JP2001521365A - 心臓血管病の治療および診断のための組成物並びに方法 - Google Patents

心臓血管病の治療および診断のための組成物並びに方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、限定するものではないが、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧症、再発性狭窄症、および動脈炎症を含む心臓血管病の治療および診断のための方法および組成物に関する。具体的には、本発明は、心臓血管病状態において示差的に発現する遺伝子を、正常な状態または非心臓血管病状態におけるそれらの発現との対比において、および／または心臓血管病に関連した操作に応じて同定および記載するものである。さらに、本発明は、それらの遺伝子産物の、心臓血管病に関与する遺伝子産物と相互作用する能力によって遺伝子を同定および記載するものである。さらに、本発明は、心臓血管病の治療薬としての化合物の同定方法および治療上の使用方法を提供する。さらに、本発明は、心臓血管病の治療の臨床評価を受ける患者の診断モニタリングの方法、および臨床試験における化合物の効力をモニタリングする方法を提供する。さらに、本発明は、種々の心臓血管病の診断的および予後的評価方法、ならびにそのような状態の疾病素因を示す被検者の同定方法を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 心臓血管病の治療および診断のための組成物並びに方法 本出願は、1996年２月16日に出願した、共同係属中の仮出願第60/011,787号に ついての35 U.S.C．§119(e)に基づく利益を主張するものである。 １．序論 本発明は、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧症、再狭窄、動脈 の炎症を含むがこれらに限らない、心臓血管病の治療および診断のための方法並 びに組成物に関する。正常な状態または非心臓血管病の状態での遺伝子発現に対 して、心臓血管病の状態では示差的に発現される遺伝子が同定される。また、そ の遺伝子産物が心臓血管病に関係のある他の遺伝子産物と相互作用する能力によ っても遺伝子が同定される。同定された遺伝子は診断的に使用されるか、または 治療的介入の標的として使用される。これに関して、本発明は、心臓血管病の治 療および診断用の化合物の同定法並びに治療的使用を提供する。さらに、心臓血 管病の治療の臨床的評価を受ける患者の診断的モニター法、臨床試験における化 合物の効力のモニター法、および心臓血管病の素因をもつ患者の同定法も提供す る。 ２．発明の背景 心臓血管病は産業の発達した世界の至る所で主要な健康上の問題となっている 。アテローム性動脈硬化症は、心臓血管病のうちで最も一般的なもので、心臓発 作、卒中、四肢の壊痘の主な原因となり、それゆえ米国では第一位の死亡原因で もある。アテローム性動脈硬化症は多くの細胞型と分子因子を巻き込んだ複雑な 疾患である（詳細については、Ross，1993，Nature 362:801-809を参照のこと） 。その過程は、正常な状況では動脈壁の内皮および平滑筋細胞（ＳＭＣ）の傷害 に対する防御反応であり、炎症が先行し、炎症を伴った繊維脂肪質または繊維質 の病変部または斑の形成から成り立っている。アテローム性動脈硬化の進行した 病変部は関係した動脈を閉塞させることがあり、多数の異なる形の傷害に対する 過 度の炎症−繊維性増殖応答が原因である。例えば、分岐点や不規則な構造のよう な、乱れた血流が起こる循環系の領域にアテローム性動脈硬化斑がよく生じるの は、ずれ応力(shear stress)が関与していると考えられている。 アテローム性動脈硬化斑の形成において最初に観察される現象は、血液由来の 単球が血管内皮層に付着して内皮下腔に移行するときに起こる。同時に隣接内皮 細胞が酸化された低密度リポタンパク質（LDL）を産生する。その後これらの酸 化型LDLは、単球の表面に発現されたスカベンジャー受容体を介して単球によっ て大量に取り込まれる。調節された経路（これにより天然LDL（ｎLDL）がｎLDL 特異的受容体により取り込まれる）とは対照的に、取込みのスカベンジャー経路 は単球によって調節されない。 こうした脂質に富む単球は泡沫細胞(foam cell)と呼ばれ、脂肪線条(fatty st reak)の主成分である。泡沫細胞とそれらを取り囲む内皮およびＳＭＣとの相互 作用は慢性の限局的炎症状態をもたらし、最終的には平滑筋細胞の増殖および移 動、そして繊維質の斑(plaque)の形成を引き起こす。この種の斑は血管を閉塞さ せ、血液の流れを制限し、結果的に虚血を生じさせる。 虚血は不十分な灌流による器官組織への酸素供給の欠乏により特徴づけられる 症状である。このような不十分な灌流は多くの症状の自然因となり得、二三の名 を挙げると、アテローム性動脈硬化または再狭窄、貧血、卒中などである。多く の医学的介入（例えばバイパス手術中の血流の遮断）も虚血をまねく。疾病状態 の心臓血管組織により時々引き起こされることに加えて、虚血は虚血性心疾患に おけるように心臓血管組織に影響を及ぼすことがある。しかしながら、虚血は酸 素供給の欠乏という問題を抱えているどの器官でも起こり得る。 心臓における虚血の最も一般的な原因は、噴門上部の冠状動脈のアテローム性 動脈硬化である。これらの血管の内腔を狭めることにより、アテローム性動脈硬 化は基底状態の心筋灌流の絶対的低下を引き起こすか、または血流に対する要求 が増大するときには適切な灌流増加を制限することになる。冠状動脈の血流は、 動脈の血栓、痙攣、稀には冠状動脈の塞栓により、さらに梅毒性大動脈炎による 口狭窄によっても制限される。肺動脈からの左前下行冠状動脈の異常な起点のよ うな先天異常は、幼児では心筋虚血や梗塞を引き起こすことがあるが、この原因 は成人では非常に稀である。また、高血圧や大動脈弁狭窄による重症の心室肥厚 におけるように、心筋の酸素要求が異常に増大したときにも心筋虚血が起こりう る。大動脈弁狭窄は冠状動脈のアテローム性動脈硬化によって引き起こされるも のと区別のつかない狭心症とともに存在する。極端に重度の貧血や一酸化炭素ヘ モグロビンの存在におけるような、血液の酸素運搬能の低下は心筋虚血の原因と しては稀である。それほど多くはないが、虚血の２以上の原因も同時に存在する ことができ、例えば、左心室肥厚による酸素要求の増加と、冠状動脈のアテロー ム性動脈硬化にとって二次的な酸素供給の低下が共存できるだろう。 虚血性アテローム性動脈硬化の治療に対する主要な外科的アプローチは、バイ パス移植術、動脈内膜切除術および経皮経管冠状動脈形成術（PCTA）である。こ れら外科的アプローチ後の再狭窄（閉塞が再び発生して、しばしば一層ひどくな る）による失敗率は驚くほど高い（30〜50％）。再狭窄の多くはさらなる炎症、 平滑筋の蓄積および血栓によるものと思われる。 ブタの動脈再狭窄を遺伝子治療により治療するために、改良されたバルーン血 管形成術が採用された（Ohnoら，1994，Science 265:781-784）。特殊なカテー テルを使って、動脈閉塞部位の細胞にチミジンキナーゼ（ｔｋ）をコードする遺 伝子を担持する組換えアデノウイルスが導入された。続いて、ブタをガンシクロ ビルで治療した。ガンシクロビルはＤＮＡに組み込まれたとき細胞を殺す毒性形 態にｔｋにより変換されるヌクレオシド類似体である。治療した動物は動脈壁の 厚さが50〜90％縮小し、いかなる局所または全身毒性も観察されなかった。 アテローム性動脈硬化および虚血における過度の炎症−繊維性増殖応答の推定 される役割のために、多くの研究者らは、動脈損傷の概念において、炎症、細胞 漸増(cell recruitment)および増殖に関与するいくつかの因子の発現を研究して きた。こうした因子としては、増殖因子、サイトカインおよび他の化学物質（細 胞漸増および移動、細胞増殖、脂質およびタンパク質の合成の制御に関与する脂 質類を含む）が挙げられる。 例えば、PDGF（血小板由来増殖因子）またはその受容体の発現が、動脈損傷の 修復中のラットで(MaJeskyら，1990，J．Cell Blol．111:2149);酸化型LDLで処 置したヒト単球由来マクロファージの接着性培養物で(Maldenら， 1991，J．Biol．Chem．266:13901);および流体ずれ応力を受けたウシ大動脈内皮 細胞で（Resnickら，1993，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:4591-4595）研究さ れた。IGF-I（インスリン様増殖因子−Ｉ）の発現はラット大動脈のバルーン脱 内皮化（deendothelialization）後に研究された（Cercekら，1990，Circulatio n Research 66:1755-1760）。 その他の研究は、単球の接着を媒介する活性化内皮細胞の表面上の接着分子の 発現に集中していた。これらの接着分子としては、細胞内接着分子−１、ICAM-1 （Simmonsら，1988，Nature，331:624-627）、ELAM（Bevilacquaら，1989，Scie nce 243:1160-1165;Bevilacquaら，1991，Cell 67:233）、および血管細胞接着 分子、VCAM-1（Osbornら，1989，Cell 59:1203-1211）があり、これらの表面分 子はすべてIL-1の存在下で転写的に誘導される。組織学的研究は、ICAM-1、ELAM およびVCAM-1がin vivoで病変部位の内皮細胞上に発現されることを明らかにし た(Cybulskyら，1991，Science 251:788-791;1991，Arterioscler．Thromb．11: 1397a;Postonら，1992，Am．J．Pathol．140:665-673)。VCAM-1とICAM-1は、培 養下のウサギ動脈内皮ばかりでなく培養下のヒト回腸動脈内皮細胞において、リ ゾホスファチジルコリン（アテローム発生リポタンパク質の主要なリン脂質成分 ）により誘導されることが示された（Kumeら，1992，J．Clin．Invest．90:1138 -1144）。VCAM-1、ICAM-1およびクラスII主要組織適合性抗原は、ウサギ大動脈 の損傷に応答して誘導されることが報告された(Tanakaら，1993，Circulation 8 8:1788-1803)。 サイトメガロウイルス（CMV）は一般にアテローム性動脈硬化と同様に再狭窄 にも関与していることが示された（Speirら，1994，Science 265:391-394）。CM Vタンパク質IE84は、p53（その活性形で腫瘍を抑制することが知られている）と 結合してそれを不活性化することにより、平滑筋細胞を再狭窄部位で明らかに増 殖しやすくすることが観察された。 前述の研究は、アテローム性動脈硬化斑を形成させる過度の炎症−繊維性増殖 応答に関与すると予想された特定の遺伝子産物の役割を規定することにねらいを 定めていた。しかしながら、このようなアプローチでは病気の過程で関係のある 一そろいの遺伝子産物を同定することはできず、ましてや、さまざまな心臓血管 病の診断および治療の標的として機能しうるものを同定することなど及びもつか ない。 ３．発明の概要 本発明は、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧症、再狭窄、動脈 の炎症を含むがこれらに限らない、心臓血管病の治療および診断のための方法並 びに組成物に関する。詳細には、正常な状態または非心臓血管病の状態での遺伝 子発現に対して、心臓血管病の状態では示差的に発現される遺伝子が同定され、 記載される。 本明細書中で用いる「示差発現」(differential expression)とは、遺伝子の 時間的および／または組織発現パターンの定量的および定性的差異を意味する。 示差発現される遺伝子は「フィンガープリント遺伝子」および／または「ターゲ ット遺伝子」でありうる。本明細書中で用いる「フィンガープリント遺伝子」と は、その発現パターンが心臓血管病の予後または診断評価の一部として利用され 得るか、または心臓血管病治療用化合物の同定方法に使用し得る示差発現遺伝子 のことである。本明細書中で用いる「ターゲット遺伝子」とは、ターゲット遺伝 子の発現レベルの調節またはターゲット遺伝子産物の活性の調節が心臓血管病の 症状を改善するように働くような、心臓血管病に関与する示差発現遺伝子のこと である。ターゲット遺伝子の発現またはターゲット遺伝子産物の活性を調節する 化合物は、心臓血管病の治療に使用することができる。 さらに、「パスウェイ遺伝子」(pathway gene)は、その遺伝子の産物が心臓血 管病に係わりのある他の遺伝子の産物と相互作用する能力により定義される。パ スウェイ遺伝子はまた、ターゲット遺伝子および／またはフィンガープリント遺 伝子の特徴を示すこともできる。本明細書中に記載する遺伝子は心臓血管病に関 して示差的に発現され、そして／また、それらの産物が心臓血管病にとって重要 な遺伝子産物と相互作用しうるが、別の心臓血管プロセスにとって重要なメカニ ズムにそれらの遺伝子が関与していてもよい。 本発明は、このようなフィンガープリント、ターゲットおよびパスウェイ遺伝 子の産物、並びにこのような遺伝子産物に対する抗体を包含する。さらに、この ような遺伝子産物が寄与しうる心臓血管病の細胞および動物を土台としたモデル の遺伝子工学的作製および使用も記載される。 本発明は、心臓血管病の症状の予後判定および診断評価法、このような疾病に 対する素因をもつ被験者の同定法を包含する。さらに、本発明は、心臓血管病の 治療の臨床試験に関係する薬物の効力を評価し、かつ患者の疾病の経過をモニタ ーする方法を提供する。 本発明はまた、心臓血管病に関係のある遺伝子の発現または遺伝子産物の活性 を調節する化合物の同定法、並びに心臓血管病の症状または傾向を示す個体にこ の種の化合物を投与することを含んでなる心臓血管病の治療法を提供する。 本発明は、一部には、感度のよい高処理量の遺伝子発現アッセイと結びついた in vivoおよびin vitro心臓血管病パラダイムを巻き込んだ体系的な検索戦略に 基づいている。疾病の過程で何らかの役割を果たすと推定された所与の遺伝子産 物の発現を単に評価するだけのアプローチとは対照的に、ここで用いる検索戦略 およびアッセイは、既知であろうと新規であろうと、疾病状態で発現または抑制 されるあらゆる遺伝子の同定を可能にし、同時に疾病の進行中のそれらの時間的 調節および機能の評価を可能にする。この包括的なアプローチおよび評価は、新 規な遺伝子と遺伝子産物の発見のみならず、その疾病の病理学において主要な役 割を果たす新規な経路（パスウェイ）において関与する（新規であろうと既知で あろうと）一そろいの遺伝子および遺伝子産物の同定を可能にする。かくして、 本発明は診断、モニター、合理的薬物スクリーニングおよびデザイン、および／ または他の治療的介入に有用な標的を規定することを可能にする。 ここに記載する実施例では５つの新規なヒト遺伝子が同定され、これらの遺伝 子は異なる心臓血管病の状態で示差発現されることが実証される。これらの遺伝 子の同定並びに特定の疾病状態でのそれらの発現の特性づけは、これらの遺伝子 の心臓血管病における新たな役割を認識させる。 具体的には、fchd531、fchd540およびfchd545が、ずれ応力を受けた内皮細胞 においてそれぞれ示差的に調節される新規遺伝子である。ずれ応力によって、fc hd531およびfchd545は、それぞれダウンレギュレートされ、一方、fchd540はア ップレギュレートされる。fchd602およびfchd605は、酸化型LDLで処理さ れた単球においてそれぞれアップレギュレートされる新規遺伝子である。したが って、fchd531、fchd540、fchd545、fchd602およびfchd605の発現パターンに関 する本発明の発見に基づいて、診断、臨床試験におけるモニタリング、治療上有 効な化合物のスクリーニング、および心臓血管病の治療のための方法が提供され る。 遺伝子fchd540、fchd602、およびfchd605の特徴的なアップレギュレーション を用いて、心臓血管病治療戦略を計画することができる。疾病状態において原因 となる作用を有するアップレギュレートされたそれらの遺伝子については、特に 内皮細胞または単球におけるそれらの発現を低下または排除するように治療方法 を計画することができる。また、治療方法には、これらの遺伝子のタンパク質産 物の活性を阻害することが含まれる。防御効果を有するアップレギュレートされ たそれらの遺伝子については、かかる遺伝子の産物の活性を高めるように治療方 法を計画することができる。 いずれの場合にも、これらの遺伝子の正常な発現を越える発現を検出すること が心臓血管病の診断を与える。さらに、臨床試験で化合物の効力を調べるとき、 これらの遺伝子の発現レベルの低下は疾病状態から正常状態に戻ることに相当し 、それゆえ用いた化合物の陽性効果を示す。このように診断され、臨床試験でモ ニターされ、治療される心臓血管病には、制限するものではないが、アテローム 性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧、再狭窄および動脈の炎症がある。 fchd531およびfchd545の特徴的なダウンレギュレーションも、心臓血管病治療 戦略の計画に用いることもがきる。そのダウンレギュレーションが病原性作用を 有するそれらの遺伝子については、特に内皮細胞中でそれらの発現が回復または 増大するように治療方法を計画することができる。また、治療方法には、これら の遺伝子のタンパク質産物の活性を増大させることが含まれる。そのダウンレギ ュレーションが防御効果を有するそれらの遺伝子については、かかる遺伝子の産 物の量または活性を低下させるように治療方法を設計することができる。 いずれの場合にも、これらの遺伝子の正常な発現を下回る発現を検出すること が心臓血管病の診断を与える。さらに、臨床試験で化合物の効力を調べるとき、 これらの遺伝子の発現レベルの増加は疾病状態から正常状態に戻ることに相当し 、 それゆえ用いた化合物の陽性効果を示す。このように診断され、臨床試験でモニ ターされ、治療される心臓血管病には、制限するものではないが、アテローム性 動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧、再狭窄および動脈の炎症がある。 本発明は、心臓血管病の治療用の化合物およびその他の物質を、本発明で開示 されたターゲット遺伝子の発現またはターゲット遺伝子のタンパク質産物の活性 を調節するそれらの能力をアッセイすることによりスクリーニングする方法を包 含する。そのようなスクリーニング方法としては、限定するものではないが、タ ーゲット遺伝子タンパク質産物と相互作用する（例えば、結合する）化合物およ びその他の物質を同定するためのアッセイが挙げられる。 さらに、本発明は、ターゲット遺伝子産物の全活性を調節する化合物およびそ の他の物質を投与することにより心臓血管病を治療する方法を包含する。化合物 およびその他の物質は、ターゲット遺伝子発現またはターゲットタンパク質活性 のレベルのいずれかにおけるかかる調節に影響を及ぼすことができる。 本発明は、一つには、rchd534タンパク質同士の、およびrchd534タンパク質と fchd540タンパク質との新規タンパク質−タンパク質相互作用、ならびにrchd534 タンパク質またはfchd540タンパク質とTGF-βシグナル伝達経路のその他のタン パク質メンバーとの相互作用の同定に基づくものである。rchd534遺伝子は、本 出願人の共同係属中の国際公開公報第WO 96/24604号に記載されており、これは 、参照により本明細書に含まれるものである。それらのかかる相互作用を阻害す る能力をアッセイすることによって、心臓血管病の治療用の化合物およびその他 の物質を同定するためのスクリーニング方法が提供される。さらに、rchd534も しくはfchd540遺伝子の発現またはそれらの遺伝子産物の活性を調節することに よりTGF-β応答を増大させる化合物およびその他の物質を同定する方法が提供さ れる。さらに、心臓血管病を、これらのタンパク質相互作用を阻害する化合物お よびその他の物質を投与することによって治療する方法が提供される。 本発明は、一つには、そのタンパク質産物がTGF-β応答を阻害する２つの遺伝 子rchd534およびrchd540の内皮細胞特異的発現パターンの同定に基づくものであ る。したがって、rchd534およびrchd540遺伝子は、限定するものではないが、癌 血管形成、炎症、および線維症を含む、内皮細胞が関与する種々の炎症性 障害および線維増殖性障害における介入の標的であり得る。 細胞外ドメインを含む、膜に結合したターゲット遺伝子産物は、治療法、診断 法および臨床モニター法にとって特に有用な標的でありうる。例えば、fchd602 遺伝子は膜貫通タンパク質をコードし、この膜貫通タンパク質は多数の膜貫通ド メインを含むため、細胞表面で他の化合物と容易に接触することができる。した がって、fchd602遺伝子産物と結合する天然リガンド、天然リガンドの誘導体お よび抗体は、その活性を抑制するために、あるいはその遺伝子を発現する細胞を 特異的に破壊するために使用することができる。さらに、fchd602遺伝子産物の 細胞外ドメインは、fchd602遺伝子産物と結合する化合物を同定するための特別 に効率のよいスクリーニング系の設計を可能とするための標的を提供する。 また、このようなアッセイ系は、fchd602遺伝子産物とfchd602遺伝子産物に結 合するリガンドとの相互作用のアンタゴニストをスクリーニングして同定するに も使用され得る。例えば、これらの化合物はfchd602遺伝子産物の内因性（すな わち、天然の）リガンドと結合することでおとり(decoy)として作用することが できる。こうして、リガンドと結合したfchd602遺伝子膜貫通タンパク質の量の 低下は、疾病状態にある単球のような細胞の活性を調節するだろう。fchd602遺 伝子産物の可溶性タンパク質またはペプチド（例えば、１以上の細胞外ドメイン を含むペプチド）、またはfchd602遺伝子産物の一部および／またはその類似体 （例えば、Ｉｇ−テイルド融合タンパク質のような可溶性融合タンパク質を含む ）は、この目的のために特に有用でありうる。 同様に、fchd602産物の１以上の細胞外ドメインに特異的な抗体は、診断試験 または臨床試験モニターにおけるこのターゲット遺伝子産物の簡便な検出を可能 にする。したがって、内皮細胞をこのような標識抗体でin vivoまたはin vitro のいずれかで処理することで、内皮細胞の疾病状態を判定することができる。fc hd602遺伝子産物は疾病状態の単球においてアップレギュレートされるので、そ の検出は心臓血管病と正の相関関係にある。 上記のfchd602遺伝子産物を用いる治療法、診断法および臨床試験モニター法 はまた、fchd545（多くの膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインをコードする） を含むがこれらに限らない膜貫通遺伝子産物をコードする他のターゲット遺 伝子にも応用できる。 以下の第６および７節に示した実施例では、心臓血管病のターゲット遺伝子を 同定するための本発明の心臓血管病パラダイムの使用を示す。 以下の第８節に示した実施例では、診断法におけるフィンガープリント遺伝子 の使用、並びに基礎研究および臨床試験で候補薬剤の効力を試験するための代理 マーカーとしてのフィンガープリント遺伝子の使用を示す。 以下の第９節に示した実施例では、疾病状態の心臓血管組織のイメージングに おけるフィンガープリント遺伝子、特にfchd545、の使用を示す。 下記の第11節の実施例は、２つの遺伝子産物、rchd534タンパク質およびfchd5 40タンパク質の相互作用、さらに心臓血管病およびTGF-βシグナリング経路にお けるそれらの役割の特性付けを示すものである。 ４．図面の説明 図１は、fchd531遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ酸配列 である。 図２は、fchd540遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ酸配列 である。 図３は、fchd545遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ酸配列 である。 図４は、fchd602遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ酸配列 である。 図５は、fchd605遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ酸配列 である。 図６は、rchd534遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ酸配列 である。 ５．発明の詳細な説明 アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流(reperfusion)、高血圧、再狭窄、お よび動脈炎症を含むが、これらに限定されない、心臓血管病の診断および治療 のための方法および組成物が記載される。本発明は、症状に生理的に関連するパ ラダイムにおいて示差的に発現される全ての遺伝子の発現および役割の評価に一 部基いている。これは疾病経路の特定並びに診断上および治療上の両方に有益で ある該経路における標的の同定を可能にする。 正常な状態または非心臓血管病の状態におけるそれらの発現に対して、心臓血 管病の状態で示差的に発現される“ターゲット遺伝子”および／または“フィン ガープリント遺伝子”と称される遺伝子は、5.4節に記載される。更に、遺伝子 産物が心臓血管病に関係する遺伝子産物と相互作用する能力を示す“パスウェイ 遺伝子”と称される遺伝子がまた5.4節に記載される。パスウェイ遺伝子は更に フィンガープリントおよび／またはターゲット遺伝子特性を更に有していてもよ い。このようなフィンガープリント遺伝子、ターゲット遺伝子、およびパスウェ イ遺伝子の同定方法が5.1節、5.2節、および5.3節に記載される。 更に、このようなフィンガープリント遺伝子、ターゲット遺伝子、およびパス ウェイ遺伝子の遺伝子産物が5.4.2節に記載され、このような遺伝子産物の抗体 が5.4.3節に記載され、同様に、このような遺伝子産物が寄与し得る心臓血管病 の細胞をベースとするモデルおよび動物をベースとするモデルが5.4.4節に記載 される。 心臓血管病に関係する遺伝子の発現または遺伝子産物の活性を調節する化合物 の同定方法が5.5節に記載される。臨床試験中の化合物の効力のモニタリング方 法が5.5.4節に記載される。更に、心臓血管病の治療方法が5.6節に記載される。 また、この疾病の疾病素質を示す被験者の同定を含む、心臓血管病の予後判定 方法および診断評価方法、および心臓血管病の状態のイメージングが5.8節に説 明される。 5.1.示差的に発現される遺伝子の同定 この節は、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧、再狭窄、および 動脈炎症を含むが、これらに限定されない、心臓血管病に関係する遺伝子の同定 方法を記載する。このような遺伝子は、正常な状態、または非心臓血管病状態に おけるそれらの発現に対し心臓血管病状態で示差的に発現される遺伝子に相当し 得る。このような示差的に発現される遺伝子は「ターゲット」遺伝子および／ま たは“フィンガープリント”遺伝子に相当し得る。このような示差的に発現され る遺伝子の同定方法がこの節で以下に記載される。このような示差的に発現され る遺伝子の更なる特性決定方法、およびターゲット遺伝子および／またはフィン ガープリント遺伝子としてのそれらの同定方法が5.3節に示される。 本明細書に使用される“示差的発現”は、遺伝子の時間的および／または組織 発現パターンの定量的差異並びに定性的差異の両方を表す。こうして、示差的に 発現される遺伝子は正常な状態vs心臓血管病状態（例えば、酸化LDLで処理vs未 処理）で、または対照状態vs実験状態下で活性化または完全に不活化されたその 発現を有し得る。このような定性的に調節された遺伝子は対照または心臓血管病 被験者のいずれかで検出し得るが、両方では検出し得ない所定の組織内または細 胞型内の発現パターンを示すであろう。また、このような定性的に調節された遺 伝子は、対照または実験被験者のいずれかで検出し得るが、両方では検出し得な い所定の組織内または細胞型内の発現パターンを示すであろう。本明細書に使用 される“検出し得る”は、示差的ディスプレイ、逆転写酵素-(RT-)PCRおよび／ またはノーザン分析（これらは当業者に周知である）の通常の技術により検出し 得るＲＮＡ発現パターンを表す。 また、示差的に発現される遺伝子は、正常な状態vs心臓血管病状態で、または 対照状態vs実験状態下で、調節された、すなわち、定量的に増加または減少され たその発現を有し得る。発現が正常な状態vs心臓血管病状態または対照状態vs実 験状態で異なる程度は、通常の特性決定技術、例えば、以下に記載される示差的 ディスプレイ技術により視党化されるのに充分に大きいことのみを必要とする。 発現の差異が視覚化し得るその他のこのような通常の特性決定技術として、定量 的RT-PCRおよびノーザン分析が挙げられるが、これらに限定されない。 示差的に発現される遺伝子はターゲット遺伝子および／またはフィンガープリ ント遺伝子として更に記載し得る。本明細書に使用される“フィンガープリント 遺伝子”は、その発現パターンが予後判定または診断の心臓血管病評価の一部と して利用されてもよく、または心臓血管病の治療に有益な化合物の同定方法に使 用されてもよい示差的に発現される遺伝子を表す。また、フィンガープリント遺 伝子はターゲット遺伝子の特徴を有していてもよい。 本明細書に使用される“ターゲット遺伝子”は、ターゲット遺伝子発現のレベ ルまたはターゲット遺伝子産物活性のレベルの調節が心臓血管病の症状を改善す るように作用し得る様式で心臓血管病に関与する示差的に発現される遺伝子を表 す。また、ターゲット遺伝子はフィンガープリント遺伝子の特徴を有していても よい。 種々の方法が心臓血管病に関係する遺伝子の同定に利用し得る。これらの方法 として、5.1.1節に記載される実験パラダイムが挙げられるが、これに限定され ない。パラダイムからの物質が5.1.2節に記載される示差的に発現される遺伝子 配列の存在について特性決定され得る。 5.1.1.示差的に発現される遺伝子の同定に関するパラダイム 心臓血管病に関係する遺伝子を同定するための一つの戦略は、疾病状態vs非疾 病状態に関連する状態のもとに示差的に発現される遺伝子を検出することである 。下記の分節は、このような示差的に発現される遺伝子を検出するのに使用し得 る、パラダイムと称される、幾つかの実験系を記載する。一般に、パラダイムは 、このような疾病に関連する治療を欠いている少なくとも一つの実験対照状態に 加えて、被験者またはサンプルが心臓血管病と関連する方法で治療される、少な くとも一つの実験状態を含む。示差的に発現される遺伝子は、実験状態と対照状 態の間で遺伝子発現のパターンを比較することにより、本明細書に以下に記載さ れるように、検出される。 特定の遺伝子が一つのこのようなパラダイムの使用により一旦同定されると、 その発現パターンが異なるパラダイムでその発現を研究することにより更に特性 決定され得る。遺伝子は、例えば、所定のパラダイムで一つの方法（例えば、ア ップレギュレーション）で調節されてもよいが、或る別のパラダイムで異なって （例えば、ダウンレギュレーション）調節されてもよい。更に、異なる遺伝子が 一つのパラダイムで同様の発現パターンを有していてもよいが、それらのそれぞ れの発現パターンが異なるパラダイムのもとで互いに異なっていてもよい。複数 のパラダイムのこのような使用は心臓血管病における特定の遺伝子の役割および 相対的重要性を区別するのに有益であるかもしれない。 5.1.1.1.泡沫細胞パラダイム−１ 例えば、アテローム性動脈硬化症に関係する示差的に発現される遺伝子の同定 に利用し得るパラダイムの中に、泡沫細胞形成に関係し得る遺伝子を分析するよ うに設計されたパラダイムがある。このようなパラダイムはこの細胞型の分化、 または酸化LDLのそれらの摂取に関係する遺伝子を同定するのに利用し得る。 このようなパラダイムの一実施態様が、以下パラダイムＡと称され、次のよう にして行われる。最初に、ヒト血液を採取し、末梢単球を当分野でルーチンに実 施される方法により単離する。次にこれらのヒト単球は直ちに使用してもよく、 または５〜９日にわたって、当分野でルーチンに実施される方法を使用して、in vitroで培養してもよく、この場合、それらはスカベンジャー受容体のアップレ ギュレーションの如きマクロファージ様特性を発現する。次にこれらの細胞を泡 沫細胞形成に関係すると考えられる薬剤で種々の時間の長さにわたって処理する 。これらの薬剤として、酸化LDL、アセチル化LDL、リゾホスファチジルコリン、 およびホモシステインが挙げられるが、これらに限定されない。処理されないか 、または天然LDLで処理された対照単球を平行して増殖させる。試験薬剤の添加 後の或る時点で、細胞を回収し、以下の5.1.2.節に詳しく記載されるようにして 示差的発現について分析する。以下の６節に示される実施例は、処理された細胞 vs対照細胞中で示差的に発現される遺伝子を同定するためのこのような泡沫細胞 パラダイムの使用を詳しく実証する。 5.1.1.2.泡沫細胞パラダイム−２ アテローム性動脈硬化症と関連する示差的に発現される遺伝子を検出するため の単球を必要とする別のパラダイムは移行(transmigration)現象の刺激を伴う。 単球が動脈損傷に遭遇する時、それらは血管内皮層に付着し、この層を横切って 移行し、内皮と動脈を取り囲む平滑筋細胞の層の間に位置を定める。この現象は 、例えば、ヒト臍帯から単離された内皮細胞の層を培養することによりin vitro で模擬し得る。内皮単層が一旦形成すると、末梢血から採取された単球をLDL の存在下および不在下で内皮の上で培養する。数時間後に、単球は内皮を通って 移行し、LDLに露出された３〜５日後に泡沫細胞に発達する。この系でば、in vi voのように、内皮細胞がLDLの酸化を行い、次にこれが単球により吸収される。 以下の5.1.2.節に記載されるように、次に遺伝子発現のパターンがこれらの泡沫 細胞と未処理単球の間で比較される。 5.1.1.3.泡沫細胞パラダイム−３ 更に別の系は第三の細胞型、すなわち、アテローム発生に重要な役割を果たす 平滑筋細胞を含む(Navabら，1988，J.Clin.Invest.，82:1853)。この系では、ヒ ト大動脈平滑筋細胞の多層を天然コラーゲンのゲル層で覆われたミクロポアーフ ィルター上で増殖させ、ヒト大動脈内皮細胞の単層をコラーゲン層の上で増殖さ せる。走化性因子rFMLPの存在下でのヒト単球へのこの共培養物の露出は、内皮 細胞への単球付着、続いて内皮単層を横切って内皮下腔のコラーゲン層への移行 をもたらした。また、この型の培養物はLDLで処理すると泡沫細胞を生じること ができる。次に泡沫細胞を回収して、遺伝子発現のそれらのパターンを5.1.2.節 に以下に説明されるように未処理細胞のパターンと比較する。 5.1.1.4.in vivo 単球パラダイム 以下パラダイムＢと称される、単球の研究のためのこのようなパラダイムの別 の実施態様は、脂質消費の食事管理によるヒト被験者の示差的治療を伴う。この ようなヒト被験者を３週間にわたって低脂肪／低コレステロール食に保ち、その 時点で血液を採取し、単球を当分野でルーチンに実施される方法に従って単離し 、ＲＮＡを以下の5.1.2.節に記載されるようにして精製する。これらの同一患者 を続いて高脂肪／高コレステロール食に切り換え、単球ＲＮＡを再度精製する。 また、患者に高詣肪／低コレステロールを含む第三の組み合わせ食を支給しても よく、単球ＲＮＡをもう一度精製してもよい。患者が食事を受ける順序を変えて もよい。次いで２種の食事、または３種全ての食事で管理された患者に由来する ＲＮＡを比較し、5.1.2.節に以下に説明するように示差的遺伝子発現について分 析することができる。 5.1.1.5.内皮細胞−IL-1パラダイム 単球中の示差的遺伝子発現の検出に加えて、内皮細胞に焦点を合わせたパラダ イムが心臓血管病に関係する遺伝子を検出するのに使用し得る。以下パラダイム Ｃと称される、一つのこのようなパラダイムでは、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVE C）をin vitroで増殖させる。アテローム性動脈硬化症状に関係する生理条件を 模擬するために、炎症反応に関係することが知られている因子であるヒトIL-1β で実験培養物を処理する。また、実験HUVEC培養物はアテローム発生性リポタン パク質の主要リン脂質成分であるリゾホスファチジルコリンまたは酸化ヒトLDL で処理してもよい。対照培養物はこれらの化合物の不在下で増殖させる。 露出処理の或る期間後に、実験細胞および対照細胞を回収し、以下の5.1.2.節 に記載されるように示差的遺伝子発現について分析する。 5.1.1.6.内皮細胞−ずれ応力パラダイム 以下パラダイムＤと称される、内皮細胞を必要とする別のパラダイムでは、培 養物を流体ずれ応力に露出するが、流体ずれ応力は異常な循環流の領域における アテローム性動脈硬化病変の広がりの原因であると考えられる。また、異常な血 流は虚血／再灌流の有害な作用においてある役割を果たし、虚血はその障害が克 服される時に、不十分な血液供給を受けている器管が過剰に多量の血液で急激に 再灌流される。 培養HUVEC単層は、液体培地を含む特殊装置(Nagelら，1994，J.Clin.Invest． 94:885-891)中で培養物を回転させることにより層状ずれ応力に露出される。同 一培地中で増殖させた静的培養物が対照として利用できる。ずれ応力への露出の 或る期間後に、実験細胞および対照細胞を回収し、以下の5.1.2節に記載される ように示差的遺伝子発現について分析する。以下の９節に示された実施例は、露 出細胞vs対照細胞中で示差的に発現される配列を同定するためのこのようなずれ 応力を受けた内皮細胞パラダイムの使用を実証する。 