JP2002142779A - Recombinant microorganism having action of decreasing malodor - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To construct a stable recombinant microorganism by transducing, into a microorganism, a gene capable of degrading hydrogen sulfide that is a typical compound that may cause malodor of feces, and to continuously decrease the malodor of feces by orally administrating the microorganism to an animal to make the microorganism inhabit in its intestine. SOLUTION: The objective recombinant microorganism having an activity of removing hydrogen sulfide was created, wherein sulfide-quinone oxidoreductase gene sqr is operably integrated into a gene region, which does not give any effect to its proliferation by a promoter of Escherichia coli, of the chromosome of E. coli.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、家畜、家禽、ある
いはペットの糞便の悪臭を低減する遺伝子組換え微生物
の作出に関する。より詳しくは、糞便中の悪臭の主要原
因である硫化水素を除去させることにより、糞便の悪臭
を低減し、環境の改善を行う遺伝子組換え微生物の作出
に関する。[0001] The present invention relates to the production of a genetically modified microorganism that reduces the odor of feces of livestock, poultry, or pets. More specifically, the present invention relates to the production of genetically modified microorganisms that reduce the odor of feces and improve the environment by removing hydrogen sulfide, which is a major cause of odors in feces.

【０００２】[0002]

【従来の技術】近年、畜産業界においては、ウシ、ブ
タ、ニワトリ等の家畜や家禽の生産性向上のため、飼育
環境が過密状態になってきている。このような状況下で
は、家畜や家禽の***する糞便による悪臭が生活環境面
から大きな問題となっている。また、近年、ペットブー
ムから、一般家庭では、ペットを室内で飼育することが
盛んに行われるようになってきており、ペットの***す
る糞便の悪臭が問題となっている。2. Description of the Related Art In recent years, in the livestock industry, the breeding environment has become overcrowded in order to improve the productivity of livestock and poultry such as cattle, pigs and chickens. Under such circumstances, odor caused by feces excreted by livestock and poultry is a serious problem in terms of living environment. In recent years, since the pet boom, in general households, pets have been actively bred indoors, and the odor of feces excreted by pets has become a problem.

【０００３】糞便の悪臭の原因となる主要な化合物は、
腸内に生息する有害菌によるタンパクの腐敗発酵などで
生成されるアンモニア、硫化水素、短鎖脂肪酸などであ
る（Ｓｈａｈａｋ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：ＦＥＢＳ Ｌｅ
ｔｔ．，２９９：１２７−１３０，１９９２）。したが
って、動物の腸内容物中に残留するこれらの化合物を人
為的に分解することができれば、畜産における上記悪臭
を低減化する有力な手段となる。そこで、硫化物−キノ
ン酸化還元酵素（ｓｕｌｆｉｄｅ−ｑｕｉｎｏｎｅ ｏ
ｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＳＱＲ）の遺伝子ｓｑｒ
およびユビキノン−８（ＵＱ−８）遺伝子を大腸菌Ｅ．
ｃｏｌｉの細胞質中に導入して発現させ、ＳＱＲ活性硫
化物を高める試みがなされた（Ｓｈｉｂａｔａ，Ｈ．ｅ
ｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．，
８８：２４４−２４９，１９９９）。しかしながら、細
胞内での一連の電子伝達反応を可能とする酵素的条件が
満足されるべきであるという問題が生じた。[0003] The main compounds responsible for the fecal odor are:
Ammonia, hydrogen sulfide, short-chain fatty acids, and the like produced by spoilage fermentation of proteins by harmful bacteria living in the intestine (Shahak, Y. et al .: FEBS Le).
tt. , 299: 127-130, 1992). Therefore, if these compounds remaining in the intestinal contents of animals can be artificially decomposed, it will be an effective means for reducing the above-mentioned odor in animal husbandry. Thus, sulfide-quinone oxidoreductase (sulfide-quinone o)
xidoreductase (SQR) gene sqr
And the ubiquinone-8 (UQ-8) gene were transformed into E. coli E. coli .
Attempts have been made to increase the SQR active sulfide by introducing it into the E. coli cytoplasm and expressing it (Shibata, He.
t al. : J. Biosci. Bioengin. ,
88: 244-249, 1999). However, a problem has arisen in that enzymatic conditions that allow a series of electron transfer reactions in cells must be satisfied.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、糞便の悪臭
の原因となる代表的な化合物であるアンモニア、硫化水
素などを分解する能力をもつ遺伝子を微生物に導入して
安定性のある組換え微生物（以下「組換え体」ともい
う）を構築すること及び該微生物を経口的に動物に与え
て腸内に定住させることにより、糞便の悪臭を永続的に
低減させ、併せて腸内菌叢をも改善することを課題とす
る。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention relates to a stable recombinant recombinant gene obtained by introducing a gene capable of decomposing ammonia, hydrogen sulfide, and the like, which are typical compounds that cause odor in feces. By constructing microorganisms (hereinafter also referred to as "recombinants") and orally giving the microorganisms to animals and allowing them to settle in the intestine, the odor of feces is permanently reduced, and the intestinal flora The task is to improve

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】その最初のステップとし
て、動物腸管内に残存する悪臭物質の一つである硫化水
素の除去を試みた。紅色非硫黄細菌の一つであるＲｈｏ
ｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｓｃｈｕｔ
ｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
７２：９８９０−９８９４，１９９７）由来のｓｑｒ遺
伝子を、本発明の組換え体の構築に用いた。Ｒ．ｃａｐ
ｓｕｌａｔｕｓから単離したｓｑｒ遺伝子は、１，２７
５ｂｐのオープンリーデーイングフレームをもち、４２
５アミノ酸からなる分子量５５ｋＤａのＳＱＲをコード
する（Ｓｃｈｕｅｔｚ，Ｍ．ｅｔａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：９８９０−９８９４，１９９
７１７；Ｓｃｈｕｅｔｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．，６５１６−６５２３，１９９９ ２
３）。このｓｑｒ遺伝子をＲ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓか
ら単離し、その多数あるいは数個を、大腸菌の細胞質
内、あるいは染色体中にプラスミドベクターを用いて導
入した。As the first step, an attempt was made to remove hydrogen sulfide, one of the malodorous substances remaining in the animal intestinal tract. Rho , one of the red non-sulfur bacteria
doctor capsulatus (Schut
z, M .; et al. : J. Biol. Chem. , 2
72: 9890-9894, 1997) was used to construct the recombinant of the present invention. R. cap
The sqr gene isolated from Sulatus was 1,27
It has an open reading frame of 5 bp and 42
It encodes an SQR consisting of 5 amino acids and having a molecular weight of 55 kDa (Schuetz, M. et al .: J. Bio).
l. Chem. , 272: 9890-9894, 199.
717; Schuetz, M .; et al. : J. Ba
cterol. , 6516-6523, 1999 2
3). This sqr gene was transformed into R. Capsulatus was isolated, and many or several of them were introduced into the cytoplasm of Escherichia coli or into the chromosome using a plasmid vector.

【０００６】その結果、ＳＱＲ活性は、ｌａｃプロモー
ターあるいはｔａｃプロモーターを伴ったｓｑｒ遺伝子
を含む組換え体、並びに同様のプロモーターを伴ったｓ
ｑｒ遺伝子２〜３個を染色体中に含む組換え体におい
て、かなり上昇した。これらの組換え体において、ｔａ
ｃプロモーターによるＳＱＲ活性発現は、ｌａｃプロモ
ーターのそれより強力であった。硫化物除去度合いは、
ＳＱＲ酵素活性の上昇に伴い直線的に増加した。この直
線性は、硫化物除去が７００ｎ ｍｏｌ／ｍｇ菌体タン
パク／分を超えると失われた。同じ反応期間において、
酸素消費量度合もＳＱＲ酵素活性の上昇に伴い増加し
た。[0006] As a result, the SQR activity was increased by the recombinant containing the sqr gene with the lac promoter or the tac promoter, as well as by the sqr gene with the similar promoter.
It was significantly increased in recombinants containing 2-3 qr genes in the chromosome. In these recombinants, ta
SQR activity expression by the c promoter was stronger than that of the lac promoter. The degree of sulfide removal is
It increased linearly with increasing SQR enzyme activity. This linearity was lost when sulfide removal exceeded 700 nmol / mg cell protein / min. During the same reaction period,
Oxygen consumption also increased with increasing SQR enzyme activity.

【０００７】これらの結果を総合すると、染色体内にｔ
ａｃプロモーターを伴って組み込まれた２〜３コピーの
ｓｑｒ遺伝子が、硫化物除去及び組換え体の生育に対し
て最も好ましいものであった。組換え体を１６０代まで
培養した結果、染色体内に、ｌａｃプロモーターと共に
ｓｑｒ遺伝子を２コピー組入れた組換え体ＷＬ２、３個
組入れた組換え体ＷＬ３、並びにｔａｃプロモーターと
共にｓｑｒ遺伝子を２個組入れた組換え体ＷＴ２は、初
代培養と同様のＳＱＲ活性が保持されていた。ｓｑｒ遺
伝子の組込まれたプラスミドを多数（それぞれ約３００
個と２０個）含むＷＬ３００及びＷＴ２０は、ＳＱＲ活
性が検出限界以下に低下した。[0007] When these results are combined, t
A few copies of the sqr gene integrated with the ac promoter were most preferred for sulfide removal and recombinant growth. As a result of culturing the recombinant up to 160 generations, a recombinant WL2 in which two copies of the sqr gene were incorporated together with the lac promoter, a recombinant WL3 in which three copies were incorporated, and two sqr genes together with the tac promoter were introduced into the chromosome. The recombinant WT2 had the same SQR activity as that of the primary culture. A large number of plasmids incorporating the sqr gene (each about 300
And WT20), the SQR activity decreased below the detection limit.

