JP2002071694A - Examination method and examination kit for inflammatory bowel disease - Google Patents
Examination method and examination kit for inflammatory bowel diseaseInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、血液中に存在する
バクテロイデス・オバータス（Bacteroides ovatus）を
認識する抗体の存在を検出することを特徴とする炎症性
腸疾患の検査方法及び検査用キットに関する。詳しくは
臨床検査分野において、簡便、迅速に実施できる炎症性
腸疾患の検査方法及び検査用キットに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method and a kit for detecting inflammatory bowel disease, which comprises detecting the presence of an antibody recognizing Bacteroides ovatus present in blood. More specifically, the present invention relates to an inflammatory bowel disease test method and a test kit that can be easily and quickly performed in the clinical test field.
【０００２】[0002]
【従来の技術】クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性
腸疾患は、原因不明で特発性炎症性腸疾患として区分さ
れ、厚生省の難治性疾患として特定されている。診断は
厚生省特定疾患難治性炎症性腸管調査研究班で作製され
た診断基準（案）に従い、便培養などで感染性腸炎を除
外した後、臨床所見、消化管造影検査、内視鏡検査、組
織検査を組み合わせて行われている。診断の中心となる
消化管造影検査や内視鏡検査は、患者の肉体的・精神的
な苦痛を伴うことが多く、熟練した医師が必要とされて
いる。しかし、これらの方法によっても診断が困難な症
例も見られる。このため炎症性腸疾患の診断のための簡
便で迅速かつ高精度で行える特異的な臨床検査法が世界
的に求められている。2. Description of the Related Art Inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease and ulcerative colitis are classified as idiopathic inflammatory bowel diseases for unknown reasons, and are identified as intractable diseases of the Ministry of Health and Welfare. Diagnosis is based on the diagnostic criteria (draft) prepared by the Research and Investigation Research Group for Intractable Inflammatory Bowel Diseases of the Ministry of Health and Welfare, after excluding infectious enteritis by stool culture, etc. Inspections are performed in combination. Gastrointestinal angiography and endoscopy, which are the mainstays of diagnosis, often involve physical and mental distress in patients, and require skilled physicians. However, some cases are difficult to diagnose by these methods. Therefore, there is a worldwide demand for a simple, rapid, and highly accurate specific clinical test method for diagnosing inflammatory bowel disease.
【０００３】クローン病患者の血清には、抗小腸抗体
（Bagchi，S．et al.：Clin．Exp．Immunol.，55，44〜
48，1984）や抗パン酵母マンナン抗体（Quinton, J．et
al.: Gut, 42, 788〜791，1998）が、一方、潰瘍性大
腸炎患者の血清には、抗好中球抗体（Targan，S．et a
l.：Gastroenterology，96，A505，1989）、抗トロポミ
オシン抗体（Das，K. et al.：J．Iｍｍunol.，150，24
87〜2493，1993）や抗カゼイン抗体（Knoflach，P. et
al.：Gastroenterology，92，479〜485，1987）あるい
は抗ムチン抗体などの存在が報告されている。クローン
病や潰瘍性大腸炎に特異的な抗体と報告されていても例
数が少ないケース（小腸タンパク、トロポミオシン、ム
チン）あるいは特異性が低い（好中球、パン酵母マンナ
ン、カゼイン）など臨床検査に応用しうる程のデータに
至っていないのが実情である（Nielsen，O. et al.: A
m. J. Gastroenterol., 95, 359〜367，2000）。[0003] The serum of patients with Crohn's disease contains anti-small intestinal antibodies (Bagchi, S. et al .: Clin. Exp. Immunol., 55, 44-
48, 1984) and anti-baking yeast mannan antibody (Quinton, J. et.
al .: Gut, 42, 788-791, 1998), while the serum of patients with ulcerative colitis contained anti-neutrophil antibodies (Targan, S. et a).
l .: Gastroenterology, 96, A505, 1989), anti-tropomyosin antibody (Das, K. et al .: J. Immunol., 150, 24)
87-2493, 1993) and anti-casein antibodies (Knoflach, P. et.
al .: Gastroenterology, 92, 479-485, 1987) or the presence of anti-mucin antibodies. Laboratory tests such as a small number of cases (small intestinal protein, tropomyosin, mucin) or low specificity (neutrophils, baker's yeast mannan, casein) even though they are reported as antibodies specific for Crohn's disease or ulcerative colitis The fact is that the data is not enough to be applied to (Nielsen, O. et al .: A
m. J. Gastroenterol., 95, 359-367, 2000).
