JP2002145784A - Biologically active medicament-introducing composition and method for using the same - Google Patents
Biologically active medicament-introducing composition and method for using the sameInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、パーフルオロカー
ボンを含有するアルブミン由来の微小気泡含有小球体を
含有することを特徴とする生物学的活性薬剤導入組成物
およびその使用方法に関する。[0001] The present invention relates to a composition for introducing a biologically active agent, which is characterized by containing microbubbles containing microbubbles derived from albumin containing perfluorocarbon, and a method for using the same.
【０００２】[0002]
【従来の技術】超音波診断法は、超音波の特性を利用
し、生体内部での組織間距離や物質性状の識別などを、
非侵襲的にリアルタイムな視覚的情報として得る診断方
法である。また、操作方法が簡便で、装置が安価である
などの特長があり、心臓領域をはじめとする循環器疾
患、消化器疾患、悪性腫瘍の診断・治療等において重要
な役割を果たしている。超音波診断用装置は、すでにＭ
ＲＩやＣＴ装置の数倍から数十倍にあたる約５万台が国
内で設置されており、あらゆる地域で診断を受けること
が可能となっている。このような超音波診断法に、さら
に造影剤を用いることにより、画像の明瞭化が図られ、
より正確な診断を行うことが可能となる。造影剤の使用
により、今後、診断医学において超音波診断法が一層有
用となることが予想される。2. Description of the Related Art Ultrasound diagnostic methods use the characteristics of ultrasonic waves to determine the distance between tissues and the properties of materials inside a living body.
This is a diagnostic method to obtain non-invasive real-time visual information. Further, it has features such as simple operation method and inexpensive device, and plays an important role in diagnosis and treatment of circulatory diseases, digestive diseases and malignant tumors including the heart region. Ultrasound diagnostic equipment is already M
Approximately 50,000 units, several to several tens of times that of RI and CT devices, are installed in Japan, and it is possible to receive diagnosis in any region. By using a contrast agent in such an ultrasonic diagnostic method, the image is clarified,
More accurate diagnosis can be performed. It is expected that the use of a contrast agent will make the ultrasonic diagnostic method more useful in diagnostic medicine in the future.
【０００３】超音波はまた、種々の低分子医薬品の吸収
を増加させるために用いられている。例えば、米国特許
第４９５３５６５号公報および同第５００７４３８号公
報には、医薬品の経皮吸収が超音波振動によって増大す
ることが示されている。超音波を用い、細胞内へ生理活
性物質を導入する試みとしては、米国特許第５３１５９
９８号公報において、医薬品を拡散および透過させるた
めに微小気泡を含む組成物と超音波との組み合わせが示
されている。また、立花ら（ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ
Ｓｙｓｔｅｍにおける超音波の応用，日本薬理学雑
誌，１１４：１３８−１４１，１９９９）は、超音波を
用いた場合の生体内における薬物の効果の増強を示して
いる。[0003] Ultrasound has also been used to increase the absorption of various small molecule pharmaceuticals. For example, U.S. Pat. Nos. 4,953,565 and 5,007,438 show that transdermal absorption of pharmaceuticals is increased by ultrasonic vibration. Attempts to introduce a bioactive substance into cells using ultrasound have been disclosed in US Pat.
No. 98 discloses a combination of a composition containing microbubbles and ultrasonic waves for diffusing and transmitting a drug. Tachibana et al. (DrugDelivery)
Application of Ultrasound in System, Pharmacological Journal of Japan, 114: 138-141, 1999) shows the enhancement of the effect of a drug in a living body when using ultrasound.
