JP2002139501A - Method for analyzing and diagnosing lipoprotein subclass - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for separating and evaluating a predetermined component, i.e., a subclass among lipoprotein particles consisting of a large number of components distributed over a wide size region in an irregular and continuous manner. SOLUTION: In this method, the subclass component is extracted and determined, and served for diagnosis by the waveform processing of distribution information of lipoprotein obtained from a chromatogram or the like of a sample.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明はリポ蛋白の分析なら
びに診断方法に関する。さらに詳しくは、生体試料に含
まれるリポ蛋白の分離、測定方法、ならびにそれを用い
た脂質成分や脂質代謝の生理的、病態生理的な評価また
は診断方法に関するものである。[0001] The present invention relates to a method for analyzing and diagnosing lipoproteins. More specifically, the present invention relates to a method for separating and measuring a lipoprotein contained in a biological sample, and a method for evaluating or diagnosing the physiological and pathophysiological properties of lipid components and lipid metabolism using the same.

【０００２】[0002]

【従来の技術】血液中ではコレステロールや中性脂肪等
の脂質は蛋白質と結合したリポ蛋白の形で存在してい
る。 リポ蛋白はその構成成分の種類や量、大きさによ
り様々な種類があり、それらは軽いものから、CM（カイ
ロミクロン）、VLDL（超低密度リポ蛋白：d ＜1.00
6）、LDL（低密度リポ蛋白：1.006 ＜d ＜1.063)、HDL
（高密度リポ蛋白：1.063 ＜d ＜1.210）の４分画に大
きく分類されている。2. Description of the Related Art In blood, lipids such as cholesterol and neutral fats exist in the form of lipoproteins bound to proteins. There are various types of lipoproteins depending on the type, amount, and size of their constituent components. These are light to CM (chylomicron), VLDL (ultra low density lipoprotein: d <1.00
6), LDL (low density lipoprotein: 1.006 <d <1.063), HDL
(High-density lipoprotein: 1.063 <d <1.210).

【０００３】これらリポ蛋白の古典的な分析法として超
遠心分離法が知られているが、これは大量の血液試料と
数日間にもわたる長時間の処理を要するうえ、正確な測
定には非常な熟練を要するという問題がある。 また電
気泳動は少量の試料、短時間で分析可能であるが、定性
的な情報のみで定量的手段として不適である。[0003] The ultracentrifugation method is known as a classical method for analyzing these lipoproteins, which requires a large amount of blood sample and a long processing time of several days, and is extremely difficult for accurate measurement. There is a problem that requires great skill. Although electrophoresis can analyze a small amount of sample in a short time, it is not suitable as a quantitative means because of only qualitative information.

【０００４】一方、リポ蛋白の粒子サイズは、一般に 4
?600 nm程度の広い範囲に分布しているので、この粒子
サイズの違いから分子ふるい効果を利用してリポ蛋白の
分離・分画を行うゲル濾過クロマトグラフィー法が開発
されている。岡崎らは、このようなゲル濾過クロマトグ
ラフィー法のうち、高速液体クロマトグラフィー (HPL
C) を利用する方法に改善を重ね、分離されたリポタン
パク質に酵素試薬を用いてコレステロールや中性脂肪そ
れぞれに特異的なリポ蛋白プロファイルを得ることによ
り、多成分のリポ蛋白を簡便、迅速に分析、定量する方
法を開発した（特許公開平８?３２０３１３、リポ蛋白
代謝異常疾患の診断方法）。On the other hand, the particle size of lipoprotein is generally 4
Since the particles are distributed over a wide range of about 600 nm, a gel filtration chromatography method for separating and fractionating lipoproteins using the molecular sieving effect has been developed based on this difference in particle size. Okazaki and colleagues used high-performance liquid chromatography (HPL) among these gel filtration chromatography methods.
Improvement of the method using C) to obtain a specific lipoprotein profile for each of cholesterol and triglyceride using enzymatic reagents on the separated lipoproteins, thereby enabling simple and rapid multicomponent lipoproteins A method for analysis and quantification was developed (Japanese Patent Laid-Open Publication No. 8-320313, a method for diagnosing lipoprotein metabolism disorder).

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】悪玉コレステロールと
して知られるLDLコレステロールや、善玉のHDLコレステ
ロールは、いずれも単一の物質ではなく、一定の範囲内
のサイズをもつ様々な粒子をまとめた総称であり、これ
らの分画内のリポ蛋白粒子がすべて同様の性質を持って
いるわけではない。リポ蛋白代謝のプロセスや、脂質代
謝に変動をきたしうる種々の生理的あるいは病理的な状
態を研究あるいは診断する上で、リポ蛋白各分画の中の
固有の性質をもつ個別の成分、すなわちサブクラスの分
析が重要である。LDL cholesterol, which is known as bad cholesterol, and HDL cholesterol, which are good, are not a single substance but a general term for various particles having a certain size range. Not all lipoprotein particles in these fractions have similar properties. In researching or diagnosing the processes of lipoprotein metabolism and various physiological or pathological conditions that may cause changes in lipid metabolism, individual components having unique properties in each lipoprotein fraction, that is, subclasses Analysis is important.

【０００６】しかしながら、従来技術によるリポ蛋白
サブクラスの分析は種々の制約をかかえており、実用性
を欠いたものであった。超遠心法によるサブクラスの定
量が試みられているが、高度な技術が必要とされ、しか
もLDLサブクラスのみに限られた方法である。また電気
泳動によるLDLサブクラスの分析法は、脂質成分の泳動
パターンを大、中、 小に型判定するのみで定量法では
なく、治療経過などの観察に用いることができない。従
って本HPLC法は、LDLやHDLサブクラス、さらにはLDLよ
り大サイズ側のVLDLサブクラスまで、リポ蛋白成分（コ
レステロール、トリグリセリド、リン脂質等）量として
サブクラスを解析可能な手法を提供するものである。However, lipoproteins according to the prior art
The analysis of the subclass was subject to various restrictions and lacked practicality. Attempts have been made to determine subclasses by ultracentrifugation, but advanced techniques are required, and the method is limited to the LDL subclass only. The analysis of LDL subclasses by electrophoresis is only a method for determining the migration pattern of lipid components into large, medium, and small types, and is not a quantitative method and cannot be used to observe the progress of treatment. Therefore, the present HPLC method provides a method capable of analyzing subclasses as lipoprotein components (cholesterol, triglyceride, phospholipid, etc.) up to LDL and HDL subclasses, and even VLDL subclasses larger than LDL.

