measured and the background fluorescence. It is characterized in that the measurement is performed after a lapse of time.
【００１３】上記の構成を有する請求項１乃至請求項５
に記載の発明によれば、マイクロアレイチップの基板自
体から発生するバックグラウンドの蛍光が減衰した後
に、ユーロピューム等の蛍光寿命の長い蛍光標識から発
生する蛍光のみを検出することができるので、マイクロ
アレイチップの基板自体から発生するバックグラウンド
の蛍光の影響を受けずに、検体に付けた蛍光標識から発
生する蛍光だけを高精度に読み取ることができる。[0013] Claims 1 to 5 having the above configuration.
According to the invention described in the above, after the background fluorescence generated from the substrate itself of the microarray chip is attenuated, it is possible to detect only the fluorescence generated from the fluorescent label having a long fluorescence lifetime such as europume, so that the microarray chip Only the fluorescence generated from the fluorescent label attached to the specimen can be read with high accuracy without being affected by the background fluorescence generated from the substrate itself.
【００１４】[0014]
【発明の実施の形態】以下、本発明の一つの実施の形態
について、図面を参照して具体的に説明する。なお、以
下に述べる実施形態は、ＤＮＡチップを例としたもので
ある。DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS One embodiment of the present invention will be specifically described below with reference to the drawings. The embodiment described below is an example of a DNA chip.
【００１５】（１）構成 （１−１）全体構成 図１は本発明に係るマイクロアレイチップ読取装置の全
体構成を示した概略図である。すなわち、１は励起光源
（キセノンフラッシュランプ等）、２は励起波長選択フ
ィルタ、３はハーフミラー、４は測定対象となるＤＮＡ
チップ、５は検出波長選択フィルタ、６はＣＣＤカメラ
等の蛍光検出器、７は本装置の制御部である。(1) Configuration (1-1) Overall Configuration FIG. 1 is a schematic diagram showing the overall configuration of a microarray chip reader according to the present invention. That is, 1 is an excitation light source (such as a xenon flash lamp), 2 is an excitation wavelength selection filter, 3 is a half mirror, and 4 is a DNA to be measured.
A chip 5, a detection wavelength selection filter 6, a fluorescence detector 6 such as a CCD camera, and a control unit 7 of the present apparatus.
【００１６】そして、励起光源１から出射された励起光
のうち、検体ＤＮＡに付けた蛍光標識に最適な励起波長
の光が励起波長選択フィルタ２によって選択された後、
その励起波長を有する励起光がハーフミラー３を通過し
てＤＮＡチップ４に照射される。すると、蛍光標識が付
いた検体ＤＮＡが結合した部分と、ＤＮＡチップ基板自
体から蛍光が発生する。この蛍光はハーフミラー３で反
射され、検出波長選択フィルタ５により検出に最適な波
長が選択されて通過し、ＣＣＤカメラ６によりＤＮＡチ
ップ４から発生する蛍光強度の分布が映像として得られ
る。After the light having the optimum excitation wavelength for the fluorescent label attached to the sample DNA among the excitation lights emitted from the excitation light source 1 is selected by the excitation wavelength selection filter 2,
The excitation light having the excitation wavelength passes through the half mirror 3 and irradiates the DNA chip 4. Then, fluorescence is generated from the portion where the fluorescently labeled sample DNA is bound and the DNA chip substrate itself. The fluorescence is reflected by the half mirror 3, the wavelength optimal for detection is selected and passed by the detection wavelength selection filter 5, and the distribution of the fluorescence intensity generated from the DNA chip 4 is obtained as an image by the CCD camera 6.
【００１７】この場合、本実施形態においては、測定対
象となるＤＮＡチップから発生する蛍光を測定するの
は、ＤＮＡチップ基板自体から発生する蛍光が減衰する
所定の時間を経過した後に行われ、後述するようなデー
タ処理によって蛍光強度の分布が数値化されるように構
成されている。In this case, in the present embodiment, the measurement of the fluorescence generated from the DNA chip to be measured is performed after a lapse of a predetermined time during which the fluorescence generated from the DNA chip substrate itself is attenuated. The distribution of the fluorescence intensity is digitized by such data processing.