【０００４】一方、超音波を用いて遺伝子等の核酸医薬
を細胞内に導入する試みも行われている。田畑ら（ソノ
テクノロジーの応用 超音波による薬物の作用増強，ケ
ミカルエンジニヤリング，４５：２５４−２５７，２０
００）は、超音波を用いることにより、培養細胞に遺伝
子を導入することが可能であることを示している。ま
た、ＷＯ２００００４０６号公報およびＷＯ９９３３５
００号公報には、超音波を用いることにより、生体内に
おけるプラスミドＤＮＡでの遺伝子発現が増強されるこ
とが示されている。また、特表２０００−５０７９３１
号公報においては、超音波診断に用いる造影剤を共存さ
せることにより、超音波を用いてアンチセンス核酸の生
体での取込み量が増強するとともに、培養細胞系におい
てはプラスミドＤＮＡでの遺伝子発現が増強されること
が示されている。[0004] On the other hand, attempts have been made to introduce nucleic acid drugs such as genes into cells using ultrasonic waves. Tabata et al. (Application of sonotechnology Enhancement of drug action by ultrasound, chemical engineering, 45: 254-257, 20
00) indicates that it is possible to introduce a gene into cultured cells by using ultrasound. In addition, WO20000406 and WO99335
No. 00 discloses that the use of ultrasonic waves enhances gene expression of plasmid DNA in vivo. In addition, JP-T-2000-507931
In the gazette, the coexistence of a contrast agent used for ultrasonic diagnosis increases the amount of antisense nucleic acid taken up in a living body using ultrasonic waves, and also enhances gene expression in plasmid DNA in a cultured cell system. Has been shown to be.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】このような状況を鑑み
て、本発明は、直接生体内に遺伝子等を導入することが
できる生物学的活性薬剤導入組成物およびその使用方法
を提供することを課題とする。In view of such circumstances, the present invention provides a composition for introducing a biologically active agent which can directly introduce a gene or the like into a living body, and a method for using the same. Make it an issue.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、本来超音波診
断用造影剤として用いられているパーフルオロカーボン
を含有するアルブミン由来の微小気泡含有小球体を含有
する組成物を用いることにより、超音波照射によって生
体内の特定部位に遺伝子を導入できることを見出し、本
発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The inventors of the present invention have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that microparticles derived from albumin containing perfluorocarbon which are originally used as a contrast agent for ultrasonic diagnostics. The present inventors have found that a gene can be introduced into a specific site in a living body by ultrasonic irradiation by using a composition containing bubble-containing small spheres, thereby completing the present invention.
【０００７】すなわち、本発明は、生体の特定部位に生
物学的活性薬剤を送達するための組成物であって、パー
フルオロカーボンを含有するアルブミン由来の微小気泡
含有小球体を含有することを特徴とする生物学的活性薬
剤導入組成物である。[0007] That is, the present invention is a composition for delivering a biologically active agent to a specific site in a living body, characterized in that the composition comprises microbubbles containing microbubbles derived from albumin containing perfluorocarbon. A biologically active agent-introducing composition.
【０００８】本発明はまた、生物学的活性薬剤が、オリ
ゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ト
リプルヘリックスフォーミングオリゴヌクレオチド、オ
リゴヌクレオチドプローブ、ヌクレオチドベクター、ウ
イルスベクターおよびプラスミドからなる群より選択さ
れる少なくとも一つであることを特徴とする前記生物学
的活性薬剤導入組成物である。[0008] The present invention also provides that the biologically active agent is at least one selected from the group consisting of oligonucleotides, antisense oligonucleotides, triple helix forming oligonucleotides, oligonucleotide probes, nucleotide vectors, viral vectors and plasmids. The biologically active agent-introducing composition according to the above, wherein
【０００９】本発明はさらに、前記生物学的活性薬剤が
特定部位に取り込まれるように、当該特定部位を超音波
に曝露することを特徴とする前記生物学的活性薬剤導入
組成物の使用方法である。以下、本発明を詳細に説明す
る。The present invention further provides a method for using the composition for introducing a biologically active agent, which comprises exposing the biologically active agent to an ultrasonic wave so that the biologically active agent is taken into the specific site. is there. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
【００１０】[0010]
【発明の実施の形態】本発明の生物学的活性薬剤導入組
成物は、生体へ直接遺伝子等を導入するための組成物で
あり、不溶性ガスであるパーフルオロカーボンを含有す
るアルブミン由来の微小気泡含有小球体を担体として含
有する。このパーフルオロカーボンを含有するアルブミ
ン由来の微小気泡含有小球体は、本来超音波診断用造影
剤として使用されているものである。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The composition for introducing a biologically active agent of the present invention is a composition for directly introducing a gene or the like into a living body, and contains microbubbles derived from albumin containing perfluorocarbon which is an insoluble gas. Contains microspheres as carrier. This microsphere containing microbubbles derived from albumin containing perfluorocarbon is originally used as a contrast agent for ultrasonic diagnosis.
