JP2002179579A - アポトーシスを誘導する多糖類の生物学的利用方法。 - Google Patents
アポトーシスを誘導する多糖類の生物学的利用方法。Info
- Publication number
- JP2002179579A JP2002179579A JP2000379937A JP2000379937A JP2002179579A JP 2002179579 A JP2002179579 A JP 2002179579A JP 2000379937 A JP2000379937 A JP 2000379937A JP 2000379937 A JP2000379937 A JP 2000379937A JP 2002179579 A JP2002179579 A JP 2002179579A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- apoptosis
- polysaccharide
- cells
- inducing
- polysaccharides
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 細胞のアポトーシスを誘導するために、微生
物の作る多糖類を利用すること。 【解決手段】 シュードモナスの培養物から分離精製し
た式（１）で示される 多糖類が、アポトーシス誘導剤として効果のあることを
明らかにすることにより、前記課題を解決した。本多糖
類は具体的には医薬、例えば悪性腫瘍、自己免疫疾患、
炎症等の治療薬としての用途が期待される。
物の作る多糖類を利用すること。 【解決手段】 シュードモナスの培養物から分離精製し
た式（１）で示される 多糖類が、アポトーシス誘導剤として効果のあることを
明らかにすることにより、前記課題を解決した。本多糖
類は具体的には医薬、例えば悪性腫瘍、自己免疫疾患、
炎症等の治療薬としての用途が期待される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】 本発明は医薬の分野で有用
であり、より具体的には細胞の新陳代謝等に関係深いア
ポトーシス誘導剤としての多糖類の利用方法に関するも
のである。
であり、より具体的には細胞の新陳代謝等に関係深いア
ポトーシス誘導剤としての多糖類の利用方法に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】 生物体を構成する細胞の死滅は、アポ
トーシス(apoptosis)とネクローシス(necrosis)の二つ
に大別される。ネクローシスは、環境の悪化又は細胞の
物理的障害により惹起される細胞死であり、一方、アポ
トーシスは、これと異なり、積極的に制御されている細
胞死のことである[ササダ(M.Sasada)：血液フロンティ
ア, 10, 1367-1372(2000)参照]。
トーシス(apoptosis)とネクローシス(necrosis)の二つ
に大別される。ネクローシスは、環境の悪化又は細胞の
物理的障害により惹起される細胞死であり、一方、アポ
トーシスは、これと異なり、積極的に制御されている細
胞死のことである[ササダ(M.Sasada)：血液フロンティ
ア, 10, 1367-1372(2000)参照]。
【０００３】近年、このアポトーシスによる細胞死が、
生物学、医学等の基礎研究分野、医薬品製造等の工業分
野において注目を集めている。その理由は、アポトーシ
スが胎生期の発達過程における形態器官形成、正常細胞
の回転、免疫系の構築と維持、ホルモンに依存した細胞
死制御などの生理的現象において、又病理的現象として
は放射線や薬物による細胞死、ウイルス感染による細胞
死など、さらに種々疾患との深い関連など極めて広範囲
かつ重要なことが明らかにされつつあること。各種の抗
がん剤がアポトーシスでがん細胞破壊を行うこと、及び
最近の遺伝子研究の進展に伴い、アポトーシスそのもの
がどのような遺伝子で制御されており、アポトーシスに
到る情報がどのようにして伝達されるかについての知見
が蓄積され、細胞生物学上の基本的興味がもたれたこ
と、等である[ムラテ(T.Murate)：血液フロンティア、1
0, 1373-1381(2000)及びユオ(Yuo)：血液フロンティア,
10, 1383-1395(2000)参照]。
生物学、医学等の基礎研究分野、医薬品製造等の工業分
野において注目を集めている。その理由は、アポトーシ
スが胎生期の発達過程における形態器官形成、正常細胞
の回転、免疫系の構築と維持、ホルモンに依存した細胞
死制御などの生理的現象において、又病理的現象として
は放射線や薬物による細胞死、ウイルス感染による細胞
死など、さらに種々疾患との深い関連など極めて広範囲
かつ重要なことが明らかにされつつあること。各種の抗
がん剤がアポトーシスでがん細胞破壊を行うこと、及び
最近の遺伝子研究の進展に伴い、アポトーシスそのもの
がどのような遺伝子で制御されており、アポトーシスに
到る情報がどのようにして伝達されるかについての知見
が蓄積され、細胞生物学上の基本的興味がもたれたこ
と、等である[ムラテ(T.Murate)：血液フロンティア、1
