JP2001524948A

JP2001524948A - 疎水性テトラサイクリンによるセリンプロテイナーゼ阻害活性

Info

Publication number: JP2001524948A
Application number: JP53959398A
Authority: JP
Inventors: サンフォードアールシモン; エリザベスジェイローマー; ローンエムゴーラブ; ヌンガヴァラムエスラママーティー
Original assignee: ザリサーチファウンデーションオブステイトユニヴァーシティオブニューヨーク
Priority date: 1997-03-13
Filing date: 1998-02-26
Publication date: 2001-12-04
Anticipated expiration: 2018-02-26
Also published as: DE69829748D1; DE69829748T2; KR100530683B1; JP4339411B2; NZ337578A; DK0975349T3; US5773430A; ATE292972T1; EP0975349B1; EP0975349A1; CA2283071A1; ES2241124T3; EP0975349A4; AU733308B2; PT975349E; CA2283071C; KR20000076231A; AU6669898A; WO1998040079A1

Abstract

(57)【要約】生物系におけるセリンプロテイナーゼの活性を阻害する方法として、該系に、セリンプロテイナーゼ阻害量の疎水性の４−デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリンを投与することを含ませる。その方法により、ヒト白血球エラスターゼの活性により生じる炎症の際の組織崩壊が低減される。その方法は、薬学的に又は化粧学的に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】疎水性テトラサイクリンによるセリンプロテイナーゼ阻害活性発明の背景１．発明の技術分野本発明は、生体系におけるセリンプロテイナーゼ活性の阻害のために疎水性テトラサイクリンを使用する方法に関するものである。より具体的には、本発明は、セリンプロテイナーゼ白血球エラスターゼ活性により生じる炎症介在組織崩壊に罹患した哺乳類を治療するための４−デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリンの治療的使用に関するものである。２．従来技術の記載結合組織へのダメージは、炎症反応の主要問題である。そのような炎症組織損傷は、例えば、関節炎疹の関節、肺気腫及び呼吸障害症候群の肺、多臓器障害の腎臓及び消火器、歯周病の歯肉及び歯根膜、並びに虚血−再灌流症候群(ischemi a-reperfusion syndrome)の心臓及び脳についての病理学的変化に寄与する。白血球により放出されたプロテアーゼは、炎症反応に関連する組織損傷において重要な役割を果たす。セリンプロテイナーゼ及びマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の２種のクラスのプロテアーゼが炎症組織損傷に関連している。セリンプロテイナーゼは、ＭＭＰの基質特異性及び基質結合態様とは全く異なる基質特異性及び基質結合態様を有する。セリンプロテイナーゼは、その基質特異性により以下の３種に分類されている：トリプシン類、キモトリプシン類及びエラスターゼ類。セリンプロテイナーゼエラスターゼは、Ｐ₁部位に小さな脂肪鎖（例えばＡｌａ、Ｖａｌ）を有する基質を好む。Ｐ₁及びＰ₂などは、基質の切断部位に隣接するプロテアーゼの天然基質の群であり、通常Ｓ₁及びＳ₂などと称される酵素のサブサイトに適合すると考えられている。セリンプロテイナーゼの作用の態様には、加水開裂のための求核試薬として作用するヒドロキシル基を有するアミノ酸セリンが包含される。対照的に、マトリックスメタロプロテイナーゼにおいては、金属（通常は亜鉛）が、加水分解のためにターゲットタンパクアミドカルボニルに作用する。従って、セリンプロテイナーゼエラスターゼは、ＭＭＰエラスターゼとは区別される。セリンプロテイナーゼエラスターゼ（ヒト白血球エラスターゼ、即ちＨＬＥ）の阻害剤の開発には多大な労力が費やされており、その理由は、特には、肺気腫及び呼吸障害症候群と関連する肺損傷のメカニズムにおけるその推定上の役割のためである。植物起源の五環系トリテルペノイドにより例証される非ペプチド類の天然生成物、特にはウルソル酸による、ヒト白血球エラスターゼの阻害は、Q-L Yingらの “ウルソン酸によるヒト白血球エラスターゼの阻害：五環系トリテルペンについての結合部位の証明”,Biochem．J．277,521-526(1991)に記載されている。 4-(メチルスルフィニル)フェニル2-1-(1-メチル-2-ピロリル)ブチレート及び関連スルフィド及びスルホン誘導体などの合成起源の、他の非ペプチド類ヒト白血球エラスターゼ阻害剤は、R．T．Cunninghamらの“CE-0266の合成及び評価：新規なヒト好中球エラスターゼ阻害剤”，Bioorganic Chemistry，20，345-355( 1992)に記載されている。ＨＬＥ阻害剤であるこれらの化合物の更なる類似体は、G．P．Kirschenheuterらの“フェニルアルカン酸の芳香族エステルから誘導されたヒト好中球エラスターゼ阻害剤の合成及び特徴づけ”,Proteases,Protease Inhibitors and Protease-Derived Peptides,Birkhauser Verlag,Basel(1993),p p 71-82に記載されている。これらの天然又は合成起源の非ペプチド類化合物は、低分子量の疎水性アニオン阻害剤である。ＨＬＥの低分子阻害剤は、好ましくは、陰電荷の中心に、拡張疎水性ドメイン (extended hydrophobic domain)を有すると考えられている。