【発明の詳細な説明】
化合物発明の分野
本発明は、アミノピリミジン誘導体である新規化合物に関する。本発明はまた
、これらの化合物の製造方法、これらを含有する組成物およびこれらの医薬とし
ての使用を含む関連する態様にも関する。またこれらの化合物の製造に有用な化
学中間体も提供される。発明の背景
酸化窒素は哺乳類の細胞内で特異的な一酸化窒素合成酵素(NOS)の作用によっ
てＬ−アルギニンから産生される。これらの酵素は、二つの明確な種類−構成型
NOS（cNOS）および誘導型NOS（iNOS）−に分かれる。現時点では、二つの構成型
NOSおよび一つの誘導型NOSが確認された。この構成型NOSのうち、内皮型酵素（e
cNOS）は、平滑筋弛緩および血圧ならびに血流の調節に関与し、一方神経型酵素
(ncNOS)は、神経伝達物質として作用して、大脳虚血のような種々の生物学的機
能の調節に関与すると思われる。誘導型NOSは、特に炎症性疾患の病原に関連付
けられてきた。このためこれらの酵素の調節は、広範囲にわたる病気の状態の治
療においてかなりの可能性を与えるであろう(J．E．Macdonald，Ann．Rep．Med
．Chem.，1996，31，221−230)。発明の開示
本発明によると、式（Ｉ）：
｛式中：
R1は水素、C1 〜6−アルキル、C1 〜6−アルコキシ、ハロゲンまたはトリフルオ
ロメチルを表し；
R2は水素またはC1 〜6−アルキルを表し；
Ａは１〜３個のヘテロ原子（これらは同一であるかまたは異なっていてもよく
、Ｏ、ＮおよびＳから選択される）を含む５員複素芳香環；または１〜３個の窒
素原子を含む６員複素芳香環を表し；
（ｉ）R3はフェニル、１〜３個の窒素原子を含む６員複素芳香環、または１〜３
個のヘテロ原子（これらは同一であるかまたは異なっていてもよく、Ｏ、Ｎおよ
びＳから選択される）を含む５員複素芳香環を表し、このフェニルまたは複素芳
香環は、場合によりC1 〜6−アルキル、C2 〜6−アルケニル、C2 〜6−アルキニル
、C1 〜6−アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、C1 〜6−アルキルチオ、シアノ、
トリフルオロメチル、ニトロまたは基−NR5R6によって置換されていてもよく；
そして
R4、R5およびR6は独立して水素またはC1 〜6−アルキルを表すか；または
（ii）R3はC1 〜8−アルキル、C2 〜8−アルケニルまたはC2 〜8−アルキニルを表
し；そして
R4は水素またはC1 〜6−アルキルを表すか；または
（iii）R3およびR4は一緒になって(CH2)a・Ｚ・(CH2)bを表し、Ｚは、N(COOR7)
［ここで、R7はC1 〜6−アルキルまたはC1 〜6−ハロアルキルを表すか、またはR7
は基(CH2)nYR9（ここでｎは２から５までの整数を表し、ＹはＯ、Ｓまたは一つ
の結合を表し、そしてR9は場合によりハロゲンまたはニトロによって置換されて
いてもよいC1 〜6−アルキルを表すか、またはR9は場合によりC1 〜6−アルキル、
ハロゲンまたはニトロによって置換されて
いてもよいフェニルを表す）を表す］を表し；そして
ａおよびｂは、独立して整数１〜３を表すが、但しａ＋ｂは３または４である
か；または
（iv）R3およびR4は一緒になって(CH2)a・Ｚ・(CH2)bを表し、Ｚは、N(COR8)［
ここで、R8はフェニル、１〜３個の窒素原子を含む６員複素芳香環、または１〜
３個のヘテロ原子（これらは同一であるかまたは異なっていてもよく、Ｏ、Ｎお
よびＳから選択される）を含む５員複素芳香環を表し、このフェニルまたは複素
芳香環は、場合によりC1 〜6−アルキル、C1 〜6−アルコキシ、ハロゲン、ニトロ
、シアノ、トリフルオロメチル、C1 〜6−アルキルスルホニルまたはアミノスル
ホニルによって置換されていてもよい］を表し；そして
ａおよびｂは、独立して整数１〜３を表すが、但しａ＋ｂは３または４である
｝
を有する化合物またはその製薬上許容し得る塩、エナンチオマー、ラセミ化合物
または互変異性体が提供される。
本発明はさらに、このような化合物またはその製薬上許容し得る塩、エナンチ
オマー、ラセミ化合物または互変異性体の製造法を提供する。
本発明によりまた、薬剤として使用するための式（Ｉ）を有する化合物または
その製薬上許容し得る塩、エナンチオマー、ラセミ化合物または互変異性体が提
供される。
本発明はまた、一酸化窒素合成酵素活性の阻害が有効な疾病または状態の治療
または予防のための薬剤の製造における、式（Ｉ）を有する化合物またはその製
薬上許容し得る塩、エナンチオマー、ラセミ化合物または互変異性体の使用に関
する。
本発明のさらに特定的な態様によれば、炎症性疾患の治療または予防の
ための薬剤の製造における、式（Ｉ）を有する化合物またはその製薬上許容し得
る塩、エナンチオマー、ラセミ化合物または互変異性体の使用がある。
本発明により、また、一酸化窒素合成酵素活性の阻害が有効な疾病または状態
を治療するかまたはその危険性を低減する方法も提供され、この方法は、上記の
疾病または状態にあるかまたはその危険性のある患者に、治療上有効な量の式（
Ｉ）の化合物またはその製薬上許容し得る塩、エナンチオマー、ラセミ化合物ま
たは互変異性体を投与することより成る。
さらに特定すれば、炎症性疾患に罹患しているかまたはその危険性のある患者
における炎症性疾患を治療するかまたはその危険性を低減する方法も提供され、
この方法はこの患者に治療上有効な量の式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容
し得る塩、エナンチオマー、ラセミ化合物または互変異性体を投与することより
成る。
本発明の化合物はまた、第二の製薬上活性な物質と組み合わせて、特にシクロ
オキシゲナーゼの誘導型アイソフォーム(COX−２)の選択的阻害剤と組み合わせ
て、有利に使用することもできる。従って、本発明のさらに別の態様として、炎
症、炎症性疾患および炎症関連障害の治療のためのCOX−２阻害剤と組み合わせ
た、式(Ｉ)の化合物またはその製薬上許容し得る塩、エナンチオマー、ラセミ化
合物または互変異性体の使用がある。そしてまた、下記の疾病または状態にある
かまたはその危険性のある患者における炎症、炎症性疾患および炎症関連障害を
治療するかまたはその危険性を低減する方法も提供されるが、この方法はこの患
者に治療上有効な量のCOX−２阻害剤と組み合わせた式(Ｉ)の化合物またはその
製薬上許容し得る塩、エナンチオマー、ラセミ化合物または互変異性体を投与す
ることより成る。
好ましくは、Ａはチエノ環を表す。特に好ましい態様は、式（Ｉ）の化合物が
チエノ［2,3-d］ピリミジンまたはチエノ［3,2-d］ピリミジンである場合である
。
もう一つの好ましい態様においては、Ａはピリド環を表す。特に好ましい態様
は、式（Ｉ）の化合物がピリド［2,3-d］ピリミジン、ピリド［3,2-d］ピリミジ
