JP2002101892A - Promoter, biological switching element and method for assaying homogeneous system utilizing the same - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an easy biological switching element and a method for a homogeneous assay system utilizing the element. SOLUTION: The objective promoter is a promoter site that is prepared by introducing a binding site for substance A into a nucleic acid promoter sequence or into 50mer on the upstream or downstream side of the sequence, wherein the binding site is designed so as to affect the reactivity to a nucleic acid polymerase by making substance A bind to the binding site or as to affect the reactivity to a nucleic acid polymerase by making substance A bind to the binding site and by making substance B having an ability of binding substance A bind to it.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本願発明は、核酸ポリメラー
ゼとの反応性を制御し得るプロモーター部位、該部位を
具備する生物学的スイッチング素子、そして該スイッチ
ング素子を利用した均一系測定方法に関するものであ
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a promoter site capable of controlling the reactivity with a nucleic acid polymerase, a biological switching device having the site, and a method for measuring a homogeneous system using the switching device. .

【０００２】[0002]

【従来の技術】生体成分の機能を利用したスイッチング
素子には、抗体、レセプター、リプレッサー等の、対象
物に対する親和性（アフィニティー）を利用したものが
多い。2. Description of the Related Art Many switching elements utilizing the function of a biological component utilize an affinity for an object such as an antibody, a receptor or a repressor.

【０００３】例えば、酵素に抗原を結合しておき、抗体
を結合させて抗体抗原複合体を形成させ、立体障害によ
って酵素活性の変化をもたらすようにしたもの、リン酸
結合蛋白質やグルコース結合蛋白質の特定位置に蛍光物
質を導入しておき、これらがリン酸イオンや糖と結合す
ることによって蛍光特性が変化することを利用したもの
（Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ｃ．、Ｆｅｌｔｕｓ，Ａ．、Ｄａｕ
ｎｅｒｔ，Ｓ．，１９９８，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｎｅｗｓ ＆ Ｆｅａｔｕｒｅｓ，
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １，５７９−５８５）、砒素やア
ンチモン耐性に関与する遺伝子群の下流にレポーター遺
伝子（ルシフェラーゼ遺伝子等）を導入したプラスミド
で形質転換した大腸菌であって、砒素やアンチモンが存
在するとレポーター遺伝子を発現するもの（Ｒａｍａｎ
ａｔｈａｎ，Ｓ．，Ｓｈｉ，Ｗ．Ｄａｕｎｅｒｔ，
Ｓ．，１９９７，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ６９，３３８０−３３８４）、天然に見出される
ラックオペロン（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｒｅｎｚｎ
ｉｋｏｆｆ，Ｗ．Ｓ．，（ｅｄｓ），１９８０，Ｔｈｅ
Ｏｐｅｒｏｎ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を利用して、イン
デューサーである糖の添加により該オペロンの下流に接
続した目的遺伝子の発現を制御するもの、等がある。[0003] For example, those in which an antigen is bound to an enzyme, an antibody is bound to form an antibody-antigen complex, and the enzyme activity is changed by steric hindrance. A fluorescent substance is introduced at a specific position, and the fluorescent property is changed by binding to a phosphate ion or a sugar (Lewis, JC, Feltus, A., Dau).
nert, S.M. , 1998, Analytical C
hemistry News & Features,
Septmber 1,579-585), Escherichia coli transformed with a plasmid into which a reporter gene (such as a luciferase gene) is introduced downstream of a group of genes involved in arsenic and antimony resistance. What to do (Raman
athan, S .; Shi, W .; Daunert,
S. , 1997, Analytical Chemis.
try69, 3380-3384), a rack operon found in nature (Miller, JH, Rennzn).
ikoff, W.C. S. , (Eds), 1980, The
Operon, 2nd Ed. , Cold Spri
ng HarborLaboratory, Cold
(Spring Harbor, NY) to control the expression of a gene of interest connected downstream of the operon by adding a sugar as an inducer.

【０００４】前記したものの中でも、酵素をさまざまな
物質で修飾しておき、抗原抗体複合体を形成させて酵素
活性を変化させるものは、臨床分析や環境分析の分野で
広く利用されている。具体的には、遊離の抗原量を測定
するための方法（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｅ．，Ｕ
ｌｌｍａｎ，Ｅ．Ｆ．，１９７２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃ
ｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，４７，８４６−８５１）
がある。この方法では、酵素に抗原を結合しておき、抗
体を結合させて抗体抗原複合体を形成させ、立体障害に
よって酵素活性が消失するようにしたスイッチング素子
を使用し、遊離の抗原量に依存して前記抗体の結合が妨
げられることを利用する。[0004] Among the above, those in which an enzyme is modified with various substances and an enzyme-antibody complex is formed to change the enzyme activity are widely used in the fields of clinical analysis and environmental analysis. Specifically, a method for measuring the amount of free antigen (Rubenstein, KE, U.S.A.)
llman, E .; F. , 1972, Biochemis
try Biophysics Research C
communications, 47, 846-851)
There is. In this method, an antigen is bound to an enzyme, an antibody is bound to form an antibody-antigen complex, and a switching element is used so that the enzyme activity is lost due to steric hindrance. And that the binding of the antibody is hindered.

【０００５】遊離の抗原量を測定するための他の方法
（エンザイムチャネリングイムノアッセイ、Ｌｉｔｍａ
ｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｕｌｌｍａｎ，Ｅ．Ｆ．，１９８０，Ａ
ｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０
６，２２３−２２９）では、アガロース粒子に目的抗原
とグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−ＰＤ
Ｈ）を接近させて結合させておく。そこにヘキソキナー
ゼ（ＨＫ）で標識した目的抗原に対する抗体を加える
と、抗体を介してＨＫが固定化されるが、ここにＡＴＰ
存在下でグルコースを加えると、ＨＫの働きでグルコー
ス−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）ができる。ＮＡＤ存在下
で、Ｇ−６−Ｐは、近傍にあるＧ−６−ＰＤＨの働きに
より６−リン酸グルコラクトン（６−ＰＧＬ）とＮＡＤ
Ｈが生成されることを利用する。遊離の抗原とＨＫ標識
抗体の複合体によりＧ−６−Ｐが生成しても、その近傍
にはＧ−６−ＰＤＨがないため、６−ＰＧＬ及びＮＡＤ
Ｈは生成されないため、ＮＡＤＨを定量することにより
遊離の抗原量を測定できるのである。Other methods for measuring the amount of free antigen (enzyme channeling immunoassay, Litma
n, D. J. Ullman, E .; F. , 1980, A
natural Biochemistry, 10
No. 6,223-229), an agarose particle contains a target antigen and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PD).
H) close together and allowed to bind. When an antibody against the target antigen labeled with hexokinase (HK) is added thereto, HK is immobilized via the antibody.
When glucose is added in the presence, glucose-6-phosphate (G-6-P) is formed by the action of HK. In the presence of NAD, G-6-P reacts with 6-phosphate glucolactone (6-PGL) and NAD by the action of nearby G-6-PDH.
Utilizing that H is generated. Even if G-6-P is generated by a complex of a free antigen and an HK-labeled antibody, 6-PGL and NAD
Since H is not produced, the amount of free antigen can be measured by quantifying NADH.