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、特異的な血清抗体を応用して、炎症性腸疾患の診
断が、簡便、迅速かつ高精度に実施できる臨床検査方法
を提供することを目的とするものである。SUMMARY OF THE INVENTION In view of the above-mentioned circumstances, the present invention provides a clinical test method in which diagnosing inflammatory bowel disease can be carried out simply, quickly and accurately by applying a specific serum antibody. It is intended to do so.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、理想的な
検査方法を求め、疫学的、免疫学的、生化学的研究を重
ねた結果、炎症性腸疾患患者の血中に腸内菌の一種であ
るバクテロイデス・オバータスを認識する抗体が量的に
有意に多く存在していることを見出し、本発明を完成す
るに至った。すなわち、本発明は、バクテロイデス・オ
バータスを用いて血液中のバクテロイデス・オバータス
を認識する抗体の存在を検出することを特徴とする炎症
性腸疾患の検査方法を提供する。バクテロイデス属細菌
はヒト腸内の最優勢菌属であるため、従来、炎症性腸疾
患との関連に関する研究は、数多くなされてきた。特
に、最優勢菌種であるバクテロイデス・ブルガータス
（Bacteroides vulgatus）、バクテロイデス・フラジリ
ス（Bacteroides ｆｒagilis）を用いて、これらの菌の
病因としての可能性、これらの菌に対する血中抗体と疾
患、病勢との関連性の研究が行われてきたが、明確な結
論は出ていない（Bamba, T. et al.: Ｊ．Gastroentero
l., 30, 45〜47, 1995、Duchmann, R. et al.: Gut, 4
4, 8121〜8, 1999、Matsuda, H. et al.: J. Gastroent
erol. Hepatol. 15,61〜68, 2000）。従って血中のバク
テロイデス・オバータスを認識する抗体の存在を検出す
ることにより炎症性腸疾患の検査が可能となったことは
到底予見し得なかったことである。Means for Solving the Problems The present inventors sought an ideal test method and conducted epidemiological, immunological and biochemical studies. The present inventors have found that an antibody recognizing Bacteroides ovatus, a kind of fungus, is present in a significantly large quantity, and have completed the present invention. That is, the present invention provides a method for examining inflammatory bowel disease, which comprises detecting the presence of an antibody that recognizes Bacteroides ovatus in blood using Bacteroides ovatus. Since Bacteroides bacteria are the most predominant bacteria in the human intestine, many studies on the association with inflammatory bowel disease have been made. In particular, using Bacteroides vulgatus and Bacteroides fragilis, which are the most predominant bacterial species, the possibility of the pathogenesis of these bacteria, blood antibodies against these bacteria and disease and disease Association studies have been performed, but no clear conclusions have been reached (Bamba, T. et al .: J. Gastroentero
l., 30, 45-47, 1995; Duchmann, R. et al .: Gut, 4
4, 8121-8, 1999, Matsuda, H. et al .: J. Gastroent
erol. Hepatol. 15, 61-68, 2000). Therefore, it has never been foreseeable that the detection of inflammatory bowel disease by detecting the presence of an antibody that recognizes Bacteroides ovatus in the blood was possible.
【０００６】バクテロイデス・オバータスとしてはヒト
由来の菌株であればいずれを用いてもよいが、基準菌株
のバクテロイデス・オバータスＪＣＭ５８２４（理化学
研究所微生物系統保存施設より入手可能）が好適に用い
られる。[0006] As Bacteroides obertus, any strain can be used as long as it is a human-derived strain, but the reference strain Bacteroides obertus JCM5824 (available from RIKEN Microbial Strain Preservation Facility) is preferably used.
【０００７】バクテロイデス・オバータスを認識する抗
体の存在の検出法としては、免疫学的測定法が好適に用
いられる。免疫学的測定法としては、いずれの方法を用
いてもよいが、酵素免疫測定法、イムノクロマトグラフ
ィー法などが好ましい。いずれの方法も検体中のバクテ
ロイデス・オバータスを認識する抗体を、支持体に含有
させたバクテロイデス・オバータス菌体と反応せしめた
後、上記抗体と反応する物質の標識化物を反応させ、反
応生成物の標識量を測定する工程を含む。酵素免疫測定
法は、酵素標識化物を用いて、反応生成物の標識量を酵
素活性により測定する。イムノクロマトグラフィー法
は、着色粒子標識化物を用いて、反応生成物の標識量を
着色量により測定する。[0007] As a method for detecting the presence of an antibody recognizing Bacteroides ovatus, an immunoassay is preferably used. As the immunoassay, any method may be used, but an enzyme immunoassay, an immunochromatography and the like are preferable. In any method, an antibody recognizing Bacteroides ovatus in the sample is reacted with Bacteroides ovatus bacteria contained in the support, and then the labeled product of the substance that reacts with the antibody is reacted. Measuring the amount of label. In the enzyme immunoassay, a labeled amount of a reaction product is measured by enzyme activity using a labeled enzyme. In the immunochromatography method, a labeled amount of a reaction product is measured based on a colored amount by using a labeled colored particle.
【０００８】本発明には反応生成物の標識量、すなわち
検体中のバクテロイデス・オバータスを認識する抗体の
存在量を容易に数値化できる酵素免疫測定法が好適に用
いられる。酵素免疫測定法には、検体中のバクテロイデ
ス・オバータスを認識する抗体を、支持体に含有させた
バクテロイデス・オバータス菌体と反応せしめた後、上
記抗体と反応する物質、好ましくは抗ヒト免疫グロブリ
ン抗体、プロテインＡ、プロテインＧ又はジャッカリン
の酵素標識化物を反応させ、反応生成物の標識量を酵素
活性により測定する工程を含む方法が適している。支持
体としては、たとえば、ポリスチレン樹脂、ポリカーボ
ネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂などプラスチ
ックやガラスが適している。この支持体へバクテロイデ
ス・オバータスを含有させる方法は物理吸着であっても
よいし、化学的結合であってもよい。標識用酵素として
は、ペルオキシダーゼ、βーガラクトシダーゼ、アルカ
リホスファターゼが好適である。[0008] In the present invention, an enzyme immunoassay which can easily quantify the labeling amount of a reaction product, that is, the amount of an antibody recognizing Bacteroides ovatus in a sample is preferably used. In the enzyme immunoassay, an antibody recognizing Bacteroides ovatus in a sample is reacted with Bacteroides ovatus cells contained in a support, and then reacted with the antibody, preferably a substance that reacts with the antibody, preferably an anti-human immunoglobulin antibody. , A protein A, a protein G, or an enzyme-labeled product of jackalin, and a method comprising the step of measuring the labeling amount of the reaction product by the enzyme activity. As the support, for example, plastic or glass such as polystyrene resin, polycarbonate resin, silicon resin, and nylon resin is suitable. The method for incorporating Bacteroides obvertus into the support may be physical adsorption or chemical bonding. As the labeling enzyme, peroxidase, β-galactosidase and alkaline phosphatase are suitable.
【０００９】本発明によって検出される血液中のバクテ
ロイデス・オバータスを認識する抗体は、バクテロイデ
ス・オバータス菌体に含まれる物質であればいずれの物
質と反応する抗体であってもよい。本発明者らがウェス
タンブロット法により血液中のバクテロイデス・オバー
タスを認識する抗体と反応するバクテロイデス・オバー
タス菌体に含まれる物質について解析した結果、炎症性
腸疾患患者の血液中のバクテロイデス・オバータスを認
識する抗体は、分子量１９５００の物質と主に反応する
ことが判明した。The antibody that recognizes Bacteroides ovatus in blood detected by the present invention may be any antibody that reacts with any substance contained in Bacteroides ovatus cells. The present inventors have analyzed the substance contained in Bacteroides obatas cells reacting with the antibody recognizing Bacteroides obatas in blood by Western blotting, and found that Bacteroides obatas in blood of patients with inflammatory bowel disease was analyzed. Antibody was found to react mainly with a substance having a molecular weight of 19,500.
【００１０】本発明は、さらに、バクテロイデス・オバ
ータスを含み、免疫学的測定法により血液中のバクテロ
イデス・オバータスを認識する抗体の存在を検出する炎
症性腸疾患の検査用キットを提供する。免疫学的測定法
が酵素免疫測定法の場合、この検査用キットには、バク
テロイデス・オバータス菌体を含有させた支持体、酵素
標識化抗ヒトＩｇＧ抗体、酵素標識化抗ヒトＩｇＡ抗
体、酵素標識化プロテインＡ、酵素標識化プロテインＧ
又は酵素標識化ジャッカリンの中のいずれか１種類の酵
素標識化物、及び標識酵素活性測定用試薬を含む。次
に、実施例を上げて詳細な説明をするが、これによって
本発明が限定されるものではない。[0010] The present invention further provides a kit for testing inflammatory bowel disease, which comprises Bacteroides ovatus and detects the presence of an antibody recognizing Bacteroides ovatus in blood by immunoassay. When the immunoassay is an enzyme immunoassay, this test kit includes a support containing Bacteroides ovatus cells, an enzyme-labeled anti-human IgG antibody, an enzyme-labeled anti-human IgA antibody, and an enzyme-labeled enzyme. Protein A, Enzyme-Labeled Protein G
Alternatively, it contains any one of enzyme-labeled jackalin and a reagent for measuring a labeled enzyme activity. Next, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
【００１１】[0011]
【実施例１】酵素免疫測定法による血液中のバクテロイ
デス・オバータスを認識する抗体の存在の検出 １）バクテロイデス・オバータス菌体の調製 バクテロイデス・オバータスＪＣＭ５８２４をGAMブイ
ヨン培地（日水製薬社製）１０ｍLで37℃、 １８時間
嫌気培養した。遠心分離により集菌後、リン酸緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。洗浄菌体をＰＢＳ ５ｍ
Lに懸濁し、超音波破砕した。Example 1 Detection of the presence of an antibody recognizing Bacteroides ovatus in blood by enzyme immunoassay 1) Preparation of Bacteroides ovatus cells Bacteroides ovatus JCM5824 was added to 10 mL of GAM bouillon medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.). The cells were anaerobically cultured at 37 ° C. for 18 hours. After collecting cells by centrifugation, the cells were washed with phosphate buffered saline (PBS). Wash the cells with PBS 5m
L and sonicated.
【００１２】２）バクテロイデス・オバータス菌体を含
有させた支持体の調製 ＰＢＳにてタンパク質濃度10μg/mlとなるよう希釈した
バクテロイデス・オバータス菌体の超音波破砕物を96穴
マイクロプレート（コースター社製）の各々のウェルに
0.2 mLずつ加え、4℃で一晩放置した。各ウェルの液を
除去した後、洗浄のためＰＢＳを0.25 mLずつ加え撹拌
後、液を除去した。この洗浄操作を3回繰り返した後、
マスキング試薬として0.1％スキムミルク加ＰＢＳを0.2
5 mL加え、37℃、１時間インキュベートした。マスキン
グの後、各ウェル内の液を除去し、３７℃で１〜３時間
乾燥した。2) Preparation of a support containing Bacteroides obatas cells The ultrasonically crushed Bacteroides obatas cells diluted to a protein concentration of 10 μg / ml with PBS were placed in a 96-well microplate (Coaster Co., Ltd.). ) For each well
It was added in 0.2 mL portions and left at 4 ° C. overnight. After removing the liquid in each well, 0.25 mL of PBS was added for washing, and the liquid was removed after stirring. After repeating this washing operation three times,
0.2% of PBS containing 0.1% skim milk as a masking reagent
5 mL was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. After the masking, the liquid in each well was removed and dried at 37 ° C. for 1 to 3 hours.
【００１３】３）血中のバクテロイデス・オバータスを
認識する抗体の存在の検出 ヒト血清中のバクテロイデス・オバータスを認識する抗
体の存在の検出にはサンドイッチ酵素免疫測定法を用い
た。すなわち、先に作製したバクテロイデス・オバータ
ス含有支持体（96穴マイクロプレート）に、あらかじめ
０.05%スキムミルク加ＰＢＳで３００倍に希釈しておい
た被検血清をウェルに0.2 mLずつ加え、マイクロプレー
トミキサーにて約1分間撹拌の後、37℃、1時間反応させ
た。各ウェルの液を除去した後、0.05％Tween20加ＰＢ
Ｓ0.25 mLにより3回洗浄を行った。次に、ペルオキシダ
ーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（カッペル社製）又はペルオ
キシダーゼ標識抗ヒトＩｇＡ抗体（カッペル社製）を至
適濃度に希釈し、各ウェルに0.2 mLずつ加え、再び37
℃、1時間反応させた。反応後、液を除去し再度洗浄を
行い、各ウェル中の液を完全に除去した後、基質液（0.
01％過酸化水素＋1.5 mg/mlｏ−フェニレンジアミン水
溶液）を0.2 mL加え室温にて10分間反応させた。4Ｎ硫
酸を各ウェルに0.05 ml添加することで反応を停止させ
た。マイクロプレート用比色計（和光純薬社製）で吸光
値（492 nmの吸光値−630 nmの吸光値）を測定し、対照
とした特定のクローン病患者血清の吸光値を１０００U/
ｍLとして、検体吸光値÷対照吸光値×１０００により
抗体価を算出した。3) Detection of the presence of an antibody recognizing Bacteroides ovatus in blood The sandwich enzyme immunoassay was used to detect the presence of an antibody recognizing Bacteroides ovatus in human serum. That is, to the Bacteroides ovatus-containing support (96-well microplate) prepared above, test serum, which had been diluted 300-fold with PBS containing 0.05% skim milk, was added in an amount of 0.2 mL to each well. After stirring for about 1 minute with a mixer, the mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour. After removing the liquid from each well, add PB with 0.05% Tween20.
Washing was performed three times with 0.25 mL of S. Next, a peroxidase-labeled anti-human IgG antibody (manufactured by Kappel) or a peroxidase-labeled anti-human IgA antibody (manufactured by Kappel) was diluted to an optimal concentration, 0.2 mL was added to each well, and the solution was added again.
The reaction was carried out at 1 ° C. for 1 hour. After the reaction, the solution was removed and washed again, and the solution in each well was completely removed.
0.2% (01% hydrogen peroxide + 1.5 mg / ml aqueous solution of phenylenediamine) was added thereto and reacted at room temperature for 10 minutes. The reaction was stopped by adding 0.05 ml of 4N sulfuric acid to each well. The absorbance value (absorbance value at 492 nm-absorbance value at 630 nm) was measured using a colorimeter for microplate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the absorbance value of the serum of a specific Crohn's disease patient as a control was measured at 1000 U /.
The antibody titer was calculated from the sample absorbance value / control absorbance value × 1000 as mL.
【００１４】潰瘍性大腸炎（３０例）及びクローン病
（１２例）の炎症性腸疾患患者血清及び健常者血清（３
０例）についてバクテロイデス・オバータスを認識する
抗体の存在の検出を行った。結果を表１に示した。炎症
性腸疾患患者の血清中にはバクテロイデス・オバータス
を認識する抗体（ＩｇＧ及びＩｇＡ）が有意に多く存在
することが判明した。健常者の抗体価の平均値＋２×標
準偏差をカットオフ値とすると、バクテロイデス・オバ
ータスを認識するＩｇＧ陽性の例数は炎症性腸疾患患者
４２例中１８例、健常者３０例中２例、ＩｇＡ陽性の例
数は炎症性腸疾患患者４２例中２０例、健常者３０例中
１例であった。これらの結果より、本測定法を炎症性腸
疾患の診断に利用できることが示された。Sera from inflammatory bowel disease patients with ulcerative colitis (30 cases) and Crohn's disease (12 cases) and healthy subjects (3
0 case), the presence of an antibody recognizing Bacteroides overtas was detected. The results are shown in Table 1. It was found that there were significantly more antibodies (IgG and IgA) recognizing Bacteroides ovatus in the serum of patients with inflammatory bowel disease. Assuming that the average value of antibody titers in healthy subjects + 2 × standard deviation is the cutoff value, the number of IgG-positive cases recognizing Bacteroides overtas was 18 out of 42 patients with inflammatory bowel disease, 2 out of 30 healthy subjects, The number of IgA-positive cases was 20 out of 42 patients with inflammatory bowel disease and 1 out of 30 healthy subjects. These results indicated that this assay can be used for diagnosis of inflammatory bowel disease.
【００１５】[0015]
【表１】 [Table 1]
【００１６】[0016]
【比較例】酵素免疫測定法による血中のバクテロイデス
・ブルガータスを認識する抗体の存在の検出 実施例１と同様の方法により、バクテロイデス・オバー
タスの代わりに、ヒトの腸内菌の最優勢菌種であるバク
テロイデス・ブルガータスＪＣＭ５８２６（理化学研究
所微生物系統保存施設より入手可能）を用いて支持体を
調製し、血中のバクテロイデス・ブルガータスを認識す
る抗体（ＩｇＧ）の存在の検出を行った。結果を表２に
示した。血清中のバクテロイデス・ブルガータスを認識
する抗体の存在量は、炎症性腸疾患患者と健常者との間
で有意差は認められなかった。[Comparative Example] Detection of presence of an antibody recognizing Bacteroides bulgartus in blood by enzyme immunoassay In the same manner as in Example 1, Bacteroides ovatus was replaced with the most predominant species of human intestinal bacteria. A support was prepared using a certain Bacteroides burgatas JCM5826 (available from RIKEN Microbial Strain Preservation Facility), and the presence of an antibody (IgG) recognizing Bacteroides burgatas in blood was detected. The results are shown in Table 2. The abundance of the antibody recognizing Bacteroides bulgartus in the serum did not show any significant difference between patients with inflammatory bowel disease and healthy subjects.
【００１７】[0017]
【表2】 [Table 2]
【００１８】 [0018]
【実施例２】バクテロイデス・オバータスを認識する抗
体と反応する物質の分子量の測定 ウェスタンブロット法により、炎症性腸疾患患者血清中
のバクテロイデス・オバータスを認識する抗体と反応す
るバクテロイデス・オバータスの菌体に含まれる物質の
分子量の測定を行った。実施例１の方法により培養した
バクテロイデス・オバータスの菌体を可溶化してＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画した。泳
動終了後、ウエスタンブロッティングによりニトロセル
ロース膜に転写した。ニトロセルロース膜を5%スキムミ
ルク加ＰＢＳによりマスキングした後、バクテロイデス
・オバータスを認識する抗体価の高い炎症性腸疾患患者
血清を２０００倍希釈して室温、１時間反応させた。反
応後、0.1％Tween20加ＰＢＳで洗浄した。至適濃度に希
釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体と室温、
1時間反応させた。反応後、再度洗浄を行い、基質液（E
CLウェスタンブロッティング検出試薬、アマシャムファ
ルマシアバイオテク社製）と室温にて10分間反応させ
た。その結果、バクテロイデス・オバータスを認識する
抗体は、分子量１９５００の物質と主に反応することが
わかった。Example 2 Measurement of Molecular Weight of Substance Reacting with Antibody Recognizing Bacteroides ovatus By Western Blot Method, Bacteroides ovatus Reacting with Bacteroides ovatus Reacting Antibody in Serum of Patients with Inflammatory Bowel Disease The molecular weight of the contained substance was measured. The cells of Bacteroides ovatus cultured by the method of Example 1 were solubilized and subjected to SDS.
-Fractionation by polyacrylamide gel electrophoresis. After the electrophoresis, the DNA was transferred to a nitrocellulose membrane by Western blotting. After masking the nitrocellulose membrane with PBS supplemented with 5% skim milk, serum of a patient with an inflammatory bowel disease having a high antibody titer recognizing Bacteroides ovatus was diluted 2000-fold and reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, the plate was washed with PBS containing 0.1% Tween20. Peroxidase-labeled anti-human IgG antibody diluted to an optimal concentration and room temperature,
The reaction was performed for 1 hour. After the reaction, washing is performed again, and the substrate solution (E
CL Western blotting detection reagent, manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) at room temperature for 10 minutes. As a result, it was found that the antibody recognizing Bacteroides obatas mainly reacted with a substance having a molecular weight of 19,500.
【００１９】[0019]
【実施例３】ウェスタンブロット法による血中のバクテ
ロイデス・オバータスを認識する抗体と反応する物質の
解析 炎症性腸疾患患者２０例、健常者１０例の血清について
実施例２と同様の試験を行った。その結果、炎症性腸疾
患では１７例がバクテロイデス・オバータスの分子量１
９５００の物質と反応した。一方、健常者では２例にと
どまった。Example 3 Analysis of Substance Reacting with Antibody Recognizing Bacteroides ovatus in Blood by Western Blot Method The same test as in Example 2 was performed on sera from 20 patients with inflammatory bowel disease and 10 healthy subjects. . As a result, 17 cases of inflammatory bowel disease had a molecular weight of 1 of Bacteroides ovatus.
Reacted with 9500 substances. On the other hand, there were only two healthy subjects.
【００２０】[0020]
【実施例４】検査用キットの作製 以下の構成試薬からなる検査用キット（酵素免疫測定
法）を作製した。 １）実施例１で調製したバクテロイデス・オバータス菌
体を含有させた支持体（９６穴マイクロプレート） ２）血液検体希釈液 ３）陽性コントロール血清 ４）ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体液又はペル
オキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＡ抗体液 ５）洗浄液 ６）酵素基質液（過酸化水素＋テトラメチルベンチジ
ン） ７）反応停止液（１Ｎ硫酸）Example 4 Preparation of Test Kit A test kit (enzyme immunoassay) comprising the following constituent reagents was prepared. 1) Support containing Bacteroides ovatus cells prepared in Example 1 (96-well microplate) 2) Blood sample diluent 3) Positive control serum 4) Peroxidase-labeled anti-human IgG antibody solution or peroxidase-labeled anti-human IgA antibody solution 5) Wash solution 6) Enzyme substrate solution (hydrogen peroxide + tetramethylbenzidine) 7) Reaction stop solution (1N sulfuric acid)
【００２１】[0021]
【発明の効果】本発明は、バクテロイデス・オバータス
を用いて、免疫学的測定法により血液中のバクテロイデ
ス・オバータスを認識する抗体の存在を検出することを
特徴とする炎症性腸疾患の検査方法及び検査用キットを
提供するものである。実施例から明らかなように、本発
明の検査方法及び検査用キットを用いれば、臨床現場に
おいて簡便、迅速な炎症性腸疾患の診断が可能となる。
また、本検査方法及び検査用キットは炎症性腸疾患の病
因解析等基礎研究にも広く利用できる。According to the present invention, there is provided a method for detecting inflammatory bowel disease, which comprises detecting the presence of an antibody recognizing Bacteroides ovatus in blood by immunoassay using Bacteroides ovatus. An inspection kit is provided. As is clear from the examples, the use of the test method and test kit of the present invention enables simple and rapid diagnosis of inflammatory bowel disease in a clinical setting.
In addition, the present test method and test kit can be widely used for basic research such as etiological analysis of inflammatory bowel disease.
Claims (6)
識する抗体の存在を検出することを特徴とする炎症性腸
疾患の検査方法。1. A method for testing inflammatory bowel disease, comprising detecting the presence of an antibody recognizing Bacteroides ovatus in blood.
デス・オバータスを認識する抗体の存在を検出すること
を特徴とする炎症性腸疾患の検査方法。2. A method for examining inflammatory bowel disease, comprising detecting the presence of an antibody recognizing Bacteroides ovatus in blood by immunological assay.
識する抗体を、支持体に含有させたバクテロイデス・オ
バータス菌体と反応せしめた後、上記抗体と反応する物
質の標識化物を反応させ、反応生成物の標識量を測定す
る工程を含む免疫学的測定法により血液中のバクテロイ
デス・オバータスを認識する抗体の存在を検出すること
を特徴とする炎症性腸疾患の検査方法。3. An antibody that recognizes Bacteroides ovatus in a sample is allowed to react with Bacteroides ovatus cells contained in a support, and then a labeled product of a substance that reacts with the antibody is reacted to obtain a reaction product. A method for detecting inflammatory bowel disease, comprising detecting the presence of an antibody recognizing Bacteroides ovatus in blood by an immunoassay including a step of measuring the amount of labeling of inflammatory bowel disease.
体は、バクテロイデス・オバータス菌体に含まれる分子
量１９５００の物質と反応する抗体であることを特徴と
する請求項１、２又は３記載の検査方法。4. The test method according to claim 1, wherein the antibody recognizing Bacteroides ovatus is an antibody that reacts with a substance having a molecular weight of 19,500 contained in Bacteroides ovatus cells.
学的測定法により血液中のバクテロイデス・オバータス
を認識する抗体の存在を検出する炎症性腸疾患の検査用
キット。5. A test kit for inflammatory bowel disease, comprising Bacteroides ovatus and detecting the presence of an antibody recognizing Bacteroides ovatus in blood by immunoassay.
支持体、酵素標識化抗ヒトＩｇＧ抗体、酵素標識化抗ヒ
トＩｇＡ抗体、酵素標識化プロテインＡ、酵素標識化プ
ロテインＧ又は酵素標識化ジャッカリンの中のいずれか
１種類の酵素標識化物、及び酵素活性測定用試薬を含
み、免疫学的測定法により、血液中のバクテロイデス・
オバータスを認識する抗体の存在を検出する炎症性腸疾
患の検査用キット。6. A support containing Bacteroides ovatus, an enzyme-labeled anti-human IgG antibody, an enzyme-labeled anti-human IgA antibody, an enzyme-labeled protein A, an enzyme-labeled protein G, or an enzyme-labeled jackalin. It contains any one type of enzyme-labeled product and a reagent for measuring enzyme activity, and is used to determine whether Bacteroides and
A test kit for inflammatory bowel disease that detects the presence of an antibody recognizing overtas.
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006132946A (en) * | 2004-11-02 | 2006-05-25 | Nitto Boseki Co Ltd | Method of measuring iga bondable alkaline phosphatase 6 and kit used for it |
| JP2008537595A (en) * | 2005-04-04 | 2008-09-18 | バイオジェン アイデック エムエイ インコーポレイテッド | Methods and products for assessing immune responses to therapeutic proteins |
| WO2019191409A1 (en) * | 2018-03-29 | 2019-10-03 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Sensor for indicating a potential forthcoming skin or gastrointestinal issue and methods of using the same |
| RU2793632C2 (en) * | 2018-03-29 | 2023-04-04 | Кимберли-Кларк Ворлдвайд, Инк. | Sensor for possible expected skin or gastrointestinal problems and how to use it |
-
2000
- 2000-08-25 JP JP2000254774A patent/JP2002071694A/en active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006132946A (en) * | 2004-11-02 | 2006-05-25 | Nitto Boseki Co Ltd | Method of measuring iga bondable alkaline phosphatase 6 and kit used for it |
| JP4517353B2 (en) * | 2004-11-02 | 2010-08-04 | 日東紡績株式会社 | Method for measuring IgA-binding alkaline phosphatase 6 and kit used therefor |
| JP2008537595A (en) * | 2005-04-04 | 2008-09-18 | バイオジェン アイデック エムエイ インコーポレイテッド | Methods and products for assessing immune responses to therapeutic proteins |
| WO2019191409A1 (en) * | 2018-03-29 | 2019-10-03 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Sensor for indicating a potential forthcoming skin or gastrointestinal issue and methods of using the same |
| GB2587121A (en) * | 2018-03-29 | 2021-03-17 | Kimberly Clark Co | Sensor for indicating a potential forthcoming skin or gastrointestinal issue and methods of using the same |
| GB2587121B (en) * | 2018-03-29 | 2023-02-01 | Kimberly Clark Co | Sensor for indicating a potential forthcoming skin or gastrointestinal issue and methods of using the same |
| RU2793632C2 (en) * | 2018-03-29 | 2023-04-04 | Кимберли-Кларк Ворлдвайд, Инк. | Sensor for possible expected skin or gastrointestinal problems and how to use it |
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