JP2001526886A - ヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ−２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト・ピロホスホヒドロラーゼ−２（ＮＴＰＰＨ−２）及びＮＴＰＰＨ−２を特定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、発現ベクター、宿主細胞、アゴニスト、抗体、及びアンタゴニストを提供する。また本発明は、ＮＴＰＰＨ−２の発現に関連する疾病を処置するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本特許明細書の開示内容の一部は、著作権による保護を受けている内容を含ん
でいる。著作権者は、本出願が特許されたときに特許公報等により複製されるこ
とに異議を唱えることは無いが、それ以外の場合については、全ての版権を所有
する。

【０００２】 （技術分野） 本発明は、ヒト・ピロホスホヒドロラーゼ−２の核酸及びアミノ酸配列、及び
関節症、免疫疾患、及び癌の診断、予防、処置におけるこれらの配列の使用法に
関するものである。

【０００３】 （発明の背景） ピロリン酸カルシウム二水和物（ＣＰＰＤ）沈着病は、滑液を含む関節組織に
おけるＣＰＰＤ結晶の沈着を特徴とする関節症である。ＣＰＰＤ結晶は、関節変
性の組織損傷及び慢性の疼痛の有意な原因となり、かつ、in vitroで好中球活性
化及び繊維芽細胞や軟骨細胞の有糸***を誘導するとともに、基質金属タンパク
質分解酵素（ＭＭＰ）及びプロスタグランジンの産生を誘導する。ＣＰＰＤ沈着
は、急性炎症性エピソード（偽痛風）、慢性関節炎、及び変性性関節疾患と関連
を有する。急性炎症性発作を経験するのはＣＰＰＤの患者の集団のなかの約１０
％に過ぎないが、大関節の慢性関節炎の患者の大半にＣＰＰＤ沈着が見られる。
ＣＰＰＤ結晶は、関節炎性疾患の進行において大きな役割を果たす。変性性関節
疾患の患者から採取されたＣＰＰＤ結晶を含む滑液は、高濃度の軟骨断片及びＭ
ＭＰ（例えばコラゲナーゼ及びストロメライシン）を含む（Swan, A.B.ら (1994
) Ann. Rheum. Dis. 53:467-470; L. S.ら (1993) Arthritis. Rheum. 36: 181-
189）。

【０００４】 ＣＰＰＤ結晶の沈着は、過剰なレベルの細胞外カルシウム若しくはピロリン酸
（ＰＰｉ）、又はその両方と関連を有すると考えられる。カルシウム濃度の上昇
が、関節におけるＣＰＰＤ沈着の主要な原因であるとは考えにくいが、ＣＰＰＤ
沈着の患者の滑液には、高濃度のＰＰｉが認められた。ＰＰｉ濃度は血漿中より
滑液中において高濃度であり、かつin vitro軟骨移植片はＰＰｉを細胞外培地に
放出することから、滑液のＰＰｉは関節組織によって産生され得る（Ryan, L.M.
ら (1996) J. Rheumatol. 23:214-219）。

【０００５】 ヌクレオチド三リン酸を加水分解し、かつＰＰｉを放出する酵素は、ヌクレオ
チドピロホスホヒドロラーゼ（ＮＴＰＰＨ）と呼ばれる。ＮＴＰＰＨ活性は滑液
中で見出され、ＰＰｉの産生と相互関係を有する。ＣＰＰＤ沈着の患者の滑液に
おいてＮＴＰＰＨ活性が見られ、また関節組織及び関節液に細胞外ＡＴＰを加え
るとＰＰｉが産生されることになる（Park, W.I.ら (1996) J. Rheumatol. 23:
665-671）。ＮＴＰＰＨ活性を有する分子の濃度は、ＣＰＰＤ結晶を含む軟骨か らの抽出物において、結晶を欠く軟骨からの抽出物より高い。in vitroで関節軟
骨から放出される基質小胞は高いＮＴＴＰＨ活性を示し、かつカルシウム及びＡ
ＴＰの存在の下でＣＰＰＤを産生する（Defus, B.A.ら (1992) Arthritis. Rheu
m. 35: 231-240）。

【０００６】 最近、ＮＴＰＰＨ活性を示し、分子量が６１ｋＤのタンパク質が、ブタの関節
軟骨外植体コンディションドメディウムから精製された（Masuda, Iら (1995) J
. Clin. Invest. 95: 699-704）。そのアミノ末端の初めの２６個の残基が配列 決定され、それは公的データベース中のあらゆる配列と相同性を有していなかっ
た。該６１ｋＤのブタのタンパク質に対して抗ペプチドの抗体が産生され、該抗
血清は、軟骨細胞及び軟骨外植体の両方の培地からのコンディションドメディウ
ムにおいて、元の６１ｋＤのブタのタンパク質と別の１２７ｋＤの小胞関連タン
パク質を特定した。６１ｋＤのアイソフォームは、１２７ｋＤのタンパク質の触
媒作用的に活性なタンパク分解性断片であると考えられる。ヒトの滑液において
６１ｋＤのアイソフォームと１２７ｋＤのアイソフォームの両方が特定され、ま
たヒトの血清において１００ｋＤのタンパク質が特定された。組織抽出物の免疫
ブロッティングにおいて抗ペプチドの抗体を用いて、ＣＰＰＤ沈着の起こる関節
組織、例えば硝子軟骨、繊維軟骨、腱、及び靭帯においてのみＮＴＰＰＨの発現
を見出した（Cardenal, A.ら (1996) Arthritis. Rheum. 39: 252-256; Cardena
l, A.ら (1996) Arthritis. Rheum. 39: 245-251）。最近になって、部分的なブ
タＮＴＰＰＨのｃＤＮＡが単離された（Masuda, Iら (1997) Gene 197: 227-282
）。

【０００７】 完全長ヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ（ＮＴＰＰＨ−１）が、軟
骨ｃＤＮＡライブラリーから単離された。ヒト、イヌ、及びウサギの関節組織の
ＲＮＡサンプルのノーザン法による解析によって、関節軟骨におけるＮＴＰＰＨ
−１の高レベルの発現、及び滑膜、半月板、腱、及び靭帯におけるＮＴＰＰＨ−
１の低い或いは有意なレベルの発現が分かった。別のヒトの組織についての発現
の試験により、骨格筋、心筋、及び骨髄における有意なレベルのｍＲＮＡの存在
、及び気管、脊髄、甲状腺、胃、精巣、子宮、小腸、結腸、胸腺、胎盤、リンパ
、及び副腎組織における低いが検出可能なレベルのｍＲＮＡの存在が分かった。

【０００８】 新規なヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ、ＮＴＰＰＨ−２、及びそ
れをコードするポリヌクレオチドの発見は、関節症、免疫疾患、及び癌の診断、
予防、処置において役立つ新規な組成物を提供することにより、当分野における
必要性を満たすものである。

【０００９】 （発明の概要） 本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有する実質
的に精製されたポリペプチドである、ヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラー
ゼ−２（ＮＴＴＰＨ−２）を提供する。

【００１０】 更に本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列と少なく
とも９０％のアミノ酸配列同一性を有する実質的に精製されたＮＴＴＰＨ−２の
変異体を提供する。また本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、単離され精製されたポリヌクレオ
チドを提供する。また本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ
酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも９０％
のポリヌクレオチド配列同一性を有する、単離され精製されたポリヌクレオチド
変異体を包含する。

【００１１】 更に本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。更に本発
明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件の下でハイブリダ
イズする、単離され精製されたポリヌクレオチドを提供すると共に、配列番号：
１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドに相補的な、単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。

【００１２】 また本発明は、配列番号：２又は配列番号：２の断片を含む単離され精製され
たポリヌクレオチド、及び配列番号：２又は配列番号：２の断片を含むポリヌク
レオチドと少なくとも９０％のポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され精
製されたポリヌクレオチド変異体を提供する。有用な配列番号：２の断片は、５
５番目乃至７５番目のヌクレオチド、４８１番目乃至５０７番目のヌクレオチド
、６４６番目乃至６６９番目のヌクレオチド、２１８２番目乃至４１４９番目の
ヌクレオチド、１７２６番目乃至４１４９番目のヌクレオチド、７５７番目乃至
４１４９番目のヌクレオチド、及び１１３番目乃至４１４９番目のヌクレオチド
からなる群から選択されたものであり得る。更に本発明は、American Type Cult
ure Collectionに受入番号 として登録された、単離され精製されたポリヌ
クレオチドを提供する。また本発明は、配列番号：２又は配列番号：２の断片を
含むポリヌクレオチドに相補的な、単離され精製されたポリヌクレオチドを提供
する。

【００１３】 更に本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発現ベクタ
ーを提供する。別の実施態様では、前記発現ベクターが宿主細胞に含められる。

【００１４】 また本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドの製造方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件
の下で、ＮＴＴＰＨ−２をコードするポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む
発現ベクターを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）前記宿主細胞の培地から
前記ポリペプチドを回収する過程とを含む、配列番号：１又は配列番号：１の断
片のアミノ酸配列を有するポリペプチドの製造方法を提供する。

【００１５】 また本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有する
実質的に精製されたＮＴＴＰＨ−２と、適切な医薬用担体とを含む医薬品組成物
を提供する。

【００１６】 更に本発明は、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドと結合する精製された抗体を包含すると共に、前記ポリペプチドの
精製されたアゴニスト及び精製されたアンタゴニストを包含する。

【００１７】 また本発明は、核酸を含む生物学的サンプルにおいてＮＴＴＰＨ−２をコード
するポリヌクレオチドを検出する方法であって、（ａ）配列番号：１又は配列番
号：１の断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的な分子
と、前記生物学的サンプルの前記核酸の少なくとも１種類とをハイブリダイズさ
せ、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、（ｂ）前記ハイブリダイ
ゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイブリダイゼーション複合体
の存在が、前記生物学的サンプルにおけるＮＴＴＰＨ−２をコードするポリヌク
レオチドの存在と相互関係を有する、該過程とを含む、核酸を含む生物学的サン
プルにおいてＮＴＴＰＨ−２をコードするポリヌクレオチドを検出する方法を提
供する。或る実施態様では、ハイブリダイゼーションを行う過程の前に、前記生
物学的サンプルの核酸をポリメラーゼ連鎖反応法により増幅する。

【００１８】 また本発明は、関節症の処置又は予防方法であって、そのような処置が必要な
患者に、ＮＴＴＰＨ−２のアンタゴニストを有効な量投与する過程を含む、関節
症の処置又は予防方法を提供する。

【００１９】 また本発明は、免疫疾患の処置又は予防方法であって、そのような処置が必要
な患者に、ＮＴＴＰＨ−２のアンタゴニストを有効な量投与する過程を含む、免
疫疾患の処置又は予防方法を提供する。

【００２０】 また本発明は、癌の処置又は予防方法であって、そのような処置が必要な患者
に、ＮＴＴＰＨ−２のアンタゴニストを有効な量投与する過程を含む、癌の処置
又は予防方法を提供する。

【００２１】 また本発明は、核酸を含む生物学的サンプルにおいてＮＴＴＰＨ−２をコード
するポリヌクレオチドを検出する方法であって、配列番号：１又は配列番号：１
の断片を含むポリペプチドを含むポリヌクレオチドに相補的な分子と、前記生物
学的サンプルの前記核酸の少なくとも１種類とをハイブリダイズさせ、ハイブリ
ダイゼーション複合体を形成する過程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複
合体を検出する過程であって、前記ハイブリダイゼーション複合体の存在が、前
記生物学的サンプルにおけるＮＴＴＰＨ−２をコードするポリヌクレオチドの存
在と相互関係を有する、該過程とを含む、核酸を含む生物学的サンプルにおいて
ＮＴＴＰＨ−２をコードするポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。或る
実施態様では、ハイブリダイゼーションを行う過程の前に、前記生物学的サンプ
ルの前記核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応法により増幅する。

【００２２】 また本発明は、生物学的サンプルにおいてＮＴＴＰＨ−２を検出する方法であ
って、（ａ）生物学的サンプルを準備する過程と、（ｂ）前記生物学的サンプル
と、配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有するポリペプチド
に結合する抗体とを、ＮＴＴＰＨ−２と前記抗体との間で生ずる複合体形成に適
した条件の下で結合する過程と、（ｃ）ＮＴＴＰＨ−２と前記抗体との間の複合
体形成を検出し、前記生物学的サンプルにおけるＮＴＴＰＨ−２の存在を確認す
る過程とを含む、生物学的サンプルにおいてＮＴＴＰＨ−２を検出する方法を提
供する。

【００２３】 本発明は、ＮＴＴＰＨ−２に結合する分子を特定するべく小分子のライブラリ
ーをスクリーニングする方法であって、（ａ）小分子のライブラリーを準備する
過程と、（ｂ）小分子のライブラリーと、配列番号：２又は配列番号：２の断片
のポリペプチドとを、複合体形成に適した条件の下で結合する過程と、（ｃ）複
合体形成を検出する過程であって、前記複合体の存在が、ＮＴＴＰＨ−２に結合
する小分子を特定する、該過程とを含む、ＮＴＴＰＨ−２に結合する分子を特定
するべく小分子のライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。

【００２４】 また本発明は、アゴニストを特定する方法であって、（ａ）小分子のライブラ
リーのスクリーニングによって特定された小分子の１つとガンマ標識したＡＴＰ
とをＮＴＴＰＨ−２を発現するベクターで形質転換された細胞に送達する過程と
、（ｂ）適切な条件の下で前記細胞を増殖する過程と、（ｃ）ＰＰｉの量の増加
をアッセイし、小分子がアゴニストであることを確認する過程とを含む、アゴニ
ストを特定する方法を提供する。

【００２５】 更に本発明は、アンタゴニストを特定する方法であって、（ａ）小分子のライ
ブラリーをスクリーニングすることによって特定された小分子の１つとガンマ標
識したＡＴＰとを、ＮＴＴＰＨ−２を発現するベクターで形質転換した細胞に送
達する過程と、（ｂ）適切な条件の下で前記細胞を増殖させる過程と、（ｃ）Ｐ
Ｐｉの量の増加をアッセイし、前記小分子がアンタゴニストであることを確認す
る過程とを含む、アンタゴニストを特定する方法を提供する。

【００２６】 （発明の実施の形態） 本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列、及び方法について説明する前に、本
発明は、ここに開示した特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター、及び試
薬に限定されず、それらは様々に変更可能であることを理解されたい。また、本
明細書において用いられる用語法は、特定の実施例のみを説明する目的で用いら
れたものであり、請求項の記載のみによって限定される本発明の範囲を限定する
ことを意図したものではないということも理解されたい。

【００２７】 本明細書及び請求の範囲において、単数を表す「或る」及び「その（この）」
と形容されたものは、前後関係でそうでないことが明らかである場合以外は、複
数の意味も含んでいることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿
主細胞」なる表記が表すものには、複数のそのような宿主細胞が含まれ、「或る
抗体」なる表記は、１種または複数の種類の抗体及び当業者に周知のその等価物
等も表している。

【００２８】 本明細書における全ての科学技術専門用語は、特別に定義されていない限り、
本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者に一般に理解されるのと
同じ意味を有する。ここに説明したものと類似のまたは等価な方法や材料を本発
明の実施や試験において用いることができるが、好適な方法、装置、及び材料を
本明細書において説明する。本明細書に記載された全ての文献は、本発明の関連
において用いられ得る文献で報告された細胞系、ベクター、及び方法論を説明し
開示する目的で引用されたものであり、引用により本明細書の一部とする。また
本明細書のあらゆる開示内容を、本発明におけるそのような開示内容が従来技術
に先行しないということを認めるものと解釈してはならない。

【００２９】 （定義） 本明細書において、ＮＴＰＰＨ−２は、任意の種、具体的にはウシ、ヒツジ、
ブタ、マウス、ウマ、及び好ましくはヒト等のような哺乳動物に由来し、天然の
、合成の、半合成の、又は組換え体の何れかから得られる実質的に精製されたＮ
ＴＰＰＨ−２のアミノ酸配列である。

【００３０】 本明細書において、用語「アゴニスト」は、ＮＴＰＰＨ−２に結合したときＮ
ＴＰＰＨ−２の効果を強めたり、その効果の持続時間を長くさせる分子である。
アゴニストには、ＮＴＰＰＨ−２に結合し、その効果を変調するタンパク質、核
酸、糖質や、任意の他の分子が含まれ得る。

【００３１】 本明細書において「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＮＴＰＰＨ−２をコ
ードする遺伝子の対立形である。アレルは、核酸配列の少なくとも一箇所の変異
によって生じ、変異したｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生ずるが、その変異した
ｍＲＮＡ或いはポリペプチドの構造や機能が変わる場合もあれば変わらない場合
もある。与えられた元のままの遺伝子または組換え遺伝子には、アレル形が存在
しないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するものがある。一般にアレル
を生じる変異はヌクレオチドの自然な欠失、付加並びに置換に因るものである。
このタイプの変異はそれぞれ単独で、或いは他の変異と同時に、所定の配列内で
１回又は２回以上生じ得る。

【００３２】 本明細書において、ＮＴＰＰＨ−２をコードする「変異」核酸配列とは、異な
るヌクレオチド残基の置換、挿入や欠失を含み、結果的に同一の、または機能的
に等価なＮＴＰＰＨ−２をコードするポリヌクレオチドとなるものである。この
定義には、ＮＴＰＰＨ−２をコードするポリヌクレオチド配列の通常の染色体上
の遺伝子座以外の座位を有する多型、アレルとの不適切なまたは予期しないハイ
ブリダイゼーションによって起こる多型、及びＮＴＰＰＨ−２をコードするポリ
ヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な、
或いは検出が困難な多型が含まれている。コードされたタンパク質も同様に「変
異」したものであり得、サイレント変異を生じ、結果的に機能的に等価なＮＴＰ
ＰＨ−２となるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに置換を含むものであり得る。意
図的なアミノ酸の置換は、ＮＴＰＰＨ−２の生物学的活性が保持される限り、残
基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性並びにまた両親媒性についての類似性
に基づいて生じさせることができる。例えば負に荷電したアミノ酸にはアスパラ
ギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジン及びアルギ
ニンが含まれ、近い親水性値を有する荷電していない極性頭基を有するアミノ酸
には、ロイシン、イソロイシン、及びバリン；グリシン及びアラニン；アスパラ
ギン及びグルタミン；セリン及びスレオニン；及びフェニルアラニン及びチロシ
ンが含まれる。

