JP2002000289A - ヌクレオシド−5’−燐酸エステルの製造法 - Google Patents
ヌクレオシド−5’−燐酸エステルの製造法Info
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Abstract
のヌクレオシドまたはその前駆体を原料として、酵素的
にヌクレオシド−5’−燐酸エステルを効率よく製造す
る方法を提供する。 【解決手段】 ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶
を、好ましくは比表面積が0.4m2/g以上となるよ
うに、物理的処理により粉砕し、粉砕したヌクレオシド
またはその前駆体の結晶を酵素触媒下で燐酸供与体と反
応させ、ヌクレオシドを燐酸化してヌクレオシド−5’
−燐酸エステルを生成せしめる。
Description
5’−燐酸エステルの製造法に関する。ヌクレオシド−
5’−燐酸エステルは、調味料、医薬並びにそれらの原
料等として有用である。
レオシド−5’−燐酸エステルを製造する方法として、
種々の方法が知られている。中でも、副産物が少なく、
かつ、効率のよいヌクレオシド−5’−燐酸エステルの
製造法として、酸性フォスファターゼをpH3.0〜5.5の条
件下でヌクレオシド並びにポリ燐酸(塩)、フェニル燐
酸(塩)及びカルバミル燐酸(塩)から成る群より選択
される燐酸供与体に作用させてヌクレオシド−5’−燐
酸エステルを製造する方法が開発されている(WO96/376
03、特開平10-201481)。また、これらの方法におい
て、好ましい酸性フォスファターゼとして、燐酸エステ
ル加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファターゼ
(WO96/37603)、あるいは、ヌクレオシドに対する親和
性が上昇し及び/又は温度安定性が向上した変異型フォ
スファターゼ(特開平10-201481)が提案されている。
は、基質(原料)として各種ヌクレオシドが利用可能で
あるが、難溶性のヌクレオシドを基質とする際、易溶性
のヌクレオシドに比べて反応収率が低下するという問題
があった。
り、ヌクレオシドまたはその前駆体、特に難溶性のヌク
レオシドまたはその前駆体を原料として、酵素的にヌク
レオシド−5’−燐酸エステルを効率よく製造する方法
を提供することを課題とする。
あっても、有機溶剤、硼酸あるいはジメチルスルホキシ
ドのような界面活性剤を反応系に添加することによっ
て、ヌクレオシド−5’−燐酸エステルの生成収率を向
上させることができる場合がある(WO96/37603、特開平
10-201481)。しかし、一般的に有機溶剤や界面活性剤
などにより酵素の失活が誘発される恐れがあり、好まし
くない場合も少なくないと考えられる。そこで本発明者
は、種々検討を行った結果、ヌクレオシド結晶を微細化
することによって、反応系へのヌクレオシドの供給速度
を向上させることができ、ヌクレオシド−5’−燐酸エ
ステルの生成収率を向上させることができることを見出
し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以
下のとおりである。
晶を物理的処理により粉砕し、粉砕したヌクレオシドま
たはその前駆体の結晶を酵素触媒下で燐酸供与体と反応
させ、ヌクレオシドを燐酸化してヌクレオシド−5’−
燐酸エステルを生成せしめることを特徴とするヌクレオ
シド−5’−燐酸エステルの製造法。 (2)ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を、比表面
積が0.4m2/g以上となるように物理的処理により
粉砕する(1)のヌクレオシド−5’−燐酸エステルの
製造法。 (3)前記酵素が酸性フォスファターゼである(1)又
は(2)のヌクレオシド−5’−燐酸エステルの製造
法。 (4)前記酸性フォスファターゼは、ヌクレオシドに対
する親和性が上昇した酸性フォスファターゼである
(3)のヌクレオシド−5’−燐酸エステルの製造法。 (5)前記反応をpH3.0〜5.5の条件下で行う
(3)又は(4)のヌクレオシド−5’−燐酸エステル
の製造法。 (6)前記ヌクレオシドがグアノシンである(1)〜