5.1.1.1節〜5.1.1.6節に上記されたパラダイムを含むが、これらに限定さ れない、心臓血管病に関係する遺伝子を同定するために設計された全てのこのよ うなパラダイムでは、その疾病症状に対する改善作用を有することが知られてい る薬剤の如き化合物が実験系に含まれてもよい。このような化合物は既知治療薬 、並びに有害な副作用のために治療薬として有用ではない化合物を含んでもよい 。5.1.1.1節〜5.1.1.6節に記載されたパラダイムに説明されるように培養される 試験細胞は、例えば、これらの化合物の一つに露出され、以下の5.1.2節に記載 される方法に従って未処理細胞に対する示差的遺伝子発現について分析されても よい。原理的に、特定のパラダイムに従って、その疾病に関係するあらゆる細胞 型をこれらの化合物により疾病プロセスのあらゆる段階で治療することができる 。 また、試験細胞は、その疾病に関係しないかもしれない遺伝子発現に関する全 般的作用をスクリーニングするために、その化合物でまた治療される無関係の細 胞（例えば、繊維芽細胞）と比較されてもよい。このような全般的作用は、その 化合物による治療後に試験細胞および無関係の細胞に共通である遺伝子発現の変 化により顕在化し得る。 これらの方法により、これらの化合物が作用する遺伝子および遺伝子産物が同 定され、心臓血管病治療用の新規な治療化合物を同定するために以下に記載され るアッセイで使用される。 5.1.2.パラダイム物質の分析 示差的に発現される遺伝子を同定するために、この節に先に記載されたような パラダイムに利用された被験者の一つ以上の組織から全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを 単離する。ＲＮＡサンプルは実験被験者の組織および対照被験者の相当する組織 から得られる。ｍＲＮＡの単離に対して選択しないＲＮＡ単離技術はどれもこの ようなＲＮＡサンプルの精製に利用し得る。例えば、Sambrookら，1989，Mol-ec ular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y．、およ びAusubel，F.M．ら編集，1987-1993，Current Protocols in Molecular Bio-lo gy，John Wiley&Sons，Inc．New York(これらの両方が参考として本明細書にそ のまま含まれる)を参照のこと。更に、多数の組織サンプルが、 当業者に公知の技術、例えば、Chomczynski，P．(1989,米国特許第4,843,155号) (これが参考として本明細書にそのまま含まれる)の単一工程ＲＮＡ単離方法を使 用して容易に処理し得る。 示差的に発現される遺伝子により産生されたＲＮＡに相当する回収されたＲＮ Ａサンプル中の転写産物は、当業者に公知である種々の方法を利用することによ り同定し得る。例えば、示差的スクリーニング(Tedder，T.F．ら，1988，Proc.N atl.Acad.Sci．USA85:208-212)、サブトラクティブハイブリダイゼーション(Hed rick，S.M．ら，1984，Nature 308:149-153:Lee,S.W．ら，1984，Proc.Natl.Aca d.Sci．USA88:2825)、および、好ましくは、示差的ディスプレイ(Liang,P．、お よびPardee,A.B.，1993,米国特許第5,262,311号(これが参考として本明細書にそ のまま含まれる))が、示差的に発現される遺伝子に由来する核酸配列を同定する のに利用し得る。 示差的スクリーニングは、ライブラリーの一つのコピーが一つの細胞型のｍＲ ＮＡ集団に対応する全細胞ｃＤＮＡプローブでスクリーニングされ、一方、ｃＤ ＮＡライブラリーの重複コピーが第二細胞型のｍＲＮＡ集団に対応する全ｃＤＮ Ａプローブでスクリーニングされる、ｃＤＮＡライブラリーの重複スクリーニン グを伴う。例えば、一つのｃＤＮＡプローブが対照被験者に由来する細胞型の全 細胞ｃＤＮＡプローブに対応してもよく、一方、第二ｃＤＮＡプローブが実験被 験者に由来する同一細胞型の全細胞ｃＤＮＡプローブに対応してもよい。一つの プローブにハイブリダイズするが、他のプローブにハイブリダイズしないクロー ンは、対照被験者vs実験被験者の関心のある細胞型中で示差的に発現される遺伝 子に由来するクローンである可能性がある。 サブトラクティブハイブリダイゼーション技術は２種の異なる起源、例えば、 対照組織および実験組織から採取されたｍＲＮＡの単離、ｍＲＮＡまたは単離さ れたｍＲＮＡから逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのハイブリダイゼーション、およ び全てのハイブリダイズされ、それ故、二本鎖となった配列の除去を一般に伴う 。残りのハイブリダイズされなかった、一本鎖のｃＤＮＡは、２種のｍＲＮＡ起 源中で示差的に発現される遺伝子に由来するクローンである可能性がある。次に このような一本鎖ｃＤＮＡが示差的に発現される遺伝子から誘導されるクローン を 含むライブラリーの構築のために出発物質として使用される。 示差的ディスプレイ技術は、示差的に発現される遺伝子に由来する配列の同定 を可能にする公知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR;Mullis，K.B.，1987,米国特許 第4,683,202号に示された実験実施態様）を利用する方法を記載している。最初 に、単離されたＲＮＡが、当業者に公知である通常の技術を利用して、一本鎖ｃ ＤＮＡに逆転写される。逆転写酵素反応のプライマーとして、好ましくは以下に 記載されるオリゴヌクレオチドのリバースプライマー型の、オリゴdTを含むプラ イマーが挙げられるが、これに限定されない。次に、この技術は、所定の細胞内 に存在するＲＮＡ転写産物のランダムサブセットを提示するクローンの増幅を可 能にする、下記のPCRプライマーの対を使用する。異なる対のプライマーの利用 は、細胞中に存在するｍＲＮＡ転写産物のそれぞれが増幅されることを可能にす る。このような増幅された転写産物の中で、示差的に発現される遺伝子から生じ た転写産物が同定され得る。 プライマー対のリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、その5'末端に、好 ましくは11ヌクレオチドの長さの、ヌクレオチドのオリゴdTストレッチを含むこ とができ、これがｍＲＮＡのpoly(A)テイルまたはｍＲＮＡpoly(A)テイルから逆 転写されたｃＤＮＡの相補体にハイブリダイズする。第二に、リバースプライマ ーの特異性を増大するために、プライマーはその3'末端に一つ以上、好ましくは 二つの付加的なヌクレオチドを含むことができる。統計上、対象のサンプル中に 存在するｍＲＮＡ由来配列の一つのサブセットのみがこのようなプライマーにハ イブリダイズするので、付加的なヌクレオチドはプライマーに該サンプル中に存 在するｍＲＮＡ由来配列の一つのサブセットのみを増幅させる。これは、それが 増幅された配列に相当するバンドのそれぞれのより一層状正確かつ完全な視党化 および特性決定を可能にする点で好ましい。 フォワードプライマーは、対象の組織に由来するｃＤＮＡ配列にハイブリダイ ズする能力を有することが統計上期待されたヌクレオチド配列を含むことができ る。そのヌクレオチド配列は任意の配列であってもよく、フォワードオリゴヌク レオチドプライマーの長さは約９〜約13のヌクレオチドの範囲であってもよく、 約10のヌクレオチドが好ましい。任意のプライマー配列は、生成される増 幅された部分ｃＤＮＡの長さを可変にし、こうして通常の変性配列決定用ゲル電 気泳動を使用することにより異なるクローンを分離させる。 増幅産物の収率および特異性を最適化し、更に、通常のゲル電気泳動技術を利 用して分割され得る長さの増幅産物を生じるようなPCR反応条件が選ばれるべき である。このような反応条件は当業者に公知であり、重要な反応パラメーターと して、例えば、先に説明されたオリゴヌクレオチドプライマーの長さおよびヌク レオチド配列、並びにアニーリングおよび伸長工程の温度および反応時間が挙げ られる。 ２種の異なる細胞型のｍＲＮＡの逆転写および増幅から得られるクローンのパ ターンが配列決定用ゲル電気泳動により表示され、比較される。２種のバンド形 成パターンの差異が示差的に発現される遺伝子を潜在的に示す。 示差的に発現される可能性がある遺伝子配列がバルク技術、例えば、上記の技 術により一旦同定されたら、このような推定上の示差的に発現される遺伝子の示 差的発現が確証されるべきである。確証は、例えば、ノーザン分析および／また はRT−PCRの如き公知技術により行い得る。 確証後に、示差的に発現される遺伝子が更に特性決定されてもよく、以下の5. 3節に説明されるようにターゲット遺伝子および／またはフィンガープリント遺 伝子として同定され得る。 また、例えば、示差的ディスプレイにより得られた示差的に発現される遺伝子 の増幅配列が、対応する遺伝子の完全長クローンを単離するのに使用されてもよ い。遺伝子の完全長コード部分は、当分野で公知の分子生物学的技術により、過 度の実験をしないで、容易に単離し得る。例えば、単離された示差的に発現され た増幅断片が標識され、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用さ れてもよい。また、標識断片がゲノムライブラリーをスクリーニングするのに使 用されてもよい。 また、PCR技術が完全長ｃＤＮＡ配列を単離するのに利用されてもよい。この 節に上記されたように、示差的ディスプレイにより得られた単離された、増幅さ れた遺伝子断片は遺伝子内の或るランダムな位置に5'末端を有し、また好ましく は遺伝子の転写部分の3'末端に相当する位置に3'末端を有する。増幅断片 からのヌクレオチド配列情報が一旦得られると、遺伝子の残部（すなわち、示差 的ディスプレイを利用する場合には、遺伝子の5'末端）が、例えば、RT-PCRを使 用して得ることができる。 完全長遺伝子配列の同定およびクローニングのためのこのような操作の一実施 態様では、ＲＮＡが適当な組織または細胞起源から通常の操作に従って単離し得 る。次に逆転写反応が、第一鎖合成のプライミングのために、増幅断片に対応す るｍＲＮＡに相補性のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＲＮＡについて 行われてもよい。プライマーはｍＲＮＡに逆行性であるので、伸長はｍＲＮＡの 5'末端に向かって進行するであろう。次に得られるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド が、通常の末端トランスフェラーゼ反応を使用してグアニンで“テイルド(taile d)”されてもよく、そのハイブリッドがRNAase Hで消化されてもよく、次に第二 鎖合成がpoly-Cプライマーで開始されてもよい。２種のプライマーを使用して、 遺伝子の5'部分が、PCRを使用して増幅される。次に得られた配列が単離され、 先に単離された配列で組換えられて、本発明の示差的に発現される遺伝子の完全 長ｃＤＮＡを生成し得る。クローニング戦略および組換えＤＮＡ技術の総説につ いて、例えば、Sambrookら，1989，上記文献、およびAusubelら，1989，上記文 献を参照のこと。 5.2.パスウェイ遺伝子の同定 この節は、心臓血管病に関係する、“パスウェイ遺伝子”と称される、遺伝子 の同定方法を記載する。本明細書に使用される“パスウェイ遺伝子”は、その遺 伝子産物が心臓血管病に関係する遺伝子産物と相互作用する能力を示す遺伝子を 表す。パスウェイ遺伝子は示差的に発現され、それ故、ターゲット遺伝子および ／またはフィンガープリント遺伝子の特性を更に有し得る。 タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに適した方法が、心臓血管病に 関係することが知られている遺伝子産物と遺伝子産物との相互作用を同定するこ とによりパスウェイ遺伝子産物を同定するのに使用し得る。このような既知の遺 伝子産物は細胞タンパク質または細胞外タンパク質であってもよい。このような 既知の遺伝子産物と相互作用する遺伝子産物はパスウェイ遺伝子産物に相当し、 またそれらをコードする遺伝子がパスウェイ遺伝子に相当する。 使用し得る従来の方法の中に、同時免疫沈殿、架橋および勾配カラムまたばク ロマトグラフィーカラムによる同時精製がある。これらのような操作の利用はパ スウェイ遺伝子産物の同定を可能にする。一旦同定されると、パスウェイ遺伝子 産物は、通常の技術と連係して、その対応するパスウェイ遺伝子を同定するのに 使用し得る。例えば、パスウェイ遺伝子産物のアミノ酸配列の少なくとも一部が 、エドマン分解技術（例えば、Creighton，1983，Proteins:Structures and Mol ecular Principles，W.H.Fre-eman&Co.，N.Y.，34-49頁を参照のこと）によるよ うな当業者に公知の技術を使用して確かめられてもよい。得られたアミノ酸配列 は、パスウェイ遺伝子配列のスクリーニングに使用し得るオリゴヌクレオチド混 合物の生成のためのガイドとして使用し得る。行われるスクリーニングは、例え ば、通常のハイブリダイゼーション技術またはPCR技術により達成し得る。オリ ゴヌクレオチド混合物の生成およびスクリーニングに関する技術は公知である（ 例えば、Ausubelら，上記文献、およびPCR Protocols:A Guide to Methods and Applications，1990，Innis，M．ら編集，Academic Press，Inc.，New Yorkを参 照のこと）。 更に、心臓血管病に関係するタンパク質と相互作用するタンパク質をコードす るパスウェイ遺伝子の同時同定をもたらす方法が使用し得る。これらの方法は、 例えば、λgt11ライブラリーの抗体検索の公知技術と同様の方法でこのタンパク 質を使用して、発現ライブラリーを心臓血管病に関係することが知られ、または 示唆される標識タンパク質で検索することを含む。 in vivoでタンパク質相互作用を検出する一つのこのような方法、ツーハイブ リッド系が、限定のためではなく、例示のみのために詳しく記載される。この系 の一つの別型が記載されており(Chienら，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88:9 578-9582)、Clontech(Palo Alto，CA)から市販されている。 簡単に言えば、このような系を利用して、二つのハイブリッドタンパク質をコ ードするプラスミドが構築される。一つは既知タンパク質に融合された転写アク チベータータンパク質のＤＮＡ結合ドメインからなり、他方がｃＤＮＡライブラ リーの一部としてこのプラスミドに組換えられたｃＤＮＡによりコードされる 未知タンパク質に融合されたアクチベータータンパク質の活性化ドメインからな る。プラスミドは、調節領域がアクチベーターの結合部位を含むリポーター遺伝 子（例えば、lacZ）を含む酵母サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces c erevisiae)の株に形質転換される。いずれのハイブリッドタンパク質も単独では リポーター遺伝子、ＤＮＡ結合ドメインハイブリッド（それは活性化機能を提供 しないから）および活性化ドメインハイブリッド（それはアクチベーターの結合 部位に局在化することができないから）の転写を活性化することができない。２ 種のタンパク質の相互作用は機能性アクチベータータンパク質を再構成し、リポ ーター遺伝子の発現をもたらし、これがリポーター遺伝子産物に関するアッセイ により検出される。 ツーハイブリッド系または関連方法が、既知“餌(bait)”遺伝子タンパク質と 相互作用するタンパク質について活性化ドメインライブラリーをスクリーニング するのに使用し得る。全ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列は、活性化ドメインをコ ードするＤＮＡに融合されてもよい。このようなライブラリーおよびＤＮＡ結合 ドメインに融合された餌遺伝子タンパク質のハイブリッドをコードするプラスミ ドが酵母リポーター株に同時形質転換され、得られる形質転換体がリポーター遺 伝子を発現する形質転換体についてスクリーニングし得る。これらのコロニーが 精製され、リポーター遺伝子発現を担うライブラリープラスミドが単離し得る。 次にＤＮＡ配列決定が、ライブラリープラスミドによりコードされたタンパク質 を同定するのに使用し得る。 例えば、限定のためではなく、餌遺伝子は、それがGAL4タンパク質のＤＮＡ結 合ドメインをコードするＤＮＡに翻訳融合されるようにベクターにクローン化し 得る。また、例えば、心臓血管病に関係する遺伝子の単離について、心臓血管病 にある種の役割を果たすことが知られ、または示唆されている既に単離された遺 伝子が餌遺伝子として使用し得る。これらとして、二三名を挙げると、bFGF、IG F-I、VEGF、IL-1、M-CSF、TGF-β、TGF-α、TNF-α、HB-EGF、PDGF、IFN-γ、お よびGM-CSFがあるが、これらに限定されない。 餌遺伝子と相互作用するタンパク質が検出される細胞系のｃＤＮＡライブラリ ーが、当分野でルーチンに実施される方法を使用してつくられる。本明細書に 記載された特別な系によれば、例えば、ｃＤＮＡ断片が、それらがGAL4の活性化 ドメインに翻訳融合されるようにベクターに挿入し得る。このライブラリーが餌 遺伝子-GAL4融合プラスミドとともに、GAL4活性化配列を含むプロモーターによ り誘導されたlacZ遺伝子を含む酵母株に同時形質転換し得る。餌遺伝子と相互作 用する、GAL4活性化ドメインに融合された、ｃＤＮＡコードされたタンパク質が 活性GAL4タンパク質を再構成し、それによりlacZ遺伝子の発現を誘導するであろ う。lacZを発現するコロニーがX-galの存在下でそれらの青色により検出し得る 。次にｃＤＮＡがこれらの株から精製され、当分野でルーチンに実施される技術 を使用して餌遺伝子相互作用タンパク質を生成し、単離するのに使用し得る。 パスウェイ遺伝子が同定され、一旦単離されると、それは、例えば、以下の5. 3節に説明されるように更に特性決定し得る。 酵母タンパク質複合体検出システムの使用についての好ましい実施態様は、以 下の節12の実施例に詳細に記載されている。節12に記載されるように、酵母タン パク質複合体検出システムは、２つのターゲット遺伝子(rchd534およびfchd540) のタンパク質産物の相互作用を検出するために用いた。 5.3.示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の特性決定 示差的に発現される遺伝子、例えば、上記の5.1.1節に説明された方法により 同定された遺伝子、パスウェイ遺伝子、例えば、上記の5.2節に説明された方法 により同定された遺伝子、並びに別の手段により同定された遺伝子は、例えば、 本明細書に説明されたような方法を利用することにより更に特性決定し得る。こ のような遺伝子が本明細書中“同定された遺伝子”と称される。 本明細書に記載された分析の如き分析が同定された遺伝子の生物学的機能に関 する情報をもたらすであろう。加えて、示差的に発現される遺伝子の生物学的機 能の評価が、ターゲット遺伝子および／またはフィンガープリント遺伝子として のそれらの指定を可能にするであろう。詳しくは、更なる特性決定が、遺伝子の 発現の調節または遺伝子産物の活性の調節が心臓血管病を回復し得ることを示す 、示差的に発現される遺伝子のいずれかが、上記5.1節に特定されたような “ターゲット遺伝子”と指定されるであろう。このようなターゲット遺伝子およ びターゲット遺伝子産物が、以下に説明されるものとともに、下記の5.5節に説 明される化合物発見戦略の焦点を構成するであろう。 更なる特性決定が、このような調節が心臓血管病に積極的に影響しないかもし れないことを示すが、その発現パターンが、例えば、心臓血管病状態の相関関係 のある遺伝子発現“フィンガープリントパターン”に寄与する、示差的に発現さ れる遺伝子のいずれかが、“フィンガープリント遺伝子”と指定されるであろう 。“フィンガープリントパターン”が下記の5.8節に更に充分に説明される。タ ーゲット遺伝子のそれぞれがまたパスウェイ遺伝子の全部またはサブセットと同 様にフィンガープリント遺伝子として機能し得ることが注目されるべきである。 パスウェイ遺伝子はまた本明細書に記載された技術の如き技術に従って特性決定 し得ることが更に注目されるべきである。パスウェイ遺伝子が示差的に発現され ること、および遺伝子の発現の調節または遺伝子産物の活性の調節が心臓血管病 を改善し得ることを指示する情報をもたらすこれらのパスウェイ遺伝子がまた“ ターゲット遺伝子”と称される。このようなターゲット遺伝子およびターゲット 遺伝子産物は、先に説明されたものとともに、下記の5.5節に説明される化合物 発見戦略の焦点を構成するであろう。 パスウェイ遺伝子の一つ以上の特性決定が示差的発現の欠如を明らかにし得る が、遺伝子の活性または発現の調節が、それにもかかわらず、心臓血管病症候を 改善し得ることが更に注目されるべきである。このような場合、これらの遺伝子 および遺伝子産物がまた下記の5.5節の化合物発見戦略の焦点と考えられるであ ろう。パスウェイ遺伝子の特性決定が、遺伝子発現または遺伝子産物活性の調節 が心臓血管病に積極的に影響しないかもしれないが、その発現が示差的に発現さ れ、これが例えば心臓血管病状態の相関関係のある遺伝子発現フィンガープリン トパターンに寄与する場合、このようなパスウェイ遺伝子は更にフィンガープリ ント遺伝子と称し得る。 同定された遺伝子が更に特性決定し得る技術の中で、同定された遺伝子のヌク レオチド配列（これは当業者に公知の通常の技術を利用することにより得られて もよい）がこのような遺伝子を更に特性決定するのに使用し得る。例えば、同 定された遺伝子の配列が、同定された遺伝子産物の生物学的機能に関する情報を 生じ得る一つ以上の既知の配列モチーフに対する相同性を明らかにし得る。 第二に、同定された遺伝子により生成されたｍＲＮＡの組織分布の分析が、当 業者に公知の通常の技術を利用して、行い得る。このような技術として、例えば 、ノーザン分析およびRT-PCRが挙げられる。このような分析は、同定された遺伝 子が心臓血管病に寄与すると予想される組織中で発現されるか否かについて情報 を与える。また、このような分析は定常状態ｍＲＮＡ調節に関する定量的情報を 与え、どの同定された遺伝子が、好ましくは、心臓血管病に寄与すると予想し得 る組織中の高レベルの調節を示すのかに関するデータを生じ得る。 また、このような分析は所定の組織に由来する特別な細胞型の単離された細胞 集団について行われてもよい。更に、通常のin situハイブリダイゼーション技 術が、所定の組織内のどの細胞が同定された遺伝子を発現するのかに関する情報 を与えるのに利用し得る。このような分析は、組織内の細胞のサブセットのみが 心臓血管病に関係すると考えられる場合に心臓血管病に対する同定された遺伝子 の生物学的機能に関する情報を与え得る。 第三に、同定された遺伝子の配列が、通常の技術を使用して、遺伝子を遺伝子 地図、例えば、マウス遺伝子地図(Copeland&Jenkins，1991，Trends in Gene-ti cs 7:113-118)およびヒト遺伝子地図(Cohenら，1993，Nature 366:698-701)に入 れるのに使用し得る。このようなマッピング情報が、例えば、既知の遺伝子心臓 血管病傾向がマッピングする近遺伝子領域をマッピングする遺伝子を同定するこ とによりヒト疾病に対する遺伝子の重要性に関する情報を生じ得る。 第四に、同定された遺伝子の生物学的機能が、妥当なin vivo系およびin vi-t ro系を利用することにより更に直接に評価し得る。in vivo系として、心臓血管 病疾病素質を自然に示す動物系、またはapoE欠乏アテローム動脈硬化症マウスモ デル(Plumpら，1992，Cell 71:343-353)を含むが、これに限定されない、このよ うな症候を示すように操作された動物系が挙げられるが、これらに限定されない 。このような系が下記の5.4.4.l節に説明される。 in vitro系として、心臓血管病の関係について知られており、またはその疑い のある細胞型を含む細胞をベースとする系が挙げられるが、これらに限定され ない。このような系が下記の5.4.4.2節に詳しく説明される。 同定された遣伝子の生物学的機能を更に特性決定する際に、これらの遺伝子の 発現がin vivo系および／またはin vitro系中で調節され、すなわち、過剰発現 または過小発現され、次にその系に関するその後の効果が分析し得る。また、同 定された遺伝子の産物の活性が、関係するin vivo系および／またはin vitro系 における活性のレベルを増加または減少することにより調節され、次にその後の 効果が分析し得る。 このような特性決定により得られた情報は、関係する遺伝子を伴う心臓血管病 の治療に適した方法を示唆し得る。例えば、治療は遺伝子発現および／または遺 伝子産物活性の調節を含んでもよい。本明細書に記載された特性決定操作の如き 特性決定操作は、このような調節が関係する遺伝子または遺伝子産物の発現また は活性の増加または減少を伴うべき場所を示し得る。 例えば、症状のもとにアップレギュレーションされる遺伝子は症状を発生また は悪化するのに関係し得る。このような有害に発現された遺伝子の活性をダウン レギュレーションするのに指示された治療は症状を回復するであろう。一方、症 状下の遺伝子のアップレギュレーションは冒された細胞による保護応答の一部で あり得る。特に正常なアップレギュレーションを欠いている個体中の、このよう なアップレギュレーションされた遺伝子産物の活性を増大または増進するのに指 示された治療は、同様に症状を回復するであろう。このような治療の方法が下記 の5.6節に説明される。 5.4.示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子 同定された遺伝子（これらは上記5.1.1節に同定されたような示差的に発現さ れる遺伝子、および上記5.2節に同定されたようなパスウェイ遺伝子を含むが、 これらに限定されない）が本明細書に記載される。詳しくは、このような同定さ れた遺伝子の核酸配列および遺伝子産物が本明細書に記載される。更に、同定さ れた遺伝子の産物、および同定された遺伝子が更に特性決定され、利用される細 胞をベースとするモデルおよび動物をベースとするモデルに対し誘導された抗体 がまたこの節に説明される。 5.4.1.示差的に発現される遺伝子配列およびパスウェイ遺伝子配列 本発明の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子が下記の表１にリ ストされる。示差的に発現される遺伝子ヌクレオチド配列およびパスウェイ遺伝 子ヌクレオチド配列が図８、12、15、18、22、28、31、および35に示される。 表１は、例えば、上記5.1.1節、および下記の６節〜９節に示される実施例に 説明されたパラダイムにより同定された示差的に発現される遺伝子をリストする 。また、表１はこのような遺伝子の更なる特性決定に関する情報を要約する。 第一に、示差的に発現される遺伝子を検出するのに最初に使用されたパラダイ ムが“最初の検出のパラダイム”と標題された欄の下に記載される。例えば、5. 1.1節に記載されたパラダイム条件の一つ以上のもとに示差的に発現されること が示された遺伝子の発現パターンが“パラダイム発現パターン”と標題された欄 の下に要約される。試験した遺伝子のそれぞれについて、使用されたパラダイム および生成されたサンプル中の遺伝子の発現の相違が示される。“↑”は、遺伝 子発現が生成されたサンプル中でアップレギュレーションされる（すなわち、検 出可能なｍＲＮＡの量の増加がある）ことを示し、一方、“↓”は、遺伝子発現 が生成されたサンプル中でダウンレギュレーションされる（すなわち、検出可能 なｍＲＮＡの量の減少がある）ことを示す。本明細書に使用される“検出可能な ”は、例えば、当業者に周知である標準のノーザン技術および／またはRT-PCR技 術により検出可能であるｍＲＮＡのレベルをいう。 示差的発現が検出された細胞型がまた表１中で“検出された細胞型”と標題さ れた欄の下に要約される。“染色***置”と標題された欄は、遺伝子が位置され るヒト染色体番号を示す。更に、遺伝子が核酸データベースに見られる配列と同 様または相同のヌクレオチド配列を含む場合、このような類似性に関する文献が リストされる。 表１にリストされた遺伝子は、適当なｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ ）ライブラリー内の遺伝子を検出するのに適したプローブの使用を含むが、これ らに限定されない、当業者に周知のクローニング方法を使用して得られてもよい （例えば、Sambrookら，1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual， ColdSpring Harbor Laboratories（これが参考として本明細書にそのまま含まれ る）を参照のこと）。本明細書に報告された新規な配列のプローブは、下記の表 ２に示されるような、ATCCに寄託された単離クローンから直接に得られてもよい 。また、新規な遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブは図１〜５に開示されたＤ ＮＡ配列に基いて合成されてもよい。 部分コード配列または非コード配列を含むクローンから得られた配列が、RACE 方法(Chenchikら，1995，CLONTECHniques(X)1:5-8;Barnes，1994，Proc．Natl.A cad.Sci．USA 91:2216-2220;およびChengら，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 91:5695 -5699)を使用することにより全コード領域を得るのに使用し得る。オリゴヌクレ オチドが全コード配列をコードする逆転写されたｍＲＮＡを増幅し得る部分クロ ーンから得られた配列に基いて設計し得る。 また、プローブは、遺伝子が転写される適当な細胞または細胞系から調製され たｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用し得る。例えば、単球中 に検出された、本明細書に記載された遺伝子が、下記の6.1.1節に記載されるよ うに単離された単球から調製されたｃＤＮＡライブラリーからクローン化し得る 。 内皮細胞中で検出された、本明細書に記載された遺伝子はまたprogress in H- emostasis and Thrombosis，３巻，P.Spaet編集者，Grune &Stratton Inc.，New York，1-28に記載されたように単離された内皮細胞から構築されたｃＤＮＡラ イブラリーからクローン化し得る。また、遺伝子が、例えば、Takahashiら，199 0，上記文献に従ってヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー(Clontech Laboratories，P alo Alto，CA)、Jonesら，1993，上記文献に記載されたHUVEC ｃＤＮＡライブラ リー、またはClearyら，1986，上記文献に記載された急性リンパ芽球性白血病(S UP-B2)ｃＤＮＡライブラリーから回収し得る。ゲノムＤＮＡライブラリーはあら ゆる供給源から調製し得る。 下記の表２は表１にリストされた新規な遺伝子を含むプラスミドを含む、ＡＴ ＣＣに寄託されたE.coli株をリストする。 本明細書において、「示差的に発現される遺伝子」（すなわち、ターゲットお よびフィンガープリント遺伝子）または「パスウェイ遺伝子(pathway gene)」と は、（ａ）本明細書に開示（図１−５に示すように）されるＤＮＡ配列の少なく とも１つを含有するか、またはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン 内に含有されている遺伝子；（ｂ）ＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクロー ン内に含有されているか、あるいは本明細書に開示（図１−５に示すように）さ れるか、またはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン内に含有されてい る、ＤＮＡ配列が属する遺伝子のコード領域内に含有されている、本明細書に開 示（図１−５に示すように）されるＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列 をコードする任意のＤＮＡ配列；（ｃ）ＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のク ローン内に含有されているか、あるいは本明細書に開示（図１−５に示すように ）されるか、またはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン内に含有され ている、ＤＮＡ配列が属する遺伝子のコード領域内に含有されている、本明細書 に開示されているコード配列の相補体に、高ストリンジェント条件下（例えば、 ０．５Ｍ ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１mM ＥＤ ＴＡ中で65℃でフィルター結合したＤＮＡにハイブリダイゼーションし、０．１ ×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６８℃で洗浄する（Ausubel F.M．ら編、1989、 分子生物学の最近の方法（Current Protocols in Molecular Biology）、Vol.I, グリーンパブリシングアソシエーツ社（Green Publishing Associates，Inc.） 、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons，Inc.）、ニュー ヨーク、第２頁１０．３）でハイブリダイズし、表２に記載のクローン内に含有 される配列によりコードされる遺伝子産物と機能的に同等の遺伝子産物をコード する、任意のＤＮＡ配列、および／または（ｄ）ＡＴＣＣに寄託された、表２に 記載のクローン内に含有されているか、あるいは本明細書に開示（図１−５に示 すように）されるか、またはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン内に 含有されている、ＤＮＡ配列が属する遺伝子のコード領域内に含有されている、 本明細書に開示（図１−５に示すように）されるコード配列の相補体に、あまり ストリンジェントでない条件下（例えばO.2×SSC／0.1％SDSで42℃で洗浄すると いう中程度のストリンジェント条件下（Ausubelら、1989、同上）でハイブリダ イズするが、機能的に同等の遺伝子産物をコードする任意のＤＮＡ配列、を意味 する。 本発明はまた、前節のＤＮＡ配列（ａ）から（ｃ）にハイブリダイズする、従 ってその相補体である、核酸分子好ましくはＤＮＡ分子も含有する。このような ハイブリダイゼーション条件は、前述のように高ストリンジェントであっても、 またはあまり高ストリンジェントでなくてもよい。核酸分子がデオキシヌクレオ チド（「オリゴ」）であるとき、高ストリンジェント条件とは、例えば6×SSC／ 0.05％ピロリン酸ナトリウム中で37℃（14塩基オリゴについて）、48℃（17塩基 オリゴについて）、55℃（20塩基オリゴについて）、および60℃（23塩基オリゴ について）での洗浄を意味する。これらの核酸分子は、例えばターゲット遺伝子 制御に有用なターゲット遺伝子アンチセンス分子として、および／またはターゲ ット遺伝子核酸配列の増幅反応のアンチセンスプライマーとして作用してもよい 。さらに、このような分子は、ターゲット遺伝子制御にも有用なリボザイムおよ び／または三重らせん配列の一部として使用することができる。さらに、このよ うな分子は、診断法の成分として使用でき、ここで心臓血管病を引き起こす対立 遺伝子の存在が検出される。 本発明はまた、（ａ）前記コード配列の任意のものおよび／またはその相補体 （すなわち、アンチセンス）を含有するＤＮＡベクター、（ｂ）コード配列の発 現を指令する調節要素に機能的に結合した前記コード配列の任意のものを含有す るＤＮＡ発現ベクター、および（ｃ）宿主細胞中でコード配列の発現を指令する 調節要素に機能的に結合した前記コード配列の任意のものを含有する、遺伝子操 作した宿主細胞、も包含する。本明細書において、調節要素は、誘導性または非 誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を指令および制御 することが当該分野で公知の他の要素を含むが、これらに限定されない。本発明 は、本明細書に開示したＤＮＡ配列の任意のものの断片を含む。 前記の遺伝子配列以外に、例えば他の種に存在するそのような配列の相同体が 、当該分野で公知の分子生物学的方法により同定され、過度の実験をすることな く容易に単離される。さらにこのような遺伝子産物の１つまたはそれ以上のドメ インに対して広範な相同性を有するタンパク質をコードするゲノム内の他の遺伝 子座に遺伝子が存在するかも知れない。これらの遺伝子もまた同様の方法により 同定される。 例えば、単離された示差的に発現される遺伝子配列は標識され、目的の生物か ら得られたｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする のに使用してもよい。ｃＤＮＡライブラリーが、標識配列が得られた生物の型と は異なる生物から得られた時、ハイブリダイゼーション条件は低ストリンジェン トであろう。あるいは、標識断片は、再度、適度のストリンジェント条件を用い て、目的の生物から得られたゲノムライブラリーをスクリーニングするために使 用される。