【０００８】すなわち、本発明は、（１） 単離された
１つ以上の硫化物−キノン酸化還元酵素遺伝子ｓｑｒが
微生物の染色体中の生育に影響しない遺伝子領域に該微
生物のプロモーターで作動可能に組込まれた硫化水素除
去活性を有する組換え微生物、（２） 生育に影響しな
い遺伝子領域がＬａｃＺ遺伝子である（１）の組換え微
生物、（３） プロモーターがｔａｃプロモーターであ
る（１）の組換え微生物、（４） ｔａｃプロモーター
で作動可能な少なくとも２コピーのｓｑｒ遺伝子をもつ
（１）または（３）の組換え微生物、（５） ｓｑｒ遺
伝子が紅色非硫黄細菌由来である（１）の組換え微生
物、（６） 紅色非硫黄細菌がＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ
ｃａｐｓｕｌａｔｕｓである（５）の組換え微生物、
（７） 微生物が大腸菌Ｗ３１１０株である（１）の組
換え微生物、（８） （１）〜（７）のいずれかの組換
え微生物を有効成分として含む家畜の***糞の悪臭低減
作用を有する飼料、（９） 家畜がブタである（８）の
飼料、（１０）家畜の***糞の悪臭を低減する作用を有
する飼料を製造するための（１）〜（８）のいずれかの
組換え微生物の使用、（１１） 家畜がブタである（１
０）の使用、からなる。[0008] That is, the present invention provides (1) one or more isolated sulfide-quinone oxidoreductase genes sqr that can be operable with a promoter of a microorganism at a gene region that does not affect the growth in the chromosome of the microorganism. (2) a recombinant microorganism having a LacZ gene in a gene region that does not affect growth, (3) a recombinant microorganism having a promoter that is a tac promoter, A microorganism, (4) a recombinant microorganism of (1) or (3) having at least two copies of the sqr gene operable by a tac promoter, and (5) a recombinant of (1) wherein the sqr gene is derived from a red non-sulfur bacterium. Microorganisms, (6) Red non-sulfur bacteria are Rhodobacter
the recombinant microorganism of (5), which is capsulatus ;
(7) The recombinant microorganism of (1), wherein the microorganism is Escherichia coli W3110 strain, and (8) an effect of reducing the odor of excreted feces of livestock containing any of the recombinant microorganisms of (1) to (7) as an active ingredient. Feed, (9) the feed of (8), wherein the livestock is a pig, and (10) the recombinant of any one of (1) to (8) for producing a feed having an effect of reducing bad smell of excreted feces of livestock Use of microorganisms, (11) Domestic animals are pigs (1
0).

【０００９】[0009]

【発明の実施の形態】本発明に用いるｓｑｒ遺伝子を含
む染色体ＤＮＡは、ＳＱＲ活性を示す微生物から、常法
により単離することができる（Ｓｈｉｂａｔａ，Ｈ．ｅ
ｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．，
８８：２４４−２４９，１９９９）。上記微生物として
は、例えば細菌においては、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃ
ａｎｓ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ａ．ａｎｄ Ｆｒｉｅｄ
ｒｉｃｈ，Ｃ．Ｇ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，３５０：６１
−６５，１９９４）、Ｃ．ｖｉｎｏｓｕｍ（Ｒｅｉｎａ
ｒｔｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．，１７０：５９−６８，１９９８）、Ｃ．ｌｉｍ
ｉｃｏｌａ（Ｓｈａｈａｋ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：ＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔ．，２９９：１２７−１３０，１９９２）
等が挙げられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The chromosomal DNA containing the sqr gene used in the present invention can be isolated from a microorganism exhibiting SQR activity by a conventional method (Shibata, He.
t al. : J. Biosci. Bioengin. ,
88: 244-249, 1999). Examples of the microorganisms include, for example, P. denitrific
and (Schneider, A. and Fried
rich, C.E. G. FIG. FEBS Lett. , 350: 61
-65, 1994), C.I. vinosum (Reina
rtz, M .; et al. : Arch. Microbi
ol. , 170: 59-68, 1998), C.I. lim
icola (Shahak, Y. et al .: FEB
S Lett. , 299: 127-130, 1992).
And the like.

【００１０】単離したｓｑｒ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ
を鋳型としてＰＣＲプライマー反応を行いｓｑｒ遺伝子
を増幅する。ＰＣＲ用のセンス、アンチセンスプライマ
ーの設計は、サブクローニングに便利なように、制限酵
素サイトを付加しておく。Chromosomal DNA containing the isolated sqr gene
Is used as a template to perform a PCR primer reaction to amplify the sqr gene. For design of sense and antisense primers for PCR, restriction enzyme sites are added in advance for convenient subcloning.

【００１１】本発明のｓｑｒ遺伝子ＤＮＡ配列は、一例
として、文献（Ｓｃｈｕｅｔｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：９８９０−９８９
４，１９９７）に示すＳＱＲをコードするＤＮＡ配列で
示されるが、このＤＮＡ配列と機能的に等価なＤＮＡ配
列も本発明に含まれる。“機能的に等価なＤＮＡ配列”
という用語は、ＳＱＲの生物学的機能、例えば、硫化物
除去活性という機能を有する酵素を発現するＤＮＡ配列
を意味する。例えば、ＳＱＲの生物学的機能に影響しな
い変異を上記ＤＮＡ配列に導入することができる。一般
的に、ポリペプチドをコードする核酸配列は、発現産物
の機能に影響を与えずに極めて多様に変更できる。実質
的な相同性（全体の５０％を超える相同性を有するアミ
ノ酸配列）を有するアミノ酸配列は、既に同一の機能を
発揮し得ると考えられる。The DNA sequence of the sqr gene of the present invention is described, for example, in the literature (Schuetz, M. et al .:
J. Biol. Chem. , 272: 9890-989.
4, 1997), and a DNA sequence functionally equivalent to this DNA sequence is also included in the present invention. "Functionally equivalent DNA sequence"
The term refers to a DNA sequence that expresses an enzyme that has the biological function of SQR, for example, sulfide removal activity. For example, mutations that do not affect the biological function of SQR can be introduced into the DNA sequence. Generally, the nucleic acid sequence encoding a polypeptide can vary widely without affecting the function of the expression product. It is thought that an amino acid sequence having substantial homology (an amino acid sequence having a homology of more than 50% of the whole) can already exert the same function.

【００１２】近年、インターネット上で、種々の配列を
解析するためのソフトが公開されており、それらを利用
することにより、特定の配列が、機能的に等価であるの
に十分な相同性を有するか否かを予測することが可能と
なってきている。したがって、当業者であれば、ｓｑｒ
遺伝子の特定の部分を、ＳＱＲと機能的に等価な発現産
物を得られるように改変することが可能である。In recent years, software for analyzing various sequences has been released on the Internet, and by using them, specific sequences have sufficient homology to be functionally equivalent. It has become possible to predict whether or not. Therefore, those skilled in the art will understand that sqr
Certain portions of the gene can be modified to obtain an expression product that is functionally equivalent to SQR.

【００１３】本発明の硫化物除去活性を有する微生物
は、ＳＱＲ活性を有する遺伝子と該遺伝子を作動させる
プロモーターを、該微生物の生育に影響しない染色体中
に含む。受容株の染色体外で複製できないプラスミド
は、それらが宿主染色体と相同配列を有する場合、結果
として、その染色体に再結合することが知られている
（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ，１７１：４６１７−４６２２，１９８
９）。[0013] The microorganism having sulfide removal activity of the present invention contains a gene having SQR activity and a promoter that activates the gene in a chromosome that does not affect the growth of the microorganism. Plasmids that cannot replicate outside the chromosome of the recipient strain are known to rejoin the chromosome if they have a homologous sequence to the host chromosome (Hamilton, CM et al .: J. Am. ba
cteriol, 171: 4617-4622,198
9).

【００１４】このようなことから、対立する遺伝子変換
とプラスミド除去を選択することが可能な急激な温度変
化に基づく操作が可能な発現ベクターが用いられる。例
えばＥ．ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（Ｌａ
ｃＺ遺伝子）中にｓｑｒ遺伝子を組み込むためのベクタ
ーとして、ｐＢＲＩＮＴ−Ｔｓ（Ｂｏｒｇｎｅ，Ｓ．
Ｌ．ｅｔ ａｌ．：Ｇｅｎｅ，２２３：２１３−２１
９，１９９８）を用いた場合を例に説明する。これらの
大腸菌への導入は、例えば、Ｈａｎａｈａｎの方法
（Ｄ．Ｈａｎａｈａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６
６：５５７，１９８３）、あるいはエレクトロポレーシ
ョン法（Ｗ．Ｊ．Ｄｏｗｅｒ，ｅｔ ａｌ．：Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：６１２７，１９
８８）等による。[0014] In view of the above, an expression vector which can be operated based on a rapid change in temperature and which can select between opposing gene conversion and plasmid removal is used. For example, E. coli β-galactosidase gene (La
As a vector for incorporating the sqr gene into the cZ gene, pBRINT-Ts (Borgne, S.L.
L. et al. : Gene, 223: 213-21
9, 1998) will be described as an example. The introduction into Escherichia coli is performed, for example, by the method of Hanahan (D. Hanahan, J. Mol. Biol., 16).
6: 557, 1983) or electroporation (WJ Dower, et al .: Nucl.
eic Acids Res. , 16: 6127, 19
88).

