JP2002037790A - Indocarbazostatin b - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new physiologically active substance which inhibits the extension of neurite induced with NGF. SOLUTION: This physiologically active substance, indocarbazostatin B has the following structure.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明が属する技術分野】本発明は、新規な生理活性を
有するインドカルバゾスタチンＢに関する。[0001] The present invention relates to indocarbazostatin B having a novel physiological activity.

【０００２】[0002]

【従来の技術】本発明のインドカルバゾスタチンＢに関
する報告はない。2. Description of the Related Art There is no report on indocarbazostatin B of the present invention.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＮＧ
Ｆ(Nerve Growth Factor)により誘導される神経突起伸
展を阻害する新規生理活性物質を提供することである。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide an NG
An object of the present invention is to provide a novel bioactive substance that inhibits neurite outgrowth induced by F (Nerve Growth Factor).

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】本発明者は、ＮＧＦによ
り誘導される神経突起伸展を阻害する新規生理活性物質
の探索を目的として多数の土壌微生物を培養し、その産
生する生理活性物質を分離探索し、ストレプトミセス属
に属する微生物の培養液及び培養菌体に文献未載の新規
生理活性物質インドカルバゾスタチンＢが産生、蓄積さ
れることを見い出し、本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventor has cultivated a large number of soil microorganisms and separated the physiologically active substance produced therefrom for the purpose of searching for a novel physiologically active substance that inhibits neurite outgrowth induced by NGF. The present inventors have searched and found that a novel physiologically active substance indocarbazostatin B, which has not been described in any literature, is produced and accumulated in a culture solution and a cultured cell of a microorganism belonging to the genus Streptomyces, thereby completing the present invention.

【０００５】すなわち、本発明は式（１）That is, the present invention provides the following formula (1)

【０００６】[0006]

【化２】 Embedded image

【０００７】で表される生理活性物質インドカルバゾス
タチンＢである。Is a physiologically active substance indocarbazostatin B.

【０００８】本発明において用いる微生物は、生理活性
物質インドカルバゾスタチンＢの生産能を有するもので
あり、ストレプトミセス属に属する菌種である。その一
例として、ストレプトミセス・エスピーTA-0403株（Str
eptomyces sp. TA-0403株（以下”TA-0403株”という）
と呼称される微生物は上記の特性を有し、本発明の生理
活性物質インドカルバゾスタチンＢを有利に生産するも
のであり、本発明方法に有効に利用し得るものである。[0008] The microorganism used in the present invention has the ability to produce the physiologically active substance indocarbazostatin B, and is a strain belonging to the genus Streptomyces. One example is Streptomyces sp. TA-0403 strain ( Str.
eptomyces sp. TA-0403 strain (hereinafter referred to as “TA-0403 strain”)
Microorganisms having the above-mentioned properties and advantageously producing the physiologically active substance indocarbazostatin B of the present invention can be effectively used in the method of the present invention.

【０００９】また、上記TA-0403株の自然的及び人工的
変異株は勿論、ストレプトミセス属に属する菌種で後述
の生理活性物質インドカルバゾスタチンＢの生産能を有
する微生物はすべて本発明方法において使用することが
できる。In addition, naturally occurring and artificial mutants of the above-mentioned TA-0403 strain, as well as microorganisms belonging to the genus Streptomyces and having the ability to produce the physiologically active substance indocarbazostatin B described below are all used in the method of the present invention. Can be used.

【００１０】TA-0403株は、高知県安芸郡で採取された
土壌中より発見された土壌放線菌であり、微生物の名称
「Streptomyces sp. TA-0403」及び微生物寄託番号「FE
RM P-17190」として工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されている。[0010] The TA-0403 strain is a soil actinomycete found in soil collected in Aki-gun, Kochi Prefecture, and has a microorganism name of “ Streptomyces sp. TA-0403” and a microorganism deposit number of “FE”.
RM P-17190 "has been deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.