【０００６】遊離の抗原量を測定するための他の方法
（補酵素標識イムノアッセイ、Ｋｏｈｅｎ，Ｆ．，Ｂｏ
ｇｕｓｌａｓｋｉ，Ｒ．Ｃ．，１９７９，Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，１１，１６１−１６７）では、抗体と補酵素で標識
した抗原とを用い、補酵素により酵素活性が発揮される
ことを利用する。[0006] Other methods for measuring the amount of free antigen (coenzyme-labeled immunoassay, Kohen, F., Bo
guslaski, R .; C. , 1979, Journa
l of Steroid Biochemistr
y, 11, 161-167) utilizes the fact that an enzyme activity is exhibited by a coenzyme using an antibody and an antigen labeled with a coenzyme.

【０００７】また、遊離の抗原量を測定するための方法
として、既に市販されている試薬もある（酵素阻害物質
標識イムノアッセイ、Ａｂｂｏｔ社、商品名；ＴＥＴＲ
ＡＺＹＭＥ）。この方法は、抗体と、酵素阻害物質で標
識した抗原とを反応させるものである。抗原抗体反応で
両者が結合すると、立体障害のために酵素阻害作用は発
揮されないが、遊離の抗原に抗体が消費されると酵素阻
害作用が発生することを利用する。As a method for measuring the amount of free antigen, there is also a reagent which is already commercially available (enzyme inhibitor labeling immunoassay, Abbott, trade name; TETR)
AZYME). In this method, an antibody is reacted with an antigen labeled with an enzyme inhibitor. When both bind in an antigen-antibody reaction, the enzyme inhibitory action is not exhibited due to steric hindrance, but the enzyme inhibitory action occurs when the antibody is consumed by the free antigen.

【０００８】[0008]

【発明が解決しようとする課題】前記した測定方法等で
利用している、生体成分の機能を利用したスイッチング
素子には、それを利用するうえでさまざまな問題があ
る。例えば、酵素等の蛋白質に物質を導入する場合、導
入位置を特定することが非常に難しい。導入位置によっ
ては、スイッチング素子として働かない場合がある。ま
た、一般的に言って従来のスイッチング素子は感度が悪
いという課題がある。更に、リプレッサー等の天然物質
を使用するスイッチング素子では、微生物やウィルス等
から、微量のリプレッサー等を精製しなければならな
い。レポーター遺伝子の発現をシグナルに利用するスイ
ッチング素子では、該遺伝子を単離し、遺伝子組み換え
技術を用いてオペレーター等に繋がなければならないと
いう課題を有する。The switching element utilizing the function of a biological component used in the above-described measuring method and the like has various problems in using it. For example, when introducing a substance into a protein such as an enzyme, it is very difficult to identify the introduction position. Depending on the introduction position, it may not work as a switching element. Also, generally speaking, there is a problem that the conventional switching element has poor sensitivity. Further, in a switching element using a natural substance such as a repressor, a trace amount of the repressor or the like must be purified from microorganisms or viruses. A switching element utilizing the expression of a reporter gene as a signal has a problem that the gene must be isolated and connected to an operator or the like using a gene recombination technique.

【０００９】従って本願発明は、作製及び利用が容易
で、しかも高感度な生物学的スイッチング素子を提供す
るとともに、それを利用した均一系測定方法を提供する
ことを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to provide a biological switching element which is easy to manufacture and use and which is highly sensitive, and to provide a homogeneous measuring method using the same.

【００１０】[0010]

【解決を解決するための手段】前記目的を達成するため
になされた本願請求項１の発明は、核酸プロモーター配
列或いはその配列の上流又は下流５０ｍｅｒ内に物質Ａ
の結合部位が導入されており、該結合部位は、物質Ａが
該結合部位に結合することにより核酸ポリメラーゼとの
反応性に影響を与えるものであるか、又は、物質Ａが該
結合部位に結合し、更に物質Ａに対する結合能を有する
物質Ｂが結合することにより核酸ポリメラーゼとの反応
性に影響を与えるものである、プロモーター部位であ
る。これは、本願発明のスイッチング素子の重要な構成
要素となる。Means for Solving the Problems In order to achieve the above object, the invention of claim 1 of the present invention relates to a nucleic acid promoter sequence or a substance A in a 50mer upstream or downstream of the sequence.
Wherein the substance A has an effect on the reactivity with the nucleic acid polymerase by binding to the binding site, or the substance A binds to the binding site. Further, it is a promoter site that affects the reactivity with nucleic acid polymerase by binding of substance B having a binding ability to substance A. This is an important component of the switching element of the present invention.

【００１１】本願請求項２の発明は、前記請求項１にか
かり、前記物質Ａ又はＢ、或いはＡとＢとの結合物が、
ポリメラーゼとプロモーターとの反応性に影響を与える
大きさを有することを特徴とする。本願請求項３の発明
は、請求項１の発明にかかり、前記プロモーターが、Ｓ
Ｐ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターであることを特
徴とする。本願請求項４の発明は、請求項１の発明にか
かり、物質Ａがビオチンであることを特徴とする。本願
請求項５の発明は、請求項１の発明にかかり、物質Ａが
ビオチンであり、物質Ｂがストレプトアビジン又は抗ビ
オチンモノクローナル抗体であることを特徴とする。The invention according to claim 2 of the present application is directed to claim 1, wherein the substance A or B or the compound of A and B is:
It has a size that affects the reactivity between the polymerase and the promoter. The invention of claim 3 of the present application is directed to the invention of claim 1, wherein the promoter is S
It is a P6 RNA polymerase promoter. The invention of claim 4 of the present application is directed to the invention of claim 1, wherein the substance A is biotin. The invention of claim 5 of the present application relates to the invention of claim 1, wherein the substance A is biotin and the substance B is streptavidin or an anti-biotin monoclonal antibody.