【００１５】このベクターは、ＬａｃＺ遺伝子、選択マ
ーカー（抗生物質耐性）遺伝子としてカナマイシン遺伝
子（Ｋｍ）、クロラムフェニコール（Ｃｍ）、あるいは
ゲンタマイシン（Ｇｍ）、そして温度感受性レプリコン
Ｔｓ、及びマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含
む。これらのベクターの特徴として、１） 染色体への
組込み場所がＬａｃＺ遺伝子中であり、Ｘ−Ｇａｌ及び
ＩＰＴＧを含む固体培地でのブルーホワイトセレクショ
ンが可能である；２） ＭＣＳが抗生物質耐性遺伝子カ
セット（Ｋｍ、Ｃｍ、あるいはＧｍ）に隣接しており、
クローン化された断片の挿入を容易にモニターできる；
３） ベクターのマーカーとしてカルベニシリン（Ｃ
ｂ）を有する；４） ｐＢＲ３２２のｏｒｉのかわり
に、３０℃で複製するが３７℃では複製できないｐＳＣ
１０１由来の温度感受性（Ｔｓ）レプリコンを有する、
等が挙げられる。ｐＢＲＩＮＴ−Ｔｓ誘導体中のＬａｃ
Ｚ遺伝子断片及びＴｓレプリコンは、染色体中のＬａｃ
Ｚ遺伝子への外来遺伝子組込みを直接選択することを可
能とし、続いて培養温度を４４℃に上げることにより、
染色体外のプラスミドを除去できる。This vector contains the LacZ gene, kanamycin gene (Km), chloramphenicol (Cm) or gentamicin (Gm) as a selectable marker (antibiotic resistance) gene, temperature-sensitive replicon Ts, and a multiple cloning site ( MCS). The characteristics of these vectors are: 1) the integration site into the chromosome is in the LacZ gene, and blue-white selection on a solid medium containing X-Gal and IPTG is possible; 2) MCS is an antibiotic resistance gene cassette ( Km, Cm, or Gm)
The insertion of the cloned fragment can be easily monitored;
3) Carbenicillin (C
4) pSC instead of the ori of pBR322, which replicates at 30 ° C. but cannot replicate at 37 ° C.
Having a temperature sensitive (Ts) replicon from 101,
And the like. Lac in pBRINT-Ts derivative
The Z gene fragment and the Ts replicon are
By allowing direct selection of foreign gene integration into the Z gene, and subsequently increasing the culture temperature to 44 ° C.,
Extrachromosomal plasmids can be removed.

【００１６】すなわち、形質転換体は、ベクター部分に
存在するＣｂに対する耐性、およびＬａｃＺ遺伝子中に
挿入された抗生物質（Ｋｍ、Ｃｍ、あるいはＧｍ）に対
する耐性で選択する。Ｘ−Ｇａｌ、ＩＰＴＧ、及び適切
な選択物質（抗生物質）を含むプレート上、４４℃でイ
ンキュベーションする。抗生物質耐性の大きな白いコロ
ニーが出現するが、これは、染色体に存在するＬａｃＺ
遺伝子中にプラスミドが組込まれたことを示している。
一つの組換え現象においては、ＬａｃＺ遺伝子中に挿入
された耐性マーカーだけでなくベクター部分でコードさ
れる耐性マーカーにも耐性を示すクローンを産生するの
に対し、対立的な組換え現象においては、ＬａｃＺ遺伝
子中に挿入された耐性マーカーを示すコロニー産生しか
示さないので、白いコロニーについて、Ｃｂに対する感
受性を調べることが必要である。That is, transformants are selected based on the resistance to Cb present in the vector portion and the resistance to an antibiotic (Km, Cm or Gm) inserted into the LacZ gene. Incubate at 44 ° C. on a plate containing X-Gal, IPTG, and the appropriate selection agent (antibiotic). Large colonies of antibiotic resistance appear, which are due to the LacZ present on the chromosome.
This indicates that the plasmid was integrated into the gene.
In one recombination event, a clone is produced that is resistant not only to the resistance marker inserted in the LacZ gene but also to the resistance marker encoded in the vector portion, whereas in an allelic recombination event, It is necessary to examine the susceptibility to Cb on white colonies, as they only show colony production showing the resistance marker inserted in the LacZ gene.

【００１７】上記で選択したコロニーも、複製可能な許
容温度３０℃でＣｂに対して感受性であり、これは、プ
ラスミドが失われたことを示している。菌体中にこれら
のベクターが存在しないことは、これらのコロニーから
プラスミドを単離し、アガロースゲルで展開しエチジウ
ムブロミド（ＥｔｄＢｒ）で染色することにより確認す
ることができる。さらに、ｓｑｒ遺伝子が、染色体に存
在するＬａｃＺ遺伝子へ適切に組込まれたかどうかは、
形質転換体からＤＮＡを抽出し、制限酵素で断片化した
後、電気泳動で分離し、ｓｑｒ遺伝子プローブを用いた
サザンハイフリダイゼーションで確認することができ
る。The colonies selected above are also sensitive to Cb at the permissive temperature of 30 ° C., which indicates that the plasmid has been lost. The absence of these vectors in the cells can be confirmed by isolating the plasmid from these colonies, developing on an agarose gel, and staining with ethidium bromide (EtdBr). Furthermore, whether the sqr gene was properly integrated into the LacZ gene present on the chromosome,
DNA can be extracted from the transformant, fragmented with restriction enzymes, separated by electrophoresis, and confirmed by Southern hybridization using an sqr gene probe.

【００１８】この発明で用いた相同組換えでは、ｓｑｒ
遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体のｌａｃＺ遺伝子に組込
まれたので、染色体に存在するその他の遺伝子の破壊を
避けることができる。さらに、組込まれた遺伝子は安定
的に保持される。形質転換に用いる宿主大腸菌として
は、上記のＷ３１１０株の他に、相同組換え遺伝子ｒｅ
ｃＡをもつｒｅｃＡ１株ＤＨ１、ＤＨ５、ＤＨ１０Ｂ、
ＪＭ１０９、あるいはＸＬ−Ｂｌｕｅを用いてもよい。In the homologous recombination used in the present invention, sqr
The gene is E. coli. Since it was integrated into the lacZ gene of the E. coli chromosome, the disruption of other genes present on the chromosome can be avoided. Further, the integrated gene is stably retained. As the host E. coli used for the transformation, in addition to the above-mentioned strain W3110, the homologous recombination gene re
recA1 strains DH1, DH5, DH10B with cA,
JM109 or XL-Blue may be used.

【００１９】ところで、ヒトや動物の腸内には１００
兆、１００種に及ぶ腸内菌叢（腸内フローラ）を構成し
ている。しかし、大腸菌は、腸内細菌としては主要なも
のではない。そこで、ｓｑｒ遺伝子を組込む対象として
腸内常在細菌はより効果的である。ラクトースオペロン
をもつ腸内常在細菌は、本発明のｓｑｒ遺伝子組込み対
象の微生物として好適である。制限系の問題があるが原
理的には可能である。したがって本発明の組換え体は、
これらの腸内常在細菌を含む。By the way, in human and animal intestines, 100
It constitutes trillion and 100 species of intestinal flora (intestinal flora). However, E. coli is not a major intestinal bacterium. Thus, intestinal resident bacteria are more effective as targets for incorporating the sqr gene. Intestinal resident bacteria having a lactose operon are suitable as the microorganisms into which the sqr gene of the present invention is to be integrated. There is a restriction system problem, but it is possible in principle. Therefore, the recombinant of the present invention
Including these intestinal resident bacteria.

【００２０】この発明では、複数コピーのｓｑｒ遺伝子
の染色体への組込み、ＳＱＲ活性と硫化物除去との間の
相関、および染色体に組込まれたｓｑｒ遺伝子の安定性
が明らかにされた。しかしながら、Ｋｍ−遺伝子がＤＮ
Ａ配列中に残された。抗生物質に耐性の遺伝子を除くに
は、例えばＦＲＴ−組換え酵素（フリッパーゼ）が導入
される組換えシステム（Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ
ａｌ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８１：７１４
３−７１４８，１９９９）を有効に利用することができ
る。In this invention, the integration of multiple copies of the sqr gene into the chromosome, the correlation between SQR activity and sulfide removal, and the stability of the chromosome-integrated sqr gene have been elucidated. However, the Km-gene is DN
Left in the A sequence. To remove genes resistant to antibiotics, for example, a recombination system (Morales, FM et al.) Into which FRT-recombinase (flippase) is introduced.
al. : J. Bacteriol. , 181: 714
3-7148, 1999) can be effectively used.

【００２１】本発明では、腸内内容物に残留する主要な
悪臭物質の一つである硫化水素をターゲットとしたが、
もう一つの主要な悪臭物質あるアンモニアの酸化酵素遺
伝子（ａｍｏＡ、ａｍｏＢ（Ｍｃｔａｖｉｓｈ，Ｈ．ｅ
ｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７５：２４
３６−２４４４，１９９３）、ａｍｏＣ（Ｋｌｏｔｚ，
Ｍ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．：ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｌｅｔｔ．，１５０：６５−７３，１９９７）、ｈ
ａｏ（Ｓａｙａｖｅｄｒａ−ｓｏｔｏ，Ｌ．Ａ．ｅｔ
ａｌ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：５０４−
５１０，１９９４））の組換え体を、本発明の方法に基
づき作出することは、当業者であれば可能である。その
ための技術的修飾は本発明に含まれる。したがって、本
発明はアンモニアの酸化酵素遺伝子を染色体中に含む組
換え体も含む。In the present invention, hydrogen sulfide which is one of the main malodorous substances remaining in the intestinal contents was targeted.
Another major malodorous substance is the oxidase gene for ammonia (amoA, amoB (Mctavish, He.
t al. : J. Bacteriol. , 175: 24
36-2444, 1993), amoC (Klotz,
M. G. FIG. , Et al. : FEMS Microbio
l. Lett. , 150: 65-73, 1997), h
ao (Sayavedra-soto, LA et al.
al. : J. Bacteriol. , 176: 504-
510, 1994)) can be produced by a person skilled in the art based on the method of the present invention. Technical modifications therefor are included in the present invention. Therefore, the present invention also includes a recombinant containing the oxidase gene for ammonia in the chromosome.

