JP2001522241A - Diagnostic methods and reagents - Google Patents

Diagnostic methods and reagents

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レーウウェン，フレデリク ウェー． ファン
ヘー． フロスフェルト，フランクリン
ペーテル ヘンリ ビュルバフ，ヨハネス
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ロイヤル ネザーランズ アカデミー オブ アーツ アンド サイエンシズ
エラスムス ユニバーシテイ ロッテルダム
ユニバーシテイ オブ ユトレヒト
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Abstract

(57)【要約】 本発明はフレームシフト突然変異を起こす転写変異含有ＲＮＡ分子を原因とする、あるいはそれに関連する疾患の診断もしくは治療の方法および試薬に関する。該診断方法は患者から体液もしくは組織サンプルを採取し、該サンプルにつきフレームシフト突然変異を有するＲＮＡ分子またはそれによってエンコードされたタンパク質が存在するか否か分析する工程からなり、そこでの突然変異ＲＮＡ分子またはエンコードされたタンパク質の存在は疾病の兆候となる。治療処置は突然変異ＲＮＡ分子を細胞から選択的に除去する物質を投与することからなる。   (57) [Summary] The present invention relates to a method and a reagent for diagnosing or treating a disease caused by or associated with a transcription mutation-containing RNA molecule causing a frameshift mutation. The diagnostic method comprises the steps of taking a body fluid or tissue sample from the patient and analyzing the sample for the presence of an RNA molecule having a frameshift mutation or a protein encoded thereby, wherein the mutated RNA molecule is present. Or the presence of the encoded protein is indicative of disease. Therapeutic treatment consists in administering a substance that selectively removes the mutant RNA molecule from the cells.

Description

【発明の詳細な説明】 診断方法および試薬 発明の背景 本発明はＲＮＡ分子内でのフレームシフト突然変異を起こす転写変異を原因と する、あるいはそれに関連する疾患の診断方法および試薬に関する。該診断方法 は患者から体液もしくは組織サンプルを採取し、該サンプルにつきフレームシフ ト突然変異を有するＲＮＡ分子またはそれによってエンコードされたタンパク質 が存在するか否か分析する工程からなり、そこでの突然変異ＲＮＡ分子またはエ ンコードされたタンパク質の存在は疾病の兆候となる。 本発明の目的は転写突然変異の関与する疾患、特に加齢に関係する疾患の検出 方法およびアッセイ法および/または治療法を提供することにあり、該疾患の罹 患可能性は患者の加齢とともに増大する。本発明は細胞のＲＮＡ分子に起こる突 然変異が原因の加齢関連疾患の検出および/または治療を意図するものである。 該突然変異が訂正されない場合、当該疾患に至る。 本発明のさらなる目的は、本発明により同定された疾患を治療するために、当 該疾患に悩む患者あるいは当該疾患に罹り易い患者に酵素またはオリゴヌクレオ チドなどの矯正薬を提供することである。 さらに本発明のさらなる目的は、該疾患とヌクレオチド配列の突然変異ホット スポットとを関連付けることにより加齢関連疾患を同定する方法を提供すること である。 本発明の他の目的は以下の加齢関連疾患の同定、検出および治療に関する：癌 （とりわけ、非遺伝性癌）および神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病（Ａ Ｄ）、ダウン症、前頭葉性痴呆（ピック病）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）および 多発タウ陽性糸状病変を伴う他の疾患（例えば、皮質基底変性、ボクサー痴呆、 繊維濃縮体のみの痴呆、繊維濃縮体および石灰化を伴う痴呆、染色体１７にリン クするパーキンソン病を伴う前頭側頭痴呆、繊維濃縮体をもつゲルストマン・シ ュトロイスラー・シャインカ病、筋緊張性異栄養症、ニーマン・ピック病タイプ Ｃ，グアムのパーキンソン痴呆複合症、脳炎後遺症性パーキンソン病、および亜 急性硬化性全脳炎）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症、ハンチン トン病、多発性硬化症、レーヴィ小体をもつ痴呆、多系統萎縮症、ユビキチンと 関連する他の封入体疾患（例えば、アレキサンダー病、アルコール性肝疾患、苔 癬アミロイドーシス、および加齢のマリネスコ体と硝子質封入体）、II型糖尿病 、および他の変性疾患、例えば、心臓血管疾患とリューマチ性関節炎。有効な治 療のためには早期疾患の診断が重要である。 アルツハイマー病は多くの場合加齢に関係する疾患である。ＡＤは大脳皮質、 皮質下部領域および海馬での神経細胞の萎縮、およびプラーク、異栄養軸索、神 経網糸および神経原繊維濃縮体の存在により特徴づけられる。殆どの場合、ＡＤ が遺伝子の異常によるのか、あるいは環境因子によるのか、またはその両方なの かは解っていない。病原となる突然変異は未知である。 本発明のさらなる目的は生存患者におけるＡＤの決定的診断を可能とするＡＤ 診断試験法を提供することである。さらに、ＡＤは進行性の疾患であるため、防 御措置が計れるようできるだけ早い時期にＡＤを診断することが望ましい。 多数の診断法がＡＤ診断のためにこれまで提案されているが、その殆どはβ− アミロイド前駆体タンパク質に焦点を絞ったものである。例えば、米国特許４， ６６６，８２９、４，８１６，４１６、および４，９３３，１５９を参照された い。しかし、β−アミロイド沈着物は痴呆の徴候を示していない個体、とりわけ 加齢者にも見出されている（J．Biol．Chem．、２６５、１５９７７頁、１９９ ０、および表３〜５参照）。従って、β−アミロイドタンパク質に基づく診断試 験法はＡＤに対する特異性を欠いている。 米国特許４，７２７，０４１では、Ｌ−dopa投与前駆活性試験に続くソマトト ロビンとソマトメジン−Cの血清中レベル測定に基づくＡＤの診断試験法を記載 している。 国際特許出願WO ９４/０２８５１では、対となったらせん状フィラメントに親 和性をもつ抗体を用い、脳脊髄液中の対となったらせん状フィラメントのレベル を定量するために、ＡＤを同定する方法を記載している。対となったらせん状フ ィラメントの存在はＡＤの兆候であると主張している。 その他の診断方法は脳脊髄液中の「疾患特異マーカータンパク質」の同定に基 づいている。国際特許出願WO ９５／０５６０４では、例えば、5種類の疾患特異 タンパク質をその分子量により同定している。しかし、そのタンパク質の特異的 本性は未知であり、ＡＤ病因との特定の関連性も未知である。従って、５種類の 「疾患特異マーカータンパク質」は、もっと基本的な細胞性もしくは生化学的変 化の結果として存在するのかも知れない。 本発明のさらなる目的は、好ましくは疾患状態の早期にＡＤを検出し得る方法 を提供することである。望ましいのは、直接当該疾患の原因となっている、ある いは疾患の発生機序に早期に関わっている、あるいは関わっていないとしても、 それにも拘わらず該疾患の原因となる機序により、直接または間接的に産生され るタンパク質または物質を検出することである。かかるタンパク質または物質は 該疾患の「原因」作因物質であり、病状の診断という意味では病状と「関係して いる」と言える。 最近、シャーリントン（Sherrington）ら（Nature、３７５、２５４〜２６０ 頁、１９９５）はミスセンス突然変異をもつ遺伝子を染色体１４上に同定したが 、その変異は常染色体優性早期発病ＡＤ例の３３％にまで関連している（表１） 。ミスセンス突然変異はヌクレオチドの置換を意味し、通常は単一ヌクレオチド の置換であって、それにより対応するコドンでのアミノ酸置換に至る。シャーリ ントンらが開示しているミスセンス突然変異は以下の位置でのエンコードされた アミノ酸が変化することを予言する：（最初の推定開始コドンから番号を付す） コドン１４６のMetからLeu；コドン１６３のHisからArg；コドン２４６のAlaか らGlu；コドン２８６のLeuからVal；コドン４１０のCysからTyr。これらの突然 変異は早期発病ＡＤを同定するのに有用であろうと提案されている。上述のよう に、ＡＤ症例の大半が後期発病（６５歳以降；表１）であり、従って、ＡＤに罹 患した個体の大半、特に後期発病ＡＤを同定するにはなお問題がある。 これらの疾患がＲＮＡレベルで起こり、ＤＮＡレベルで起こるのではないとい う証拠はない。従って、先行技術の検出法は、変異したＤＮＡまたは変異したＤ ＮＡによりエンコードされたタンパク質に対してのものであり、ＲＮＡ分子の転 写突然変異の存在を示すものではない。 現在、ＡＤの治療に有用であると主張する物質は数多くある。しかし、これら の物質で達成した成功も非常に限られたものである。ＡＤを効果的に治療および ／または防止する方法はなお必要とされる（アレンおよびバーンズ（Allen and Burns）、Journal of Psychopharmacology、９、４３〜５６頁、１９９５、参照 ）。 発明の要約 本発明はフレームシフト突然変異を含み、対応する突然変異タンパク質をエン コードするＲＮＡ分子が疾患の存在と相関するという観察に基づいている。 本発明に従えば、フレームシフト突然変異を起こす１またはそれ以上の突然変 異を有するＲＮＡ分子が原因となる、あるいはそれと関連する疾患の診断方法が 提供されるものであって、該方法は（イ）患者から体液もしくは組織サンプルな どの生体サンプルを採取し、（ロ）該サンプルにつきフレームシフト突然変異を 有するＲＮＡ分子またはそれによってエンコードされた突然変異タンパク質が存 在するか否か分析することを含み、そこでの突然変異されたＲＮＡ分子または突 然変異タンパク質の存在を疾病の兆候とするものである。 「突然変異」タンパク質とは突然変異ｍＲＮＡによりエンコードされたポリペ プチドであって、少なくともその一部は、当初の開始コドンに関して本来のまた は野生型の読み枠のものからずれている読み枠内にあり、結果、野生型遺伝子配 列の＋１または＋２読み枠によりエンコードされた異常カルボキシ末端部分をも つタンパク質を含むこととなる。このように、突然変異タンパク質はハイブリッ ドの野生型/ナンセンス・タンパク質を包含し、該タンパク質はその有するアミ ノ末端アミノ酸配列が野生型（Ｏ）読み枠によりエンコードされ、かつ、カルボ キシ末端アミノ酸配列が＋１または＋２読み枠によりエンコードされていて、そ れが突然変異タンパク質のナンセンス部分となっている。野生型とナンセンスア ミノ酸配列間の重なり点がフレームシフト突然変異を含むコドンである。 本発明は罹患した個体からの組織中にかかる突然変異タンパク質が存在すると いう、あるいは１以上の突然変異タンパク質が蓄積しているという発見、また、 当該突然変異タンパク質が該疾患の兆候として同定されるという発見に基づいて いる。また、本発明は突然変異タンパク質を生じる突然変異がＲＮＡレベルで起 こり、ＤＮＡレベルで起こるのではないという発見にも基づいている。 「原因となる、あるいはそれと関連する」とは、ＲＮＡ分子が疾患に対しての 全部の原因あるいは一部の原因であるか、あるいはＲＮＡ分子が疾患の原因では ないが、病状を診断するという意味で病状と関連するという意味で用いる。 フレームシフト突然変異を起こす１またはそれ以上の突然変異を有する少なく とも１つのＲＮＡ分子が原因となる、あるいはそれと関連する疾患とは以下の疾 患である：非遺伝性癌、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）；ダ ウン症候群；前頭葉性痴呆（ピック病）；進行性核上麻痺（ＰＳＰ）および多発 タウ陽性糸状病変を伴う他の疾患、例えば、皮質基底変性、ボクサー痴呆、繊維 濃縮体のみの痴呆、繊維濃縮体および石灰化を伴う痴呆、染色体１７にリンクす るパーキンソン病を伴う前頭側頭痴呆、繊維濃縮体をもつゲルストマン・シュト ロイスラー・シャインカ病、筋緊張性異栄養症、ニーマン・ピック病タイプＣ、 グアムのパーキンソン痴呆複合症、脳炎後遺症性パーキンソン病、および亜急性 硬化性全脳炎；パーキンソン病（ＰＤ）筋萎縮性側索硬化症；ハンチントン病； 多発性硬化症；レーヴィ小体をもつ痴呆、多系統萎縮症およびユビキチンと関連 する他の封入体疾患、例えば、アレキサンダー病、アルコール性肝疾患、苔癬ア ミロイドーシス、および加齢のマリネスコ体と硝子質封入体；および他の変性疾 患、例えば、心臓血管疾患、リューマチ性関節炎およびII型糖尿病。本発明によ り治療し得る癌は、これらに限られるものではないが、ホジキン病、急性および 慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、および胃癌、または 膀胱癌である。 フレームシフト突然変異に導く転写突然変異を有するＲＮＡは、本明細書では 「突然変異ＲＮＡ」と称するが、フレームシフト突然変異に導く少なくとも１つ の転写突然変異を有するＲＮＡ分子である。該ＲＮＡ分子は一次転写体およびメ ッセンジャ−ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むＲＮＡ分子である。 用語「転写突然変異」とはＲＮＡレベルでは起こるが、ＤＮＡからＲＮＡが転 写される際のＤＮＡには起こらない突然変異をいう。転写突然変異を同定するた めには、ＲＮＡとＲＮＡが転写されるＤＮＡとを比較しなければならない。 「フレームシフト突然変異」とは1個以上のヌクレオチドをオープンリーディ ングフレーム内で欠失または挿入することを言い、例えば、単一のヌクレオチド またはジヌクレオチドの欠失または挿入であって、それによってコーディング領 域の読み枠がヌクレオチド1個分または2個分シフトする。フレームシフト突然変 異は、好ましくは1個のヌクレオチドもしくはジヌクレオチドが欠失して＋１ま たは＋２のフレームシフト突然変異に導くことである。しかし、もしフレームシ フト突然変異が結果として生じるならば、ヌクレオチド欠失は多数起こり得る。 また、1個以上のヌクレオチドの挿入がフレームシフトを生じ、かかる突然変異 もまた本発明の一部を形成する。 フレームシフトを生じる他の遺伝子修飾も本発明の一部を形成する。例えば、 ヌクレオチド配列の変化が異なる位置からの翻訳開始に導く、あるいはコーディ ング領域外の突然変異、例えば、イントロン内（もしＲＮＡ分子が一次転写物で あるならば）、または５'もしくは３'非翻訳領域の突然変異が誤翻訳および突然 変異タンパク質の産生に至る。 突然変異はヌクレオチド、より好ましくはジヌクレオチドの欠失もしくは挿入 がＲＮＡ分子のヌクレオチド配列ＧＡＧＡまたはその相補配列ＣＴＣＴと関連し ており、とりわけ好ましいフレームシフト突然変異は、ＲＮＡのヌクレオチド配 列がＧＡＧＡＸまたはＣＴＣＴＸ（ただし、ＸはＧ、Ａ、ＵまたはＣのうちの１ つ）からなるものと会合している変異であり、好ましいモチーフはＧＡＧＡＧ、 ＧＡＧＡＣ、ＧＡＧＡＴおよびＧＡＧＡＡならびにＣＴＣＴＣ、ＣＴＣＴＧ、Ｃ ＴＣＴＡおよびＣＴＣＴＴである。本明細書で使用する用語「ＧＡＧＡ突然変異 」は、ＧＡＧＡまたはＣＴＣＴモチーフそれ自体内、またはＧＡＧＡまたはＣＴ ＣＴモチーフそれ自体に隣接した（５−もしくは３'一末端であって、５〜１０ ヌクレオチド内）の単一のヌクレオチドの挿入もしくは欠失またはジヌクレオチ ドの挿入もしくは欠失をいう。 好適には、ジヌクレオチドの欠失はＧＡＧＡモチーフ内のＧＡ欠失、またはＧ ＡＧＡモチーフ直後のＧＴ欠失（すなわち、３'の１０ヌクレオチド内）、およ びＣＴＣＴモチーフのＣＴ欠失である。さらに好適なのは、突然変異RNAが１個 または２個のジヌクレオチド欠失を有し、それがＧＡＧＡ、ＧＡＧＡＣ、ＧＡＧ ＡＧ、ＧＡＧＡＴまたはＧＡＧＡＡと、あるいはＣＴＣＴ、ＣＴＣＴＧ、ＣＴＣ Ｔ Ｃ、ＣＴＣＴＡまたはＣＴＣＴＴと会合して、それぞれ＋１または＋２フレーム シフト突然変異に導くものである。 本発明の好適な態様において、転写突然変異は神経細胞系のＲＮＡ分子に起こ り、その場合の病気が神経変性疾患である。 「神経細胞系」とは、すべての細胞、ＲＮＡ分子、タンパク質、または、ニュ ーロン、グリア細胞、タンパク質およびタンパク質をエンコードするＲＮＡ分子 などの神経細胞系に関係する、もしくはその一部を形成する物質と定義され、該 タンパク質とは、タウ（Tau）、βアミロイド前駆体タンパク質、ユビキチンB、 アポリポタンパク質Ｅ４、神経細糸タンパク質および微小管会合タンパク質ILプ レセニリンI、プレセニリンII、ビッグタウ、グリア原繊維酸性タンパク質（Ｇ ＦＡＰ）、ヒトＰ５３細胞性腫瘍抗原、ヒトＢ細胞白血病/リンパ腫２（ＢＣＬ −２）プロトオンコジーン、セマホリン、酵母アップフレームシフトタンパク質 Ｉのヒト同族体（ＨＵＰＦ−Ｉ）、ヒト能動性群タンパク質（ＨＭＧ）、ニュー ロン特異タンパク質Ａ（ＮＳＰ−Ａ）を含む。 該疾患が神経変性疾患、特にＡＤであるとき、本発明の好ましい突然変異ＲＮ Ａ分子は、βアミロイド前駆体タンパク質、タウタンパク質、ユビキチン、アポ リポタンパク質Ｅ４（Ａｐｏ−Ｅ4）、微小管結合タンパク質II（ＭＡＰ２）、 神経細糸タンパク質、プレセニリンI、プレセニリンII、ビッグタウ、ＧＦＡＰ 、Ｐ５３、ＢＣＬ２、ＨＵＰＦ−Ｉ、ＨＭＧおよびＮＳＰ−Ａをエンコードする ＲＮＡ分子であり、該RNA分子は、フレームシフト突然変異に導く欠失、挿入ま たは他の修飾を有する。本発明の最も好ましい突然変異ＲＮＡ分子は、フレーム シフト突然変異を有するβアミロイド前駆体タンパク質、ユビキチンＢ、ＭＡＰ ２、神経細糸タンパク質、プレセニリンI、プレセニリンII、ビッグタウ、ＧＦ ＡＰ、Ｐ５３、ＢＣＬ２、およびＨＵＰＦ−ＩをエンコードするＲＮＡ分子であ る。 好ましくは、突然変異が、フレームシフト突然変異に導くＧＡＧＡまたはＧＡ ＧＡＸ配（５'または３'の１０ヌクレオチド内）と会合するＧＡまたはＧＴジヌ クレオチドの欠失、あるいはフレームシフト突然変異に導くＣＴＣＴまたはＣＴ ＣＴＸ配列（５'または３'の１０ヌクレオチド内）と会合するＣＴまたはＣＡジ ヌクレオチドの欠失というものである。 本明細書で用いる用語「突然変異タンパク質」は本発明の突然変異ＲＮＡ分子 によりエンコードされるタンパク質と定義される。 本発明の方法はフレームシフト突然変異を起こす１またはそれ以上の突然変異 を有する少なくとも１つのＲＮＡ分子が原因となる、あるいはそれと関連する疾 患の診断方法であることが好ましい。本発明により診断する好ましい疾患はＡＤ であるが、ただし、染色体１、１４および２１に関連して発見される早期発病Ａ Ｄの場合は例外である。本発明の方法は若年および後期発病ＡＤ、とりわけ、非 家族性または「散在性」後期発病ＡＤ例の診断方法であることがさらに好ましい 。 本明細書で用いる「生体サンプル」とはタンパク質および/または細胞を含む 体液または体組織を言い、そこから核酸およびタンパク質を単離し得るものであ る。好ましい起源は、口腔綿棒採取物、血液、***、上皮または他の組織、乳汁 、尿、脳脊髄液、喀痰、便試料、肺吸引物、喉頭綿棒採取物、生殖器綿棒採取物 および分泌物、直腸綿棒採取物、および鼻咽頭吸引物である。 体液サンプルとは、フレームシフト突然変異を起こし、該疾患の原因となる、 あるいはそれと関連する転写突然変異をもつ細胞を含む体液である。該疾患が神 経変性疾患である場合、体液サンプルは神経細胞系の細胞またはかかる細胞の産 物を含むことが好ましい。該疾患が神経変性疾患である場合、好ましい体液サン プルは脳脊髄液であり、これは腰椎穿刺により入手し得る（ランフェルト（Lann felt）ら、Nature Medicin、１、８２９〜８３２頁、１９９５）。他の好適な体 液は血液（静脈血、動脈血および臍帯血を包含するが、これらに限定されるもの ではない）であるが、血液は簡単に入手可能であって、突然変異ＲＮＡ分子また はエンコードされたタンパク質の存在を分析し得るリンパ球を含む。 組織サンプルとはいずれの組織であっても好いが、好ましくは容易に入手可能 な組織、例えば、皮膚および鼻上皮などである。 突然変異ＲＮＡ分子用にサンプルを分析する場合、好ましくは核酸プローブを 使用する。該核酸プローブは、好ましくはフレームシフト突然変異を起こす突然 変異を含む突然変異ＲＮＡ分子の部分に相補的な配列をもつヌクレオチドプロー ブである。 該プローブはＲＮＡもしくはＲＮＡから逆転写したＤＮＡを検出するのに用い るが、ゲノムＤＮＡは突然変異を含んでいないので、ゲノムＤＮＡを検出するの に用いてはならない。 本発明はさらに、フレームシフト突然変異に導く突然変異を含む突然変異ＲＮ Ａ分子の部分に相補的な配列をもつ核酸プローブを提供する。該プローブはＲＮ Ａ分子の突然変異配列に好ましくは十分に相補的であり、その結果緊縮条件下で 該プローブのみが突然変異配列に結合したままとなり、緊縮条件下、突然変異体 と対応する野生型転写物とを識別し得るものとなる。「緊縮」条件とは、ここで はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド形成条件と定義され、５０％ホルムアミドと０． １ＸＳＳＣに等価のハイブリッド形成バッファーを用い６５℃で実施することが できる（下記およびエバンス（Evans）ら、ＰＮＡＳ（１９９４）９；６０５９ 〜６０６３、６０６０参照）。「緊縮」条件は、好ましくはまたエバンスら（同 上）の記載どおり緊縮洗浄をも包含する。 該プローブはいかなる長さでもよいが、好ましくは５ないし５０ヌクレオチド の長さ、より好ましくは１０ないし３０ヌクレオチドの長さである。例えば、該 プローブは、５、１０、１５、２０、２５、または３０ヌクレオチドの長さであ ってもよい。 好適な態様において、該プローブはヌクレオチドまたはジヌクレオチドの欠失 または挿入を有し、ＧＡＧＡもしくはＧＡＧＡＸに相補的な、またはＣＴＣＴも しくはＣＴＣＴＸに相補的な配列、および野生型ＲＮＡ分子のＧＡＧＡまたはＣ ＴＣＴモチーフをフランキングするヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配 列を含んで成る。もし突然変異RNA配列に相補的な逆転写ＤＮＡがプローブであ るならば、相補的ＤＮＡに存在する対応するＧＡＧＡまたはＣＴＣＴモチーフに 相補的な配列からなるプローブを用いることは、当業者には明らかであろう。 突然変異ＲＮＡ分子の存在を検出する方法は、フレームシフト突然変異を生じ る突然変異の両側の配列に相補的な配列を有するプライマーを使用する、逆転写 酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む。先ず、１個のプライマーを ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写に用い、第２に、下記のように２個のプライマーを 用いてＤＮＡを増幅する。 上記ＲＴ−ＰＣＲ法に用いられるプライマーはそのサイズが、２０ｂｐないし ２〜３ｋｂ、例えば、２０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ ｂｐ、１５００ｂｐ、２０００ｂｐ、または３０００ｂｐと変わり得る。 プライマーは多くの標準的技法、例えば、増幅すべきヌクレオチド領域をフラン キングする配列のクローニング、あるいはホスファーアミダイト法によりプライ マーを合成するなどによって調製することができる。 さらに、本発明は突然変異を含むヌクレオチド領域増幅のための上記定義のＲ Ｔ−ＰＣＲ法に使用するプライマーを提供する。 好ましくは、本発明の突然変異タンパク質用サンプルを分析する際には免疫学 的試験を採用する。免疫学的試験は、好ましくは、本発明の突然変異タンパク質 に特異性を示し、野生型タンパク質には示さない抗体分子の使用を基本とする。 かくして本発明はさらに本発明の突然変異タンパク質に特異性を示し、野生型 タンパク質には示さない抗体分子を提供する。好ましくは、該抗体は突然変異タ ンパク質のカルボキシ末端に特異的なものである。 さらに本発明は神経変性疾患または他の加齢関連疾患の診断法、あるいはこれ らの疾患に罹患し易い人の診断法を提供するものであって、該方法は（イ）患者 から体液もしくは組織サンプルを採取し、（ロ）該サンプルにつきフレームシフ ト突然変異を有する神経細胞系のＲＮＡ分子またはそれによってエンコードされ たタンパク質が存在するか否か分析することを含み、そこでの突然変異されたＲ ＮＡ分子の存在を疾病の兆候とするものである。 好ましくは、神経変性疾患とはＡＤおよびダウン症候群である。 また、本発明は該疾患の防止および/または治療法、該疾患の防止および/また は治療用および診断薬生産用のベクター、該疾患の防止および/または治療用組 成物、本発明に使用する核酸配列、プローブおよび抗体分子、および形質転換動 物に関する。 本発明により期待される治療法は、突然変異転写物を含む細胞に、突然変異転 写物を選択的に除去（すなわち、切断）することの可能なリボザイムを提供し、 それによって転写物を翻訳不能とするものである。 また、該治療法はリボザイムでこのように処理した細胞に、リボザイムにより 実質的に切断し得ない対応する野生型転写物を提供することを含む。野生型転写 物は、ＧＡＧＡもしくはＣＴＣＴ順列を除く突然変異RNA配列に対応し、野生型 タンパク質をエンコードする野生型配列を含んでもよく、また、野生型ＲＮＡを 突然変異RNA配列からさらに識別し、それによってさらにリボザイムの認識およ び切断に関し該配列を識別する第３の塩基（コドン内に）サイレント突然変異を 含んでもよい。 また、本発明により包含される治療法は、突然変異RNAを含む細胞に、該突然 変異RNAに相補的であって、かつ、細胞中で翻訳不能な突然変異RNAと二重らせん を形成し得るＲＮＡまたはＤＮＡを提供することをも包含する。相補的配列は突 然変異RNAの全長であってもよいが、好ましくは、より短い、例えば、１０、２ ０、５０または１００ヌクレオチドの長さのものである。相補的配列はかくして オリゴヌクレオチドの形状で投与しても、あるいはベクターに組入れた発現可能 な配列によりエンコードしてもよいが、該ベクターは細胞に投与する。 従って、本発明はＧＡＧＡもしくはＣＴＣＴ突然変異を有する標的ＲＮＡを選 択的に切断するリボザイムを、製剤学的に許容し得る担体と混合して含んで成る 製剤組成物を包含する。 また、本発明はＧＡＧＡもしくはＣＴＣＴ突然変異を有する標的ＲＮＡとフレ ームシフト突然変異を生じるＧＡＧＡもしくはＣＴＣＴ配列を有するＲＮＡの野 生型類似体とを選択的に切断するリボザイムを、製剤学的に許容し得る担体と混 合して含んで成る製剤組成物をも包含する。 また、本発明はフレームシフト突然変異を生じるＧＡＧＡもしくはＣＴＣＴ配 列を有するＲＮＡの野生型類似体を、製剤学的に許容し得る担体と混合して含ん で成る製剤組成物をも包含する。 また、本発明は該ＲＮＡの野生型類似体が第３塩基サイレント突然変異を有す るヌクレオチド配列を含んで成る製剤組成物をも包含する。 また、本発明はフレームシフト突然変異を生じる１以上のＧＡＧＡもしくはＣ ＴＣＴ突然変異を有するＲＮＡに相補的な配列をもつ一本鎖核酸と製剤学的に許 容し得る担体とを混合して含んで成る製剤組成物をも包含する。 また、本発明は突然変異タンパク質の野生型類似体と製剤学的に許容し得る担 体とを混合して含んで成る製剤組成物をも包含する。 また、本発明はＧＡＧＡもしくはＣＴＣＴ配列を有する標的ＲＮＡを選択的に 切断するリボザイムをエンコードする発現可能な遺伝子を含んで成るベクターを 包含する。 また、本発明はフレームシフト突然変異を生じるＧＡＧＡもしくはＣＴＣＴ突 然変異を有するＲＮＡに相補的な配列をエンコードする発現可能な遺伝子を含ん で成るベクターを包含する。 また、本発明は本明細書記載のベクターを含む宿主細胞を包含する。 また、本発明はフレームシフト突然変異を生じるＧＡＧＡもしくはＣＴＣＴ突 然変異を有するＲＮＡが原因となる、あるいはそれと関連する疾患の治療および /または防止方法であって、当該疾患に罹患した患者または罹患し易い患者に上 記の組成物、ベクターまたは宿主細胞を投与することからなる方法を包含する。 また、本発明は治療においてプロモーターの制御下ＧＡＧＡもしくはＣＴＣＴ 突然変異を有する標的ＲＮＡを選択的に切断するリボザイムをエンコードするベ クターの使用を包含する。 また、本発明はフレームシフト突然変異を生じる１以上のＧＡＧＡもしくはＣ ＴＣＴ突然変異を有する少なくとも１つのＲＮＡが原因となる、あるいはそれと 関連する疾患の治療のための組成物製造に際し、プロモーターの制御下にリボザ イムをエンコードするベクターの使用を包含する。 また、本発明は治療においてプロモーターの制御下フレームシフト突然変異を 生じる１以上のＧＡＧＡもしくはＣＴＣＴ突然変異を有するＲＮＡに相補的な配 列をエンコードするベクターの使用を包含する。 また、本発明は治療において任意の組合わせで、上記の組成物、ベクター、ま たは宿主細胞の１つより多くの使用を包含する。 また、本発明はフレームシフト突然変異を生じる１以上のＧＡＧＡもしくはＣ ＴＣＴ突然変異を有する少なくとも１つのＲＮＡが原因となる、あるいはそれと 関連する疾患の治療および/または防止において、任意の組合わせで、本明細書 記載の組成物、ベクター、または宿主細胞の１つより多くの使用を包含する。 本発明はさらに神経変性疾患に対する早期マーカーを提供する。本発明はフレ ームシフト突然変異を生じる１以上の転写突然変異を有する少なくとも１つのＲ ＮＡ分子が原因となる、あるいはそれと関連する疾患を診断するための診断キッ トを提供し、該キットは（イ）フレームシフト突然変異に導く突然変異を包含す る突然変異ＲＮＡ分子の部分に相補的な配列を有する核酸プローブとそのための パッケージング材料、および（ロ）突然変異ＲＮＡ分子に結合したプローブを検 出するための手段を含んで成る。 本発明はさらにフレームシフト突然変異を生じる１以上の転写突然変異を有す る少なくとも１つのＲＮＡ分子が原因となる、あるいはそれと関連する疾患を診 断するための診断キットを提供し、該キットは（イ）ＲＴ−ＰＣＲ反応に使用す るプライマーであって、フレームシフト突然変異を生じる突然変異の両側の配列 に相補的な配列を有するプライマー、そのためのパッケージング材料、およびＲ Ｔ−ＰＣＲ反応を実施し、突然変異を含むＤＮＡ配列を増幅するための試薬と、 （ロ）増幅した、突然変異を含むＤＮＡ配列を検出するための手段を含んで成る 。 本発明はさらにフレームシフト突然変異を生じる１以上の転写突然変異を有す る少なくとも１つのＲＮＡ分子が原因となる、あるいはそれと関連する疾患を診 断するための診断キットを提供し、該キットは（イ）本発明の突然変異タンパク 質に特異性を示し、野生型タンパク質には示さない抗体分子、および（ロ）該突 然変異タンパク質に結合した抗体分子を検出するための手段を含んで成る。 該抗体分子、および結合した抗体分子を検出するための手段は上記定義のとお りである。 本発明のさらなる態様において、上記記載の診断キットはさらに（イ）野生型 タンパク質に特異性を有する抗体分子、および（ロ）フレームシフト突然変異を 生じる１以上の転写突然変異を有する少なくとも１つのＲＮＡ分子が原因となる 、あるいはそれと関連する疾患を診断するための対照としての野生型タンパク質 に結合した抗体分子を検出する手段を含んで成る。 本発明はさらに該疾患の原因となるまたは関連するフレームシフト突然変異を 生じる、１以上の転写突然変異を有するＲＮＡ分子を提供する。 本発明はさらに数種（１以上）のＲＮＡ分子を提供するが、該ＲＮＡ分子はＧ ＡＧＡもしくはＣＴＣＴモチーフまでは同一のアミノ酸配列をエンコードし、そ れ以降は異なる配列をエンコードするものである。例えば、単一の細胞において 、 例えば、β−ａｐｐに基づくフレームシフトタンパク質をエンコードする１つの ＲＮＡ分子は、該ＲＮＡ配列のエクソン９のＧＡＧＡモチーフに、または該モチ ーフ内に突然変異を含み、β−ａｐｐをエンコードする第２のＲＮＡ分子は該配 列のエクソン１０のＧＡＧＡモチーフに、または該モチーフ内に突然変異を含ん でいてもよい。 本発明はさらに疾患の兆候であると判明した突然変異したＲＮＡ分子によりエ ンコードされた、突然変異されたタンパク質を提供するものであり、該突然変異 ＲＮＡ分子はフレームシフト突然変異を生じる１以上の転写突然変異を有する。 好ましくは、該突然変異タンパク質は疾患状態に特異的な抗原エピトープを含有 する。その例を表９に示す。 本発明の好適な態様において、突然変異されたＲＮＡ分子は、図２ないし１９ のいずれか１つにおいて＋１もしくは＋２とした配列の少なくとも一部またはそ の免疫学的に等価なフラグメントを含むタンパク質をエンコードする。 好適な態様において、突然変異されたタンパク質は、とりわけ該疾患がＡＤな どの神経変性疾患である場合、以下の個々の配列のいずれか１つを含んで成る。 ＲＧＲＴＳＳＫＥＬＡ［配列識別番号：１］；ＨＧＲＬＡＰＡＲＨＡＳ［配列識 別番号：２］；ＹＡＤＬＲＥＤＰＤＲＱ［配列識別番号：３］；ＲＱＤＨＨＰＧ ＳＧＡＱ［配列識別番号：４］；ＹＡＤＬＲＥＤＰＤＲＱＤＨＨＰＧＳＧＡＱ［ 配列識別番号：１４００］；ＧＧＧＡＱ［配列識別番号：５］；ＧＡＰＲＬＰＰ ＡＱＡＡ［配列識別番号：６］；ＫＴＲＦＱＲＫＧＰＳ［配列識別番号：７］； ＰＧＮＲＳＭＧＨＥ［配列識別番号：８］；ＥＡＥＧＧＳＲＳ［配列識別番号： ９］；ＶＧＡＡＲＤＳＲＡＡ［配列識別番号：１０］；ＨＤＹＰＰＧＧＳＶ［配 列識別番号：１１］；ＳＩＱＫＦＱＶ［配列識別番号：１２］；ＶＥＫＰＧＥＲ ＧＧＲ［配列識別番号：１３］；ＰＬＦＧＲＧＨＫＲＧ［配列識別番号：１４］ ；ＥＤＲＧＤＡＧＷＲＧＨ［配列識別番号：１５］；ＱＥＲＧＡＳＰＲＡＡＰＲ ＥＨ［配列識別番号：１６］；ＲＱＰＧＤＶＡＰＧＧＱＨＲＰＶＤＤ［配列識別 番号：１７］；ＡＧＬＬＡＩＰＥＡＫ［配列識別番号：１８］；ＹＶＤＶＹＮＧ ＧＫＦＳ［配列識別番号：１９］；ＡＡＤＥＲＲＣＨＬＬＨＭＣＧＲＲ［配列識 別番号：２０］；ＱＱＡＴＥＡＧＱＨＹＱＰＧＳＰＬＨＤＨＳＨＶ［配列識別番 号：２１］；ＰＱＥＡＡＡＲＴＮＲ［配列識別番号：２２］；ＲＳＷＶ 号：２１］；ＰＱＥＡＡＡＲＴＮＲ［配列識別番号：２２］；ＲＳＷＶＨＰＡＰ ＰＹＱＭＣＬＧ［配列識別番号：２３］；およびＧＧＳＲＴＨＰＲ［配列識別番 号：２４］。 好適な態様において、本発明の抗体分子は上記定義の突然変異タンパク質に対 し親和性を有する。 また、本発明はフレームシフト突然変異を生じる１以上の転写突然変異を有す る少なくとも１つのＲＮＡ分子が原因となる、あるいはそれと関連する疾患を治 療および/または防止するための方法に関する。突然変異タンパク質の産生をリ ードし、疾患の兆候となるＲＮＡ分子の突然変異についての知見は、該疾患を治 療および/または防止する多数の方法を導いている。 本発明はさらにフレームシフト突然変異を生じる１以上の転写突然変異を有す る少なくとも１つのＲＮＡ分子が原因となる、あるいはそれと関連する疾患を同 定する方法を提供する。該方法は、（イ）疾患の病因に関係すると疑われるＲＮ Ａ分子の配列を提供し、（ロ）フレームシフト突然変異にたいし３'末端のＲＮ Ａ配列によりエンコードされた突然変異タンパク質の配列を同定し、（ハ）該突 然変異タンパク質またはそのフラグメントに対するプローブを調製し、次いで（ ニ）疾患をもつ患者および疾患をもたない患者からの体液または組織をプローブ し、突然変異タンパク質の存在および病状間の相関を見出すことを含む。 好ましくは、該プローブは本明細書に定義した抗体分子である。さらに好まし くは、抗体分子は、とりわけ該疾患がＡＤなどの神経変性疾患である場合、少な くとも１つの以下の配列を含むタンパク質に対し親和性を有するものである。Ｒ ＧＲＴＳＳＫＥＬＡ［配列識別番号：１］；ＨＧＲＬＡＰＡＲＨＡＳ［配列識別 番号：２］；ＹＡＤＬＲＥＤＰＤＲＱ［配列識別番号：３］；ＲＱＤＨＨＰＧＳ ＧＡＱ［配列識別番号：４］；ＹＡＤＬＲＥＤＰＤＲＱＤＨＨＰＧＳＧＡＱ［配 列識別番号：１４００］；ＧＧＧＡＱ［配列識別番号：５］；ＧＡＰＲＬＰＰＡ ＱＡＡ［配列識別番号：６］；ＫＴＲＦＱＲＫＧＰＳ［配列識別番号：７］；Ｐ ＧＮＲＳＭＧＨＥ［配列識別番号：８］；ＥＡＥＧＧＳＲＳ［配列識別番号：９ ］；ＶＧＡＡＲＤＳＲＡＡ［配列識別番号：１０］；ＨＤＹＰＰＧＧＳＶ［配列 識別番号：１１］；ＳＩＱＫＦＱＶ［配列識別番号：１２］；ＶＥＫＰＧＥＲＧ ＧＲ［配列識別番号：１３］；ＰＬＦＧＲＧＨＫＲＧ［配列識別番号：１ ＧＲ［配列識別番号：１３］；ＰＬＦＧＲＧＨＫＲＧ［配列識別番号：１４］； ＥＤＲＧＤＡＧＷＲＧＨ［配列識別番号：１５］；ＱＥＲＧＡＳＰＲＡＡＰＲＥ Ｈ［配列識別番号：１６］；ＲＱＰＧＤＶＡＰＧＧＱＨＲＰＶＤＤ［配列識別番 号：１７］；ＡＧＬＬＡＩＰＥＡＫ［配列識別番号：１８］；ＹＶＤＶＹＮＧＧ ＫＦＳ［配列識別番号：１９］；ＡＡＤＥＲＲＣＨＬＬＨＭＣＧＲＲ［配列識別 番号：２０］；ＱＱＡＴＥＡＧＱＨＹＱＰＧＳＰＬＨＤＨＳＨＶ［配列識別番号 ：２１］；ＰＱＥＡＡＡＲＴＮＲ［配列識別番号：２２］；ＲＳＷＶＨＰＡＰＰ ＹＱＭＣＬＧ［配列識別番号：２３］；およびＧＧＳＲＴＨＰＲ［配列識別番号 ：２４］。 本発明の他の特徴および利点は、以下の好適な実施例の詳細な説明、および特 許請求の範囲から明らかとなろう。 図面の簡単な説明 本発明を以下の図面に関する例示により説明する。 図１は女子アルツハイマー患者（７０歳、＃８３００２；表２）の前頭皮質の パラフィン切片コピーであり、βＡＰＰの＋１読み枠により予測されたペプチド に対する抗体と免疫細胞化学的にインキュベートしたものである（図２０）。異 栄養軸索（矢印先端）および繊維濃縮体（矢印）が皮質層IIIに鮮明に観察し得 る。 図２はヒトβアミロイド前駆体タンパク質遺伝子転写物のコーディングヌクレ オチド配列［配列識別番号：２５］、野生型タンパク質のアミノ酸配列［配列識 別番号：８３および８４］、突然変異＋１フレームシフトタンパク質［配列識別 番号：５０〜８２］、および突然変異＋２フレームシフトタンパク質［配列識別 番号：２６〜４９］を示す。 図３はヒト微小管結合タンパク質タウ遺伝子転写物のコーディングヌクレオチ ド配列［配列識別番号：８５］、野生型タンパク質のアミノ酸配列［配列識別番 号：９９］、突然変異＋１フレームシフトタンパク質［配列識別番号：８６〜９ ８］、および突然変異＋２フレームシフトタンパク質［配列識別番号：１００〜 １１２］を示す。 図４はヒトユビキチンＢ遺伝子転写物のコーディングヌクレオチド配列［配列 識別番号：１１３］、野生型タンパク質のアミノ酸配列［配列識別番号：１２５ および１２６］、突然変異＋１フレームシフトタンパク質［配列識別番号：１１ ４〜１２４］、および突然変異＋２フレームシフトタンパク質［配列識別番号： １２７〜１３６］を示す。 図５はヒトアポリポタンパク質Ｅ遺伝子転写物のコーディングヌクレオチド配 列［配列識別番号：１３７］、野生型タンパク質のアミノ酸配列［配列識別番号 ：１４４〜１４６］、突然変異＋１フレームシフトタンパク質［配列識別番号： １３８〜１４３］、および突然変異＋２フレームシフトタンパク質［配列識別番 号：１４７〜１５２］を示す。制限酵素部位に関する情報も示す。 図６はヒト微小管結合タンパク質２転写物のコーディングヌクレオチド配列［ 配列識別番号：１５３］、野生型タンパク質のアミノ酸配列［配列識別番号：１ ５４〜１５８］、突然変異＋１フレームシフトタンパク質［配列識別番号：２３ ２〜３４７］、および突然変異＋２フレームシフトタンパク質［配列識別番号： １５９〜２３１］を示す。 図７はヒトニューロフィラメントサブユニットＮＦ−低転写物のコーディング ヌクレオチド配列［配列識別番号：３４８］、野生型タンパク質のアミノ酸配列 ［配列識別番号：４６６〜５１３］、突然変異＋１フレームシフトタンパク質［ 配列識別番号：４１３〜４６５］、および突然変異＋２フレームシフトタンパク 質［配列識別番号：３４９〜４１２］を示す。 図８はヒトニューロフィラメントサブユニットＮＦ−Ｍ転写物のコーディング ヌクレオチド配列［配列識別番号：５１４］、野生型タンパク質のアミノ酸配列 ［配列識別番号：５１５〜５７４］、突然変異＋１フレームシフトタンパク質［ 配列識別番号：６２９〜６９５］、および突然変異＋２フレームシフトタンパク 質［配列識別番号：５７５〜６２８］を示す。 図９はヒトニューロフィラメントサブユニットＮＦ−Ｈ遺伝子転写物のコーデ ィングヌクレオチド配列［配列識別番号：６９６］、野生型タンパク質のアミノ 酸配列［配列識別番号：６９７〜６９８］、突然変異＋１フレームシフトタンパ ク質［配列識別番号：７０８〜７１０］、および突然変異＋２フレームシフトタ ンパク質［配列識別番号：６９９〜７０７］を示す。 図１０は野生型に発現されたプレセニリンＩのコーディングｍＲＮＡヌクレオ チド配列［配列識別番号：７１１］およびアミノ酸配列［配列識別番号：７１２ ］、＋１読み枠［配列識別番号：７３３〜７５３］、および＋２読み枠［配列識 別番号：７１３〜７３２］を示す。 図１１は野生型に発現されたプレセニリンIIのコーディングｍＲＮＡヌクレオ チド配列［配列識別番号：７５４］およびアミノ酸配列［配列識別番号：７７６ 〜７８７］、＋１読み枠［配列識別番号：７５５〜７７５］、および＋２読み枠 ［配列識別番号：７８８〜８１４］を示す。 図１２は野生型に発現されたビッグタウのコーディングｍＲＮＡヌクレオチド 配列［配列識別番号：８１５］およびアミノ酸配列［配列識別番号：８１６〜８ １８］、＋１読み枠［配列識別番号：８２４〜８３４］、および＋２読み枠［配 列識別番号：８１９〜８２３］を示す。 図１３は野生型に発現されたＧＦＡＰのコーディングｍＲＮＡヌクレオチド配 列［配列識別番号：８３５］およびアミノ酸配列［配列識別番号：８３６〜８５ ２］、＋１読み枠［配列識別番号：８８３〜９１４］、および＋２読み枠［配列 識別番号：８５３〜８８２］を示す。 図１４は野生型に発現されたＰ５３のコーディングｍＲＮＡヌクレオチド配列 ［配列識別番号：９１５］およびアミノ酸配列［配列識別番号：９４０〜９４９ ］、＋１読み枠［配列識別番号：９１６〜９３９］、および＋２読み枠［配列識 別番号：９５０〜９６５］を示す。 図１５は野生型に発現されたＢＣＬ２のコーディングｍＲＮＡヌクレオチド配 列［配列識別番号：９６６］およびアミノ酸配列［配列識別番号：９６７〜１０ １５］、＋１読み枠［配列識別番号：１０７５〜１１２６］、および＋２読み枠 ［配列識別番号：１０１６〜１０７４］を示す。 図１６は野生型に発現されたセマホリンIIIのコーディングｍＲＮＡヌクレオ チド配列［配列識別番号：１１２７］およびアミノ酸配列［配列識別番号：１１ ２８〜１１３１］、＋１読み枠［配列識別番号：１１６２〜１２１２］、および ＋２読み枠［配列識別番号：１１３２〜１１６１］を示す。 図１７は野生型に発現されたＨＵＰＦのコーディングｍＲＮＡヌクレオチド配 列［配列識別番号：１２１３］およびアミノ酸配列［配列識別番号：１２４１〜 １２４４］、＋１読み枠［配列識別番号：１２１４〜１２４０］、および＋２読 み枠［配列識別番号：１２４５〜１２８１］を示す。 図１８は野生型に発現されたＨＭＧのコーディングｍＲＮＡヌクレオチド配列 ［配列識別番号：１２８２］およびアミノ酸配列［配列識別番号：１２９７〜１ ２９９］、＋１読み枠［配列識別番号：１２８９〜１２９6]、および＋２読み枠 ［配列識別番号：１２８３〜１２８８］を示す。 図１９は野生型に発現されたＮＳＰ−ＡのコーディングｍＲＮＡヌクレオチド 配列［配列識別番号：１３００］およびアミノ酸配列［配列識別番号：１３７４ 〜１３８７］、＋１読み枠［配列識別番号：１３３９〜１３７３］、および＋２ 読み枠［配列識別番号：１３０１〜１３３８］を示す。 図２０は野生型および＋１読み枠に発現された２種のヒトニューロンタンパク 質（βアミロイド前駆体タンパク質（エクソン９および１０）およびユビキチン Ｂ（エクソン２））の部分ｍＲＮＡヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す 。 図２１：βアミロイド前駆体タンパク質およびユビキチンＢの転写物において ジヌクレオチド欠失により生成した新たな制限部位の２例（野生型ヌクレオチド 配列［配列識別番号：２５および１１３］、βアミロイド前駆体タンパク質欠失 配列［配列識別番号：１３９６および１３９７］、ユビキチン欠失配列［配列識 別番号：１３９８および１３９９］）。 説明 以下の非制限的例示により本発明を説明するが、ここでは以下の材料と方法を 採用する。ここに引用した各参考文献の全開示を参照によりここに組込む。 本発明はフレームシフト突然変異が単一のＲＮＡ分子または複数のＲＮＡ分子 に起こり、その産物が病状と関連するかまたは兆候を示す突然変異タンパク質で あるという発見に基づいている。本発明はフレームシフト突然変異の存在がフレ ームシフト突然変異を含む細胞にとっての新たなコーディング配列となり、疾患 と関連してその兆候を示す新たなポリペプチド（本明細書では突然変異タンパク 質と呼称する）となるという認識に基づいている。 本発明によると、フレームシフト突然変異を生じる１以上の転写突然変異を有 する少なくとも１つのＲＮＡ分子が原因となる、あるいはそれと関連する疾患の 診断および/または同定が本明細書に記載のように達成される。 本発明によると、該疾患を防止および/または治療するための方法、該疾患を 防止および/または治療するための、また、診断薬生産のためのベクター、該疾 患を防止および/または治療するための組成物、本発明に使用する核酸配列、プ ローブおよび抗体分子、および形質転換動物が本明細書に記載のように達成され る。 本発明によると、転写メカニズムにおけるエラーの検出法が本明細書に記載の ように達成される。それ故、本発明の突然変異ＲＮＡ分子に見出される突然変異 の修正が疾病を撲滅する、価値ある方法である。 疾患の診断と治療の方法および試薬につき以下により詳細に記載する。 本発明による疾患の診断 本発明はフレームシフト突然変異を生じる１以上の転写突然変異を有する少な くとも１つのＲＮＡ分子が原因となる、あるいはそれと関連する疾患の診断方法 に関する。かかる疾患はこれらに限定されるものではないが以下の疾患である。 癌、II型糖尿病および神経変性疾患、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツ ハイマー病（ＡＤ）、前頭葉性痴呆（ピック病）；進行性核上麻痺（ＰＳＰ）お よび多発タウ陽性糸状病変を伴う他の疾患、例えば、皮質基底変性、ボクサー痴 呆、繊維濃縮体のみの痴呆、繊維濃縮体および石灰化を伴う痴呆、染色体１７に リンクするパーキンソン病を伴う前頭側頭痴呆、繊維濃縮体をもつゲルストマン ・シュトロイスラー・シャインカ病、筋緊張性異栄養症、ニーマン・ピック病タ イプＣ、グアムのパーキンソン痴呆複合症、脳炎後遺症性パーキンソン病、亜急 性硬化性全脳炎、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、レーヴィ小体をもつ痴 呆、多系統萎縮症、ユビキチンと関連する他の封入体疾患、例えば、アレキサン ダー病、アルコール性肝疾患、苔癬アミロイドーシス、および加齢のマリネスコ 体と硝子質封入体、多発性硬化症、ダウン症候群および他の変性疾患、例えば、 心臓血管疾患、リューマチ性関節炎およびII型糖尿病。 体細胞の突然変異は遺伝子機能を異なるものとし、その結果特定の癌など、加 齢に関連付けられる疾患に関係する。しかし、非増殖性の細胞は染色体レベルで 重大な変化を受けることがないと一般に考えられている。例えば、染色体の変化 は主に細胞の増殖に関係しており（スミス（Smith）、Mutation Research、２７ ７ 、１３９〜１４２頁、１９９２）、殆どのニューロンなどの非増殖性細胞にと って増殖は生後生活の初期に終了するとこれまでは考えられていた（ラキック（ Rakic）、Science、２７７、１０５４〜１０５６頁、１９８５）。しかし、エバ ンス（Evans）ら（Proc．Nat．Acad．Sci.、９１：６０５９、１９９４）は、体 細胞突然変異が神経細胞系、すなわち有糸核***後のニューロンの遺伝子に起こ ることを示唆した。抗利尿ホルモン・バソプレッシン（ＶＰ）欠如のために重症 の尿崩症に罹患しているdi/diブラットルボロ（Brattleboro）ラットがエバンス らの報文の対象であった。以前に確立されていたことではあるが、ブラットルボ ロ・ラットにはＶＰ遺伝子の第２エクソンの単−Ｇ残基が欠失し、その結果Ｃ− 末端アミノ酸配列の変化した突然変異ＶＰ前駆体となるために、ＶＰホルモンが 欠如している。また、di/diラットの少数のニューロンはヘテロ接合体＋/diフェ ノタイプを示し、明らかに正常なＶＰ遺伝子産物を発現することが観察されてい た。di/diラットの分子生物学の研究により、エバンスらは、配列の変化が突然 変異ＶＰ前駆体ｍＲＮＡの読み枠をもとに戻しており、それがＧＡＧＡモチーフ のジヌクレオチド欠失に基づくものであると同定した。彼らは単一大型細胞ニュ ーロンの少量の正常ＶＰ遺伝子産物の存在とフレームシフト突然変異から生じる 突然変異遺伝子の復帰とを相関させた。エバンズらの結論は、＋１フレームシフ ト突然変異が野生型ラットおよびdi/diラット両方のＶＰ転写物に存在するので 、これらの突然変異に導く事象はdi/diラットそれ自身の病状が原因ではないと いうことであった。このように、エバンスらは突然変異ＧＡＧＡＧホットスポッ トと病状または疾患の好発とを相関させなかった。さらに、先行技術には、転写 突然変異が起こっていること、また、かかる転写突然変異が疾患を原因とする、 あるいはそれと関連するという示唆はない。突然変異はこれまでＤＮＡに起こる と考えられていたので、染色体ＤＮＡには突然変異がないとするような、また、 染色体ＤＮＡのプロービングが突然変異の有無について間違った結果を与えるよ うな検出方法には信頼性がなかった。 本発明においては、エバンスらの観察、すなわち、野生型様ＶＰ遺伝子産物に 導くdi/diラットの単一ニューロン内においてＶＰ転写物のＧＡＧＡＧホットス ポットで野生型読み枠での復帰に関するという観察が拡張発展された。本発明に よると、突然変異ホットスポットで起こっていて、フレームシフト突然変異を生 じる１以上の転写突然変異を有する少なくとも１つのＲＮＡ分子が原因となる、 あるいはそれと関連するヒトの疾患が同定および/または診断される。病気の原 因に関係していると疑われるＲＮＡ分子のヌクレオチド配列が、例えば、公開さ れた遺伝子配列から、あるいは疑わしいＲＮＡ分子のクローニングおよび配列決 定から得られる。該ＲＮＡ分子によりエンコードされるアミノ酸配列は、エンコ ードされた突然変異タンパク質のアミノ酸配列であると予測される。突然変異タ ンパク質配列は、仮定されたフレームシフト突然変異に従う＋１および＋２読み 枠において予測される。フレームシフト突然変異の位置は、フレームシフト突然 変異の発生が疑われる所定のヌクレオチド配列モチーフに関して仮定することが できる；ＲＮＡ分子に存在するかかるモチーフの例は以下のものであるが、これ らに限定されるものではない：ＧＡＧＡを含んで成る、例えばＧＡＧＡＣ、ＧＡ ＧＡＧ、ＧＡＧＡＴ、およびＧＡＧＡＡ；またはＣＴＣＴを含んで成る、例えば ＣＴＣＴＣ、ＣＴＣＴＧ、ＣＴＣＴＡ、およびＣＴＣＴＴである。 突然変異タンパク質またはその抗原性フラグメントに特異的なプローブを調製 する（かかるプローブについてはタンパク質またはタンパク質フラグメントの検 出のためのものとして上記した）。フレームシフトに導く突然変異が起こる場所 によって、突然変異タンパク質の部分は野生型タンパク質と同じ配列を有し、該 タンパク質の部分は突然変異タンパク質の配列を有する。さらに、突然変異が起 こる場所によって、突然変異タンパク質は、ヌクレオチド配列が停止コドンをコ ードしている場合には停止する（図中＊として示す）。このように突然変異が起 こる場所により異なる突然変異タンパク質が産生される。 アルツハイマー病（ＡＤ）は本発明により診断可能な、また治療し得る典型的 な疾患である。ＡＤは特発性進行性の痴呆を特徴とする神経変性疾患であり、先 進国では４番目に高い主要な死因である。６５歳を越える人口の５％ないし１１ ％が罹患し、８５歳を越えるとそれが人口の４７％にも及ぶ。現在、米国ではＡ Ｄ罹患患者が４百万人と推定され（参照：コールマン（Coleman）、Neurobiol． of Aging、１５、補遺２、５７７〜５７８頁、１９９４）、世界全体ではアルツ f Aging、１５、補遺２、５７７〜５７８頁、１９９４）、世界全体ではアルツ ハイマー患者が２千万人と推定される。 ＡＤ診断に対する臨床基準が規定されている（参照：ライスベルグ（Reisberg ）ら、Am．J．Psych.、１２、１１３６〜１１３９頁、１９８２；マックカーン （MacKhann）ら、Neurology、３４、９３９〜９４４頁、１９８４）。ＡＤの初 期症候は多様ではあるが、一般に鬱状態、妄想および不安を伴う。また、知的機 能および記憶の緩慢な退化がある。特に、認識機能障害、特異言語障害（失語症 ）、行動活性障害（失行症）、および知覚認識障害（失認症）が起こる。 しかしそれでも、ＡＤに関係する病因機序の知識が欠如しているために、生存 中にＡＤを診断する一般的な合意はない。ＡＤの診断は、脳組織の検査によって 行われる。かかる診断は通常死後の個々人について実施される。該診断は多数の 神経細胞内の神経原繊維濃縮体の存在、および脳組織、特に新皮質および海馬に おける軸索プラークの存在に基づいている。種々のタイプのプラーク（例えば、 軸索プラーク）、神経網糸、および神経原繊維濃縮体を同定するために、いくつ かの脳組織切片につき染色と微視的試験が必要である。軸索プラークは変性した 軸索（例えば、神経網糸）、神経末端、そして恐らく星状神経膠細胞性ミクログ リア要素から構成されていると信じられている。また、軸索プラークはアミロイ ドタンパクコアを有することがしばしば見出されている。神経原繊維濃縮体は正 常のペアらせん状フィラメントからなり、幾つかのタンパク質から構成されると 信じられている。 ＡＤには２つの主要なタイプ、すなわち、後期発病（＞６５歳）および早期発 病（＜６５歳）がある。すべてのＡＤ症例の大凡８５％が後期発病であり、早期 発病はわずか１５％である。後者群の０．３％は染色体２１にリンクする遺伝型 のＡＤから構成され、症例の２％が染色体１４にリンクすると考えられ、染色体 １は以下に検討するごとく若年での発病（＜０．１％）に関係することが判明し ている。散在性症例は早期発病ＡＤのもつとも顕著な群（４０％）である。 もっとも共通している後期発病群において、症例の４０％が家族性であると考 えられるが、これはアルツハイマーが一次血縁に観察されたことを意味している 。この家族型の内、１０％のみが常染色体優性である。残りの後期発病例（６０ ％）は非家族性であるか、「散在性」症例である（表１参照）。これらの症例 ）は非家族性であるか、「散在性」症例である（表１参照）。これらの症例につ いてはあまり知られておらず、これまでもＡＤの可能性のある原因を示唆するよ うなデータは入手し得なかった。 現在、軸索プラークおよび/または神経原繊維濃縮体の形成が直接ＡＤを引き 起こす原因であるか否かは明らかでない。軸索プラーク、神経網糸および/また は神経原繊維濃縮体の形成は、より基本的な細胞上のまたは生化学的変化の結果 である可能性がある。 本発明の診断法は、本明細書に記載のとおり、核酸配列の検出を包含し、該検 出は、好ましくは２つの核酸鎖の間の、すなわち、核酸プローブと、突然変異RN Aまたは生体サンプルから単離した突然変異体ＲＮＡからの逆転写突然変異ＤＮ Ａにおける相補的配列との間の核酸二重鎖の形成に関与する手法を介した検出で あり、本診断法はまた、タンパク質の検出、好ましくは突然変異またはハイブリ ッド野生型/ナンセンスタンパク質を検出することをも包含する。 １．遺伝子スクリーニングのためのＲＮＡの調製および検出 典型的に、ＲＮＡは、当該分野において周知のＤＮＡ抽出手順（例えば、Samb rook et al.，1990，A Laboratory Manual for Cloning，Cold Spring Harbor P ress，CSH，NY参照）によって、生物学的サンプルから調製され、および所望で あれば、分析の前に、例えば、電気溶出によって、さらに精製され得る。 生物学的サンプルから突然変異ＲＮＡ分子を検出する方法は、以下を包含する が、これらに制限されない：（１）逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−Ｐ ＣＲ）、次いでサイズ分離ゲル電気泳動、または対立遺伝子特異的（または、配 列特異的）プローブでのハイブリダイゼーション、（２）突然変異されたＲＮＡ に相補的である核酸プローブで溶出されたＲＮＡのハイブリダイゼーション、（ ３）ＡＲＭＳ試験、ここでは、１つのプライマーは、フレームシフト突然変異を 生じる突然変異を含む相補的な配列を有し、そして増幅は、突然変異された配列 が存在する場合のみ生じる、（４）ヌクレオチド配列決定、（５）ＲＴ−ＰＣＲ およびＴ７ポリメラーゼを介するＲＮＡ増幅、および（６）ＲＴ−ＰＣＲ増幅後 のＲＮＡにおけるジヌクレオチド欠失によって、ｃＤＮＡは、新規な制限部位を 伴って作製され得る（図２１）。 本発明に従う有用な核酸プローブは、好ましくは、緊縮条件下で、プローブの みが突然変異配列に結合したままであるように、ＲＮＡ分子の突然変異配列に十 分に相補的である（Evans et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91:6059-6063 (1994)を参照のこと）。プローブは、好ましくは、32Ｐもしくは任意の他の標準 的なアイソトープを放射活性に使用するか、またはビオチンまたはＤＩＧ標識化 を含む非放射性の方法を使用するような、当業者に公知の任意の標準的な技術を 使用して、標識される。次いで、標識化プローブは、当業者に周知の方法によっ て容易に検出され得る。 突然変異ＲＮＡ分子の存在を検出するための代替の方法は、逆転写酵素ポリメ ラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を介する。フレームシフト突然変異を生じる突 然変異のいずれかの側の配列に相補的な配列を有するプライマーは、ＲＮＡを逆 転写し、そして突然変異を含む逆転写されたＤＮＡを増幅するために使用される 。次いで、増幅されたフラグメントにおける突然変異は、上記のプローブを使用 して標準的な技術を使用して、または増幅された配列を配列決定することによっ て、検出され得る。ＲＴ−ＰＣＲ反応を使用する利点は、開始材料が少なくてす むこと、およびＰＣＲ法は、定量的および定性的な決定を可能にすることである 。定量的な決定によって、特定のサンプル中に存在する突然変異されたＲＮＡ分 子のコピー数の推定が可能となり、そしてこの情報を考慮して、疾患状態の重篤 度が推定され得る。 突然変異ＲＮＡ分子の存在を検出するための別の代替の方法は、１つのプライ マーが、フレームシフト突然変異を生じる突然変異を含む相補的な配列を有する 方法である。したがって、増幅は、突然変異された配列が存在する場合にのみ生 じる。Newton et al.，Nucl．Acids．Res．17:2503,1989。この方法は、嚢胞性 線維症を担う遺伝子における突然変異の検出において以前から使用されており、 当業者は、本発明の突然変異ＲＮＡまたは、突然変異ＲＮＡに対応する逆転写さ れたＤＮＡの検出のために、この試験を容易に行い得る。 例示的な分析方法（１）は、以下のとおりである。ＲＮＡは、逆転写され、次 いで、ＤＮＡは、分析の前に、例えば、ＰＣＲを使用して増幅される。任意の１ つのＰＣＲ、すなわち、特定の配列を標的化するＰＣＲ、または任意の１つの多 重ＰＣＲ、すなわち、配列の特定のセットを標的化するＰＣＲ、についての特異 的な条件は、変化し得るが、当業者に理解されるであろう。 突然変異されたまたは野生型の、逆転写されたＤＮＡ配列の増幅は、以下のよ うに調製されたＤＮＡのアリコートから、直接的に達成され得る。 ２５μｌのＤＮＡを、２５μｌのＨ2Ｏ、５０μｌのマスターミックス（以下 を参照のこと）、０．５μｌのＡｍｐｌｉｔａｑ（Perkin Elmer Cetus，Norwal k，CT）および０．５μｌ ＵＮＧ（Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT）を含有 する反応チューブに、アリコート化される。５０μｌのマスターミックスは、２ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ2 、各０．０２μモルのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、０．０４μモルのｄＵ ＴＰ、２０ｐｍｏｌの各プライマー（Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT）、お よび２５μｌゼラチンを含有する。 次いで、選択された増幅配列に特徴的なフラグメントは、増幅のアリコートが 電気泳動された１３％ポリアクリルアミドゲルを、エチジウムブロマイド染色し た後に、紫外線光下で可視化され得る。あるいは、対立遺伝子特異的プローブで のハイブリダイゼーションは、正常なおよび／または突然変異対立遺伝子のいず れかから増幅された産物の存在を、同定し得る。 ２．遺伝子スクリーニングのためのタンパク質の調製および検出 分析される生物学的分子がタンパク質である場合、タンパク質溶出の前に生物 学的サンプルの細胞から核酸を放出するか、またはタンパク質分析の前にサンプ ル溶出物から核酸を除去することが、所望され得る。したがって、サンプルまた は溶出物は、まず、機械的破壊（例えば、凍結／溶解、摩砕、超音波処理）、物 理学的／化学的破壊、例えば、洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、ま たはドデシル硫酸ナトリウム）での処理、浸透圧ショック、熱、酵素学的溶解（ リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ペプシンなど）、またはヌクレアーゼ処理によ って、全て当該分野において周知の従来の方法に従って、核酸を放出または除去 するために処理され得る。 生物学的サンプルが突然変異タンパク質を含む場合、その存在または不在は、 遺伝子疾患を示し、そのタンパク質は、従来の検出アッセイ、例えば、抗体プロ ーブのようなタンパク質特異的プローブを使用して、検出され得る。同様に、遺 伝子疾患がアミノ酸またはアミノ酸の配列の存在または不在と相関する場合、こ れらのアミノ酸は、従来の手段、例えば、ネイティブな配列または突然変異配列 に特異的である抗体を使用して、検出され得る（突然変異タンパク質に存在する アミノ酸配列の例について、表９を参照のこと）。 本発明の方法において有用な任意の抗体試薬は、全抗体、抗体フラグメント、 多機能性抗体凝集物、または、一般に、抗体からの１つまたはそれ以上の特異的 な結合部位を含有する任意の物質を含有してもよい。抗体フラグメントは、例え ば、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ'）2フラグメント、またはその任意の誘導体 、例えば、１本鎖Ｆｖフラグメントであってもよい。抗体または抗体フラグメン トは、非組換え、組換え、またはヒト化であってもよい。抗体は、任意の免疫グ ロブリンイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭなどであってもよい。さらに、適 切である場合には免疫グロブリンの凝集物、ポリマー、誘導体、および結合体、 またはそのフラグメントを使用してもよい。 抗体試薬についての免疫グロブリン供給源は、例えば、従来のポリクローナル 抗血清の調製、もしくはモノクローナル抗体またはキメラ抗体の調製によって、 任意の様式において得ることができる。抗血清は、十分に確立された技術によっ て得ることができ、これは、マウス、ウサギ、モルモット、またはヤギのような 動物を、適切な免疫原で免疫化することを含む。抗体の調製 １．ポリクローナル抗体 ペプチドまたはポリペプチドは、その免疫原性を増加するために従来のキャリ ア（例えば、サイログロブリン）に結合されてもよく、そしてペプチド−キャリ ア結合体に対する抗血清は、ウサギにおいて惹起される。キャリアタンパク質へ のペプチドの結合および免疫化は、記載されているように行う(Dymecki，S.M.， et al.，J．Biol．Chem 267:4815-4823，1992）。このペプ チドに対するウサギの抗体は惹起され、そして血清は、ＥＬＩＳＡによって、あ るいはドットまたはスポットブロッティングによって、ペプチド抗原に対して力 価測定される（Boersma and Van Leeuwen，1994，Jour．Neurosci．Methods 51: 317）。同時に、抗血清は、組織切片において使用され得る。血清は、グリーン （Green）ら、Cell，28，477-487(1982)の手順に従い、ＥＬＩＳＡによって、適 切なペプチドと強力に反応することが示される。最も高い力価を示す血清は、そ の後の実験において使用される。 ２．モノクローナル抗体 モノクローナル抗体を調製するための技術は周知であり、本発明のモノクロー ナル抗体は、アルンハイタ（Arnheiter）ら、Nature，294，278-280(1981)によ って記載されるように、合成ペプチドを使用して、好適にはキャリアに結合され た合成ペプチドを使用して調整されてもよい。 モノクローナル抗体は、典型的に、ハイブリドーマ組織培養物、またはハイブ リドーマ組織が導入された動物から得られる腹水液から得られる。それにもかか わらず、モノクローナル抗体は、合成ペプチドまたはそれらの結合体に対して「 惹起される」か、またはこれらによって「誘導される」として記載され得る。 特に好ましい免疫学的試験は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体 のいずれかの使用に依存し、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロッテ ィング、免疫沈降、および放射性免疫検定法を含む。Voller，A.，Diagnostic H orizons 2:1-7，1978，Microbiological Associates Quarterly Publication，W alkersville，MD;Voller，A．et al.，J．Clin．Pathol．31:507-520(1978)；米 国再発行特許第３１，００６号；英国特許第２，０１９，４０８号；Butler，J. E.，Meth．Enzymol．73:482-523(1981);Maggio，E.(ed.)，Enzyme Immunoassay ，CRC Press，Boca Raton，FL，1980)または放射性免疫検定法（ＲＩＡ）(Weint raub，B.，Principles of radioimmunoassays，Seventh Training Course on Ra dioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March 1986，pp．1-5， 46-49and68-78）を参照のこと。本発明の突然変異タンパク質の存在について組 織を分析するために、好ましくは免疫組識化学的技術が 使用される。突然変異タンパク質の容易な検出を促進するために抗体分子が標識 されるべきであることは、当業者に明らかである。抗体分子を標識するための技 術は、当業者に周知である（Harlour and Lane，Antibodies，Cold Spring Harb our Laboratory，pp 1-726，1989を参照のこと）。 あるいは、サンドイッチハイブリダイゼーション技術、例えば、所与のタンパ ク質に特異的な抗体が使用され得る。さらに、結合タンパク質に結合されたハプ テン基に特異的な抗体が、使用され得る。検出に有用な別のサンドイッチ検出系 は、アビジンまたはストレプトアビジン系であり、ここでは検出可能なタンパク 質に特異的なタンパク質は、ビオチンの付加によって修飾されている。さらに別 の実施形態において、抗体は、免疫グロブリン分子に結合する能力を有する非免 疫グロブリンタンパク質、例えば、当該分野において周知である、ブドウ球菌の プロテインＡまたは連鎖球菌のプロテインＧで置き換えられてもよい。タンパク 質は、それ自身検出可能に標識され得るか、または検出可能に標識された二次結 合タンパク質、例えば、一次抗体に特異的な二次抗体によって間接的に検出され 得るかのいずれかである。