JP2001521390A

JP2001521390A - 増強された持続性のための新規導入遺伝子発現系

Info

Publication number: JP2001521390A
Application number: JP54434398A
Authority: JP
Inventors: アーメンタノ，ドンナ; マーシャル，ジョン; イュー，ネルソン; チェン，セン; グレゴリー，リチャード，ジェイ．
Original assignee: ジエンザイムコーポレイション
Priority date: 1997-04-14
Filing date: 1998-04-14
Publication date: 2001-11-06
Also published as: WO1998046781A3; AU7133698A; WO1998046781A2; US5981275A; EP0975786A2; CA2287076A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、発現抑制配列、好ましくはCMVプロモーター、に作動可能性に連結した導入遺伝子を含み、アデノウイルスE4ゲノム領域の全部または一部を同時に、導入遺伝子の持続的発現を促進するために、細胞に供給されている、転写単位を含む導入遺伝子発現系を目指している。導入遺伝子発現系の成分は、プラスミドおよび／またはウイルスを含むベクターにより供給することができ、そして細胞への侵入を促進するよう陽イオン両親媒性物質と複合体となっている。本発明は、また、導入遺伝子発現系の産生方法を目指している。本発明は、より更に、導入遺伝子発現系を含む組成物、および生物学的に活性なタンパク質をコードする導入遺伝子を細胞に供給する、そのような組成物の使用方法を目指している。

Description

【発明の詳細な説明】増強された持続性のための新規導入遺伝子発現系緒言本発明は、好ましくはサイトメガロウイルス前初期プロモーター、発現制御配列に作動的に連結した導入遺伝子を含有する転写単位、および細胞中の導入遺伝子の持続的発現を促進するように細胞にアデノウイルスE4ゲノム領域の全部または一部を、一過性に供給する導入遺伝子発現系を目指している。導入遺伝子発現系の成分は、プラスミドおよび／またはウイルスを含む１またはそれ以上のベクターにより供給することができ、そして細胞内に侵入しやすいように陽イオン両親媒性の複合体である。本発明は、更に、導入遺伝子発現系を含む組成物、および、生物活性タンパク質をコードする導入遺伝子をin vivoで細胞に供給し、その持続的発現を得るために、そのような組成物を使用する方法、を目指している。発明の背景アデノウイルスは、約36kbのゲノムを有するエンベロープを持たない、核DNA ウイルスであり、古典的遺伝学および分子生物学における研究を通してよく特徴付けられている（horwitz，M.S.，"Adenoviridae and Their Replication"，Vir ology，2nd edition，Fields et al.，eds Raven Press，New York，1990）。ウイルス遺伝子は、初期（E1−E4として知られている）および後期（L1−L5として知られている）転写単位に、ウイルスタンパク質の２つの一時的なクラスの発生に関して、分類されている。これらの減少の間の限界はウイルスDNA複製である。組換えアデノウイルスは、***および非***細胞の両者に対する親和性、最小の病原性力価、ベクター系の製造に対する高力価のものを複製する能力、および、大きな挿入体を運搬する力、を含めて、遺伝子導入ベクターとしての使用にいくつかの進歩性を有している（Berker，K.L.，Curr．Top．Micro．Immunol．158 :39-66，1992;Jolly，D.，Cancer Gene Therapy 1:51-64，1994）。アデノウイルスベクターのクローニング容積は、ベクター中に存在するアデノウイルスゲノムの大きさに比例する。例えば、約８kbのクローニング容積が、ウイルス増殖になくてもよいウイルスゲノムのある種の領域、例えばE3の欠失、および293細胞（Graham，F.L.，J．Gen．Virol．36:59-72，1977）またはA549細胞（Imler et al.，Gene Therapy 3:75-84，1996）からトランス型で回復される機能のあるE1のようなゲノム領域の欠失、から創生することができる。そのような E1−欠失ベクターは、複製欠損とされる。至適実行容積に対しベクターDNA容積の上限は、野生型ゲノムの長さの約105％−108％である。更に、アデノウイルスゲノム修飾は、他のウイルス遺伝子産物をトランス型で、例えばE2aの相補性（Z ho et al.，J．Virol．70:7030-7038，1996）E4の相補性（Krougliak et al.，H um．Gene Ther．6:1575-1586，1995;Wang，et al.，Gene Ther．2:775-783，199 5）またはタンパク質の相補性（Caravokyri et al.，J．Virol．69:6627-6633， 1995;Krougliak et al.，6:1575-1586，1995）、を供給するような細胞系を使ってベクター設計が可能である。最大許容容積は、全てのウイルスコード配列を欠失したアデノウイルスベクターを用いて達成することができる（Kochanek et al .，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:5731-5736，1996;Fischer et al．Virology 217:11-22，1996）。アデノウイルスベクターにより、現在までに発現される、導入遺伝子は、p53 （Wills et al.，Human Gene Therapy 5:1079-188，1994）；ジストロフィン（V incent et al.，Nature Genetics 5:130-134，1993）；エリトロポイエチン（De scamps et al.，Human Gene Therapy 5:979-985，1994）；オルニチントランスカルバミラーゼ（Stratford-Perricaandet et al.，Human Gene Therapy 1:241- 256，1990;We et al.，J．Biol．Chem．271:3639-3646，1996）；アデノシンデアミナーゼ（Mitani et al.，Human Gene Therapy 5:941-948，1994）；インターロイキン−２（Haddada et al.，Human Gene Therapy 4-703-711，1993）；およびα１−アンチトリプチン（Jaffe et al.，Nature Genetics 1:372-378，199 2）；トロンボポイエチン（Ohwada et al.，Blood 88:778-784，1996）；およびシトシンデアミナーゼ（Ohwada et al.，Human Gene Therapy 7:1567-1576，199 6）、を含む。気道の細胞に対するアデノウイルスの特別な親和性は白色人種における最も普通の常染色体劣性の疾病である嚢胞性繊維症（CF）に対する遺伝子治療においてアデノウイルスを使用に特に適している。気道上皮のcAMP調節C1^-チャンネルを阻害する嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（CFTR）遺伝子の突然変異は、肺機能不全を引き起こす（Zabner et al.，Nature Genetics 6:75-83，1994）。CFTR 遺伝子を運搬するように組替えたアデノウイルスベクターが開発され（Rich et al.，Human Gene Therapy 4:461-476，1993）、そして研究の結果は、それらベクターが、CF患者の鼻上皮（Zabner et al.，Cell 75:207-216，1993），コトンラットおよび霊長類の気道上皮（Zabner et al.，Nature Genetics 6:75-83，19 94）、およびCF患者の肺胞上皮（Crystal et al.，Nature Genetics 8:42-51，1 994）にCFTRを供給する作用を示している。最近の研究によると、CFTRをコードするDNA配列を含むアデノウイルスベクターをCF患者の気道上皮細胞に投与すると、処置した上皮細胞中の機能的塩素イオンチャンネルを復元することができる（Zabner et al.，J．Clin．Invest．97:1504-1511，1996;米国特許出願Ser.No. 08/136,742、1993年10月13日出願として受理）。今日までの、遺伝子導入研究におけるアデノウイルスの使用の結果は、導入遺伝子発現の持続はしばしば一過性である、ことを示している。少なくともいくつかの限度は、アデノウイルス感染細胞を破壊するかまたはそれに対して有害に作用するかの異常炎症の引き金を引く、レプリコン欠損ベクターからでさえも抗原として発現されるウイルスタンパク質に対する細胞免疫反応が生起するためによる（Yang et al.，J．Virol．69:2004-2015，1995;Yang et al.，Proc．Natl．A cad．Sci．USA 91:4407-4411，1994;Zsengeller et al.，Hum．Gene Ther．6:45 7-467，1995;Worgall et al.，Hum．