【０００７】HPLC法で得られる出力波形は、図１に見ら
れるように連続的かつ不規則なため、サブクラスを特定
のピークとしてとらえることは容易でなく、その判読に
は熟練者の経験と勘に頼る必要があった。HDL分画中の
サブクラスに関していえば、HDL専用の液体クロマトグ
ラフィー用カラムを用いることにより分離が可能であ
る。しかし、この手法では 各サブクラスの測定精度の
問題の他、HDL以外の分画を別の測定系で分析し直す必
要が生ずる。先に呈示したHPLC法によるリポ蛋白分析の
最も優れた特徴は、段階的な分画を繰り返さずに、4?60
0nm程度の広範囲にわたる粒子サイズを有するリポ蛋白
を一度に分離できることであり、部分的な分析のために
カラムを使い分けることなく、一括してサブクラス分析
が可能となる。Since the output waveform obtained by the HPLC method is continuous and irregular as shown in FIG. 1, it is not easy to catch a subclass as a specific peak. Had to rely on. Regarding the subclasses in the HDL fraction, separation can be performed by using a liquid chromatography column dedicated to HDL. However, in this method, in addition to the problem of the measurement accuracy of each subclass, it becomes necessary to re-analyze fractions other than HDL using another measurement system. The best feature of the lipoprotein analysis presented by the HPLC method presented earlier is that 4 to 60
The ability to separate lipoproteins having a particle size over a wide range of about 0 nm at a time makes it possible to perform subclass analysis collectively without using different columns for partial analysis.

【０００８】そこで本発明では、リポ蛋白を生理学的、
病態生理学的に意義のあるサブクラスに分離する新規な
方法を提供することを目的とする。 また、かかるサブ
クラスを分離した後に、簡便に精度の高い定量を可能と
するリポ蛋白質の分析方法を提供することを目的とす
る。さらに、かかるリポ蛋白のサブクラス分析から生体
試料中のリポ蛋白の特徴を把握し、リポ蛋白の代謝動態
やその異常を簡便かつ正確に評価、診断する方法を提供
することを目的とする。Accordingly, in the present invention, lipoproteins are
It is an object of the present invention to provide a novel method for separating into subclasses having a pathophysiological significance. Another object of the present invention is to provide a method for analyzing lipoproteins, which enables simple and accurate quantification after separating such subclasses. It is another object of the present invention to provide a method for easily and accurately evaluating and diagnosing the metabolic dynamics of lipoproteins and abnormalities thereof by grasping the characteristics of lipoproteins in a biological sample from the lipoprotein subclass analysis.

【０００９】[0009]

【課題を解決するための手段】リポ蛋白プロファイルの
詳細な分析からは、主要４大分画成分のみでは特徴づけ
られない様々な生理的、病態生理的変動を反映する多数
の表現型が存在することがみいだされる。本発明者は、
ヒトおよび各種動物から得られた正常および各種代謝変
動を含む多数の血清その他の生体内、生体外検体の分析
に鋭意研究を重ねた結果、リポ蛋白が内包するこうした
複雑な代謝動態の表現型を最小限個数に集約させたうえ
でかつ、個々の表現型を一つのサブクラスとした分布関
数波形の合成としてリポ蛋白プロファイルを解析するこ
とに成功した。本発明は、HPLC法および核磁気共鳴法、
超遠心法、各種電気泳動法に例示されるリポ蛋白分離手
法により得られたリポ蛋白プロファイルに波形処理を施
すことにより、これらの表現型を、図８に定義されるよ
うなリポ蛋白サブクラスとして分離抽出する方法であ
る。Detailed analysis of the lipoprotein profile reveals that there are many phenotypes that reflect various physiological and pathophysiological variations that cannot be characterized only by the four major fraction components. Is found. The inventor has
After extensive research into the analysis of a large number of serum and other in vivo and in vitro specimens, including normal and various metabolic changes obtained from humans and various animals, the phenotype of such complex metabolic kinetics encapsulated by lipoproteins was revealed. We have succeeded in analyzing the lipoprotein profile as a synthesis of distribution function waveforms with each phenotype as one subclass after being aggregated to the minimum number. The present invention relates to an HPLC method and a nuclear magnetic resonance method,
By subjecting lipoprotein profiles obtained by lipoprotein separation techniques exemplified by ultracentrifugation and various electrophoresis methods to waveform processing, these phenotypes are separated as lipoprotein subclasses as defined in FIG. It is a method to extract.

【００１０】リポ蛋白サブクラスの定量測定は、基本波
形として用いる分布関数の波形領域として迅速に算出さ
れる。クロマトグラフィー装置由来の波形の歪は、デコ
ンボリュウションにより近似することが可能であり、機
械的ノイズはスムージングにより補正できる。標準検体
によるキャリブレイションを実施し、実際の分析試料の
波形処理における基本波形のパラメーターを調整するこ
となどの手順をとることにより、種々の異なる測定条件
下でも本発明はこのように客観性のあるサブクラスの定
量分析を可能とする方法である。[0010] The quantitative measurement of the lipoprotein subclass is rapidly calculated as a waveform region of a distribution function used as a basic waveform. The distortion of the waveform derived from the chromatography apparatus can be approximated by deconvolution, and the mechanical noise can be corrected by smoothing. The present invention is thus objective even under various different measurement conditions by performing calibration with a standard sample and taking steps such as adjusting parameters of a basic waveform in waveform processing of an actual analysis sample. This is a method that enables quantitative analysis of subclasses.

【００１１】また、本発明は上記分析法をもちいて試料
中のリポ蛋白サブクラスの特徴を把握し、種々の状況下
でのリポ蛋白の代謝動態あるいは病態を診断する方法で
ある。The present invention is also a method for diagnosing lipoprotein metabolic dynamics or pathological conditions under various conditions by ascertaining the characteristics of lipoprotein subclasses in a sample using the above-described analysis method.

【発明の実施の形態】BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

【００１２】本発明の方法における被検試料は、そのリ
ポ蛋白構成を調べようとするものであればいずれのもの
であってもよく、例えば血漿や血清、脳せき髄液のよう
な体液、HepG2細胞やWHHLウサギ肝細胞などの細胞培養
液や各種実験測定系処理液の上清成分等、例えばアポ蛋
白の抗体吸着処理後の血清等を挙げることができる。試
料は人間のみならず、各種動物からの検体も分析可能で
ある。これらの生体試料、好ましくは血清は、前処理を
行わずにクロマトグラフィーに付することもできるが、
前処理を施した後に分離操作に付すことも可能である。
リポ蛋白のある特定の成分を抗体吸収法等により前もっ
て除去した試料をクロマトグラフィーに付するというよ
うな手法が一例である。被検試料は、必要に応じ、適宜
希釈してから他の試薬と混合してもよい。本発明の方法
により精度よくリポ蛋白代謝の分析診断能力を損なわな
い限りいかなる前処理工程を採用してもよい。The test sample in the method of the present invention may be any sample as long as its lipoprotein composition is to be examined. Examples thereof include plasma, serum, body fluids such as cerebrospinal fluid, and HepG2 cells. And cell culture solutions such as WHHL rabbit hepatocytes and supernatant components of various experimental measurement system treatment solutions, such as serum after apoprotein antibody adsorption treatment. Samples can be analyzed not only from humans but also from various animals. These biological samples, preferably serum, can also be subjected to chromatography without pretreatment,
It is also possible to perform a separation operation after performing the pretreatment.
An example is a technique in which a sample from which a specific component of lipoprotein has been removed in advance by an antibody absorption method or the like is subjected to chromatography. The test sample may be appropriately diluted and then mixed with another reagent if necessary. Any pretreatment step may be employed as long as the ability of the method of the present invention to accurately analyze and diagnose lipoprotein metabolism is not impaired.

