JP2002173448A - Beta-selectase activity inhibitor - Google Patents
Beta-selectase activity inhibitorInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、β-セクレターゼ
活性阻害剤に関する。即ち、本発明は、アルツハイマー
病の治療剤等として有用なβ−アミロイド生成抑制剤に
関する。さらに本発明は、β−アミロイド沈着性神経変
性疾患治療剤に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a β-secretase activity inhibitor. That is, the present invention relates to a β-amyloid production inhibitor useful as a therapeutic agent for Alzheimer's disease and the like. Further, the present invention relates to a therapeutic agent for β-amyloid deposition neurodegenerative disease.
【０００２】[0002]
【従来の技術】近年、老人人口の増加に伴い、老人性痴
呆症の治療に有効な医薬品の開発が強く望まれている。
老人性痴呆症の代表的疾患であるアルツハイマー病は、
脳の萎縮、老人斑の沈着および神経原線維の形成を特徴
とする変性疾患で、神経細胞の脱落が痴呆症状を引き起
こすと考えられている（Alzheimer, A. (1907) Central
bl. Nervenheilk. Psychiatr. 30, 177-179）。アルツ
ハイマー病発症の原因について未だ定説はないが、病理
組織学的研究により、老人斑が沈着しそれにより神経細
胞が脱落し脳の萎縮が生じると考えられている。老人斑
の主成分であるβ−アミロイドは細胞毒性作用を有して
おり、アルツハイマー病における神経細胞死を引き起こ
していると考えられている（Yankner,B.et al. Scienc
e, 245, 417-420(1989); Cai,X., Gold, T. & Younkin,
S. Science, 259, 514-516(1993); Rose, A. Nature M
ed. 2, 267-269(1996); Scheuner,D. et al. Nature Me
d. 2, 864-869(1996)）。β−アミロイドは39-43残基の
アミノ酸からなる凝集しやすいペプタイドであり（Glen
ner, G. G., and Wong, C. W. (1984) Biochem. Biophy
s. Res. Commun. 120, 885-890）、その前駆体であるア
ミロイド前駆体蛋白質がプロセシングされることによ
り、生成される（Haass,C. , and Selkoe, D. Cell 75,
1039-1042(1993)）; Roher, A. E., et al. Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 90, 10836-10840(1993)）。アミロ
イド前駆体蛋白質は膜貫通部位を持つ蛋白質(Kang, J.
et al. Nature,325, 733-736(1987))で、βアミロイド
の17残基目付近α部位で切断を受け、Ｎ末端を含む分子
量約120kDaの断片が細胞外に分泌される(Seubert, P. e
t al. Nature, 361, 260-262(1993))。一方、βアミロ
イドはアミロイド前駆体蛋白質のＣ末端領域に存在し、
βアミロイドの両端で切断を受け産生したβアミロイド
が細胞外に分泌される。アミロイド前駆体蛋白質のプロ
セシング及びβアミロイドの切断にはプロテアーゼが関
与していることが推定され、数種類の酵素が候補に挙げ
られてたが、同定されていなかった。ところが最近にな
り、アミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）のβ−サイトを
切断する酵素（β−セクレターゼ）が発見され、クロー
ニングされて、俄にβ-セクレターゼ性阻害剤の研究が
進展した。β-セクレターゼには、アミノ酸配列が異な
る２種のサブタイプが存在し、BACE-1（Vassar,R. et a
l. Science 286 (5440), 735-741 (1999)）、BACE-2（
Yan, R. et al. Nature 402, 533-537 (1999)）と名付
けられている。現在、このいずれの酵素を優先的に阻害
した方がβ−アミロイド沈着性神経変性疾患、例えば、
アルツハイマー病の治療剤としてよいのかも分かってい
ない。ごく最近、BACE1を直接阻害する化合物が見出さ
れた（Sinha S. et al. Nature402, 537-540 (199
9)、 Hong L, et al. Science 290 150-153(200
0)）。ただし、BACE2に関しては、どのような性質のも
のが阻害剤として有効であるかについてもほとんど分か
っていなかった。2. Description of the Related Art In recent years, with the increase in the aging population, there is a strong demand for the development of pharmaceuticals effective for treating senile dementia.
Alzheimer's disease, a typical disease of senile dementia,
A degenerative disease characterized by brain atrophy, senile plaque deposition, and neurofibrillary tangles, which is thought to cause dementia of neurons (Alzheimer, A. (1907) Central
bl. Nervenheilk. Psychiatr. 30, 177-179). Although the cause of the onset of Alzheimer's disease has not yet been established, histopathological studies suggest that senile plaques are deposited, which results in neuronal loss and brain atrophy. Β-amyloid, the main component of senile plaques, has a cytotoxic effect and is thought to cause neuronal death in Alzheimer's disease (Yankner, B. et al. Scienc
e, 245 , 417-420 (1989); Cai, X., Gold, T. & Younkin,
S. Science, 259 , 514-516 (1993); Rose, A. Nature M
ed. 2 , 267-269 (1996); Scheuner, D. et al. Nature Me
d. 2 , 864-869 (1996)). β-amyloid is an aggregation-prone peptide consisting of 39-43 amino acids (Glen
ner, GG, and Wong, CW (1984) Biochem. Biophy
s. Res. Commun. 120, 885-890), which is produced by processing the precursor amyloid precursor protein (Haass, C., and Selkoe, D. Cell 75 ,
1039-1042 (1993)); Roher, AE, et al. Proc. Nat.
l. Acad. Sci. USA 90 , 10836-10840 (1993)). Amyloid precursor protein is a protein with a transmembrane site (Kang, J.
et al. Nature, 325 , 733-736 (1987)) undergoes cleavage at the α-site near residue 17 of β-amyloid and secretes extracellular fragments containing a molecular weight of about 120 kDa, including the N-terminus (Seubert, P. e
t al. Nature, 361 , 260-262 (1993)). On the other hand, β-amyloid is present in the C-terminal region of the amyloid precursor protein,
β-amyloid produced by cleavage at both ends of β-amyloid is secreted extracellularly. Proteases were presumed to be involved in the processing of amyloid precursor protein and the cleavage of β-amyloid, and several enzymes were listed as candidates, but were not identified. However, recently, an enzyme (β-secretase) that cleaves the β-site of amyloid precursor protein (APP) has been discovered and cloned, and research on β-secretase inhibitors has rapidly progressed. There are two subtypes of β-secretase having different amino acid sequences, and BACE-1 (Vassar, R. et a
l. Science 286 (5440), 735-741 (1999)), BACE-2 (
Yan, R. et al. Nature 402, 533-537 (1999)). Currently, preferentially inhibiting any of these enzymes is a β-amyloid deposition neurodegenerative disease, for example,
It is not known whether it is good as a therapeutic agent for Alzheimer's disease. Very recently, compounds that directly inhibit BACE1 have been found (Sinha S. et al. Nature 402, 537-540 (199
9), Hong L, et al. Science 290 150-153 (200
0)). However, regarding BACE2, little was known about what properties would be effective as inhibitors.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、有効なβ-セクレターゼ活性阻害剤または
これに基づくβ−アミロイド沈着性神経変性疾患治療剤
を提供することである。また、本発明が解決しようとす
る他の課題は、βアミロイド生成抑制剤等として有用な
新規なアミド化合物を提供することにある。The problem to be solved by the present invention is to provide an effective inhibitor of β-secretase activity or a therapeutic agent for β-amyloid depositing neurodegenerative disease based on the same. Another object of the present invention is to provide a novel amide compound useful as a β-amyloid production inhibitor or the like.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意検討
の結果、ペプシン・ファミリーの酸性プロテアーゼ阻害
剤または後述の式(1)〜式(4)で表される化合物がβ-セ
クレターゼ活性を有効に阻害することを見出し、本発明
を完成した。さらに詳しくは、本発明では、ペプシン・
ファミリーの酸性プロテアーゼ阻害剤または本発明の式
(1)〜式(4)で表される化合物（３アミノ酸残基を含有す
るペプチド）が、β-セクレターゼのサブタイプであるB
ACE-2に関して顕著な活性阻害作用を示すことを見出し
た。最近のβ-セクレターゼに関する報告（Sinha S. e
t al. Nature 402, 537-540 (1999)、 Hong L, et a
l. Science 290 150-153(2000)）によれば、その活
性阻害剤はアルツハイマー病等のβ−アミロイド沈着性
の神経変性疾患の治療剤となることが示されている。一
方、これに対して別途の報告（Bigl, M., et al. Neuro
sci.Lett., 292, 107-110(2000)）では、ヒト型APP695
（アミロイド前駆体タンパク）のスウェーデン型変異体
を高発現するトランスジェニックマウス（Tg2576）を用
いて次のような知見を報告している。 加齢に伴いアルツハイマー様のβ−アミロイドの沈着
が見られること。 Tg2576の13月齢及び17月齢の脳切片におけるBACE1 mR
NAをin situにて検出したところ、様々な部位の神経細
胞にはBACE1の発現が認められたが、これまでβ−セク
レターゼとの関連が指摘されてきたアストロサイトには
発現が認められなかったこと。 アミロイド沈着部位をとりまく領域での発現が多いと
いうことはなく、部位特異的発現パターンもβ−アミロ
イド沈着に相関していなかったこと。 以上の事実から、本発明者等は、β−アミロイド沈着に
はBACE1以外のβ−セクレターゼの関与、すなわちBACE2
の関与が強いものと考えた。即ち、本発明者等は、これ
らの知見より、BACE-1よりもBACE-2を阻害する方が、よ
りβ−アミロイド沈着性神経変性疾患に有効な薬剤が提
供できると考えた。本発明者らが見出した阻害剤は、β
-セクレターゼのサブタイプであるBACE-2に関して顕著
な活性阻害作用を示すことから、本発明のβ-セレクタ
ーゼ活性阻害剤は、より有効なβ−アミロイド沈着性神
経変性疾患治療剤であることが示された。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies, the present inventors have found that an acid protease inhibitor of the pepsin family or a compound represented by the following formulas (1) to (4) has β-secretase activity. Have been found to effectively inhibit the present invention, and the present invention has been completed. More specifically, in the present invention, pepsin
Family of acidic protease inhibitors or formulas of the invention
The compounds represented by the formulas (1) to (4) (peptides containing 3 amino acid residues) are B-secretase subtypes
ACE-2 was found to exhibit a marked activity inhibitory effect. Recent report on β-secretase (Sinha S. e
t al. Nature 402, 537-540 (1999), Hong L, et a
l. Science 290 150-153 (2000)), it has been shown that its activity inhibitor is a therapeutic agent for β-amyloid depositing neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease. On the other hand, a separate report (Bigl, M., et al. Neuro
sci. Lett., 292 , 107-110 (2000)), human APP695.