【００３３】 本明細書において「アミノ酸」又は「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペ
プチド、ポリペプチド、又はタンパク質の配列、又はそれらの何れかの断片であ
り、自然発生の分子又は合成した分子である。ＮＴＰＰＨ−２の断片は、好まし
くは約５個〜約１５個のアミノ酸からなる長さを有し、かつＮＴＰＰＨ−２の生
物学的活性又は免疫学的活性を保持しているものである。ここで、「アミノ酸配
列」が自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を指している場合に、「アミノ酸
配列」や類似の用語は、そのアミノ酸配列を本明細書に記載のタンパク質分子に
関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定する意味で用いられているわけで
はない。

【００３４】 本明細書において「増幅」は、核酸配列の更なるコピーを生成することであり
、通常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）を用いて行われる
（Dieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer. a Laboratory Man ual , Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY）。

【００３５】 本明細書において、用語「アンタゴニスト（拮抗物質）」は、ＮＴＰＰＨ−２
に結合したとき、ＮＴＰＰＨ−２の生物学的又は免疫学的効果の大きさを低下さ
せたり、効果の継続時間を短縮させる分子である。アンタゴニストとしては、Ｎ
ＴＰＰＨ−２の効果を低下させるタンパク質、核酸、糖質、抗体、または他の分
子等が挙げられる。

【００３６】 本明細書において、用語「抗体」は、完全な抗体分子を意味するとともに、例
えばＦａ、Ｆ（ａｂ'）₂、及びＦｖ断片のような抗原決定基と結合し得るその断
片を意味する。ＮＴＰＰＨ−２ポリペプチドに結合する抗体は、免疫化の抗原と
して完全なポリペプチド又は目的の小ペプチドを含むその断片を用いることによ
って作り出すことができる。動物を免疫化するのに用いられるポリペプチドまた
はペプチドは、ＲＮＡの翻訳に由来するもの、又は化学的に合成されたものであ
り得、必要ならば担体タンパク質と結合させることができる。ペプチドに化学的
に結合する担体として通常用いられるものとしては、ウシ血清アルブミン、サイ
ログロブリン、及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が挙げられる
。この結合したペプチドを用いて動物（例えばマウス、ラット、またはウサギ）
を免疫化する。

【００３７】 本明細書において、用語「抗原決定基」は、特定の抗体と結びつく分子の断片
（即ちエピトープ）である。タンパク質の一部分、即ち断片を用いてホストの動
物を免疫化すると、このタンパク質の様々な領域が、該タンパク質上の所定の領
域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。このような領
域または構造を抗原決定基と称する。抗原決定基は、抗体への結合について元の
抗原（即ち免疫応答を誘導するに用いられる免疫原）と競合し得る。

【００３８】 本明細書において用語「アンチセンス」は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に
相補的なヌクレオチド配列を含む組成物である。用語「アンチセンス鎖」は、「
センス」鎖に相補的な核酸鎖の意味で用いられる。アンチセンス分子としてはペ
プチド核酸があり、アンチセンス分子は合成や転写を含む任意の方法で作り出す
ことができる。この相補的ヌクレオチドは、一旦細胞内に導入されると、細胞に
よって作られた自然の配列と結合して二重鎖を形成し、これが更なる転写や翻訳
を阻害する。「マイナス（−）」なる表現がアンチセンス鎖の意味で用いられ、
「プラス（＋）」はセンス鎖の意味で用いられることがある。

【００３９】 本明細書において、用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造上の機
能、調節の機能、又は生化学的な機能を有するタンパク質である。同様に「免疫
学的に活性」は、天然の、組換え体の、又は合成のＮＴＰＰＨ−２、若しくはそ
のオリゴペプチドの、適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定
の抗体に結合する能力である。

【００４０】 本明細書において、用語「相補的」または「相補性」は、許容的な塩濃度及び
温度条件の下で、塩基対を形成してポリヌクレオチド同士が自然に結合すること
である。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は相補的な配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する
。２本の一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合する「部分的」なも
のであるか、若しくは、一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合は完全に相
補的なものであり得る。核酸鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブリダ
イゼーションの効率及び強さに有意な影響を与える。このことは、核酸鎖同士の
結合によって左右される増幅反応や、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計及び使
用において特に重要である。

【００４１】 本明細書において「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」とは、所定の
ポリヌクレオチド配列を含むあらゆる物質をさす。この組成物は、粉末製剤また
は水溶液の形態であり得る。ＮＴＰＰＨ−２をコードするポリヌクレオチド配列
又はその断片を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして利用する
ことができる。このプローブは凍結乾燥した状態で保存することができ、糖質の
ような安定化剤と結合させることができる。ハイブリダイゼーションにおいて、
このプローブを、塩（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばＳＤＳ）及び他の
物質（例えばデンハート液、粉乳、サケ***ＤＮＡ等）を含む水溶液に分散させ
ることができる。

【００４２】 本明細書において「コンセンサス」は、配列決定し直して不要な塩基を分離し
、XL-PCR^TM（Perkin Elmer, Norwalk, CT）を用いて５′方向及び／または３′ 方向に延長した上で再度配列決定し直した核酸配列か、または断片を組み合わせ
るためのコンピュータプログラム（例えばGELVIEW^TM Fragment Assembly system
, GCG, Madison WI）を用いて２種以上のインサイト社クローンの重複した配列 を組み合わせて導き出した核酸配列である。延長と組み合わせの両方によってコ
ンセンサス配列が作られることもある。

【００４３】 本明細書において、「ポリヌクレオチドの発現と相互関係を有する」なる表現
は、ノーザン法による解析でリボ核酸の存在が検出されることが、サンプル内の
ＮＴＰＰＨ−２をコードするｍＲＮＡの存在を表し、従って該タンパク質をコー
ドする遺伝子からの転写物の発現と相互関係を有している、ということを表して
いる。

【００４４】 本明細書において「欠失」は、１個または２個以上のヌクレオチド若しくはア
ミノ酸残基が欠けるような、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化
である。

【００４５】 本明細書において、用語「誘導体」は、ＮＴＰＰＨ−２をコードする核酸或い
はそれに相補的な核酸又はコードされたＮＴＰＰＨ−２を化学的に修飾したもの
を意味する。このような修飾の例には、水素からアルキル基、アシル基、又はア
ミノ基への置換がある。核酸誘導体は、元のままの分子の生物学的又は免疫学的
機能を保持しているポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、元のポ
リペプチドの生物学的又は免疫学的機能の少なくとも１種類を保持しており、グ
リコシル化、ポリエチレングリコール化（PEGylation）、又は他の何らかのプロ
セスで修飾されたものである。

【００４６】 本明細書において、用語「相同性」は、或る程度の相補性を意味する。用語「
（配列）同一性」は、用語「相同性」と置換えることができる。同一の配列が標
的の核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する部分的に相補的
な配列を、「実質的に相同」という。完全に相補的な配列と標的配列とのハイブ
リダイゼーションの阻害は、ストリンジェンシー（厳密さ）を低くした条件の下
で、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロット法またはノーザンブロッ
ト法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて調べることができる。実質的に
相同な配列またはプローブは、低いストリンジェンシー条件の下で、標的の配列
と完全に相同な配列またはプローブとの結合（即ちハイブリッド形成）について
競合し、それを阻害する。このことは、低いストリンジェンシー条件が、非特異
的な結合を許容するものであることを意味するわけではない。低いストリンジェ
ンシー条件では、２つの配列の相互の結合が特異的（即ち選択的）相互作用であ
ることが必要だからである。非特異的結合が存在しないことは、部分的な程度の
相補性（即ち約３０％未満の相同性即ち同一性）も有していない第２の標的配列
を用いることにより調べることができる。非特異的結合が存在しない場合、プロ
ーブは第２の非相補的標的配列とハイブリダイズしない。

【００４７】 「ヒト人工染色体」（ＨＡＣｓ）は約１０ｋｂ〜１０ｍｂのサイズのＤＮＡ配
列を含んでいるものであり得、安定した***染色体の分離及び維持に必要な全て
の要素を含む線状の小形染色体である（Harrington, J.J.他 (1997) Nat Genet.
15:345-355）。

【００４８】 本明細書において、用語「ヒト化抗体」は、その元の結合能をそのまま保持し
つつ、ヒトの抗体により近づくように非抗原結合領域のアミノ酸配列を改変した
抗体分子である。

【００４９】 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）」は
、核酸の鎖が塩基対の形成によって相補鎖と結合する過程である。

【００５０】 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なＧ塩
基とＣ塩基の間及び相補的なＡ塩基とＴ塩基の間での水素結合の形成によって、
２つの核酸配列で形成された複合体である。ハイブリダイゼーション複合体は、
溶液中で形成されるか（例えばＣ₀ｔ又はＲ₀ｔ解析の場合）、或いは核酸は溶液
中に存在する一方の核酸と、固体支持体（例えば細胞やその核酸が固定される紙
、メンブラン、フィルター、ピン、またはスライドガラスまたは他の適切な基板
）に固定されたもう一方の核酸との間で形成され得る。

【００５１】 本明細書において「炎症」は「免疫応答」と相互に変換可能であり、両用語は
、外傷、免疫疾患、及び感染症又は遺伝病と関連を有し、かつ細胞や全身の防御
系を活性化する、サイトカイン、ケモカイン、及び他のシグナル伝達分子の産生
によって特性化される状態を指す。

【００５２】 本明細書において、用語「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子と比較し
て、１個または２個以上のヌクレオチド、アミノ酸残基がそれぞれ加わるような
、ヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。

【００５３】 本明細書において、用語「マイクロアレイ」は、個々のポリヌクレオチド又は
オリゴヌクレオチドを基板上に高密度で配列したものである。基板としては、例
えば紙、ナイロン又は他の種類のメンブラン、濾紙、チップ、スライドガラス、
又は他の任意の適切な固体支持体等がある。

【００５４】 本明細書において、用語「変調」は、ＮＴＰＰＨ−２の活性の変化である。例
えば、変調によって、タンパク質の活性の増加や減少、結合特性の変化、又は他
のＮＴＰＰＨ−２の生物学的、機能的、免疫学的特性の変化がもたらされる。

【００５５】 本明細書において「核酸」又は「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレ
オチド、又はポリヌクレオチド、及びその断片、一本鎖か二本鎖であり、またセ
ンス鎖又はアンチセンス鎖である、ゲノム起源の若しくは合成したＤＮＡ又はＲ
ＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は、ＤＮＡ様又はＲＮＡ様物質である。この
文脈において、「断片（フラグメント）」は、長さが６０ヌクレオチド以上の核
酸配列であり、最も好ましくは、長さが１００ヌクレオチド以上又は１０００ヌ
クレオチド以上、及び１００００ヌクレオチド以上の断片である。

【００５６】 本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は、ＰＣＲ増幅又はハイブリ
ダイゼーションアッセイ、若しくはマイクロアレイで用いることができる核酸配
列であって、長さが約６ヌクレオチド以上、最大６０ヌクレオチド程度、好適に
は１５〜３０ヌクレオチド、より好適には２０〜２５ヌクレオチドであるものを
指す。本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」は、当分野において一般
に定義されているような用語「アンブリマー」、「プライマー」、「オリゴマー
」、及び「プローブ」と実質的に同義である。

【００５７】 本明細書において「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）は、末端がリジンであるアミノ
酸残基のペプチドバックボーンに結合した５ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌ
クレオチドを含むアンチセンス分子即ち抗遺伝子剤を意味する。末端のリジンが
この物質に溶解性を与えている。ＰＮＡは、相補的な一本鎖ＤＮＡやＲＮＡに優
先的に結合して転写物の伸長を止め、かつＰＮＡをポリエチレングリコール化す
ることにより、細胞でのその寿命を延ばすことができる（Nielsen, P.E.他(1993
) Anticancer Drug Des. 8:53-63）。

【００５８】 本明細書において、用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている
。ＮＴＰＰＨ−２をコードする核酸またはその断片またはＮＴＰＰＨ−２自体を
含む疑いのある生物学的サンプルには、体液や、細胞から単離された染色体、細
胞小器官、又は細胞膜からの抽出物や、細胞や、（溶液中の、または固体支持体
に結合した）ゲノムのＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡや、組織や、組織プリン
ト（tissue print）その他が含まれる。

【００５９】 本明細書において、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、タン
パク質又はペプチドと、アゴニスト、抗体、及びアンタゴニストとの相互作用で
ある。この相互作用は、結合する分子によって認識されるタンパク質上の特定の
構造（即ち抗原決定基、即ちエピトープ）の存在に左右される。例えば、抗体が
エピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識した「Ａ」及びその抗体を含
む反応において、エピトープＡ（つまり結合していない、非標識のＡ）を含むタ
ンパク質が存在すると、抗体が結合した標識したＡの量が低下する。

【００６０】 本明細書において、用語「ストリンジェントな（厳密な）条件」は、ポリヌク
レオチド配列と、特許請求の範囲に記載されたポリヌクレオチド配列との間のハ
イブリダイゼーションを許容する条件を指す。適切なレベルのストリンジェント
な条件は、例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション領
域における塩又はホルムアミドの濃度、又はハイブリダイゼーション温度によっ
て決定することができ、当分野でよく知られている。詳述すると、ストリンジェ
ンシー（厳密さ）は、塩の濃度を低下させること、ホルムアミドの濃度を上昇さ
せること、又はハイブリダイゼーション温度を高めることによって高めることが
できる。

【００６１】 例えば、高いレベルのストリンジェントな条件の下でのハイブリダイゼーショ
ンは、約３７℃〜４２℃における約５０％のホルムアミド濃度で生じ得る。低い
レベルのストリンジェントな条件の下でのハイブリダイゼーションは、約３０℃
〜３５℃の温度での約３５％〜２５％のホルムアミド濃度で生じ得る。詳述する
と、高いストリンジェンシーの条件の下でのハイブリダイゼーションは、５０％
のホルムアミド濃度、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、及び２００μｇ／ｍｌ
の同じ長さに切り揃えた、変性サケ***ＤＮＡを用いて４２℃で生じ得る。低い
ストリンジェンシーの条件の下でのハイブリダイゼーションは、上述の条件で、
温度を３５℃に下げ、ホルムアミド濃度を３５％にした時に生じ得る。特定のレ
ベルのストリンジェンシーに対応する温度範囲は、目的の核酸のプリン対ピリミ
ジン比を計算し、それに従って温度を調節することによって更に狭めることがで
きる。上述の温度範囲及び条件の変更については当分野で周知である。

【００６２】 本明細書において、用語「実質的に精製」は、天然の環境から取り除かれ、単
離または分離されて、自然にはそれが結合して存在する他の構成要素が６０％以
上、好ましくは７５％以上、最も好ましくは９０％以上除去された核酸配列又は
アミノ酸配列である。

【００６３】 本明細書において「置換」は、１個または２個以上のヌクレオチド或いはアミ
ノ酸を、それぞれ異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置き換えることである。

【００６４】 本明細書の定義では、「形質転換」は、外来ＤＮＡが入ってレシピエント細胞
を変化させるプロセスを意味する。このプロセスは、よく知られた様々な方法を
用いて、自然または人工の条件の下で生じ得る。形質転換は、外来核酸配列を原
核生物または真核生物の宿主細胞に挿入するための既知の方法によって行うこと
ができる。この方法は形質転換される宿主細胞の型に基づいて選択され、以下に
限定するものではないが、ウイルスを感染させる方法、電気穿孔法（エレクトロ
ポレーション）、リポフェクション、及び微粒子銃を用いる方法等があり得る。
このような「形質転換された」細胞には、そのなかで挿入されたＤＮＡが、自律
的に複製するプラスミドか、または宿主の染色体の一部として複製できる、安定
的に形質転換された細胞がある。またこのような細胞には、限られた時間での挿
入されたＤＮＡやＲＮＡの一過性の発現が起こる細胞もある。

【００６５】 本明細書においてＮＴＰＰＨ−２の「変異体」は、１又は２箇所以上のアミノ
酸が変化したアミノ酸配列である。この変異体は「保存的」変化を含むものであ
り得、この保存的変化の場合は、例えばロイシンをイソロイシンで置き換える場
合のように置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性を有する。稀に、
変異体が「非保存的」に変化する場合もあり、この非保存的変化の場合は、例え
ばグリシンがトリプトファンで置換される。類似した小さな変化として、アミノ
酸の欠失か挿入、若しくはその両方が含まれる。生物学的或いは免疫学的活性を
損なわずに置換、挿入、又は欠失させることができるアミノ酸は何れかというこ
とは、例えばDNASTARソフトウエアのような周知のコンピュータプログラムを用 いて決定することができる。

【００６６】 （発明） 本発明は、新規なヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ（ＮＴＴＰＨ−
２）、ＮＴＴＰＨ−２をコードするポリヌクレオチド、及び関節症、免疫疾患、
及び癌の診断、処置、又は予防のためのこれらの組成物の使用法の発見に基づく
ものである。

【００６７】 本発明のＮＴＴＰＨ−２をコードする核酸は、変形性関節症軟骨細胞ｃＤＮＡ
ライブラリー（SATPF 1008）を起源とするインサイト社クローンNo. 1388013、1
423393、及び1423402においてヌクレオチド配列の相同性のコンピュータ検索及 び部分的なブタｃＤＮＡ配列を用いて初めに特定された（Masuda, 前出）。４．
１ｋｂの配列は、インサイト社クローンNo. 1423393を起源とするｃＤＮＡイン サートをハイブリダイゼーションプローブとして用いて、軟骨細胞ライブラリー
において特定された。４．１ｋｂのクローンの５’末端コーティング領域からの
７００ｂｐの制限断片を用いて、変形性関節症軟骨細胞ライブラリーを再度スク
リーニングすると、適切なコザック（Kozak）開始配列及びシグナル配列を備え た、ＮＴＴＰＨ−２をコードする完全長遺伝子が得られた。この配列と、好適Ｄ
ＮＡ配列データベースにおけるあらゆる配列との間に一致は見られなかった。本
出願の完全長ＮＴＴＰＨ−２のｃＤＮＡは、（ 年 月 日）にAmerican Type
Culture Collection, Bethesda, MDに受入番号 として登録された。