【００１１】本発明の生物学的活性薬剤導入組成物に含
まれる、不溶性ガスであるパーフルオロカーボンを含有
するアルブミン由来の微小気泡含有小球体としては、特
に限定されないが、発明者の鋭意研究により、ＯＰＴＩ
ＳＯＮ（商標名：米国モレキュラー・バイオシステムズ
・インク社製）が特に好ましく用いられることが判明し
ている。ＯＰＴＩＳＯＮは、すでに超音波診断用造影剤
として使用されており、その安全性が保証されているも
のである。The microbubble-containing microspheres derived from albumin containing the insoluble gas perfluorocarbon contained in the composition for introducing a biologically active agent of the present invention are not particularly limited. OPTI
It has been found that SON (trade name: manufactured by Molecular Biosystems, Inc., USA) is particularly preferably used. OPTISON has already been used as a contrast agent for ultrasonic diagnosis, and its safety is guaranteed.
【００１２】本発明の生物学的活性薬剤導入用組成物に
含有されることができる生物学的活性薬剤は、特に限定
されないが、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴ
ヌクレオチド、トリプルヘリックスフォーミングオリゴ
ヌクレオチド（ＴＦＯ）、オリゴヌクレオチドプロー
ブ、ヌクレオチドベクター、ウイルスベクターおよびプ
ラスミドからなる群より選択される少なくとも一つの生
物学的活性薬剤を含有することが好ましい。これらの中
でも特に、生理活性を有する遺伝子をコードしたプラス
ミドＤＮＡが好ましく用いられる。The biologically active agent that can be contained in the composition for introducing a biologically active agent of the present invention is not particularly limited, but may be an oligonucleotide, an antisense oligonucleotide, a triple helix forming oligonucleotide (TFO). And at least one biologically active agent selected from the group consisting of oligonucleotide probes, nucleotide vectors, viral vectors and plasmids. Among these, a plasmid DNA encoding a gene having a physiological activity is preferably used.
【００１３】また、プラスミドＤＮＡにコードされる遺
伝子の生理活性は、特に限定されないが、例えば、疾患
に対応する遺伝子、即ち、疾患に対して拮抗的に作用す
る遺伝子や疾患における欠如を補足する遺伝子が用いら
れる。このような遺伝子としては、例えば、サイトカイ
ン、成長因子、抗体または抗体断片、サイトカインまた
は成長因子に対するレセプター、増殖防止または増殖抑
制作用を有するタンパク質、酵素、脈関係抑制剤、血栓
誘発物質、および凝集抑制剤、フィブリン溶解作用を有
するタンパク質、ウイルスコートタンパク質、細菌性抗
原および寄生動物性抗原、腫瘍抗原、血液循環に効果を
有するタンパク質、ペプチドホルモン、ならびにリボザ
イムおよびアンチセンスＲＮＡのようなリボ核酸からな
る群より選択される薬理活性化合物をコードする遺伝子
等が挙げられる。The physiological activity of the gene encoded by the plasmid DNA is not particularly limited. For example, a gene corresponding to a disease, that is, a gene that acts antagonistically to a disease or a gene that complements a lack in a disease. Is used. Such genes include, for example, cytokines, growth factors, antibodies or antibody fragments, receptors for cytokines or growth factors, proteins having an antiproliferative or antiproliferative effect, enzymes, pulse-related inhibitors, thrombogenic substances, and aggregation inhibitors. Agents, proteins having fibrinolytic action, virus coat proteins, bacterial and parasite antigens, tumor antigens, proteins having an effect on blood circulation, peptide hormones, and ribonucleic acids such as ribozymes and antisense RNA And a gene encoding a pharmacologically active compound selected from the group consisting of:
【００１４】本発明のパーフルオロカーボンを含有する
アルブミン由来の微小気泡含有小球体を含有する生物学
的活性薬剤導入組成物は、例えば、担体としての上記Ｏ
ＰＴＩＳＯＮと、薬剤としてのプラスミドＤＮＡを混合
することにより得ることができる。すなわち、これらを
混合することにより、パーフルオロカーボンを含有する
アルブミン由来の微小気泡含有小球体と生物学的活性薬
剤であるプラスミドＤＮＡとが結合若しくは近隣に存在
する形態をとる。The composition for introducing a biologically active agent containing microbubbles containing microbubbles derived from albumin containing perfluorocarbon according to the present invention is, for example, the above-mentioned O as a carrier.
