【発明の詳細な説明】
乳癌治療剤としての有糸***活性化プロテインキナーゼの アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、アメリカンキャンサーソサイエティにより支援された認可Ｎｏ．Ｂ
Ｅ１８８による個人の支持によりなされた。
発明の分野
本発明は、哺乳類の癌を治療する方法、より特定すれば、アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを用いて哺乳類の癌を治療する方法に関する。
発明の背景
癌は、一般に、細胞内のシグナル系の疾患である。正常な細胞は、増殖、分化
またはその他に代謝活性を変えることにより多くの細胞外のシグナルに応答する
。そのようなシグナルは、細胞表面上で受け取られて、シグナル導入蛋白質の系
により、細胞により解読可能なメッセージに変換される。
シグナル導入経路に関与する蛋白質の例は、有糸***活性化蛋白質（MAP）キ
ナーゼである。MAPキナーゼは、細胞増殖に必須の遺伝子の制御に直接関与する
と信じられる。
MAPキナーゼスーパーファミリーの遺伝子は、３つのファミリーを含む。３つ
のファミリーのひとつはERK-1およびERK-2をコードする遺伝子を含む。第２のフ
ァミリーは、ストレス活性化プロテインキナーゼ、例えばJUNキナーゼをコード
する遺伝子を含む。第３のファミリーは、p38をコードする遺伝子を含む。
MAPキナーゼは、順に、様々なレベルの上流の制御蛋白質により制御される。M
APキナーゼの制御機構は、逆転可能な蛋白質リン酸化である。
第１のレベルの上流のMAPキナーゼ制御蛋白質は、MAPキナーゼキナーゼのファ
ミリー、例えばMEKを含む。MAPキナーゼキナーゼは、順に、第２のレベルの制御
蛋白質、即ちMAPキナーゼキナーゼキナーゼにより制御される。
癌は、シグナル導入に必須の遺伝子における欠損により共通に引き起こされる
。そのような欠損遺伝子は、オンコジーンと呼ばれる。オンコジーンは、細胞の
核に増殖に不適当なシグナルを受け入れさせる、ひとつまたは複数のシグナル導
入蛋白質の過剰発現を導きうる。
オンコジーンにより発現された蛋白質はオンコプロテインと呼ばれ、典型的に
は、RNAおよびDNAの合成のトランスアクチベーターおよびレギュレーターとして
直接機能する。多くのオンコジーンは、MAPキナーゼキナーゼおよびMAPキナーゼ
キナーゼキナーゼのファミリーのメンバーである。広く研究されたオンコジーン
のいくつかの例は、ras，raf-1，nyc，ski，myb，fosおよびjunである。Blenis
，J．"Signal Transduction Via MAP Kinase：Proceed at Your Own Risk,"Proc
．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，Vol．90，5889-5892(1994)；Cobb，et al.，"How
MAP Kinase Are Regulated,"J．Blol．Chem.，Vol．270，14843-14846（1995）
およびJanes，et al.，"Activation of the Ras Pathway In Breast Cancer Cel
ls,"Oncogene，Vol．9，3601-3608（1994）を参照されたい。
例えば、構成的に活性なMAPキナーゼは、MAPキナーゼキナーゼ（MEK）が線維
芽細胞中で発現される場合に癌原性を誘発すると信じられる。Brunet et al.，"
MAP kinase Module：Role in the Control of Cell Proliferation,"Comptes．R
endus．Sci．Soc．Biol.，Vol．189，43-57(1995)；Brunet et al.,"Constituti
vely Active Mutants of MAP Kinase Induced Growth Factor-Relaxation and O
ncogenicity When Expressed in Fibroblasts,"Oncogene，Vol，Vol．9，3379-3
387(1994)。
多くのウイルス性および細胞性遺伝子が有力なオンコジーンとして同定されて
きた。オンコジーンの産物はそれらの細胞内局在、例えば、分泌されるか、表面
にあるか、サイトプラズム性であるか、そして核オンコジーンであるかに従い分
類される。
核オンコジーンの産物は、異常な細胞成長そして最後には新形成（neoplasia
）を導く、遺伝子制御における変化を誘発する能力を有する。有力な悪性新形成
細胞成長の形成に関与するオンコジーンの発現産物の結果として、オンコプロテ
イン発現を阻害する方法に多大なる焦点が集中した。
標的蛋白質、例えばオンコプロテインの発現を阻害するのに効果的となる技術
は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用である。オンコジーンのアンチセン
スオリゴヌクレオチドの阻害は、様々なオンコジーンファミリーの役割を理解す
る有用な手段であると信じられてきた。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のmRNA転写物に相補であり、
即ち特異的にハイブリダイズすることができる。いくつかの例において、アンチ
センスオリゴヌクレオチドは標的蛋白質の二本鎖（ds）DNAの主要な塊に結合し
て三重鎖または抗遺伝子（antigene）を形成する。mRNAまたはdsDNAのいずれか
に結合することで、標的蛋白質の発現を阻害する。そのような三重鎖の議論は、
Stull et al.,"Antlgene，Ribozyme and Aptamer Nucleic Acid Drugs：Progres
s and Prospects,"Pharm．Res.，Vol．14，No．4，465-483（1995）に見いださ
れ、引用により本明細書に編入される。
如何にしてオンコジーンの発現産物が細胞のシグナル導入経路を変えるのかに
ついて、多くの注意が向けられた。現在、シグナル導入経路の変化に対する焦点
は、主に、MAPキナーゼ、例えばras，raf-1およびMEKの上流のレギュレーターに
向けられている。このアプローチのいくつかの例は、米国特許第5,582,986号に
見いだされ、ras遺伝子の阻害のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示
しており、また米国特許第5,597,719号にも見いだされ、raf-1活性を変調するヒ
ト14-3-3蛋白質を開示しており、そして米国特許第5,525,625号にも見いだされ
、MEKの活性を阻害するフラボン化合物を開示する。
さらに、Holt et al.，Mol．Cell Biol.，Vol．8，963-973(1988)は、オンコ
ジーンc-mycのmRNA転写物と特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌ
クレオチドが、培養されたHL60白血病細胞に添加された場合に、増殖を阻害して
分化を誘発することを示した。Anfossi et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．Vol．
86，3379-3383（1989）は、cmybのmRNA転写物と特異的にハイブリダイズするア
ンチセンスオリゴヌクレオチドがヒト骨髄性白血病細胞系の増殖を阻害すること
を示した。Wickstorm et al.，Proc．Natl．Acad．Sci.，Vol．85，1028-1032（
1988）は、c-mycオンコジーンの蛋白質産物の発現並びにHL60培養白血病細胞の
増殖が、c-myc mRNAと特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオ
チドにより阻害されることを示した。
しかしながら、MAPキナーゼ、例えばras，raf-1およびMEKの上流のレギュレー
ターを阻害するかまたは不活性化するこれらの戦略は、一般的には効果がなかっ
た。上記阻害によりブロックされる増殖経路は非制御細胞増殖を促進する他の経
路により置き換わりうることが、明らかとなりつつある。置換経路は、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを用いて処理された悪性細胞において、または処理され
た細胞と共に存在する他の悪性細胞のクローン中に生じてよい。
上記のMAPキナーゼの上流のレギュレーターの阻害に加えて、MAPキナーゼ自身
の発現の阻害がインビトロおよびインビボにおいて証明された。現在まで、その
ような阻害は主に一般的な研究手段として用いられてきた。
例えば、Sale et al.，は、p90 S6キナーゼのインスリン活性化のため、およ
びDNA合成のインスリンまたは血清刺激のための、線維芽細胞の脂肪細胞への分
化におけるMAPキナーゼの役割の調査のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド
の使用を開示する、"Sale et al.，EMBO J.，Vol．14，No．4，674-684(1995)。
Gao et al.，は、F9幹細胞の進行におけるMAPキナーゼの役割の調査のためのSal
e et al.,のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を開示する。Gao et al.，J
．Biol．Chem.，Vol．271，No．9002-9008(1996)。
癌におけるMAPキナーゼの役割が調査された。これらの知見は、しかしながら
、結論に達しておらず、悪性新形成細胞成長を阻害する新しいルートを提供して
いない。
例えば、MAPキナーゼERK-1およびERK-2の活性がCREF細胞中の過剰発現並びに
各細胞系の悪性度に相関しうることが報告された。Graff，Jeremy R.，"Messeng
er on a Translation and Malignancy,"The mRNA CAP-Binding Protein，eIF-4E
，as an Integral Component of Malignancy in Cloned Rat，Dissertation sub mitted to University of Kentucky
，Chapter 6，110-130(1994)。しかしながら
、癌におけるMAPキナーゼの役割に関する仮説はなされなかった。さらに、MAPキ
ナーゼの高活性化を例示する研究は高活性化の原因に関する何の示唆も提供しな
い。これらの発見は悪性新形成細胞成長例えば初期乳癌を治療する新規なルート
を提供しない。
同様に、培養された非小細胞肺癌および乳癌細胞系における増大されたMAPキ
ナーゼ発現の報告があった。しかしながら、試験された約３分の１の乳癌細胞系
のみがMAPキナーゼにおける変化を示した。いくつかの細胞系がより多くのERK-1
を示し、そしてその他はより多くのERK-2を示したように、不一致のパターンが
観察
された。Cobb，MelanlneH.，"The Role of MAP Kinase Pathway in Breast Canc
er,"National Technical Information Service，Accession No．AD-8301 655/7/
XAB(1995)。これらの一致しない発見の結果として、著者は彼女が癌におけるMAP
キナーゼの役割に関する最初の仮説さえも作ることができなかっと述べた。この
研究並びに培養細胞系を用いる研究の別の困難は、生検から得た非培養細胞を用
いて得られた結果により、結果を推定することができないことである。
現在、癌の治療は、第一に放射線の使用および／または化学治療剤、例えばビ
ンブラスチンまたはアドリアマイシンの使用に依存する。しかしながら、そのよ
うな治療の副作用がときどき深刻であることが広く認識されており、これらの治
療戦略を極めて不評にさせている。
癌に関連する他の問題は、悪性新形成細胞成長の初期の予後を獲得するための
真の病理学への信頼である。多くの悪性新形成細胞成長においては、悪性を示す
外見上の変化が現われるまで、初期の検出が難しい。初期の段階における癌の検
出のためのアッセイの開発におけるいくらかの前進はあったが(例えば、前立腺
およびメラノーマ)、そのようなアッセイは他の癌例えば乳癌には適用できない
。
上記の見地から、放射線および化学治療剤の投与の必要性を排除する、癌の効
果的な治療に関する当業界の引き続く要求が存在することは明らかである。同様
に、悪性度の早い時期の検出および段階決定を許容するはずの潜在的な悪性新形
成成長を同定および監視する方法に関する当業界の要求が引き続き存在する。
したがって、本発明の目的は、潜在的な悪性新形成細胞成長を同定および監視
するため、並びに癌を治療するための当業界の方法の欠点を克服する、より効果
的な方法を提供することである。
発明の概要
これら並びに他の目的は当業者には明らかであり、以下に記載される本発明に
より達成される。一つの態様において、本発明は、哺乳類の上皮および内皮細胞
の悪性新形成細胞成長を阻害する方法であって、哺乳類において過剰に発現され
るERK-1またはERK-2あるいは両者のmRNAの少なくとも一部に相補なオリゴヌクレ
オチドの効果的な量を哺乳類に投与することからなる。好ましくは、相補オリゴ
ヌクレオチドは約10から約100のヌクレオチドを有し、より好ましくは約15から
約
45のヌクレオチドを有し、さらに好ましくは約17から約32のヌクレオチドを有す
る。特に適切なオリゴヌクレオチドは、5'-GCC GCC GCC GCC GCC AU-3'、5'-GCC
GCC GCC GCC GCC AT-3'およびその混合物からなる群から選択される。
オリゴヌクレオチドは、好ましくは、効果的な量のオリゴヌクレオチドを注入
することにより投与される。例えば、注入工程は、好ましくは、悪性新形成細胞
成長の部位において効果的な量のオリゴヌクレオチドを注入することにより達成