したがって、ウサギ抗ハイブリッド野生型／ノンセン スタンパク質抗体が、一次結合タンパク質として作用する場合、標識されたヤギ 抗ウサギ免疫グロブリン抗体が、二次結合タンパク質である。 別の実施形態において、ハイブリッド野生型／ノンセンスタンパク質の存在に よって作製されるシグナルは、検出可能に標識されるその融合タンパク質に特異 的な抗体、例えば、抗βガラクトシダーゼ抗体との反応によって、増幅される。 当業者は、当該分野で周知の従来の方法を使用して、過度の実験を伴わずに、多 くのこのような可能な一次および二次結合タンパク質系を案出し得る。 あるいは、他の技術は、突然変異タンパク質を検出するために使用されること ができ、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、ウェスタンブロッティング、ＨＰ ＬＣ、およびキャピラリー電気泳動のようなクロマトグラフィー法を含む。 本発明に従う疾患の同定 本発明は、フレームシフト突然変異を生じる１つまたはそれ以上の転写突然変 異を有する少なくとも１つのＲＮＡ分子を原因とするか、またはそれと関連する 疾患を同定するための方法を提供する。 疾患は、以下のように本発明に従って同定される。疾患の病原性に関与するこ とが疑われるＲＮＡ分子のヌクレオチド配列は、例えば、公開された遺伝子配列 から、または疑わしい遺伝子のクローニングおよび配列決定から、提供される。 次いで、ＲＮＡによってエンコードされるアミノ酸配列が、エンコードされる突 然変異タンパク質のアミノ酸配列であるので、予測される。突然変異タンパク質 の配列は、仮説されるフレームシフト突然変異に従って、＋１および＋２リーデ ィングフレームにおいて予測される。フレームシフト突然変異の位置は、ＲＮＡ 分子における、あるヌクレオチド配列モチーフに関して仮説されることができ、 このようなモチーフの例としては、ＧＡＧＡ、例えばＧＡＧＡＣ、ＧＡＧＡＧ、 ＧＡＧＡＴ、およびＧＡＧＡＡ、またはＣＴＣＴ、例えばＣＴＣＴＧ、ＣＴＣＴ Ｃ、ＣＴＣＴＡ、およびＣＴＣＴＴが挙げられるが、これらに制限されない。 次いで、突然変異タンパク質に特異的であるか、またはその免疫原フラグメン トに特異的であるプローブが調製される（このようなプローブは、タンパク質ま たはタンパク質フラグメントの検出について本明細書において上記されている） 。フレームシフトを導く突然変異がどこで生じるのかに依存して、突然変異タン パク質の部分は、野生型タンパク質と同じ配列を有し、タンパク質の部分は、突 然変異タンパク質の配列を有するであろう。さらに、どこで突然変異が生じるの かに依存して、ヌクレオチド配列が停止コドンをコードする場合、突然変異タン パク質は終結する（図において＊として示される）。したがって、どこで突然変 異が生じるのかに依存して、異なる突然変異タンパク質が生成される。 特定の突然変異タンパク質の存在についてプローブするもっとも簡単な方法は 、そのタンパク質またはその免疫原性部分に対する抗体を作製することである。 突然変異が配列中の別の部分で生じた場合であっても、由来する突然変異タンパ ク質がペプチド配列を含む可能性は増加されるので、予測される突然変異タンパ ク質のＣ末端に対応する免疫原性フラグメントが、合成され得る。例えば、β− ＡｐｐをエンコードするＲＮＡにおいて、同一のＣ末端配列を有する２つのフレ ームシフトされたタンパク質を生じる２つの異なる転写改変（すなわち、２つの 異 なるＧＡＧＡモチーフ）が生じる。さらに、タンパク質のＣ末端領域は、タンパ ク質の他の領域よりも、エピトープを形成するようである。 いったんプローブが作製されると、疾患を有する患者からの生物学的サンプル 、および疾患を有しない患者からの生物学的サンプルは、また上記されるように 、突然変異タンパク質の存在または不在についてプローブされる。あるいは、い くつかのプローブが調製されてもよく、そしてプローブの組み合わせが、組識サ ンプルをプローブするために使用されてもよい。疾患を有する患者からの生物学 的サンプルにおける突然変異タンパク質の存在、および疾患を有しない患者から の生物学的サンプルにおける突然変異タンパク質の不在は、その突然変異タンパ ク質が、疾患または疾患に対する罹患性についてのマーカーであることを示す。 本発明に従う疾患の処置 本発明はまた、疾患を予防および／または治療するための方法、疾患を予防お よび／または治療するためのベクター、および疾患を予防および／または治療す るための、核酸配列およびタンパク質のような組成物に関し、その方法および組 成物は、遺伝子治療およびタンパク質治療において有用である。 本発明は、フレームシフト突然変異を生じるＧＡＧＡまたはＣＴＣＴにおける 突然変異を有するＲＮＡを原因とするか、またはそれと関連する疾患の治療およ び／または予防の方法を包含し、ここでは、リボザイム、野生型ＲＮＡ、もしく はその両方、突然変異ＲＮＡに相補的でありかつ突然変異ＲＮＡとのハイブリッ ドを形成し得るＲＮＡまたはＤＮＡ、または任意のこれらの配列をエンコードす る配列を含有するベクター、または突然変異体タンパク質の野生型形態が、疾患 にかかっているか、または疾患にかかりやすい患者に投与される。 本発明に従って治療される好ましい疾患としては、ガン、または神経退行性疾 患、特にＡＤが挙げられるが、これらに制限されず、本発明の好ましい突然変異 ＲＮＡとしては、フレームシフト突然変異を導くＲＮＡにおける欠失、挿入、ま たは他の改変を有する、βアミロイド前駆体タンパク質、タウタンパク質、ユビ キチンＢ、アポリポタンパク質−Ｅ4（Ａｐｏ−Ｅ4）、微小管結合タンパク質Ｉ Ｉ（ＭＡＰ２）、ニューロフィラメントタンパク質（Ｌ、Ｍ、Ｈ）、プレセニリ ン（presenilin）Ｉ、プレセニリンII、ビッグタウ(Big Tau)、ＧＦＡＰ、Ｐ５ ３、ＢＣＬ２、セマフォリン（semaphorin）III、ＨＵＰＦ、ＨＭＧ、およびＮ ＳＰ−Ａが挙げられるが、これらに制限されない。 本発明に従う治療において有用なリボザイムは、好ましくは、ハンマーヘッド 型リボザイムである。 本発明に従う薬学的組成物としては、キャリアとの混合物において、治療学的 に有効な量のリボザイム、突然変異ＲＮＡの野生型アナログ、またはその両方、 もしくは突然変異ＲＮＡに相補的でありかつインビボで翻訳できない配列とハイ ブリッドを形成し得るＤＮＡもしくはＲＮＡを含み得る。治療学的に有効な量は 、患者に投与される場合、患者に治療学的利益を提供する量であると考えられる 。このような量は、一般に、１０μｇ〜１００ｍｇの治療学的タンパク質／患者 のｋｇ体重、好ましくは５０μｇ〜１０ｍｇ、および最も好ましくは、１００μ ｇ〜１ｍｇの範囲である。 ベクターが、本発明に従って有用である場合、ベクターは、当業者に公知の広 範な一連の文献において概説されるように、直線状または環状の構造であっても よく、宿主細胞中でのエピゾーマル、またはインテグレートな存在のために適応 し得る。ベクターは、ウイルス送達系または非ウイルス送達系を使用して、細胞 に送達されてもよい。送達系の選択は、物質が、選択される中枢神経系または神 経細胞タイプに送達されるのか、もしくは一般にこれらの細胞に送達されるのか に依存する。 本発明のベクターは、エンコードされる遺伝子のより制御された発現を導くた めに、さらなる制御配列、例えば、エンハンサーまたは遺伝子配座制御領域（Ｌ ＣＳ）をさらに含み得る。ＬＣＳは、ＥＰ−Ａ−０３３２６６７において記載さ れている。遺伝子配座制御領域（ＬＣ）の包含は、ＤＮＡが取込みの部位で開始 状態で確実に挿入され、それによってベクター中に含まれる遺伝子の発現が確実 に可能となるので、特に好ましい。本発明のベクターは、エクスビボおよびイン ビボの遺伝子治療において、広範な用途を有する。 本発明に従う疾患診断および治療のための動物モデル 本発明はまた、試験または治療についての疾患のモデルとして使用するための 、安定な細胞株およびトランスジェニック動物を含む。 本発明に従う安定な細胞株またはトランスジェニック動物は、本明細書中で導 入遺伝子としても知られ、疾患を引き起こすか、または疾患と関連するフレーム シフト突然変異を生じる１つまたはそれ以上の突然変異をエンコードする、組換 え遺伝子を含む。 組換え遺伝子は、疾患を示すことが見出された突然変異されたタンパク質をエ ンコードするＲＮＡをエンコードする。好ましくは、突然変異タンパク質は、疾 患状態に特異的な抗原性エピトープを含む。組換え遺伝子は、図２〜９のいずれ かにおいて＋１または＋２と示される配列の少なくとも一部、またはその免疫学 的に等価なフラグメントを含有するタンパク質をエンコードし得る。 本明細書中に記載されるように、突然変異タンパク質をエンコードする導入遺 伝子を含む細胞株は、細胞中に外来遺伝子を導入するための当該分野において公 知のいくつかの手順のうちのいずれかに従って、選択された細胞株に導入遺伝子 を導入することによって、作製される。 このような導入遺伝子を含むトランスジェニック動物としては、げっ歯類、例 えば、ラットまたはマウス、もしくは他の哺乳動物、例えば、ヤギ、ウシなどが 挙げられ、当該分野において周知の手順に従って作製され得る。 トランスジェニック動物は、フレームシフト突然変異を生じる１つまたはそれ 以上の突然変異を含有するＲＮＡをエンコードする少なくとも１つの遺伝子を原 因とするか、またはそれと関連する疾患、およびその治療の研究目的のための疾 患モデルとして、本発明に従って有用である。上述で定義されるように、１つま たはそれ以上の突然変異遺伝子を特異的に発現することによって、疾患の発症に 対するこのような突然変異体の効果が研究され得る。さらに、遺伝子治療、およ び種々の薬物を含む治療が、トランスジェニック動物に対して試験され得る。 本発明において有用なトランスジェニック動物を作製するために、動物に導入 される組換え遺伝子としては、本明細書中に具体的に開示される遺伝子が挙げら れ、遺伝子の野生型配列に関してジヌクレオチドの欠失または挿入、ヌクレオチ ド配列ＧＡＧＡまたはＣＴＣＴと関連するジヌクレオチドの欠失または挿入、例 えば、ＧＡＧＡＸまたはＣＴＣＴＸ、ここでＸは、Ｇ、Ａ、Ｔ、またはＣのうち の１つであり、例えば、ＧＡＧＡＧ、ＧＡＧＡＣ、ＧＡＧＡＴ、およびＧＡＧＡ Ａ）またはＣＴＣＴＧ、ＣＴＣＴＣ、ＣＴＣＴＴ、およびＣＴＣＴＡを含む。こ のような導入遺伝子は、好ましくは、ＧＡＧＡＧ（図２０）に極めて近接するＡ Ｇ欠失またはＧＴ欠失、例えば、それぞれ、＋１または＋２フレームシフト突然 変異を導くＧＡＧＡ、ＧＡＧＡＧ、ＧＡＧＡＣ、ＧＡＧＡＴ、ＧＡＧＡＡと関連 する１つまたは２つのジヌクレオチド欠失を含む。類似の様式において、ＣＴＣ ＴＸは、同じ欠失プロセス（△ＣＴ）を受け得る。 疾患の動物モデルにおいて特に有用であるこのような突然変異を含む組換え導 入遺伝子としては、神経退行性疾患、特に、アルツハイマー病と関連する導入遺 伝子が挙げられ、突然変異体βアミロイド前駆体タンパク質、タウタンパク質、 ユビキチンＢ、アポリポタンパク質−Ｅ4（Ａｐｏ−Ｅ4）、微小管結合タンパク 質II（ＭＡＰ２）、神経線維タンパク質（Ｌ、Ｍ、Ｈ）、プレセニリンＩ、プレ セニリンII、ビッグタウ(Big Tau)、ＧＦＡＰ、Ｐ５３、ＢＣＬ２、セマフォリ ンIII、ＨＵＰＦ、ＨＭＧ、およびＮＳＰ−Ａをエンコードする、本明細書中に 開示される突然変異遺伝子配列が挙げられるが、これらに制限されない（表２〜 ８もまた参照のこと）。 本発明のトランスジェニック動物は、対応の野生型タンパク質が、動物の発生 および成熟の選択された段階の間で、ならびに選択された組織において、発現さ れるように、そして突然変異体遺伝子が、所望される場合に作動されるように、 調節可能なおよび／または調節化プロモーターを介して制御される導入遺伝子を 含み得る。これは、動物モデルが、アルツハイマー病のものである場合、特に望 ましく、この場合突然変異タンパク質は、動物の生涯において後に発現され始め る。従って、突然変異遺伝子が、脳特異的な誘導性のプロモーター、例えば、ニ ューロフィラメント、アルドラーゼ、または改変されたＴｈｙ−１のプロモータ ーの制御下にある場合、疾患の発症は、突然変異遺伝子の発現を介して制御され 得る。本発明に従うトランスジェニック動物は、ａ）ヒトβアミロイド前駆体タ ンパク質＋１、ｂ）ヒトユビキチン＋１タンパク質、ｃ）ヒトニューロフィラメ ントタンパク質、を過剰発現するために作製され得る。 実施例１ 以下で、ニューロン組織中に存在するタンパク質をコードしているＲＮＡ分子 中の転写フレームシフト突然変異の同定に係わる本発明の実施態様とこのような 突然変異が或る種の疾病状態の診断においてどのように有用であるのかについて 記載する。 ヒトβアミロイド前駆体タンパク質、タウ、ユビキチン、アポリポタンパク質 Ｅ４、ＭＡＰ２、低（Ｌ）、中（Ｍ）および高（Ｈ）ニューロフィラメントサブ ユニット、プレセニリンＩ、プレセニリンII、ビッグタウ（Big Tau）、ＧＦＡＰ、 Ｐ５３、ＢＣＬ２、セマホリンIII、ＨＵＰＦ−Ｉ、ＨＭＧ、ならびにＮＳＰ-Ａ をコードしているｃＤＮＡ配列は種々の遺伝子配列データベースから得た。 配列データを使用して、配列中の種々のＧＡＧＡまたはＣＴＣＴモチーフを同 定し、そして欠失を仮定して、誘導される突然変異タンパク質の配列を図２〜１ ９に示されているように予測した。＋１と＋２のフレームシフト突然変異タンパ ク質の両配列を予測した。 仮定された突然変異タンパク質の配列を試験して、仮定された突然変異タンパ ク質のＣ末端に相当するペプチドを合成した。これらのペプチドは当該技術分野 の熟練者に知られている標準的な技術を使用して合成した。次の配列を有するペ プチドを合成した：ＲＧＲＴＳＳＫＥＬＡ［配列識別番号：１］、ＨＧＲＬＡＰ ＡＲＨＡＳ［配列識別番号：２］、ＹＡＤＬＲＥＤＰＤＲＱ［配列識別番号：３ ］、ＲＱＤＨＨＰＧＳＧＡＱ［配列識別番号：４］、ＹＡＤＬＲＥＤＰＤＲＱＤ ＨＨＰＧＳＧＡＱ［配列識別番号：１４００］、ＧＧＧＡＱ［配列識別番号：５ ］、ＧＡＰＲＬＰＰＡＱＡＡ［配列識別番号：６］、ＫＴＲＦＱＲＫＧＰＳ［配 列識別番号：７］、ＰＧＮＲＳＭＧＨＥ［配列識別番号：８］、ＥＡＥＧＧＳＲ Ｓ［配列識別番号：９］、ＶＧＡＡＲＤＳＲＡＡ［配列識別番号：１０］、ＨＤ ＹＰＰＧＧＳＶ［配列識別番号：１１］、ＳＩＱＫＦＱＶ［配列識別番号：１２ ］、ＶＥＫＰＧＥＲＧＧＲ［配列識別番号：１３］、Ｐ 配列識別番号：１２］、ＶＥＫＰＧＥＲＧＧＲ［配列識別番号：１３］、ＰＬＦ ＧＲＧＨＫＲＧ［配列識別番号：１４］、ＥＤＲＧＤＡＧＷＲＧＨ［配列識別番 号：１５］、ＱＥＲＧＡＳＰＲＡＡＰＲＥＨ［配列識別番号：１６］、ＲＱＰＧ ＤＶＡＰＧＧＱＨＲＰＶＤＤ［配列識別番号：１７］、ＡＧＬＬＡＩＰＥＡＫ［ 配列識別番号：１８］、ＹＶＤＶＹＮＧＧＫＦＳ［配列識別番号：１９］、ＡＡ ＤＥＲＲＣＨＬＬＨＭＣＧＲＲ［配列識別番号：２０］、ＱＱＡＴＥＡＧＱＨＹ ＱＰＧＳＰＬＨＤＨＳＨＶ［配列識別番号：２１］、ＰＱＥＡＡＡＲＴＮＲ［配 列識別番号：２２］、ＲＳＷＶＨＰＡＰＰＹＱＭＣＬＧ［配列識別番号：２３］ 、およびＧＧＳＲＴＨＰＲ［配列識別番号：２４］。 フレームシフトに至らしめる突然変異が何処に生起するのかに依存して、突然 変異タンパク質の一部分は野生型タンパク質と同じ配列を有していると思われ、 およびタンパク質の一部分は突然変異タンパク質の配列を有してると思われる。 更に、突然変異が何処に生起するのかに依存して、ヌクレオチド配列が停止コド ン（図面中に＊で示されている）をコードしているとき、突然変異タンパク質は 終了するであろう。かくして、突然変異が何処に生起するのかに依存して、種々 の突然変異タンパク質が産生されよう。 ｃＤＮＡ中のＧＡＧＡまたはＣＴＣＴモチーフに突然変異が生起することが予 測されるので、それに従って突然変異タンパク質の配列が予測される。 たとえ配列中の別の位置で突然変異が生起したとしても、誘導される突然変異 タンパク質は予測される突然変異タンパク質のＣ末端に相当するペプチド配列を 含有している可能性が高いので、このようなペプチドを合成した。更に、タンパ ク質のＣ末端領域はこのタンパク質の他の領域より一層エピトープを形成し易い ように思われる。 合成されたペプチドの固有性は遺伝子配列データベース検索によって確認した 。 次いで、合成した各ペプチドをウサギに注入し、そしてこのペプチドに親和性 を有する抗体を精製した。抗体を得るために使用した技術は当該技術分野の熟練 者に知られている標準的な技術である。 次いで、得られた抗体は神経病理学的に確認されたＡＤ症例および対照の非Ａ Ｄ症例の前頭皮質、側頭葉および海馬の剖検材料で試験した。抗体の存在は当該 技術分野の熟練者に知られている標準的な検出法を使用して測定される。 図１は、βアミロイド前駆体タンパク質の＋１読み取り枠で予測されるペプチ ドに対する抗体を使用して同定されたアルツハイマー患者の前頭皮質におけるβ アミロイド前駆体突然変異タンパク質（βＡＰＰ+1）の存在を示している。使用 した抗体は次の配列、ＲＧＲＴＳＳＫＥＬＡ［配列識別番号：１］を有するペプ チドに対して親和性を有していた。 予測されたペプチドに対する抗体を使用して実施した他の免疫反応試験の結果 は表２〜５に示す。 突然変異タンパク質の存在は検出することができ、そしてＡＤを有する被験者 と相関していることが分かる。それ故、１種またはそれより多くの突然変異タン パク質の存在はＡＤの指標であることが分かる。 表６は前頭皮質（領域１１）、側頭皮質（領域３８）および海馬内部の免疫反 応性の結果を要約している。 他の疾病も本明細書で定義した突然変異タンパク質の存在と相関している可能 性がある。例えば、７人のダウン症候群患者を本発明に従って試験した。ダウン 症候群は、β-アミロイド前駆体タンパク質の過剰発現をもたらす染色体２１の ３染色体性である。本発明者はこれら患者の前頭および側頭大脳皮質ならびに海 馬がプラークやもつれた状態のニューロフィブリンを含有していることに注目し て、このような過剰発現が、過剰に発現されたβ-アミロイド遺伝子中のＧＡＧ ＡＧモチーフのフレームシフト突然変異によってニューロンに転写突然変異の蓄 積を促進する可能性があると仮定した。アミロイド＋１カルボキシ末端ペプチド に特異的な上記抗体を有するダウン症患者の前頭および側頭大脳皮質から得られ る組織を免疫細胞化学的に染色した後、７人の患者のうち６人のもつれた状態の ニューロフィブリンに免疫反応性が観察された。対合対照の前頭皮質は染色され なかった。それ故、突然変異アミロイドタンパク質はアルツハイマー病だけでな く他の疾病、例えばアルツハイマー神経病理学に係わっ ているダウン症にも相関している。 多数の突然変異がＧＡＧＡまたはＣＴＣＴモチーフで生起することが見い出さ れている。表７は神経細胞系の種々のｃＤＮＡ中に相補的なＧＡＧＡモチーフが 存在していることを示している。このモチーフまたはタウおよびアポリポタンパ ク質Ｅ４の配列から分かるように、（ｃＤＮＡ中の）ＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣ、Ｇ ＡＧＡＡおよびＧＡＧＡＴのような類似のモチーフはこれらの疾病になるかまた はこれらの疾病と関係しているフレームシフト突然変異に関係付けることができ る。他のＲＮＡ分子中にこのモチーフまたは類似のモチーフが存在していること は、これらモチーフが疾病に関係していることを示している可能性がある。この ようなモチーフとは関係がないが、依然として疾病を引き起こすかまたは疾病と 関係のあるフレームシフト突然変異に導く他の突然変異が生起している可能性も ある。 表８は、神経細胞系の特定のＲＮＡ分子中にＧＡＧＡＣモチーフ、即ちβＡＰ Ｐ、タウおよびユビキチンが存在していることを示している。この表はまた、な かんずく、遺伝子（この遺伝子から突然変異ＲＮＡ分子が転写される）の染色体 位置およびこのＲＮＡ分子によってコードされる最長ポリペプチド形態の分子量 とそのＣ末端（このＣ末端に対して抗体が産生させられる）を有する異常な＋１ ペプチドの予測される大きさも示している。これらのペプチドはウエスタンブロ ットで示され、そしてまた、影響を受けていない野生型Ｎ末端のエピトープを認 識する別の抗体を使用しても同定された。 実施例２ 抗原性ペプチドの選択 本明細書で記載したように、配列中で突然変異タンパク質の一部分に相当する 合成ポリペプチド（このようなペプチドが化学的に合成されるにしろ、化学的若 しくは組換え技術で産生されたタンパク質フラグメントであるにしろ）は、これ らが以下の特徴を有している場合、本発明に従って突然変異タンパク質に特異的 な抗体を産生するための抗原性ペプチドとして有用であろう。合成ペプチドは最 小限８個の、そして好ましくは１２〜１５個のアミノ酸残基を含んで おり、そして最適の長さは２０〜２１個のアミノ酸であろう。ハイブリッド野生 型／ナンセンスタンパク質のアミノ酸配列の親水性と抗原性指数は、コンピュー タープログラミングを使用するアナリティカル バイオテクノロジー サイエンシ ズ（Analytical Biotechnology Sciences）、マサチューセッツ州ボストン、に よって測定することができる。本発明に従って有用となる可能性のある合成ペプ チドは、好ましくはハイブリッド野生型／ナンセンスタンパク質の１００〜１５ ０個のカルボキシ末端アミノ酸の範囲内の１２〜２０個の範囲のアミノ酸を含ん でいる。 選択されたペプチドのアミノ酸配列は、相応の濃度で、任意の１つのペプチド に対する抗血清が既知の配列の任意のタンパク質と特異的に相互作用する可能性 を排除するために、配列に関するコンピューターデータベース（例えば、GenBan k）で検索する。好ましい配列は、近似する相同性（即ち、「近似する」とは８ ０〜１００％の同一性を意味する）を有していないことが決定されている配列で ある。 実施例３ 「突然変異」タンパク質の検出 本発明のもう１つの実施態様は、疾病状態の指標として所与の組織における「 突然変異体」または突然変異タンパク質の存在のアッセイに関係している。ここ で、上記した抗体を調製する。次いで、抗体またはそのイディオタイプ含有ポリ アミド部分を候補組織および指示基と混合する。天然生起アミノ酸配列の存在は 、指示基で信号化される免疫反応の形成によって確認される。候補組織には、上 記したような突然変異タンパク質の存在を試験すべき任意の組織若しくは細胞系 または体液が含まれる。 所与のハイブリッド野生型／ナンセンスタンパク質の発現は、以下のようにハ イブリッド野生型／ナンセンスタンパク質中のカルボキシ末端範囲のアミノ酸に 相当するペプチドに対してウサギで調製した血清を使用して調査することができ る。 ＣＭＫ細胞またはＵ３Ｔ３細胞は35Ｓ-メチオニンで代謝過程で標識され、そ して抽出物は抗血清で免疫沈降させられる。ハイブリッド野生型／ナンセンスタ ンパク質が細胞内に存在している場合には、対応する分子量のタンパク質種がＣ ＭＫおよびＵ３Ｔ３細胞内で検出されるであろう。このタンパク質は、Towbin e t al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，76 ，4350〜4354(1979)に一般的に記載さ れているようにして、核、膜および細胞質フラクションのウエスタンブロット分 析によって膜、核または細胞質に対して位置を決定することができる。この位置 決定は主として形質膜に関係している免疫蛍光分析によって確認することができ る。 代謝標識化免疫沈降および免疫学的位置決定アッセイは以前に記載された(Fur th，et al.，Oncogene 1:47〜58、1987;Laemmli，U.K.、Neture 227:680〜685， 1970;Yarden，Y．et al.，EMBO J．6:3341〜3351，1987;Konopka，J.B.，et al. ，Mol．Cell．Biol．5:3116〜3123，1985)ようにして行われる。免疫ブロット分 析用に、総溶解物を調製する（フルース（Fruth）の溶解緩衝液を使用して）（F ruth，M.E.，et al.，Oncogene，1:47〜58，1987）。相対タンパク質濃度は、標 準品としてウシ血清アルブミンを使用して比色アッセイキット（Bio-Rad）で測 定する。概ね０.０５mgのタンパク質を含有する溶解物のタンパク質を、２-メル カプトエタノールを含有する等量の２ｘＳＤＳ試料緩衝液と混合し、５分間沸騰 させ、１０％のポリアクリルアミド-ＳＤＳゲル(Konopka，J.B．et al.，J．Vir ol.，51:223〜232，1984)で分画し、そしてイムノビロン ポリビニルジン ジフ ルオリド（Millipore Corp.、マサチューセッツ州ベッドフォード）フィルター に移した。タンパク質ブロットは、特異的な抗ペプチド抗体（下記参照）で処理 した。特異的抗体の主要な結合は、ホースラディッシュペルオキシダーゼに抱合 した抗IgG第二抗体を使用し、そしてその後化学発光発現ＥＣＬウエスタンブロ ットシステム（Amersham International）を使用して検出することができる。 代謝標識化のために、１０6個の細胞は、メチオニンを除いたダルベッコの修 正イーグル培地（Amersham Corp.）１ml中１００μCiの35Ｓ-メチオニンを使用 して１６時間標識する。抗ペプチド抗血清で標識した細胞から得られるタン パク質の免疫沈降は記載された（Dymecki，S.M.等、J．Biol．Chem．２６７：４ ８１５〜４８２３、１９９２年）ようにして実施する。１０7cpmの酸不溶性35Ｓ -メチオニンを含有する溶解物の一部を抗血清１μgと共に０.５mlの反応混合物 中でインキュベートした。免疫沈降試料はＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気 泳動およびオートラジオグラフィーで分析した。 免疫学的位置決定試験のために、１０7個のＣＭＫ細胞を音波処理緩衝液（６ ０ｍＭのトリス-HCl、ｐＨ７.５、６ｍＭのＥＤＴＡ、１５ｍＭのＥＧＴＡ、０ ．７５Ｍのスクロース、０.０３％のロイペプチン、１２ｍＭのフェニルメチル スルホニルフルオリド、３０ｍＭの２-メルカプトエタノール）中に再懸濁する 。細胞は６回、各１０秒間音波処理し、そして２５,０００×ｇで１０分間４℃ で遠心する。このペレットを音波処理緩衝液１mlに溶解し、そして２５,０００ ×ｇで１０分間４℃で遠心する。 このペレット（核フラクション）を音波処理緩衝液１mlに再懸濁し、そして等 量の２ｘＳＤＳ試料緩衝液に添加する。上記で得られた（最初の音波処理後の） 上清液を１００,０００×ｇで４０分間４℃で再度遠心する。この上清液（サイ トゾルフラクション）を取り出し、そして等量の２ｘ濃縮ＳＤＳ試料緩衝液に添 加する。残っているペレット（膜フラクション）を洗浄し、そして上記したよう にして音波処理緩衝液およびＳＤＳ試料緩衝液に溶解する。タンパク質試料は、 レムリ（Laemmli）法（Konopka，J.B.等、Mol．Cell．Biol．５:３１１６〜３１ ２３、１９８５年）に従って１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して分析 する。これらのタンパク質は、その後の免疫ブロット分析用に上記ゲルから０. ４５μmのポリビニリジンジフルオリド膜に移す。抗体の主要な結合はホースラ ディッシュペルオキシダーゼに抱合した抗IgG第二抗体を使用して検出する。 所与のタンパク質の免疫組織化学的位置決定のために、所望の場合、ＣＭＫ細 胞またはＵ３Ｔ３はカバーガラス上で概ね５０％の集密になるまで増殖させ、そ して培地を除去した後にＰＢＳ（ｐＨ７.４）で洗浄する。これらの細胞は、０. ０７５％のトリトンＸ-１００を含有する１％のパラホルムアルデヒド中３ ７℃で１分間予備的に固定し、ＰＢＳですすぎ、そしてその後４％のパラホルム アルデヒドで１０分間固定する。固定段階後、細胞をＰＢＳ中ですすぎ、０．１ を有するＰＢＳ中で反応を停止させ、そして最後にＰＢＳ中で再度すすぐ。抗体 を染色するために、細胞は先ず遮断溶液（ＰＢＳ中３％のウシ血清アルブミン） で遮断し、そして３７℃で１時間インキュベートする。次いで、細胞を抗血清（ １：１００希釈または前免疫ウサギ血清（１：１００）（下記参照））と共に３ ７℃で１時間インキュベートする。一次抗体とのインキュベーション後、細胞は ３％のウシ血清アルブミンおよび０.１％のトゥイーン２０を含有するＰＢＳ中 で洗浄し、そして遮断溶液中で１：１００に希釈したフルオレセイン抱合ロバ抗 ウサギIgG（Jackson Immunoresearch、メイン州）中３７℃で１時間インキュベ ートする。 カバーガラスをＰＢＳ（ｐＨ８.０）中で洗浄し、そしてガラススライドに載 せる前に各カバーガラスにグリセリンを添加し、そして透明なマニキュア液で密 封する。ガラススライドは全てツァイス アキシオホト（Zeiss Axiophoto）顕微 鏡で試験した。 実施例４ 生物学的試料の分析 所与の突然変異タンパク質または核酸に関する上記検出方法は、マーカータン パク質を含有している疑いのある組織、細胞系および体液（例えば、脳脊髄液ま たは、静脈血、動脈血および臍帯血を含むがこれらに限定されない血液）に係わ る分析に適用できる。 例えば、疾病状態の疑いのあるＣＮＳ組織の試料を分析することができ、この 場合にはこの特定の疾病状態の組織が健常組織と比較して検出可能な値のハイブ リッド野生型／ナンセンスタンパク質を含有していることが本発明に従って前以 て観察されている。 この疑いのある試料と健常対照試料の分別物を準備し、そして本明細書に記載 したハイブリッド野生型／ナンセンスタンパク質に特異的な抗体の有効量および 指示基と混合する。この混合物は典型的には、免疫反応を生じさせるのに 十分な時間、知られているようにしてインキュベートする。次いで、インキュベ ートした混合物は指示基で示される免疫反応の存在についてアッセイする。次い で、疑いのある試料と対照試料中のハイブリッド野生型／ナンセンスタンパク質 の相対的な値を比較することによって、疑いのある試料における疾病状態または 健常状態の診断が可能になる。 ハイブリッド野生型／ナンセンスタンパク質の存在を分析する上記タイプは、 勿論、コード化ＲＮＡについての分析、例えば当該技術分野で慣用であり且つ知 られているノーザンブロット分析またはＲＮＡドットブロット分析によって実施 することができる。 本発明による疾病治療法 本発明による疾病治療法は突然変異転写物の除去を意図している。転写突然変 異ＲＮＡ分子の存在を支持する証拠とは、ホモ接合性のブラトレボロ（Brattleb oro）視床下部細胞でフレームシフト突然変異を有するバソプレシンｃＤＮＡが １００個のコロニー中１個のコロニーで観察され、一方フレームシフト突然変異 を有するゲノムバソプレシンＤＮＡは同定されなかったということである。 ヒト視床下部中では、バソプレシン＋１免疫反応性細胞数の年齢に関係した増 加は観察されていない（ラットとは対照的に）。しかしながら、胎内期（妊娠２ ９〜４２週）では、＋１バソプレシンタンパク質を含有する＋１免疫反応性細胞 数の膨大な増加が検出される。誕生後、これらの細胞数はほんの２,３個にまで 後退する。βapp遺伝子の発現が非常に高い（正常より５倍高い）ダウン症候群 では、βappおよび＋１突然変異タンパク質の最高値も観察され、これはβapp遺 伝子の発現が正常値以上に増加することが見い出されていないＡＤより高かった 。βＡＰＰ＋１突然変異タンパク質とUbiB＋１突然変異タンパク質が同一細胞内 に共存している（且つもつれた状態で、そして栄養障害性神経突起に存在してい る）ことも見い出された。従って、この一時的な増加がゲノム事象によるものと は思われない。 フレームシフト突然変異を含有するＲＮＡ分子（即ち、フレームシフトした 転写物）または突然変異タンパク質が或る疾病状態と相関関係にある場合、この 疾病は本発明に従って次のようにして治療することができる、フレームシフトし たＲＮＡを開裂によって選択的に除去するのに役立つ酵素、例えばリボザイムを このような酵素の投与を必要としている患者に投与することによって、好ましく は実質的に非開裂形態の突然変異ＲＮＡの野生型のものを投与することによって 、ハイブリッド野生型／ナンセンスタンパク質の野生型のものを投与することに よって、または突然変異ＲＮＡを翻訳不能にする核酸重複物を形成するために突 然変異ＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド若しくはこのようなオリゴヌクレオ チドをコードしている配列を細胞に投与することによって。 上記の投与を必要としている患者には、疾病の症状を示している患者、更には 疾病を発現している疑いのある患者、即ちフレームシフトしたペプチド（例えば 、＋１または＋２読取り枠にアミノ酸配列を有しているペプチド）の存在につい て組織試料、例えば脳脊髄液を測定して本発明に従ってモニターされる患者が含 まれる。 本発明によって、リボザイムは影響を受けているかまたは疑いのある細胞に送 達されて、突然変異ＲＮＡを開裂させそしてその結果突然変異ＲＮＡを突然変異 タンパク質に翻訳する細胞の能力を不能にすることができる。野生型タンパク質 は、細胞によってそれまでに産生されていなかった場合、タンパク質形態で提供 するかまたは野生型ＲＮＡをリボザイムと一緒に細胞に投与することによって提 供することができる。野生型ＲＮＡは、単なるＧＡＧＡまたはＣＴＣＴ突然変異 のレベルではない突然変異ＲＮＡ配列と識別できる配列を含有するように操作す ることができる。例えば、突然変異ＲＮＡは第三塩基サイレント突然変異、即ち ＲＮＡのコード化配列は変えないが野生型ＲＮＡをリボザイムによる開裂に対し て殆どまたは実質的に非感受性にする突然変異を含有することができる。 １つの理論で拘束されないが、突然変異ＲＮＡの割合を減少させそしてハイブ リッド野生型／ナンセンスタンパク質に関して産生される正しいタンパク質の割 合を増加させることによって疾病の更なる進行を低下させるかまたは防止 し、そして多分疾病状態を逆転させることが示唆される。加えて、全ての突然変 異転写がニューロン組織に直接毒性の突然変異タンパク質を生じさせるのではな いことも考えられる。例えば、突然変異タンパク質はプロテアソーム系および／ またはリソソーム系に輸送されるか、或いはすぐに分泌され（例えば、構成性経 路または調節性経路によって）そして他の場所で分解されると思われる。しかし ながら、ときには突然変異タンパク質は、例えば小胞体内の小器官の膜に蓄積さ れ、その結果細胞機構の正常な過程を破壊するであろう。 突然変異ＲＮＡの野生型のものは正しいタンパク質をコードしている。疾病が 神経退行変性疾病であるとき、好ましい野生型配列にはβアミロイド前駆体タン パク質遺伝子、タウ遺伝子、ユビキチンＢ遺伝子、アポリポタンパク質-Ｅ4遺伝 子、微小管結合タンパク質II（ＭＡＰ２）遺伝子、ニューロフィラメントタンパ ク質遺伝子（Ｌ、ＭおよびＨ）、プレセニリンＩおよびII遺伝子、ビッグタウ（ Big Tau）、ＧＦＡＰ、Ｐ５３、ＢＣＬ２、セマホリンIII、ＨＵＰＦ-１、ＨＭ ＧおよびＮＳＰ-ＡによってコードされるＲＮＡが含まれる。これら遺伝子の配 列は本明細書の図面中で提供されている。他の好ましい野生型ＲＮＡはアルファ およびベータチューブリン遺伝子によってコードされており、そしてこれら遺伝 子の配列はそれぞれ、Cowan et al.，Mol．Cell．Biol.，3 ，1738〜1745(1983); Lewis et al.，J．Mol．Biol．182，11〜20(1985)中に見られる。 疾病が非遺伝性の癌であるとき、好ましい野生型ＲＮＡは、ヒトｐ５３遺伝子 およびＢＣＬ-２遺伝子を含んでいるがこれらに限定されない遺伝子配列でコー ドされている。哺乳類リンタンパク質ｐ５３は細胞分割の調節で必須の役割を果 たしておりそして細胞周期のＧ０期からＧ１期への移行に必要であることが示さ れている。ｐ５３は通常、正常細胞では非常に低い値で存在しておりそして腫瘍 サプレッサー遺伝子であると信じられている、ｐ５３が高い値で存在していると き、ｐ５３は形質転換や悪性で或る役割を果たすことが示されている。正常およ び悪性組織から得られるｐ５３遺伝子対立因子はBglII部位多形性を有している ことが示されている(Buchman et al.，1988， Gene 70:245)。ｐ５３コード化領域は幾つかのＧＡＧＡモチーフ、例えばブッフ マン（Buchman）等で発表された配列の１４７６位のＧＡＧＡＣ、１４９８位の ＧＡＧＡ、１６４３位のＧＡＧＡ、および１７１３位のＧＡＧＡを含有しており 、そしてこれらのモチーフは本発明によるフレームシフトＲＮＡの候補部位を提 示している。かくして、ｐ５３ＲＮＡ内のフレームシフト突然変異は天然ｐ５３ 腫瘍サプレッサー機能の喪失につながる可能性がある。ｐ５３内のこのような突 然変異の検出は前癌性または悪性の診断法となることができ、そしてｐ５３機能 を修正する本明細書に記載した治療法は腫瘍サプレッサー機能を回復させること ができる。 高齢者において高頻度で生じるII型真性糖尿病では、ランゲルハンス島が、多 分種々の転写物（例えば、ユビキチン転写物）におけるフレームシフト突然変異 の結果として退行変性する。 本発明はまた、ＲＮＡ転写物を標的とすることによってフレームシフト突然変 異を生じさせる１つまたはそれより多くのＧＡ、ＧＴまたはＣＴ欠失を有する少 なくとも１つのＲＮＡによって引き起こされる疾病と闘う方法も包含する。かく して、本発明に従って、ＲＮＡ内のフレームシフト突然変異を、突然変異ＲＮＡ 配列に特異性を有するリボザイムを使用して開裂させ（Denman等、Arch．Of Bio chem．Biophysics．３２３、７１〜７８、１９９５年）そして突然変異ｍＲＮＡ を除去して、フレームシフトしたＲＮＡ値を修正できることも意図されている。 それ故、フレームシフトしたＲＮＡに関連した疾病は適当なリボザイムまたは該 リボザイムをコードする配列を患者に投与することによって治療される。 選択された特異性を有するリボザイムはサレンジャー（Sullenger）およびセ ック（Cech）、Nature ３７１：６１９〜６２２、１９９４年）（これは本明細 書に参照して組み入れる）が記載したようにして製造することができる。リボザ イムやリボザイムをコードする配列はタッシュル（Tuschl）等、Curr．Opin．St ruc．Biol．５:２９６、１９９５年およびワール（Wahl）等、Curr．Opin．Stru c．Biol．５:２８２、１９９５年が記載したようにして調製することができる。 ることができる。 本発明はまた、フレームシフトしたＲＮＡを含有する標的細胞に相補的オリゴ ヌクレオチドまたは相補的オリゴヌクレオチドをコードする配列を送達すること によって、フレームシフトを生じさせる１つまたはそれより多くのＧＡＧＡまた はＣＴＣＴ突然変異を有する少なくとも１つのＲＮＡによって引き起こされるか またはこれに関係のある疾病を治療する方法も包含する。上記オリゴヌクレオチ ドはＧＡ、ＧＴまたはＣＴ欠失を含有する突然変異ＲＮＡの領域に関して突然変 異配列を有しており、そしてその結果突然変異ＲＮＡとインビボでハイブリッド を形成してこのようなＲＮＡの転写不能化に寄与することができる。強い標的部 位結合親和性、即ち十分な標的部位相同性を有するオリゴヌクレオチドが好まし い。ヌクレオチドの長さが１０から３０個の間でありそしてＣＴＣＴ、ＣＴＣＴ Ｇ、ＣＴＣＴＣ、ＣＴＣＴＴ若しくはＣＴＣＴＡモチーフまたはＧＡＧＡ、ＧＡ ＧＡＧ、ＧＡＧＡＣ、ＧＡＧＡＴ若しくはＧＡＧＡＡモチーフを含有するオリゴ ヌクレオチドも好ましい。 本発明による疾病の治療法は以下に記載されており、そして投与される物質の 調製および疾病を患っている患者に該物質を本発明に従って投与することを含ん でいる。本明細書で使用するとき、「物質」とは次の任意のものを言う、リボザ イム、リボザイムをコードしている核酸配列、野生型転写物、アンチセンス突然 変異ＲＮＡ若しくはＤＮＡまたはアンチセンス配列をコードしている核酸配列、 野生型遺伝子によってコードされている野生型タンパク質、フレームシフトした （ナンセンス）タンパク質に特異的な抗体。 本発明による疾病の治療法は次のようにして達成することができる。実施例５ では、本発明に従ってリボザイムを使用する治療法を記載する。 実施例６では、ベクターの投与を記載する。実施例７では、タンパク質、リボ ザイムまたはリポソームを使用する核酸ベクターの投与を記載する。実施例８で は、血液−脳関門を通過するこれら物質の送達を記載する。最後に、実施例９で は、タンパク質、リボザイムまたは他の核酸、例えば遺伝子発現構築物を有する ベクターを含んでいる細胞の送達方法を記載する。実施例５ リボザイムを使用する本発明による治療法 フレームシフトしたＲＮＡの選択的除去を行うかまたは促進するリボザイムま たはリボザイムをコードする核酸配列の調製および送達は次のようにして実施す る。 本発明による突然変異転写物の選択的除去 かくして、本発明は、β-ＡＰＰおよびユビキチンＢ遺伝子中のＧＡＧＡまた はＣＴＣＴモチーフにおいてまたはこれらに近接して生じる転写背信の結果であ るフレームシフトしたｍＲＮＡの転写によって引き起こされる疾病の治療方法も 包含する。これらのメッセージによってコードされる異常なタンパク質の蓄積が アルツハイマー病の進行に寄与すると信じられている、それ故、突然変異転写物 の除去は治療的に価値がある。本明細書に記載した突然変異転写物が、本明細書 に記載したようにして設計されそして投与されるリボザイムを使用するリボザイ ム介在性開裂によって細胞内で翻訳不能にされることも本発明によって意図され ている。加えて、或る状況下ではリボザイムで開裂されたメッセージを、野生型 タンパク質をコードする外来性転写物で置換することが有利であることもあり、 その際該転写物は開裂抵抗性であり、そしてそれ故その合成は、本明細書に記載 した突然変異転写物を産生するような転写エラーまたは転写後修正に付されない 。 細胞内のユビキチンＢおよびβ-ＡＰＰ突然変異転写物を選択的に除去するた めの治療方策を以下に記載する。しかしながら、本発明は以下に記載する方法に 従って他の突然変異転写物を、これらが本明細書に開示されていようと、後にな って発見されようと、選択的に除去することも意図している。 ハンマーヘッドクラスのリボザイムは知られている最小のものであり、そして インビトロ合成および細胞への送達の両方に役立つ(Sullivan，J．Invest．Derm atol．103:85S〜98S，1994;Usman et al.，Curr．Opin．Struct．Biol．6:527〜 533，1996によって要約されている)。ハンマーヘッド開裂標的には配列モチーフ ＵＨ（式中、ＨはリボヌクレオチドＡ、ＵまたはＣを示すが、Ｇは 示さない）を含んでいることが必要であり、そしてこの配列はＨの後で開裂され る。ハンマーヘッドリボザイムのコア機能ユニットは、ヘリックスＩ（これは開 裂部位の３'ｍＲＮＡ配列とハイブリッドを形成する）、ヘリックスII（開裂反 応に介在する２２個のリボヌクレオチド触媒ドメイン）およびヘリックスIII（ これはＵＨ開裂モチーフの５'配列および該モチーフの「Ｕ」を含んでいる５'配 列とハイブリッドを形成する）から構成されている３分節構造である(Haseloff and Gerlach,Nature 334：585〜591，1988年;Ruffner et al.，Biochemistry 33 :10695〜10702，1990)。研究によって、ヘリックスＩおよびIIIの長さは、リボ ザイムが開裂部位周囲の領域に結合し且つ開裂後にリボザイム自体を該領域から 放出する効率と比例することが示された、前者は標的の認識に重要であり、一方 後者は真の触媒活性、即ち不活性化された標的分子対リボザイムの比率をアンチ センス-ＲＮＡ介在性の不活性化で観察される１：１の化学量論的比率以上に高 める触媒活性を示す動力学の維持に重要である。理想的には、ヘリックスＩは、 ヘリックスIIIでの９〜１３個のリボヌクレオチドに対して３〜５個のリボヌク レオチドの長さである（Tabler et al.，Nucleic Acids Res．22:3958〜3965，1 994;Hendry andMcCall，Nucleic Acids Res．24:2679〜2684，1996)。他の因子 、例えば非結合リボザイムにおけるステムループ形成や標的ｍＲＮＡも反応動力 学やリボザイムの安定性において或る役割を果たしており、そしてこのような相 互作用を予測しそして／または相殺するために、多数のリボザイムデザインの分 子モデル作成試験やインビトロ試験がしばしば行われる(Sioud et al.，Nucleic Acids Res．22:5571〜5575，1994;Gavin and Gupta，J．Biol．Chem．272:1461 〜1472，1997)。 突然変異ユビキチンＢ転写物は、細胞に送達されるハンマーヘッドリボザイム をリポソームベクター内で適用することによってこれら細胞から除去することが できる。本発明は、これらリボザイムを使用して、５'部位の突然変異転写物を 認識してこれら転写物を転写中のポリメラーゼのずれの源になっているＧＡＧＡ またはＧＧＴ含有部位に開裂し、そしてそれによってこれらの欠陥メッセージの 翻訳産生物のフレームシフト部分を細胞から除去することを含んでい る。 ユビキチン転写物のＧＡＧＡモチーフの直前の配列はＧＣＧＵＣＵであり、そ してこれは開裂認識モチーフＵＣを含有している。上記で述べた長さに関する考 慮を所与のものとすると、特定の突然変異に対してヘリックスＩで理想的に結合 される配列はＧＡＧである、しかしながら、このようなリボザイムは突然変異転 写物や野生型転写物と同等の効率で結合すると予期されるので、ヘリックスＩは ４個のヌクレオチドを更に含むように延長し、その結果７個の塩基は全て突然変 異転写物とハイブリッドを形成するが、野生型配列との結合を不安定にする程十 分なミスマッチを生じさせるようにしなければならない。この方策は突然変異転 写物が挿入によってというよりはむしろ欠失によって生じている場合に一層効率 的である。何故なら、前者においては標的放出に与えるヘリックスＩの絶対的な 長さの効果が関心事になる、しかしながら、リボザイムの効率的な結合を阻害す る程野生型配列と十分にミスマッチしているユビキチンの場合には、ＧＡＧＡモ チーフまたはＧＧＴ配列の不正確な転写から生じ得る種々の突然変異配列と相補 的な種々に設計されたリボザイムのプールを送達すると、大部分の欠陥メッセー ジのフレームシフト産生物は翻訳されないであろう。 このような方策は、開裂部位が開裂部位の５'側まで１個から（せいぜい）５ 個の塩基である状況下で実用的である、しかしながら、距離が長ければ長いほど それに応じてより長いヘリックスＩ結合ドメインが必要であり、そしてこれによ って、突然変異転写物と野生型転写物間の識別に３'ミスマッチを創製する必要 性と相俟って、このような手法が或る種の突然変異を取り扱うのに不適切となっ ている。これはβ-ＡＰＰのＧＡＧＡ-欠失転写物に当てはまる。１つのＧＡＧＡ モチーフは１個の塩基で開裂部位から分離されているが、残りの４つのモチーフ は最も近い５'開裂部位から７個と２０個の塩基の間にある。このような場合に は、ハンマーヘッドリボザイムによる野生型転写物の開裂も回避できないので、 開裂抵抗性の転写物による置換を突然変異転写物の除去と同時に行われなければ ならない(開裂抵抗性の転写物を生じさせる可能性のある配列 置換体については表１０参照)、ここで、リボザイムは最初のＧＡＧＡモチーフ の任意のＵＨ５'部位で両タイプのメッセージを開裂するように設計されている 。 β-ＡＰＰ転写物が必要な全ての細胞でβ-ＡＰＰ転写物を置換することが有利 であると思われる、それ故、β-ＡＰＰプロモーター配列によって駆動される、 スプライシングされたβ-ＡＰＰミニ遺伝子を有する発現ベクターの同時送達を 使用することができる。このプロモーターに関して多数の研究が行われており（ なかでも、Lahiri and Robakis，Brain Res．Mol．Brain Res．9:253〜257，199 1年;Bourbonniere and Nalbantoglu，Brain Res．Mol.Brain Res．19:246〜250 ，1993年;Lukiw et al.，Brain Res．Mol．Brain Res．22:121〜131,1994年;Lah iri and Nall，Brain Res．Mol．BrainRes．32:233〜240，1995年;Bourbonniere and Nalbantoglu，Brain Res．Mol．BrainRes．35:304〜308，1996年;Quitschk e et al.，J．Biol．Chem．271:22231〜22239，1996）、そして組織培養中の細 胞型特異的プロモーター活性には転写開始部位に対して５'の９６塩基対で十分 であることが証明されている(Quitschke and Goldgaber，J．Biol．Chem．267:1 7362〜17368，1992)。これらの９６塩基対は、リボザイム認識部位で改変されて 置換β-ＡＰＰ転写物の開裂を防止し、そしてＧＡＧＡモチーフで改変されて最 初に突然変異転写物を産生するような転写機構のずれを阻止するように操作され たミニ遺伝子と融合することができる、これらの置換は、各々の場合において翻 訳上の「サイレント」突然変異が導入されるように実施されなければならない。 このような変更の例は表１０に示されている。 実施例６ 核酸ベクターの調製 リボザイムをコードする配列若しくは突然変異ＲＮＡの野生型のもの、または アンチセンス（相補的）突然変異オリゴヌクレオチド配列は所望の哺乳類細胞内 で発現させるために適当なベクター中にクローン化することができる。このよう なベクターは標的細胞型で発現されるプロモーターを含んでおり、そし て更には所与の細胞型で発現させるために選択されたエンハンサーや遺伝子座調 節領域を含んでいることもできる。本発明による有用なベクターの例には、標的 哺乳類細胞にコード化配列を成功裏に伝達させる任意のベクターが含まれるがこ れに限定されない。核酸は、ウイルス性（例えば、アデノウイルス性またはレト ロウイルス性）または非ウイルス性ＤＮＡ若しくはＲＮＡベクター（その際、非 ウイルス性ベクターにはプラスミド、直鎖核酸分子、人工染色体およびエピソー ムベクターが含まれるがこれらに限定されない）を使用して本発明で使用するた めにトランスフェクションすることができる。異種遺伝子の発現は、プラスミド ＤＮＡを筋肉(Wolff J.A．et al.，1990年，Science，247:1465〜1468;Carson D .A．et al．米国特許第５,５８０,８５９号）、甲状腺(Sykes et al.，1994;Hum an Gene Ther．5:837〜844)、メラノーマ(Vile et al.，1993年，Cancer Res.,5 3 :962〜967)、皮膚(Hengge et al.，1995，Nature Genet.，10:161〜166)、肝臓 (Hickman et al.，1994，Human Gene Therapy，5:1477〜1483)内に注入した後や 気道上皮(Meyer et al.，1995，Gene Therapy，2:450〜460)の暴露後に観察され た。 例えば、レトロウイルス遺伝子伝達ベクターＳＡＸ(Kantoff et al.，Proc．N at．Aca．Sci．83:6563，1986)を使用して標的細胞内に選択されたコード化配列 を挿入することができる。ＳＡＸは、レトロウイルスＬＴＲから開始するneoR遺 伝子と内部ＳＶ４０プロモーターから開始するヒトＡＤＡ遺伝子を有するモロニ ーウイルスに基づくベクターである。かくして、ＳＡＸベクターは、例えばＳＡ Ｘベクター内のｈＡＤＡコード化領域を所望のコード化領域に置換することによ って、リボザイムのコード化配列若しくは野生型ＲＮＡ、或いは本明細書に記載 されたようにして同定される選択されたアンチセンス配列を含有するように当該 技術分野の熟練者が操作することができる。 選択されたリボザイムをコードするかまたはコードするように操作することが できる発現ベクターは当該技術分野で知られている。Yuyama et al.，Nucl．Aci ds Res．22:5060，1994、は幾つかのリボザイムをコードしている多機能発現ベ クターを記載している。このベクターは、選択されたリボザイム配列をベ クター内の１つまたは両リボザイム配列に置換することによって選択された特異 性を有するリボザイムをコードするように適合させることができる。Zhou et al .，Gene 149:33，1994;Yamada et al.，Virology 205:121，1994はＴ細胞内への リボザイム配列のレトロウイルス形質導入を記載している。これらのレトロウイ ルスベクターは選択されたリボザイム配列をコードするように適合させることが できる。Liu er al.，Gene Therapy 1:32，1994;Lee et al.，Gene Therapy 2:3 77,1995は本発明によって意図されている任意の核酸配列の発現に使用するのに 適合できる発現ベクターを記載している。 一般的に、核酸分子は投与量製剤に適合した態様で、そして予防的におよび／ または治療的に有効であるような量で投与される。最終産生物（例えば、アンチ センスＲＮＡ分子またはリボザイム）を直接投与するとき、投与すべき投与量は 細胞当たりで必要な量およびトランスフェクションすべき細胞数と正比例し、補 正係数はこれら分子の取込み効率である。遺伝子を核酸分子から発現させなけれ ばならない場合、コードされている産生物の適当な値を生じさせる標的細胞当た りの核酸分子数の算出においては、関連した転写調節配列の強さも考慮しなけれ ばならない。遺伝子発現構築物を投与する場合、適当な投与量範囲は単回投与量 では０.５〜１μgまたは１〜１０μg、或いは任意に１０〜１００μgの核酸のオ ーダーである。１mgまでの投与量が有利に使用できると考えられる。細胞当たり のモル当量数は構築物の大きさと共に変動するので、それに応じて使用されるＤ ＮＡの絶対量を調節して、大きな構築物を注入するときには適当な遺伝子コピー 数を確保するようにしなければならないことに注意されたい。 本発明に従って投与される核酸分子は、例えば、水、リン酸緩衝生理食塩液ま たは生理食塩液のような生理学的に許容され得る希釈剤中で処方することができ 、そして更にアジュバントを含めることができる、しかしながら、他の製剤を有 利に使用できることも意図されている。不完全フロイントアジュバント、リン酸 アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバンのようなアジュバントは当 該技術分野で周知の材料である。本明細書に記載した核酸分子は局所 的または全身的のどちらかで投与することができる。薬理学的組成物を局所的お よび全身的に投与する方法は共に当該技術分野で良く知られている。 本発明で使用される核酸構築物は単回または多数回投与量で投与することがで きる。多数回投与量スケジュールは、投与初期コースが１〜１０回の別個の投与 量を含んでいることができ、そしてトランスフェクションされた核酸の細胞値の 維持および／または増強に必要なその後の時間間隔で投与される他の投与量が続 くというものである。このような間隔は治療用核酸に対する受容者の必要性の持 続、投与された核酸が受容者のゲノム内に組み込まれるようにならない場合には 該核酸が哺乳類細胞内で自己複製する能力および更新不能な核酸（例えば、自己 複製しない分子）の半減期に依存する。好ましくは、受容哺乳類の医学的必要性 によって核酸またはその産生物がその寿命中または少なくとも長期問、例えば１ 年またはそれ以上に亘って必要であることが決定されるとき、核酸は標的細胞内 で自己複製するベクター配列でコードされていることができる。核酸分子のトラ ンスフェクションとその後の維持の有効性は、トランスフェクションされた構築 物を更に含んでいることができるマーカー遺伝子の活性をモニターするかまたは 、問題の遺伝子でコードされているタンパク質か若しくは産生を阻害するように 設計されているタンパク質値の減少のどちらかを直接測定することによってアッ セイすることができる。これらのアッセイは、当該技術分野の熟練者に知られて いるような慣用の分子および生化学的技術を使用して実施することができる。 本発明の核酸分子を使用する治療法の成功は既知の臨床的指標（例えば、神経 退行変性疾病、認識または運動機能の喪失に関する）を評価して決定することが できる。被治療者におけるこのような症状の進行または（治療法が、疾病の危険 性があると信じられている患者で予防的に行われる場合）発現を、治療を受けて いない対照被験者で観察されるものと比較する、対照被験者と比較して、治療を 受けた患者の状態の改善が観察される場合、治療法は有効であると判断される。 このような評価を行うことは正に当該技術分野の熟練者の知識の範囲内である。実施例７ 本発明によるリポソーム送達 物質は当該技術分野で知られている任意の送達手段を使用して本発明に従って 投与することができる。リポソーム送達を以下に記載する。本明細書に記載した 物質、例えばリボザイムを投与するために使用されるリポソームは種々のタイプ のものであることができ、そして種々の組成を有することができる。主要な制限 はリポソームが生存細胞に有毒であってはならないことおよび処置される細胞内 部にまでリポソームの内容物を送達しなければならないということである。 カルセインやＦＩＴＣデキストランの細胞質送達に介在するためにｐＨ感受性 リポソームを使用することが記載されている(Straubinger et al.，Cell 32:106 9〜1079，1983;Straubinger et al.，FEBS Letters 179:148〜154，1985参照） 。ｐＨ感受性リポソームに関する他の考察は、エイ．イー．サワーズ（A.E．Sow ers）によって編集されたネジャット ダズグネス（Nejat Duzgunes）等の「二価 陽イオンとプロトンによって誘導されるリン脂質小胞の融合」という題名の教本 セル フュージョン（CELL FUSION）、プレナム プレス（Plenum Press）、ニュ ーヨーク州、１９８７年、２４１〜２６７の１１章に見ることができる。Ellens e et al.，Biochemistry，23:1532〜1538,1984;Bentzetal.，Biochemistry，26: 2105〜2116，1987も参照。 リポソームは種々の大きさであることができ、そして内部および外部隔室を分 離する１つまたは幾つかの膜層を有していることができる。リポソーム構造にお ける最も重要な要素は、物質を送達するために僅か１個または２,３個のリポソ ームしか各細胞に入る必要がないように十分な量の酵素または核酸を隔離してい ること、そしてリポソームが破壊に対して抵抗性であることである。リポソーム 構造体には小さな単ラメラ小胞（SUVs、直径２５０オングストローム未満）、大 きな単ラメラ小胞（LUVs、直径５００オングストローム以上）および多重ラメラ 小胞（MLs）が含まれる。以下で示す実施例では、リボザイムを投与するためにS UVsが使用されるが、これらの方法は本明細書に記載し た任意の物質を投与するために適用することができる。 SUVsは分子量によって他のリポソームおよび取り込まれなかった酵素から単離 することができ、そしてモレキュラーシーブクロマトグラフィー（この方法は正 確であるが時間がかかりそしてリポソームを希釈する）または微分遠心法（この 方法は迅速であるがより広範囲の大きさのリポソームを生じさせる）によって他 のリポソームや取り込まれなかった酵素から単離することができる。 リポソームは天然および合成リン脂質、糖脂質、ならびに他の脂質および脂質 同属体、コレステロール、コレステロール誘導体および他のコレステロール同属 体、膜に正味電荷を付与する荷電種、リポソーム形成後に更に分子をリポソーム 膜と結合させるように反応し得る反応性種、ならびに化学的または生物学的活性 を有する他の脂質可溶性成分から製造することができる。 本発明による有用なリポソームは、例えば、リボザイムを含有するリポソーム の調製を記載している米国特許第５,２９６,２３１号に記載されているようにし て調製することができるが、本発明による有用なリポソームは本明細書に記載し た物質の任意のものを含有できることに留意しなければならない。簡単に言えば 、リン脂質成分をリボザイム（または所望の物質）を含有する水性成分と小胞が 形成される条件下で組み合わせることによって。リン脂質の濃度はラメラ構造体 を形成するのに十分なものであり且つ水性成分は酵素の生物学的安定性と適合可 能でなければならない。リン脂質をガラス上に組み合わせそしてその後小胞を形 成させる方法には:リン脂質をガラス上に乾燥させ、そしてその後これらを水性 成分中に分散させ、揮発性または非揮発性有機溶媒に溶解したリン脂質を前以て 加熱した上記水性成分中に注入し、そして界面活性剤を使用してリン脂質を水性 層に溶解し、そしてその後透析して界面活性剤を除去する、ことが含まれる。水 性成分中のリボザイムの濃度は、この酵素を乾燥リン脂質上に凍結させ、次いで この混合物を、水性緩衝液の量を少なくして再度水和して高めることができる。 SUVsは上記混合物を音波処理するかまたは小孔管若しくはフレンチプレス（Fren ch Press）の小孔を通して分散させることによって上記混合物から製造すること ができる。 リポソームに取り込まれたリボザイムは生存細胞に内部的にまたは局所的に投 与することができる。動物またはヒトの内部に投与するためにはリポソームは発 熱物質不含で且つ無菌でなければならない。発熱物質を排除するためには、化学 品、酵素および水を含めて全て発熱物質不含の原料を使用してリポソームを形成 する。滅菌は０.２ミクロンのフィルターでリポソームをろ過して実施すること ができる。注射用には、リポソームは無菌の発熱物質不含緩衝液中に生理学的に 有効な濃度で懸濁する。局所投与でもリポソーム製剤は発熱物質不含でなければ ならず、そして無菌であることが望ましい。この場合には、たとえ皮膚に適用す るためであっても、生理学的に有効な濃度のリポソームは緩衝化した高分子グリ コールゲル中に懸濁することができる。一般的に、ゲルはリポソーム膜を破壊す る可能性のある非イオン性界面活性剤を含んでいてはならない。リポソームを局 所的に適用するために他の小胞を使用することもできる。 最終調製物中の物質の濃度は広範囲に亘って変動することができ、典型的な濃 度は５０μg/mlのオーダーである。ｐＨ感受性リポソームの場合には、より低濃 度の物質を、例えば、細胞に内部的に投与されるリポソームでは０.０１〜１.０ μg/mlのオーダーで使用することができる。局所適用の場合には、より高いリポ ソーム濃度、例えば１０倍またはそれ以上高い濃度を使用することができる。 実施例８ 血液−脳関門を通過する投与 投与された材料が血液−脳関門を通過するように、本明細書に記載した物質若 しくはそのコード化配列、またはこのような物質を含有するリポソームを個体に 投与することが本発明に従って望ましい場合、幾つかの方法が当該技術分野で知 られている。 例えば、投与すべき物質は、これがタンパク質であれ、核酸であれ、またはリ ポソームであれ、ポリペプチド、例えば血液−脳関門における透過性を高める親 油性ポリペプチドと同時に投与することができる。このようなポリペプチドの例 にはブラジキニンおよびレセプター介在性透過剤、例えば米国特許第５, １１２,５９６号および第５,２６８,１６４号に記載されているＡ−７またはそ の立体配座類似体が含まれるが、これらに限定されない。透過性ポリペプチドに よって、同時投与されたリボザイム、コード化配列またはリポソームは血液−脳 関門を貫通することができ、そして脳の脳脊髄液隔室に到達することができ、そ してそこでリボザイムまたはコード化配列はその後標的ニューロン細胞に達しそ して該細胞内に入ることができる。或いは、投与される物質はステロイド系エス トロゲルまたはアンドロゲルとカップリングさせてステロイドレセプターとの結 合を高め、そしてその結果脳に接近することができる。 リボザイム、抗体、核酸またはこのような分子を含有するリポソームのような 物質を本発明に従って投与するもう１つの代表的な方法には、米国特許第５,１ ８２,１０７号に記載されているように、投与される物質と、トランスフェリン レセプターと反応性の抗体との間でコンプレックスを形成することが含まれる。 このコンプレックスは開裂可能であるかまたは開裂不可能なリンカーを含んでい ることができ、そして脳の毛細管内皮細胞上で抗体とトランスフェリンレセプタ ーとの結合が生じる条件下で投与されるので、上記物質は活性形態で血液−脳関 門を通過して伝達される。 実施例９ エクスビボ治療法 インビボ治療法（即ち、細胞による取込みおよびその後のインシトゥ発現用に 核酸を患者に直接投与する治療法）だけでなくエクスビボ治療法（即ち、インビ トロで培養されるかまたは移植された細胞に核酸を投与し、そしてトランスフェ クションされた細胞を引き続いて臨床患者に移植して治療用産生物を供給する治 療法）に使用するためにも治療用核酸を投与することができる。エクスビボ遺伝 子療法の方法は本明細書で詳細に記載する。これらの方法によって、形質転換さ れるかまたはトランスフェクションされた細胞が哺乳類のような多細胞宿主に投 与された（例えば、移植によって）後にこのような細胞内で依然として維持され ているプラスミドは上記宿主に遺伝子産生物を送達する。問題の遺伝子、特に治 療用遺伝子は移植された細胞によって発現され、そしてそれ によって必要なＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイム）または タンパク質を受容生物、特にヒトに提供することが意図されている。 当該技術分野で知られているような核酸トランスフェクション方法になじみ易 い細胞型を本発明に従って使用することができる。このような細胞には受容生物 と同一種の生物の細胞、または更には、再導入前にエクスビボ核酸トランスフェ クション用に受容生物自身から採取された細胞を含めることができる。このよう な自己由来細胞移植片は当該技術分野で知られている。１つの一般的な例は骨髄 移植のものであり、その際骨髄はドナーからかまたは臨床患者（例えば、高投与 量の電離放射線のような細胞毒性治療法を受けようとしている患者）から取り出 され、そしてその後注入して患者に移植され、その結果細胞は骨や造血系の他の 器官に再移住する。 ａ．細胞投与量 受容生物に投与するトランスフェクションした細胞の数は、生物に必要な治療 用または他の遺伝子産生物の絶対量をトランスフェクションした細胞が産生する 上記作用剤の平均的な量で割って決定される。定常状態のプラスミドコピー数は 、プラスミドに包含される問題の遺伝子の発現値（この値もその関係するプロモ ーターの強さおよび所与の宿主細胞背景におけるヌクレオチドおよび転写因子の 利用可能性によって決定される）と同様に、その複製起点の強さならびに宿主細 胞環境によって決定される因子、ヌクレオチドおよび複製酵素コンプレックスの 利用可能性に依存して変動することに注意されたい。その結果、問題の所与の遺 伝子の細胞当たりの発現値は受容体に細胞を投与する前に経験的に決定しなけれ ばならない。 細胞のトランスフェクションや移植の効率的な方法は当該技術分野で知られて いるが、これらの方法ではトランスフェクションされた細胞が不死であるという ことは保証されていない。加えて、導入遺伝子によってコードされる産生物に対 する受容生物の必要性は長い間に変動する可能性がある。これらの考慮事項から みて、細胞は、必要に応じて単回投与量または多数回投与量で投与できることが 意図されている。多数回投与量スケジュールは、投与初期コースが １〜１０回の別個の投与量を含んでいることができ、そしてトランスフェクショ ンされた核酸の細胞値の維持および／または増強に必要なその後の時間間隔で投 与される他の投与量が続くというものである。このような間隔は治療用遺伝子産 生物に対する受容者の必要性の持続に依存する。好ましくは、受容哺乳類の医学 的必要性によって遺伝子産生物がその寿命中または少なくとも長期間、例えば１ 年またはそれ以上に亘って必要であることが決定されるとき、トランスフェクシ ョンされた細胞は、このような細胞が受容患者に永久的な態様で、例えば成功的 な骨髄細胞移植の場合に当てはまるような態様で移住し得ない限り、定期的なス ケジュールで、例えば月に１回または月に２回補充されよう。 ｂ．核酸投与量 トランスフェクションされた細胞内で複製し得る核酸ベクターが使用される場 合、このようなベクターの少なくとも１つのコピーを受け取っている細胞内では このベクターはコピー数の平衡が達成されるまで複製するので、移植前に細胞内 にトランスフェクションされる核酸の絶対量は決定的ではない。最初の概算とし て、トランスフェクションされる細胞当たり１から１０個の間のコピーと等価の ベクター量を使用することができる、当該技術分野の熟練者は、ベクター取込み を最適化するのに必要なプラスミド分子対細胞の比率を調整することができる。 本発明で特に使用されるベクターまたはトランスフェクション技術は、トランス フェクションされた細胞の染色体内への問題の遺伝子の安定した組込みを生じさ せ、その結果、受容多細胞生物、例えばヒトに移植した後にベクターを有してい る細胞に対する選択を維持する必要性を回避できるものである。 ｃ．自己由来または同系細胞の投与 単一種の個体間（または、或る個体から細胞培養系に取り出しそして同一個体 に戻すことであっても）に通常移植される細胞型は骨髄中に存在する造血幹細胞 （HSCs）の細胞型である、このような細胞は培養中に核酸トランスフェクション になじみ易いという利点を有しており、そしてそれ故、本発明で使用するのに正 に適している。