The following findings have been reported using transgenic mice (Tg2576) that highly express Swedish mutants of (amyloid precursor protein). Alzheimer's-like β-amyloid deposition with age. BACE1 mR in 13 and 17 month old brain sections of Tg2576
When NA was detected in situ, BACE1 expression was observed in neurons at various sites, but no expression was observed in astrocytes, which had been previously linked to β-secretase. thing. The expression in the region surrounding the amyloid deposition site was not high, and the site-specific expression pattern did not correlate with β-amyloid deposition. From the above facts, the present inventors believe that β-amyloid deposition involves β-secretase other than BACE1, ie, BACE2
Was considered to be strongly involved. That is, based on these findings, the present inventors thought that inhibiting BACE-2 rather than BACE-1 would provide a more effective drug for β-amyloid deposition neurodegenerative disease. The inhibitor we have found is β
BACE-2, which is a subtype of secretase, exhibits a remarkable activity inhibitory effect, so that the β-selectase activity inhibitor of the present invention is a more effective β-amyloid deposition neurodegenerative disease therapeutic agent. Indicated.
【０００５】すなわち本発明の要旨は以下に示す通りで
ある。 （１）ペプシン・ファミリーの酸性プロテアーゼ阻害剤
を有効成分とするβ-セクレターゼ活性阻害剤。 （２）ペプシン・ファミリーの酸性プロテアーゼがペプ
シンである上記（１）記載のβ-セクレターゼ活性阻害
剤。 （３）ペプシン・ファミリーの酸性プロテアーゼ阻害剤
がペプスタチンAである上記（２）記載のβ-セクレター
ゼ活性阻害剤。 （４）β-セクレターゼがＢＡＣＥ−２のアミノ酸配列
の蛋白である、上記（１）〜（３）のいずれか記載のβ
-セクレターゼ活性阻害剤。 （５）ペプシン・ファミリーの酸性プロテアーゼ阻害剤
を有効成分とするβ−アミロイド沈着性神経変性疾患治
療剤。 （６）ペプシン・ファミリーの酸性プロテアーゼがペプ
シンである上記（５）記載のβ−アミロイド沈着性神経
変性疾患治療剤。 （７）ペプシン・ファミリーの酸性プロテアーゼ阻害剤
がペプスタチンAである上記（６）記載のβ−アミロイ
ド沈着性神経変性疾患治療剤。 （８）β−アミロイド沈着性神経変性疾患がアルツハイ
マー病である、上記（５）〜（７）のいずれかの神経変
性疾患治療剤。 （９）以下の部分構造、、またはのペプチドを
含有することを特徴とするβ-セクレターゼ活性阻害
剤、 一般式(1)のＣ−末３アミノ酸残基アルデヒドThat is, the gist of the present invention is as follows. (1) A β-secretase activity inhibitor comprising an acidic protease inhibitor of the pepsin family as an active ingredient. (2) The β-secretase activity inhibitor according to the above (1), wherein the acidic protease of the pepsin family is pepsin. (3) The β-secretase activity inhibitor according to the above (2), wherein the acidic protease inhibitor of the pepsin family is pepstatin A. (4) The β-protein according to any one of the above (1) to (3), wherein the β-secretase is a protein having the amino acid sequence of BACE-2.
-Secretase activity inhibitor. (5) A therapeutic agent for β-amyloid-depositing neurodegenerative disease, comprising an acidic protease inhibitor of the pepsin family as an active ingredient. (6) The therapeutic agent for β-amyloid depositing neurodegenerative disease according to (5), wherein the acidic protease of the pepsin family is pepsin. (7) The therapeutic agent for β-amyloid depositing neurodegenerative disease according to (6), wherein the acidic protease inhibitor of the pepsin family is pepstatin A. (8) The therapeutic agent for a neurodegenerative disease according to any one of the above (5) to (7), wherein the β-amyloid depositing neurodegenerative disease is Alzheimer's disease. (9) a β-secretase activity inhibitor, which comprises a peptide having the following partial structure or a peptide, and a C-terminal 3 amino acid residue aldehyde of the general formula (1):
【０００６】[0006]
【化５】 ［式中、Ｒ１、Ｒ３はそれぞれ独立に疎水性の直鎖また
は分枝状の低級アルキル基を表し、Ｒ２はアミノ基、水
酸基、カルボキシル基またはカルバモイル基で置換され
ていてもよい直鎖または分枝状の低級アルキル基を表
す。］ 一般式(2)の３アミノ酸残基からなるペプチドEmbedded image [Wherein, R 1 and R 3 each independently represent a hydrophobic linear or branched lower alkyl group, and R 2 represents a direct group which may be substituted with an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group or a carbamoyl group. Represents a chain or branched lower alkyl group. ] A peptide comprising three amino acid residues of the general formula (2)
【化６】 ［式中、Ｒ４、Ｒ６はそれぞれ独立に疎水性の直鎖また
は分枝状の低級アルキル基を表し、Ｒ５はアミノ基、水
酸基、カルボキシル基、カルバモイル基あるいはメチル
チオ基で置換されていてもよい直鎖または分枝状の低級
アルキル基を表す。］ 一般式(3)のＣ−末３アミノ酸残基アルデヒドEmbedded image [Wherein, R 4 and R 6 each independently represent a hydrophobic linear or branched lower alkyl group, and R 5 is substituted with an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a carbamoyl group or a methylthio group. Represents a linear or branched lower alkyl group. ] C-terminal 3 amino acid residue aldehyde of the general formula (3)
【化７】 ［式中、Ｒ１、Ｒ２ 、Ｒ３はそれぞれ独立に前項と同
じ意味を表す。］ 一般式(4)の３アミノ酸残基からなるペプチドEmbedded image [Wherein, R 1 , R 2 and R 3 each independently represent the same meaning as in the preceding paragraph. ] A peptide comprising three amino acid residues of the general formula (4)
【化８】 ［式中、Ｒ４、Ｒ５ 、Ｒ６はそれぞれ独立に前項と同
じ意味を表す。］ （１０）Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６がそれぞれメチル基、
ｎ−プロピル基、iso−プロピル基、１−メチルプロピ
ル基、２−メチルプロピル基、ｎ−ブチル基あるいは２
−メチルチオエチル基の何れかであり、Ｒ２、Ｒ５がメ
チル基、ｎ−プロピル基、iso−プロピル基、１−メチ
ルプロピル基、２−メチルプロピル基、ｎ−ブチル基、
２−カルバモイルエチル基、２−カルボキシエチル基、