(5)のいずれか一項に記載のヌクレオシド−5’−燐
酸エステルの製造法。 (7)比表面積が0.4m2/g以上であるヌクレオシ
ドまたはその前駆体の結晶を酵素触媒下で燐酸供与体と
反応させ、ヌクレオシドを燐酸化してヌクレオシド−
5’−燐酸エステルを生成せしめることを特徴とするヌ
クレオシド−5’−燐酸エステルの製造法。
本発明のヌクレオシド−5’−燐酸エステルの製造法に
おいては、ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を物理
的処理により粉砕し、粉砕したヌクレオシドまたはその
前駆体の結晶を酵素触媒下で燐酸供与体と反応させ、ヌ
クレオシドを燐酸化してヌクレオシド−5’−燐酸エス
テルを生成せしめる。ヌクレオシドまたはその前駆体の
結晶の物理的処理による粉砕は、例えば、ヌクレオシド
またはその前駆体の結晶を水中でスラリーとし、一般的
に用いられている粉砕機(例えばスイスWAB社製DYNO-MI
LL等)を用いて粉砕することによって行うことができ
る。このような処理によって、微細化された結晶のスラ
リーが得られる。
の前駆体の結晶を粉砕することによって、ヌクレオシド
−5’−燐酸エステルを生成する反応の効率を高めるこ
とができる。したがって、前記反応効率が向上する限
り、粉砕の程度は特に問わないが、好ましくは、粉砕後
の結晶の比表面積が0.4m2/g以上、より好ましく
は0.8m2/g以上となるように粉砕することが望ま
しい。比表面積の上限は特に制限されないが、ヌクレオ
シド−5’−燐酸エステルの生成効率の向上は結晶の比
表面積が一定以上になると頭打ちになるので、通常は1
m2/g程度で十分であると考えられる。
は、例えば、stokesの抵抗則に基づく沈降法に従い、沈
降式粒度分布測定装置(例えば、島津製作所(株)遠心沈
降式粒度分布測定装置SA-CP3)を用いて測定することが
できる。また、こうして測定される平均粒径に基づい
て、微結晶の比表面積を計算することができる。
結晶は、精製されたものであってもよく、ヌクレオシド
またはその前駆体を産生する微生物の培養液中に蓄積す
る結晶スラリーをそのまま用いてもよい。
ドまたはその前駆体への、燐酸供与体からの燐酸基の転
移によりヌクレオシド−5’−燐酸エステルを生成する
反応を触媒するものであれば制限はない。
物又は動物等に由来する酵素を用いることができるが、
微生物に由来するものが好ましい。また、酵素は、微生
物の野生株又は変異株から調製したものであってもよ
く、遺伝子工学的手法を用いて作製された形質転換株か
ら調製したものであってもよい。さらに、酵素を産生す
る微生物の菌体を含む培養物、該培養物から分離・回収
した菌体、該菌体を固定化処理、アセトン処理、凍結乾
燥処理等した菌体処理物を使用することもできる。
フォスファターゼ(EC 3.1.3.2)が挙げられる。酸性ホ
スファターゼとしては、微生物に由来するものが好まし
く、特に好適な例として、モルガネラ属、エシェリヒア
属、プロビデンシア属、エンテロバクター属、クレブシ
エラ属又はセラチア属に属する細菌が、当該酵素活性を
有しており、これら細菌に由来する酵素がある。そのよ
うな細菌の代表例として以下のような菌株を挙げること
ができる。
和性が上昇した酸性フォスファターゼ(特開平10-20148
1参照)が挙げられる。このような酸性フォスファター
ゼとして具体的には、後記参考例1記載のエシェリヒア
・ブラッタエ由来変異型酸性フォスファターゼ、エンテ
ロバクター・アエロゲネス由来新規変異型酸性フォスフ
ァターゼ、及び、特開平10-201481号公報記載の各種変
異型酸性フォスファターゼが挙げられる。
酸エステルを酸性条件下で加水分解する反応を触媒する
酵素であり、燐酸転移反応により生成するヌクレオシド
−5’−燐酸エステルを分解するヌクレオチダーゼ活性
を有しているが、ヌクレオチダーゼ活性(燐酸エステル
加水分解活性)が低下した変異型酸性フォスファターゼ
(WO96/37603参照)も、本発明に好適に使用することが
できる。さらに、温度安定性の向上した酸性フォスファ
ターゼ、又は、ヌクレオシドに対する親和性が上昇し、
かつ、温度安定性の向上した酸性フォスファターゼ(特
開平10-201481)も、本発明に好適に用いることができ
る。
シドまたはその前駆体の結晶を用いる以外は、通常のヌ