【００１８】なお、検体ＤＮＡに付ける蛍光寿命の長い
蛍光標識としては、Ｅｕ（ユーロピューム）、Ｓｍ（サ
マリウム）、Ｔｂ（テルビウム）、Ｄｙ（ディスプロシ
ウム）等を用いることができる。また、ＤＮＡチップ基
板に配列したスポット状のＤＮＡに蛍光標識を付けた検
体ＤＮＡが結合すると、そのスポットから蛍光が発生す
るので、ＣＣＤカメラによる映像には、その蛍光を発生
したスポットが点状に撮影される。この蛍光強度の数値
化は、スポット状の蛍光の中心部分の蛍光強度をＡ／Ｄ
変換することにより行われるように構成されている。As a fluorescent label having a long fluorescence lifetime attached to the sample DNA, Eu (Europyme), Sm (Samarium), Tb (Terbium), Dy (Dysprosium) and the like can be used. In addition, when specimen DNA labeled with fluorescence is bound to spot-shaped DNA arranged on the DNA chip substrate, fluorescence is generated from that spot. Be photographed. This numerical conversion of the fluorescence intensity is performed by converting the fluorescence intensity of the central part of the spot-like fluorescence from A / D.
It is configured to perform the conversion.
【００１９】（１−２）制御部の構成 図２は、上記制御部７の構成を示す機能ブロック図であ
る。すなわち、制御部７には、検体ＤＮＡに付けた蛍光
標識の種類を入力したり、本装置による検出結果を外部
の処理装置に出力する入出力部１１と、検体ＤＮＡに付
けた蛍光標識に最適な励起波長を選択する励起波長選択
部１２と、検出に最適な波長を選択する検出波長選択部
１３と、これらの波長選択部１２，１３によって選択さ
れた最適波長の光を透過するフィルタを選択して所定の
位置にセットするフィルタ選択部１４と、所定のタイミ
ングで励起光源をＯＮ／ＯＦＦする励起光源操作部１５
と、ＣＣＤカメラ等の蛍光検出器を操作する検出器操作
部１６と、蛍光検出器によって得られた画像データを記
憶する画像データ記憶部１７と、その画像データに所定
の処理（蛍光量を数値化、積分、経時変化データに変換
等）を施すデータ処理部１８と、励起光源が遮断されて
から後の時間を計測する経時部１９と、測定対象となる
ＤＮＡチップを所望の測定位置に移動させる基板駆動部
２０とを備えている。(1-2) Configuration of Control Unit FIG. 2 is a functional block diagram showing the configuration of the control unit 7. That is, the input / output unit 11 for inputting the type of the fluorescent label attached to the sample DNA to the control unit 7 and outputting the detection result by the present apparatus to an external processing device, and the control unit 7 is optimal for the fluorescent label attached to the sample DNA. An excitation wavelength selection unit 12 for selecting a suitable excitation wavelength, a detection wavelength selection unit 13 for selecting an optimal wavelength for detection, and a filter that transmits light of the optimal wavelength selected by these wavelength selection units 12 and 13. A filter selection unit 14 for setting the excitation light source to a predetermined position and an excitation light source operation unit 15 for turning on / off the excitation light source at a predetermined timing
A detector operation unit 16 for operating a fluorescence detector such as a CCD camera; an image data storage unit 17 for storing image data obtained by the fluorescence detector; , Integration, conversion into time-varying data, etc.), a time-lapse unit 19 that measures the time after the excitation light source is cut off, and a DNA chip to be measured is moved to a desired measurement position. And a substrate driving unit 20 for performing the operation.
【００２０】なお、上記励起波長選択部１２及び検出波
長選択部１３は、検体ＤＮＡに付ける蛍光標識に対する
最適励起波長や最適検出波長に関する情報が予め格納さ
れたデータベースから最適波長を選択するように構成さ
れている。The excitation wavelength selection section 12 and the detection wavelength selection section 13 are configured to select the optimum wavelength from a database in which information on the optimum excitation wavelength and the optimum detection wavelength for the fluorescent label attached to the sample DNA is stored in advance. Have been.