このような低ストリンジェント条件は当業者に周知であり、ライブラ リーおよび標識配列が得られた特定の生物に依存して変動するであろう。このよ うな条件に関する指針は、例えばSambrookら、1989、分子クローニング、実験室 マニュアル（Molecular Cloning，A Laboratory Manual）、コールド・スプリン グ・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、ニューヨーク；Ausubel F.M．ら編、1989、分子生物学の最近の方法（Current Protocols in Molecular Biology）、グリーンパブリシングアソシエーツ・アンド・ワイリー・インタイ ーサイエンス（Green Publishing AssociatesとWiley Interscience）、ニュー ヨークを参照のこと。 さらに、従来は未知の示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子型配 列が、目的の遺伝子内のアミノ酸配列に基づいて設計された、２つの縮重オリゴ ヌクレオチドプライマープールを用いてPCRを行うことにより単離される。反応 の鋳型は、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子対立遺伝子を発現 することが知られているかまたは疑われる、ヒトまたは非ヒト細胞株または組織 から調製されるｍＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡでもよい。 PCR産物は、増幅された配列が、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ 遺伝子様の核酸配列の配列であることを確認するために、サブクローニングまた は配列決定してもよい。次にPCR断片を用いて、種々の方法で全長ｃＤＮＡクロ ーンを単離する。例えば、増幅断片を標識し、バクテリオファージｃＤＮＡライ ブラリーをスクリーニングするのに用いてもよい。あるいは標識断片を用いて、 ゲノムライブラリーをスクリーニングしてもよい。 PCR技術はまた、全長ｃＤＮＡ配列を単離するのに利用できる。例えば適当な 細胞または組織供給源から、標準的方法を用いてＲＮＡが単離される。第１の鎖 の合成のプライミングのための増幅断片の最も５’末端に特異的なオリゴヌクレ オチドプライマーを用いて、ＲＮＡについて逆転写反応を行う。得られるＲＮＡ ／ＤＮＡハイブリッドを次に、標準的末端トランスフェラーゼ反応を用いてグア ニンで「テイル」を作り、ＲＮＡａｓｅＨを用いてハイブリッドを消化し、次に ポリーＣプライマーを用いて第２の鎖の合成をプライミングする。こうして、増 幅断片の上流のｃＤＮＡ配列が容易に単離される。使用されるクローニング法の 総説については、Sambrookら、1989（前述）を参照のこと。 同定される示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子が正常（すなわ ち、野生型）な場合、この遺伝子は遺伝子の突然変異対立遺伝子を単離するのに 使用される。このような単離は、遺伝的基礎を有することが知られているかまた は疑われる過程および疾患において好適である。突然変異対立遺伝子は、心臓血 管病症状に寄与する遺伝子型を有することが知られているかまたは疑われる個人 から単離される。突然変異対立遺伝子と突然変異対立遺伝子産物は次に、後述の 治療および診断測定系に使用される。 突然変異遺伝子のｃＤＮＡは、例えば当業者に周知のPCR法を用いて単離され る。この場合、第１のｃＤＮＡ鎖は、突然変異対立遺伝子を有すると考えられる 個人で発現されることが知られているかまたは疑われる組織から単離されるｍＲ ＮＡに、オリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、新しい鎖を逆 転写酵素を用いて伸長するることにより合成できる。次にｃＤＮＡの第２の鎖は 、正常な遺伝子の５’末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを 用いて合成される。次にこれらの２つのプライマーを用いて、PCRにより生成物 を増幅し、適切なベクターにクローン化させ、当業者に周知の方法によりＤＮＡ 配列解析を行う。突然変異遺伝子のＤＮＡ配列を正常な遺伝子と比較して、突然 変異遺伝子産物の機能の喪失または変化に関係する突然変異を確認することがで きる。 あるいは、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーは、突然変異対立 遺伝子を有することが知られているかまたは疑われる個体の目的の遺伝子を発現 することが知られているかまたは疑われる組織から、それぞれＤＮＡまたはＲＮ Ａを用いて構築し、スクリーニングすることができる。正常な遺伝子またはその 適切な断片は次に、標識して、ライブラリー中の対応する突然変異対立遺伝子を 同定するためのプローブとして使用される。次にこの遺伝子を含有するクローン を、当該分野で通常使用される方法により精製して、この節で前記したように配 列分析にかける。 さらに発現ライブラリーは、突然変異対立遺伝子を有することが疑われるかま たは知られている個体の目的の遺伝子を発現することが知られているかまたは疑 われる組織から合成されるｃＤＮＡから単離されたＤＮＡを用いて作製される。 こうして、推定の突然変異組織により作成した遺伝子産物を発現させ、以下の５ ．４．３節で説明するように正常な遺伝子産物に対して作成した抗体とともに標 準的抗体スクリーニング法を使用してスクリーニングする。（スクリーニング法 については、Harlow，E．とLane編、1988、「抗体：実験室マニュアル（Antibod ies:A Labratory Manual）」、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コー ルド・スプリング・ハーバーを参照のこと）。突然変異により、機能が変化した （例えば、ミスセンス突然変異の結果として）遺伝子産物が発現される場合、ポ リクローナルな抗体のセットは、突然変異遺伝子産物と交差反応する可能性があ る。そのような標識抗体との反応を介して検出されるライブラリークローンを精 製し、この節で前記したように配列分析にかける。 ５．４．２ 示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物 示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物には、前記５．４． １節に記載の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子配列によりコー ドされるタンパク質がある。具体的には、示差的に発現される遺伝子およびパス ウェイ遺伝子の産物は、ＡＴＣＣに寄託された、表２に記載の前記クローン内に 含有されているか、あるいは本明細書に開示（図１−５に示すように）されるか 、またはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン内に含有されている、Ｄ ＮＡ配列が属する遺伝子のコード領域内に含有されている、示差的に発現される 遺伝子およびパスウエイ遺伝子の配列によりコードされる示差的に発現される遺 伝子およびパスウエイ遺伝子ポリペプチドを含む。 さらに、示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物は、機能的 に同等の同等の遺伝子産物であるタンパク質を含んでもよい。このような同等の 示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物は、前記５．４．１節 に記載の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の配列によりコード されるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、付加またば置換を有してもよいが 、サイレント変化であるため、機能的に同等の示差的に発現される遺伝子および パスウェイ遺伝子の産物を産生する欠失、付加または置換を含有してもよい。ア ミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／ または両性に基づいて行われる。 例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン 、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが あり、極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チ ロシン、アスパラギン、およびグルタミンがあり、陽性に荷電した（塩基性）ア ミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンがあり、陰性に荷電（酸性 ）したアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸がある。本明細書にお いて「機能的に同等である」とは、前記５．４．１節に記載の示差的に発現され る遺伝子およびパスウェイ遺伝子の配列によりコードされる内因性の示差的に発 現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物と、in vivoで実質的に同様の活 性を示すことができるタンパク質を意味する。あるいは以下の５．５節に記載の ような測定法の一部として使用される時、「機能的同等である」とは、内因性の 示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物の対応する部分が相互 作用するのと実質的に同じ方法で、他の細胞性または細胞外分子と相互作用する ことができるペプチドを意味する。 示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物は、当該分野で周知 の技術を使用して組換えＤＮＡ技術により産生してよい。すなわち、示差的に発 現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子配列をコードする核酸を発現することに より、本発明の示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子ポリペプチド およびペプチドを調製する方法が本明細書中に記載される。示差的に発現される 遺伝子およびパスウェイ遺伝子タンパク質コード配列および適切な転写／翻訳制 御シグナルを含有する発現ベクターを作製するために、当業者に周知の方法が使 用できる。これらの方法には例えば、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術およ びin vivo組換え／遺伝的組換えがある。例えば、Sambrookら、1989（前 述）およびAusubelら、1989（前述）を参照のこと。あるいは、示差的に発現さ れる遺伝子およびパスウェイ遺伝子タンパク質配列をコードすることができるＲ ＮＡは、例えば合成機を用いて化学的に合成できる。例えば、「オリゴヌクレオ チド合成（Oligonucleotide Synthesis）」、１９８４、Gait，J.J.編、ＩＲＬ プレス、オックスフォオード（これは参考のためその全体が本明細書に引用され る）を参照のこと。 本発明の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子コード配列を発現 するために、種々の宿主−発現ベクター系が使用できる。このような宿主−発現 ベクター系は、目的のコード配列を産生し、次に精製するが、適切なヌクレオチ ドコード配列で形質転換またはトランスフェクションした時には、本発明の示差 的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質をその場で示すビヒク ルである。これらは、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパ ク質コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌（例えば、大腸菌（E．c oli)、枯草菌（Bacillus subtilis））、示差的に発現される遺伝子またはパス ウェイ遺伝子タンパク質コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転 換した酵母（例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピヒア（Pichia）） 、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質コード配列を含 有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた 昆虫細胞系、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質コー ド配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイク ウイルス（CaMV）、タバコモザイクウイルス（TMV））で感染させたか、または 組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換した植物細 胞系、または哺乳動物細胞（例えば、メタロチオネインプロモーター）のゲノム または哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニ アウイルス７．５Kプロモーター）から得られるプロモーターを含有する組換え 発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3）を含 むが、これらに限定されない。 細菌系では、発現される示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タ ンパク質の使用目的に依存して、多くの発現ベクターが有利に選択できる。例え ば、抗体の産生のために、あるいはペプチドライブラリーをスクリーニングする ために、このようなタンパク質を大量に産生する時、容易に精製できる融合タン パク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが好ましい。このようなベクタ ーには、大腸菌（E．coli）発現ベクターｐＵＲ２７８（Rutherら、1983、EMBO J．2:1791）（ここでは、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タ ンパク質をコードする配列は、lacZコード領域と一緒にフレーム内でベクターに 個々に連結され、その結果融合タンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（In ouye & Inouye，1985，Nucleic Acids Res．13:3101-3109;Van Heeke & Schuste r，1989，J．Biol．Chem 264::5503-5509）などがあるが、これらに限定されな い。ｐＧＥＸベクターも、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と の融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用することができ る。一般的にこのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロ ースビーズに吸着させ、次に遊離グルタチオンの存在下で溶出することにより、 溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローン 化されたターゲット遺伝子タンパク質がＧＳＴ部分から放出されるように、トロ ンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。 好適な実施態様において、標準的PCR法（Innisら、1990、前述）を用いて、ア ミノ末端のフレーム内（in-frame）のＢａｍＨＩ部位とカルボキシ末端のＥｃｏ ＲＩ部位に、全長ｃＤＮＡ配列を追加し、ｐＧＥＸ−２ＴＫベクター（ファルマ シア（Pharmacia）、ウプサラ（Uppsala）、スエーデン）に連結することができ る。得られるｃＤＮＡ構築物は、放射能標識のためにアミノ末端にキナーゼ認識 部位を含有し、親和性精製のためにカルボキシ末端にグルタチオン−Ｓ−トラン スフェラーゼ配列を有する（Nilssonら、1985、EMBO J．4:1075；ZabeauとStanl ey，1982，EMBO J．1:1217）。 昆虫の系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica） 多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとし て使用される。このウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera fru giperda）細胞中で増殖する。示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺 伝子コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個 々にクローン化され、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、、ポリヘドリン プロモーター）の制御下に置かれる。示差的に発現される遺伝子またはパスウェ イ遺伝子コード配列の挿入が成功すれば、、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され 、非閉塞組換えウイルス（すなわち、、ポリヘドリン遺伝子にコードされるタン パク質性コートが欠如したウイルス）が産生される。次にこれらの組換えウイル スは、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞を感染させ るのに使用され、そこで挿入遺伝子が発現される（例えば、Smithら、1983，J． Virol．46:584:Smith、米国特許第４，２１５，０５１号）。 哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系が使用される。アデノ ウイルスが発現ベクターとして使用される時、目的の示差的に発現される遺伝子 またはパスウェイ遺伝子コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（ 例えば、後期プロモーターおよび三部分リーダー配列）に連結される。次にこの キメラ遺伝子は、in vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスゲノム中 に挿入される。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）へ の挿入により、感染宿主中で生存活性がありそこで示差的に発現される遺伝子ま たはパスウェイ遺伝子タンパク質を発現することができる組換えウイルスができ る。（例えば、LoganとShenk、1984，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:3655-365 9）。挿入された示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子コード配列 の効率的な翻訳のために具体的な開始シグナルがまた必要とされる。これらのシ グナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列がある。示差的に発現される遺伝 子またはパスウェイ遺伝子の全遺伝子（それ自身の開始コドンと隣接配列を含む ）が適切な発現ベクターに挿入される場合、追加の翻訳制御シグナルは必要ない 。しかし、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子コード配列の一部 のみが挿入される場合、内因性翻訳制御シグナル（おそらく、ＡＴＧ開始コドン を含む）が提供される必要がある。さらに開始コドンは、完全な挿入体の翻訳を 確認するために、開始コドンは目的のコード配列の読みとり枠と同じフェーズに なければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然 および合成の種々の起源のものでもよい。発現の効率は、適切な転写エ ンハンサー要素、転写ターミネーターなど（Bittnerら、1987，Methods in Enzy mol．153:516-544）を含めることにより増強されてもよい。 好適な実施態様において、全長読みとり枠をコードするｃＤＮＡ配列は、ｃＤ ＮＡ発現がCMVプロモーターにより指令されるように、β−ガラクトシダーゼ遺 伝子を置換してｐCMVβ中に連結される（Alam，1990，Anal．Biochem．188:245- 254;MacGregorとCaskey，1989，Nucl．Acids Res．17:2365;NortonとCorrin，19 85，Mol．Cell．Biol．5:281）。 さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の具体的な方法で遺 伝子産物を修飾しプロセシングする、宿主細胞株が選択される。タンパク質産物 のこのような修飾（例えば、グリコシル化）やプロセシング（例えば、切断）は 、タンパク質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳 後プロセシングや修飾の特徴的および特異的機構を有する。適切な細胞株または 宿主系は、発現される外来タンパク質の正しい修飾やプロセシングを確保するよ うに選択することができる。このために、一次転写物の正しいプロセシング、遺 伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細 胞が使用される。このような哺乳動物宿主細胞には、CHO、VERO、BHK、HeLa、CO S、MDCK、293、3T3、WI38などがあるが、これらに限定されない。 組換えタンパク質の長期、高収率産生のために安定な発現が好ましい。例えば 、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質を安定に産生す る細胞株が操作される。ウイルス性複製開始点を含有する発現ベクターを用いる より、宿主細胞を、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー 、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択性マーカー により制御されるＤＮＡで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後に、 作成した細胞は、高富化培地中で１〜２日間増殖され、次に選択培地に交換され る。組換えプラスミド中の選択性マーカーは、選択に耐性を与え、細胞が、その 染色体中にプラスミドを安定に組み込み、増殖して増殖巣を形成させ、次にこれ がクローン化され細胞株に拡大されることを可能にする。この方法は、示差的に 発現されるあるいはパスウェイ遺伝子タンパク質を発現する細胞株を操作するの に有利に用いられる。このような作成した細胞株は、示差的に発現される遺伝子 また はパスウェイ遺伝子タンパク質の内因性活性に影響を与える化合物のスクリーニ ングや評価に特に有用である。 多くの選択系が利用でき、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wi glerら、1977，Cell 11:223）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトラ ンスフェラーゼ（SzybalskaとSzybalski，1962，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 4 8:2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、1980， Cell 22:817）遺伝子が、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ￣細胞 に用いられるが、これらに限定されない。また、抗代謝物耐性が、ｄｈｆｒ（こ れはメトトレキセートに対する耐性を与える（Wiglerら、1980，Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 77:3567;O'Hareら、1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:1527 ）；ｇｐｔ（これは、ミコフェノール酸に対する耐性を与える）（MulliganとBe rg，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:2072）；ｎｅｏ（これは、アミノグ リコシドＧ４１８に対する耐性を与える）（Colberre-Garapinら、1981，J．Mol ．Biol．150:1）；およびｈｙｇｒｏ（これは、ヒグロマイシンに対する耐性を 与える）（Santerreら、1984，Gene 30:147）遺伝子の選択の基礎として使用す ることができる。 別の融合タンパク質系は、ヒト細胞株で発現される非変性融合タンパク質の容 易な精製を可能にする（Janknechtら、1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:8 972-8976）。この系では、目的の遺伝子は、遺伝子の読みとり枠が一過性に、６ つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに融合されるように、ワクシニア組 換えプラスミド中にサブクローニングされる。組換えワクシニアウイルスで感染 させた細胞の抽出物を、Ｎｉ2+ニトリロ酢酸−アガロースカラムにのせ、ヒスチ ジンが付加されたタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出する。 ５．５節で後述するような測定系の成分として使用される時、示差的に発現さ れる遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質は、示差的に発現される遺伝子ま たはパスウェイ遺伝子タンパク質と試験物質の間で形成される複合体の検出を促 進するために、直接または間接に標識される。種々の適切な標識系の任意のもの が使用でき、例えば、125Ｉ；基質に接触させた時、検出可能な発色シグナルま たは光を産生する酵素標識系；および蛍光標識物があるが、これらに限定され ない。 このような測定系のために示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子 タンパク質を産生するために組換えＤＮＡ技術が使用される時、標識化、固定化 および／または検出を促進できる融合タンパク質を作成することが有利である。 間接標識化では、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子産物に特異 的に結合する、標識抗体のようなタンパク質を使用する。そのような抗体には、 ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂ断 片およびＦａｂ発現ライブラリーにより産生される断片があるが、これらに限定 されない。 ５．４．３ 示差的に発現される遺伝子またはパスウエイ遺伝子産物抗体 本明細書に、１つまたはそれ以上の示差的に発現される遺伝子またはパスウェ イ遺伝子エピトープを特異的に認識することができる抗体の産生方法が記載され る。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ） 、ヒト化またはキメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂ断片、F(ab')2断片、Ｆａｂ発 現ライブラリーから産生される断片、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、およ び前記いずれかのエピトープ結合断片があるが、これらに限定されない。このよ うな抗体は、例えば生物試料中のフィンガープリント、ターゲット、またはパス ウェイ遺伝子の検出に用いられるか、あるいは異常ターゲット遺伝子活性の阻害 方法として使用される。すなわち、このような抗体は、心臓血管病治療法の一部 として、および／または診断法（こうして、患者は、フィンガープリント、ター ゲット、またはパスウェイ遺伝子タンパク質の異常レベル、あるいはこのような タンパク質の異常な型の存在の試験のために用いられる）の一部として使用され る。 示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子に対する抗体の産生のため に、種々の宿主動物を、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タン パク質またはその部分を注射して免疫する。このような宿主動物には、ウサギ、 マウス、およびラットなどがあるが、これらに限定されない。宿主の種に依存し て、免疫応答を上昇させるために種々のアジュバントが使用できる。例えば、フ ロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムのような鉱物 ゲル、表面活性物質（例えば、リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリア ニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジ ニトロフェノール、およびＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin）やコリネバクテ リウム・パルブム（Corynebacterium parvum）のような有用である可能性のある ヒトアジュバントがあるが、これらに限定されない。 好適な実施態様において、ターゲット遺伝子産物のアミノ酸配列に対応するペ プチド配列が選択され、合成と抗体産生のためにリサーチジェネティクス（Rese arch Genetics）（ハンツビル（Huntsville）、アラバマ州）に提出された。ペ プチドは、記載されている（Tam，J.P.，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85 :5409-5413:Tam，J.P.，とZavala，F.，1989，J．Immunol．Methods 124:53-61; Tam，J.P.,とLu，Y.A.，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:9084-9088）よ うに修飾され、等量のフロイントアジュバントに乳化させ、ウサギの背中側の皮 下に１回の免疫当たり総量１．０ml（ペプチド０．５mg）を注射した。２週間お よび６週間後ウサギに追加免疫し、４、８、および１０週間目に採血した。血液 を凝固させ、遠心分離して血清を採取した。fchd545遺伝子産物に対するポリク ローナル抗体の作製は以下の第10節中、実施例において詳細に記載する。 ポリクローナル抗体は、ターゲット遺伝子産物のような抗原またはその抗原機 能のある誘導体で免疫した動物の血清から得られる抗体分子の不均一な集団であ る。ポリクローナル抗体の産生のために、前述のような宿主動物を、これも前述 のアジュバントを補足した示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子産 物を注射して免疫する。 特定の抗原に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体は、細胞株の 連続培養により抗体分子の産生を提供する任意の方法により得られる。これらに は、KohlerとMilsteinのハイブリドーマ法（1975，Nature 256:495-497；および 米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kosborら、 1983，Immunolgy Today 4:72；Coleら、1983，Proc．Natl．Acad．Sci．USA80:2 026-2030）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら、1985， モノクローナル抗体と癌治療（Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy）、 アランアールリス社（Alan R．Liss，Inc.）、pp．77-96）があるが、これらに 限定されない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤお よびこれらの任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスである。本発 明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、in vitroまたはin vivoで培養できる 。in vivoでの高力価のｍＡｂの産生は、本発明の好適な産生方法である。 さらに、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生 物活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子とともにスプライスすることによる、 「キメラ抗体」の産生のために開発されている方法（Morrisonら、1984，Proc． Natl．Acad．Sci.，81:6851-6855;Neubergerら、1984，Nature，317:604-608;Ta kedaら、1985，Nature，314:452-454）が使用できる。キメラ抗体は、マウスｍ Ａｂ由来の可変領域とヒトの免疫グロブリン定常領域を有するような、異なる部 分が異なる動物種に由来する分子である。 あるいは、１本鎖抗体の産生について記載されている方法（米国特許第４，９ ４６，７７８号；Bird，1988，Science 242:423-426;Hustonら、1988，Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 85:5879-5883；およびWardら、1989，Nature 334:544-546 ）を、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子１本鎖抗体を産生する ように応用することができる。１本鎖抗体は、アミノ酸の橋を介してＦｖ領域の 重鎖と軽鎖フラグメントを連結し、１本鎖ポリペプチドを得ることにより形成さ れる。 特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の方法により産生される。この ような断片には例えば、抗体分子のペプシン消化により産生されるF(ab')2断片 、およびF(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することにより形成されるＦａ ｂ断片があるが、これらに限定されない。あるいは、所望の特異性を有するモノ クローナルＦａｂ断片の迅速で容易な同定を可能にするように、Ｆａｂ発現ライ ブラリーが構築される（Huseら、1989，Science，246:1275-1281）。 ５．４．４ 細胞ベースおよび動物ベースのモデル系 本明細書において、心臓血管病のモデルとして作用する細胞ベースおよび動物 ベースの系が記載される。これらの系は、種々の応用に使用される。例えば、細 胞ベースおよび動物ベースの系は、前記５．３節に記載したように示差的に発現 される遺伝子またはパスウェイ遺伝子をさらに性状解析するために使用される。 このようなさらなる性状解析は、例えば示差的に発現される遺伝子はターゲット 遺伝子であることを示す。第２に、そのような測定法は、以下の５．５．４節で 説明されるように、心臓血管病症状を緩和することができる化合物を同定するよ うに設計されるスクリーニング方策の一部として使用することができる。すなわ ち、動物ベースおよび細胞ベースのモデルは、心臓血管病の治療に有効な薬物、 医薬、治療法および介入方法を同定するのに、使用される。さらに以下の５．７ ｌ節で詳述されるように、そのような動物モデルは、動物被験体中のＬＤ50およ びＥＤ50を求めるために使用され、そしてそのようなデータは、心臓血管病治療 法の可能性のある方法のin vivoの有効性を求めるために使用することができる 。 ５．４．４．１ 動物ベースの系 心臓血管病の動物ベースのモデル系には、非組換え動物および作成したトラン スジェニック動物が含まれるが、これらに限定されない。 心臓血管病の非組換え動物モデルには、例えば遺伝的モデルがある。そのよう な遺伝的心臓血管病モデルには、例えばａｐｏＢまたはａｐｏＲ欠損ブタ（Rapa czら、1986，Science 234:1573-1577）およびワタナベ（Watanebe）遺伝性高脂 血症（WHHL）ウサギ（Kitaら、1987，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:5928-593 1）がある。 動脈硬化の非組換え、非遺伝的動物モデルには、例えばLDLを食餌に補足する ことによる化学的傷害、または例えばバルーンカテーテル血管形成術による機械 的傷害を受けたブタ、ウサギ、またはラットモデルがある。 さらに、心臓血管病症状を示す動物モデルは、前記５．４．