0, 1373-1381(2000)及びユオ(Yuo)：血液フロンティア,
10, 1383-1395(2000)参照]。
【０００４】以上のような知見は、アポトーシスを誘導
することによって、その存在が生体にとって望ましくな
い細胞、例えば自己免疫疾患患者の自己反応性リンパ
球、アレルギー患者のアレルゲンに感作されたリンパ
球、がん細胞等を排除することが可能であることを示し
ており、そのためにアポトーシス誘導剤の果たす役割が
期待されている。又外部からの細菌やウイルスのアポト
ーシスを誘導することにより、細菌からの感染治療を促
したり、あるいは、皮膚の表皮細胞のアポトーシスを誘
導することにより皮膚の新陳代謝を促進することができ
ると考えられる。従って、アポトーシスを制御する因子
や薬剤を開発し、これらの疾患の治療に応用する可能性
を探る動きも起こってきている。しかし、その数はまだ
少なく、新たな化合物の提供が望まれている。
することによって、その存在が生体にとって望ましくな
い細胞、例えば自己免疫疾患患者の自己反応性リンパ
球、アレルギー患者のアレルゲンに感作されたリンパ
球、がん細胞等を排除することが可能であることを示し
ており、そのためにアポトーシス誘導剤の果たす役割が
期待されている。又外部からの細菌やウイルスのアポト
ーシスを誘導することにより、細菌からの感染治療を促
したり、あるいは、皮膚の表皮細胞のアポトーシスを誘
導することにより皮膚の新陳代謝を促進することができ
ると考えられる。従って、アポトーシスを制御する因子
や薬剤を開発し、これらの疾患の治療に応用する可能性
を探る動きも起こってきている。しかし、その数はまだ
少なく、新たな化合物の提供が望まれている。
【０００５】このうち、多糖類に関係するものとして
は、例えばヘパリンがヒトリンパ芽球のアポトーシスを
強く誘導すること[エルドラン(E.Erduran)ら：American
Journal of Hematology, 61, 90-93(1999)参照]や、海
洋微細藻類の生産する硫酸多糖類がヒト白血病培養細胞
K562に対しいてアポトーシス誘導作用のあることが知ら
れている[ソガワ(K.Sogawa)ら：Journal of Marine Bio
technology, 6, 241-243(1998)参照]。
は、例えばヘパリンがヒトリンパ芽球のアポトーシスを
強く誘導すること[エルドラン(E.Erduran)ら：American
Journal of Hematology, 61, 90-93(1999)参照]や、海
洋微細藻類の生産する硫酸多糖類がヒト白血病培養細胞
K562に対しいてアポトーシス誘導作用のあることが知ら
れている[ソガワ(K.Sogawa)ら：Journal of Marine Bio
technology, 6, 241-243(1998)参照]。
【０００６】電子顕微鏡を用いた形態学的観察によれ
ば、アポトーシスによる細胞死では、染色体の凝集、細
胞核の断片化、細胞表面の微絨毛の消失、細胞質の凝縮
が観察され、アポトーシスにより死滅した細胞は、速や
かにマクロフアージ等に貪食されて処理されることが明
らかにされている。また、染色体DNAの断片化等の生化
学的特徴を伴うアポトーシスが観察されることが多いこ
とも良く知られている。
ば、アポトーシスによる細胞死では、染色体の凝集、細
胞核の断片化、細胞表面の微絨毛の消失、細胞質の凝縮
が観察され、アポトーシスにより死滅した細胞は、速や
かにマクロフアージ等に貪食されて処理されることが明
らかにされている。また、染色体DNAの断片化等の生化
学的特徴を伴うアポトーシスが観察されることが多いこ
とも良く知られている。
【０００７】一方、構造式(I)で示される硫酸多糖類
は、海洋微生物の培養液から分離精製された化合物であ
り、ある主のウイルスに対して弱い抗ウイルス活性をを
示すことが知られている[マツダ(M.Matsuda)ら：日本水
産学会誌, 59, 535-538(1993)及びマツダ(M.Matsuda)
ら：Marine Biotechnology, 1, 68-73(1999)参照]。し
かしながら、その生物活性とくにアポトーシス誘導作用
を有することは知られておらず、文献にも記載されてい
ない。
は、海洋微生物の培養液から分離精製された化合物であ
り、ある主のウイルスに対して弱い抗ウイルス活性をを
示すことが知られている[マツダ(M.Matsuda)ら：日本水
産学会誌, 59, 535-538(1993)及びマツダ(M.Matsuda)
ら：Marine Biotechnology, 1, 68-73(1999)参照]。し
かしながら、その生物活性とくにアポトーシス誘導作用
を有することは知られておらず、文献にも記載されてい
ない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】 本発明は、海洋微生
物の培養物から分離精製した多糖類をアポトーシス誘導
剤として開発し提供することを目的とする。
物の培養物から分離精製した多糖類をアポトーシス誘導
剤として開発し提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】 本発明者等は、種々の