Gene Ther．8:37-44，1997;Kaplan et al. ，Hum．Gene Ther．8:45-56，1997）。なぜならアデノウイルスは、細胞ゲノムに一体化されないので、ビリオンまたは感染細胞を破壊する宿主免疫反応はアデノウイルスを基にした遺伝子治療を限定する力を持っているからである。有害な免疫反応は、アデノウイルスベクターの高投与量または反復投与に対して、厳しい障害であるようにみえる（Crystal，R．Science 270:404-410，1995）。導入遺伝子発現の持続を制限する宿主免疫反応を回避するために、一般的には免疫反応それ自体を修飾するか免疫反応を減少させるベクターを組替えるがいずれかによる、種々の戦略がとられる。ベクターの投与と共に免疫抑制剤の投与は、導入遺伝子持続を長らえることが示された（Fang et al.，Hum．Gene Ther．6 :1039-1044，1995;Kay et al.，Nature Genetics 11:191-197，1995;Zsellenger et al.，Hum．Gene Ther．6:457-467，1995）。アデノウイルスベクター由来導入遺伝子の発現における持続性の欠損は転写単位中に含まれるプロモーターまたは導入遺伝子の選択により強要される制限によることもある（Guo et al.，Gene Therapy 3:802-801，1996;Tripathy et al.， Nature Med．2:545-550，1996）。組換えベクター中に含まれるゲノムアデノウイルス配列に対する修飾は宿主免疫反応を減少するために試みられてきた（Yang et al.，Nature Genetics 7:362 -369，1994;Lieber et al.，J．Virol．70:8944-8960，1996;Gorziglia et al. ，J．Virol．70:4173-4178，Kochanek et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93 :5731-5736，1996;Fischer et al．Virology 217:11-22，1996）。アデノウイルスE3gp19Kタンパク質はMHCクラスI抗原と複合体を形成し、細胞表面提示を防ぎ細胞障害性Tリンパ球（CTLs）による感染細胞の傷害を行う小胞体中にそれらを保持する（Wold et al.，Trends Microbiol．437-443，1994）、このことは組替えアデノウイルスベクター中のその存在は有益である、ことを示している。アデノウイルスベクターをヌードマウスに導入した実験で、アデノウイルスE4ゲノム領域の範囲は、特にCMVプロモーターが導入遺伝子の発現を制御するのに使用されたときに、発現の持続性の決定基であることが示された（Kaplan et al.，Hum ．Gene Ther．8:45-56，1997;Armentano et al.，J．Virol．71:2408-2416，199 7）。それゆえに、アデノウイルスを基にした遺伝子供給の現状は、導入遺伝子の持続および維持された発現能力を示す導入遺伝子発現系の開発が必要である。発明の概要本発明は、発現抑制配列、好ましくはサイトメガロウイルス前初期プロモーター、に作動可能性に連結した導入遺伝子を含み、アデノウイルスE4ゲノム領域の全部または一部を同時に、導入遺伝子の持続的発現を促進するために、細胞に供給されている、転写単位を含む導入遺伝子発現系を目指している。導入遺伝子発現系の成分は、１またはそれ以上のプラスミドおよび／またはウイルスにより供給することができ、そして細胞への侵入を促進するよう陽イオン両親媒性物質と複合体となっている。本発明は、また、導入遺伝子発現系の産生方法を目指している。本発明は、より更に、導入遺伝子発現系を含む組成物、および導入遺伝子を細胞にin vivoで供給し、それらの持続的発現を得るような組成物の使用方法を目指している。図面の簡単な説明図１はCMVβgal、E1aCFTRおよびE1aβgalアデノウイルスベクター系のゲノム構造の模式図を示す。図２はAd2/βgalアデノウイルスベクター系のゲノム構造の模式図を示す。図３はAd2/CMVCFTRアデノウイルスベクター系のゲノム構造の模式図を示す。図４はアデノウイルスE4のヌードマウスにおけるβ−ガラクトシダーゼ発現の効果を示す。図５はアデノウイルスE4のラット肝細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現の効果を示す。図６はアデノウイルスE4のラット肝細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現の効果を示す。図７はヌードマウスにおけるE4修飾アデノウイルスベクターを用いたβ−ガラクトシダーゼの発現を示す。図８はマウスにおけるE4修飾アデノウイルスベクターからのCFTRの発現を示す。図９Aはラット肝細胞におけるE4修飾アデノウイルスベクターからのβ−ガラクトシダーゼの発現を示す。図９Bは特異的E4オープンリーディングフレームを除去したアデノウイルスベクターを用いた発現を示す。図１０はプラスミドpCF1-CATの模式図を示す。図１１はヌードマウスにおけるアデノウイルスベクターからのβ−ガラクトシダーゼの発現の持続を示す。図１２は１６日間のヌードマウスにおけるpCF1-CATからのCATの発現の持続を示す。図１３は２８日間のヌードマウスにおけるpCF1-CATからのCATの発現の持続を示す。図１４はプロモーターの選択に関連したCATの発現の持続を示す。図１５は免疫担当マウスにおけるCATの発現の持続を示す。図１６はヌードラットにおけるCATの発現の持続を示す。図１７はE4＋アデノウイルスの貯蔵におけるCATの発現の再活性化を示す。図１８は静脈投与後のCATの発現の持続を示す。図１９はヌードマウスにおける野生型または端を切り取ったCMVプロモーターから発現したCATの発現の持続を示す。図２０はE4遺伝子の存在下での発現の持続に関連するCMVプロモーターの欠失系の模式図を示す。図２１はプラスミドのおいて使われたプロモーターに関連する発現の持続を示す。図２２はプラスミドをコードしたE4配列の存在下でのCAT発現の持続を示す。図２３はpCFA-ORF3-CATの模式図である。図２４はプラスミドをコードしたORF3およびアデノウイルスの存在下でのCAT 発現の持続を示す。発明の詳細な説明本発明は、発現抑制配列、好ましくはサイトメガロウイルス（CMV）前初期プロモーター、に作動可能性に連結した導入遺伝子を含む導入遺伝子をコードする DNA配列、およびアデノウイルスE4ゲノム領域の全部または一部をコードするDNA 配列、これらは導入遺伝子の持続的発現を促進するために、細胞に同時に供給されている、を含む導入遺伝子発現系を目指している。導入遺伝子発現系のこれら成分は、１またはそれ以上のプラスミドおよび／またはウイルスにより供給することができ、そして細胞への侵入を促進するよう陽イオン両親媒性物質と複合体となっている。本発明は、また、導入遺伝子発現系の産生方法を目指している。本発明は、より更に、導入遺伝子発現系を含む組成物、および導入遺伝子を細胞にin vivoで供給し、それらの持続的発現を得るような組成物の使用方法を目指している。導入遺伝子は、ここで、アデノウイルスゲノム本来のものでない遺伝子と定義される。持続的発現は、導入遺伝子の発現の持続するレベルが時間を超えて発生することと定義される。本発明は、また、ベクターは本発明の導入遺伝子発現系の全ての成分を含んでいるので、導入遺伝子の持続的発現を提供することができる新規なアデノウイルスベクターを目指している。ベクターは、CMVプロモーターの制御下にある導入遺伝子を含んでいる。アデノウイルスE4領域は、CMVプロモーターの制御下に導入遺伝子からの発現の持続を増加するベクターを、好ましくは保有している。ベクターのアデノウイルスゲノムは、例えばE1漁期の全部または一部、およびE3領域の全部または一部が除去された、アデノウイルスゲノムの他の修飾を含む。本発明の導入遺伝子発現系の転写単位は、ここで、導入遺伝子の発現を行うために作動し得るように連結されている。全ての、導入遺伝子をコードするDNA配列、プロモーターまたはエンハンサーのような発現制御配列、ポリアデニル化要素、および発現を修飾または増加させるのに使用されるその他の調節要素、として定義される。導入遺伝子の持続的発現を促進するいかなる発現制御配列、または調節要素、の使用も、本発明の範囲に包含される。そのような配列または要素は、組織特異的発現を生起することができ、または外来の試薬または刺激による誘導に感受性がある。好ましくは、サイトメガロウイルス（CMV）前初期プロモーター（Boshart et al.，Cell 41:521-530，1985）が転写単位中の導入遺伝子の発現を制御するのに使用され、あるいは同様に機能するこのプロモーターの端を切った断片も使用される。CMVプロモーターは、転写単位の導入遺伝子に対し５'に位置している全長プロモーターの部分を、以下に記載する測定を用いて導入遺伝子の持続的発現を行い得る能力を試験することができる。好ましくは、ヌクレオチドの−523から −14または−522から＋72のCMVプロモーターの領域が、本発明の導入遺伝子発現系において使用することができる。本発明における使用に更に好ましい実施態様は、−462から−141までを除去したヌクレオチド−522から＋72を含むCMVプロモーターである。