４−アミノブチル基あるいは２−メチルチオエチル基の
何れかである、上記（９）記載のβ-セクレターゼ活性
阻害剤。 （１１）Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６がそれぞれｎ−プロピ
ル基、iso−プロピル基、１−メチルプロピル基、２−
メチルプロピル基あるいはｎ−ブチル基の何れかであ
り、Ｒ２、Ｒ５がメチル基、２−カルバモイルエチル
基、４−アミノブチル基あるいは２−メチルチオエチル
基の何れかである、上記（９）、（１０）記載のβ-セ
クレターゼ活性阻害剤。 （１２）上記（９）〜（１１）記載の化合物で、かつプ
ロテアソーム阻害活性を有する化合物を有効成分とする
β-セクレターゼ活性阻害剤。 （１３）上記（９）〜（１２）記載のβ-セクレターゼ
活性阻害剤を有効成分とするβ−アミロイド沈着性神経
変性疾患治療剤。 （１４）β−アミロイド沈着性神経変性疾患がアルツハ
イマー病である、上記（１３）記載の治療剤。 （１５）上記（９）〜（１２）記載のβ-セクレターゼ
活性阻害剤を有効成分とするβ−アミロイド生成抑制
剤。 （１６）下の工程よりなるβ−セクレターゼ活性阻害剤
のスクリーニング方法。 (1)精製タグ付加可溶性BACE2を使用し、(2)合成蛍光基
質MOCAc-SEVNLDAEFRK(Dnp)RR-NH2のバッファー溶液を混
合し、次いで被験化合物の溶液を加えて保温する、(3)
培養液の蛍光測定し、アミロイド前駆体の切断活性を測
定する、 （１７）ペプスタチンAを基準物質として使用し、ペプ
スタチンA以上の阻害活性を有するβ−セクレターゼ活
性阻害剤を選別することを特徴とする、上記（１６）載
のスクリーニング方法。 （１８）上記（１６）及び（１７）載のスクリーニング
方法により得られるペプスタチンA以上の阻害活性を有
するβ−セクレターゼ活性阻害剤。 （１９）上記（１８）記載のβ−セクレターゼ活性阻害
剤を有効成分とするβアミロイド生成抑制剤。 （２０）上記（１８）記載のβ-セクレターゼ活性阻害
剤を有効成分とするβ−アミロイド沈着性神経変性疾患
治療剤。 （２１）β−アミロイド沈着性神経変性疾患がアルツハ
イマー病である、上記（２０）記載の治療剤。Embedded image [Wherein, R 4 , R 5 and R 6 each independently represent the same meaning as in the preceding paragraph. (10) R 1 , R 3 , R 4 and R 6 are each a methyl group,
n-propyl group, iso-propyl group, 1-methylpropyl group, 2-methylpropyl group, n-butyl group or 2
-Methylthioethyl group, wherein R 2 and R 5 are a methyl group, an n-propyl group, an iso-propyl group, a 1-methylpropyl group, a 2-methylpropyl group, an n-butyl group,
2-carbamoylethyl group, 2-carboxyethyl group,
The β-secretase activity inhibitor according to the above (9), which is either a 4-aminobutyl group or a 2-methylthioethyl group. (11) R 1 , R 3 , R 4 , and R 6 each represent an n-propyl group, an iso-propyl group, a 1-methylpropyl group,
(9) the above (9), which is any one of a methylpropyl group and an n-butyl group, and wherein R 2 and R 5 are any one of a methyl group, a 2-carbamoylethyl group, a 4-aminobutyl group and a 2-methylthioethyl group; And β-secretase activity inhibitor according to (10). (12) A β-secretase activity inhibitor comprising, as an active ingredient, the compound according to (9) to (11) and having a proteasome inhibitory activity. (13) A therapeutic agent for β-amyloid deposition neurodegenerative disease, comprising the β-secretase activity inhibitor according to any one of (9) to (12) as an active ingredient. (14) The therapeutic agent according to the above (13), wherein the β-amyloid depositing neurodegenerative disease is Alzheimer's disease. (15) A β-amyloid production inhibitor comprising the β-secretase activity inhibitor according to any of (9) to (12) as an active ingredient. (16) A method for screening a β-secretase activity inhibitor comprising the following steps. (1) Using a purified tag-added soluble BACE2, (2) mixing a buffer solution of the synthetic fluorescent substrate MOCAc-SEVNLDAEFRK (Dnp) RR-NH2, then adding the test compound solution and keeping warm, (3)
(17) using a pepstatin A as a reference substance, and selecting a β-secretase activity inhibitor having an inhibitory activity of pepstatin A or more, by measuring the fluorescence of the culture solution and measuring the amyloid precursor cleavage activity. The screening method described in (16) above. (18) A β-secretase activity inhibitor having an inhibitory activity equal to or higher than pepstatin A obtained by the screening methods described in (16) and (17). (19) A β-amyloid production inhibitor comprising the β-secretase activity inhibitor according to (18) as an active ingredient. (20) A therapeutic agent for β-amyloid deposition neurodegenerative disease, comprising the β-secretase activity inhibitor according to (18) as an active ingredient. (21) The therapeutic agent according to the above (20), wherein the β-amyloid deposition neurodegenerative disease is Alzheimer's disease.
【０００７】[0007]
【発明の実施形態】本発明の第１態様は、ペプシン・フ
ァミリーの酸性プロテアーゼ阻害剤または後述の式(1)
〜式(4)で表される化合物を有効成分とするβ-セレクタ
ーゼ活性阻害剤に関するものである。本発明におけるβ
-セクレターゼには、BACE-1とBACE-2の２つのサブタイ
プが存在し、それぞれの塩基配列、アミノ酸配列は報告
され公知となっている（Vassar,R. et al. Science 286
(5440), 735-741 (1999)）、BACE-2（ Yan, R. et al.
Nature 402, 533-537 (1999)）。本発明におけるペプ
シン・ファミリーの酸性プロテアーゼとは、例えば、ペ
プシン、カテプシンD、レニン等を挙げることができ
る。好ましくは、ペプシンを挙げることができる。本発
明におけるペプシン・ファミリーの酸性プロテアーゼ阻
害剤とは、該酸性プロテアーゼに阻害活性を示す化合物
である。あるいは、以下の部分ペプチドを含有する化合
物であり、プロテアソーム阻害活性を有することが好ま
しい。 一般式(1)のＣ−末３アミノ酸残基アルデヒドBEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The first aspect of the present invention is directed to an acidic protease inhibitor of the pepsin family or a compound represented by the following formula (1):
To β-selectase activity inhibitors comprising a compound represented by the formula (4) as an active ingredient. Β in the present invention
-Secretase has two subtypes, BACE-1 and BACE-2, and the nucleotide sequence and amino acid sequence of each are reported and known (Vassar, R. et al. Science 286).
(5440), 735-741 (1999)), BACE-2 (Yan, R. et al.