【００１１】[0011]

【発明の実施の形態】この菌株の菌学的性状を以下に示
す。 ＜形態＞TA-0403株は菌株同定試験用寒天培地上で、基
生菌糸はよく生育し分岐しているが、分断は見られな
い。気菌糸の形成及び胞子の形成は、スターチ・無機塩
寒天培地で良好であるが、その他の培地では弱いもしく
は見られない。寒天培地中の胞子形成は認められない。
気菌糸より単純分岐した螺旋状の分節胞子の連鎖（２０
〜４０胞子又はそれ以上）を形成する。胞子の形はほぼ
球形もしくは卵形で、長さが０．８〜１．２μｍ、幅が
０．７〜０．８μｍ、表面は棘状である。胞子嚢や菌核
の形成及び胞子の運動性は認められない。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The bacteriological properties of this strain are shown below. <Morphology> On the agar medium for the strain identification test, the base mycelia of the TA-0403 strain grow well and diverge, but no fragmentation is observed. The formation of aerial mycelium and the formation of spores are good on a starch / inorganic salt agar medium, but weak or absent on other mediums. No sporulation is observed in the agar medium.
A chain of spiral segmented spores that are simply branched from aerial hyphae (20
~ 40 spores or more). The spores are almost spherical or ovoid, 0.8-1.2 μm in length, 0.7-0.8 μm in width, and spicy on the surface. No sporangia or sclerotium formation or spore motility is observed.

【００１２】＜各種培地上における生育状態＞各種培地
上で、２８℃、１４日間培養した場合の肉眼的観察結果
を次の表１に示した。なお色の表示は日本規格協会、Ｊ
ＩＳ色名帳（１９８５年）の系統色名を引用した。<Growth state on various media> The following Table 1 shows the results of macroscopic observation when cultured on various media at 28 ° C. for 14 days. The colors are indicated by the Japan Standards Association, J
The system color names in the IS color name book (1985) were cited.

【００１３】[0013]

【表１】 [Table 1]

【００１４】＜炭素源の資化性＞ Ｌ−アラビノース：＋ Ｌ−ラムロース ：＋ Ｄ−キシロース ：± ラフィノース ：＋ Ｄ−グルコース ：＋ イノシトール ：＋ Ｄ−フラクトース：± Ｄ−マンニトール：＋ シュクロース ：＋ ＜その他の生理的性質＞生育温度試験は１週間、その他
は２８℃、２週間培養後に観察した。 生育温度範囲：１６〜４０℃、最適生育温度：３２〜
３６℃ ゼラチンの液化：陰性 脱脂乳の凝固：陰性 脱脂乳のペプトン化：陽性 メラニン様色素の生産：陰性 でんぷんの加水分解 ：陽性<Utilization of carbon source> L-arabinose: + L-lamulose: + D-xylose: ± raffinose: + D-glucose: + inositol: + D-fructose: ± D-mannitol: + sucrose: + <Other physiological properties> The growth temperature test was observed for 1 week, and the others were observed at 28 ° C after 2 weeks of culture. Growth temperature range: 16-40 ° C, optimal growth temperature: 32-
36 ℃ Liquefaction of gelatin: negative Coagulation of skim milk: negative Peptone conversion of skim milk: positive Production of melanin-like pigment: negative Hydrolysis of starch: positive

【００１５】＜化学分類学的性質＞ ジアミノピメリン酸の有無と光学異性型：ＬＬ型のジ
アミノピメリン酸が検出された。 メナキノン： ＭＫ−９（Ｈ８) が主成分として、ま
たＭＫ−９（Ｈ６）もわずかに検出された。<Chemotaxonomical Properties> Presence / absence of diaminopimelic acid and optical isomer: LL-type diaminopimelic acid was detected. Menaquinone: MK-9 (H8) was detected as the main component, and MK-9 (H6) was slightly detected.