HSCsの培養物は、オペレーター配列と問題の遺 伝子を含んでいる最小限のプラスミドでトランスフェクションされ、そしてこの トランスフェクションされた細胞はこの遺伝子産生物を必要としている受容哺乳 類に投与される。造血幹細胞のトランスフェクションはMannion-Henderson et a l.,1995，Exp．Hematol.，23:1628;Schiffmann et al .，1995，Blood，86:1218 ;Williams,1990;Bone Marrow Transplant，5:141;Boggs，1990，Int．Ｊ．Cell Cloning，8:80;Martensson et al.，1987，Eur．J．Immunol.，17:1499;Okabe e t al.，1992，Eur．J．Immunol.，22:37〜43;Banerji et al.，1983 Cell，33:7 29に記載されている。このような方法は本発明に従って有利に使用することがで きる。トランスフェクションされた細胞の投与は、以下で記載するように、トラ ンスフェクションされていない細胞の投与で確立された方法に従って進める。 例えば骨髄移植におけるような造血細胞の移植は当該技術分野で一般的に、ト ーマス（Thomas）等(1975，New England J．Med.，292:832〜843)によって記載 されているような方法およびその修正された方法で実施される。このような方法 は簡単に次のように要約される:同系移植片または免疫学的欠損を患っている患 者の場合には、免疫を抑制する前処置管理は必要でない、しかしながら、非自己 ドナーの細胞が応答免疫系を有する患者に投与される場合、免疫抑制医薬品、例 えばシクロホスファミド（５０mg/kg（体重）、４日間毎日、最後の投与量は移 植３６時間後）を投与しなければならない。白血病患者は、癌性血液細胞を除去 するために１０００ラドの正中線線量の全身照射を定型的に受ける、この照射も 免疫抑制効果を有している。前処置の後に、骨髄細胞（この集団は少数の多分化 能造血幹細胞またはHSCsを含んでいる）は注入して投与され、そしてその後、こ れら細胞は受容宿主の造血系に移住する。移植片の成功は、当該技術分野で周知 の免疫学的および分子的方法によって多数の成熟血液細胞型の再出現をモニター することによって測定される。理論的には１〜１０個ほどの少ないHSCsしか致死 的に照射された受容哺乳類に長期間移住し且つ再定住できない場合、ヒト骨髄移 植患者で再定住が生じる割合を最適にすることが有利である、それ故、治療的に 有効であるためには１０〜１００個、ま たは更には１００〜１０００個のHSCsを含んでいる移植骨髄試料を投与すベきで ある。 リンパ系細胞および実質細胞は共に本発明で使用されるように意図されている 。このような実質細胞にはランゲルハンス島、甲状腺、副腎皮質、筋肉、軟骨性 または他の滑膜組織、腎臓、上皮組織（特に、腸腔、肺、心臓、肝臓、腎臓、ニ ューロンおよび滑膜細胞の外部および内部上皮組織）、そして特に神経系が含ま れる。 受容生物による免疫拒絶に対して移植細胞を、少なくとも集合的に、抵抗性に するために、高い値の活性化されたＮＦκＢ（高いＮＦκＢ「セットポイント」 ）を発現する移植細胞が、これらは依然として自己免疫宿主リンパ球によって破 壊されるが、細胞殺害の速度を上回る速度で増殖するように強い増殖能力という 利点を享有し、そしてそれによって長期間生存する治療用細胞集団を受容生物に 提供することが意図されている。このような細胞は、自体トランスジェニック動 物であることができるようなドナーから取り出されたタンパク質抽出物を使用す る当該技術分野で周知の方法によって、インビトロ転写アッセイまたはＤＮＡ／ タンパク質結合アッセイで測定される高い値の活性化されたＮＦκＢを産生する 遺伝子発現構築物でトランスフェクションされているかまたは高い内在性ＮＦκ Ｂ活性で選択したドナーから得られた細胞であることができる。 ｄ．異種細胞と同種細胞の投与 受容生物と同様な種の個体または細胞培養系から得られる細胞のトランスフェ クションそしてそれに引き続いて移植を行うことができるが、別の生物（例えば 、良く特徴付けられた真核微生物、例えば酵母、この場合には、治療用遺伝子に よってコードされているタンパク質は適切にプロセシングされると思われそして 有用な複製起点が知られている）の細胞を使用して本発明を実施できることも同 等に当てはまる。このような場合には、一定の注意を払わなければならない。 第一に、タンパク質が問題の遺伝子によってコードされているとき、移植細 胞は受容生物に有用な形態でそのタンパク質を産生しなければならない。転写後 プロセシング（開裂およびグリコシル化パターンを含むがこれらに限定されない ）は、受容体の適切な機能と一致しなければならない。加えて、合成後に、例え ば移植細胞からの分泌、***またはエキソサイトーシスによって、問題のタンパ ク質またはＲＮＡ分子のどちらかが受容体に利用可能にならなければならない。 前者を扱うために、トランスフェクションされた細胞によって産生されたタンパ ク質はタンパク質化学の分野で周知の生化学的方法によって受容生物と同一種の 個体によって産生された天然タンパク質と定性的に比較することができる。後者 、即ち移植される細胞による問題のタンパク質の放出は、トランスフェクション された細胞から傾瀉された培養培地からかまたはこのような細胞が分離されてい る（即ち、遠心またはろ過によって）培養培地からタンパク質を単離し、そして 問題のタンパク質に向けられた抗体を使用してウエスタン分析を行ってアッセイ することができる。多数のタンパク質に対する抗体が市販で入手可能である、抗 体分子の産生に関する技術は当該技術分野で良く知られている。 第二に、細胞は受容生物による免疫拒絶から遮蔽されなければならない。この ような細胞は受容患者に特徴的な細胞表面マーカー（例えば、ＭＨＣ抗原）を発 現する構築物でトランスフェクションして、これら細胞に生化学的カモフラージ ュを提供できることが意図されている。 更に、発酵器のような人工的増殖環境かまたは受容生物中で増殖させるために 生存細胞培養物をカプセル化する方法が開発されており、そして本発明に従って トランスフェクションした細胞の投与においてはこのような方法を使用すること もできる。このようなカプセル化系によって免疫検出に対して細胞が見えなくな り、そして加えて、移植細胞と宿主生物環境間で材料（例えば、問題の遺伝子産 生物、酸素、栄養素および老廃物）の自由な交換が可能になる。 細胞カプセル化の方法やデバイスは多数の米国特許、なかんずく、第４,３５ ３,８８８号、第４,４０９,３１１号、第４,６７３,５６６号、第４,７４４,９ ３３号、第４,７９８,７８６号、第４,８０３，１６８号、第４,８９２,５ ３８号、第５,０１１,４７２号、第５,１５８,８８１号、第５,１８２,１１１号 、第５,２８３,１８７号、第５,４７４,５４７号、第５,４９８,４０１号(これ は特に細菌および酵母細胞のキトサン中でのカプセル化に向けられている)、第 ５,５５０,０５０号、第５,５７３,９３４号、第５,５７８,３１４号、第５,６ ２０,８８３号、第５,６２６,５６１号、第５,６５３,６８７号、第５,６８６, １１５号、第５,６９３,５１３号、および第５,６９８,４１３号に開示されてお り、そしてこれらの内容は全体として本明細書に参照して組み入れる。カプセル 化された細胞の上首尾な培養には典型的には、生物適合性の（即ち、カプセル化 した細胞と受容宿主の両者に寛容される）選択的透過性の外部被覆または「皮膚 」、ならびに、任意に、内部または上部に細胞が分散されており、その結果足場 依存性細胞自体が結合できる構造支持体および基質を提供するマトリックスが必 要である。本発明で使用するために適用できるカプセル化デバイスに関して、用 語「選択的透過性」とは、小分子（約５０,０００Ｍ.Ｗ.〜１００,０００Ｍ.Ｗ. までの分子を含む）は通過するが、より大きな分子、例えば抗体（概ね１５０, ０００Ｍ.Ｗ.）は排除される開口部を含んでいる材料を言う。適当な被覆材料に は多孔性および／またはポリマー材料、例えば、ポリアスパルテート、ポリグル タメート、ポリアクリレート（例えば、アクリルコポリマーまたはＲＬ(登録商 標、Monsanto Corporation)、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニリジエン、ポリ 塩化ビニル、ポリウレタン、ポリウレタンイソシアネート、ポリスチレン、ポリ アミド、セルロース系ポリマー（例えば、セルロースアセテートおよびセルロー スニトレート）、ポリメチル−アクリレート、ポリアルギネート、ポリスルホン 、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、ポリアクリロニトリルならび にこれらの誘導体、コポリマーおよび／または混合物、伸展ポリテトラフルオロ エチレン（米国特許第３,９５３,５６６号および第４,１８７,３９０号、これら は共に本明細書に参照して組み入れる）、伸展ポリプロピレン、伸展ポリエチレ ン、多孔性ポリフッ化ビニリデン、織若しくは不織繊維または糸集合物、例えば 「エンジェルヘア（Angel Hair）」(Anderson，Science，246:747〜749;Thompso n et al.，1989， Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，86:7928〜7932)、単独か若しくは組み合わせ た繊維マトリックス（米国特許第５,３８７,２３７号参照、これは本明細書に参 照して組み入れる）またはシリコン-酸素−シリコンマトリックス（米国特許第 ５,６９３,５１３号）が含まれるがこれらに限定されない。１０,０００〜３０, ０００、好ましくは１５,０００〜２５,０００、そして最も好ましくは１７,０ ００の分子量を有するポリリシンも本発明で有用である（米国特許第4,６７３, ５６６号参照）。或いは、本発明のトランスフェクションされた細胞を含んでい るマトリックス材料は、以下に考察するように、それ自身の外部被覆を形成する ように誘導する条件に付される。 米国特許第５,６２６,５６１号に記載されているように、このような被覆の選 択的透過性は多孔性ポリマー材料（例えば、進展ポリテトラフルオロエチレン） の間隙空間をヒドロゲル材料で飽和させて変化させることができる。ヒドロゲル 材料は多孔性ポリマー材料の空隙空間を実質的に全て、または該空隙空間の一部 分だけを飽和させることができる。例えば、多孔性ポリマー材料の内部表面に隣 接しそして／または該表面に沿った材料内部の連続帯で多孔性ポリマー材料をヒ ドロゲル材料で飽和させることによって、該材料の選択的透過性は該材料の外部 横断面領域から該材料の内部横断面領域まで鋭敏に変化させられる。多孔性ポリ マー材料中に飽和されるヒドロゲル材料の量と組成は移植用の細胞をカプセル化 するために使用される特定の多孔性ポリマー材料に大部分依存している。適当な ヒドロゲル材料の例には、単独または組み合わせたＨＹＰＡＮ（登録商標）構造 ヒドロゲル(Structural Hydrogel)(Hymedix International，Inc.、ニュージャ ージー州デイトン)、ＰＣＴ/ＵＳ９３/０５４６１（これは本明細書で参照して 組み入れる）中でドリアン（Dorian）によって教示されている非繊維形成誘導性 アルギネート、アガロース、アルギン酸、カラゲエニン、コラーゲン、ゼラチン 、ポリビニルアルコール、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ （Ｎ−ビニル-２-ピロリドン）またはゲランガムが含まれるが、これらに限定さ れない。マトリックスは典型的には、高い表面積対容量比を有しており、内部ま たは上部に細胞が増殖できそして液体が 通過できる孔または他の空間を含んでおり、加えて、適当なマトリックス材料は 受容生物に移植した後に安定である。好ましくは、マトリックスは多数の粒子、 繊維または薄層の集合を含んでいる。或いは、マトリックスは水溶液、例えば生 理学的緩衝液または受容生物から得られる体液を含んでいることができる（米国 特許第５,０１１,４７２号参照）。適当なマトリックス材料には、アミノ化した グルコ多糖（例えば、脱アセチル化キチン、またはカニ若しくは他の甲殻類動物 の粉末殻から調製されそして乾燥粉末として市販で入手可能な「キトサン」、カ タログ番号Ｃ ３６４６、Sigma、ミズーリー州セントルイス）、アルギン酸塩（ 米国特許第４,４０９,３３１号）、ポリ-β-１−５-Ｎ-アセチルグルコサミン（ ｐ−G1cNAc）多糖種（単独かまたはコラーゲンとのコポリマーとして処方されて いる、米国特許第５,６８６,１１５号参照）、再構成細胞外マトリックス調製物 （例えば、Matrigel（登録商標）、Collaborative Research，Inc.,マサチュー セッツ州レキシントン、Babensee et al.，1992年，J．Biomed．Matr．Res.,26 ：1401）、タンパク質、ポリアクリルアミド、アガロース等の液体、ゲル状、ポ リマー、コポリマーまたは微粒子製剤が含まれる。 このような材料を使用して細胞をカプセル化する方法は多種多様である。上記 した半透過性膜材料を含んでいるカプセル化デバイスを予め形成し、細胞を満た し（例えば、注入または他の手動手段によって）、そしてその後密封する（米国 特許第４,８９２,５３８号、第５,０１１,４７２号、第５,６２６,５６号、およ び第５,６５３,６８７号）ことができ、このような密封は効果的には永久的（例 えば、ヒートシール法を使用して）、半永久的（例えば、水性環境下で溶解また は分解しないエポキシのような生物適合性接着剤を使用して）または一時的（例 えば、離脱式キャップ若しくはプラグを使用して、またはバルブ若しくはコック 栓を閉めることによって）であることができる。永久的および半永久的に密封す る方法は米国特許第５,６５３,６８７号に開示されている。予め形成され、半透 過性の細胞容器の使用の変法としては、マトリックス材料中に懸濁された細胞と カプセル化デバイスの外部被覆を形成する物質を細胞／マトリックス混合物を生 じさせる条件下で一緒に押し出す方法であり、 細胞／マトリックス混合物を生じさせる条件下で一緒に押し出す方法であり、そ して該混合物は、このような押出し条件下で形成するかまたは架橋する半透過性 ポリマーの連続管に入れられるように液体または半液体（即ち、ゲル状）の形態 であることができる、このような押出し法によって僅か１個の細胞容器を有して いる（米国特許第５,２８３,１８７号）かまたは複数の別個の隔室に別れている （米国特許第５,１５８,８８１号）カプセルが形成される。両タイプの方法の変 法として、液体または半液体（即ち、ゲル状）細胞／マトリックス混合物の小滴 を、半透過性バリヤー（米国特許第４,７９８,７８６号および第５,４８９,４０ １号）を形成するマトリックス材料の外部層の「硬化」若しくは架橋を誘導する 物質中かまたはポリマー材料（またはそのモノマー）溶液（これは細胞／マトリ ックス小滴と接触して重合しそして／または架橋してその結果半透過性膜が上に 沈着する）（米国特許第４,３５３,８８８号、第４,６７３,５６６号、第４,７ ４４,９３３号、第５,６２０,８８３号、および第５,６９３,５１３号）中に懸 濁させる。 当該技術分野の熟練者は、適当なマトリックスおよび半透過性材料を選択しそ して上記した細胞−カプセル化デバイスを十分構築することができる。 このようなデバイスの移植は、最も安全で且つ最も適当と考えられる標準的な 技術によって、問題の遺伝子によってコードされる産生物を送達すべき解剖学的 位置の部位にまたはその近辺で外科的に達成される。このようなデバイスは、球 状、ペレットまたは他のカプセル形状、円盤、棒または管形状を含むがこれらに 限定されない好都合な形状を取ることができる、しばしば、デバイスの形状はそ の合成方法によって決定される。例えば、細胞懸濁物とポリマー被覆材料の共押 出しによって形成される形状は典型的には管状であり、一方マトリックス材料内 に細胞を含んでいる小滴上での被覆物沈着によって形成される形状は球状である と思われる。上記で考察したように、移植しなければならない（そしてそれ故、 カプセル化しなければならない）細胞数はトランスフェクションされた遺伝子の 産生物に対する受容生物の必要性に依存する。上記したカプセル化デバイスは典 型的には小さく（最も有用には、直径１０μm〜１mmで あり、その結果外部被覆物とマトリックスに最も深く埋め込まれた細胞との間の 物質の端から端への効率的な拡散が可能になる）、そしてこのようなデバイスは それぞれ１０個から１０10個の間の細胞を有することができるように意図されて いる。より多数の細胞の必要性が予期される場合、複数（２個、１０個または更 には１００個若しくはそれ以上）の上記インビボ培養デバイスを製造しそしてこ れらを所与の受容生物に移植することができる。 カプセル化細胞デバイスは永久的な設置を意図することができる、或いは、当 該技術分野の熟練者、例えば医者（医者は所与の細胞移植片が受容生物に有益な 期間を症例毎に決定しなければならない）の裁量で問題の遺伝子産生物の受容生 物への送達を終了させるためにしろ、または長期間（即ち、数カ月から数年）使 用した後デバイスに新たな細胞を補充するためにしろ、デバイスを回収すること がが望ましい場合がある。後者の目的で、移植デバイスは有用には、誘導ワイヤ ーのような回収補助器具および細胞容器に接近できるように開閉可能なキャップ または他の入口（これらは共に米国特許第４,８９２,５３８号に記載されている ）を含んでいることができる。 カプセル化した細胞の生存培養物は受容動物の組織に遺伝子産生物を送達する ために上首尾に使用されている。米国特許第４,６７３,５６６号は、カプセル化 したラットランゲルハンス島細胞を移植した糖尿病ラットにおいて正常な血糖値 を維持するのに成功したことを開示している、各々３,０００個の細胞を２回投 与すると６カ月間有効であり、一方１,０００個の細胞の単回投与量は２カ月間 有効であった。 同様に、カプセル化されたランゲルハンス島細胞の異種特異的移植は糖尿病を 首尾良く治療することが証明されている（イヌランゲルハンス島細胞をマウス受 容体に、米国特許第５,５７８,３１４号;ブタランゲルハンス島細胞をマウス受 容体に、Sun et al.，1992，ASAIO J.，38:124）。このような手法はヒトの真性 糖尿病の臨床的治療法に有望であると信じられている(Calafiore，1992，ASAIO J.，38:34)。 トランスフェクションされていない細胞に成功裏に適用されているこれらの 技術は、本発明で使用される治療用核酸分子でトランスフェクションされる細胞 で有利に使用することができる。 ｅ．受容生物における移植細胞の有効性アッセイ このように投与されたトランスフェクション細胞の有効性およびそれに引き続 くこれら細胞の受容宿主内での維持は、トランスフェクションされた構築物が追 加的に含んでいることができるマーカー遺伝子の活性をモニターするかまたは問 題の遺伝子によってコードされる産生物（例えば、タンパク質）か若しくは上記 産生物（アンチセンスメッセージまたはリボザイム）がその産生を阻害するよう に設計されているタンパク質値の減少のどちらかを直接測定することによってア ッセイすることができる。これらのアッセイは、当該技術分野の熟練者に知られ ているような慣用の分子的および生化学的技術を使用して行うことができるかま たは組織学的試料採取（即ち、剖検）および移植細胞若しくは器官の検査を含ん でいることができる。 トランスフェクションされた／移植された細胞内のベクターが有している問題 の遺伝子によってコードされる血液または標的組織中のタンパク質または核酸値 の直接的測定に加えて、問題の遺伝子が維持されている細胞の移植によって遺伝 子伝達を受けている患者の疾病状態の変化をモニターし、そしてこれらの変化を 、問題の遺伝子を欠失しているベクター構築物でトランスフェクションした比較 用細胞を投与されている患者の疾病の進行または持続と比較することができる。 他の投与量および投与様式 フレームシフト突然変異に関係のある疾病状態にある患者は、上記したように 、本発明に従って、インビボ、エクスビボまたはインビトロ方法で治療すること ができる。例えば、インビボ治療法では、リボザイム或いはリボザイム、野生型 ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ若しくはＤＮＡをコードしている核酸ベクターまた はアンチセンスＲＮＡをコードしている配列、またはハイブリッド野生型／ナン センスタンパク質の野生型のものを、好ましくは製薬的に許容し得る送達媒体お よび生物学的に適合可能な溶液中で、摂取、注入、吸入または他 の多くの方法によって上記患者に投与することができる。投与される量は患者問 で変動することができる、「有効投与量」は、伝達される遺伝子材料が機能を強 化する値を有害な副作用の危険性と比較考量して決定される。遺伝子発現および ／或いはコードされている突然変異ＲＮＡまたはタンパク質若しくはその対応す る「センス」タンパク質の存在または値のモニタリングが投与される投与量の選 択および調節の助けとなるであろう。一般的に、リボザイムのような核タンパク 質を含んでいる組成物は、医者によって決定されるような単回または多数回投与 量で、５０μg〜１mgの範囲内または１００μg〜５００μｇの範囲内で投与され よう。オリゴヌクレオチドを含んでいる組成物は、５ng〜１０μgの範囲内また は１００ng〜５００ngの範囲内で単回投与量で投与されよう。野生型ＲＮＡまた はベクターを含んでいる組成物は単回投与量で、上記配列の少なくとも１つのコ ピーが各標的細胞内に送達されるように１０ng〜１００μg／kg（体重）の範囲 内、好ましくは１００ng〜１０μg／kg（体重）の範囲内で投与されよう。タン パク質、例えばハイブリッド野生型／ナンセンスタンパク質の野生型のものを含 んでいる組成物は医者によって決定されるような単回または多数回投与量で、１ ０μg〜１mgの範囲内または１００μg〜５０μgの範囲内で投与されよう。上記 投与量の任意のものを、医者によって決定されるように、患者の体重に従って投 与することができる。 エクスビボ形質導入も本発明の範囲内で意図されている。細胞集団は患者から 取り出されるかまたは他の方法で提供され、本発明に従ってベクターを使用して 形質導入され、次いで患者に再導入することができる。患者に再導入された細胞 数はベクター伝達の効率に依存し、そして一般的には１０4〜１０6個の形質導入 された細胞／患者の範囲内であろう。 本発明に従ってエクスビボ遺伝子伝達の標的となる細胞にはベクターの送達が 望まれる任意の細胞、例えば、ニューロン細胞または幹細胞が含まれる。 本発明に従って投与されるタンパク質、核酸または細胞は好ましくは製薬的に 許容され得る担体物質、例えば、炭酸マグネシウム、ラクトースまたはミセルを 形成するリン脂質との混合物として投与され、そして上記担体とタンパク 質、核酸または細胞は一緒になって治療用組成物、例えば、哺乳類の経口投与用 のピル、錠剤、カプセルまたは液体を形成することができる。他の形態の組成物 、例えば、ドロップ若しくはスプレーとして経鼻的に投与し得る液体または静脈 内、非経口、皮下若しくは腹腔内に投与し得る液体も構想されている。投与され る物質は筋肉内投与用の生物分解性の放出持続製剤の形態であることができる。 有効性を最高にするためにゼロのオーダーの放出が望ましい場合、例えば移植可 能なまたは外部ポンプ、例えばインフセッド（InfusaidTM）ポンプ（Infusaid C orp、マサチューセッツ州）を使用することができる。 本発明による有用なキット 本発明は、本発明による疾病の診断または治療用のキットを包含する。 診断キットには適当な包装材料および１つまたはそれより多くの次の試薬:上 記で定義された核酸プローブおよびその相補的配列と結合したときプローブを検 出する任意の手段を含んでいる。例えば、核酸プローブは、例えば放射性標識、 蛍光標識等で標識することができ、または当該技術分野で周知の間接的標識化技 術によって、例えばビオチン／アビジン系を使用して検出することができる。 好ましくはキット形態の診断系は本発明の更にもう１つの実施態様を構成する 。この系は、免疫コンプレックスの形成によって細胞内でのハイブリッド野生型 ／ナンセンスタンパク質またはその誘導体の存在をアッセイするのに有用である 。この系は本発明の抗体を含有している少なくとも１つのパッケージを含んでい る。任意に、キットは陽性の組織試料対照を含んでいることもできる。 抗体はまた、ときには「標識」とも呼ばれる「指示基」と一緒に使用される。 この指示基または標識は、免疫反応が生じているかどうかを測定する手段、そし て場合によってはこのような反応の程度を測定する手段として抗体と一緒に使用 される。 用語「指示基」または「標識」は本明細書では抗体と結合しているかまたは別 々に使用される単一の原子および分子（これらの原子または分子が単独で使用さ れるにしろ、追加的な試薬と一緒に使用されるにしろ）を含むように使用 される。このような指示基または標識は免疫化学で自体周知であり、そしてこれ らは他の新規な抗体、方法および／または系と一緒に使用される限りにおいてだ け本発明の一部を構成する。 例えば、抗原特異的抗体または抗体フラグメントは酵素と結合させて検出可能 なように標識され、そしてＥＩＡまたはエリザ法（ELISA）で使用される。この 酵素は、順次、その後、例えば比色法、蛍光定量法または、最も好ましくは、可 視的手段によって検出することができる化学的部分を生じさせるようにして基質 に暴露される。基質は、裸眼で見える反応生成物を産生する色素原性基質である ことができる。 所望の検出可能な突然変異タンパク質に特異的な結合タンパク質を検出可能な ように標識するために使用できる酵素にはアルカリホスファターゼ、ホースラデ ィッシュペルオキシダーゼ、グルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ、スタフィ ロコッカスヌクレアーゼ、デルタ-Ｖ-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール デヒドロゲナーゼ、アルファ-グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオ ースホスフェートイソメラーゼ、アスパラギナーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレア ーゼ、カタラーゼ、グルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ およびアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。 結合タンパク質、例えば抗体を放射性標識することによって、ラジオイムノア ッセイ（ＲＩＡ）を使用して、固体支持体に結合した抗原を検出することができ る。放射性同位元素は、ガンマカウンター若しくはシンチレーションカウンター を使用するような手段によってまたはオートラジオグラフィーによって検出する ことができる。本発明の目的で特に有用な同位元素は：3Ｈ、131Ｉ、14Ｃ、そし て好ましくは125Ｉである。 第一または第二の結合タンパク質を蛍光化合物で標識することもできる。蛍光 標識した抗体を適当な波長の光線に暴露するとき、蛍光によってその存在を検出 することができる。最も一般的に使用される蛍光標識化合物にはフルオレセイン イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、 アロフィコシアニン、ｏ-フタルデヒドおよびフルオレスカミンがある。 第一または第二結合タンパク質は化学発光化合物と結合させて検出できるよう に標識することもできる。次いで、化学発光標識抗体の存在は、化学反応の経過 中に生じる発光の存在を検出することによって測定される。特に有用な化学発光 標識化合物の例はルミノール、イソルミノール、テロマチックアクリジニウムエ ステル、イミダゾール、アクリジニウム塩および蓚酸エステルである。 同様に、生物発光化合物を使用して第一または第二結合タンパク質を標識する ことができる。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める生物 学的系に見られる化学発光の１つのタイプである。生物発光タンパク質の存在は 発光の存在を検出することによって測定される。標識目的で重要な生物発光化合 物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエコリンである。 本発明にはまた、本発明で使用される診断用試薬、例えば核酸配列、プローブ および抗体分子および／または上記したような陽性組織対照、ならびに疾病の診 断または治療に使用されるような試薬を含んでいるキットも含まれる。 指示基または標識は好ましくは抗体と一緒に提供し、そして抗体と一緒に包装 するかまたは別々に包装することができる。ＨＲＰのような指示基を使用すると き、過酸化水素およびジアミノベンジジンならびに硫酸アンモニウムニッケルの ような追加的な試薬もこの系に含めることができる。このような材料は、多数の 指示基と同様に市販で容易に入手できるので、診断系と一緒に提供する必要はな い。更に、過酸化水素のような試薬のなかには放置すると分解するかまたはそう ではなくて放射性元素のように寿命の短いものもあるので、最終ユーザーによっ てより良好に提供される。 他の実施態様 本発明は説明のためにだけ記載されていることが理解されよう。本明細書に記 載した実施態様に加えて本発明の他の多数の実施態様は、下記請求の範囲で定義 されている本発明の範囲から離れることなく、本明細書でなされた説明から当該 技術分野の熟練者に明白であろう。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                            Diagnostic methods and reagents Background of the Invention   The present invention is based on transcription mutations that cause frameshift mutations in RNA molecules. The present invention relates to a method and a reagent for diagnosing a disease associated with or associated therewith. The diagnostic method Collects a body fluid or tissue sample from a patient and RNA molecule having a mutation or a protein encoded thereby Analyzing the presence or absence of the mutated RNA molecule or The presence of the encoded protein is a sign of disease.   It is an object of the present invention to detect diseases involving transcriptional mutations, in particular diseases related to aging. To provide methods and assays and / or treatments, The likelihood increases with the age of the patient. The present invention relates to sudden changes in RNA molecules of cells. It is intended to detect and / or treat age-related diseases caused by mutations. If the mutation is not corrected, it leads to the disease.   A further object of the present invention is to treat the diseases identified according to the present invention. Enzymes or oligonucleotides for patients suffering from or susceptible to the disease Providing correctives such as tide.   It is a further object of the present invention to provide a method for treating said disease and nucleotide sequence mutations. To provide a method for identifying an age-related disease by associating with a spot It is.   Another object of the invention relates to the identification, detection and treatment of the following age-related diseases: cancer (Among others, non-hereditary cancers) and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (A D), Down syndrome, frontal dementia (Pick's disease), progressive supranuclear palsy (PSP) and Other diseases with multiple tau-positive filamentous lesions (eg, cortical basal degeneration, boxer dementia, Dementia with fiber concentrate alone, dementia with fiber concentrate and calcification, phosphorous on chromosome 17 Frontotemporal dementia with Parkinson's disease, gerstmann si with fiber concentrate Neutroisler-Scheinka disease, myotonic dystrophy, Niemann-Pick disease type C, Parkinson's dementia complex in Guam, sequelae Parkinson's disease of encephalitis, and Acute sclerosing panencephalitis), Parkinson's disease (PD), amyotrophic lateral sclerosis, hunting Ton's disease, multiple sclerosis, dementia with Lewy bodies, multiple system atrophy, ubiquitin Other related inclusion body diseases (eg, Alexander disease, alcoholic liver disease, moss Amyloidosis, and aging marinesco and vitreous inclusions), type II diabetes And other degenerative diseases such as cardiovascular disease and rheumatoid arthritis. Effective cure Early diagnosis of the disease is important for treatment.   Alzheimer's disease is often an age-related disease. AD is the cerebral cortex, Neuronal atrophy in the subcortical area and hippocampus, and plaques, dystrophic axons, It is characterized by the presence of retinal and neurofibrillary tangles. In most cases, AD Is due to a genetic abnormality, an environmental factor, or both? I don't know. Pathogenic mutations are unknown.   It is a further object of the present invention to provide a method for the definitive diagnosis of AD in surviving patients. To provide a diagnostic test method. In addition, AD is a progressive disease, It is desirable to diagnose AD as early as possible so that corrective measures can be taken.   A number of diagnostic methods have been proposed for AD diagnosis, most of which are β- It focuses on the amyloid precursor protein. For example, U.S. Pat. 666,829, 4,816,416, and 4,933,159. No. However, β-amyloid deposits are not present in individuals showing no signs of dementia, especially It is also found in aged people (J. Biol. Chem.,265Pp. 15977, 199 0, and Tables 3-5). Therefore, diagnostic tests based on β-amyloid protein The test lacks specificity for AD.   In U.S. Pat. No. 4,727,041, somatoto following L-dopa administration precursor activity test Describes a diagnostic test method for AD based on measurement of serum levels of robin and somatomedin-C are doing.   In International Patent Application WO 94/02851, paired helical filaments are Levels of paired helical filaments in the cerebrospinal fluid using compatible antibodies A method for identifying AD in order to quantify is described. Spiral spiral Claims that the presence of filament is a sign of AD.   Other diagnostic methods are based on the identification of “disease-specific marker proteins” in cerebrospinal fluid. Is based on In International Patent Application WO 95/05604, for example, five disease-specific Proteins are identified by their molecular weight. However, the specificity of the protein The nature is unknown, and its specific association with AD etiology is also unknown. Therefore, five types “Disease-specific marker proteins” are more basic cellular or biochemical alterations. May exist as a result of the transformation.   A further object of the present invention is a method which can preferably detect AD early in the disease state It is to provide. Desirable is directly responsible for the disease Or early or not involved in the pathogenesis of the disease, Nevertheless, it is produced directly or indirectly by the mechanism responsible for the disease. To detect proteins or substances. Such proteins or substances are It is the "causal" agent of the disease and, in the context of diagnosing the condition, Yes. "   Recently, Sherrington et al. (Nature,375254-260 P. 1995) identified a gene with a missense mutation on chromosome 14. , The mutation is associated with up to 33% of autosomal dominant early-onset AD cases (Table 1). . A missense mutation refers to a substitution of a nucleotide, usually a single nucleotide. , Thereby leading to an amino acid substitution at the corresponding codon. Shirley Disclosed the missense mutations encoded at the following positions: Predict that amino acids change: (numbered from first putative start codon) Met to Leu at codon 146; His to Arg at codon 163; Ala at codon 246 Glu et al .; Leu to Val at codon 286; Cys to Tyr at codon 410. These suddenly It has been proposed that the mutations would be useful in identifying early onset AD. As mentioned above In addition, the majority of AD cases are late-onset (after age 65; Table 1), and thus There is still a problem in identifying the majority of affected individuals, especially late-onset AD.   These diseases occur at the RNA level and not at the DNA level There is no evidence. Thus, prior art methods of detection provide for mutated DNA or mutated D For proteins encoded by NA, It does not indicate the presence of a transmutation.   Currently, there are a number of substances that claim to be useful in treating AD. But these The success achieved with this material is also very limited. Effectively treat AD and A method to prevent and / or prevent is still needed (Allen and Burns Burns), Journal of Psychopharmacology,943-56, 1995. ).   Summary of the Invention   The present invention includes frameshift mutations and encodes the corresponding mutant protein. It is based on the observation that the encoding RNA molecule correlates with the presence of a disease.   According to the present invention, one or more mutations that cause a frameshift mutation Methods for diagnosing diseases caused by or related to different RNA molecules Provided, wherein the method comprises the steps of (a) obtaining a body fluid or tissue sample from a patient; Which biological sample was taken and (b) a frameshift mutation was RNA molecules or muteins encoded thereby Analyzing the presence or absence of the mutated RNA molecule or sudden Naturally, the presence of the mutant protein is a sign of disease.   A “mutated” protein is a polypeptide encoded by a mutated mRNA. A peptide, at least a portion of which is in its original form with respect to the initial start codon. Is in a reading frame that deviates from that of the wild-type reading frame, and as a result, the wild-type gene The unusual carboxy terminal portion encoded by the +1 or +2 reading frame of the column One protein. Thus, the mutant protein is hybridized. Wild-type / nonsense protein, which protein has The amino-terminal amino acid sequence is encoded by a wild-type (O) reading frame; The xy-terminal amino acid sequence is encoded by a +1 or +2 reading frame, and This is the nonsense portion of the mutein. Wild type and nonsense The point of overlap between the amino acid sequences is the codon containing the frameshift mutation.   The present invention relates to the presence of such a mutant protein in tissue from an affected individual. Or the accumulation of one or more muteins, Based on the discovery that the mutein is identified as a sign of the disease I have. In addition, the present invention provides that mutations that result in muteins occur at the RNA level. This is based on the finding that it does not occur at the DNA level.   "Cause or related" means that the RNA molecule is Either all or some causes, or RNA molecules may be the cause of the disease Not used, but used in the context of diagnosing a medical condition.   At least one having one or more mutations that cause a frameshift mutation Diseases caused by or related to one RNA molecule are the following diseases: Is a non-hereditary cancer, a neurodegenerative disease such as Alzheimer's disease (AD); Eun syndrome; frontal dementia (Pick's disease); progressive supranuclear palsy (PSP) and multiple occurrences Other diseases with tau-positive filamentous lesions, such as cortical basal degeneration, boxer dementia, fiber Dementia with concentrate only, fiber concentrate and dementia with calcification, linked to chromosome 17 -Temporal dementia with Parkinson's disease, Gerstmann-St with fiber concentrate Loisler-Scheinka disease, myotonic dystrophy, Niemann-Pick disease type C, Guam's Parkinson's dementia complex, encephalitis sequelae Parkinson's disease, and subacute Sclerosing panencephalitis; Parkinson's disease (PD) amyotrophic lateral sclerosis; Huntington's disease; Multiple sclerosis; dementia with Lewy bodies, multiple system atrophy and associated with ubiquitin Other inclusion body diseases such as Alexander disease, alcoholic liver disease, lichen Myloidosis and aging marinesco and vitreous inclusions; and other degenerative diseases Diseases such as cardiovascular disease, rheumatoid arthritis and type II diabetes. According to the invention Cancers that can be treated include, but are not limited to, Hodgkin's disease, acute and Chronic lymphocytic leukemia, multiple myeloma, breast, ovarian, lung, and gastric cancer, or Bladder cancer.   RNA having a transcriptional mutation that leads to a frameshift mutation is referred to herein as At least one that leads to a frameshift mutation, referred to as "mutant RNA" Is an RNA molecule having a transcriptional mutation of The RNA molecule contains primary transcripts and It is an RNA molecule containing sensor-RNA (mRNA).   The term "transcriptional mutation" occurs at the RNA level, but the conversion of RNA from DNA It refers to a mutation that does not occur in the DNA when copied. To identify transcriptional mutations To do so, one must compare RNA with the DNA from which the RNA is transcribed.   A "frameshift mutation" is an open reading of one or more nucleotides. Refers to a deletion or insertion within the coding frame, e.g., a single nucleotide Or a deletion or insertion of a dinucleotide, whereby the coding region The reading frame of the region shifts by one or two nucleotides. Frameshift sudden change The difference is preferably +1 to the deletion of one nucleotide or dinucleotide. Or +2 frameshift mutations. However, if the flame If a ft mutation results, a large number of nucleotide deletions can occur. Also, the insertion of one or more nucleotides results in a frameshift, Also form part of the invention.   Other genetic modifications that result in a frameshift also form part of the invention. For example, Nucleotide sequence changes can lead to translation initiation from different positions, or Mutations outside the coding region, for example, in the intron (if the RNA molecule is in the primary transcript If any), or mutations in the 5 'or 3' untranslated region This leads to the production of mutant proteins.   Mutations are deletions or insertions of nucleotides, more preferably dinucleotides Is associated with the nucleotide sequence GAGA of the RNA molecule or its complementary sequence CTCT Particularly preferred frameshift mutations are the nucleotide sequences of the RNA. The column is GAGAX or CTCTX (where X is one of G, A, U or C) And a preferred motif is GAGAG, GAGAC, GAGAT and GAGAA and CTCTC, CTCTG, C TCTA and CTCTT. As used herein, the term “GAGA mutation "Is within the GAGA or CTCT motif itself, or Adjacent to the CT motif itself (5- or 3 'one end, 5-10 Insertion or deletion of a single nucleotide within a nucleotide or dinucleotide) Insertion or deletion.   Preferably, the deletion of the dinucleotide is a GA deletion in the GAGA motif, or G GT deletion immediately after the AGA motif (ie, within 10 nucleotides 3 '), and And CT deletion of CTCT motif. Even more preferred is one mutant RNA Or two dinucleotide deletions, which are GAGA, GAGAC, GAG With AG, GAGAT or GAGAA, or CTCT, CTCTG, CTC T +1 or +2 frames, respectively, associated with C, CTCTA or CTCTT This leads to shift mutation.   In a preferred embodiment of the present invention, the transcription mutation occurs in an RNA molecule of a neural cell line. The disease in that case is a neurodegenerative disease.   “Neural cell system” means any cell, RNA molecule, protein, or , Glial cells, proteins and RNA molecules encoding proteins Is defined as a substance that is related to or forms part of a neuronal cell system such as Proteins include tau, β-amyloid precursor protein, ubiquitin B, Apolipoprotein E4, neurofilament protein and microtubule-associated protein IL Resenilin I, presenilin II, big tau, glial fibrillary acidic protein (G FAP), human P53 cell tumor antigen, human B-cell leukemia / lymphoma 2 (BCL -2) Proto-oncogene, semaphorin, yeast upframe shift protein I human homolog (HUPF-I), human active group protein (HMG), Ron specific protein A (NSP-A).   When said disease is a neurodegenerative disease, especially AD, preferred mutant RNs of the invention A molecule is β-amyloid precursor protein, tau protein, ubiquitin, apo Lipoprotein E4 (Apo-EFour), Microtubule-associated protein II (MAP2), Neurofilament protein, presenilin I, presenilin II, big tau, GFAP , P53, BCL2, HUPF-I, HMG and NSP-A RNA molecules, which may be deletions, insertions or Or have other modifications. The most preferred mutant RNA molecule of the present invention is the frame Β-amyloid precursor protein with shift mutation, ubiquitin B, MAP 2. Neurofilament protein, presenilin I, presenilin II, big tau, GF RNA molecules encoding AP, P53, BCL2, and HUPF-I You.   Preferably the GAGA or GA wherein the mutation leads to a frameshift mutation GA or GT dinus associated with the GAX sequence (within 5 'or 3' 10 nucleotides) CTCT or CT leading to deletion of a nucleotide or a frameshift mutation CT or CA genes associated with CTX sequences (within 5 'or 3' 10 nucleotides) This is a nucleotide deletion.   As used herein, the term "mutant protein" refers to a mutant RNA molecule of the present invention. Are defined as proteins encoded by   The method of the invention may comprise one or more mutations causing a frameshift mutation. Diseases caused by or associated with at least one RNA molecule having Preferably, it is a method for diagnosing a disease. A preferred disease to be diagnosed according to the invention is AD With the proviso that the early onset A found in relation to chromosomes 1, 14 and 21 D is an exception. The methods of the present invention are useful for juvenile and late-onset AD, Further preferred is a method of diagnosing familial or “sporadic” late-onset AD cases .   As used herein, "biological sample" includes proteins and / or cells A body fluid or body tissue from which nucleic acids and proteins can be isolated. You. Preferred sources include oral swab collections, blood, semen, epithelium or other tissue, milk , Urine, cerebrospinal fluid, sputum, stool sample, lung aspirate, laryngeal swab, genital swab And secretions, rectal swabs, and nasopharyngeal aspirates.   A body fluid sample has a frameshift mutation, which causes the disease, Alternatively, it is a body fluid containing cells having a transcription mutation associated therewith. The disease is God In the case of a degenerative disease, the body fluid sample may contain cells of the neural cell line or the production of such cells. It is preferable to include a substance. When the disease is a neurodegenerative disease, a preferred body fluid Pull is cerebrospinal fluid, which is available by lumbar puncture (Lannfeld felt) et al., Nature Medicin,1829-832, 1995). Other suitable body Fluids include blood (including but not limited to venous, arterial and umbilical cord blood) However, blood is readily available and mutant RNA molecules or Include lymphocytes that can be analyzed for the presence of the encoded protein.   The tissue sample can be any tissue, but is preferably readily available Tissue such as skin and nasal epithelium.   