【００２１】（１−３）蛍光標識を付けた検体ＤＮＡが
結合した部分から発生する蛍光と、ＤＮＡチップ基板自
体から発生する蛍光を分離するタイミング 図３は、ＤＮＡチップに励起光を照射し、その後に励起
光を遮断した場合に検出された蛍光強度を経時的に表し
たものである。図から明らかなように、励起光を遮断し
た直後に検出される蛍光は、約１００マイクロ秒程度を
経過するまでに急激に減少し、その後、約１ミリ秒程度
を経過するまでに徐々に減少する。これは、励起光を遮
断した際に、ＤＮＡチップ基板自体から発生するバック
グラウンドの蛍光は、約１００マイクロ秒程度を経過す
るまでに減衰してしまうのに対して、ユーロピューム等
の蛍光寿命の長い蛍光標識から発生する蛍光は、約１ミ
リ秒程度まで蛍光を発生しているためであることが分か
った。(1-3) Timing of Separating Fluorescence Generated from Fluorescence-Labeled Specimen DNA-Binding Portion and Fluorescence Generated from DNA Chip Substrate itself FIG. Thereafter, the intensity of fluorescence detected when the excitation light is cut off is shown over time. As is clear from the figure, the fluorescence detected immediately after the excitation light was cut off sharply decreased by about 100 microseconds, and then gradually decreased by about 1 millisecond. I do. This is because, when the excitation light is cut off, the background fluorescence generated from the DNA chip substrate itself is attenuated until about 100 microseconds elapse, whereas the fluorescence lifetime of europume or the like is long. It was found that the fluorescence generated from the fluorescent label was due to the generation of fluorescence up to about 1 millisecond.
【００２２】すなわち、励起光を遮断した直後に検出さ
れる蛍光には、ＤＮＡチップ基板自体から発生するバッ
クグラウンドの蛍光と、検体ＤＮＡに付けたユーロピュ
ーム等の蛍光寿命の長い蛍光標識から発生する蛍光の両
方が含まれているが、所定の時間“Ｔａ”を経過した後
には、ＤＮＡチップ基板自体から発生するバックグラウ
ンドの蛍光は減衰し、検体ＤＮＡに付けた蛍光標識から
発生する蛍光のみを検出することができることが分かっ
た。本発明はこの知見に基づいてなされたものである。That is, the fluorescence detected immediately after the excitation light is cut off includes the background fluorescence generated from the DNA chip substrate itself and the fluorescence generated from a long-lived fluorescent label such as Europume attached to the sample DNA. After the predetermined time “Ta” has elapsed, the background fluorescence generated from the DNA chip substrate itself is attenuated, and only the fluorescence generated from the fluorescent label attached to the sample DNA is detected. I found that I could do it. The present invention has been made based on this finding.
【００２３】（２）作用 続いて、本実施形態のマイクロアレイチップ読取装置の
作用を図４に示したフローチャートに基づいて説明す
る。本装置の利用者によって入出力部１１に検体ＤＮＡ
に付けた蛍光標識の種類が入力されると（ステップ４０
１）、励起波長選択部１２によってその蛍光標識に最適
な励起波長が選択され（ステップ４０２）、フィルタ選
択部１４によってその波長の光を透過する励起波長選択
フィルタが所定の位置にセットされる（ステップ４０
３）。続いて、検出波長選択部１３によって検出に最適
な波長が選択され（ステップ４０４）、フィルタ選択部
１４によってその波長の光を透過する検出波長選択フィ
ルタが所定の位置にセットされる（ステップ４０５）。(2) Operation Next, the operation of the microarray chip reader of this embodiment will be described with reference to the flowchart shown in FIG. The sample DNA is input to the input / output unit 11 by the user of the apparatus.