【００２２】培養液中の細菌は、常法（例えば、遠心分
離）にしたがって分離・洗浄する。分離した菌体濃縮液
は、大腸菌１０^７〜１０^９／ｇを含み、飼料に、体重１
ｋｇ当たり１日０．１〜１０ｍＬ、好ましくは１〜４ｍ
Ｌ添加する。また、保護剤（例えば、スキムミルク、ラ
クトース、デンプン等）を加えた後、ｐＨを調整し、真
空凍結乾燥機等で水分を４％以下に乾燥した菌体製剤と
して用いてもよい。該製剤は粉状、顆粒状、ペレット
状、あるいはタブレット状とすることができる。The bacteria in the culture solution are separated and washed according to a conventional method (eg, centrifugation). Separated cells concentrate comprises E. coli ¹⁰ 7 ^~10 9 / g, the feed, body weight
0.1 to 10 mL / kg per day, preferably 1 to 4 m
Add L. Alternatively, after adding a protective agent (for example, skim milk, lactose, starch, etc.), the pH may be adjusted, and the resultant may be used as a cell preparation prepared by drying the water to 4% or less with a vacuum freeze dryer or the like. The preparation can be in the form of powder, granules, pellets, or tablets.

【００２３】本発明の組換え菌は、そのまま家畜用飼料
に添加してもよく、あるいは他の栄養源、例えば、オリ
ゴ糖、ゼオライト、カテキン、ポリフェノール等他の消
臭性物質と併用してもよい。The recombinant bacterium of the present invention may be added to livestock feed as it is, or may be used in combination with other nutrients such as oligosaccharides, zeolites, catechins and polyphenols. Good.

【００２４】[0024]

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

【００２５】［実施例１］ 染色体組み込みベクターの
構築 全てのプラスミドの構築には、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｘ
Ｌ１Ｂｌｕｅ−ＭＲＦ’を使用した。大腸菌はＬＢ培地
で培養し、必要に応じてカルベニシリン（Ｃｂ）５０μ
ｇ／ｍｌ、カナマイシン（Ｋｍ）３０μｇ／ｍｌを添加
した。[Example 1] Construction of chromosome integration vector For construction of all plasmids, E. coli E. coli was used . coli strain X
L1Blue-MRF 'was used. Escherichia coli is cultured in LB medium, and if necessary, carbenicillin (Cb) 50 μl is used.
g / ml and 30 μg / ml of kanamycin (Km).

【００２６】１）ｓｑｒ遺伝子の調製 ｓｑｒ遺伝子は、文献記載の方法（Ｓｈｉｂａｔａ，
Ｈ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇｉ
ｎ．，８８：２４４−２４９，１９９９）に従い調製し
た。Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＤＳＭ１５５から常法によ
りｓｑｒ遺伝子を含む染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳
型としてｓｑｒ遺伝子をセンスプライマー（配列番号
１）およびアンチセンスプライマー（配列番号２）を用
いてＰＣＲで増幅した。 ＰＣＲサイクル 当初 ９４℃、３分 １ｃｙｃｌｅ 熱変成 ９８℃、２０秒 アニーリング ５８℃、１分 ＤＮＡ合成 ６８℃、２分 熱変成からＤＮＡ合成
までを３０ ｃｙｃｌｅ 終了後 ７２℃、１０分 １ｃｙｃｌｅ ＰＣＲ産物はＮｄｅ Ｉ（開始コドンに存在する）及び
ＢａｍＨＩ（アンチセンスプライマーに組み込んであ
る）で切断して、ｓｑｒ遺伝子断片（１．３ｋｂｐ）を
得た。1) Preparation of sqr gene The sqr gene can be prepared by the method described in the literature (Shibata,
H. et al. : J. Biosci. Bioengi
n. , 88: 244-249, 1999). R. A chromosomal DNA containing the sqr gene was extracted from capsulatus DSM155 by a conventional method, and using this as a template, the sqr gene was amplified by PCR using a sense primer (SEQ ID NO: 1) and an antisense primer (SEQ ID NO: 2). PCR cycle Initial 94 ° C, 3 minutes 1 cycle Thermal denaturation 98 ° C, 20 seconds Annealing 58 ° C, 1 minute DNA synthesis 68 ° C, 2 minutes After completion of 30 cycles from thermal denaturation to DNA synthesis 72 ° C, 10 minutes 1 cycle PCR product is Nde Cleavage with I (present at the start codon) and BamHI (incorporated in the antisense primer) gave the sqr gene fragment (1.3 kbp).

【００２７】２）ｌａｃプロモーター制御下にｓｑｒ遺
伝子をもつプラスミドの作製 ｌａｃプロモーターをもつプラスミドｐＫＦ１８（Ｈａ
ｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．：Ｇｅｎｅ，１６
７：３３３−３３４，１９９５）をＮｄｅ Ｉ及びＢａ
ｍＨＩで切断し、上記ｓｑｒ遺伝子断片（１．３ｋｂ
ｐ）とライゲーションして、ｌａｃプロモーターによっ
て発現されるｓｑｒ遺伝子を含むプラスミドｐＦＳＱを
得た。このｐＦＳＱをＡｐａＬ Ｉで切断し、Ｔ４ポリ
メラーゼで末端を平滑化した後、Ｓａｃ ＩまたはＸｂ
ａ Ｉで切断して、ｌａｃプロモーターの下流にｓｑｒ
遺伝子を含むＤＮＡ断片（１．７ｋｂｐ）を得た。プラ
スミドｐＳＴＶ２８（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）をＳａｃ ＩとＳｍａ
Ｉで切断し、上記ＤＮＡ断片（１．７ｋｂｐ）とライゲ
ーションしてプラスミドｐＶ−ＬＳＱを得た。このｐＶ
−ＬＳＱは、ｐＦＳＱ由来のｌａｃプロモーターの制御
下にｓｑｒ遺伝子を含む。また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ Ｓｋ（＋）をＳｍａ ＩとＸｂａ Ｉで切断し、上
記ＤＮＡ断片（１．７ｋｂｐ）とライゲーションして、
プラスミドｐＳｃ−ＬＳＱを得た、このｐＳｃ−ＬＳＱ
は、ｐＦＳＱ由来のｌａｃプロモーターの制御下にｓｑ
ｒ遺伝子を含む。2) Preparation of plasmid having sqr gene under control of lac promoter Plasmid pKF18 (Ha
Shimoto, T .; , Et al. : Gene, 16
7: 333-334, 1995) with Nde I and Ba.
Cleavage with mHI, the sqr gene fragment (1.3 kb)
Ligation with p) resulted in plasmid pFSQ containing the sqr gene expressed by the lac promoter. This pFSQ was digested with ApaL I and blunt-ended with T4 polymerase, followed by Sac I or Xb
aI digestion and sqr downstream of the lac promoter.
A DNA fragment (1.7 kbp) containing the gene was obtained. Plasmid pSTV28 (Amersham Pharma
Cia Biotech) with Sac I and Sma
C. and ligated with the above DNA fragment (1.7 kbp) to obtain plasmid pV-LSQ. This pV
-LSQ contains the sqr gene under the control of the lac promoter from pFSQ. Also, pBluescript
t Sk (+) is digested with Sma I and Xba I, ligated with the above DNA fragment (1.7 kbp),
The plasmid pSc-LSQ was obtained.
Sq under the control of the lac promoter from pFSQ
r gene.

【００２８】３）ｔａｃプロモータ制御下にｓｑｒ遺伝
子をもつプラスミドの作製 ｔａｃプロモーターをもつｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）
を、ＥｃｏＲ Ｉ及びＰｓｔ Ｉで切断し、上記ｓｑｒ
遺伝子断片（１．３ｋｂｐ）とともに末端をＴ４ポリメ
ラーゼで平滑化した後、ライゲーションしてプラスミド
ｐＫ−ＴＳＱを得た。このｐＫ−ＴＳＱはｔａｃプロモ
ーターによって発現されるｓｑｒ遺伝子を含む。このｐ
Ｋ−ＴＳＱをＰｖｕ ＩとＢａｍＨ Ｉで切断し、また
ｐＳＴＶ２８をＳｍａ Ｉで切断し、Ｔ４ポリメラーゼ
で平滑化した後、両者をライゲーションして、プラスミ
ドｐＶ−ＴＳＱを得た。このｐＶ−ＴＳＱはｐＫ−ＴＳ
Ｑ由来のｔａｃプロモーターによって制御されるｓｑｒ
遺伝子を含む。3) Preparation of plasmid having sqr gene under control of tac promoter pKK223-3 (Amer
sham Pharmacia Biotech)
Was digested with EcoR I and Pst I, and the above sqr
After blunt-ending with T4 polymerase together with the gene fragment (1.3 kbp), ligation was performed to obtain plasmid pK-TSQ. This pK-TSQ contains the sqr gene expressed by the tac promoter. This p
K-TSQ was digested with Pvu I and BamHI, and pSTV28 was digested with Sma I, blunted with T4 polymerase, and ligated to obtain plasmid pV-TSQ. This pV-TSQ is pK-TS
Sqr controlled by the tac promoter from Q
Including genes.