ン、ピリド［3,4-d］ピリミジンまたはピリド［4,3-d］ピリミジンである場合で
ある。式(Ｉ)のピリド［3,2-d］ピリミジン化合物が最も好ましい。
好ましくは、R3はフェニル、シクロプロピル、エチル、チアゾリル、ェチニル
またはフラニルを表す。
R3およびR4が式（Ｉ）における選択的定義(iii)による別の好ましい態様にお
いては、ＺはN(COOC2H5)を表し、そしてａおよびｂは各々数値２を有する。
特に好ましい本発明の化合物としては：
７−アミノ−4,5−ジヒドロ−５−フェニルチエノ［3,2-d］ピリミジン；
５−シクロプロピル−4,5−ジヒドロ−７−アミノチエノ［3,2-d］ピリミジン
；
５−エチル−4,5−ジヒドロ−７−アミノチエノ［3,2-d］ピリミジン；
５−（２−チアゾリル）−4,5−ジヒドロ−７−アミノチエノ［3,2-d］ピリミ
ジン；
５−（２−フリル）−4,5−ジヒドロ−７−アミノチエノ［3,2-d］ピリミジン
；
７−アミノ−4,5−ジヒドロ−５−エチニルチエノ［3,2-d］ピリミジン；
7'−アミノスピロ［ピペリジン−4,5'(4'H)−チエノ[3,2-d]ピリミジン］−１
−カルボン酸エチル；
4'−アミノ−3'−クロロスピロ［ピペリジン−4,6'（7'H）−チエノ［2,3-d］
ピリミジン］−１−カルボン酸エチル；
4'−アミノ−（４−シアノベンゾイル）−スピロ［ピペリジン−4,2'−（1'H
）−（ピリド［3,2-d］ピリミジン）］；
4'−アミノ−（２−チエノイル）−スピロ［ピペリジン−4,2'−（1'H）−（
ピリド［3,2-d］ピリミジン）］；
4'−アミノスピロ［ピペリジン−4,2'−（1'H）−（ピリド［3,2-d］ピリミジ
ン）］−１−カルボン酸エチル；
4'−アミノ−（４−シアノベンゾイル）−スピロ［ピペリジン−4,2'−（1'H
）−（ピリド［3,4-d］ピリミジン）］；
4'−アミノスピロ［ピペリジン−4,2'−（1'H）−（ピリド［3,4-d］ピリミジ
ン）］−１−カルボン酸エチル；
4'−アミノ−（４−シアノベンゾイル）−スピロ［ピペリジン−4,2'−（1'H
）−（ピリド［4,3-d］ピリミジン）］；
4'−アミノスピロ［ピペリジン−4,2'−（1'H）−（ピリド［2,3-d］ピリミジ
ン）］−１−カルボン酸エチル；
４−アミノ−２−（２−チエニル）−ピリド［3,2-d］ピリミジン；
7'−アミノ−１−（６−シアノ−３−ピリジンカルボニル）スピロ［ピペリジ
ン−4,5'−（4'H）−（チエノ［3,2-d］ピリミジン）］；
および、その製薬上許容し得る塩、エナンチオマーまたは互変異性体がある。
特記しない限り、本明細書中で言及される用語“C1 〜6−アルキル”とは、１
〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖状アルキル基または３〜６
個の炭素原子を有する環状アルキル基を意味する。このような基の例としては、
メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−
ブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルがある。
特記しない限り、本明細書中で言及される用語“C2 〜6−アルケニル”は、２
〜６個の炭素原子を有し、１個の二重結合を包含する直鎖または分枝鎖状アルキ
ル基または３〜６個の炭素原子を有し、１個の二重結合を包含する環状アルキル
基を意味する。このような基の例としては、エテニル、１−および２−プロペニ
ル、２−メチル−２−プロペニル、２−ブテニル、シクロペンテニルおよびシク
ロヘキセニルがある。
特記しない限り、本明細書中で言及される用語“C2 〜6−アルキニル”は、２
〜６個の炭素原子を有し、１個の三重結合を包含する直鎖または分枝鎖状アルキ
ル基を意味する。このような基の例としては、エチニル、１−および２−プロピ
ニルおよび２−ブチニルがある。
特記しない限り、本明細書中で言及される用語“C1 〜6−アルコキシ”は、１
〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖状アルコキシ基を意味する。このよ
うな基の例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、
ｎ−ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓ−ブトキシおよびｔ−ブトキシがある。
その他の基、例えばアルキルチオ、ハロアルキル、アルキルスルホニルは同様
に解釈されるべきである。
本発明の化合物またはその製薬上許容し得る塩、エナンチオマー、ラセミ化合
物または互変異性体の製造のための上述の方法は
（ａ）式（II）
（式中、Ａ、R1およびR2は上に定義したとおりである）の化合物と式(III)
R3COR4 （III）
（式中、R3およびR4は上に定義したとおりである）の化合物またはそのアセター
ル誘導体との反応；または
（ｂ）式（IV）または（IV'）
（式中、Ａ、R1、R2、Ｒ3およびR4は上に定義したとおりであり、そしてR8はア
ルキル基を表す）の化合物とアンモニアまたはその等価物との反応；または
（ｃ）R5およびR6の一方または両方が水素を表す相当する化合物のアルキル化に
よる式（Ｉ）［式中、R3およびR4は上に示した式（Ｉ）の一般的な
定義における選択的定義（ｉ）のとおりであり、そしてR5およびR6の一方または
両方は、C1 〜6−アルキルを表す］の化合物の製造；または
（ｄ）R2が水素を表す相当する化合物のアルキル化による式（Ｉ）（式中、R2は
、C1 〜6−アルキルを表す）の化合物の製造；または
（ｅ）１個以上の窒素原子および／または別の原子が保護されている式（Ｉ）の
化合物の脱保護；または
（ｆ）式（Ｖ）（式中、Ａ、R1、R2、ａおよびｂは上に定義したとおりである）の化合物を式（
VI）
Ｘ−Ｌ （VI）
（式中、ＸはCOOR7またはCOR8を表し、R7およびR8は、上記のとおりであり、そ
してＬは脱離基である）の化合物と反応させることによる式（Ｉ）［式中、R3お
よびR4は上に示した式（Ｉ）の一般的な定義における選択的定義(iv)のとおりで
ある］の化合物の製造
よりなり、そして所望または必要な場合には得られる式（Ｉ）の化合物またはそ
の別の塩をその製薬上許容し得る塩に変換するかまたはその逆を行ない、そして
所望の場合には得られる式（Ｉ）の化合物をその光学異性体に変換する
ことより成る。
方法（ａ）においては、式（II）の化合物と式（III）の化合物との反応
は、これらの反応物を不活性溶媒中で、室温とこの溶媒の沸点との間の温度で72
時間までの期間、または反応が完了するまで、撹拌することによって実施するこ
とができる。本発明において、式（III）の化合物を保護された形で、例えばジ
エトキシアセタールのようなアセタールとして使用することがしばしば好都合で
あることが見出された。このときこの方法は好ましくは、酸触媒の存在下で実施