Ｘ線結晶学による白血球エラスターゼの３次元結合部位の分析により、この酵素のための拡張基質結合部位(extended substrate binding site)が、疎水性残部により主に配置(li ne)されるが、この疎水性環境(milieu)の中央におけるアルギニン側鎖（触媒三つ組残基の直接的部位でない）が、構造的に、活性部位の構造を安定化させるのに寄与することが示される。阻害剤として作用し得る、ペプチド類及び非ペプチド類の両方の疎水性アニオン化合物は、疎水力及びアルギニン残部との静電反応の組み合せを通じて、拡張基質結合部位に結合すると考えられている。ＨＬＥの非ペプチド類の、疎水性アニオン阻害剤の他の例は、脂肪酸、胆汁及びピレントリスルホン酸であり、それらの全ては本件発明者の１人の実験室において研究されている。S．Simonらの“ポリグアニル酸及び他の合成ポリヌクレオチドによるヒト好中球エラスターゼの阻害”，Adv.Exp.Med.Biol.240,65-74(198 8);S．C．Tyagi及びS．R．Simonの“好中球エラスターゼにおける結合ドメインに関連する阻害剤”，Biochemistry 20，9970-9977(1990);S．Tyagi及びS．R．S imonの“好中球エラスターゼにおける結合ドメインのプローブとしてのパリナリン酸”，J．Biol．Chem．266，15185-15191(1991);S．Tyagi及びS．R.Simonの“ 好中球エラスターゼと疎水性ポリアニオンキレート剤の相互作用”，Biochem．C ell Biol．69，624-629(1991)。これらの化合物の全てが、可逆阻害剤であり、かつ、酵素との共有結合性相互反応をなさない。それらは、拡張基質結合部位で結合するので、それらは、高分子のオリゴペプチド基質及びタンパク質（エラスチンなど）の酵素的加水分解の競合的阻害剤であるが、活性部位内の触媒三つ組残基の中間付近においてのみ結合する最小合成基質の加水分解の非競合的阻害剤である。これらの天然又は合成起源の非ペプチド類化合物のいずれも、テトラサイクリンに類似していない。テトラサイクリンは、抗生物質としての早期的及びめざましい成功のために特に周知のクラスの化合物である。テトラサイクリン、スポロサイクリン(sporocy cline)などのそのような化合物は、広範な種々のバクテリア及び他の細菌に対して有用な広範領域抗生物質である。親化合物、テトラサイクリンは、以下の一般構造を有する：多環核の番号システムは以下のとおりである：テトラサイクリン、及び5-OH(オキシテトラサイクリン、例えばterramycin(登録商標))及び7-Cl(クロロテトラサイクリン、例えばaureomycin(登録商標))誘導体は、天然界に存在し、かつ、全て周知の抗生物質である。半合成テトラサイクリンには、例えば、ドキシサイクリン、ミノサイクリン及びメタサイクリンが含まれる。テトラサイクリン抗生物質の使用は、一般に感染治療に効果的であるが、望ましくない副作用が生じ得る。例えば、抗生物質テトラサイクリンの長期投与により、腸内フロラなどのヘルシーフロラが低減又は排除され、抗生物質抵抗性生物の産生又は酵母菌及び菌類の過成長が生じ得る。これらの著しく不利な点により、典型的には、これらの化合物の治療規則要求長期投与が不可能となる。天然テトラサイクリンは、それらの抗生物質特性を失うことなく修飾することができるが、その構造のある要素はそのために保持しなければならない。構造的に抗生物質テトラサイクリンと関連するが、化学的修飾により、それらの抗生物質作用が実質的に又は完全に失われたクラスの化合物が明らかとなっている。テトラサイクリン基本構造に行っても行わなくてもよい修飾は、Mitscher，L．A. ，The Chemistry of the Tetracycline Antibiotics,Marcel Dekker,New York(1 978)，Ch．6で研究されている。Mitscherによれば、テトラサイクリン環系の５〜９位の修飾は、抗生物質特性の完全な損失なしに行うことができる。しかしながら、環系の基本構造の変更又は１〜４位又は１０〜１２位での置換基の置換により、通常、抗生物質活性を実質的に失った、又は本質的に有さない合成テトラサイクリンが生じる。化学的に修飾したテトラサイクリン（ＣＭＴ）としては、例えば、4-デ(ジメチルアミノ)テトラサイクリン(CMT-1)、テトラサイクリノニトリル(CMT-2)、6- デメチル-6-デオキシ-4-デ(ジメチルアミノ)テトラサイクリン(CMT-3)、7-クロロ-4-デ(ジメチルアミノ)テトラサイクリン(CMT-4)、テトラサイクリンピラゾール(CMT-5)、4-ヒドロキシ-4-デ(ジメチルアミノ)テトラサイクリン(CMT-6)、4- デ(ジメチルアミノ)-12α-デオキシテトラサイクリン(CMT-7)、6-デオキシ-5α- ヒドロキシ-4-デ(ジメチルアミノ)テトラサイクリン(CMT-8)、4-デ(ジメチルアミノ)-12α-デオキシアンヒドロテトラサイクリン(CMT-9)及び4-デ(ジメチルアミノ)ミノサイクリン(CMT−10)が挙げられる。低減された抗菌活性のために修飾されたテトラサイクリンの更なる例としては、オキシテトラサイクリン及びクロロテトラサイクリンの4-エピマー（エピ−オキシテトラサイクリン及びエピ−テトラサイクリン）が挙げられる。数種のテトラサイクリンは、マトリックスメタロプロテイナーゼを阻害することが知られており、本発明者の２人の実験室では、テトラサイクリン抗生物質活性のＭＭＰを独立的に阻害し得る一連の化合物群としてテトラサイクリンを確認している。Golubらの米国特許第5,459,135号、Golubらの米国特許第5,321,017号、Golubらの米国特許第5,308,839号、McNamaraらの米国特許第4,935,412号、McN amaraらの米国特許第4,704,383号及びGolubらの米国特許第4,666,897号には、非抗菌性テトラサイクリンを使用して、組織崩壊状態、慢性炎、及びコラゲナーゼ、ゲラチナーゼ及びＭＭＰエラスターゼなどのマトリックスメタロプロテイナーゼの過剰なメタロプロテイナーゼ活性に関連する他の状態を治療することが記載されている。