When the type of the fluorescent label attached to is input (step 40)
1) The excitation wavelength selection unit 12 selects an excitation wavelength optimal for the fluorescent label (step 402), and the filter selection unit 14 sets an excitation wavelength selection filter that transmits light of that wavelength at a predetermined position (step 402). Step 40
3). Subsequently, a wavelength optimum for detection is selected by the detection wavelength selection unit 13 (step 404), and a detection wavelength selection filter that transmits light of that wavelength is set at a predetermined position by the filter selection unit 14 (step 405). .
【００２４】次に、プローブＤＮＡ及び検体ＤＮＡのい
ずれも付着させていないブランクのＤＮＡチップ基板を
所定の検出位置にセットし（ステップ４０６）、励起光
源操作部１５によって励起光源１をＯＮし、励起光を所
定時間照射した後（ステップ４０７）、励起光を遮断し
（ステップ４０８）、ＣＣＤカメラでＤＮＡチップ基板
から発生する蛍光を所定間隔毎に（例えば、１０μｓｅ
ｃ毎に）撮影する（ステップ４０９）。画像データ記憶
部１７によってそれらの画像データを記憶し（ステップ
４１０）、データ処理部１８によって各画像データにつ
いて、蛍光量を数値化したり、経時データに変換すると
いった所定のデータ処理を施し、ブランクのＤＮＡチッ
プ基板から発生する蛍光強度の経時変化を図示し（ステ
ップ４１１）、ブランクのＤＮＡチップ基板から発生す
る蛍光強度（バックグラウンド）が減衰する時間“Ｔ
ａ”を検出する（ステップ４１２）。Next, a blank DNA chip substrate to which neither the probe DNA nor the sample DNA is attached is set at a predetermined detection position (step 406), and the excitation light source 1 is turned on by the excitation light source operation unit 15, and the excitation light source is turned on. After irradiation with light for a predetermined time (step 407), the excitation light is cut off (step 408), and the fluorescence generated from the DNA chip substrate is emitted by the CCD camera at predetermined intervals (for example, 10 μs).
(for each c) (step 409). The image data is stored in the image data storage unit 17 (step 410), and the data processing unit 18 performs predetermined data processing on each image data, such as converting the amount of fluorescence into numerical data or converting it into time-dependent data. The change with time of the intensity of the fluorescence generated from the DNA chip substrate is illustrated (step 411), and the time “T” when the intensity of the fluorescence (background) generated from the blank DNA chip substrate decays is shown.
a "is detected (step 412).
【００２５】続いて、測定対象となるＤＮＡチップを所
定の検出位置にセットし（ステップ４１３）、１つのス
ポットを選択し（ステップ４１４）、励起光を所定時間
照射した後（ステップ４１５）、励起光を遮断し（ステ
ップ４１６）、経時部１９によって励起光を遮断した後
の経過時間を計測し、ステップ４１２で検出したバック
グラウンドの減衰時間“Ｔａ”を経過した後（ステップ
４１７）、ＣＣＤカメラでＤＮＡチップから発生する蛍
光を所定間隔ごとに撮影する（ステップ４１８）。それ
らの画像データを記憶し（ステップ４１９）、各画像デ
ータについて、蛍光量を数値化したり、経時データに変
換したり、所定時間内の蛍光量を積分するといった所定
のデータ処理を施す（ステップ４２０）。そして、すべ
てのスポットについて測定が終了したか否かを判断し
（ステップ４２１）、終了していない場合には、ステッ
プ４１４に戻り、それ以降の操作が繰り返し行われる。Subsequently, the DNA chip to be measured is set at a predetermined detection position (step 413), one spot is selected (step 414), and after excitation light is irradiated for a predetermined time (step 415), excitation is performed. The light is cut off (step 416), the elapsed time after the excitation light is cut off by the elapse unit 19 is measured, and after the background decay time “Ta” detected in step 412 has passed (step 417), the CCD camera Then, the fluorescence generated from the DNA chip is photographed at predetermined intervals (step 418). The image data is stored (step 419), and the image data is subjected to predetermined data processing such as digitizing the amount of fluorescence, converting the data into temporal data, and integrating the amount of fluorescence within a predetermined time (step 420). ). Then, it is determined whether or not the measurement has been completed for all the spots (step 421). If the measurement has not been completed, the process returns to step 414, and the subsequent operations are repeated.