される。好ましくは、発現ベクターは、哺乳類の悪性新形成細胞成長を標的とす
る。
他の態様において、本発明は、哺乳類にアンチセンスヌクレオチドを投与する
ための投薬ユニットでもある。最適には、投薬ユニットのためのオリゴヌクレオ
チドをシリンジに含ませる。
第３の態様において、本発明は、哺乳類において潜在性の悪性新形成細胞成長
を同定および監視する方法も含む。該方法は、（ａ）哺乳類から得られた悪性新
形成成長の疑いのある上皮または内皮細胞中における、ERK-1，ERK-2または両者
の発現レベルを測定し；そして（ｂ）工程（ａ）において測定された発現レベル
が同じ起源の正常細胞におけるERK-1，ERK-2または両者の発現レベルよりも高い
か否かを確認する工程を含む。好ましくは、細胞は哺乳類の***の組織から得ら
れる。本発明の使用に特に適切な哺乳類はヒトである。
図面の簡単な説明
図１は、カルシノーマ、良性線維腺腫、線維性嚢胞疾患および正常組織を有す
る患者の胸部組織サンプルからとられた抽出物のMAPキナーゼ活性の棒グラフで
ある。
図２は、カルシノーマ(CA)、良性線維腺腫(FA)、および線維性嚢胞疾患（FC）
を有する患者の胸部組織抽出物から単離されたMAPキナーゼのニトロセルロース
ブロットの写真である。
図３パネルＡ−Ｆは、MAPキナーゼmRNAに関するインサイチュ逆転写ポリメラ
ーゼチェインリアクション（RT-PCR）により分析された、良性成長および悪性成
長（初期胸部カルシノーマ）を有する患者の上皮細胞の顕微鏡写真である。パネ
ルＡは、矢印により示されるとおり、高いレベルのMAPキナーゼmRNAを示す侵入
性癌
細胞を有する上皮細胞を示す。パネルＢは、DNAse消化後の非関連Ｃ型肝炎ウイ
ルスのRNAのためのPCRプライマーを用いて分析された上皮細胞の陰性対照を示す
。パネルＣは、DNAse前処理を伴わずに、MAPキナーゼのためのPCRプライマーと
ゲノミックDNAを用いて分析された上皮細胞の陽性対照を示す。パネルＤは、DNA
seにより前処理した後の、MAPキナーゼのためのPCRプライマーを用いて分析され
た上皮細胞を示す。パネルＥおよびＦは、インサイチュRT-PCRにより分析された
、それぞれ良性成長および悪性成長の両方を有する患者（DW）の上皮細胞を示す
。
図４パネルＡ−Ｄは、インサイチュRT-PCRに供された転移した初期胸部カルシ
ノーマを示すリンパ節組織の顕微鏡写真である。パネルＡは、矢印により示され
るとおり、MAPキナーゼmRNAを高レベルで示す転移性癌細胞を有するリンパ節組
織を示す。パネルＢは、DNAse消化後の非関連Ｃ型肝炎ウイルスのRNAのためのPC
Rプライマーを用いて分析されたリンパ節組織の陰性対照を示す。パネルＣは、D
NAse前処理を伴わずに、MAPキナーゼのためのPCRプライマーとゲノミックDNAを
用いて分析されたリンパ節組織の陽性対照を示す。パネルＤは、DNAseにより前
処理した後の、MAPキナーゼのためのPCRプライマーを用いて分析されたリンパ節
組織を示す。
図５パネルＡおよびＢは、MAPキナーゼの過剰発現を測定するために免疫組織
化学に供された、初期乳癌および転移した初期乳癌を示すリンパ節組織の顕微鏡
写真である。パネルＡは、一次抗体をMAPキナーゼに免疫複合させてエオシンお
よびヘマトキシリンにより染色した初期乳癌を示す。パネルＢは、一次抗体をMA
Pキナーゼに免疫複合させてエオシンおよびヘマトキシリンにより染色したリン
パ節組織を示す。
図６パネルＡ−Ｃは、初期乳癌組織サンプルから単離されたMAPキナーゼのニ
トロセルロースブロットの写真である。パネルＡは、SDS-ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動およびマウスモノクローナル抗-MAPキナーゼ抗体を用いた免疫ブロッ
ト染色に供された、組織抽出物から単離したMAPキナーゼを示す。パネルＢは、
ウサギポリクローナル抗-MAPキナーゼ血清（IP）により免疫沈殿、次にSDS-PAGE
そして抗ホスホチロシン抗体（IB）による免疫ブロット染色に供された、組織抽
出物から単離したMAPキナーゼを示す。パネルＣは、二重にリン酸化された（セ
リンお
よびチロシン）「活性」形態のMAPキナーゼに特異的なウサギポリクローナル抗体
を用いた免疫ブロット染色に供された組織抽出物から単離したMAPキナーゼを示
す。
図７は、SDS-PAGEおよびMAPキナーゼ（MAPK）またはホスホチロシン（PY）の
いずれかに対する抗体で染色する免疫ブロットに供された初期乳癌の全細胞抽出
物から単離したMAPキナーゼのニトロセルロースブロットの写真である。
発明の詳細な説明
今発見されたのは、上皮および内皮の起源の悪性新形成細胞の成長が、MAPキ
ナーゼであるERK-1およびERK-2の過剰発現を阻害することにより阻害できること
である。これらの上皮および内皮悪性腫の例は、限定されないが、胸部、前立腺
、および他の内分泌組織の初期または転移性癌並びに血管肉腫、あらゆる内皮組
織、例えば血管系に見いだされる上皮細胞に基づく癌を含む。
この発見の結果として、ERK-1、ERK-2、または両者の何れかの標的化mRNAの少
なくとも一部に相補なオリゴヌクレオチドを哺乳類に投与する。投与される量は
、ERK-1またはERK-2の過剰発現を低下させるのに効果的であるべきであり、それ
により哺乳類に見いだされる悪性新形成細胞成長を阻害する。ERK-1またはERK-2
の発現レベルは、好ましくは、実質正常レベルに低下する。
上記のとおり、本発明の方法は、哺乳類において上皮および内皮細胞の悪性新
形成成長を阻害する。本明細書における悪性新形成成長は、同一の起源の正常細
胞において発現される量よりも顕著に多い量でERK-1またはERK-2を発現する細胞
のあらゆる悪性成長（即ち、腫瘍）を意味する。「同一の起源の正常細胞におい
て発現される量よりも顕著に多い量」なる句は、悪性成長におけるERK-1またはE
RK-2の発現レベルが正常細胞中のERK-1またはERK-2の発現レベルの少なくとも約
50％、好ましくは少なくとも約100％、およびより好ましくは少なくとも約200％
高いことを意味する。事実、悪性細胞中の発現レベルは正常細胞中のERK-1また
はERK-2の発現レベルの約500％を超えることができ、そしてある場合には、約10
00％そして約2000％さえも超え得る。
いくつかの腫瘍は、例えば、カルシノーマ、サルコーマおよび芽腫（blastoma
）を含む。上皮および内皮起源の細胞のいくつかの例は本発明に従い治療するこ
とができ、胸部、前立腺、肝臓、肺および腎臓の上皮および内皮細胞を含む。
悪性細胞の成長は、成長速度が顕著に低下するかまたは停止するなら、阻害さ
れる。「成長速度が顕著に低下するかまたは停止する」なる句は、本発明による
治療の後の成長が治療前の多くて約80％、好ましくは多くて約50％、より好まし
くは多くて約30％、そして最大では多くて約10％であることを意味する。悪性細
胞は、それらが最初に形質転換された場所、あるいはそれらが転移後に存在して
よい場所に存在してよい。
ヒトERK-1およびERK-2のcDNAおよびアミノ酸配列は、Charest et al.，"Mocec