する。必要なアセタールは、未保護の式（III）の化合物を当技術分野で周知の
方法を用いてエタノールのようなアルコールと反応させることによって形成する
ことができる。
方法（ｂ）においては、この反応は、不活性極性溶媒中の式（IV）または(IV'
)の化合物の溶液を通してアンモニアガスを泡立たせることによって実施するこ
とができる。別法として、この反応は、極性プロトン性溶媒中の式（IV）または
（IV')の化合物の溶液をアンモニア水、アセトニトリル中のアンモニアで、また
はメタノール性アンモニアで処理するか、または式（IV）または（IV')の化合物
をアルコール溶液中のヨウ化アンモニウムおよびアンモニアで処理することによ
って実施することができる。
方法（ｃ）および（ｄ）においては、アルキル化反応は、当技術分野で周知の
方法によって実施することができる。例えば、アミンをハロゲン化アルキル、特
に臭化またはヨウ化アルキルと反応させることができる。
方法（ｅ）においては、アミンの保護基としてはアルキル、アラルキル、アシ
ル、アシルスルホニル、アリールスルホニルおよびトリアルキルシリルがある。
末端アルキンもまた、トリアルキルシリル基を用いて保護することができる。保
護基がトリアルキルシリルであるときは、この基は、例えばフッ化テトラ−ｎ−
ブチルアンモニウムを用いて除去することができる。その他の保護基およびその
除去の方法の詳細については、GreeneおよびWutsによる標準的なテキスト“Prot
ecting Groups in Organic
Synthesis”、第２版（1991）を参照することができる。
方法（ｆ）においては、反応は不活性溶媒中で適当な温度で塩基、例えばピリ
ジンの存在下で両反応物を化合させることによって実施することができる。多数
の標準的な脱離基Ｌが適当であるけれども、本発明において、Ｌがハロゲン、特
に塩素または臭素を表すのが好ましい。
本発明は塩、特に酸付加塩の形態の式（Ｉ）の化合物を包含する。適当な塩に
は、有機酸および無機酸の両方によって形成される塩が包含される。製薬上許容
し得ない酸の塩は、問題の化合物の製造および精製に有用であるかもしれないけ
れども、上記のような酸付加塩は普通、製薬上許容できるであろう。従って、好
ましい塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ピ
ルビン酸、酢酸、琥珀酸、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸およびべン
ゼンスルホン酸から形成される塩が包含される。
式（Ｉ）の化合物の塩は遊離塩基、またはその塩、エナンチオマーまたは互変
異性体を１当量以上の適当な酸と反応させることによって形成させることができ
る。この反応は、その塩がそれに不溶である溶媒または媒質中、またはその塩が
それに可溶である溶媒、例えば水、ジオキサン、エタノール、テトラヒドロフラ
ンまたはジエチルエーテル、または溶媒の混合物中で実施することができ、これ
らの溶媒は、真空でまたは凍結乾燥によって除去することができる。この反応は
また、複分解法であってもよく、またはそれはイオン交換樹脂上で実施すること
ができる。
式（II）、（IV）、（IV'）および(Ｖ)の新規な中間体は、本発明の別の態様
を形成する。
式（II）の化合物は、式（VII）
（式中、Ａ、R1およびR2は上に定義したとおりである）の化合物の還元によって
製造することができる。
この還元法は、式（VII）の化合物を炭素上のパラジウムまたはアルミナ上の
ロジウムまたはラニーニッケルの存在下で高められた温度および圧力、典型的に
は65℃、30気圧で水素で処理することによって実施することができる。
式（VII）の化合物は、式（VIII）
（式中、Ａ、R1およびR2は上に定義したとおりである）の化合物とヒドロキシル
アミン塩酸塩との反応によって製造することができる。
この反応においては、二つの反応物をメタノール中でナトリウムメトキシドの
ような塩基の存在下で一緒に加熱することができる。
式（II）の化合物の別製法として、式（VIII）の化合物を酸の存在下でエタノ
ールのような第一アルコールで処理し、続いて塩化アンモニウムで処理して式（
II）の化合物を得ることができる。または式（VIII）の化合物はトルエンのよう
な溶媒中でトリメチルアルミニウムと塩化アンモニウムとの混合物で処理するこ
とができる。
式（II）の化合物のさらに別の製法として、式（IX）
（式中、Ａ、R1およびR2は上に定義したとおりである）の化合物をアンモニアで
処理することができる。
例えばメールワイン試薬を使用する予備活性化工程が普通は必要であるけれど
も、この反応は標準的な条件下で起こる。
式（III）、（VIII）および（IX）の化合物は、公知であるかまたはそれ自体
公知の一般的な方法によって製造することができる。
R2がC1 〜6−アルキルを表す式（VIII）および（IX）の化合物は、上記方法（
ｄ）に従って、R2が水素を表す相当する式（VIII）または（IX）の化合物をアル
キル化することによって製造することができる。
式（IV）の化合物は、式（Ｘ）
（式中、Ａ、R1およびR2は上に定義したとおりである）の化合物をヨウ化アルキ
ルの存在下で式（III）の化合物と反応させることによって製造することができ
る。
この反応のための条件は、方法（ａ）について上記したものと同様であ
る。
式（Ｘ）の化合物は、式（IX）の化合物をロウェッソン（Lawesson）試薬で処
理することによって製造することができる。
式（II）の化合物はまた、式（Ｘ）の化合物をハロゲン化アルキル（特にヨウ
化アルキル）で処理することによって相当するアルキルチオ誘導体に変換し、続
いて上記方法（ｂ）の工程と類似した工程に従ってアンモニアと反応させること
によって製造することもできる。
中間化合物は、保護された形態で使用することができる。保護基およびその除
去のための方法の詳細については、GreeneおよびWutsによる標準的なテキスト“
Protecting Groupsin Organic Synthesis”、第２版（1991）を参照することが
できる。
本発明の化合物およびそれへの中間体は、標準的な方法を使用してその反応混
合物から単離し、もし必要ならばさらに精製することができる。
式（Ｉ）の化合物は、エナンチオマー形態であってもよい。そのため、すべて
のエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ化合物およびそれらの混合物類は
本発明の範囲内に包含される。
種々の光学異性体は、一般に行われている方法、例えば分別結晶またはHPLCを
使用する本化合物のラセミ混合物の分離によって単離することができる。
中間化合物はまた、エナンチオマー形態であってもよく、精製したエナンチオ
マー、ジアステレオマー、ラセミ化合物またはそれらの混合物として使用するこ
とができる。
式（Ｉ）の化合物は別の互変異性体の形態であってもよい。式（Ｉ）の化合物