１節に記載のよう なターゲット遺伝子配列を、当業者に周知のトランスジェニック動物を産生する 技術とともに用いて、作成できる。例えば、ターゲット遺伝子配列は、目的の動 物のゲノム内に導入、およびゲノム内で過剰発現するか、あるいは内因性ターゲ ット遺伝子配列が存在するなら、過剰発現されるかまたは、例えばマウスのａｐ ｏＥの破壊について記載（Plumpら、1992，Cell 71:343-353）されているように 、ターゲット遺伝子を低発現するかもしくは発現を不活性化するために破壊され る。 ターゲット遺伝子配列を過剰発現させるために、ターゲット遺伝子配列のコー ド部分を、目的の型の動物または細胞中の遺伝子発現を指令することができる制 御配列に連結してもよい。そのような制御領域は、当業者に周知であり、過度の 実験をすることなく利用できる。 内因性ターゲット遺伝子配列の低発現のために、そのような配列を単離し、目 的の動物のゲノムに再導入された時、内因性ターゲット遺伝子対立遺伝子が不活 性化されるように作成される。好ましくは、作成されるターゲット遺伝子配列は 、作成されたターゲット遺伝子配列が動物のゲノム内に組み込まれると内因性標 的配列が破壊されるように、遺伝子ターゲティングにより導入される。遺伝子タ ーゲティングは、本節で後述される。 マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロブタ、ヤギ、および非 ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）など（ただしこれらに 限定されない）の任意の種の動物を用いて、心臓血管病動物モデルを作成できる 。 トランスジェニック動物の創始系統を産生するために動物内にターゲット遺伝 子トランスジーンを導入するのに、当該分野で公知の任意の方法が利用できる。 そのような方法には、前核微量注入法（Hoppe，P.C．とWagner，T.E.，1989，米 国特許第４，８７３，１９１号）；生殖系列へのレトロウイルス介在遺伝子導入 （Van der Puttenら、1985，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:6148-6152）；胚 幹細胞中の遺伝子ターゲティング（Thompsonら、1989，Cell 56:313-321）：胚 の電気穿孔法（Lo，1983，Mol Cell．Biol．3:1803-1814）；および***介在遺 伝子導入（Lavitranoら、1989，Cell 57:717-723）などがあるが、これらに限定 されない。そのような方法の総説については、Gordon，1989，トランスジェニッ ク動物（Transgenic Animals）、Intl．Rev．Cytol．115:171-229（これは参考 のためその全体が本明細書に引用される）を参照のこと。 本発明は、そのすべての細胞中にトランスジーンを有する動物並べにすべてで はないが一部の細胞にトランスジーンを有する動物（すなわち、モザイク動物） を提供する。トランスジーンは、単一のトランスジーンとしてまたはコンカタマ ー（例えば、頭対頭縦列（head-to head tandem）もしくは頭対尾縦列（head-to -tail tandem）として組み込まれる。トランスジーンはまた、例えばLaskoら（L asko，M．ら、1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:6232-6236）の教示に従っ て、特定の細胞型中に導入され活性化される。そのような細胞型に特異的な活性 化に必要な制御配列は、目的の特定の細胞型に依存し、当業者には公知である。 ターゲット遺伝子トランスジーンを、内因性ターゲット遺伝子の染色体部位内に 組み込みたい場合は、遺伝子ターゲティングが好ましい。簡単に説明すると、そ のような方法が使用される時、目的の内因性ターゲット遺伝子に相同的ないくつ かのヌクレオチド配列を含有するベクターが、染色体配列との相同的組換えを介 して、内因性ターゲット遺伝子のヌクレオチド配列の中に組み込まれ、その機能 を破壊することを目的として設計される。トランスジーンはまた、特定の細胞型 に選択的に導入され、こうして、例えばGuら（Guら、1994，Science 265:103-10 6）の教示に従って、その細胞型のみの目的の内因性遺伝子を不活性化する。そ のような細胞型特異的不活性化に必要な制御配列は、目的の特定の細胞型に依存 し、当業者に公知である。ターゲット遺伝子を発現するための組換え法は、前記 ５．４．２節に記載されている。 トランスジェニック動物がいったん作成されると、標準的方法を用いて組換え ターゲット遺伝子およびタンパク質の発現が測定される。最初のスクリーニング は、サザンブロット解析またはPCR法により行って、動物組織を解析し、トラン スジーンの組み込みが起きた否かを測定することができる。トランスジェニック 動物の組織中のトランスジーンのｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得られる 組織試料のノーザンブロット解析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析 、およびＲＴ−PCRなどの方法（しかし、これらに限定されない）でも測定でき る。ターゲット遺伝子発現組織の試料はまた、目的のターゲット遺伝子トランス ジーン産物に特異的な抗体を用いて免疫組織化学的に評価される。 容易に検出可能なレベルでターゲット遺伝子ｍＲＮＡまたはターゲット遺伝子 トランスジーンペプチド（ターゲット遺伝子産物のエピトープに対して作成され た抗体を用いて免疫組織化学的に検出される）を発現するターゲット遺伝子トラ ンスジェニック動物は、次にさらに評価して特徴的な心臓血管病症状を示す動物 を同定する。そのような症状には、例えば脂肪の縞および／または心臓血管病班 の数やサイズの増加がある。 さらにトランスジェニック動物内の特異的細胞型を解析し、心臓血管病に特徴 的な細胞表現型について測定する。単核細胞の場合は、そのような表現型には、 LDL摂取率、内皮細胞への接着、遊出、泡沫細胞形成、脂肪縞形成、泡沫細胞特 異的産物の産生の増加があるが、これらに限定されない。細胞表現型測定法は、 以下の５．４．４．２節で詳述される。さらに、そのような細胞表現型は、心臓 血管病症状を示す動物での特定の細胞型の既知のフィンガープリント発現プロフ ィールに比較して、特定の細胞型のフィンガープリントパターンの発現を含んで もよい。フィンガープリントプロフィールは、以下の５．８．１節で詳述される 。そのようなトランスジェニック動物は、心臓血管病の適切なモデル系になる。 ターゲット遺伝子トランスジェニック創始動物がいったん産生されると、これ らは育種、同系交配、異系交配、または交雑して特定の動物のコロニーが産生さ れる。このような育種の例には、創始動物を２つ以上の組み込み部位で異系交配 して別の系統を樹立すること、別の系統を同系交配して、各ターゲット遺伝子ト ランスジーンの付加的発現の作用のために、より高レベルで目的のターゲット遺 伝子トランスジーンを発現する複合ターゲット遺伝子トランスジェニック体を産 生すること、異型接合トランスジェニック動物を交配させて、特定の組み込み部 位で同型接合である動物を産生させて、発現を増強することおよびＤＮＡ解析で 動物をスクリーニングする必要性をなくすこと、別の同系接合系統を交配させて 、複合異型接合または同型接合系統を産生させること、動物を異なる近交系遺伝 的バックグランドに品種改良してターゲット遺伝子トランスジーンの発現および 心臓血管病症状の進展に及ぼす対立遺伝子修飾の影響を調べることがあるが、こ れらに限定されない。そのような方法の１つは、ターゲット遺伝子トランスジェ ニック創始動物を野生株と交配させて、心臓血管病症状を示すＦ１世代を産生す ることである。次に同型接合ターゲット遺伝子トランスジェニック動物が生存活 性を有することがわかれば、Ｆ１世代を同系交配して同型接合系統を出現させ る。 ５．４．４．２ 細胞ベースの測定法 ターゲット遺伝子タンパク質をコードし、さらに心臓血管病に関連した細胞表 現型を示すターゲット遺伝子配列を含有し発現する細胞は、抗心臓血管病活性を 示す化合物を同定するのに利用される。 そのような細胞は、非組換え単核細胞株、例えばＵ９３７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ −１５９３）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−２０２）、およびＰ３８８Ｄ１ （ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−６３）；内皮細胞、例えばＨＵＶＥＣおよびウシ大動脈内 皮細胞（ＢＡＥＣ）；並びに一般的哺乳動物細胞株、例えばＨｅＬａ細胞および ＣＯＳ細胞、例えばＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃−１６５１）がある。さらにそのよ うな細胞には、組換えトランスジェニック細胞株がある。例えば、前記５．４． ４．１節で考察した本発明の心臓血管病動物モデルは、心臓血管病の細胞培養モ デルとして使用できる、心臓血管病に関与する１つまたはそれ以上の細胞型を含 有する、細胞株を産生するために使用される。本発明の心臓血管病トランスジェ ニック動物から得られる初代培養物が利用できるが、連続細胞株の産生が好まし い。トランスジェニック動物から連続細胞株を得るために使用される方法の例に ついては、Smallら、1985，Mol．Cell Biol．5:642-648を参照。 あるいは、心臓血管病に関与することが知られている細胞型の細胞を、細胞内 のターゲット遺伝子発現の量を増加または低下させることができる配列でトラン スフェクションしてもよい。例えば、ターゲット遺伝子配列は、目的の細胞のゲ ノム内に導入され過剰発現されるか、またはもし内因性ターゲット遺伝子配列が 存在するなら、これらは過剰発現されるかまたは破壊されてターゲット遺伝子を 低発現または発現を不活性化する。 ターゲット遺伝子配列を過剰発現するために、ターゲット遺伝子配列のコード 部分を、目的の細胞型中で遺伝子発現を指令することができる制御配列に連結す る。そのような制御配列は当業者に周知であり、過度の実験をすることなく利用 できる。ターゲット遺伝子を発現するための組換え法は、前記５．４．２節に記 載されている。 内因性ターゲット遺伝子配列の低発現のために、そのような配列は単離され、 目的の細胞型のゲノムに再導入される時、内因性ターゲット遺伝子対立遺伝子が 不活性化されるように作成される。好ましくは作成されるターゲット遺伝子配列 は、作成されたターゲット遺伝子配列が細胞のゲノムに組み込まれた時、内因性 標的配列が破壊されるように、遺伝子ターゲティングにより導入される。ターゲ ット遺伝子を用いる宿主細胞のトランスフェクション法は、前記５．４．４．１ 節に記載される。 化合物で処理される細胞またはターゲット遺伝子でトランスフェクションされ る細胞を、心臓血管病に関連した表現型について調べることができる。単核細胞 の場合は、そのような表現型は、LDL摂取率、内皮細胞への接着、遊出、泡沫細 胞形成、脂肪縞形成、泡沫細胞によるｂＦＧＦ、IGF-I、VEGF、IL-1、Ｍ−ＣＳ Ｆ、ＴＧＦβ、ＴＧＦα、ＴＮＦα、ＨＢ−ＥＧＦ、PDGF、ＩＦＮ−γ、および ＧＭ−ＣＳＦのような成長因子の産生の増加があるが、これらに限定されない。 例えば、遊出速度は、前記５．１．１．３節に記載のNavabらのin vitroの系を 用いて、内皮単層を通過して移動し内皮下スペースのコラーゲン層に入る単核細 胞の数を定量することにより、測定される。 同様に、ＨＵＶＥＣは、試験化合物で処理できるか、または前記５．４．２節 に記載の遺伝子操作したターゲット遺伝子によりトランスフェクションできる。 次にＨＵＶＥＣは、心臓血管病に関連する表現型、例えば細胞形態、細胞増殖、 細胞遊走、および単核細胞接着など（ただし、これらに限定されない）、または 心臓血管病に関与する他のタンパク質（例えば、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、PDGF−β 、およびＥ−セレクチン）の産生に及ぼす作用について、試験される。 ターゲット遺伝子配列核酸のトランスフェクションは、標準的方法を使用して 行われる。例えば、Ausubelら、1989（前述）を参照のこと。トランスフェクシ ョンされた細胞は、組換えターゲット遺伝子配列の有無、ターゲット遺伝子ｍＲ ＮＡの発現と蓄積、および組換えターゲット遺伝子タンパク質産生があることに ついて評価される。ターゲット遺伝子発現の減少が好ましい場合、標準的方法を 使用して内因性ターゲット遺伝子発現および／またはターゲット遺伝子産物の産 生の減少が達成されるかどうかを証明する。 ５．５ ターゲット遺伝子産物と相互作用および/またはターゲット遺伝子発現 を調節する化合物のスクリーニングアッセイ ターゲット遺伝子産物に結合する化合物、ターゲット遺伝子産物と相互作用す る他の細胞性または細胞外タンパク質に結合する化合物、およびターゲット遺伝 子産物と他の細胞性または細胞外タンパク質との相互作用を妨害する化合物を同 定するために以下のアッセイが設計される。そのような化合物は、ターゲット遺 伝子のタンパク質産物の活性を調節することによって、例えば動脈硬化、虚血／ 再潅流、高血圧、再狭窄、および動脈炎症のような心臓血管病の緩和の基礎とし て作用する。そのような化合物には、ペプチド、抗体または小さい有機もしくは 無機化合物があるが、これらに限定されない。このような化合物の同定方法は、 以下の５．５．１節で説明される。このような化合物には、他の細胞性タンパク 質も含まれ得る。このような細胞性タンパク質の同定方法は、以下の５．５．２ 節で説明される。 本明細書に記載のようなアッセイにより同定される化合物は、例えばターゲッ ト遺伝子産物の生物学的機能を調べたり、心臓血管病の緩和に有用である。心臓 血管病の状態がターゲット遺伝子発現の総合的な低レベルおよび／または細胞ま たは組織でのターゲット遺伝子産物の総合的な低レベルに起因する場合は、ター ゲット遺伝子産物と相互作用する化合物は、結合したターゲット遺伝子タンパク 質の活性を強調もしくは増幅する化合物を含んでよい。このような化合物は、タ ーゲット遺伝子産物活性のレベルを有効に上昇させ、こうして症状を緩和する。 場合によって、病気の状態下でアップレギュレーションされていることが観察 されるターゲット遺伝子は、保護作用を示しているかも知れない。このようなア ップレギュレーション遺伝子の発現、またはその遺伝子産物の活性を増強する化 合物はまた、特にターゲット遺伝子が正常な場合にはアップレギュレーションさ れない個体で、症状を緩和するであろう。 他の場合には、ターゲット遺伝子内の突然変異は、ターゲット遺伝子タンパク 質の異常な型もしくは過剰量の産生を引き起こし、これは有害作用を引き起こし 心臓血管病をもたらす。同様に生理学的条件が、ターゲット遺伝子発現の過剰な 上昇を引き起こし、心臓血管病をもたらすことがある。このような場合は、結合 したターゲット遺伝子タンパク質の活性を阻害する、ターゲット遺伝子タンパク 質に結合する化合物が同定される。例えばこの節で説明したような技術により同 定される化合物の有効性を試験するためのアッセイは、５．５．４節で考察され る。 ５．５．１．ターゲット遺伝子産物に結合する化合物のin vitroスクリーニング アッセイ 本発明のターゲット遺伝子に結合することができる化合物を同定するために、 in vitroの系を設計することができる。このような化合物は、Ｄ−および／また はＬ−立体配置のアミノ酸から作られるペプチド（例えば、ランダムペプチドラ イブラリーの形で：例えば、Lam，K.S．ら，1991，Nature 354:82-84を参照のこ と）、ホスホペプチド（例えば、ランダムまたは部分縮重指向性ホスホペプチド ライブラリー（partially degenerate，directed phosphopeptide libraries） の形で；例えば、Songyang，Z．ら，1993，Cell 72:767-778を参照のこと）、抗 体、および有機または無機小分子を含むが、これらに限定されない。同定される 化合物は、例えば、ターゲット遺伝子タンパク質、好ましくは突然変異ターゲッ ト遺伝子タンパク質の活性を調節するのに有用であったり、ターゲット遺伝子タ ンパク質の生物学的機能を調べるのに有用であったり、正常なターゲット遺伝子 相互作用を妨害する化合物を同定するためのスクリーニングにおいて利用された り、またはこれら自体がこのような相互作用を妨害しうる。例えば、以下の１２ 節の実施例では、rchd534タンパク質とfchd540タンパク質との間の相互作用につ いて記載する。この２つのタンパク質の間の相互作用を妨害する化合物は、心臓 血管病の治療に有用で有り得る。 ターゲット遺伝子タンパク質に結合する化合物を同定するために使用されるア ッセイの原理は、ターゲット遺伝子タンパク質および試験化合物の２つの成分を 相互作用させ結合させるのに十分な条件および時間で、この２つの成分の反応混 合物を調製して、そして反応混合物中で除去および／または検出することができ る複合体を形成することを伴う。これらのアッセイは、種々の方法で行うことが できる。例えば、このようなアッセイを行うための１つの方法では、固相にター ゲット遺伝子または試験物質を定着し、固相に定着したターゲット遺伝子／試験 物質複合体を反応後に検出する。このような方法の１つの実施態様において、タ ーゲット遺伝子タンパク質は固相表面に定着され、定着されない試験化合物が、 直接または間接に標識される。 実際には、マイクロタイタープレートが都合よく利用されている。定着される 成分は、非共有または共有結合により固定化され得る。非共有結合は、単に、タ ンパク質の溶液で固相表面をコーティングして乾燥することにより達成できる。 あるいは、タンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体を 使用して、タンパク質を固相表面に定着させる。表面は、前もって調製して保存 することができる。 アッセイを行うために、定着された成分を含有するコーティングされた表面に 非固定化成分を添加する。反応終了後、形成された複合体が固相表面に固定化さ れて残るような条件下で、未反応成分を除去（例えば、洗浄により）する。固相 表面に定着された複合体の検出は、多くの方法で達成され得る。予め固定化され ない成分を前もって標識してある場合、表面上に固定化された標識の検出は、複 合体が形成されたことを示している。非固定化成分を前もって標識しない場合、 表面に定着された複合体を検出するために、間接的標識を使用することができる 。例えば、予め固定化されない成分に特異的な標識抗体を使用する（抗体は、次 に標識抗Ｉｇ抗体で直接標識または間接標識されてよい）。 あるいは、反応を液相で行い、反応生成物を未反応成分から分離し、そして複 合体を検出することができる（例えば、ターゲット遺伝子産物または試験化合物 に特異的な固定化抗体を使用して溶液中で形成された任意の複合体も定着し、可 能性のある複合体の他の成分に特異的な標識抗体を使用して定着された複合体を 検出する）。 前記方法の１つにより特定のターゲット遺伝子産物に結合することが判明した 化合物は、さらに、ターゲット遺伝子タンパク質から生物化学的応答を誘発する 能力について試験することができる。本明細書では、シグナル伝達に関与する受 容体タンパク質についての特定の実施態様を記載する。ターゲット遺伝子産物受 容体ドメインと相互作用する化合物は、リガンドとして機能する（すなわち、シ グナル伝達経路を開始(trigger)させるように、受容体タンパク質に結合する） 能力についてスクリーニングすることができる。本発明の有用な受容体断片また は類似体は、リガンドと相互作用するものである。受容体成分は、機能的に（す なわち、リガンドに結合し、Ｃａ++を移動する能力について）アッセイすること ができる（下記を参照のこと）。これらのアッセイは、成分として、結合の検出 を可能にする配置の、リガンドと組換えターゲット遺伝子産物（または適切な断 片若しくは類似体）を含む。 例えば、組換え受容体は、カルシウムのリガンド依存性の移動を媒介する能力 により、リガンドのスクリーニングのために使用することができるが、これに限 定されない。ターゲット遺伝子発現ベクター（前記５．４．２節に記載された方 法により構築される）でトランスフェクトされた細胞、好ましくはミエローマ細 胞若しくはアフリカツメガエル卵母細胞は、標準法によりＦＵＲＡ−２またはＩ ＮＤＯ−１を付加する。リガンドにより誘導されるＣａ2+の移動は、上記した（ Grynklewiczら，1985，J．Biol．Chem．260:3440）ように蛍光分光法により測定 される。したがってターゲット遺伝子産物の受容体ドメインと反応するリガンド は、蛍光シグナルを生成する能力により同定することができる。これらの受容体 結合活性は、バックグラウンド以上に生成された蛍光のレベルを測定することに より定量し比較することができる。以下の５．５．３節に記載するように、リガ ンドを同定し、リガンド−受容体複合体の活性を測定することにより、この相互 作用のアンタゴニストを同定することができる。このようなアンタゴニストは、 心臓血管病の治療に有用である。 ５．５．２．ターゲット遺伝子産物と相互作用する細胞性または細胞外タンパク 質のアッセイ タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに適切な任意の方法を使用して 、新規な標的タンパク質−細胞性または細胞外タンパク質相互作用を同定するこ とができる。これらの方法は、パスウェイ遺伝子の同定に関して上記５．２．節 に略述されており、そして同定された標的タンパク質と相互作用するタンパク質 の 同定に関して本明細書において利用することができる。このような場合に、ター ゲット遺伝子は、既知の「餌（bait）」遺伝子として働く。 以下の１２節に記載する実施例は、共に標的タンパク質であると同定されたrc hd534タンパク質とfchd540タンパク質との間の相互作用を検出する本方法の使用 を実証する。 ５．５．３．ターゲット遺伝子産物と他の化合物との間の相互作用を妨害する化 合物のアッセイ 本発明のターゲット遺伝子タンパク質は、in vivoで、１つまたはそれ以上の 細胞性または細胞外タンパク質と相互作用しうる。このようなタンパク質は、上 記５．５．２．節に記載したような方法により同定されるタンパク質を含むが、 これらに限定されない。説明の便宜上、ターゲット遺伝子産物とこのような細胞 性および細胞外タンパク質は、本明細書では「結合パートナー」と呼ぶ。そのよ うな相互作用を妨害する化合物は、ターゲット遺伝子タンパク質、特に突然変異 ターゲット遺伝子タンパク質の活性を調節するのに有用であり得る。このような 化合物は、前記５．５．１．節に記載される、抗体、ペプチドなどのような分子 を含むが、これらに限定されない。 ターゲット遺伝子タンパク質と、その細胞性または細胞外タンパク質結合パー トナーとの間の相互作用を妨害する化合物を同定するために使用されるアッセイ 系の基本的原理は、ターゲット遺伝子タンパク質と結合パートナーが相互作用し 結合するのに充分な条件および時間で、この２つのタンパク質を含有する反応混 合物を調製して、複合体を形成する。阻害活性について化合物を試験するために 、反応混合物を、試験化合物の存在下および非存在下で調製する。試験化合物は 、最初から反応混合物に含ませるか、またはターゲット遺伝子およびその細胞性 または細胞外結合パートナーの添加後に添加してもよい。対照の反応混合物は、 試験化合物なしで、またはプラセボと共にインキュベートする。次に、ターゲッ ト遺伝子タンパク質と、細胞性または細胞外結合パートナーとの間の複合体の形 成が検出される。対照反応においては複合体の形成があるが、試験化合物を含有 する反応混合物ではそれがないということは、その化合物が、ターゲット遺伝子 タ ンパク質とその相互作用する結合パートナータンパク質との相互作用を妨害して いることを示している。さらに、試験化合物と正常なターゲット遺伝子タンパク 質を含有する反応混合物内での複合体形成はまた、試験化合物と突然変異ターゲ ット遺伝子タンパク質を含有する反応混合物内での複合体形成と比較することが できる。この比較は、突然変異ターゲット遺伝子タンパク質の相互作用は妨害す るが、正常なターゲット遺伝子タンパク質のそれは妨害しない化合物を同定する ことを目的とする場合に重要となり得る。 結合パートナーの相互作用を妨害する化合物のアッセイは、不均一系または均 一系で行うことができる。不均一系アッセイは、結合パートナーの１つを固相に 定着し、反応の最後に固相に定着されている複合体を検出することを含む。均一 系アッセイでは、全反応は液相で行われる。いずれのアプローチにおいても、反 応物の添加の順番は、試験する化合物について異なる情報を得るために変化させ てよい。例えば、結合パートナーの間の相互作用を、例えば競合により妨害する 試験化合物は、試験物質の存在下で反応を行うことにより（すなわち、試験物質 を、ターゲット遺伝子タンパク質と相互作用する細胞性または細胞外タンパク質 の前またはこれらと同時に反応混合物に添加することにより）同定することがで きる。あるいは、前もって形成された複合体を妨害する試験化合物（例えば、複 合体の結合パートナーの１つを置き換える高い結合定数を有する化合物）は、複 合体形成後に反応混合物に試験化合物を添加することにより試験することができ る。種々の系を以下に簡単に記載する。 不均一アッセイ系においては、ターゲット遺伝子タンパク質または相互作用す る細胞性あるいは細胞外結合パートナータンパク質のいずれかを固相表面に定着 して、そして定着していない結合パートナーを、直接的または間接的に標識する 。実際には、マイクロタイタープレートが都合よく利用される。定着される分子 種は、非共有または共有結合により固定化することができる。非共有結合は、単 に、タンパク質の溶液で固相表面をコーティングして乾燥することにより行うこ とができる。あるいは、タンパク質に特異的な固定化抗体を使用して、タンパク 質を固相表面に定着することができる。表面は、前もって調製して保存すること ができる。 アッセイを行うために、固定化された分子種の結合パートナーを、試験化合物 の存在下または非存在下で、コーティングした表面に暴露する。反応終了後、末 反応成分を除去（例えば、洗浄により）すると、形成した複合体は固相表面に固 定化されて残る。固相表面に定着された複合体の検出は、多くの方法で行うこと ができる。結合パートナーが前もって標識されていた場合、表面上に固定化され た標識検出により、複合体の形成が判る。結合パートナーが前もって標識されて いなかった場合、表面に定着された複合体を検出するために間接標識を使用する ことができる。例えば、結合パートナーに特異的な標識抗体を使用する（抗体は 、次に標識抗Ｉｇ抗体で直接標識または間接標識されてよい）。反応成分の添加 の順番に応じて、複合体形成を阻害または前もって形成された複合体を妨害する 試験化合物を検出することができる。 あるいは反応は、試験化合物、未反応物成分から分離された反応物生成物、お よび検出される複合体の存在下または非存在下で液相で行うことができる（例え ば、一方の結合パートナーに特異的な固定化抗体を用いて溶液中で形成した複合 体を定着し、他方の結合パートナーに特異的な標識抗体を使用して定着された複 合体を検出する）。ここでも再度、液相への反応物の添加の順番に応じて、複合 体を阻害するかまたは前もって形成された複合体を妨害する試験化合物を同定す ることができる。 本発明の別の実施態様において、均一アッセイを使用することができる。この アプローチでは、ターゲット遺伝子タンパク質と、相互作用する細胞性または細 胞外タンパク質との前もって形成される複合体は、結合パートナーの１つが標識 されて調製されるが、標識により生成するシグナルは、複合体形成により消失す る（例えば、このアプローチをイムノアッセイに利用している、Rubenstelnの米 国特許第4,109,496号を参照のこと）。前もって形成された複合体の結合パート ナーのｌつに競合してこれを置き換える試験物質の添加により、バックグラウン ド以上のシグナルの生成が起こる。このように、ターゲット遺伝子タンパク質− 細胞性または細胞外タンパク質の相互作用を妨害する試験物質を同定することが できる。 特定の実施態様において、ターゲット遺伝子タンパク質は、前記５．４．２節 に記載された組換えＤＮＡ技術を使用して固定化のために調製することができる 。例えば、ターゲット遺伝子コード領域は、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１のような融合ベ クターを使用して、得られる融合タンパク質においてその結合活性が維持される ように、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に融合するこ とができる。相互作用する細胞性または細胞外タンパク質は、当該分野で通常行 われ上記５．４．３節に記載した方法を使用して、精製し、かつモノクローナル 抗体を作成するために使用することができる。この抗体は、例えば、放射性同位 体125Iを用いて、当該分野で通常行われる方法により標識することができる。不 均−アッセイでは、例えばＧＳＴ−ターゲット遺伝子融合タンパク質をグルタチ オンーアガロースビーズに定着させることができる。次に、相互作用する細胞性 又は細胞外結合パートナータンパク質を、試験化合物の存在下又は不在下におい て相互作用および結合を生じるような方法で加える。反応期間の終わりに、未結 合物質を洗い流し、標識モノクローナル抗体を系に加えて複合化結合パートナー と結合させる。ターゲット遺伝子タンパク質および相互作用する細胞性又は細胞 外結合パートナータンパク質との間の相互作用は、グルタチオン−アガロースビ ーズに残存する放射能量を測定することにより検出できる。試験化合物によって 相互作用がうまく阻害された場合には、測定放射能が減少する。 あるいは、ＧＳＴ−ターゲット遺伝子融合タンパク質と、相互作用する細胞性 又は細胞外結合パートナータンパク質とを、固体グルタチオン−アガロースビー ズの不在下において、液体中で混合することができる。結合パートナー間で相互 作用が起きる間又はその後に、試験化合物を加え得る。この混合物を次にグルタ チオン−アガロースビーズに加えて、未結合物質を洗い流す。ここでも、結合パ ートナー相互作用の阻害の程度が、標識抗体を加えてビーズに残存する放射能を 測定することにより検出できる。 本発明の別の態様では、ターゲット遺伝子タンパク質及び相互作用的細胞性又 は細胞外タンパク質の一方又は両方の全長タンパク質に代えて、これらのタンパ ク質の結合ドメインにそれぞれに対応するペプチド断片を用いて同じ技術を行う ことができる。当該分野で日常的に実施されているあらゆる方法を用いてタンパ ク質の結合部位を同定し単離することができる。これらの方法は、タンパク質を コードする遺伝子の一つを突然変異誘発し、共免疫沈降アッセイで結合の妨害を スクリーニングすることを含むが、これに限定されない。ターゲット遺伝子中の 代償性突然変異を選択することができる。それぞれのタンパク質をコードする遺 伝子の配列分析により、相互作用する結合に関与するタンパク質の領域に対応す る突然変異が明らかになるであろう。あるいは、先に本節で記載した方法を用い て、一つのタンパク質を固体表面に定着させ、トリプシンなどのタンパク質分解 酵素で処理したその標識結合パートナーと相互作用させ結合させる。洗浄後に、 結合ドメインを含む短い標識ペプチドが固体物質と会合したまま残るので、これ を単離しアミノ酸配列決定により同定する。また、細胞性又は細胞外タンパク質 をコードする遺伝子がいったん得られると、短い遺伝子セグメントを遺伝子操作 してこのタンパク質のペプチド断片を発現させることができ、次いでこの結合活 性について試験し、精製又は合成することができる。 これに限定するものではないが、例えば、ＧＳＴ−ターゲット遺伝子融合タン パク質を作製し、これをグルタチオンアガロースビーズに結合させることによっ て、この節で上述したように固体物質にターゲット遺伝子を定着させることがで きる。相互作用する細胞性又は細胞外結合パートナータンパク質を35Ｓなどの放 射性同位体で標識し、トリプシンなどのタンパク質分解酵素で切断することがで きる。次に切断産物を、定着させたＧＳＴ−ターゲット遺伝子融合タンパク質に 加えて結合させる。未結合ペプチドを洗い流した後、細胞性又は細胞外結合パー トナータンパク質結合ドメインを表す標識された結合物質を溶出し、精製し、当 業者に公知の方法、例えばエドマン分解法（例えば、Creighton，1983，Protein s:Structures and Molecular Principles，W.H．Freeman & Co.，N.Y.，pp.34-4 9参照）によってアミノ酸配列を分析する。このようにして同定されたペプチド は、合成的（例えば、Creighton，1983,前出，pp.50-60参照）又は、もしも遺伝 子が既に単離されているのであれば、５．４．２節で上述したような組換えＤＮ Ａ技術等の当業者に公知の方法を用いて製造することができる。 本発明の特定の態様は、リガンドと、ターゲット遺伝子産物の受容体ドメイン との間の相互作用に拮抗する能力について候補化合物をスクリーニングする方法 を特徴とする。この方法は、ａ）候補アンタゴニスト化合物を、受容体ドメイン を含む組換えターゲット遺伝子産物（又はリガンド結合断片又は類似体）を含む 第１化合物と一方で混合し、またリガンドを含む第２化合物と他方で混合し：ｂ ）第１化合物と第２化合物が結合するかどうかを決定し；そしてｃ）第１化合物 の第２化合物への結合を妨害すること、及び／又はリガンドに媒介される細胞内 Ｃａ++の放出を低下する化合物としてアンタゴニスト化合物を同定することを含 んでなる。 “アンタゴニスト”の語は、特定の活性、この場合では、リガンドがターゲッ ト遺伝子産物受容体ドメインと相互作用する能力及び／又はこのような相互作用 の結果生じる生物学的事象（例えば、細胞内Ｃａ++の放出）を引き起こす能力を 阻害するような分子を意味する。好ましい治療剤には、リガンド−受容体相互作 用を妨げることによってリガンド又はターゲット遺伝子産物機能をブロックする 、アンタゴニスト、例えばペプチド断片（特に、Ｎ−末端細胞外ドメインに由来 する断片）、抗体（特に、Ｎ−末端細胞外ドメインを認識しこれと結合する抗体 ）、又は薬剤を含む。 ターゲット遺伝子産物の受容体成分は組換え技術で生産され、また候補アンタ ゴニストはin vitrooでスクリーニングされ得るので、本発明は有用な治療剤を 同定するための簡単かつ迅速なアプローチを提供する。 目的とする特異的受容体断片には、リガンドと相互作用できるターゲット遺伝 子産物のあらゆる部分、例えば、Ｎ−末端細胞外ドメインの全て又は一部を含む 。このような部分には、膜貫通セグメント及び細胞外にあると推論される受容体 の部分を含む。このような断片は、（上述したような）アンタゴニストとして有 用であり、またターゲット遺伝子産物の活性をin vivoで中和する抗体（例えば 、受容体とリガンドとの間の相互作用を妨げることによって；下記参照）を産生 するための免疫源としても有用である。細胞外領域は類似の構造をもつ関連タン パク質と比較することによって同定でき；有用な領域はファミリー中のよく性状 決定されたメンバーの細胞外ドメインと相同性を示すものである。 あるいは、アミノ酸の一次配列から、Chou-Fasman法（例えばChouおよびFasma n，Ann．Rev．Biochem．47:251，1978参照）などによる疎水性／親水性の計算を 用いてタンパク質の二次構造、そして細胞外ドメイン領域を半経験的に推 定できる。親水性ドメイン、特に疎水性領域に囲まれた親水性ドメイン（例えば 膜貫通ドメイン）は細胞外ドメインの強力な候補である。最後に、細胞外ドメイ ンは、トリプシン消化分析などの標準的酵素消化分析を用いて経験的に同定でき る。 候補の断片（例えば、膜貫通セグメントの全て又は一部又はあらゆる細胞外断 片）を用いて、本明細書で記載するアッセイ（例えば上述のアッセイ）によって リガンドとの相互作用を試験する。このような断片を、本明細書で記載するアッ セイによってリガンドとその内在性受容体との間の相互作用を拮抗する能力につ いても試験する。有用な受容体断片の類似体（上述したような）を作製してスク リーニング成分又はアンタゴニストとしての有効性について試験することもでき （本明細書に記載するアッセイを用いて）；このような類似体も本発明で有用で あると考えられる。 特に目的とするのは、細胞外主要末端領域を含む受容体断片（又はそのリガン ド結合断片）である。同様に目的とするのは、ターゲット遺伝子産物の細胞外ル ープである。これらの細胞外ループに由来するペプチド断片もアンタゴニストと して使用でき、特にループがアミノ末端ドメインと協力してリガンド結合を容易 にしている場合には使用できる。あるいは、このようなループと細胞外Ｎ−末端 ドメインは（全長のターゲット遺伝子産物と同様に）、抗−ターゲット遺伝子産 物抗体を産生するための免疫原を提供する。 リガンドのその受容体への結合は５．５．１節で上述した方法のいずれでもア ッセイしてもよい。好ましくは、組換えターゲット遺伝子産物（又は適当なター ゲット遺伝子産物断片又は類似体）を発現する細胞を固体基質（例えばミクロタ イタープレート又はカラムの壁）に固定化し、検出可能に標識されたリガンドと 反応させる（上述したように）。結合は、受容体成分と会合した（従って固体基 質と会合した）検出標識によってアッセイする。標識リガンドの受容体−保持細 胞への結合を、アンタゴニストアッセイを測定する“対照”として用いる。アン タゴニストアッセイには、ターゲット遺伝子産物−保持細胞を適当な量の候補ア ンタゴニストとともにインキュベートすることを含む。この混合物に、標識リガ ンドと等量を加える。本発明で有用なアンタゴニストは、固定化された受容体− 発現細胞に結合している標識リガンドを特異的に妨げる。 次にアンタゴニストを、リガンド機能を妨げる能力、すなわち受容体によって 通常媒介されるシグナル形質導入を生じることなく結合した標識化リガンド結合 を特異的に妨げる能力について試験する。