ular Cloning，Expression，and Characterization of the Human Mitogen-Acti
vated Protein Kinasep 44ERKI,"Mol．Cell．Biol.，Vol．13，No．8，4679-469
0（1993）およびOwaki et al.，"Extracellular Signal-Regulated Kinases in
T Cells:Chara cterization of ERK-1 and ERK-2 cDNAs,"Biochem．Biophys．Re
s．Commun.，Vol．182，No．3，1416-1420（1992）に記載されており、引用によ
り本明細書に編入される。ERK-1およびERK-2の配列は、それぞれアクセス番号X6
0188およびM84489としてGenBankにおいても見いだされうる。GenBankに開示され
た配列も、引用により本明細書に編入される。しかしながら、便宜上、ERK-1お
よびERK-2のcDNA配列を以下に示す。
ヒトERK-1のcDN配列（配列番号：１）は以下のとおりである。 ヒトERK-2のcDN配列（配列番号：２）は以下のとおりである。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ERK-1またはERK-2遺伝予の少なくとも一部に
相補である。本明細書において用いるとおり、他に示さなければ、用語「オリゴ
ヌクレオチド」は、リボヌクレオチドのオリゴマー、即ちオリゴリボヌクレオチ
ドおよびデオキシリボヌクレオチドのオリゴマー、オリゴデオキシリボヌクレオ
チドを含む。
用語「オリゴヌクレオチド」は、生物において優位なヌクレオチド、アデニン
、デオキシアデニン、グアニン、デオキシグアニン、チミン、ウラシル、シトシ
ンおよびデオキシシトシンのオリゴマーおよびポリマー、並びに標的mRNA転写物
にハイブリダイズする他のヌクレオチドを含むオリゴマーおよびポリマーを含む
。これらの用語は、ひとつまたは複数のプリンまたはピリミジンモイエティ、糖
モイエティ、または化学的に修飾されたヌクレオチド内部結合を有するオリゴマ
ーおよびポリマーも含む。そのような修飾は実在してよく、そして非ヌクレオチ
ド化学を含んでよく、非糖、非リン酸バックボーン、並びにワトソン−クリック
塩基対と類似かまたは異なる塩基対合機構によりmRNAへの特定のハイブリダイズ
を維持するための塩基に対する化学的な変更を含む。用語「オリゴヌクレオチド
」は、アルファまたはベータ立体構造の何れかにおける糖モイエティに接続した
ヌクレオシド含有塩基からなるオリゴマーまたはポリマーをさらに含む。
用語「相補」は、本明細書においては、mRNA転写物のその標的配列とハイブリ
ダイズするかまたは安定な二本鎖を形成することができるオリゴヌクレオチドを
示すために用いられる。そのオリゴヌクレオチドは、二本鎖DNAとハイブリダイ
ズすることにより、相補のオリゴヌクレオチドが主要な塊の中でdsDNAに結合し
て転写を阻害するように三重鎖または抗遺伝予を形成することもできる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、ERK-1またはERK-2のmRNAに相補で
あってその発現を阻害するあらゆる長さである。オリゴヌクレオチドが極めて短
ければ、標的核酸以外の配列に親和性があってよい。同様に、オリゴヌクレオチ
ドが極めて長ければ、二次構造、低下した細胞内取り込み、およびERK-1およびE
RK-2に対する特異性の損失の問題が有り得る。好ましくは、ヌクレオチドの数は
、
約10より長く、約15より長いのが好ましく、そして約17より長いのがさらに好ま
しい。同様に、ヌクレオチドの数は約100を超えないべきであり、約45未満が好
ましく、約32未満がさらに好ましい。
本発明によれば、オリゴヌクレオチドは、ERK-1、ERK-2または両者のmRNAの任
意の部分に相補でありうる。mRNAの相補部分は、非コーディング領域、コーディ
ング領域またはその組み合わせを含んでよい。好ましくは、オリゴヌクレオチド
は、どんな長さでも、メチオニン開始コドン（ATG）および該開始コドンの上流
および／または下流の何れかの十分な数のヌクレオチドを含む。ERK-1およびERK
-2に特異的な特に適切なオリゴヌクレオチドは、5'-GCC GCC GCC GCC GCC AU-3'
(配列番号：3)、5'-GCC GCC GCC GCC GCC AT-3'（配列番号：４）を有する17マ
ーおよびその組み合わせである。
本発明のオリゴヌクレオチドは、十分な相補性を有することにより、標的核酸
配列の立体構造配列または非立体構造配列にハイブリダイズする。「十分な相補
性」は、オリゴヌクレオチド中の少なくとも約80％のヌクレオチドが標的配列に
相補であるかまたは結合することを意味し、好ましくは約90％であり、さらに好
ましくは約100％である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、当業界において公知のいかなる手段によって
も合成することができる。適切な手段は、例えば、固相または液相合成を含み、
好ましくは、自動化核酸合成器中においてかまたは液相技術による。あるいは、
オリゴヌクレオチドは、逆転写酵素、PCR合成の使用または他の遺伝子工学技術
により製造してよい。
オリゴヌクレオチドに対する修飾は、例えば、可溶性、増強された取り込み、
または分解に対する増強された安定性を含むいくつかの望ましい特性を増大させ
るためになされてよい。リン酸バックボーン、末端、糖モイエティまたは個々の
核酸塩基に対する修飾は、本発明の範囲内である。例えば、糖モイエティ間のホ
スホジエステル結合を修飾してよい。適切な修飾は、糖モイエティ間のホスホロ
チオエート結合の使用を含む。様々な修飾の組み合わせ、例えば、多数の末端複
合体（conjugates）と組み合わせたリン酸バックボーンの修飾は、本発明の範囲
内である。末端の修飾は、架橋剤、インターカレーター、光化学活性化モイエテ
ィ、アルキル化剤、および酸化還元活性核酸分割基を含んでよい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、悪性細胞中への伝達を引き起こすあらゆる手
段により投与してよい。オリゴヌクレオチドは、局所または全身に哺乳類に投与
されてよい。
オリゴヌクレオチドの局所投与は、悪性新形成成長あるいは該成長周囲の組織
に直接オリゴヌクレオチドを挿入し、そしてオリゴヌクレオチドを悪性細胞に移
動させて入ることにより達成できる。例えば、シリンジの針に接近可能な腫瘍、
例えば胸部腫瘍は、オリゴヌクレオチドを腫瘍または腫瘍周囲の組織に注入する
ことにより治療することができる。注入は、筋肉内、静脈内、腹腔内、または皮
下であってよい。オリゴヌクレオチドは、肝門脈系を通して肝臓に投与してよい
。同様に、オリゴヌクレオチドは、肺吸入器の使用により肺に投与することがで
きる。
しかしながら、全身または局所にオリゴヌクレオチドを投与する別の様式も利
用することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、発現ベクター中で全身に
投与することができる。用語「発現ベクター」は、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドの挿入または取り込みにより操作された、当業界において公知のプラスミド
、ウイルスまたは他の媒体を意味する。本発明の使用に適したベクターは、pMSX
ND発現ベクター（Lee and Nathans，J．Blol．Chem.，Vol，263，3521(1988)）
および真核生物ウイルスベクター、例えばシミアンウイルス40(SV40)、ウシパピ
ローマウイルス(真核ウイルスベクター、Cold Spring Harbor Laboratory，Gluz
man ed.，(1982))、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスを含む。アデノ
関連ウイルスベクターの例、およびそれらの製造方法は、米国特許第5,173,414
号および第5,354,678号に見いだすことができる。利用するのに特に好ましいベ
クター系はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPCK）遺伝子を取り
込んだ発現ベクターであり、Moxham et al.，"Induction of Gaα12-Specific A
ntisense RNA in Vivo Inhibits Neonatal Growth,"Science,Vol．260，991-995
（1993）に記載されているとおりであり、引用により本明細書に編入される。
好ましくは、発現ベクターは哺乳類におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド
の効果的な生産、好ましくはオリゴヌクレオチドの構成的生産を許容するプロモ
ーターを含む。例えば、プロモーターはポリヘドリンプロモーターでありうる。
発現ベクターは、悪性新形成の部位においてオリゴヌクレオチドの発現を標的
とするのも好ましい。これは、標的細胞、例えば上皮または内皮に特異的なプロ
モーターの制御下でオリゴヌクレオチドを入れることにより達成できる。そのよ
うなプラスミドの例は、乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、例えばマウス乳腺腫瘍
ウイルス（MuMTV）プロモーターであり、乳癌の治療には特に有用である。乳癌
に特異的な他のプロモーターの例は、ミルク蛋白質のプロモーター、例えば乳漿
酸蛋白質、β−ラクトグロブリン、αs1-カゼイン、およびβ−カゼインである
。ミルク蛋白質のプロモーターは特に有用であるが、なぜならば発現を催乳剤（
lactogenic agent）により誘導してよいからである。
前記のとおり、本発明のオリゴヌクレオチドは哺乳類に投与される。ERK-1お
よびERK-2は哺乳類間で高度に保存されているから、本発明は容易に哺乳類種に
適用される。哺乳類のいくつかの例は、家畜、サルおよびヒトを含む。家畜は、
以下の種：イヌ；ネコ；ウシ；ウマ；ブタ；およびマウスの家畜を含む。
本発明は、治療される哺乳類のためのERK-1またはERK-2のmRNAの少なくとも一
部に相補なオリゴヌクレオチドの効果的な量を含む投薬ユニットも含む。投薬ユ
ニットに含まれる量は、MAPキナーゼの発現を低下させるのに有効である。
本発明によれば、投薬ユニットは、あらゆる形態でありうる。当業者には理解
されるとおり、オリゴヌクレオチドの濃度は哺乳類への投与の選択により変更さ
れる。例えば、オリゴヌクレオチドを注入により哺乳類へ投与する場合は、投薬
ユニットは効果的な量のオリゴヌクレオチドを含むシリンジである。全身投与の
ための効果的な量のオリゴヌクレオチドは、約0.01mg/Kgから50mg/Kgの一日一回
または二回の投与の範囲でありうる。しかしながら、（ｉ）発現を阻害すること
における個々のオリゴヌクレオチドの能力、（ii）病原性の疾患状態の重度また
は範囲、または（iii）与えられるオリゴヌクレオチドの薬物動力学に依存して
、異なる投薬予定表を利用することができる。
オリゴヌクレオチドは、薬学上受容可能な担体または賦形剤と化合することが
できる。賦形剤のいくつかの例は、フィルター、増量剤、結合剤、崩壊剤、界面
活性剤または滑剤を、投与および投薬形態に依存して含む。典型的な投薬形態は
、
タブレット、粉末、懸濁液、乳濁液および溶液を含む液体調製物、顆粒、カプセ
ル、坐剤並びにリポソーム調製物を含む注入のための液体調製物を含む。
哺乳類への投与のためには、本発明のオリゴヌクレオチドは液体溶液、好まし
くは生理学上適合性のバッファー例えばハンクス（Hank's）溶液またはリンゲル
（Ringer's）溶液中に製剤化することが有利である。さらに、オリゴヌクレオチ
ドは、固体形態で製剤化して使用直前に再溶解するか懸濁することができる。オ
リゴヌクレオチドを含む凍結乾燥形態およびリポソームも含まれる。
局所投与のためには、本発明のオリゴヌクレオチドは、上記のとおり、液体溶
液、または軟膏(ointment)、軟膏剤(salves)、ゲルまたはクリーム中に製剤化し
てよく、当業界において一般に知られているとおりである。眼科適応症のための
本発明のオリゴマーの製剤化は、当業界で知られている標準の組成物に基づく。
本発明のオリゴヌクレオチドは、全身投与のための当業界公知のあらゆる方法
により投与してもよい。全身投与のためのいくつかの適切な方法は、例えば、経
粘膜、経皮、または経口方法を含む。経粘膜または経皮投与に燗しては、浸透さ
れるバリアーに適した浸透剤（penetrants）を製剤中に使用してよい。そのよう
な浸透剤は、当業界において一般に知られており、例えば、経粘膜投与のための
胆汁酸塩およびフシジン酸塩を含む。さらに、増強剤（enhancers）を用いて浸
透を促進することができる。経粘膜投与は、鼻内スプレー、例えば、あるいは坐
剤（suppositories）の使用によることができる。経口投与のためには、オリゴ
ヌクレオチドは慣用の経口投与形態、例えばカプセル、タブレット、および強壮
薬（tonics）内に製剤化する。
本発明は、哺乳類の潜在的悪性新形成細胞成長を同定および監視する方法も含
む。悪性かまたは潜在的に悪性の組織サンプルからの細胞を哺乳類から得る。そ
のあと、ERK-1またはERK-2、あるいはERK-1またはERK-2の蛋白質をコードするmR
NAをアッセイのために得るか、またはインサイチュにおいてアッセイしてよい。
アッセイの第一工程は、悪性新形成成長に関して試験される哺乳類から得た上
皮または内皮細胞中のERK-1またはERK-2の発現レベルを測定することである。第
二工程は、第一工程において測定された発現レベルが、同様な、好ましくは同一
の起源の正常細胞において見いだされるかまたは予測される同じMAPキナーゼの
発
現のベースラインのレベルより高いか否かを確認することである。「高いレベル