は、別の互変異性体の形態でか、またはそれらの混合物として提供される。
式（Ｉ）の化合物、およびその製薬上許容し得る塩、エナンチオマー、ラセミ
化合物および互変異性体は、これらが動物に対し薬理学的活性を有するので有用
である。特にこれらの化合物は、一酸化窒素合成酵素の阻害剤として活性である
。さらに特定すれば、これらは、マクロファージ中に存在する一酸化窒素合成酵
素の誘導型アイソフォームの阻害剤であって、それ自体、例えば抗炎症剤として
、治療に有用であることが予測できる。
本化合物およびその製薬上許容し得る塩、エナンチオマー、ラセミ化合物およ
び互変異性体は、一酸化窒素合成酵素の合成または過剰合成が関与している疾病
または状態の治療または予防に使用するために必要である。特に、本化合物はヒ
トを含む哺乳動物における炎症状態の治療に使用するのに必要である。
特に対象となる状態としては、以下のものがある：
変形性関節症、慢性関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、痛風性関節炎およびそ
の他の関節炎状態、炎症を起こした関節；
湿疹、乾癬、皮膚炎または日焼けのようなその他の炎症性皮膚状態；
ブドウ膜炎および結膜炎を含む炎症性の眼の状態；
炎症が関与している肺疾患、例えば喘息、気管支炎、ハト愛好家病、農夫肺、
急性呼吸窮迫症候群；
菌血症、内毒素血症（敗血症性ショック）、アフタ性潰瘍、歯肉炎、ピレシス
（pyresis）、疼痛および膵炎；
クローン病、萎縮性胃炎、多形胃炎（gastritis varialoforme）、潰瘍性大腸
炎、ツェリアキー、局部性回腸炎、消化性潰瘍、過敏性腸症候群、例えばヘリコ
バクター・ピロリによる感染または非ステロイド系抗炎症剤を用いた治療の結果
として起こる胃腸管への損傷を包含する胃腸管の状態；およびその他の炎症に関
連する状態。
本化合物はまた、急性もしくは持続性の炎症性または神経障害性の痛みまたは
中枢起源の痛みの治療および緩和にも有用である。
式（Ｉ）の化合物およびその製薬上許容し得る塩、エナンチオマー、ラセミ化
合物および互変異性体はまた、上述以外の疾病または状態の治療または予防にも
有用であり得る。例えば、これらの化合物は、アテローム性動脈硬化症、嚢胞性
線維症、敗血症性および／または毒性ショックに関連する低血圧の治療において
、免疫系の機能不全の治療において、臓器移植治療における短期免疫抑制に対す
るアジュバントとして、糖尿病に関連する血管性合併症の治療において、そして
サイトカイン、例えばTNFまたはインターロイキンとの併用治療において有用で
あり得る。
式（Ｉ）の化合物はまた、神経細胞系イソ型の一酸化窒素合成酵素に対しても
阻害活性を示す。従ってこれらはまた、例えば心停止および発作の場合における
低酸素症；低酸素症、低血糖症、癲癇のような疾病および外部創傷（脊髄および
頭部損傷のような）における神経変性および／または神経壊死、高圧酸素痙攣お
よび中毒、痴呆、例えば初老期痴呆、アルツハイマー病およびエイズ関連痴呆、
シドナム舞踏病、パーキンソン病、ツーレット症候群、ハンチントン病、筋萎縮
性側索硬化症、コルサコフ病、大脳血管障害に関連する痴愚、睡眠障害、精神分
裂病、鬱病、自閉症、季節性情動障害、時差ぼけ、月経前症候群(PMS)に関連す
る抑鬱またはその他の症状、不安および敗血症性ショックを包含する神経変性疾
患の治療にも有用であり得る。式（Ｉ）の化合物はまた、アヘン剤およびジアゼ
ピン類に対する耐性の予防および逆転、薬物嗜癖の治療、片頭痛およびその他の
血管性頭痛、神経原性炎症の治療において、胃腸運動性障害、ガンの治療におい
て、そして分娩の誘発において活性を示すことを期待することもできる。
上述した治療適応のためには、投与する用量はもちろん、使用する化合物、投
与方法および所望の治療によって変わるであろう。しかしながら一般には、満足
すべき結果は、本化合物を固体の形態で１日に１mgと2000mgとの間の用量で投与
する場合に得られる。
式（Ｉ）の化合物およびその製薬上許容し得る誘導体は、独立して、またはそ
の化合物または誘導体が製薬上許容し得るアジュバント、希釈剤またはキャリヤ
ーと混合された適当な医薬組成物の形態で使用することができる。投与は、腸内
（経口、舌下または直腸を含む）、鼻内、静脈内、局所またはその他の非経口経
路によってよいが、これらに限定はされない。適当な医薬製剤の選択および製造
のための一般的な手順は、例えば“Pharmaceuticals−The Science of Dosage F
orm Designs"，M．E．Aulton，Churchill Livingstone，1988に記載されている
。本医薬組成物は、好ましくは80％未満、そしてさらに好ましくは50％未満の式
（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容し得る塩、エナンチオマー、ラセミ化合物
または互変異性体を包含する。
また、成分を混合することより成るこのような医薬組成物の製法も提供される
。
式(Ｉ)の化合物およびその製薬上許容し得る誘導体はまた、COX−２阻害剤と
組み合わせて有利に使用することもできる。特に好ましいCOX−２阻害剤はセレ
コキシブ(Celecoxib)およびMK−966である。NOS阻害剤およびCOX−２阻害剤は、
単一投与単位で投与するための同一医薬組成物中で一緒に処方するか、また各々
の成分を個々に処方して別々の用量を同時にまたは逐次投与することができるよ
うにすることができる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、決してこれらに限定する
ものではない。
製造例 １
２−アミジノ−３−アミノピリジン塩酸塩
（ａ）３−アジド−２−シアノピリジン
DMF（30ml）中の３−ブロモ−２−シアノピリジン(Chem．Pharm．Bull.，1985
，33，565)(2.6g、14.2ミリモル)およびアジ化ナトリウム（1.0ｇ、15.3ミリモ
ル）の溶液を16時間90℃に加熱した。得られた混合物を冷却し、水を加えて、こ
の全体を酢酸エチルで抽出した。合わせた抽出物を飽和ブラインで洗浄して、硫
酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を蒸発させると生成物が油状物として得ら
れた。これを溶離剤として酢酸エチル／ガソリン（１：３〜１：１）を用いて溶
離するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、
生成物を得た。
（ｂ）３−アミノ−２−シアノピリジン
エタノール(100ml)中の３−アジド−２−シアノピリジン(1.44ｇ、9.9ミリモ
ル)の溶液を室温、3.5p.s.iで18時間、炭素上のパラジウム（10％、50mg）上で
水素化した。触媒をセライト（Celite）上で濾去して、濾液を濃縮すると、生成