When analyzing samples for mutant RNA molecules, nucleic acid probes are preferably use. The nucleic acid probe is preferably a mutant that causes a frameshift mutation. Nucleotide probes with sequences complementary to the part of the mutant RNA molecule containing the mutation It is.   The probe is used to detect RNA or DNA reverse transcribed from RNA. However, since the genomic DNA contains no mutations, Must not be used for   The invention further provides a mutant RN comprising a mutation leading to a frameshift mutation. A nucleic acid probe having a sequence complementary to a portion of the A molecule is provided. The probe is RN It is preferably sufficiently complementary to the mutant sequence of the A molecule, so that under stringent conditions Only the probe remains bound to the mutant sequence and, under stringent conditions, the mutant And the corresponding wild-type transcript. Here is the "austerity" condition Is defined as RNA: DNA hybridization conditions, with 50% formamide and 0. Running at 65 ° C. using a hybridization buffer equivalent to 1 × SSC (See below and Evans et al. PNAS (1994) 9; 6059 ~ 6063, 6060). The "astringency" condition is Preferably also Evans et al. Includes stringency washing as described above.   The probe may be of any length, Preferably 5 to 50 nucleotides The length of More preferably, it is 10 to 30 nucleotides in length. For example, The The probe is 5, 10, 15, 20, 25, Or 30 nucleotides in length You may.   In a preferred embodiment, The probe is a nucleotide or dinucleotide deletion Or have an insertion, Complementary to GAGA or GAGAX, Or also CTCT Or a sequence complementary to CTCTX, And GAGA or C of wild-type RNA molecule Nucleotide sequence corresponding to the nucleotide sequence flanking the TCT motif Comprising a column. If the reverse transcribed DNA complementary to the mutated RNA sequence is the probe If To the corresponding GAGA or CTCT motif present in the complementary DNA Using a probe consisting of a complementary sequence It will be clear to those skilled in the art.   Methods for detecting the presence of a mutant RNA molecule include: Resulting in a frameshift mutation Using a primer having a sequence complementary to the sequence on either side of the mutation Reverse transcription Including the enzyme polymerase chain reaction (RT-PCR). First, One primer Used for reverse transcription from RNA to DNA, Second, Two primers as below To amplify the DNA.   The size of the primer used in the RT-PCR method is 20 bp or 2-3 kb, For example, 20 bp, 50 bp, 100 bp, 500bp, 1000 bp, 1500 bp, 2000bp, Or 3000 bp. Primers are used in many standard techniques, For example, Nucleotide region to be amplified Cloning of the sequence to be king, Alternatively, the primers can be It can be prepared by synthesizing a mer.   further, The present invention relates to R as defined above for amplification of a nucleotide region containing a mutation. Provides primers for use in the T-PCR method.   Preferably, When analyzing the sample for the mutant protein of the present invention, Adopt a dynamic test. Immunological tests Preferably, Muteins of the invention Shows specificity, Based on the use of antibody molecules not shown for wild-type proteins.   Thus, the invention further shows specificity for the muteins of the invention, Wild type Provides antibody molecules not shown for proteins. Preferably, The antibody is a mutant Specific to the carboxy terminus of the protein.   The present invention further provides a method of diagnosing a neurodegenerative disease or other age-related disease, Or this It provides a diagnostic method for those who are susceptible to these diseases, The method is (a) patient A body fluid or tissue sample from (B) Frame shift for the sample RNA molecule of the neuronal cell line having the mutation or encoded thereby Analyzing whether or not the protein is present, The mutated R there The presence of NA molecules is a sign of disease.   Preferably, Neurodegenerative diseases are AD and Down's syndrome.   Also, The present invention provides a method for preventing and / or treating the disease, Prevention of the disease and / or Are vectors for therapeutic and diagnostic production, A set for preventing and / or treating the disease Adult, A nucleic acid sequence used in the present invention, Probe and antibody molecules, And transformation About things.   Therapies expected according to the invention are: In cells containing the mutant transcript, Mutation Selectively removes the image (ie, Ribozymes that can be cleaved) This renders the transcript untranslatable.   Also, The treatment involves treating the cells thus treated with ribozymes, By ribozyme Providing a corresponding wild-type transcript that cannot be substantially cleaved. Wild-type transcription Things are Corresponding to the mutated RNA sequence excluding the GAGA or CTCT permutation, Wild type May comprise a wild-type sequence encoding a protein, Also, Wild-type RNA Further distinguished from the mutated RNA sequence, This further enhances ribozyme recognition and Base silent mutation (within the codon) that identifies the sequence for cleavage and cleavage May be included.   Also, Therapies encompassed by the present invention include: In cells containing mutant RNA, Suddenly Complementary to the mutant RNA, And, Mutant RNA and double helix not translatable in cells And providing RNA or DNA that can form Complementary sequences Naturally, it may be the full length of the mutant RNA, Preferably, Shorter, For example, 10, 2 0, It is 50 or 100 nucleotides in length. The complementary sequence is thus Even when administered in the form of an oligonucleotide, Alternatively, expression in vector May be encoded using a simple array, The vector is administered to the cells.   Therefore, The present invention selects target RNAs having GAGA or CTCT mutations. A ribozyme that selectively cleaves Comprising a mixture with a pharmaceutically acceptable carrier And pharmaceutical compositions.   Also, The present invention relates to target RNA having GAGA or CTCT mutation and free RNA. Of RNAs having GAGA or CTCT sequences that cause A ribozyme that selectively cleaves the biotype analog, Mix with pharmaceutically acceptable carrier Also encompassed are pharmaceutical compositions comprising the same.   Also, The present invention relates to GAGA or CTCT A wild-type analog of the RNA having the sequence Including in admixture with pharmaceutically acceptable carrier And a pharmaceutical composition comprising:   Also, The present invention provides that the wild-type analog of the RNA has a third base silent mutation. And pharmaceutical compositions comprising the nucleotide sequence of the present invention.   Also, The present invention relates to one or more GAGA or C A single-stranded nucleic acid having a sequence complementary to an RNA having a TCT mutation is pharmaceutically acceptable. Pharmaceutical compositions comprising admixture with an acceptable carrier are also included.   Also, The present invention relates to wild-type analogs of the muteins and to pharmaceutically acceptable carriers. Pharmaceutical compositions comprising admixture with the body are also included.   Also, The present invention selectively targets RNA having a GAGA or CTCT sequence A vector comprising an expressible gene encoding a ribozyme to be cleaved; Include.   Also, The present invention relates to GAGA or CTCT projections that produce frameshift mutations. Includes an expressible gene that encodes a sequence complementary to the RNA with the mutation And a vector consisting of   Also, The present invention includes a host cell comprising the vector described herein.   Also, The present invention relates to GAGA or CTCT projections that produce frameshift mutations. RNA that has a mutation, Or treatment of diseases associated therewith and And / or a prevention method, For patients suffering from or susceptible to the disease Composition, A method comprising administering a vector or host cell.   Also, The present invention relates to the treatment of GAGA or CTCT under the control of a promoter in therapy. A vector encoding a ribozyme that selectively cleaves target RNA having a mutation. Include the use of a reactor.   Also, The present invention relates to one or more GAGA or C Due to at least one RNA having a TCT mutation, Or with it In producing a composition for the treatment of a related disorder, Riboza under the control of a promoter Includes the use of vectors encoding the im.   Also, The present invention provides for the treatment of promoter-controlled frameshift mutations Sequences complementary to the resulting RNA having one or more GAGA or CTCT mutations Includes the use of vectors that encode the sequence.   Also, The present invention can be used in any combination in therapy, The above composition, vector, Ma Or the use of more than one host cell.   Also, The present invention relates to one or more GAGA or C Due to at least one RNA having a TCT mutation, Or with it In treating and / or preventing related diseases, In any combination, This specification The composition of claim vector, Or the use of more than one host cell.   The present invention further provides early markers for neurodegenerative diseases. The present invention At least one R having one or more transcription mutations resulting in a Caused by NA molecules, Alternatively, a diagnostic kit for diagnosing a disease associated therewith Offer The kit includes (a) a mutation leading to a frameshift mutation. Nucleic acid probe having a sequence complementary to a portion of a mutant RNA molecule Packaging materials, And (b) detecting the probe bound to the mutant RNA molecule. Means for exiting.   The invention further has one or more transcription mutations that result in a frameshift mutation At least one RNA molecule is responsible for Or to diagnose related diseases Provide a diagnostic kit for The kit is used for (a) RT-PCR reaction. Primers, Sequences on both sides of the mutation causing the frameshift mutation A primer having a sequence complementary to Packaging materials for that, And R Perform a T-PCR reaction, Reagents for amplifying the DNA sequence containing the mutation; (B) amplified Comprising means for detecting a DNA sequence containing a mutation .   The invention further has one or more transcription mutations that result in a frameshift mutation At least one RNA molecule is responsible for Or to diagnose related diseases Provide a diagnostic kit for The kit comprises (a) the mutant protein of the present invention. Show specificity in quality, Antibody molecules not shown by wild-type proteins, And (b) the protrusion And means for detecting the antibody molecule bound to the mutant protein.   The antibody molecule, And the means for detecting the bound antibody molecule are as defined above. It is.   In a further aspect of the invention, The diagnostic kit described above further comprises (a) wild-type An antibody molecule having specificity for a protein, And (b) frameshift mutations Caused by at least one RNA molecule with one or more resulting transcriptional mutations , Or a wild-type protein as a control for diagnosing a disease associated therewith Means for detecting the antibody molecule bound to the antibody.   The present invention further provides for a frameshift mutation that causes or is associated with the disease. Arise, An RNA molecule having one or more transcription mutations is provided.   The invention further provides several (one or more) RNA molecules, The RNA molecule is G Encoding the same amino acid sequence up to the AGA or CTCT motif, So After that, it encodes a different sequence. For example, In a single cell , For example, One encoding a β-app based frameshift protein RNA molecules are In the GAGA motif of exon 9 of the RNA sequence, Or the mochi Contain mutations in the The second RNA molecule encoding β-app is In the GAGA motif of exon 10 in the row, Or contains a mutation in the motif You may go out.   The present invention further provides for mutated RNA molecules that have been found to be a sign of disease. Coded, Providing a mutated protein, The mutation An RNA molecule has one or more transcription mutations that result in a frameshift mutation. Preferably, The mutein contains an antigenic epitope specific to the disease state I do. Table 9 shows an example.   In a preferred embodiment of the present invention, The mutated RNA molecule is Figures 2 to 19 At least a part of the sequence set to +1 or +2 in any one of Encodes a protein containing an immunologically equivalent fragment of   In a preferred embodiment, The mutated protein is In particular, the disease is AD Which neurodegenerative disease, It comprises any one of the following individual sequences. RGRTSSKELA [SEQ ID NO: 1]; HGRLAPARHAS [sequence knowledge Another number: 2]; YADLREDPDRQ [sequence identification number: 3]; RQDHHPG SGAQ [sequence identification number: 4]; YADLREDPDRQDHHPGSGAQ [ Sequence identification number: 1400]; GGGAQ [sequence identification number: 5]; GAPRLPP AQAA [SEQ ID NO: 6]; KTRFQRKGPS [SEQ ID NO: 7]; PGNRSMGHE [SEQ ID NO: 8]; EAEGGSRS [SEQ ID NO: 9]; VGAARDSRAA [SEQ ID NO: 10]; HDYPPGGSV [distribution Column identification number: 11]; SIQKFQV [sequence identification number: 12]; VEKPGER GGR [SEQ ID NO: 13]; PLFGRGHKRG [SEQ ID NO: 14] ; EDRGDAWRGH [SEQ ID NO: 15]; QERGASPRAAPR EH [SEQ ID NO: 16]; RQPGDVAPGGQHRPVDD [sequence identification number: 17]; AGLLAIPEAK [SEQ ID NO: 18]; YVDVYNG GKFS [sequence identification number: 19]; AADERRCHLLHMCGRR [sequence knowledge Another number: 20]; QQATEAGQHYQPGSPLHDHSHV [sequence identification number issue: 21]; PQEAAARTNR [SEQ ID NO: 22]; RSWV issue: 21]; PQEAAARTNR [SEQ ID NO: 22]; RSWVHPAP PYQMCLG [sequence identification number: 23]; And GGSRTHPR [sequence identification number issue: 24].   In a preferred embodiment, The antibody molecule of the present invention is directed against a mutein as defined above. It has affinity.   Also, The present invention has one or more transcription mutations that result in a frameshift mutation At least one RNA molecule is responsible for Or cure related diseases Methods for treatment and / or prevention. Reduce the production of mutant proteins And Knowledge of mutations in RNA molecules that are indicative of disease Cure the disease Has led a number of ways to treat and / or prevent.   The invention further has one or more transcription mutations that result in a frameshift mutation At least one RNA molecule is responsible for Or a related disease Provide a way to determine The method comprises: (B) RN suspected to be related to the etiology of the disease Providing the sequence of the A molecule; (B) RN at 3 'end for frameshift mutation Identifying the sequence of the mutein encoded by the A sequence; (C) the protrusion Preparing a probe for the mutant protein or a fragment thereof, Then ( D) Probe body fluids or tissues from patients with and without disease And This involves finding a correlation between the presence of the mutein and the condition.   Preferably, The probe is an antibody molecule as defined herein. Even more preferred H Antibody molecules Especially when the disease is a neurodegenerative disease such as AD, Few It has affinity for proteins containing at least one of the following sequences: R GRTSSKELA [SEQ ID NO: 1]; HGRLAPARHAS [sequence identification number: 2]; YADLREDPDRQ [sequence identification number: 3]; RQDHHPGS GAQ [sequence identification number: 4]; YADLREDPDRQDHHPGSGAQ [distribution Column identification number: 1400]; GGGAQ [sequence identification number: 5]; GAPRLPPA QAA [sequence identification number: 6]; KTRFQRKGPS [SEQ ID NO: 7]; P GNRSMGHE [SEQ ID NO: 8]; EAEGGSRS [SEQ ID NO: 9 ]; VGAARDSRAA [SEQ ID NO: 10]; HDYPPGGSV [sequence Identification number: 11]; SIQKFQV [sequence identification number: 12]; VEKPGERG GR [sequence identification number: 13]; PLFGRGHKRG [SEQ ID NO: 1 GR [sequence identification number: 13]; PLFGRGHKRG [SEQ ID NO: 14]; EDRGDAWRGH [SEQ ID NO: 15]; QERGASPRAAPRE H [SEQ ID NO: 16]; RQPGDVAPGGQHRPVDD [sequence identification number issue: 17]; AGLLAIPEAK [SEQ ID NO: 18]; YVDVYNGG KFS [sequence identification number: 19]; AADERRCHLLHMCGRR [sequence identification number: 20]; QQATEAGQHYQPGSPLHDHSHV [sequence identification number : 21]; PQEAAARTNR [SEQ ID NO: 22]; RSWVHPAPP YQMCLG [sequence identification number: 23]; And GGSRTHPR [sequence identification number : 24].   Other features and advantages of the present invention include: Detailed description of the preferred embodiment below, And special It will be clear from the claims.   BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   The present invention will be described with reference to the following drawings.   Figure 1 shows a female Alzheimer patient (70 years old, # 83002; Table 2) of the frontal cortex A paraffin section copy, Peptides predicted by the +1 reading frame of βAPP (Fig. 20). Different Vegetative axons (arrowheads) and fiber concentrates (arrowheads) can be clearly observed in cortical layer III You.   Figure 2 shows the coding sequence of the human β-amyloid precursor protein gene transcript. Otide sequence [sequence identification number: 25], Amino acid sequence of wild-type protein [sequence knowledge Another number: 83 and 84], Mutation + 1 frameshift protein [sequence identification number: 50-82], And mutant +2 frameshift protein [sequence identification number: 26 to 49].   Figure 3 shows the coding nucleotid of human microtubule-associated protein tau gene transcript. Sequence [sequence identification number: 85], Amino acid sequence of wild-type protein [sequence identification number issue: 99], Mutation + 1 frameshift protein [SEQ ID NO: 86-9 8], And mutant +2 frameshift protein [SEQ ID NO: 100 ~ 112].   FIG. 4 shows the coding nucleotide sequence of the human ubiquitin B gene transcript [sequence Identification number: 113], Amino acid sequence of wild-type protein [SEQ ID NO: 125 And 126], Mutation + 1 frameshift protein [SEQ ID NO: 11 4-124], And mutant +2 frameshift protein [SEQ ID NO: 127 to 136].   FIG. 5 shows the coding nucleotide sequence of the human apolipoprotein E gene transcript. Column [sequence identification number: 137], Amino acid sequence of wild-type protein [SEQ ID NO: : 144-146], Mutation + 1 frameshift protein [SEQ ID NO: 138-143], And mutant +2 frameshift protein [sequence identification number issue: 147-152]. Information about restriction sites is also provided.   FIG. 6 shows the coding nucleotide sequence of the human microtubule binding protein 2 transcript [ Sequence identification number: 153], Amino acid sequence of wild-type protein [SEQ ID NO: 1 54-158], Mutation + 1 frameshift protein [SEQ ID NO: 23 2-347], And mutant +2 frameshift protein [SEQ ID NO: 159 to 231].   FIG. 7 shows coding of human neurofilament subunit NF-low transcript Nucleotide sequence [SEQ ID NO: 348], Amino acid sequence of wild-type protein [Sequence identification number: 466-513], Mutation + 1 frameshift protein [ Sequence identification number: 413-465], And mutation +2 frameshift proteins Quality [sequence identification number: 349-412].   FIG. 8 shows coding of human neurofilament subunit NF-M transcript. Nucleotide sequence [SEQ ID NO: 514], Amino acid sequence of wild-type protein [Sequence identification number: 515-574], Mutation + 1 frameshift protein [ Sequence identification number: 629-695], And mutation +2 frameshift proteins Quality [sequence identification number: 575-628].   FIG. 9 shows the transcript of the human neurofilament subunit NF-H gene transcript. Nucleotide sequence [SEQ ID NO: 696], Amino of wild-type protein Acid sequence [SEQ ID NO: 697-698], Mutation + 1 frameshift tamper Quality [sequence identification number: 708-710], And mutation +2 frameshifters Protein [SEQ ID NO: 699-707].   FIG. 10 shows the presenilin I coding mRNA nucleoside expressed in wild type. Pide sequence [sequence identification number: 711] and the amino acid sequence [SEQ ID NO: 712 ], +1 reading frame [sequence identification number: 733-753], And +2 reading frame [sequence knowledge Another number: 713-732].   FIG. 11 shows the coding mRNA nucleoside of presenilin II expressed in wild type. Pide sequence [sequence identification number: 754] and the amino acid sequence [SEQ ID NO: 776 ~ 787], +1 reading frame [sequence identification number: 755-775], And +2 reading frame [Sequence identification number: 788-814].   Figure 12: Big tau coding mRNA nucleotides expressed in wild type. Sequence [sequence identification number: 815] and the amino acid sequence [SEQ ID NO: 816-8 18], +1 reading frame [sequence identification number: 824-834], And +2 reading frame [distribution Column identification number: 819-823].   FIG. 13 shows the coding mRNA nucleotide sequence of GFAP expressed in wild type. Column [sequence identification number: 835] and the amino acid sequence [SEQ ID NO: 836-85 2], +1 reading frame [sequence identification number: 883-914], And +2 reading frame [array Identification number: 853-882].   FIG. 14 shows the coding mRNA nucleotide sequence of P53 expressed in wild type. [Sequence identification number: 915] and the amino acid sequence [SEQ ID NO: 940-949 ], +1 reading frame [sequence identification number: 916-939], And +2 reading frame [sequence knowledge Another number: 950 to 965].   FIG. 15 shows the coding mRNA nucleotide sequence of BCL2 expressed in wild type. Column [sequence identification number: 966] and the amino acid sequence [SEQ ID NO: 967-10 15], +1 reading frame [sequence identification number: 1075-1126], And +2 reading frame [Sequence identification number: 1016 to 1074].   FIG. 16 shows semaphorin III coding mRNA nucleoside expressed in wild type. Pide sequence [sequence identification number: 1127] and amino acid sequence [SEQ ID NO: 11 28-1131], +1 reading frame [sequence identification number: 1162-1212], and +2 reading frame [sequence identification number: 1132-1161].   FIG. 17 shows the coding mRNA nucleotide sequence of HUPF expressed in wild type. Column [sequence identification number: 1213] and amino acid sequence [SEQ ID NO: 1241 1244], +1 reading frame [sequence identification number: 1214-1240], And +2 reading Frame [sequence identification number: 1245 to 1281].   FIG. 18 shows the coding mRNA nucleotide sequence of wild-type expressed HMG. [Sequence identification number: 1282] and amino acid sequence [SEQ ID NO: 1297-1 299], +1 reading frame [sequence identification number: 1289-1296], And +2 reading frame [Sequence identification number: 1283-1288].   FIG. 19 shows NSP-A coding mRNA nucleotides expressed in wild type. Sequence [sequence identification number: 1300] and the amino acid sequence [SEQ ID NO: 1374 ~ 1387], +1 reading frame [sequence identification number: 1339-1373], And +2 Reading frame [sequence identification number: 1301-1338].   FIG. 20 shows two human neuronal proteins expressed in the wild-type and +1 reading frames. Quality (β-amyloid precursor protein (exons 9 and 10) and ubiquitin B (exon 2) shows the partial mRNA nucleotide sequence and amino acid sequence .   Figure 21: In the transcript of β-amyloid precursor protein and ubiquitin B Two new restriction sites created by dinucleotide deletion (wild-type nucleotides) Sequence [sequence identification number: 25 and 113], β-amyloid precursor protein deletion Sequence [sequence identification number: 1396 and 1397], Ubiquitin deletion sequence [sequence knowledge Another number: 1398 and 1399]).   Description   The present invention is illustrated by the following non-limiting examples, Here, the following materials and methods are used. adopt. The entire disclosure of each reference cited herein is hereby incorporated by reference.   The invention relates to a method wherein the frameshift mutation comprises a single RNA molecule or multiple RNA molecules. Happened to Muteins whose products are associated with or show symptoms of the disease It is based on the discovery that there is. The present invention is based on the A new coding sequence for the cell containing the disease New polypeptides that exhibit the symptoms in connection with (a mutated protein herein) Quality).   According to the present invention, Has one or more transcription mutations that cause a frameshift mutation At least one RNA molecule that Or the associated disease Diagnosis and / or identification is achieved as described herein.   According to the present invention, A method for preventing and / or treating the disease, The disease To prevent and / or treat Also, A vector for the production of diagnostics, The disease A composition for preventing and / or treating the disease, A nucleic acid sequence used in the present invention, Step Lobe and antibody molecules, And the transgenic animal is achieved as described herein. You.   According to the present invention, A method for detecting an error in the transcription mechanism is described in the present specification. Is achieved as follows. Therefore, Mutations found in mutant RNA molecules of the invention Amends eradicate disease, This is a valuable method.   Methods and reagents for diagnosing and treating diseases are described in more detail below.   Diagnosis of disease according to the present invention   The present invention relates to a method for reducing the number of transcription mutations resulting in one or more At least one RNA molecule is responsible, Or a method for diagnosing a disease associated therewith About. Such diseases include, but are not limited to, the following: cancer, Type II diabetes and neurodegenerative diseases, For example, Parkinson's disease (PD), Arts Heimer's disease (AD), Frontal dementia (Pick's disease); Progressive supranuclear palsy (PSP) And other diseases with multiple tau-positive filamentous lesions, For example, Cortical basal degeneration, Boxer chi Stupid, Dementia with fiber concentrate only, Dementia with fiber concentrates and calcification, On chromosome 17 Frontotemporal dementia with Parkinson's disease linked, Gerstmann with fiber concentrate ・ Stroisler-Scheinka disease, Myotonic dystrophy, Neiman-Pick disease Ip C, Parkinson's dementia complex in Guam, Sequelae of encephalitis, Parkinson's disease, Akyu Sclerosing panencephalitis, Amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's disease, Slut with Lewy body Stupid, Multiple system atrophy, Other inclusion body diseases associated with ubiquitin, For example, Alexan Darr's disease, Alcoholic liver disease, Lichen amyloidosis, And aging marinesco Body and vitreous inclusions, Multiple sclerosis, Down syndrome and other degenerative diseases, For example, Cardiovascular disease, Rheumatoid arthritis and type II diabetes.   Somatic mutations make gene function different, As a result, certain cancers Addition Related to age-related diseases. But, Non-proliferating cells at the chromosome level It is generally believed that they will not undergo significant changes. For example, Chromosome changes Is primarily related to cell growth (Smith, Mutation Research,27 7 139-142, 1992), for non-proliferating cells such as most neurons. It was previously thought that proliferation ended early in life after birth (Rakik ( Rakic), Science,277Pp. 1054-1056, 1985). But Eva Evans et al. (Proc. Nat. Acad. Sci., 91: 6059, 1994) describe the body. Cell mutations occur in the genes of the neural cell line, postmitotic neurons. Suggested that Severe due to lack of antidiuretic hormone vasopressin (VP) Di / di Brattleboro rats suffering from diabetes insipidus in Evans The subject of these reports. Although previously established, Brattlebo Rats lack the single-G residue in the second exon of the VP gene, resulting in C- To become a mutant VP precursor with an altered terminal amino acid sequence, the VP hormone Is missing. A small number of neurons in di / di rats are heterozygous + / di Have been observed to express the normal VP gene product. Was. In a study of the molecular biology of di / di rats, Evans et al. The reading frame of the mutated VP precursor mRNA has been restored and the GAGA motif Was determined to be based on the dinucleotide deletion of They are single large cell Of small amounts of normal VP gene product of Ehron and resulting from frameshift mutation It was correlated with the reversion of the mutated gene. Evans' conclusion is that the +1 frame shift G mutation is present in both wild-type and di / di rat VP transcripts. The events leading to these mutations are not due to the pathology of the di / di rat itself It was that. Thus, Evans et al. Did not correlate with the prevalence of the condition or disease. In addition, prior art includes transcription That the mutation has occurred, and that the transcriptional mutation is the cause of the disease, There is no indication that it is related to it. Mutations ever occur in DNA It was thought that there was no mutation in the chromosomal DNA, Probing chromosomal DNA gives wrong result for mutation Such detection methods were not reliable.   In the present invention, the observations of Evans et al. GAGAG hots of VP transcripts in single neurons of di / di rats leading Observations regarding the return of wild-type reading frames in pots have been extended. In the present invention According to a mutation hotspot, a frameshift mutation At least one RNA molecule having one or more transcriptional mutations Alternatively, a human disease associated therewith is identified and / or diagnosed. Disease source The nucleotide sequence of the RNA molecule suspected to be Cloning and sequencing of suspected RNA molecules from isolated gene sequences or Obtained from constant. The amino acid sequence encoded by the RNA molecule is Predicted amino acid sequence of the loaded mutein. Mutant The protein sequences were +1 and +2 readings according to the postulated frameshift mutation. Expected in the box. The location of the frameshift mutation is suddenly the frameshift Making assumptions about certain nucleotide sequence motifs where mutations are suspected Yes; examples of such motifs present on RNA molecules are: But not limited to: comprising GAGA, eg, GAGAC, GA Comprising GAG, GAGAT, and GAGAA; or CTCT, eg, CTCTC, CTCTG, CTCTA, and CTCTT.   Prepare probes specific for muteins or antigenic fragments thereof (For such probes, the detection of proteins or protein fragments) As described above for exit). Where mutations that lead to frameshifts occur The portion of the mutein has the same sequence as the wild-type protein, A portion of the protein has the sequence of the mutein. In addition, mutations Depending on the location, the mutein may have a nucleotide sequence encoding a stop codon. If it is loaded, it stops (indicated as * in the figure). In this way, mutation Different locations produce different muteins.   