【００１３】本発明のうち、液体クロマトグラフイーに
よるリポタンパク質の分離・分析は、操作性や迅速性の
観点から、高速液体クロマトグラフイー(HPLC) による
ことが好ましい。その中で特に、ゲル濾過クロマトグラ
フィーを可能にするHPLC法ならばいかなるものを用いて
もよい。In the present invention, the separation and analysis of lipoproteins by liquid chromatography are preferably performed by high performance liquid chromatography (HPLC) from the viewpoint of operability and quickness. In particular, any HPLC method that enables gel filtration chromatography may be used.

【００１４】HPLC法により本発明の方法を施行する際に
用いる分析装置は、例えば、従来公知のHPLCによるリポ
蛋白の自動分析装置をそのまま用いることが可能であ
る。本発明の方法に用いることができる好ましいHPLC分
析装置の概略を図９に示す。図の装置では、オートサン
プラーにセットされた血清がクロマトグラフィー用カラ
ムに注入され、ポンプ１から送液される溶離液によって
リポ蛋白が粒子サイズの大きさの順に分離される。その
後、カラムからの溶出液中にポンプ２から酵素試薬を連
続的に送り込み、リアクター内で発色させてコレステロ
ールを検出し、溶出時間とコレステロール量を示すクロ
マトグラムが自動的に作成されるようになっている。こ
のような装置をそのまま用いてトリアシルグリセロール
の定量を行うことができる。なお、トリアシルグリセロ
ールの定量は同一の試料を用いて別途に行ってもよい
が、図示の装置において、カラムからの溶出液を二手に
分配して、コレステロール検出用のリアクターとトリア
シルグリセロール検出用のリアクターに送り込み、一度
の操作でコレステロールおよびトリアシルグリセロール
を同時に定量することも可能である。本発明の方法に利
用可能な装置はこれらの例に限定されることはない。As the analyzer used when performing the method of the present invention by the HPLC method, for example, a conventionally known automatic analyzer for lipoproteins by HPLC can be used as it is. FIG. 9 shows an outline of a preferred HPLC analyzer that can be used in the method of the present invention. In the apparatus shown in the figure, the serum set in the autosampler is injected into the chromatography column, and the lipoprotein is separated by the eluent sent from the pump 1 in the order of particle size. Thereafter, the enzyme reagent is continuously sent from the pump 2 into the eluate from the column, and the color is developed in the reactor to detect cholesterol, and a chromatogram showing the elution time and the amount of cholesterol is automatically created. ing. Triacylglycerol can be quantitatively determined using such an apparatus as it is. The quantification of triacylglycerol may be separately performed using the same sample.However, in the illustrated apparatus, the eluate from the column is divided into two parts, and a reactor for detecting cholesterol and a reagent for detecting triacylglycerol are used. Cholesterol and triacylglycerol can be simultaneously determined in one operation. Devices that can be used in the method of the present invention are not limited to these examples.

【００１５】カラムの充填剤であるゲル濾過剤として
は、広い範囲の粒子サイズを有するリポ蛋白の分離を可
能にするものならば、ポリマー系ゲル濾過剤やシリカゲ
ル系ゲル濾過剤などのいかなるゲル濾過剤を用いてもよ
い。もっとも、本発明の方法により的確な診断を行うた
めには、少なくとも大サイズリポ蛋白と小サイズリポ蛋
白とが十分に分離され、特に、小サイズリポ蛋白が大サ
イズリポ蛋白から完全に独立したピークを与えるような
カラムを選択すべきである。このようなゲル濾過剤を充
填したHPLC用カラムは市販のものをそのまま用いること
ができる。例えば、単一の種類のカラムを１または２以
上用いてもよいが、種類の異なる２以上のカラムを組み
合わせて用いてもよい。As the gel filtration agent which is a column packing material, any gel filtration agent such as a polymer gel filtration agent or a silica gel gel filtration agent can be used as long as it enables separation of lipoproteins having a wide range of particle sizes. An agent may be used. However, in order to make an accurate diagnosis by the method of the present invention, at least the large lipoprotein and the small lipoprotein are sufficiently separated, and particularly, the peak in which the small lipoprotein is completely independent of the large lipoprotein. You should choose a column that gives A commercially available HPLC column filled with such a gel filtration agent can be used as it is. For example, one or more columns of a single type may be used, or two or more columns of different types may be used in combination.

【００１６】リポ蛋白を分離するための溶離液として
は、広い範囲の粒子サイズを有するリポ蛋白の分離を可
能にするものならばいかなるものを用いてもよく、例え
ば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ビス?トリス緩衝液
等を用いることができる。緩衝液の濃度やpHは特に制限
されないが、一般的には、十分な緩衝能を有し、コレス
テロール及びトリアシルグリセロールの検出（ポストカ
ラム反応）を阻害せず、カラムの充填剤に対するリポ蛋
白の非特異的吸着を抑制する、などの特性を備え、大小
サイズリポ蛋白が完全に分離されるような条件を選択す
べきである。溶離液はカラムとの組み合わせで選択する
ことが望ましく、例えば東ソーのTSKgel LipopropakXL
の場合はTSK eluent LP-1や LP-2が、ファルマシアのSu
perose 6HRカラムの場合は、リン酸緩衝液（ｐH 7.4）
が適している。As the eluent for separating lipoproteins, any eluent can be used as long as it allows separation of lipoproteins having a wide range of particle sizes, such as phosphate buffer and Tris buffer. Liquid, bistris buffer and the like can be used. The concentration and pH of the buffer are not particularly limited, but generally have a sufficient buffering capacity, do not inhibit the detection of cholesterol and triacylglycerol (post-column reaction), and prevent the lipoprotein from reacting with the column packing material. Conditions should be selected that have characteristics such as suppressing non-specific adsorption and allow complete separation of large and small size lipoproteins. The eluent is preferably selected in combination with a column, for example, TSKgel LipopropakXL from Tosoh
In the case of TSK eluent LP-1 or LP-2, Pharmacia Su
For perose 6HR column, phosphate buffer (pH 7.4)
Is suitable.