【００２９】４） 染色体組込みベクター構築ｓｑｒを
もつ染色体組込みベクターを構築するため、ｐＳｃ−Ｌ
ＳＱをＥｃｏ ＲＶ及びＢａｍＨ Ｉで切断して、ｌａｃプロモーター
によって制御されるｓｑｒ遺伝子断片（１．７ｋｂｐ）
を得た。また、ｐＶ−ＴＳＱをＰｖｕ ＩおよびＢａｍ
Ｈ Ｉで切断して、ｔａｃプロモーターによって制御さ
れるｓｑｒ遺伝子断片（２．５ｋｂｐ）を得た。これら
のＤＮＡ断片１〜３つを、温度感受性複製起点をもつｐ
ＩＮＴ−Ｔｓ／Ｋｍ（Ｂｏｒｇｎｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａ
ｌ．：Ｇｅｎｅ，２３３：２１３−２１９，１９９８）
のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に、ｍｕｌｔｉ
ｐｌｅｔａｎｄｅｍ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ法で導入し
て、ｌａｃプロモーターによって制御されるｓｑｒ遺伝
子をもつ相同組換え用発現ベクターｐＩＮＴ−ＬＳＱ
１、ｐＩＮＴ−ＬＳＱ２、及びｐＩＮＴ−ＬＳＱ３、ｔ
ａｃプロモーターによって制御されるｓｑｒ遺伝子をも
つ相同組換え用発現ベクターｐＩＮＴ−ＴＳＱ１、及び
ｐＩＮＴ−ＴＳＱ２を得た（図１）。4) Construction of Chromosome Integration Vector In order to construct a chromosome integration vector having sqr, pSc-L
SQ is cut with Eco RV and BamHI to obtain a sqr gene fragment (1.7 kbp) controlled by a lac promoter.
Got. Also, pV-TSQ is converted to Pvu I and Bam
Cleavage with HI resulted in a sqr gene fragment (2.5 kbp) controlled by the tac promoter. These DNA fragments 1 to 3 are converted into a p-type having a temperature-sensitive replication origin.
INT-Ts / Km (Borgne, SL et a
l. : Gene, 233: 213-219, 1998).
Multi cloning site (MCS)
pINT-LSQ, an expression vector for homologous recombination having a sqr gene controlled by a lac promoter, introduced by the pletandem insertion method
1, pINT-LSQ2 and pINT-LSQ3, t
Expression vectors pINT-TSQ1 and pINT-TSQ2 for homologous recombination having the sqr gene controlled by the ac promoter were obtained (FIG. 1).

【００３０】［実施例２］ ｓｑｒ遺伝子の染色体組込
み体の作製 発現ベクターｐＩＮＴ−ＬＳＱ１、ｐＩＮＴ−ＬＳＱ
２、ｐＩＮＴ−ＬＳＱ３、ｐＩＮＴ−ＴＳＱ１、及びｐ
ＩＮＴ−ＴＳＱ２を、大腸菌の野生株に近いとされるＷ
３１１０に導入した。Ｗ３１１０は、Ｄａｖｉｓ最少培
地に１００ｍＭＫＮＯ_３、１％グリセロール、０．２％
カザミノ酸を添加した培地で窒素ガス下で培養した。Ｗ
３１１０を３０℃、４０時間培養して、上記ベクターを
もつ菌株を得た。１コロニーを採取し、さらに、２ｍＬ
ＬＢ培地で３０℃、１２時間培養した。この培養液を
１，０００倍に希釈して（約２×１０^６細胞数／ｍ
Ｌ）、Ｘ−ｇａｌ及びＩＰＴＧを含むＫｍプレート上で
４４℃、２０時間培養した。生じた白色コロニーをＫｍ
プレート上に植え継いだ。これを４４℃、４時間培養
後、二重交叉による相同組換えをおこした株を選択する
ため、Ｃｂプレート上に植え継ぎ、Ｃｂに感受性（Ｃｂ
^Ｓ）の株を選択した。さらに、この株をＫｍプレート上
に植え継ぎ、４４℃、２４時間培養し、ｓｑｒ遺伝子を
染色体上に含む株を選択した。この株をＣｂプレート上
に植え継ぎ、菌が生育しないことから、プラスミドを欠
失しているのを確認した。さらに、最終的に得たこれら
の菌株よりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ ＤＩＧプローブ合
成キット及びＤＩＧ核酸検出キット（ベーリンガー・マ
ンハイム株式会社）を使用して、サザンハイブリダイゼ
ーション分析を行い、染色体上にｓｑｒ遺伝子が組込ま
れていることを確認した。プローブはｓｑｒ遺伝子のヌ
クレオチド４７７〜１１４９（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２７２：９８９０−９８９４，１９９７のＦｉｇ
３．のヌクレオチド配列に対応）をＤＩＧ（Ｄｉｇｏｘ
ｉｇｅｎｉｎ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｋｉｔ：Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａ社製）標識した。すなわち、ｌａｃプロモーターと、
このプロモーターの下流に１〜３コピーのｓｑｒ遺伝子
をもつ組換え体が得られた。これらの組換え体は、それ
ぞれ、ＷＬ１、ＷＬ２、及びＷＬ３と命名した。また、
ｔａｃプロモーターと、このプロモーターの下流に１及
び２コピーのｓｑｒをもつ組換え体が得られた。これら
の組換え体は、それぞれ、ＷＴ１、及びＷＴ２と命名し
た。これらの組換え体をＸ−ｇａｌ及びＩＰＴＧを含む
プレートで、４４℃でインキュベーションすると、１０
^−３の頻度で白い大きなコロニーが出現し、その内の
０．５〜５．０％に相同的組換えが起こっていた。挿入
配列が伸長するにつれ、組換え頻度は減少した。[Example 2] Preparation of chromosome integration of sqr gene Expression vectors pINT-LSQ1, pINT-LSQ
2, pINT-LSQ3, pINT-TSQ1, and p
INT-TSQ2 was replaced with W which is considered to be close to a wild strain of E. coli.
3110. W3110 is 100 mM KNO ₃ , 1% glycerol, 0.2% in Davis minimal medium
The cells were cultured in a medium supplemented with casamino acid under nitrogen gas. W
3110 was cultured at 30 ° C. for 40 hours to obtain a strain having the above vector. Pick one colony and add 2 mL
The cells were cultured in an LB medium at 30 ° C. for 12 hours. This culture solution was diluted 1,000 times (about 2 × 10 ⁶ cells / m
L), cultured on a Km plate containing X-gal and IPTG at 44 ° C. for 20 hours. The resulting white colony is
Planted on a plate. After culturing this at 44 ° C. for 4 hours, in order to select a strain that has undergone homologous recombination by double crossover, it is subcultured on a Cb plate and sensitized to Cb (Cb
The strain of ^S ) was selected. Further, this strain was subcultured on a Km plate, cultured at 44 ° C. for 24 hours, and a strain containing the sqr gene on the chromosome was selected. This strain was subcultured on a Cb plate, and it was confirmed that the plasmid had been deleted since the bacteria did not grow. Furthermore, DNA was extracted from these finally obtained strains, and subjected to Southern hybridization analysis using a PCR DIG probe synthesis kit and a DIG nucleic acid detection kit (Boehringer Mannheim KK). Has been incorporated. The probe was constructed at nucleotides 477 to 1149 of the sqr gene (J. Biol. Che.
m. , 272: 9890-9894, 1997.
3. Of DIG (Digox)
igenin labelling kit: Boeh
ringer Mannheim Biochemical
a company). That is, the lac promoter,
A recombinant having 1-3 copies of the sqr gene downstream of this promoter was obtained. These recombinants were named WL1, WL2, and WL3, respectively. Also,
A recombinant having the tac promoter and one and two copies of sqr downstream of this promoter was obtained. These recombinants were named WT1 and WT2, respectively. Incubation of these recombinants at 44 ° C. on plates containing X-gal and IPTG resulted in 10
Large white colonies appeared at a frequency of ^-3, of which 0.5 to 5.0% had homologous recombination. The recombination frequency decreased as the inserted sequence extended.

【００３１】［実施例３］ 組換え体の増殖 大腸菌Ｗ３１１０染色体中に、ｌａｃプロモーターによ
って制御されるｓｑｒ遺伝子をもつ組換え体ＷＬ１、Ｗ
Ｌ２、およびＷＬ３の増殖は、染色体中にＫｍマーカー
のみをもつコントロールの菌株の増殖と類似していた。
生育組換え菌の密度は、与えられた培地および培養条件
では、約６時間後に最大となった（図２）。一方、大腸
菌Ｗ３１１０染色体中に、ｔａｃプロモーターによって
制御されるｓｑｒ遺伝子をもつ組換え体ＷＴ１、および
ＷＴ２の増殖は、ｌａｃプロモーターの場合と同様にの
傾向を示し、染色体中にＫｍマーカーのみをもつコント
ロールの菌株の増殖と類似していた（図４）。また、細
胞質中にｓｑｒ遺伝子を担うプラスミドｐＫ−ＴＳＱを
２０〜３０個もつ組換え体ＷＴ２０〜３０の増殖は、Ｗ
Ｔ１、およびＷＴ２、あるいはコントロール菌株と比較
して増殖が遅れた（図４）。Example 3 Propagation of Recombinants Recombinants WL1, W having the sqr gene controlled by the lac promoter in the Escherichia coli W3110 chromosome
The growth of L2 and WL3 was similar to that of a control strain with only the Km marker in the chromosome.
The density of the growing recombinant bacterium reached a maximum after about 6 hours with the given medium and culture conditions (FIG. 2). On the other hand, the growth of the recombinants WT1 and WT2 having the sqr gene controlled by the tac promoter in the Escherichia coli W3110 chromosome showed the same tendency as in the case of the lac promoter, and the control having the Km marker alone in the chromosome (FIG. 4). In addition, the growth of the recombinants WT20-30 having 20-30 plasmids pK-TSQ carrying the sqr gene in the cytoplasm is due to W
Growth was delayed compared to T1, WT2, or control strains (FIG. 4).