Nature 402, 533-537 (1999)). Examples of the pepsin family acidic protease in the present invention include pepsin, cathepsin D, and renin. Preferably, pepsin can be mentioned. The pepsin family acidic protease inhibitor according to the present invention is a compound having an inhibitory activity on the acidic protease. Alternatively, it is a compound containing the following partial peptide and preferably has proteasome inhibitory activity. C-terminal 3 amino acid residue aldehyde of general formula (1)
【０００８】[0008]
【化９】 ［式中、Ｒ１、Ｒ３はそれぞれ独立に直鎖または分枝状
の低級アルキル基を表し、Ｒ２はアミノ基、水酸基、カ
ルボキシル基、カルバモイル基で置換されていてもよい
直鎖または分枝状の低級アルキル基を表す。］ 一般式(2)の３アミノ酸残基からなるペプチドEmbedded image [Wherein, R 1 and R 3 each independently represent a linear or branched lower alkyl group, and R 2 represents a linear or branched lower alkyl group which may be substituted with an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, or a carbamoyl group. Represents a branched lower alkyl group. ] A peptide comprising three amino acid residues of the general formula (2)
【化１０】 ［式中、Ｒ４、Ｒ６はそれぞれ独立に疎水性の直鎖また
は分枝状の低級アルキル基を表し、Ｒ５はアミノ基、水
酸基、カルボキシル基、カルバモイル基あるいはメチル
チオ基で置換されていてもよい直鎖または分枝状の低級
アルキル基を表す。］ 一般式(3)のＣ−末３アミノ酸残基アルデヒドEmbedded image [Wherein, R 4 and R 6 each independently represent a hydrophobic linear or branched lower alkyl group, and R 5 is substituted with an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a carbamoyl group or a methylthio group. Represents a linear or branched lower alkyl group. ] C-terminal 3 amino acid residue aldehyde of the general formula (3)
【化１１】 ［式中、Ｒ１、Ｒ２ 、Ｒ３はそれぞれ独立に前項と同
じ意味を表す。］ 一般式(4)の３アミノ酸残基からなるペプチドEmbedded image [Wherein, R 1 , R 2 and R 3 each independently represent the same meaning as in the preceding paragraph. ] A peptide comprising three amino acid residues of the general formula (4)
【化１２】 ［式中、Ｒ４、Ｒ５ 、Ｒ６はそれぞれ独立に前項と同
じ意味を表す。］ 本発明のＲ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６は、疎水性の直鎖また
は分枝状の炭素数１〜８の低級アルキル基を表し、例え
ば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、iso−プロ
ピル基、１−メチルプロピル基、２−メチルプロピル
基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基あ
るいは２−メチルチオエチル基を挙げることができる。
好ましくはＲ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６が、ｎ−プロピル
基、iso−プロピル基、１−メチルプロピル基、２−メ
チルプロピル基あるいはｎ−ブチル基を挙げることがで
きる。本発明のＲ２、Ｒ５はアミノ基、水酸基、カルボ
キシル基、カルバモイル基で置換されていてもよい直鎖
または分枝状の炭素数１〜８の低級アルキル基を表し、
例えば、メチル基、ｎ−プロピル基、iso−プロピル
基、１−メチルプロピル基、２−メチルプロピル基、ｎ
−ブチル基、２−カルバモイルエチル基、２−カルボキ
シエチル基、４−アミノブチル基あるいは２−メチルチ
オエチル基を挙げることができる。Ｒ２、Ｒ５として好
ましいものは、メチル基、２−カルバモイルエチル基、
４−アミノブチル基あるいは２−メチルチオエチル基を
挙げることができる。さらに詳しくは、ペプシン・ファ
ミリーの酸性プロテアーゼ阻害剤として、例えばペプス
タチンAおよびヒドロキシペプスタチン等を挙げること
ができる。好ましくは、ペプスタチンAを挙げることが
できる。疎水性アミノ酸３残基以上からなるペプタイド
性阻害剤とは、例えばLLL（MG-132）、LLnV（MG-115）
等を挙げることができる。好ましくは、 LLL（MG-132）
を挙げることができる。好ましくは、ペプスタチンA、
ヒドロキシペプスタチン等を挙げることができる。より
好ましくは、ペプスタチンAを挙げることができる。な
お、上記で使用される阻害剤ペプチドの略号は以下の内
容を表すものである。Embedded image [Wherein, R 4 , R 5 and R 6 each independently represent the same meaning as in the preceding paragraph. R 1 , R 3 , R 4 , and R 6 of the present invention represent a hydrophobic linear or branched lower alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, such as a methyl group, an ethyl group, and an n-propyl group. Group, iso-propyl group, 1-methylpropyl group, 2-methylpropyl group, n-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group and 2-methylthioethyl group.
Preferably, R 1 , R 3 , R 4 and R 6 are n-propyl, iso-propyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl or n-butyl. R 2 and R 5 of the present invention represent a linear or branched lower alkyl group having 1 to 8 carbon atoms which may be substituted with an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, or a carbamoyl group;
For example, methyl group, n-propyl group, iso-propyl group, 1-methylpropyl group, 2-methylpropyl group, n
A -butyl group, a 2-carbamoylethyl group, a 2-carboxyethyl group, a 4-aminobutyl group or a 2-methylthioethyl group. Preferred as R 2 and R 5 are a methyl group, a 2-carbamoylethyl group,
Examples thereof include a 4-aminobutyl group and a 2-methylthioethyl group. More specifically, examples of the pepsin family acidic protease inhibitor include pepstatin A and hydroxypepstatin. Preferably, pepstatin A can be mentioned. Peptide inhibitors consisting of three or more hydrophobic amino acids include, for example, LLL (MG-132), LLnV (MG-115)
And the like. Preferably, LLL (MG-132)
Can be mentioned. Preferably, pepstatin A,
Hydroxypepstatin and the like can be mentioned. More preferably, pepstatin A can be mentioned. The abbreviations of the inhibitor peptides used above represent the following contents.
【０００９】［阻害剤略記］ DMQD：Ac-Asp-Met-Gln-Asp-H(aldehyde) LEHD：Ac-Leu-Glu-His-Asp-H(aldehyde) LL：Z-Leu-Leu-H(aldehyde) LLL：Z-Leu-Leu-Leu-H(aldehyde) LLnV：Z-Leu-Leu-Nva-H(aldehyde)[Inhibitor abbreviation] DMQD: Ac-Asp-Met-Gln-Asp-H (aldehyde) LEHD: Ac-Leu-Glu-His-Asp-H (aldehyde) LL: Z-Leu-Leu-H (aldehyde) aldehyde) LLL: Z-Leu-Leu-Leu-H (aldehyde) LLnV: Z-Leu-Leu-Nva-H (aldehyde)
【００１０】本発明の第２態様は、ペプシン・ファミリ
ーの酸性プロテアーゼ阻害剤を有効成分とするβ−アミ
ロイド沈着性神経変性疾患治療剤に関するものである。
本発明のβ−アミロイド沈着性神経変性疾患としては、
例えば家族性アルツハイマー病および弧発性アルツハイ
マー病等を挙げることができる。[0010] A second aspect of the present invention relates to a therapeutic agent for β-amyloid-depositing neurodegenerative disease, which comprises an acidic protease inhibitor of the pepsin family as an active ingredient.
As the β-amyloid deposition neurodegenerative disease of the present invention,
For example, familial Alzheimer's disease and arctic Alzheimer's disease can be mentioned.
【００１１】本発明の第３態様は、β−セクレターゼの
活性阻害剤に関するものである。本発明のβ−セクレタ
ーゼとは、BACE-1およびBACE-2の二つのサブタイプのこ
とを表す（Science, 286 (5440), 735-741 (1999)、 Na
ture 402, 533-537 (1999)）。本発明のβ−セクレタ
ーゼ活性阻害剤とは、上記BACE-1およびBACE-2の二つの
サブタイプの酵素を阻害するものを表す。好ましいβ−
セクレターゼ活性阻害剤とは、サブタイプBACE-2をより
選択的に阻害するもの等が挙げられる。なお、本発明の
β−セクレターゼ阻害剤とは、サブタイプBACE-2を阻害
していればそれでよく、サブタイプBACE-1を阻害しない
ものを排除するものではない。[0011] A third aspect of the present invention relates to a β-secretase activity inhibitor. The β-secretase of the present invention refers to two subtypes of BACE-1 and BACE-2 (Science, 286 (5440), 735-741 (1999),
ture 402, 533-537 (1999)). The β-secretase activity inhibitor of the present invention refers to an inhibitor that inhibits the above-mentioned two subtypes of BACE-1 and BACE-2. Preferred β-
Examples of the secretase activity inhibitor include those that more selectively inhibit subtype BACE-2. The β-secretase inhibitor of the present invention only needs to inhibit subtype BACE-2, and does not exclude those that do not inhibit subtype BACE-1.
【００１２】本発明の第４態様は、β−セクレターゼの
活性阻害剤のスクリーニング方法に関するものである。
本発明のスクリーニング方法において、タグ付加可溶性
BACE2とは、例えば、BACE2の膜貫通ドメイン以降の代わ
りに6xHisタグやFcタグを有する融合タンパクを表す。
本発明のスクリーニング方法では、合成蛍光基質MOCAc-
SEVNLDAEFRK(Dnp)RR-NH2溶液と精製タグ付加可溶性BACE
2溶液を混合し、次いで被験化合物の溶液を加えて保温
するが、その反応溶液、濃度、温度等に関しては適宜通
常の酵素反応実験における条件を選択することができ
る。例えば、スクリーニングの反応液組成は0.2M NaOAc
-HOAc buffer(pH4.6)、30μM蛍光合成基質溶液、酵素液
量最大40%(v/v)を選択することができ、反応温度は37℃
で14〜18時間反応させることが望ましい。本発明におけ
る反応の進捗については、培養液の蛍光測定により観測
することができ、適宜市販の蛍光測定器を使用すること
ができる。例えば、フルオロスキャンIIを使用し、測定
条件としてはex=320nm、em=405nmで測定を行うことがで
きる。これによりβセクレターゼのアミロイド前駆体切
断活性を測定することができる。A fourth aspect of the present invention relates to a method for screening for an inhibitor of β-secretase activity.
In the screening method of the present invention, the tag-added soluble
BACE2 represents, for example, a fusion protein having a 6xHis tag or Fc tag instead of the transmembrane domain of BACE2.