【００１２】また本願請求項６の発明は、スイッチング
素子に関するものであり、前記請求項１のプロモーター
を具備することを特徴とする。According to a sixth aspect of the present invention, there is provided a switching element, comprising the promoter of the first aspect.

【００１３】そして本願請求項７の発明は、均一系測定
方法に関するものであり、前記請求項６のスイッチング
素子を利用することを特徴とする。更に本願請求項８の
発明は、請求項７にかかり、前記測定が、核酸ポリメラ
ーゼにより発生又は生成されるシグナルを検出するもの
であることを特徴とする。以下、本願発明を詳細に説明
する。[0013] The invention of claim 7 of the present application relates to a method for measuring a uniform system, wherein the switching element of claim 6 is used. Furthermore, the invention of claim 8 of the present application is directed to claim 7, wherein the measurement is to detect a signal generated or generated by a nucleic acid polymerase. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

【００１４】本願発明は、物質Ａの結合部位が導入され
たプロモーター配列等である。かかる結合部位は、例え
ばアミノ基、ＳＨ基等の官能基やリンカー付きの官能基
や、物質Ａとの親和性を有する塩基配列である。ここ
で、前記官能基や塩基配列を導入するのは、任意の核酸
ポリメラーゼに対し、下流に接続された核酸配列を転写
し又は発現し得る任意の核酸プロモーターであれば良
く、特に制限はない。例えば、ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅのプロモーターである、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラ
ーゼプロモーターを例示できる。The present invention relates to a promoter sequence into which a binding site of substance A has been introduced. Such a binding site is, for example, a functional group such as an amino group or an SH group, a functional group with a linker, or a base sequence having an affinity for substance A. Here, the functional group or base sequence may be introduced by any nucleic acid promoter capable of transcribing or expressing a nucleic acid sequence connected downstream to any nucleic acid polymerase, and is not particularly limited. For example, RNA polymer
An example of the promoter is an SP6 RNA polymerase promoter.

【００１５】結合部位は、上記したプロモーター配列の
内部に導入しても良いし、プロモーター配列の上流又は
下流５０ｍｅｒ以内に導入しても良い。本願発明におい
て重要なのは、導入した結合部位に物質Ａが結合し、又
は、導入した結合部位に物質Ａが結合し、更に物質Ａに
対する結合能を有する物質Ｂが結合した場合、それによ
ってプロモーターと核酸ポリメラーゼとの反応性が影響
をうけ、前記転写や発現の量が変化する部位に、物質Ａ
の結合部位を導入することである。なお、蛋白質と比較
して核酸では、導入位置を自由に選択でき、しかも確実
に選択した位置に導入できるという利点がある。The binding site may be introduced into the above-mentioned promoter sequence, or may be introduced within 50 mer upstream or downstream of the promoter sequence. It is important in the present invention that the substance A binds to the introduced binding site, or the substance A binds to the introduced binding site, and further binds the substance B capable of binding to the substance A. The site where the amount of transcription or expression changes due to the influence of the reactivity with the polymerase,
Is to introduce a binding site. In addition, compared to proteins, nucleic acids have the advantage that the introduction position can be freely selected and that they can be reliably introduced into the selected position.

【００１６】物質Ａ又はＢ、或いは物質ＡとＢの結合物
は、前記のように導入された結合部位に結合した場合、
核酸ポリメラーゼとプロモーターとの反応性に影響を与
える大きさを有する物質である。物質Ａは、実際に核酸
プロモーター配列とそれに対応する核酸ポリメラーゼと
を用い、予備的実験を行って核酸ポリメラーゼとプロモ
ーターとの反応性に影響を与えるか否かを試験すること
で適宜選択できるが、具体的にはビオチンを例示するこ
とができる。物質Ａに加えて物質Ｂを使用する場合、物
質Ａは核酸ポリメラーゼとプロモーターとの反応性に影
響を与える大きさを有している必要はないが、物質Ｂが
単独又は物質Ａと結合して、核酸ポリメラーゼとプロモ
ーターとの反応性に影響を与える大きさとなるものであ
り、また物質Ｂは、物質Ａへの結合能を有していなけれ
ばならない。物質Ｂとしては、例えば、物質Ａに対する
レセプター又は抗体（インタクト型、Ｆ（ａｂ’）２
型、Ｆａｂ型、Ｆａｂ’型のいずれでも良い）、物質Ａ
との親和性を有する酵素、基質、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそ
の他のポリマー等を使用できるが、具体的にはストレプ
トアビジンや抗ビオチンモノクローナル抗体等を例示で
きる。The substance A or B, or the conjugate of the substances A and B, when bound to the binding site introduced as described above,
It is a substance having a size that affects the reactivity between a nucleic acid polymerase and a promoter. Substance A can be appropriately selected by actually using a nucleic acid promoter sequence and a corresponding nucleic acid polymerase and conducting a preliminary experiment to test whether or not the reactivity between the nucleic acid polymerase and the promoter is affected. Specifically, biotin can be exemplified. When the substance B is used in addition to the substance A, the substance A does not need to have a size that affects the reactivity between the nucleic acid polymerase and the promoter. The substance B must have a size that affects the reactivity between the nucleic acid polymerase and the promoter, and the substance B must have the ability to bind to the substance A. As the substance B, for example, a receptor or an antibody to the substance A (intact type, F (ab ') 2
Type, Fab type or Fab 'type), substance A
Enzymes, substrates, DNA, RNA, or other polymers having affinity for, can be used, and specific examples include streptavidin and anti-biotin monoclonal antibodies.

【００１７】上述した核酸プロモーター部位は、後述す
るように、例えば均一系測定のためのスイッチング素子
として利用できるが、これ以外にも、例えばその下流に
蛋白質を暗号化する遺伝子を接続し、通常の遺伝子組み
換えにおける蛋白質発現の制御を行う目的でも利用する
ことができる。The nucleic acid promoter site described above can be used, for example, as a switching element for measuring a homogeneous system, as will be described later. It can also be used for the purpose of controlling protein expression in gene recombination.