【００２６】（３）効果 このように、本実施形態によれば、ＤＮＡチップ基板自
体から発生するバックグラウンドの蛍光が減衰した後
に、ユーロピューム等の蛍光寿命の長い蛍光標識から発
生する蛍光のみを検出することができるので、ＤＮＡチ
ップ基板自体から発生するバックグラウンドの蛍光の影
響を受けずに、検体ＤＮＡに付けた蛍光標識から発生す
る蛍光だけを高精度に読み取ることができる。特に、本
実施形態によれば、ＤＮＡチップ基板の材質、基板上の
微細な汚れや凹凸といった部分的な表面状態の違いによ
って検出データの精度が影響を受けるといった不具合を
無くすことができる。(3) Effect As described above, according to the present embodiment, after the background fluorescence generated from the DNA chip substrate itself is attenuated, only the fluorescence generated from a fluorescent label having a long fluorescence life such as europume is detected. Therefore, only the fluorescence generated from the fluorescent label attached to the sample DNA can be read with high accuracy without being affected by the background fluorescence generated from the DNA chip substrate itself. In particular, according to the present embodiment, it is possible to eliminate the problem that the accuracy of the detection data is affected by the difference in the material of the DNA chip substrate and the partial surface state such as minute dirt and unevenness on the substrate.
【００２７】（４）他の実施形態 なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではな
く、例えば、励起光源に窒素ガスレーザ等のパルスレー
ザを使用しても同様に実施することができる。また、波
長選択フィルタの交換は、制御部によって指示されたフ
ィルタを手動で交換するように構成しても良い。(4) Other Embodiments The present invention is not limited to the above-described embodiments, and can be similarly implemented, for example, by using a pulse laser such as a nitrogen gas laser as an excitation light source. . The replacement of the wavelength selection filter may be configured to manually replace the filter specified by the control unit.
【００２８】また、蛍光検出器としては、通常のＣＣＤ
カメラの他、ＣＭＯＳ型カメラ、冷却型ＣＣＤカメラ、
イメージインテンシファイアを付加したＣＣＤカメラ、
撮像管等を用いることができ、ＤＮＡチップの移動方
向、移動速度、駆動手段は、上記蛍光検出器の検出精度
等との関係から適宜設定することができる。その他、本
発明はその要旨を逸脱しない範囲で、蛍光標識を付けた
検体の結合量の検出方法として、種々変形して実施する
ことができる。As a fluorescence detector, an ordinary CCD is used.
In addition to cameras, CMOS cameras, cooled CCD cameras,
CCD camera with image intensifier,
An imaging tube or the like can be used, and the moving direction, the moving speed, and the driving means of the DNA chip can be appropriately set in relation to the detection accuracy of the fluorescence detector and the like. In addition, the present invention can be variously modified and implemented as a method for detecting the amount of binding of a fluorescently labeled specimen without departing from the gist thereof.
【００２９】[0029]
【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、マ
イクロアレイチップの基板自体から発生するバックグラ
ウンドの蛍光が減衰した後に、蛍光寿命の長い蛍光標識
から発生する蛍光のみを検出することができるので、マ
イクロアレイチップの基板自体から発生するバックグラ
ウンドの蛍光の影響を受けずに、検体に付けた蛍光標識
から発生する蛍光だけを高精度に読み取ることができる
マイクロアレイチップの読取方法及びその装置を提供す
ることができる。As described above, according to the present invention, after the background fluorescence generated from the substrate of the microarray chip is attenuated, only the fluorescence generated from the fluorescent label having a long fluorescence lifetime can be detected. A microarray chip reading method and apparatus capable of reading only fluorescence generated from a fluorescent label attached to a sample with high accuracy without being affected by background fluorescence generated from the substrate of the microarray chip itself. Can be provided.
【図１】本発明に係るマイクロアレイチップの読取装置
の一実施形態の構成を示す概略図FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of an embodiment of a microarray chip reader according to the present invention.