【００１６】以上の性状からTA-0403株は、Streptomyce
s属に属する放線菌に分類することができるので、本菌
株を Streptomyces sp. TA-0403と命名した。From the above properties, the TA-0403 strain was obtained from Streptomyce
This strain was named Streptomyces sp. TA-0403 because it can be classified into actinomycetes belonging to the genus s .

【００１７】＜培養法及び精製法＞本発明の生理活性物
質インドカルバゾスタチンＢを得るに当っては、ストレ
プトミセス属に属する上記生理活性物質生産菌を、生理
活性物質を生産する通常の方法で培養することにより行
い得る。培養の形態は液体培養でも固体培養でもよく、
工業的に有利に培養するためには、前記生産菌の胞子懸
濁液又は培養液を培地に接種し、通気撹拌培養を行えば
よい。<Culture Method and Purification Method> In order to obtain the physiologically active substance indocarbazostatin B of the present invention, the above-mentioned physiologically active substance-producing bacterium belonging to the genus Streptomyces is produced by a usual method for producing a physiologically active substance. By culturing the cells. The form of culture may be liquid culture or solid culture,
For industrially advantageous cultivation, a spore suspension or a culture solution of the above-mentioned production bacterium may be inoculated into a medium, and aerated and agitated culture may be performed.

【００１８】培地の窒素源としては特に限定されること
はなく、微生物の培養に通常用いられる炭素源、窒素源
その他を培地中に含有させることができる。炭素源とし
ては、澱粉、デキストリン、グリセリン、グルコース、
シュクロース、ガラクトース、イノシトール、マンニト
ールなどが、また窒素源としては、ペプトン、大豆粉、
肉エキス、米ぬか、麩、尿素、コーンスティープリカ
ー、アンモニウム塩、硝酸塩、その他の有機または無機
の窒素化合物が用いられる。その他、無機塩類、たとえ
ば食塩、燐酸塩類、カリウム、カルシウム、亜鉛、マン
ガン、鉄等の金属塩類等を適宜に添加してもよく、必要
に応じて消泡剤として、動、植、鉱物油等を添加しても
よい。培養温度、培養時間等の培養条件は使用菌の発育
に適し、しかもインドカルバゾスタチンＢの生産が最高
となるような条件が選ばれる。たとえば、培地のpHは４
〜９、特に６〜７付近がよく、培養の適温は25〜35℃程
度がよい。しかし、これらの培養組成物、培地の水素イ
オン濃度、培養温度、撹拌条件などの培養条件は使用す
る菌株の種類や、外部の条件などに応じて好ましい結果
が得られるように適宜調節されるべきであることはいう
までもない。このようにして得られる培養物から、イン
ドカルバゾスタチンＢを得るには、代謝産物を採取する
のに通常用いられる手段を適宜に利用して採取し得る。
たとえば、インドカルバゾスタチンＢと不純物との溶解
度差を利用する手段、イオン結合力の差を利用する手
段、吸着親和力の差を利用する手段、分子量の差を利用
する手段のいずれも、それぞれ単独、又は、適宜組合わ
せて、あるいは反復して使用される。具体的には、イン
ドカルバゾスタチンＢの活性画分は、大部分がその培養
菌体に存在し、アセトン抽出後アセトンを留去して得ら
れる。培養液に活性が確認される場合は、これと合わ
せ、クロロホルム抽出、シリカゲルカラムクロマトグラ
フィー、逆相液体クロマトグラフィー、結晶化等を組合
せて精製すると純粋なインドカルバゾスタチンＢを得
る。The nitrogen source of the medium is not particularly limited, and a carbon source, a nitrogen source and the like usually used for culturing microorganisms can be contained in the medium. As a carbon source, starch, dextrin, glycerin, glucose,
Sucrose, galactose, inositol, mannitol and the like, and nitrogen sources include peptone, soy flour,
Meat extract, rice bran, fu, urea, corn steep liquor, ammonium salts, nitrates, and other organic or inorganic nitrogen compounds are used. In addition, inorganic salts such as salt, phosphates, metal salts such as potassium, calcium, zinc, manganese, iron and the like may be appropriately added. May be added. Culture conditions such as culture temperature and culture time are selected so as to be suitable for the growth of the bacterium to be used and to maximize the production of indocarbazostatin B. For example, the pH of the medium is 4
-9, especially around 6-7, and the optimal temperature for culture is preferably about 25-35 ° C. However, the culture conditions such as the culture composition, the hydrogen ion concentration of the medium, the culture temperature, and the stirring conditions should be appropriately adjusted so as to obtain preferable results depending on the type of the strain used and external conditions. Needless to say, In order to obtain indcarbazostatin B from the culture thus obtained, the metabolite may be collected by appropriately using a commonly used means.
For example, each of the means for utilizing the difference in solubility between indocarbazostatin B and an impurity, the means for utilizing the difference in ionic binding force, the means for utilizing the difference in adsorption affinity, and the means for utilizing the difference in molecular weight are each independently used. , Or in combination as appropriate or repeated. Specifically, the active fraction of indocarbazostatin B is mostly present in the cultured cells, and is obtained by extracting acetone and then distilling off acetone. When the activity is confirmed in the culture solution, it is combined with this and purified by a combination of chloroform extraction, silica gel column chromatography, reverse phase liquid chromatography, crystallization and the like to obtain pure indocarbazostatin B.