物（1.16ｇ）が得られた。
（ｃ）３−アミノ−２−(アミノ（ヒドロキシイミノ）メチル)ピリジン
エタノール（10ml）中の３−アミノ−２−シアノピリジン(1.18ｇ、9.9ミリモ
ル)、ナトリウムメトキシド（0.64ｇ、12ミリモル）およびヒドロキシルアミン
塩酸塩（0.83ｇ、12ミリモル）の懸濁液を１時間加熱して還流させた。混合物を
濾過し、濾液を濃縮して油状物を得た。これを溶離剤
としてジクロロメタン／メタノール（50：１〜10：１）を用いて溶離するシリカ
ゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物を黄色
固体（0.82ｇ）として得た、
（ｄ）２−アミジノ−３−アミノピリジン塩酸塩
エタノール（200ml）中の３−アミノ−２−（アミノ(ヒドロキシイミノ)メチ
ル）ピリジン（0.82g、5.4ミリモル）および湿潤ラニーニッケル（約0.1ｇ）の
懸濁液を３気圧の水素下、60℃で16時間撹拌した。触媒を濾去し、溶媒を蒸発さ
せて、生成物を油として得た。これを少量のエタノールに溶解させた。エーテル
中の塩化水素（１Ｎ、11ml）を撹拌しながら加えて、沈殿を濾過によって集めて
、固体を得た。
製造例 ２
４−アミジノ−３−アミノピリジン塩酸塩
（ａ）3,5−ジクロロ−４−ホルミルピリジン
ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中1.6Ｍ、9.3ml、14.9ミリモル）を０℃で、TH
F（30ml）中のジイソプロピルアミン(1.95ml、14.9ミリモル)の溶液に滴加した
。０℃で15分後にこの溶液を−78℃に冷却して、3,5−ジクロロピリジン(2.0ｇ
、13.5ミリモル)を加えた。１時間後にギ酸メチル（0.92ml）を加えて、混合物
を２時間かけて室温まで昇温させ、１Ｎ塩酸で希釈し、酢酸エチルで２回抽出し
た。抽出物をブラインで洗浄して、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させて、
黄色油状物を得たが、このもの
は固化した。融点110〜111℃
（ｂ）3,5−ジクロロ−４−シアノピリジン
水（20ml）中の3,5−ジクロロ−４−ホルミルピリジン（1.0g、5.68ミリモル
）およびヒドロキシルアミン−Ｏ−スルホン酸(0.96ｇ、8.5ミリモル)の懸濁液
を16時間70℃で加熱した後、冷却し、酢酸エチルで２回抽出した。抽出物をブラ
インで洗浄して、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を蒸発させて、生成物を
油状物として得た。これをジクロロメタン／メタノール（10：１）で溶離するシ
リカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物を
得た。
（ｃ）５−アジド−３−クロロ−４−シアノピリジン
この化合物を、3,5−ジクロロ−４−シアノピリジンから製造例１(ａ)の方法
に従って製造して固体を得た。
（ｄ）５−アミノ−３−クロロ−４−シアノピリジン
塩化スズ（II）(1.42ｇ、7.5ミリモル)を、エタノール（20ml）および水（0.3
ml）中の５−アジド−３−クロロ−４−シアノピリジン（0.9ｇ、５ミリモル）
の溶液に加えた。泡立ちが起こった。混合物を１時間撹拌した後、酢酸エチルで
２回抽出した。抽出物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液で２回洗浄して、硫酸ナト
リウム上で乾燥させた。溶媒を蒸発させて生成物を油状物として得た。これをジ
クロロメタン／メタノール（10：１）で溶離するシリカゲル上のフラッシュカラ
ムクロマトグラフィーによって精製して生成物を得た。
（ｅ）４−アミジノ−３−アミノピリジン塩酸塩
この化合物を、５−アミノ−３−クロロ−４−シアノピリジンから製造例１、
工程（ｃ）および（ｄ）の方法に従って製造して固体を得た。
製造例 ３
３−アミジノ−４−アミノピリジン塩酸塩
（ａ）４−アミノ−３−シアノピリジン
この化合物を４−アミノ−３−ホルミルピリジンから製造例２(ｂ)の方法に従
って製造して、生成物を白色固体として得た。
（ｂ）３−アミジノ−４−アミノピリジン
トルエン中の塩化アンモニウム（430mg、8.1ミリモル）に５℃でトリメチルア
ルミニウム（ヘキサン中２Ｍ、4ml、8.1ミリモル）を加えて、混合物を室温で2
時間撹拌した。４−アミノ−３−シアノピリジン(320mg、2.7ミリモル)を加えて
、反応混合物を一晩80℃で加熱した。この混合物を冷却して、クロロホルム中の
アルムナ上に注加し、エタノールでクェンチして濾過した。濾液を濃縮し、エー
テルで摩砕して固体を得た。
実施例 １
７−アミノ−4,5−ジヒドロ−５−フェニルチエノ［3,2-d］ピリミジン塩酸塩
（ａ）３−アミノチオフェン−２−チオカルボキサミド
テトラヒドロフラン中の３−アミノチオフェン−２−カルボキサミド（4.5ｇ
、31ミリモル）の溶液をロウェッソン（Lawesson）試薬（7.7ｇ、190ミリモル）
で処理して、この溶液を室温で18時間撹拌した。溶媒を除去して、残留物を、溶
離剤としてジクロロメタンを使用するシリカゲル上のクロマトグラフィーによっ
て精製した。生成物を黄色粉末(2.8ｇ、56％)として得た。融点98〜99℃
（ｂ） 4,5−ジヒドロ−７−（メチルチオ）−５−フェニルチエノ［3,2-d］ピ
リミジンヨウ化水素酸塩
アセトニトリル中の３−アミノチオフェン−２−チオカルボキサミド（1.0g、
6.3ミリモル）、ヨウ化メチル（0.39ml、6.3ミリモル）およびベンズアルデヒド
（0.67ｇ、6.3ミリモル）の溶液を室温で18時間撹拌した。
生成物を濾過によって集めて、アセトニトリルで洗浄し、次にエーテルで洗浄し
、乾燥させた（1.58ｇ、64％）。融点193〜194℃
（ｃ）4,5−ジヒドロ−７−アミノ−５−フェニルチエノ［3,2-d］ピリミジン塩
酸塩
アセトニトリル中の4，5−ジヒドロ−７−（メチルチオ）−５−フェニルチエ
ノ［3,2-d］ピリミジンヨウ化水素酸塩（0.5ｇ、1.29ミリモル）の溶液を乾燥ア
ンモニアガスで飽和させた後、20時間還流温度で加熱した。溶媒を除去し、残留
物をエーテル／エタノール混合物で摩砕して、ヨウ化水素酸塩（92mg）を吸湿性
粉末として得た、融点179〜181℃。この物質を中和し、続いてエーテル中の過剰
の塩化水素で処理することによって塩酸塩（融点229〜231℃）に変換した。
実施例 ２
実施例１と同様の方法に従って、下記の化合物を製造した：
（ａ）５−シクロプロピル−4,5−ジヒドロ−７−アミノチエノ［3,2-d］
ピリミジン塩酸塩，融点195〜196℃
（ｂ）５−エチル−4,5−ジヒドロ−７−アミノチエノ［3,2-d］ピリミジンヨウ
化水素酸塩，融点177℃
（ｃ）５−(２−チアゾイル)−4,5−ジヒドロ−７−アミノチエノ[3,2-d]ピリミ