It can be obtained by mixing PTISON and plasmid DNA as a drug. That is, by mixing them, a microsphere containing microbubbles derived from albumin containing perfluorocarbon and a plasmid DNA which is a biologically active agent are bound or located nearby.
【００１５】本発明の生物学的活性薬剤導入組成物に含
まれるプラスミドＤＮＡは、コードしている遺伝子を導
入したい特定部位に本発明の組成物が達した際に、当該
特定部位に超音波に曝露する。超音波のエネルギーによ
り小球体の微小気泡が破裂し、特定部位に存在する細胞
に安全性には影響がないレベルの衝撃を与え、細胞に遺
伝子等の生物学的活性薬剤を導入することが可能とな
る。[0015] The plasmid DNA contained in the composition for introducing a biologically active agent of the present invention, when the composition of the present invention reaches a specific site into which the gene encoding the gene is to be introduced, is sonicated at the specific site. Expose. Ultrasonic energy bursts microbubbles in small spheres, impacting cells at specific sites without affecting safety, and introducing genes and other biologically active agents into cells Becomes
【００１６】よって、本発明は、本発明の生物学的活性
薬剤導入組成物を投与し、生体の特定の部位に生物学的
活性薬剤が取り込まれるように、認識部位（当該特定部
位）を超音波に暴露する行程を含む前記生物学的活性薬
剤導入組成物の使用方法を包含するものである。Accordingly, the present invention provides a method for administering a biologically active agent-introducing composition according to the present invention, in which a biologically active agent is incorporated into a specific site of a living body, and the recognition site (the specific site) is superposed. And a method of using said biologically active agent-introducing composition comprising the step of exposing to sound waves.
【００１７】なお、このような方法で遺伝子を導入する
ことが可能な特定部位としては、特に制限はないが、例
えば、脳、消化器官、血管、筋肉、または種々の疾患部
位が挙げられ、特に腫瘍組織への投与は好ましい。The specific site into which a gene can be introduced by such a method is not particularly limited, and includes, for example, brain, digestive organs, blood vessels, muscles, and various disease sites. Administration to tumor tissue is preferred.
【００１８】[0018]
【実施例】以下、実施例を示して本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらにより限定されるもので
はない。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following Examples, which should not be construed as limiting the invention thereto.
【００１９】〔実施例１〕 脳への遺伝子導入実験 体重３５０〜４００ｇのＷＫＹ系雄性ラットを、ネンブ
タール（０．１ｍｌ／１００ｇ）で麻酔した後、頭頂部
をバリカンで剃毛、左外頸動脈にＰＥ１０チューブでカ
ニュレ−ションを行った。その後、頭頂部にジェルをは
さんで超音波発信用プロ−ベを固定した。ゆっくり２分
間かけて左内頸動脈に容量１ｍｌのルシフェラーゼ遺伝
子をコードしたプラスミド（ｐＬｕｃ）溶液、ｐＬｕｃ
とＯＰＴＩＳＯＮの混合溶液またはｐＬｕｃとＬＥＶＯ
ＶＩＳＴ（商標名；モレキュラー・バイオシステムズ・
インク社製）の超音波診断用造影剤の混合溶液を動脈注
射すると同時に、連続２分間、頭蓋骨の上から２．５Ｗ
／ｃｍ２または５Ｗ／ｃｍ ２の超音波を照射した。２４
時間後に脳（大脳、中脳、小脳、延髄）を取り出し、左
脳と右脳に２分してルシフェラーゼの活性を測定した。
その際、ＯＰＴＩＳＯＮは薬物原液を、ＬＥＶＯＶＩＳ
Ｔは３００ｍｇ／ｍｌを使用した。Example 1 Experiment of Gene Transfer into the Brain A male WKY rat weighing 350 to 400 g was placed
After anesthesia with tar (0.1 ml / 100 g),
Is shaved with a clipper, and the left external carotid artery is
Nuration was performed. Then put gel on top
Fixed the probe for transmitting ultrasound. 2 minutes slowly
1 ml of luciferase inherited in the left internal carotid artery over time
Plasmid encoding plasmid (pLuc), pLuc
And OPTICON mixed solution or pLuc and LEVO
VIST (trade name; Molecular Biosystems)
Ink Co., Ltd.) mixed solution of ultrasound contrast agent
2.5W from the top of the skull for 2 minutes continuously
/ Cm2Or 5W / cm 2Was irradiated. 24
After a time, remove the brain (cerebrum, midbrain, cerebellum, medulla oblongata) and left
Luciferase activity was measured in the brain and right brain in two minutes.