【００１７】上記のようなHPLCによってリポ蛋白を粒子
サイズの順に分離し、リポ蛋白プロファイルが得られ
る。また、HPLCカラムからの溶出液に酵素試薬処理（ポ
ストカラム反応）を施すことでコレステロール及びトリ
アシルグリセロールが検出され、それぞれの定量的クロ
マトグラム（リポ蛋白プロファイル）が得られる。ここ
でいう酵素試薬としては、コレステロールとの反応では
アスコルビン酸オキシダーゼ、コレステロールエステラ
ーゼ、コレステロールオキシダーゼ又はパーオキシダー
ゼ等、また、これら酵素と組み合わせる発色色素として
キノン系発色色素を例示することができ、それらの反応
物を吸光度計等で検出することにより、分離されたリポ
タンパク質を分析・定量することができる。The lipoproteins are separated in order of particle size by HPLC as described above, and a lipoprotein profile is obtained. By subjecting the eluate from the HPLC column to an enzyme reagent treatment (post-column reaction), cholesterol and triacylglycerol are detected, and a quantitative chromatogram (lipoprotein profile) of each is obtained. As the enzyme reagent referred to herein, in the reaction with cholesterol, ascorbate oxidase, cholesterol esterase, cholesterol oxidase or peroxidase, and the like, and a quinone-based coloring dye can be exemplified as a coloring dye combined with these enzymes. By detecting the substance with an absorptiometer or the like, the separated lipoprotein can be analyzed and quantified.

【００１８】以上、分析装置、ゲル濾過剤、HPLC用カラ
ム、溶離液、及びポストカラム反応等の設定は、例示の
ものに限定されることはなく、本発明の方法を実施する
目的や生体試料の種類、分析装置の種類などに応じて適
宜選択することが可能である。また、カラムの容量に応
じて、流速は広い範囲で選択することが可能である。The settings of the analyzer, gel filtration agent, HPLC column, eluent, post-column reaction, etc. are not limited to those described above. Can be appropriately selected according to the type of the analyzer, the type of the analyzer, and the like. Further, the flow rate can be selected in a wide range according to the capacity of the column.

【００１９】リポ蛋白分野の研究には未解明の領域が多
く、そのサブクラス分析においても統一された明確な基
準はこれまで確立されていない。本発明におけるリポ蛋
白サブクラスの定義を以下に述べる。Havelらの段階的
超遠心浮上法では、そのカットオフ比重を1.006、1.063
に設定する事により、リポ蛋白はCM、VLDL、LDL、HDLの
4つの主要クラスに分離されている。しかし、その主要
クラス間に濃度がゼロのゾーンが存在することはなく、
また各クラス内のリポ蛋白の分布は不均一であり、連続
的なサブクラスの存在が予測されている。例えば比重に
よるLDLサブクラスとして、LDL比重内をさらに細かくカ
ットオフ比重を設定して４個以上の不特定の数のサブク
ラスが定義されており、リポ蛋白のサブクラスの定義は
不定である。リポ蛋白サブクラスの基準物質が無いた
め、分離方法に依存した、また各分析者に依存した固有
のサブクラスが定義されているのが現状である。ポリア
クリルアミド電気泳動によるLDLサブクラスの分析法
は、脂質成分を非特異的に染色する方法であり、泳動パ
ターンを大サイズ型（Aパターン）、小サイズ型（Bパタ
ーン）、その中間型（ABパターン）に型判定するカテゴ
リー解析である。Bパターンを small dense LDL 優性型
と判定するのみで定量法ではなく、治療経過などの観察
に用いることができない。Many studies in the field of lipoproteins have not been elucidated, and no unified standard has been established in subclass analysis. The definition of the lipoprotein subclass in the present invention is described below. In the stepwise ultracentrifugation flotation method of Havel et al., The cutoff specific gravity was 1.006, 1.063
By setting to, lipoprotein is CM, VLDL, LDL, HDL
It is separated into four main classes. However, there is no zone with zero concentration between its major classes,
The distribution of lipoproteins in each class is not uniform, and the existence of continuous subclasses is predicted. For example, as an LDL subclass based on specific gravity, an unspecified number of four or more subclasses is defined by setting a more specific cutoff specific gravity within the LDL specific gravity, and the definition of the lipoprotein subclass is undefined. Since there is no reference substance for the lipoprotein subclass, a unique subclass depending on the separation method or depending on each analyst is currently defined. The analysis method of LDL subclass by polyacrylamide electrophoresis is a method to stain the lipid component non-specifically, and the electrophoresis pattern is large size type (A pattern), small size type (B pattern), intermediate type (AB pattern) The category analysis is performed in ()). The B pattern is determined to be the dominant type of small dense LDL only, and cannot be used for monitoring the progress of treatment, etc., rather than a quantitative method.

【００２０】多様性を持った生体内物質であるリポ蛋白
粒子は連続的なサイズ分布を示すため、測定対象物質の
粒子サイズの違いを反映するクロマトグラム波形も、実
は多数のリポ蛋白粒子の分布により構成された無数に近
いサブクラスの、いわば論理的な合成波形と想定するこ
とが可能である。また、一検体からのクロマトグラム波
形は、これを一本の観測波形とみなすかわりに、臨床的
あるいは代謝的に固有の性質（表現型）を持つリポ蛋白
粒子のグループが様々なサブクラスを形成しており、こ
うしたサブクラスの波形が重複して、最終的に一本の観
測波形が合成されたと考えることもできる。一本の合成
波形を個々のサブクラス単位に波形分解するに際して、
分解されうる成分波形の数は数学的には多数ありうる
が、臨床応用を念頭に置いた場合、分離すべき重複波形
の数は、幅広い代謝疾患例を含めて全ての症例でその合
成波形として近似できる最小の数で、しかも臨床症例間
の診断等に有効なサブクラス分布の違いが反映できる数
と決めることも可能である。Since lipoprotein particles, which are various biological substances, have a continuous size distribution, the chromatogram waveform reflecting the difference in the particle size of the substance to be measured is actually a distribution of a large number of lipoprotein particles. Can be assumed to be a so-called logical composite waveform of an infinite number of subclasses constituted by In addition, the chromatogram waveform from one sample is not regarded as a single observation waveform, but instead a group of lipoprotein particles having unique characteristics (phenotype) clinically or metabolically forms various subclasses. Therefore, it can be considered that the waveforms of these subclasses overlap and one observation waveform is finally synthesized. When decomposing a single composite waveform into individual subclass units,
The number of component waveforms that can be decomposed can be mathematically large, but with clinical applications in mind, the number of overlapping waveforms to be separated is the combined waveform in all cases, including a wide range of metabolic disease cases. It is also possible to determine the minimum number that can be approximated and that can reflect the difference in subclass distribution that is effective for diagnosis among clinical cases.