【００６８】 或る実施態様では、本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドを包含する。ＮＴＴＰＨ−２は１１５６個のアミノ酸からなる長さを有し（
図１Ａ〜図１Ｋ）、且つＮ（２７６番）、Ｎ（３０８番）、Ｎ（３２９番）に３
個のＮグリコシル化可能部位を、Ｔ（２４番）、Ｓ（１３５番）、Ｓ（２２９番
）、Ｔ（２４５番）、Ｓ（２６７番）、Ｓ（３２５番）、Ｔ（３３１番）、Ｔ（
３７２番）、Ｓ（４２７番）、Ｓ（４３４番）、Ｓ（４３９番）、Ｔ（５１７番
）、Ｔ（５２３番）、Ｙ（５９９番）、Ｔ（６０８番）、Ｓ（６３０番）、Ｔ（
７５０番）、Ｔ（８４７番）、Ｓ（８８３番）、Ｙ（９０９番）、Ｓ（９７７番
）、Ｓ（１０１７番）、Ｔ（１０６３番）、Ｓ（１０６８番）、及びＴ（１１４
９番）に２５個のリン酸化可能部位を有する。図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃに示
すように、ＮＴＴＰＨ−２は、ＮＴＴＰＨ−１（配列番号：３）と化学的及び構
造的相同性を有する。詳述すると、ＮＴＴＰＨ−２とＮＴＴＰＨ−１とは５０％
の配列同一性を共有している。これらの相同な分子間を区別するためのハイブリ
ダイゼーションプローブとして直接用いられる、或いはオリゴヌクレオチドの設
計に役立つ核酸配列の断片としては、５５番目乃至７５番目のヌクレオチド、４
８１番目乃至５０７番目のヌクレオチド、６４６番目乃至６６９番目のヌクレオ
チド、２１８２番目乃至４１４９番目のヌクレオチド、１７２６番目乃至４１４
９番目のヌクレオチド、７５７番目乃至４１４９番目のヌクレオチド、及び１１
３番目乃至４１４９番目のヌクレオチドからなる断片が挙げられる。図３Ａ及び
図３Ｂに示すように、ＮＴＴＰＨ−２とＮＴＴＰＨ−１は類似な疎水性プロット
を示し、両者は疎水性シグナル配列を示す。ＮＴＴＰＨ−２及びＮＴＴＰＨ−１
の推定上の等電点は、それぞれ８．０７及び８．２１である。膜をベースにした
ノーザン解析の結果から、軟骨における最も高いレベルのＮＴＴＰＨ−２のｍＲ
ＮＡの発現、及び精巣、器官、及び骨髄におけるより低いが有意なレベルの発現
が分かった。電子的なノーザン解析の結果から、様々なライブラリーにおけるこ
の配列の発現が分かる。そのようなライブラリーの少なくとも５７％は免疫応答
関連であり、そのようなライブラリーの殆どは軟骨又は関節関連であり、そのよ
うなライブラリーの少なくとも２６％は不死化又は癌細胞及び組織に関連するも
のである。特に注目すべきは、リウマチ性及び変形性関節症の滑液、軟骨細胞、
及び脛骨ライブラリーにおけるＮＴＴＰＨ−２の発現である。

【００６９】 また本発明は、ＮＴＴＰＨ−２の変異体を包含する。好ましいＮＴＴＰＨ−２
の変異体は、ＮＴＴＰＨ−２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、より好まし
くは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同
一性を有し、且つＮＴＴＰＨ−２を生物学的、免疫学的、又は他の機能的特徴又
は活性の少なくとも１種類を保持しているものである。

【００７０】 また本発明は、ＮＴＴＰＨ−２をコードするポリヌクレオチドを包含する。特
定の実施態様では、本発明は、配列番号：２の配列を有し、ＮＴＴＰＨ−２をコ
ードするポリヌクレオチド配列を包含する。

【００７１】 また本発明は、ＮＴＴＰＨ−２をコードするポリヌクレオチド配列の変異体を
包含する。詳述すると、そのような変異体ポリヌクレオチド配列は、ＮＴＴＰＨ
−２をコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも約８０％、より好ましく
は少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のポリヌクレオチド
配列同一性を有する。本発明の特定の実施態様は、配列番号：２と少なくとも約
８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５
％のポリヌクレオチド配列同一性を有する、配列番号：２の変異体を包含する。
加えて、これらの変異体によってコードされるアミノ酸配列は、ＮＴＴＰＨ−２
の機能的又は構造的特徴の少なくとも１種類を有し得る。

【００７２】 当業者には理解されるように、遺伝暗号の縮重の結果、任意の既知の自然発生
遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の相同性しか有していないものも含めて、多
種のＮＴＰＰＨ−２をコードするヌクレオチド配列が作り出され得る。従って本
発明は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することによって作り出さ
れるあらゆる可能な核酸配列の変異をその範囲に含んでいる。それらの組み合わ
せは、自然発生のＮＴＰＰＨ−２のヌクレオチド配列に適用されるような標準的
なトリプレット遺伝暗号に基づいて作り出されるものであり、このような変異は
全てここに具体的に開示されたものと考えられたい。

【００７３】 ＮＴＰＰＨ−２をコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適切に選
択されたストリンジェンシーの条件の下で自然発生配列のヌクレオチド配列とハ
イブリダイズ可能であるのが好ましいが、実質的に異なるコドンを有しているＮ
ＴＰＰＨ−２又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有
益であり得る。コドンの選択においては、特定のコドンが宿主によって使用され
る頻度に従って、特定の原核細胞又は真核細胞の発現宿主におけるペプチド発現
の発生率を高めるように選択することができる。ＮＴＰＰＨ−２及びその誘導体
をコードするヌクレオチド配列を、コードされるアミノ酸配列が変わらないよう
に実質的に改変する他の理由として、例えば自然発生配列から作られる転写物よ
り長い半減期のような、より望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を作り出すこと
が挙げられる。

【００７４】 本発明の範囲には、ＮＴＰＰＨ−２又はその誘導体をコードするＤＮＡ配列又
はその断片の、完全な合成ケミストリによる作製も含まれる。作製した後、この
合成遺伝子を、周知の試薬を用いて入手可能な様々な発現ベクター及び細胞系に
挿入することができる。更に、合成ケミストリを用いてＮＴＰＰＨ−２をコード
する配列又はその任意の断片に突然変異を導入することができる。

【００７５】 また本発明の範囲に含まれるものとして、Wahl, G.M. 及びS.L.Berger（1987;
Methods Enzymol. 152:399-407）及びKimmel, A.R.（1987; Methods in Enzymo
l. 152:507-511）に教示されている様々なストリンジェンシーの条件の下で請求
項に記載のヌクレオチド配列、特に配列番号：２又は配列番号：２の断片のヌク
レオチド配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列がある。

【００７６】 ＤＮＡシークエンシングの方法は、周知で当業者が通常利用可能であり、本発
明の実施例の何れかの実施のために用いることができる。この方法では、例えば
ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenowフラグメントであるSequenase（US Biochemical
Corp. Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱安定性T7ポリメ ラーゼ（Amersham, Chicago IL）、或いはGibco BRL（Gaithersburg MD）から発
売されているELONGASE Amplification Systemに見られるもののような校正エキ ソヌクレアーゼと組換え体ポリメラーゼとの組み合わせたもののような酵素を用
いることができる。このプロセスは、Hamilton Micro Lab2200（Hamilton, Reno
, NV）、Peltier Thermal Cycler（PTC200；MJ Reserch, Watertown MA）並びに
ABI Catalyst及びABI377及び377 DNAシーケンサ（Perkin Elmer）のような装置 を用いて自動化するのが好ましい。

【００７７】 ＮＴＰＰＨ−２をコードする核酸配列を、部分的なヌクレオチド配列を利用し
て、周知の様々な方法を用いて伸長させ、プロモーター及び調節エレメントのよ
うな上流の配列を検出することができる。例えば、使用可能な方法の一つである
制限部位ＰＣＲ法では、汎用プライマーを用いて既知の位置に隣接する未知の配
列を得る（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322）。詳述すると、
まずゲノムＤＮＡを、既知の領域に特異的なプライマー及びリンカー配列に対す
るプライマーの存在の下で増幅する。増幅された配列を、同じリンカープライマ
ーと最初のプライマーの内に含まれる別の特異的プライマーを用いてＰＣＲの２
巡目にかける。各回のＰＣＲの産物を、適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写
させ、逆転写酵素を用いて配列決定する。

【００７８】 既知の領域に基づく多様なプライマーを利用した配列の増幅、または延長のた
めに、逆ＰＣＲ法を用いることもできる（Triglia, T.他（1988）Nucleic Acids
Res 16:8186）。プライマーは、OLIGO 4.06 Primer Analysis software（Natio
nal Biosciences Inc., Plymouth MN）のような市販のソフトウェアや他の適切 なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含量が５０％以上
、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計する。この方
法では数種の制限酵素を用いて遺伝子の既知の領域の適当な断片を作り出す。次
にこの断片を分子内ライゲーションにより環状にし、ＰＣＲ用の鋳型として使用
する。

【００７９】 使用できる別の方法にキャプチャＰＣＲ法があり、この方法ではヒト及び酵母
菌人工染色体ＤＮＡ内の既知の配列に隣接するＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅
する（Lagerstrom, M.他（1991）PCR Methods Applic 1:111-119）。この方法で
は、ＰＣＲを行う前に、複数の制限酵素による消化及び連結によってそのＤＮＡ
分子の未知の断片のなかに、組換え二本鎖配列を組み入れておくこともできる。
未知の配列を得るために用いることができる別の方法は、Parker, J.D.他の方法
（1991; Nucleic Acids Res 19:3055-3060）である。更に、ＰＣＲ、入れ子プラ
イマー、PromoterFinder^TMライブラリーを用いて、ゲノムＤＮＡ内歩行を行うこ
とができる（Clontech, Palo Alto CA）。このプロセスは、ライブラリーをスク
リーニングする必要がなく、イントロン／エクソン接合部を探し出すのに有用で
ある。

【００８０】 完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするときには、より大きなｃＤＮＡを含むよ
うにサイズ選択されたライブラリーを用いるのが好ましい。またランダムプライ
ミングした（random primed）ライブラリーは、遺伝子の５′領域を含む配列を より多く含むという点で好適である。ランダムプライミングしたライブラリーを
用いることは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーでは完全長ｃＤＮＡが得られない場
合に特に好ましい。またゲノムライブラリーは、転写されない５′調節領域まで
配列を延長するために有用であり得る。

【００８１】 シークエンシングやＰＣＲの産物のヌクレオチド配列をサイズ分析したりその
存在を確認するために、市販のキャピラリー電気泳動システムを用いることがで
きる。特に、キャピラリーシークエンシングでは、電気泳動による分離のための
流動性ポリマー、レーザーで活性化される４種の異なる蛍光色素（各ヌクレオチ
ドに対して１種類）を使用し、ＣＣＤカメラにより放射された波長の検出を行う
。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えばPerkin Elmer製のGenotyper^TM及 びSequence Navigator^TM）を用いて電気信号に変換され、サンプルの負荷からコ
ンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコンピュータ制御される。キ
ャピラリー電気泳動法は、特定のサンプル内に少量しか存在しないようなＤＮＡ
の小片の配列決定に特に適している。

【００８２】 本発明の別の実施例では、ＮＴＰＰＨ−２をコードするポリヌクレオチド配列
またはその断片を組換えＤＮＡ分子に組み入れることにより、適切な宿主細胞内
でのＮＴＰＰＨ−２、その断片または機能的等価物の発現を誘導することができ
る。遺伝暗号固有の縮重のために、実質的に同一即ち機能的に等価なアミノ酸配
列をコードする他のＤＮＡ配列も作り出され得、これらの配列をＮＴＰＰＨ−２
のクローン化や発現のために用いることができる。

【００８３】 当業者には理解されるように、非自然発生コドンを有するＮＴＰＰＨ−２コー
ディングヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。例えば、特定の原
核細胞或いは真核細胞の宿主において選好されるコドンを選択して、タンパク質
の発現率を増大させたり、或いは自然発生配列から生成された転写物より長い半
減期のような望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を作り出すことができる。

【００８４】 本発明のヌクレオチド配列は、様々な目的でＮＴＰＰＨ−２をコードする配列
を改変するために、周知の方法を用いて組換えることができる。この配列改変の
目的としては、限定するものではないが、例えば遺伝子産物のクローニング、プ
ロセシング及び／又は発現を変えること等が挙げられる。無作為断片によるＤＮ
Ａ再編成や遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲによる再構成（reas
sembly）によって、ヌクレオチド配列を組換えることができる。例えば、特定部
位突然変異誘発によって、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更
、コドン選好の変化、スプライスバリアントの生成、及び突然変異の導入等をも
たらすことができる。

【００８５】 本発明の別の実施例では、元のＮＴＰＰＨ−２コーディング配列、改変したＮ
ＴＰＰＨ−２コーディング配列、或いは組換えＮＴＰＰＨ−２コーディング配列
を異種の配列に結合して、融合タンパク質をコードする配列にすることができる
。例えば、ＮＴＰＰＨ−２活性のインヒビターをペプチドライブラリーからスク
リーニングするために、市販の抗体により認識されるキメラＮＴＰＰＨ−２タン
パク質をコードすることが役立つことがある。融合タンパク質はＮＴＰＰＨ−２
をコードする配列と異種のタンパク質配列との間の位置に切断部位を有する形に
設計することもでき、これによってＮＴＰＰＨ−２を切断して、異種の部分から
分けて精製することが可能となる。

【００８６】 本発明の別の実施例では、周知の化学的方法（例えばCaruthers. M.H.他（198
0）Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-223; Horn, T.他（1980）Nucl. Acids
Res. Symp. Ser. 225-232参照）を用いて、ＮＴＰＰＨ−２をコードする配列の 全体、或いはその一部を合成することができる。或いは、化学的方法を用いてタ
ンパク質自体を作り出して、ＮＴＰＰＨ−２のアミノ酸配列またはその断片を合
成することができる。例えば、様々な固相技術（Roberge, J.Y.他(1995) Scienc
e 269:202-204）でペプチド合成を行うことができ、合成の自動化は、例えばABI
431Aペプチド合成機（Perkin Elmer）を用いることにより達成することができ る。

【００８７】 この新たに合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーにより
実質的に精製することができる（例えばCreighton T.（1983）Proteins Structu re and Molecular Principles , WH Freeman and Co., NY参照）。合成されたペ プチドの組成は、アミノ酸解析或いはシークエンシングにより確認することがで
きる（例えばエドマン分解法；Creighton, 前出）。さらにＮＴＰＰＨ−２のア ミノ酸配列或いはその任意の一部分を、その直接の合成の際の改変することによ
り、及び／又は化学的方法を用いて他のタンパク質或いはその任意の部分に由来
する配列と結合させることにより、変異体ポリペプチドを作り出すことができる
。

【００８８】 生物学的に活性なＮＴＰＰＨ−２を発現させるためには、ＮＴＰＰＨ−２をコ
ードするヌクレオチド配列或いはその機能的等価物を、適切な発現ベクター、す
なわち挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含むベ
クターに挿入する。

【００８９】 ＮＴＰＰＨ−２をコードする配列及び適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現
ベクターを作製するために当業者に周知の方法を用いることができる。これらの
方法としては、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo遺伝子組 換え技術が挙げられる。このような技術は、Sambrook, J.他（1989）Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, Planview NY及びA
usubel, F.M.他Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley &Sons, N
ew York, NYに記載されている。

【００９０】 ＮＴＰＰＨ−２コーディング配列の保持、発現のために様々な発現ベクター／
宿主系を用いることができる。このようなものとしては、限定するものではない
が、組換えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクター
で形質転換した細菌のような微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母
菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞
系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMV、タバ
コモザイクウイルスTMV）或いは細菌の発現ベクター（例えばTi、或いはpBR322 プラスミド）で形質転換した植物細胞系や、或いは動物細胞系等が挙げられる。
本発明は、使用される宿主細胞によって限定されるものではない。

【００９１】 「調節領域」或いは「制御配列」とは、転写及び翻訳を行うために宿主細胞の
タンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域、即ちエンハンサー、プロモー
ター及び３′非翻訳領域である。このようなエレメントの作用の強さや特異性は
様々に異なったものであり得る。使用されるベクター系及び宿主に応じて、構成
的及び誘導的プロモーターを含む適切な転写及び翻訳エレメントを任意の数だけ
用いることができる。例えば、細菌系にクローン化する際には、Bluescript フ ァージミド（Stratagene, LaJolla CA）またはpSportI^TMプラスミド（Gibco BRL
）等のハイブリッドlacZプロモーターのような誘導的プロモーターを用いること
ができる。昆虫細胞では、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターを用いる
ことができる。植物細胞のゲノムに由来するプロモーター或いはエンハンサー（
例えば熱ショック RUBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子）、若しくは植物ウイルス
に由来するプロモーター或いはエンハンサー（例えばウイルス性プロモータ或い
はリーダー配列）を、ベクターにクローン化してもよい。哺乳動物の細胞系では
、哺乳動物の遺伝子或いは哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが適している。
ＮＴＰＰＨ−２をコードする配列の複数のコピーを含む細胞系を作る必要がある
場合には、SV40またはEBVをベースにしたベクターを適切な選択マーカーと共に 用いることができる。

【００９２】 細菌系では、ＮＴＰＰＨ−２の用途に応じて多種の発現ベクターを選択するこ
とができる。例えば抗体の誘発のために大量のＮＴＰＰＨ−２が必要な場合には
、精製が容易であり得る融合タンパク質を高レベルで発現できるベクターを用い
ることができる。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、多機
能の大腸菌クローニング・発現ベクターである、Bluescript（Stratagene）（こ
のベクターでは、ＮＴＰＰＨ−２をコードする配列を、アミノ末端メチオニン及
び後続のβ−ガラクトシダーゼの７個の残基からなる配列を備えたベクターのフ
レーム内に結合してハイブリッドタンパク質を生成できる）や、pINベクター（V
an Heeke, G.及びS.M. Schuster（1989）J. Biol. Chem. 264:5503-5509）等が 挙げられる。また、グルタチオンS−トランスファーゼ（GST）との融合タンパク
質として外来ポリペプチドを発現させるために、pGEXベクター（Promage、Madis
on WI）を用いることもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性で あり、グルタチオンアガロースビーズに吸着させた後、フリーのグルタチオンの
存在下で溶出させることによって溶解した細胞から容易に精製できる。そのよう
な系において作り出されるタンパク質は、ヘパリン、トロンビン或いはＸａ因子
プロテアーゼ切断部位を含むように設計し、目的のクローン化ポリペプチドをGS
T部分から随意に放出させられるようにすることができる。

【００９３】 酵母菌、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因
子、アルコールオキシダーゼ及びPGHのような構成的或いは誘導的プロモーター を含む多種のベクターを用いることができる。その概要を知るには、Ausubel他 （前出）及びGrant他（1987）Methods Enzymol 153:516-544を参照されたい。