At that time, OPTSON will transfer the drug stock solution to LEVOVIS
T used 300 mg / ml.
【００２０】その結果、ｐＬｕｃの導入効率は、０．１
ｍｌのＯＰＴＩＳＯＮを混合して投与し、５Ｗ／ｃｍ２
の超音波を照射した場合が最も優れていた。また、ｐＬ
ｕｃだけを投与して超音波を照射しなかった場合、ｐＬ
ｕｃとＯＰＴＩＳＯＮの混合溶液を投与して超音波を照
射しなかった場合、およびｐＬｕｃだけを投与して超音
波を照射した場合においては、ルシフェラーゼの発現が
見られなかった。さらに、本発明の組成物における担体
（超音波診断用造影剤）としてＬＥＶＯＶＩＳＴを用い
た場合より、ＯＰＴＩＳＯＮを用いた場合のほうが、高
い遺伝子発現を示した。遺伝子発現は、ｐＬｕｃを動脈
注射した左脳にのみ認められた。一方、超音波照射によ
り頭蓋骨表面の温度が最大６０℃まで上昇するため、頭
皮に熱傷をきたしたラットを認めた。このような熱傷
は、今回用いた１ＭＨｚの高周波数超音波を４０〜２０
０ＫＨｚ程度の低周波数超音波に変更すれば超音波が頭
蓋骨を透過しやすくなり、その分超音波強度を下げるこ
とにより抑制できると考えられる。As a result, the introduction efficiency of pLuc was 0.1
ml of OPTISON mixed and administered, 5 W / cm 2
Irradiation of the ultrasonic wave was most excellent. Also, pL
In the case where only uc was administered and ultrasonic irradiation was not performed, pL
No luciferase expression was observed when the mixed solution of uc and OPTSON was administered and the ultrasound was not irradiated, or when only the pLuc was administered and the ultrasound was applied. Furthermore, gene expression was higher when OPTISON was used than when LEVOVIST was used as a carrier (contrast agent for diagnostic ultrasound) in the composition of the present invention. Gene expression was observed only in the left brain injected with pLuc artery. On the other hand, since the temperature of the skull surface increased to a maximum of 60 ° C. by the ultrasonic irradiation, rats with burns on the scalp were recognized. Such a burn can be caused by applying the high frequency ultrasonic wave of 1 MHz used this time to 40 to 20 minutes.
It is considered that if the frequency is changed to a low frequency ultrasonic wave of about 0 KHz, the ultrasonic wave is easily transmitted through the skull, and the ultrasonic wave can be suppressed by lowering the ultrasonic wave intensity.
【００２１】〔実施例２〕 腫瘍組織への遺伝子導入実
験 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系雄性マウスの後背部に５×１０６個
のＢ１６−Ｆ１を接種した。１週間後に、自殺遺伝子で
あるヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子をコードしたプラ
スミド（ｐＴＫ）溶液（１μｇ／μｌ）、またはｐＴＫ
と５０％濃度のＯＰＴＩＳＯＮの混合溶液５０μｌを腫
瘍組織内に局所注射した。その後、強度１０、２ＨＺ、
３０秒間の超音波照射を４回行った。遺伝子導入６日後
より５日間連続してガンシクロビルを１００ｍｇ／ｋｇ
で投与し生存日数の測定を行った。Example 2 Gene Transfer Experiment into Tumor Tissue 5 × 10 6 B16-F1 cells were inoculated into the back of male C57BL / 6J mice. One week later, a plasmid (pTK) solution (1 μg / μl) encoding the herpes thymidine kinase gene, which is a suicide gene, or pTK
50 μl of a mixed solution of OPTSON and 50% concentration was locally injected into the tumor tissue. Then, strength 10, 2HZ,
Ultrasonic irradiation for 30 seconds was performed four times. Ganciclovir 100 mg / kg for 5 consecutive days from 6 days after gene transfer
And the number of surviving days was measured.