機能アッセイを用いてこの試験を行う には、ターゲット遺伝子産物を含む安定に形質転換された細胞系を本明細書に記 載するように調製し、そしてカルシウム結合剤であるＦＵＲＡ−２などのレポー ター化合物を標準的な方法で細胞質に充填した。異種のターゲット遺伝子産物を リガンド又はその他のアゴニストで刺激すると、細胞内カルシウムの放出とこれ に付随するカルシウム−ＦＵＲＡ−２複合体の蛍光をもたらす。これはアゴニス ト活性を測定するための便利な手段を提供する。アンタゴニストとなりうるもの とリガンドとを含むことによって、蛍光の発生を伴わずに（すなわち、細胞内Ｃ ａ++の移動を引き起こすことなく）リガンド結合を有効にブロックするような真 性の受容体アンタゴニストをスクリーニングし同定することが可能になる。この ようなアンタゴニストは、心臓血管障害の有用な治療剤となることが期待できる 。 適当な候補アンタゴニストは、ターゲット遺伝子産物断片、特に１以上の膜貫 通セグメント又は受容体の細胞外ドメイン（上述したもの）に隣接するか又はこ れを含むリガンド−結合性部分を含む断片を含み；このような断片は好ましくは ５個以上のアミノ酸を含む。その他の候補アンタゴニストには、リガンド類似体 及びその他のペプチドならびに非ペプチド化合物及び受容体の分析により設計さ れる又はこれに由来する抗−ターゲット遺伝子産物抗体を含む。 ５．５．４．心臓血管病症状の改善についてのアッセイ 上述したアッセイ系で同定された化合物を含む（ただしこれに限定されない） あらゆる結合性化合物を、その心臓血管病症状を改善する能力について試験し得 る。心臓血管病症状を改善する能力を示す化合物を同定するための細胞及び動物 モデルに基づくアッセイを以下に記載する。 まず、５．４．４．２．節で上述したような細胞に基づく系を用いて心臓血管 病症状を改善するように機能し得る化合物を同定することができる。例えば、そ のような細胞系を心臓血管病症状を改善する能力を示すと疑われる化合物に対し て、暴露した細胞中で心臓血管病症状の改善を引き出すのに十分な濃度および時 間の間暴露する。暴露の後、細胞を検査して、１以上の心臓血管病の細胞表現型 が、より正常な又はより野生型の非心臓血管病の表現型に類似するように変化し たかどうかを決定する。例えば単球の場合では、より正常な表現型には、LDL取 り込み速度の低下、内皮細胞への付着、移行（transmigration）、泡沫細胞の形 成、脂肪線条の形成、及び泡沫細胞によるｂＦＧＦ、IGF-I、VEGF、IL-1、Ｍ− ＣＳＦ、ＴＧＦβ、ＴＧＦα、ＴＮＦα、ＨＢ−ＥＧＦ、PDGF、ＩＦＮ−γ、及 びＧＭ−ＣＳＦなどの成長因子の産生を含むが、これに限定されない。例えば移 行速度は５．１．１．３．節で上述したNavabらのin vitro系を用いて、内皮単 層を横切って内皮下空間のコラーゲン層に移動する単球の数を定量することによ って測定できる。 さらに、５．４．４．１．節で上述したような動物モデルに基づく心臓血管病 系を用いて、心臓血管病症状を改善できる化合物を同定することができる。この ような動物モデルは、心臓血管病の治療に有効な薬剤、医薬、治療及び介在の同 定のための試験基質として用いることができる。例えば、動物モデルを心臓血管 病症状を改善する能力を示すと思われる化合物に対して、暴露した動物中で心臓 血管病症状の改善を引き出すのに十分な濃度と時間で、暴露する。暴露に対する 動物の応答を、例えばアテローム性動脈硬化症プラークの数の計数及び／又は治 療の前後におけるその大きさの測定によって、心臓血管病に関連する障害の逆転 を評価することによってモニターできる。 介在に関しては、心臓血管病症状のいかなる様相をも逆転するいかなる治療も 、ヒト心臓血管病の治療的介在の候補として考慮すべきである。試験薬剤の投与 量は下記の５．７．１．節で記載する用量−応答曲線から決定できる。 さらに、遺伝子発現パターンを心臓血管病症状を改善する化合物の能力評価に 用いることができる。例えば、１以上のフィンガープリント遺伝子の発現パター ンで“フィンガープリントプロフィール”の一部を形成し、次いでこれを用いて そのような評価を行う。本明細書における“フィンガープリントプロフィール” という語は、一定の条件下における所与の組織又は細胞型について得られたｍＲ ＮＡ発現パターンを指す。このような条件には、上記５．１．１．節のパラダイ ムに記載したあらゆるコントロール又は実験条件をも含み、アテローム性動脈硬 化症、虚血症／再灌流、高血圧症、再狭窄、及び動脈炎症を含むが、これらに限 定されない。フィンガープリントプロフィールは例えば５．１．２．節で上述し た示差的ディスプレイ法、ノーザン分析及び／又はＲＴ−PCRを用いて作製でき る。５．４．１．節で上述したあらゆる遺伝子配列を、このようなフィンガープ リントプロフィールの作製及び確証のためのプローブ及び／又はPCRプライマー として用いることができる。 フィンガープリントプロフィールを、細胞及び／又は動物に基づくモデル系に おける心臓血管病であるか正常であるかの既知の状態について特徴付けることが できる。次いで、これらの既知のフィンガープリントプロフィールを比較して、 試験化合物がこのようなフィンガープリントプロフィールを修飾したり、またよ り望ましいフィンガープリントのプロフィールにより似させる効果を確かめるこ とができる。 例えば、ある化合物の投与によって、心臓血管病モデル系のフィンガープリン トプロフィールが対照系により類似し得る。あるいは、ある化合物の投与によっ て、対照系のフィンガープリントプロフィールが心臓血管病状態を模倣し始め得 る。このような化合物は、例えば、目的とする化合物のさらなる特徴付けを、あ るいは別の動物モデルを作製するために使用され得る。 ５．５．５．臨床試験中の効果のモニタリング 化合物が心臓血管病状態に対して及ぼす影響のモニタリングは、基礎的な薬剤 スクリーニングのみでなく、臨床試験においても適用できる。このような臨床試 験では、５．１．１．１節から５．１．１．６節に記載したパラダイムのいずれ かで発見した遺伝子パネルの発現を、心臓血管病状態に及ぼす特定薬剤の効果の “読み取り”として用いることができる。 これに限定するものではないが、例えば、パラダイムＡは、酸化LDLで処置し た単球においてアップレギュレートされるフィンガープリント遺伝子の同定を提 供する。従って、例えば臨床試験で抗酸化剤の効果を研究するために、このよう な薬剤で処置する前及び処置中の種々の段階で患者から血液を採取し得る。次い でその単球を単離してＲＮＡを調製し、６．１．１及び６．１．２節で記載する 示差的ディスプレイによって分析する。これらのフィンガープリント遺伝子の発 現レベルは、６．１．２節で記載するノーザンブロット分析又はＲＴ−PCR、又 は５．８．１節で記載するいずれかの方法を用いて定量するか、あるいは５．８ ．２節で記載するいずれかの方法を用いて産生されたタンパク質の量を測定する 。このようにして、フィンガープリントプロフィールは、酸化型LDLを取り込ん だ単球の生理学的応答を示す代理マーカーとして作用する。従って、薬剤処置の 前及び処置中の種々の時点でこの応答状態を決定する。この方法は下記の８節の 実施例でさらに詳しく説明する。特に、酸化型LDLで処置したfchd602およびfchd 605のアップレギュレーションにより、酸性ストレス(oxidative stress)下にあ る単球のフィンガープリントプロフィールが得られる。そのため、fchd602およ びfchd605遺伝子は、心臓血管病の臨床治療において代理マーカーとして機能し 得る。従って、酸化ポテンシャル(oxidative potentlal)に対する抗−酸化剤の 影響は、臨床治療を受けている患者の単球中のfchd602およびfchd605の示差ディ スプレイを記録することによって測定する。 ５．５．６．ターゲット遺伝子の発現を調整する化合物についてのアッセイ ターゲット遺伝子の発現を調整する化合物および他の物質は、in vitro細胞系 を用いてスクリーニングし得る。上記節5.5.5に記載した化合物臨床サンプルの モニタリングに類似した手法で、組織培養物等の細胞使用を試験物質に暴露する 。適切な組織培養細胞には、ヒト膀静脈内皮細胞(HUVEC)、ウシ動脈内皮細胞(BA EC)、および293細胞(ヒト胚腎細胞)が含まれるが、これらには限定されない。次 いで、ＲＮＡを細胞から抽出する。特異的ターゲット遺伝子の転写のレベルを、 例えば、標準RT-PCR増幅技術および/またはノーザン分析を用いて(以下の６．１ ．２節の実施例に記載のように)検出し得る。あるいは、標的タンパク質産生の レベルを、上記５．５．１節に記載したようなターゲット遺伝子タンパク質を検 出する抗体を用いてアッセイし得る。発現のレベルを、試験物質に暴露しなかっ た対照細胞サンプルと比較する。 ターゲット遺伝子の発現の調節についてスクリーニングし得る化合物には、無 機または有機小分子、ペプチドホルモン類似体等のペプチド、ステロイドホルモ ン、そのようなホルモンの類似体、およびその他のタンパク質を含まれるがこれ らに限定されない。発現をダウンレギュレートする化合物には、ターゲット遺伝 子のｍＲＮＡの５’末端に相補的、且つ三重らせん構造を形成して転写を阻害す るオリゴヌクレオチド、ならびにターゲット遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を阻害するリ ボザイムまたはアンチセンス分子を含むがこれらに限定されない。このようなダ ウンレギュレート試験化合物を設計するための技術および方法は、以下の５．６ 節に詳細に記載する。 ５．６．心臓血管病の治療用化合物及び方法 心臓血管病症状を改善する方法及び組成物について以下に記載する。特定の心 臓血管病は少なくとも部分的に、過剰レベルの遺伝子産物又は異常若しくは過剰 活性を示す遺伝子産物の存在によってもたらされる。従って、このような遺伝子 産物のレベル及び／又は活性の低下は心臓血管病症状の改善をもたらす。ターゲ ット遺伝子の発現レベル又はターゲット遺伝子産物の活性レベルを低下する方法 は下記の５．６．１節で記載する。 あるいは、その他の特定の心臓血管病は、少なくとも一部には、遺伝子の発現 レベルの欠損若しくは低下、又は遺伝子産物の活性レベルの低下によって生じる 。従って、遺伝子発現レベル及び／又はこのような遺伝子産物の活性の上昇によ り心臓血管病症状の改善を生じる。 場合によっては、疾患状態にある遺伝子のアップレギュレーションは、疾患状 態に対する応答におけるその遺伝子産物についての防御的役割を反映する。この ようなターゲット遺伝子の発現又はターゲット遺伝子産物の活性の増強は、それ が及ぼす防御的効果を補強するであろう。一部の心臓血管病状態は、このような 防御的遺伝子の活性レベルが異常に低いことによって生じる。このような場合に も、遺伝子発現レベル及び／又はこのような遺伝子産物の活性の上昇は心臓血管 病症状の改善をもたらすであろう。ターゲット遺伝子の発現レベル又はターゲッ ト遺伝子産物の活性レベルを上昇させる方法は下記の５．６．２節で記載する。 ５．６．１．突然変異体ターゲット遺伝子活性の発現、合成又は活性を阻害する 化合物 上述したように、心臓血管病障害に関与するターゲット遺伝子は、ターゲット 遺伝子の活性レベルの上昇によりこのような障害を引き起こし得る。上述した表 １にまとめ、また下記の６節及び７節の実施例で記載するように、疾患状態下で は多数の遺伝子が単球および内皮細胞でアップレギュレートされていることが知 られている。特に、fchd602及びfchd605はそれぞれ、酸化型LDLで処理した単球 中でアップレギュレートされている。さらに、fchd540は、ずれ応力をかけられ た内皮細胞中でアップレギュレートされる。場合によっては、このようなアップ レギュレーションは疾患状態の原因となったり悪化させたりする影響がある。こ のようなターゲット遺伝子及び／またタンパク質の発現、合成又は活性を阻害す るために種々の方法を用いることができる。 例えば、５．５節で上述したアッセイで同定された阻害活性を示す化合物を、 本発明において心臓血管病症状の改善に用いることができる。５．５節で上述し たように、このような分子には小さい有機分子、ペプチド、抗体等が含まれるが 、これらに限定されない。阻害性抗体法は下記の５．６．１．２節で記載する。 例えば、膜貫通ターゲット遺伝子産物に対する内在性リガンドと競合する化合 物を投与できる。その結果としてリガンド結合したターゲット遺伝子膜貫通タン パク質の量が低下すると、細胞の生理機能が調節される。この目的に特に有用な 化合物は、例えばターゲット遺伝子産物の１以上の細胞外ドメインを含むペプチ ド又はその部分及び／又は類似体等の可溶性タンパク質又はペプチド、例えばＩ ｇ−テイルド融合タンパク質のような可溶性融合タンパク質を含む。（Ｉｇ−テ イルド融合タンパク質の生産については例えば米国特許第5,116,964号を参照さ れたい）。あるいは、リガンド類似体又は抗体などの、ターゲット遺伝子産物受 容体部位と結合するがタンパク質を活性化しないような化合物（例えば、受容体 −リガンドアンタゴニスト）が、ターゲット遺伝子産物の活性を阻害するのに有 効でありうる。 さらに、ターゲット遺伝子の発現を阻害するアンチセンス又はリボザイム分子 も本発明において異常なターゲット遺伝子活性を阻害するのに用いることができ る。このような方法は下記の５．６．１．１節に記載する。さらにまた、下記の ５．６．１．１に記載するように、異常なターゲット遺伝子活性の阻害に三重ら せん分子を用いることもできる。 5.6.1.1. 阻害性アンチセンス、リボザイム及び三重らせん、及び遺伝子不活化 心臓血管病症状の改善能を示す化合物には、アンチセンス、リボザイム及び三 重らせん分子がある。突然変異体ターゲット遺伝子活性を低下又は阻害するため にこのような分子をデザインすることができる。このような分子の製造法及び使 用法は当業者に公知である。 アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子は標的ｍＲＮＡとハイブリダイズしてタン パク質の翻訳を妨げることにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックする作用を有 する。 アンチセンスを用いるアプローチは、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡに相補的な オリゴヌクレオチド（ＤＮＡあるいはＲＮＡのいずれか）のデザインを必要とす る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それと相補的なターゲット遺伝子のｍ ＲＮＡ転写物と結合し、翻訳を阻止する。完全に相補的であることが好ましいが 、要求されてはいない。本明細書中でいうＲＮＡの一部分に「相補的」な配列と は、そのＲＮＡとハイブリダイズし、安定な二重らせんを形成するために十分な 相補性を有する配列を意味する。二本鎖のアンチセンス核酸の場合には、二重ら せんＤＮＡの一本鎖を調べるかあるいは三重らせん形成をアッセイして相補性を 調べることができる。ハイブリダイズ能は、相補性の程度及びアンチセンス核酸 の長さに依存する。通常、ハイブリダイズさせる核酸が長ければ長いほど、ＲＮ Ａとの塩基のミスマッチをより多く含むようになるが、その場合でも、依然とし て安定な二重らせん（場合によっては三重らせん）は形成されている。当業者で あれば、ハイブリダイズさせた複合体の融解温度を標準的な操作法を用いて測定 することにより、許容しうるミスマッチの度合いを確かめることができる。 メッセージの5'末端部、例えば、AUG開始コドンまで及びそれを含む5'非翻訳 配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害する際、最も効率的に働くは ずである。しかし、ｍＲＮＡの3'非翻訳配列に対して相補的な配列も、ｍＲＮＡ の翻訳の阻害に効果的であることが最近示された。概説はWagner，R.，1994，Na ture 372:333-335を参照されたい。このように、ターゲット遺伝子の5'-または3 '-末端の非翻訳、非コーディング領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチド は、内因性ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチ に用いうる。ｍＲＮＡの5'非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、AUG開 始コドンに相補的な部分を含まねばならない。ｍＲＮＡのコーディング領域に相 補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、効率の劣る翻訳阻害剤ではあるが、 本発明に用いることができる。ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの5'-、3'-、またはコ ーディング領域のいずれとハイブリダイズするようにデザインされたものであっ ても、アンチセンス核酸は少なくとも６個のヌクレオチド長を有するものでなけ ればならず、好ましくは６個〜約50個のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドで ある。いくつかの特定の態様においては、オリゴヌクレオチドは、少なくともヌ クレオチド10個、少なくともヌクレオチド17個、少なくともヌクレオチド25個、 または少なくともヌクレオチド50個を有する。 標的配列の選択にかかわらず、アンチセンスオリゴヌクレオチドの遺伝子発現 阻害能を定量するためのin vitro実験をまず最初に行うことが好ましい。これら の実験においては、アンチセンスによる遺伝子阻害と、オリゴヌクレオチドの非 特異的な生物活性とを判別しうる対照を用いることが好ましい。これらの実験に おいてはまた、内部対照ＲＮＡまたはタンパク質と標的ＲＮＡまたはタンパク質 のレベルを比較することが好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチド を用いて得られた結果を、対照オリゴヌクレオチドを用いて得られた結果と比較 することが考えられる。対照オリゴヌクレオチドは試験オリゴヌクレオチドと ほぼ同じ長さで、そのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的配列と特 異的なハイブリダイゼーションを起こすことを阻止するのに必要な以上にはアン チセンス配列と相違しないものであることが好ましい。 オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ混合物、あるいはそれらの誘 導体または修飾したもの、一本鎖または二本鎖のものを用いうる。オリゴヌクレ オチドは、例えば分子の安定性やハイブリダイゼーションなどを向上させるため 、塩基部位、糖部位、またはリン酸主鎖を修飾しうる。オリゴヌクレオチドには 他のグループ、例えばペプチド（例えば、in vivoで宿主細胞の受容体をターゲ ッティングするため）、細胞膜（例えば、Letsingerら，1989，Proc．Natl．Aca d．Sci．U.S.A．86:6553-6556;Lemaitreら，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．84: 648-652;PCT公開公報No.WO88/09810，1988年12月15日公開を参照）や脳血液関門 （例えば、PCT公開公報No.WO89/10134，1988年４月25日公開を参照）を通過しや すくするための薬剤、ハイブリダイゼーションによってトリガーされる切断剤（ 例えば、Krolら，1988，BioTechniques 6:958-976を参照）またはインターカレ ート剤（例えば、Zon，1988，Pharma．Res．5:539-549を参照）などを含むこと ができる。この目的のためにオリゴヌクレオチドは他の分子、例えば、ペプチド 、ハイブリダイゼーションによってトリガーされる架橋剤、輸送剤、ハイブリダ イゼーションによってトリガーされる切断剤などを含むことができる。 アンチセンスオリゴヌクレオチドは次の群から選択される少なくとも１種の修 飾塩基部位を有している。該群は、５-フルオロウラシル、５-ブロモウラシル、 ５-クロロウラシル、５-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４-ア セチルシトシン、５-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５-カルボキ シメチルアミノメチル-２-チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウ ラシル、ジヒドロウラシル、β-Ｄ-ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６ -イソペンテニルアデニン、１-メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２-ジ メチルグアニン、２-メチルアデニン、２-メチルグアニン、３-メチルシトシン 、５-メチルシトシン、Ｎ６-アデニン、７-メチルグアニン、５-メチルアミノメ チルウラシル、５-メトキシアミノメチル-２-チオウラシル、β-Ｄ-マンノシル キューオシン、５’-メトキシカルボキシメチルウラシル、５-メトキシウラシル 、２-メチルチオ-Ｎ６-イソペンテニルアデニン、ウラシル-５-オキシ酢酸(v)、 ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２-チオシトシン、５-メ チル-２-チオウラシル、２-チオウラシル、４-チオウラシル、５-メチルウラシ ル、ウラシル-５-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-５-オキシ酢酸(v)、５- メチル-２-チオウラシル、３-（３-アミノ-３-Ｎ-２-カルボキシプロピル）ウラ シル、(acp3)w、及び２,６-ジアミノプリンからなるが、それらに限定されない 。 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、また、アラビノース、２-フルオロアラ ビノース、キシルロース、及びヘキソースからなるがそれらに限定されない群か ら選択される、修飾された糖部位を少なくとも一つ有する。 また別の実施態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロ チオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデー ト、ホスホジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、 及びホルムアセタールまたはそれらの類似体からなる群から選択されるリン酸主 鎖を少なくとも一つ有する。 また別の実施態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα-アノマ ーオリゴヌクレオチドである。α-アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮ Ａと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、それは通常のβ-ユニットとは逆に、 鎖がお互いに同一方向に平行に走っている（Gautierら，1987，Nucl．Acids Res ．15:6625-6641）。それらのオリゴヌクレオチドは２'-o-メチルリボヌクレオチ ド（Inoueら，1987，Nucl．Acids Res．15:6131-6148）、またはキメラＲ ＮＡ-ＤＮＡ類似体（Inoueら，1987，FEBS Lett．215:327-330）である。 本発明のオリゴヌクレオチドは当業界で公知の標準的な方法、例えば、自動Ｄ ＮＡ合成機（例えばBiosearch社やApplied Biosystems社などから市販されてい る）を用いて合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌク レオチドは、Steinら（1988，Nucl．Acids Res．16:3209）の方法で合成でき、 メチルホスホネートオリゴヌクレオチドはコントロールドポアグラスポリマー支 持体（Sarinら，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．85:7448-7451）を用い て合成できる、などがある。 ターゲット遺伝子のコーディング領域配列に対して相補的なアンチセンスヌク レオチドを用いることは可能ではあるが、転写されるが翻訳されない領域に対し て相補的なものが最も好ましい。 rchd534遺伝子及びfchd540遺伝子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド については下記の第１３節の実施例で述べる。 アンチセンス分子は、in vivoでターゲット遺伝子を発現している細胞、例え ば、内皮細胞に送達しなければならない。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細 胞に送達するための方法は多数開発されている。例えば、アンチセンス分子を組 織部位に直接注入するか、あるいは、目的とする細胞を標的とするようにデザイ ンされた修飾アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面に発現している受容体あ るいは抗原と特異的に結合するペプチドまたは抗体とリンクさせたアンチセンス ）であれば全身投与が可能である。 しかしながら、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細 胞内濃度を達成することはしばしば困難なことである。それ故、好適なアプロー チでは、強力なpol IIIまたはpol IIプロモーターの制御下にアンチセンスオリ ゴヌクレオチドを置いた組換えＤＮＡ構築物を使用する。患者体内の標的細胞を トランスフェクトさせるためにそのような構築物を用いると、内因性ターゲット 遺伝子構築物と相補的な塩基対を形成してターゲット遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を 阻止する一本鎖ＲＮＡの十分量の転写をもたらす。例えば、細胞に取り込ませて アンチセンスＲＮＡの転写を起こすように、ベクターをin vivoで導入すること ができる。このようなベクターは、目的とするアンチセンスＲＮＡを産生するた めに転写されうるものである限りは、エピソームのままであってもよいし、ある いは染色体中に組み込んでもよい。このようなベクターは当業界で標準的なもの となっている組換えＤＮＡ技術を用いて構築しうる。ベクターはプラスミド、ウ イルスまたばその他の当業界で知られたものであって哺乳動物細胞中での複製及 び発現のために用いられるものであればよい。アンチセンスＲＮＡをコードする 配列の発現は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞で作用する当業界で公知の任 意のプロモーターでも可能である。このようなプロモーターは誘導しうるもので もよいし、構成的なものであってもよい。このようなものとしては、SV40初期プ ロモーター領域（Bernoist and Chambon，1981，Nature 290:304-310）、ラウス 肉腫ウイルスの3'長鎖末端反復に含まれるプロモーター（Yamamotoら，1980，Ce ll 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら，1981，P roc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調 節配列（Brinsterら，1982，Nature 296:39-42）などが挙げられるが、それらに 限定されない。特定の組織部位、例えば動脈硬化を生じた血管組織へ直接導入し うる組換えＤＮＡ構築物を調製するのに、任意の種類のプラスミド、コスミド、 ＹＡＣまたはウイルスベクターを用いることができる。あるいは、目的とする組 織に選択的に感染するウイルスベクターを用いることもでき、その場合には、投 与は別の経路（例えば全身投与）で行ってもよい。 リボザイムはＲＮＡの特定の開裂を触媒できる酵素ＲＮＡ分子である。リボザ イムの作用メカニズムには、リボザイム分子の相補的標的ＲＮＡへの配列特異的 ハイブリダイゼーション及びそれに続くエンドヌクレオ分解的開裂が含まれる。 ターゲット遺伝子ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するようにデザインされたリボ ザイム分子は、ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの翻訳及びターゲット遺伝子の発現も 阻止する（例えば、PCT国際公開WO90/11364，1990年10月４日公開；Sarverら，1 990，Science 247:1222-1225を参照）。部位特異的認識配列の位置でｍ ＲＮＡを切断するリボザイムはターゲット遺伝子のｍＲＮＡを破壊しうるが、ハ ンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは標 的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成するフランキング領域によって定められる位 置でｍＲＮＡを切断する。唯一の要求事項は、標的ｍＲＮＡが２個の塩基の配列 、5'-UG-3'を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築と産生は当 業界で周知であり、より詳細にはHaseloff and Gerlach，1988，Nature，334:58 5-591に述べられている。例えば、rchd534及びfchd540 ｃＤＮＡのヌクレオチド 配列中にはハンマーヘッド型リボザイムの切断部位となりうる箇所が何百カ所か ある。リボザイムは、その切断認識部位が標的ｍＲＮＡの5'末端に近いところに 位置するように設計すること、すなわち、効率を向上させ、かつ機能を持たない ｍＲＮＡ転写物の細胞内への蓄積を最小限とすることが好ましい。 rchd534及びfchd540遺伝子に対する特異的ハンマーヘッド型リボザイム分子に ついては、下記の第13節中の実施例中に述べる。 本発明のリボザイムとしては、例えば、Tetrahymena Thermophila中に天然に 含まれているもの（IVSまたはL-19 IVS ＲＮＡとして知られる）などのＲＮＡエ ンドリボヌクレアーゼ（これ以後「Cech型リボザイム」と呼ぶ）も含まれるが、 これについてはThomas Cechと共同研究者が広範囲に述べている（Zaugら，1984 ，Science，224:574-578;Zaug and Cech，1986，Science，231:470-475;Zaugら ，1986，Nature，324:429-433;国際特許出願公開公報No．WO/88/04300 Universi ty Patents Inc.による;Been and Cech，1986，Cell，47:207-216）。Cech型リ ボザイムは標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズする８個の塩基対からなる活性部位 を有し、そこで標的ＲＮＡの切断が起こる。本発明はターゲット遺伝子中に存在 する８個の塩基対からなる活性部位配列を標的とするCech型リボザイムをも包含 する。 アンチセンスアプローチと同様、リボザイムは修飾オリゴヌクレオチド（例え ば、安定性、標的性などを向上させたもの）で構成することもでき、in vivoで ターゲット遺伝子を発現している細胞、例えば内皮細胞に送達しなければならな い。送達方法として好ましいのは、強力な構成的pol IIIまたはpol IIプロモー ターの制御下でリボザイムをコードするＤＮＡ構築物を用いることであり、その 結果、トランスフェクトされた細胞は、内因性ターゲット遺伝子のメッセージを 破壊し翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生するようになる。アンチ センス分子とは異なりリボザイムは触媒活性を持つため、より低い細胞内濃度し か要求されない。 転写阻害のための三重らせん形成に用いる核酸分子は、一本鎖でデオキシリボ ヌクレオチドからなるものであるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩 基組成は、フーグスティーン（Hoogsteen）型塩基対則による三重らせん形成を 促進するようにデザインされねばならず、これは一般に二本鎖のうちの一方の鎖 にプリン又はピリミジンのかなり大きな連なりを必要とする。ヌクレオチド配列 はピリミジンをベースにするものであってよく、このときは生じる三重らせんの ３つの会合した鎖を横切ってTAT又はCGCトリプレットになる。ピリミジンに富む 分子は、二本鎖のうちの一本鎖のプリンに富む領域と、その鎖と平行な方向にお いて塩基相補性を与える。また、核酸分子は例えばＧ残基の連なりを含むプリン に富むものであるように選択できる。これらの分子はGC対に富むＤＮＡ二本鎖と 三重らせんを形成することができ、このときプリン残基のほとんどは標的二本鎖 の一本鎖上に位置しており、三重らせん中の３本の鎖を横切ってGGCトリプレッ トになる。 あるいは、三重らせん形成のための標的となりうる候補配列を、いわゆる”ス イッチバック”核酸分子を作ることによって増加できる。スイッチバック分子は 、5’-3’と3’-5’に方向を変えるように合成され、このため二本鎖のうちの一 本鎖とまず塩基対をつくり、次に他方と塩基対をつくり、従ってプリン又はピリ ミジンのいずれかからなるかなりの大きさの連なりが二本鎖の一方の鎖に存在す るように作製する必要がない。 ここに記載するアンチセンス、リボザイム及び／又は三重らせん分子は、正常 体及び突然変異体の両方のターゲット遺伝子の対立遺伝子によって生産されるｍ ＲＮＡの転写（三重らせん）及び／又は翻訳（アンチセンス、リボザイム）を低 下又は阻害することができる。実質的に正常なレベルのターゲット遺伝子活性が 維持されていることを確認するために、正常な活性を示すターゲット遺伝子ポリ ペプチドをコードし発現する核酸分子を、下記の5.7節で記載するような遺伝子 治療法によって細胞中に導入することができ、これにはアンチセンス、リボザイ ム又は三重らせん治療に用いられる可能性のあるいかなる配列も含まない。ある いは、細胞又は組織のターゲット遺伝子活性の必要レベルを維持するために、正 常なターゲット遺伝子タンパク質を細胞又は組織に同時投与することが好ましい 内因性ターゲット遺伝子発現は、標的相同的組換えを用いてターゲット遺伝子 またはそのプロモーターを不活化するかまたは「ノックアウト」することによっ ても低減しうる。（例えば、Smithiesら，1985，Nature 317:230-234;Thomas & Capecchi，1987，Cell 51:503-512;Thompsonら，1989 Cell 5:313-321;これら各 論文は、その全体を引用により本明細書に組み込むものとする）。例えば、in v ivoで標的を発現している細胞をトランフェクトするために、内因性ターゲット 遺伝子（ターゲット遺伝子のコーディング領域あるいは調節領域のどちらか）に 相同なＤＮＡに隣接するが機能を持たない変異体標的（または完全に無関係なＤ ＮＡ配列）を、選択的マーカー及び／または陰性選択的マーカーと共にあるいは マーカーなしで用いうる。標的となった相同組換えを介してＤＮＡ構築物を挿入 すると、ターゲット遺伝子が不活化される。このようなアプローチは、組換えＤ ＮＡ構築物を直接投与するか、あるいはin vivoで必要とされる部位へ適当なウ イルスベクター、例えば血管組織への送達用ベクターを用いて標的とする場合に は、ヒトに適用しうる。 あるいはまた、内因性ターゲット遺伝子の発現は、体内の標的細胞中のターゲ ット遺伝子の転写を阻止する三重らせん構造を形成するために、ターゲット遺伝 子の調節領域（すなわち標的プロモーター及び/またはエンハンサー）に相補的 なデオキシリボヌクレオチド配列を標的とすることによって低減させうる。（概 説は、Helene，C．1991，Anticancer Drug Des.，6(6):569-84;Helene，C.ら， 1992，Ann，N.Y．Accad．Sci.，660:27-36;及びMaher，L.J.，1992，Bioassays 14(12):807-15を参照）。 また本発明の別の実施態様においては、心臓血管病の症状の軽減を実現するた めに標的の活性を「ドミナントネガティブ（dominant negative）」アプローチ を用いて低下させうる。例えば、２種の遺伝子産物、例えばrchd534及びfchd540 のタンパク質が相互作用すれば、これら２種のタンパク質のうちの一方あるいは 双方の変異体が細胞中に存在することによって、野生型のタンパク質のみででき た複合体のプールを全体として減らしうる。このようなやり方で、rchd534/fchd 540タンパク質相互作用より得られる活性レベルを全体的に低減することができ る。 5.6.1.2. ターゲット遺伝子産物に対する抗体 ターゲット遺伝子タンパク質に特異的でかつその活性を妨げる抗体をターゲッ ト遺伝子機能の阻害に用いることができる。このような抗体は5.4.3節で上述し た標準的方法を用いて、タンパク質自体又はタンパク質の一部に対応するペプチ ドに対して作製することができる。このような抗体にはポリクローナル抗体、モ ノクローナル抗体、Fab断片、一本鎖抗体、キメラ抗体などを含むが、これらに 限定されない。 ターゲット遺伝子タンパク質が細胞内性であって全抗体を用いるときには、イ ンターナリゼーションする抗体が好ましい。しかしながら、ターゲット遺伝子の エピトープと結合する抗体又はFab領域の断片を細胞に送達するためにリポフェ クチンリポソームを用いることができる。