化合物について探索した結果、海洋微生物の生産する多
糖類にアポトーシスを誘導する作用を持つことを見出
し、本発明を完成した。
化合物について探索した結果、海洋微生物の生産する多
糖類にアポトーシスを誘導する作用を持つことを見出
し、本発明を完成した。
【００１０】本発明で使用した多糖類は、文献[上記マ
ツダ(M.Matsuda)ら：1993] に記載されている硫酸多糖
類と同じもので、場合により薬理及び製薬上容認できる
その塩である。
ツダ(M.Matsuda)ら：1993] に記載されている硫酸多糖
類と同じもので、場合により薬理及び製薬上容認できる
その塩である。
【００１１】即ち、本発明は上記構造式(I)で表される
多糖類又は生理学的に許容されうるその塩のアポトーシ
ス誘導剤としての利用に関するものである。
多糖類又は生理学的に許容されうるその塩のアポトーシ
ス誘導剤としての利用に関するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】 本発明で使用する多糖類を生産
する能力のある微生物としては、海洋性シユードモナス
(Pseudomonas)属の微生物が挙げられ、より具体的には
シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)WAK-1が挙
げられる。本株は香川大学農学部生物資源食糧化学科松
田研究室に保存されている[マツダ(M.Matsuda)ら：日本
水産学会誌, 58, 1735-1741(1992)参照]。
する能力のある微生物としては、海洋性シユードモナス
(Pseudomonas)属の微生物が挙げられ、より具体的には
シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)WAK-1が挙
げられる。本株は香川大学農学部生物資源食糧化学科松
田研究室に保存されている[マツダ(M.Matsuda)ら：日本
水産学会誌, 58, 1735-1741(1992)参照]。
【００１３】なお、該多糖類の生産株シュードモナス・
エスピー(Pseudomonas sp.)WAK-1に因んで、上記構造
式(I)で示される多糖類をを以下WAK-APOと称する。
エスピー(Pseudomonas sp.)WAK-1に因んで、上記構造
式(I)で示される多糖類をを以下WAK-APOと称する。
【００１４】海洋性シュードモナス(Pseudomonas)属の
菌株を栄養源含有培地に接種して発育させることによ
り、WAK-APOを含む培養物が得られる。培地は前記微生
物が資化できる炭素源、窒素源及び生育に必要な各種無
機塩等の栄養源を含む液体培地が好ましい。具体的に
は、例えば、炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、シュクロース等が挙げられ、単独又は混合物として
用いられる。窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、
ポリペプトン、その他の有機物あるいは無機物等が挙げ
られ、単独又は混合物として用いられる。無機塩として
は、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、又は各種リン酸
塩等を使用することができる。その他、必要に応じて、
鉄、マンガン、亜鉛、コバルト等の重金属塩を微量添加
することもできる。また、海水で調製した培地が好まし
いが、人工海水や2〜3重量%の食塩水でも良い。
菌株を栄養源含有培地に接種して発育させることによ
り、WAK-APOを含む培養物が得られる。培地は前記微生
物が資化できる炭素源、窒素源及び生育に必要な各種無
機塩等の栄養源を含む液体培地が好ましい。具体的に
は、例えば、炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、シュクロース等が挙げられ、単独又は混合物として
用いられる。窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、
ポリペプトン、その他の有機物あるいは無機物等が挙げ
られ、単独又は混合物として用いられる。無機塩として
は、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、又は各種リン酸
塩等を使用することができる。その他、必要に応じて、
鉄、マンガン、亜鉛、コバルト等の重金属塩を微量添加
することもできる。また、海水で調製した培地が好まし
いが、人工海水や2〜3重量%の食塩水でも良い。
【００１５】培養方法としては、一般の微生物の代謝産
物生産方法と同様に行えばよく、固体培養でも液体培養
でも良いが、液体培養がより好ましい。液体培養の場合
は、攪拌培養、振盪培養又は通気培養等のいずれを実施
しても良いが、実質的に振盪の条件で培養すれば、培養
物中に本発明で使用する硫酸多糖類が選択的に生成蓄積
する(特願2000-265079参照)。発泡の激しい場合には、
消泡剤として例えば大豆油等の植物油、オクタデカノー