テトラサイクリンによるマトリックスメタロプロテイナーゼ活性の阻害が、実験動物を含む一連の実験において示されており、その中においては、歯周炎を口内病原体の感染により医原的に引き起こし、又は歯周靭帯の萎縮をすい島の崩壊により引き起こし、組織損傷部位でのＭＭＰ活性の病理学的評価を得ている。抗菌活性に欠ける、化学的に修飾されたテトラサイクリン及び抗菌活性を保持する半合成テトラサイクリンを用いたこれらの動物の治療により、組織損傷部位でのＭＭＰレベルにおける顕著な低減及び動物の歯根膜の顕著な改善が得られた。例えば、K．M．Changらの“Local and Systemic Factors in Periodontal Disease Increase Matrix-Degrading Enzyme Activities in Rat Gingiva;Effect of Mi nocycline Therapy”，Research Communications in Molecular Pathology and Pharmacology，91，303-318(1996);M．E．Ryan，et al.，“Matrix Metalloproteinases and Their Inhibition in Periodontal Treatment”,Curre nt Opinion in Periodontology，3，85-96(1996)を参照されたい。しかしながら、この関連研究においては、種々の修飾テトラサイクリンがマトリックスメタロプロテイナーゼエラスターゼの活性を阻害するが、当時に特徴付けされたテトラサイクリンは、ラットＰＭＮ又はヒト滑膜のいずれの、インビトロでのセリンプロテイナーゼエラスターゼ活性も阻害しなかったことが分かっている。例えば、L．Golubらの“Tetracyclines Inhibit Connective Tissue Brea kdown:New Therapeutic Implications For an Old Family of Drugs”，Crit．R ev．Oral Biol．Med.，2，297-322(1991)，pp300-301を参照されたい。メタロプロテイナーゼ及びセリンプロテイナーゼは、組み合せで、間質(inter stitial stroma)及び基底膜を含む細胞外マトリックスのほとんどの要素を破壊し得る。この相互作用において、１）カテプシンＧ（セリンプロテアーゼ）は、ＭＭＰ−８を活性化し得；２）ヒト白血球エラスターゼ（セリンプロテアーゼ）は、マトリックスメタロプロテイナーゼの主要内在性組織阻害剤(ＴＩＭＰ)を不活性化し得；かつ、３）ＭＭＰ−８及びＭＭＰ−９は、α₁−プロテイナーゼ阻害剤（α₁−ＰＩ）及びヒト白血球エラスターゼの主要内在性阻害剤を不活性化し得る。S.K.Mallyaらの“Interaction of Matrix Metalloproteinases With Se rine Protease Inhibitors”,Annals of the New York Academy of Science,732 ,303-314(1994);及びA.R.Rinehartらの“Human α-Proteinase Inhibitor Binds to Extracellular Matrix In Vitro”,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,9,666-679 (1993)を参照されたい。従って、プロテアーゼ活性化に寄与し内在性阻害剤を不活性化することにより、２つのクラスのプロテイナーゼが、病的組織崩壊に対するプロテアーゼ−抗プロテアーゼバランスを崩すこととなり得る。酵素は通常条件下で制御されるが、制御メカニズムの崩壊により、過度なセリンプロテイナーゼ活性により特徴付けられる種々の病的状況が生じ得る。例えば、α₁−ＰＩの内在レベルがヒト白血球エラスターゼレベルを効果的に中和(neutralize)し得ないような、呼吸障害症候群が生じ得る多数の好中球の浸入状況下では、プロテアーゼ−抗プロテアーゼバランスが崩れることになるので、内在性抗エラスターゼの保護は、ＨＬＥ介在損傷からの保護を提供するには不十分であろう。プロテアーゼ−抗プロテアーゼバランスを十分に回復させ得る外来性プロテアーゼ阻害剤は、今日まで見い出されていない。発明の概要そこで、本発明により、生体系に、セリンプロテアーゼ阻害量の疎水性テトラサイクリンを投与することにより、生体系におけるセリンプロテアーゼの過度な活性を阻害する方法を提供する。好ましいテトラサイクリンは、4-デ(ジメチルアミノ)テトラサイクリン、例えば、6-デオキシ-5α-ヒドロキシ-4-デ(ジメチルアミノ)テトラサイクリン、及び特には、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ(ジメチルアミノ)テトラサイクリンである。ある実施態様においては、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ(ジメチルアミノ)テトラサイクリンを、白血球エラスターゼの活性を阻害するのに十分な量で哺乳類に投与して、白血球エラスターゼの活性に関連する炎症性崩壊を低減する。哺乳類は好ましくはヒトであるが、他の動物を好適に処理することもできる。本発明の方法は、医薬品及び化粧品に対して有用である。阻害剤は、プロテアーゼ−抗プロテアーゼバランスを回復させる治療剤として顕著な利点を有する。図面の簡単な説明図１は、実施例１に記載したような、１１種の異なるテトラサイクリンによる細胞外マトリックスのヒト好中球介在崩壊の阻害の棒グラフである。この阻害の投与量依存性の結果を表Ｉに記載する。図２は、実施例１及び２に記載したような、ＣＭＴ−３（ＣＯＬ−３）による細胞外マトリックスのヒト好中球介在及びヒト白血球エラスターゼ介在崩壊の阻害の比較を表す棒グラフである。