【００３２】［実施例４］ 組換え体による硫化物除去 ＳＱＲの硫化物除去活性測定のため、基質としてＮａＳ
_２を使用した。反応は、特に記載のない限り２５℃で行
い、硫化物の測定はメチレンブルー法（Ｔｒｕｅｐｅ
ｒ，Ｈ．Ｇ．ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｈ．Ｇ．：Ａ
ｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ ｈｏｅｋ，３
０：２２５−２３８，１９６４）で調べた。反応液の組
成は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
０．５％ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ_２、２００μＭ Ｎａ_２Ｓ（基質）とし、菌体を用
いた場合は、１．５ｍｇタンパク／１００ｍＬとなるよ
うに、菌体を懸濁した。これらの反応液１０ｍＬを３０
ｍＬ容試験管に採り、ブチルゴム栓で密栓後、試験管を
横に置き、１００回転／分で１０分振とうした後、Ｎａ
_２Ｓの添加によって反応を開始した。残余の硫化物は、
ジアミン及びＦｅＣｌ_３溶液を添加した２％（ＣＨ_３Ｃ
ＯＯ）_２Ｚｎで固定し、ＯＤ_６７０で測定した。硫化物
除去活性は、酸化された硫化物ｎｍｏｌ／細胞タンパク
１ｍｇ／分）で示した。Example 4 Sulfide Removal by Recombinant To measure the sulfide removal activity of SQR, NaS was used as a substrate.
₂ was used. Reactions were performed at 25 ° C. unless otherwise specified, and sulfide was measured by the methylene blue method (Truepe).
r, H .; G. FIG. and Schlegel, H .; G. FIG. : A
ntonie van Leeuwen hook, 3
0: 225-238, 1964). The composition of the reaction solution was 20 mM Tris-HCl (pH 7.5),
0.5% NaCl, 5 mM MgCl ₂ , 1 mM Ca
When Cl ₂ and 200 μM Na ₂ S (substrate) were used and the cells were used, the cells were suspended at 1.5 mg protein / 100 mL. 10 mL of these reaction solutions are added to 30
After taking the sample in a mL-volume test tube, sealing it tightly with a butyl rubber stopper, placing the test tube aside, shaking it at 100 rpm for 10 minutes,
_The reaction was started by the addition of 2S. The remaining sulfide is
2% (CH ₃ C) containing diamine and FeCl ₃ solution
OO) ₂ Zn and measured at OD ₆₇₀ . The sulfide removal activity was expressed as nmol sulfide oxidized / cell protein 1 mg / min).

【００３３】なお、タンパク濃度の測定は、ＤＣタンパ
クアッセイキット（Ｂｉｏｌａｄ）を用いて測定した。
菌体タンパク濃度は、Ｈｅｒｂｅｒｔらの方法（Ｈｅｒ
ｂｅｒｔ，Ｄ．ｅｔ ａｌ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．５Ｂ，ｐ２０９−３
４４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，１９７１）によって菌体を可溶化後、測定した。染
色体中にｌａｃプロモーターによって制御されるｓｑｒ
遺伝子１〜３個をもつ組換え体ＷＬ２、あるいはＷＬ３
を培養した場合、硫化物除去活性は、培養時間の経過に
伴い、定常期まで増加する傾向を示した（図３）。ＷＬ
３の硫化物除去活性は、ＷＬ２及びＷＬ１のそれらより
も高かった。およそ１０個のｐＶ−ＬＳＱを染色体外に
もつＷＬ１０の活性は、培養時間に関係なくほとんど一
定の活性を示した。およそ３００個のｐＳｃ−ＬＳＱを
染色体外にもつＷＬ３００の活性は、ＩＰＴＧの添加、
無添加の場合共に、僅かに減少した。ＷＬ１、ＷＬ２、
ＷＬ３，ＷＬ１０、ＷＬ３００（ＩＰＴＧ添加）、及び
ＷＬ３００（ＩＰＴＧ無添加）の硫化物除去が最大とな
る培養時間は、それぞれ、７、６、７、８、４、及び４
時間であり、前記時間における硫化物除去活性は、それ
ぞれ、３６、１１２、１４１、３３７、３１６、及び３
２４ｎｍｏｌ／ｍｇ細胞タンパク／ｍｇであった。ＷＬ
３の活性は、細胞質中にｓｑｒ遺伝子のマルチコピーを
もつ組換え体の活性のほぼ半分であった。The protein concentration was measured using a DC protein assay kit (Biolad).
The bacterial protein concentration was determined by the method of Herbert et al. (Her
bert, D .; et al: Methods in M
microbiology Vol. 5B, p209-3
44, Academic Press, New York
k, 1971). Sqr controlled by lac promoter in chromosome
Recombinant WL2 having 1 to 3 genes or WL3
When culturing was carried out, the sulfide removal activity tended to increase until the stationary phase with the lapse of the culturing time (FIG. 3). WL
The sulfide removal activity of 3 was higher than those of WL2 and WL1. The activity of WL10 having about 10 pV-LSQs extrachromosomally showed almost constant activity regardless of the culture time. The activity of WL300, which has about 300 pSc-LSQs extrachromosomally, is due to the addition of IPTG,
There was a slight decrease in both cases where no additive was added. WL1, WL2,
The culture times at which the sulfide removal of WL3, WL10, WL300 (with IPTG added), and WL300 (without IPTG added) were maximized were 7, 6, 7, 8, 4, and 4, respectively.
And the sulfide removal activity at that time was 36, 112, 141, 337, 316, and 3 respectively.
It was 24 nmol / mg cell protein / mg. WL
The activity of 3 was almost half that of the recombinant with multiple copies of the sqr gene in the cytoplasm.

【００３４】一方、染色体中に、ｔａｃプロモーターに
よって制御されるｓｑｒ遺伝子をもつＷＴ１、あるいは
ＷＴ２を培養した場合、ＷＴ１の硫化物除去活性は、培
養時間の経過に伴いゆるやかに増加する傾向を示した
（図５）。ＷＴ２の活性はＷＴ１のそれよりも高かった
が、ＷＴ１とは異なり、時間の経過に関係なくほぼ一定
に推移した。およそ１０個のｐＶ−ＴＳＱをもつＷＴ１
０、及び２０〜３０個のｐＫ−ＴＳＱをもつＷＴ２０
は、いずれも培養期間の早いステージで高い硫化物除去
活性を示したが、その後減少し、定常期においてほぼ一
定の活性を示した。ＷＴ１、ＷＴ２、ＷＴ１０、ＷＴ２
０（ＩＰＴＧ添加）、及びＷＴ２０（ＩＰＴＧ無添加）
の硫化物除去活性が最大となる培養時間は、それぞれ、
８、７、２、２、及び３時間であり、前記時間における
硫化物除去活性は、それぞれ、２４０、３１０、４２
３、３９４、及び３７２ｎｍｏｌ／ｍｇ細胞タンパク／
ｍｇであった。結論として、ＷＴ２は、コントロール細
胞の増殖に全く遅れることなく増殖するという点（図
４）、対数増殖期中期におるＷＴ２０の硫化物除去活性
のほぼ半分の硫化物除去活性をもつという点、及びｓｑ
ｒ遺伝子のマルチコピーをもつ菌体の定常期における硫
化物除去活性に近い活性をもつという点、から極めて満
足すべきものであった。On the other hand, when WT1 or WT2 having the sqr gene controlled by the tac promoter in the chromosome was cultured, the sulfide removing activity of WT1 tended to increase gradually with the elapse of the culture time. (FIG. 5). The activity of WT2 was higher than that of WT1, but, unlike WT1, it remained almost constant over time. WT1 with about 10 pV-TSQ
WT20 with 0 and 20-30 pK-TSQs
Showed high sulfide removal activity at an early stage of the culture period, but then decreased and showed almost constant activity in the stationary phase. WT1, WT2, WT10, WT2
0 (with no IPTG) and WT20 (without IPTG)
The culture time at which the sulfide removal activity of
8, 7, 2, 2, and 3 hours, at which time the sulfide removal activity was 240, 310, 42, respectively.
3, 394 and 372 nmol / mg cell protein /
mg. In conclusion, WT2 grows without any delay in the growth of control cells (FIG. 4), has almost half the sulfide removal activity of WT20 in mid-log phase, and sq
This was extremely satisfactory in that cells having multiple copies of the r gene had activities close to the sulfide removal activity in the stationary phase.

【００３５】［実施例５］ ＳＱＲ活性と酸素消費量の
関連 １）組換え体粗抽出液の調製 培養液を遠心分離（４，０００×ｇ、１０分、４℃）し
て得た菌体を、５ｍＭＥＤＴＡを含む２５ｍＭリン酸緩
衝液、（ｐＨ７．４）で１回洗浄後、再度同条件で遠心
分離し、菌体を回収した。回収した菌体を上記緩衝液に
懸濁した後、超音波処理（１２秒×２回、３０秒間間
隔）し、菌体を粉砕した。ＳＱＲ活性測定のために、こ
の粉砕液に１０％（ｖ／ｖ）Ｔｈｅｓｉｔを２５μＬ／
ｍＬ加え、氷上で１時間インキュベートしてＳＱＲタン
パクを可溶化した。インキュベーション後、遠心分離
（１０，０００×ｇ、１０分、４℃）して得た上清（粗
抽出液）をＳＱＲ活性測定に用いた。[Example 5] Relationship between SQR activity and oxygen consumption 1) Preparation of crude extract of recombinant cells Cells obtained by centrifuging the culture solution (4,000 xg, 10 minutes, 4 ° C) Was washed once with 25 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 5 mM EDTA, and then centrifuged again under the same conditions to collect cells. After suspending the collected cells in the above buffer, the cells were sonicated (12 seconds × 2 times, 30 seconds apart) to pulverize the cells. For the measurement of SQR activity, 25 μL /% of 10% (v / v)
mL was added and incubated for 1 hour on ice to solubilize the SQR protein. After the incubation, the supernatant (crude extract) obtained by centrifugation (10,000 × g, 10 minutes, 4 ° C.) was used for SQR activity measurement.