【００１８】上記したプロモーター部位を用いることに
より、均一系の測定方法を行うためのスイッチング素子
を提供することができる。例えば物試料中に存在する物
質Ａを測定する場合には、本願発明のプロモーター部位
を試料と接触させれば良い。これにより、物質Ａの量に
依存して、核酸ポリメラーゼによる転写又は発現物の量
が変化する。また物質Ａが、物質Ｂと結合して核酸ポリ
メラーゼとプロモーターとの反応性に影響を与える大き
さとなるものである場合には、物質Ａの量に従って遊離
の物質Ｂの量が変わり、更に、核酸ポリメラーゼによる
転写又は発現物の量も変化する。従って、例えば前記転
写又は発現産物の量を定量すれば、例えば従来の免疫測
定のように目的物質と結合していない標識物を測定系か
ら除去する必要なしに、物質Ａの量を定量することが可
能となる。なお後者の場合には、本願発明のプロモータ
ー部位とともに物質Ａを試料と接触させることにより、
物質Ｂを定量することもできる。By using the above promoter site, it is possible to provide a switching element for performing a homogeneous measuring method. For example, when measuring substance A present in a sample, the promoter site of the present invention may be brought into contact with the sample. Thereby, depending on the amount of substance A, the amount of transcription or expression by the nucleic acid polymerase changes. When the substance A has a size that binds to the substance B and affects the reactivity between the nucleic acid polymerase and the promoter, the amount of the free substance B changes according to the amount of the substance A, and The amount of transcription or expression by the polymerase will also vary. Therefore, for example, by quantifying the amount of the transcription or expression product, it is possible to quantify the amount of the substance A without removing a label that is not bound to the target substance from the measurement system as in a conventional immunoassay. Becomes possible. In the latter case, by bringing the substance A into contact with the sample together with the promoter site of the present invention,
Substance B can also be quantified.

【００１９】[0019]

【発明の実施の形態】以下、本願発明をさらに詳細に説
明するために実施例を示すが、本願発明はこれら実施例
に限定されるものではない。 実施例１ ビオチン修飾ＤＮＡの調製 ５'末端から８番目の塩基（Ｔ）と９番目の塩基（Ａ）
の間に、炭素数１５のリンカーを介してビオチンを結合
した１６ｂａｓｅのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーター領域（Ｔ９Ｂ、配列番号１、図１）を調製し、そ
の１００ｐｍｏｌを６５ｂａｓｅの鋳型ＤＮＡ（３０．
４、図２）と混ぜ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌと１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡの水溶液（ｐＨ８．０）（以下、ＴＥ）を
加えて１３μｌにした。これを９５℃、５分間加熱後室
温に戻すことにより、アニーリングを行った。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. Example 1 Preparation of biotin-modified DNA Eighth base (T) and ninth base (A) from 5 ′ end
In between, a 16-base SP6 RNA polymerase promoter region (T9B, SEQ ID NO: 1, FIG. 1) to which biotin was bound via a linker having 15 carbon atoms was prepared, and 100 pmol thereof was used as a 65-base template DNA (30.
4, mix with 10mM Tris-HCl and 1m
An aqueous solution of M EDTA (pH 8.0) (hereinafter referred to as TE) was added to 13 μl. This was heated at 95 ° C. for 5 minutes and then returned to room temperature to perform annealing.

【００２０】アニーリング後室温まで冷却し、Ｔ７ Ｓ
ｅｑｕｅｎａｓｅ ｖｅｒｓｉｏｎ２．０ ＤＮＡ ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、アマシャム・ライフサイ
エンス社製）２６Ｕを１８μｌ、５倍濃縮反応緩衝液
（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅに添付されたもの）を１０μｌ、
１００ｍＭ ＤＴＴを５μｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ混合物
を４μＬ加えて、３７℃で９０分インキュベーションし
た。サンプルをゲルろ過高速液体クロマトグラフィー
（商品名；Ｇ３０００ＳＷＸＬ、東ソー（株）製）に供
し、新たに現れた分子量が増大したピークを分取して、
ビオチンが結合した６５ｂａｓｅの二重鎖ＤＮＡ（以
下、Ｔ９Ｂｓｅｑ）を２２ｐｍｏｌ得た（図２、図
３）。なお、配列番号２に、Ｔ９Ｂｓｅｑのうち、ビオ
チンが結合した鎖の配列を示す。After annealing, it is cooled to room temperature, and T7 S
equinase version 2.0 DNA p
18 μl of 26 U of oligomerase (trade name, manufactured by Amersham Life Science), 10 μl of a 5 × concentrated reaction buffer (attached to Sequenase),
5 μl of 100 mM DTT and 4 μl of a 2 mM dNTP mixture were added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 90 minutes. The sample was subjected to gel filtration high performance liquid chromatography (trade name: G3000SWXL, manufactured by Tosoh Corporation), and a newly appearing peak having an increased molecular weight was collected.
22 pmol of 65 base double-stranded DNA (hereinafter, referred to as T9Bseq) to which biotin was bound was obtained (FIGS. 2 and 3). In addition, SEQ ID NO: 2 shows the sequence of the biotin-bound chain of T9Bseq.

【００２１】１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌと０．１ｍＭ
ＥＤＴＡの水溶液（ｐＨ８．０）に、それぞれ０．２ｐ
ｍｏｌ／２μｌ、０〜１．６ｐｍｏｌ／２μＬとなるよ
うにＴ９Ｂｓｅｑ及びストレプトアビジン（ベーリンガ
ーマンハイム社製、以下、ＳＡ）を加え、ＰＣＲチュー
ブ内で混和し、３７℃で５分間インキュベーションし
た。1 mM Tris-HCl and 0.1 mM
0.2 p each in an aqueous solution of EDTA (pH 8.0)
T9Bseq and streptavidin (manufactured by Boehringer Mannheim, hereinafter referred to as SA) were added at a concentration of 0 mol / μl to 2 μl and 0 to 1.6 pmol / 2 μl, mixed in a PCR tube, and incubated at 37 ° C. for 5 minutes.