CMVプロモーターの別の好ましい実施態様は以下のヌクレオチド配列を有する態様を含む：−140から＋72、−299から−19、−140から−19、または−19から＋72。他のプロモーターも、ラウス肉腫ウイルス（RSV）またはヒトムチン（MUC1）プロモーターを含んで、しかしこれに限定されないが、本発明の転写単位において使用することができる。転写単位における導入遺伝子の３'端に位置するポリアデニル化シグナルは、ウシ生長ホルモン（BGH）およびSV40から誘導されたものを含むが、これらには限定されない。スプライシング装置を活性化させ、およびメッセージの安定性を増強するために本発明の転写単位中に位置するイントロンの使用は本発明の範囲内に包含される。そのような使用に好ましいイントロンはYew et al.，Hum．Gene Ther．8:57 5-584，1997に記載されているハイブリッドイントロンである。本発明の転写単位から供給され発現することのできる導入遺伝子は、それらをコードした酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン、例えばインターロイキンおよびインターフェロン、凝固体、増殖因子、神経伝達物質、ガン抑制体、アポリポタンパク質、抗原、および抗体、ならびに他の生物活性タンパク質を含むが、これらには限定されない。本発明の転写単位によりコードされる特異的導入遺伝子は、嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（CFTR）、ジストロフィン、グルコセレブロシダーセ、腫瘍壊死因子、p53、網膜芽細胞腫（Rb）、およびアデノシンデアミナーゼ（ADA）を含むが、それらには限定されない。アンチセンス分子、またはリボザイムをコードする導入遺伝子は本発明の範囲内である。本発明の、導入遺伝子発現系の更なる成分は、導入遺伝子発現の転写下向調節を防止する、それゆえ持続の増強を促進するために差に房に転写単位と同時に供給されるアデノウイルスE4ゲノム領域の全部または一部である。E4領域の遺伝子産物は、E4DNA配列は機能するために転写単位に対しシスであることを必要としないから、持続を維持するためにトランスで供給される。E4領域は、ORF１、２、３、3/4、６および6/7を含む。いくつかのオープンリーディングフレーム（OR F）を含む。アデノウイルスE4ゲノム領域は、転写単位に含まれる導入遺伝子の持続的発現を促進するために、全長配列、またはE4領域の一部として、または全長配列に類似的に機能するように使われる個々のオープンリーディングフレーム、として供給される。E4領域のオープンリーディングフレームは導入遺伝子の転写下方調節を防止するために使われるところでは、そのような遺伝子は、生のE4プロモーターの制御下におかれ、また、別に、異種のプロモーターの制御下におかれる。本発明の別の１実施態様において、E4オープンリーディングフレームは、充分なタンパク質産物が転写単位に、例えばCMVプロモーターを別に、または同様な強さのプロモーターを使用して、利用できるように、E4オープンリーディングフレームの充分な発現をもたらすプロモーターの制御の下におかれる。本発明の好ましい実施態様において、アデノウイルスE4配列は、持続的発現を促進するためにORF3遺伝子のコード配列を保持するプラスミドあるいはアデノウイルスベクターに供給される。本発明の特に好ましい実施態様において、アデノウイルスベクターAd2/CFTR-18が、CFTR遺伝子からの持続的発現を提供するために使用される、あるいは、それに含まれているアデノウイルスベクター骨格が、別の所望の導入遺伝子からの持続的発現を提供するために使用される。導入遺伝子の一過性発現が、持続的発現を与える成分を除去した、例えばE4領域あるいはそれに含まれる特定のオープンリーディングフレームを除去した、アデノウイルスベクターを使用して、望むところに、達成できるであろうことは当業者によって認識されることである。本発明の導入遺伝子発現系の成分は、プラスミドおよびウイルスを含むが、これにらには限定されない、１またはそれ以上のベクターで細胞に供給される。本発明の特別の実施態様において、１またはそれ以上の転写単位がプラスミドに供給され、そこでCMVプロモーターが発現を制御するため使用され、そして導入遺伝子の5'位に位置される。上記したように、導入遺伝子発現系のアデノウイルス E4成分は、導入遺伝子転写単位にシスまたはトランスで供給することができる。本発明の好ましい実施態様において、アデノウイルスE4領域は導入遺伝子転写単位にシスで供給され、そこでE4領域は同じベクター、例えばプラスミドまたはウイルス、に転写単位として組替えられる。この特別な例は、導入遺伝子の発現持続に必要な全てのDNA配列に供給するに要する容器が一つで済むという利点がある。代りに、E4領域は、細胞に共に供与される別のベクターで転写単位にトランス型で供給される。導入遺伝子の発現系の成分は、ある種の成分はプラスミドで供給され、別の成分はウイルスで供給されるといったハイブリッドベクター供給系を使って細胞に供給することができる。好ましくは、そのようなハイブリッド供給系はプラスミドに導入遺伝子転写単位を含み、そしてウイルスにトランス型でアデノウイルス E4配列を含む。このハイブリッドベクター系を使って導入遺伝子発現系の供給は、陽イオン分子を基にした供給を利用することができ、例えば、プラスミドとウイルスの両者を供給することができ、あるいは、代りに、プラスミドを細胞に供給するために陽イオン分子を基にした供給を使い、同時にウイルスを細胞に感染させることもできる。本発明の好ましい実施態様において、プラスミドおよびウイルスの両者を、導入遺伝子発現系の成分の化学量論的に制御するために、例えば陽イオン分子を基にした供給を、同じ運搬経路により共に供給される。本発明の一実施態様においては、プラスミドとウイルスは同時に供給される必要はなく、例えば、数日をかけて順次供給することもできる。例えば、プラスミドは細胞に供給され、そして後にウイルスの引続いた供給により再活性化される。今日給されたプラスミドの再活性化は、酪酸ナトリウムのような分子の投与により完遂される。新規アデノウイルスベクターは導入遺伝子発現系の成分を供給するのに使うことができ、そしてそれは本発明の範囲内である。本発明のこの実施態様において、アデノウイルスベクターは導入遺伝子転写単位を含むように組替えられ、そこで導入遺伝子は、好ましくは、E4ゲノム領域の全部または一部を保持すると共に、CMVプロモーターの制御下にある。ウイルスは、好ましくは、アデノウイルスゲノムの他のゲノム領域の全部または一部、例えば、E1、E2およびE3、を含み、そして導入遺伝子転写単位は好ましくは欠失E1領域に挿入されている、複製欠損アデノウイルスベクターである。本発明の好ましい実施態様において、そのようなアデノウイルスベクターはE4ORF3遺伝子およびE3gp19K遺伝子のコード配列を保持している。転写単位を含むように使用することができ、そしてアデノウイルスE4領域を含むベクターの骨格の例は、Ad2/CFTR-1を含む（米国特許No.5,670,4 88、1997年9月23日発行；Rich et al.，Human Gene Therapy 4:461-476，1993、これらはここに文献として取り入れられている）。本発明の転写単位をそのようなベクターに組替えることを含むアデノウイルスベクターを構築することは当業者の水準の範囲内である。転写単位を含む本発明の組替えアデノウイルスベクターを創造するために、アデノウイルスゲノム断片に挿入した転写単位を含むプラスミドは、所定のアデノウイルスベクターから誘導された直線化されたウイルスゲノムと、ゲノム断片とウイルスの間に相同の組換えが起こるような条件下で、受容細胞に共移入される。好ましくは、転写単位はE1欠失の部位に組替えられる。その結果、所望の導入遺伝子をコードする転写単位は、アデノウイルスゲノムのプラスミドにクローン化された部位に挿入され、組換えアデノウイルスベクターが創造される。相同組換えに続いて、ベクターゲノムは、ウイルスプラークの形成による証明のために、ビリオン中にキャプシド化される。転写単位および／またはアデノウイルスE4 領域を含む複製欠損ベクター株の調製は、相補ウイルス遺伝子がベクターから除去されている細胞系、例えば、欠失アデノウイルスE1ゲノム配列を含む293またはA549細胞を用いて達成することができる。適当な相補性細胞系中にプラークの増幅を行った後、ウイルスは凍結融解により回収され、次いで塩化セシウムを使用した遠心法で精製することができる。代りに、ウイルス精製はクロマトグラフ法を使って行うこともできる、例えば国際出願No.PCT/US96/13872、1996年8月30 日出願があげられ、ここに文献として取り入れられる。複製欠損アデノウイルスベクター株の力価は、相補細胞系、例えば293細胞、におけるプラーク形成により決めることができる。例えば、アデノウイルスヘキソンタンパク質に対する抗体を使ったエンドポイント稀釈法がウイルス産生の定量に使用し得る（Armentano et al.，Hum．Gene Ther．6:1343-1353，1995）。導入遺伝子転写単位および／またはアデノウイルスE4配列を供給するのに使用され得るプラスミドは、標的遺伝子がCMVプロモーターの制御の基におかれているpCMVβ（Clontech，Palo Alto，CA）、またはpCFA-ORF3-CATのようなベクター、を含む。本発明は、導入遺伝子発現系の成分が標準的組換えDNA技術を使って組替えすることができ、そして導入遺伝子の持続的発現が促進される、いかなるプラスミドの使用も意図している。