抗体断片を用いる場合には、標的タン パク質の結合ドメインに結合する最小の阻害性断片が好ましい。例えば、ターゲ ット遺伝子タンパク質と結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸 配列をもつペプチドを用いることができる。このようなペプチドは当業者に公知 の方法を用いて化学合成又は組換えＤＮＡ法で生産できる（例えば、Creighton ，1983,前出;及びSambrookら，1989，前出、参照）。あるいは、細胞内ターゲッ ト遺伝子エピトープと結合する一本鎖中和抗体も投与できる。このような一本 鎖抗体は例えば、Marascoら（Marasco，W．ら，1993，Proc．Natl．Acad．Sci． USA 90:7889-7893）の記載するような方法を用いて標的細胞集団中で一本鎖抗体 をコードするヌクレオチド配列を発現させることによって、投与できる。 いくつかの場合には、fchd545及びfchd602遺伝子産物のように、ターゲット遺 伝子タンパク質は細胞外性であるか、又は膜貫通タンパク質である。例えば、こ れらの遺伝子産物の１以上の細胞外ドメインに特異的でかつその活性を妨げる抗 体は、心臓血管病の治療に特に有用である。このような抗体は血流から標的ドメ インに直接アクセスできるので、特に有効である。ペプチド投与に適した下記の 5.7節で記載するあらゆる投与法を用いて、阻害性ターゲット遺伝子抗体をその 作用部位に有効に投与することができる。 5.6.2. ターゲット遺伝子活性を回復又は増強する方法 心臓血管病を引き起こすターゲット遺伝子は心臓血管病の状況では低く発現さ れていることがある。上述の表１にまとめ、また下記の７節の実施例で記載する ように、疾患状態の単球ではいくつかの遺伝子がダウンレギュレートされている ことが知られている。特に、ずれ応力に暴露された内皮細胞では、fchd531及びf chd545がダウンレギュレートされている。あるいは、ターゲット遺伝子産物の活 性が低下して、心臓血管病症状の進展を導くのかも知れない。このようなターゲ ット遺伝子発現のダウンレギュレーション又はターゲット遺伝子産物活性の低下 は、疾患状態を引き起こしたり悪化させるかも知れない。 いくつかの場合では、疾患状態でアップレギュレートされるターゲット遺伝子 が防御効果を及ぼす。上述の表１にまとめ、また下記の６節及び７節の実施例で 記載するように、多数の遺伝子が疾患状態の単球及び内皮細胞中でアップレギュ レートされていることが今や知られている。特に、fchd602及びfchd605は各々、 酸化LDLで処理された単球中でアップレギュレートされている。さらに、fchd540 は、ずれ応力をかけた内皮細胞中でアップレギュレートされている。種々の方法 を用いて、このようなターゲット遺伝子の発現、合成又は活性を上昇させ、それ らの遺伝子の疾患状態に応答した防御効果を発揮させることができる。 この節ではターゲット遺伝子の活性レベルを心臓血管病症状が改善されるよう なレベルまで上昇させる方法を記載する。遺伝子の活性レベルは例えば、ターゲ ット遺伝子産物の存在レベルを上昇させるか、あるいは存在する活性ターゲット 遺伝子産物のレベルを上昇させることによって上昇させることができる。 例えば、心臓血管病症状の改善に十分なレベルでターゲット遺伝子産物をこの ような症状を示す患者に投与する。投与には下記の5.7節で記載するあらゆる方 法を用いることができる。下記の5.7.1節に記載する方法を用いて、当業者であ れば正常なターゲット遺伝子タンパク質の有効で無毒性な投与濃度を容易に知る ことができる。 さらに、ターゲット遺伝子タンパク質をコードするＲＮＡ配列を、心臓血管病 症状が改善されるようなターゲット遺伝子タンパク質のレベルを生じるのに十分 な濃度で、心臓血管病症状を示す患者に直接投与できる。化合物の細胞内投与を 達成する下記の5.7節で記載するあらゆる方法、例えばリポソーム投与などの方 法を用いて、このようなＲＮＡ分子を投与できる。ＲＮＡ分子は例えば5.4.2節 で上述した組換え法で作製できる。 さらに、遺伝子置換治療によって患者を治療することができる。ターゲット遺 伝子機能をもつ正常なターゲット遺伝子タンパク質の産生を指示する正常なター ゲット遺伝子又は該遺伝子の一部の１コピー以上を、アデノウイルス、アデノ随 伴ウイルス及びレトロウイルスを含む（ただしこれに限定されない）ベクターを 用いて、リポソームなどのＤＮＡを細胞中に導入するためのその他の分子ととも に、細胞中に挿入する。また、正常なターゲット遺伝子配列をヒト細胞中に導入 するために上述の方法を用いることができる。 次いで、遺伝子配列を発現する正常なターゲット遺伝子を含む細胞、特に自己 由来細胞を、心臓血管病症状の改善を可能にする部位において患者に導入又は再 導入する。このような細胞置換法は、例えばターゲット遺伝子産物が分泌された 細胞外遺伝子産物であるような場合に好ましい。 5.7. 医薬調製物及び投与方法 ターゲット遺伝子の発現、合成及び／又は活性を阻害する同定された化合物を 心臓血管病を治療又は改善をするための治療的有効投与量で患者に投与すること ができる。治療的有効投与量とは、心臓血管病の症状の改善をもたらすのに十分 な化合物の量をいう。 5.7.1. 有効用量 このような化合物の毒性及び治療的有効性は、例えばLD50（集団の50％を致死 にする用量）やED50（集団の50％に治療的有効性をもたらす用量）を決定するた めの細胞培養又は実験動物における標準的薬学的方法によって決定できる。毒性 効果と治療効果との間の用量比を治療インデックスといい、LD50／ED50で表され る。大きい治療係数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を用い ることもできるが、影響されない細胞への損傷の可能性を最少にし、副作用を減 少するように、病気に冒された組織部位へのこのような化合物を標的とする送達 系をデザインするよう注意すべきである。 細胞培養系及び動物研究から得られたデータを用いてヒトに使用するための用 量範囲を設定する。このような化合物の用量は、ほとんど又は全く毒性を伴わな いED50を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。用量は使用する投与形態及 び投与経路により、この範囲内で変動する。本発明の方法で使用するあらゆる化 合物について、治療的有効投与量を細胞培養系からまず推定できる。動物モデル では、細胞培養で決定したIC50（すなわち、症状の最大阻害の半分）を設定でき る。このような情報を用いてヒトでの有用投与量をより正確に決定できる。例え ば血漿中のレベルは高性能液体クロマトグラフィーによって測定できる。 5.7.2. 製剤及び用途 本発明で使用する医薬組成物は、１以上の生理学的に許容できる担体又は賦形 剤を用いて慣用法で処方できる。 従って、該化合物及びその生理学的に許容できる塩及び溶媒和物は、吸入若し くは通気法（口又は鼻から）又は経口、頬、腹腔、若しくは直腸投与による投与 用に処方できる。 経口投与には、医薬組成物は例えば、結合剤（例えば、予めゼラチン化したト ウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロー ス）；充填剤（例えば、ラクトース、微晶質セルロース又はリン酸水素カルシウ ム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊 剤（例えば、ジャガイモ澱粉又は澱粉グリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（ 例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬剤学的に許容できる賦形剤とともに 慣用法で調製した錠剤又はカプセル剤の形態をとりうる。錠剤は、当業者に公知 の方法によりコーティングできる。経口投与用の液体製剤は、例えば溶液、シロ ップ又は懸濁液の形態をとることができ、あるいは使用前に水又はその他の適当 なビヒクルで構成できるように乾燥粉末としてもよい。このような液体製剤は、 懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は食用硬化脂肪） ；乳化剤（例えば、レシチン又はアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、ア ーモンド油、油脂エステル、エチルアルコール又は分画植物油）；及び保存剤（ 例えば、メチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）な どの薬剤学的に許容できる添加物とともに慣用法で調製できる。製剤には緩衝塩 、着香剤、着色剤及び甘昧料も適宜含むことができる。 経口投与用製剤は適当に処方することにより活性化合物を制御放出させること ができる。 頬投与用には、組成物は慣用法で処方した錠剤又はトローチ剤の形態をとりう る。 吸入による投与用には、本発明の化合物を、例えばジクロロジフルオロメタン 、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素又は その他の適当なガスなどの適当な噴射剤を用いることにより、加圧パック又はネ ブライザーからのエアロゾルスプレー製剤の形態で便宜送達する。加圧エアロゾ ルの場合、投与単位は計量された量を送達するためのバルブを装備することによ って決定できる。吸入器又は通気器で使用するゼラチンなどのカプセル及びカー トリッジは、化合物とラクトース又は澱粉などの適当な粉末ベースとの粉末混合 物を含むよう処方される。 化合物は、例えばボーラス注射や連続注射などの注射によって非経口投与する ように処方できる。注射用製剤は、添加の保存料とともにアンプル又は複数投与 量容器中に入れた単位投与量形態とすることができる。組成物は油性又は水性ビ ヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンとしての形態をとることができ、また 懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの処方剤を含むことができる。あるいは 、活性成分を、適当なビヒクル、例えば滅菌された発熱質を含まない水で構成す るように、使用前に粉末形態とすることができる。 化合物は、例えばカカオバターやその他のグリセリドなどの慣用の坐薬ベース を含む坐薬又は保持浣腸のような直腸組成物で処方することもできる。 上述した処方に加えて、化合物はデポ製剤として処方することもできる。この ような長時間作用性製剤は移植（例えば皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射により 投与できる。従って、例えば化合物は適当な重合体又は疎水性物質（例えば、許 容できるオイル中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂とともに、又は例 えばやや溶けにくい塩などのやや溶けにくい誘導体として処方することができる 。 所望するならば、組成物は活性成分を含む１以上の単位投与形態を含むパック 又はディスペンサー装置で提供してもよい。例えばパックは発庖剤（blister） パックのような金属又はプラスチックホイルからなる。パック又はディスペンサ ー装置には投与の説明書を付けてもよい。 5.8. 心臓血管病の異常の診断 5.4.1節で記載するフィンガープリント遺伝子ヌクレオチド配列のような試薬 、ならびに5.4.2節（ペプチド）及び5.4.3節（抗体）で記載する示差的に発現さ れたパスウェイ遺伝子ペプチドに対する抗体を用いて、種々の方法を実施できる 。特に、このような試薬は例えばターゲット遺伝子の突然変異の存在の検出、又 はターゲット遺伝子ｍＲＮＡの過剰若しくは不足発現の検出に用いることができ る。 本明細書で記載する方法は、本明細書に記載する少なくとも１つの特異的フィ ンガープリント遺伝子核酸又は抗−フィンガープリント遺伝子抗体試薬を含んで なる予めパッケージングされた診断キットを用いて実施することができ、これは 心臓血管病症状を示す患者又は心臓血管病を進行させる危険のある患者を診断す るために、例えば臨床現場において便宜用い得る。 フィンガープリント遺伝子が発現しているあらゆる細胞型又は組織、好ましく は単球、内皮細胞、又は平滑筋細胞を下記の診断に使用できる。 5.8.1. フィンガープリント遺伝子核酸の検出 分析すべき細胞型又は組織からのＤＮＡ又はＲＮＡは当業者に公知の方法を用 いて容易に単離できる。診断法は、核酸の精製の必要がない、バイオプシーや切 除から得られた患者組織の組織切片（固定及び／又は凍結）上で直接”in situ ”で実施することもできる。5.1節で記載するような核酸試薬をこのようなin si tu法のプローブ及び／又はプライマーとして使用できる（例えば、Nuovo，G．J. ，1992，PCR in situ hybridization:protocols and application，Raven Press ，NY参照）。 ＲＮＡ又はＤＮＡのフィンガープリント遺伝子ヌクレオチド配列は、例えば心 臓血管病関連の遺伝子構造及び発現を検出するための生物学的サンプルのハイブ リダイゼーション又は増幅アッセイに使用できる。このようなアッセイには、サ ザン又はノーザン分析、一本鎖高次多型分析、in situハイブリダイゼーション アッセイ、及びポリメラーゼ連鎖反応分析を含むが、これに限定されない。この ような分析によって、フィンガープリント遺伝子の発現パターンの定量的側面と 、フィンガープリント遺伝子の発現及び／又は遺伝子組成物の定性的側面の両方 が明らかになる。このような側面には例えば、点突然変異、挿入、欠失、染色体 の組換え、及び／又は遺伝子発現の活性化若しくは不活化を含む。 フィンガープリント遺伝子−特異的核酸分子を検出する好ましい診断法は、例 えば分析すべき細胞型又は組織に由来する核酸を、5.1節で記載するような１以 上の標識した核酸試薬と、このような試薬が興味のある核酸分子中のその相補的 配列と特異的にアニーリングするのに好ましい条件下に、接触させインキュベー トすることを含む。好ましくは、核酸試薬の長さは少なくとも9〜30ヌクレオチ ドである。インキュベーションの後、核酸：フィンガープリント分子ハイブリッ ドから全てのアニーリングしない核酸を除去する。ハイブリダイズしたフィンガ ープリント組織からの核酸の存在を、もしもそのような分子が存在する場合には 、検出する。このような検出法を用いることにより、興味のある組織又は細胞型 由来の核酸を、例えば膜、又はマイクロタイタープレートやポリスチレンビーズ などのプラスチック表面のような固体支持体に固定することができる。この場合 に は、インキュベーション後に、5.1節で記載する型のアニーリングしなかった標 識フィンガープリント核酸試薬は容易に除去される。残存するアニーリングした 標識核酸試薬の検出は当業者に公知の標準的方法を用いて実施できる。 フィンガープリント遺伝子特異的核酸分子を検出する別の診断法は、例えばPC R（Mullis，K.B.，1987，米国特許第4,683,202号に記載の実施態様）、リガーゼ 連鎖反応（Barany，F.，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:189-193）、自 己持続性（self sustained）配列複製（Guatelli，J.C.ら，1990，Proc．Natl． Acad．Sci．USA 87:1874-1878）、転写増幅系（Kwoh，D.Y．ら，1989，Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 86:1173-1177）、Ｑ−βレプリカーゼ（Lizardi，P.M．ら ，1988，Bio/Technology 6:1197）、又はあらゆるその他の核酸増幅法による増 幅と、それに続く当業者に公知の方法を用いる増幅分子の検出を含む。これらの 検出法は、核酸分子が非常に少数で存在する場合の検出に特に有用である。 このような検出法のある態様では、興味のあるＲＮＡ分子からｃＤＮＡ分子を 得る（例えば、ＲＮＡ分子からｃＤＮＡへの逆転写により）。このようなＲＮＡ が単離される細胞型又は組織には、単球、内皮、及び／又は平滑筋を含む（ただ しこれに限定されない）野生型フィンガープリント遺伝子が発現されることが知 られているあらゆる組織を含む。次にｃＤＮＡ中のフィンガープリント配列をPC R増幅反応などの核酸増幅反応のための鋳型として用いる。この方法の逆転写工 程及び核酸増幅工程において合成開始試薬として使用する核酸試薬（例えばプラ イマー）は、5.1節で記載するフィンガープリント遺伝子核酸試薬の中から選択 される。このような核酸試薬の好ましい長さは、少なくとも15〜30ヌクレオチド である。増幅産物を検出するには、核酸増幅を放射能又は非放射能で標識したヌ クレオチドを用いて実施する。あるいは、増幅産物が標準の臭化エチジウム染色 又はあらゆるその他の適当な核酸染色法で可視化できるのに十分な程度に増幅産 物を生産する。 主として１つの核酸配列の検出に焦点をあてる方法に加えて、5.5.4節で記載 するフィンガープリントプロフィールもこのような検出法で評価できる。例えば 、ノーザン分析及び／又はRT-PCRなどの5.1.2節で記載する示差的ディスプレイ 法を用いてフインガープリントプロフィールを作製する。このようなフィンガー プリントプロフィールの作製及び確証に5.4.1節で記載するあらゆる遺伝子配列 をプローブ及び／又はPCRプライマーとして使用できる。 5.8.2. フィンガープリント遺伝子ペプチドの検出 5.4.3節で記載する野生型又は突然変異型フィンガープリント遺伝子ペプチド に対する抗体も、例えば本明細書で記載する心臓血管病の診断及び予後判定に使 用できる。このような診断法は、フィンガープリント遺伝子タンパク質の発現レ ベルの異常、又はフィンガープリント遺伝子タンパク質の構造及び／又は組織、 細胞、又は細胞下（subcellular）での位置の異常の検出に使用できる。構造的 相違には、例えば正常なフィンガープリント遺伝子タンパク質と比較した突然変 異型フィンガープリント遺伝子タンパク質のサイズ、電気陰性度、又は抗原性の 相違を含む。 分析すべき組織又は細胞型からのタンパク質は、ウエスタンブロット分析を含 む（ただしこれに限定されない）当業者に公知の方法を用いて容易に検出又は単 離できる。ウエスタンブロット分析を行う詳細な説明はSambrookら（1989、前出 ）の18章を参照されたい。ここで使用するタンパク質の検出及び単離方法は、例 えばHarlowとLaneの記載する方法（Harlow，E．and Lane，D.，1988，”Antibod ies:A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spr ing Harbor，New York）によっても実施でき、この文献の全てを参照としてここ に援用する。 野生型又は突然変異型のフィンガープリント遺伝子ペプチド分子を検出するた めの好ましい診断法には、例えばフィンガープリント遺伝子ペプチドと抗−フィ ンガープリント遺伝子特異的ペプチド抗体との間の相互作用によって検出するイ ムノアッセイを含む。 例えば、本発明で有用な5.4.3節で記載するような抗体又は抗体断片を、野生 型又は突然変異型のフィンガープリント遺伝子ペプチドの存在の定量的又は定性 的検出に使用できる。これは例えば、蛍光標識した抗体（下記参照）を光学顕微 鏡、フローサイトメトリー、又は蛍光定量的検出とともに用いる免疫蛍光法によ って実施できる。フィンガープリント遺伝子ペプチドが細胞表面で発現している ときにはこの方法は特に好ましい。 本発明で有用な抗体（又はその断片）はさらに、フィンガープリント遺伝子ペ プチドをin situ検出するための免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡において組織学的 に使用することもできる。in situ検出は、患者から組織学的標本を取り、これ に本発明の標識抗体を適用することによって実施できる。生物学的サンプル上の 標識抗体（又はその断片）に上乗せすることにより抗体（又はその断片）を適用 するのが好ましい。このような方法を用いることにより、フィンガープリント遺 伝子ペプチドの存在のみでなく、試験組織中におけるその分布も決定することが できる。本発明の方法を用いることにより、このようなin situ検出を行うため のあらゆる広範な組織学的方法（染色法など）を修飾し得ることは当業者であれ ば容易に認識できるであろう。 野生型又は突然変異型のフィンガープリント遺伝子ペプチドのイムノアッセイ には典型的に、生物学的流体、組織抽出物、新たに回収した細胞、又は組織培養 で予めインキュベートしておいた細胞のような生物学的サンプルを、フィンガー プリント遺伝子ペプチドを同定できる検出可能に標識された抗体の存在下にイン キュベートし、そして当業者に公知の多くの方法のいずれかによって結合抗体を 検出することを含む。 生物学的サンプルを、細胞、細胞粒子又は可溶性タンパク質を固定できるニト ロセルロースのような固相支持体又は担体又はその他の固体支持体と接触させこ れに固定する。次いで支持体を適当なバッファーで洗浄し、検出可能に標識され たフィンガープリント遺伝子特異的抗体で処理する。次いで固相支持体をバッフ アーで２度目に洗浄して未結合抗体を除去する。固相支持体に結合した標識の量 を次いで慣用法により検出する。 ”固相支持体又は担体”とは、抗原又は抗体を支持できるあらゆる支持体を意 味する。よく知られた支持体又は担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピ レン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修飾セル ロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、及び磁鉄鉱を含む。担体の性質は本発明 の目的にとってはいくらか可溶性か又は不溶性のものである。支持体物質は、結 合分子が抗原又は抗体と結合できる限り、実質上いかなる構造的配置をもってい てもよい。従って、支持体の配置はビーズのような球状であっても、試験管の内 側表面又はロッドの外側表面のような円筒状であってもよい。あるいは、表面は シート、試験ストリップなどのように平面であってもよい。好ましい支持体には ポリスチレンビーズを含む。当業者であれば抗体又は抗原を結合するための他の 多くの適当な担体を知っているし、また日常的実験を用いてこれを確認できるで あろう。 あるロットの抗−野生型又は突然変異型フィンガープリント遺伝子ペプチド抗 体の結合活性は公知の方法により決定できる。当業者は日常的実験を用いて決定 したそれぞれについての作動可能で最適なアッセイ条件を決定できる。 フィンガープリント遺伝子ペプチド−特異的抗体を検出可能に標識する方法の １つは、これを酵素と結合してエンザイムイムノアッセイ（EIA）に用いる（Vol ler,"The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)"，Diagnostic Horizons 2:1-7，1978，Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersvi lle，MD;Vollerら，J．Clin．Pathol．31:507-520(1978);Butler，Meth．Enzymo l．73:482-523(1981);Maggio，(ed.)Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Rat on，FL，1980;Ishikawa,ら，(eds.)Enzyme Immunoassay，Kagaku Shoin，Tokyo ，1981）。抗体に結合した酵素は、適当な基質、好ましくは色原体基質と、例え ば分光光学的、蛍光定量的又は可視手段によって検出できるような化学的部分を 生じるように反応する。抗体を検出可能に標識するために用いる酵素には、リン ゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラ ーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロ ゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキ シダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダ ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グ ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリン エステラーゼを含むが、これに限定されない。酵素のための色原体基質を用いる 比色法によって検出を行うことができる。基質の酵素反応の程度を同様に調製し た標準と目視で比較することによっても検出を行うこと ができる。 その他の各種イムノアッセイのいずれを用いても検出を行うことができる。例 えば、抗体又は抗体断片を放射能標識することにより、フィンガープリント遺伝 子野生型又は突然変異型ペプチドをラジオイムノアッセイ（RIA）を用いて検出 できる（例えば、Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society， March，1986,参照によりここに援用する）。放射性同位体はガンマカウンター又 はシンチレーションカウンター又はオートラジオグラフィーのような手段を用い て検出できる。 抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識された抗体を適切な 波長の光に暴露し、蛍光によってその存在を検出する。最も普通に用いられる蛍 光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエ リスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフ ルオレスアミンである。 例えば152Eu又はその他のランタニド系のような蛍光発生金属を用いて抗体を 検出可能に標識することもできる。これらの金属はジェチレントリアミン五酢酸 (DTPA)又はエチレンジアミン四酢酸(EDTA)のような金属キレート基を用いて抗体 に結合できる。 抗体を化学発光化合物に結合することによって抗体を検出可能に標識すること もできる。次いで化学発光標識された抗体の存在を、化学反応中に生じる発光の 存在を検出することによって測定する。特に有用な化学発光標識化合物の例とし ては、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル、 イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。 同様に、生物発光化合物を本発明の抗体の標識に用いることもできる。生物発 光は生物系で見いだされた化学発光の一種であり、ここでは触媒タンパク質が化 学発光反応の有効性を増加する。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出 することにより決定できる。標識の目的にとって重要な生物発光化合物は、ルシ フェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。 5.8.3. 心臓血管病状態のイメージング いくつかの場合では、本明細書で同定した示差的に発現した遺伝子産物は、心 臓血管病状態下ではアップレギュレートされて影響を受けた組織の表面で発現す る。このようなターゲット遺伝子産物は、病気の診断及び治療を指示する目的で 、損傷を受けたり病気の心臓血管組織を非侵入的にイメージングすることができ る。例えば、このような示差的に発現する遺伝子産物には、動脈硬化症発生の原 因となるアテローム性動脈硬化症特異的付着分子、又は２節で上述した酸化LDL に応答してアップレギュレートされる単球スカベンジャー受容体を含むが、これ に限定されない。あるいは、虚血症／再灌流に悩む組織、あるいはアテローム性 動脈硬化症又は再狭窄病変をもつ他の組織においては、別のこのような表面タン パク質が特異的にアップレギュレートされているかも知れない。 後記第６節の実施例に記載するように、fchd602遺伝子は、疾患状態の単球で アップレギュレートされている遺伝子である。さらに、そのfchd602遺伝子は、 複数の膜貫通ドメインを含有する新規なタンパク質をコードする。アテローム性 動脈硬化症の発症および進行に役割を果たす単球で発現されたfchd602だけでな く、そのような疾患状態の単球でもアップレギュレートされている。したがって 、fchd602遺伝子産物より、心臓血管病の状態をイメージングするための優れた 道具が得られる。 この方法は、fchd545遺伝子産物のような他の膜貫通ターゲット遺伝子産物に 対しても同様に応用できる。下記７節の実施例に記載されるとおり、そのfchd54 5遺伝子は、新規なアニオンチャンネルをコードし、複数の膜貫通ドメインを含 む。疾患状態にある組織と反対に、fchd545遺伝子産物は、正常な組織では容易 に検出される可能性があるため、心臓血管病症状をイメージングする優れた道具 も得られる。 この本発明の方法の使用例を示す実施例は、下記９節に記載する。上記5.6.1. ２節に記載したように、このような表面タンパク質（例えば、fchd602およびfch d545遺伝子産物）に特異的に結合するモノクローナルおよびポリクローナル抗体 は、in vivo組織イメージング技術によって心臓血管病の診断に使用できる。fch d545遺伝子産物に対して誘導されるこのような抗体は、下記10節の実施例 で詳細に記載する。ターゲット遺伝子産物に特異的な抗体、または好ましくはそ の抗原結合断片は、検出可能なシグナルを発生し、心臓血管病を有することが予 測される被験者（ヒトまたは動物）に投与される標識（例えば、ガンマ線を放射 する放射性同位体）に複合される。十分な時間の後、検出可能な標識抗体を、罹 患したまたは損傷を受けた組織部位に局在させ、標識によって発生するシグナル をフォトスキャニング装置によって検出する。次いで、検出シグナルを組織の画 像に変換する。この画像により、in vivoでの組織の局在化が可能となる。次い で、このデータを使用して適切な治療方策を開発することができる。 一般に組織イメージングに使用するには抗体分子全体よりも抗体断片の方が好 ましい。抗体断片は全抗体分子より迅速に分配されるので迅速に組織（１つまた は複数）に蓄積される。したがって、抗体全体を使用するよりも短い時間で画像 を得ることができる。また、これらの断片は、より迅速に組織から除去され、そ の結果バックグラウンド信号が低くなる。たとえば、Haberらの米国特許第4,036 ,945号、Goldenbergらの米国特許第4,331,647号参照。二価の抗原結合性断片(Fa b')2および一価のFabが特に好ましい。このような断片は、よく知られているい くつかのプロトコルのいずれかに従って全イムノグロブリン分子を酵素ペプシン またはパパインで消化することによって調製することができる。罹病または損傷 組織の位置確定用のモノクローナル抗体に結合するのに適したタイプの標識とし ては、放射性標識（すなわち、放射性同位体）、蛍光性標識およびビオチン標識 があるがこれらに限られることはない。 抗体または抗体断片を標識するのに使用することができる放射性同位体のうち 、ガンマ線エミッター、ポジトロンエミッター、Ｘ線エミッターおよび蛍光エミ ッターが位置確定に適している。抗体標識用に適した放射性同位体としては、ヨ ウ素-131、ヨウ素-123、ヨウ素-125、ヨウ素-126、ヨウ素-133、臭素-77、イン ジウム-111、インジウム-113m、ガリウム-67、ガリウム-68、ルテニウム-95、ル テニウム-97、ルテニウム-103、ルテニウム-105、水銀-107、水銀-203、レニウ ム-99m、レニウム-105、レニウム-101、テルル-121m、テルル-122m、テルル-125 m、ツリウム-165、ツリウム-167、ツリウム-168、テクネチウム-99mおよびフッ 素-18がある。ハロゲンは多かれ少なかれ相互に 互換的に使用することができる。というのは、ハロゲンで標識された抗体および ／または通常のイムノグロブリンはほとんど同じ動力学および分布ならびに類似 の代謝性をもっているからである。 ガンマ線エミッターであるインジウム-111とテクネチウム-99mが好ましい。す なわち、これらの放射性金属はガンマカメラで検出可能であり、in vivoでのイ メージングに好適な半減期をもっているからである。抗体は、DTPA（ジエチレン トリアミンペンタ酢酸）のような複合金属キレート剤によってインジウム-111ま たはテクネチウム-99mで標識することができる。Krejcarekら、1977年、Biochem ．Biophys．Rec．Comm．77:581、Khawら、1980年、Science 209:295、Gansowら の米国特許第4,472,509号、Hnatowichの米国特許第4,479,930号（これらの教示 は引用したことにより本明細書に含まれているものとする）参照。 モノクローナル抗体に結合するのに適した蛍光性化合物としては、フルオレセ インナトリウム、フルオレセインイソチオシアネートおよびテキサスレッドスル ホニルクロライドがある。DeBelder & Wik、1975年、Carbohydrate Research 44 :254-257参照。当業者であれば、モノクローナル抗体を標識するのに適した他の 蛍光性化合物を知っているであろうし、または通常以上の実験をすることなく確 かめることができるであろう。 ６．実施例：例Ａに応答して示差的に発現する遺伝子の同定：in vitro泡沫細胞 の例 本発明によると、示差的ディスプレイを用いて、アテローム形成の間に泡沫細 胞が発生する条件をシミュレートするように処理した単球で示差的に発現する遺 伝子を検出することができる。例Ａを使用することによって、新規な遺伝子fchd 602およびfchd605を同定した。fchd602およびfchd605は両方とも、酸化LDLで処 理された疾患状態下でアップレギュレートされている。 fchd602遺伝子産物は、複数の膜貫通ドメインを含み、ラットのC1-6遺伝子に 配列類似性を示す。該C1-6遺伝子は、ラットの肝臓の再生において誘発され、イ ンシュリン誘導性であり、複数の膜貫通ドメインも含む(Diamond，R.H.ら、J．B iol．Chem.，268:15185-15192、1993年)。fchd605遺伝子産物は、マウスのgly9 6遺伝子(Charles，C.H.，Oncogene，8:797-801，1993年)、およびEST T49562に 対して配列類似性を示す。 これら２つの遺伝子のアップレギュレーションの知見より、泡沫細胞の形成の 過程で単球についてのフィンガープリントプロフィール、例えばマーカーが得ら れる。このプロフィールは、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化 症、虚血症／再灌流、高血圧、再狭窄、および動脈の炎症を含めた心臓血管病の 治療及び診断に使用できる。 さらに、膜貫通タンパク質として、fchd602遺伝子産物は、他の化合物によっ て単球の表面上で容易に誘発される(access)かまたは検出できる。したがって、 治験での化合物の有効性をモニターする場合と同様に、診断システムで心臓血管 病の状態を検出するのに優れた標的が得られる。さらに、この遺伝子産物の細胞 外ドメインより、それに結合する化合物を同定するための特に有効なスクリーニ ングシステムの設計を考慮した標的が得られる。このような化合物は、膜貫通遺 伝子産物の活性を調節することによって、心臓血管病を治療するのに有用である 。 6.1. 材料と方法 6.1.1. 細胞の単離と培養 クエン酸リン酸デキストロース(Sigma)３mlを入れた20mlの冷却vacutainerチ ューブに血液（〜200ml）を吸い込んだ。次に血液を50mlのチューブにプールし 、Beckman GS-6R中において1250RPM、４℃で15分間遠心した。次いで透明な上層 （〜25ml）をピペットで取って捨て、代わりに同容量の４℃のPBSを入れた。そ の後血液を混合し、再び2680RPM、４℃で15分間遠心した。次いで上層を取って 捨て、界面のバフィーコートを〜５ml取り出し、別の50mlのチューブに入れ、ピ ペットを20mlのPBSで洗浄した。細胞をＴフラスコに入れ、４℃で16時間保存し た。次に細胞サンプルを少し取り出し、血球計を用いて計数した。次いでバフィ ーコート集団中の最終赤血球細胞濃度をPBSで1.5×109/mlに調節し、その細胞を 室温に戻した後Leucoprepチューブ(Becton Dickinson)に入れ、2300RPM、25℃で 25分間遠心した。透明な上層を取って捨て、ゲル上の濁った層を取り出して50ml のチューブにプールした。次にサンプル をPBS(25℃)で50mlに希釈し、1000RPMで10分間遠心した。次いで上清を除き、ペ レットを50mlのPBSに再懸濁させた。この手順をさらに三回繰り返した。最後の 遠心後細胞を小容量のPBSに再懸濁させ、計数した。 単球を拡げる前に組織培養皿をウシコラーゲンで被覆した。1/6容量の7×RPMI （JRH Biosciences）をVitrogen 100コラーゲン（Celtrix）に入れた後これをRP MIで1:10に希釈して最終濃度を0.35mg/mlとした。次にコラーゲン混合物をプレ ートに加え(2.5ml/100mm皿)、少なくとも１時間37℃にしてゲルを形成させた。 ゲルが生成した後RPMIを除き、細胞をRPMI/10％血漿由来血清(PDS)に加えた。PD Sは、1/10倍容量の3.8％クエン酸ナトリウムを含有する排気し冷却したチューブ に血液を吸い込んで調製した。次に血液を新しいSorvallチューブに移し、14,00 0〜16,000RPM、４℃で20分間遠心した。血漿層を取り、1/50倍容量のIMのCaCl2 を加えた新しいチューブにプールした。