図３Ａ、Ｂ及び図４Ａ、Ｂは、実施例２に記載したような、ＣＭＴ−３（ＣＯＬ−３）によるヒト白血球エラスターゼのアミド(amidolytic)活性の阻害のディクソンプロット（図３Ａ及び４Ａ）及びコーニッシュ−ボーデンプロット（図３Ｂ及び４Ｂ）を表す。コーニッシュ−ボーデンプロットのバラレルな傾斜(paral lel slope)及びＸ軸上のディクソンプロットの交差から、ＣＭＴ−３（ＣＯＬ− ３）が、オリゴペプチド色素基質メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-p- ニトロアニリドに対するヒト白血球エラスターゼアミド活性の競合性阻害剤であることが示される。図５は、ドキシサイクリンの存在下におけるＨＬＥアミド活性のディクソンプロットを表し、それは、実施例２に記載したような、ＣＭＴ−３と対比したこのテトラサイクリンによる非常に弱い阻害のみを示す。図６は、実施例３における、局所的炎症を引き起こすために細菌性リポ多糖類を歯肉注入したラットの歯肉組織抽出物における白血球エラスターゼ活性を低減させる、経口投与されたＣＭＴ−３の能力を示す。発明の詳細な説明本発明の方法においては、疎水性テトラサイクリンが、効果的なセリンプロテアーゼエラスターゼ阻害活性を有する。ヒト白血球エラスターゼ(ＨＬＥ)及びカテプシンＧは、ヒト多形核白血球(好中球)のアズール顆粒において見出されたセリンプロテイナーゼである。このエラスターゼは、ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）と称され得る。天然基質、エラスチンは、デスモシン及びα−イソデスモシン及び他の架橋成分により高度に架橋された可撓性タンパク質である。セリンプロテイナーゼエラスターゼは、弾性繊維、タイプIVコラーゲン(血管の基底膜中に生じる)、タイプIIIコラーゲン( 歯肉及び平滑筋中に生じる)、プロテオグリカン、フィブロネクチン及びラミニンなどの癒着性グリコプロテイン、ＴＩＭＰ、及び結合組織及び間質液の他のタンパク成分を崩壊し得る。セリンプロテイナーゼヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）は、関節炎、歯周病、糸球体腎炎、急性肺疾患、嚢胞性繊維症、及び腫瘍細胞による細胞外マトリックスの侵入により特徴付けされる数種の悪性ガンなどの多くの病症状態における組織崩壊についての潜在的可能性を有する。ＨＬＥ活性は、細菌性ショック、多臓器障害（ＭＯＦ）及び心筋虚血−再灌流損傷に関連している。ＨＬＥは、また、気腫及び成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）に関連する肺損傷のメカニズムに関連している。肺へのダメージは、プロテアーゼと内在性抗プロテアーゼ（例えばＴＩＭＰ及びα₁−ＰＩ）とのアンバランスにより少なくとも部分的に生じるとされている。白血球エラスターゼを阻害する主な内在性抗プロテイナーゼは、α₁ −ＰＩである。化学的に修飾したテトラサイクリンを白血球エラスターゼ阻害活性のために使用し得ることを見出した。テトラサイクリンは、疎水性4-デ(ジメチルアミノ)テトラサイクリン、最も好ましくは、6-デメチル-6-デオキシ-4-デ(ジメチルアミノ)テトラサイクリン（ＣＭＴ−３）である。ＨＬＥ阻害は、この酵素により生じる直接組織損傷を低減するばかりでなく、ＴＩＭＰのレベルを維持し、従って、活性状態のＭＭＰの内在性阻害剤を維持する。非抗菌性テトラサイクリンを用いる好中球プロテアーゼの阻害は、効果的な応答が高い危険性を伴わず、なぜなら、これらの化合物は、インビトロでの阻害活性での投与量で使用したときに、細菌感染部位に生じた化学誘引物質に応答して間質を血管外遊出させ侵入させる好中球の能力を弱める傾向にないからである。数種のＣＭＴ、特にはＣＭＴ−３は、実質的な白血球エラスターゼ阻害活性を示すが、ミノサイクリン、ドキシサイクリン及び他の化学的に修飾されたテトラサイクリンは実質的な白血球エラスターゼ阻害活性を示さないことを見出した。種々のテトラサイクリンの活性が、炎症性組織損傷のインビトロでのアッセイを用いて研究されており、その中においては、ヒト好中球が、生合成された完全な間質性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を崩壊させる。好中球は、白血球の１つのタイプ（多形核白血球）である。この実験系での研究により、このＥＣＭの好中球介在崩壊が、ＭＭＰに対する競合性基質及び白血球エラスターゼの潜在的可能性を有する阻害剤であり、α₁−ＰＩの添加により実質的に完全に阻害されることが示される。E.J.Roemer，K.J.Stanton及びS.R.Simonの“In Vitro Assay S ystems for Inflammatory Cell-Mediated Damage to Interstitial Extracellul ar Matrix”，In Vitro Toxicol．7，75-81(1994);E．J．Roemer，K．J．Stanto n及びS．R．Simonの“In Vitro Assay Systems for Cell Interactions With In terstitial Extracellular Matrix”，In Vitro Toxicol．7，209-224(1994)。テトラサイクリンを、例えば３０μＭの投与量でこの系においてＥＣＭ崩壊を阻害するそれらの能力について試験したところ(実施例１)、ＣＭＴ−３は、図１に示すように、好中球介在崩壊からのＥＣＭの保護について他のテトラサイクリンより非常に優れたものであった。このインビトロアッセイを用いる、更なる投与応答研究において、好中球介在ＥＣＭ崩壊の約５０％の阻害が２５〜５０μＭで達成され得る。同一の投与範囲で試験した他のテトラサイクリンのほとんどが、このアッセイを用いる好中球介在ＥＣＭ崩壊の〜２０％より高い阻害が不可能なものであった。