In the screening method of the present invention, the synthetic fluorescent substrate MOCAc-
SEVNLDAEFRK (Dnp) RR-NH2 Solution and Purified Tagged Soluble BACE
The two solutions are mixed, and then a solution of the test compound is added and the mixture is kept warm. The conditions for the reaction solution, concentration, temperature, and the like can be appropriately selected in ordinary enzyme reaction experiments. For example, the composition of the reaction solution for screening is 0.2 M NaOAc
-HOAc buffer (pH 4.6), 30μM fluorescent synthesis substrate solution, enzyme solution up to 40% (v / v) can be selected, reaction temperature is 37 ° C
For 14 to 18 hours. The progress of the reaction in the present invention can be monitored by measuring the fluorescence of the culture solution, and a commercially available fluorometer can be used as appropriate. For example, the measurement can be performed using fluoroscan II at ex = 320 nm and em = 405 nm as measurement conditions. Thereby, the amyloid precursor cleavage activity of β-secretase can be measured.
【００１３】本発明の一般式（１）〜（４）で表される
β−セクレターゼ活性阻害剤は、それぞれのアミノ酸残
基に対応するものとして、天然のアミノ酸あるいは合成
アミノ酸を使用することができる。合成アミノ酸とし
て、非天然型のアミノ酸は適宜公知の方法で得ることが
でき、例えば、第４版実験化学講座２２「有機合成Ｉ
Ｖ」（丸善）に準じて製造することができる。更には、
これらの文献、あるいは新生化学実験講座１「タンパク
質ＶＩ」（合成及び発現）（東京化学同人）に記載のペ
プチド合成の方法に準じて製造することができる。The β-secretase activity inhibitors represented by the general formulas (1) to (4) of the present invention can use natural amino acids or synthetic amino acids as corresponding to each amino acid residue. . As a synthetic amino acid, an unnatural amino acid can be appropriately obtained by a known method. For example, the fourth edition of Experimental Chemistry Lecture 22 “Organic Synthesis I”
V "(Maruzen). Furthermore,
It can be produced according to the method of peptide synthesis described in these documents or in Shinsei Kagaku Jikken Koza 1 “Protein VI” (synthesis and expression) (Tokyo Kagaku Dojin).
【００１４】本発明のβ−セクレターゼ活性阻害剤は、
酸性プロテアーゼ阻害剤を有効量含有する製剤であり、
以下のような導入方法、導入形態および導入量で使用さ
れ得る。本発明のβ−セクレターゼ活性阻害剤は、経
口、非経口で患者に投与される。非経口投与としては、
静脈注射による投与、皮下注射、筋肉注射、局所注入、
腹腔内投与、坐薬としての投与などが行える。本発明の
タンパク製剤は、上記の投与方法に依存して、種々の単
位投与形態で投与することができる。例えば静脈投与の
ためには、本発明のタンパク質を、医薬として許容され
得る担体、好ましくは水性担体の中に溶解または懸濁さ
せて用いることができる。水性担体としては、例えば、
水、緩衝化水、０．４％の生理的食塩水などを使用する
ことができる。このようにして作製された水溶液は、そ
のまま包装するか、あるいは凍結乾燥することができ、
凍結乾燥した調製物は投与前に無菌の水溶液に溶解させ
て使用することがある。以上の調製物は、医薬として許
容される補助剤、例えば、pH調節剤あるいは緩衝剤、張
度調節剤、浸潤剤などを、より具体的には、例えば酢酸
ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カ
リウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、
トリエタノールアミンオレエートなどを含有することが
できる。経口投与のためには、本発明のタンパク質を、
粉末、錠剤、ピル、カプセル剤及びシロップ剤の単位投
与形態にして用いることができる。皮下注射、筋肉注
射、局所注入、腹腔内投与のためには、本発明のタンパ
ク質を水性または油担体の中に溶解または懸濁させて用
いることができる。あるいは、コラーゲン等の生体親和
性の材料を用いて、徐放性製剤として投与することもで
きる。製剤中のタンパク質の含量は、治療目的の疾患、
患者の年齢、体重等により適宜調節することができる
が、通常は0.001−100mg、好ましくは0.1−10mgであ
る。The β-secretase activity inhibitor of the present invention comprises:
A formulation containing an effective amount of an acidic protease inhibitor,
The following introduction methods, introduction forms and introduction amounts can be used. The β-secretase activity inhibitor of the present invention is administered orally or parenterally to a patient. For parenteral administration,
Intravenous administration, subcutaneous injection, intramuscular injection, local injection,
Intraperitoneal administration, administration as a suppository, etc. can be performed. The protein preparation of the present invention can be administered in various unit dosage forms depending on the administration method described above. For example, for intravenous administration, the protein of the present invention can be used dissolved or suspended in a pharmaceutically acceptable carrier, preferably an aqueous carrier. As the aqueous carrier, for example,
Water, buffered water, 0.4% saline, and the like can be used. The aqueous solution thus prepared can be packaged as it is or lyophilized,
The lyophilized preparation may be used by dissolving it in a sterile aqueous solution before administration. The above preparations may contain pharmaceutically acceptable auxiliaries, such as pH adjusters or buffers, tonicity adjusters, infiltrant and the like, more specifically, for example, sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, chloride, etc. Potassium, calcium chloride, sorbitan monolaurate,
It can contain triethanolamine oleate and the like. For oral administration, the protein of the invention is
It can be used in unit dosage forms of powders, tablets, pills, capsules and syrups. For subcutaneous injection, intramuscular injection, local injection, or intraperitoneal administration, the protein of the present invention can be used by dissolving or suspending it in an aqueous or oily carrier. Alternatively, it can be administered as a sustained-release preparation using a biocompatible material such as collagen. The content of protein in the formulation depends on the disease to be treated,
The dose can be appropriately adjusted depending on the age, weight and the like of the patient, but is usually 0.001 to 100 mg, preferably 0.1 to 10 mg.
【００１５】[0015]
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるも
のではない。EXAMPLES The present invention will be described below in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
【００１６】実施例１タグ付加可溶性BACE2の製造 1)発現プラスミドpMEBACE2の構築 ヒトBACE2 cDNA全長を含むプラスミドGenBank No. AI27
4802はNCBIより購入した。SalI及びNotI消化により切り
出したcDNAインサート全長を、pUC19をベースとしてSR
αプロモーター、EcoRI-XhoI-NotIリンカー及びSV40のp
oly(A)付加配列を有する発現ベクターのXhoI-NotI間に
挿入した。得られたプラスミドをpMEBACE2と命名した。 2)発現プラスミドpMEBACE2Kの構築 BACE2の発現効率を上昇させるために、BACE2にコザック
のコンセンサス配列を導入した。まず、プライマー 5’
-TCT GAA TTC CGC CAC CAT GGG CGC ACT GGC CCGGGC GC
T-3’および5’-GCC CTT GGA GCG GTA TG-3’を用いてp
MEBACE2を鋳型としてPCRを行って得た断片をEcoRIとBst
XIで消化した後に電気泳動ゲルより約240bpのバンドを
切り出し断片1とした。続いて、pMEBACE2をEcoRIおよび
BstXIで消化して得たベクターを含む大断片2、およびpM
EBACE2をBstXIで消化して得た約1kbの断片3を、いずれ
も電気泳動ゲルからの切り出しにより調製した。断片
1、2及び3を結合することにより、 BACE2の翻訳開始部
位上流をコザックのコンセンサス配列に置換したpMEBAC
E2Kを得た。 PCRにより目的とする変異が導入されたこ
と、および目的外の変異が起きていないことをシークエ
ンシングにより確認した。 3)発現プラスミドpMEBACE2K_TMDの構築 合成オリゴヌクレオチド5’-GTG GAT TGT GTC CTA TCA
TCA TCA CCA TCA CCA TTG AGT GC-3’及び5’-GGC CGC
ACT CAA TGG TGA TGG TGA TGA TGA TAG GAC ACAATC CAC
AAA-3’を、5’末端をリン酸化した後にアニーリング
し、pMEBACE2KをPflMIおよびNotIで消化して得た大断片
と連結した。このようにして得たプラスミドは、 BACE2
の膜貫通ドメイン以降の代わりに6xHisタグを有する融
合タンパクをコードする。本プラスミドをpMEBACE2K_TM
Dと命名した。 4)発現プラスミドpMEBACE2K_Fcの構築 pBSK-hIgGFc-linker+はヒトIgGのFcドメイン（IgG-Fcの
sequence：GENBANK ACCESSION、 Y14735、756塩基目-14
62塩基目）を含み、その5’側にEcoRI-HindIII-SphI-Xh
oIのマルチクローニングサイトを、3’側にNotI-SacIの
サイトを有するプラスミドである。 プライマー5’-CGC
CAA CTT CTT GGC CAT GGT AGA-3’及び5’-TAC GCT CG
A GGC ATA GGA CAC AAT CCA CAA AAT GGG CTC-3’を用
いてpMEBACE2を鋳型としてPCRを行い得られた断片をEco
RI及びXhoIで消化して得た断片を、pBSK-hIgGFc-linker
+のマルチクローニングサイト中のEcoRI-XhoI間に挿入
した。PCRにより目的とする変異が導入されたこと、お
よび目的外の変異が起きていないことをシークエンシン
グにより確認した。得られたプラスミドをPflMI及びNot
Iで消化することにより約750bpの断片を得、 pMEBACE2K
をPflMIおよびNotIで消化して得た大断片と連結した。
このようにして得たプラスミドはBACE2の膜貫通ドメイ
ン以降の代わりにFcタグを有する融合タンパクをコード
する。本プラスミドをpMEBACE2K_Fcと命名した。 5)タグ付加可溶性BACE2の発現および一段階精製 得られたタグ付加可溶性BACE2をコードするプラスミド
をCOS1細胞に導入することにより一過性発現させた。CO
S1細胞を150mmプレートに撒きこみ、50〜70％コンフレ
ントに達した時点でFuGene（ベーリンガーマンハイム）
を用いてプラスミドを導入した。導入条件はFuGeneの取
扱説明書にしたがった。導入後1日目に無血清培地に交
換し、そのまま培養を継続した。7日目ないし8日目に培
養上清を回収し、3000回転、10分間遠心後、-20℃にて
凍結保存した。６ｘHisタグ付加品の一段階精製につい
てはHisTrap（アマシャムファルマシア）を利用し、メ
ーカーの取扱説明書の記載にしたがって、40mM、100mM
及び500mMイミダゾールにて溶出し、1mlづつフラクショ
ネーションを行った。Fcタグ付加品一段階精製について
はHiTrap Protein A（同）を利用し、メーカーの取扱説
明書の記載にしたがって、0.2Mクエン酸-りん酸緩衝液
(pH3.6)により溶出し、1mlづつフラクショネーションを
行った。Embodiment 1Production of tagged soluble BACE2 1)Construction of expression plasmid pMEBACE2 Plasmid GenBank No. AI27 containing the full length human BACE2 cDNA
4802 was purchased from NCBI. Cut by digestion with SalI and NotI
The full-length cDNA insert was converted to SR based on pUC19.