ジンヨウ化水素酸塩三水和物，融点194〜195℃
（ｄ）５−(２−フリル)−4,5−ジヒドロ−７−アミノチエノ[3,2-d]ピリミジン
ヨウ化水素酸塩三水和物，融点239〜240℃
実施例 ３
７−アミノ−4,5−ジヒドロ−５−エチニルチエノ［3,2-d］ピリミジン塩酸塩
（ａ）実施例１と同様の方法に従って、下記の化合物を製造した：
７−アミノ−4,5−ジヒドロ−５−（２−（トリメチルシリル）エチニル）チ
エノ［3,2-d］ピリミジンヨウ化水素酸塩，MS m／z 250〔M+H〕+
（ｂ）７−アミノ−4,5−ジヒドロ−５−エチニルチエノ[3,2-d]ピリミジン塩酸
塩
テトラヒドロフラン中の工程（ａ）の生成物(0.47ｇ、1.9ミリモル)の溶液を
フッ化テトラブチルアンモニウム(THF中１Ｍ、2.27ml、2.27ミリモル)で処理し
た。この溶液を室温で18時間撹拌し、溶媒を減圧除去した。残留物を、ジクロロ
メタン／メタノール混合物を使用する酸化アルミニウム［ブロックマン(Brockma
n)グレード、中性］上のクロマトグラフィーによって精製して、粗生成物画分を
分取逆相hplcによってさらに精製した。生成物画分を濃縮し、エーテル中の過剰
の塩化水素で処理すると、塩酸塩が沈殿した。エーテルで摩砕後に標題化合物塩
酸塩をクリーム色の粉末（14.2mg）として得た。融点194〜196℃
実施例 ４
7'−アミノスピロ［ピペリジン−4,5'−（4'H）−（チエノ−［3,2-d］ピリミジ
ン）］−１−カルボン酸エチルヨウ化水素酸塩
（ａ）7'−(メチルチオ)スピロ［ピペリジン−4,5'−(4'H)−（チエノ−［3,2-d
］ピリミジン）］−１−カルボン酸エチルヨウ化水素酸塩
アセトニトリル中の３−アミノチオフェン−２−チオカルボキサミド（0.5ｇ
、3.16ミリモル）、ヨウ化メチル（0.2ml、3.16ミリモル）およびＮ−カルボエ
トキシ−４−ピペリドン（0.47ml、3.16ミリモル）の溶液を、室温で18時間撹拌
した。生成物を濾過によって集めて、アセトニトリルで洗浄し、乾燥させて明黄
色固体（0.88ｇ）を得た。
（ｂ）7'−アミノスピロ［ピペリジン−4,5'−(4'H)−(チエノ−［3,2-d］ピリ
ミジン)］−１−カルボン酸エチルヨウ化水素酸塩
最小容量のアセトニトリル中の実施例４（ａ）の生成物（0.88ｇ、1.94ミリモ
ル）およびヨウ化アンモニウム（0.28ｇ、1.94ミリモル）の混合物を乾燥アンモ
ニアで飽和させ、次に６時間還流温度で加熱した。溶媒を蒸発させ、残留物をジ
クロロメタン／メタノール混合物で溶離する中性アルミナ上のクロマトグラフィ
ーによって精製して、エーテルで摩砕後に生成物をレモン色の粉末(0.15ｇ)とし
て得た。融点239℃（143℃で軟化）
実施例 ５
4'−アミノ−3'−クロロスピロ［ピペリジン−4,6'(7'H)−チエノ[2,3-d]ピリミ
ジン］−１−カルボン酸エチル塩酸塩
（ａ）３−アミジノ−２−アミノ−４−クロロチオフェン塩酸塩
トリメチルアルミニウム（トルエン中2.0Ｍ、8.33ミリモル、4.2ml）を、５℃
で撹拌したトルエン（10ml）中の塩化アンモニウム(446mg、8.33ミリ
モル)の溶液に滴加した。室温で２時間後に２−アミノ−４−クロロ−３−シア
ノチオフェン(440mg、2.78ミリモル)を少しずつ10分かけて加え、この溶液を２
時間80℃に加熱し、冷却して、シリカ（２ｇ）上に注加して、この混合物を撹拌
しながらメタノール（10ml）で処理した。５分後に、混合物を濾過し、固体をメ
タノールで洗浄し、濾液を蒸発させて、粗生成物を褐色固体(640mg)として得た
。
（過剰の塩化アンモニウムに対するシグナルでもある）
（ｂ）4'−アミノ−3'−クロロスピロ［ピペリジン−4,6'(7'H)−チエノ［2,3-d
］ピリミジン］−１−カルボン酸エチル塩酸塩
３−アミジノ−２−アミノ−４−クロロチオフェン塩酸塩（130mg）を、Ｎ−
カルボエトキシ−４−ピペリドン（0.6ミリモル、0.1ml）とともに２時間90℃で
加熱し、冷却し、蒸発させた。残留物をジクロロメタン／メタノール混合物で溶
離する中性アルミナ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、
生成物をジエチルエーテル中の１Ｎ塩化水素で処理してベージュの固体を得た。
実施例 ６
4'−アミノ−(４−シアノベンゾイル)−スピロ[ピペリジン−4,2'−[1'H]−（ピ
リド［3,2-d］ピリミジン）]塩酸塩
エーテル中の１Ｍ塩化水素（３ml）およびエタノール（15ml）中の２−アミジ
ノ−３−アミノピリジン塩酸塩（0.22ｇ、1.05ミリモル）、１−
（４−シアノベンゾイル）−４−ピペリドンエチレンケタール（1.08ｇ、3.98ミ
リモル）の溶液を、70℃で18時間撹拌した。混合物を冷却し、濃縮し、溶離剤と
してジクロロメタン／メタノール（10：１〜５：１）を用いて溶離する中性アル
ミナ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物を黄色
固体として得た。融点173〜175℃
実施例 ７
4'−アミノ−(２−チエノイル)−スピロ［ピペリジン−4,2'−［1'H］−（ピリ
ド［3,2-d］ピリミジン）］塩酸塩
この化合物を実施例６の方法に従って２−アミジノ−３−アミノピリジン塩酸
塩から製造して黄色固体を得た。融点144〜145℃
実施例 ８
4'−アミノスピロ［ピペリジン−4,2'−［1'H］−（ピリド−［3,2-d］ピリミジ
ン）］−１−カルボン酸エチル塩酸塩
この化合物を実施例６の方法に従って２−アミジノ−３−アミノピリジン塩酸
塩から製造して黄色固体を得た。融点135〜136℃
実施例 ９
4'−アミノ−(４−シアノベンゾイル)−スピロ[ピペリジン−4,2'−[1'H]−（ピ
リド−［3,4-d］−ピリミジン）]塩酸塩
この化合物を実施例６の方法に従って４−アミジノ−３−アミノピリジン塩酸
塩から製造して黄色固体を得た。
実施例 10
4'−アミノスピロ［ピペリジン−4,2'−［1'H］−（ピリド−［3,4-d］ピリミジ
ン）］−１−カルボン酸エチル塩酸塩
この化合物を実施例６の方法に従って４−アミジノ−３−アミノピリジン塩酸
塩から製造して黄色固体を得た。
実施例 11
4'−アミノ−(４−シアノベンゾイル)−スピロ[ピペリジン−4,2'−[1'H]−（ピ
リド−［4,3-d］−ピリミジン）]塩酸塩
エタノール（20ml）中の３−アミジノ−４−アミノピリジン（0.56ｇ）、１−
(４−シアノベンゾイル)−４−ピペリドンエチレンケタール(1.08ｇ、3.98ミリ
モル)および炭酸カリウム(0.5ｇ)の懸濁液を70℃で48時間撹拌した。混合物を冷
却し、濃縮し、ジクロロメタン／メタノール（20：１〜１：１）で溶離する中性
アルミナ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物を
白色固体として得た。実施例 12