【００３６】２）ＳＱＲ活性測定 ＳＱＲ活性は、ＳＱＲによって触媒されるデシル−ＵＱ
の還元割合を、波長２７５ｎｍで測定した。反応温度は
２５℃とし、反応液組成（３ｍＬ）は、２５ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６．５）、０．０１％Ｔｈｅｓｉｔ、５０
μＭデシル−ＵＱ、１００μＭ Ｎａ_２Ｓ、及び上記粗
抽出物（１０μｇタンパク／ｍＬ）となるように調製し
た。反応は、Ｎａ_２Ｓの添加によって反応を開始した。
波長２７５ｎｍの吸収減少量を、デシル−ＵＱのミリモ
ル吸光係数１５（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ａ．：Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｑｕｉｎｏｎｅｓ，ｐ２３−２
４，１９６５）より算出した。2) Measurement of SQR activity The SQR activity is determined by decyl-UQ catalyzed by SQR.
Was measured at a wavelength of 275 nm. The reaction temperature was 25 ° C., and the reaction solution composition (3 mL) was 25 mM phosphate buffer (pH 6.5), 0.01% Thesit, 50%
It was prepared to be μM decyl-UQ, 100 μM Na ₂ S, and the above crude extract (10 μg protein / mL). The reaction was started by the addition of Na ₂ S.
The amount of decrease in absorption at a wavelength of 275 nm was determined by comparing the decyl-UQ with a molar extinction coefficient of 15 (Morton, RA: Bioch).
emistry of Quinones, p23-2
4, 1965).

【００３７】３）硫化物除去に伴う酸素消費度の測定 硫化物除去に伴う酸素消費度を、酸素電極（飯島電子工
業、ＧＵ−ＢＭ）を用いて測定した。反応液及びＮａ_２
Ｓ濃度は、硫化物除去活性の測定に用いたものと同じも
のを使用した。ただし、菌体濃度は、０．１５ｍｇタン
パク／ｍＬであった。反応液２．２ｍＬを使用した。菌
体を添加後、２５℃、１０分間保温した後、Ｎａ_２Ｓの
添加により反応を開始した。3) Measurement of oxygen consumption due to sulfide removal The oxygen consumption due to sulfide removal was measured using an oxygen electrode (Iijima Denshi Kogyo, GU-BM). Reaction solution and Na ₂
The same S concentration as that used in the measurement of the sulfide removal activity was used. However, the cell concentration was 0.15 mg protein / mL. 2.2 mL of the reaction solution was used. After adding the cells, the mixture was kept at 25 ° C. for 10 minutes, and then the reaction was started by adding Na ₂ S.

【００３８】４）ＳＱＲ活性と酸素消費量 組換え体のＳＱＲ活性と硫化物の除去に伴う酸素消費量
との関連を、対数増殖期中期、対数増殖期後期、及び定
常期のそれぞれについて調べた。ｓｑｒ遺伝子のコピー
数が１０及びそれ以下の場合、いずれの増殖期において
も、染色体中に、ｌａｃプロモーター、あるいはｔａｃ
プロモーターの制御下にあるｓｑｒ遺伝子をもつ組換え
体は、ｓｑｒ遺伝子のコピー数が１０及びそれ以下の場
合、ＳＱＲ活性の増加に伴って酸素消費量が増加した。
すなわち、ｓｑｒ遺伝子の導入効果がはっきりと認めら
れた。ＳＱＲ活性は、培養ステージが進むにつれて、一
般的に、その変化幅は減少傾向を示した。酸素消費量も
培養ステージの終末には減少した。酸素消費量は、対数
増殖期中期までは、ＳＱＲ活性の増加に対して、ほとん
ど直線的に増加した。ＳＱＲ活性が約７００ｎｍｏｌ／
ｍｇ菌体タンパク質／分以下の場合は、酸素消費量はＳ
ＱＲ活性に比例して増加した。しかしながら、ＳＱＲ活
性が９００ｎｍｏｌ／ｍｇ菌体タンパク質／分を超える
と、酸素消費量はＳＱＲ活性に影響されなくなった（図
６）。この反応において、酸化された硫化物と消費され
た酸素の分子比は、ほぼ、２：１であった。4) SQR Activity and Oxygen Consumption The relationship between the SQR activity of the recombinant and the oxygen consumption due to the removal of sulfide was examined in each of the middle logarithmic growth phase, the late logarithmic growth phase, and the stationary phase. . When the copy number of the sqr gene is 10 or less, the lac promoter or tac
Recombinants with the sqr gene under the control of the promoter increased oxygen consumption with increasing SQR activity when the copy number of the sqr gene was 10 or less.
That is, the effect of introducing the sqr gene was clearly observed. SQR activity generally showed a decreasing trend as the culture stage progressed. Oxygen consumption also decreased at the end of the culture stage. Oxygen consumption increased almost linearly with increasing SQR activity until mid-log phase. SQR activity is about 700 nmol /
In the case of mg cell protein / min or less, the oxygen consumption is S
Increased in proportion to QR activity. However, when SQR activity exceeded 900 nmol / mg bacterial cell protein / min, oxygen consumption was no longer affected by SQR activity (FIG. 6). In this reaction, the molecular ratio of oxidized sulfide to consumed oxygen was approximately 2: 1.

【００３９】［実施例６］ 染色体組込み株の安定性 ｓｑｒ遺伝子を細胞質または染色体の中に導入した組換
え細胞の生存を、非選択培地上で１６０世代まで調べ
た。ｓｑｒ遺伝子を染色体にもつ菌株、及びｓｑｒ遺伝
子をもつプラスミドを保持する菌株を選択培地で１４時
間（ＷＬ３００、ＷＴ２０は１８時間）培養後の菌液を
“０”世代（ｔ＝０）とした。これを１０^３ＣＦＵ／ｍ
Ｌになるように非選択培地で調製後、定常期まで培養し
た。この時点で、約２０世代培養したことになる。さら
に、このような培養を７回繰り返し、最終的に約１６０
世代まで培養した。ｔ＝０とｔ＝１６０でのｓｑｒ活
性、硫化物除去活性に伴う酸素消費度、及びサザンハイ
ブリダイゼーション分析を行い、組込み株の安定性を調
べた。Example 6 Stability of Chromosome-Integrated Strains The survival of recombinant cells in which the sqr gene was introduced into the cytoplasm or chromosome was examined on a non-selective medium up to 160 generations. The bacterial solution obtained by culturing the strain having the sqr gene on the chromosome and the strain having the plasmid having the sqr gene in a selective medium for 14 hours (18 hours for WL300 and WT20) was defined as the “0” generation (t = 0). This is 10 ³ CFU / m
After being prepared in a non-selective medium so as to be L, the cells were cultured until the stationary phase. At this point, about 20 generations have been cultured. Further, such culture was repeated seven times, and finally, about 160
Cultured to generations. The stability of the integrated strain was examined by performing sqr activity at t = 0 and t = 160, oxygen consumption accompanying sulfide removal activity, and Southern hybridization analysis.

【００４０】プラスミドｐＳｃ−ＬＳＱもつＷＬ３０
０、及びｐＫ−ＴＳＱをもつＷＴ２０細胞は、ＳＱＲ活
性を失い、硫化物除去活性も検出限界以下に低下した。
染色体中にｌａｃプロモーターの制御下にｓｑｒ遺伝子
１コピーをもつＷＬ１、２コピーをもつＷＬ２、３コピ
ーをもつＷＬ３、並びに染色体中にｔａｃプロモーター
の制御下にｓｑｒ遺伝子１コピーをもつＷＴ１、２コピ
ーをもつＷＴ２細胞はいずれも、０世代と同程度のＳＱ
Ｒ活性及び硫化物除去活性を保持していた（表１）。上
記１６０世代の組換え細胞の染色体中のｓｑｒ配列は、
サザンブロット法で確認した。WL30 with plasmid pSc-LSQ
WT20 cells having 0 and pK-TSQ lost the SQR activity, and the sulfide removal activity also fell below the detection limit.
WL1 with one copy of the sqr gene under control of the lac promoter in the chromosome, WL2 with two copies, WL3 with three copies, and WT1 and two copies of the sqr gene with one copy under the control of the tac promoter in the chromosome. WT2 cells have the same SQ as the 0 generation
R activity and sulfide removal activity were retained (Table 1). The sqr sequence in the chromosome of the above-mentioned 160 generation recombinant cells is:
Confirmed by Southern blotting.

【００４１】[0041]

【表１】 [Table 1]

【００４２】[0042]

【発明の効果】本発明の硫化水素除去活性を有する組換
え体は、家畜の飼料に添加することにより、腸内に残存
し悪臭の主たる原因である硫化水素を除去し、結果、排
泄糞の悪臭を低減化することが期待できる。また、他の
消臭性物質（例えば、オリゴ糖、ゼオライト、カテキン
類等）と併用することにより、さらなる消臭効果が期待
できる。The recombinant having the activity of removing hydrogen sulfide of the present invention is added to livestock feed to remove hydrogen sulfide, which remains in the intestine and is a main cause of malodor, and as a result, excreted feces It can be expected that odor is reduced. Further, when used in combination with other deodorant substances (for example, oligosaccharides, zeolites, catechins, etc.), a further deodorant effect can be expected.