α promoter, EcoRI-XhoI-NotI linker and SV40 p
oly (A) between XhoI-NotI of the expression vector having an additional sequence
Inserted. The resulting plasmid was named pMEBACE2. 2)Construction of expression plasmid pMEBACE2K Kozak is added to BACE2 to increase the expression efficiency of BACE2
A consensus sequence was introduced. First, primer 5 ’
-TCT GAA TTC CGC CAC CAT GGG CGC ACT GGC CCGGGC GC
P using T-3 'and 5'-GCC CTT GGA GCG GTA TG-3'
The fragment obtained by performing PCR using MEBACE2 as a template was EcoRI and Bst
After digestion with XI, an approximately 240 bp band
The cut fragment 1 was obtained. Subsequently, EcoRI and pMEBACE2 were
Large fragment 2 containing vector obtained by digestion with BstXI, and pM
About 1 kb fragment 3 obtained by digesting EBACE2 with BstXI
Was also prepared by cutting out from the electrophoresis gel. fragment
By combining 1, 2 and 3, the translation start part of BACE2
PMEBAC with a Kozak consensus sequence upstream
I got E2K. That the desired mutation was introduced by PCR
And that no unintended mutations have occurred.
Confirmed by lancing. 3)Construction of expression plasmid pMEBACE2K_TMD Synthetic oligonucleotide 5'-GTG GAT TGT GTC CTA TCA
TCA TCA CCA TCA CCA TTG AGT GC-3 'and 5'-GGC CGC
ACT CAA TGG TGA TGG TGA TGA TGA TAG GAC ACAATC CAC
Annealing after AAA-3 'phosphorylation at 5' end
Large fragment obtained by digesting pMEBACE2K with PflMI and NotI
And connected. The plasmid obtained in this way is BACE2
With a 6xHis tag instead of the transmembrane domain
Encode the protein. Transfer this plasmid to pMEBACE2K_TM
Named D. Four)Construction of expression plasmid pMEBACE2K_Fc pBSK-hIgGFc-linker + is a human IgG Fc domain (IgG-Fc
sequence: GENBANK ACCESSION, Y14735, 756th base-14
62nd base) and EcoRI-HindIII-SphI-Xh on the 5 'side
oI multi-cloning site with NotI-SacI
It is a plasmid having a site. Primer 5'-CGC
CAA CTT CTT GGC CAT GGT AGA-3 'and 5'-TAC GCT CG
A GGC ATA GGA CAC AAT CCA CAA AAT GGG CTC-3 ’
The fragment obtained by performing PCR using pMEBACE2 as a template
The fragment obtained by digestion with RI and XhoI was digested with pBSK-hIgGFc-linker.
Insert between EcoRI and XhoI in the + multiple cloning site
did. That the desired mutation was introduced by PCR,
And that no unintended mutations have occurred
Confirmation. The resulting plasmid was transformed with PflMI and Not
An approximately 750 bp fragment was obtained by digestion with I, and pMEBACE2K
Was ligated with the large fragment obtained by digestion with PflMI and NotI.
The plasmid thus obtained is used as a transmembrane domain for BACE2.
Code fusion protein with Fc tag instead of
I do. This plasmid was designated as pMEBACE2K_Fc. Five)Expression and one-step purification of tagged soluble BACE2 Plasmid encoding the resulting soluble BACE2 with tag
Was transiently expressed by introducing it into COS1 cells. CO
Spread S1 cells on a 150mm plate and use 50-70% confluence
At the end of the project, FuGene (Boehringer Mannheim)
Was used to introduce the plasmid. Installation conditions are FuGene's
According to the instruction manual. Change to serum-free medium 1 day after introduction
The culture was continued as it was. Culture on days 7-8
Collect the culture supernatant, centrifuge at 3,000 rpm for 10 minutes, and
Stored frozen. One-step purification of 6xHis-tagged product
Using HisTrap (Amersham Pharmacia)
40mM, 100mM as described in the manufacturer's instruction manual
And 500 mM imidazole.
Nation went. One-step purification with Fc-tagged products
Uses HiTrap Protein A (same as above)
0.2 M citrate-phosphate buffer as described in the specification
(pH 3.6) and elute fractions in 1 ml increments.
went.
【００１７】実施例２タグ付加可溶性BACE2のアミロイド前駆体切断活性測定 アミロイド前駆体として合成蛍光基質MOCAc-SEVNLDAEFR
K(Dnp)RR-NH2を使用した。本合成蛍光基質はペプチド研
究所より購入し、メーカーの取扱説明書の記載にしたが
った。反応液組成は0.2M NaOAc-HOAc buffer(pH4.6)、3
0μM蛍光合成基質溶液、酵素液量最大40%(v/v)とした。
37℃で14〜18時間反応後、フルオロスキャンIIにてex=3
20nm、em=405nmで蛍光測定を行った。結果を以下に示
す。 Embodiment 2Measurement of amyloid precursor cleavage activity of tagged soluble BACE2 Synthetic fluorescent substrate MOCAc-SEVNLDAEFR as amyloid precursor
K (Dnp) RR-NH2 was used. This synthetic fluorescent substrate is
According to the manufacturer's instruction manual
Was. The reaction solution composition was 0.2 M NaOAc-HOAc buffer (pH 4.6), 3
The amount of the 0 μM fluorescent synthetic substrate solution and the amount of the enzyme solution were 40% (v / v) at maximum.
After reaction at 37 ° C for 14-18 hours, ex = 3 by Fluoroscan II
Fluorescence was measured at 20 nm, em = 405 nm. The results are shown below
You.