ＣＭＴ−３によるＨＬＥの直接阻害を、Yingら（Q．Ying，A．R．Rinehart,S ．R．Simon，and J．C．Cheronis，“Inhibition of Human Leukocyte Elastase by Ursolic Acid:Evidence for a Hydrophobic Binding Site for Pentacyclic Triterpenes”，Biochem．J．277，521-526(1991)）により記載されたヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）活性のアッセイの変更を用いて測定したが(実施例２) 、その中においては、有機溶剤及び洗剤濃度を低減し、染色オリゴペプチド基質、メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリドのアミドリシスの測定によるヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）活性の従来のアッセイを用いた。このオリゴペプチドは、一般に、ＨＬＥにおける拡張基質結合ドメインの最初の５つのサブサイトを占有すると考えられている。Yingら(Biochem．J．277，521-52 6(1991))による他の非ペプチド類エラスターゼ阻害剤について先に記載されたような、同一の方法での割合データを分析するためにディクソン及びコーニッシュ −ボーデンプロットの組み合せを用いることにより、ＣＭＴ−３が、図３Ａ、Ｂ及び図４Ａ、Ｂに示されるような１８〜４０μＭの明らかなＫ_iを有する、メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリドのアミドリシスの主な競合性阻害剤であることが示された。対照的に、２５〜５０μＭでインビトロでＭＭＰ−８活性を阻害し得るドキシサイクリンは、図５におけるディクソンプロットのスロープにより示されるような３００μＭを超えるＫ_iで、非常に弱いＨＬＥ阻害剤である。ＣＭＴ−３を、生存好中球よりむしろ精製ＨＬＥにより介在されるＥＣＭ崩壊のアッセイにおいて使用した場合に、〜２５−５０μＭの明らかなＩ₅₀で、効果的な阻害剤であることが証明される。インビボでのアッセイ（実施例３）から、エンドトキシンの投与により急性歯肉炎が誘発されたラットにＣＭＴ−３を投与することにより、基質スクシニル-A la-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリドでのアミドリシスアッセイ(amidolytic assay )によりアッセイされたように、白血球エラスターゼの活性が低減されることが分かる。本発明により治療可能な条件は、哺乳類被験体におけるものであり得る。ヒトの患者は特に重要な被験体であるが、その方法は、例えば、犬や猫などのペット動物、ラットやマウスなどの実験動物、及び家畜を含む他の哺乳類のために行うことができる。本発明の方法を用いて、過度なヒト白血球エラスターゼ活性から生じた組織ダメージ、例えば、数種の肺疾患及び腎疾患に罹患した被験体を治療することができる。このタイプの肺疾患には、嚢胞性繊維症、気腫、成人呼吸窮迫症候群(複数外傷、手術侵襲、セプシスの合併症として、又は多臓器疾患の１部として)；及び酸性物質、化学物質、工業的及び軍事的毒性物質及び煙及び他の燃焼毒性生成物などの毒性物質(toxycant)の吸入により生じる急性灰損傷が含まれる。このタイプの腎疾患には、糸球体腎炎及び急性腎疾患（複数外傷又はセプシスの合併症として、又は多臓器疾患の１部として）が含まれる。また、その方法を使用して、好中球での真皮−上皮接合の著しい浸潤(infiltr ation)を含み、真皮−上皮接合を分離する病変及び炎症性皮膚疾患を治療することができる。そのような状況は、免疫性起源（自己免疫又は薬剤反応の結果として）を含み、かつ、細菌性毒物質により引き起こされ得る(乳児の“熱傷皮膚” におけるようなもの)。白血球エラスターゼが、これらの状況下で真皮−上皮接合の崩壊に寄与すると考えられている。また、好中球浸潤及び真皮−上皮接合の分離が生じる、化学的発疱薬により引き起こされた数種の病変（工業的及び軍事的暴露を含む）は、白血球エラスターゼを包含し、ＣＭＴ−３療法による対応の候補である。眼の数種の病変は、損傷の１部として好中球浸潤を有し、かつ、抗プロテイナーゼ様ＣＭＴ−３と共に、より効果的に取り扱われ得る。本発明の方法は、過度の白血球エラスターゼ活性に関連する望ましくない結果を低減又は阻害するのに効果的な量でテトラサイクリン化合物を投与することを包含する。好ましいテトラサイクリン化合物は、その抗菌特性を低減させる又は排除するために化学的に修飾されたものである。そのような化学的に修飾されたテトラサイクリンは、該化合物の抗菌量での使用を伴うのが頻繁である有益細菌の無差別殺傷などの数種の不利な点を避けながら、抗菌性テトラサイクリンより高濃度で使用することができる。このための最大投与量は、不本意な及び過度の副作用を引き起こさない最大投与量である。例えば、テトラサイクリン化合物は、約０．１〜約２４ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約２〜約１８ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与することができる。本発明では、副作用には、臨床的に有意な抗菌活性及び毒作用が含まれる。例えば、約５０ｍｇ／ｋｇ／日を超える投与量により、ヒトを含むほとんどの哺乳類で副作用が生じるであろう。いずれにせよ、現場の者は、当該技術分野における技術及び知識により導かれ、本発明には、上記現象を達成するのに効果的な、制限ない投与が含まれる。本発明の方法において使用するための好ましい医薬組成物は、当該技術分野における当業者により認識されているような適切な医薬ビヒクル中におけるテトラサイクリン化合物の組み合わせを含む。