【００２２】次に、１００ｍＭ ＤＴＴを１μｌ、１０
ＵのＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）
製）を０．８μｌ、２０ｍＭ ＮＴＰ混合物（ＡＴＰ、
ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰの混合物）を０．５μｌ、
０．１％のウシ血清アルブミンを１μｌ、１０倍濃度の
酵素添付緩衝液（宝酒造（株）製、６０ｍＭ ＭｇＣｌ
₂と２０ｍＭ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅを含む、４００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．５）を１μｌ、５
０ＵのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）製）
を１μｌ加え、３７℃で４５分間インキュベーションし
た。ＤＮａｓｅ（宝酒造社製）を１μｇ／１μｌとなる
ように加え、３７℃と５分間インキュベーションした
後、１２％ポリアクリルアミド電気泳動に供した。泳動
後、ゲルをＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ−ＩＩ（商品名、宝酒
造（株）製）で染色し、解析した。電気泳動結果を図４
に示す。Next, 1 μl of 100 mM DTT, 10 μm
U's RNase Inhibitor (Takara Shuzo Co., Ltd.)
0.8 μl, 20 mM NTP mixture (ATP,
0.5 μl of a mixture of CTP, GTP and UTP)
1 μl of 0.1% bovine serum albumin, 10-fold concentration of enzyme attached buffer (Takara Shuzo Co., Ltd., 60 mM MgCl 2
400m including ₂ and 20mM spermidine
1 μl of M Tris-HCl solution (pH 7.5)
0U SP6 RNA polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.)
Was added and incubated at 37 ° C. for 45 minutes. DNase (manufactured by Takara Shuzo) was added at 1 μg / 1 μl, incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and then subjected to 12% polyacrylamide electrophoresis. After the electrophoresis, the gel was stained with SYBR green-II (trade name, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and analyzed. Fig. 4 shows the results of electrophoresis.
Shown in

【００２３】ＳＡの０．２ｐｍｏｌ添加からＳＰ６ Ｒ
ＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の阻害が始まり、
０．８ｐｍｏｌの添加で完全に阻害した。このように、
ＤＮＡに結合したビオチンへのＳＡの脱着によりＲＮＡ
転写が調節されるスイッチング素子が構築できた。From addition of 0.2 pmol of SA to SP6R
Inhibition of RNA transcription by NA polymerase begins,
The addition was completely inhibited by the addition of 0.8 pmol. in this way,
Desorption of SA to biotin bound to DNA results in RNA
A switching element whose transfer is regulated was constructed.

【００２４】実施例２ 抗ビオチン・モノクローナル抗
体を用いたスイッチング機能 実施例１で調製したスイッチング素子について、ＳＡに
代えて抗ビオチンモノクローナル抗体（ベーリンガー・
マンハイム社製）を用いて同様の実験を行った。結果を
図５に示す。Example 2 Switching Function Using Anti-Biotin Monoclonal Antibody The switching element prepared in Example 1 was replaced with an anti-biotin monoclonal antibody (Boehringer.
The same experiment was performed using Mannheim Corporation. FIG. 5 shows the results.

【００２５】抗ビオチンモノクローナル抗体の０．４ｐ
ｍｏｌ添加から、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによるＲ
ＮＡ転写の阻害が始まり、３．２ｐｍｏｌの添加ではほ
とんど阻害した。このように、ＳＡに代え、より一般的
なモノクローナル抗体を用いても、ＤＮＡに結合したビ
オチンへの抗体の脱着によりＲＮＡ転写が調節されるス
イッチング素子が構築できた。0.4 p of anti-biotin monoclonal antibody
mol from the R by SP6 RNA polymerase
Inhibition of NA transcription started, and almost all was inhibited by addition of 3.2 pmol. Thus, even when a more general monoclonal antibody was used in place of SA, a switching element in which RNA transcription was regulated by desorption of the antibody to biotin bound to DNA could be constructed.

【００２６】実施例３ スイッチング素子を利用した測
定 実施例１で示したスイッチング素子を利用して、均一測
定系を構築した。まず、１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌと
０．１ｍＭ ＥＤＴＡの溶液（ｐＨ８．０）に、それぞ
れ０．２ｐｍｏｌ／４μｌ、６．４〜０．０２５ｐｍｏ
ｌ／４μｌ、０．４ｐｍｏｌ／４μｌとなるようにＴ９
Ｂｓｅｑ、ビオチンＡＣ５（同仁化学（株）製）及びス
トレプトアビジンを加え、ＰＣＲチューブ内で混和し、
３７℃で５分間インキュベーションした。Example 3 Measurement Using Switching Element A uniform measurement system was constructed using the switching element shown in Example 1. First, 1 mM Tris-HCl
In a solution (pH 8.0) of 0.1 mM EDTA, 0.2 pmol / 4 μl and 6.4 to 0.025 pmo, respectively.
1/4 μl, 0.4 pmol / 4 μl T9
Bseq, biotin AC5 (manufactured by Dojindo Co., Ltd.) and streptavidin are added, and mixed in a PCR tube.
Incubate at 37 ° C for 5 minutes.

【００２７】次に、１００ｍＭ ＤＴＴを２μｌ、２０
ＵのＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを１．６μｌ、２
０ｍＭ ＮＴＰ混合物（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵ
ＴＰの混合物）を１μｌ、０．１％のウシ血清アルブミ
ンを２μｌ、１０倍濃度の酵素添付緩衝液を２μｌ、５
０ＵのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを２μｌ、２．５μ
Ｍのインターカレーター性蛍光色素（オキサゾールイエ
ロー）で標識された１３ｍｅｒのオリゴヌクレオチドプ
ローブ（配列番号３）を０．３μｌ加えた。Next, 2 μl of 100 mM DTT, 20
1.6 μl of U RNase Inhibitor, 2
0 mM NTP mixture (ATP, CTP, GTP and UTP
TP mixture), 2 μl of 0.1% bovine serum albumin, 2 μl of a 10-fold concentration of enzyme-attached buffer, 5 μl
2 μl of 0 U SP6 RNA polymerase, 2.5 μl
0.3 μl of a 13-mer oligonucleotide probe (SEQ ID NO: 3) labeled with M intercalator fluorescent dye (oxazole yellow) was added.

【００２８】ＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能
付き蛍光分光光度計を用い、３７℃保温して、励起波長
４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液の蛍光強
度を経時的に測定した。酵素添加時の時刻を０分とし
て、サンプルの蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バ
ックグランドの蛍光強度値）の経時変化を図６に示し
た。Using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function capable of directly measuring a PCR tube, the temperature of the reaction solution was kept at 37 ° C., and the fluorescence intensity of the reaction solution was measured with time at an excitation wavelength of 470 nm and a fluorescence wavelength of 510 nm. FIG. 6 shows the time-dependent change in the fluorescence intensity ratio of the sample (the fluorescence intensity value at a predetermined time / the fluorescence intensity value of the background), with the time at the time of addition of the enzyme being 0 minute.