【００２１】この原則に基づき、１０００例以上の多数
の臨床例のクロマトグラム波形の解析と基本波形の近似
検討を重ねた結果、リポ蛋白の粒子サイズ全領域を最少
で２０個のサブクラス（表現型）に分類できることが解
明された。本発明におけるリポ蛋白サブクラスの定義の
詳細を図８に示す。本発明の内容はこの表に示す２０個
のサブクラスに限定されるものではなく、臨床的あるい
は代謝的な観点からサブクラスの利用意義が改善される
形の、より優れた異なる定義も可能である。その場合、
いくつかのサブクラスの再グループ化や、ピーク値の直
径の変更が発生する。本発明に例示されたサブクラス分
離のための波形処理法は、ガウス関数による近似を基本
としたが、波形分離に用いるサブクラスの基本波形とし
て用いる分布関数は、ガウス型かローレンツ型のような
既知関数、または全く不定の任意の成分波形を用いるこ
とができる。また、装置によるクロマトグラム波形の歪
は、デコンボリュウションにより基本波形に種々の歪を
もたせて近似することが可能であり、機械的ノイズはス
ムージングにより補正できる。Based on this principle, the analysis of the chromatogram waveforms of a large number of clinical cases of more than 1000 cases and the approximation of the basic waveforms were repeated, and as a result, the entire lipoprotein particle size region was reduced to at least 20 subclasses (phenotypes). ). FIG. 8 shows the details of the definition of the lipoprotein subclass in the present invention. The content of the present invention is not limited to the 20 subclasses shown in this table, but better different definitions are possible in which the subclass is significantly more useful from a clinical or metabolic point of view. In that case,
Regrouping of some subclasses and changes in the diameter of the peak values occur. Although the waveform processing method for subclass separation exemplified in the present invention is based on approximation by a Gaussian function, a distribution function used as a basic waveform of a subclass used for waveform separation is a known function such as a Gaussian type or a Lorentz type. , Or any arbitrary component waveform can be used. Further, the distortion of the chromatogram waveform by the apparatus can be approximated by giving various distortions to the basic waveform by deconvolution, and mechanical noise can be corrected by smoothing.

【００２２】波形処理で得られた各サブクラスの定量の
精度管理には標準血清（ヒトプール）で得られ波形を基
準として用いることができる。さらにコレステロール量
のCDC基準法とのtraceability を保証する為には、CDC
基準法であるアベルケンダール法によりそのコレステロ
ール濃度を値付けされた標準血清が最適である。またそ
の各サブクラスのコレステロール量を予めサイズ既知の
試料でキャリブレートしてあるカラムを装着したHPLC基
準法で確定しておき、実際の分析試料の波形処理におけ
る基本波形のパラメーター (各サブクラスのピーク時間
と幅) はその標準血清のサブクラス濃度が確定値に近づ
くように調整することができる。こうした手順をとるこ
とにより、異なる測定系下で得られた分析結果にもデー
タの再現性を持たせることが可能である。For controlling the quantification of each subclass obtained by the waveform processing, the waveform obtained from the standard serum (human pool) can be used as a reference. To ensure traceability of the cholesterol level with the CDC standard, CDC
A standard serum whose cholesterol concentration has been valued by the Averkendar method, which is a reference method, is optimal. In addition, the cholesterol amount of each subclass is determined in advance by the HPLC standard method equipped with a column calibrated with a sample of known size, and the parameters of the basic waveform in the actual analysis sample waveform processing (the peak time of each subclass and The width can be adjusted so that the subclass concentration of the standard serum approaches the determined value. By taking such a procedure, it is possible to give data reproducibility to analysis results obtained under different measurement systems.

【００２３】本発明は、リポ蛋白のサイズ分布を示すク
ロマトグラム等の分布波形をその臨床的、代謝的に意義
のある個々のサブクラスに波形分離し、さらにキャリブ
レーターを用いた個々のサブクラスの定量に関する方法
を提供するものである。本発明に好ましい利用形態がHP
LC法である理由は、現時点において、これがリポ蛋白の
分布パターン（プロファイル）およびサブクラスの定量
を同時に行える唯一の、しかも簡便でな方法であるため
である。The present invention relates to the separation of a distribution waveform such as a chromatogram showing the size distribution of lipoprotein into individual clinically and metabolically significant subclasses, and further to the quantification of individual subclasses using a calibrator. It provides a method. The preferred mode of use for the present invention is HP
The reason for the LC method is that it is currently the only and simple method that can simultaneously quantify the distribution pattern (profile) of lipoproteins and subclasses.

【００２４】しかし、本発明の利用はHPLC法に限られた
ものではなく、核磁気共鳴法、超遠心法、各種電気泳動
法などの他の分離手段に適用することが可能である。リ
ポ蛋白のサブクラス情報は、核磁気共鳴法で得られる粒
子の大きさを反映したリポ蛋白粒子中の脂質成分の末端
メチル基のシグナルパターン、比重の違いによる超遠心
法や電荷の違いを利用した各種担体を用いた電気泳動、
またはキャピラリー電気泳動等による他の分離手段によ
って得られるリポ蛋白サブクラスの合成波形から得るこ
とができる。本発明法はこれらのHPLC法以外のリポ蛋白
サブクラス情報を提供する他の分離手段による合成波形
からも臨床的、代謝的に意義のあるサブクラスの抽出お
よびその定量法を提供するものである。However, the use of the present invention is not limited to the HPLC method, but can be applied to other separation means such as a nuclear magnetic resonance method, an ultracentrifugation method and various electrophoresis methods. The lipoprotein subclass information is based on the signal pattern of the terminal methyl group of the lipid component in the lipoprotein particles, which reflects the particle size obtained by nuclear magnetic resonance, ultracentrifugation due to differences in specific gravity, and differences in charge. Electrophoresis using various carriers,
Alternatively, it can be obtained from a synthesized waveform of a lipoprotein subclass obtained by other separation means such as capillary electrophoresis. The method of the present invention provides a method of extracting a clinically and metabolically significant subclass from a synthesized waveform by other separation means that provides lipoprotein subclass information other than these HPLC methods, and a method of quantifying the same.

【００２５】[0025]

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定され
ることはない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples.