【００９４】 植物の発現ベクターを用いる場合、ＮＴＰＰＨ−２をコードする配列の発現は
、多数のプロモーターの何れかによって促進され得る。例えばＣａＭＶの35S及 び19Sプロモーターのようなウイルスのプロモーターを、単独で、或いはＴＭＶ （Takamatsu,N.他（1987）EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と組み
合わせて用いることができる。或いは、RUBISCOの小サブユニット、熱ショック プロモーターのような植物のプロモーターを用いてもよい（Coruzzi, G.他（198
4）EMBO J 3:1671-1680）; Broglie, R.他（1984）Science 224:838-843; 及びW
inter, J.他（1991）Results Probl. Cell Differ. 17:85-105）。これらの作製
物は、直接のＤＮＡ形質転換或いは病原体を介したトランスフェクションにより
植物細胞内に導入できる。このような技術は、様々な一般に入手できる文献に記
載されている（例えばMcGraw Hill Yearbook of Science and Technology（1992
）McGraw Hill NY, pp191-196に記載のHobbs, S.又はMurry, L.E.を参照された い）。

【００９５】 ＮＴＰＰＨ−２の発現のために昆虫系も用いることができる。例えば、そのよ
うな系の一つでは、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞或いはイラクサキ ンウワバ（Trichoplusia）幼虫において外来遺伝子を発現するためのベクターと
して、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV）を用いる。ＮＴＰ ＰＨ−２をコードする配列は、ポリヘドリン（polyhedrin）遺伝子のようなウイ
ルスの非必須領域にクローン化して、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置く
ことができる。ＮＴＰＰＨ−２コーディング配列の挿入が成功すると、ポリヘド
リン遺伝子が失活し、コートタンパク質膜を欠く変異体ウイルスが生成される。
次に、この変異体ウイルスを、ヨトウガ（S.frugiperda）細胞或いはイラクサキ
ンウワバ（Trichoplusia）幼虫へ感染させ、その中でＮＴＰＰＨ−２を発現させ
ることができる（Engelhard, E.K.他（1994）Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3
227）。

【００９６】 哺乳動物の宿主細胞では、様々なウイルスをベースにした発現系を利用するこ
とができる。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、ＮＴＰ
ＰＨ−２をコードする配列は、後期プロモータ及び三連リーダー配列からなるア
デノウイルス転写／翻訳コンプレックス（transcription/translation complex ）のなかに結合することが可能である。ウイルスのゲノムにおける必須でないE1
又はE3領域へ挿入することにより、感染した宿主細胞でＮＴＰＰＨ−２を発現で
きる生ウイルスが得られる（Logan, J.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad
. Sci. 81:3655-3659）。加えて、哺乳類宿主細胞内の発現を増加させるために ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いるこ とができる。

【００９７】 また、ヒト人工染色体（ＨＡＣｓ）を用いることにより、プラスミドに含めて
発現させることができるＤＮＡ断片より大きいＤＮＡの断片を供給することもで
きる。治療上の目的で、６〜１０ＭのＨＡＣｓを構築し、それを従来のデリバリ
ー方法（リポソーム、ポリカチオンのアミノポリマー、又は小胞）を利用して供
給することができる。

【００９８】 また、ＮＴＰＰＨ−２をコードする配列のより効率的な翻訳のためには、特定
の開始シグナルも必要である。このようなシグナルとしては、ATG開始コドン及 び隣接する配列が挙げられる。ＮＴＰＰＨ−２及びその開始コドン及び上流配列
が適切な発現ベクター内に挿入される場合には、他の転写または翻訳の制御シグ
ナルは不要である。しかし、コーディング配列又はその断片のみが挿入される場
合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを与えなければならない 。さらに、全インサートの転写が確実に行われるようにするために、開始コドン
は正しい読み枠に存在しなければならない。外来転写エレメント及び開始コドン
は、自然及び合成両方の様々な起源に由来するものであり得る。例えば文献（Sc
harf,D.他（1994）Results Probl. Cell Differ. 20:125-162）に記載されてい るように、使用される特定の細胞系に適切なエンハンサーを含めることにより、
発現の効率を高めることができる。

【００９９】 加えて、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するその能力、若しくは
発現したタンパク質を望ましい形にプロセシングするその能力ついて選択するこ
とができる。このようなポリペプチドの修飾としては、以下のものに限定はしな
いが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipida
tion）並びにアシル化等が挙げられる。またタンパク質の「プレプロ」部分を切
り離す翻訳後プロセシングも、正しい挿入、折り畳み、及び／又は機能の発揮の
ために重要である。そのような翻訳後の作用のための特定の細胞装置及び特徴的
な機構を有している種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、及びWI3
8）は、American Type Culture Collection（ATCC; Bethesda, MD）より入手で き、導入される外来タンパク質の正しい修飾やプロセシングが確実に行われるよ
うに、このなかから選択することができる。

【０１００】 長期間にわたって組換えタンパク質の高収率の産生を確保するためには安定し
た発現が望ましい。例えば、ウイルスの複製起点及び／または内在性発現エレメ
ント及び選択マーカー遺伝子を同一のベクター上、或いは別のベクター上に含む
発現ベクターを用いることにより、ＮＴＰＰＨ−２を安定的に発現する細胞系を
形質転換することができる。ベクターの導入の後、細胞は、選択培地に切り替え
る前に濃縮培地内で１〜２日間増殖させる。選択マーカーの目的は、選択のため
の耐性を与え、その存在に基づいて導入された配列を発現する細胞を増殖、回収
できるようにすることである。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、
その細胞の型に適した組織培養技術を用いて増殖することができる。

【０１０１】 形質転換された株細胞を回収するために任意の数の選択系を用いることができ
る。選択系としては、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミ
ジンキナーゼ（tk）（Wigler, M.他（1977）Cell 11:223-32）及びアデニンホス
ホリボシルトランスフェラーゼ（aprt）（Lowy, I.他（1980）Cell 22:817-23）
遺伝子等があり、それぞれtk^-又はaprt^-細胞において用いられる。また代謝拮抗
物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の基礎として用いることができる。
例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え（Wigler, M.他(1980) Proc.
Natl. Acad. Sci. 77:3567）、nptはアミノ配糖体のネオマイシン及びG-418に 対する耐性を与え（Colberre-Garapin, F.他（1981）J. Mol. Biol. 150:1-14）
、als或いはpatはクロルスルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンア セチルトランスフェラーゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐 性を与える（Murry, 前出）。別の選択に利用できる遺伝子として、例えば細胞 がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするtrpB、細胞がヒ
スチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるようにするhisDが文
献に記載されている（Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Natl. Ac
ad. Sci. 85:8047-51）。最近になって、形質転換体を特定するためばかりでは なく、特定ベクター系による一過性の或いは安定的なタンパク質発現の量を定量
するために、例えばアントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質である
GUS、及びルシフェラーゼ及びその基質であるルシフェリンのような可視マーカ ーが用いられるようになった（Rhodes, C.A.他（1995）Methods Mol. Biol. 55:
121-131）。

【０１０２】 マーカー遺伝子の発現の存在／不存在が目的の遺伝子の存在をも示唆するが、
その存在及び発現を確認する必要がある場合がある。例えばＮＴＰＰＨ−２をコ
ードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入される場合は、ＮＴＰＰＨ−２をコ
ードする配列を含む形質転換された細胞を、マーカー遺伝子の機能を欠いている
ことで確認できる。或いは、マーカー遺伝子が、ＮＴＰＰＨ−２をコードする配
列と直列に配置されて、両者が単一のプロモータの制御下となり得る。誘導また
は選択に応じてのマーカー遺伝子の発現は、通常、直列に配置された配列の発現
をも同時に示すことになる。

【０１０３】 或いは、当業者には周知の様々な方法により、ＮＴＰＰＨ−２をコードする核
酸配列を含みＮＴＰＰＨ−２を発現する宿主細胞を特定できる。このような方法
としては、以下に限定するものではないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮ
Ａハイブリダイゼーションや、核酸及びタンパク質を検出及び／又は定量するた
めの膜、溶液、或いはチップを用いる技術を含むタンパク質バイオアッセイ或い
はイムノアッセイ等が挙げられる ＮＴＰＰＨ−２をコードする配列のプローブ、一部分、或いは断片を用いるＤ
ＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅により、Ｎ
ＴＰＰＨ−２をコードするポリヌクレオチド配列の存在を検出することができる
。核酸増幅を利用するアッセイでは、ＮＴＰＰＨ−２をコードするＤＮＡ或いは
ＲＮＡを含む形質転換体を検出するために、ＮＴＰＰＨ−２をコードする配列を
ベースにしたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーを用いる。

【０１０４】 ＮＴＰＰＨ−２の発現を検出、測定するための、このタンパク質に特異的なポ
リクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれかを用いる様々なプロトコル
が周知である。このようなプロトコルの例としては、酵素結合免疫検定法（ＥＬ
ＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光表示式細胞分取器法（ＦＡ
ＣＳ）が挙げられる。ＮＴＰＰＨ−２ポリペプチド上で２種の非干渉なエピトー
プに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナルベース
イムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好適であるが、
競合的結合アッセイも用いることができる。これらアッセイの並びに他のアッセ
イは、他の文献、Hampton, R.他（1990; Serological Methods, a Laboratory M anual , APS Press, St. Paul MN）及びMaddox, D.E.他（1983, J. Exp. Med. 15
8:1211-1216）に記載されている。

【０１０５】 さらに様々な標識・結合技術が周知であり、様々な核酸及びアミノ酸のアッセ
イにおいて用いることができる。近縁な配列を検出するための、標識されたハイ
ブリダイゼーションプローブやＰＣＲプローブを作製するための手段としては、
オリゴ標識、ニックトランスレーション法、末端標識、或いは標識したヌクレオ
チドを用いるＰＣＲ増幅等が挙げられる。或いは、ＮＴＰＰＨ−２をコードする
配列またはその任意の断片を、ｍＲＮＡプローブの作製のためベクターにクロー
ン化する。そのようなベクターは周知で、市販されており、これを用いてT7、T3
、或いはSP6のような適切なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを 加えることによって、in vitroでＲＮＡプローブを合成することができる。この
ような方法は、種々の市販のキット（Pharmacia & Upjohn（Kalamazoo, MI）；P
romega（Madison WI）；及びU.S. Biochemical Corp.（Cleveland OH））を用い
て実施することができる。検出を容易にするために用いられる適切なリポーター
分子、即ち標識としては、放射性核種、酵素、フルオレセント（蛍光剤）、化学
発光剤或いは色素剤のほか、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子等が挙げ
られる。

【０１０６】 ＮＴＰＰＨ−２をコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、
このタンパク質を細胞培地で発現させ、そこから回収するのに適した条件の下で
培養することができる。形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、用
いられる配列及び／またはベクターに応じて、分泌されるか、或いは細胞内に含
められる。当業者には理解されるように、ＮＴＰＰＨ−２をコードするポリヌク
レオチドを含む発現ベクターを、原核細胞か真核細胞の細胞膜を通してのＮＴＰ
ＰＨ−２の分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計することができる。ま
た他の構築物を用いて、ＮＴＰＰＨ−２をコードする配列を、可溶性タンパク質
の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合
することができる。そのような精製を容易にするドメインとしては、限定するも
のではないが、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファンモ
ジュールのような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上での精製を可
能にするプロテインＡドメイン、並びにFLAGS 延長／アフィニティ精製システム
（Immunex Corp., Seattle WA）において用いられるドメイン等が挙げられる。 精製ドメインとＮＴＰＰＨ−２の間に、例えばＸａ因子またはエンテロキナーゼ
に特異的な配列（Invitrogen, San Diego CA）のような切断可能なリンカー配列
を含めることによって、精製を促進することができる。このような発現ベクター
の１つは、ＮＴＰＰＨ−２をコードする配列とともに、６個のヒスチジン残基を
コードする核酸配列、それに続くチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位
をコードする配列を発現させて、融合タンパク質を作り出す。ヒスチジン残基が
固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（IMIAC、Porath, J.他（199
2）Prot. Exp. Purif. 3: 263-281に記載）での精製を容易にするとともに、エ ンテロキナーゼ切断部位が融合タンパク質からＮＴＰＰＨ−２を精製するための
手段となる。融合タンパク質を含むベクターについての解説は、Kroll, D.J.他 （1993; DNA Cell Biol. 12:441-453）に記載されている。

【０１０７】 ＮＴＰＰＨ−２の断片は、組換え体の作製による方法のみならず、固相技術を
用いた直接的なペプチド合成によってもを作り出すことができる（Merrifield J
. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154参照）。タンパク質合成は手作業で 行えるが、自動化することもできる。自動的な合成は、例えば、Applied Biosys
tem 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことができる。様
々なＮＴＰＰＨ−２の断片を個別に化学的に合成し、それを化学的方法で結合し
て完全長分子を作り出すことも可能である。

【０１０８】 （治療） ＮＴＴＰＨ−２とヒトＮＴＴＰＨ−１（配列番号：３）との間に化学的及び構
造的相同性が存在する。ＮＴＴＰＨ−２のｃＤＮＡとハイブリダイズする転写物
は、軟骨、精巣、器官、及び骨髄の組織において検出された。また、電子的なノ
ーザン法による解析の結果から、免疫関連の組織（５７％；滑膜及び軟骨組織を
含む）、及び癌性組織（２６％）におけるＮＴＴＰＨ−２の発現が分かった。従
って、ＮＴＴＰＨ−２は、関節症、免疫疾患、及び癌において一定の役割を果た
していると考えられる。

【０１０９】 従って、或る実施例では、関節症の予防又は処置のために、ＮＴＴＰＨ−２の
アンタゴニストを被験者に投与し得る。関節症としては、以下に限定するもので
はないが、ベーチェット症候群、シャルコー骨関節病症、ＣＰＰＤ病、糖尿病神
経障害性関節症、変形性関節疾患、繊維筋痛、ヘモクロマトーシス、血友病性関
節症、ジャコー関節炎、エリテマトーデス、混合型結合組織病、マックル・ウェ
ルズ症候群、変形性関節症、全身性進行性硬化症、偽痛風、乾癬、ライター症候
群、リウマチ性関節炎、シェーグレン症候群、及び脊椎関節症等が挙げられる。
或る実施態様では、ＮＴＴＰＨ−２に特異的に結合する抗体を、アンタゴニスト
として直接的に用いたり、或いはＮＴＴＰＨ−２を発現する細胞又は組織に薬物
を送達するためのターゲティング又はデリバリー機構として間接的に用いること
ができる。

【０１１０】 別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む関節症
の処置又は予防のために、ＮＴＴＰＨ−２をコードするポリヌクレオチドに相補
的な分子を発現するベクターを被験者に投与し得る。

【０１１１】 別の実施態様では、免疫疾患の予防又は処置のために、ＮＴＴＰＨ−２のアン
タゴニストを被験者に投与し得る。免疫疾患としては、以下に限定するものでは
ないが、ＡＩＤＳ、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、貧血症、喘
息、アテローム性動脈硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、
アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、腎炎
、痛風、グレーブス病、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症
筋無力症、心筋炎又は心膜炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、強皮症、自己免疫
性甲状腺炎、及び潰瘍性大腸炎；癌と血液透析と体外循環の合併症；ウイルス感
染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、原虫感染、及び蠕虫感染；及び外傷等が
挙げられる。このような疾患は、サイトカインの産生や、白血球マクロファージ
、及び組織の損傷又は炎症性メディエータに応じての組織の不適切な増殖又は肉
芽腫性組織の精製を引き起こし得る他の細胞の増殖によって特性化され得る。或
る実施態様では、ＮＴＴＰＨ−２に特異的に結合する抗体を、アンタゴニストと
して直接的に用いたり、或いはＮＴＴＰＨ−２を発現する細胞又は組織に薬物を
送達するためのターゲティング又はデリバリー機構として間接的に用いることが
できる。

【０１１２】 別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む免疫疾
患の処置又は予防のために、ＮＴＴＰＨ−２をコードするポリヌクレオチドに相
補的な分子を発現するベクターを被験者に投与し得る。

【０１１３】 別の実施態様では、癌の予防又は処置のために、ＮＴＴＰＨ−２のアンタゴニ
ストを被験者に投与し得る。癌としては、以下に限定するものではないが、腺癌
、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫、具体的には、副腎、膀
胱、骨、骨髄、脳、***、軟骨、子宮頚、胆嚢、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、
肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、
精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌等が挙げられる。或る実施態様では、ＮＴＴ
ＰＨ−２に特異的に結合する抗体を、アンタゴニストとして直接的に用いたり、
或いはＮＴＴＰＨ−２を発現する細胞又は組織に薬物を送達するためのターゲテ
ィング又はデリバリー機構して間接的に用いることができる。

【０１１４】 別の実施態様では、限定するものではないが、上に列挙したものを含む癌の処
置又は予防のために、ＮＴＴＰＨ−２をコードするポリヌクレオチドに相補的な
分子を発現するベクターを被験者に投与し得る。

【０１１５】 別の実施例では、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、
相補的配列、又はベクターの何れかを、他の適切な薬剤と組み合わせて投与する
ことができる。当業者であれば、従来の薬学上の原理に基づいて併用療法で用い
るための適切な薬剤を選択することができよう。治療薬を組み合わせることによ
り、上述の様々な疾患の治療又は予防に効果を奏する相乗作用が得られる。この
方法を用いることにより、より低い用量の各薬剤で治療効果を上げることができ
、副作用が生ずる可能性を低下させることができる。

【０１１６】 ＮＴＰＰＨ−２のアンタゴニストは、周知の方法を用いて製造することができ
る。詳述すると、精製されたＮＴＰＰＨ−２を用いることによって、抗体を作り
出したり、或いはＮＴＰＰＨ−２に特異的に結合するものを同定するために薬物
のライブラリーをスクリーニングすることができる。ＮＴＰＰＨ−２に対する抗
体も、周知の方法を用いて作り出すことができる。このような抗体としては、限
定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体
、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリーから作られた
フラグメントが含まれる。中和抗体（即ち二量体形成を阻害するもの）は治療の
用途に特に好適である。

【０１１７】 抗体を作り出すため、ＮＴＰＰＨ−２か、免疫学的特性を有するその断片或い
はオリゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等の
様々なホストを免疫化することができる。免疫学的反応を増強するために、ホス
トの種に応じた様々なアジュバントを用いることができる。そのようなアジュバ
ントとしては、限定するものではないが、フロイントのアジュバント、水酸化ア
ルミニウムのような無機質ゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニ
ックポリオール（pluronic polyol）、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キ ーホールリンペットヘモシアニン、並びにジニトロフェノール等が挙げられる。
ヒトで使用するアジュバントのなかでは、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及
びコリネバクテリウム−パルヴム（Corynebacterium parvum）が特に好適である
。