クレオシドまたはその前駆体を酵素的に燐酸化してヌク
レオシド−5’−燐酸エステルを生成せしめる方法と同
様にして燐酸化反応を行うことができる。
場合は、燐酸化反応をpH3.0から5.5の範囲の弱酸性に調
製することが好ましい。
駆体としては、プリンヌクレオシド類として、イノシ
ン、グアノシン、アデノシン、キサントシン、プリンリ
ボシド、6−メトキシプリンリボシド、2,6−ジアミ
ノプリンリボシド、6−フルオロプリンリボシド、6−
チオプリンリボシド、2−アミノ−6−チオプリンリボ
シド、メルカプトグアノシン等、ピリミジンヌクレオシ
ド類として、ウリジン、シチジン、5−アミノウリジ
ン、5−ヒドロキシウリジン、5−ブロモウリジン、6
−アザウリジン等が挙げられる。燐酸化反応によりこれ
らの天然型ヌクレオシド及び非天然型ヌクレオシドの
5’位が特異的に燐酸化され、それぞれ対応するヌクレ
オシド−5’−燐酸エステルが生成する。
シドまたはその前駆体のうち、溶解度の低いもの、例え
ばグアノシン、イノシン、アデノシン等、特にグアノシ
ン、アデノシン等のような難溶性のヌクレオシドを用い
た場合、特に高い効果が期待できる。これらヌクレオチ
ド等の製造法は、公知の方法を用いることができ、例え
ばグアノシンは特公昭57−14160号公報、イノシ
ンは特公昭57−22558号公報、特公昭62−37
959号公報、アデノシンは特公平4−52118号公
報記載の方法を採用できる。
前駆体の濃度は1〜20g/dlが望ましい。水に難溶性のヌ
クレオシドまたはその前駆体を使用する場合には、それ
らの結晶を粉砕して微細化することに加えて、硼酸ある
いはジメチルスルホキシドのような界面活性剤を反応液
に添加すると、さらに反応収率が向上する場合がある。
は、酵素反応によりヌクレオシドまたはその前駆体へ燐
酸基を転移してヌクレオシド−5’−燐酸エステルを生
成し得るものであれば特に制限されないが、具体的に
は、ポリ燐酸(塩)、フェニル燐酸(塩)、アセチル燐
酸(塩)及びカルバミル燐酸(塩)等が挙げられる。ポ
リ燐酸(塩)としては、ピロ燐酸、トリポリ燐酸、トリ
メタ燐酸、テトラメタ燐酸、ヘキサメタ燐酸もしくはそ
れらの混合物、又はそれらのナトリウム塩、カリウム塩
もしくはそれらの塩混合物などが、フェニル燐酸(塩)
としては、フェニル燐酸ジナトリウム、フェニル燐酸ジ
カリウム、O,O−ジフェニル燐酸無水物もしくはそれ
らの混合物などが、カルバミル燐酸(塩)としては、カ
ルバミル燐酸ジナトリウム、カルバミル燐酸ジカリウ
ム、カルバミル燐酸ジアンモニウム、カルバミル燐酸ジ
リチウムもしくはそれらの混合物などが使用可能であ
る。燐酸供与体の使用濃度は、燐酸受容体であるヌクレ
オシドまたはその前駆体の濃度によって決定される。通
常、ヌクレオシドまたはその前駆体の1〜5倍量が望ま
しい。
〜40℃で、pH3.5〜6.5、好ましくはpH3.5〜5.5の弱酸性
側が好結果を与える。反応には静置又は撹はんのいずれ
の方法も採用し得る。反応時間は、使用する酵素の活
性、基質濃度などの条件によって異なるが、1〜100時
間である。
5’−燐酸エステルを反応終了混合物より採取分離する
には、合成吸着樹脂を用いる方法や沈殿剤を用いる方
法、その他通常の採取分離方法が採用できる。
説明する。
フォスファターゼ遺伝子の取得 エシェリヒア・ブラッタエJCM1650由来野生型酸性フォ
スファターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドpEPI
305(WO96/37603参照)を用い、このプラスミドDNAに遺
伝子工学的手法により部位特異的変異を導入し、変異型
酸性フォスファターゼをコードする遺伝子を作製した
(特開平10-201481参照)。
50に由来する野生型酸性フォスファターゼをコードする
遺伝子を含む、制限酵素ClaIと制限酵素BamHIで切り出
される2.4Kbpの大きさのDNA断片を、ClaI及びBamHIで切
断したpBluescript KS(+)(ストラタジーン社製)に結
合したプラスミドDNAである。pEPI305をエシェリヒア・
コリ JM109に保持させた株は、AJ13144と命名され、平
成8年2月23日付で工業技術院生命工学工業技術研究所