」なる句は、発現レベルが正常細胞よりも少なくとも約50％高いことを意味し、
少なくとも約100％高いのが好ましく、少なくとも約200％高いのがさらに好まし
い。しかしながら、上記のとおり、500％、1000％さらには2000％を超える発現
レベルが観察されてよい。
用語「発現」は、ERK-1またはERK-2の何れかをコードするmRNAを生成するため
のDNAの転写およびMAPキナーゼを生成するためのmRNAの翻訳を含むことを意味す
る。
２つの発現レベルを比較する能力は、潜在的悪性新形成細胞成長を同定するた
めの有効な方法を可能にし、そして悪性と同定されたそのような細胞成長を監視
することを可能にする。少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約100％、さ
らに好ましくは少なくとも約200％の高い発現レベルが悪性の識別に使用される
。
悪性疾患を識別するための細胞の変化を定量するこの能力の結果として、病理
学は、診断を行うために表現型の変化にのみ依存する必要はない。これは、潜在
的悪性状態、例えば増殖性胸部疾患を監視することにおいて特に重要である。増
殖性胸部疾患は、病理学者が、例えば、異型性、非侵入性カルシノーマおよび侵
入性カルシノーマを伴う、腺疾患、硬化症、過形成（管の、小葉の、およびアポ
クリンの）を識別せねばならない場合の表現型の変化の範囲（spectrum）を含む
。これらの段階、例えば過形成とカルシノーマの間の病理学者の診断は、表現型
におけるそのような微小な変化を識別する彼または彼女の能力に依存する。病理
学者の経験は、しばしば、そのような変化を識別する決定因子となり、病理学者
の間の診断を変えることにつながる。即ち、潜在的悪性新形成細胞成長を同定お
よび監視するための定量可能な方法は、彼らの診断を補助する一定の方法を彼ら
に提供する。
新形成細胞成長のサンプルは、標準の生検技術に従い哺乳類から取り出される
。好ましくは、新形成細胞成長のサンプルは、針生検により取り出されて、すぐ
にERK-1およびERK-2の発現の分析に供されることができる。本発明の顕著な利点
は、慣用の組織病理学が数日であるのに比して、悪性疾患の測定が数時間で作成
できることである。即ち、本発明は、生検に従う悪性疾患の測定に一般的に要求
され
る時間を劇的に短縮する。
所望であれば、組織サンプルを哺乳類から切り出して本発明による後の分析の
ために加工することもできる。例えば、組織サンプルを区分して、凍結してそし
て液体窒素またはヘリウム中に保存してよい。いずれにせよ、アッセイを行う前
に細胞を培養しない方が好ましい。
発現の基底レベルは、同様の、好ましくは同一の起源の正常細胞の組織サンプ
ルから測定する。正常細胞の組織サンプルを同じ哺乳類からあるいは同様な、好
ましくは同一のバックグラウンドを有する他の哺乳類から得る。例えば、コア生
検技術の出現と共に、腫瘍および周囲の正常組織のコアサンプルを取る際に、悪
性腫瘍の測定のための組織サンプルのみを一度に哺乳類からとる必要がある。
発現基底レベルは、試験サンプルの発現レベルと同時に測定される必要はない
。発現基底レベルは様々な哺乳類から、特にヒトからの様々な細胞に関して測定
して、のちのアッセイに用いることができる。
ERK-1およびERK-2のレベルは、当業界において公知の標準技術により測定でき
る。そのような方法は、一般に標識プローブの使用を含む。プローブはERK-1ま
たはERK-2蛋白質またはその断片を認識する抗体、ERK-1またはERK-2蛋白質をコ
ードするDNAまたはRNAを認識するオリゴヌクレオチドであってよい。
例えば、mRNAのレベルは適切な標識核酸プローブを用いたノーザンブロッティ
ングにより測定してよい。プローブはRNAまたはDNAであってよく、例えばアンチ
センスオリゴヌクレオチドとして使用するための上記の本発明のオリゴヌクレオ
チドである。標識されたプローブは当業界において公知の標準方法により定量さ
れる。
オリゴヌクレオチドプローブの長さは決定的ではなく、標的核酸にハイブリダ
イズできさえすればよい。オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも約６ヌクレ
オチド、好ましくは少なくとも約10ヌクレオチド、そしてより好ましくは少なく
とも約15ヌクレオチドを含むべきである。
オリゴヌクレオチドプローブの長さに上限はない。より長いプローブは調製が
難しく、より長いハイブリダイゼーション時間を必要とする。よって、プローブ
を必要以上に長くするべきではない。通常、オリゴヌクレオチドプローブは約50
ヌクレオチド以上を含まず、好ましくは約40ヌクレオチド以上を含まず、そして
よい好ましくは約30ヌクレオチド以上を含まない。
本明細書に記載されたプローブは当業界において公知の方法により標識される
。標識は放射性元素、酵素、または色素産生部分を含んでよい。オリゴヌクレオ
チドプローブを標識する方法は、例えば、Leary et al.，Proc．Natl．Acad．Sc
i．USA，Vol．80，4045(1983)；Rens and Kurz，Nucl．Acids Res.，Vol．12，3
435(1984)；Richardson and Gumport，Nucl．Acids Res.，Vol．11，6167(1983)
；Smith et al.，Nucl．Acids Res.，Vol．13，2399(1985)；およびMeinkoth an
d Wahl，Anal．Biochm.，Vol．138，267(1984)に記載された。
別法として、mRNA発現レベルは、引用により本明細書に編入される、G.J.Nuov
o.，in situ Hybridization：Protocols and Applications，2nd edition，Rave
n Press，New York 1994に記載されたとおりに逆転写ポリメラーゼチェインリア
クション（RT-PCR）を用いて測定してよい。
ERK-1またはERK-2蛋白質のレベルは当業界において公知の標準技術により測定
してもよい。典型的には、免疫アッセイ、例えばウエスタンブロッティングまた
はELISAを実施する(Sale et al.，"Requirement of MAP Kinase for Differenti
ation of Fibroblasts to Adipocytes，for Insulin Activation of p90 S6 Kin
ase and for Insulin or Serum Stimulation of DNA Synthesis,"EMBO J.，Vol.
，14，No．4，674-684(1995)；Gao，Ping and Malbon，Craig C.，"Morphogen-i
nduced Declinein G1 α2 Triggers F9 Teratocarcinoma Stem Cell Progression
via Phopholipase C and Mitogen-activated Protein Kinase,"J．Biol．Chem.