血漿を混合し、そのサンプルを新しいSo rvallチューブに入れ、37％で２時間インキュベートしてフィブリンクロットを 形成させた。次にこのクロットをピペットで掻き混ぜて収縮させ、チューブを14 ,500RPM、25℃で20分間遠心した。上清を集め、プールし、56℃で熱不活化させ てから滅菌濾過し凍結した。 精製したヒト単球を、５単位／mlのGenzyme組換えヒトMCSFを含有する10％PDS /RPMI中で５日間培養した後、LDL酸化LDL、アセチル化LDL（LDLは全て50μg/ml ）、リゾホスファチジルコリン（Sigma、37.5μM）またはホモシステイン（Sigm a、１mM）で処理した。これらの試薬と共に２時間から３日間までの範囲の期間 インキュベーションした後、培地を除去し、細胞をＲＮＡ溶菌バッファーに溶解 させ、上記第6.1節に記載したようにしてＲＮＡを調製した。 リポタンパク質 酸化させるため、最初にヒトLDL（Sigam）をPBSで１mg/mlに 希釈した後、４℃でPBSに対して一晩透析した。次に、LDLをPBSで0.3mg/mlに希 釈した。次いで、CUSO4・5H2Oを５μMの最終濃度まで加え、その溶液を37℃のイ ンキュベーターにおいてＴフラスコ中で24時間インキュベートした。次にLDL溶 液を４℃で0.15M NaCl/0.3mM EDTAに対して２日間数回交換しながら透析した後 取り出し、Amiconスピンカラムを用いて１時間4000RPM、４℃で遠心することに よって遠心分離した。 アセチル化のためには、１mlの5mg/ml LDLを４℃のシェーカー上の氷上で15ml のチューブ中の１mlのNaOAc飽和溶液に加えた。８μlの無水酢酸を一度に２μl ずつ１時間かけて加えた。次にLDLを４℃で48時間0.15M NaCl/0.3mM EDTAに対し て数回交換しながら48時間透析した。誘導体化したLDLの最終濃度はOD280で分析 した天然LDLの希釈曲線と比較することによって決定した。いずれの場合も希釈 剤としては0.15M NaCl/0.3mMEDTAを使用した。 6.1.2. 実例材料の分析 示差的ディスプレイ ：ＤＮＡの除去 ：ＲＮＡペレットをH2Oに再懸濁させ、OD260で分光光度法によって 定量した。次に、サンプルのほぼ半分をDNAseIで処理して夾雑する染色体ＤＮＡ を除去した。以下の手順を用いてPCRによりＲＮＡを増幅した。50μlのＲＮＡサ ンプル(10〜20μg)、5.7μlの10×PCRバッファー（Perkin-Elmer/Cetus）、１μ lのRNAse阻害剤(40単位/μl)（Boehringer Mannheim、ドイツ）を一緒に混合し 、ボルテックスで掻き混ぜ、簡単に遠心した。２μlのDNAse I(10単位/μl)（Bo ehringer Mannheim）を反応混合物に加え、これを37℃で30分間インキュベート した。DEPC H2Oで全容量を200μlにし、フェノール／クロロホルムで一回、クロ ロホルムで一回抽出し、そして、20μlの３Ｍ NaOAc、pH4.8(DEPC処理したもの) 、500μlの無水ETOHを加えドライアイス上で１時間または−20℃で一晩インキュ ベートすることによって沈殿させた。こうして沈殿したサンプルを15分間遠心分 離し、ペレットを70％ETOHで洗浄した。サンプルを再度遠心分離し、残った液体 を吸引し、ペレットを100μlのH2Oに再懸濁させた。ＲＮＡの濃度はOD260で読み 取ることによって測定した。 第一ストランドｃＤＮＡ合成：各ＲＮＡサンプルに対して重複反応を平行して 行なった。400ngのRNA+DEPC H2O(合計容量10μl)を４μlのT11XX逆プライマー( 10μM)（Operon）に加えた。各実験で使用した特異的プライマーは上記第４節の 図面の説明に挙げてある。混合物を70℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変 性させた後室温にした。以下の成分を含有する26μlの反応混合物を各変性ＲＮ Ａ／プライマーサンプルに加えた。８μlの５×First Strand Buffer （Glbco/BRL、Galthersburg、MD）、４μlの0.1M DTT（Gibco/BRL）、２μlのRN Ase阻害剤(40単位/μl)（Boehringer Mannheim）、４μlの200μM dNTP混合物、 ６μlのH2O、２μlのSuperscript逆転写酵素(200単位/μl)（Gibco/BRL）。反応 混合物を穏やかに混合し、42℃で30分間インキュベートした。次に60μlのH2O( 最終容量＝100μl)を加え、サンプルを85℃で５分間変性させ、−20℃で保存し た。 PCR 反応：13μlの反応混合物を氷上の96ウェルプレートの各チューブに加えた 。この反応混合物は、6.4μlのH2O、2μlの10×PCRバッファー（Perkin-Elmer） 、２μlの20μM dNTP、0.4μlの35S dATP(12.5μCi/μl、合計50μCi)(Dupont/N EN)、２μlの前方(for-)プライマー(10μM)（Operon）、および0.2μlのAmpliTa qポリメラーゼ(5単位/μl)（Perkin-Elmer）を含有していた。次に、２μlの逆( rev-)プライマー(T11XX、10μM)を各チューブの側に加えた後、５μlのｃＤＮＡ もこれらチューブの側（これらはまだ氷上にあった）に加えた。各実験で使用し た特異的プライマーは以下の通りである： fchd602：rev-T11XC及びfor-GTGAGGCGTC fchd605：rev-T11XC及びfor-TGGACCGGTG チューブに蓋をし、混合し、遠心管中で1000RPMまで上げた後すぐに氷に戻した 。このPCR機（Perkin-Elmer 9600）は、示差的ディスプレイ用に以下のようにプ ログラムを組んだ。 94℃ ２分 *94℃ 15秒 *40℃ ２分 *＝×40 *ramp 72℃ １分 *72℃ 30秒 72℃ ５分 4℃ 保持 このPCR機が94℃に達したときプレートを氷から取り出し、Perkin-Elmer 96 00PCR機に直接入れた。PCRの後15μlの負荷(loading)染料(80％ホルムアミド、1 0mM EDTA、１mg/mlのキシレンシアノール、1mg/mlのブロモフェノールブル ーを含有する）を加えた。負荷染料と反応混合物を混合し、85℃で５分間インキ ュベートし、氷で冷却し、遠心分離し、氷上に載せた。各チューブから約４μl を取ってprerun(60V)６％アクリルアミドゲルに載せた。このゲルを約80Vで、最 上の染料前面が底から約１インチに達するまで走らせた。ゲルを3MM紙（Whatman Paper、英国）に移し、真空中で乾燥した。バンドはオートラジオグラフィーで 可視化した。 バンドの単離と増幅：示差的に発現したバンドを、乾燥したゲルからかみそリ の刃で切り出し、100μlのH2Oと共にマイクロ遠心管(microfuge tube)に入れ、 ５分間100℃に加熱し、ボルテックスで掻き混ぜ、再び５分間100℃に加熱し、再 度ボルテックスで掻き混ぜた。冷却後、100μlのH2O、20μlの3Ｍ NaOAc、1μl のグリコーゲン(20mg/ml)、および500μlのエタノールを加え、冷却した。遠心 分離後ペレットを洗浄し、10μlのH2Oに再懸濁させた。 次に、こうして単離した示差的に発現したバンドを、以下の反応条件を用いて PCRにより増幅した。 58μl H2O 10μl 10×PCRバッファー 10μl 200μm dNTP 10μl 10μM 逆プライマー 10μl 10μM 前方プライマー 1.5μl 増幅したバンド 0.5μl AmpliTaqポリメラーゼ（５単位/μl）（Perkin-Elmer） PCRは、本節で示差的ディスプレイに関して前記したプログラムを用いて実施 した。PCRの後、グリセロール負荷染料を加え、サンプルを２％調製用TAE/Bioge l（Bio101、La Jolla、CA）アガロースゲルにかけ、溶出した。次いでバンドを かみそりの刃でゲルから切り出し、室温にて15分間ボルテックスで掻き混ぜ、Bi o101製のMermaidキットを用い、マイクロ遠心管中で３容量のMermaid高塩結合性 溶液と８μlの再懸濁したglassfogを加えることによって精製した。次にglassfo gをペレット化し、エタノール洗浄溶液で３回洗浄した後、ＤＮＡを50℃で10μl 中に二回溶出させた。サブクローニング：増幅したバンドをサブクローニングするにはTAクローニン グキット（Invitrogen、San Diego、CA）を用いた。典型的な連結反応混合物は ４μlの無菌H2O、１μlの連結バッファー、２μlのTAクローニングベクター、２ μlのPCR産物、および１μlのT4ＤＮＡリガーゼから成っていた。PCR産物の容量 は変えることができるが、PCR産物とH2Oの合計容量は常に６μlとした。（ベク ターのみを含む）連結混合物は細菌の形質転換前に12℃で一晩インキュベートし た。TAクローニングキットのコンピテント細菌(INVaF'：endal，recAl，hsdR17( r-k，m+k)，supE44，λ-，thi-1，gyrA，relAl,φ80lacZαΔM15Δ(lacZYA-argF )，deoR+，F'）を氷上で解凍し、各チューブに２μlの0.5Ｍβ-メルカプトエタ ノールを加えた。各連結混合物の２μlを各チューブのコンピテント細胞(50μl) に加え、ボルテックスで掻き混ぜることなく混合し、氷上で30分間インキュベー トした。次にチューブを42℃の浴にちようど30秒入れた後、２分間氷に戻した。 次いで、450μlのSOC培地（Sambrookら、1989年、上掲）を各チューブに加えた 後37℃で１時間振盪した。次に細菌をペレット化し、〜200μlのSOCに再懸濁さ せ、X-galおよび60μg/mlのアンピシリンを含有するLuriaブロス寒天プレートに 撒き、37℃で一晩インキュベートした。次に白色のコロニーを摘出し、PCRを用 いてインサートに関してスクリーニングした。 ２μlの10×PCRバッファー、1.6μlの2.5mM dNTP、0.1μlの25mM MgCl2、0.2 μlのM13逆プライマー(100ng/μl)、0.2μlのM13前方プライマー(100ng/μl)、0 .1μlのAmpliTaq（Perkin-Elmer）、および15.8μlのH2Oを含有するマスターミ ックスを作成した。40μlのマスターミックスサンプルを96ウェルプレートのチ ューブに入れ、PCRの前にピペットチップで全細菌を加えた。PCR機（Perkin-Elm er 9600）は、インサートスクリーニング用に以下のようにプログラムを組んだ 。 94℃ ２分 *94℃ 15秒 *47℃ ２分 *＝×35 *ramp 72℃ 30秒 *72℃ 30秒 72℃ 10分 4℃ 保持 反応生成物を２％アガロースゲル上で溶出し、ベクターコントロールと比較し た。インサートを含有するベクターを有するコロニーをLB/Ampプレート上に画線 することによって精製した。そのような菌株からベクターを単離し、Applied Bi osystems Automated Sequencer（Applied Biosystems，Inc．Seattle，WA）を用 いて配列を解析した。 ノーザン解析：ノーザン解析を実施して、増幅したバンドに対応する遺伝子の 示差発現を確認した。ｍＲＮＡを検出するのに使用したプローブは以下のように して合成した。典型的には２μlの増幅したバンド(〜30ng)、7μlのH2O、および ２μlの10×Hexanucleotide mix（Boehringer-Mannheim）を混合し、５分間95℃ に加熱した後、氷上で冷却した。増幅したバンドの容量は変えることができるが 、バンドとH2Oの合計容量は常に9μlとした。3μlのdATP/dGTP/dTTP混合物(各々 0.5mMで1:1:1)、5μlのα32P dCTP(3000Ci/mM、合計50μCi)（Amersham，Arling ton，Heights，IL）、およびｌμlのKlenow(２単位)(Boehringer-Mannheim)を混 合し、37℃でインキュベートした。１時間後、30μlのTEを加え、反応混合物をB iospin-6（登録商標）カラム（Biorad，Hercules，CA）上に載せ、遠心分離した 。溶出液のサンプル１μlを用い、scintillantを用いたシンチレーションカウン ターで取込みを測定して、106cpm/μlの取込みが達成されたことを確認した。 サンプルを変性アガロースゲル上に載せた。300mlの１％ゲルは、３ｇのアガ ロース（SeaKem（登録商標）LE，FMC BioProducts，Rockland，ME）と60mlの５ ×MOPSバッファーを210mlの無菌H2Oに加えることによって作成した。5×MOPSバ ッファー(0.1Ｍ MOPS(pH7.0)、40mM NaOAc、５mM EDTA(pH8.0))は、20.6gのMOPS を800mlの50mM NaOAc(800mlの無菌H2O中の13.3mlの3Ｍ NaOAc pH4.8)に加え、次 に10ＭのNaOHでpHを7.0に調節し、0.5MのEDTA(pH8.0)を10ml加え、最終容量1Lに なるまでH2Oを加えることによって作成した。混合物を融解するまで加熱した後5 0℃に冷却し、この時点で５μlの臭化エチジウム(5mg/ml)と30mlの37％ホルムア ルデヒドのゲルを加えた。このゲルをすば やく回転させて混合した後すぐに注いだ。 ２μｇのＲＮＡサンプル、１×最終1.5×ＲＮＡ負荷染料（60％ホルムアミド 、９％ホルムアルデヒド、1.5×MOPS、0.075％XC/BPB染料）およびH2Oを混合し て最終容量を40μlとした。チューブを５分間65℃に加熱した後氷上で冷却した 。10μgのＲＮＡ MW標本（New England Biolabs，Beverly，MA）も染料で変性さ せ、ゲル上に載せた。ゲルをMOPS泳動バッファー中32Vで一晩泳動した。 次にゲルを0.5μg/mlの臭化エチジウムに45分間、50mMのNaOH/0.1ＭのNaClに3 0分間、0.1ＭのTris(pH8.0)に30分間、そして20×のSSCに20分間浸した。各々の 浸漬ステップは室温で振盪しながら行なった。次にゲルを蛍光ルーラーに沿って 写真に取った後、Sambrookら、1989年、上掲の方法に従ってHybond-Nメンブラン (Amersham)を用いて20×のSSCに一晩ブロッティングした。 ノーザンブロット・ハイブリダイゼーションは以下のように行った。プレハイ ブリダイゼーションでは、10mlのラピッド−hyb溶液（Amersham）を含有するロ ーラーボトルにブロットを入れ、少なくとも１時間、65℃のインキュベーターに 入れた。ハイブリダイゼーションでは、次いで１×107cpmのプローブを95℃まで 加熱し、氷上で冷却し、10mlのラピッド−hyb溶液に添加した。その後、プレハ イブリダイゼーション溶液をプローブ溶液に交換し、３時間、65℃でインキュベ ートした。次の日、室温で20分間２×SSC/0.1％SDSで一回、65℃で15分間0.1×S SC/0.1％SDSで二回、ブロットを洗浄し、その後プラスチックラップで覆い、照 射にかけた。 RT-PCR 解析：RT-PCRを実施して、増幅したバンドに対応する遺伝子から示差的 に発現したｍＲＮＡのレベルを検出した。第一ストランド合成は、20μlのDNase を加えたＲＮＡ(〜２μg)、１μlのオリゴdT(Operon)（１μg）、および9.75μl のH2Oを混合することによって実施した。サンプルを10分間70℃に加熱した後、 氷上で冷却した。反応混合物に10μlの第一ストランドバッファー(Gibco/BRL)、 ５μlの0.1Ｍ DTT、l.25μlの20mM dNTP(最終500μM)、1μのRNAsin(40単位/μl )(Boehringer Mannheim)および2μlのSuperscript逆転写酵素(200単位/μl)(Gib co/BRL)を加え、１時間42℃にインキュベートした後、５分間85℃にし、−20℃ に保存した。 この逆転写したサンプルでPCRを実施した。各反応混合物は、2μlの10×PCRバ ッファー、14.5μlのH2O、0.2μlの20mM dNTP(最終200μM)、0.5μlの20μM前方 プライマー（最終0.4μM)、0.5μlの20μM逆プライマー(最終0.4μM)、0.3μlの AmpliTaqポリメラーゼ（Perkin-Elmer/Cetus）、２μlのｃＤＮＡ希釈または陽 性コントロール(〜40pg)を含有していた。各実験で使用した特異的プライマーは 上記第４節の図面の説明に挙げてある。サンプルを94℃のPCR 9600機に入れた（ 高温開始）。このPCR機は以下のようにプログラムを組んだ。 94℃ ２分(サンプル負荷) *94℃ 45秒 *＝35× *55℃ 45秒 *72℃ ２分 72℃ ５分 4℃ 保持 反応はｃＤＮＡ希釈系列に対して行ない、いろいろなサイクルで72℃のステッ プ中にチューブを機械から取り出した。反応生成物を1.8％アガロースゲル上で 溶出させ、臭化エチジウムで可視化した。遺伝子の回収 ：該遺伝子の一部を含有した増幅配列をサブクローニングし、次い で対応する遺伝子をコードするｃＤＮＡを回収するのにそれぞれ使用した。ベク ターＤＮＡから得たサブクローン化挿入ＤＮＡを単離し、6.1.2節で上述したよ うに32Ｐで標識することによってプローブを作製した。fchd602配列を含有する 標識挿入ＤＮＡは、ヒトマクロファージ細胞系U937から作製したｃＤＮＡライブ ラリーをプローブするのに使用した。fchd605配列を含有する標識挿入ＤＮＡは 、ヒトの一次血液単球から作製したｃＤＮＡライブラリーをプローブするのに使 用した。ｃＤＮＡライブラリーを作製し、当業界で通常行われている方法にした がってスクリーニングを行った(Sambrookら、前掲、1989年参照)。プローブによ って検出されたライブラリーから得たプラークを単離し、ファージベクター内の ｃＤＮＡインサートを配列決定した。 RACE法キットを、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングに対する代替物として 、またはｃＤＮＡライブラリーが全長遺伝子をコードするクローンを生じない 場合に該遺伝子の隣接配列を得るために使用した。取扱説明書にしたがって操作 を行った(Clontech，CA、Palo Alto):Chenchikら，CLONTECHniques(X)1，5-8，1 995年;Barnes，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:2216-2220，1994年;およびChen gら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA91:5695-5699)。増幅配列、またはｃＤＮＡラ イブラリーからの単離物から得られた配列に基づいて、プライマーを設計した。 ヒトの一次血液単球から、fchd605の鋳型ｍＲＮＡを単離した。 6.1.3. ターゲット遺伝子の染色体上位置確定 ヌクレオチド配列が決定されれば特定の染色体上の遺伝子の存在が検出される 。ターゲット遺伝子のヌクレオチド配列に基づいたオリゴヌクレオチドプライマ ーを、個々のヒト染色体を鋳型として用いるPCR反応に使用する。各23のヒト染 色体の個々のサンプルは市販されている(Coriel Institute for Medical Resear ch，Camden，NJ)。次の条件に従って染色体ＤＮＡを増幅する。10ngの染色体Ｄ ＮＡ、2μlの10×PCRバッファー、1.6μlの2.5mM dNTP、0.1μlの25mM MgCl2、0 .2μlの逆プライマー（100ng/μl)、0.2μlの前方プライマー(100ng/μl)、0.1 μlのTaqポリメラーゼおよび15.8μlのH2O。サンプルを94℃のPCR 9600機に入れ た（高温開始）。このPCRは以下のようにプログラムを組んだ。 94℃ ２分(サンプル負荷) *94℃ 20秒 *＝35× *55℃ 30秒 *72℃ 30秒 72℃ ５分 4℃ 保持 6.2. 結果 酸化LDLで処理した単球および未処理の単球について示差的ディスプレイを行 った。未処理の単球と比較して、酸化LDLによってアップレギュレートされるた めfchd602およびfchd605に対応するバンドが検出された。ノーザンブロット分 析によって、アップレギュレーションを確認した。 fchd602遺伝子は、酸化LDL、最小限に酸化したLDL、およびリソホスファチジ ルコリンで５時間処理した後、アップレギュレートされた2.5kbのｍＲＮＡを産 生した。未処理または天然LDLで処理した対照単球ではメッセージは検出されな かった。増幅ＤＮＡ配列を使用して、およそ182個のアミノ酸をコードするオー プンリーディングフレームを含有するおよそ875bpのｃＤＮＡを回収した。fchd6 02遺伝子から得たこのｃＤＮＡのＤＮＡ配列およびコードされたアミノ酸配列を 図４に示す。オープンリーディングフレームは、ラットの肝臓の再生において誘 発され、インシュリン誘導性であり、複数の膜貫通ドメインも含有するラットC1 -6遺伝子に対して88％の配列類似性を示す(Diamond，R.H.ら，J．Biol.Chem．26 8:15185-15192，1993年）。 未処理の単球と比較して、fchd605は、酸化LDLで５時間処理した後ではアップ レギュレートされた1.5bpのｍＲＮＡを産生したが、天然のLDLでの処理ではもっ と少なかった。増幅ＤＮＡを配列決定し、これを使用して、配列決定によってお よそ86個のアミノ酸をコードするおよそ258bpの部分オープンリーディングフレ ームが明らかとなったおよそ2.2kbのｃＤＮＡを回収した。fchd605遺伝子から得 られたＤＮＡ配列およびコードされたアミノ酸配列を図５に示す。該配列は、マ ウスの肺、精巣、および子宮で発現されるサイトカイン誘導性グリコシル化タン パク質をコードするマウスのgly96遺伝子に類似性を示す。 ７．実施例：例Ｄに応答して示差的に発現する遺伝子の同定：内皮細胞ずれ応力 本発明により、示差的ディスプレイを用いて、in vitroで流体ずれ応力にかけ た内皮細胞中で示差的に発現する遺伝子を検出した。ずれ応力は、異常な循環流 の領域におけるアテローム性動脈硬化症の損傷の原因として有力であると考えら れている。実例Ｄの方法を用いて３つの新規なＤＮＡ配列が同定された。 fchd531遺伝子は、静的対照と比較して、乱流および層流ずれ応力の両方の下 で、内皮細胞中にダウンレギュレートされる。fchd531遺伝子は、新規な570個の アミノ酸からなるポリペプチドをコードし、マウスのペンタ亜鉛フィンガー遺伝 子(Pzf)に94％配列類似性を示し、公表されていないが、受け入れ番号U05343 号としてGenBank配列データベースに含まれている。 fchd540遺伝子は、層流ずれ応力下で内皮細胞にアップレギュレートされるが 、IL-1処理ではアップレギュレートされない。fchd540遺伝子は、ショウジョウ バエ(Drosophila Mad)のタンパク質に配列類似性を示す新規な細胞間タンパク質 をコードする(Sekelskyら，Genetics 139:1347-1358，1995年)。 fchd545遺伝子は、乱流ずれ応力下での内皮細胞および静的対照内皮膚細胞と 比較して、層流ずれ応力下で内皮細胞にダウンレギュレートされる。fchd545遺 伝子は、電圧依存性アニオンチャンネル・タンパク質に73％配列類似性を示す84 8個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする(Blachly-Dyson，E.ら，J.Bio l．Chem．268:1835-1841，1993年)。fchd545遺伝子は、ヒト心臓、平滑筋、およ び精巣でも発現される。 ずれ応力を受けた内皮細胞でのfchd540遺伝子のアップレギュレーションおよ びfchd531、fchd545遺伝子のダウンレギュレーションより、心臓血管病（アテロ ーム性動脈硬化症、虚血症／再灌流、高血圧、および再狭窄が含まれるがこれら に限定されない）の研究のためのフィンガープリントが得られる。これらの遺伝 子の１つであるfchd540が例Ｃ（IL-1誘発）でアップレギュレートされないとい う事実より、ずれ応力に特異的な生理学的現象を区別し、標的とする非常に有用 な手段が得られる。 さらに、膜貫通タンパク質として、fchd545遺伝子産物は、他の化合物によっ て内皮細胞表面上で容易に誘発される(access)かまたは検出できる。したがって 、治験での化合物の有効性をモニターする場合と同様に、診断システムで心臓血 管病の状態を検出するのに優れた標的が得られる。さらに、この遺伝子産物の細 胞外部のドメインより、それらに結合する化合物を同定するための特に有効なス クリーニングシステムを設計することを考慮した標的が得られる。このような化 合物は、膜貫通遺伝子産物の活性を調節することによって、心臓血管病を治療す るのに有用である。 7.1． 材料および方法 すでに記載されているようにして(In Progress in Hemostasis and Thrombo sis，Vol．3，P．Spaet，editor，Grune & Stratton Inc.，New York，1-28)、 正常期の臍帯からHUVECの一次培養物を確立した。細胞を20％牛胎児血清完全培 地(1989，J．Immunol．142:2257-2263)で増殖させ、ずれ応力誘発の前に１〜３ 回継代した。 誘発のためには、第二継代HUVECを組織培養処理ポリスチレンに載せ、すでに 記載されているようにして(1994年、J．Clin．Invest．94:885-891)10dyn/cm2の 層流に１時間および６時間、またはすでに記載されているようにして(1986年、P roc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．83:2114-2117)３〜10dyn/cm2の乱流にかけた。 ＲＮＡを、上記6.1節に記載したように単離した。上記6.1.2節に記載したように 、示差的ディスプレイ、ノーザン分析、RT-PCR、サブクローニング、およびＤＮ Ａ配列決定を行った。示差的ディスプレイに使用した特定のプライマーは、以下 のとおりである： fchd531:for-T11XAおよびrev-AGACGTCCAC fchd540：for-T11XAおよびrev-ACTTCGCCAC fchd545:for-T11XCおよびrev-TCGGACGTGA 遺伝子の一部を含有する増幅した配列をサブクローニングした後、別個に使用 して対応する遺伝子をコードしているｃＤＮＡを回収した。プローブは、ベクタ ーＤＮＡからサブクローニングした挿入ＤＮＡを単離し、6.1.2節で上述したよ うに32Ｐで標識することによって作製した。標識挿入ＤＮＡを用いて、ずれ応力 誘導内皮細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーをプローブした。該ライブラリ ーは、当業界で通常行われる方法を使用して作製し、プローブした(Sambrookら ，前掲，1989年参照)。プローブによって検出されたライブラリーから得たプラ ークを単離し、ファージベクター内のｃＤＮＡインサートを配列決定した。 RACE法キットを、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングに対する代替物として 、またはｃＤＮＡライブラリーが全長遺伝子をコードするクローンを生じない場 合に該遺伝子の隣接配列を得るために使用した。取扱説明書にしたがって操作を 行った(Clontech，CA、Palo Alto);Chenchikら，CLONTECHniques(X)1，5-8，199 5年;Barnes，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:2216-2220，1994年;およびCheng ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:5695-5699)。増幅配列、または ｃＤＮＡライブラリーからの単離物から得られた配列に基づいてプライマーを設 計した。ずれ応力をかけたHUVECから鋳型ｍＲＮＡを単離した。 各種ヒト臓器および組織から抽出したＲＮＡのノーザンブロット解析は、市販 されているプレブロットフィルター(Clontech，Palo Alto，CA)を用いて行なっ た。 7.2. 結果 示唆的ディスプレイから得られた増幅fchd531断片をサブクローニングし、配 列決定し、全fchd531コーディング領域を含む1.9kbのｃＤＮＡを得るのに使用し た。新規なfchd531遺伝子のＤＮＡ配列およびコードされるアミノ酸配列を図１ に示す。fchd531遺伝子は、570個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードし、 マウスのペンタ亜鉛フィンガー遺伝子(Pzf)に94％配列類似性を示す(GenBank受 け入れ番号U05343号)。乱流および層流ずれ応力をかけたHUVECのノーザン分析よ り、fchd531遺伝子が、静的対照と比較して、乱流ずれ応力下ではなくて層流ず れ応力下でダウンレギュレートされるおよそ５kbのメッセージを産生することが 判明した。 ずれ応力下でアップレギュレートされたメッセージとしてfchd540遺伝子を検 出した。増幅断片を使用して、層流ずれ応力で処理したHUVECから得られたサン プルを含有するノーザンブロットをプローブした。層流ずれ応力で６時間処理し た後、4.4kbのfchd540mＲＮＡがアップレギュレートされた。fchd540遺伝子は、 例Ｃの方法によるIL-1では誘導されない（上記5.1.1.5節）。増幅断片を配列決 定し、全fchd540コーディング領域を含有する2.7kbのｃＤＮＡを得るのに使用し た。fchd540遺伝子から得られるＤＮＡ配列およびコードされたアミノ酸配列を 図２に示す。fchd540遺伝子は、426個のアミノ酸からなるポリペプチドをコード し、ショウジョウバエ(Dorosophila Mad)の遺伝子に配列類似性を示す(Sekelsky ら，Genetics 139:1347-1358，1995年)。 ずれ応力下でダウンレギュレートされたメッセージとしてfchd545遺伝子を検 出した。ノーザン分析より、fchd545遺伝子が、静的対照と比較して、層流ずれ 応力ではなくて乱流ずれ応力によってダウンレギュレートされる1.4kbのメッ セージを産生することが判明した。増幅断片を配列決定し、完全なfchd545コー ディング配列を含有する1.4kbのｃＤＮＡを単離するのに使用した。fchd545遺伝 子のＤＮＡ配列およびコードされたアミノ酸配列を図３に示す。fchd545遺伝子 は、ヒトの電圧依存性アニオンチャンネルに73％の配列類似性を示す283個のア ミノ酸からなるポリペプチドをコードする(Blachly-Dyson，E.ら，J．Biol．Che m．268:1835-1841，1993年)。市販のノーザンブロット（Clontech，Palo Alto， California）によるノーザン分析より、fchd545遺伝子がヒトの心臓、平滑筋お よび精巣で発現されることが明らかとなった。 ８．実施例：臨床試験の代用マーカーとしての例Ａ下での遺伝子の使用 本発明にしたがって、5.1.1.1節から5.1.1.6節に記載したいずれかの例から誘 導されたフィンガープリントプロフィールを使用して、ヒト患者における薬剤の 臨床試験をモニターすることができる。上記5.5.4節で一般的に記載したフィン ガープリントプロフィールは特定の病状に対応する特定的な遺伝子調節の特性的 なパターンを示す。5.1.1.1節に記載した、および例えば上記第６節の例で示し た例Ａは酸性ストレス下における単球のフィンガープリントプロフィールを提供 する。従って、酸化LDLの取り込みに対する単球の生理的応答を読み取ることに より、ターゲット遺伝子は代用マーカーとして作用する。これによって、臨床試 験を実施している患者の単球上に示差的ディスプレイが表れることによって、酸 化ポテンシャルに対する抗酸化薬剤の影響を測定することができる。 8.1. 患者の処置および細胞の単離 抗酸化活性を有すると推測される化合物を試験患者に投与することができる。 対照患者にはプラシーボを与える。 12時間の絶食後に各患者から血液を取り、上記第7.1.1節のように単球を精製 する。上記第6.1.1節にしたがってＲＮＡを単離することができる。次いでプラ イマーを、fchd602およびfchd605のようなアップレギュレートされたものとして 、または例Ａでのダウンレギュレートされたものとして同定されたターゲット遺 伝子のＤＮＡ配列に基づいて、増幅用に設計することができる。 8.2. サンプルの分析 上記第6.1.2節にしたがって、ＲＮＡを示差的ディスプレイ分析に供すること ができる。上記第6.2節にしたがって、例Ａにおいて酸化LDLによってアップレギ ュレートされたfchd602及びfchd605に対応するバンドの強度の減少によって、単 球の生理的応答状態の減少が示される。 ９．実施例：心臓血管病の状態のイメージング 本発明にしたがって、病気のまたは損傷された組織をイメージングするために 、患部組織の表面に位置する示差的に発現された遺伝子産生物をマーカーとして 使用することができる。示差的に発現された遺伝子産生物に特異的な複合抗体を 患者または試験動物に静脈内投与することができる。この方法は、病気のまたは 損傷した組織を侵害しないで可視化させるという利点を与える。 説明の目的で、この方法をfchd602遺伝子産生物について詳細に記載する。こ の原理および手法を、例えばfchd545遺伝子産生物を含む、いずれの膜貫通ター ゲット遺伝子産生物に対しても適用することができる。 9.1. モノクローナル複合抗体 上記第5.4.2節の方法を使用して、fchd602遺伝子産生物などの示差的に発現さ れた表面遺伝子産生物が組換え体宿主中に発現され、精製される。好ましくは、 fchd602産生物の１以上の細胞外ドメインを含有するタンパク質断片が産生され る。精製後、上記第5.4.3節にしたがって、F(ab')2またはFab断片を産生させる のに使用される。その後、上記第5.8.3節にしたがって、DTPAなどの複合金属キ レート剤を使用して、これらの断片をテクネチウム-99m（99mTc）で標識する。 9.2. イメージング剤の投与および検出 アテローム性動脈硬化、再狭窄、または虚血／再潅流と診断された患者に対し て、標識MAbを静脈内投与することができる。検出を可能にするために標識した 抗体が病気のまたは損傷した組織部位（または複数の部位）に局在して、fchd60 2遺伝子産生物と結合するのに十分な時間を与える。標識によって発生するシグ ナルを光走査装置によって検出する。その後、検出されたシグナルを、fchd602 遺伝子発現がアップレギュレートされる単球などの細胞を示す組織の画像に転換 する。 10．ターゲット遺伝子ペプチド配列に対するポリクローナル抗体 示されたｃＤＮＡのアミノ酸配列に相当するペプチド配列を選定し、合成およ び抗体の製造のためにResearch Genetics(Huntsville,AL)に提出した。ペプチド を文献の記載（Tam,J.P.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5409-5413；Tam,J.P .,and Zavala,F.,1989,J.Immunol.Methods 124:53-61；Tam,J.P.,and Lu,Y.A.,1 989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9084-9088）にしたがって修飾し、同容量のFre undアジュバンド中で乳化し、ウサギの背部の３，４箇所に１免疫当たり総量で1 .0ml（ペプチド0.5mg）となるように皮下注入した。この動物に２および６週間 後に追加免疫し、４，８，および10週間目に採血した。血液を凝固させて、遠心 分離によって血清を採取した。 使用したペプチドを下記に要約する。fchd545 ペプチド抗体 名称 位置 配列 fchd545.1 48-63 YTDTGKASGNLETKYK fchd545.2 107-121 YGKKSGKLKASYKRD １１．実施例：RCHD534 およびFCHD540遺伝子産物の相互作用 新規fchd540遺伝子およびそのヌクレオチド配列は、上記第７節に記載される 。fchd540遺伝子は、Drosophila Mad遺伝子と相同性を有する。rchd534遺伝子（ 出願人の共同係属中の国際出願公開番号WO96/24604号に記載され、それは参照と してここに全部組み込まれる）は、ずれ応力によって内皮細胞でアップレギュレ ートされる別の遺伝子である。rchd534遺伝子のＤＮＡおよびコードされたアミ ノ酸配列は、図６に示される。rchd534遺伝子は、1995年６月６日に、ジ・ アグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション(the Agr icultural Research Service Culture Collection)(NRRL)に微生物FCHD534で寄 託され、NRRL受託番号B-21459号で受託された。rchd534遺伝子も、Drosophila M ad遺伝子と相同性を有する。Mad遺伝子は、TGF-βシグナル伝達経路で役割を果 たすことが示された(Sekelskyら，Genetics 139:1347-1358，1995年;Chenら，Na ture383:691-696，1996年;Serraら，Nature Medicine 2:390-391,1996年)。TGF- βシグナル伝達は、アテローム性動脈硬化症および再発性狭窄症に有益であると 考えられる(Borderら，Nature Medicine 1:1000，1995年;Graingerら，Nature M edicine 1:1067-1073，1995年;Kojimaら，J．Cell Biol．113:1439-1445，1991 年;Nikolら，J．Clin．Invest.，90:1582-1592，1992年)。 