上記医薬目的のために、本発明のテトラサイクリンそれ自体を、公知の薬学的に許容可能なアジュバント又はキャリヤーを含んでいてもよい医薬製剤中に配合することができる。これらの製剤は、従来の化学的方法により調製することができ、かつ、例えばタブレット又は液体により経口的に、又は座薬により；例えば、注入可能な液体又は懸濁液として静脈内、筋内又は皮下などの非経口的に；典型的には、肺又は気道への吸入のための呼吸可能な範囲内の液滴のエアロゾル又はスプレーの形態で、内部的に投与することができる。そのようなエアロゾルは、更なる治療効果に寄与し得る肺表面活性物質製剤などのビヒクルを含んでいてもよい。持効性又は制御放出性投与を使用することができる。医薬品又は化粧品は、セリンプロテアーゼ阻害の、特には白血球エラスターゼ阻害に有効量のテトラサイクリンを含む。他の実施態様においては、テトラサイクリンを、化粧法のための皮膚クリーム及びローション、化粧マスク、化粧ラップ、化粧ドレッシング及びシャンプーなどの化粧品中の薬剤として使用することができる。化粧という用語は、身体的風貌の向上又は改善を意図するものであると理解すべきである。局所的な又は化粧用途のために、適切な配合物に含まれ得るものは、リポソーム、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏(ointment)、パウダー、リニメント剤、軟膏(salve)、エアロゾルなどであるが、これらに限定される訳ではなく、また、該配合物は、所望なら、無菌化され、かつ／又は、保存剤、安定化剤、湿潤剤、バッファー又は浸透圧を変更するための塩などの補助剤と共に混合される。具体的ケースにおける活性化合物の実際に好ましい量は、配合する具体的組成物、用途の態様、治療する具体的部位及び被験体に従って変化するであろう。投与量は、例えば、適切な従来の薬学的又は化粧学的プロトコールによる、公知の薬剤及び配合物の異なる活性を従来どおりに比較することにより決定されるであろう。化粧品用途のために、多くの更なる生体適合的又は生物学的挿入材料をテトラサイクリンと共に導入することができる。生体適合的とは、ヒト及びヒトでない動物の組織に対して無毒性であるか又はダメージを与えないことを意味する。これらの更なる材料としては、例えば、以下のものが挙げられる：湿潤剤、即ち、グリセリン、プロピレングリコール又はイソプロパノールプロピレングリコールなどの水との親和力を有する物質、第四アンモニウム化合物及び亜鉛塩などの有機又は無機塩、ベンジルアルコール又は低級脂肪族アルコールなどのアルコール、ポリマーラテックス、シリカ及びタルクなどの充填剤、鉱油、ヒマシ油及びワセリンなどのオイル、エチレンオキシド及びプロビレンオキシドのブロック共重合体などの湿潤又は分散剤又は界面活性剤、染料、フラグランス、顔料、酸化亜鉛、二酸化チタン、メチルサリチレート、ニコチネート、カプサイチン及びメタノールなどの局所用薬物、ベンゾイルペロキシド、レゾルシノール及びレチン酸などの抗アクネ薬物、スルファジアジン銀、他のテトラサイクリン及びセファゾリンなどの局所用抗菌物質、ピロリジンカルボン酸ナトリウムなどの皮膚水補給剤、並びにｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）又は２−エチルヘキシル４−Ｎ，Ｎ −ジメチルアミノベンゾエート（パジメートＯ）などのＵＶ−Ａ及びＵＶ−Ｂ吸収日焼け止め剤。支持体を用いてガス又は液体バリヤなどでの強化を図ることができ、かつ、治療領域の保護を図ることができる。支持体は、実質的に制限されず、かつ、ポリマーフィルム、金属箔、セルロース系物質及び他の天然又は合成材料を含む。以下の実施例は、本発明の更なる理解を助けるために記載するものであって、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。実施例１テトラサイクリンのセリンプロテイナーゼ阻害活性を、炎症性組織損傷のインビトロでのアッセイを用いて試験したが、その中においては、ヒト好中球（生存ＰＭＮ）は、Roemerら(E．J．Roemer，K．J．Stanton，and S．R．Simon，“In Vitro Assay Systems for Inflammatory Cell-Mediated Damage to Interstitia l Extracellular Matrix”，In Vitro Toxicol．7，75-81(1994);E．J．Roemer ，K．J．Stanton，and S．R．Simon，“In Vitro Assay Systems for Cell Inte ractions With Interstitial Extracellular Matrix”，In Vitro Toxicol．7， 209-224(1994))に記載されたように、培養R22ラット心臓平滑筋細胞により産生された、生合成された完全間質性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を崩壊させた。ＣＭＴ−１からＣＭＴ−１０及びドキシサイクリンと称される１０種の異なる、化学的に改質されたテトラサイクリン（ＣＭＴ）を、ハンクス液（ＨＢＳＳ）中の２×１０⁶の生存ヒトＰＭＮ／ｍＬ懸濁液と同時にＥＣＭに添加した。これらの研究において、ＥＣＭを、３Ｈプロリンで代謝的に放射標識し、６時間のインキュベーション後に可溶化した数値を測定し、ＰＭＮのみでインキュベートした後に放出された数値と比較した。５μｍ、２５μｍ及び５０μｍの濃度の結果を表１に記載し、３０μｍの結果を図１に記載する。表１ PMN(+0.5nM PMA)-介在R22-ECM加水分解についてのCHTの作用 (37℃で６時間に放出された3H-Pro cpm) 注：ＥＣＭ加水分解は、％コントロールとして表され、その中において、コントロールは１００％に規定された阻害剤の存在しない加水分解である。表１及び図１により、ＣＭＴ−３が好中球介在ＥＣＭ崩壊の有意な阻害（≧２５〜３０μＭの濃度での〜５０％阻害）を達成可能であり、このアッセイにおいて使用した全ての投与量でＥＣＭ崩壊が良好に阻害されたことが示される。