ル等の高次アルコール類、各種シリコン化合物等を適宜
添加しても良い。
物生産方法と同様に行えばよく、固体培養でも液体培養
でも良いが、液体培養がより好ましい。液体培養の場合
は、攪拌培養、振盪培養又は通気培養等のいずれを実施
しても良いが、実質的に振盪の条件で培養すれば、培養
物中に本発明で使用する硫酸多糖類が選択的に生成蓄積
する(特願2000-265079参照)。発泡の激しい場合には、
消泡剤として例えば大豆油等の植物油、オクタデカノー
ル等の高次アルコール類、各種シリコン化合物等を適宜
添加しても良い。
【００１６】培養は通常pHは6.0〜8.0、好ましくは6.5
〜7.5の範囲で、温度は15〜35℃、好ましくは25〜30℃
が適当である。培養時間は本発明で用いる多糖類の生産
が最大に達する期間が選ばれるが、通常は48〜144時
間、好ましくは72〜96時間である。
〜7.5の範囲で、温度は15〜35℃、好ましくは25〜30℃
が適当である。培養時間は本発明で用いる多糖類の生産
が最大に達する期間が選ばれるが、通常は48〜144時
間、好ましくは72〜96時間である。
【００１７】このようにして得られた培養物中には、本
発明で使用する多糖類が含まれている。該多糖類の採取
に当たっては、WAK-APOは菌体外に存在するので、予め
培養物中の菌体や他の固形成分を除去した後、通常の分
離手段、例えば溶媒沈殿法、イオン交換樹脂法又は吸着
若しくは分配クロマトグラフィー法及びゲル濾過法、透
析、凍結乾燥法等多糖類を不純物から回収するために通
常使用されている手段を単独にあるいは適宜組み合わせ
ることによって分離精製できる。
発明で使用する多糖類が含まれている。該多糖類の採取
に当たっては、WAK-APOは菌体外に存在するので、予め
培養物中の菌体や他の固形成分を除去した後、通常の分
離手段、例えば溶媒沈殿法、イオン交換樹脂法又は吸着
若しくは分配クロマトグラフィー法及びゲル濾過法、透
析、凍結乾燥法等多糖類を不純物から回収するために通
常使用されている手段を単独にあるいは適宜組み合わせ
ることによって分離精製できる。
【００１８】その一例を示すと、上記固形分を除去して
得られた溶液にエタノール等の溶剤を添加して該多糖類
を析出せしめる。得られた該多糖類を水に溶解させ、こ
れに第四級アンモニウム塩例えばセチルトリメチルアン
モニウムブロマイド溶液を加えてセチルトリメチルアン
モニウムブロマイドとの複合体として多糖類を沈殿させ
る。この沈殿物を塩化ナトリウムを含む水に溶解させた
後、エタノールによる沈殿を行い、沈殿物を水に溶解さ
せた後、透析、凍結乾燥することにより該多糖類を得る
ことができる。
得られた溶液にエタノール等の溶剤を添加して該多糖類
を析出せしめる。得られた該多糖類を水に溶解させ、こ
れに第四級アンモニウム塩例えばセチルトリメチルアン
モニウムブロマイド溶液を加えてセチルトリメチルアン
モニウムブロマイドとの複合体として多糖類を沈殿させ
る。この沈殿物を塩化ナトリウムを含む水に溶解させた
後、エタノールによる沈殿を行い、沈殿物を水に溶解さ
せた後、透析、凍結乾燥することにより該多糖類を得る
ことができる。
【００１９】このようにして得られた多糖類について
は、DEAE-セルロースイオン交換カラムクロマトグラフ
ィー、電気泳動法による均一性分析、糖組成分析、硫酸
基分析、及び核磁気共鳴分析等により、目的とする多糖
類であることが確認できる[上記マツダ(M.Matsuda)ら、
(1993)参照]。
は、DEAE-セルロースイオン交換カラムクロマトグラフ
ィー、電気泳動法による均一性分析、糖組成分析、硫酸
基分析、及び核磁気共鳴分析等により、目的とする多糖
類であることが確認できる[上記マツダ(M.Matsuda)ら、
(1993)参照]。
【００２０】得られた多糖類を試験試料としてヒト骨髄
性白血病細胞U937を用いてアポトーシス誘導試験を細胞
の形態変化と、DNAの断片化分析とにより試験を実施す
る。
性白血病細胞U937を用いてアポトーシス誘導試験を細胞
の形態変化と、DNAの断片化分析とにより試験を実施す
る。
【００２１】
【実施例】 以下に、参考例、試験例を挙げて本発明を
具体的に説明するが、本発明は実施例のみに限定される
ものではない。参考例 文献[マツダ(M.Matsuda)ら： 1
992]の記載に従い、ペプトン0.5%、酵母エキス0.1%、の
組成を有する海水から調製した培地を、121℃にて20分
間オートクレーブで滅菌した。シュードモナス・エスピ
ーWAK-1(Pseudomonas sp.WAK-1,香川大学農学部生物資
源食糧化学科松田研究室保存菌株No.WAK-1)の保存用斜
面培養から1白金耳を試験管中の上記滅菌培地(10mL)に
接種し、28℃にて72時間振盪培養をおこなった。つい
で、この前培養液を500mL容の三角フラスコ中の3%ショ
糖加上記滅菌培地(200mL)に接種し、28℃にて72時間振
盪培養を行った。培養後、培養終了液を遠心分離して菌
体を除いた上澄液に2倍量のエタノールを加え、白色沈
殿を得た。この沈殿物を採取し、水(200mL)中に溶解
し、沈殿が新たに生じなくなるまで5%セチルトリメチル
アンモニウムブロマイド水溶液を徐々に加え、セチルト