【００１８】実施例３タグ付加可溶性BACE2に対するペプスタチンAのβセクレ
ターゼ阻害作用 実施例２と同様の反応系にてペプスタチンAの阻害作用
を検討した。50μM及び5μM ペプスタチンAは1mMメタノ
ール溶液を調製し、5%及び0.5%(v/v)にて反応液に添加
した。比較のため5%及び0.5%メタノールのみの阻害効果
も検討した。反応は3連で行った。 ペプスタチンAは50
μMで明らかな阻害活性を、5μMでも約30%の阻害活性を
示した。結果を図１に示す。P10-P4'statVも１μMで明
らかなBACE2阻害活性を示したが、これはSinhaら（Sinh
a, S. et al., Nature, 402, 537-540(1999)）がBACE1
をIC50=約30nMで阻害することを報告している基質アナ
ログである。同文献ではペプスタチンはBACE1を阻害し
ないことが報告されている。以上の結果から、ペプスタ
チンAはBACE1を阻害せず、選択的にBACE２を阻害するこ
とが示された。また、公知のβセクレターゼの阻害剤で
あるP10-P4'statVはBACE２を阻害するものの、より選択
的にBACE１を阻害するものであることが示された。Example 3 β-Secret of Pepstatin A against Tagged Soluble BACE2
Inhibition of pepstatin A was examined in the same reaction system as in Example 2. 50 μM and 5 μM pepstatin A were prepared as 1 mM methanol solutions and added to the reaction solution at 5% and 0.5% (v / v). For comparison, the inhibitory effect of only 5% and 0.5% methanol was also examined. Reactions were performed in triplicate. Pepstatin A is 50
The inhibitory activity was apparent at μM, and about 30% at 5 μM. The results are shown in FIG. P10-P4'statV also showed a clear BACE2 inhibitory activity at 1 μM, as shown by Sinha et al. (Sinh
a, S. et al., Nature, 402 , 537-540 (1999))
Is a substrate analog that has been reported to inhibit IC50 at about 30 nM. The document reports that pepstatin does not inhibit BACE1. The above results indicated that pepstatin A did not inhibit BACE1, but selectively inhibited BACE2. In addition, it was shown that P10-P4′statV, a known β-secretase inhibitor, inhibits BACE2, but more selectively inhibits BACE1.
【００１９】実施例４タグ付加可溶性BACE2に対する種々の酵素阻害剤のβセ
クレターゼ活性阻害作用 実施例３と同様の反応系にて種々の酵素阻害剤の阻害作
用を検討した。各種酵素阻害剤の50μM及び5μMについ
ては１ｍM 溶液をDMSOにて調製した。ただし、Pepstati
nはメタノールにて、PhosphoramidoneはｄH2Oにて1mM溶
液を調製した。各々、5%及び0.5%(v/v)にて反応液に添
加した。0.5μMについては1mM溶液をdH2Oにて1/10希釈
し、0.5%(v/v)にて反応液に添加した。LLLal（MG-13
2）、LLnVal（MG-115）についてはペプスタチンAと同等
以上の阻害効果を認めた。なお、BACE1に対して同様の
検討を行った結果、これらの阻害剤はいずれもBACE1に
対して阻害効果を示さなかった。結果を図２に示す。Embodiment 4Β-separation of various enzyme inhibitors against tagged BACE2
Cretase activity inhibitory action Inhibition of various enzyme inhibitors in the same reaction system as in Example 3.
Was considered. About 50 μM and 5 μM of various enzyme inhibitors
A 1 mM solution was prepared in DMSO. However, Pepstati
n is methanol, Phosphoramidone is dHTwo1mM dissolved in O
A liquid was prepared. Add to the reaction solution at 5% and 0.5% (v / v), respectively.
Added. For 0.5 μM, add 1 mM solution to dHTwo1/10 dilution with O
Then, it was added to the reaction solution at 0.5% (v / v). LLLal (MG-13
2), LLnVal (MG-115) is equivalent to pepstatin A
The above inhibitory effects were observed. The same applies to BACE1
As a result of the investigation, all of these inhibitors became BACE1
No inhibitory effect was observed. The results are shown in FIG.
【００２０】実施例５タグ付加可溶性BACE2に対する他の酸性プロテアーゼ阻
害剤のβセクレターゼ活性阻害作用とその再現性（LLL
（MG-132）、LLnV（MG-115）、HIV protease inhibitor
の阻害効果） 実施例４と同様にしてLLL、LLnV及び酸性プロテアーゼ
阻害剤であるHIV protease inhibitorのBACE2阻害効果
を検討した。HIV protease inhibitorはDMSOにて1mM溶
液とした。反応は3連で行った。その結果、以下に示す
ように、HIV protease inhibitorは阻害作用を示さなか
ったが、LLL、LLnVについては阻害効果の再現性を確認
した。結果を図３に示す。以上の結果より、ペプスタチ
ンA、LLL及びLLnVがBACE2活性を阻害することが明らか
となった。EXAMPLE 5 Other Acidic Protease Inhibition Against Tagged Soluble BACE2
Β-secretase activity inhibitory action of harmful agents and its reproducibility (LLL
(MG-132), LLnV (MG-115), HIV protease inhibitor
Were examined LLL, the BACE2 inhibitory effect of HIV Protease Inhibitor is LLnV and acidic protease inhibitors inhibitory effect) in the same manner as in Example 4. HIV protease inhibitor was prepared as a 1 mM solution in DMSO. Reactions were performed in triplicate. As a result, as shown below, HIV protease inhibitor did not show an inhibitory effect, but reproducibility of the inhibitory effect was confirmed for LLL and LLnV. The results are shown in FIG. The above results revealed that pepstatin A, LLL and LLnV inhibit BACE2 activity.
【００２１】[0021]
【発明の効果】本発明により、ペプシン・ファミリーの
酸性プロテアーゼ阻害剤を有効成分とするβ-セレクタ
ーゼ活性阻害剤が提供される。特に、本発明のβ-セレ
クターゼ活性阻害剤はBACE-2の活性阻害剤として有効で
あり、優れたβ−アミロイド沈着性神経変性疾患治療剤
として有用である。Industrial Applicability According to the present invention, there is provided a β-selectase activity inhibitor containing a pepsin family acidic protease inhibitor as an active ingredient. In particular, the β-selectase activity inhibitor of the present invention is effective as a BACE-2 activity inhibitor, and is useful as an excellent therapeutic agent for β-amyloid deposition neurodegenerative disease.
【図１】実施例３における可溶化BACE2のアミロイド前
駆体合成蛍光基質切断に対する阻害剤の効果を示すグラ
フである。FIG. 1 is a graph showing the effect of an inhibitor on the cleavage of a fluorescent substrate for amyloid precursor synthesis of solubilized BACE2 in Example 3.
【図２】実施例４におけるタグ付加可溶性ＢＡＣＥ−２
に対する種々の酵素阻害剤のβセクレターゼ活性阻害作
用を示すグラフである。FIG. 2: Tagged soluble BACE-2 in Example 4
4 is a graph showing the inhibitory action of various enzyme inhibitors on β-secretase activity against.
【図３】実施例５におけるLLL、LLnV及び酸性プロテア
ーゼ阻害剤であるHIV protease inhibitorのBACE2阻害
効果を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the BACE2 inhibitory effects of LLL, LLnV and HIV protease inhibitor, which is an acidic protease inhibitor, in Example 5.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｃ０７Ｋ 5/027 33/53 Ａ６１Ｋ 37/64 // Ｃ０７Ｋ 5/027 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB10 BB41 BB46 BB48 BB51 DA77 FB01 FB02 GC15 4B024 AA01 BA80 CA01 GA11 4C084 AA01 AA02 AA07 AA17 BA01 BA08 BA10 BA14 BA15 BA31 DC38 MA01 NA14 ZA162 ZC202 4H045 AA10 BA12 BA13 CA11 DA55 EA20 EA28 FA74 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 15/09 ZNA G01N 33/50 Z G01N 33/15 33/53 D 33/50 C07K 5/027 33 / 53 A61K 37/64 // C07K 5/027 C12N 15/00 ZNAA F-term (reference) 2G045 AA35 BB10 BB41 BB46 BB48 BB51 DA77 FB01 FB02 GC15 4B024 AA01 BA80 CA01 GA11 4C084 AA01 AA02 AA31 BA01 BA08 BA08 BA08 NA14 ZA162 ZC202 4H045 AA10 BA12 BA13 CA11 DA55 EA20 EA28 FA74
Claims (20)
ゼ阻害剤を有効成分とするβ-セクレターゼ活性阻害
剤。1. A β-secretase activity inhibitor comprising as an active ingredient a pepsin family acidic protease inhibitor.
ゼがペプシンである請求項１記載のβ-セクレターゼ活
性阻害剤。2. The β-secretase activity inhibitor according to claim 1, wherein the acidic protease of the pepsin family is pepsin.
ゼ阻害剤がペプスタチンＡである請求項２記載のβ-セ
クレターゼ活性阻害剤。3. The β-secretase activity inhibitor according to claim 2, wherein the acidic protease inhibitor of the pepsin family is pepstatin A.
ノ酸配列の蛋白である、請求項１〜３のいずれか記載の
β-セクレターゼ活性阻害剤。4. The β-secretase activity inhibitor according to claim 1, wherein the β-secretase is a protein having an amino acid sequence of BACE-2.