【００２６】例１：リポ蛋白プロファイルの作成とサブ
クラス分離 図９に示す装置により、未処理血清 (5μl)の分離を行
った。分析カラムとして市販の TSKgel LipopropakXL２
本（東ソー株式会社：内径7.8 mm、長さ30 mm ）、試料
注入として AS-8020（東ソー株式会社）、検出器として
UV-8010（東ソー株式会社）を用いた。検出波長は 550
nm とした。リアクターとして反応オーブン CO-8020
（東ソー株式会社）内に反応コイルＫ（東ソー株式会
社、内径 0.4 mm 、全長 7.5 m）を設置して45℃で反応
を行った。Example 1 Preparation of Lipoprotein Profile and Subclass Separation Untreated serum (5 μl) was separated using the apparatus shown in FIG. Commercially available TSKgel LipopropakXL2 as an analytical column
Book (Tosoh Corporation: Inner diameter 7.8 mm, length 30 mm), AS-8020 (Tosoh Corporation) for sample injection, and detector
UV-8010 (Tosoh Corporation) was used. Detection wavelength is 550
nm. Reaction oven CO-8020 as reactor
A reaction coil K (Tosoh Corporation, inner diameter 0.4 mm, total length 7.5 m) was installed in (Tosoh Corporation) and reacted at 45 ° C.

【００２７】ポンプ１（送液用）としてCCPＳ（東ソー
株式会社）を用い、溶離液としてTSKeluent LP-1又はLP
2 を用い流速を 0.７ ml/min とした。ポンプ２として
CCPM （東ソー株式会社）を用い、検出用試薬としてコ
レステロールについてはデタミナーL TC R-1 (協和メデ
ックス株式会社、0.263 ml/min) とデタミナーL TC R-2
(協和メデックス株式会社、0.087 ml/min)を用いた。コ
レステロールとトリグリセリドの同時測定には試料注入
量を２倍の10μLとし、カラムからの溶出液を２分した
後、片方の反応経路にポンプ２からコレステロール検出
試薬を0.35ml/minで、もう片方の反応経路にやはりポン
プ２に相当する位置からトリグリセリド検出試薬を0.35
ml/minで送りこみ、３７℃で反応コイル（テフロン（登
録商標）チュウブ、内径0.4 mm 、全長 15 m）を用い
た。As a pump 1 (for liquid sending), CCPS (Tosoh Corporation) was used, and as an eluent, TSKeluent LP-1 or LP was used.
2 and the flow rate was 0.7 ml / min. As pump 2
Using CCPM (Tosoh Corporation), Detector L TC R-1 (Kyowa Medex, 0.263 ml / min) and Determinator L TC R-2 for cholesterol as detection reagents
(Kyowa Medex Co., Ltd., 0.087 ml / min) was used. For simultaneous measurement of cholesterol and triglyceride, the sample injection volume was doubled to 10 μL, the eluate from the column was divided into 2 minutes, and the cholesterol detection reagent was pumped from the pump 2 to one reaction path at 0.35 ml / min. 0.35 of the triglyceride detection reagent was also added to the reaction path from the position corresponding to Pump 2.
The mixture was fed at a rate of ml / min, and a reaction coil (Teflon (registered trademark) tube, inner diameter 0.4 mm, total length 15 m) was used at 37 ° C.

【００２８】上記のような装置と条件を用いて、コレス
テロール検出により得られたクロマトグラフィ波形（コ
レステロールプロファイル ）を図１に示す。症例aは中
性脂肪高値、症例bは LCAT 欠損症、症例cは CETP欠損
症、症例dは溶血性貧血の例である。リポ蛋白の主要分
画であるCM、VLDL、LDL、HDLのピークが様々な形で現れ
ているが、生体内の脂質が、これらの主要分画の大小の
みでは表現できない複雑な構成要素の集合により形成さ
れていることを明確に表現する事例である。FIG. 1 shows a chromatographic waveform (cholesterol profile) obtained by cholesterol detection using the apparatus and conditions as described above. Case a is a case of high triglyceride, case b is a case of LCAT deficiency, case c is a case of CETP deficiency, and case d is a case of hemolytic anemia. Although the peaks of CM, VLDL, LDL, and HDL, which are the major fractions of lipoproteins, appear in various forms, lipids in the body are complex sets of complex components that cannot be expressed only by the size of these major fractions. This is an example that clearly expresses the fact that it is formed by

【００２９】例２：健常者におけるリポ蛋白サブクラス
の特徴（性別差の存在）健康な青年男女の血清コレステ
ロールプロファイルを図２に示す。図中、実線は男性、
破線は女性例を表わす。LDLコレステロール分画およびH
DLコレステロール分画の波形にわずかなズレが認められ
る。 本発明を用いて健康な青年男女４５人の血清コレ
ステロールのリポ蛋白サブクラス分析を行なうと、表１
に示すとおり、女性ではLarge HDL (HDL p3) が、また
男性では Small HDL (HDL p5) やLDL p2,p3 がそれぞれ
有意に増加していることがわかる。従来の手法によるLD
L およびHDL コレステロールの定量測定からは、リポ蛋
白のこうした生理的差異は認識しえない。Example 2 Characteristics of Lipoprotein Subclass in Healthy Subjects (Existence of Sex) Serum cholesterol profiles of healthy young men and women are shown in FIG. In the figure, the solid line is male,
The broken line represents a female example. LDL cholesterol fraction and H
A slight shift is observed in the waveform of the DL cholesterol fraction. A lipoprotein subclass analysis of serum cholesterol of 45 healthy young men and women using the present invention shows that
As shown in Fig. 6, women have significantly increased Large HDL (HDL p3), and men have significantly increased Small HDL (HDL p5) and LDL p2, p3. LD by conventional method
Quantitative measurements of L and HDL cholesterol do not recognize these physiological differences in lipoproteins.