【００２９】反応開始から１５分で、ビオチンＡＣ５の
添加量（０、０．１、０．４、１．６ｐｍｏｌ）の相違
が蛍光強度比の差となって表れた。このように、本発明
のスイッチング素子を利用することで、洗浄操作を行う
必要のない、均一測定系が構築できた。At 15 minutes from the start of the reaction, the difference in the amount of biotin AC5 added (0, 0.1, 0.4, 1.6 pmol) appeared as a difference in the fluorescence intensity ratio. As described above, by using the switching element of the present invention, a uniform measurement system that does not require a cleaning operation can be constructed.

【００３０】実施例４ 抗ビオチンモノクローナル抗体
を用いたビオチンの測定 １ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌと ０．１ｍＭ ＥＤＴＡの
溶液（ｐＨ８．０）に、それぞれ０．２ｐｍｏｌ／４μ
ｌ、２．５〜０．００８ｐｍｏｌ／４μｌ、１．６ｐｍ
ｏｌ／４μｌとなるようにＴ９Ｂｓｅｑ、ビオチンＡＣ
５及び抗ビオチンモノクローナル抗体を加え、ＰＣＲチ
ューブ内で混和し、以後、実施例３と同様の実験を行っ
た。酵素添加時の時刻を０分として、サンプルの蛍光強
度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強
度値）の経時変化を図７に示した。Example 4 Measurement of Biotin Using Anti-Biotin Monoclonal Antibody 0.2 pmol / 4 μm each in a solution (pH 8.0) of 1 mM Tris-HCl and 0.1 mM EDTA.
1, 2.5-0.008 pmol / 4 μl, 1.6 pm
ol / 4 μl of T9Bseq and biotin AC
5 and anti-biotin monoclonal antibody were added and mixed in a PCR tube. Thereafter, the same experiment as in Example 3 was performed. FIG. 7 shows the time-dependent change of the fluorescence intensity ratio of the sample (the fluorescence intensity value at a predetermined time / the fluorescence intensity value of the background) with the time at the time of addition of the enzyme being 0 minute.

【００３１】反応開始から１５分で、ビオチンＡＣ５の
添加量（０、０．１６、０．３１、０．６３、１．２５
ｐｍｏｌ）の相違が蛍光強度比の差となって表れた。こ
のように、本発明のスイッチング素子を利用すること
で、モノクローナル抗体を用いても、洗浄操作を行う必
要のない、均一測定系が構築できた。実施例５ 抗エス
トラジオール（Ｅ２）・モノクローナル抗体を用いたＥ
２の測定 （１）Ｅ２修飾DNAの調製 ５'末端から8番目の塩基（Ｔ）と9番目の塩基（Ａ）の
間に炭素数15のリンカーを介してＥ２を結合した１６ｂ
ａｓｅのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター領
域（Ｔ９Ｅ）を調製した。その後、実施例１と同様の操
作で、Ｅ２が結合した６５ｂａｓｅの二重鎖ＤＮＡ（以
下、Ｔ９Ｅｓｅｑ）を得た。 （２）抗Ｅ２モノクローナル抗体を用いたＥ２の測定 Ｔ９Ｅｓｅｑ ０．１ｐｍｏｌ／４μＬ、エストラジオ
ール（Ｅ２、シグマ社製）１６〜０．５ｐｍｏｌ／４μ
Ｌ、抗Ｅ２モノクローナル抗体（フィッツジェラルド社
製）０．８ｐｍｏｌ／４μＬをＰＣＲチューブ内で混和
し、以後、実施例３と同様の実験を行なった。酵素添加
時の時刻を０分として、サンプルの蛍光強度比（所定の
時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）の
経時変化を図８に示した。15 minutes after the start of the reaction, the amount of biotin AC5 added (0, 0.16, 0.31, 0.63, 1.25)
pmol) as a difference in the fluorescence intensity ratio. As described above, by using the switching element of the present invention, a uniform measuring system which does not require a washing operation even when a monoclonal antibody is used was constructed. Example 5 E using anti-estradiol (E2) monoclonal antibody
Measurement of 2 (1) Preparation of E2-Modified DNA 16b in which E2 was bound between the eighth base (T) and the ninth base (A) from the 5 ′ end via a linker having 15 carbon atoms
Assay SP6 RNA polymerase promoter region (T9E) was prepared. Thereafter, a 65-base double-stranded DNA to which E2 was bound (hereinafter, T9Eseq) was obtained by the same operation as in Example 1. (2) Measurement of E2 using anti-E2 monoclonal antibody T9Eseq 0.1 pmol / 4 μL, estradiol (E2, manufactured by Sigma) 16-0.5 pmol / 4 μL
L, 0.8 pmol / 4 μL of anti-E2 monoclonal antibody (Fitzgerald) was mixed in a PCR tube, and the same experiment as in Example 3 was performed thereafter. FIG. 8 shows the change over time in the fluorescence intensity ratio of the sample (the fluorescence intensity value at a predetermined time / the fluorescence intensity value of the background), with the time at the time of addition of the enzyme being 0 minute.

【００３２】反応開始から１０分で、Ｅ２添加量（０、
０．５、１．０、４．０、１６．０ｐｍｏｌ）の相違が
蛍光強度比の差となって表れた。このように、ビオチン
のみならず、Ｅ２においても均一測定系が構築できたこ
とは、この方法の普遍性を示唆している。10 minutes after the start of the reaction, the amount of E2 added (0,
(0.5, 1.0, 4.0, 16.0 pmol) appeared as a difference in the fluorescence intensity ratio. Thus, the fact that a uniform measurement system was constructed not only for biotin but also for E2 suggests the universality of this method.

【００３３】実施例６ 高速スクリーニング用試薬への
応用（培地中の抗Ｅ２抗体の検出） モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを獲得す
る場合、クローニングされたハイブリドーマから培地中
に分泌された抗体を検出して目的のハイブリドーマを選
別する。抗体の検出方法は、通常、抗原を９６ウェルプ
レートの各ウェルに固定化し、ウシ血清アルブミン等の
タンパク質でブロッキングした後、被検培地を添加し、
３７℃でインキュベーションする。その後、洗浄した
後、酵素等で標識された抗マウス抗体等を添加し、イン
キュベーションする。洗浄後、酵素基質等を添加し、発
色等で酵素活性を測定することで、被検培地中の抗体存
在の有無を見積もっている。さらに通常、この操作の検
体数は数百から数千になり、かなり労力の必要な作業で
ある。Example 6 Application to High-Speed Screening Reagent (Detection of Anti-E2 Antibody in Medium) When a hybridoma producing a monoclonal antibody is obtained, an antibody secreted into the medium from the cloned hybridoma is detected. Select the desired hybridoma. Antibody detection method is usually immobilized antigen in each well of a 96-well plate, after blocking with a protein such as bovine serum albumin, adding a test medium,
Incubate at 37 ° C. Thereafter, after washing, an anti-mouse antibody or the like labeled with an enzyme or the like is added, followed by incubation. After washing, an enzyme substrate or the like is added, and the presence or absence of the antibody in the test medium is estimated by measuring the enzyme activity by color development or the like. Furthermore, the number of samples in this operation is usually several hundred to several thousand, which is a considerably labor-intensive operation.