【００１９】＜インドカルバゾスタチンＢの理化学的性
質、生物学的性質＞ （１）形状：黄色粉末 （２）融点：192℃（255℃以上で分解） （３）分子式：C₂₈H₂₂N₄0₇ FAB・マススペクトル：m/z 527 (M+H)⁺ 高分解能FAB・マススペクトル：m/z 527.1587(C₂₈H₂₂N₄
0₇, Calcd.512.1598) （４）比旋光度：²⁵[α]_D -48.74(c 0.05, MeOH) （５）溶解性：アセトンに易溶 （６）核磁気共鳴スペクトル：¹ Ｈ−ＮＭＲ（400MHz、溶媒：重アセトン、標準：d₆-ac
etone、2.06ppm）：図１のとおり （７）赤外吸収スペクトル： 薄膜法：図２のとおり （８）紫外・可視スペクトル： λMeOHmax nm (logε) 236(4.36), 270(4.11), 292(4.
04), 327(4.04)：図３のとおり<Physicochemical and biological properties of indocarbazostatin B> (1) Shape: yellow powder (2) Melting point: 192 ° C (decomposed at 255 ° C or higher) (3) Molecular formula: C ₂₈ H ₂₂ N ₄ 0 ₇ FAB / mass spectrum: m / z 527 (M + H) ⁺ High-resolution FAB / mass spectrum: m / z 527.1587 (C ₂₈ H ₂₂ N ₄
( ₇ ) Calcd. 512.1598) (4) Specific rotation: ²⁵ [α] _D -48.74 (c 0.05, MeOH) (5) Solubility: easily soluble in acetone (6) Nuclear magnetic resonance spectrum: ¹ H-NMR ( 400 MHz, solvent: heavy acetone, standard: d ₆ -ac
etone, 2.06 ppm): as in FIG. 1 (7) Infrared absorption spectrum: as in thin film method: as in FIG. 2 (8) Ultraviolet / visible spectrum: λMeOHmax nm (logε) 236 (4.36), 270 (4.11), 292 ( Four.
04), 327 (4.04): As shown in FIG.