【図２】本発明に係るマイクロアレイチップの読取装置
の制御部の構成を示す機能ブロック図FIG. 2 is a functional block diagram showing a configuration of a control unit of the microarray chip reader according to the present invention.
【図３】ＤＮＡチップ基板自体から発生するバックグラ
ウンドの蛍光と、蛍光寿命の長い蛍光標識から発生する
蛍光を分離するタイミングを示した図FIG. 3 is a diagram showing timing for separating background fluorescence generated from a DNA chip substrate itself and fluorescence generated from a fluorescent label having a long fluorescence lifetime.
【図４】本発明に係るマイクロアレイチップの読取装置
における処理の流れを示すフローチャートFIG. 4 is a flowchart showing the flow of processing in the microarray chip reading device according to the present invention.
１…励起光源 ２…励起波長選択フィルタ ３…ハーフミラー ４…ＤＮＡチップ ５…検出波長選択フィルタ ６…ＣＣＤカメラ ７…制御部 １１…入出力部 １２…励起波長選択部 １３…検出波長選択部 １４…フィルタ選択部 １５…励起光源操作部 １６…検出器操作部 １７…画像データ記憶部 １８…データ処理部 １９…経時部 ２０…基板駆動部 REFERENCE SIGNS LIST 1 excitation light source 2 excitation wavelength selection filter 3 half mirror 4 DNA chip 5 detection wavelength selection filter 6 CCD camera 7 control unit 11 input / output unit 12 excitation wavelength selection unit 13 detection wavelength selection unit 14 ... Filter selection unit 15 ... Excitation light source operation unit 16 ... Detector operation unit 17 ... Image data storage unit 18 ... Data processing unit 19 ... Elapsed time unit 20 ... Substrate drive unit
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 33/58 Ａ 33/58 37/00 １０２ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ Ｆターム(参考） 2G043 AA03 AA04 BA16 CA03 DA02 EA01 FA03 GA08 GB21 JA03 LA03 MA01 NA06 2G045 DA12 DA13 FB07 FB12 GC15 4B024 AA11 AA19 AA20 CA09 HA11 HA13 HA14 HA20 4B029 AA07 AA23 BB15 BB20 CC02 CC03 CC08 CC11 FA12 FA15 4B063 QA01 QQ41 QQ79 QR56 QR66 QS32 QS36 QS39 QX02 Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat II (reference) G01N 33/53 G01N 33/566 33/566 33/58 A 33/58 37/00 102 37/00 102 C12N 15/00 FF term (reference) 2G043 AA03 AA04 BA16 CA03 DA02 EA01 FA03 GA08 GB21 JA03 LA03 MA01 NA06 2G045 DA12 DA13 FB07 FB12 GC15 4B024 AA11 AA19 AA20 CA09 HA11 HA13 HA14 HA20 4B029 AA07 AA23 BB15 Q08 CCB CC CC QR56 QR66 QS32 QS36 QS39 QX02
Claims (5)
の読取方法において、 マイクロアレイチップの基板自体から発生するバックグ
ラウンドの蛍光と、検体に付けた蛍光標識から発生する
蛍光を、両蛍光の検出時間をずらすことによって分離し
て検出するようにしたことを特徴とするマイクロアレイ
チップの読取方法。1. A method for reading a microarray chip using a fluorescent label, wherein the detection time of the fluorescence of the background is generated from the substrate of the microarray chip itself and the fluorescence of the fluorescent label generated on the sample is shifted. A method for reading a microarray chip, wherein the detection is performed separately.
の読取方法において、 マイクロアレイチップの基板自体から発生するバックグ
ラウンドの蛍光が減衰する時間を求め、その減衰時間が
経過した後で、検体に付けた蛍光標識から発生する蛍光
を測定するようにしたことを特徴とするマイクロアレイ
チップの読取方法。2. A method for reading a microarray chip using a fluorescent label, wherein the time required for background fluorescence generated from the substrate of the microarray chip itself to decay is determined, and after the lapse of the decay time, the fluorescence attached to the sample is determined. A method for reading a microarray chip, wherein fluorescence generated from a label is measured.