【００３０】[0030]

【表１】 [Table 1]

【００３１】例３：脂質代謝異常におけるリポ蛋白サブ
クラスの特徴（III 型 高脂血症） III 型高脂血症（アポE2/2）で治療中の一症例(3b)を呈
示する。本例の血清総コレステロール値 (TC) は 163 m
g/dl、HDLコレステロール値 (HDL-C) は 67 mg/dl と正
常値であり、従来の手法による脂質分画の定量分析では
健常者（3a; TC 164 mg/dl、HDL-C 67 mg/dl ）と区別
ができない。本例の血清コレステロールのリポ蛋白プロ
ファイルを図３に示す。図中、実線は本症例、破線は健
常者例を表わす。本発明によるサブクラス分析を行なう
と、表２に示すとおり、Medium andsmall VLDL (VLDL p
4, p5）の増加と通常の LDL（LDLp2）の減少が明らかに
なる。本症ではアポEタイプが違うため VLDL remnant
の肝への取り込みが障害され、コレステロール含有量の
高い VLDL （VLDL p4, p5）が血中に増加していまう
が、こうした病態生理が本法で簡便に解明された一例で
ある。Example 3: Characteristics of lipoprotein subclass in abnormal lipid metabolism (type III hyperlipidemia) One case (3b) during treatment for type III hyperlipidemia (apoE2 / 2) is presented. The serum total cholesterol (TC) in this example was 163 m
g / dl and HDL cholesterol level (HDL-C) are normal at 67 mg / dl, and quantitative analysis of lipid fraction by the conventional method showed that healthy subjects (3a; TC 164 mg / dl, HDL-C 67 mg / dl) / dl). FIG. 3 shows the lipoprotein profile of serum cholesterol of this example. In the figure, the solid line represents the present case, and the broken line represents the case of a healthy subject. According to the subclass analysis according to the present invention, as shown in Table 2, Medium and small VLDL (VLDL p
4, p5) and normal LDL (LDLp2) decrease. VLDL remnant due to different apoE type in this disease
The hepatic uptake is impaired, and cholesterol-rich VLDL (VLDL p4, p5) is increased in the blood. This is an example of how this pathophysiology was easily elucidated by this method.

【００３２】[0032]

【表２】 [Table 2]

【００３３】例４：臓器障害におけるリポ蛋白サブクラ
スの特徴（肝硬変） 肝硬変の症例（4b）における血清コレステロールのリポ
蛋白プロファイルを図４に示す。本発明によるサブクラ
ス分析を行なうと、表３にみられるように、健常者（4
a）に比べHDL p4, p5 の領域で著明な減少が見られる。
このように、本来の脂質代謝疾患以外の臓器疾患がリ
ポ蛋白の特定のサブクラスに変化をきたすことも容易に
わかる。Example 4 Characteristics of Lipoprotein Subclass in Organ Damage (Cirrhosis) FIG. 4 shows the lipoprotein profile of serum cholesterol in cirrhosis case (4b). When the subclass analysis according to the present invention was performed, as shown in Table 3, healthy subjects (4
A marked decrease is seen in the HDL p4 and p5 regions compared to a).
Thus, it is easily understood that organ diseases other than the original lipid metabolism disease cause a change to a specific subclass of lipoprotein.

【００３４】[0034]

【表３】 [Table 3]

【００３５】例５：リポ蛋白サブクラスの独立性を示す
疾患例（CETP欠損症） 脂質代謝異常疾患の一種、CETP欠損症の一症例（5b）の
血清コレステロールのリポ蛋白プロファイルを図５に示
す。サブクラス分析（表４）からは、健常者（5a）にみ
られない HDL p1, p2 が出現していることがわかる。
CETP（コレステロールエステル輸送タンパク）の欠損に
よって、CETP が本来つかさどる生体内での特定の脂質
成分の代謝障害がサブクラス分析で明確に評価できる。
これは、本発明によるサブクラス分析が単にリポ蛋白分
画を便宜的に細分化したものではなく、生体内の多種多
様なリポ蛋白粒子の集合体の中から生理学的、病態生理
学的に固有の性質を持つ特定の集団をより選択的に分離
する手法であることを裏付ける一例である。Example 5: Disease example showing lipoprotein subclass independence (CETP deficiency) FIG. 5 shows the lipoprotein profile of serum cholesterol of one case (5b) of a type of disorder of lipid metabolism, CETP deficiency. From the subclass analysis (Table 4), it can be seen that HDL p1 and p2, which are not observed in healthy subjects (5a), appear.
Due to the lack of CETP (cholesterol ester transfer protein), the metabolic disorders of specific lipid components in vivo, which CETP is primarily responsible for, can be clearly evaluated by subclass analysis.
This is because the subclass analysis according to the present invention is not merely a subdivision of the lipoprotein fraction for the sake of convenience, but rather a physiologically and pathophysiologically unique property among an aggregate of various lipoprotein particles in a living body. This is an example that confirms that this is a technique for more selectively separating a particular group having.

【００３６】[0036]

【表４】 [Table 4]

【００３７】例６：リポ蛋白サブクラスの独立性を薬理
効果から示す例（高脂血症治療薬の効果） 糖尿病症例２７名に２種類の高脂血症改善薬を投与した
際の、治療前後の血清コレステロールのサブクラスの変
化を図６に示す。通常の検査法でLDLおよびHDLコレステ
ロールの定量測定を行なうのみでは、２つの治療薬の間
に明らかな効果の違いは認めにくいが、サブクラス分析
を行なうことにより、その差異が明白となる。 LDL お
よびHDL コレステロール分画に含まれる広範囲なリポ蛋
白粒子の中で、様々な薬剤が特定のリポ蛋白の代謝に選
択的に作用していることがわかる。すなわち本発明は、
リポ蛋白を便宜的に細分化したものではなく、リポ蛋白
の生理的代謝動態や薬理効果を鋭敏に反映しうる手法で
あることを裏付ける一例である。Example 6: Example showing pharmacological effect of independence of lipoprotein subclass (effect of therapeutic agent for hyperlipidemia) Before and after treatment when two types of hyperlipidemia improving agent were administered to 27 diabetic patients FIG. 6 shows the changes in the serum cholesterol subclass. Only by quantitative measurement of LDL and HDL cholesterol by a conventional test method, it is difficult to recognize a clear difference in effect between the two therapeutic agents, but the difference is evident by performing subclass analysis. Among the wide range of lipoprotein particles contained in the LDL and HDL cholesterol fractions, it can be seen that various drugs selectively act on specific lipoprotein metabolism. That is, the present invention
This is an example that proves that this method is not a method of subdividing lipoproteins for convenience, but is a method that can sharply reflect the physiological metabolic dynamics and pharmacological effects of lipoproteins.