(郵便番号305 日本国茨城県つくば市東一丁目1番
3号)にブタペスト条約に基づき国際寄託され、受託番
号FERM BP-5423が付与されている。
社製モデル394)を用いてホスホアミダイト法にて配列
番号1及び配列番号2に示すオリゴヌクレオチドMUT300
及びMUT370をそれぞれ合成した。
てM13プライマーRV(宝酒造社製)およびMUT370オリゴ
ヌクレオチド各2.5μmolおよびタックDNAポリメラーゼ
(宝酒造社製)2.5ユニットをdATP、dCTP、dGTP、dTTP
各200μM、塩化カリウム50mMおよび塩化マグネシウム
1.5mMを含む100mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.3)100μl
に添加し、94℃を30秒、55℃を2分、72℃を3分のサイク
ルを25回繰り返すPCR反応を行った。PCR反応はサ
ーマルサイクラーPJ2000型(宝酒造社製)を用いて行っ
た。また別に、鋳型としてプラスミドDNA pEPI305 1n
g、プライマーとしてM13プライマーM3(宝酒造社製)お
よびMUT300オリゴヌクレオチド各2.5μmolを用いて同様
にPCR反応を行った。それぞれの反応液をマイクロス
ピンカラムS-400(ファルマシア社製)を用いてゲル濾
過により精製し、プライマーを除去した。
P、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム 50mMおよび塩化
マグネシウム 1.5mMを含む100mM トリス−塩酸緩衝液
(pH8.3)95μlに添加し、94℃で10分加熱後、60分間か
けて37℃まで冷却した後、37℃で15分保温しヘテロ二本
鎖を形成させた。これにタックDNAポリメラーゼ2.5ユニ
ットを添加して72℃で3分反応を行い、ヘテロ二本鎖を
完成させた。次に、この反応液にM13プライマーRVおよ
びM13プライマーM3各2.5μmolを添加して、94℃を30
秒、55℃を2分、72℃を3分のサイクルを10回繰り返すP
CR反応を行った。
で切断後フェノール/クロロホルム抽出し、エタノール
沈殿した。このDNA断片をClaIとBamHIで切断したpBlues
cript KS(+)に結合し、得られたプラスミドDNAを用いて
常法によりエシェリヒア・コリJM109(宝酒造製)を形
質転換した。これを100μg/mlのアンピシリンを含むL
寒天培地上にプレーティングし、形質転換体を得た。
形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製
し、塩基配列の決定を行い、目的の塩基が置換されてい
ることを確認した。塩基配列の決定は Taq DyeDeoxy Te
rminator Cycle Sequencing Kit (アプライドバイオケ
ミカル社製)を用い、サンガーらの方法(J. Mol. Bio
l., 143, 161(1980))に従って行った。
ロイシン残基(CTG)がグルタミン残基(C*AG)に、6
5番目のアラニン残基(GCG)がグルタミン残基(*C*A
G)に、66番目のグルタミン酸残基(GAA)がアラニン
残基(G*CA)に、69番目のアスパラギン残基(AAC)
がアスパラギン酸残基(*GAC)に、71番目のセリン残
基(AGC)がアラニン残基(*G*CC)に、72番目のセリ
ン残基(AGT)がアラニン残基(*G*CT)に、74番目の
グリシン残基(GGG)がアスパラギン酸残基( *G*A*T)
に、135番目のスレオニン残基(ACC)がリジン残基
(*A*A*A)に、136番目のグルタミン酸残基(GAG)
がアスパラギン酸残基(GA*C)に、153番目のイソロ
イシン残基(ATC)がスレオニン残基(A*CC)にそれぞ
れ置換した、変異型フォスファターゼをコードする変異
型遺伝子を作製した。この変異型遺伝子を含むプラスミ
ドをpEPI370と命名した。
フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた5’−グアニル
酸の生産 <1>酸性フォスファターゼを含む菌体の調製 参考例1記載のプラスミドpEPI370を保持するエシェリ
ヒア・コリJM109/pEPI370をL培地50mlに接種し、37℃