，Vol．271，No．15，9002-9008(1996)；Boulton，T.G．and Cobb，M.H.，"Iden
tification of Multiple Extracellular Signal-regulated Kinases（ERKs）wit
h Antipeptide Antibodies,"Cell Reg，Vol．2，357-371(1991))。別法として、
ERK-1またはERK-2発現のレベルは他の標準技術、例えば免疫組織化学染色および
免疫沈殿により測定してよい。
蛋白質の存在の検出のための抗体を用いた免疫アッセイは、通常、蛋白質を含
む疑いのあるサンプルを抗体とインキュベートし、そして抗体と蛋白質の間の複
合体の存在を検出することに基づく。抗体はインキュベーション工程の前、間ま
たは後の何れかにおいて標識される。蛋白質は検出前に固定化されるのが好まし
い。固定化は蛋白質を固相表面、例えばマイクロタイターウエルに直接結合させ
るか、または固定化した抗体に蛋白質を結合させることにより達成してよい。
好ましい態様においては、蛋白質は蛋白質に特異的な固定化一次抗体を通して
固相上に固定化される。固定化された一次抗体を蛋白質を含む疑いのあるサンプ
ルとインキュベートする。存在するならば、蛋白質は一次抗体に結合する。
二次抗体も蛋白質に特異的であり、固定化された蛋白質に結合する。二次抗体
は当業界において公知の方法により標識してよい。非固定化物質は洗い流されて
、固定化された標識の存在が蛋白質の存在を示す。これおよび他の免疫アッセイ
はHybritech，Inc.，LaJolla，Californiaに対する米国特許第4,376,110号にお
いてDavid et al.,により記載される。
免疫アッセイは１工程または２工程を含んでよい。１工程アッセイにおいては
、標的分子が存在するのなら固定化して標識抗体とインキュベートする。標識抗
体は固定化標識分子に結合する。未結合分子の除去のための洗浄後、サンプルを
標識の存在に関してアッセイする。
２工程アッセイにおいては、固定化された標的分子を未標識一次抗体とインキ
ュベートする。標的分子−抗体複合体が存在するのならば、次に、未標識抗体に
特異的な二次標識抗体に結合させる。サンプルを洗浄して上記のとおりに標識の
存在に関してアッセイする。
本明細書に記載されたイムノメトリックアッセイは、同時のサンドイッチ、前
方（forward）サンドイッチ、およびリバースサンドイッチ免疫アッセイを含む
。これらの用語は当業者にはよく知られている。
前方サンドイッチ免疫アッセイにおいては、サンプルは、最初に、蛋白質に対
する抗体を含む固相免疫吸着剤とインキュベートする。インキュベーションは、
サンプル中の蛋白質が固相中の固定化された抗体に結合するのに十分な時間続け
る。最初のインキュベーションの後、固相免疫吸着剤をインキュベーション混合
物から分離して洗浄することにより過剰な蛋白質並びにサンプル中に存在するか
もしれない他の干渉物質を除去する。固定化された抗体に結合した固相免疫吸着
剤含有蛋白質は、続いて、蛋白質上の異なるドメインと交差反応する可溶性標識
抗体ともう一度インキュベートする。第２のインキュベーションの後、別の洗浄
を実施して、固体免疫吸着剤から未結合の標識抗体を除去し、そして非特異的に
結合した標識抗体を除去する。固相免疫吸着剤に結合した標識抗体を検出し、検
出された標識抗体の量を最初のサンプル中に存在する抗原の量の直接の測定値と
する。別法として、固相免疫吸着剤複合体に結合しない標識抗体を検出すること
もでき、その場合、測定値はサンプル中に存在する抗原の量と反比例する。前方
サンドイッチアッセイは、例えば来国特許第3,867,517号；第4,012,294号および
第4,376,110号に記載される。
リバースサンドイッチアッセイにおいては、サンプルを最初の標識抗体とイン
キュベートする。蛋白質上の異なるドメインに交差反応する固定化抗体を含む固
相免疫吸着剤を標識抗体に加えて、第２のインキュベーションを実施する。前方
サンドイッチアッセイに必要な最初の洗浄工程は必要ないが、第２のインキュベ
ーションの後に洗浄を実施する。リバースサンドイッチアッセイは、米国特許第
4,098,876号および第4,376,110号に記載される。
同時サンドイッチアッセイにおいては、サンプル、固定化抗体を含む固相免疫
吸着剤、および異なるドメインに特異的な標識可溶性抗体は、一つのインキュベ
ーション工程において同時にインキュベートする。同時アッセイはたった一つの
インキュベーションを必要とし、何ら洗浄工程を必要とはしない。同時アッセイ
は極めて有用な技術であり、操作の用意性、均質性、再現性、アッセイの直線性
および高い正確性を提供する。David et alに対する米国特許第4,376,110号を参
照されたい。
上記アッセイの各々において、ERK-1および／またはERK-2蛋白質を含むサンプ
ル、固定化抗体を含む固相免疫吸着剤、および標識された可溶性抗体は、蛋白質
が固定化抗体および可溶性抗体に結合するのを許容するのに十分な条件下並びに
期間インキュベートする。通常、可能な限り多くの蛋白質を結合するのに十分な
インキュベーション条件を提供することが望まれるが、これは固相への標識抗体
の結合を最大にして、それによりシグナルを増加させるためである。特定の濃度
の標識されて固定化された抗体、インキュベーションの温度および時間並びに他
のそのようなアッセイ条件は、様々な因子に依存して変更することができ、サン
プル中の蛋白質の濃度、サンプルの性質等を含む。当業者は、日常の実験を用い
ることにより各測定のための有効かつ最適なアッセイ条件を決定することができ
る。
用いられてきて、本発明において使用できる、多くの固相免疫吸着剤が存在す
る。よく知られた免疫吸着剤は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デキ
ストラン、ナイロン、および他の材料から作られたビーズ；そのような材料で形
成されるかまたはコートされたチューブ等を含む。固定化された抗体は、アミド
またはエステル結合による共有結合等の技術によるかまたは吸着により、固相免
疫吸着剤に共有結合または物理結合してよい。
免疫アッセイに適切な抗体を標識する方法は、例えば、Hunter and Greenwood
，Nature，Vol．144，945(1962)およびDavld et al.，Biochemistry，Vol．13，
1014-1021(1974)により記載される。抗体を標識するための追加の方法は、米国
特許第3,940,475号および第3,645,090号に記載される。
オリゴヌクレオチド、抗体またはその断片のための標識は、放射性であってよ
い。有用な放射性標識のいくつかの例は、32Ｐ，125Ｉ，131Ｉおよび3Ｈを含む
。放射性標識の使用は、英国第2,034,323号、米国第4,358,535号および米国第4,
302,204号に記載される。
非放射性標識のいくつかの例は、電子顕微鏡により検出可能な酵素、色素体、
原子および分子、並びにそれらの磁気特性により検出可能な金属イオンを含む。
いくつかの有用な酵素標識は、基質中に検出可能な変化を起こす酵素を含む。
いくつかの有用な酵素およびそれらの基質は、例えば、ホースラディッシュパー
オキシダーゼ(ピロガロールおよびｏ−フェニレンジアミン)、ベーター−ガラク
トシダーゼ(フルオレセインベータＤ−ガラクトピラノシド)、およびアルカリホ
スファターゼ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロ
ブルーテトラゾリン）を含む。酵素標識の使用は、英国第2,019,404号、欧州特
許63,879号およびRotman，Proc．Natl．Acad．Sci.，Vol．47，1981-1991(1961)
に記載される。
有用な色素体は、例えば、蛍光、ケミルミネッセンス、およびバイオルミネッ
センス分予並びに染料を含む。本発明において有用ないくつかの特定の色素体は
、
例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドおよびフィコエリトリン
、ウンベリフェロン、ルミノールを含む。