リメチルアンモニウムブロマイドとの複合体として多糖
類を沈殿させた。この複合体を水で洗浄して過剰のセチ
ルトリメチルアンモニウムブロマイドを除いた後、4M塩
化ナトリウム水溶液(200ml)中に複合体を溶解した。こ
の溶液に、2倍量のエタノールを加えて多糖類を沈殿さ
せた。得られた沈殿物を水に溶解し、水に対して透析
後、凍結乾燥を行い、酸性多糖類(約0.1g)を得た。本多
糖類をさらに精製するため、次にこの多糖類(102mg)を
0.01Mリン酸塩緩衝液(pH7.0)100mLに溶解し0.01Mリン酸
緩衝液(pH7.0)で平衡させたDEAE-セルロースカラム(2.3
×22.5cm)に充填した。0.01Mリン酸緩衝液(pH7.0)中の
0.6M塩化ナトリウムで溶出される画分を除いた後、0.8M
塩化ナトリウムで溶出される画分を集め、透析し、次い
で凍結乾燥し多糖類(53mg)を得た。このようにして得ら
れた多糖類については、セルロースアセテート膜電気泳
動法を用いて均一性を確認すると共に、糖組成分析、硫
酸基含量分析、及び核磁気共鳴分析等により、構造式
(I)で示される多糖類であることを確認した[上記マツダ
(M.Matsuda)ら：(1993)参照]。
具体的に説明するが、本発明は実施例のみに限定される
ものではない。参考例 文献[マツダ(M.Matsuda)ら： 1
992]の記載に従い、ペプトン0.5%、酵母エキス0.1%、の
組成を有する海水から調製した培地を、121℃にて20分
間オートクレーブで滅菌した。シュードモナス・エスピ
ーWAK-1(Pseudomonas sp.WAK-1,香川大学農学部生物資
源食糧化学科松田研究室保存菌株No.WAK-1)の保存用斜
面培養から1白金耳を試験管中の上記滅菌培地(10mL)に
接種し、28℃にて72時間振盪培養をおこなった。つい
で、この前培養液を500mL容の三角フラスコ中の3%ショ
糖加上記滅菌培地(200mL)に接種し、28℃にて72時間振
盪培養を行った。培養後、培養終了液を遠心分離して菌
体を除いた上澄液に2倍量のエタノールを加え、白色沈
殿を得た。この沈殿物を採取し、水(200mL)中に溶解
し、沈殿が新たに生じなくなるまで5%セチルトリメチル
アンモニウムブロマイド水溶液を徐々に加え、セチルト
リメチルアンモニウムブロマイドとの複合体として多糖
類を沈殿させた。この複合体を水で洗浄して過剰のセチ
ルトリメチルアンモニウムブロマイドを除いた後、4M塩
化ナトリウム水溶液(200ml)中に複合体を溶解した。こ
の溶液に、2倍量のエタノールを加えて多糖類を沈殿さ
せた。得られた沈殿物を水に溶解し、水に対して透析
後、凍結乾燥を行い、酸性多糖類(約0.1g)を得た。本多
糖類をさらに精製するため、次にこの多糖類(102mg)を
0.01Mリン酸塩緩衝液(pH7.0)100mLに溶解し0.01Mリン酸
緩衝液(pH7.0)で平衡させたDEAE-セルロースカラム(2.3
×22.5cm)に充填した。0.01Mリン酸緩衝液(pH7.0)中の
0.6M塩化ナトリウムで溶出される画分を除いた後、0.8M
塩化ナトリウムで溶出される画分を集め、透析し、次い
で凍結乾燥し多糖類(53mg)を得た。このようにして得ら
れた多糖類については、セルロースアセテート膜電気泳
動法を用いて均一性を確認すると共に、糖組成分析、硫
酸基含量分析、及び核磁気共鳴分析等により、構造式
(I)で示される多糖類であることを確認した[上記マツダ
(M.Matsuda)ら：(1993)参照]。
【００２２】次に、上記で得られたWAK-APOについて本
発明の効果を確認するため、以下の試験を行った。アポ
トーシス誘導作用を検出する際には、細胞壊死であるネ
クローシスとの違いを明らかにする必要がある。アポト
ーシスが誘導された細胞は、上述したように、先ず細胞
が縮小し、クロマチンが凝縮し、凝縮した核は断片化す
る。また、細胞表面の微絨毛は消失して平滑化し、自己
認識機構を担う細胞表面分子マーカーを徐々に喪失して
いく。さらに、細胞表面に大小の突起が出現し、やがて
アポトーシス小体に断片化する。このアポトーシス小体
は、生体内においてはやがてマクロファージのような貪
食細胞によって除去される。
発明の効果を確認するため、以下の試験を行った。アポ
トーシス誘導作用を検出する際には、細胞壊死であるネ
クローシスとの違いを明らかにする必要がある。アポト
ーシスが誘導された細胞は、上述したように、先ず細胞
が縮小し、クロマチンが凝縮し、凝縮した核は断片化す
る。また、細胞表面の微絨毛は消失して平滑化し、自己
認識機構を担う細胞表面分子マーカーを徐々に喪失して
いく。さらに、細胞表面に大小の突起が出現し、やがて
アポトーシス小体に断片化する。このアポトーシス小体
は、生体内においてはやがてマクロファージのような貪
食細胞によって除去される。
【００２３】そこでこれらの現象に着目して、ヒト骨髄
性白血病細胞U937にWAK-APOを添加し、反応終了後、ア
ポトーシスが誘導されたかどうかを検出するため、以下
のような複数の方法を用いて実験を行った。
性白血病細胞U937にWAK-APOを添加し、反応終了後、ア