Alzheimer's disease (AD) is typically diagnosed and treatable by the present invention. Is a serious disease. AD is a neurodegenerative disease characterized by idiopathic progressive dementia. It is the fourth leading cause of death in developed countries. 5% to 11% of the population over 65 % Are affected, and over the age of 85 it reaches 47% of the population. Currently in the United States A It is estimated that the number of affected patients is 4 million (see: Coleman, Neurobiol. of Aging,Fifteen, Supplement 2, pp. 577-578, 1994). f Aging,Fifteen, Supplement 2, pp. 577-578, 1994). It is estimated that 20 million Hymer patients.   Clinical criteria for the diagnosis of AD are defined (see: Reisberg ) Et al., Am. J. Psych., 12, 1136-1139, 1982; MacKern (MacKhann) et al., Neurology,34939-944, 1984). AD first Stage symptoms vary but are generally accompanied by depression, delusions and anxiety. Also, intelligent machines There is a slow degeneration of noh and memory. In particular, cognitive impairment, idiosyncratic language disorders (aphasia ), Behavioral impairment (apraxia), and impaired cognition (agnosia).   Nevertheless, the lack of knowledge of the etiological mechanisms associated with AD There is no general agreement to diagnose AD. Diagnosis of AD is based on brain tissue examination Done. Such diagnosis is usually performed on post-mortem individuals. The diagnosis is Presence of neurofibrillary tangles in nerve cells and in brain tissue, especially neocortex and hippocampus Based on the presence of axonal plaques in Various types of plaque (eg, Axon plaques), neural reticulum, and neurofibrillary tangles Such brain tissue sections require staining and microscopic examination. Axonal plaque has degenerated Axons (eg, neural reticulum), nerve endings, and possibly astroglial microglia It is believed to consist of rear elements. Axonal plaque is also amyloid It has often been found to have a protein core. Neurofibrillary tangles are positive Consisting of a normal pair of helical filaments and composed of several proteins Is believed.   AD has two major types: late onset (> 65 years) and early onset. I have a disease (<65 years old). Approximately 85% of all AD cases are late-onset, early The attack is only 15%. 0.3% of the latter group is genotype linked to chromosome 21 Of AD, 2% of cases are thought to link to chromosome 14, 1 was found to be associated with a younger incidence (<0.1%) as discussed below. ing. Sporadic cases are the most prominent group with early onset AD (40%).   In the most common late-onset group, 40% of cases are considered familial. Yes, this means that Alzheimer's was observed in the primary relatives . Only 10% of this family type is autosomal dominant. The remaining late onset cases (60 %) Are non-familial or "sporadic" cases (see Table 1). These cases ) Are non-familial or "sporadic" cases (see Table 1). About these cases Is not well known and has suggested a possible cause of AD No such data was available.   Currently, the formation of axonal plaques and / or neurofibrillary tangles directly leads to AD. It is not clear whether this is the cause. Axonal plaque, neural reticulum and / or The formation of neurofibrillary tangles is the result of more basic cellular or biochemical changes Could be   The diagnostic method of the invention, as described herein, involves detecting a nucleic acid sequence. The exit preferably occurs between the two nucleic acid strands, ie, the nucleic acid probe and the mutant RN. A or reverse transcription mutation DN from mutant RNA isolated from biological sample A through detection involving the formation of a nucleic acid duplex between complementary sequences in A Yes, the diagnostic method also provides for the detection, preferably mutation or hybridization, of proteins. And detecting non-wild type / nonsense proteins. 1. Preparation and detection of RNA for genetic screening   Typically, RNA is prepared using DNA extraction procedures well known in the art (eg, Samb). rook et al., 1990, A Laboratory Manual for Cloning, Cold Spring Harbor P ress, CSH, NY) and prepared from biological samples If present, it can be further purified before analysis, for example, by electroelution.   Methods for detecting a mutant RNA molecule from a biological sample include: But not limited to: (1) Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-P CR), followed by size-separation gel electrophoresis, or allele-specific (or Column-specific) hybridization with probe, (2) mutated RNA Hybridization of RNA eluted with a nucleic acid probe that is complementary to 3) ARMS test, where one primer has a frameshift mutation Have the complementary sequence containing the resulting mutation, and the amplification is (4) Nucleotide sequencing, (5) RT-PCR And RNA amplification via T7 polymerase, and (6) after RT-PCR amplification Due to the dinucleotide deletion in the RNA of the cDNA, a new restriction site (FIG. 21).   Useful nucleic acid probes according to the invention are preferably probed under stringent conditions. The mutant sequence of the RNA molecule must be sufficient so that only the (Evans et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 6059-6063). (1994)). The probe is preferably32P or any other standard Radioisotope or biotin or DIG labeling Any standard technique known to those skilled in the art, such as using non-radioactive methods, including Use and be labeled. The labeled probe is then obtained by methods well known to those skilled in the art. And can be easily detected.   An alternative method for detecting the presence of a mutant RNA molecule is a reverse transcriptase polymer. Via the lase chain reaction (RT-PCR). A bump that produces a frameshift mutation Primers having a sequence complementary to the sequence on either side of the mutation will reverse the RNA Used to transcribe and amplify reverse transcribed DNA containing mutations . Mutations in the amplified fragment then use the probes described above Using standard techniques or by sequencing the amplified sequence And can be detected. The advantage of using an RT-PCR reaction is that it requires less starting material. And the PCR method is to allow quantitative and qualitative decisions . By quantitative determination, the amount of mutated RNA present in a particular sample The copy number of the offspring can be estimated, and taking this information into account, The degree can be estimated.   Another alternative method for detecting the presence of a mutant RNA molecule is a single primer. Has a complementary sequence containing a mutation that results in a frameshift mutation Is the way. Therefore, amplification occurs only when the mutated sequence is present. I will. Newton et al., Nucl. Acids. Res. 17: 2503, 1989. This method is cystic It has been used previously in the detection of mutations in genes responsible for fibrosis, One skilled in the art will appreciate that the mutant RNA of the present invention or the reverse transcribed RNA This test can be easily performed for the detection of isolated DNA.   An exemplary analysis method (1) is as follows. RNA is reverse transcribed and then Now, the DNA is amplified before analysis, for example using PCR. Any one One PCR, ie, a PCR targeting a particular sequence, or any one Specificity for double PCR, ie, PCR that targets a particular set of sequences Typical conditions can vary, but will be understood by those skilled in the art.   Amplification of a mutated or wild-type, reverse transcribed DNA sequence is as follows. Can be achieved directly from an aliquot of DNA prepared as described above.   25 μl of DNA is replaced with 25 μl of HTwoO, 50 μl master mix (hereinafter 0.5 μl of Amplitaq (Perkin Elmer Cetus, Norwal) k, CT) and 0.5 μl UNG (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) Aliquot into reaction tubes. 50 μl of master mix is 2 0 mM Tris HCl, pH 8.3, 100 mM KCl, 5 mM MgClTwo 0.02 μmol dATP, dGTP, dCTP, 0.04 μmol dU each TP, 20 pmol of each primer (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), and And 25 μl gelatin.   The fragments characteristic of the selected amplification sequence are then The electrophoresed 13% polyacrylamide gel was stained with ethidium bromide. After that, it can be visualized under ultraviolet light. Alternatively, with an allele-specific probe Hybridization of either normal and / or mutant alleles The presence of the product amplified therefrom can be identified. 2. Preparation and detection of proteins for genetic screening   If the biological molecule being analyzed is a protein, the biological Release nucleic acids from the cells of the biological sample, or It may be desirable to remove nucleic acids from the eluate. Therefore, the sample or The eluate is first mechanically disrupted (eg, freeze / thaw, trituration, sonication), Physical / chemical disruption, such as cleaning agents (eg, Triton, Tween, Or sodium dodecyl sulfate), osmotic shock, heat, enzymatic lysis ( Lysozyme, proteinase K, pepsin, etc.) or nuclease treatment Release or removal of nucleic acids according to conventional methods, all well known in the art. To be processed.   If the biological sample contains a mutein, its presence or absence is Indicates a genetic disease, the protein of which is detected in a conventional detection assay, such as an antibody pro Can be detected using a protein-specific probe such as a probe. Similarly, the remains If the genetic disorder correlates with the presence or absence of an amino acid or sequence of amino acids, These amino acids can be converted by conventional means, e.g., by native or mutated sequences. Can be detected using antibodies that are specific for See Table 9 for examples of amino acid sequences).   Any antibody reagents useful in the methods of the invention include whole antibodies, antibody fragments, Multifunctional antibody aggregates, or, generally, one or more specific Any substance containing a suitable binding site may be contained. Antibody fragments, for example For example, Fv, Fab, and F (ab ')TwoFragment or any derivative thereof For example, it may be a single-chain Fv fragment. Antibody or antibody fragment The protocol can be non-recombinant, recombinant, or humanized. Antibodies can be used on any Robrin isotype, for example, IgG, IgM, etc. In addition, Aggregates, polymers, derivatives, and conjugates of immunoglobulins if Alternatively, a fragment thereof may be used.   Immunoglobulin sources for antibody reagents include, for example, conventional polyclonal By preparing antisera, or preparing monoclonal or chimeric antibodies, It can be obtained in any manner. Antisera are derived from well-established technology. This can be like a mouse, rabbit, guinea pig, or goat Immunizing the animal with a suitable immunogen.Preparation of antibodies   1. Polyclonal antibody   Peptides or polypeptides can be used as conventional carriers to increase their immunogenicity. (E.g., thyroglobulin), and the peptide-carrier Antiserum to the conjugate is raised in rabbits. To carrier protein The conjugation and immunization of the peptide is performed as described (Dymecki, S.M., et al., J. Amer. Biol. Chem 267: 4815-4823, 1992). This pep Rabbit antibodies to tide were elicited and sera were raised by ELISA. Force against peptide antigens by dot or spot blotting (Boersma and Van Leeuwen, 1994, Jour. Neurosci. Methods 51: 317). At the same time, antisera can be used on tissue sections. Serum is green (Green) et al., Cell, 28, 477-487 (1982). It is shown to react strongly with sharp peptides. The serum with the highest titer is Used in later experiments.   2. Monoclonal antibody   Techniques for preparing monoclonal antibodies are well known, and the monoclonal antibodies of the invention Null antibodies have been described by Arnheiter et al., Nature, 294, 278-280 (1981). The synthetic peptide is used, preferably coupled to a carrier, as described May be adjusted using synthetic peptides that have been used.   Monoclonal antibodies are typically prepared from hybridoma tissue culture, or hybridomas. Obtained from ascites fluid obtained from animals into which the redoma tissue has been introduced. And heels Nevertheless, monoclonal antibodies are not available for synthetic peptides or their conjugates. Or "induced" by them.   Particularly preferred immunological tests are monoclonal or polyclonal antibodies. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunoblotting , Immunoprecipitation, and radioimmunoassays. Voller, A., Diagnostic H orizons 2: 1-7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, W alkersville, MD; Voller, A .; et al., J. Amer. Clin. Pathol. 31: 507-520 (1978); rice National Reissue Patent No. 31,006; British Patent No. 2,019,408; Butler, J. et al. E., Meth. Enzymol. 73: 482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay. , CRC Press, Boca Raton, FL, 1980) or radioimmunoassay (RIA) (Weint raub, B.,Principles of radioimmunoassays, Seventh Training Course on Ra dioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March 1986, pp. 1-5, 46-49and68-78). Group for the presence of the muteins of the invention Preferably, immunohistochemical techniques are used to analyze the tissue. used. Antibody molecules are labeled to facilitate easy detection of muteins It should be clear to those skilled in the art. Techniques for labeling antibody molecules The art is well known to those skilled in the art (Harlour and Lane, Antibodies, Cold Spring Harb our Laboratory, pp 1-726, 1989).   Alternatively, a sandwich hybridization technique, such as a given tamper Antibodies specific to the protein can be used. In addition, the haptic bound to the binding protein Antibodies specific for the ten groups can be used. Another sandwich detection system useful for detection Are avidin or streptavidin systems, where detectable proteins Quality specific proteins have been modified by the addition of biotin. Yet another In embodiments, the antibody is a non-immunized antibody that has the ability to bind immunoglobulin molecules. Epidemiological globulin proteins, such as those of staphylococci, which are well known in the art. It may be replaced by protein A or streptococcal protein G. Protein The quality can be detectably labeled by itself or a detectably labeled secondary Protein, for example, indirectly detected by a secondary antibody specific for the primary antibody Either get. Therefore, rabbit anti-hybrid wild type / non-sen When a protein antibody acts as a primary binding protein, labeled goats Anti-rabbit immunoglobulin antibodies are secondary binding proteins.   In another embodiment, the presence of a hybrid wild type / nonsense protein The signal generated is specific for that fusion protein that is detectably labeled Amplified by a specific antibody, for example, an anti-β-galactosidase antibody. One of ordinary skill in the art will appreciate, using Many such possible primary and secondary binding protein systems can be devised.   Alternatively, other techniques may be used to detect muteins , SDS PAGE, isoelectric focusing, western blotting, HP Includes LC and chromatographic methods such as capillary electrophoresis. Identification of diseases according to the invention   The present invention relates to one or more transcriptional mutations that result in a frameshift mutation. Caused by or associated with at least one RNA molecule having a difference Methods are provided for identifying a disease.   Diseases are identified according to the present invention as follows. Be involved in the pathogenesis of the disease The nucleotide sequence of the suspected RNA molecule is, for example, the published gene sequence Or from cloning and sequencing of the suspected gene. The amino acid sequence encoded by the RNA is It is predicted because it is the amino acid sequence of the mutant protein. Mutant protein The sequence of +1 and +2 reads according to the hypothesized frameshift mutation. Predicted in the switching frame. The position of the frameshift mutation is RNA Can be hypothesized for certain nucleotide sequence motifs in the molecule; Examples of such motifs are GAGA, such as GAGAC, GAGAG, GAGAT, and GAGAA, or CTCT, eg, CTCTG, CTCT C, CTCTA, and CCTTT, but are not limited to these.   Then, specific for the mutein or its immunogen fragment A probe is prepared that is specific to the protein (such a probe is Or detection of protein fragments as described herein above) . Depending on where the mutation leading to the frameshift occurs, The protein part has the same sequence as the wild-type protein, and the protein part It will have the sequence of the mutant protein. And where are the mutations If the nucleotide sequence encodes a stop codon, depending on the The protein is terminated (indicated as * in the figure). Therefore, where suddenly strange Depending on whether the difference occurs, different muteins are produced.   The easiest way to probe for the presence of a particular mutein is Making antibodies against the protein or immunogenic portion thereof. Even if the mutation occurs in another part of the sequence, As the probability that the protein contains the peptide sequence is increased, the predicted mutant protein An immunogenic fragment corresponding to the C-terminus of the protein can be synthesized. For example, β- In the RNA encoding App, two frames having the same C-terminal sequence were used. Two different transcriptional alterations that result in a time-shifted protein (ie, two Different GAGA motif). In addition, the C-terminal region of the protein It appears to form an epitope more than other regions of the protein.   Once the probe is made, a biological sample from a patient with the disease , And biological samples from patients without the disease, also as described above. Are probed for the presence or absence of the mutein. Or yes Several probes may be prepared, and the combination of probes may be It may be used to probe samples. Biology from patients with disease Of muteins in genetic samples and from patients without disease The absence of the mutant protein in a biological sample of Indicates that the protein is a marker for the disease or susceptibility to the disease.   Treatment of diseases according to the invention   The present invention also provides a method for preventing and / or treating a disease, a method for preventing and / or treating a disease. Vector for treating and / or treating, and preventing and / or treating a disease Methods and sets for compositions such as nucleic acid sequences and proteins for The compositions are useful in gene therapy and protein therapy.   The present invention relates to GAGA or CTCT that produce a frameshift mutation. Treatment and treatment of diseases caused by or associated with RNA having a mutation And / or prophylactic methods, wherein a ribozyme, wild-type RNA or Are both complementary to and hybridized with the mutant RNA. Encoding RNA or DNA, or any of these sequences, capable of forming A wild type form of a mutant protein or a vector containing the sequence Is administered to patients who have or are susceptible to disease.   Preferred diseases to be treated according to the invention include cancer or neurodegenerative disease Disease, especially AD, but is not limited thereto, and preferred mutations of the invention RNA includes deletions, insertions, or deletions in RNA that lead to frameshift mutations. Beta-amyloid precursor protein, tau protein, ubiquitin or other modifications Chitin B, apolipoprotein-EFour(Apo-EFour), Microtubule-associated protein I I (MAP2), neurofilament protein (L, M, H), presenili (Presenilin) I, presenilin II, Big Tau, GFAP, P5 3, BCL2, semaphorin III, HUPF, HMG, and N SP-A, but is not limited thereto.   A ribozyme useful in the treatment according to the invention is preferably a hammerhead Type ribozyme.   Pharmaceutical compositions according to the present invention may be therapeutically mixed with a carrier. An effective amount of a ribozyme, a wild-type analog of mutant RNA, or both, Or a sequence that is complementary to the mutant RNA and cannot be translated in vivo. It may contain DNA or RNA that can form a brid. A therapeutically effective amount is Is considered to be an amount that, when administered to a patient, provides a therapeutic benefit to the patient . Such amounts generally range from 10 μg to 100 mg of therapeutic protein / patient Kg body weight, preferably 50 μg to 10 mg, and most preferably 100 μg g to 1 mg.   If the vector is useful in accordance with the present invention, the vector may be any of the vectors known to those of skill in the art. As outlined in the extensive literature, even linear or cyclic structures Well adapted for episomal or integrated presence in host cells I can do it. Vectors can be transferred to cells using viral or non-viral delivery systems. May be delivered to The choice of delivery system depends on whether the substance is Delivered to transcellular types or generally to these cells Depends on.   The vectors of the present invention provide for more controlled expression of the encoded gene. For example, additional regulatory sequences, such as enhancers or gene conformational control regions (L CS). LCS is described in EP-A-0332667. Have been. Inclusion of the gene conformational control region (LC) starts at the site of DNA uptake State, ensuring the expression of the gene contained in the vector. This is particularly preferable because it becomes possible. The vectors of the present invention can be used ex vivo and in vivo. It has widespread use in vivo gene therapy.   Animal model for disease diagnosis and treatment according to the present invention   The present invention also provides for use as a model of a disease for testing or treatment. , Stable cell lines and transgenic animals.   Stable cell lines or transgenic animals according to the invention are described herein. A frame, also known as a transgene, that causes or is associated with a disease Recombination encoding one or more mutations resulting in a shift mutation Including genes.   The recombinant gene removes the mutated protein found to be indicative of the disease. Encodes the encoding RNA. Preferably, the mutein is Contains antigenic epitopes specific to the disease state. Recombinant genes are shown in FIGS. Or at least a portion of the sequence designated as +1 or +2, or immunology thereof. Can encode proteins containing highly equivalent fragments.   An introductory gene encoding a mutein as described herein Cell lines containing the gene are publicly available in the art for introducing foreign genes into cells. The transgene is selected into the selected cell line according to any of several known procedures. Is produced by introducing   Transgenic animals containing such transgenes include rodents, e.g. For example, rats or mice, or other mammals, such as goats, cows, etc. And can be made according to procedures well known in the art.   The transgenic animal has one or more of the At least one gene encoding an RNA containing the mutation Diseases associated with or associated with it, and diseases for research purposes It is useful according to the invention as a disease model. One, as defined above Or the specific expression of more mutant genes, The effect of such mutants on can be studied. In addition, gene therapy and And treatments containing various drugs can be tested on transgenic animals.   Introduction into animals to produce transgenic animals useful in the present invention Examples of the recombinant gene include a gene specifically disclosed in the present specification. Deletion or insertion of a dinucleotide with respect to the wild-type sequence of the gene, Or insertion of a dinucleotide associated with the GAGA or CTCT sequence, eg For example, GAGAX or CTCTX, where X is G, A, T, or C For example, GAGAG, GAGAC, GAGAT, and GAGA A) or CTCTG, CTCTC, CTCTT, and CCTTA. This The transgene such as is preferably A, which is in close proximity to GAGAG (FIG. 20). G deletion or GT deletion, eg, +1 or +2 frameshift suddenly, respectively Related to GAGA, GAGAG, GAGAC, GAGAT, GAGAA leading mutation One or two dinucleotide deletions. In a similar fashion, CTC TX can undergo the same deletion process (ΔCT).   Recombinant genes containing such mutations are particularly useful in animal models of disease The transgene includes transgenes associated with neurodegenerative diseases, especially Alzheimer's disease. Genes, mutant beta amyloid precursor protein, tau protein, Ubiquitin B, apolipoprotein-EFour(Apo-EFour), Microtubule-associated protein Quality II (MAP2), nerve fiber protein (L, M, H), presenilin I, pre- Senirin II, Big Tau, GFAP, P53, BCL2, Semaphori Encoding III, HUPF, HMG, and NSP-A, herein The disclosed mutant gene sequences include, but are not limited to, 8 also).   In the transgenic animal of the present invention, the corresponding wild-type protein And expression during selected stages of maturation and in selected tissues So that the mutant gene is activated when desired. Transgenes regulated via a regulatable and / or regulated promoter May be included. This is particularly desirable if the animal model is of Alzheimer's disease. Preferably, in this case, the mutant protein begins to be expressed later in the life of the animal. You. Therefore, the mutated gene is a brain-specific inducible promoter, such as Neurofilament, aldolase, or modified Thy-1 promoter Disease control is controlled through the expression of the mutated gene obtain. The transgenic animal according to the invention comprises: a) a human β-amyloid precursor Protein + 1, b) human ubiquitin + 1 protein, c) human neurofilament Protein can be made to overexpress the protein.   Example 1   Below, RNA molecules encoding proteins present in neuronal tissue Embodiments of the invention relating to the identification of transcriptional frameshift mutations in How mutations are useful in diagnosing certain disease states Describe.   Human β-amyloid precursor protein, tau, ubiquitin, apolipoprotein E4, MAP2, low (L), medium (M) and high (H) neurofilament sub Unit, Presenilin I, Presenilin II, Big Tau, GFAP, P53, BCL2, Semaphorin III, HUPF-I, HMG, and NSP-A CDNA sequences encoding were obtained from various gene sequence databases.   The sequence data is used to identify various GAGA or CTCT motifs in the sequence. And, assuming deletion, the sequence of the derived mutein is shown in FIGS. 9 as predicted. +1 and +2 frameshift mutant tampers Both sequences of the protein were predicted.   The sequence of the putative mutein is tested to find the putative mutant protein. A peptide corresponding to the C-terminus of the protein was synthesized. These peptides are available in the art. Synthesized using standard techniques known to those skilled in the art. A pair with the following sequence The peptides were synthesized: RGRTSSKELA [SEQ ID NO: 1], HGRLAP ARHAS [sequence identification number: 2], YADLREDPDRQ [sequence identification number: 3] ], RQDHHPGSGAQ [SEQ ID NO: 4], YADLREDPDRQD HHPGSGAQ [SEQ ID NO: 1400], GGGAQ [SEQ ID NO: 5 ], GAPRLPPAQAA [SEQ ID NO: 6], KTRFQRKGPS [ Column identification number: 7], PGNRSMGHE [sequence identification number: 8], EAEGGGSR S [SEQ ID NO: 9], VGAARDSRAA [SEQ ID NO: 10], HD YPPGGSV [SEQ ID NO: 11], SIQKFQV [SEQ ID NO: 12 ], VEKPGGERGR [SEQ ID NO: 13], P SEQ ID NO: 12], VEKGPERGRGR [SEQ ID NO: 13], PLF GRGHKRG [SEQ ID NO: 14], EDRGDAWRGH [SEQ ID NO: No .: 15], QERGASPRAAPREH [SEQ ID NO: 16], RQPG DVAPGGQHRPVDD [SEQ ID NO: 17], AGLLAIPEAK [ SEQ ID NO: 18], YVDVYNGGKFS [SEQ ID NO: 19], AA DERRCHLLHMCGRR [SEQ ID NO: 20], QQATEAGQHY QPGSPLHDHSHV [SEQ ID NO: 21], PQEAAARTNR [ Column identification number: 22], RSWVHPAPPYQMCLG [sequence identification number: 23] , And GGSRTHPR [SEQ ID NO: 24].   Depending on where the mutation that leads to the frameshift occurs, suddenly A portion of the mutant protein appears to have the same sequence as the wild-type protein, And a portion of the protein appears to have the sequence of the mutein. In addition, depending on where the mutation occurs, the nucleotide sequence may Mutein (indicated by * in the drawing) Will end. Thus, depending on where the mutation occurs, various Will be produced.   Mutations are expected to occur in the GAGA or CTCT motif in the cDNA. The sequence of the mutein is predicted accordingly.   Induced mutation, even if the mutation occurs at another position in the sequence The protein has a peptide sequence corresponding to the C-terminus of the predicted mutein. Such peptides were synthesized because they are likely to be present. Furthermore, tampa The C-terminal region of the protein is more likely to form an epitope than other regions of the protein Seems to be.   The identity of the synthesized peptide was confirmed by searching the gene sequence database .   Each of the synthesized peptides is then injected into rabbits, and the peptides Was purified. The techniques used to obtain the antibodies are those skilled in the art. Is a standard technique known to the public.   The resulting antibodies were then used in neuropathologically confirmed AD cases and control non-A D cases were examined on autopsy material of frontal cortex, temporal lobe and hippocampus. The presence of the antibody It is measured using standard detection methods known to those skilled in the art.   FIG. 1 shows the predicted peptides in the +1 open reading frame of β-amyloid precursor protein. Β in the frontal cortex of Alzheimer's patients identified using antibodies to Amyloid precursor mutein (βAPP+1). use The purified antibody has the following sequence, RGRTSSKELA [SEQ ID NO: 1]. It had an affinity for tide.   Results of other immunoreactivity tests performed using antibodies to the predicted peptide Are shown in Tables 2-5.   The presence of the mutein can be detected and the subject with AD It can be seen that it is correlated with. Therefore, one or more mutant tan It can be seen that the presence of parkin is an indicator of AD.   Table 6 shows immune responses in the frontal cortex (region 11), temporal cortex (region 38) and inside the hippocampus. Summarizes the responsivity results.   