ゼ阻害剤を有効成分とするβ−アミロイド沈着性神経変
性疾患治療剤。5. A therapeutic agent for β-amyloid-depositing neurodegenerative disease, which comprises an acidic protease inhibitor of the pepsin family as an active ingredient.
ゼがペプシンである請求項５記載のβ−アミロイド沈着
性神経変性疾患治療剤。6. The therapeutic agent for β-amyloid deposition neurodegenerative disease according to claim 5, wherein the acidic protease of the pepsin family is pepsin.
ゼ阻害剤がペプスタチンＡである請求項６記載のβ−ア
ミロイド沈着性神経変性疾患治療剤。7. The therapeutic agent for β-amyloid deposition neurodegenerative disease according to claim 6, wherein the acidic protease inhibitor of the pepsin family is pepstatin A.
ルツハイマー病である、請求項５〜７のいずれかの神経
変性疾患治療剤。8. The therapeutic agent for a neurodegenerative disease according to claim 5, wherein the β-amyloid depositing neurodegenerative disease is Alzheimer's disease.
するペプチドを含有することを特徴とするβ-セクレタ
ーゼ活性阻害剤、 一般式(1)のＣ−末３アミノ酸残基アルデヒド 【化１】 ［式中、Ｒ１、Ｒ３はそれぞれ独立に直鎖または分枝状
の低級アルキル基を表し、Ｒ２はアミノ基、水酸基、カ
ルボキシル基または、カルバモイル基で置換されていて
もよい直鎖または分枝状の低級アルキル基を表す。］ 一般式(2)の３アミノ酸残基からなるペプチド 【化２】 ［式中、Ｒ４、Ｒ６はそれぞれ独立に直鎖または分枝状
の低級アルキル基を表し、Ｒ５はアミノ基、水酸基、カ
ルボキシル基、カルバモイル基あるいはメチルチオ基で
置換されていてもよい直鎖または分枝状の低級アルキル
基を表す。］ 一般式(3)のＣ−末３アミノ酸残基アルデヒド 【化３】 ［式中、Ｒ１、Ｒ２ 、Ｒ３はそれぞれ独立に前項と同
じ意味を表す。］ 一般式(4)の３アミノ酸残基からなるペプチド 【化４】 ［式中、Ｒ４、Ｒ５ 、Ｒ６はそれぞれ独立に前項と同
じ意味を表す。］9. A β-secretase activity inhibitor, which comprises a peptide having the following partial structure, or a C-terminal 3 amino acid residue aldehyde of the general formula (1): [Wherein, R 1 and R 3 each independently represent a linear or branched lower alkyl group, and R 2 represents a linear or branched group that may be substituted with an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, or a carbamoyl group. Represents a branched lower alkyl group. ] A peptide comprising three amino acid residues of the general formula (2): [In the formula, R 4 and R 6 each independently represent a linear or branched lower alkyl group, and R 5 represents a direct group optionally substituted with an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a carbamoyl group or a methylthio group. Represents a chain or branched lower alkyl group. ] C-terminal 3 amino acid residue aldehyde of the general formula (3) [Wherein, R 1 , R 2 and R 3 each independently represent the same meaning as in the preceding paragraph. ] A peptide comprising three amino acid residues of the general formula (4): [Wherein, R 4 , R 5 and R 6 each independently represent the same meaning as in the preceding paragraph. ]
チル基、ｎ−プロピル基、iso−プロピル基、１−メチ
ルプロピル基、２−メチルプロピル基、ｎ−ブチル基あ
るいは２−メチルチオエチル基の何れかであり、Ｒ２、
Ｒ５がメチル基、ｎ−プロピル基、iso−プロピル基、
１−メチルプロピル基、２−メチルプロピル基、ｎ−ブ
チル基、２−カルバモイルエチル基、２−カルボキシエ
チル基、４−アミノブチル基あるいは２−メチルチオエ
チル基の何れかである、請求項９記載のβ-セクレター
ゼ活性阻害剤。10. R 1 , R 3 , R 4 and R 6 each represent a methyl group, an n-propyl group, an iso-propyl group, a 1-methylpropyl group, a 2-methylpropyl group, an n-butyl group or a 2- Any of methylthioethyl groups, R 2 ,
R 5 is a methyl group, an n-propyl group, an iso-propyl group,
10. A 1-methylpropyl group, 2-methylpropyl group, n-butyl group, 2-carbamoylethyl group, 2-carboxyethyl group, 4-aminobutyl group or 2-methylthioethyl group. Β-secretase activity inhibitor.
−プロピル基、iso−プロピル基、１−メチルプロピル
基、２−メチルプロピル基あるいはｎ−ブチル基の何れ
かであり、Ｒ２、Ｒ５がメチル基、２−カルバモイルエ
チル基、４−アミノブチル基あるいは２−メチルチオエ
チル基の何れかである、請求項９、１０記載のβ-セク
レターゼ活性阻害剤。11. Each of R 1 , R 3 , R 4 and R 6 is n.
-Propyl group, iso-propyl group, 1-methylpropyl group, 2-methylpropyl group or n-butyl group, wherein R 2 and R 5 are methyl group, 2-carbamoylethyl group, 4-aminobutyl The β-secretase activity inhibitor according to claim 9, which is any one of a group and a 2-methylthioethyl group.
セクレターゼ活性阻害剤を有効成分とするβ−アミロイ
ド沈着性神経変性疾患治療剤。12. The β- according to claim 9, 10 or 11
A therapeutic agent for β-amyloid deposition neurodegenerative disease comprising a secretase activity inhibitor as an active ingredient.
アルツハイマー病である、請求項１２記載の治療剤。13. The therapeutic agent according to claim 12, wherein the β-amyloid depositing neurodegenerative disease is Alzheimer's disease.
レターゼ活性阻害剤を有効成分とするβ−アミロイド生
成抑制剤。14. A β-amyloid production inhibitor comprising the β-secretase activity inhibitor according to claim 9, 10 or 11 as an active ingredient.
活性阻害剤のスクリーニング方法。 (1)精製タグ付加可溶性BACE2と、合成蛍光基質MOCAc-SE
VNLDAEFRK(Dnp)RR-NH2のバッファー溶液を混合する、
(2)次いで被験化合物の溶液を加えて保温する、(3)培養
液の蛍光測定し、アミロイド前駆体の切断活性を測定す
る、15. A method for screening a β-secretase activity inhibitor comprising the following steps. (1) Purified tagged soluble BACE2 and synthetic fluorescent substrate MOCAc-SE
Mix the buffer solution of VNLDAEFRK (Dnp) RR-NH2,
(2) Then add the test compound solution to keep warm, (3) measure the fluorescence of the culture solution, measure the amyloid precursor cleavage activity,
し、ペプスタチンA以上の阻害活性を有するβ−セクレ
ターゼ活性阻害剤を選別することを特徴とする、請求項
１５記載のスクリーニング方法。16. The screening method according to claim 15, wherein pepstatin A is used as a reference substance, and a β-secretase activity inhibitor having an inhibitory activity equal to or higher than pepstatin A is selected.
により得られるペプスタチンA以上の阻害活性を有する
β−セクレターゼ活性阻害剤。17. A β-secretase activity inhibitor having an inhibitory activity of pepstatin A or higher obtained by the screening method according to claim 16.
性阻害剤を有効成分とするβアミロイド生成抑制剤。18. A β-amyloid production inhibitor comprising the β-secretase activity inhibitor according to claim 17 as an active ingredient.
性阻害剤を有効成分とするβ−アミロイド沈着性神経変
性疾患治療剤。19. A therapeutic agent for β-amyloid deposition neurodegenerative disease, comprising the β-secretase activity inhibitor according to claim 17 as an active ingredient.
アルツハイマー病である、請求項１９記載の治療剤。20. The therapeutic agent according to claim 19, wherein the β-amyloid depositing neurodegenerative disease is Alzheimer's disease.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005037316A1 (en) * | 2003-10-20 | 2005-04-28 | Locomogene, Inc. | Method of inhibiting secretase activity |
| WO2020130205A1 (en) * | 2018-12-21 | 2020-06-25 | 경상대학교병원 | Pharmaceutical composition and health function food comprising pepsin inhibitor |
-
2000
- 2000-12-01 JP JP2000367737A patent/JP2002173448A/en active Pending
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|---|---|---|---|---|
| WO2005037316A1 (en) * | 2003-10-20 | 2005-04-28 | Locomogene, Inc. | Method of inhibiting secretase activity |
| WO2020130205A1 (en) * | 2018-12-21 | 2020-06-25 | 경상대학교병원 | Pharmaceutical composition and health function food comprising pepsin inhibitor |
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