4'−アミノスピロ［ピペリジン−4,2'−［1'H］−（ピリド［2,3-d］ピリミジン
）］−１−カルボン酸エチル塩酸塩
（ａ）3',4'−ジヒドロ−4'−オキソスピロ［ピペリジン−4,2'−［1'H］−（ピ
リド［2,3-d］ピリミジン）］−１−カルボン酸エチル
エーテル中の１Ｍ塩化水素（３ml）およびエタノール（10ml）中の３−
アミド−２−アミノピリジン（0.5ｇ、3.6ミリモル）、Ｎ−カルボエトキシ−４
−ピペリドン(0.7ｇ、4.02ミリモル)および３Ａ分子篩（４ｇ）を１時間還流温
度で加熱した。混合物をシリカゲル上に吸収させ、ジクロロメタン／メタノール
（20：１〜５：１）で溶離するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフ
ィーによって精製して、生成物を白色固体(0.8ｇ)として得た。
（ｂ）3',4'−ジヒドロ−4'−チオキソスピロ［ピペリジン−4,2'−［1'H］−（
ピリド［2,3-d］ピリミジン）］−１−カルボン酸エチル
ジオキサン（15ml）中の3',4'−ジヒドロ−4'−オキソスピロ[ピペリジン−4,
2'−[1'H]−(ピリド［2,3-d］ピリミジン)]−１−カルボン酸エチル（0.74ｇ、2
.55ミリモル）およびロウェッソン(Lawesson)試薬(0.62ｇ、1.5ミリモル)の溶液
を２時間還流温度で加熱した。混合物をシリカゲル上に吸収させ、ジクロロメタ
ン／メタノール（50：１）で溶離するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマト
グラフィーによって精製して、生成物を白色固体（0.7ｇ）として得た。（ｃ）4'−アミノスピロ［ピペリジン−4,2'−［1'H］−（ピリド−[3,4-d]−ピ
リミジン)］−１−カルボン酸エチル塩酸塩
室温のアセトニトリル(20ml)中の3',4'−ジヒドロ−4'−チオキソスピ
ロ[ピペリジン−4,2'−［1'H］−(ピリド[2,3-d]ピリミジン)]−１−カルボン酸
エチル(0.5ｇ、1.63ミリモル)の溶液に、ヨードメタン(0.1ml、1.63ミリモル)を
加えた。この溶液を20時間撹拌し、蒸発させ、溶離剤としてジクロロメタン／メ
タノール（10：１）を用いて溶離するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマト
グラフィーによって精製して、チオイミデートを得た。このチオイミデートを、
アンモニアで飽和させたアセトニトリル(20ml)に溶解し、ボンベ内で48時間150
℃で加熱した。この溶液を蒸発させて、残留物をジクロロメタン／メタノール（
10：１）を用いて溶離する中性アルミナ上のフラッシュカラムクロマトグラフィ
ーによって精製して、エーテル中の１Ｍ塩化水素で酸性化した後に生成物を得た
。
実施例 13
４−アミノ−２−（２−チエニル）−ピリド［3,2-d］ピリミジン塩酸塩
エタノール(１ml)中の２−アミジノ−３−アミノピリジン塩酸塩(0.10ｇ、0.4
7ミリモル)および２−チオフェンアルデヒド（60mg、0.54ミリモル）の溶液を50
℃で18時間撹拌した。混合物を冷却した後、濃縮し、残留物を溶離剤としてジク
ロロメタン／メタノール（20：１〜10：１）を用いて溶離する中性アルミナ上の
フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物を褐色／赤色固
体として得た。融点186〜187℃
実施例 14
7'−アミノ−１−（６−シアノ−３−ピリジンカルボニル）スピロ［ピペリジン
−4,5'−（4'H）−（チエノ［3,2-d］ピリミジン）］ヨウ化水素酸
塩
これは、１−（６−シアノ−３−ピリジンカルボニル）−４−ピペリドンエチ
レンケタール（WO 97／14686）を使用して実施例４の方法によって製造した。融
点260〜261℃（分解）スクリーニング
本発明による化合物の薬理学的活性を下記のスクリーニングにおいて試験した
。スクリーニング１
式（Ｉ）の化合物またはその製薬上許容し得る塩、エナンチオマーまた
161−165の手法によって一酸化窒素合成酵素阻害活性についてスクリーニングす
ることができる。一酸化窒素合成酵素は、3H−Ｌ−アルギニンを3H−Ｌ−シトル
リンに変換し、この3H−Ｌ−シトルリンはカチオン交換クロマトグラフィーによ
って分離して、液体シンチレーション計数によって定量することができる。
酵素は誘導後に、培養したネズミのマクロファージ細胞系統J774A−１（the I
mperial Cancer Research Fundの研究所から得る）から製造される。
J774A−１細胞は、10％胎児のウシ血清、４mM Ｌ−グルタミンおよび抗生物質（
100単位／mlペニシリンＧ、100mg／mlストレプトマイシンおよび0.25mg／mlアン
ホテリシンＢ）を補足したダルベッコ改質イーグル培地［Dulbeccos Modified E
agles Medium（DMEM）］中で培養する。細胞は37℃で５％のCO2を含む給湿した
雰囲気に保った35mlの培地を含む225cm3のフラスコ内で通常通り成長させる。
一酸化窒素合成酵素は、インターフェロン−ｇ（IFNg）およびリポポリサッカ
リド(LPS)に応答して細胞によって産生される。集密培養フラスコ
からの培地を除去して、１mg／mlのLPSおよび10単位／mlのIFNgを含有する新し
い培地25ml（１フラスコ当たり）で置き換える。17〜20時間の培養期間の後、細
胞の収穫は細胞シートをフラスコ表面から培地内へ削り落とすことによって行う
。細胞を遠心分離（10分間1000ｇ）によって集め、この細胞ペレットに、50mMト
リス−HCl（20℃でpH7.5）、10％（v／v）グリセロール、0.1％（v／v）トリト
ン（Triton）−Ｘ−100、0.1mMジチオトレイトールおよび、ロイペプチン（２mg
／ml）、ダイズトリプシン阻害剤（10mg／ml）、アプロチニン（５mg／ml）およ
びフッ化フェニルメチルスルホニル（50mg／ml）より成るプロテアーゼ阻害剤の
カクテルを含有する溶液を加えることによって溶解産物を製造する。
検定のためには、25μlの基質カクテル［50mMトリス−HCl（20℃でpH7.5）、4
00μM NADPH、20μMフラビンアデニンジヌクレオチド、20μMフラビンモノヌク
レオチド、４μMテトラヒドロビオプテリン、12μM Ｌ−アルギニンおよび0.025
mCi Ｌ−[3H]アルギニン］を、50mM トリス−HCl中の試験化合物の溶液25μlを
含む96ウェルフィルタープレートのウェル（孔の大きさ0.45μM）に加える。反
応は50μlの細胞溶解産物（上記のようにして製造）を加えることによって開始
させ、室温で１時間のインキュベーションの後、３mMのニトロアルギニンおよび
21mMのEDTAの水溶液50μlを添加することによって停止させる。
Dowex AG-50Wを使用して、標識付けしたＬ−シトルリンを標識付けしたＬ−ア