【００２０】（９）呈色反応：アニスアルデヒド試薬に
陽性 （１０）PC12細胞のNGFによる神経突起誘導の阻害活
性：10％FBS(Fetal Bovine Serum)、10％HS(Horse Seru
m)及び0.35％グルコースを含むDMEM(Dulbecco's Modifi
ed Eagle Medium)培地を用いて37℃、５％ＣＯ₂存在下
で培養したPC12細胞をトリプシン処理し、シャーレから
剥がして懸濁細胞とした。４℃、1000rpm、３分間遠心
分離を行った後、0.5x10⁴ cells/mlの濃度に調整し、コ
ラーゲンTypeIコート96ウェルマルチプレートに200μl
づつ分注し、検定プレートとした。１２時間後、10％ジ
メチルスルホキシドに溶かしたサンプル並びに２倍希釈
系列の濃度に調整したサンプルを上記検定プレートの各
ウェルに２μlづつ添加した。サンプル添加１２時間後
にNGFを10μl（最終濃度50nM）添加し、３〜７日培養
後、細胞の形態変化を光学顕微鏡下観察を行った。本化
合物は24nMで、PC12細胞のNGFによる神経突起誘導を阻
害した。(9) Color reaction: positive for anisaldehyde reagent (10) Inhibitory activity of PC12 cells on neurite induction by NGF: 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 10% HS (Horse Seru)
m) and DMEM containing 0.35% glucose (Dulbecco's Modifi
Using an ed Eagle Medium) medium, PC12 cells cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO ₂ were treated with trypsin, and detached from the petri dish to obtain suspension cells. After centrifugation at 4 ° C., 1000 rpm for 3 minutes, the concentration was adjusted to 0.5 × 10 ⁴ cells / ml, and 200 μl was placed in a collagen Type I-coated 96-well multiplate.
Each was dispensed one by one to obtain a test plate. Twelve hours later, 2 μl of a sample dissolved in 10% dimethyl sulfoxide and a sample adjusted to a concentration of a two-fold dilution series were added to each well of the assay plate. Twelve hours after the addition of the sample, 10 µl of NGF (final concentration: 50 nM) was added, and after culturing for 3 to 7 days, the morphological change of the cells was observed under an optical microscope. At 24 nM, this compound inhibited neurite induction by NGF in PC12 cells.

【００２１】以上、本発明の生理活性物質インドカルバ
ゾスタチンＢの理化学的性質及び生物学的性質を、既知
物質と比較し、新規物質であると結論した。本化合物
は、各種神経疾患治療薬あるいは細胞増殖にも影響を与
えることから、例えばタキソール等との併用による制癌
剤としての利用が期待される。As described above, the physicochemical and biological properties of the physiologically active substance indocarbazostatin B of the present invention were compared with known substances, and it was concluded that the substance was a novel substance. Since the present compound also affects various neurological diseases or cell proliferation, it is expected to be used as an anticancer agent in combination with, for example, taxol.

【００２２】[0022]

【実施例】以下に、本発明を実施例によって説明する。
500ml容積の円筒型フラスコにグルコース0.29％、可溶
性澱粉1.44％、ファーマメディア1.58％、 大豆粉0.79
％、コーンスティープリカー0.79％、酵母エキス0.32
％、食塩0.3％、硫酸マグネシウム0.05％、炭酸カルシ
ウム0.3％(pH7.0)の組成よりなる培地70ml（x1200本）
に、あらかじめグルコース0.5％、可溶性澱粉２％、NZ
Case 0.3％、酵母エキス0.3％、魚粉0.5％、炭酸カルシ
ウム0.2％（pH6.5）の組成よりなる培地に、TA-0403株
を接種して30℃、２日間、撹拌回転数200rpmにて、振盪
培養を行った培養液を、各フラスコ２mlづつ接種して同
様な培養条件にて３日間振盪培養を行った。The present invention will be described below with reference to examples.
0.29% glucose, 1.44% soluble starch, 1.58% pharma media, 0.79 soy flour in a 500ml cylindrical flask
%, Corn steep liquor 0.79%, yeast extract 0.32
%, Salt 0.3%, magnesium sulfate 0.05%, calcium carbonate 0.3% (pH7.0) composition 70ml (x1200)
In advance, 0.5% glucose, 2% soluble starch, NZ
Inoculate the TA-0403 strain into a medium consisting of Case 0.3%, yeast extract 0.3%, fishmeal 0.5%, calcium carbonate 0.2% (pH 6.5), and incubate at 30 ° C for 2 days with stirring at 200 rpm. The culture solution subjected to shaking culture was inoculated in 2 ml of each flask, and shaking culture was performed under the same culture conditions for 3 days.