【００２２】結果を図１のグラフに示す。図１におい
て、◆はｐＴＫとＯＰＴＩＳＯＮの混合溶液投与後に超
音波照射を行った系、■はｐＴＫ溶液投与後に超音波照
射を行った系、▲はｐＴＫとＯＰＴＩＳＯＮの混合溶液
投与後に超音波照射を行わなかった系、×はｐＴＫ溶液
投与後に超音波照射を行わなかった系を示す。図１の結
果から、ｐＴＫとＯＰＴＩＳＯＮの混合溶液投与後に超
音波照射を行った系において生存日数の延長が観察さ
れ、超音波診断用造影剤であるＯＰＴＩＳＯＮ存在下で
超音波照射を行うことにより、生体内で効率良く遺伝子
導入が行われることが明らかとなった。The results are shown in the graph of FIG. In FIG. 1, ◆ indicates a system in which ultrasonic irradiation was performed after administration of a mixed solution of pTK and OPTSON, ■, a system in which ultrasonic irradiation was performed after administration of a pTK solution, and ▲, an ultrasonic irradiation was performed after administration of a mixed solution of pTK and OPTison The system not performed, x indicates a system in which ultrasonic irradiation was not performed after administration of the pTK solution. From the results of FIG. 1, it was observed that the number of survival days was prolonged in the system subjected to ultrasonic irradiation after administration of the mixed solution of pTK and OPTION, and by performing ultrasonic irradiation in the presence of OPTSON, which is a contrast agent for ultrasonic diagnosis, It has been clarified that gene transfer can be performed efficiently in vivo.
【００２３】〔実施例３〕 骨格筋への遺伝子導入実験 体重３５０〜４００ｇのＷＫＹ系雄性ラットをネンブタ
ール（０．１ｍｌ／１００ｇ）で麻酔後、頸部をバリカ
ンで剃毛後、ジェルをはさんで超音波発信用プロ−ベを
固定した。前頸骨筋に２０μｇのｐＬｕｃとＯＰＴＩＳ
ＯＮの混合溶液５０μｌを筋肉注射すると同時に、１Ｍ
Ｈｚ、２．５Ｗ／ｃｍ２の超音波を照射した。２４時間
後に前頸骨筋を取り出してルシフェラーゼの活性を測定
した。Example 3 Experiment of Gene Transfer into Skeletal Muscle A WKY male rat weighing 350 to 400 g was anesthetized with Nembutal (0.1 ml / 100 g), the neck was shaved with a clipper, and the gel was sandwiched. The ultrasonic transmission probe was fixed. 20 μg of pLuc and OPTIS in the tibialis anterior muscle
50 μl of a mixed solution of ON was intramuscularly injected and at the same time 1 M
Ultrasonic waves of 2.5 W / cm 2 were applied. Twenty-four hours later, the anterior tibialis muscle was removed and the luciferase activity was measured.
【００２４】投与した混合溶液中のＯＰＴＩＳＯＮ濃度
を変化させて遺伝子導入効率を比較した結果、ＯＰＴＩ
ＳＯＮ濃度が７５％の場合に最も高い遺伝子発現が観察
された（図２）。また、ＯＰＴＩＳＯＮ濃度が７５％の
ｐＬｕｃ混合溶液を投与した際、超音波照射時間の影響
を検討した結果、超音波照射時間が長いほど遺伝子導入
効率が向上することが示され、超音波診断用造影剤であ
るＯＰＴＩＳＯＮ存在下で超音波照射を行う優位性が示
された（図３）。As a result of comparing the gene transfer efficiency by changing the concentration of OPTISON in the administered mixed solution,
The highest gene expression was observed when the SON concentration was 75% (FIG. 2). In addition, when the pLuc mixed solution having an OPTison concentration of 75% was administered, the effect of the ultrasonic irradiation time was examined. As a result, it was shown that the longer the ultrasonic irradiation time, the higher the gene transfer efficiency was. The superiority of performing ultrasonic irradiation in the presence of the agent OPTISON was shown (FIG. 3).