ポトーシスが誘導されたかどうかを検出するため、以下
のような複数の方法を用いて実験を行った。
【００２４】試験例 ヒト培養細胞に対する前記参考例
で得たWAK-APOのアポトーシス誘導効果を試験管内で試
験した。培養細胞にはヒト単球系白血病細胞U937を用い
た。培地は、10%FBSを含むRPMIを用いた。細胞の前培養
を行い、対数期に入った細胞を3×105個/mLになるよう
に培地で調整し、24穴培養プレートに1mLずつ分注し、
サンプル溶液を10μLずつ最終濃度が、それぞれ10, 1,
0.1, 0.01μg/mLになるように添加し、混和した。培養
は、37℃、5%炭酸ガス濃度で行い、 24時間培養した
後、各ウエルの細胞について形態変化を顕微鏡写真撮影
し観察すると共に、アガロース電気泳動法でDNA断片化
分析を行った。
で得たWAK-APOのアポトーシス誘導効果を試験管内で試
験した。培養細胞にはヒト単球系白血病細胞U937を用い
た。培地は、10%FBSを含むRPMIを用いた。細胞の前培養
を行い、対数期に入った細胞を3×105個/mLになるよう
に培地で調整し、24穴培養プレートに1mLずつ分注し、
サンプル溶液を10μLずつ最終濃度が、それぞれ10, 1,
0.1, 0.01μg/mLになるように添加し、混和した。培養
は、37℃、5%炭酸ガス濃度で行い、 24時間培養した
後、各ウエルの細胞について形態変化を顕微鏡写真撮影
し観察すると共に、アガロース電気泳動法でDNA断片化
分析を行った。
【００２５】形態変化の観察では、形態変化の全くない
ものを(-)、多くの細胞に形態変化が認められるものを
(+)、細胞が死滅していると思われるものを(++)と判定
し、又DNA 断片化分析 では、DNA ladderが見られない
ものを(-)、DNAの分解が認められるものを(+)とし、DNA
ladderがはっきり見られるものを(++)と判定した。試
験結果を表1に示す。
ものを(-)、多くの細胞に形態変化が認められるものを
(+)、細胞が死滅していると思われるものを(++)と判定
し、又DNA 断片化分析 では、DNA ladderが見られない
ものを(-)、DNAの分解が認められるものを(+)とし、DNA
ladderがはっきり見られるものを(++)と判定した。試
験結果を表1に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】表1に示すように、コントロールにおいて
は、形態変化、DNAの断片化は見られなかったが、WAK-A
POで処理したU937細胞には0.1, 1μL/mLの濃度でアポト
ーシスに特徴的な細胞の形態変化が認められた。又0.1,
1μL/mLの濃度で断片化したDNAからなる梯子状の泳動
像が見られ、アポトーシスの特徴であるDNAの断片化が
観察された。
は、形態変化、DNAの断片化は見られなかったが、WAK-A
POで処理したU937細胞には0.1, 1μL/mLの濃度でアポト
ーシスに特徴的な細胞の形態変化が認められた。又0.1,
1μL/mLの濃度で断片化したDNAからなる梯子状の泳動
像が見られ、アポトーシスの特徴であるDNAの断片化が
観察された。
【００２８】以上の試験結果が示すように、本参考例で
製造したWAK-APOにはアポトーシス誘導作用があること
が認められた。
製造したWAK-APOにはアポトーシス誘導作用があること
が認められた。
【００２９】
【発明の効果】 本発明に記載する多糖類WAK-APOは、
ヒト培養細胞に対してアポトーシス誘導作用を示すこと
から、細胞サイクルを制御することが可能であり、医
薬、例えば悪性腫瘍、自己免疫疾患、炎症等の治療薬と
しての用途が期待できる。
ヒト培養細胞に対してアポトーシス誘導作用を示すこと
から、細胞サイクルを制御することが可能であり、医
薬、例えば悪性腫瘍、自己免疫疾患、炎症等の治療薬と
しての用途が期待できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｈ
Claims (1)
- 【請求項１】有効成分が構造式(I)で示される化合物又
はその塩類のアポトーシス誘導剤としての利用方法。 【化１】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000379937A JP4991046B2 (ja) | 2000-12-14 | 2000-12-14 | アポトーシス誘導剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000379937A JP4991046B2 (ja) | 2000-12-14 | 2000-12-14 | アポトーシス誘導剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002179579A true JP2002179579A (ja) | 2002-06-26 |
| JP4991046B2 JP4991046B2 (ja) | 2012-08-01 |
Family
ID=18848212