ＣＭＴ−８及びＣＭＴ−１０、特にＣＭＴ−８は、数種の濃度で、ＥＣＭ崩壊のある程度の阻害を示した。図２は、上述したものと同一の記載を用いた、２×１０⁶ＰＭＮ／ｍＬ又は１０μＭ精製ＨＬＥのいずれかにより介在されたＥＣＭ崩壊のパラレルアッセイにおける、２５μＭＣＭＴ−３（ＣＯＬ−３）の阻害効力の比較を示す。実施例２ヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）のアミド化活性(amidolytic activity)におけるテトラサイクリンの直接阻害作用を、YingらのBiochem.J.277,521-526(19 91)に記載された方法により評価したが、そこでは、ＤＭＳＯ濃度を２％に低減させ、洗剤トリトンＸ−１００を使用しなかった。アミド化アッセイにおいて使用した９６−ウエルマイクロプレートのウエル上へのＨＬＥの時間依存性吸着を避けるために、該プレートを０．２％牛血清アルブミン溶液で前処理した。１００〜３００μＭの濃度範囲の色素オリゴペプチド基質メトキシスクシニル-Ala-A la-Pro-Val-p-ニトロアニリドを全測定において使用した；この基質は、Ｘ線結晶分析ベースにおいてＨＬＥの基質結合サブサイトＳ₁〜Ｓ₅を構成するとされている(W.Bode,E.Meyer,and J.C.Powers,“Human Leukocyte and Porcine Pancrea tic Elastase:X-Ray Crystal Structures，Mechanism， Substrate Specificity ，and Hechanism-Based Inhibitors”，Biochemistry 28，1951-1963(1989))。アミド化活性の阻害を、Yingらにおけるように、ディクソン(M.Dixon，Biochem ．J.55，170-171(1953))及びコーニッシュ−ボーデン（A．Cornish-Bowden，Bio chem．J．137，143-144(1974)）のグラフ法により分析した：Ｘ軸上のポイントでの異なる基質濃度で得られたディクソンプロットの交差は、純粋な非競合阻害のメカニズムを除外するが、異なる基質濃度で得られたパラレルのコーニッシュ−ボーデンプロットは、純粋な競合阻害に関連するものである。ディクソンプロットが交差する基質濃度は、阻害剤のＫ_iの測定値である。ＣＭＴ −３（ＣＯＬ−３）によるＨＬＥの阻害についての典型的なディクソン及びコーニッシュ−ボーデンプロットを、図３Ａ、Ｂ及び４Ａ、Ｂに記載する。これらのデータから、ＣＭＴ−３によるＨＬＥのアミド化活性の阻害についてのＫ_iが、２５〜４０μＭであると推定され得る。１０％ジメチルスルホキシド及び０.１％トリトンＸ−１００の存在下において、ＣＭＴ−３の阻害効力が顕著に低減され、疎水性相互作用がＣＭＴ−３のＨＬＥへの結合を安定化させるのに寄与するという結論が支持される。また、ＨＬＥによるメトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-p-ニトロアニリドのアミドリシスに対するドキシサイクリンの阻害活性を、ＣＭＴ−３について上述したように、２％ＤＭＳＯの存在下で洗剤の不存在下で測定した。ドキシサイクリンによるＨＬＥのアミド化活性の阻害についてのディクソンプロットのスロープの分析により、図５に示されたように、３００μＭ周辺の、非常に高いＫ_i 値が示される。ＨＬＥのアミド化活性の阻害剤としての効力が非常に低いか全くない他のテトラサイクリン誘導体は、オキシテトラサイクリン及びその４−エピマー、エピ−オキシテトラサイクリン；クロロテトラサイクリン及びその４−エピマー、エピ−クロロテトラサイクリン；アンヒドロクロロテトラサイクリン；及びＣＭＴ−５、４つの縮合環のベースでのオキソ及びヒドロキシ成分がピラゾール環により置換されている、化学的に修飾されたテトラサイクリンであった。それは、テトラサイクリンの縮合環系の６−及び４−位のいずれかに置換基を欠くものであるため、ＣＭＴ−３は、予期せぬことに、試験した他のテトラサイクリンより、一層高いＨＬＥ結合性で結合可能であると考えられている。ＣＭＴ−３のＨＬＥ阻害能力は、図２に示したように、アミド化アッセイにとらわれず、その中においては、精製ＨＬＥによる完全な間質性細胞外マトリックスの崩壊がＣＭＴ−３により阻害されている。ＨＬＥによるマトリックス崩壊の阻害のこのアッセイにおけるＣＭＴ−３の阻害活性効力は、ＨＬＥアミド化活性のアッセイで測定されたものに匹敵するものであり、両タイプのアッセイにおける阻害のメカニズムが、ペプチド又はタンパク基質のいずれかの結合を防ぐ方法においてＣＭＴ−３の酵素への結合を包含するという解釈と一致する。ＥＣＭのＨＬＥ−介在崩壊のアッセイにおいて、試験した他のテトラサイクリンは、ＣＭＴ−３を用いて試験した投与量に匹敵する投与量で効果的でなかった。実施例３急性炎症及び好中球浸潤の動物モデルにおけるインビボでの白血球エラスターゼ活性を低減するという、経口的に投与されたＣＭＴ−３（ＣＯＬ−３）の能力を、Changら（K．M．Chang，M．E．Ryan，L．M．Golub，N，S．Ramamurthy，and T．F．McNamara，“Local and Systemic Factors in Periodontal Disease Inc rease Matrix-Degrading Enzyme Activities in Rat Gingiva:Effect of Minocy cline Therapy”，Res．Comm．Mol．Path．Pharm．91，303-318(1996)）により記載されたと同様の実験プロトコールを用いて確認した。ラットの上顎及び下顎の唇側歯肉に、０．０１ｍｇのＥ．ｃｏｌｉリポ多糖類（ＬＰＳ）又は１０μｌ容量の生理食塩水のビヒクルを、１日おきに６日間注入した。また、２セットのラットには、１ｍｌ容量で１日あたり２ｍｇ又は５ｍｇのＣＭＴ−３を経口胃管栄養法により６日間投与したが、他のセットのラットには、２％カルボキシメチルセルロースのビヒクルのみを投与した。６日間の処理期間の最後に、動物を犠牲にし、その歯肉組織を解剖した。各実験群からの組織を、集め、凍結し、解凍し、Yuら（Z．Yu,N．S．Ramamurthy,M.Leung,K．H．Chang，T．F．McNamara,and L．M．Golub,“Chemically Modified Tetracycline Normalizes Collagen Meta bolism in Diabetic Rats”，J．Periodont．Res．28，420-428(1993)）の手順に従った酵素活性のアッセイのために抽出した。白血球エラスターゼ活性を、Ra mamurthy及びGolub(1983)(N．S．Ramamurthy，and L．M．Golub，“Diabetes In creases Collagenase Activity in Extracts of Rat Gingiva and Skin”,J.Per iodont.Res．18，23-30(1983))の手順に従って、基質スクシニル-Ala-Ala-Pro-V al-p-ニトロアニリドを用いてアッセイした。本件明細書において報告するのは、ＬＰＳ−注入ラットの歯肉抽出物における白血球エラスターゼ活性のレベルを低減するという、経口的に投与されたＣＭＴ−３の能力である。図６により、ＬＰＳ−注入及びビヒクルのみの胃管栄養法又は生理食塩水注入のラットからの歯肉抽出物におけるエラスターゼ活性と比較して、ＣＭＴ−３の両投与量で処理したＬＰＳ− 注入ラットの歯肉抽出物における白血球エラスターゼ活性のレベルが低減されることが説明される。ＣＭＴ−３の投与により、ＬＰＳ−注入されたラットの歯肉抽出物におけるエラスターゼ活性のレベルが低減されて、生理食塩水のみの歯肉注入をしたラットにおいて検出されるレベルとなると思われる。この結果は、インビボでのＣＭＴ−３投与により、好中球浸潤による局所的な急性炎症の部位での白血球エラスターゼレベルが低減され得ることを説明するものである。以上には、本発明の好ましい実施態様を記載したが、当該技術分野における当業者は、本発明の精神を逸脱することなく本発明に変更を加えることができると理解するであろうし、また、本件請求の範囲に記載の範囲内の全ての変更が可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ローマーエリザベスジェイアメリカ合衆国ニューヨーク州 11777 ポートジェファーソンパインヒルロード 25 (72)発明者ゴーラブローンエムアメリカ合衆国ニューヨーク州 11787 スミスタウンウィットニーゲート 29 (72)発明者ラママーティーヌンガヴァラムエスアメリカ合衆国ニューヨーク州 11787 スミスタウンライナムコート 10

Claims

【特許請求の範囲】１．生体系において過度の白血球エラスターゼ活性を阻害する方法であって、過度の白血球エラスターゼ活性に感受性の生体系に対し、白血球エラスターゼ活性阻害量の疎水性テトラサイクリンを投与することを含む該方法。２．テトラサイクリンが４−デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリンである請求項１記載の方法。３．生体系が哺乳類である請求項１記載の方法。４．テトラサイクリンが、６−デメチル−６−デオキシ−４−デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン、６−デオキシ−５α−ヒドロキシ−４−デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン、４−デ（ジメチルアミノ）ミノサイクリン、及びそれらの組み合せを含む請求項１記載の方法。５．テトラサイクリンが６−デメチル−６−デオキシ−４−デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリンを含む請求項１記載の方法。６．テトラサイクリンが、更に、化粧品を含む請求項１記載の方法。７．テトラサイクリンが、更に、医薬製剤を含む請求項１記載の方法。８．過度の白血球エラスターゼ活性により生じた組織ダメージに罹患した被験体を治療する方法であって、該被験体に対し、白血球エラスターゼ阻害量の疎水性テトラサイクリンを投与することを含む該方法。９．テトラサイクリンが４−デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリンである請求項８記載の方法。 10．被験体が哺乳類である請求項８記載の方法。 11．テトラサイクリンが、６−デメチル−６−デオキシ−４−デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン、６−デオキシ−５α−ヒドロキシ−４−デ（ジメチルアミノ）テトラサイクリン、４−デ（ジメチルアミノ）ミノサイクリン、及びそれらの組み合せを含む請求項８記載の方法。 12．テトラサイクリンが６−デメチル−６−デオキシ−４−デ(ジメチルアミノ) テトラサイクリンを含む請求項８記載の方法。 13．過度の白血球エラスターゼ活性により生じた組織ダメージが肺疾患である請求項８記載の方法。 14．肺疾患が、嚢胞性繊維症、気腫、成人呼吸窮迫症候群、又は毒性物質の吸入により生じる急性灰損傷である請求項１３記載の方法。 15．呼吸窮迫症候群が、複数外傷、手術侵襲、セプシスの合併症として、又は多臓器疾患の１部としてのものである請求項１４記載の方法。 16．毒性物質が、酸性物質、化学物質、工業的及び軍事的毒性物質及び煙及び他の燃焼毒性生成物である請求項１４記載の方法。 17．過度の白血球エラスターゼ活性による組織ダメージが、腎疾患である請求項８記載の方法。 18．腎疾患が、糸球体腎炎、複数外傷又はセプシスの合併症としての急性腎不全、又は多臓器疾患の１部としての急性腎不全である請求項１７記載の方法。