【０１１８】 ＮＴＰＰＨ−２に特異的に結合する、抗体、結合タンパク質、又はペプチドを
作り出すため、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、他の抗体フラグメント、非抗
体タンパク質ドメイン、又はペプチドのライブラリーをスクリーニングすること
ができる。これらのライブラリーは、ファージディスプレイ（phage display） 、他の組換えＤＮＡ方法、又はペプチド合成を用いて作り出すことができる（Va
ughan, T. J.ら (1996) Nature Biotechnology 14:309-314）。これらのライブ ラリーを、ＮＴＰＰＨ−２への特異的な結合を示す配列を特定するべく周知の方
法を用いてスクリーニングする。

【０１１９】 ＮＴＰＰＨ−２に対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペ
プチド、またはその断片は、好ましくは５個以上のアミノ酸、より好ましくは１
０個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。またこれらの配列は、元の
タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小形の自然発生の分子の全アミ
ノ酸配列を含んでいるのが好ましい。ＮＴＰＰＨ−２アミノ酸の短いストレッチ
を、キーホールリンペットヘモシアニンのような他のタンパク質のストレッチと
融合し、そのキメラ分子に対する抗体を産生させることができる。

【０１２０】 ＮＴＰＰＨ−２のモノクローナル抗体は、培地内の無制限増殖性細胞系（cont
inuous cell line）に抗体分子を産生させる技術を用いて作製できる。このよう
な技術として、限定するものではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイ
ブリドーマ技術、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術等が挙げられる（Kohler, G.
他(1975) Nature 256:495-497；Kozbor, D.他(1985)J. Immunol. Methods 81 :3
1-42；Cote, R.J.他(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030；Cole, S.P.
他(1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120）。

【０１２１】 加えて、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための、マウス
抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングする技術のような「キメラ抗体」
の産生のために開発された技術を用いることができる（Morrison,S.L.他（1984 ）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855；Neuberger, M.S.他（1984）Nature 3
12:604-608；Takeda, S.他（1985）Nature 314:452-454）。或いは、一本鎖抗体
の生成のための周知技術を適用して、周知の方法によりＮＴＰＰＨ−２に特異的
な一本鎖抗体を作り出すことができる。関連する特異性を有しているがイディオ
タイプの構成が異なる抗体は、無作為組み合わせ免疫グロブリンライブラリーか
らの鎖再編成（chain shuffling）によって作り出すことができる（Burton D.R.
(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3）。

【０１２２】 また、文献（Orlandi, R.他(1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837；
Winter, G.他 (1991) Nature 349:293-299）に開示されているように、高度に特
異的な結合試薬のパネルや組換え免疫グロブリンライブラリーをスクリーニング
することによって、或いはリンパ球集団でのin vivoの産生を誘導することによ って抗体を作り出すこともできる。

【０１２３】 ＮＴＰＰＨ−２に対する特異結合部位を含む抗体断片を作り出すこともできる
。このような断片としては、以下に限定するものではないが、抗体分子のペプシ
ンによる消化で生成することができるＦ（ａｂ′）₂フラグメントや、Ｆ（ａｂ ′）₂フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより作り出すことができ るＦａｂフラグメント等が挙げられる。或いは、所望の特異性を有するモノクロ
ーナルＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定できるように、Ｆａｂ発現ライ
ブラリーを作製してもよい（Huse, W.D.他（1989）Science 256:1275-1281）。

【０１２４】 様々なイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリ
ーニングに利用することができる。確立された特異性を有するモノクローナル抗
体或いはポリクローナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイ或いはラジ
オイムノアッセイの、様々なプロトコルが当分野で周知である。このようなイム
ノアッセイでは、ＮＴＰＰＨ−２とその特異的抗体との複合体の形成量の測定を
行う。２つの互いに非干渉なエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる
二部位モノクローナル抗体ベースイムノアッセイ（two sites monoclonal based
immunoassay）が好適であるが、競合的結合アッセイを用いてもよい（Maddox ,
前出）。

【０１２５】 本発明の別の実施例では、ＮＴＰＰＨ−２をコードするポリヌクレオチド、ま
たはその任意の断片や相補配列を、治療上の目的で用いることができる。或る実
施態様では、ｍＲＮＡの転写を阻害することが望ましいような状況において、Ｎ
ＴＰＰＨ−２をコードするポリヌクレオチドに対する相補配列を用いることがで
きる。詳述すると、ＮＴＰＰＨ−２をコードするポリヌクレオチドに相補的な配
列で細胞を形質転換することができる。従って、相補的分子または断片を用いて
、ＮＴＰＰＨ−２の活性を変調、即ち遺伝子の機能を調節することができる。こ
のような技術は現在周知であり、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、
若しくはより大きな断片は、ＮＴＰＰＨ−２コーディング配列のコード領域や調
節領域の様々な位置から設計することができる。

【０１２６】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルス由来の
発現ベクター、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターを、標的
の器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いることが
できる。ＮＴＰＰＨ−２をコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的な核酸
配列を発現するベクターは、当業者に周知の方法を用いて作製することができる
。これらの技術はSambrook他（前出）及びAusubel他（前出）の両方に記載され ている。

【０１２７】 ＮＴＰＰＨ−２をコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルで発
現する発現ベクターで細胞または組織を形質転換することにより、ＮＴＰＰＨ−
２をコードする遺伝子を機能停止させることができる。このような作製物を用い
て、翻訳不可能なセンス配列或いはアンチセンス配列を細胞に導入することがで
きる。このようなベクターは、ＤＮＡへ組み入れられない場合でも、そのベクタ
ーが内在性ヌクレアーゼにより破壊されるまでＲＮＡ分子の転写を続ける。この
ような一過性の発現は、非複製ベクターでも１ヶ月以上、適当な複製エレメント
がベクター系の一部である場合には更に長い期間継続し得る。

【０１２８】 上述のように、ＮＴＰＰＨ−２をコードする遺伝子の制御領域、５′領域、ま
たは調節領域（シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、及びイントロン）
に相補的な配列、即ちアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ）を設計
することにより遺伝子の発現の仕方を変えることができる。転写開始部位、例え
ば開始部位の概ね＋１０〜−１０の間の位置にある領域に由来するオリゴヌクレ
オチドが好適である。同様に、三重らせん塩基対合法を用いて阻害を達成するこ
とができる。三重らせん対合が有用なのは、二重らせんがポリメラーゼ、転写因
子、或いは調節分子の結合のために十分にほどける能力を、それが阻害するから
である。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療上の進歩については、文献に記載
されている（Huber, B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Approach es , Futura Publishing Co, Mt Kisco NYにおけるGee, J.E.他(1994)）。また、
転写物のリボソームへの結合を妨げてｍＲＮＡの転写を阻害するために、相補的
配列、即ちアンチセンス分子を設計することもできる。

【０１２９】 酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムを、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために
用いることもできる。リボザイムの作用機構では、リボザイム分子が相補的標的
ＲＮＡに配列特異的にハイブリダイズし、その後エンドヌクレアーゼによる切断
（endonucleolytic cleavage）がなされる。使用できるリボザイムの例として、
ＮＴＰＰＨ−２をコードする配列のエンドヌクレアーゼによる切断を特異的かつ
効果的に触媒し得る人工合成のハンマーヘッド型リボザイム分子がある。

【０１３０】 標的となり得るＲＮＡ内の特異的なリボザイム切断部位を、初めに、標的の分
子における配列GUA、GUU並びにGUCを含むリボザイム切断部位をスキャンするこ とによって同定する。一旦同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対
応する１５〜２０個のリボヌクレオチドからなる短いＲＮＡ配列について、その
オリゴヌクレオチドの機能を停止させる２次構造の特徴を評価することができる
。候補の標的の適切性も、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ribonucl
ease protection assay）によって、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリ ダイゼーションについての接触性（accessibility）を測定することにより評価 することができる。

【０１３１】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成のための周知
の方法により作製することができる。これらの技術としては、固相ホスホラミダ
イト化学合成法のようなオリゴヌクレオチドの化学合成技術等がある。或いは、
ＲＮＡ分子は、in vivo及びin vitroでのＮＴＰＰＨ−２をコードするＤＮＡ配 列の転写により作り出すことができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳ
Ｐ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する様々なベクターに
組み入れることができる。或いは、構成的ＲＮＡを合成するｃＤＮＡ作製物を、
細胞系、細胞或いは組織内に導入することができる。

【０１３２】 ＲＮＡ分子はその細胞内での安定性を高めたり、半減期を長くするために修飾
することができる。可能な修飾としては、限定するものではないが、その分子の
５′末端か３′末端、或いはその両方へのフランキング配列の付加や、分子のバ
ックボーン内でホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート（phosph
orothioate）或いは２′Ｏ−メチルを使用すること等が挙げられる。この方式（
concept）は本来ＰＮＡの作製において用いられるもので、以下のようにこれら の分子全てに拡張することができる。即ち、内在性エンドヌクレアーゼにより容
易に認識されないアデニン、グアニン、シチジン、チミン、及びウリジンの、ア
セチル−、メチル−、チオ−形態、及び類似の形態の修飾によるだけでなく、イ
ノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）のような
従来あまり用いられなかった塩基を含めることによって、これら分子全てにこの
方式を拡張することができる。

【０１３３】 細胞或いは組織内にベクターを導入するための多くの方法が利用可能であり、
それらの方法は、in vivo、in vitro、及びex vivoでの使用についても同様に適
している。ex vivo治療の場合には、患者から採取された幹細胞にベクターを導 入し、自家移植用にクローンとして増殖して同じ患者に戻す方法がある。またト
ランスフェクションによるデリバリー、リポソーム注入またはポリカチオンアミ
ノポリマーによるデリバリー（Goldman, C.K.他(1997) Nature Biotechnology 1
5:462-66; 引用により本明細書の一部とする）は、当分野で周知の方法を用いて
実施することができる。

【０１３４】 上述の治療法の何れも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及び
最も好ましくはヒトのような哺乳動物を含む、任意の適切な被験体に適用するこ
とができる。

【０１３５】 本発明の更に別の実施例では、上述の治療効果をあげるために、医薬品組成物
を医薬上許容される担体とともに投与する。このような医薬品組成物は、ＮＴＰ
ＰＨ−２、ＮＴＰＰＨ−２に対する抗体、ＮＴＰＰＨ−２の模擬体（mimetics）
、アゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターからなるものであり得る。こ
の医薬品組成物は、単独で、或いは例えば安定化剤のような１種以上の他の薬剤
とともに、滅菌した生体適合性の医薬用担体を用いて投与する。このような担体
としては、限定はしないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水等が挙
げられる。このような組成物は、単体で、或いは他の薬剤やホルモンと組み合わ
せた形で患者に投与することができる。

【０１３６】 本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路としては、以下に限定するもので
はないが、経口投与、静脈内投与、筋内投与、動脈内投与、髄内投与、髄腔内投
与、心室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局
所投与、舌下投与、或いは直腸内投与等が挙げられる。

【０１３７】 これらの医薬品組成物は、主成分に加えて、作用物質を医薬上使用可能な製剤
にするための処理を容易にする、賦形剤及び添加剤のような適切な医薬上許容さ
れる担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、Remington's Phar maceutical Sciences （Maack Publishing Co, Easton PA）の最新版において見 ることができる。

【０１３８】 経口投与用の医薬品組成物は、当分野で周知の医薬上に許容される担体を用い
て適切な剤形に製剤することができる。このような担体により、この医薬品組成
物を、患者が服用するための、錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤
、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等に製剤することができる。

【０１３９】 経口投与するための医薬製剤は、主成分と固形の賦形剤とを組み合わせた上で
、所望に応じて得られた混合物を粉砕し、錠剤或いは糖衣剤コア（dragee core ）を作るために必要ならば適切な添加剤を添加した後、顆粒の混合物を加工する
ことによって得られる。適切な添加剤としては、ラクトース、スクロース、マン
ニトール或いはソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク質の賦形剤
（filler）、トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ等のデンプン、メチルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセル
ロースナトリウムのようなセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントのよう
なゴム、並びにゼラチン或いはコラーゲンのようなタンパク質がある。必要なら
ば、崩壊剤または可溶化剤、或いは橋かけ結合したポリビニルピロリドン、寒天
、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸或いはアルギン酸ナトリウムのよう
なその塩を加えてもよい。

【０１４０】 糖衣剤コアは、濃縮砂糖溶液等により適切な錠皮を塗布して用いられる。錠皮
を作るための溶液としては、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カ
ルボポルゲル剤、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカ
ー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混合物等が挙げられる。錠剤の識別のため
、或いは主成分の量即ち投与量を表示するために染料或いは色素を錠剤或いは錠
皮に加えてもよい。

【０１４１】 経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル、ゼラチ
ンからなる柔軟な密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビトール
のような錠皮を有する。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはでんぷ
んのような賦形剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのよう
な潤滑剤、並びに所望に応じて安定化剤と混合された主成分を含み得る。柔軟な
カプセルでは、主成分が、安定化剤とともに或いは安定化剤なしで、脂肪油、液
体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或いは懸
濁されている。

【０１４２】 非経口投与用の医薬製剤は、水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液
或いは生理緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液において配合すること
ができる。水性の注射用懸濁剤には、 例えばカルボキシルメチルセルロースナ トリウム、ソルビトール或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を高める物質
を含めることができる。更に、主成分の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁剤とし
て調製することができる。適切な親油性の溶媒或いは担体としては、胡麻油のよ
うな脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合
成脂肪酸エステルがある。脂質でないポリカチオンのアミノポリマーをデリバリ
ーのために用いることもできる。懸濁剤には、溶解度を高め濃縮度の高い溶液の
調製を可能にする適切な薬剤または安定剤を、所望に応じて加えることができる
。

【０１４３】 局所適用または経鼻粘膜投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸
透剤を用いて製剤する。このような浸透剤は、当技術分野において周知である。

【０１４４】 本発明の医薬品組成物は周知の方法、例えば従来通りの混合、溶解、顆粒化、
糖衣形成、微粒子化（levigating）、乳化、カプセル化、包入（entrapping）、
或いは凍結乾燥により製造される。

【０１４５】 この医薬品組成物は塩として提供することもでき、限定するものではないが塩
酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む種々の酸とともに
形成することができる。塩は、水性或いはプロトニック溶剤において、対応する
フリーの塩基形態より可溶性が高くなる傾向がある。この他、好ましい製剤には
、ｐＨ４．５〜５．５の範囲にあって、使用前に緩衝剤を配合した、１ｍＭ〜５
０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のショ糖、及び２％〜７％のマンニトール
の全てまたは何れかを含む凍結乾燥粉末がある。

【０１４６】 医薬品組成物は、調製した後に適切な容器内に入れ、さらに提示した状態の処
置に用いられるようにラベル付けすることができる。ＮＴＰＰＨ−２の投与の場
合、このようなラベルには、投与の量、頻度、及び方法が表示される。

【０１４７】 本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、有効成分を所望の目的
を達成するために有効な量含む組成物である。有効な量の決定は、当業者の能力
の範囲内で十分行うことができる。

【０１４８】 あらゆる化合物について、治療上有効な量は、初めに、新生物細胞、或いは通
常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のアッセ
イから推定することができる。この動物モデルを、適切な濃度範囲や投与経路を
決定するために用いることもできる。次に、このような情報を利用して、ヒトに
おける有効な量や投与経路を決定することができる。

【０１４９】 治療上有効な量とは、症状や状態を改善する有効成分、例えばＮＴＰＰＨ−２
またはその断片、ＮＴＰＰＨ−２の抗体、ＮＴＰＰＨ−２のアゴニスト、アンタ
ゴニスト、またはインヒビターの量である。そのような化合物の治療上の有効性
及び毒性は、細胞培地における或いは実験動物を用いた標準的な薬学的手順によ
って、例えばＥＤ５０（集団の５０％における治療上の有効量、５０％有効量）
及びＬＤ５０（集団の５０％の致死投与量）として決定することができる。毒性
と治療有効性との間の投与量の比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比と
して表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい。これら
の細胞培地のアッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用におけ
る投与量の範囲を決める際に利用することができる。そのような化合物の投与量
は、毒性がほとんど或いは全くなく、ＥＤ５０を達成する循環濃度の範囲内にあ
ることが望ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並びに投与経路に
応じてこの範囲内で変わってくる。

【０１５０】 正確な投与量は、処置が必要な患者に関連する要因を考慮して担当医師が選択
する。用量及び投与は、主成分を十分なレベルだけ与え、かつ所望の効果を維持
するべく調節する。考慮すべき要素としては、疾病状態の重症度、患者の全身の
健康状態、患者の年齢、体重、並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用す
る薬剤、反応感受性、並びに治療に対する耐性／反応等が挙げられる。長期的に
作用する医薬品組成物は、その特定の製剤のクリアランス率に応じて、３〜４日
毎に、１週間毎に、或いは２週間に１度投与することができる。

【０１５１】 通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲にあって、全投与量は最大
約１ｇであり、投与経路に応じて変わってくる。特定の投与量或いはデリバリー
方法に関する手引きは、当分野の実施者が通常入手できる文献に見出すことがで
きる。当業者であれば、ヌクレオチドでは、タンパク質やインヒビター用の剤形
とは異なる剤形を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドのデリバリーの方式は、特定の細胞、状態、位置等によって決まってくる。

【０１５２】 （診断） 別の実施例では、ＮＴＰＰＨ−２に特異的に結合する抗体を、ＮＴＰＰＨ−２
の発現によって特性化される状態や疾病の診断、或いは、ＮＴＰＰＨ−２やＮＴ
ＰＰＨ−２のアゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターで治療を受けて
いる患者のモニタリングのためのアッセイにおいて用いることができる。診断の
ために有用な抗体は、上述の治療用のものと同一の方法で作り出すことができる
。ＮＴＰＰＨ−２の診断アッセイとして、ヒトの体液、細胞或いは組織の抽出物
においてＮＴＰＰＨ−２を検出するために抗体或いは標識を利用する方法がある
。この抗体は、修飾して用いても、修飾なしで用いてもよく、共有結合または非
共有結合の何れかでリポーター分子と結合させることにより標識することができ
る。その幾つかについては上記した種々のリポーター分子が知られており、それ
を用いることができる。

【０１５３】 例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）
並びにＦＡＣＳ（蛍光表示式細胞分取器法）のようなＮＴＰＰＨ−２を測定する
ための種々のプロトコルが当分野では周知であり、これによってＮＴＰＰＨ−２
発現の変化や異常を診断するための基礎が得られる。ＮＴＰＰＨ−２の発現の正
常値、即ち標準値は、哺乳動物、好ましくはヒトの正常な被験者から得られる体
液或いは細胞抽出物とＮＴＰＰＨ−２の抗体とを、複合体形成に適した条件の下
で結合させることによって確立する。標準の複合体形成量は、様々な方法、好ま
しくは測光手段を用いることにより定量することができる。被験者の生検組織の
患部組織サンプル及び対照サンプルにおいて発現されたＮＴＰＰＨ−２の量を、
標準値と比較する。標準値と被験者の値との偏差から、疾病の診断のためのパラ
メータを確立する。