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000379937A Expired - Fee Related JP4991046B2 (ja) | 2000-12-14 | 2000-12-14 | アポトーシス誘導剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4991046B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003023045A1 (fr) * | 2001-09-06 | 2003-03-20 | Techno Network Shikoku Co.,Ltd. | Polysaccharides sulfates, procede de production et substances contenant ceux-ci comme ingredient actif |
| JP2006016336A (ja) * | 2004-07-01 | 2006-01-19 | Shiibaion:Kk | Ｉｌ−１２産生誘導活性を有するマクロファージ活性化剤 |
| JP2006062983A (ja) * | 2004-08-24 | 2006-03-09 | Kyoto Sangyo Univ | 組成物及びそれを含有する抗腫瘍剤 |
| JP2016501526A (ja) * | 2012-12-06 | 2016-01-21 | エンリヴェックス セラピューティクス リミテッド | 治療用アポトーシス細胞調製物、その製造方法及びその使用 |
-
2000
- 2000-12-14 JP JP2000379937A patent/JP4991046B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003023045A1 (fr) * | 2001-09-06 | 2003-03-20 | Techno Network Shikoku Co.,Ltd. | Polysaccharides sulfates, procede de production et substances contenant ceux-ci comme ingredient actif |
| JP2006016336A (ja) * | 2004-07-01 | 2006-01-19 | Shiibaion:Kk | Ｉｌ−１２産生誘導活性を有するマクロファージ活性化剤 |
| JP2006062983A (ja) * | 2004-08-24 | 2006-03-09 | Kyoto Sangyo Univ | 組成物及びそれを含有する抗腫瘍剤 |
| JP2016501526A (ja) * | 2012-12-06 | 2016-01-21 | エンリヴェックス セラピューティクス リミテッド | 治療用アポトーシス細胞調製物、その製造方法及びその使用 |
| US10077426B2 (en) | 2012-12-06 | 2018-09-18 | Enlivex Therapeutics Ltd | Therapeutic apoptotic cell preparations, method for producing same and uses thereof |
| JP2019047813A (ja) * | 2012-12-06 | 2019-03-28 | エンリヴェックス セラピューティクス リミテッド | 治療用アポトーシス細胞調製物、その製造方法及びその使用 |
| US10927343B2 (en) | 2012-12-06 | 2021-02-23 | Enlivex Therapeutics Ltd | Therapeutic apoptotic cell preparations, method for producing same and uses thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4991046B2 (ja) | 2012-08-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109970538B (zh) | 一类海洋真菌来源的二倍半萜类化合物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用 | |
| EP1954800A2 (en) | Composition and use of phyto-percolate for treatment of disease | |
| CN106727623B (zh) | 海藻低聚糖在制备抗禽白血病病毒制剂中的应用 | |
| SU1423002A3 (ru) | Способ получени белка,понижающего содержание холестерина в крови млекопитающих животных | |
| JP4991046B2 (ja) | アポトーシス誘導剤 | |
| CN109022309B (zh) | 一种能够产游离脂肪酸的嗜麦芽寡养单胞菌及其应用 | |