で16時間培養後、培養液から遠心分離により集菌し、菌
体を取得した。
WAB社製DYNO-MILL)により結晶の粉砕処理を行った。こ
の際、粉砕時間などの条件を変更して様々な粒経の結晶
を取得した。グアノシン結晶は単位重量あたりの比表面
積は0.2m2/gであったものが、粉砕後0.4m2/g以上に増加
し、結晶の微細化が可能であった(表1)。なお、グア
ノシン結晶の比表面積はstokesの抵抗則に基づく沈降法
に従い、沈降式粒度分布測定装置(島津製作所(株)遠心
沈降式粒度分布測定装置SA-CP3)で測定した平均粒経を
もとに算出した。
晶又は粉砕結晶のスラリー7.5g(グアノシン含量として)
を水溶液中で混合して苛性ソーダでpH4.5付近に調整
後、上記菌体を100mg添加して最終液量が100mlとなるよ
うに調製し、30℃で40時間反応を行い、生成した5’−
グアニル酸の量を測定した。
での蓄積および収率を表1及び図1に、反応経時収率変
化を図2に示した。その結果、粉砕結晶を基質とした場
合、未粉砕結晶を基質とした場合に比べ、良好に燐酸化
反応が進行し、5’−グアニル酸生成収率で14%以上、
燐酸収率で1.4%以上、成績が向上した。
フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた各種ヌクレオシ
ド−5’−燐酸エステルの生産 <1>酸性フォスファターゼを含む菌体の調製 実施例1と同様に、エシェリヒア・コリJM109/pEPI370
をL培地に接種し、37℃で16時間培養後、培養液から遠
心分離により集菌し、菌体を取得した。
スWAB社製DYNO-MILL)により結晶の粉砕処理を行った。
ヌクレオシド結晶は単位重量あたりの比表面積は0.2m2/
gであったものが、粉砕後0.4m2/g以上に増加し、結晶の
微細化が可能であった。なお、比表面積はstokesの抵抗
則に基づく沈降法に従い沈降式粒度分布測定装置(島津
製作所(株)遠心沈降式粒度分布測定装置SA-CP3)で測定
した平均粒経をもとに算出した。
アデノシンの未粉砕結晶又はこれらのヌクレオシドの粉
砕結晶のスラリー5g(ヌクレオシド含量として)を水溶液
中で混合して苛性ソーダでpH4.5付近に調整後、上記菌
体を100mg添加して最終液量が100mlとなるように調製
後、30℃で24時間反応を行い、生成したヌクレオチドの
量を測定した。最大蓄積時点での蓄積を表2に示した。
その結果、粉砕したヌクレオシドスラリーを基質とした
場合、未粉砕結晶を基質とした場合に比べ良好に燐酸化
反応が進行し、ヌクレオチド生成量の向上が認められ
た。
10由来新規変異型酸性フォスファターゼ遺伝子の作製 エンテロバクター・アエロゲネス IFO 12010由来野生型
酸性フォスファターゼをコードする遺伝子に、遺伝子工
学的手法によって部位特異的変異を導入し、ヌクレオシ
ドに対する親和性が向上した変異型酸性フォスファター
ゼをコードする遺伝子を作製した。
の方法にて取得したエンテロバクター・アエロゲネス I
FO 12010由来野生型酸性フォスファターゼをコードする
遺伝子を含むプラスミドpENP110より、野生型酸性フォ
スファターゼをコードする遺伝子を含む、制限酵素SalI
と制限酵素KpnIで切り出される1.6kbpの大きさのDNA断
片を切り出し、SalI及びKpnIで切断したpUC19(酒造社
製)に結合し、このプラスミドをpENP120と命名した。
社製モデル394)を用いてホスホアミダイト法にて配列
表に示す配列のオリゴヌクレオチドMUT110(配列番号
3)、MUT120(配列番号4)、MUT130(配列番号5)、
MUT140(配列番号6)、MUT150(配列番号7)を合成し
た。
てM13プライマーM4(宝酒造社製)およびMUT110オリゴ
ヌクレオチド各2.5μmol、およびタックDNAポリメラー
ゼ(宝酒造社製)2.5ユニットを、dATP、dCTP、dGTP、d
TTP各200μM、塩化カリウム 50mMおよび塩化マグネシウ
ム 1.5mMを含む100mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.3)100
μlに添加し、94℃を30秒、55℃を2分、72℃を3分のサ
イクルを25回繰り返すPCR反応を行った。PCR反応