【００２５】〔実施例４〕 血管への遺伝子導入実験 体重３５０〜４００ｇのＷＫＹ系雄性ラットをネンブタ
ール（０．１ｍｌ／１００ｇ）で麻酔後、頸部をバリカ
ンで剃毛する。その後、頸部にジェルをはさんで超音波
発信用プロ−ベを固定した。左外頸動脈にバルーンカテ
ーテルを導入して血管内皮細胞に損傷を与えた場合と与
えない場合のそれぞれにおいて、左外頸動脈に５０μｇ
のｐＬｕｃ溶液またはｐＬｕｃと濃度１０％のＯＰＴＩ
ＳＯＮの混合溶液５０μｌを動脈注射すると同時に、１
ＭＨｚ、２Ｗ／ｃｍ２の超音波を２分間照射した。２４
時間後に左外頸動脈を取り出し、ルシフェラーゼの活性
を測定した。Example 4 Experiment of Gene Transfer into Blood Vessels Male WKY rats weighing 350 to 400 g were anesthetized with Nembutal (0.1 ml / 100 g), and the neck was shaved with a clipper. Thereafter, a probe for transmitting an ultrasonic wave was fixed to the neck with a gel. In each of cases where a balloon catheter was introduced into the left external carotid artery and the vascular endothelial cells were damaged and not damaged, 50 μg was added to the left external carotid artery.
PLuc solution or pLuc and 10% OPTI
An arterial injection of 50 μl of the mixed solution of SON was performed at the same time.
Ultrasonic waves of 2 MHz / cm 2 were irradiated for 2 minutes. 24
After a lapse of time, the left external carotid artery was removed and luciferase activity was measured.
【００２６】バルーンカテーテルで血管内皮細胞に損傷
を与えた場合（図４）および与えなかった場合（図５）
のいずれの場合においても、ｐＬｕｃとＯＰＴＩＳＯＮ
の混合溶液を投与した場合のみで高い遺伝子導入が観察
され、ＯＰＴＩＳＯＮ存在下で超音波照射を行う優位性
が示された。When the endothelial cells are damaged by the balloon catheter (FIG. 4) and when they are not damaged (FIG. 5)
In both cases, pLuc and OPTISON
High gene transfer was observed only when the mixed solution was administered, indicating the superiority of performing ultrasonic irradiation in the presence of OPTION.
【００２７】また、バルーンカテーテルで血管内皮細胞
に損傷を与える場合、細胞増殖を抑制する効果があると
考えられるがん抑制遺伝子ｐ５３をコードしたプラスミ
ド（ｐＰ５３）１００μｇと２５％のＯＰＴＩＳＯＮの
混合溶液５０μｌを左外頸動脈に動脈注射すると同時
に、１ＭＨｚ、２Ｗ／ｃｍ２の超音波を２分間照射し
た。２週間後に左外頸動脈を取り出し、動脈の内膜／中
膜比を測定した。When vascular endothelial cells are damaged by a balloon catheter, 50 μl of a mixed solution of 100 μg of a plasmid (pP53) encoding a tumor suppressor gene p53, which is considered to have an effect of suppressing cell proliferation, and 25% OPTISON. Was simultaneously injected into the left external carotid artery and irradiated with 1 MHz, 2 W / cm 2 ultrasonic waves for 2 minutes. Two weeks later, the left external carotid artery was removed and the intima / media ratio of the artery was measured.
【００２８】その結果、ｐＰ５３とＯＰＴＩＳＯＮの混
合溶液を投与した場合に動脈の内膜／中膜比が低く押さ
えられており（図６）、再狭窄の治療に応用できる可能
性が示された。As a result, when the mixed solution of pP53 and OPTISON was administered, the intima / media ratio of the artery was kept low (FIG. 6), indicating the possibility of application to the treatment of restenosis.
【００２９】[0029]
【発明の効果】本発明の生物学的活性薬剤導入組成物
は、特定の超音波診断用造影剤を担体として用いること
により、超音波照射によって安全かつ確実に直接生体に
遺伝子を導入することができる。According to the composition for introducing a biologically active agent of the present invention, by using a specific contrast agent for diagnostic ultrasound as a carrier, it is possible to directly and safely introduce a gene directly into a living body by ultrasonic irradiation. it can.
【図１】自殺遺伝子投与後の生存日数を示すグラフであ
る。FIG. 1 is a graph showing the number of surviving days after administration of a suicide gene.
【図２】前頸骨筋における遺伝子発現に対するOPTISON
の濃度の影響を示すグラフである。FIG. 2. OPTISON for gene expression in tibialis anterior.
6 is a graph showing the effect of the concentration of the slag.
【図３】前頸骨筋における遺伝子発現に対する超音波照
射時間の影響を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the effect of ultrasonic irradiation time on gene expression in anterior tibial muscle.
【図４】バルーンカテーテルによる血管障害後の血管平
滑筋に対する遺伝子導入を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing gene transfer to vascular smooth muscle after vascular injury by a balloon catheter.
【図５】バルーンカテーテルによる血管障害が無い状態
での血管内皮細胞に対する遺伝子導入を示すグラフであ
る。FIG. 5 is a graph showing gene transfer into vascular endothelial cells in a state where there is no vascular injury by a balloon catheter.
【図６】バルーンカテーテルによる血管障害後の動脈の
内膜／中膜比に対する遺伝子導入の効果を示すグラフで
ある。FIG. 6 is a graph showing the effect of gene transfer on the intima / media ratio of arteries after vascular injury by a balloon catheter.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 47/06 ４Ｃ０８７ 47/06 47/42 ４Ｃ０９９ 47/42 48/00 ４Ｃ１６７ 48/00 Ａ６１Ｍ 37/00 ４Ｃ３０１ Ａ６１Ｍ 37/00 Ａ６１Ｂ 17/36 ３３０ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 CA01 CA09 DA02 GA11 HA17 4C060 JJ11 MM24 MM25 4C076 AA95 AA99 DD35 EE41 FF02 4C084 AA13 MA05 NA13 ZC801 4C086 AA01 AA02 EA16 MA05 NA13 ZC80 4C087 AA01 AA02 BC83 MA05 NA13 ZC80 4C099 AA10 CA03 CA11 CA13 JA13 TA04 4C167 AA74 BB26 BB45 CC05 CC08 CC12 CC20 CC23 CC24 DD10 GG02 GG12 GG16 GG31 GG34 GG41 GG42 HH01 HH08 HH30 4C301 EE20 LL20 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 35/76 A61K 47/06 4C087 47/06 47/42 4C099 47/42 48/00 4C167 48/00 A61M 37/00 4C301 A61M 37/00 A61B 17/36 330 C12N 15/09 C12N 15/00 A F term (reference) 4B024 AA01 AA20 CA01 CA09 DA02 GA11 HA17 4C060 JJ11 MM24 MM25 4C076 AA95 AA99 DD35 EE41 FF02 4C0813 AA13 MA05 NA0515 4C086 AA01 AA02 EA16 MA05 NA13 ZC80 4C087 AA01 AA02 BC83 MA05 NA13 ZC80 4C099 AA10 CA03 CA11 CA13 JA13 TA04 4C167 AA74 BB26 BB45 CC05 CC08 CC12 CC20 CC23 CC24 DD10 GG02 GG12 GG16 H20 GG30 GG30 GG30
Claims (3)
達するための組成物であって、パーフルオロカーボンを
含有するアルブミン由来の微小気泡含有小球体を含有す
ることを特徴とする生物学的活性薬剤導入組成物。1. A composition for delivering a biologically active agent to a specific site in a living body, comprising a microsphere-containing microsphere containing albumin containing perfluorocarbon. Active drug delivery composition.
ド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、トリプルヘリッ
クスフォーミングオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオ
チドプローブ、ヌクレオチドベクター、ウイルスベクタ
ーおよびプラスミドからなる群より選択される少なくと
も一つであることを特徴とする請求項１記載の生物学的
活性薬剤導入組成物。2. The biologically active agent is at least one selected from the group consisting of oligonucleotides, antisense oligonucleotides, triple helix forming oligonucleotides, oligonucleotide probes, nucleotide vectors, virus vectors and plasmids. The composition for introducing a biologically active agent according to claim 1, wherein
れるように、当該特定部位を超音波に曝露することを特
徴とする請求項１または２記載の生物学的活性薬剤導入
組成物の使用方法。3. Use of the composition for introducing a biologically active agent according to claim 1 or 2, wherein the specific site is exposed to an ultrasonic wave so that the biologically active agent is taken into the specific site. Method.
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