| CN108864316B (zh) | 一种磺酸化牡丹籽多糖及其制备治疗肝癌辅助药物中的应用 | |
| CN116284479A (zh) | 一种绣球菌多糖及其制备方法和应用 | |
| Sun et al. | Effects of AZT and RNA-protein complex (FA-2-b-β) extracted from Liang Jin mushroom on apoptosis of gastric cancer cells | |
| RU2177788C2 (ru) | Средство для профилактики и лечения инфекционных заболеваний и коррекции патологических состояний живого организма | |
| CN1123577C (zh) | 海洋真菌炭团菌多糖及其提取方法和用途 | |
| US5711948A (en) | Plant-derived, biologically active polysaccharides and method of preparing same | |
| JPH04300898A (ja) | 新規糖タンパク複合体およびその製造方法 | |
| US3629235A (en) | Process for isolating an interferon inducer and the product per se | |
| CN114940679B (zh) | Sting激动剂前药化合物及其制备方法和应用 | |
| Mane et al. | Bioprospection of Bioactive Compounds from Spirulina platensis and in-vitro Therapeutic Applications | |
| CN113181222B (zh) | 一株隐球酵母的胞外多糖代谢产物在制备抗病毒药物中的应用 | |
| CN116694485B (zh) | 一种胶孢炭疽菌及其胞外多糖作为植物免疫诱抗剂的应用 | |
| RU2422532C2 (ru) | Способ выделения низкомолекулярных ядерных рибонуклеопротеидов (рнп) из тканей и органов млекопитающих | |
| CN105754931A (zh) | 一种促进人角质细胞激活肿瘤坏死因子信号通路的方法 | |
| CN112759661A (zh) | 金樱子多糖制备方法、鉴定方法和应用 | |
| RU2435611C1 (ru) | Способ получения полимерного комплекса | |
| CN104926932B (zh) | 一种从火水母刺细胞毒液中提取的多肽及其应用 | |
| RU2412995C1 (ru) | Способ получения ингибитора коллагеназы с противоопухолевым действием из гепатопанкреаса камчатского краба | |
| RU2274658C2 (ru) | Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20071023 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20071023 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20071114 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20071114 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110426 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110623 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110705 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110905 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120424 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120507 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4991046 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150511 Year of fee payment: 3 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150511 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |