JP2002047298A - New anticancer agent transfer system - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To solve the problem of toxic side action of various cytotoxic anticancer agent lacking a selective drug transfer system and to improve the transfer efficiency of drug. SOLUTION: The new system for the transfer of an anti-cancer agent to a cancer cell is produced by using a new cancer treating compound expressed by general formula paclitaxel (or PEG-DOPE)-O-R-NH-R' [R is a dicarboxylic acid residue; and R' is somatostatin analog]. The compound can be synthesized by a solid phase process.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】発明の分野 本発明は、新規抗がん剤伝達系、特にソマトスタチン類
縁体を抗がん剤（例えばタキソール（パクリタキセル
（paclitaxel））など）と結合させ、それによって当該
抗がん剤が標的がん細胞に特異的に伝達されるようにし
た系に関するものである。[0001] The present invention relates to a novel anticancer drug delivery system, particularly a somatostatin analog, which is bound to an anticancer drug (for example, taxol (paclitaxel) or the like), whereby the anticancer drug is produced. The present invention relates to a system that is specifically transmitted to a target cancer cell.

【０００２】関連技術の記載 多くの細胞毒性抗がん剤は、共通の問題点、すなわち選
択的薬剤伝達系を欠いているため、毒性的副作用を発揮
するという問題点を有している。抗がん剤を標的である
がん細胞に指向させるための担体としてエンドサイトシ
ス的（endocytotic)リガンドを使用することにより、毒
性的副作用を回避し、当該薬剤の伝達効率を顕著に改善
することが出来る。2. Description of the Related Art Many cytotoxic anticancer drugs have a common problem, namely, they exhibit toxic side effects because they lack a selective drug delivery system. By using endocytotic ligands as carriers for targeting anticancer drugs to target cancer cells, avoiding toxic side effects and significantly improving the transfer efficiency of the drugs Can be done.

【０００３】ソマトスタチンは、ソマトスタチン受容体
（SSTR）として知られる細胞膜受容体を介して機能す
る。これらの受容体は、ある種のがん細胞（例えばカル
チノイド、膵島細胞腫、傍神経節腫、肺小細胞癌など）
の表面で過剰発現される。ソマトスタチン類縁体は、こ
のように興味有る性質を有しているので、薬剤がそれら
の細胞に特異的に作用するような悪性腫瘍細胞に指向さ
れた担体系として使用することが出来る。X-c[Cys-Phe-
Trp-Lys-Thr-Cys]-X、X-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]
-X またはX-c[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Xを含むソ
マトスタチン類縁体を色素又は放射性核種で標識して、
SSTRを発現する腫瘍を可視化し、モニターすることが報
告されている。ソマトスタチン類縁体は、元のソマトス
タチンよりも大きさが小さく、ソマトスタチン受容体に
対する親和性が高く、安定性が大であるところから、上
記した適用について、元のソマトスタチン類よりも好ま
しい。[0003] Somatostatin functions via a cell membrane receptor known as the somatostatin receptor (SSTR). These receptors are used for certain types of cancer cells (eg, carcinoids, islet cell tumors, paraganglioma, small cell lung cancer, etc.)
Is overexpressed on the surface. Somatostatin analogs have such interesting properties that they can be used as carrier systems directed at malignant tumor cells where the drug acts specifically on those cells. Xc [Cys-Phe-
Trp-Lys-Thr-Cys] -X, Xc [Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]
-X or Xc [Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys] -X containing a somatostatin analog containing a dye or radionuclide,
It has been reported to visualize and monitor tumors that express SSTR. Somatostatin analogs are preferred over the original somatostatins for the above applications because of their smaller size, higher affinity for the somatostatin receptor, and greater stability than the original somatostatin.

【０００４】発明の要約 本発明は、オクトレオチド（octreotide）、ランレオチ
ド（lanreotide）およびバプレオチド（vapretotide）
のようなソマトスタチン類縁体と、パクリタキセルのよ
うな抗がん剤との、共有結合または物理的捕捉を介した
結合体に関するものである。すなわち、本発明化合物
は、次の一般的構造を有するものである： X-O-スペーサー-NH-ペプチド （式中、Xは抗がん剤、リポソームを作るための脂質又
はポリマーマトリックスを形成させるためのモノマーで
ある）。SUMMARY OF THE INVENTION [0004] The present invention relates to octreotide, lanreotide and vapretotide.
And a conjugate of a somatostatin analog such as described above and an anticancer agent such as paclitaxel via covalent bond or physical capture. That is, the compound of the present invention has the following general structure: XO-spacer-NH-peptide (where X is an anticancer agent, a lipid for forming liposomes or a polymer for forming a polymer matrix) Monomer).

【０００５】一般に、本発明は、X-c[Cys-Phe-Trp-Lys-
Thr-Cys]-X、X-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-X また
はX-c[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys]-Xなる配列を有する
ソマトスタチン類縁体を使用して、抗がん剤をがん細胞
に伝達するための新しい系を提供するものである。ソマ
トスタチン類縁体の合成は、Fmoc（9-フルオレニルメト
キシカルボニル）法により、固相ペプチド合成機上で行
うことが出来る。例えば、抗がん剤（例えばパクリタキ
セル、ドキソルビシン、カンプトテシンなど）のよう
な、標的細胞へ伝達することが意図されている所望の化
合物を、カルボキシル末端基を有するスペーサーと反応
させて薬剤とスペーサーの複合体を形成させ、次いで、
当該複合体を樹脂上でソマトスタチン類縁体ペプチドの
N末端にカップリングさせて、最終成績体、すなわち第
１図に示すような薬剤-スペーサー-ペプチドを形成せし
める。[0005] In general, the present invention relates to Xc [Cys-Phe-Trp-Lys-
Somatostatin analogs having the sequence Thr-Cys] -X, Xc [Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys] -X or Xc [Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys] -X It provides a new system for delivering anticancer drugs to cancer cells using the body. The synthesis of somatostatin analogs can be performed on a solid phase peptide synthesizer by the Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) method. For example, a desired compound intended to be delivered to a target cell, such as an anticancer drug (eg, paclitaxel, doxorubicin, camptothecin, etc.) is reacted with a spacer having a carboxyl terminal group to form a conjugate of the drug and the spacer. Let the body form, then
The complex is converted to a somatostatin analog peptide on a resin.
Coupling to the N-terminus forms the final product, ie, drug-spacer-peptide as shown in FIG.

【０００６】本発明は、更に、DOPE-PEG-スペーサー-ソ
マトスタチン類縁体で示される結合体を合成する方法を
提供するものであり、当該結合体は第１図に示すように
リポソーム薬剤伝達系の調製に有用なものである。The present invention further provides a method for synthesizing a conjugate represented by a DOPE-PEG-spacer-somatostatin analog, wherein the conjugate comprises a liposome drug delivery system as shown in FIG. It is useful for preparation.

【０００７】本発明に関する種々の新規な特徴は、本願
明細書の開示の一部をなしている特許請求の範囲に指摘
されている。本発明、その実施上の利点、その使用によ
り達成される具体的な目的などのより良い理解のため
に、以下に示す図面及び本発明の具体的な実施態様を含
む詳細な記載が参酌されるべきである。[0007] Various novel features of the invention are pointed out in the claims forming an integral part of the disclosure herein. For a better understanding of the invention, its practical advantages, and the specific objects achieved by its use, reference is made to the following drawings and detailed description, including specific embodiments of the invention. Should.

【０００８】好ましい態様の詳細な説明 略号の意義は、次のとおりである： Fmoc： ９−フルオレニルメトキシカルボニル； Trt： トリフェニルメチル； Thr-ol： スレオニナオール； Phe： フェニルアラニン； Cys： システイン； Thr： スレオニン； Lys： リジン； Trp： トリプトファン； ＤβNal： Ｄ−β−（２−ナフチル）アラニン； TFA： トリフルオロ酢酸； DMF： Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド； THF： テトラヒドロフラン； HBTU： ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テ トラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート； DMAP： ４−ジメチルアミノピリジン； ACN： アセトニトリル； DCM： ジクロロメタン； TIS： トリイソプロピルシラン； PEG： ポリエチレングリコール； DOPE： ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン； MTT： ３-[４，５−ジメチルチアゾール−２−イル]−２，５−ジフェニルテ トラゾリウムブロミド。DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The meaning of the abbreviations is as follows: Fmoc: 9-fluorenylmethoxycarbonyl; Trt: triphenylmethyl; Thr-ol: threoninaol; Phe: phenylalanine; Cys: Cysteine; Thr: threonine; Lys: lysine; Trp: tryptophan; DβNal: D-β- (2-naphthyl) alanine; TFA: trifluoroacetic acid; DMF: N, N-dimethylformamide; THF: tetrahydrofuran; (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate; DMAP: 4-dimethylaminopyridine; ACN: acetonitrile; DCM: dichloromethane; TIS: triisopropylsilane; PEG: polyethylene glycol; DOPE: dioleoyl phosphatidyl Noruamin; MTT: 3- [4,5- dimethylthiazol-2-yl] -2,5-Jifenirute tiger tetrazolium bromide.

【０００９】抗がん剤の活性が十分に保持された、安定
な結合体を形成するには、グルタル酸のようなジカルボ
ン酸スペーサーを使用することによって達成される。ス
ペーサーの一方のカルボキシル基は、抗がん剤のヒドロ
キシ基（例えばパクリタキセルの２’−ＯＨ基）とエス
テル結合を形成し、他方のカルボキシル基は、ペプチド
担体（例えばソマスタチン類縁体）の適宜のアミノ基と
カルボンアミド基を形成する。遊離のＮ−末端アミノ基
を有するすべてのソマトスタチン類縁体がスペーサーを
介して抗がん剤などと結合させるために使用されてよい
が、特に好ましいペプチド担体はソマトスタチン類縁体
であるオクトレオチド、ランレオチド及びバプレオチド
であって、これはそれらがそれぞれヒトソマトスタチン
受容体サブタイプ２、５及び４に対して高い親和性を有
するからである。これら３つの好ましいソマトスタチン
類縁体の配列は、次のとおりである： オクトレオチド： D-Phe-c[Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cy
s]-Thr(ol) ランレオチド： DβNal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cy
s]-Thr-NH₂ バプレオチド： D-Phe-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]
-Trp-NH₂ [0009] The formation of a stable conjugate with sufficient activity of the anticancer agent is achieved by using a dicarboxylic acid spacer such as glutaric acid. One carboxyl group of the spacer forms an ester bond with a hydroxy group of the anticancer drug (for example, 2′-OH group of paclitaxel), and the other carboxyl group forms an appropriate amino group of the peptide carrier (for example, somasatin analog). Form a carboxamide group with the group. Although all somatostatin analogs having a free N-terminal amino group may be used to bind anticancer agents and the like via a spacer, particularly preferred peptide carriers are the somatostatin analogs octreotide, lanreotide and valeotide. Since they have high affinity for human somatostatin receptor subtypes 2, 5 and 4, respectively. The sequences of these three preferred somatostatin analogs are as follows: Octreotide: D-Phe-c [Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cy
s] -Thr (ol) Lanreotide: DβNal-c [Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cy
s] -Thr-NH ₂ vapleotide: D-Phe-c [Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]
-Trp-NH ₂

【００１０】本発明の目的のために使用されるソマトス
タチン類縁体は、当該技術分野で公知の技術を用いて合
成されたもの、天然界から抽出されたもの又は商業的供
給元（ペニンシュラ、ネオシステムス、シグマ及びＢＡ
ＳＦ）から得られたものであってよい。使用可能なソマ
トスタチン類縁体のリストは、例えばWeil,Muller and
Thorner編「Somatostatin」（1992）に記載されてお
り、その内容を本明細書の記載の一部とする。好ましく
は、ソマトスタチンペプチドは、常套の固相合成法を用
いて合成されたものである。The somatostatin analogs used for the purposes of the present invention may be synthesized using techniques known in the art, extracted from the natural world, or commercial sources (Peninsula, Neosystems). , Sigma and BA
SF). A list of available somatostatin analogs can be found, for example, in Weil, Muller and
Thorner, "Somatostatin" (1992), the contents of which are incorporated herein by reference. Preferably, the somatostatin peptide has been synthesized using conventional solid phase synthesis techniques.

【００１１】本発明に従って、所望の化合物Ｘをジカル
ボン酸スペーサーＲの２つのカルボキシル基の一方と結
合させ、ソマトスタチン類縁体を他方と結合させること
により、一般式： X-O-R-NH-R' [式中、Rは-C(O)-(CH2)n-C(O)-（ｎは０〜７）であり、
Ｒ’はソマトスタチンペプチドの残基である。］で表さ
れる成績体を得る。ソマトスタチン類縁体がN-末端にお
いて遊離のチオ基やカルボキシル基のような基を有する
アミノ酸誘導体で伸長される限り、式：NH₂-(CH₂)n-COO
H、NH₂-(PEG)-COOH、HOOC-(PEG)-COOH又はHOOC-X-マレ
イミドで示される化合物もまた、スペーサーとして使用
出来る。In accordance with the present invention, the desired compound X is linked to one of the two carboxyl groups of the dicarboxylic acid spacer R and the somatostatin analog is linked to the other to form a compound of the general formula: XOR-NH-R ' , R is -C (O)-(CH2) nC (O)-(n is 0-7);
R 'is the residue of the somatostatin peptide. ] Is obtained. As long as the somatostatin analog is extended with an amino acid derivative having a group such as a free thio or carboxyl group at the N-terminus, the formula: NH _2- (CH ₂ ) n -COO
Compounds represented by H, NH _2- (PEG) -COOH, HOOC- (PEG) -COOH or HOOC-X-maleimide can also be used as spacers.

【００１２】好ましい化合物Ｘは、式：Preferred compounds X have the formula:

【化３】 で表される抗がん剤パクリタキセルであるか、後記条件
下にリポソームを形成することが知られており、式：Embedded image Or is known to form a liposome under the conditions described below.

【化４】 で表されるPEG-DOPEである。Embedded image PEG-DOPE represented by

【００１３】上記した化合物に加え、スペーサーのカル
ボキシル基とエステル結合を形成することが出来る他の
化合物も、本発明の目的のために使用することが出来
る。In addition to the compounds described above, other compounds capable of forming an ester bond with the carboxyl group of the spacer can also be used for the purpose of the present invention.

【００１４】パクリタキセルは、商業的供給元（例えば
ブリストル-マイヤーズ-スクイブ）から、天然資源の精
製により或いは当該技術分野で公知の技術で合成して、
得ることができる。PEGやDOPEも一般に入手可能であ
る。Paclitaxel may be synthesized from commercial sources (eg, Bristol-Myers-Squibb) by purification of natural resources or by techniques known in the art.
Obtainable. PEG and DOPE are also generally available.

【００１５】スペーサーを介して、薬剤とソマトスタチ
ンの結合体を形成させてから、その生物学的活性を細胞
培養法により試験する。After the conjugate of the drug and somatostatin is formed via the spacer, its biological activity is tested by cell culture.

【００１６】第２図は、オクトレオチドがMCF-7細胞に
対すして特異的に結合するが、CHO細胞に対しては結合
しないことを示す、蛍光顕微鏡写真図である。パネルＡ
とＣ及びパネルＥとＧは、それぞれMCF-7細胞及びCHO細
胞の形態を示す。パネルＡ、Ｃ、Ｅ及びＧにそれぞれ対
応するパネルＢ、Ｄ、Ｆ及びＨは、MCF-7細胞及びCHO細
胞に結合するフルオレセイン標識化オクトレオチドを示
す。MCF-7細胞とCHO細胞を、フルオレセイン標識化オク
トレオチド１００μｇと共に、緩衝液１ｍｌ中、４℃で
３０分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄
し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、蛍光顕微鏡で
観察する。パネルＢとＦに示すように、オクトレオチド
はMCF-7細胞には結合するが（パネルB)、CHO細胞には結
合しない（パネルF）。ＭＣＦ−７細胞に結合したオク
トレオチドは、過剰の非標識化オクトレオチドの存在下
に消失し、標識化オクトレオチドと競合する（パネル
D）。オクトレオチドは、CHO細胞が高濃度の標識化オク
トレオチドを与えられた場合でも、CHO細胞に結合しな
い。FIG. 2 is a fluorescence micrograph showing that octreotide specifically binds to MCF-7 cells but does not bind to CHO cells. Panel A
And C and panels E and G show the morphology of MCF-7 cells and CHO cells, respectively. Panels B, D, F and H, corresponding to panels A, C, E and G, respectively, show fluorescein-labeled octreotide binding to MCF-7 cells and CHO cells. MCF-7 cells and CHO cells are incubated with 100 μg of fluorescein-labeled octreotide in 1 ml of buffer at 4 ° C. for 30 minutes, then the cells are washed with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde, and observed with a fluorescence microscope. . As shown in Panels B and F, octreotide binds to MCF-7 cells (Panel B) but does not bind to CHO cells (Panel F). Octreotide bound to MCF-7 cells is lost in the presence of excess unlabeled octreotide and competes with labeled octreotide (panel
D). Octreotide does not bind to CHO cells, even when the CHO cells are given a high concentration of labeled octreotide.

【００１７】第３図は、MCF-7細胞に結合した標識化オ
クトレオチドが、標識化オクトレオチド１００μｇ／ｍ
ｌと３７℃で１時間インキュベートした後において、ソ
マトスタチン受容体-介在エンドサイトーシスを経て、M
CF-7サイトゾル中に内在化したことを示すものである。FIG. 3 shows that labeled octreotide bound to MCF-7 cells was 100 μg / m of labeled octreotide.
After incubation for 1 hour at 37 ° C. with M1 via M-mediated somatostatin receptor-mediated endocytosis
This indicates that it was internalized in the CF-7 cytosol.

【００１８】第４図において、オクトレオチド結合パク
リタキセルは、細胞の微小管形成の破壊を通して、非結
合パクリタキセルと同等の抗がん活性を示している。パ
ネルＡは、MCF-7細胞が１０−６パクリタキセルの不存
在下（Ａ１）又は存在下（Ａ２）において若しくはオク
トレオチド結合パクリタキセルの存在下（Ａ３）におい
て、当該細胞内におけるチューブリンの破壊を示してい
る。Bar=20μｍ。ＢとＣは、自滅的（apoptotic）細胞
におけるクロマチン縮合を示すものであって、自滅的MC
F-7細胞の超微細構造の透過型電子顕微鏡写真図（Ｂ；
Ｘ７，５００；bar=500nm)又は核をヘキスト３３２５８
で染色した、蛍光顕微鏡写真図（Ｃ；bar=10μｍ）であ
る；なお、MCF-7細胞は、１０−６パクリタキセルで処
理しなかった場合（B1とC1）又は処理した場合（B2とC
2）若しくはオクトレオチド-結合パクリタキセル（B3と
C3）で１日間処理した場合である。In FIG. 4, octreotide-bound paclitaxel has shown the same anticancer activity as unbound paclitaxel through disruption of cell microtubule formation. Panel A shows the destruction of tubulin in MCF-7 cells in the absence (A1) or presence (A2) of 10-6 paclitaxel or in the presence of octreotide-bound paclitaxel (A3). I have. Bar = 20 μm. B and C show chromatin condensation in apoptotic cells and show suicide MC.
Transmission electron micrograph of ultrastructure of F-7 cells (B;
X7,500; bar = 500 nm) or Hoechst 33258
(C; bar = 10 μm); MCF-7 cells were not treated with 10-6 paclitaxel (B1 and C1) or treated (B2 and C1).
2) or octreotide-linked paclitaxel (with B3
This is the case where the treatment was performed for one day in C3).

【００１９】第５図は、オクトレオチド結合パクリタキ
セルの細胞特異性を示すものであって、パネルA1とB1は
それぞれ未処理MCF-7細胞とCHO細胞の場合であり、パネ
ルA2とB2はそれぞれパクリタキセル（10-5Ｍ）で１日間
処理したMCF-7細胞とCHO細胞の場合であり、パネルA3と
B3はそれぞれオクトレオチド結合パクリタキセル(10-5
M)で１日間処理したMCF-7細胞とCHO細胞の場合である。
MCF-7細胞やCHO細胞の死をもたらす遊離のパクリタキセ
ルとは異なり、オクトレオチド結合パクリタキセルは、
MCF-7細胞の死のみをもたらし、パネルA3とB3に示され
るように、CHO細胞の死をもたらさない。細胞死は、矢
印によって示される；bar=20μm。FIG. 5 shows the cell specificity of octreotide-bound paclitaxel, wherein panels A1 and B1 are for untreated MCF-7 cells and CHO cells, respectively, and panels A2 and B2 are for paclitaxel ( 10-5M) for 1 day with MCF-7 cells and CHO cells.
B3 is octreotide-bound paclitaxel (10-5
M) for 1 day with MCF-7 cells and CHO cells.
Unlike free paclitaxel, which causes the death of MCF-7 cells and CHO cells, octreotide-bound paclitaxel is
Only results in death of MCF-7 cells and not CHO cells, as shown in panels A3 and B3. Cell death is indicated by the arrow; bar = 20 μm.

【００２０】本発明の新規ソマトスタチン結合化合物
は、当該化合物と医薬的に許容される担体を含む組成物
の状態で、がん患者に対して投与することによる、がん
疾患処置剤として使用されてよい。The novel somatostatin-binding compound of the present invention is used as a therapeutic agent for cancer diseases by administering it to a cancer patient in a composition containing the compound and a pharmaceutically acceptable carrier. Good.

【００２１】本発明の実施態様を更に以下の実施例で説
明するが、本発明の範囲はこの実施例によって制限を受
けるものではない。The embodiments of the present invention will be further described in the following examples, but the scope of the present invention is not limited by these examples.

【００２２】実施例１ パクリタキセル−グルタリル−オクトレオチドの合成 パクリタキセル（０．４３ｇ；０．５ｍｍｏｌ）とグル
タール酸無水物（０．８６ｇ；６ｍｍｏｌ）をピリジン
５ｍｌに溶かし、室温で３時間攪拌した。反応終了時、
減圧で蒸発乾固させた。残渣を水２０ｍｌで２０分間攪
拌下に処理し、ろ過した。沈澱物をアセトンに再溶解
し、水をパクリタキセル−グルタレートの微結晶（０．
４２ｇ；８６％収率）を得た。分析の結果、ＥＳＭによ
り、［Ｍ＋Ｈ］⁺ｍ／ｚ＝９６８Ｄａを与えた。パクリ
タキセル−グルタレート複合体は、次の構造を有してい
る：Example 1 Synthesis of paclitaxel-glutaryl-octreotide Paclitaxel (0.43 g; 0.5 mmol) and glutaric anhydride (0.86 g; 6 mmol) were dissolved in 5 ml of pyridine and stirred at room temperature for 3 hours. At the end of the reaction,
Evaporate to dryness under reduced pressure. The residue was treated with 20 ml of water with stirring for 20 minutes and filtered. The precipitate was redissolved in acetone and water was added to the microcrystals of paclitaxel-glutarate (0.
42 g; 86% yield). As a result of analysis, ESM gave [M + H] ⁺ m / z = 968 Da. Paclitaxel-glutarate conjugate has the following structure:

【化５】 Embedded image

【００２３】オクトレオチドの配列は、Fmocを使用する
固相法により合成され、次ぎの集合体鎖を有するもので
ある：NH₂-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Mtt)-Thr-Cy
s(Trt)-Thr-ol-アセタール-サイバーアミドレジン
（０．１ｍｍｏｌ）．HBTUによって活性化されたパクリ
タキセル-グルタレートの４モル等量を第９アミノ酸誘
導体として加え、オクトレオチドとカップリングさせ
た。反応の終点は、N−末端において減少した遊離アミ
ノ基を測定するニンヒドリン反応を用いてモニターし
た。The octreotide sequence is synthesized by the solid phase method using Fmoc and has the following aggregated chain: NH ₂ -D-Phe-Cys (Trt) -Phe-D-Trp-Lys ( Mtt) -Thr-Cy
s (Trt) -Thr-ol-acetal-cyber amide resin (0.1 mmol). Four molar equivalents of paclitaxel-glutarate activated by HBTU were added as a ninth amino acid derivative and coupled with octreotide. The end of the reaction was monitored using a ninhydrin reaction which measures reduced free amino groups at the N-terminus.

【００２４】アミド樹脂からのペプチド結合体の開裂
は、1%TFA/5%TIS/DCMを使用して行なわれた。開裂した
化合物は、15%ピリジン／メタノールで中和し、pH7.5の
緩衝液で希釈してジスルフィド形成を完了させ、凍結乾
燥して粗製物135mgを得た。これを、更に、プレパラテ
イブカラムとACN/H₂O溶出系を使用するHPLCによって、
精製することが出来る。分析の結果、ESMにより、［Ｍ
＋Ｈ］⁺ｍ／ｚ＝１９６９Ｄａを与えた。当該成績体
は、次の構造を有している：Cleavage of the peptide conjugate from the amide resin was performed using 1% TFA / 5% TIS / DCM. The cleaved compound was neutralized with 15% pyridine / methanol, diluted with pH 7.5 buffer to complete disulfide formation, and lyophilized to give 135 mg crude. This was further purified by HPLC using a preparative column and an ACN / H ₂ O elution system.
It can be purified. As a result of the analysis, [SM
+ H] ⁺ m / z = 1969 Da. The grade has the following structure:

【化６】 Embedded image

【００２５】実施例２ フルオレセイン-オクトレオチドの合成 ５−カルボキシ−フルオレセイン（０．４ｍｍｏｌ）の
４モル等量を、アミノ酸誘導体として、Ｆｍｏｃ Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙを用いるペプチド合成機で合成するNH₂-
β-Ala-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Mtt)-Thr-Cys(T
rt)-Thr-ol-アセタール-サイバーアミドレジン（０．１
ｍｍｏｌ）の集合体鎖にカップリングさせる。アミド樹
脂からのペプチド結合体の開裂は、９５%TFA/5%TISを使
用して行なわれた。減圧下TFAを蒸発させた後、氷冷乾
燥エーテルを加えて、ペプチドを沈澱させた。沈澱物を
ろ取し、燒結ガラスロート上で冷エーテルで洗浄し、２
０％酢酸溶液で抽出した。ペプチド成績体を５％酢酸ア
ンモニウム溶液で約１ｍMに希釈し、ｐHを水酸化アンモ
ニウム（２５％）で７．５に調節し、ジスルフィド形成
を行った。試料を凍結乾燥して、粉末にした。分析の結
果、ESMにより、［Ｍ＋Ｈ］⁺ｍ／ｚ＝１４４８Ｄａを与
えた。Example 2 Synthesis of fluorescein-octreotide 4 mole equivalents of 5-carboxy-fluorescein (0.4 mmol) were used as amino acid derivatives as Fmoc Ch
NH _2- synthesized with a peptide synthesizer using chemistry
β-Ala-D-Phe-Cys (Trt) -Phe-D-Trp-Lys (Mtt) -Thr-Cys (T
rt) -Thr-ol-acetal-cyberamide resin (0.1
(mmol). Cleavage of the peptide conjugate from the amide resin was performed using 95% TFA / 5% TIS. After evaporating TFA under reduced pressure, the peptide was precipitated by adding ice-cold dry ether. The precipitate is collected by filtration, washed with cold ether on a sintered glass funnel,
Extracted with 0% acetic acid solution. The peptide product was diluted to about 1 mM with a 5% ammonium acetate solution, the pH was adjusted to 7.5 with ammonium hydroxide (25%), and disulfide formation was performed. The sample was lyophilized to a powder. As a result of analysis, ESM gave [M + H] ⁺ m / z = 1448 Da.

【００２６】実施例３ DOPE-PEG-オクトレオチドの合成 PEG（1g、0.5mmol）とコハク酸無水物（0.1ｇ、1mmol）
を、DMAPの添加により、THFに溶解させた。この溶液を
還流下、５０℃に６時間攪拌した。反応終了後、溶液を
減圧下に蒸発させて、ジサクシニル-PEGを得、これをシ
リカゲル上の残渣のフラッシュクロマトグラフィーによ
り精製した。４モル当量のジサクシニル-PEG（０．４ｍ
ｍｏｌ）と４モル当量のDOPE（０．４ｍｍｏｌ）を、NH
₂-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Mtt)-Thr-Cys(Trt)-T
hr-ol-アセタール-サイバーアミドレジン集合体（０．
１ｍｍｏｌ）に対して第９及び第１０のアミノ酸誘導体
として、順次カップリングさせた。アミド樹脂からのペ
プチド結合体の開裂は、１%TFA/5%TIS/DSMを使用して行
なわれた。開裂した化合物は、15%ピリジン／メタノー
ルで中和し、pH7.5の緩衝液で希釈してジスルフィド形
成を完了させ、凍結乾燥して、次ぎの構造を有する粗製
物を得た：Example 3 Synthesis of DOPE-PEG-octreotide PEG (1 g, 0.5 mmol) and succinic anhydride (0.1 g, 1 mmol)
Was dissolved in THF by addition of DMAP. This solution was stirred at 50 ° C. for 6 hours under reflux. After the reaction was completed, the solution was evaporated under reduced pressure to obtain disuccinyl-PEG, which was purified by flash chromatography of the residue on silica gel. 4 molar equivalents of disuccinyl-PEG (0.4 m
mol) and 4 molar equivalents of DOPE (0.4 mmol)
₂ -D-Phe-Cys (Trt) -Phe-D-Trp-Lys (Mtt) -Thr-Cys (Trt) -T
hr-ol-acetal-cyberamide resin aggregate (0.
1 mmol) as ninth and tenth amino acid derivatives. Cleavage of the peptide conjugate from the amide resin was performed using 1% TFA / 5% TIS / DSM. The cleaved compound was neutralized with 15% pyridine / methanol, diluted with pH 7.5 buffer to complete disulfide formation, and lyophilized to give a crude having the following structure:

【化７】 このものをリポソームの調製に使用した。Embedded image This was used for the preparation of liposomes.

【００２７】実施例４ リポソーム製剤 リポソームを、脂質／界面活性剤混合ミセルによって調
製し、調節された透析に付した。ジステアロイルホスフ
ァチジルコリン(DSPC)/コレステロール/DOPE-PEG-オク
トレオチド（モル比１０：１：１）の１０ｍｌクロロホ
ルム／エタノール（容量比２：１）溶液を、コール酸ナ
トリウム（脂質／コール酸塩モル比０．６）と混合し、
丸底フラスコ中、減圧下、５５℃で蒸発乾固させた。残
った薄膜を、１０ｍMリン酸塩緩衝液ｐH7.4（５ｍｌ）
に分散させ、イオン強度０．１６に調節した。混合ミセ
ルが自然に形成された。短時間平衡化させた後、混合ミ
セル溶液を１０，０００分子量カットオフのセルロース
デイスク膜を使用するミニ-リポプレップ(MINI-LIPOPRE
P)(Sialomed，Inc., USA)により６０℃で２４時間透析
した。このようにして調製したリポソームを直接アッセ
イに使用した。Example 4 Liposomal Formulation Liposomes were prepared by mixed lipid / surfactant micelles and subjected to controlled dialysis. A solution of distearoylphosphatidylcholine (DSPC) / cholesterol / DOPE-PEG-octreotide (molar ratio 10: 1: 1) in 10 ml chloroform / ethanol (volume ratio 2: 1) was added to sodium cholate (lipid / cholate molar ratio 0). .6) and
Evaporate to dryness at 55 ° C. under reduced pressure in a round bottom flask. The remaining thin film was washed with 10 mM phosphate buffer, pH 7.4 (5 ml).
And the ionic strength was adjusted to 0.16. Mixed micelles formed spontaneously. After brief equilibration, the mixed micellar solution was converted to MINI-LIPOPRE using a 10,000 molecular weight cut-off cellulose disk membrane.
P) (Sialomed, Inc., USA) for 24 hours at 60 ° C. The liposomes thus prepared were used directly in the assay.

【００２８】リポソームにカプセル化した抗がん剤の場
合、ドキソルビシンを、水和の際に、１．５５ｍＭ硫酸
アンモニウム溶液中ＰＬ／ドキソルビシン＝１０／１
(ｗ／ｗ)の割合で、丸底フラスコ中の乾燥薄脂質膜(thi
n lipid film)に加え、２４時間６０℃でインキュベー
ションした。カプセル化リポソームおよび遊離ドキソル
ビシンを、１２３ｍＭクエン酸ナトリウム(ｐＨ＝５．
５)で平衡化したＴＳＫＨＷ４０ゲルカラムで分離し
た。カプセル化ドキソルビシンの濃度を分光測光法によ
り測定した(波長＝４９０ｎｍ)。In the case of an anticancer agent encapsulated in liposomes, doxorubicin was replaced with PL / doxorubicin in a 1.55 mM ammonium sulfate solution at the time of hydration at a ratio of 10/1.
(w / w), dry thin lipid membrane (thi
n lipid film) and incubated at 60 ° C. for 24 hours. Encapsulated liposomes and free doxorubicin were treated with 123 mM sodium citrate (pH = 5.
Separation was carried out using a TSKHW40 gel column equilibrated in 5). The concentration of encapsulated doxorubicin was measured by spectrophotometry (wavelength = 490 nm).

【００２９】本発明は、実施例として挙げられた上記実
施の態様によって限定されるものではなく、特許請求の
範囲によって定義される保護範囲内で種々変化させるこ
とが出来る。The present invention is not limited to the above-described embodiments, but can be variously changed within the protection scope defined by the claims.

【００３０】[0030]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> ACADEMIA SINICA <120> A Novel Anti-cancer Drug Delivery System <130> 172394 <140> <141> <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <220> <223> Xaa=Thr(ol) <400> 1 Phe Cys Phe Trp Lys Thr Cys Xaa 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <220> <223> Xaa=beta-(2-naphthyl)alanine <400> 2 Xaa Cys Tyr Trp Lys Val Cys Thr 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <400> 3 Phe Cys Tyr Trp Lys Val Cys Trp 1 5[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> ACADEMIA SINICA <120> A Novel Anti-cancer Drug Delivery System <130> 172394 <140> <141> <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <220> <223> Xaa = Thr (ol) <400> 1 Phe Cys Phe Trp Lys Thr Cys Xaa 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <220> <223> Xaa = beta- (2-naphthyl) alanine <400> 2 Xaa Cys Tyr Trp Lys Val Cys Thr 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <400> 3 Phe Cys Tyr Trp Lys Val Cys Trp 1 5

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 第１図は、ソマトスタチン類縁体結合体を形
成する一般的な図式と、３つの好ましいソマトスタチン
類縁体の配列を示す。FIG. 1 shows the general scheme for forming somatostatin analog conjugates and the sequences of three preferred somatostatin analogs.

【図２】 第２図は、MCF-7及びCHO細胞をフルオレセイ
ン-オクトレオチドと共に４℃で３０分間インキュベー
トした後の蛍光顕微鏡写真図である；標識はMCF-7細胞
表面（Ｂ）に限定 されており（Ｂ）、MCF-7細胞を過剰量（１，０００
倍）の非蛍光オクトレオチドの存在下にインキュベート
すると消失する（Ｄ）。CHO細胞の間では、標識は認め
られず（Ｆ）、これらの細胞を高濃度（５００μg/ml)
のフルオレセイン-オクトレオチドと共にインキュベー
トしても変化はなかった（Ｈ）。細胞の形態は、Ａ、
Ｃ、ＥおよびＧに示されている；Bar=20μｍ。FIG. 2 is a fluorescence micrograph of MCF-7 and CHO cells after incubation with fluorescein-octreotide for 30 minutes at 4 ° C .; labeling is restricted to the MCF-7 cell surface (B). Cage (B), excess MCF-7 cells (1,000
X) disappears when incubated in the presence of non-fluorescent octreotide (D). No labeling was observed among the CHO cells (F), and these cells were in high concentrations (500 μg / ml).
No change was observed when incubated with fluorescein-octreotide at room temperature (H). Cell morphology is A,
Indicated in C, E and G; Bar = 20 μm.