その他のベクター、例えば転写単位および／または導入遺伝子発現系のアデノウイルスE4領域を含むプラスミドは標準的組換えDNA技術を使って構築することができる。大量生産および精製は当業者によく知られた技術を使って行うことができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel et al.， eds.，John Wiley & Sons，Inc.，New York，1995を参照）。導入遺伝子発現系のDNA成分は好ましくは、細胞に供給するためにプラスミドおよび／またはウイルスを含む、種々のベクターを含む。しかし、裸のDNAの形で細胞にそのような成分を、例えばトランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、および他のDNA運搬法により、供給することは本発明の範囲内に入る。そのような運搬は、PCT Publication No．WO96/18372、1996年6月2 0日発行、ここに文献として取り入れられる、に記載されたように、例えば陽イオン性脂質のような陽イオン分子を使用して行うことができる。マーカーまたはレポーター遺伝子が、本発明の導入遺伝子発現系においては発現の持続を決定するために導入遺伝子として使用される場合、CMVプロモーターの制御下にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）（以下の実施例６に記載）を含む、pCF1-CATのようなプラスミドを使用することができる。使用し得る他のマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼをコードする遺伝子を含むが、これに限定されるものではない。導入遺伝子発現系は、発現制御配列から導入遺伝子発現の下向き調節を防止することにより持続を促進するのに使用することができる。本発明の特別な実施態様において、導入遺伝子発現系成分は、例えば、CMVプロモーターに作動可能に連結した導入遺伝子を含む、および更にアデノウイルスE4領域の全部または一部を含む、いかなるベクターまたは遺伝子供給系においても使用することができる。導入遺伝子発現系の成分の全部または一部が一またはそれ以上のプラスミドおよび／またはウイルスに含まれていても、そのようなベヒクルの細胞への侵入は、脂質を含む陽イオン両親媒性物質の使用のような媒介供給を用いて達成され得る。陽イオン両親媒性物質は、極性および非極性領域を包含した化学構造を有している、それによって分子は、膜の陽イオン極性領域が膜を通過して運搬される生物学的に有用な分子に付着している間に、非極性領域と共に脂質膜を通過して同時に侵入するのを促進することができる。本発明の導入遺伝子発現系を含むプラスミドまたはウイルスとの複合体を形成するために使用される陽イオン両親媒性物質は陽イオン脂質、例えばDOTMA（Fel gner et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413-7417，1987）（N−[1−（２，３−ジオレトロキシ）プロピル]−N,N,N，−トリメチルアンモニウムクロリド）；DOGS（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）（Behr et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 86:6982-6986，1989）；DMRIE（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）（Fe lgner et al.，J．Biol．Chem．269:2550-2561，1994）；およびDC−コル（3B[N -N',N'−（ジメチルアミノエタン）−カルバモイル]コレステロール）（米国特許No．5,283,185、Epandら）。技術で認識されているまたは発見されることになる他の陽イオン両親媒性物質は本発明の範囲内である。本発明の好ましい実施態様において、本発明のプラスミドおよび／またはウイルスと複合体を造るおよび運搬を促進するに有用な陽イオン両親媒性物質は、PC T発行No．WO96/18372、1996年6月20日発行、文献としてここにとりいれられる、に記載された脂質である。プラスミドおよび／またはウイルスの供給に使用されるようにここに記載された陽イオン両親媒性物質は、GL-53、GL-67、GL-75、GL- 87、GL-89、およびGL-120であり、これらのプロトン化された、部分プロトンかされた、および脱プロトン化されたものを含む。更に、実施態様は、プロトン化された、部分プロトンかされた、および脱プロトン化されたものを含む、前記PC T出願の22−23頁に記載された非Ｔ型両親媒性物質を含む。最も好ましくは、導入遺伝子発現系の成分を含む本発明のプラスミドおよび／またはウイルスを供給するのに使用される両親媒性物質はスペルミンコレステロールカルバミン酸エステル（GL-67）である。本発明の導入遺伝子発現系を含む組成物の処方において、導入遺伝子発現系の細胞への供給を促進するためにジレオキシホスファチジルエタノールアミン（DO PE）のような中性コリピド（co-lipids）と共にーまたはそれ以上の両親媒性物質が処方される。これら複合体に使用される他のコリピドは、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、他のホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリンおよびコレステロールを含むが、これには限定されない。陽イオン両親媒性物質とコリピドの好ましいモル比は１：１である。しかし、考慮すべき範囲に亙るのを含め、この比率を変化することは本発明の範囲内である。本発明の好ましい実施態様において、細胞に供給するためにプラスミドおよび／またはウイルスと複合体にする前に、陽イオン両親媒性物質GL-67と中性コリピドDOPEは１：２モル比で、それぞれ、組み合わされる。本発明の一実施態様において、導入遺伝子転写単位がプラスミドに含有され、アデノウイルスE4領域がアデノウイルスベクターに含有される場合、プラスミドとウイルスの両者は、細胞に供給するために陽イオン両親媒性物質と複合体をつくられる。例えば、プラスミドはGL-67：DOPE（１：２モル比）で結合され、そしてアデノウイルスは100％GL-67と結合される、そしてこれら各々の等容積が導入遺伝子発現系の全ての成分を含むプラスミド／ウイルス複合体を形成するために組み合わされる。陽イオン両親媒性物質とプラスミドを含む複合体の処方において、好ましくは、陽イオン両親媒性物質の４mM−１mMの範囲が、プラスミドの３mM−８mMの範囲と、複合体を形成するために組み合わされる。陽イオン両親媒性物質とウイルス、好ましくはアデノウイルス、を含む複合体の処方において、ウイルスの、好ましくは、10⁷−10¹⁰感染単位の範囲が、10⁴−10⁶陽イオン両親媒性物質／ウイルス粒子の範囲と組み合わされる。測定は導入遺伝子のin vivo発現の持続を決定するために組織培養系で行われる。本発明のプラスミドと共に移入されるまたはウイルスと共に感染される細胞系は、含まれる導入遺伝子の発現の水準および期間を測るための測定に適当なものである。導入遺伝子は、in vivoで、導入遺伝子発現系の持続を試験するに使用される生物学的に有用なタンパク質をコードするか、あるいはマーカータンパク質をコードする。発現の持続を決定する適当な分子測定は、例えば、ノーザンブロット、S1分析または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により、導入遺伝子mRNAの測定を含む。導入遺伝子によりコードされるタンパク質の存在は、ウエスタンブロット、免疫沈降法、免疫細胞化学法、またはその他の当業者に知られた技術により検出される。本発明の構成および組成物を用いてin vivoで導入遺伝子発現の持続を測定するために、動物モデルが、強い宿主免疫反応の背景に対する導入遺伝子持続を評価するために特に適している。そのようなモデルは供給、導入遺伝子の同定、適当な分子測定、および臨床状態での評価の容易さ等のパラメーターにより選択される。導入遺伝子がコードするタンパク質で、その欠乏が特別の病態に関連する場合、その病態を代表する動物モデルが、特異的表現型の結果および臨床改善を評価するために、必要により、使用される。導入遺伝子発現系を測定するに適当な動物は、マウス、ラット、サル、およびウサギを含むが、これに限定されない。導入遺伝子発現系を測定する適当なマウス株は、C3H、C57Bl/6（野生型およびヌード）およびBalb/c（Taconic Farms，G ermantown，New Yorkから入手可能）を含むが、これらには限定されない。宿主免疫反応のベクター投与に対する評価を必要とする場合、免疫担当および免疫欠損動物での試験が免疫系により発生する特異的有害作用を調べるために比較される。免疫欠損動物、例えば、ヌードマウスまたはラット、の使用は、獲得宿主反応と無関係で、ベクターの完成度と導入遺伝子発現の持続を特徴づけるため、および導入遺伝子持続の決定因子を同定するためである。導入遺伝子持続が、試験動物の呼吸器上皮に投与される嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（CFTR）をコードする遺伝子である特別な実施態様においては、CF TRの発現の持続は関連した動物モデル、例えば、C57Bl/6またはBalb/cマウス、コトンラット、またはアカゲザルの肺で測定される。