【００３８】例７：リポ蛋白サブクラス分析の臨床応用
例（small dense LDL） 症例 7a と 7b は、それぞれ糖尿病（7a）と肥満（7b）
の症例である。症例の血清コレステロールのリポ蛋白プ
ロファイルを図７に示す。図中、実線は症例 7a、破線
は症例 7bを表わす。両者とも LDLコレステロール値 (L
DL-C) が 190 mg/dl 台、HDLコレステロール値 (HDL-C)
が 30 mg/dl 台と、同様の数値を示すが、サブクラス
分析（表５）からは症例 7a の LDL p4 前後が著明に上
昇していることがわかる。この LDL p4 領域は、動脈硬
化、虚血性心疾患の危険因子の一つと考えられている s
mall dense LDL に相当する。現在、この small dense
LDLを定量的に分析する手法は存在しない。 本例は、
血清コレステロール値やHDL分画などの通常の臨床検査
からは察知しえない危険因子が、リポ蛋白サブクラス分
析により容易に評価できるようになった臨床応用の例で
ある。Example 7: Clinical application of lipoprotein subclass analysis (small dense LDL) Cases 7a and 7b are diabetic (7a) and obese (7b), respectively.
It is a case of. The lipoprotein profile of serum cholesterol in the case is shown in FIG. In the figure, the solid line represents case 7a and the dashed line represents case 7b. Both LDL cholesterol levels (L
DL-C) in the 190 mg / dl range, HDL cholesterol level (HDL-C)
Is similar to the 30 mg / dl level, but the subclass analysis (Table 5) shows that the LDL p4 around Case 7a is significantly increased. This LDL p4 region is thought to be one of the risk factors for atherosclerosis and ischemic heart disease.
Equivalent to mall dense LDL. Currently this small dense
There is no method to analyze LDL quantitatively. In this example,
Risk factors, such as serum cholesterol levels and HDL fractions, that are not detectable from normal laboratory tests are examples of clinical applications that can be easily evaluated by lipoprotein subclass analysis.

【００３９】[0039]

【表５】 [Table 5]

【００４０】[0040]

【発明の効果】以上説明したように、この発明は簡便に
精度の高いリポ蛋白サブクラスの分離、測定を可能と
し、リポ蛋白の代謝動態やその異常を評価、診断する方
法を提供することができるので有用である。As described above, the present invention makes it possible to easily and accurately separate and measure lipoprotein subclasses, and to provide a method for evaluating and diagnosing lipoprotein metabolism and abnormalities thereof. So useful.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】実施例１におけるリポ蛋白プロファイルを示す
図である。HPLCにより分離されたリポ蛋白中のコレステ
ロールの分布（横軸：溶出時間；縦軸：コレステロール
量）を示すクロマトグラムを示す図である。 FIG. 1 is a view showing a lipoprotein profile in Example 1. It is a figure which shows the chromatogram which shows the distribution (horizontal axis: elution time; vertical axis: cholesterol amount) of cholesterol in the lipoprotein isolate | separated by HPLC.

【図２】実施例２における健常者のリポ蛋白プロファイ
ルを示す図である。図中、実線は男性、破線は女性例を
表わす。 FIG. 2 is a view showing a lipoprotein profile of a healthy subject in Example 2. In the figure, the solid line represents a male and the broken line represents a female.

【図３】実施例３における脂質代謝異常者のリポ蛋白プ
ロファイルを示す図である。図中、実線は本症例、破線
は健常者例を表わす。 FIG. 3 is a view showing a lipoprotein profile of a person with abnormal lipid metabolism in Example 3. In the figure, the solid line represents the present case, and the broken line represents the case of a healthy subject.

【図４】 実施例４における肝硬変の症例のリポ蛋白プ
ロファイルを示す図である。図中、実線は本症例、破線
は健常者例を表わす。 FIG. 4 is a view showing a lipoprotein profile of a case of cirrhosis in Example 4. In the figure, the solid line represents the present case, and the broken line represents the case of a healthy subject.

【図５】実施例５におけるCETP欠損症の症例のリポ蛋白
プロファイルを示す図である。図中、実線は本症例、破
線は健常者例を表わす。 FIG. 5 is a view showing a lipoprotein profile of a case of CETP deficiency in Example 5. In the figure, the solid line represents the present case, and the broken line represents the case of a healthy subject.

【図６】 糖尿病症例に２種類の高脂血症改善薬を投与
した際の、治療前後の血清コレステロールのLDL（左パ
ネル）およびHDLサブクラス濃度（右パネル）の変化率
（％）を示す。 図中、実線は Pravastatin、破線は Be
zafibrate 投与例を表わす。 FIG. 6 shows the rate of change (%) in serum LDL (left panel) and HDL subclass concentration (right panel) of serum cholesterol before and after treatment when two types of hyperlipidemia improving drugs were administered to diabetic patients. In the figure, the solid line is Pravastatin, and the broken line is Be
Shows an example of zafibrate administration.

【図７】 実施例７における脂質代謝異常者のリポ蛋白
プロファイルを示す図である。図中、実線は 症例 7a
、破線は症例 7bを表わす。 FIG. 7 is a view showing a lipoprotein profile of a person with abnormal lipid metabolism in Example 7. In the figure, the solid line is Case 7a.
, The dashed line represents case 7b.

【図８】 HPLC法による本発明のリポ蛋白サブクラスの
定義を示す図である。右半分に、各サブクラスと超遠心
分離法による比重分画との関連を示す。 FIG. 8 is a diagram showing a definition of a lipoprotein subclass of the present invention by an HPLC method. The right half shows the relationship between each subclass and specific gravity fractionation by ultracentrifugation.

【図９】 本発明の方法を実施するために利用できるHP
LC法による測定装置の一例の概略を示した図である。 FIG. 9 : HP available for carrying out the method of the present invention .
FIG. 2 is a diagram schematically illustrating an example of a measurement device using an LC method.

Claims (4)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】リポ蛋白プロファイルの波形解析によりリ
ポ蛋白の代謝動態の個々の表現型をサブクラスとして被
検試料から分離抽出する工程と、分離されたリポ蛋白サ
ブクラスの定量を行う工程とを含む、リポ蛋白サブクラ
スの分析方法。1. A method comprising: separating and extracting a phenotype of each lipoprotein metabolism from a test sample as a subclass by analyzing a lipoprotein profile by a waveform analysis of a lipoprotein profile; and quantifying the separated lipoprotein subclass. Analysis method for lipoprotein subclass. 【請求項２】請求項１に記載の方法において、被検試料
のリポ蛋白の代謝動態あるいは病態を診断する方法。2. The method according to claim 1, wherein the metabolic kinetics or pathological state of lipoprotein in the test sample is diagnosed. 【請求項３】請求項１ないし２に記載の方法において、
HPLC ゲル濾過クロマトグラフィー法の結果をリポ蛋白
サブクラスの分析に利用する方法。3. The method according to claim 1, wherein
HPLC A method that utilizes the results of gel filtration chromatography for the analysis of lipoprotein subclasses. 【請求項４】請求項１ないし２に記載の方法において、
核磁気共鳴法、超遠心法、各種電気泳動法のいずれかの
リポ蛋白分離法の結果をリポ蛋白サブクラスの分析に利
用する方法。4. The method according to claim 1, wherein
A method in which the results of any of lipoprotein separation methods, such as nuclear magnetic resonance, ultracentrifugation, and various electrophoresis methods, are used for lipoprotein subclass analysis.