その蛍光標識に最適な励起波長を選択して、その波長の
光を透過する第１のフィルタを所定位置にセットすると
共に、その蛍光標識に最適な検出波長を選択して、その
波長の光を透過する第２のフィルタを所定位置にセット
し、 ブランクのマイクロアレイチップの基板に前記第１のフ
ィルタを透過した励起光を照射し、前記基板自体から発
生する蛍光を前記第２のフィルタを介して蛍光検出器で
検出し、ブランクのマイクロアレイチップの基板から発
生するバックグラウンドの蛍光強度が減衰する時間を求
め、 測定対象となるマイクロアレイチップに前記第１のフィ
ルタを透過した励起光を照射し、前記マイクロアレイチ
ップから発生する蛍光を、前記バックグラウンドの蛍光
が減衰する時間を経過した後で、前記第２のフィルタを
介して蛍光検出器で検出することを特徴とするマイクロ
アレイチップの読取方法。3. An excitation wavelength optimal for the fluorescent label is selected based on the type of the fluorescent label attached to the sample, a first filter transmitting light of the wavelength is set at a predetermined position, and the fluorescence Selecting a detection wavelength that is optimal for the label, setting a second filter that transmits light of that wavelength at a predetermined position, and irradiating a blank microarray chip substrate with excitation light that has passed through the first filter, The fluorescence generated from the substrate itself is detected by the fluorescence detector through the second filter, and the time required for the background fluorescence intensity generated from the substrate of the blank microarray chip to decay is determined. Is irradiated with the excitation light transmitted through the first filter, and the fluorescence generated from the microarray chip is attenuated by the background fluorescence. After a lapse of time, microarray chip reading method of and detecting a fluorescence detector via the second filter.
の読取装置であって、 測定対象となるマイクロアレイチップに励起光を照射す
る励起光源と、 検体に付けた蛍光標識を励起するのに適する波長の光を
選択的に透過する第１のフィルタと、 検体に付けた蛍光標識を検出するのに適する波長の光を
選択的に透過する第２のフィルタと、 前記測定対象となるマイクロアレイチップから発生した
蛍光を前記第２のフィルタに導くためのハーフミラー
と、 マイクロアレイチップから発生した蛍光を検出する蛍光
検出器と、 測定対象となるマイクロアレイチップの基板自体から発
生するバックグラウンドの蛍光と、検体に付けた蛍光標
識から発生する蛍光とを、両蛍光の検出時間をずらすこ
とによって分離して検出するように制御する制御部とを
備えたことを特徴とするマイクロアレイチップの読取装
置。4. A microarray chip reader using a fluorescent label, comprising: an excitation light source for irradiating the microarray chip to be measured with excitation light; and a light having a wavelength suitable for exciting the fluorescent label attached to the sample. A first filter that selectively transmits light, a second filter that selectively transmits light having a wavelength suitable for detecting a fluorescent label attached to the sample, and a fluorescent light generated from the microarray chip to be measured. To the second filter, a fluorescence detector for detecting fluorescence generated from the microarray chip, background fluorescence generated from the substrate of the microarray chip to be measured, and A control unit that controls the fluorescence generated from the fluorescent label to be separated and detected by staggering the detection time of both fluorescence. A reading device for a microarray chip, comprising:
アレイチップから発生する蛍光を、前記バックグラウン
ドの蛍光が減衰する時間を経過した後で測定するように
制御することを特徴とする請求項４に記載のマイクロア
レイチップの読取装置。5. The control unit according to claim 4, wherein the control unit controls to measure the fluorescence generated from the microarray chip to be measured after a lapse of the time for the background fluorescence to attenuate. A reading device for a microarray chip according to claim 1.
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|---|---|---|---|
| JP2000379833A JP2002181708A (en) | 2000-12-14 | 2000-12-14 | Microarray chip reading method and apparatus therefor |
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|---|---|
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| JP (1) | JP2002181708A (en) |
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- 2000-12-14 JP JP2000379833A patent/JP2002181708A/en active Pending
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