【００４３】[0043]

【配列表】[Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 １〜３コピーのｓｑｒ遺伝子が大腸菌Ｗ３１
１０株の染色体中に組込みまれたＷ３１１０誘導体の構
築を示す図である。ｓｑｒ遺伝子断片は、ＥｃｏＲ Ｖ
（ｐＩＮＴ−ＬＳＱ１）、ＢａｍＨ Ｉ（ｐＩＮＴ−Ｌ
ＳＱ２）、ＸｂａＩ（ｐＩＮＴ−ＬＳＱ３）、ＥｃｏＲ
Ｉ（ｐＩＮＴ−ＴＳＱ１）、あるいはＳｍａＩ（ｐＩ
ＮＴ−ＴＳＱ２）消化後、末端をＴ４ポリメララーゼで
平滑化し、一個ずつ、ｐＩＮＴ−Ｔｓ／Ｋｍｒのマルチ
クローニングサイト（ＭＣＳ）に導入された。FIG. 1. 1-3 copies of the sqr gene are found in E. coli W31.
FIG. 3 is a diagram showing the construction of a W3110 derivative integrated into chromosomes of 10 strains. The sqr gene fragment is EcoR V
(PINT-LSQ1), BamHI (pINT-L
SQ2), XbaI (pINT-LSQ3), EcoR
I (pINT-TSQ1) or SmaI (pI
After NT-TSQ2) digestion, the ends were blunted with T4 polymerase and introduced one by one into the multicloning site (MCS) of pINT-Ts / Kmr.

【図２】 ｌａｃプロモーター制御下にある数コピーの
ｓｑｒ遺伝子をもつＷ３１１０誘導体の増殖パターンを
示す図である。１ｍＭ（最終濃度）のＩＰＴＧでｓｑｒ
遺伝子の発現を誘導した。コピー数はｍａｎｕｆａｃｔ
ｕｒｅ’ｓｒｅｐｏｒｔ（ＱＩＡＧＥＮＰｒｏｄｕｃｔ
Ｇｕｉｄｅ，１９９９）から推定した。□：１コピ
ー、●：２コピー、△：３コピー、■：約１０コピー、
◆：３００〜５００コピー、○：３００〜５００コピー
^＊。^＊：培地にＩＰＴＧを含まない。FIG. 2 shows the growth pattern of a W3110 derivative with several copies of the sqr gene under the control of the lac promoter. Sqr with 1 mM (final concentration) IPTG
Gene expression was induced. Copy number is manfactor
ure's report (QIAGENProduct
Guide, 1999). □: 1 copy, ●: 2 copies, △: 3 copies, ■: about 10 copies,
◆: 300-500 copies, ○: 300-500 copies
^* . ^* : The medium does not contain IPTG.

【図３】 ｌａｃプロモーター制御下にある数コピーの
ｓｑｒ遺伝子をもつＷ３１１０誘導体全細胞抽出物の硫
化物除去を示す図である。□：１コピー、●：２コピ
ー、△：３コピー、■：約１０コピー、◆：３００〜５
００コピー、○：３００〜５００コピー^＊。^＊：培地に
ＩＰＴＧを含まない。FIG. 3 shows sulfide removal of W3110 derivative whole cell extract with several copies of the sqr gene under the control of the lac promoter. □: 1 copy, ●: 2 copies, △: 3 copies, ■: about 10 copies, ◆: 300-5
00 copies, ：: 300 to 500 copies ^* . ^* : The medium does not contain IPTG.

【図４】 ｔａｃプロモーター制御下にある数コピーの
ｓｑｒ遺伝子をもつＷ３１１０誘導体の増殖パターンを
示す図である。１ｍＭ（最終濃度）のＩＰＴＧでｓｑｒ
遺伝子の発現を誘導した。コピー数はｍａｎｕｆａｃｔ
ｕｒｅ’ｓｒｅｐｏｒｔ（ＱＩＡＧＥＮＰｒｏｄｕｃｔ
Ｇｕｉｄｅ，１９９９）から推定した。△：１コピ
ー、○：２コピー、□：１０コピー、●：２０〜３０コ
ピー、◆：２０〜３０コピー^＊。^＊：培地にＩＰＴＧを
含まない。FIG. 4 shows the proliferation pattern of a W3110 derivative having several copies of the sqr gene under the control of the tac promoter. Sqr with 1 mM (final concentration) IPTG
Gene expression was induced. Copy number is manfactor
ure's report (QIAGENProduct
Guide, 1999). Δ: 1 copy, ○: 2 copies, □: 10 copies, ●: 20 to 30 copies, Δ: 20 to 30 copies ^* . ^* : The medium does not contain IPTG.

【図５】 ｔａｃプロモーター制御下にある数コピーの
ｓｑｒ遺伝子をもつＷ３１１０誘導体全抽出物の硫化物
除去を示す図である。△：１コピー、○：２コピー、
□：１０コピー、●：２０〜３０コピー、◆：２０〜３
０コピー^＊。^＊：培地にＩＰＴＧを含まない。FIG. 5 shows sulfide removal of W3110 derivative whole extract having several copies of sqr gene under the control of tac promoter. △: 1 copy, ○: 2 copies,
□: 10 copies, ●: 20-30 copies, Δ: 20-3
0 copies ^* . ^* : The medium does not contain IPTG.

【図６】 ＳＱＲ酵素活性と全菌体粗抽出物における酸
素消費量との関連を示す図である。低ＳＱＲ活性は、Ｗ
Ｌ１，ＷＬ２，ＷＬ３，ＷＴ１およびＷＴ２の各株で得
られた。高ＳＱＲ活性は、特に対数増殖期後期のＷＴ１
０およびＷＴ２０の株で得られた。□：対数増殖期中
期、○：対数増殖期後期、△：定常期。FIG. 6 is a graph showing the relationship between the SQR enzyme activity and the amount of oxygen consumed in the crude extract of whole cells. Low SQR activity is
L1, WL2, WL3, WT1 and WT2 were obtained. High SQR activity is particularly significant in late log phase WT1
0 and WT20 strains. □: middle logarithmic growth phase, ○: late logarithmic growth phase, Δ: stationary phase.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｅ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｆターム(参考） 2B005 EA01 2B150 AA01 AA03 AA05 AA06 AB12 AC01 AC37 DC13 DD11 DH21 4B024 AA10 AA17 BA08 CA03 DA06 EA04 FA02 FA03 FA04 GA11 4B050 CC04 DD02 LL10 4B065 AA01Y AA26X AB01 AC14 BA02 CA28 CA43 CA54 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) // C12N 9/02 C12R 1:01) (C12N 15/09 ZNA (C12N 1/20 E C12R 1:01) ) C12R 1:19) (C12N 1/20 (C12N 1/21 C12R 1:19) C12R 1:19) (C12N 1/21 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:19) C12R 1:01) F term (reference) ) 2B005 EA01 2B150 AA01 AA03 AA05 AA06 AB12 AC01 AC37 DC13 DD11 DH21 4B024 AA10 AA17 BA08 CA03 DA06 EA04 FA02 FA03 FA04 GA11 4B050 CC04 DD02 LL10 4B065 AA01Y AA26X AB01 AC14 BA02 CA43 CA54

Claims (11)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 単離された１つ以上の硫化物−キノン酸
化還元酵素遺伝子ｓｑｒが微生物の染色体中の生育に影
響しない遺伝子領域に該微生物のプロモーターで作動可
能に組込まれた硫化水素除去活性を有する組換え微生
物。1. A hydrogen sulfide-removing activity in which one or more isolated sulfide-quinone oxidoreductase genes sqr are operably integrated with a promoter of a microorganism in a gene region that does not affect growth in the chromosome of the microorganism. A recombinant microorganism having: 【請求項２】 生育に影響しない遺伝子領域がＬａｃＺ
遺伝子である請求項１記載の組換え微生物。2. A gene region that does not affect growth is LacZ.
The recombinant microorganism according to claim 1, which is a gene. 【請求項３】 プロモーターがｔａｃプロモーターであ
る請求項１記載の組換え微生物。3. The recombinant microorganism according to claim 1, wherein the promoter is a tac promoter. 【請求項４】 ｔａｃプロモーターで作動可能な少なく
とも２コピーのｓｑｒ遺伝子をもつ請求項１記載または
３記載の組換え微生物。4. The recombinant microorganism according to claim 1, which has at least two copies of the sqr gene operable by a tac promoter. 【請求項５】 ｓｑｒ遺伝子が紅色非硫黄細菌由来であ
る請求項１記載の組換え微生物。5. The recombinant microorganism according to claim 1, wherein the sqr gene is derived from a red non-sulfur bacterium. 【請求項６】 紅色非硫黄細菌がＲｈｏｄｏｂａｃｔｅ
ｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓである請求項５記載の組換え
微生物。6. The red non-sulfur bacterium is Rhodobacte.
The recombinant microorganism according to claim 5, which is r capsulatus . 【請求項７】 微生物が大腸菌Ｗ３１１０株である請求
項１記載の組換え微生物。7. The recombinant microorganism according to claim 1, wherein the microorganism is Escherichia coli strain W3110. 【請求項８】 請求項１〜７記載のいずれかの組換え微
生物を有効成分として含む家畜の***糞の悪臭低減作用
を有する飼料。8. A feed containing the recombinant microorganism according to any one of claims 1 to 7 as an active ingredient and having an action of reducing foul odor of excreted feces of livestock. 【請求項９】 家畜がブタである請求項８記載の飼料。9. The feed according to claim 8, wherein the livestock is a pig. 【請求項１０】 家畜の***糞の悪臭を低減する作用を
有する飼料を製造するための請求項１〜８記載のいずれ
かの組換え微生物の使用。10. Use of the recombinant microorganism according to any one of claims 1 to 8 for producing a feed having an action of reducing malodor of feces excreted by livestock. 【請求項１１】 家畜がブタである請求項１０記載の使
用。11. Use according to claim 10, wherein the livestock is a pig.