【図３】 第３図は、MCF-7細胞によるフルオレセイン-
オクトレオチドの内在化を示す；Bar=5 μｍ。FIG. 3 shows fluorescein-mediated expression of MCF-7 cells.
Indicates octreotide internalization; Bar = 5 μm.

【図４】 第４図は、オクトレオチド-結合タキソール
がタキソールの細胞融合を実質的に保持することを示
す。FIG. 4 shows that octreotide-linked taxol substantially retains cell fusion of taxol.

【図５】 第５図は、オクトレオチド-結合パクリタキ
セルがMCF-7細胞に対して特異的であることを示す。FIG. 5 shows that octreotide-bound paclitaxel is specific for MCF-7 cells.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｂ０１Ｊ 13/02 Ｂ０１Ｊ 13/02 Ｚ (72)発明者 イン−タ・ウ 台湾732タイナン、パイ−ホ、シン−チ・ ストリート26番 (72)発明者 チュン−ミン・フアン 台湾807カオション、サン−ミン・ディス トリクト、タイ−カン・ストリート34番 Ｆターム(参考） 4C076 AA19 CC27 CC41 DD15H DD63H DD70L FF63 FF67 FF68 4C084 AA07 BA31 BA32 BA33 BA44 DB11 MA24 NA03 NA06 NA10 NA13 ZB262 4G005 AA07 AB21 BA20 BB11 DB22X DB22Y DC26X DC26Y DC43X DC43Y DC56Y DC56Z DC70X DC70Y EA03 4H045 AA10 BA15 BA32 BA51 EA28 FA34 FA51 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) B01J 13/02 B01J 13/02 Z (72) Inventor Inta W Taiwan 732 Tainan, Pai-ho, Sinchi Street No. 26 (72) Inventor Chun-Min Huang Taiwan 807 Chao Chong, San-Min District, Thai-Kan Street No. 34 F-term (reference) 4C076 AA19 CC27 CC41 DD15H DD63H DD70L FF63 FF67 FF68 4C084 AA07 BA31 BA32 BA33 BA44 DB11 MA24 NA03 NA06 NA10 NA13 ZB262 4G005 AA07 AB21 BA20 BB11 DB22X DB22Y DC26X DC26Y DC43X DC43Y DC56Y DC56Z DC70X DC70Y EA03 4H045 AA10 BA15 BA32 BA51 EA28 FA34 FA51

Claims (8)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 式： 【化１】 ［式中、Rは-C(O)-(CH₂)_n-C(O)-（ただし、ｎは０〜
７）、R'はソマトスタチン類縁体ペプチドの残基。]で
示される化合物。1. The formula: embedded image [Wherein, R represents -C (O)-(CH ₂ ) _n -C (O)-(where n is 0 to
7), R 'is a residue of a somatostatin analog peptide. ] The compound shown by these. 【請求項２】 ソマトスタチン類縁体ペプチドがオクト
レオチド（SEQ ID NO:1)、ランレオチド(SEQ ID NO:2)
およびバプレオチド(SEQ ID NO:3)から選択されたもの
である、請求項１記載の化合物。2. The somatostatin analog peptide is octreotide (SEQ ID NO: 1) or lanreotide (SEQ ID NO: 2).
The compound according to claim 1, wherein the compound is selected from and vapleotide (SEQ ID NO: 3). 【請求項３】 Rが-C(O)-(CH₂)₂-C(O)-である、請求項
１又は２記載の化合物。3. The compound according to claim 1, wherein R is —C (O) — (CH ₂ ) ₂ —C (O) —. 【請求項４】 式： [式中、Rは-C(O)-(CH₂)_n-C(O)-（ただし、ｎは０〜
７）、mは22-220、R'はソマトスタチン類縁体ペプチド
の残基、およびR''は または である。］で示される化合物。4. The formula: [Wherein, R represents -C (O)-(CH ₂ ) _n -C (O)-(where n is 0 to
7), m is 22-220, R ′ is the residue of the somatostatin analog peptide, and R ″ is Or It is. ] The compound shown by these. 【請求項５】 式： 【化２】 ［式中、Rは-C(O)-(CH₂)_n-C(O)-（ただし、ｎは０〜
７）、R'はソマトスタチン類縁体ペプチドの残基。]で
示される化合物。5. The formula: embedded image [Wherein, R represents -C (O)-(CH ₂ ) _n -C (O)-(where n is 0 to
7), R 'is a residue of a somatostatin analog peptide. ] The compound shown by these. 【請求項６】 ソマトスタチン類縁体ペプチドがオクト
レオチド（SEQ ID NO:1)、ランレオチド(SEQ ID NO:2)
およびバプレオチド(SEQ ID NO:3)から選択されたもの
である、請求項５記載の化合物。6. The somatostatin analog peptide is octreotide (SEQ ID NO: 1) or lanreotide (SEQ ID NO: 2).
6. The compound according to claim 5, wherein the compound is selected from and bapleotide (SEQ ID NO: 3). 【請求項７】 Rが-C(O)-(CH₂)₂-C(O)-である、請求項
５又は６記載の化合物。7. The compound according to claim 5, wherein R is —C (O) — (CH ₂ ) ₂ —C (O) —. 【請求項８】 請求項５〜７のいずれかに記載の化合物
を含有する、リポソーム。8. A liposome containing the compound according to claim 5.