発現の持続を測定するのに使用される分子マーカーは、例えば、ノーザンブロット、S1分析またはRT-PCRによるCFTRmRNAの測定を含む。CFTRタンパク質の存在はウエスタンブロット、免疫沈降法、免疫細胞化学法、または当業者に知られたその他の技術により検出される。そのような測定は、機能的CFTRタンパク質を欠きそして導入遺伝子発現系が導入されている細胞を、機能的CFTR分子の存在の指標である機能的塩素イオンチャンネルの存在を決定するために評価する場合に、組織培養において使用することができる。本発明の導入遺伝子発現系は、特定の表現型の結果を達成するために、導入遺伝子をいくつでも細胞に供給し発現するために、使用することができる。本発明は、更に、１ないしそれ以上の所望の導入遺伝子を、そのような分子を必要とする個々の細胞に運搬し、そして特異的表現型を達成するための生物学的活性タンパク質をコードする導入遺伝子の持続的発現をもたらすために有効な量を投与することができる、本発明の導入遺伝子発現系を含む組成物を目指している。陽イオン両親媒性物質−プラスミド複合体または陽イオン両親媒性物質−ウイルス複合体は導入遺伝子の供給の必要性がある個々に投与するための組成物に処方することができる。組成物は、適当な溶媒を含む生理学的に許容される担体を含み得る。ここで使用される、「生理学的に許容される担体」はどのような全ての溶媒、分散媒体、被覆剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、その他を含む。通常の媒体または薬剤が有効成分と配合禁忌である範囲を除いて、組成物におけるその使用は考慮される。導入遺伝子発現系を含む組成物の投与経路は、標的臓器または組織に対する直接供給、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口およびその他の非経口投与経路のような通常および生理学的に許容される経路を含む。本発明は、導入遺伝子が正常の生物学的または表現型効果を産生するような１ないしそれ以上の導入遺伝子を細胞内に供給するのが望ましいように、本発明の組成物をin vivoまたはex vivoで応用し使用する方法を目指している。in vivo での応用は、組成物に処方した導入遺伝子発現系を個々の細胞に投与することを目指している。ex vivoでの応用は、導入遺伝子発現系を直接、in vitroに保持された自家細胞に転移し、次いで形質導入細胞の宿主に再投与することを含む。生物学的活性タンパク質をコードする持続的発現導入遺伝子を個々に投与し、特異的表現型を達成する導入遺伝子発現系の投与量は、治療される状態、年齢、個々の体重および臨床症状、および生物学的活性タンパク質の支給を必要とする特別な分子欠損を含む、種々のパラメーターに関して決定される。投与量は、好ましくは分子測定または臨床マーカーにより測定され、投与が特異的表現型の結果となるように選択される。例えば、個々に投与されるCFTR導入遺伝子を含有する導入遺伝子発現系の持続性を測定するには、例えば、ノーザンブロット法、免疫沈降法、免疫細胞化学法、または当業者に知られた他の技術による、CFTRmRNA の測定を含む分子測定法により行うことができる。CFTR導入遺伝子の供給から表現型の結果を評価するために使うことができる適当な臨床試験は、肺機能の PFT評価および肺の放射線評価を含む。CFTRをコードする導入遺伝子の供給の証明は導入遺伝子を含有するベクターを投与された嚢胞性繊維症個々の細胞中の機能的塩素チャンネルの存在を検出することにより証明することができる（Zabner et al.，J．Clin．Invest．97:1504-1511，1996）。その他の病態における導入遺伝子発現の持続は条件に最も適した特異的臨床パラメーターを用いて類似の方法で測定することができる。導入遺伝子発現系の全ての成分を含み、生物活性タンパク質をコードする導入遺伝子の持続的発現を供給する効果があり、特異的表現型の結果を達成する、アデノウイルスベクターの投与量は、ヒトについて約10⁸感染単位（I.U.）から10¹ ¹ I.U.の範囲である。投与と投与量の均一を容易にするための投与単位型に非経口組成物を処方するのは特に有利である。ここで使われる投与単位型とは、治療される患者に単位投与量として適した身体的に別々の単位を云い、各単位は必要な生理学的に許容される担体と共同して特異的表現型の効果を産生するように計算された有効成分の予め決められた量を含む。本発明の新規投与単位の明細は、導入遺伝子発現系の独特の性質、および合成物の技術に固有の限度により定められ、直接的に依存している。主要有効成分（導入遺伝子発現系）は、上記に考察した投与単位型で生理学的に許容される担体の有効量において、便利にそして有効に投与するように混ぜ合わされる。本発明の導入遺伝子発現系の投与から得られた特異的表現型の最大の利益および成績を得るには反復投与を必要とする。アデノウイルスベクターを導入遺伝子発現系の成分のいくつかまたは全てを供給するのに使用した場合、そのような反復投与は同じアデノウイルスベクターの使用を含み、あるいは、代りに、ウイルス抗原の発現を変える、宿主免疫反応を減少させるために交換された異なったベクターの使用を含む。本発明の実施には、他に指摘しないかぎり、通常のタンパク質化学、分子ウイルス学、微生物学、組換えDNA技術、および薬理学の技術を使い、それらは通常の技術範囲内である。そのような技術は、文献に全部説明されている。例えば、 Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel et al.，eds.，John Wiley & Sons，Inc.，New York，1995,およびRemington's Pharmaceutical Sciences ，17th ed.，Mack Publishing Co.，Waston，PA，1985を参照。本発明は更に、本発明の範囲を限定するために意図されたものではない、以下の特定の実施例により説明される。実施例１：アデノウイルスベクターの構築方法特異的転写単位およびアデノウイルスゲノムに対する特定の修飾、E4領域に対するそれらを含めて記載されている、以下の実験に使用された組換えアデノウイルスの模式図を図１に描写する。 Ad2/ βgal発現ベクター：CMVβgal発現カセットを、ヌクレオチド357−3328を除去したAd2ヌクレオチド1−10,680を含むpBR322基準プラスミド中に構築した。除去した配列はサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ヌクレオチド−523 から−14まで、pRC/CMV、Invitrogen Carlsbad、CAから入手）、β−ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子および核局在シグナル（Kalderon et al.，Cell 39:499-509，1984）およびSV40ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド2533−27 29、Liebowitz et al.，Curr．Top．Micro．Immunol．87:43-172，1979）で置換した。 E1aCFTRおよびE1aβgal発現カセットは、ヌクレオチド545から始まるAd2欠失を除き同様に構築した。CFTRに対するcDNAは公表されている配列のヌクレオチド 123−4622を表わし、そしてlacZ遺伝子はpCMVβからのNotI断片として得られた（Clontech Palo Alto，CA）。 E4領域の変異は、特別のベクターシリーズに基き番号を付した。図１に示すように、CMVβgal、E1aCFTR、およびE1aβgalベクターシリーズについて、野生型（wt）E4領域をNo.1とし、そしてAd2E4ORF6（Armentano et al.，Human Gene Th erapy 6:1343-1353，1995、ここに文献として取り入れられる）骨格をNo.2と命名した。変異株No.3（mORF6）は２に同じであるが、しかし、繊維領域とORF6の間に挿入されたSV40ポリアデニル化シグナル（ヌクレオチド2533−2729）を含んでいる。この修飾はAd2E4ORF6に見られる減少した繊維合成を修正する（未発表データ）。変異No.4（タンパクIXを移動、PNM）はmORF6に基づいており、欠失して繊維およびSV40ポリアデニル化シグナルの間に再配置されたpIX配列（ヌクレオチド3519−4061）を含んでいる。この修飾は、ウイルス拡大の間、複製適格アデノウイルスの発生を減少するのを助け、そしてウイルスの臨床グレードの調製品を生成するのに非常に貴重であった（Hehir et al.，J．Virol．70:8459-84 67，1996）。完全なE4欠失、変異５（ΔE4）、は以下のようにして構築された。 pAdORF6（Armentano et al.，Hum．Gene Ther．6:1344-1353，1995）をBamHIおよびSalIで切断し、ITRおよびE4ORF6を除く。これを、SV40ポリアデニル化シグナルを含むBamHI−BglII断片、およびAdヌクレオチド35642−35937（E4エンハンサー領域および逆方向末端反復配列）を含むPCRにより生成したBamHI−SalI断片で置き換えた。 Ad2/βgalベクターシリーズの模式図を図２に示した。