Other diseases may also correlate with the presence of the mutein as defined herein There is. For example, seven Down syndrome patients were tested according to the present invention. down Syndrome occurs in chromosome 21 resulting in overexpression of β-amyloid precursor protein. It is trisomy. The present inventors have studied the frontal and temporal cerebral cortex and marine Note that the horse contains plaque and entangled neurofibrin Thus, such overexpression may result in GAGs in the overexpressed β-amyloid gene. Accumulation of transcriptional mutations in neurons by frameshift mutation of AG motif It was assumed that the product could be promoted. Amyloid + 1 carboxy terminal peptide Obtained from the frontal and temporal cerebral cortices of Down's syndrome patients with the above antibodies specific for After immunocytochemical staining of the tissue, six out of seven patients were entangled. Immunoreactivity was observed with neurofibrin. The frontal cortex of the matched control is stained Did not. Therefore, mutated amyloid proteins are not only in Alzheimer's disease. Involved in other diseases, such as Alzheimer's neuropathology Down syndrome has also been correlated.   Multiple mutations found to occur in GAGA or CTCT motif Have been. Table 7 shows that complementary GAGA motifs were found in various cDNAs of the neural cell line. Indicates that it exists. This motif or tau and apolipotampa As can be seen from the sequence of the denatured E4, GAGAGGGAGAC (in the cDNA), G Similar motifs such as AGAA and GAGAT can lead to these diseases and Can be linked to frameshift mutations that are associated with these diseases. You. Presence of this or similar motifs in other RNA molecules May indicate that these motifs are involved in disease. this Is not related to such motifs, but still causes disease or Other mutations leading to related frameshift mutations may have occurred is there.   Table 8 shows that the GAGAC motif, βAP, was found in certain RNA molecules of the neural cell line. It indicates that P, tau and ubiquitin are present. This table also Above all, the chromosome of the gene (from which the mutant RNA molecule is transcribed) Position and molecular weight of the longest polypeptide form encoded by this RNA molecule And an abnormal +1 with its C-terminus (to which an antibody is raised) The predicted size of the peptide is also shown. These peptides are And also show unaffected wild-type N-terminal epitopes. It was also identified using another known antibody.   Example 2 Selection of antigenic peptides   Corresponds to a portion of the mutein in the sequence, as described herein Synthetic polypeptides (whether such peptides are chemically synthesized, Or recombinantly produced protein fragments) Specific for a mutein according to the invention if they have the following characteristics: Would be useful as an antigenic peptide to produce a unique antibody. Synthetic peptides are the best Containing a minimum of 8, and preferably 12-15 amino acid residues And the optimal length would be 20-21 amino acids. Hybrid wild Type / nonsense protein amino acid sequence hydrophilicity and antigenicity index Biotechnology science using computer programming (Analytical Biotechnology Sciences) in Boston, Mass. Therefore, it can be measured. Synthetic peptides that may be useful according to the invention The tide is preferably 100 to 15 hybrid wild type / nonsense protein. Includes a range of 12-20 amino acids within 0 carboxy terminal amino acids In.   The amino acid sequence of the selected peptide, at the appropriate concentration, May specifically interact with any protein of known sequence Computer databases for sequences (eg, GenBan Search by k). Preferred sequences have close homology (ie, "close" means 8 0 to 100% identity). is there.   Example 3 Detection of "mutated" proteins   Another embodiment of the present invention provides a method for determining disease status in a given tissue. "Mutants" or muteins. here Then, the above antibody is prepared. Then, the antibody or its idiotype-containing poly The amide moiety is mixed with the candidate tissue and indicator. The presence of naturally occurring amino acid sequences , Confirmed by the formation of an immune response signaled by the indicator. Candidate organizations include Any tissue or cell line to be tested for the presence of the mutein as noted Or body fluids are included.   Expression of a given hybrid wild-type / nonsense protein is determined as follows: Amino acids in the carboxy terminal range in hybrid wild-type / nonsense proteins Can be investigated using serum prepared in rabbits for the corresponding peptide You.   CMK cells or U3T3 cells35Labeled in the metabolic process with S-methionine, The extract is then immunoprecipitated with antiserum. Hybrid wild type / nonsense If the protein is present in the cell, the protein species of the corresponding molecular weight is C Will be detected in MK and U3T3 cells. This protein is t al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,76 ,4350-4354 (1979) Western blot of nuclear, membrane and cytoplasmic fractions The location can be determined relative to the membrane, nucleus or cytoplasm by analysis. This position The decision can be confirmed by immunofluorescence analysis, which mainly involves the plasma membrane You.   Metabolic labeling immunoprecipitation and immunolocalization assays have been described previously (Fur th, et al., Oncogene1: 47-58, 1987; Laemmli, U.K., Neture227: 680〜685 、 1970; Yarden, Y .; et al., EMBO J .;6: 3341-3351, 1987; Konopka, J.B., et al. , Mol. Cell. Biol.Five: 3116-3123, 1985). Immunoblot minutes Prepare a total lysate for analysis (using Fruth lysis buffer) (F ruth, M.E., et al., Oncogene,1: 47-58, 1987). The relative protein concentration is Using a calorimetric assay kit (Bio-Rad) using bovine serum albumin as an equivalent Set. Lysate protein containing approximately 0.05 mg protein was added to 2-mer Mix with an equal volume of 2xSDS sample buffer containing captoethanol and boil for 5 minutes And 10% polyacrylamide-SDS gel (Konopka, J.B. et al., J. Vir. ol.,51: 223-232, 1984), and immunoviron polyvinylzine diph. Ruolid (Millipore Corp., Bedford, MA) filters Moved to Protein blots are treated with specific anti-peptide antibodies (see below) did. Primary binding of specific antibody conjugated to horseradish peroxidase Anti-IgG secondary antibody was used and then ECL Western Detection system (Amersham International).   For metabolic labeling, 106Individual cells were prepared by Dulbecco's repair without methionine. 100 μCi in 1 ml of positive Eagle's medium (Amersham Corp.)35Uses S-methionine And label for 16 hours. Tan obtained from cells labeled with anti-peptide antiserum Immunoprecipitation of protein has been described (Dymecki, S.M. et al., J. Biol. Chem.267: 4 815-4823, 1992). 107cpm acid insoluble35S A portion of the lysate containing -methionine was combined with 1 µg of antiserum in 0.5 ml of the reaction mixture. Incubated in. Immunoprecipitation sample is SDS-polyacrylamide gel electrophoresis Analysis was performed by electrophoresis and autoradiography.   For immunological localization studies, 107Individual CMK cells in sonication buffer (6 0 mM Tris-HCl, pH 7.5, 6 mM EDTA, 15 mM EGTA, 0 mM . 75M sucrose, 0.03% leupeptin, 12 mM phenylmethyl Resuspend in sulfonyl fluoride, 30 mM 2-mercaptoethanol) . Cells are sonicated six times for 10 seconds each, and at 25,000 xg for 10 minutes at 4 ° C. Centrifuge at. The pellet was dissolved in 1 ml of sonication buffer and 25,000 Centrifuge at 4 ° C for 10 minutes at xg.   This pellet (nuclear fraction) is resuspended in 1 ml of sonication buffer, and Add to the volume of 2xSDS sample buffer. Obtained above (after first sonication) The supernatant is centrifuged again at 100,000 × g for 40 minutes at 4 ° C. This supernatant (size Tosol fraction) and add to an equal volume of 2x concentrated SDS sample buffer. Add. Wash the remaining pellet (membrane fraction) and proceed as described above. And dissolved in sonication buffer and SDS sample buffer. The protein sample is Laemmli method (Konopka, J.B. et al., Mol. Cell. Biol.5: 3116-31 23, 1985) and analyzed by electrophoresis on a 10% polyacrylamide gel. I do. These proteins were purified from the gel for subsequent immunoblot analysis. Transfer to a 45 μm polyvinylidine difluoride membrane. The main binding of antibodies is Hosera Detection is performed using a secondary anti-IgG antibody conjugated to dish peroxidase.   For immunohistochemical localization of a given protein, if desired, CMK cells Cells or U3T3 are grown on coverslips to approximately 50% confluence and After removing the medium, the plate is washed with PBS (pH 7.4). These cells contain 0. 3 in 1% paraformaldehyde containing 075% Triton X-100 Pre-fix for 1 min at 7 ° C., rinse with PBS and then 4% paraform Fix with aldehyde for 10 minutes. After the fixation step, the cells are rinsed in PBS, Stop the reaction in PBS with and finally rinse again in PBS. antibody To stain the cells, cells are first blocked (3% bovine serum albumin in PBS) And incubate at 37 ° C. for 1 hour. The cells were then purified by the antiserum ( 1: 100 dilution or with pre-immune rabbit serum (1: 100) (see below)) Incubate at 7 ° C for 1 hour. After incubation with the primary antibody, the cells In PBS containing 3% bovine serum albumin and 0.1% Tween 20 With fluorescein-conjugated donkey antiseptin and diluted 1: 100 in blocking solution Incubate at 37 ° C for 1 hour in rabbit IgG (Jackson Immunoresearch, ME) To   The coverslips are washed in PBS (pH 8.0) and mounted on glass slides Glycerin is added to each coverslip prior to drying, and sealed with clear nail polish. Seal. All glass slides are Zeiss Axiophoto microscopy Tested in a mirror.   Example 4 Analysis of biological samples   The above detection method for a given mutein or nucleic acid comprises a marker protein. Tissues, cell lines, and body fluids suspected of containing protein (such as cerebrospinal fluid Or blood including, but not limited to, venous blood, arterial blood, and umbilical cord blood). Can be applied to the analysis.   For example, a sample of CNS tissue suspected of having a disease state can be analyzed. In this case, the specific disease state of the tissue may be higher than the healthy tissue in a detectable value. In accordance with the present invention, the inclusion of a lid wild type / nonsense protein Has been observed.   Prepare an aliquot of this suspected sample and a healthy control sample and describe it here. Amount of an antibody specific for the hybrid wild-type / nonsense protein Mix with indicator group. This mixture is typically used to generate an immune response. Incubate for a sufficient time as is known. Then, incube The resulting mixture is assayed for the presence of the immune response indicated by the indicator. Next And the hybrid wild-type / nonsense protein in the suspect and control samples By comparing the relative values of the disease state or Diagnosis of a healthy state becomes possible.   The above type of assaying for the presence of a hybrid wild type / nonsense protein comprises: Of course, analysis of the encoded RNA, for example, those which are conventional and known in the art. Performed by Northern blot analysis or RNA dot blot analysis can do.   Disease treatment method according to the present invention   Disease treatment methods according to the present invention contemplate the removal of mutant transcripts. Transcription sudden change Evidence supporting the presence of the heterologous RNA molecule includes the homozygous Brattleb oro) Vasopressin cDNA with frameshift mutation in hypothalamic cells Observed in 1 out of 100 colonies, while frameshift mutation Is not identified.   In the human hypothalamus, the age-related increase in vasopressin + 1 immunoreactive cell count was observed. No addition was observed (as opposed to rats). However, in utero (pregnancy 2) 9-42 weeks), +1 immunoreactive cells containing +1 vasopressin protein A huge increase in the number is detected. After birth, the number of these cells is only a few fall back. Down syndrome with very high expression of βapp gene (5 times higher than normal) Also observed the highest values of βapp and +1 muteins, Gene expression was higher than AD, which was not found to increase above normal . βAPP + 1 mutein and UbiB + 1 mutein in the same cell Coexist with (and are tangled and present in dystrophic neurites) ) Was also found. Therefore, this temporary increase was attributed to genomic events. I don't think   RNA molecules containing frameshift mutations (ie, frameshifted Transcript) or mutein correlates with a disease state The disease can be treated according to the present invention as follows, Enzymes, such as ribozymes, that help to selectively remove RNA by cleavage By administering to a patient in need of administration of such an enzyme, By administering a wild-type mutant RNA in a substantially uncleaved form To administer the hybrid wild type / wild type nonsense protein Or to form nucleic acid duplicates that render the mutant RNA untranslatable. Oligonucleotides complementary to the mutant RNA or such oligonucleotides By administering a sequence encoding a tide to a cell.   Patients in need of the above administrations include those who are showing symptoms of the disease, Patients suspected of developing the disease, ie, a frameshifted peptide (eg, , Or a peptide having an amino acid sequence in the +1 or +2 reading frame). Tissue samples, for example, patients monitored in accordance with the present invention by measuring cerebrospinal fluid. I will.   According to the present invention, ribozymes are delivered to affected or suspect cells. Reached to cleave the mutant RNA and consequently mutate the mutant RNA It can disable a cell's ability to translate into protein. Wild-type protein Is provided in protein form if not previously produced by the cell Or by administering wild-type RNA to the cells along with the ribozyme. Can be offered. Wild-type RNA is simply a GAGA or CTCT mutation Engineered to contain sequences that can be distinguished from mutant RNA sequences that are not at the level of Can be For example, the mutant RNA is a third base silent mutation, ie, The coding sequence of RNA is not changed, but wild-type RNA is not cleaved by ribozymes. And may contain mutations that render them almost or substantially insensitive.   Without being bound by one theory, reducing the proportion of mutant RNA % Of correct protein produced for lid wild type / nonsense protein Reduce or prevent further progression of the disease by increasing And possibly reverse the disease state. In addition, all sudden changes Heterologous transcription does not directly produce toxic mutant proteins in neuronal tissue. It is also possible. For example, the mutein is a proteasome system and / or Or is transported to the lysosomal system or secreted immediately (eg, (By tracts or regulatory pathways) and elsewhere. However However, sometimes muteins accumulate in the membranes of organelles, for example in the endoplasmic reticulum. Would destroy the normal processes of cellular machinery.   The wild-type mutant RNA encodes the correct protein. Illness When a neurodegenerative degenerative disease is present, the preferred wild-type sequence is a beta amyloid precursor tannin. Protein gene, tau gene, ubiquitin B gene, apolipoprotein-EFourHeredity , Microtubule-associated protein II (MAP2) gene, neurofilament protein Quality genes (L, M and H), presenilin I and II genes, big tau ( Big Tau), GFAP, P53, BCL2, semaphorin III, HUPF-1, HM RNAs encoded by G and NSP-A are included. Distribution of these genes The columns are provided in the drawings herein. Another preferred wild-type RNA is alpha And beta-tubulin genes The sequences of the offspring are, respectively, Cowan et al., Mol. Cell. Biol.,Three ,1738-1745 (1983); Lewis et al., J. Amer. Mol. Biol.182, 11-20 (1985).   When the disease is a non-hereditary cancer, the preferred wild-type RNA is the human p53 gene And gene sequences including but not limited to the BCL-2 gene. Has been Mammalian phosphoprotein p53 plays an essential role in regulating cell division Have been shown to be necessary for the transition from the G0 phase to the G1 phase of the cell cycle. Have been. p53 is usually present at very low levels in normal cells and is It is believed that p53 is present at a high level, which is believed to be a suppressor gene. P53 has been shown to play a role in transformation and malignancy. Normal and P53 gene allele obtained from cerebral and malignant tissues has BglII site polymorphism (Buchman et al., 1988, Gene70: 245). The p53 coding region contains several GAGA motifs, such as Buch GAGAC at position 1476 and 1498 at position 1498 of the sequence published by Buchman et al. GAGA, GAGA at position 1643, and GAGA at position 1713 And these motifs provide candidate sites for frameshift RNAs according to the present invention. Is shown. Thus, a frameshift mutation in the p53 RNA is May lead to loss of tumor suppressor function. Such a protrusion in p53 Detection of mutations can be diagnostic of precancerous or malignant, and p53 function Therapy described herein restores tumor suppressor function Can be.   In type II diabetes mellitus, which occurs frequently in the elderly, Langerhans is Frameshift mutations in various transcripts (eg, ubiquitin transcripts) Degenerate as a result of   The present invention also provides for frameshift mutations by targeting RNA transcripts. Those with one or more GA, GT or CT deletions Also encompasses methods of combating disease caused by at least one RNA. Scratch In accordance with the present invention, a frameshift mutation in the RNA Cleavage using ribozymes with sequence specificity (Denman et al., Arch. Of Bio. chem. Biophysics.32371-78, 1995) and mutant mRNAs. It is also contemplated that can be removed to correct for frameshifted RNA values. Therefore, diseases associated with frameshifted RNAs are not suitable ribozymes or It is treated by administering to a patient a sequence that encodes a ribozyme.   Ribozymes of the selected specificity are available in Sullenger and Cech, Nature371: 619-622, 1994). And incorporated by reference herein). Riboza The sequences encoding the zyme and ribozyme are described in Tuschl et al., Curr. Opin. St ruc. Biol.5: 296, 1995 and Wahl et al., Curr. Opin. Stru c. Biol.5: 282, 1995. Can be   The present invention also provides oligonucleotides complementary to target cells containing frameshifted RNA. Delivering sequences encoding nucleotides or complementary oligonucleotides Depending on one or more GAGA or Is caused by at least one RNA with a CTCT mutation Alternatively, the present invention also includes a method for treating a disease related thereto. The above oligonucleotide Are abruptly altered with respect to regions of the mutant RNA containing GA, GT or CT deletions. Have heterologous sequences and thus hybridize in vivo with the mutated RNA To contribute to the transcription inability of such RNA. Strong target Oligonucleotides with site binding affinity, i.e. sufficient target site homology, are preferred. No. CTCT, CTCT, wherein the nucleotide length is between 10 and 30 G, CTCTC, CTCTT or CCTTA motif or GAGA, GA Oligos containing GAG, GAGAC, GAGAT or GAGAA motifs Nucleotides are also preferred.   The treatment of the disease according to the invention is described below and comprises Preparation and administering the substance to a patient suffering from a disease according to the invention In. As used herein, "substance" refers to any of the following: Ribonucleic acid sequence, wild-type transcript, antisense sudden A nucleic acid sequence encoding a mutant RNA or DNA or antisense sequence, Wild-type protein encoded by the wild-type gene, frameshifted (Nonsense) Protein specific antibody.   The method for treating a disease according to the present invention can be achieved as follows. Example 5 Thus, a method of using ribozymes according to the present invention is described.   Example 6 describes the administration of the vector. In Example 7, the protein, ribo The administration of nucleic acid vectors using zymes or liposomes is described. In Example 8 Describes the delivery of these substances across the blood-brain barrier. Finally, in Example 9, Has a protein, ribozyme or other nucleic acid, such as a gene expression construct A method for delivering a cell containing a vector is described.Example 5 Therapeutic method according to the invention using ribozymes   Ribozymes or ribozymes that selectively remove or promote frame-shifted RNA Alternatively, the preparation and delivery of the nucleic acid sequence encoding the ribozyme is performed as follows. You.   Selective removal of mutant transcripts according to the invention   Thus, the present invention provides for GAGA or βGA in the β-APP and ubiquitin B genes. Is the result of transcriptional disbelief occurring at or near the CTCT motif. To treat disease caused by transcription of frameshifted mRNA Include. The accumulation of abnormal proteins encoded by these messages It is believed to contribute to the progression of Alzheimer's disease, and therefore the mutant transcript Removal is therapeutically valuable. The mutant transcript described herein can be Ribozymes using ribozymes designed and administered as described in It is also contemplated by the present invention that translation mediated by ing. In addition, under certain circumstances, ribozyme-cleaved messages are It may be advantageous to substitute a foreign transcript encoding the protein, The transcript is then resistant to cleavage and therefore its synthesis is described herein. Not subjected to transcriptional errors or post-transcriptional corrections that produce modified transcripts .   To selectively remove ubiquitin B and β-APP mutant transcripts in cells Treatment strategies are described below. However, the present invention relates to the method described below. Therefore, other mutant transcripts, whether or not disclosed herein, are subsequently identified. It is intended to be selectively removed even if it is discovered.   Hammerhead class ribozymes are the smallest known, and Useful for both in vitro synthesis and delivery to cells (Sullivan, J. Invest. Derm. atol.103: 85S-98S, 1994; Usman et al., Curr. Opin. Struct. Biol.6: 527〜 533, 1996). Sequence motifs for hammerhead cleavage targets UH (where H represents ribonucleotides A, U or C, and G is (Not shown) and this sequence is cleaved after H You. The core functional unit of the hammerhead ribozyme is helix I (which is open Hybridizes with the 3 'mRNA sequence at the cleavage site), helix II (the cleavage site) 22 intervening ribonucleotide catalytic domains) and helix III ( This is the 5 'sequence of the UH cleavage motif and the 5' sequence containing the "U" of the motif. Is a three-segment structure consisting of a sequence and a hybrid) (Haseloff and Gerlach, Nature334: 585-591, 1988; Ruffner et al., Biochemistry33 : 10695-10702, 1990). Studies have shown that the lengths of helices I and III are The zyme binds to the region around the cleavage site and after cleavage the ribozyme itself The former has been shown to be proportional to the efficiency of emission, the former being important for target recognition, while The latter reduces the true catalytic activity, ie, the ratio of inactivated target molecule to ribozyme. Higher than the 1: 1 stoichiometric ratio observed with sense-RNA mediated inactivation It is important to maintain the kinetics of the catalytic activity. Ideally, helix I is 3 to 5 ribonucleic acids for 9 to 13 ribonucleotides in helix III Reotide length (Tabler et al., Nucleic Acids Res.twenty two: 3958〜3965、1 994; Hendry and McCall, Nucleic Acids Res.twenty four: 2679-2684, 1996). Other factors For example, stem loop formation in unbound ribozyme and target mRNA And play a role in the stability of ribozymes and Multiple ribozyme designs can be used to predict and / or offset interactions. Child model generation tests and in vitro tests are often performed (Sioud et al., Nucleic  Acids Res.twenty two:5571-5575, 1994; Gavin and Gupta, J. et al. Biol. Chem.272: 1461 ~ 1472, 1997).   Mutant ubiquitin B transcripts are delivered to cells by hammerhead ribozymes Can be removed from these cells by applying it in a liposome vector. it can. The present invention uses these ribozymes to generate mutant transcripts at the 5 'site. GAGA recognizes these transcripts and is the source of polymerase shift during transcription Or cleaving at the GGT-containing site, and thereby Including removing the frameshift portion of the translation product from the cells. You.   The sequence immediately before the GAGA motif of the ubiquitin transcript is GCGUCU. It thus contains the cleavage recognition motif UC. The length considerations mentioned above Given hindrance, ideally binds to helix I for a particular mutation The sequence performed is GAG, however, such ribozymes are Helix I is expected to bind with the same efficiency as the transcript or wild-type transcript It is extended to further include four nucleotides, so that all seven bases are suddenly changed. Hybridizes to the heterologous transcript, but is insufficient to destabilize binding to the wild-type sequence. Must be created. This strategy is a mutation More efficient when the transcript is caused by a deletion rather than an insertion It is a target. This is because in the former, the absolute Length effects are of concern, however, impeding efficient ribozyme binding In the case of ubiquitin that is sufficiently mismatched with the wild-type sequence, Complementary to various mutant sequences that can result from incorrect transcription of the chief or GGT sequence Delivery of a pool of unique, designed ribozymes will result in most defective messages The di-frameshift product will not be translated.   Such a strategy is based on the fact that the cleavage site is 5 (at most) to 5 'side of the cleavage site. Practical in situations where there are three bases, however, the longer the distance A correspondingly longer helix I binding domain is required, and Therefore, it is necessary to create a 3 'mismatch to distinguish between mutant and wild-type transcripts Coupled with gender, these techniques are not suitable for handling certain mutations. ing. This is true for GAGA-deleted transcripts of β-APP. One GAGA The motif is separated from the cleavage site by one base, while the remaining four motifs Is between 7 and 20 bases from the nearest 5 'cleavage site. In such a case Cannot avoid cleavage of the wild-type transcript by the hammerhead ribozyme, Must be replaced by cleavage-resistant transcripts simultaneously with removal of mutant transcripts (Sequences that may give rise to cleavage-resistant transcripts) See Table 10 for substitutions), where the ribozyme is the first GAGA motif Designed to cleave both types of messages at any UH5 'site .   Advantageously replacing β-APP transcript in all cells that require β-APP transcript Which is therefore driven by the β-APP promoter sequence, Co-delivery of expression vector with spliced β-APP minigene Can be used. Numerous studies have been conducted on this promoter ( Among them, Lahiri and Robakis, Brain Res. Mol. Brain Res.9: 253〜257,199 1 year; Bourbonniere and Nalbantoglu, Brain Res. Mol. Brain Res.19: 246〜250 1993; Lukiw et al., Brain Res. Mol. Brain Res.twenty two: 121-131, 1994; Lah iri and Nall, Brain Res. Mol. BrainRes.32: 233-240, 1995; Bourbonniere  and Nalbantoglu, Brain Res. Mol. BrainRes.35: 304-308, 1996; Quitschk e et al., J. et al. Biol. Chem.271: 22231-22239, 1996), and cells in tissue culture. 96 bp 5 'to the transcription start site is sufficient for vesicle-type specific promoter activity (Quitschke and Goldgaber, J. Biol. Chem.267: 1 7362-17368, 1992). These 96 base pairs are modified at the ribozyme recognition site. Prevents the cleavage of substituted β-APP transcripts and can be modified with GAGA motifs It is initially engineered to prevent a shift in the transcription machinery that produces mutant transcripts. These substitutions can be fused in each case It must be done so that translational "silent" mutations are introduced. Examples of such changes are shown in Table 10.   Example 6 Preparation of nucleic acid vector   A wild-type sequence of a ribozyme-encoding sequence or mutant RNA, or The antisense (complementary) mutated oligonucleotide sequence is inserted into the desired mammalian cell. Can be cloned into an appropriate vector for expression. like this Vectors contain a promoter that is expressed in the target cell type, and And enhancers and loci selected for expression in a given cell type It may also include a nodal region. Examples of useful vectors according to the present invention include target This includes any vector that successfully transmits the coding sequence to mammalian cells. It is not limited to this. Nucleic acids can be viral (eg, adenoviral or retroviral). Virus or non-viral DNA or RNA vector (where the non-viral Viral vectors include plasmids, linear nucleic acid molecules, artificial chromosomes and episodes. (Including, but not limited to, vector vectors) for use in the present invention. Can be transfected. Expression of the heterologous gene is determined by plasmid DNA was converted to muscle (Wolff J.A. et al., 1990,Science, 247: 1465-1468; Carson D .A. et al. U.S. Pat. No. 5,580,859), thyroid (Sykes et al., 1994; Hum). an Gene Ther.Five: 837-844), melanoma (Vile et al., 1993, Cancer Res.,Five Three : 962-967), skin (Hengge et al., 1995, Nature Genet.,Ten: 161-166), liver (Hickman et al., 1994, Human Gene Therapy,Five: 1477-1483) Airway epithelium (Meyer et al., 1995, Gene Therapy,Two: 450-460) Was.   For example, the retroviral gene transfer vector SAX (Kantoff et al., Proc. N at. Aca. Sci.83: 6563,1986) and selected coding sequences in target cells Can be inserted. SAX is a neoR site starting from the retrovirus LTR. Moroni having the gene and the human ADA gene starting from the internal SV40 promoter -A virus-based vector. Thus, a SAX vector contains, for example, SA By replacing the hADA coding region in the X vector with the desired coding region Ribozyme coding sequence or wild-type RNA, or as described herein. Containing the selected antisense sequence identified as Operable by those skilled in the art.   Can encode or manipulate the selected ribozyme Possible expression vectors are known in the art. Yuyama et al., Nucl. Aci ds Res.twenty two: 5060,1994, is a multifunctional expression vector encoding several ribozymes. Is described. This vector contains the selected ribozyme sequence. Specificity by substituting one or both ribozyme sequences in the It can be adapted to encode a ribozyme having sex. Zhou et al ., Gene149: 33, 1994; Yamada et al., Virology205: 121,1994 are for T cells Retroviral transduction of ribozyme sequences is described. These retro ui Lus vectors can be adapted to encode selected ribozyme sequences. it can. Liu er al., Gene Therapy1: 32, 1994; Lee et al., Gene TherapyTwo: 3 77,1995 is for use in expressing any of the nucleic acid sequences contemplated by the present invention. Compatible expression vectors are described.   Generally, the nucleic acid molecule will be administered in a manner compatible with the dosage formulation, and prophylactically and / or Or it is administered in an amount that is therapeutically effective. End products (eg, anti (Sense RNA molecule or ribozyme) It is directly proportional to the amount required per cell and the number of cells to be transfected. The positive coefficient is the uptake efficiency of these molecules. Genes must be expressed from nucleic acid molecules If so, the target cells that produce the appropriate value of the encoded product When calculating the number of nucleic acid molecules, the strength of the relevant transcription regulatory sequence must also be considered. Must. When administering a gene expression construct, a suitable dosage range may be a single dose 0.5 to 1 μg or 1 to 10 μg, or optionally 10 to 100 μg of nucleic acid Leader. It is believed that dosages of up to 1 mg can be used to advantage. Per cell Varies with the size of the construct, so that the D Adjusting the absolute amount of NA, appropriate gene copy when injecting large constructs Note that you must ensure that the numbers are reserved.   Nucleic acid molecules administered in accordance with the present invention include, for example, water, phosphate buffered saline, and the like. Or in a physiologically acceptable diluent such as saline. And may further include an adjuvant; however, other formulations may be available. It is also intended to be useful. Incomplete Freund's adjuvant, phosphoric acid Adjuvants such as aluminum, aluminum hydroxide or alum are Materials well known in the art. The nucleic acid molecules described herein are topical Administration can be either targeted or systemic. Apply the pharmacological composition topically Both methods of systemic and systemic administration are well-known in the art.   The nucleic acid constructs used in the present invention can be administered in single or multiple doses. Wear. Multiple dose schedules consist of 1 to 10 separate doses with the initial dose course The amount of the transfected nucleic acid Continue with other doses administered at subsequent time intervals necessary for maintenance and / or augmentation. It is a thing. Such an interval may be a requirement of the recipient for therapeutic nucleic acids. If the administered nucleic acid does not become integrated into the recipient's genome The ability of the nucleic acid to self-replicate in mammalian cells and non-renewable nucleic acids (eg, (Non-replicating molecule). Preferably, the medical need of the recipient mammal The nucleic acid or its product during its lifetime or at least for a long time, for example 1 When determined to be necessary for years or more, the nucleic acid is Can be encoded by a vector sequence that replicates itself. Tiger of nucleic acid molecule The efficacy of transfection and subsequent maintenance depends on the transfected Monitoring the activity of a marker gene that can further include To inhibit the production or the protein encoded by the gene in question By directly measuring either the decrease in the designed protein level, You can say These assays are known to those skilled in the art. It can be performed using conventional molecular and biochemical techniques such as   Successful therapy using the nucleic acid molecules of the invention is known clinical indicators (eg, neurological). Assessment of degenerative diseases, loss of cognitive or motor function) it can. If the progression or treatment of such symptoms in the subject is If treated prophylactically in patients believed to be Treatment compared to control subjects compared to that observed in non-control subjects. If improvement in the patient's condition is observed, the treatment is considered effective. Performing such an assessment is well within the knowledge of those skilled in the art.Example 7 Liposomal delivery according to the present invention   The substance may be used in accordance with the present invention using any means of delivery known in the art. Can be administered. Liposomal delivery is described below. As described herein Liposomes used to administer substances such as ribozymes can be of various types. And can have various compositions. Key restrictions Is that liposomes must not be toxic to living cells and intracellular Part of the liposome content must be delivered.   PH sensitive to mediate cytosolic delivery of calcein and FITC dextran The use of liposomes is described (Straubinger et al., Cell32: 106 9-1079, 1983; Straubinger et al., FEBS Letters179: 148-154, 1985) . Other considerations regarding pH-sensitive liposomes can be found in E. Sourds (A.E. Sow er), edited by Nejat Duzgunes and others Textbook titled "Fusion of Phospholipid Vesicles Induced by Cations and Protons" CELL FUSION, Plenum Press, New -York State, 1987, 241-267, Chapter 11. Ellens e et al., Biochemistry,twenty three: 1532-1538,1984; Bentzetal., Biochemistry,26: See also 2105-2116, 1987.   Liposomes can be of various sizes and separate the internal and external compartments. It may have one or several membrane layers separating. Liposome structure The most important factor in the delivery of a substance is that only one or a few liposomes A sufficient amount of enzymes or nucleic acids so that only And that the liposomes are resistant to disruption. Liposome Structures include small unilamellar vesicles (SUVs, less than 250 Å in diameter), large Single lamellar vesicles (LUVs,> 500 Å in diameter) and multiple lamellar Vesicles (MLs) are included. In the example shown below, the ribozyme is administered using S UVs are used, but these methods are described here. It can be applied to administer any substance.   SUVs are isolated from other liposomes and unincorporated enzymes by molecular weight And molecular sieve chromatography (this method is Reliable but time-consuming and diluting liposomes) or differential centrifugation (this The method is rapid but yields a wider range of liposomes). Can be isolated from liposomes or enzymes that have not been incorporated.   Liposomes include natural and synthetic phospholipids, glycolipids, and other lipids and lipids. Congeners, cholesterol, cholesterol derivatives and other cholesterol congeners Charged species that impart a net charge to the body or membrane, and additional molecules after liposome formation Reactive species that can react to associate with the membrane, as well as chemical or biological activities Can be produced from other lipid-soluble components having   Useful liposomes according to the present invention include, for example, liposomes containing ribozymes. As described in US Pat. No. 5,296,231 describing the preparation of Although useful, liposomes according to the present invention can be prepared as described herein. It should be noted that any of the materials mentioned can be contained. Simply put The aqueous component containing ribozyme (or desired substance) and vesicles By combining under the conditions formed. Phospholipid concentration is lamellar structure And the aqueous component is compatible with the biological stability of the enzyme. Must be capable. Combine phospholipids on glass and then form vesicles The method is to dry the phospholipids on glass and then Disperse phospholipids in volatile or non-volatile organic solvents Inject into the heated aqueous component and use surfactant to convert phospholipids into aqueous Dissolved in a layer and then dialyzed to remove surfactant. water The concentration of the ribozyme in the sexual component is such that the enzyme is frozen on dried phospholipids and then This mixture can be rehydrated and enhanced with a reduced amount of aqueous buffer. SUVs sonicate the above mixture or use a stoma tube or French press ch Press) from the above mixture by dispersion through the pores Can be.   The ribozyme incorporated in the liposome is injected internally or locally into living cells. Can be given. Liposomes develop for administration into animals or humans. It must be heat-free and sterile. To eliminate pyrogens, chemical Of liposomes using pyrogen-free raw materials, including products, enzymes and water I do. Sterilization should be performed by filtering liposomes with a 0.2 micron filter. Can be. For injection, liposomes are physiologically dissolved in sterile, pyrogen-free buffer. Suspend at effective concentration. Liposomal preparations must be pyrogen-free even for topical administration Desirably, and be sterile. In this case, even if applied to the skin However, physiologically effective concentrations of liposomes are It can be suspended in a coal gel. Generally, gels disrupt liposome membranes It should not contain any non-ionic surfactants that may be present. Liposomes localize Other vesicles can be used for localized applications.   The concentration of the substance in the final preparation can vary over a wide range and typical concentrations The degree is on the order of 50 μg / ml. For pH-sensitive liposomes, lower concentrations For example, 0.01 to 1.0 for liposomes administered internally to cells. It can be used on the order of μg / ml. For topical applications, a higher liposome Sosome concentrations can be used, for example, 10-fold or higher.   Example 8 Administration across the blood-brain barrier   The substance described herein can be administered such that the administered material crosses the blood-brain barrier. Or its coding sequence or a liposome containing such a substance If administration is desired according to the present invention, several methods are known in the art. Have been.   For example, the substance to be administered, whether it is a protein, nucleic acid, or Even posomes, polypeptides such as parents that increase permeability at the blood-brain barrier It can be administered simultaneously with the oleaginous polypeptide. Examples of such polypeptides Include bradykinin and receptor-mediated penetrants, such as US Pat. A-7 described in 112,596 and 5,268,164 or the like. , But is not limited to. For permeable polypeptides Thus, co-administered ribozymes, coding sequences or liposomes may It can penetrate the barrier and reach the cerebrospinal fluid compartment of the brain, The ribozyme or coding sequence then reaches the target neuron cell. To enter the cells. Alternatively, the substance administered may be a steroid Coupling with trogel or androgel and binding to steroid receptors Increase the degree of cohesion, and thus gain access to the brain.   Such as ribozymes, antibodies, nucleic acids or liposomes containing such molecules Another exemplary method of administering a substance in accordance with the present invention is disclosed in US Pat. No. 82,107, the substance to be administered and transferrin It involves forming a complex between the receptor and the reactive antibody. This complex contains a cleavable or non-cleavable linker And transferrin receptor on capillary endothelial cells of the brain The substance is administered in a form that is active in the blood-brain It is transmitted through the gate.   Example 9 Ex vivo treatment   In vivo therapy (ie, for uptake by cells and subsequent in situ expression) Ex vivo therapy (ie, in vivo therapy) as well as therapy in which nucleic acids are administered directly to the patient. Administering the nucleic acid to cells cultured or transplanted in vitro, and transferring The transplanted cells are subsequently transplanted into a clinical patient to provide a therapeutic product. Therapeutic nucleic acids can also be administered for use in therapy). Ex vivo genetics The method of child therapy is described in detail herein. Transformed by these methods Transfected or transfected cells into a multicellular host, such as a mammal. Is still maintained in such cells after being given (eg, by transplantation) Some plasmids deliver the gene product to the host. The gene in question, especially cure The therapeutic gene is expressed by the transplanted cells and Required RNA (eg, antisense RNA or ribozyme) or It is intended to provide the protein to a recipient organism, especially a human.   Familiar with nucleic acid transfection methods as known in the art Different cell types can be used according to the present invention. Such cells contain the recipient organism Cells of the same species as the organism, or even ex vivo nucleic acid transfer prior to reintroduction. Cells taken from the recipient organism itself for action can be included. like this Various autologous cell grafts are known in the art. One common example is bone marrow Bone marrow from a donor or a clinical patient (eg, high dose Patients who are undergoing an amount of cytotoxic treatment such as ionizing radiation) And then infused and transplanted into the patient, so that the cells can Remigrate to an organ.   a. Cell dose   The number of transfected cells administered to the recipient organism depends on the treatment required for the organism. Transfected cells produce absolute or other gene products It is determined by dividing by the average amount of the agent. The steady state plasmid copy number is , The expression value of the gene in question contained in the plasmid (this value is also Of the nucleotide and transcription factors in a given host cell background (Determined by availability), as well as the strength of its origin of replication and host Factors determined by the cell environment, nucleotides and replication enzyme complexes Note that it varies depending on availability. As a result, given the problem Gene expression per cell must be determined empirically before administering cells to the receptor Must.   Efficient methods for transfecting and transplanting cells are known in the art. However, these methods claim that transfected cells are immortal. That is not guaranteed. In addition, the product encoded by the transgene The need for a recipient organism can fluctuate over time. From these considerations As such, cells can be administered in single or multiple doses as needed. Is intended. For multiple dose schedules, the initial course It can contain from 1 to 10 separate doses and can be transfected. At subsequent time intervals necessary to maintain and / or enhance cellular values of The other doses given will follow. Such an interval may be Depends on the lasting need of the recipient for the organism. Preferably, the recipient mammal's medicine Depending on the specific need, the gene product may be in its lifetime or at least for an extended period of time, e.g. When determined to be necessary for years or more, transfection The cells that have been implanted are such that they are permanent in the recipient Regular bone marrow cell transplantation unless regular migration is possible. On a schedule, for example, would be replenished once a month or twice a month.   b. Nucleic acid dosage   When nucleic acid vectors capable of replicating in transfected cells are used In a cell receiving at least one copy of such a vector, This vector replicates until copy number equilibrium is achieved, so intracellular The absolute amount of nucleic acid transfected into is not critical. As an initial estimate Equivalent to between 1 and 10 copies per cell transfected Those skilled in the art can use vector amounts, The ratio of plasmid molecules to cells needed to optimize the DNA can be adjusted. Vectors or transfection techniques particularly used in the present invention include trans Produces stable integration of the gene in question into the chromosome of the transfected cell. As a result, after transplantation into a recipient multicellular organism, for example a human, The need to maintain selection for such cells.   c. Administration of autologous or syngeneic cells   Between individuals of a single species (or from one individual into a cell culture system and The cell type that is usually transplanted is the hematopoietic stem cells present in the bone marrow These cells, which are of the cell type (HSCs), are transfected in culture during nucleic acid transfection. It has the advantage of being easy to adapt to, and is therefore correct for use in the present invention. Suitable for. Cultures of HSCs will contain operator sequences and Transfected with a minimal plasmid containing the gene, and The transfected cell is a recipient mammal in need of this gene product. Administered to Transfection of hematopoietic stem cells is performed by Mannion-Henderson et a l., 1995, Exp. Hematol.,twenty three: 1628; Schiffmann et al., 1995, Blood,86: 1218 ; Williams, 1990; Bone Marrow Transplant,Five: 141; Boggs, 1990, Int. J. Cell Cloning,8: 80; Martensson et al., 1987, Eur. J. Immunol.,17: 1499; Okabe e t al., 1992, Eur. J. Immunol.,twenty two: 37-43; Banerji et al., 1983 Cell,33: 7 29. Such a method can be used advantageously according to the invention. Wear. Administration of the transfected cells can be performed as described below. Proceed according to established methods for administration of untransfected cells.   Transplantation of hematopoietic cells, for example, in bone marrow transplants, is commonly performed in the art. Thomas (Thomas) et al. (1975, New England J. Med.,292: 832 to 843) And a modified method thereof. This way Can be briefly summarized as: Patients with syngeneic grafts or immunological deficiencies In patients, pretreatment control to suppress immunity is not necessary; however, non-self Immunosuppressive drugs, e.g., when donor cells are administered to a patient with a responding immune system For example, cyclophosphamide (50 mg / kg (body weight), daily for 4 days, 36 hours after implantation). Leukemia patient removes cancerous blood cells To receive a 1000-rad midline dose of whole-body irradiation It has an immunosuppressive effect. After pretreatment, bone marrow cells (this population is Active hematopoietic stem cells or HSCs) are administered by infusion and then These cells migrate to the hematopoietic system of the recipient host. Graft success is well known in the art Monitors the reappearance of many mature blood cell types by immunological and molecular methods It is measured by: Theoretically, only 1-10 HSCs are fatal In the case of long-term immigration and resettability of a recipient mammal that has been It is advantageous to optimize the rate at which resettlement occurs in transplanted patients, and therefore therapeutically 10 to 100 pieces to be effective, or Or even to administer transplanted bone marrow samples containing 100 to 1000 HSCs. is there.   Lymphoid cells and parenchymal cells are both intended to be used in the present invention . Such parenchymal cells include the islets of Langerhans, thyroid gland, adrenal cortex, muscle, and cartilage Or other synovial tissue, kidney, epithelial tissue (especially intestinal cavity, lung, heart, liver, kidney, And the inner and outer epithelial tissues of urones and synovial cells), and especially the nervous system It is.   Make transplanted cells at least collectively resistant to immune rejection by the recipient organism High NFκB (high NFκB “setpoint”) ) Expressing transplant cells, which are still destroyed by autoimmune host lymphocytes It is destroyed, but it has a strong growth ability to grow at a rate exceeding the rate of cell killing Reap the benefits of, and thereby transform, long-lived therapeutic cell populations into recipient organisms It is intended to be provided. Such cells are themselves transgenic Use a protein extract taken from a donor that can be In vitro transcription assays or DNA / Produces high levels of activated NFκB as measured by protein binding assays Endogenous NFκ transfected or high with gene expression constructs It can be cells obtained from a donor selected for B activity.   d. Administration of xenogeneic and allogeneic cells   Transfer of cells obtained from individuals or cell culture systems of the same species as the recipient organism And subsequent transplantation can be performed, but with another organism (eg, A well-characterized eukaryotic microorganism, such as yeast, in this case, a therapeutic gene. Thus the encoded protein appears to be properly processed and It is also possible to practice the present invention using cells of which a useful origin of replication is known). And so on. In such cases, certain precautions must be taken.   First, when the protein is encoded by the gene in question, The vesicle must produce the protein in a form useful to the recipient organism. After transfer Processing (including but not limited to cleavage and glycosylation patterns) ) Must be consistent with the proper functioning of the receptor. In addition, after synthesis, Secretion, excretion or exocytosis from transplanted cells Either the protein or the RNA molecule must be made available to the receptor. To address the former, the proteins produced by transfected cells Proteins are isolated from the same species as the recipient organism by biochemical methods well known in the field of protein chemistry. It can be qualitatively compared to the native protein produced by the individual. the latter Ie the release of the protein in question by the cells to be implanted From the culture medium decanted from the isolated cells or Isolating the protein from the culture medium (ie, by centrifugation or filtration); Assay by Western analysis using antibodies directed to the protein in question can do. Antibodies to a number of proteins are commercially available, Techniques for the production of body molecules are well known in the art.   Second, cells must be shielded from immune rejection by the recipient organism. this Such cells develop cell surface markers (eg, MHC antigens) characteristic of the recipient patient. Transfected with the resulting construct, the biochemical camouflage It is intended to provide a menu.   In addition, to grow in an artificial growth environment such as a fermentor or in a recipient organism Methods for encapsulating live cell cultures have been developed and according to the invention Use of such methods for administration of transfected cells Can also. Such an encapsulation system renders the cells invisible for immunodetection. And, in addition, material (eg, production of the gene in question) between the transplanted cells and the host biological environment. Free exchange of organisms, oxygen, nutrients and waste products).   Methods and devices for cell encapsulation are described in a number of US patents, including, inter alia, No. 3,888, No. 4,409,311, No. 4,673,566, No. 4,744,9 No. 33, No. 4,798,786, No. 4,803,168, No. 4,892,5 No. 38, No. 5,011,472, No. 5,158,881, No. 5,182,111 No. 5,283,187, 5,474,547, 5,498,401 (this Is specifically directed to the encapsulation of bacterial and yeast cells in chitosan). 5,550,050, 5,573,934, 5,578,314, 5,6 20,883, 5,626,561, 5,653,687, 5,686, Nos. 115, 5,693,513, and 5,698,413. And their contents are incorporated herein by reference in their entirety. capsule Successful cultures of the transformed cells are typically biocompatible (ie, encapsulated). Selectively permeable outer coating or "skin" that is tolerated by both And, optionally, cells dispersed within or on top of the A matrix that provides the structural support and substrate to which the dependent cells themselves can bind It is important. Regarding the encapsulation device applicable for use in the present invention, The term "selective permeability" refers to small molecules (about 50,000 MW to 100,000 MW). Up to and including larger molecules, such as antibodies (approximately 150, 000 MW) refers to the material containing the openings to be excluded. Suitable coating material Are porous and / or polymeric materials such as polyaspartate, polyglu Tamate, polyacrylate (for example, acrylic copolymer or RL (registered trademark) Monsanto Corporation), polyvinylidene fluoride, polyvinylidene, poly Vinyl chloride, polyurethane, polyurethane isocyanate, polystyrene, poly Amides, cellulosic polymers (eg, cellulose acetate and cellulose) Sunitrate), polymethyl-acrylate, polyalginate, polysulfone , Polyvinyl alcohol, polyethylene oxide, polyacrylonitrile and These derivatives, copolymers and / or mixtures, extended polytetrafluoro Ethylene (U.S. Pat. Nos. 3,953,566 and 4,187,390; Are both incorporated by reference herein), expanded polypropylene, expanded polyethylene Fibers, porous polyvinylidene fluoride, woven or non-woven fibers or yarn aggregates, e.g. "Angel Hair" (Anderson, Science,246: 747〜749; Thompso n et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,86: 7928〜7932), alone or in combination Fiber matrix (see US Pat. No. 5,387,237, which is incorporated herein by reference). Or a silicon-oxygen-silicon matrix (US Patent No. 5,693,513), but is not limited thereto. 10,000-30, 000, preferably 15,000 to 25,000, and most preferably 17,0 Polylysine having a molecular weight of 00 is also useful in the present invention (US Pat. No. 4,673, No. 566). Alternatively, it comprises the transfected cells of the invention. Matrix material forms its own outer coating, as discussed below. To be induced.   Selection of such coatings is described in U.S. Pat. No. 5,626,561. Alternative permeability is a porous polymer material (eg, advanced polytetrafluoroethylene) Can be varied by saturating with a hydrogel material. Hydrogel The material comprises substantially all or a portion of the void space of the porous polymeric material. Only minutes can be saturated. For example, next to the inner surface of a porous polymer material The porous polymer material is contacted and / or pierced with a continuous band inside the material along the surface. By saturating with a drogel material, the selective permeability of the material is increased outside the material. It is sharply varied from the cross-sectional area to the internal cross-sectional area of the material. Porous poly The amount and composition of the hydrogel material saturated in the mer material encapsulates the cells for implantation To a large extent depends on the particular porous polymer material used to perform the Appropriate Examples of hydrogel materials include HYPAN® structures, alone or in combination. Structural Hydrogel (Hymedix International, Inc., New Jersey) PCT / US93 / 05461, which is incorporated herein by reference. Non-fibrotic inducible taught by Dorian in Alginate, agarose, alginic acid, carrageenin, collagen, gelatin , Polyvinyl alcohol, poly (2-hydroxyethyl methacrylate), poly (N-vinyl-2-pyrrolidone) or gellan gum. Not. The matrix typically has a high surface area to volume ratio, Or the cells can grow on top and the liquid Includes holes or other spaces through which, in addition, suitable matrix materials include Stable after transplantation into recipient organism. Preferably, the matrix comprises a number of particles, Contains a collection of fibers or thin layers. Alternatively, the matrix is an aqueous solution, May contain a physical buffer or a body fluid obtained from a recipient organism (US Patent No. 5,011,472). Suitable matrix materials include aminated Glucopolysaccharides (eg, deacetylated chitin, or crab or other crustacean Chitosan, which is prepared from powdered shells and commercially available as a dry powder, Catalog No. C3646, Sigma, St. Louis, Mo., alginate ( U.S. Pat. No. 4,409,331), poly-.beta.-1-5-N-acetylglucosamine ( p-G1cNAc) polysaccharide species (alone or copolymerized with collagen) US Pat. No. 5,686,115), a reconstituted extracellular matrix preparation (Eg, Matrigel®, Collaborative Research, Inc., Mass.) Babensee et al., 1992, Lexington, Setts. Biomed. Matr. Res.,26 : 1401), liquid such as protein, polyacrylamide, agarose, gel, Includes limmer, copolymer or particulate formulations.   There are many different ways to encapsulate cells using such materials. the above Preformed encapsulation device containing the semipermeable membrane material (Eg, by injection or other manual means) and then sealed (US Patents 4,892,538, 5,011,472, 5,626,56 and No. 5,653,687), and such a seal is effectively permanent (eg, For example, using a heat-sealing method, semi-permanently (for example, Does not decompose using a biocompatible adhesive such as epoxy) or temporary (eg For example, using a removable cap or plug, or a valve or cock By closing the stopper). Permanent and semi-permanent sealing Such a method is disclosed in U.S. Pat. No. 5,653,687. Preformed, semi-transparent A variation on the use of transient cell containers is to use cells suspended in a matrix material. The material forming the outer coating of the encapsulation device is converted to a cell / matrix mixture. Is to extrude them together under the same conditions. This is a method of extruding together under conditions that give rise to a cell / matrix mixture. The mixture then forms or crosslinks under such extrusion conditions as a semi-permeable Liquid or semi-liquid (ie, gel-like) form to be placed in a continuous tube of polymer Having only one cell container by such an extrusion method (U.S. Pat. No. 5,283,187) or divided into a plurality of separate compartments (U.S. Pat. No. 5,158,881) A capsule is formed. Variations on both types of methods As a method, droplets of a liquid or semi-liquid (ie, gel-like) cell / matrix mixture With a semipermeable barrier (U.S. Pat. Nos. 4,798,786 and 5,489,40). No. 1) induces "hardening" or crosslinking of the outer layer of the matrix material A solution in a substance or in a polymer material (or its monomer), which is a cell / matrix Polymerizes and / or crosslinks in contact with the water droplets, resulting in a semipermeable membrane on top (U.S. Pat. Nos. 4,353,888, 4,673,566, 4,7). 44,933, 5,620,883, and 5,693,513). Cloudy.   One skilled in the art will select the appropriate matrix and semi-permeable material. Thus, the cell-encapsulation device described above can be sufficiently constructed.   