はサーマルサイクラーPJ2000型(宝酒造社製)を用いて
行った。また別に、鋳型としてプラスミドDNA pENP120
1ng、プライマーとしてM13プライマーRV(宝酒造社製)
およびMUT6プライマー(宝酒造社製)各2.5μmolを用い
て同様にPCR反応を行った。それぞれの反応液をマイ
クロスピンカラムS-400(ファルマシア社製)を用いて
ゲル濾過により精製し、プライマーを除去した。
TP、dGTP、dTTP各200μM、塩化カリウム50mMおよび塩化
マグネシウム 1.5mMを含む100mM トリス−塩酸緩衝液
(pH8.3)95μlに添加し、94℃で10分加熱後、60分間
かけて37℃まで冷却した後、37℃で15分保温しヘテロ二
本鎖を形成させた。これにタックDNAポリメラーゼ2.5ユ
ニットを添加して72℃で3分反応を行い、ヘテロ二本鎖
を完成させた。次に、この反応液にM13プライマーRVお
よびM13プライマーM3各2.5μmolを添加して、94℃を30
秒、55℃を2分、72℃を3分のサイクルを10回繰り返すP
CR反応を行った。
RIで切断後フェノール/クロロホルム抽出し、エタノー
ル沈殿した。このDNA断片をSalI及びEcoRIで切断したpU
C19に結合し、得られたプラスミドDNAを用いて常法によ
りエシェリヒア・コリJM109(宝酒造製)を形質転換し
た。これを100μg/mlのアンピシリンを含むL寒天培地
上にプレーティングし、形質転換体を得た。形質転換体
よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを調製し、塩基配
列の決定を行い、目的の塩基が置換されていることを確
認した。塩基配列の決定は Taq DyeDeoxy Terminator
Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオケミカル社
製)を用い、サンガーらの方法(J. Mol.Biol., 143, 1
61 (1980))に従って行った。このようにしてプロ蛋白
質の92番目のグリシン残基(GGC)がアスパラギン酸残
基(G*A*C)に置換した変異型フォスファターゼをコー
ドする変異型遺伝子を作製した。この変異型遺伝子を含
むプラスミドをpENP130と命名した。
様の操作を繰り返し、累加的に部位特異的変異を導入し
た。形質転換体よりアルカリ溶菌法によりプラスミドを
調製し、塩基配列の決定を行い、目的の塩基が置換され
ていることを確認した。作製した変異型フォスファター
ゼをコードする変異型遺伝子と変異部位を表3に示し
た。なお変異部位のアミノ酸残基はシグナルペプチドが
切断される前のプロ蛋白質のアミノ酸配列中のアミノ酸
残基を示している。
プラスミドを導入したエシェリヒア・コリ JM109/pENP1
70、および野生型酸性フォスファターゼ遺伝子を含むプ
ラスミドを導入したエシェリヒア・コリ JM109/pENP120
を、アンピシリン100μg/mlおよびIPTG 1mMを含むL培
地50mlに接種し、37℃で16時間培養した。それぞれの菌
の培養液2Lから遠心分離により菌体を集め、生理食塩水
で1回洗浄した。菌体を50mlの100mM燐酸バッファー(pH
7.0)に懸濁し、4℃で20分間超音波処理を行い菌体を破
砕した。処理液を遠心分離して不溶性画分を除き、無細
胞抽出液を調製した。それぞれの無細胞抽出液を用いて
燐酸転移反応におけるイノシンに対するKm値を測定し
た。
イノシンを基質として、次の条件で行った。イノシン40
μmol/ml、ピロ燐酸ナトリウム100μmol/ml、酢酸ナト
リウム緩衝液(pH4.0)100μmol/ml及び酵素を含む反応
液(1ml)でpH4.0、30℃で10分反応を行った。2N塩酸20
0μlを添加して反応を停止した後、遠心分離により沈澱
を除き、燐酸転移反応により生成した5’−イノシン酸
を定量した。この標準反応条件にて1分間に1μmolの
5’−イノシン酸を生成する酵素量を1unitと定めた。
なお、イノシン及び5’−イノシン酸は、高速液体クロ
マトグラフィー(HPLC)により、下記の条件にて分
析した。
m)〔ナカライテスク社製品〕 移動相:5mM 燐酸カリウムバッファー(pH 2.8)/メタ
ノール=95/5 流速:1.0ml/min 温度:室温 検出:UV245nm
度を10から100μmol/mlまで変化させて燐酸転移活性を
測定し、Hanes-Woolfプロット(Biochem.J., 26,1406
(1932))により燐酸転移反応におけるイノシンの速度定
数を求めた。
している野生型酵素のKm値は200mMと算出された。一
方、本実施例で作製したエシェリヒア・コリ JM109/pEP
I330で発現している変異型酵素のKm値は40mMと算出さ
れ、新たに構築したエンテロバクター・アエロゲネス由
来変異型酸性フォスファターゼは、イノシンに対するKm
値が大きく低下し、イノシンに対する親和性が向上して
いることが明らかになった。
型酸性フォスファターゼ遺伝子保持株を用いた5’−グ
アニル酸の生産 <1>酸性フォスファターゼを含む菌体の調製 実施例3で取得したエンテロバクター・アエロゲネス由
来変異型酸性フォスファターゼ遺伝子を導入したエシェ
リヒア・コリ JM109/pENP170を、IPTG 1mMを含むL培地5
0mlに接種し、37℃で16時間培養後、培養液から遠心
分離により集菌し、菌体を取得した。
WAB社製DYNO-MILL)により結晶の粉砕処理を行った。グ
アノシン結晶は、単位重量あたりの比表面積は0.2m2/g
であったものが、粉砕後0.4m2/g以上に増加し、結晶の
微細化が可能であった。なお、比表面積はstokesの抵抗
則に基づく沈降法に従い沈降式粒度分布測定装置(島津
製作所(株)遠心沈降式粒度分布測定装置SA-CP3)で測定
した平均粒経をもとに算出した。
晶又は粉砕結晶のスラリー7.5g(グアノシン含量として)
を水溶液中で混合して苛性ソーダでpH4.5付近に調整
後、上記菌体を100mg添加して最終液量が100mlとなるよ
うに調製し、30℃で40時間反応を行い、生成した5’−
グアニル酸量を測定した。最大蓄積時の反応成績を表4
に示した。グアノシンの粉砕結晶を基質とした場合、未
粉砕結晶を基質とした場合に比べ良好に燐酸化反応が進
行し、5’−グアニル酸収率が19%向上した。
前駆体、特に難溶性のヌクレオシドまたはその前駆体を
原料として、ヌクレオシド−5’−燐酸エステルを酵素
反応により効率よく製造することができる。
酸の収率との関係を示す図。
す図。
Claims (7)
- 【請求項1】 ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶を
物理的処理により粉砕し、粉砕したヌクレオシドまたは
その前駆体の結晶を酵素触媒下で燐酸供与体と反応さ
せ、ヌクレオシドを燐酸化してヌクレオシド−5’−燐
酸エステルを生成せしめることを特徴とするヌクレオシ
ド−5’−燐酸エステルの製造法。 - 【請求項2】 ヌクレオシドまたはその前駆体の結晶
を、比表面積が0.4m2/g以上となるように物理的
処理により粉砕する請求項1記載のヌクレオシド−5’
−燐酸エステルの製造法。 - 【請求項3】 前記酵素が酸性フォスファターゼである
請求項1又は2に記載のヌクレオシド−5’−燐酸エス
テルの製造法。 - 【請求項4】 前記酸性フォスファターゼは、ヌクレオ
シドに対する親和性が上昇した酸性フォスファターゼで
ある請求項3記載のヌクレオシド−5’−燐酸エステル
の製造法。 - 【請求項5】 前記反応をpH3.0〜5.5の条件下
で行う請求項3又は4に記載のヌクレオシド−5’−燐
酸エステルの製造法。 - 【請求項6】 前記ヌクレオシドがグアノシンである請
求項1〜5のいずれか一項に記載のヌクレオシド−5’
−燐酸エステルの製造法。 - 【請求項7】 比表面積が0.4m2/g以上であるヌ
クレオシドまたはその前駆体の結晶を酵素触媒下で燐酸
供与体と反応させ、ヌクレオシドを燐酸化してヌクレオ
シド−5’−燐酸エステルを生成せしめることを特徴と
するヌクレオシド−5’−燐酸エステルの製造法。
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WO2009088049A1 (ja) | 2008-01-10 | 2009-07-16 | Ajinomoto Co., Inc. | 発酵法による目的物質の製造法 |
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