Ad2/βgal-7をAd2/βga l-2の大きなPacI断片（ウイルスの左端に相当する）をdI366＋ORF4の大きなPmeI 断片（右端に相当する）と共に組換えによりVK2-20中に造った。Ad2/βgal-8から-13を同様にAd2/βgal-5を使って293細胞中に組替えのためにこしらえた。Ad2 /βgal-8をORF6および6/7のみを含むE4d1ORF1-4と共に組換えにより造った（Hua ng et al.，J．Virol．63:2605-2615，1989）。個々のORF、Ad2/βgal-9(ORF1) 、Ad2/βgal-10（ORF2）、Ad2/βgal-11（ORF3）、Ad2/βgal-12（ORF4）および Ad2/βgal-13（ORF6/7）のノックアウトウイルスは、それぞれ351、352、ORF3中のE4、d1358、およびd1356中から誘導した（Halbert et al.，J．Virol．56:250 -257，1985）。いくつか既に記載したベクターは単純化のため異なった名称を与えている。ベクターCMVβgal-1および-2はAd2/βgal-2およびAd2/βgal-4と、それぞれ、称し（Kaplan et al.，Hum．GeneTher．8:45-56，1997）およびベクターE1aCFTR-4（ PNM）はAd2/CFTR-8（Hehir et al.，J．Virol．70:8459-8467，1996）と称する。 Ad2/CFTR 発現ベクター。Ad2/CFTR-5の構築は既に記載されている（Jiang et a l.，Hum．Gene Ther．8:671-680，1997）そしてORF6のみを含むようにE4中に修飾される。Ad2/CFTR-16は野生型E4領域を含んでいるが、しかしE3中に修飾されている。Ad2/CFTR-18はE4中でORF3およびORF4のみを含むように修飾されており、以下のように構築された。E4ORF3およびORF4発現カセットを含むプラスミドは、pBluescriptIIsk＋（stratagene）のSpeIおよびHindIII部位にクローンされた 27123から35937までのAd2配列を含むpAdE4から誘導された。pAdE4中のAvrII部位（ヌクレオチド35470）とBcII部位（ヌクレオチド32891）の間の配列は除かれ、 PCR生成AvrII-BamHI断片（Ad2ヌクレオチド34804から33998まで）で置換されている。この断片はORF3およびORF4に対するコード配列およびORF3およびORF4発現に対する３'スプライス部位を含む。できあがったプラスミド、pAdE4ORF3+4は、 PacI切断Ad2/CFTR-5と組替えるためEagIと直線化され、Ad2/CFTR-18を生成する。これらのベクターは図３に示す。完全E4欠失を除いて、全てのウイルスは293細胞中で増殖、精製され、そして前に記述した（Armentano et al.，Hum．Gene Ther．6:1344-1353，1995）FITC 複合抗ヘキソン抗体（Chemicon）を用いてエンドポイント稀釈により滴定した。完全E4欠失ウイルスは、293細胞から誘導されたE4相補細胞系である、VK2-20細胞中で増殖された（Krougliak et al.，Hum．Gene Ther．6:1575-1586，1995）。293およびVK2-20細胞の両者はDr．Frank Grahamより入手された。実施例２：アデノウイルスE4を用いたトランス型における導入遺伝子発現系の持続方法野生型E4領域を含むが、しかしCMVプロモーターを含まないベクターからE4の効果がトランス型で供給することができるかどうかを試験するために、実験を行った。この目的のために、ヌードマウスはCMVβgal-1(wtE4)またはCMVβgal-2(O RF6)のみで感染させ、またはE1aCFTR-1(wtE4)、E1aCFTR-4(PNM)またはE1aCFTR-5 (ΔE4)と共感染させた。もし、野生型E4が持続に要求されるなら、E1aCFTRシリーズのいずれとでもCMVβgal-1（wtE4）との共感染では発現の大略は変らず、そして発現の持続が全ての場合で見られる筈である。もし、E4が要求され、しかしその効果はトランス型で供給され得るならば、CMVβgal-2(ORF6)とE1aCFTR-1(wt E4)の共感染は、CMVβgal-1(wtE4)と共に観察されるのと類似の発現が持続する結果となるはずである。対照的に、E1aCFTR-4(PNM)または-5(ΔE4) のいずれかとの共感染は発現効果がなく、CMVβgal-2のみを投与された動物で観察されると類似の発現プロファイルが予期された。 Ba1b/c親およびヌードマウスはTaconic Farms(Germantown，New York)から購入した。動物は、ほとんど雌で、７から16週令の範囲のものをin vivo試験に使用した。マウスはメトファン（メトキシフルラン）の吸入により麻酔され、100 μl PBS、３％しょ糖で組替えウイルスを鼻内に滴下した。マウスは、CMVβgal-1(A-D)1.5×10⁹I.U.またはCMVβgal-2(E-H)のみ(A、E)、または1.5×10⁹I.U．E1aCFTR-1(B、F)、1.5×10⁹I.U．E1aCFTR-4(C、G)または4. 3×10⁸I.U．ElaCFTR-5(D、H)と一緒に鼻内に滴下した。マウスは、第３日および 14日に屠殺し、個々の動物の肺をホモジナイズし、β−ガラクトシダーゼ活性を AMPGD（３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキシエタン−３，２'−トリシクロ［3.3.1.1^3,7］デカン］−４−イル］フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）（Galactolight^TM）アッセイ（Tropix，Bedford，MA）により測定した。肺ホモジネート中のタンパク質濃度はBioRad（Hercules、CA）DC試薬で測定し、β −ガラクトシダーゼ活性は相対蛍光単位（RLU／μgタンパク質）で表わした。各棒は、少なくとも３動物の平均活性を示す。結果図４に示した結果は、CMVβgal-1（A）からの発現プロフィールは、E1a-CFTR ベクターのいずれとの共感染された動物で変化なしに残っていることを示している（B、CおよびD）。CMVβgal-2からの発現（E）は、E1a-CFTR-4または-5と共感染された動物では第14日目に降下している（G、H）。しかし、E1a-CFTR-1と共感染された動物で第14日目には（F）上昇したまま残っており、そしてそれはCMVβ gal-1を受容した動物において見られたのと類似している（A−D）。このことはE 4産物はトランス型で供給され、直接的または間接的に、CMVプロモーターからの発現の持続ができるよう働くことができる、ことを示唆している。実施例３：組織培養における導入遺伝子発現系の持続方法肺以外の組織でCMVプロモーターからの発現にE4要求が見られるか、およびE4 機能はトランス型で提供されるかをしらべるために培養ラット肝細胞で共感染試験を行った。初代ラット肝細胞はMOI（感染多重性）10でCMVβgal-1または-2のみを感染させ、またはE1aCFTR-1、-4または-5をMOI 10で共感染させ、X-gal染色によりβ−ガラクトシダーゼ発現を解析した。結果図５パネルAおよびBは、感染後第３日および第14日の、それぞれのCMVβgal-1 で見られたβ−ガラクトシダーゼ発現を描写したものである。パネルC、Dおよび EはE1aCFTR-4、-1または-5を、それぞれ共感染させた培養における感染後14日間に観察された発現に相当する。全ての場合において、発現は第14日まで持続しているようにみえる。図６のパネルＡおよびＢは、それぞれ感染後第3日および14日に解析したCMVβ gal-2感染培養を表わす。肝細胞におけるこのベクターでの発現は明らかにこの期間中減少した。パネルＣ、ＤおよびＥに示した、E1aCFTR-4、-1または-5との共感染は、E1aCFTR-1と共感染した培養を除いて第14日までに発現が下降している。これらの結果は、マウス肺における場合と同じく培養肝細胞においてＣＭＶプロモーターからの延長した発現にはＥ4の要求性があること、および持続発現に必要なＥ4機能はトランス型で提供されることを明らかにしている。実施例４：マウス肺における発現の持続に対する特異的Ｅ4オープンリーディングフレームの効果方法ＣＭＶプロモーターからの導入遺伝子の持続的発現にアデノウイルスＥ4領域の特異的オープンリーディングフレームが必要かどうかを決定するために実験を行った。Ｅ4領域の特異的オープンリーディングフレームが保持または欠失している組換えアデノウイルスベクターを実験に使用した。 Ad2/ βgal発現ベクター。Ba1b/cヌードマウスに、Ad2/βgal-4（野生型E4）、 Ad2/βgal-7（ORF4を含む）、またはAd2/βgal-8（ORF6およびORF6/7を含む）の 3×10⁹感染単位を鼻内に滴下した（図２）。マウスを第３日目および14日目に屠殺し、試験動物の肺におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を実施例２に記載した方法により測定した。各時間の点は動物４頭の平均を示す。Ad2/CFTR 発現ベクター。マウスに、Ad2/CFTR-5、Ad2/CFTR-16、またはAd2/CFT R-18の3×10⁹感染単位を鼻内に滴下し、滴下後、第3日目、2111目および42日目に屠殺した。