【００２３】培養終了後、培養液を7500rpm、15分間遠
心分離し菌体と濾液に分けた。菌体はアセトンを用いて
抽出し、これを減圧濃縮してアセトンを留去し水溶液を
得た。得られた溶液をクロロホルムにて抽出し、減圧濃
縮し8.9gの粗抽出物を得た。シリカゲルカラムクロマト
グラフィー（担体：シリカゲル60N、カラムサイズ：８
Φｘ18cm、溶出液：ヘキサン：アセトン＝３：２）を行
い110mgの活性画分を得た。得られた活性画分を逆相HPL
C(マイティーシルRP-18, 65％MeOH）にて活性画分を分
取し、1.2mgの粗インドカルバゾスタチンＢを得た。こ
のものをアセトン−ベンゼン溶媒にて結晶化を行うこと
により純粋なインドカルバゾスタチンＢ0.92mgを得た。After completion of the culture, the culture was centrifuged at 7,500 rpm for 15 minutes to separate the cells from the cells and the filtrate. The cells were extracted with acetone, and the extract was concentrated under reduced pressure to remove the acetone and obtain an aqueous solution. The obtained solution was extracted with chloroform and concentrated under reduced pressure to obtain 8.9 g of a crude extract. Silica gel column chromatography (Carrier: Silica gel 60N, Column size: 8
Φ x 18 cm, eluent: hexane: acetone = 3: 2) to obtain 110 mg of an active fraction. The obtained active fraction is subjected to reverse phase HPL.
The active fraction was collected by C (Mightysil RP-18, 65% MeOH) to obtain 1.2 mg of crude indocarbazostatin B. This was crystallized with an acetone-benzene solvent to obtain 0.92 mg of pure indocarbazostatin B.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 重アセトン中、４００ＭＨｚで測定したイン
ドカルバゾスタチンＢの ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示
す。FIG. 1 shows the ¹ H-NMR spectrum of indocarbazostatin B measured in heavy acetone at 400 MHz.

【図２】 薄膜法で測定したインドカルバゾスタチンＢ
の赤外線吸収スペクトルを示す。FIG. 2 Indocarbazostatin B measured by the thin film method
2 shows an infrared absorption spectrum of the sample.

【図３】 メタノール中で測定したインドカルバゾスタ
チンＢの紫外・可視スペクトルを示す。FIG. 3 shows an ultraviolet-visible spectrum of indocarbazostatin B measured in methanol.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ Ｆターム(参考） 4B064 AE58 BA06 BC03 BE12 BH01 BH02 BH04 BH06 BH07 CA03 DA01 DA05 4B065 AA50X AC14 BA22 CA18 CA44 4C072 AA03 AA07 BB04 BB08 CC03 CC11 EE09 FF03 GG07 GG08 GG09 JJ01 UU01 4C086 AA02 AA03 CB22 NA14 ZA01 ZB21 ZB26 ZC75 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) // C12N 1/20 C12N 1/20 A C12P 17/18 C12P 17/18 C F term (Reference) 4B064 AE58 BA06 BC03 BE12 BH01 BH02 BH04 BH06 BH07 CA03 DA01 DA05 4B065 AA50X AC14 BA22 CA18 CA44 4C072 AA03 AA07 BB04 BB08 CC03 CC11 EE09 FF03 GG07 GG08 GG09 JJ01 UU01 4C086 AA02 ZA21 ZA22 ZA22 ZA22 CB22

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 下記の式で表される生理活性物質インド
カルバゾスタチンＢ 【化１】 （立体化学は相対立体配置を表す）1. A biologically active substance indocarbazostatin B represented by the following formula: (Stereochemistry indicates relative configuration)