ルギニンから分離する。Dowex 50W(Na+型)の25％水性スラリー150μlをこのアッ
セイに加え、その後この全体を濾過して96ウェルプレートに入れる。75μlの濾
液を試料として取り、固体シンチラント（scintillant）を含む96ウェルプレー
トのウェルに加える。これらの試料を乾燥させた後、Ｌ−シトルリンをシンチレ
ーション計数によって定量す
る。
一般的な実験においては、基礎活性は75μlの試料当たり300dpmであって、試
薬対照において1900dpmまで増大する。化合物活性はIC50(このアッセイにおいて
50％の酵素阻害を示す薬物の濃度)として表し、アミノグアニジン［これは10μM
のIC50(50％阻害濃度)を示す］を、この手順を証明するための標準として試験す
る。化合物はある濃度範囲で試験して、得られる阻害からIC50値を計算する。10
0μMで少なくとも25％酵素を阻害する化合物は活性であるとして分類して、少な
くとも１回の再試験を行う。
上記のスクリーニングにおいて、実施例１〜14の化合物を試験したが、これら
は、25μMより小さいIC50値を示し、これらは有用な治療活性を示すことが期待
されることを示した。スクリーニング２
化合物はまた、下記のアッセイで証明することができるように、ヒト型の誘導
型一酸化窒素合成酵素に対しても活性を示す。
酵素は誘導後に培養したヒト結腸の腺ガン細胞系統DLDl（the European Colle
ction of Animal Cell Cultureから得る一細胞系統番号90102540）から製造する
。DLD1細胞は10％胎児のウシ血清、４mM Ｌ−グルタミンおよび抗生物質(100単
位／mlペニシリンＧ、100μg／mlストレプトマイシンおよび0.25μg／mlアンホ
テリシンＢ)を補足したRPMI 1640培地中で培養する。細胞は37℃で５％のCO2を
含む給湿した雰囲気に保った35mlの培地を含む225cm3のフラスコ内で通常通り成
長させる。
一酸化窒素合成酵素は、インターフェロン−γ（IFN-γ）およびインターロイ
キン−１β（ＩＬ−１β）に応答して細胞によって産生される。集密フラスコか
らの培地を除去して、250単位／mlのＩＬ−１βおよび1000単位／mlのIFN−γを
含有する新しい培地25ml(１フラスコ当たり)で置き
換える。17〜20時間の培養期間の後、細胞の収穫は細胞単層をフラスコ表面から
培地内へ削り落とすことによって行う。細胞を遠心分離（10分間1000ｇ）によっ
て集め、この細胞ペレットに50mMトリス−HCl（20℃でpH7.5）、10％（v／v）グ
リセロール、0.1％（v／v）トリトン(Triton)-X100、0.1mMジチオトレイトール
および、ロイペプチン（２μg／ml）、ダイズトリプシン阻害剤（10μg／ml）、
アプロチニン（５μg／ml）およびフッ化フェニルメチルスルホニル(50μg／ml)
を包含するプロテアーゼ阻害剤のカクテル、を含有する溶液を加えることによっ
て溶解産物を製造する。
アッセイのためには、25μlの基質カクテル[50mMトリス−HCl(pH7.5)、400μM
NADPH、20μMフラビンアデニンジヌクレオチド、20μMフラビンモノヌクレオチ
ドおよび４μMテトラヒドロビオプテリン]を96−ウェルプレートのウェルに加え
る。試験化合物は40μlの細胞溶解産物(上記のようにして製造)とともに加えて3
7℃で１時間インキュベートすることによって、酵素で予備インキュベートし、
この期間の終わりに50mM トリス−HCl中の30μM Ｌ−アルギニンおよび0.025μC
i Ｌ−[3H]−アルギニン10μlを加えて酵素反応を開始させる。インキュベーシ
ョンを37℃でさらに１時間続ける。この反応は３mMのニトロアルギニンおよび21
mMのEDTAの水溶液50μlを添加することによって停止させる。
Dowex AG-50Wを使用して、標識付けしたＬ−シトルリンを標識付けしたＬ−ア
ルギニンから分離する。Dowex 50Wの25％水性スラリー120μlを96−ウェルフィ
ルタープレート（孔の大きさ0.45μm）に加える。これに120μlの停止したアッ
セイ混合物を加える。75μlの濾液を試料として取り、固体シンチラント（scint
illant）を含む96ウェルプレートのウェルに加える。これらの試料を乾燥させた
後、Ｌ−シトルリンをシンチレーション
計数によって定量する。
一般的な実験においては、基礎活性は75μlの試薬比較対照試料当たり300dpm
であって、酵素の存在下で3000dpmまで増大する。化合物活性は、IC50（このア
ッセイにおいて50％の酵素阻害を与える薬物の濃度）として表し、L-NMMA（これ
は約0.4μMのIC50を示す）を、この手順を証明するための標準として試験する。
化合物はある濃度範囲で試験して、得られる阻害からIC50値を計算する。
このスクリーニングにおいて、実施例１〜14の化合物は、25μMより小さいIC5 0
値を示し、これらは有用な治療活性を示すことが予測される。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 29/00
１０１ １０１
43/00 １１１ 43/00 １１１
Ｃ０７Ｄ 471/04 １１７ Ｃ０７Ｄ 471/04 １１７Ｚ
471/20 471/20
495/04 １０５ 495/04 １０５Ｚ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，
ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ
Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ
，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ
，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，
ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ
Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ
，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，
ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ
Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ
，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，
ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ
Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