肺からのRNA試料を各ベクターの各々の時間（ｎ＝４）でプールし、hCFTRmRNAを定量RT-PCRで測定した。結果 Ad2/ βgal発現ベクター。図７は、野生型E4を含むAd2/βgal-4を投与した動物の第14日目までの発現の持続を示す。Ad2/βgal-7またはAd2/βgal-8を投与された動物での発現は第3日から第14日目まで下降した。このことは、ORF4またはORF 6および6/7のいずれもCMVプロモーターから発現の延長を達成するに充分でないことを示している。 Ad2/CFTR 発現ベクター。図８に示した結果は、Ad2/CFTR-16（野生型E4）を投与された動物はCFTRの発現が第42日目まで持続するが、Ad2/CFTR-18（ORF3およびORF4）を投与された動物においてはそうでないことを示している。この結果は、ORF3がCMVプロモーターからの長期発現に必要であるという、Ad2/βgalベクターシリーズでの発現解析からの結論を支持している。Ad2/CFTR-18ベクターにおいて、ORF4による発現の延長における寄与を除外することはできない。ORF4（Ad 2/βgal-7）のみを保有するベクターにおけるCMVプロモーターからの発現は持続しないので、ORF4の寄与は極微であろう。それゆえ、ORF3はCMVプロモーターからの長期発現を達成するに充分であるように思われる。実施例５：ラット肝細胞における発現の持続に対する特異的Ｅ4オープンリーディングフレームの効果方法ラット肝細胞をMOI 10でAd2/βgalシリーズでウイルスに感染させた。β−ガラクトシダーゼ発現は、感染後第3日および14日に感染肝細胞のX-gal染色により可視化された。結果図９Aのグラフは、特異的E4オープンリーディングフレーム：Ad2/βgal-2、Ad 2/βgal-7、およびAd2/βgal-8（図２）、を含むアデノウイルスベクターを感染させた細胞における、染色細胞の割合を示す。前に観察したように、野生型E4 領域（Ad2/βgal-4）を含むベクターと共にラット肝細胞において発現は持続するが、ORF6（Ad2/βgal-2）のみを含むベクターでは持続しない。ここで上部のパネルに示すように、ORF4（Ad2/βgal-7）のみを含むベクター、またはORF6および6/7（Ad2/βgal-8）のみを含むベクターのいずれかで感染された肝細胞においては発現は持続しない。データはORF4またはORF6および6/7はCMVプロモーターからの持続的発現をするには充分でないことを示している。図９Bのグラフは、個々のE4ORF（Ad2/βgal-9からAd2/βgal-13、図２）のノックアウトを含むアデノウイルスベクターで感染したラット肝細胞で得られた結果を示す。ORF3ノックアウト（Ad2/βgal-11）で感染した培養を除き、個々のOR Fノックアウトを含むウイルスで感染した全ての培養で、発現が持続している。このデータは、ORF１、２、４、および6/7は長期発現を達成するのに要求されなく、CMVプロモーターからの持続的発現においてE4の観察されたような効果での役割を演じるようにORF3をしていることを示している。ORF3は、少なくとも、CM Vプロモーターからの発現の持続を達成するために必要であることを、データは示している。実施例６：マウスにおけるハイブリッドプラスミド／ウイルス導入遺伝子発現系の持続方法プラスミドpCF1-CATを創生するために、ベクターpCMVβ（Clontech，Palo Alt o，CA）を、最初NotIで消化し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を切り出して、−5 22から＋72までのCMV前初期プロモーターを含むpCMVを形成した（Boshart et al .，Cell 41:521-530，1985）。ウシ成長ホルモン（BGH）ポリAシグナルをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いてベクターpcDNA3（Invirogen，San Diego，CA）から増幅した。241bpPCR産物をベクターpCRII（Invirogen，San Diego）にサブクローンしてpCRII-BGHを形成した。NotI-HindIIIBGH断片を切断し、pCMVのNotI およびHindIII部位に結合し、SV40ポリAシグナルを置換し、pCMV-BGHを形成した。ハイブリッドイントロンがベクターpADB（Clontech，Palo Alto，CA）から得られた。PADBをPmlIおよびNotIで消化し、そして−500bp断片を単離し、pBluesc riptII KS(-)のHincIIおよびNotI部位に結合して、pBlueII-HI2を形成した。pBlueII-HI2をXhoIおよびNotIで消化してハイブリッドイントロン断片を切断した。この断片をpCMV-BGHのXhoIおよびNotI部位に結合し、SV40イントロンを置換してpCMVHI2BGHを形成した。カナマイシンに抵抗性を付与するアミノグリコシド３'ホスホトランスフェラーゼ（APT）遺伝子はベクターpUC4K（Pharmacia， Piscataway，NJ）から得た。pUC4KはEcoRIで消化して、1.3kbAPT遺伝子に切断した。EcoRI末端はDNAポリメラーゼIのKlenow断片を用いて平滑にした。pCMVはA1w NIおよびEcoRIで消化して、Klenowで末端平滑化した。APT断片をpCMVベクターに結合し、アンピシリン耐性遺伝子を置換してpCMV/kanを生成した。pCMV/kanはNc oIおよびA1wNIで消化してAPT遺伝子およびフランキング配列を切断した。この断片を、pCMVHI2BGHのNcoIおよびA1wNI部位に結合し、pCMVM2BGH/kanを生成した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）cDNAをCAT Geneblock （Pharmacia）から得、NotIリンカーをcDNAの末端に加えた。pCMVHI2BGH/kanをN otIで消化し、CATcDNAに結合し、pCF1-CATを生成した（図10）。 p5GΔCECMV-CAT（p5GminCMV-CAT）プラスミドはpCFI-CATから由来した。小ポリリンカーをpCMVHI2BGH/kan（上を見よ）のCMVエンハンサー／プロモーターの５'に挿入し、pCMV(A-N)kanを生成した。５つのイーストGAL4結合部位を４つの合成オリゴヌクレオチドから組み立て、そしてpCMV(A-N)kanのポリリンカーAvrI I部位に挿入した。322bpAatII断片（転写開始部位に相当する−462から−141のC MVエンハンサーを除去）を除き、CATcDNAをNotI部位に結合して、p5GΔCE-CAT（ p5GminCMV-CAT）を形成した。陽イオン両親媒性物質−プラスミド複合体は、pCF1-CAT（0.6：3.6mM）のGL67 -DOPE（１：２）とアデノウイルス（Ad2/CMVβgal-4、野生型E4またはAd2/CMVβ gal-5を含む、E4は欠損）のGL-67（100%）の間に生成した（約３×10⁵GL-67分子／ウイルス粒子および約10⁹感染単位／マウス）。脂質−DNAおよび脂質−ウイルス複合体は、全ての成分を5分間30℃に加温し、脂質をDNAまたはウイルスに非撹拌で加え（脂質140μlをDNAまたはウイルス140μlに加えた）、そして複合体を3 0℃、15分間放置することにより生成された。２つの複合体を組み合せた。量複合体の混合物をBa1b/cマウスに、50μlずつの２投与段階で鼻内に滴下した。動物は、示した時間に屠殺した。複合体を滴下したマウスの肺からの抽出物を、アデノウイルスから生成したβ-gal活性（陽性対照）、およびプラスミドから生成したCAT活性につき評価した。個々の動物からの肺をホモジナイズし、実施例２に記載した方法でβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。CAT活性は標準アイソトープ測定法により検出した（Molecular Biology，3rd．ed.，Aussubel et al.，eds.，Wiley and Sons，Ne w York，1995の小計画書を参照）。結果陽イオン両親媒性物質媒介供給による細胞に同時に導入された、CMVプロモーターとE4領域を含むアデノウイルスの転写単位を含有するプラスミドを用いて、導入遺伝子の発現が達成されるかを試験するために実験を行った。測定は、滴下後種々の時間で行われ、その結果は図11、12および13に示した。導入遺伝子発現は発現の初期レベルの機能として示した。図11において、アデノウイルスからのβ-gal発現は、野生型E4（Ad2/CMVβgal -4）を含むベクターが、検出し得る時間中β-galの増加したレベルで16日間に亙る発現の持続を示すことを、証明した。E4を除去したベクター（Ad2/CMVβgal-5 ）はβ-gal発現の急速な喪失を示した（Ad2/CMVβgal-4ベクターから約50％の絶対レベルから開始）。図12は、プラスミドベクターからのCAT活性は、＋／−野生型E4を6日まで滴下したとき、同様の傾向を示した、ことを示している。E4欠損マウスでのCAATの発現は16日に亙り下降を続けたのに対し、E4＋マウスは発現の第１日レベルの約70 ％まで安定した増加を示した（図12）。pCF1-CATからのCATの発現を28日間にわたり測定したとき、Ad2/βgal-4により供給されたアデノウイルスE4領域の存在は、それがないときに検出されるよりも第28日において有意に高い発現で相関した（図13）。