【０１５４】 本発明の別の実施例では、ＮＴＰＰＨ−２をコードするポリヌクレオチドを診
断目的で用いることができる。使用できるポリヌクレオチドとしては、オリゴヌ
クレオチド配列、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡ等がある。このポリ
ヌクレオチドは、ＮＴＰＰＨ−２の発現が疾病と関係がある可能性がある生検組
織における遺伝子発現を検出し、定量するために用いられる。診断アッセイは、
ＮＴＰＰＨ−２が存在する状態か、存在しない状態か、過剰発現している状態の
何れの状態にあるかを区別したり、治療的な介入においてＮＴＰＰＨ−２レベル
の調節をモニタリングするために利用することができる。

【０１５５】 或る実施態様では、ＮＴＰＰＨ−２または近縁な分子をコードする、ゲノム配
列を含むポリヌクレオチド配列を検出できるＰＣＲプローブとのハイブリダイゼ
ーションを利用して、ＮＴＰＰＨ−２をコードする核酸配列を同定することがで
きる。そのプローブの特異性、即ちそのプローブが非常に高度に特異的な領域（
例えば５′調節領域における１０個の独特のヌクレオチド）、或いは特異性の低
い領域（例えば特に３′コーディング領域）の何れに由来するのかということ、
及びハイブリダイゼーション或いは増幅の（高い、中程度の或いは低い）ストリ
ンジェンシーにより、そのプローブが自然発生ＮＴＰＰＨ−２のみを同定するも
のであるか、或いはアレル配列や近縁な配列も同定するものであるかが決まる。

【０１５６】 プローブは、近縁な配列を検出するためにも用いることができ、好ましくは、
ＮＴＰＰＨ−２をコードする任意の配列に基づくヌクレオチドを少なくとも５０
％含むべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号：２
のヌクレオチド配列か、自然発生ＮＴＰＰＨ−２のイントロン、プロモータ、及
びエンハンサーエレメントを含むゲノムの配列に由来するものであり得る。

【０１５７】 ＮＴＰＰＨ−２をコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーション
プローブを作製するための手段としては、ＮＴＰＰＨ−２やＮＴＰＰＨ−２誘導
体をコードする核酸配列を、ｍＲＮＡプローブ生成のためのベクターにクローン
化する方法がある。このようなベクターは周知で市販されており、適切なＲＮＡ
ポリメラーゼや適切な標識ヌクレオチドを付加することによりin vitroでのＲＮ
Ａプローブ合成のために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブ
は様々なリポータ分子により標識することができる。例えば、³²Ｐや³⁵Ｓのよう
な放射性核種により、アビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合するア
ルカリホスファターゼのような酵素標識等により標識することができる。

【０１５８】 ＮＴＰＰＨ−２をコードするポリヌクレオチド配列を、ＮＴＰＰＨ−２の発現
に関連する状態または疾患の診断のために用いることができる。そのような状態
または疾患の例としては、以下に限定するものではないが、 例えばベーチェット症候群、シャルコー骨関節病症、ＣＰＰＤ病、糖尿病神経
障害性関節症、変形性関節疾患、繊維筋痛、ヘモクロマトーシス、血友病性関節
症、ジャコー関節炎、エリテマトーデス、混合型結合組織病、マックル・ウェル
ズ症候群、変形性関節症、全身性進行性硬化症、偽痛風、乾癬、ライター症候群
、リウマチ性関節炎、シェーグレン症候群、及び脊椎関節症等の関節症や、 例えばＡＩＤＳ、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、貧血症、喘
息、アテローム性動脈硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、
アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、腎炎
、痛風、グレーブス病、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症
筋無力症、心筋炎又は心膜炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、強皮症、自己免疫
性甲状腺炎、及び潰瘍性大腸炎；癌と血液透析と体外循環の合併症；ウイルス感
染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、原虫感染、及び蠕虫感染；及び外傷等の
免疫疾患や、 例えば腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫、具体的に
は、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、***、軟骨、子宮頚、胆嚢、神経節、胃腸管、
心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、
皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌等の癌が挙げられる。

【０１５９】 ＮＴＰＰＨ−２をコードするポリヌクレオチド配列を、患者の生検組織や体液
を利用する、サザンブロット法或いはノーザンブロット法、ドットブロット法或
いは他の膜をベースにした技術や、ＰＣＲ技術、ディップスティック試験法（試
験紙法）、ピン技術、及びＥＬＩＳＡアッセイや、マイクロアレイにおいて用い
ることによって、ＮＴＰＰＨ−２発現の変化を検出することができる。このよう
な定性的或いは定量的試験法は当分野では周知である。

【０１６０】 特定の実施態様では、種々の癌、特に上に列挙した癌の活性化即ち誘発を検出
するアッセイにおいてＮＴＰＰＨ−２をコードするヌクレオチド配列が有用であ
り得る。ＮＴＰＰＨ−２をコードするヌクレオチド配列を標準的な方法で標識し
、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した条件の下で患者の体液や組織サ
ンプルに加えることができる。適当なインキュベーション時間の経過後、このサ
ンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。生検サンプルまたは抽
出サンプルにおけるシグナルの量が、比較できる対照サンプルのシグナル量と有
意に異なっている場合、このヌクレオチド配列はサンプルのヌクレオチド配列と
ハイブリダイズしており、サンプルのなかのＮＴＰＰＨ−２をコードするヌクレ
オチド配列のレベルの変化が生じていることは、関連する疾患の存在を示してい
る。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験、または個々の患者の治療のモ
ニタリングにおいて特定の治療上の処置の有効性を評価するために用いることも
できる。

【０１６１】 ＮＴＰＰＨ−２の発現に関連する疾病の診断の基礎とするために、正常な、即
ち標準の発現プロフィールを確立する。この標準プロフィールは、動物或いはヒ
ト何れかの正常な被験者から採取された体液或いは細胞の抽出物を、ハイブリダ
イゼーション或いは増幅に適した条件下でＮＴＰＰＨ−２をコードする配列又は
その断片と結合することにより確立し得る。標準のハイブリッド形成量は、既知
の量の実質的に精製されたＮＴＰＰＨ−２が用いられる実験で得られる値と、正
常被験者で得られる値とを比較することにより定量することができる。正常なサ
ンプルから得られた標準値は、疾病の症状を呈する患者のサンプルから得られる
値と比較することができる。標準値と被験者値との偏差を用いて疾病の存在を確
認する。

【０１６２】 一旦疾患が確認され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを定期的に反復して行って、患者における発現のレベルが正常な患者
において観察されるレベルに近づき始めたか否かを評価することができる。継続
的なアッセイから得られる結果を用いて、数日間或いは数ヶ月にわたる期間での
治療の効果を知ることができる。

【０１６３】 癌については、患者の生検組織において転写物が比較的多量に存在することが
、疾病の発生の素因を示す。つまり実際の臨床的症状が現れる前に疾病を検出す
る手段となり得る。このタイプの確定診断により、医療従事者が予防的処置を講
じたり、より早期に積極的な治療を開始し、癌の発生や更なる進行を予防するこ
とが可能となる。

【０１６４】 ＮＴＰＰＨ−２をコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの別の診
断目的の使用法では、ＰＣＲ法での利用があり得る。このようなオリゴマーは化
学的に合成したり、酵素を用いて作製したり、或いはin vitroで作製することが
できる。オリゴマーは、好ましくは、特定の遺伝子或いは状態を特定するために
最適な条件下で用いられる２種のヌクレオチド配列、即ちセンス方向（５′→３
′）のヌクレオチド配列及びアンチセンス方向（３′←５′）のヌクレオチド配
列からなる。また、同一の２種のオリゴマーや入れ子オリゴマーの組、或いはオ
リゴマーの縮重プールを、近縁なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出及び／または定
量のため低いレベルのストリンジェントな条件の下で用いることもできる。

【０１６５】 ＮＴＰＰＨ−２の発現を定量するために用いることができる方法として、放射
標識（radiolabeling）或いはビオチン標識したヌクレオチドの利用、対照の核 酸の同時増幅（coamplification）の利用、並びに実験結果を補完して引かれた 標準のグラフ曲線の利用等がある（Melby, P.C.他(1993) J. Immunol. Methods,
159:235-44；Duplaa, C.他(1993) Anal. Biochem. 229-236）。多数のサンプル
の定量では、目的のオリゴマーが複数の希釈溶液中に存在し、分光光度計を用い
たり比色定量により迅速に定量することができるようなＥＬＩＳＡ形式のアッセ
イを行うことによって一層定量のスピードを上げることができる。

【０１６６】 別の実施例では、ここに開示するポリヌクレオチド配列の何れかに由来するオ
リゴヌクレオチドまたはより大形の断片を、マイクロアレイにおけるターゲット
（標的）として用いることができる。マイクロアレイを用いることにより、多く
の遺伝子の発現レベルを同時にモニタし（転写物イメージを生成する）、また遺
伝子の変異体、変異及び多型を同定することができる。この情報は、遺伝子の機
能の決定や、疾病の遺伝的な基礎の理解、疾病の診断、及び治療薬の開発やその
活性のモニタリングのために利用することができる。

【０１６７】 或る実施例では、ＰＣＴ出願WO95/11995（Chee他）、Lockhart, D. J. 他（19
96; Nat.Biotech. 14: 1675-1680）及びSchena, M. 他（1996; Proc. Natl. Aca
d. Sci. 93: 10614-10619）に記載の方法によりマイクロアレイを準備し、利用 する。上記の文献はここに引用することにより本明細書の一部とする。

【０１６８】 好ましくは、マイクロアレイは、固体支持体に固定された、通常は合成アンチ
センスオリゴヌクレオチドかｃＤＮＡの断片の何れかである、数多くの独特の一
本鎖の核酸配列から構成される。このオリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは
６〜６０個のヌクレオチドからなる長さ、より好ましくは１５〜３０個のヌクレ
オチドからなる長さ、最も好ましくは２０〜２５個のヌクレオチドからなる長さ
である。或るタイプのマイクロアレイでは、７〜１０ヌクレオチドの長さしかな
いオリゴヌクレオチドを用いるのが好ましいことがある。マイクロアレイは、既
知の５’又は３’配列をカバーするオリゴヌクレオチド、完全長配列をカバーす
る連続的なオリゴヌクレオチド、又は配列の長さ方向に沿った特定の領域から選
択された独特のオリゴヌクレオチドを有し得る。マイクロアレイにおいて用いら
れるポリヌクレオチドは、少なくとも配列の断片が既知であるターゲットの遺伝
子又は遺伝子群に特異的なオリゴヌクレオチド、或いは特定の細胞の型、発達又
は疾病の状態について共通な１種又は２種以上の未同定ｃＤＮＡに特異的なオリ
ゴヌクレオチドであり得る。

【０１６９】 マイクロアレイ用の既知の配列に対するオリゴヌクレオチドを作製するために
、コンピュータアルゴリズムを用いてヌクレオチド配列の５’またはより好まし
くは３’末端から目的の遺伝子を調べる。このアルゴリズムでは、その遺伝子に
独特でハイブリダイゼーションに適した範囲内のＧＣ含量を有し、ハイブリダイ
ゼーションを妨げる可能性のある推定上の二次構造の無い、決まった長さのオリ
ゴマーを同定する。或る場合には、オリゴマーを、光照射化学プロセスを用いて
基板上の所定の領域において合成する。この基板は、紙、ナイロン、又は他のタ
イプのメンブラン、濾紙、チップ、スライドガラス、又は他の任意の適切な固体
支持体であり得る。

【０１７０】 別の実施態様では、オリゴマーを、ＰＣＴ出願WO95/251116 （Baldeschweiler
他）に記載のように化学結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いること
によって基板の表面上で合成することができる。上記ＰＣＴ出願はここに引用す
ることにより本明細書の一部とする。別の実施態様では、ドットブロット又はス
ロットブロット（HYBRIDOT（登録商標）装置, GIBCO/BRL）に類似した「格子型 」アレイを使用し、真空システム、熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合プロシージ
ャを利用してｃＤＮＡ断片又はオリゴヌクレオチドを基板の表面上に配置し結合
させることができる。別の実施態様では、アレイは、手作業で製作するか、或い
は市販の装置（スロットブロット又はドットブロット装置）、材料（任意の適切
な固形支持体）、及び機械（Brinkmann（登録商標）マルチチャネルピペッター 又はロボット装置を含む）を用いることにより製作することができ、このアレイ
は市販の器具を効果的に使用できる８、２４、９６、３８４、１５３６、又は６
１４４のオリゴヌクレオチド、若しくは２から１００万の範囲の任意の数のオリ
ゴヌクレオチドを含み得る。

【０１７１】 マイクロアレイを用いてサンプルの解析を行うために、ポリヌクレオチドを生
物学的サンプルから抽出する。この生物学的サンプルは、体液（例えば血液、尿
、唾液、痰、胃液等）、培養された細胞、生検組織、又は他の組織調製物から得
ることができる。プローブを作製するため、サンプルから抽出したポリヌクレオ
チドを用いて、マイクロアレイ上の核酸に相補的な核酸配列を作り出す。マイク
ロアレイがｃＤＮＡからなる場合には、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）が適切
なプローブである。従って或る実施態様では、ｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡ作り出
し、このｃＤＮＡを蛍光標識したヌクレオチドの存在下で用いて、断片、即ちオ
リゴヌクレオチドａＲＮＡプローブを作製する。これらの蛍光標識したプローブ
を、プローブの配列がマイクロアレイのｃＤＮＡオリゴヌクレオチドとハイブリ
ダイズするように、マイクロアレイとともにインキュベートする。別の実施態様
では、相補的核酸配列をプローブとして使用する。この相補的核酸配列には、ハ
イブリダイゼーション技術の領域で周知の制限酵素、ＰＣＲ技術、及びOligolav
elingまたはTransProbeキット（Pharmacia）を用いて作製した、ポリヌクレオチ
ド、断片、相補的即ちアンチセンス配列も含まれる。

【０１７２】 インキュベーション条件は、ハイブリダイゼーションが正確な相補的一致をも
って起こるか、或いは種々のより低いレベルの相補性で起こるように調節する。
ハイブリダイズしたプローブを取り除いた後、スキャナーを用いて、蛍光のレベ
ル及びパターンを決定する。スキャンされたイメージを調べて、マイクロアレイ
上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の程度及び相対的な量を求める。検出シ
ステムを用いることにより、全ての個別の配列について同時にハイブリダイゼー
ションの不存在、存在、及び量を測定することができる。このデータは、サンプ
ルにおける配列、突然変異、変異体、又は多型についてのラージスケールの相互
関係の研究のために用いることができる（Heller, R.A.他 (1997) Proc. Natl.
Acad. Sci. 94:2150-55）。

【０１７３】 本発明の別の実施例では、ＮＴＰＰＨ−２をコードする核酸配列を用いて、自
然発生のゲノム配列マッピングのために有用なハイブリダイゼーションプローブ
を作り出すこともできる。この配列は、特定の染色体、染色体の特定の領域、又
は人工染色体作製物にマッピングし得る。人工染色体作製物としては、例えばヒ
ト人工染色体（ＨＡＣｓ）、酵母菌人工染色体（ＹＡＣｓ）、細菌人工染色体（
ＢＡＣｓ）、細菌性Ｐ１作製物又は単染色体ｃＤＮＡライブラリー等があり、Pr
ice, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134, 及びTrask, B.J. (1991) Trends Gen
et. 7:149-154にその概要が記載されている。

【０１７４】 蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ、Verma他（1988）Human Chro mosomes: A Manual of Basic Technique , Pergamon Press, New York, NY”に記
載）は、他の物理的染色体マッピング技術及び遺伝子地図データと関連を有し得
る。遺伝子地図データの例は、種々の科学誌や、Online Mendelian Inheritance
in Man（OMIM）に見ることができる。物理的染色体地図上でのＮＴＰＰＨ−２ をコードする配列の位置と特定の疾病（または特定の疾病の素因）との相関関係
を助けとして、或る遺伝病に関連するＤＮＡの領域を決定することができる。本
発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、キャリア、または患者の遺伝子配列
の違いを検出することができる。

【０１７５】 染色体調製物のin situハイブリダイゼーションや、確立された染色体マーカ ーを用いる連鎖解析のような物理的マッピング技術を、遺伝子地図を拡大するた
めに用いることができる。多くの場合、特定のヒト染色体の数やアームが未知で
あっても、マウスのような別の哺乳動物の染色体上の遺伝子配置から、関連する
マーカーがわかる。新たな配列は、物理的マッピングにより染色体のアームまた
はその一部へ割当てることができる。これにより、位置クローニング或いは他の
遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を調査する研究者に貴重な情報を提供するこ
とができる。例えば毛細血管拡張性運動失調（AT）が11q22-23に位置決定された
ように（Gatti, R.A.他（1988）Nature 336:577-580）、一旦疾患或いは症候群 が特定のゲノム領域に粗く位置決定されたならば、その領域にマッピングされる
任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは調節遺伝子を表し
得ることになる。本発明のヌクレオチド配列を、転座、逆位等によって生じた、
正常者、キャリア、及び患者の間の染色体の位置の違いを検出するために用いる
こともできる。

【０１７６】 本発明の別の実施例では、ＮＴＰＰＨ−２や、その触媒作用性または免疫原性
断片、オリゴペプチドを、様々な薬物スクリーニング技術において化合物のスク
リーニングのために用いることができる。このようなスクリーニングにおいて用
いられる断片は、溶液に遊離した形態で存在するか、固体支持体へ付着した形態
で存在するか、細胞表面へ付着した形態で存在するか、或いは細胞内に存在する
ものであり得る。ＮＴＰＰＨ−２と試験対象の薬剤との結合複合体形成を測定す
ることができる。

【０１７７】 ＮＴＰＰＨ−２に結合する分子を特定するべく小分子のライブラリーをスクリ
ーニングするための方法は、（ａ）小分子のライブラリーを準備する過程と、（
ｂ）複合体形成に適した条件の下で、前記小分子のライブラリーと請求項１５の
ポリペプチドとを結合する過程と、（ｃ）複合体形成を検出する過程であって、
前記複合体の存在がＮＴＴＰＨ−２に結合する小分子を特定する、該過程とを含
む。ＮＴＰＰＨ−２に結合するこれらの小分子の１つをアゴニストとして特定す
るための方法は、請求項２５の小分子の１つとγ標識したＡＴＰとを、ＮＴＴＰ
Ｈ−２を発現するベクターで形質転換された細胞に送達する過程と、適切な条件
の下で前記細胞を増殖させる過程と、ＰＰｉをアッセイする過程とを含む。ＰＰ
ｉの量の増加によって、該小分子がＮＴＰＰＨ−２の活性を増加させるアゴニス
トであることが確認される。アンタゴニストを特定するための方法は、小分子と
γ標識したＡＴＰとを、ＮＴＴＰＨ−２を発現するベクターで形質転換された細
胞に送達する過程と、適切な条件の下で前記細胞を増殖させる過程と、培地にお
けるＰＰｉをアッセイする過程とを含む。ＰＰｉの量の低下により、該小分子が
ＮＴＰＰＨ−２の活性を低下させるアンタゴニストであることが確認される。

【０１７８】 公開されたＰＣＴ出願WO84/03564に記載のように、別の薬物スクリーニング技
術によって、対象のタンパク質に対する適切な結合親和性を有する化合物の高ス
ループットのスクリーニングを行うことができる。この方法では、ＮＴＰＰＨ−
２に適用する場合、多数の異なる小形の試験対象の化合物を、プラスチックピン
或いは他の表面のような固体基板上で合成する。この試験対象の化合物をＮＴＰ
ＰＨ−２又はその断片と反応させ、洗浄する。次に結合したＮＴＰＰＨ−２を当
分野で周知の方法により検出する。また、前述の薬物スクリーニング技術におい
て使用するために、精製したＮＴＰＰＨ−２をプレート上に直接コーティングす
ることもできる。或いは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、固体基板上に
固定することができる。

【０１７９】 別の実施例では、ＮＴＰＰＨ−２に結合し得る中和抗体が、ＮＴＰＰＨ−２と
の結合について試験対象の化合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニング
アッセイを用いることができる。この方法では、抗体を用いて、ＮＴＰＰＨ−２
の１または２以上の抗原決定基を共通に有する任意のペプチドの存在を検出する
ことができる。

【０１８０】 更に別の実施例では、現在までに開発されていない分子生物学上の技術であっ
ても、その新技術がヌクレオチド配列の現在までに知られている特性（例えば、
以下に限らないが、トリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対合のような特性）に
基づく技術であるならば、その技術においてＮＴＰＰＨ−２をコードするヌクレ
オチド配列を用いることができる。

【０１８１】 以下の実施例は、本発明の単なる例示であり、本発明をこの実施例に限定しよ
うとするものではない。

【０１８２】

【実施例】

１ SATPF 1008 ｃＤＮＡライブラリーの作製 ｃＤＮＡライブラリーのSATPF 1008を、末期の骨関節症の患者である４人のド
ナーから得られた軟骨組織から作製した。骨関節症の患者は、プレドニゾンや様
々な非ステロイド性抗炎症薬のようなステロイドの投薬を受けていた。IL-1（Pf
izer Inc., Groton, CT）による刺激は与えられていなかった。

【０１８３】 骨関節症の軟骨組織を関節置換術の際に収集し、抗体（ペニシリン、ストレプ
トマイシン、及びゲンタマイシン）を加えたダルベッコの改良イーグル培地（D-
MEN；Gibco/BRL）に入れ、Pfizer研究所に移した。この軟骨は、下にある骨から
無菌状態で取り出され、D-MENでリンスされ、小片（〜４ｍｍ²）に切断され、ノ
イマン・タイテルの無血清培養液（Gibco/BRL）を２０ｍｌ入れた１００ｍｍの ペトリ皿に入れた。Mitchellら (1996) J. Clin. Invest. 97:761-768に記載の プロトコルを用いて、各患者からの軟骨を、４ｍｇ／ｍｌのプロナーゼ（Sigma,
St Louis, MO）で１．５時間かけて消化し、次に３ｍｇ／ｍｌの細菌のコラゲ ナーゼ（Sigma）で１．５時間かけて消化した。消化された軟骨を、セルストレ ーナ（cell strainer）を通して濾過し、消化されていない材料を取り除き、細 胞を遠心分離によってペレット化した。細胞のペレットをリン酸緩衝食塩水（Ｐ
ＢＳ）で１回洗浄し、次に５Ｍのグアニジンイソチオシアネート、１０ｍＭのＥ
ＤＴＡ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、及び８％のβメルカプトエタノール
からなるバッファーの５ｍｌに溶解した。５倍量の４Ｍ ＬｉＣｌをバッファー
に加え、混合物を冷蔵庫で一昼夜保管した。遠心分離の後、沈殿物を３ＭのＬｉ
Ｃｌで１回洗浄し、再度遠心分離にかけた。この第２の沈殿物を、０．１％のド
デシル硫酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５
）からなる溶液に溶解した。懸濁液を−７０℃で冷凍し、解凍時にボルテックス
した（Cathalaら (1983); DNA 2:329-335）。

【０１８４】 全ＲＮＡをフェノールクロロホルムで２回抽出し、クロロホルムで１回抽出し
、次にエタノールで沈殿させた。４人のドナーに由来するＲＮＡを等量取り出し
て結合し、エタノール沈殿し、１１２μｇのプールされたＲＮＡを得た。遠心分
離の後、ＲＮＡペレットをＤＥＰＣ処理し、希釈した脱イオン水（ＤＥＰＣ−ｄ
ｄＨ₂Ｏ）に再度溶解し、塩化セシウム密度勾配の上で走らせた。このＲＮＡを 酸性フェノール（１Ｘ、ｐＨ４．０、catalog #972Z, Ambion, Austin, TX）で 抽出し、エタノールで沈殿させ、ＤＥＰＣ−ｄｄＨ₂Ｏに再懸濁した。ＲＮアー ゼの無いＤＮアーゼ（Epicentre Technologies, Madison, WI）で１５分間処理 し、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿・洗浄し、ＤＥＰＣ−ｄｄＨ₂Ｏ に溶解した。

【０１８５】 このｍＲＮＡは、SuperScript Plasmid System for cDNA synthesis and plas
mid cloning（Cat. # 18248-013, Gibco/BRL）の推奨プロトコルに従って取り扱
った。ｃＤＮＡをSepharose CL4Bカラム（Cat. #275105-01; Pharmacia）上で分
画化し、４００ｂｐを越えるｃＤＮＡをpINCY 1（Incyte）に連結した。次にこ のプラスミドpINCY 1をDH5α^TMコンピテント細胞（Cat. #18258-012; Gibco/BRL
）に形質転換した。

【０１８６】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡはこの細胞から放出され、これをREAL Prep 96 Plasmid Kit
（Catalog #26173,QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA）を用いて精製した。このキ ットは、マルチチャネル試薬ディスペンサを用いて９６穴ブロックにおける９６
個のサンプルの同時増幅が可能なものであった。推奨プロトコルを利用したが、
以下の点を変更した。（１）２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン及び０．４％のグリ
セロールを含む１ｍｌの滅菌Terrific Broth （品番22711, Gibco/BRL）におい て細菌を培養した。（２）接種の後、培溶液を１９時間インキュベートし、イン
キュベーションの終了時に、この細胞を０．３ｍｌの溶解バッファーに溶解した
。（３）イソプロパノール沈殿を行った後、プラスミドＤＮＡのペレットを０．
１ｍｌの蒸留水に再懸濁した。プロトコルの最終ステップの後、サンプルを９６
穴ブロックに移し４℃で保管した。

【０１８７】 このｃＤＮＡの配列決定は、Peltier Thermal Cyclers （MJ Research, Water
town, MA製のPTC200）及びApplied Biosystems社製の377 DNA Sequencing Syste
msと組み合わせてHamilton Micro Lab 2200 （Hamilton, Reno, NV）を用いて、
Sangerらの方法（1975, J. Mol. Biol.94:441f）により行い、読み枠を決定した
。

【０１８８】 ３ ｃＤＮＡクローン及びそれらの類推されるタンパク質の相同性検索 配列表のヌクレオチド配列及び、それらから類推されるアミノ酸配列を問い合
わせ配列として用いて、例えばGenBank、SwissProt、BLOCKS、及びPima IIのよ うなデータベースを検索した。これらのデータベースには既に同定された配列が
注釈付きで含められており、BLAST（Basic Local Alignment Toolを表す）を用 いて相同性（類似性）を有する領域をこのデータベースのなかから検索した（Al
tschul. S.F. (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul他(1990) J. Mol. B
iol. 215:403-10）。

【０１８９】 BLASTは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを作成して配 列の類似性を決定する。そのアライメントの局所的性質のために、BLASTは正確 な一致、すなわち原核生物（細菌）や真核生物（動物、菌類、又は植物）を起源
とするホモログを特定する際に特に有効である。一次配列パターンや二次構造の
ギャップペナルティを処理する際には、この引用により本明細書の一部とするSm
ith R.F.及びT.F. Smith（1992, Protein Engineering 5:35-51）に記載のよう な他のアルゴリズムを用いることができる。本明細書に開示された配列の長さは
少なくとも４９ヌクレオチドであり、不必要な塩基は１２％以下である（ここで
ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴ以外と記録されたものである）。

【０１９０】 BLAST法は、この引用により本明細書の一部とするKarlin. S.及びS.F. Altsch
ul（1993: Proc. Nat. Acad. Sci. 90:5873-7）に詳細に記載されているように 、問い合わせ配列とデータベースの配列の一致を検索し、発見したあらゆる配列
の一致の統計的有意性を評価して、ユーザが選択した有意性の閾値を満たす一致
のみを報告する。本出願での閾値は、ヌクレオチドで１０^-25、ペプチドで１０^{- 14} に設定した。

【０１９１】 インサイト社のヌクレオチド配列を、霊長類（pri）、げっ歯類（rod）、及び
他の哺乳類配列（mam）のGenBankデータベースで検索し、次に同じクローンから
類推されるアミノ酸配列を、GenBankの機能性タンパク質データベース、哺乳類 （mamp）、脊椎動物（vrtp）、及び真核生物（eukp）で、相同性について検索し
た。

【０１９２】 ４ 完全長ＮＴＰＰＨ−２のクローニング 部分的なブタＮＴＰＰＨをコードする２．３ｋｂのｃＤＮＡ配列（L.M. Ryan, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI）を、NCBI公的EST及びインハ ウスのデータベースにおいて検索した。相同な配列は、骨関節症軟骨ライブラリ
ーにおいて見出された。

【０１９３】 ４．１ｋｂの配列を、軟骨細胞ライブラリーと、プローブとしてインサイト社
クローンNo. 1423393を起源とするインサートを用いて特定した。この４．１ｋ ｂのクローンの５’末端のコーディング領域から７００ｂｐの制限断片を用いて
骨関節症軟骨ライブラリーを再度スクリーニングすると、ＮＴＰＰＨ−２をコー
ドする完全長ｃＤＮＡライブラリーが特定された。前記完全長ｃＤＮＡをシーク
エンシングし、適切なKozak開始配列及びシグナル配列が含まれていることを見 出した。このクローン化したポリヌクレオチド配列は、American Type Culture
Collectionに受入番号 として登録した（ 年 月 日）。

【０１９４】 ５ ノーザン法による解析 ノーザン法解析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技
術であり、標識されたヌクレオチド配列と、特定の細胞タイプまたは組織のＲＮ
Ａが結合しているメンブランとのハイブリダイゼーションを行う（Sambrook他、
前出）。

【０１９５】 ヒトの複数の組織のノーザンブロットを、Clonetech（Palo Alto, CA）から入
手した。ヒトの軟骨を、+/-ヒト組換え体IL-1で処理した。ＲＮＡの調製のため 、軟骨細胞を、プロナーゼ（４ｍｇ／ｍｌ）で１．５時間、続けて細菌のコラゲ
ナーゼ（３ｍｇ／ｍｌ）で３−５時間かけて消化することによって単離した。軟
骨細胞をペレット化し、細胞をグアニジウムイソチオシアネートに溶解した。Mi
tchellら（前出）に記載のようにＬｉＣｌでＲＮＡを沈殿させた。ノーザン法に
よる解析は、random primer kit（Pharmacia Biotech Inc. piscattaway, NJ） で標識したプローブを用いて行った。ブロットを、概ねSambrookら（前出）に記
載のような４２℃で一昼夜ハイブリダイゼイズさせ、次に室温で3xSSC/0.1%SDS において３回洗浄し、６０℃で１５分間0.3xSSC/0.1%SDSで１回洗浄した。

【０１９６】 ヒト、イヌ、及びウサギ関節組織のＲＮＡサンプルの膜を用いるノーザン法に
よる解析によって、ＮＴＰＰＨ−２の、軟骨における最高レベルの発現と、精巣
、気管、及び骨髄におけるより低いが有意なレベルの発現とが立証された。

【０１９７】 BLAST（Altschul, S.F. 前出; Altschul, S.F. 前出）を用いて、ノーザン法 による解析に類似したコンピュータ技術も実施した。検索の基準値は、積スコア
（product score）であり、これは以下の式で定義されるものである。 （配列の一致（％）×最大BLASTスコア（％））／１００ この積スコアでは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致の双方
が考慮される。例えば、積スコアが４０の場合は、一致は誤差が１〜２％の範囲
で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相同な分子は、通常
積スコアとして１５〜４０を示すものを選択することにより同定されるが、これ
よりスコアの低いものは近縁な分子として同定される。

【０１９８】 電子的なノーザン法による解析から、様々なライブラリーにおけるこの配列の
発現が分かった。このようなライブラリーの少なくとも５７％は免疫応答関連の
ものであり、少なくとも２６％は、不死化即ち癌性組織のものである。特に注目
すべきは、リウマチ性及び変形性関節症の滑膜、軟骨細胞、及び脛骨のライブラ
リーにおけるＮＴＰＰＨ−２の発現である。

【０１９９】 ６ ＮＴＰＰＨ−２をコードする配列の延長 ＮＴＰＰＨ−２をコードする核酸配列を用いて、部分的ヌクレオチド配列を完
全長まで伸長させるためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。一方のプ
ライマーはアンチセンス方向の延長を開始するために合成し、他方のプライマー
はセンス方向に配列を延長するために合成した。これらのプライマーを用いて、
既知のＮＴＰＰＨ−２配列を「外側に」延長し、興味の対象の領域の新しい未知
のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成した。初めのプライマーは、OLIG
O 4.06（National Biosciences社）、或いは他の適切なプログラムを用いて設計
したもので、約２２個から約３０個のヌクレオチドからなる長さで、５０％以上
のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜約７２℃の温度で標的配列にアニールするよう
に設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体化を生じるような
あらゆるヌクレオチドのストレッチは除いた。

【０２００】 選択されたヒトｃＤＮＡライブラリー（Gibco/BRL）を用いて、この配列を延 長した。２段階以上の延長が必要または望ましい場合は、既知領域をさらに延長
するための追加のプライマーの組を設計する。

【０２０１】 XL-PCRキット（Perkin Elmer）の説明書の指示に従って、酵素と反応混合物と
を徹底的に混合することにより、高い忠実度の増幅がなされる。４０ｐｍｏｌの
各プライマーと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始す
る場合、Peltier Thermal Cycler（PTC200；M.J. Reserch, Watertown MA）を用
いて、以下のパラメータ、即ち ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（その温度を保持） でＰＣＲを行った。

【０２０２】 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）ア
ガロースミニゲル上での電気泳動で解析して、配列を延長する反応が成功したか
否かを決定した。最も大きな生成物即ちバンドを選択して、ゲルから切り出し、
QIAQuick^TM（QIAGEN Inc., Chatsworth, CA）を用いて精製し、Klenow酵素を用 いて一本鎖ヌクレオチドの延び出し（overhang）を切り取って、再結合及びクロ
ーニングを容易にする平滑末端を作った。

【０２０３】 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌの連結バッファーに再溶解し、１μｌ
のＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを加えて、その混合物を室温で２〜３時間、或いは１６℃で終夜インキュベー
トした。コンピテントな大腸菌細胞（４０μｌの適切な培養液内にある）を、３
μｌのライゲーション混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培地（Semb
rook他、前出）で培養した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、全ての
形質転換混合物を、２ｘCarbを含むLuria Bertani（LB）寒天（Sembrook他、前 出）上にのせた。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択し、
適切な市販の無菌の９６穴マイクロタイタープレートの各のウェル内に入れられ
た１５０μｌの液状ＬＢ／２ｘＣａｒｂ培地で培養した。さらに後日、各５μｌ
の終夜の培養物を非滅菌９６穴プレート内に移し、水で１：１０に希釈した後、
それぞれ５μｌのサンプルをＰＣＲアレイに移した。

【０２０４】 ＰＣＲ増幅のため、４単位のrTth ＤＮＡポリメラーゼを含む１８μｌの濃縮 ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用いら
れる遺伝子に特異的なプライマーの一方或いは両方を各ウェルに加えた。増幅は
、以下の条件、即ち ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） で行った。

【０２０５】 ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上を走ら
せた。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的ｃＤＮＡと比較して、適切なクローン
を選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行った。

【０２０６】 同様に、配列番号：２のヌクレオチド配列を用いて、上述の手順を用いて５′
調節配列を得ること、５′方向の延長のために設計されたオリゴヌクレオチドを
得ること、及び適切なゲノムライブラリーを得ることが可能である。

【０２０７】 ７ ハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 配列番号：２の配列から作られたハイブリダイゼーションプローブを用いて、
ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０の塩基対
からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなｃＤＮＡフ
ラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。OLIGO4.06（National Bioscience
）のような最新式のソフトウェアを用いてオリゴヌクレオチドを設計し、それぞ
れ５０ｐｍｏｌのオリゴマーと、２５０μＣｉの[γ‐³²Ｐ]アデノシン三リン酸
（Amersham）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN、Boston MA）と を結合することによって標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、Sephadex
G-25超微粒子樹脂カラム（Pharmacia & Upjohn）を用いて精製する。毎分１０ ⁷ カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、エンドヌクレアーゼAseI ，Bgl II，EcoRI，Pst I，Xba1或いはPvuII；DuPont NENの１つを用いて消化し たヒトゲノムＤＮＡの一般的な膜を用いるハイブリダイゼーション解析において
用いる。

【０２０８】 各消化物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画化して、ナイロン
膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）にトランスファーする。
ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取
り除くため、ブロットを、０．１ｘクエン酸ナトリウム水及び０．５％ドデシル
硫酸ナトリウムまでの、段階的にストリンジェンシーが増す条件下で室温にて順
次洗浄する。XOMAT AR^TMフィルム（Kodak, Rochester, NY）を、Phosphoimager カセット（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）においてブロットに数時間露 光した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。