【００３４】事例についても、本方法を適用した。１０
％ウシ胎児血清を含むＥ−ＲＤＦ培地（極東製薬社製）
と無血清Ｅ−ＲＤＦ培地に抗Ｅ２モノクローナル抗体を
それぞれ、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬになるよう
に添加した。抗体添加培地５μＬにＴ９Ｅｓｅｑ ０．
１ｐｍｏｌ／１０μＬ加え、３７℃で１０分インキュベ
ーション後、実施例３の酵素溶液（１００ｍＭ ＤＴＴ
３μＬ、ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ ２０Ｕ／２．
４μＬ、２０ｍＭ ＮＴＰｍｉｘ １．５μＬ、０．１
％ウシ血清アルブミン ３μＬ、10倍濃度の酵素添付緩
衝液 ３μＬ、ＳＰ６ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
５０Ｕ／１μＬ、２．５μＭのインターカレーター性
蛍光色素（オキサゾールイエロー）で標識された１３ｍ
ｅｒのオリゴヌクレオチドプローブ ０．３μＬ）を加
え、さらに３７℃でインキュベーションした。The present method was applied to the case. 10
E-RDF medium containing 10% fetal bovine serum (Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.)
And an anti-E2 monoclonal antibody were added to the serum-free E-RDF medium and 50 μg / mL and 25 μg / mL, respectively. Add 5 μL of T9Eseq 0.
After adding 1 pmol / 10 μL and incubating at 37 ° C. for 10 minutes, the enzyme solution of Example 3 (100 mM DTT
3 μL, RNaseInhibitor 20U / 2.
4 μL, 20 mM NTPmix 1.5 μL, 0.1
% Bovine serum albumin 3 μL, 10-fold concentration of buffer attached to enzyme 3 μL, SP6 RNA polymerase
13 m labeled with 50 U / 1 μL, 2.5 μM intercalating fluorescent dye (oxazole yellow)
er oligonucleotide probe (0.3 μL), and further incubated at 37 ° C.

【００３５】１５分後の蛍光強度（励起波長４７０ｎ
ｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を測定した結果を表１に示し
た（反応後１５分の蛍光強度値−バックグラウンドの蛍
光強度値）。表１において、上段の数字は抗体濃度、下
段は蛍光強度である。The fluorescence intensity after 15 minutes (excitation wavelength 470 n
m, fluorescence wavelength 510 nm) are shown in Table 1 (fluorescence intensity value 15 minutes after reaction-background fluorescence intensity value). In Table 1, the upper numbers indicate the antibody concentration, and the lower numbers indicate the fluorescence intensity.

【００３６】[0036]

【表１】 １０％血清を含む培地でも、無血清培地においても、培
地中に抗体が存在すると蛍光強度の減少が認められた。
このように、本方法を用いれば、抗原の固定化、ブロッ
キング、洗浄等の操作を行なわずに、培地中の抗Ｅ２抗
体を短時間で検出できる。[Table 1] In both the medium containing 10% serum and the serum-free medium, a decrease in fluorescence intensity was observed when the antibody was present in the medium.
As described above, by using this method, the anti-E2 antibody in the medium can be detected in a short time without performing operations such as immobilization, blocking, and washing of the antigen.

【００３７】さらに、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ・プ
ロモーター領域に結合させる物質を換えることにより、
さまざまな物質の高速スクリーニング用試薬として適用
可能である。Further, by changing the substance to be bound to the SP6 RNA polymerase promoter region,
It is applicable as a reagent for high-speed screening of various substances.

【００３８】[0038]

【発明の効果】本願発明は、作製及び利用が容易で、し
かも高感度な生物学的スイッチング素子を提供するもの
である。本願発明のスイッチング素子は、例えば均一系
測定方法に利用することができる。The present invention provides a biological switching device which is easy to manufacture and use and has high sensitivity. The switching element of the present invention can be used, for example, in a uniform measurement method.

【００３９】本願発明では、酵素等の蛋白質に物質Ａの
結合部位を導入するものではなく、従ってその導入位置
を特定することは容易である。また、本願発明のスイッ
チング素子を利用する均一測定系は、ＲＮＡの転写等、
大きなシグナルへの影響を検出しようとするものである
から、従来のスイッチング素子やそれを利用する測定方
法に比較して高感度である。更に、本願発明のスイッチ
ング素子では、リプレッサー等の天然物質を使用しない
から、微生物やウィルス等から微量のリプレッサー等を
精製しなければならないという課題もない。In the present invention, the binding site of the substance A is not introduced into a protein such as an enzyme, and therefore, it is easy to specify the introduction position. In addition, the uniform measurement system using the switching element of the present invention, such as RNA transcription,
Since it is intended to detect an influence on a large signal, the sensitivity is higher than that of a conventional switching element or a measuring method using the same. Furthermore, since the switching element of the present invention does not use a natural substance such as a repressor, there is no problem that a small amount of a repressor or the like must be purified from microorganisms or viruses.

【００４０】[0040]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOSOH Corporation <120> プロモーター、それを利用した生物学的スイッチング素子と均一系測定方 法 <130> PA211-0426 <160> 3 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> bacteriophage SP6 <220> <223> T9B <400> 1 atttaggtac actata 16 <210> 2 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T9Bseq <400> 2 atttaggtac actatagaat acaagcctgg agatttgggc gtgcccccgc 50 gagactgcta gccg 64 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> オリゴヌクレオチドプローブ <400> 3 ctcgcggggg ctg 13[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> TOSOH Corporation <120> Promoter, biological switching element using it, and homogeneous measurement method <130> PA211-0426 <160> 3 <210> 1 <211> 16 < 212> DNA <213> bacteriophage SP6 <220> <223> T9B <400> 1 atttaggtac actata 16 <210> 2 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T9Bseq <400> 2 atttaggtac actatagaat acaagcctgg agatttgggc gtgcccccgc 50 gagactgcta gccg 64 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide probe <400> 3 ctcgcggggg ctg 13

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】実施例１で用いた、ビオチン修飾ＤＮＡ調製用
オリゴマーを示す図である。FIG. 1 is a diagram showing an oligomer for preparing biotin-modified DNA used in Example 1.

【図２】実施例１で作製した二重鎖ＤＮＡの一部を示す
図である。FIG. 2 is a diagram showing a part of the double-stranded DNA prepared in Example 1.

【図３】実施例１で作製した、二重鎖ＤＮＡの全体を示
す図である。FIG. 3 is a diagram showing the entire double-stranded DNA prepared in Example 1.

【図４】実施例１の結果を示す図であり、発色部分がＳ
Ｐ６ ＲＮＡポリメラーゼで転写されたＲＮＡである。FIG. 4 is a diagram showing the results of Example 1, in which the colored portion is S
RNA transcribed by P6 RNA polymerase.

【図５】実施例２の結果を示す図であり、発色部分がＳ
Ｐ６ ＲＮＡポリメラーゼで転写されたＲＮＡである。FIG. 5 is a view showing a result of Example 2, in which a coloring portion is S
RNA transcribed by P6 RNA polymerase.

【図６】実施例３の結果を示す図であり、縦軸は蛍光強
度比、横軸はインキュベーション時間（分）をそれぞれ
示す。図中の記号は添加したビオチンの濃度を示し、そ
れぞれ、ひし形が６．４ｐｍｏｌ、四角が１．６ｐｍｏ
ｌ、三角が０．４ｐｍｏｌ、バツが０．１ｐｍｏｌ、米
印が０．０２５ｐｍｏｌ、そして丸が０ｐｍｏｌ／４μ
ｌである。FIG. 6 is a graph showing the results of Example 3, wherein the vertical axis represents the fluorescence intensity ratio and the horizontal axis represents the incubation time (minutes). The symbols in the figure indicate the concentration of added biotin, and the diamonds are 6.4 pmol and the squares are 1.6 pmo, respectively.
1, triangle is 0.4 pmol, cross is 0.1 pmol, US mark is 0.025 pmol, and circle is 0 pmol / 4μ
l.

【図７】実施例４の結果を示す図であり、縦軸は蛍光強
度比、横軸はインキュベーション時間（分）をそれぞれ
示す。図中の記号は添加したビオチンの濃度を示し、そ
れぞれ、ひし形が２．５ｐｍｏｌ、四角が１．２５ｐｍ
ｏｌ、三角が０．６３ｐｍｏｌ、白丸が０．３１ｐｍｏ
ｌ、米印が０．１６ｐｍｏｌ、黒丸が０．０８ｐｍｏ
ｌ、そしてプラスが０ｐｍｏｌ／４μｌである。FIG. 7 is a diagram showing the results of Example 4, wherein the vertical axis represents the fluorescence intensity ratio and the horizontal axis represents the incubation time (minutes). The symbols in the figure indicate the concentrations of the added biotin, and the diamonds are 2.5 pmol and the squares are 1.25 pm, respectively.
ol, triangle is 0.63 pmol, white circle is 0.31 pmo
1, 0.16 pmol for the U.S. mark and 0.08 pmo for the black circle
1 and plus are 0 pmol / 4 μl.

【図８】実施例５の結果を示す図であり、縦軸は蛍光強
度比、横軸はインキュベーション時間（分）をそれぞれ
示す。図中の記号は添加したＥ２の濃度を示し、それぞ
れ、ひし形が１６ｐｍｏｌ、四角が４ｐｍｏｌ、三角が
１ｐｍｏｌ、バツが０．５ｐｍｏｌ、横棒が０ｐｍｏｌ
／４μＬである。FIG. 8 is a graph showing the results of Example 5, wherein the vertical axis represents the fluorescence intensity ratio, and the horizontal axis represents the incubation time (minutes). The symbols in the figure indicate the concentration of the added E2, and the rhombus is 16 pmol, the square is 4 pmol, the triangle is 1 pmol, the cross is 0.5 pmol, and the horizontal bar is 0 pmol, respectively.
/ 4 μL.

Claims (8)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】核酸プロモーター配列或いはその配列の上
流又は下流５０ｍｅｒ内に物質Ａの結合部位が導入され
ており、該結合部位は、物質Ａが該結合部位に結合する
ことにより核酸ポリメラーゼとの反応性に影響を与える
ものであるか、又は、物質Ａが該結合部位に結合し、更
に物質Ａに対する結合能を有する物質Ｂが結合すること
により核酸ポリメラーゼとの反応性に影響を与えるもの
である、プロモーター部位。1. A binding site for a substance A is introduced into a nucleic acid promoter sequence or 50 mer upstream or downstream of the sequence, and the binding site reacts with a nucleic acid polymerase when the substance A binds to the binding site. Or a substance which binds to the binding site and further binds a substance B having a binding ability to the substance A, thereby affecting the reactivity with the nucleic acid polymerase. , Promoter site. 【請求項２】前記物質Ａ又はＢ、或いはＡとＢとの結合
物は、ポリメラーゼとプロモーターとの反応性に影響を
与える大きさを有する、請求項１のプロモーター部位。2. The promoter site according to claim 1, wherein the substance A or B, or the conjugate of A and B has a size that affects the reactivity between the polymerase and the promoter. 【請求項３】前記プロモーターは、ＳＰ６ ＲＮＡポリ
メラーゼプロモーターである、請求項１のプロモーター
部位。3. The promoter of claim 1, wherein said promoter is an SP6 RNA polymerase promoter. 【請求項４】物質Ａがビオチンである、請求項１のプロ
モーター部位。4. The promoter site according to claim 1, wherein the substance A is biotin. 【請求項５】物質Ａがビオチンであり、物質Ｂがストレ
プトアビジン又は抗ビオチンモノクローナル抗体であ
る、請求項１のプロモーター部位。5. The promoter site according to claim 1, wherein the substance A is biotin and the substance B is streptavidin or an anti-biotin monoclonal antibody. 【請求項６】請求項１のプロモーターを具備する、スイ
ッチング素子。6. A switching element comprising the promoter according to claim 1. 【請求項７】請求項６のスイッチング素子を利用する、
均一系測定方法。7. The switching element according to claim 6, wherein:
Homogeneous measurement method. 【請求項８】前記測定は、核酸ポリメラーゼにより発生
又は生成されるシグナルを検出するものである、請求項
７の測定方法。8. The method according to claim 7, wherein said measurement is to detect a signal generated or generated by a nucleic acid polymerase.