Implantation of such a device is standard and is considered the safest and most appropriate. Anatomical to deliver the product encoded by the gene in question by the technique This is achieved surgically at or near the site of the location. Such a device is a sphere Shape, pellet or other capsule shape, including disk, rod or tube shape It can take any convenient shape without limitation, and often the shape of the device Is determined by the synthesis method. For example, co-extrusion of cell suspension and polymer coating material The shape formed by the extrusion is typically tubular, while in the matrix material Shape formed by deposits on droplets containing cells is spherical I think that the. As discussed above, it must be transplanted (and therefore, The number of cells (which must be encapsulated) Depends on the needs of the recipient organism for the product. The above encapsulation device is Small in size (most usefully 10 μm to 1 mm in diameter Between the outer coating and the cells most deeply embedded in the matrix. Which allows efficient diffusion of the material from end to end), and such devices 10 to 10 eachTenIntended to be able to have cells between individuals I have. If the need for more cells is anticipated, multiple (2, 10, or additional) 100 or more) of said in vivo culture devices. They can be transplanted into a given recipient organism.   The encapsulated cell device can be intended for permanent installation, or A person skilled in the art, such as a physician (a physician may The duration of which must be determined on a case-by-case basis) Use it to end delivery to goods or for extended periods of time (ie, months to years). Retrieving the device after using it to replenish the device with new cells May be desirable. For the latter purpose, implantation devices are usefully Caps that can be opened and closed to gain access to collection aids and cell containers such as Or other inlets, both of which are described in U.S. Pat. No. 4,892,538. ) Can be included.   Surviving cultures of encapsulated cells deliver gene products to recipient animal tissues Has been used successfully for. U.S. Pat. No. 4,673,566 discloses an encapsulation Blood glucose levels in diabetic rats transplanted with isolated rat islets of Langerhans Injection of 3,000 cells each, disclosing a successful maintenance of It is effective for 6 months when given, while a single dose of 1,000 cells can be used for 2 months Was effective.   Similarly, xenospecific transplantation of encapsulated islet cells of Langerhans can lead to diabetes. Proven successful treatment (Inulin Langerhans islet cells in mice US Pat. No. 5,578,314; porcine Langerhans islet cells in mice. On condition, Sun et al., 1992, ASAIO J.,38: 124). Such a method is human Promising for clinical treatment of diabetes (Calafiore, 1992, ASAIO J.,38: 34).   These have been successfully applied to untransfected cells. The technique involves transfecting cells with the therapeutic nucleic acid molecules used in the present invention. Can be used advantageously.   e. Assay of potency of transplanted cells in recipient organism   Efficacy of transfected cells administered in this way and subsequent The maintenance of these cells in the recipient host is dependent on the transfected construct. Monitor or interrogate the activity of marker genes that may additionally be included. A product (eg, a protein) encoded by the subject gene or The product (antisense message or ribozyme) may inhibit its production By directly measuring either the decrease in protein levels designed for You can essay. These assays are known to those skilled in the art. Can be performed using conventional molecular and biochemical techniques such as Or histological sampling (ie, necropsy) and examination of transplanted cells or organs You can be in.   Problems with vectors in transfected / transplanted cells Or nucleic acid levels in blood or target tissues encoded by the genes of In addition to direct measurement of Monitor changes in the disease state of patients undergoing child transmission, and monitor these changes Comparison of transfected with a vector construct lacking the gene in question Can be compared to the progression or duration of the disease in the patient receiving the cells.   Other dosages and modes of administration   Patients with a disease state associated with a frameshift mutation will have Treating according to the invention in an in vivo, ex vivo or in vitro method Can be. For example, in vivo treatments include ribozymes or ribozymes, wild-type A nucleic acid vector encoding RNA, antisense RNA or DNA, or Is the sequence encoding the antisense RNA, or hybrid wild type / nan The wild-type of the sense protein is preferably replaced with a pharmaceutically acceptable delivery vehicle and Ingestion, infusion, inhalation or other Can be administered to the patient by a number of methods. The amount administered depends on the patient. The “effective dose” can vary with the amount of genetic material transmitted Value is determined by weighing the risk of adverse side effects. Gene expression and And / or the encoded mutant RNA or protein or its corresponding Monitoring of the presence or value of the "sense" protein Would help with selection and adjustment. Generally, nuclear proteins such as ribozymes The composition containing the quality may be administered in single or multiple doses as determined by the doctor Administered in the range of 50 μg to 1 mg or in the range of 100 μg to 500 μg Like. Compositions containing oligonucleotides can be in the range of 5 ng to 10 μg or Will be administered in a single dose ranging from 100 ng to 500 ng. Wild-type RNA or The composition containing the vector is a single dose of at least one of the above sequences. Range from 10 ng to 100 μg / kg (body weight) so that the pea is delivered into each target cell Administration, preferably in the range of 100 ng to 10 μg / kg (body weight). Tan Proteins, such as those of the hybrid wild type / wild type nonsense protein. The composition may be administered in single or multiple doses as determined by a physician. It will be administered in the range of 0 μg to 1 mg or in the range of 100 μg to 50 μg. the above Administer any of the doses according to the patient's weight, as determined by the physician. Can be given.   Ex vivo transduction is also contemplated within the scope of the present invention. Cell population from patient Removed or otherwise provided, using a vector according to the invention Once transduced, they can then be reintroduced into the patient. Cells reintroduced into the patient The number depends on the efficiency of vector transfer, and is generally 10Four-106Transduction Cells / patients performed.   Vector delivery to cells targeted for ex vivo gene transfer according to the present invention Any cells desired, for example, neuronal cells or stem cells are included.   The protein, nucleic acid or cell administered according to the invention is preferably pharmaceutically Acceptable carrier materials, such as magnesium carbonate, lactose or micelles Administered as a mixture with the phospholipids formed, and The quality, nucleic acid or cells together form a therapeutic composition, e.g., for oral administration to a mammal. Pills, tablets, capsules or liquids. Other forms of composition Liquid or vein that can be administered nasally, for example, as drops or sprays Liquids that can be administered internally, parenterally, subcutaneously or intraperitoneally are also envisioned. Administered The substance can be in the form of a biodegradable sustained release formulation for intramuscular administration. If zero order release is desired for maximum efficacy, e.g., implantable Functional or external pump, such as InfusaidTM) Pump (Infusaid C) orp, Mass.).   Useful kits according to the invention   The present invention includes a kit for diagnosing or treating a disease according to the present invention.   The diagnostic kit contains appropriate packaging materials and one or more of the following reagents: Probe when bound to the nucleic acid probe defined above and its complementary sequence Includes any means of issuing. For example, nucleic acid probes can be, for example, radioactive labels, Labeling with a fluorescent label or the like is possible, or indirect labeling techniques well known in the art. It can be detected by surgery, for example using the biotin / avidin system.   The diagnostic system, preferably in kit form, constitutes yet another embodiment of the present invention. . This system is a hybrid wild-type in cells by forming an immune complex. / Useful for assaying for the presence of nonsense proteins or derivatives thereof . The system comprises at least one package containing an antibody of the invention. You. Optionally, the kit can include a positive tissue sample control.   Antibodies are also used with "indicators", sometimes also referred to as "labels". This indicator or label is a means of determining whether an immune response is occurring, and Sometimes used with antibodies as a means of measuring the extent of such reactions Is done.   The terms "indicator" or "label" are used herein to refer to the antibody either bound to or Single atoms and molecules used individually (these atoms or molecules are used alone To be used with or without additional reagents) Is done. Such indicator groups or labels are well known per se in immunochemistry, and As long as they are used with other novel antibodies, methods and / or systems. It forms part of the present invention.   For example, antigen-specific antibodies or antibody fragments can be detected by binding to an enzyme Labeled and used in EIA or ELISA (ELISA). this The enzyme may be sequentially, subsequently, for example, colorimetrically, fluorometrically or, most preferably, Substrate to produce a chemical moiety that can be detected by visual means Exposure to Substrates are chromogenic substrates that produce reaction products that are visible to the naked eye be able to.   Detects binding proteins specific for the desired detectable mutant protein Enzymes that can be used for labeling include alkaline phosphatase and horseradish. Tissue peroxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, staphy Lococcus nuclease, Delta-V-steroid isomerase, yeast alcohol Dehydrogenase, alpha-glycerophosphate dehydrogenase, trio Phosphate isomerase, asparaginase, ribonuclease, urea Ase, catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucoamylase And acetylcholinesterase.   By radiolabeling a binding protein, eg, an antibody, Can be used to detect antigen bound to a solid support. You. Radioisotope is gamma counter or scintillation counter Detection by such means as using or by autoradiography be able to. Particularly useful isotopes for the purposes of the present invention are:ThreeH,131I,14C, then Preferably125I.   The first or second binding protein can also be labeled with a fluorescent compound. fluorescence When the labeled antibody is exposed to light of the appropriate wavelength, its presence is detected by fluorescence can do. The most commonly used fluorescent labeling compound is fluorescein Isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, There are allophycocyanin, o-phthalaldehyde and fluorescamine.   The first or second binding protein can be detected by binding to a chemiluminescent compound Can also be labeled. The presence of the chemiluminescent-labeled antibody then indicates the course of the chemical reaction. It is measured by detecting the presence of luminescence that occurs therein. Particularly useful chemiluminescence Examples of labeling compounds are luminol, isoluminol, telomatic acridinium et Steles, imidazoles, acridinium salts and oxalates.   Similarly, a first or second binding protein is labeled using a bioluminescent compound. be able to. Bioluminescence is an organism in which catalytic proteins increase the efficiency of the chemiluminescent reaction. Is a type of chemiluminescence found in biological systems. The presence of bioluminescent proteins It is measured by detecting the presence of luminescence. Bioluminescent compounds important for labeling purposes The products are luciferin, luciferase and ecoline.   The present invention also provides diagnostic reagents used in the present invention, such as nucleic acid sequences, probes. And antibody molecules and / or positive tissue controls as described above, and disease diagnosis Also included are kits containing reagents as used for ablation or therapy.   The indicator or label is preferably provided with the antibody and packaged with the antibody Or can be packaged separately. Using an indicator like HRP Hydrogen peroxide and diaminobenzidine and nickel ammonium sulfate Such additional reagents can also be included in the system. Such materials are numerous Like the indicator, it is readily available commercially and does not need to be provided with the diagnostic system. No. In addition, some reagents such as hydrogen peroxide decompose or Some radioactive elements, such as radioactive elements, have a short lifespan. Better provided.   Other embodiments   It will be understood that the present invention has been described by way of illustration only. As described in this specification In addition to the described embodiments, numerous other embodiments of the invention are defined in the following claims. Without departing from the scope of the invention as set forth in the description herein. It will be apparent to those skilled in the art.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｐ 3/10 48/00 21/04 Ａ６１Ｐ 3/10 25/14 21/04 25/16 25/14 25/28 25/16 35/00 25/28 Ｃ０７Ｋ 7/06 35/00 7/08 Ｃ０７Ｋ 7/06 14/47 7/08 Ｃ１２Ｎ 1/15 14/47 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ｗ (71)出願人 ユニバーシテイ オブ ユトレヒト オランダ国 エヌエル―3000 デーエル ロッテルダム デ アイトフ ユニフェル シテイツウェフ 100 (72)発明者 ファン レーウウェン，フレデリク ウェ ー. オランダ国 エヌエル―3063 セーエル マールセン ケルクウェフ 37 (72)発明者 フロスフェルト，フランクリン ヘー. オランダ国 エヌエル―3065 エンハー ロッテルダム ヤコビュスファン フェッ セルムシンヘル ９ (72)発明者 ビュルバフ，ヨハネス ペーテル ヘンリ オランダ国 エヌエル―3981 エスベー ビュニク コペルスラヘルスフーク ９──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI theme coat ゛ (Reference) A61K 38/00 A61P 3/10 48/00 21/04 A61P 3/10 25/14 21/04 25/16 25/14 25/28 25/16 35/00 25/28 C07K 7/06 35/00 7/08 C07K 7/06 14/47 7/08 C12N 1/15 14/47 1/19 C12N 1/15 1 / 21 1/19 C12Q 1/68 A 1/21 C12N 15/00 ZNAA 5/10 5/00 A C12Q 1/68 A61K 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, W), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU , LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (71) Applicant University of Utrecht, Netherlands Nuel-3000 D.L. Le-3063 Seier Marsen Kerkwech 37 (72) Inventor Flossfeld, Franklin He. The Netherlands Enuel-3065 Enha Rotterdam Jakobusfan Fesselmussingh 9 (72) Inventor Bulbach, Johannes Peter Henry Nuel-3981 Kosperk Buch 9

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．フレームシフト突然変異を生じる転写突然変異を有するＲＮＡ分子を原因 とする、またはそれに関連する疾患を診断するための方法において： ｉ．該疾患を有するかまたは発症する疑いのある患者から生物学的サンプルを得 る工程、および ｉｉ．フレームシフト突然変異を有する突然変異体ＲＮＡ分子またはそれによっ てエンコードされるタンパク質の存在を、該サンプルにおいて検出する工程とを 包含し、検出は疾患を示すことを特徴とする方法。 ２．フレームシフト突然変異が、ヌクレオチドの欠失または挿入を含むことを 特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．フレームシフト突然変異が、ヌクレオチド配列ＧＡＧＡまたはＣＴＣＴと 関連することを特徴とする請求項２に記載の方法。 ４．フレームシフト突然変異が、ＧＡＧＡまたはＣＴＣＴを含有するヌクレオ チド配列と関連するジヌクレオチド突然変異を含むことを特徴とする請求項３に 記載の方法。 ５．前記配列が、ＧＡＧＡＸまたはＣＴＣＴＸを含み、ここでＸは、Ｇ、Ａ、 Ｔ、またはＣのうちの１つであることを特徴とする請求項３に記載の方法。 ６．前記配列が、ＧＡＧＡＣ、ＣＴＣＴＧ、ＧＡＧＡＧ、またはＣＴＣＴＣの うちの１つであることを特徴とする請求項３に記載の方法。 ７．前記疾患が、ガンまたは神経退行性の疾患であることを特徴とする請求項 １に記載の方法。 ８．前記疾患が、アルツハイマー病またはダウン症候群；前頭葉痴呆（ピック 病）；進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、および、皮質基底変形と、ボクサー性痴呆 と、もつれのみを伴う痴呆と、もつれおよびカルシウム沈着を伴う痴呆と、第１ ７染色体に関連する振せん麻痺を伴う前頭側頭骨痴呆と、もつれを伴う ック病Ｃ型と、グアムの振せん麻痺−痴呆複合症と、脳炎後の振せん麻痺と、亜 急性硬化性汎脳炎とを含む群から選択される多発タウ陽性の糸状病変を伴う他の 疾患；パーキンソン氏病；筋萎縮側索硬化症；ハンティングトン病；多発性硬化 症；レーヴィ体を伴う痴呆；多系統萎縮症；アレキサンダー病と、アルコール性 肝疾患と、苔癬アミロイドーシスと、マリネスコ体およびガラス質封入体の存在 とを含む群から選択されるユビキチンと関連する他の封入体病；糖尿病ＩＩ型； および他の退行性疾患であることを特徴とする請求項７に記載の方法。 ９．フレームシフト突然変異を有する前記ＲＮＡが、野生型配列に含まれる場 合、βアミロイド前駆体タンパク質、タウタンパク質、ユビキチン、アポリポタ ンパク質−Ｅ4（Ａｐｏ−Ｅ4）、微小管結合タンパク質ＩＩ（ＭＡＰ２）、神経 線維タンパク質（Ｌ、Ｍ、Ｈ）、プレセニリンＩ、プレセニリンＩＩ、ビッグタ ウ(Big Tau)、ＧＦＡＰ、Ｐ５３、ＢＣＬ２、セマホリンＩＩＩ、ＨＵＰＦ−Ｉ 、ＨＭＧ、およびＮＳＰ−Ａをエンコードすることを特徴とする請求項１に記載 の方法。 １０．前記生物学的サンプルが、体液または組織を含むことを特徴とする請求 項１に記載の方法。 １１．前記体液が、脳脊髄液または血液を含むことを特徴とする請求項１０に 記載の方法。 １２．前記組織が、皮膚または鼻上皮を含むことを特徴とする請求項１０に記 載の方法。 １３．前記突然変異体ＲＮＡ分子が、核酸２本鎖の形成によって検出され、該 ２本鎖の第１の鎖は、フレームシフト突然変異を生じる突然変異を含む突然変異 体ＲＮＡ分子の部分に相補的な配列を有する核酸プローブを含み、該２本鎖の第 ２の鎖は、該プローブに相補的であるＲＮＡ分子の突然変異体の核酸配列を含む ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 １４．突然変異体ＲＮＡ分子が、ＲＴ−ＰＣＲを使用して突然変異体ＲＮＡ分 子を逆転写し、次いで、突然変異体ＲＮＡ分子に対応する逆転写されたＤＮＡの 少なくともフラグメントを増幅し、該突然変異体ＲＮＡ分子は、フレームシフト を生じる突然変異を含み、次いで、フレームシフト突然変異を生じる突然変異を 含む逆転写されたＤＮＡの部分に相補的な配列を有する核酸プローブを使用して 、 増幅されたフラグメントをプローブするか、または増幅されたフラグメントを配 列決定することによって、検出されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 １５．突然変異体ＲＮＡ分子によってエンコードされるタンパク質が、突然変 異体タンパク質に特異性を有し、野生型タンパク質に特異性を有しない抗体分子 を使用して検出されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 １６．フレームシフト突然変異を生じる転写突然変異を有するＲＮＡ分子を原 因とする、またはそれと関連する疾患を同定するための方法において： ｉ．疾患の病原性に関与することが疑われるＲＮＡ分子の配列を提供する工程、 ｉｉ．フレームシフト突然変異の３'末端のＲＮＡ配列によってエンコードされ る突然変異体タンパク質の配列を同定する工程、 ｉｉｉ．突然変異体タンパク質またはそのフラグメントに対するプローブを調製 する工程、および ｉｖ．疾患を有する患者からの生物学的サンプル、および疾患を有しない患者か らの生物学的サンプルをプローブする工程を包含し、疾患を有する患者からの生 物学的サンプルにおける該突然変異体タンパク質の存在、および疾患を有しない 患者からの生物学的サンプルにおける該突然変異体タンパク質の不在は、生物学 的サンプル中の突然変異体タンパク質の存在が疾患または疾患に対する罹患性に っいてのマーカーであることを示すことを特徴とする方法。 １７．フレームシフト突然変異を生じる転写突然変異を有するＲＮＡ分子を原 因とするか、またはそれと関連する疾患を診断するための診断キットであって、 ｉ．フレームシフト突然変異を導く突然変異を含む突然変異体ＲＮＡ分子の部分 に相補的な配列を有する標識化核酸プローブ、および ｉｉ．そのためのパッケージング材料を含有することを特徴とするキット。 １８．フレームシフト突然変異を生じる転写突然変異を有するＲＮＡ分子を原 因とするか、またはそれと関連する疾患を診断するための診断キットであって、 ｉ．ＲＴ−ＰＣＲ反応のためのプライマーの対であって、フレームシフト突然変 異を生じる突然変異のいずれかの側における配列に相補的な配列を有するプライ マーの対、およびＲＴ−ＰＣＲを行うために必要な試薬、ならびに ｉｉ．そのためのパッケージング材料を含有することを特徴とするキット。 １９．フレームシフト突然変異を生じる１つまたはそれ以上の転写突然変異を 有する、少なくとも１つのＲＮＡ分子を原因とするか、またはそれと関連する疾 患を診断するための診断キットにおいて、 ｉ．突然変異体ＲＮＡによってエンコードされる突然変異体タンパク質について の特異性を有し、野生型タンパク質についての特異性を有しない抗体分子、なら びに ｉｉ．そのためのパッケージング材料を含有することを特徴とするキット。 ２０．請求項１から９のいずれかに記載の、フレームシフト突然変異を有する ことを特徴とする組換えＲＮＡ分子。 ２１．請求項２０に記載のＲＮＡ分子であって、図２〜１９のいずれかにおい て示される＋１または＋２と示されるタンパク質配列の少なくとも部分をエンコ ードすることを特徴とするＲＮＡ分子。 ２２．請求項２０または２１に記載のＲＮＡによってエンコードされることを 特徴とする突然変異体タンパク質。 ２３．請求項２２に記載の突然変異体タンパク質の免疫原性フラグメント。 ２４．請求項２２に記載の突然変異体タンパク質または請求項２３に記載の免 疫原性フラグメントであって、アミノ酸配列： ＲＧＲＴＳＳＫＥＬＡ （配列識別番号１）、 ＨＧＲＬＡＰＡＲＨＡＳ （配列識別番号２）、 ＹＡＤＬＲＥＤＰＤＲＱ （配列識別番号３）、 ＲＱＤＨＨＰＧＳＧＡＱ （配列識別番号４）、 ＹＡＤＬＲＥＤＰＤＲＱＤＨＨＰＧＳＧＡＱ （配列識別番号１４００）、 ＧＧＧＡＱ （配列識別番号５）、 ＧＡＰＲＬＰＰＡＱＡＡ （配列識別番号６）、 ＫＴＲＦＱＲＫＧＰＳ （配列識別番号７）、 ＰＧＮＲＳＭＧＨＥ （配列識別番号８）、 ＥＡＥＧＧＳＲＳ （配列識別番号９）、 ＶＧＡＡＲＤＳＲＡＡ （配列識別番号１０）、 ＨＤＹＰＰＧＧＳＶ （配列識別番号１１）、 ＳＩＱＫＦＱＶ （配列識別番号１２）、 ＶＥＫＰＧＥＲＧＧＲ （配列識別番号１３）、 ＰＬＦＧＲＧＨＫＲＧ （配列識別番号１４）、 ＥＤＲＧＤＡＧＷＲＧＨ （配列識別番号１５）、 ＱＥＲＧＡＳＰＲＡＡＰＲＥＨ （配列識別番号１６）、 ＲＱＰＧＤＶＡＰＧＧＱＨＲＰＶＤＤ （配列識別番号１７）、 ＡＧＬＬＡＩＰＥＡＫ （配列識別番号１８）、 ＹＶＤＶＹＮＧＧＫＦＳ （配列識別番号１９）、 ＡＡＤＥＲＲＣＨＬＬＨＭＣＧＲＲ （配列識別番号２０）、 ＱＱＡＴＥＡＧＱＨＹＱＰＧＳＰＬＨＤＨＳＨＶ （配列識別番号２１）、 ＰＱＥＡＡＡＲＴＮＲ （配列識別番号２２）、 ＲＳＷＶＨＰＡＰＰＹＱＭＣＬＧ （配列識別番号２３）、または ＧＧＳＲＴＨＰＲ （配列識別番号２４）を含有するこ とを特徴とする突然変異体タンパク質または免疫原性フラグメント。 ２５．薬学的に受容可能なキャリアと混合される、ＧＡＧＡまたはＣＴＣＴを 有する標的ＲＮＡを選択的に切断するリボザイムを含有することを特徴とする薬 学的組成物。 ２６．薬学的に受容可能なキャリアと混合される、ＧＡＧＡまたはＣＴＣＴを 有する標的ＲＮＡを選択的に切断するリボザイム、およびフレームシフト突然変 異を生じるＧＡＧＡ配列を有するＲＮＡの野生型アナログを含有することを特徴 とする薬学的組成物。 ２７．薬学的に受容可能なキャリアとに混合される、フレームシフト突然変異 を生じるＧＡＧＡまたはＣＴＣＴ配列を有するＲＮＡの野生型アナログを含有す ることを特徴とする薬学的組成物。 ２８．前記ＲＮＡの野生型アナログが、第３番目の塩基のサイレント突然変異 を有するヌクレオチド配列を含有することを特徴とする請求項２７に記載の薬学 的組成物。 ２９．薬学的に受容可能なキャリアと混合される、フレームシフト突然変異を 生じる、１つまたはそれ以上のＧＡＧＡまたはＣＴＣＴ突然変異を有するＲＮＡ に相補的である配列を有する１本鎖核酸を含むことを特徴とする薬学的組成物。 ３０．薬学的に受容可能なキャリアとの混合物における、突然変異体タンパク 質の野生型アナログを含有することを特徴とする薬学的組成物。 ３１．ＧＡＧＡまたはＣＴＣＴを有する標的ＲＮＡを選択的に切断するリボザ イムをエンコードする発現可能な遺伝子を含有することを特徴とするベクター。 ３２．フレームシフト突然変異を生じるＧＡＧＡまたはＣＴＣＴ突然変異を有 するＲＮＡに相補的な配列をエンコードする発現可能な遺伝子を含有することを 特徴とするベクター。 ３３．請求項３１または３２に記載のベクターを含有することを特徴とする宿 主細胞。 ３４．フレームシフト突然変異を生じるＧＡＧＡまたはＣＴＣＴ突然変異を有 するＲＮＡを原因とするか、またはそれと関連する疾患を処置および／または予 防する方法であって、請求項２５から３０のいずれかに記載の組成物、請求項３ １または３２に記載のベクター、または請求項３３に記載の宿主細胞を、疾患に 羅患している患者または疾患に罹患性の患者に投与することを包含する方法。 ３５．治療において、プロモーターの制御下で、ＧＡＧＡまたはＣＴＣＴを有 する標的ＲＮＡを選択的に切断するリボザイムをエンコードすることを特徴とす るベクターの使用。 ３６．フレームシフト突然変異を生じる１つまたはそれ以上のＧＡＧＡまたは ＣＴＣＴ突然変異を有する少なくとも１つのＲＮＡを原因とするか、またはこれ と関連する疾患の処置のための組成物の製造における、プロモーターの制御下で リボザイムをエンコードすることを特徴とするベクターの使用。 ３７．治療において、プロモーターの制御下で、フレームシフト突然変異を生 じる１つまたはそれ以上のＧＡＧＡまたはＣＴＣＴ突然変異を有するＲＮＡに相 補的な配列をエンコードすることを特徴とするベクターの使用。 ３８．請求項２５〜３０のいずれかに記載の組成物、請求項３１もしくは３２ に記載のベクター、または請求項３３に記載の宿主細胞の１つより多くの任意の 組み合わせによる治療における使用。 ３９．フレームシフト突然変異を生じる１つまたはそれ以上のＧＡＧＡまたは ＣＴＣＴ突然変異を有する少なくとも１つのＲＮＡを原因とするか、またはそれ と関連する疾患の処置および／または予防において、請求項２５〜３０のいずれ かに記載の組成物、請求項３１もしくは３２に記載のベクター、または請求項３ ３に記載の宿主細胞の１つより多くの任意の組み合わせによる使用。[Claims] 1. In a method for diagnosing a disease caused by or associated with an RNA molecule having a transcription mutation that results in a frameshift mutation: i. Obtaining a biological sample from a patient having or suspected of developing the disease; and ii. Detecting in said sample the presence of a mutant RNA molecule having a frameshift mutation or a protein encoded thereby, wherein the detection is indicative of a disease. 2. 2. The method of claim 1, wherein the frameshift mutation comprises a nucleotide deletion or insertion. 3. 3. The method according to claim 2, wherein the frameshift mutation is associated with the nucleotide sequence GAGA or CTCT. 4. 4. The method of claim 3, wherein the frameshift mutation comprises a dinucleotide mutation associated with a nucleotide sequence containing GAGA or CTCT. 5. 4. The method of claim 3, wherein the sequence comprises GAGAX or CTCTX, wherein X is one of G, A, T, or C. 6. 4. The method of claim 3, wherein the sequence is one of GAGAC, CTCTG, GAGAG, or CTCTC. 7. The method according to claim 1, wherein the disease is a cancer or a neurodegenerative disease. 8. The disease may be Alzheimer's disease or Down's syndrome; frontal lobe dementia (Pick's disease); progressive supranuclear palsy (PSP) and cortical basal deformity, boxer dementia, dementia with only tangles, tangles and calcifications With dementia, frontotemporal dementia with tremor paralysis associated with chromosome 17 and tangles Other diseases with multiple tau-positive filamentous lesions selected from the group comprising: Crohn's disease type C, Guam's palsy-dementia complex, tremor after encephalitis, and subacute sclerosing panencephalitis. Disease; Parkinson's disease; Amyotrophic lateral sclerosis; Huntington's disease; Multiple sclerosis; Dementia with Lewy bodies; Multiple system atrophy; Alexander disease, alcoholic liver disease, lichen amyloidosis, and Marinesco body The method of claim 7, wherein the disease is other inclusion body diseases associated with ubiquitin selected from the group comprising and the presence of vitreous inclusions; diabetes type II; and other degenerative diseases. 9. If the RNA having a frameshift mutation, is included in the wild type sequence, beta amyloid precursor protein, tau protein, ubiquitin, Apolipoprotein -E 4 (Apo-E 4) , microtubule associated protein II (MAP2), It encodes nerve fiber proteins (L, M, H), presenilin I, presenilin II, Big Tau, GFAP, P53, BCL2, semaphorin III, HUPF-I, HMG, and NSP-A. The method of claim 1. 10. The method of claim 1, wherein the biological sample comprises a bodily fluid or tissue. 11. The method of claim 10, wherein the bodily fluid comprises cerebrospinal fluid or blood. 12. The method of claim 10, wherein the tissue comprises skin or nasal epithelium. 13. The mutant RNA molecule is detected by the formation of a nucleic acid duplex, wherein the first strand of the duplex is complementary to the portion of the mutant RNA molecule containing the mutation causing the frameshift mutation. The method of claim 1, comprising a nucleic acid probe having a sequence, wherein the second strand of the duplex comprises a nucleic acid sequence of a mutant RNA molecule that is complementary to the probe. 14． The mutant RNA molecule reverse transcribes the mutant RNA molecule using RT-PCR and then amplifies at least a fragment of the reverse transcribed DNA corresponding to the mutant RNA molecule, The molecule contains a mutation that causes a frameshift, and then uses the nucleic acid probe having a sequence that is complementary to the portion of the reverse transcribed DNA that contains the mutation that causes the frameshift mutation to ligate the amplified fragment. The method of claim 1, wherein the method is detected by probing or sequencing the amplified fragment. 15. 2. The protein of claim 1, wherein the protein encoded by the mutant RNA molecule is detected using an antibody molecule having specificity for the mutant protein and no specificity for the wild-type protein. The described method. 16. In a method for identifying a disease caused by or associated with an RNA molecule having a transcriptional mutation that results in a frameshift mutation: i. Providing the sequence of an RNA molecule suspected of being involved in the pathogenesis of the disease, ii. Identifying the sequence of the mutant protein encoded by the RNA sequence at the 3 'end of the frameshift mutation, iii. Preparing a probe for the mutant protein or a fragment thereof; and iv. Probing a biological sample from a patient with the disease and a biological sample from a patient without the disease, the presence of the mutant protein in a biological sample from the patient with the disease, And the absence of the mutant protein in a biological sample from a patient without the disease indicates that the presence of the mutant protein in the biological sample is a marker for the disease or susceptibility to the disease. A method characterized by showing. 17． A diagnostic kit for diagnosing a disease caused by or associated with an RNA molecule having a transcriptional mutation that causes a frameshift mutation, comprising: i. A labeled nucleic acid probe having a sequence that is complementary to the portion of the mutant RNA molecule that contains the mutation leading to the frameshift mutation, and ii. A kit comprising a packaging material therefor. 18. A diagnostic kit for diagnosing a disease caused by or associated with an RNA molecule having a transcriptional mutation that causes a frameshift mutation, comprising: i. A pair of primers for the RT-PCR reaction, the pair of primers having a sequence complementary to the sequence on either side of the mutation causing the frameshift mutation, and the Reagents, and ii. A kit comprising a packaging material therefor. 19. A diagnostic kit for diagnosing a disease caused by or associated with at least one RNA molecule having one or more transcriptional mutations resulting in a frameshift mutation, i. An antibody molecule having specificity for the mutant protein encoded by the mutant RNA and no specificity for the wild-type protein; and ii. A kit comprising a packaging material therefor. 20. A recombinant RNA molecule having a frameshift mutation according to any one of claims 1 to 9. 21. 21. The RNA molecule of claim 20, wherein the RNA molecule encodes at least a portion of the protein sequence shown as +1 or +2 as shown in any of FIGS. 22. A mutant protein encoded by the RNA according to claim 20 or 21. 23. An immunogenic fragment of the mutant protein of claim 22. 24. A mutant protein according to claim 22 or an immunogenic fragment according to claim 23, wherein the amino acid sequence is: RGRTSSKELA (SEQ ID NO: 1), HGRLAPARHAS (SEQ ID NO: 2), YADLREDPDDRQ (SEQ ID NO: 3) ), RQDHHPGSGAQ (SEQ ID NO: 4), YADLREDPDDRQDHHPGSGAQ (SEQ ID NO: 1400), GGGAQ (SEQ ID NO: 5), GAPRLPPAQAA (SEQ ID NO: 6), KTRFQRKGPS (SEQ ID NO: 7), PGNRSMGHE (SEQ ID NO: 8) EAEGGSRS (SEQ ID NO: 9), VGAARDSRAA (SEQ ID NO: 10), HDYPPGGSV (SEQ ID NO: 11), SIQKFQV (SEQ ID NO: 12), VEK GERGGR (sequence identification number 13), PLFGRGHKRG (sequence identification number 14), EDRGDAWRGH (sequence identification number 15), QERGASPRAAPREH (sequence identification number 16), RQPGDVAPGGQHRPVDD (sequence identification number 17), AGLLAIPEAK (SEQ ID NO. SEQ ID NO: 19), AADERRCHLLHMCGRR (SEQ ID NO: 20), QQATEAGQHYQPGSPLHDHSHV (SEQ ID NO: 21), PQEAAARTNR (SEQ ID NO: 22), RSWVHPAPPYQMCLG (SEQ ID NO: 23), or GGSRTHPR (contains SEQ ID NO: 24) A mutant protein or immunogenic fragment characterized by the following: 25. A pharmaceutical composition comprising a ribozyme that selectively cleaves a target RNA having GAGA or CTCT, which is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. 26. A ribozyme that selectively cleaves a target RNA having GAGA or CTCT, and a wild-type analog of RNA having a GAGA sequence that causes a frameshift mutation, mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutical compositions. 27. A pharmaceutical composition comprising a wild-type analog of RNA having a GAGA or CTCT sequence causing a frameshift mutation, mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. 28. 28. The pharmaceutical composition of claim 27, wherein the wild-type analog of the RNA comprises a nucleotide sequence having a third base silent mutation. 29. Comprising a single-stranded nucleic acid having a sequence that is complementary to RNA having one or more GAGA or CTCT mutations causing a frameshift mutation, mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. A pharmaceutical composition comprising: 30. A pharmaceutical composition comprising a wild-type analog of a mutant protein in a mixture with a pharmaceutically acceptable carrier. 31. A vector comprising an expressible gene encoding a ribozyme that selectively cleaves a target RNA having GAGA or CTCT. 32. A vector comprising an expressible gene encoding a sequence complementary to RNA having a GAGA or CTCT mutation causing a frameshift mutation. 33. A host cell comprising the vector according to claim 31. 34. 31. A method of treating and / or preventing a disease caused by or associated with an RNA having a GAGA or CTCT mutation causing a frameshift mutation, wherein the composition according to any of claims 25 to 30. 34. A method comprising administering the vector of claim 31 or 32, or the host cell of claim 33, to a patient suffering from or afflicted with a disease. 35. Use of a vector, which in therapy, encodes a ribozyme that selectively cleaves a target RNA having GAGA or CTCT under the control of a promoter. 36. Under the control of a promoter in the manufacture of a composition for the treatment of a disease caused by or associated with at least one RNA having one or more GAGA or CTCT mutations resulting in a frameshift mutation Use of a vector characterized in that it encodes a ribozyme. 37. Use of a vector, which in therapy, encodes a sequence complementary to an RNA having one or more GAGA or CTCT mutations causing a frameshift mutation under the control of a promoter. 38. 34. Use in therapy with a composition according to any of claims 25-30, a vector according to claim 31 or claim 32, or any combination of more than one of the host cells according to claim 33. 39. 31. Any of the claims 25-30 in the treatment and / or prevention of a disease caused by or associated with at least one RNA having one or more GAGA or CTCT mutations resulting in a frameshift mutation. 34. Use of the composition of any of claims 31 or 32, or the host cell of claim 33, in any combination of more than one.
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