その結果、プラスミド由来レポーター遺伝子発現の持続にE4領域の必要性が明かにされた。 E4に反応する他のプロモーターの同定：BALB/c nu/nuマウスへの複合体の鼻内ボーラス滴下。ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーターまたはヒトムチン１（MUC1）プロモーターのいずれかから推進されるCATを含むプラスミドは両者共E 4(+)アデノウイルスの存在下で持続性導入遺伝子発現を与える（図４）。免疫適格性動物における持続性発現：弱い免疫原性レポーター遺伝子ヒトα− ガラクトシダーゼおよびE4(+)アデノウイルスのBALB/cマウスへの共滴下により、再びα-galの持続性発現が観察された（図15）。別の種における持続性発現：複合体のヌードラットへのボーラス鼻内滴下。ヌードラットにおいては、ヌードマウスにおけるように、pCF1-CATとE4(+)アデノウイルスの鼻内滴下はE4(-)アデノウイルスのそれよりも、より持続性の導入遺伝子発現が得られた（図16）。 E4(+)アデノウイルスによるプラスミドの再活性化：pCF1-CATのボーラス鼻内滴下：陽イオン脂質複合体をBALB/c nu/nuマウスにE4(+)アデノウイルスを共滴下するか、または滴下して７日後に類似の持続発現プロフィールが得られた。このことは、プラスミドは肺細胞に未だ存在し、後の時間点においても再活性化することできることを、示している（図１７）。静脈内投与後の持続性発現：pCF1-CATまたはpCFT-E4-CATのボーラス静脈内注射：BALB/c nu/nuマウスへの陽イオン脂質複合体。持続性発現をE4遺伝子、但し E4配列を欠くベクター内ではない、を含むベクターから肺において観察した（図 18）。実施例７：CMVプロモーターから発現の持続性におけるプロモーター先端切除の効果方法導入遺伝子発現系による持続性発現に全長CMVプロモーターが必要であるかを決めるために実験を行った。プラスミドpCF1-CATおよびp5GminCMV-CATを、実施例６に記載したようにしてヌードBa1b/cマウスに、Ad2/βgal-4により供給されたアデノウイルスE4領域と共に、導入した、そして発現を滴下後14日間モニターした。結果図19は、14日間に亙るCAT発現の持続を全pCF1-CATプロモーター領域またはCMV プロモーター配列（p5GminCMV-CAT）の部分の大欠損を含むプラスミドを用いてヌードマウスに保持した結果を示す。図20は、CMVプロモーターの欠失シリーズの模式図およびE4遺伝子の存否に応じて各プロモーターを達成した発現を示す。実施例８：E4含有アデノウイルスの存在下異なったプロモータープラスミドから CAT発現の持続 pCF1-CATはCMVプロモーターを含み、pRSV-CATはラウス肉腫ウイルスLTRプロモーターを含み、pCEMUC1-CATはCMVエンハンサー−ムチン１プロモーターを含み、そしてpIL8-CATはヒトインターロイキン−８プロモーターを含む。ヌードBALB/c マウスにAd2/βgal-4(E4+)および別のプラスミドを滴下し、次いでCAT測定を滴下後異なった日に集めた肺で行った。 CMV、RSV、またはCMVエンハンサー−ムチン１プロモーターのいづれかを含むプラスミドからの発現レベルは、Ad2/βgal-4を共滴下したとき第21日で、第2日のレベルの約80−300%であった。対照的に、これらのベクターからの発現はAd2/ βgal-4がない場合第21日で第２日のレベルの５％以下であった。IL-8プロモーターからの発現は、Ad2/βgal-4の存在下で持続はなく、第21日で第２日のレベルの５％以下であった。このことは、CMV、RSV、およびCMVエンハンサー−ムチン１プロモーターはE4に反応性であるが、しかしIL-8プロモーターはそうではない（図21）。実施例９：プラスミドにコードしたE4配列の持続におけるCAT発現の持続ヌードBALB/cマウスに、脂質GL-67、pGF1-CATおよび、pCFA-E4またはpCFA-ORF 3のいずれかの複合体、または陽イオン脂質GL-67とpCFA-E4-CATの複合体を共滴下した。CAT測定は、滴下後異なった日に採取した肺で行った。図22に見られるように、E4の全てまたはORF3のみのいずれかを発現するプラスミドを投与されたマウスからCAT発現のレベルはpCF1-CATのみを滴下したマウスからの発現に比較して第42日において有意に高かった。結果は、CMVプロモーターからE4を発現するプラスミドはpCF1-CATよりの持続性発現を付与し、ORF3のみの産物は持続性発現を付与するのに充分であり、そしてE4およびCATの両者を含有する単一プラスミドは持続性である、と云うことを示している。実施例１０：E4 ORF3およびCATを発現するプラスミド pCFA-ORF3-CATを、CMVエンハンサープロモーターの５'にある、pCMV(A-N)kan のMfeI部位に、rabβグロブリンポリアデニル化シグナルを含む合成オリゴヌクレオチドを先ず挿入することによって、構築した。次いで、Ad2 E4プロモーターを含有する平滑化Taq I断片を、ポリアデニル化シグナルを含むpCMV(A-N)kanのA vr II部位に挿入した。次に、Ad2 E4 ORF3をPme I部位に挿入した。最後に、CAT cDNAをNot I部位に挿入して、pCFA-ORF3-CATを形成した（図23）。実施例１１：発現を至適持続するためのE4 ORF3以外のアデノウイルスの追加成分の必要条件ヌードBALB/cマウスに、陽イオン脂質GL-67と、pCF1-CATまたはpCFA-E4-CATのいずれか、プラスAd2/βgal-2、Ad2/βgal-4、または賦形剤（リン酸バッファー生理食塩水）のいずれか、との複合体を滴下した。CAT測定は、滴下後異なった日に収穫した肺で行った。 pCFA-E4-CAT＋賦形剤から第21日での発現は、第２日のレベルのおよそ２０％であり、その結果と一致した図24に示した。比較すると、pCFA-E4-CAT＋Ad2/βg al-2を投与されたマウスよりの第21日の発現は第２日のレベルの100%大きい。このことは、複合体内にアデノウイルスが存在すると、発現の持続性が増加する、ことを示唆している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 35/76 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ａ６１Ｋ 35/76 5/00 ＢＡ (72)発明者イュー，ネルソンアメリカ合衆国マサチューセッツ，ウエストアップトン，ロックデールヒルサークル 25 (72)発明者チェン，センアメリカ合衆国マサチューセッツ，ウェルスリイ，ウォールストリート 50 (72)発明者グレゴリー，リチャード，ジェイ. アメリカ合衆国マサチューセッツ，ウエストフォード，ウィンターグリーンレーン２

Claims

【特許請求の範囲】 1. （a）発現制御配列に作用し得るように連結された導入遺伝子を含む転写単位をコードするDNA配列、および（b）アデノウイルスE４領域の全部または一部をコードするDNA配列を含む導入遺伝子発現系。 2. 転写単位およびアデノウイルスE４領域の全部または一部をコードするDNA 配列がプラスミドに含有されている請求項１記載の導入遺伝子発現系。 3. 転写単位をコードするDNA配列がプラスミドに含有され、そしてアデノウイルスE４領域の全部または一部をコードするDNA配列がアデノウイルスベクターに含有されている、請求項１記載の導入遺伝子発現系。 4. 転写単位およびアデノウイルスE４領域の全部または一部をコードするDNA 配列がアデノウイルスベクターに含有されている、請求項１記載の導入遺伝子発現系。 5. 発現制御配列が、RSV、WUC１およびCMVプロモーターからなる群より選択された請求項１記載の導入遺伝子発現系。 6. 発現制御配列がCMVプロモーターである請求項１記載の導入遺伝子発現系。 7. 導入遺伝子が嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（CFTR）である請求項１記載の導入遺伝子発現系。 8. 請求項１記載の導入遺伝子発現系および陽イオン両親媒性物質を含む複合体。 9. 陽イオン両親媒性物質がGL-67である請求項８記載の複合体。 10．導入遺伝子発現系および１またはそれ以上の陽イオン両親媒性物質を複合体を形成するように組み合せ、そして該複合体を細胞に導入する、ことを含む導入遺伝子を標的細胞に供給する方法。 11．請求項８記載の複合体および生理的に許容される担体を含む組成物。 12．１またはそれ以上の陽イオン両親媒性物質およびCFTRをコードする導入遺伝子を含む導入遺伝子発現系を組み合せて複合体を形成し、嚢胞性繊維症患者の気道上皮細胞に該導入遺伝子が発現し、そして機能的塩素イオンチャンネルが産生するような条件下で、機能的塩素イオンチャンネルが生成するために生物活性 CFTRタンパク質を供給するような該複合体の量を、該嚢胞性繊維症患者の気道上皮細胞に投与することを含む、嚢胞性繊維症患者の気道上皮細胞にCFTRを供給する方法。 13．転写単位およびアデノウイルスE４領域のORF3をコードするDNA配列がアデノウイルスベクターに含有されている請求項１記載の導入遺伝子発現系。 14．転写単位およびアデノウイルスE４領域のORF3およびORF4をコードするDNA 配列がアデノウイルスベクターに含有されている請求項１記載の導入遺伝子発現系。