【０２０９】 ８ マイクロアレイ マイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドを作製するために、配列番号：２を、
ヌクレオチド配列の３’末端からコンピュータアルゴリズムを用いて調べる。こ
のアルゴリズムは、その遺伝子に独特で、ハイブリダイゼーションに適した範囲
内のＧＣ含量を有し、且つハイブリダイゼーションを妨げるような推定上の２次
構造が存在しない、決まった長さのオリゴマーを同定する。このアルゴリズムは
、長さ20ヌクレオチドの（20量体）20個の配列特異的オリゴヌクレオチドを同定
する。各配列の中央の１個のヌクレオチドだけが変化して他は一致しているオリ
ゴヌクレオチドの組を作製する。このプロセスはマイクロアレイにおける各遺伝
子について反復され、20個の20量体の組が２組、光照射化学プロセスを用いてシ
リコンチップの表面上で合成され配列される（Chee, M.他 PCT/WO95/11995）。

【０２１０】 別法では、化学結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いて、基板の表
面上でオリゴマーを合成する（Baldeschweiler, J.D.他 PCT/WO95/25116）。更 に別の方法では、ドットブロット法（スロットブロット法）で用いるものに類似
した「格子型」アレイを用いて、真空システム、熱、ＵＶ、機械的又は化学的結
合プロシージャを用いて、ｃＤＮＡ断片又はオリゴヌクレオチドを基板の表面に
配置し結合させる。アレイは、手作業により、又は市販の材料及び機械を用いる
ことによって製作することができ、8ドット、24ドット、94ドット、384ドット、
1536ドット、又は6144ドットの格子を有し得る。ハイブリダイゼーションの後、
マイクロアレイを洗浄してハイブリダイズしていないプローブを取り除き、スキ
ャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを求める。スキャンされた画像を調べ
て、マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の程度及び相対的な
量／発現レベルを求める。

【０２１１】 ９ 相補的ポリヌクレオチド ＮＴＰＰＨ−２をコードする配列或いはその任意の一部分に相補的な配列は、
自然発生のＮＴＰＰＨ−２の発現を低下、即ち阻害するために用られる。約１５
〜約３０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの使用について特に記すが、より小
さな或いはより大きな配列フラグメントの場合でも基本的に同じ方法を用いるこ
とができる。Oligo4.06ソフトウェア及びＮＴＰＰＨ−２のコーディング配列（ 配列番号：１）を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害す
るためには、最も独特な５′配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、こ
れを用いてプロモーターが結合しないようにする。翻訳を阻害するためには、相
補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＮＴＰＰＨ−２をコードす
る転写物に結合しないようにする。

【０２１２】 １０ ＮＴＰＰＨ−２の発現 ＮＴＰＰＨ−２をコードするｃＤＮＡを用いて、完全長と切断型両方の組換え
ＮＴＰＰＨを発現させる。ＮＴＰＰＨ−２の発現は、ｃＤＮＡを適切なベクター
内にサブクローニングし、そのベクターを宿主細胞に形質転換することによって
達成される。この場合、バキュロウイルスFast-BACシステム（GIBCO/BRL）にお いてＮＴＰＰＨ−２を発現させるためにクローニングベクターが用いられた。こ
のベクターは、クローニング部位の上流に、ポリヘドリンコートタンパク質のプ
ロモーターを有する。組換えバキュロウイルスをSF9のような昆虫細胞系に感染 させた結果、ＮＴＰＰＨ−２の発現が生ずる。シグナル残基群は、培地へのＮＴ
ＰＰＨ−２の分泌を誘導し、この培地は次の活性のアッセイにおいて直接用いる
ことができる。

【０２１３】 １１ ＮＴＰＰＨ−２の活性の立証 ヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ−２の活性を、チミジン１リン酸
パラニトロフェニルエステル又は［³²Ｐ］ガンマ標識したＡＴＰを基質として用
いて解析する。Cardenal, A.ら（1996; Arthritis Rheum. 39:252-256.）に記載
のように、培地をクロマトグラフィにかけ、ピーク分画を動力学的に解析する。

【０２１４】 １２ ＮＴＰＰＨ−２特異的抗体の産生 ＮＴＰＰＨ−２をコードするｃＤＮＡから類推されるアミノ酸配列をDNASTAR ソフトウエア（DNASTAR Inc.）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、
対応するオリゴペプチドを合成し、当業者に周知の方法でこれを用いて抗体を産
生させる。適切なペプチド配列の選択及び抗体の産生の技術は当業者に周知であ
る。Ｃ末端付近のエピトープ或いは親水性領域内のエピトープのような適切なエ
ピトープの選択については、Ausubel他（前出）や他の文献に記載されている。

【０２１５】 一般的に、１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、Applied Biosystemsの
ペプチドシンセサイザModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し
、Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ
：Ausubel他、前出）を用いる反応によってキーホールリンペットヘモシニアン （ＫＬＨ、Sigma, St. Louis, MO）に結合する。フロイントの完全アジュバント
中のオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血
清の抗ペプチド活性を試験するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、
１％ＢＳＡでブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ
素標識したヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。

【０２１６】 １３ 特異的抗体を用いる自然発生ＮＴＰＰＨ−２の精製 自然発生のＮＴＰＰＨ−２或いは組換えＮＴＰＰＨ−２を、ＮＴＰＰＨ−２に
特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精
製する。イムノアフィニティーカラムは、CnBr-活性化 Sepharose（Pharmacia &
Upjohn）のような活性化クロマトグラフィーレジンとＮＴＰＰＨ−２抗体とを 共有結合で結合させることにより構築する。結合の後、そのレジンを使用説明書
の指示に従って、ブロックし洗浄する。

【０２１７】 ＮＴＰＰＨ−２を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラ
ムをＮＴＰＰＨ−２を優先的に吸着できる条件下で（例えば界面活性剤の存在下
において高イオン強度バッファーで）洗浄する。このカラムを、抗体とＮＴＰＰ
Ｈ−２との結合を切るような条件下（例えばｐＨ２〜３のバッファー、或いは高
濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオン）で溶出
させ、ＮＴＰＰＨ−２を回収する。

【０２１８】 １４ ＮＴＰＰＨ−２と相互作用する分子の同定 ＮＴＰＰＨ−２又は生物学的に活性なその断片を、¹²⁵Ｉボルトンハンター試 薬（Bolton 他 (1973) Biochem. J. 133:529）で標識する。マルチウェルプレー
トのウェルに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＮＴＰＰＨ−２ととも
にインキュベートし、洗浄して、標識ＮＴＰＰＨ−２複合体を有するウェルをア
ッセイする。異なる濃度のＮＴＰＰＨ−２を用いて得られたデータを用いて、候
補の分子とＮＴＰＰＨ−２の会合、親和性、数の数値を計算する。

【０２１９】 上記のすべての刊行物及び特許明細書は、引用により本明細書の一部とする。
本発明の範囲及び精神から逸脱しない本明細書に記載した本発明の方法及びシス
テムの様々な改変は、当業者には明らかであろう。本発明は、特に好適な実施例
に関連して説明されているが、本発明の真の範囲は、そのような特定の実施例に
不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは
関連分野の専門家には明らかな本発明の実施形態の様々な改変は、請求の範囲内
に含まれるものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ、ＮＴＴＰＨ−２のアミノ酸配列
（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）の一部を示す図である。配列の
アライメントは、MacDNAsis PRO^TMソフトウェア（Hitachi Software Engineerin
g Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図１Ｂ】 ヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ、ＮＴＴＰＨ−２のアミノ酸配列
（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）の一部を示す図である。配列の
アライメントは、MacDNAsis PRO^TMソフトウェア（Hitachi Software Engineerin
g Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図１Ｃ】 ヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ、ＮＴＴＰＨ−２のアミノ酸配列
（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）の一部を示す図である。配列の
アライメントは、MacDNAsis PRO^TMソフトウェア（Hitachi Software Engineerin
g Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図１Ｄ】 ヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ、ＮＴＴＰＨ−２のアミノ酸配列
（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）の一部を示す図である。配列の
アライメントは、MacDNAsis PRO^TMソフトウェア（Hitachi Software Engineerin
g Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図１Ｅ】 ヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ、ＮＴＴＰＨ−２のアミノ酸配列
（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）の一部を示す図である。配列の
アライメントは、MacDNAsis PRO^TMソフトウェア（Hitachi Software Engineerin
g Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図１Ｆ】 ヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ、ＮＴＴＰＨ−２のアミノ酸配列
（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）の一部を示す図である。配列の
アライメントは、MacDNAsis PRO^TMソフトウェア（Hitachi Software Engineerin
g Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図１Ｇ】 ヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ、ＮＴＴＰＨ−２のアミノ酸配列
（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）の一部を示す図である。配列の
アライメントは、MacDNAsis PRO^TMソフトウェア（Hitachi Software Engineerin
g Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図１Ｈ】 ヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ、ＮＴＴＰＨ−２のアミノ酸配列
（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）の一部を示す図である。配列の
アライメントは、MacDNAsis PRO^TMソフトウェア（Hitachi Software Engineerin
g Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図１Ｉ】 ヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ、ＮＴＴＰＨ−２のアミノ酸配列
（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）の一部を示す図である。配列の
アライメントは、MacDNAsis PRO^TMソフトウェア（Hitachi Software Engineerin
g Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図１Ｊ】 ヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ、ＮＴＴＰＨ−２のアミノ酸配列
（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）の一部を示す図である。配列の
アライメントは、MacDNAsis PRO^TMソフトウェア（Hitachi Software Engineerin
g Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図１Ｋ】 ヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ、ＮＴＴＰＨ−２のアミノ酸配列
（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）の一部を示す図である。配列の
アライメントは、MacDNAsis PRO^TMソフトウェア（Hitachi Software Engineerin
g Co. Ltd. San Bruno, CA）を用いて作成した。

【図２Ａ】 ＮＴＴＰＨ−２（配列番号：１）とＮＴＴＰＨ−１（配列番号：３）との間の
配列アライメントの一部を示す図である。

【図２Ｂ】 ＮＴＴＰＨ−２（配列番号：１）とＮＴＴＰＨ−１（配列番号：３）との間の
配列アライメントの一部を示す図である。

【図２Ｃ】 ＮＴＴＰＨ−２（配列番号：１）とＮＴＴＰＨ−１（配列番号：３）との間の
配列アライメントの一部を示す図である。

【図３Ａ】 ＮＴＴＰＨ−２（配列番号：１）の疎水性プロットを示す図である。Ｘ軸は正
の方向にアミノ酸の位置を表し、Ｙ軸は負の方向に疎水性のレベルを表す（MacD
NAsis PROソフトウェアを用いて作成）。

【図３Ｂ】 ＮＴＴＰＨ−１（配列番号：３）の疎水性プロットを示す図である。Ｘ軸は正
の方向にアミノ酸の位置を表し、Ｙ軸は負の方向に疎水性のレベルを表す（MacD
NAsis PROソフトウェアを用いて作成）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 37/02 ４Ｃ０８５ 37/02 Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 33/50 Ａ６１Ｋ 37/54 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 シャファー、ポール アメリカ合衆国コネチカット州06340・グ ラトン・アパートメント ４・ハインズア ベニュー 101 (72)発明者 ロートン、マイケル アメリカ合衆国コネチカット州06498・ウ エストブルック・マグナレーン 61 (72)発明者 ヨッカム、スー・エイ アメリカ合衆国コネチカット州06330・バ ルティック・パインクレストレーン 11 (72)発明者 ミッチェル、ピーター・ジー アメリカ合衆国コネチカット州06355・ミ スティック・ゴッドフリーストリート ５ (72)発明者 ハッチンソン、ナンシー アメリカ合衆国コネチカット州06371・オ ールドライム・スクワイアーヒル ７ (72)発明者 マリー、リン・イー アメリカ合衆国カリフォルニア州94028・ ポルトラバレー・ロストランコスロード 1124 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA26 AA34 AA35 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 AA12 BA11 BA53 CA04 CA05 CA11 DA02 HA15 4B050 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QQ44 QQ58 QR42 QR55 QS25 QS34 QX07 4C084 AA02 AA06 AA07 AA17 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 CA53 CA56 CA59 DC22 NA14 ZA962 ZB072 ZB262 ZC422 4C085 AA14 BB22 DD06 DD62 DD63 DD86 DD88 FF02 FF03 FF11 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA40 DA89 EA22 EA28 EA51 FA74

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有
   する、実質的に精製されたヒト・ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ−２（Ｎ
   ＴＴＰＨ−２）。
2. 【請求項２】 配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ
   酸配列同一性を有する、実質的に精製されたＮＴＴＰＨ−２の変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のＮＴＴＰＨ−２をコードする、単離され精製さ
   れたポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドと少なくとも９０％のポリヌ
   クレオチド配列同一性を有する、単離され精製されたポリヌクレオチド変異体。
5. 【請求項５】 請求項３のポリヌクレオチドを含む組成物。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件の
   下でハイブリダイズする、単離され精製されたポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 請求項３のポリヌクレオチドに相補的な、単離され精製さ
   れたポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項２又は配列番号：２の断片を含む、単離され精製さ
   れたポリヌクレオチド。
9. 【請求項９】 American Type Culture Collectionに受入番号 とし
   て登録された、請求項８の単離され精製されたポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 前記断片が、 （ａ）配列番号：２の５５番目乃至７５番目のヌクレオチド； （ｂ）配列番号：２の４８１番目乃至５０７番目のヌクレオチド； （ｃ）配列番号：２の６４６番目乃至６６９番目のヌクレオチド； （ｄ）配列番号：２の２１８２番目乃至４１４９番目のヌクレオチド； （ｅ）配列番号：２の１７２６番目乃至４１４９番目のヌクレオチド； （ｆ）配列番号：２の７５７番目乃至４１４９番目のヌクレオチド； （ｅ）配列番号：２の１７２６番目乃至４１４９番目のヌクレオチド；及び （ｇ）配列番号：２の１１３番目乃至４１４９番目のヌクレオチドからなる群
    から選択されたものであることを特徴とする請求項８のポリヌクレオチドの断片
    。
11. 【請求項１１】 請求項８のポリヌクレオチドと少なくとも９０％のポリ
    ヌクレオチド配列同一性を有する、単離され精製されたポリヌクレオチド変異体
    。
12. 【請求項１２】 請求項８のポリヌクレオチドに相補的な、単離され精製
    されたポリヌクレオチド。
13. 【請求項１３】 配列番号：３のポリヌクレオチドの少なくとも断片を含
    む発現ベクター。
14. 【請求項１４】 請求項１３の発現ベクターを含む宿主細胞。
15. 【請求項１５】 配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を
    有するポリペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、請求項１４の宿主細胞を
    培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
    を特徴とする配列番号：１又は配列番号：１の断片のアミノ酸配列を有するポリ
    ペプチドの製造方法。
16. 【請求項１６】 請求項１のＮＴＴＰＨ−２と適切な医薬用担体とを含む
    医薬品組成物。
17. 【請求項１７】 請求項１のＮＴＴＰＨ−２に特異的に結合する精製され
    た抗体。
18. 【請求項１８】 請求項１のＮＴＴＰＨ−２の精製されたアゴニスト。
19. 【請求項１９】 請求項１のＮＴＴＰＨ−２の精製されたアンタゴニスト
    。
20. 【請求項２０】 関節症を処置するための方法であって、 そのような処置が必要な患者に、請求項１８のアンタゴニストを有効な量投与
    する過程を含むことを特徴とする関節症を処置するための方法。
21. 【請求項２１】 免疫疾患を処置するための方法であって、 そのような処置が必要な患者に、請求項１９のアンタゴニストを有効な量投与
    する過程を含むことを特徴とする免疫疾患を処置するための方法。
22. 【請求項２２】 癌を処置するための方法であって、 そのような処置が必要な患者に、請求項１９のアンタゴニストを有効な量投与
    する過程を含むことを特徴とする癌を処置するための方法。
23. 【請求項２３】 生物学的サンプルにおいてＮＴＴＰＨ−２をコードする
    ポリヌクレオチドを検出する方法であって、 （ａ）請求項７のポリヌクレオチドと、前記生物学的サンプルの核酸の少なく
    とも１種類とをハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成する
    過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
    ブリダイゼーション複合体の存在が、前記生物学的サンプルにおけるＮＴＴＰＨ
    −２をコードするポリヌクレオチドの存在と相互関係を有する、該過程とを有す
    ることを特徴とする生物学的サンプルにおいてＮＴＴＰＨ−２をコードするポリ
    ヌクレオチドを検出する方法。
24. 【請求項２４】 ハイブリダイゼーションを行う過程の前に、前記生物学
    的サンプルの核酸をポリメラーゼ連鎖反応法により増幅することを特徴とする請
    求項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 生物学的サンプルにおいてＮＴＴＰＨ−２を検出する方
    法であって、 （ａ）複合体形成に適した条件の下で、前記生物学的サンプルと請求項１７の
    抗体とを結合する過程と、 （ｂ）ＮＴＴＰＨ−２と前記抗体との複合体形成を検出し、前記生物学的サン
    プルにおけるＮＴＴＰＨ−２の存在を確認する過程とを含むことを特徴とする生
    物学的サンプルにおいてＮＴＴＰＨ−２を検出する方法。
26. 【請求項２６】 ＮＴＴＰＨ−２に結合する分子を特定するべく小分子の
    ライブラリーをスクリーニングする方法であって、 （ａ）複合体形成に適した条件の下で、前記小分子のライブラリーと請求項１
    ５のポリペプチドとを結合する過程と、 （ｂ）複合体形成を検出する過程であって、前記複合体の存在が、ＮＴＴＰＨ
    −２に結合する小分子を特定する、該過程とを含むことを特徴とするＮＴＴＰＨ
    −２に結合する分子を特定するべく小分子のライブラリーをスクリーニングする
    方法。
27. 【請求項２７】 アゴニストを特定する方法であって、 （ａ）請求項２６の小分子の１つとγ標識したＡＴＰとを、ＮＴＴＰＨ−２を
    発現するベクターで形質転換された細胞に送達する過程と、 （ｂ）適切な条件の下で前記細胞を増殖させる過程と、 （ｃ）量の増加したＰＰｉをアッセイし、小分子がアゴニストであることを確
    認する過程とを含むことを特徴とするアゴニストを特定する方法。
28. 【請求項２８】 アンタゴニストを特定する方法であって、 （ａ）請求項２６の小分子の１つとγ標識したＡＴＰとを、ＮＴＴＰＨ−２を
    発現するベクターで形質転換された細胞に送達する過程と、 （ｂ）適切な条件の下で前記細胞を増殖させる過程と、 （ｃ）量の増加したＰＰｉをアッセイし、前記小分子がアンタゴニストである
    ことを確認する過程とを含むことを特徴とするアンタゴニストを特定する方法。