以下で記載されたデータは、rchd534およびfchd540タンパク質が互いに相互作 用することを示す。そしてこの相互作用は、TGF-βシグナル伝達の阻害に至る可 能性がある。さらに、これら２つの遺伝子の発現は、以下に記載するとおり、内 皮細胞に特異的である。これらの２つの遺伝子は、１）両方とも内皮細胞におい て特異的に発現され、２）両方とも、ある種の条件下で内皮細胞においてアップ レギュレートされ、３）内皮細胞で互いに相互作用するＭＡＤタンパク質をコー ドし、４）TGF-βシグナル伝達（アテローム性動脈硬化症に有益であると考えら れる）を阻害するので、rchd534およびfchd540タンパク質は、心臓血管病に治療 介入のための魅力的な標的である。特に、rchd534およびfchd540タンパク質の相 互作用または活性を阻害する治療管理は、心臓血管病治療に有益でありうる。 さらに別の分析は、rchd534タンパク質がそれ自身と相互作用してホモダイマ ーを形成することを例示する。したがって、rchd534タンパク質がそれ自身と相 互作用するのを阻害する治療管理は、心臓血管病治療に有益でありうる。 さらに、以下に記載された分析は、rchd534およびfchd540タンパク質の両方が 、TGF-βシグナル伝達経路に含まれることが知られている他のタンパク質と新規 に相互作用することを示した。試験されたTGF-βシグナル伝達経路のタンパク質 メンバーとしては、MADR1(Hoodlessら，Cell，85:489-500，1996年)、MADR 2(Eppertら，Cell，86:543-552，1996年)、DPC4(Rafteryら，Genetics，139:241 -254，1988年)、TβR1、TSR1、ActRIb、ALK3、およびALK6(Wieserら、EMBOJ.，1 4:2199-2208，1995年)が挙げられる。例えば、rchd534タンパク質は、MADR1、MA DR2、DPC4、と内皮細胞で強く、レセプターTβRIおよびActRIの活性形態と293（ ヒト胚腎）細胞で弱く相互作用する。fchd540タンパク質は、レセプターTf3RIお よびALK6の活性形態と293細胞と強く相互作用する。 形質移入rchd543およびfchd540遺伝子が不在のとき、トランスフェクトされた MADR1またはトランスフェクトされたＭＡＤＲ２は、BAECにおいてTGF-β誘導プ ロモーターの誘導を20倍にした。この系でのトランスフェクトされたrchd534ま たはトランスフェクトされたrchd540のいずれかの共発現は、誘導物を削除し、T GF-βシグナル伝達に応答して核にMADR2が局在するのも防止した。したがって、 TGF-β経路に含まれるrchd534およびfchd540タンパク質が他のタンパク質と相互 作用するのを阻害する処理管理は、心臓血管の疾病の処置に有益でもある。上記 記載されるとおり、rchd534およびfchd540の発現は、内皮細胞に動脈組織内で特 異性がある。したがって、rchd534およびrchd540遺伝子は、限定されるものでは ないが、癌性血管形成、炎症、および線維症を含めた内皮細胞を包含する種々の 炎症および線維増殖性障害での介在についての標的でありうる。 11.1. 材料および方法 11.1.1. 酵母株、培地、および微生物技術 Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、およびＬ−ヒスチジンを欠く合成完全培 地を含めた標準酵母培地が製造され、酵母遺伝子操作は、記載のとおり行われた (Sherman，Meth．Enzymol.、194:3-21，1991年)。標準プロトコールを用いて、 酵母の形質転換を行った(Gietzら，Nucleic Acids Res.，20:1425，1992年。Ito ら，J．Bacteriol.，153:163-168，1983年)。標準法により、酵母株からプラス ミドＤＮＡを単離した(HoffmanおよびWinston，Gene，57:267-272，1987年)。 11.1.2. プラスミドおよび酵母株の構築 PCRによって、ヒトfchd540のコーディング領域を増幅し、フレームで(in fr ame)pGBT9にクローン化して(Bartelら，Cellular Interactions in Development ，p153-159，1993年)、プラスミドpGBT9-fchd540を生じた。pGBT9-fchd540をツ ーハイブリッド・スクリーニング株HF7cに形質導入し、１つの生じた形質転換体 を、TB35とした。 11.1.3. ツーハイブリッド・スクリーニング レシピエント株としてTB35を、ヒト胸ツーハイブリッド・ライブラリーを使用 して、実質的に記載された(Bartelら，上述文献，1993年)とおり、ツーハイブリ ッドのスクリーニングを行った。 11.1.4. 濾紙β−ガラクトシダーゼアッセイ 実質的に先に記載されたとおり(Brillら，Mol．Biol．Cell、5:297-312，1994 年)、濾紙β−ガラクトシダーゼアッセイ(ベータ-gal)アッセイを行った。 11.2 結果 11.2.1. ツーハイブリッドアッセイによって測定されたrchd534とfchd540との 強力な物理的相互作用 PCRによって、fchd540コーディング配列を増幅し、pGBT9にクローニングして 、GAL4 ＤＮＡ結合ドメイン−fchd540融合遺伝子を作製した。この構築物で、ス クリーニング株HF7cを形質転換した。pGAD424に、rchd534コーディング配列をク ローニングして(Bartelら、1993年、上掲)、GAL4転写活性ドメイン−rchd534融 合遺伝子を作製し、その後形質転換株Y187に使用した。 GAL4 ＤＮＡ結合ドメインを単独でコードするか、またはfchd540、rchd534、D rosophila Mad、DPC4またはp53にフレーム内で(in frame)融合した酵母発現プラ スミドを、MATaのツーハイブリッド・スクリーニング株HF7cに形質転換させた。 GAL4転写活性ドメインを単独で、およびrchd534およびSV40に対するGAL4活性ド メイン融合体をコードする酵母発現プラスミドを、MATαのツーハイブリッドス クリーニング株Y187に形質転換した。p53およびSV40は、互いに相互作用し、実 験的タンパク質とは相互に作用すべきでない。HF7c形質転換体を、 Ｌ−トリプトファンを欠く半固形の合成完全培地上でストライプ(stripe)として 、増殖させ、Y187形質転換体は、Ｌ−ロイシンを欠く半固形の合成完全培地上の ストライプとして育成された。ストライプの両方のセットを、単独の富YPADプレ ートの上にグリッド(grid)の形態でレプリカプレートし、反対の交配型のハプロ イド株を30℃で一晩交配させた。交配プレート上の酵母株を、二倍体について選 択するＬ−ロイシンおよびＬ−トリプトファンを欠く合成完全プレートにレプリ カプレートし、30℃で一晩インキュベートした。Ｌ−ロイシンおよびＬ−トリプ トファンを欠く合成完全プレート上の二倍体株を、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプト ファンおよびＬ−ヒシチジンを欠く合成完全プレートにレプリカプレート、HIS3 発現およびＬ−ロイシンおよびＬ−トリプトファンを欠く合成完全プレート上の 濾紙をアッセイした。次の日に、濾紙を濾紙ベーターガラクトシダーゼアッセイ にかけて、lacZレセプター遺伝子の発現を測定した。HIS3発現を、30℃での成長 の３日後に記録した。結果を表３に示す。 rchd534魚タンパク質が、fchd540餌(bait)タンパク質と強力に相互作用し、rc hd534、MAD、DPC4、p53、およびGAL4DNA結合ドメイン餌タンパク質と相互作用し ないことが分かった。この結果では、rchd534およびfchd540が、目立った特異性 を有して互いに強力に物理的に作用することが示された。 11.2.2. fchd540 と物理的に作用するタンパク質の同定 PCRによって、fchd540コーディング配列を増幅させ、pGBT9(Bartelら，上述文 献，1993年)にクローニングさせて、GAL4 ＤＮＡ結合ドメイン−fchd540融合遺 伝子を作った。HF7cをこの構築物で形質転換させて、株TB35を生じた。TB35は、 Ｌ−トリプトファンを欠く合成完全培地で成育し、Ｌ−トリプトファンおよびＬ −ヒスタミンを欠く合成完全培地で成育せず、これは、GAL4 ＤＮＡ結合ドメイ ンfchd540融合が、固有の転写活性化活性を示さないことを示した。 TB35を、ヒト胸ツーハイブリッド・ライブラリーで形質転換し、500万の形質 転換体を得た。その形質転換体を、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、および Ｌ−ヒスチジンを欠く合成完全培地に載せて、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファ ン、およびＬ−ヒスチジンを欠く合成完全培地で成育させるとともに、ベーター ガラクトシダーゼリポーター遺伝子を発現した酵母コロニーを同定した。最も強 いベーターガラクトシダーゼ誘導を示す30の株が特徴づけられた。ライブラリー ・プラスミドをこれらの株から単離し、ｃＤＮＡ挿入物の全ての５'末端が配列 決定された。 11.2.3. tchvO3A およびtchvR4Aの再形質転換および特異性試験 最も強い相互作用物(interactor)をコードしたプラスミドの内の２つは、rchd 534 ｃＤＮＡを含有することが分かった。プラスミドtchvO3Aが、rchd534のアミ ノ酸17-235をコードすると分かり、プラスミドtchvR4Aは、rchd534のアミノ酸25 -235をコードすると分かった。 これらのrchd534ｃＤＮＡｓが、特異的にfchd540と物理的に相互作用するタン パク質をコードすることが確認された。単独でGAL4 ＤＮＡ−結合ドメインをコ ードするか、またはfchd540、rchd534、Drosophila Mad、DPC4およびp53にフレ ーム内で融合してコードするかのいずれかの酵母発現プラスミドが、MATaのツー ハイブリッドスクリーニング株HF7cに形質転換された。GAL4転写活性ドメイン(G AL4 AD)単独をコードする酵母発現プラスミド、およびtchvO3a、tchvR4AおよびS V40に対するGAL4活性ドメイン融合体を、MATαのツーハイブリッドスクリーニン グ株Y187に形質転換させた。p53およびSV40は、互いに作用し、試験タンパク質 とは作用すべきでない。HF7c形質転換体は、Ｌ−ロイシンを欠く半固形の合成完 全培地上にストラップとして繁殖させた。ストライプの両方のセットを、単独の 富YPADプレートの上にグリッドの形態でレプリカプレートし、反対の交配型のハ プロイド株を30℃で一晩交配させた。交配プレート上の酵母株を、二倍体につい て選択するＬ−ロイシンおよびＬ−トリプトファンを欠く合成完全プレートにレ プリカプレートし、30℃で一晩インキュベートした。Ｌ−ロイシンおよびＬ−ト リプトファンを欠く合成完全プレート上の二倍体株を、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリ プトファンおよびＬ−ヒシチジンを欠く合成完全プレートにレプリカプレートし 、HIS3発現およびＬ−ロイシンおよびＬ−トリプトファンを欠く合成完全プレー ト上の濾紙をアッセイした。次の日に、濾紙を濾紙ベータ−ガラクトシダーゼア ッセイにかけて、lacZレセプター遺伝子の発現を測定し た。HIS3発現を、30℃での成長の３日後に記録した。結果は、以下の表に示され る。試験タンパク質の各組合せの間の物理的相互作用の強さまたは不在が列記さ れる。強い相互作用は、HIS3およびlacZレポーター遺伝子の両方の活性を起こす 相互作用と定義される。 結合ドメインのみ tchvO3AおよびtchvR4A魚タンパク質が、fchd540餌タンパク質と強力に相互作 用し、rchd534、MAD、DPC4、p53、およびGAL4ＤＮＡ結合ドメイン餌タンパク質 とは相互作用しないことが分かった。これらの結果では、rchd534およびfchd540 タンパク質が、互いに強力に相互作用する成果であることを確認される。 11.3. rchd534 およびfchd540機能の別の分析 rchd534／fchd540タンパク質相互作用の重要性は、ヒト細胞および動物モデル でのそれらの発現および活性を試験することによって確認された。 11.3.1. 組織発現パターン in situハイブリダイゼーション技術を用いて、発現パターンを試験した。rch d534およびfchd540遺伝子の両方の蛍光標識されたＤＮＡプローブは、ヒト頚 動脈の動脈内膜切断サンプルをプローブするために使用した。rchd534およびfch d540の発現は、頚動脈の層表面を覆う内皮細胞に特異性があった。遺伝子が、平 滑筋細胞およびマクロファージを含めた動脈組織サンプルに存在する他のいかな る細胞型での発現を示すことはなかった。したがって、ずれ応力下での心臓血管 病パラダイムのアップレギュレーションに加えて、アテローム性動脈硬化症プラ ークを含めた血管組織でのみ見られる細胞型でのそれらの発現の特異性は、rchd 534およびfchd540が、治療介在についての優れた特異的な標的であることを示す 。 11.3.2. 細胞局在化 ウシの大動脈内皮細胞（BAEC）でのrchd534およびfchd540タンパク質の細胞の 局在は、TGF-βシグナル伝達経路に含まれる他のタンパク質に関係して試験され た。全ての試験で、rchd534およびfchd540タンパク質は、細胞質に存在していた 。MADR2は、トランフェクトのみされた場合に細胞質に存在し、活性化TβRIとの コトランスフェクトの場合またはTGF-βが培養培地に添加された場合には核に存 在した。MADR2とのrchd534またはfchd540のコトランスフェクションは、TGF-β シグナル伝達に対応して核中でMADR2の局在化を阻止した。 11.3.3. ヒト細胞でのタンパク質相互作用 上記記載のとおり酵母細胞で観察されたrchd534およびfchd540タンパク質の相 互作用は、哺乳動物の内皮細胞組織培養で試験された。ウシの大動脈の内皮細胞 （BAEC）または293細胞(ヒト胚腎細胞、ATCC受託番号CRL-1573号)のいずれかは 、rchd534およびfchd540タンパク質の両方をコードする構築物でトランスフェク トし、各々、特異的な免疫沈降法と考えられる別個のフラグ(flag)ペプチドに融 合された。rchd534およびfchd540タンパク質は、293細胞およびBAECの両方から 製造された抽出物中で異種ダイマーとして共免疫沈降することが分かった。rchd 534およびfchd540の共免疫沈降は、これらのタンパク質が心臓血管病に生理学的 に関連するヒト細胞で相互作用することをさらに支持する。 それら自身と、TGF-βシグナル伝達経路の他のタンパク質メンバー(MADR1、MA DR2、DPC4、TbR1、TSR1、ActR1b、ALK3、ALK6)と相互作用するrchd534およびfch d540タンパク質の能力は、この共免疫沈降法を用いて試験された。各遺伝子は、 単独で、および293細胞またはBAECのいずれかで他のTGF-β経路の遺伝子との種 々の組合せで形質移入された。rchd534タンパク質は、293細胞およびBAEC中にホ モダイマーを形成した。fchd540タンパク質は、293細胞またはBAEC中にホモダイ マーを形成しなかった。上記記述されたとおり、rchd534およびfchd540タンパク 質は、293細胞およびBAEC中に異種ダイマーを形成した。この相互作用は、同量 のタンパク質に対して293細胞よりBAECで約50倍強い。しかし、rchd534−fchd54 0タンパク質相互作用は、rchd534タンパク質とそれ自身との相互作用より明らか に貪欲さが低かった。 rchd534タンパク質は、293細胞およびBAEC中のMADR1、MADR2およびDPC4と相互 作用した。MADR1およびMADR2相互作用の強度は、293細胞およびBAECの間とおよ そ同じであり、DPC4についてのBAECでよりかなり大きかった。fchd540タンパク 質は、293細胞中のMADR1、MADR2およびDPC4と非常に弱く相互作用した。rchd534 タンパク質は、Tβ3RIおよびActRIの活性形態と強力に相互作用し、293細胞中の 活性化ALK6と弱く相互作用した。fchd540タンパク質は、活性化TβRIおよびALK6 レセプターと強力に相互作用し、293細胞中のTSRI、ALK3およびActRIbの活性化 形態と弱く相互作用した。したがって、rchd534およびfchd540タンパク質の相互 作用に加えて、それ自身とrchd534タンパク質との相互作用は、rchd534タンパク 質およびfchd540タンパク質と上記記載されたTGF-β経路中の他のタンパク質と の相互作用と同じく、治療的介在のための優れた標的である。 11.3.4. TGF- βシグナル伝達での発現の効果 TGF-βシグナル伝達経路でのrchd534およびfchd540の両方の効果を、in vitro で試験した。一次BAECは、レポーター遺伝子に融合されたTGF-β応答性プロモー ターを含有するp3TP-Luxと称される構築物にトランスフェクトされた(Wranaら、 19944、Nature、370:341-347)。pCI発現ベクター(Promega)中のrchd534遺伝子ま たはfchd540遺伝子が、MADR1と、または無しで(pCMV5MADR1-フラグ、 Hoodlessら、Cell、85:489-500、1996年)またはMADR2(pCMV5MADR2-フラグ、Eppe rtら、Cell、86:543-552、1996年)でトランスフェクトされた。TGF-βの応答は 、MADR1またはMADR2によって20倍に誘導された。rchd534またはfchd540のいずれ かの共発現は、この誘導を完全に排除した。したがって、rchd534およびfchd540 タンパク質は、内皮細胞でのMADR1-およびMADR2-媒介TGF-βシグナル伝達を阻害 した。これらの結果は、さらに、rchd534タンパク質またはfchd540タンパク質の いずれかと、MADR2と、または活性化TβR1との相互作用が、治療的介在について の優れた標的であることを示す。上に記載されたとおり、rchd534およびfchd540 の発現は、動脈組織内で、内皮細胞に特異性がある。したがって、rchd534およ びfchd540遺伝子は、限定されないが、癌性血管形成、炎症、および線維症を含 めた内皮細胞を含む種々の炎症および線維増殖障害で介在するための標的である 可能性がある。 12．実施例:RCHD534 およびFCHD540発現の阻害のためのアンチセンスおよびリボ ザイム分子 上記第5.6.1.1節に示した概念は、rchd534またはfchd540遺伝子のような、タ ーゲット遺伝子の発現を阻害するうえで使用されるオリゴヌクレオチドを設計す るのに使用できる。 以下のアンチセンス分子は、rchd534遺伝子の発現を阻害するのに使用できる 。アンチセンス ： 以下のアンチセンス分子は、fchd540遺伝子の発現を阻害するのに使用できる。ここで、５'-近傍ＣＡ塩基は、標的ｍＲＮＡ中の相補的5'-UG-3'とハイブリダイ ズする。最初の４つの下線付き塩基は、下線付き塩基の第二のセットと塩基対を なすことによってステムを形成し、それとともに、X’ｓとして示される介在塩 基は、対でないループを形成する。標的ｍＲＮＡにハイブリダイズするために、 ハンマーヘッド・リボザイムは、上に示された中央セグメントの各末端に吊下が る付加塩基を含有する。５'リボザイム吊下げセグメントは、標的ＵＧのすぐ３' で各々吊下げ配列に相補性がある。そして、３'吊下げセグメントは、標的Ｕの 上流の２つの塩基を始め、５'向きに拡張する各々吊下げ配列に相補性がある（ 効果的に、標的Ｕの上流の第一の塩基を飛ばす）。標的5'-UG-3'部位でのＵの上 流（すなわち、５'に）で第一と第二の塩基の間に切断が生じる。 以下のリボザイム分子は、ｆｃｈｄ５３４遺伝子の発現を阻害するのに使用で きる。 １３．微生物の寄託 以下の微生物は、提示した日に、メリーランド、ロックビルのアメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)に 寄託され、提示の受託番号が付与された。：微生物 ATCC受託番号 寄託の日付 pFCHD531 69983 1996年２月７日 pFCHD540 69984 1996年２月７日 fchd545 69974 1996年１月５日 が付与された。 以下の微生物は、提示された日付に、イリノイ、ペオリアのジ・アグリカルチ ュラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション(the Agricultural Re search Service Culture Collection)(NRRL)に寄託され、提示受託番号が付与さ れた。微生物 NRRL受託番号 寄託の日付 FCHD534 B-21459 1995年６月６日 本発明は、ここに記載された特定の具体例によって範囲を限定されず、そのこ とは、本発明の個々の態様のたんなる例示として示され、機能的に同等な方法お よび成分は、本発明の範囲内にある。実際、ここで示されそして記載されたもの に加えて、本発明の種々の改正は、先述の記載および添付の図面から当業者に明 らかになる。このような改正は、付随の請求項の範囲内にはいることが意図され る。 国際出願番号：ＰＣＴ／ ＰＣＴ／ＲＯ／１３４ （続き） アメリカン タイプ カルチャー コレクション アメリカ合衆国 ２０８５２ メリーランド州 ロックビル，パークローン ドライブ １２３０１受託番号 寄託日 ６９９８４ １９９６年 ２月 ７日 ６９９７４ １９９６年 １月 ５日 アグリカルチュラル リサーチ カルチャー コレクション(NRRL) インターナショナル デポジタリー オーソリティー アメリカ合衆国 ６１６０４ イリノイ州 ペオリア， エヌ．ユニバーシティー ストリート １８１５ Ｂ−２１４５９ １９９５年 ６月 ６日
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 9/00 48/00 9/10 Ａ６１Ｐ 9/00 9/12 9/10 Ｃ０７Ｋ 14/47 9/12 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 15/00 ＺＮＡＡ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．下記のヌクレオチド配列： fchd531（配列番号１）、 fchd540（配列番号２）、 fchd545（配列番号３）、 fchd602（配列番号４）、もしくは fchd605（配列番号５） または、ＡＴＣＣに寄託された下記のクローン： pFCHD531（ＡＴＣＣ受託番号69983）、 pFCHD540（ＡＴＣＣ受託番号69984）、もしくは fchd545（ＡＴＣＣ受託番号69974） に含まれる遺伝子または遺伝子断片のヌクレオチド配列を含む、単離された ポリヌクレオチド。 ２．ストリンジェント条件下で、請求項１に記載のヌクレオチド配列もしくはそ の相補配列、またはＡＴＣＣに寄託された請求項１に記載のクローンに含ま れる遺伝子または遺伝子断片とハイブリダイズする単離されたポリヌクレオ チド。 ３．請求項１に記載のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、またはＡＴＣＣ に寄託された請求項１に記載のクローンに含まれる遺伝子または遺伝子断片 によってコードされるアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチ ド。 ４．請求項１、２または３に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベ クター。 ５．宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御するヌクレオチド調節要素 と機能的な関連(operative association)を有する請求項１、２または３に 記載のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド発現ベクター。 ６．請求項１、２または３に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子操作された 宿主細胞。 ７．宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を制御するヌクレオチド調節要素 と機能的な関連を有する請求項１、２または３に記載のポリヌクレオチドを 含む、遺伝子操作された宿主細胞。 ８．請求項１、２または３に記載のポリヌクレオチドによりコードされる実質的 に純粋な遺伝子産物。 ９．請求項８に記載の遺伝子産物を免疫特異的に結合する抗体。 １０．請求項１、２または３に記載のポリヌクレオチドが、動物のゲノムに含ま れる発現トランスジーンである、トランスジェニック動物。 １１．請求項８に記載の遺伝子産物をコードするゲノム配列の発現が妨害または 抑制される、トランスジェニック動物。 １２．患者のサンプル中のfchd531タンパク質、fchd540タンパク質、fchd545タ ンパク質、fchd602タンパク質、またはfchd605タンパク質をコードする遺伝 子の示差発現をアッセイすることを含む、心臓血管病の診断方法。 １３．前記心臓血管病がアテローム性動脈硬化症である、請求項１２に記載の方 法。 １４．前記心臓血管病が虚血／再灌流である、請求項１２に記載の方法。 １５．前記心臓血管病が高血圧症である、請求項１２に記載の方法。 １６．前記心臓血管病が再発性狭窄症である、請求項１２に記載の方法。 １７．遺伝子がアップレギュレートされる、請求項１２に記載の方法。 １８．前記遺伝子が、fchd540タンパク質、fchd602タンパク質、またはfchd605 タンパク質をコードする、請求項１７に記載の方法。 １９．遺伝子がダウンレギュレートされる、請求項１２に記載の方法。 ２０．前記遺伝子が、fchd531タンパク質またはfchd545タンパク質をコードする 、請求項１９に記載の方法。 ２１．fchd531遺伝子、fchd540遺伝子、fchd545遺伝子、fchd602遺伝子、もしく はfchd605遺伝子の発現、またはコードされたタンパク質産物の活性を調節 する化合物を、心臓血管病の治療が必要な患者に投与することを含む、心臓 血管病の治療方法。 ２２．前記心臓血管病がアテローム性動脈硬化症である、請求項２１に記載の方 法。 ２３．前記心臓血管病が虚血／再灌流である、請求項２１に記載の方法。 ２４．前記心臓血管病が高血圧症である、請求項２１に記載の方法。 ２５．前記心臓血管病が再発性狭窄症である、請求項２１に記載の方法。 ２６．化合物が、遺伝子の発現またはタンパク質産物の活性を阻害する、請求項 ２１に記載の方法。 ２７．前記遺伝子が、fchd540遺伝子、fchd602遺伝子、またはfchd605遺伝子で ある、請求項２６に記載の方法。 ２８．化合物が、遺伝子の翻訳を遮断するアンチセンス分子またはリボザイム分 子である、請求項２７に記載の方法。 ２９．化合物が、遺伝子の5'領域に相補的であり、三重らせん形成により転写を 遮断する、請求項２７に記載の方法。 ３０．化合物が、タンパク質産物の活性を阻害する抗体である、請求項２６に記 載の方法。 ３１．化合物が、遺伝子の発現またはタンパク質産物の活性を増大させる、請求 項２１に記載の方法。 ３２．前記遺伝子が、fchd531遺伝子またはfchd545遺伝子である、請求項３１に 記載の方法。 ３３．fchd531タンパク質またはfchd545タンパク質をコードするポリヌクレオチ ドを、心臓血管病の治療が必要な患者に投与することを含む、心臓血管病の 治療方法。 ３４．fchd531タンパク質またはfchd545タンパク質の有効量を心臓血管病の治療 が必要な患者に投与することを含む、心臓血管病の治療方法。 ３５．患者のサンプル中のfchd531タンパク質、fchd540タンパク質、fchd545タ ンパク質、fchd602タンパク質、またはfchd605タンパク質をコードする遺伝 子の示差発現をアッセイすることを含む、心臓血管病の治療のための臨床試 験において化合物の効力をモニタリングする方法。 ３６．前記心臓血管病がアテローム性動脈硬化症である、請求項３５に記載の方 法。 ３７．前記心臓血管病が虚血／再灌流である、請求項３５に記載の方法。 ３８．前記心臓血管病が高血圧症である、請求項３５に記載の方法。 ３９．前記心臓血管病が再発性狭窄症である、請求項３５に記載の方法。 ４０．遺伝子がアップレギュレートされる、請求項３５に記載の方法。 ４１．前記遺伝子が、fchd540タンパク質、fchd602タンパク質、またはfchd605 タンパク質をコードする、請求項４０に記載の方法。 ４２．遺伝子がダウンレギュレートされる、請求項３５に記載の方法。 ４３．前記遺伝子が、fchd531タンパク質またはfchd545タンパク質をコードする 、請求項４２に記載の方法。 ４４．fchd531遺伝子、fchd540遺伝子、fchd545遺伝子、fchd602遺伝子、もしく はfchd605遺伝子の発現、またはそのコードされたタンパク質産物の活性を 調節する物質の能力をアッセイすることを含む、心臓血管病の治療用の物質 を同定する方法。 ４５．前記心臓血管病がアテローム性動脈硬化症である、請求項４４に記載の方 法。 ４６．前記心臓血管病が虚血／再灌流である、請求項４４に記載の方法。 ４７．前記心臓血管病が高血圧症である、請求項４４に記載の方法。 ４８．前記心臓血管病が再発性狭窄症である、請求項４４に記載の方法。 ４９．前記遺伝子の発現の調節が： （ａ）細胞サンプルを試験物質に曝し； （ｂ）前記細胞サンプル中で前記遺伝子の発現をアッセイし；そして （ｃ）前記物質に曝された前記サンプル中の遺伝子の発現レベルを、対照細 胞サンプル中の遺伝子の発現レベルと比較する ことよってアッセイされるものであり、前記物質に曝されたサンプル中の遺 伝子の発現レベルと、前記対照中の遺伝子の発現レベルとの差異が、遺伝子 発現の調節を示すものである、請求項４４に記載の方法。 ５０．前記遺伝子が、試験物質によってダウンレギュレートされる、請求項４９ に記載の方法。 ５１．前記物質が、遺伝子の5'領域と相補的なオリゴヌクレオチドであり、三重 らせん形成によって転写を遮断する、請求項５０に記載の方法。 ５２．物質が、遺伝子の翻訳を遮断するアンチセンス分子またはリボザイム分子 である、請求項５０に記載の方法。 ５３．遺伝子が、試験物質によってアップレギュレートされる、請求項４９に記 載の方法。 ５４．物質が、タンパク質産物と結合することによってそのタンパク質産物の活 性を調節する小さい有機または無機分子である、請求項４４に記載の方法。 ５５．物質が、タンパク質産物と結合することによってそのタンパク質産物の活 性を調節する抗体である、請求項４４に記載の方法。 ５６．fchd531タンパク質、fchd540タンパク質、fchd545タンパク質、fchd602タ ンパク質、またはfchd605タンパク質に結合する物質を同定するためのアッ セイであって、 （ａ）前記タンパク質の結合部位に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質ま たはペプチドと試験物質とを、該タンパク質または該ペプチドと該試験 物質とが結合して複合体を生成することが可能な条件下にて十分な時間 接触させ、そして （ｂ）複合体の生成を検出する ことを含み、試験物質のタンパク質に結合する能力が、複合体中の試験物質 の存在によって示されるものである、前記アッセイ。 ５７．rchd534タンパク質とfchd540タンパク質との相互作用を阻害する物質を同 定するためのアッセイであって、 （ａ）rchd534タンパク質の結合部位に対応するアミノ酸配列を含むタンパク 質またはペプチドと、fchd540タンパク質の結合部位に対応するアミノ 酸配列を含むタンパク質またはペプチドとを、それらが結合して複合体 を生成することが可能な条件下にて十分な時間、試験物質の存在下で接 触させ、そして （ｂ）複合体の生成を検出する ことを含み、試験物質のrchd534タンパク質とfchd540タンパク質との相互作用 を阻害する能力が、試験物質の不存在下で生成した複合体の量と比較した複合 体生成の減少量によって示されるものである、前記アッセイ。 ５８．２つのrchd534タンパク質分子間の相互作用を阻害する物質を同定するた めのアッセイであって、 （ａ）rchd534タンパク質の結合部位に対応するアミノ酸配列を含む第１のタ ンパク質またはペプチドと、rchd534タンパク質の結合部位に対応する アミノ酸配列を含む第２のタンパク質またはペプチドとを、それらが結 合して複合体を生成することが可能な条件下にて十分な時間、試験物質 の存在下で接触させ、そして （ｂ）複合体の生成を検出する ことを含み、試験物質の２つのrchd534タンパク質分子間の相互作用を阻害 する能力が、試験物質の不存在下で生成した複合体の量と比較した複合体生 成の減少量によって示されるものである、前記アッセイ。 ５９．rchd534タンパク質と、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路のタンパク質メンバ ーとの相互作用を阻害する物質を同定するためのアッセイであって、 （ａ）rchd534タンパク質の結合部位に対応するアミノ酸配列を含むタンパク 質またはペプチドと、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路のタンパク質メンバ ーの結合部位に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチド とを、それらが結合して複合体を生成することが可能な条件下にて十分 な時間、試験物質の存在下で接触させ、そして （ｂ）複合体の生成を検出する ことを含み、試験物質のrchd534タンパク質と、ＴＧＦ−βシグナル伝達経 路のタンパク質メンバーとの相互作用を阻害する能力が、試験物質の不存在 下で生成した複合体の量と比較した複合体生成の減少量によって示されるも のである、前記アッセイ。 ６０．前記ＴＧＦ−βシグナル伝達経路のタンパク質メンバーが、ＭＡＤＲ１、 ＭＡＤＲ２、ＤＰＣ４、活性化ＴβＲ１、活性化ＡｃｔＲ１ｂ、または活性 化ＡＬＫ６である、請求項５９に記載のアッセイ。 ６１．fchd540タンパク質と、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路のタンパク質メンバ ーとの相互作用を阻害する物質を同定するためのアッセイであって、 （ａ）fchd540タンパク質の結合部位に対応するアミノ酸配列を含むタンパ ク質またはペプチドと、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路のタンパク質メン バーの結合部位に対応するアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチ ドとを、それらが結合して複合体を生成することが可能な条件下にて十 分な時間、試験物質の存在下で接触させ、そして （ｂ）複合体の生成を検出する ことを含み、試験物質のfchd540タンパク質と、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路 のタンパク質メンバーとの相互作用を阻害する能力が、試験物質の不存在下で 生成した複合体の量と比較した複合体生成の減少量によって示されるものであ る、前記アッセイ。 ６２．前記ＴＧＦ−βシグナル伝達経路のタンパク質メンバーが、ＭＡＤＲ１、 ＭＡＤＲ２、ＤＰＣ４、活性化ＴβＲ１、活性化ＡＬＫ６、活性化ＴＳＲ１ 、活性化ＡＬＫ３、または活性化ＡｃｔＲ１βである、請求項６１に記載の アッセイ。 ６３．rchd534タンパク質とfchd540タンパク質との相互作用を阻害する化合物を 投与することを含む、心臓血管病の治療方法。 ６４．２つのrchd534タンパク質分子間の相互作用を阻害する化合物を投与する ことを含む、心臓血管病の治療方法。 ６５．rchd534タンパク質と、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路のタンパク質メンバ ーとの相互作用を阻害する化合物を投与することを含む、心臓血管病の治療 方法。 ６６．前記ＴＧＦ−βシグナル伝達経路のタンパク質メンバーが、ＭＡＤＲ１、 ＭＡＤＲ２、ＤＰＣ４、活性化ＴβＲ１、活性化ＡｃｔＲ１ｂ、または活性 化ＡＬＫ６である、請求項６５に記載のアッセイ。 ６７．fchd540タンパク質と、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路のタンパク質メンバ ーとの相互作用を阻害する化合物を投与することを含む、心臓血管病の治療 方法。 ６８．前記ＴＧＦ−βシグナル伝達経路のタンパク質メンバーが、ＭＡＤＲ１、 ＭＡＤＲ２、ＤＰＣ４、活性化ＴβＲ１、活性化ＡＬＫ６、活性化ＴＳＲ１ 、活性化ＡＬＫ３、または活性化ＡｃｔＲ１βである、請求項６７に記載の 方 法。 ６９．ＴＧＦ−βシグナル伝達応答を増大させる物質を同定する方法であって、 （ａ）１）誘導ＴＧＦ−β調節要素と機能的な関連を有するレポーター遺伝子 ；２）rchd534タンパク質をコードする組換え遺伝子またはfchd540タン パク質をコードする組換え遺伝子；および３）ＭＡＤＲ１タンパク質を コードする組換え遺伝子またはＭＡＤＲ２タンパク質をコードする組換 え遺伝子を含む遺伝子操作された細胞と、試験物質とを接触させ、そし て （ｂ）前記レポーター遺伝子の発現を検出する ことを含み、試験物質のＴＧＦ−βシグナル伝達応答を増大させる能力が、試 験物質の不存在下における発現量と比較したレボーター遺伝子の発現の増加量 によって示されるものである、前記方法。
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