標識は、当業者に公知の方法により抗体またはヌクレオチドに結合させてよい
。標識は、プローブ上の官能基を通して直接付着させてよい。プローブは、その
ような官能基を含むか含むようにさせることができる。適切な官能基のいくつか
の例は、例えば、アミノ、カルボキシル、スルフィドリル、マレイミド、イソシ
アネート、イソチオシアネートを含む。
別法として、酵素および色素体分子等の標識をカップリング剤、例えばジアル
デヒド、カルボジイミド、ジマレイミド等により抗体またはヌクレオチドに結合
させてよい。
標識は、上記の方法によりプローブに付着させたリガンドおよび標識に付着さ
せたそのリガンドのリセプターの手段によりオリゴヌクレオチドまたは抗体に結
合させてもよい。あらゆる公知のリガンド−リセプターの組合わせが適切である
。いくつかの適切なリガンド−リセプター対は、例えば、ビオチン−アビジンま
たはストレプトアビジン、および抗体−抗原を含む。ビオチン−アビジンの組み
合わせが好ましい。
上記のアッセイにおいて使用される抗体は、ポリクローナルまたはモノクロー
ナルであってよい。ポリクローナル抗体は当業界において公知の方法に従い、ER
K-1またはERK-2蛋白質またはその機能類似物を接種された哺乳類から単離してよ
い。簡単にいえば、ポリクローナル抗体は、宿主哺乳類、例えばウサギ、マウス
、ラットまたはヒツジにERK-1またはERK-2に特異的な抗体を産生することができ
る蛋白質またはその断片を注射することにより生産してよい。哺乳類からの血清
を抽出して、ERK-1またはERK-2に特異的なポリクローナル抗体を得るためにスク
リーニングする。
抗体は、好ましくはモノクローナルである。モノクローナル抗体は、当業界に
おいて公知の方法により生産してよい。これらの方法は、Kohler and Milstein
，Nature，Vol．256，495-497(1975)およびCampbell，"MonoclonalAntibody Tec
hnology，The Production and Characterization of Rodent and Human Hybrido
mas,"in Burdon et al.，Eds，Laboratory Techniquesin Biochemistry and
Molecular Biology，Vol．13，Elsevler Science Publishers，Amsterdam 1985
に記載された免疫方法；並びにHuse et al.，Science，Vol．246，1275-1281(19
89)により記載得た組換えDNA法を含む。
以下の非限定実施例により証明されるとおり、本発明の方法は、特に、哺乳類
における乳癌を同定し、監視し、そして治療することに応用できる。
実施例
別に示さない限り、ゲル電気泳動、免疫ブロッティング、免疫染色、および免
疫沈殿は標準技術であり、Sambrook et al.，Molecular Cloning:A Laboratory
Manual，Vol．1-3，2nd editlon，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New
York 1989に記載されるとおりである。
実施例１
全部で37の胸部組織サンプルを以下の患者から採った：正常胸部組織の５人、
女性化***の１人、良性線維腺腫の４人、線維嚢胞症の５人、線維嚢胞症と線維
腺腫の１人、慢性炎症疾患の２人、初期胸部カルシノーマを有すると、のちに同
定された11人および癌肉腫の１人。
切り出された組織サンプルを切片化し、凍結し、80℃において一時保存して、
保存のために液体窒素に入れた。凍結したサンプルは、次に貯蔵庫から取り出し
て、液体窒素に入れて、機械的に粉末化した。その結果の粉末を、溶解バッファ
ー（70mM β-グリセロホスフェート(pH7.2)、0.1mMバナジン酸ナトリウム、２mM
MgCl2、１mMジチオスレイトール、0.5％（v/v）トリトンＸ-100、0.2mMフェニ
ルメチルスルフォニルフルオライド、５mg/mlロイペプチン、２mg/mlアプロチニ
ン）中で再構成した。
MAPキナーゼ活性は、Gupta et al.，"MAP Kinase is constit utively active
in gip2 and src transformed rat HeLa cells,"J．Biol．Chem.，Vol．267，7
987-7990(1992)に記載されたとおりに基質としてEGFリセプターペプチドを用い
て測定した。各サンプルのMAPキナーゼ活性は３通りに、そして、１回より多く
（on more than one occassion）分析した。10人の患者から採っ織サンプルの代
表的結果を図１に示すが、４つの異なる病理状態として分類される。
図１において見ることができるとおり、初期胸部カルシノーマサンプルは増加
したレベルのMAPキナーゼ活性を示した。例えば、一人の患者において、MAPキナ
ーゼ活性は、分析された悪性組織サンプル中で、分析された３つの正常（非悪性
）組織サンプルよりも５−６倍高かった。
これらの発見は、乳癌を有する全11人の患者において一致し、全てが顕著に上
昇したMAPキナーゼ活性を示した。MAPキナーゼ活性（pmol/分/mg蛋白質）は、初
期胸部カルシノーマの患者の組織に関する6.39±0.71（p≦0.05の違い）に比較
して、対照研究群からの組織に関する1.40±0.19（平均±S.E.M..，n=6）であっ
た。
実施例２
初期胸部カルシノーマにおけるMAPキナーゼの増大した活性化の原因を決定す
るために、MAPキナーゼ発現を、実施例１に記載された胸部組織サンプルのいく
つかにおいて測定した。特に、線維嚢胞症(FC)、良性線維腺腫（FA）および胸部
カルシノーマ（CA）の患者からの胸部組織サンプルを利用した。
組織サンプルは実施例１に記載の方法に従い処理した。組織抽出物のサンプル
（即ち、細胞蛋白質）を、10％アクリルアミド分離用ゲル上において50μg/レー
ンにてSDS-PAGEに供した。分離された蛋白質は、Moxham et al.，"Mammalian be
tal and beta2-adrenergic receptors，immunological and structural compari
sons,"J．Biol．Chem.，Vol．261，14562-14570(1986)の方法に従い、ニトロセ
ルロースフィルター上に移して、ヒトMAPキナーゼに特異的な一次抗体（BRL Lab
oratories，Gaithersberg，MD）と免疫複合体形成し、そして免疫複合体のアル
カリホスファターゼ−結合二次抗体染色により可視化した。より特定すれば、ブ
ロットを調製し、一次抗体で染色して、洗浄し、二次抗体で染色して、次にバン
ドが見えるまで（約30秒）22℃において基質（5.0mlの50mMグリシン(pH9.6)、0.
17mg/ml p-ニトロブルーテトラゾリンクロリド、7mM MgCl2、および0.08mg/ml 5
-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート）とインキュベートした。反応は
、基質溶液を洗い流して蒸留水で洗浄することにより停止した。染色した免疫ブ
ロットを図２に示す。
図２から、乳癌におけるMAPキナーゼの顕著な過剰発現が高度に可視化された
バンドから明らかとなる。しかしながら、良性線維腺腫および線維嚢胞症の組織
サ
ンプルを用いた場合には、同じ条件下でMAPキナーゼ活性の何らかの染色があっ
たとしても殆どなかった。即ち、この実施例は、MAPキナーゼの過剰発現が乳癌
におけるMAPキナーゼの過剰活性化の原因の一つであることを証明する。
実施例３
胸部組織は細胞種に関して異種であることから、MAPキナーゼの上昇した発現
に必要な細胞種の同定を調査した。約４ミクロン厚の薄い切片を初期胸部カルシ
ノーマのパラフィンブロックからスライスした。切片は、慣用の組織病理学に従
い、全てエオシンおよびヘマトキシリンで染色した。一つの代表的な染色切片を
図３のパネルＡに示す。癌細胞を矢印により示す。
残りの切片は次に、Nuovo et al.，"Correlation of the in situ detection
of polymerase chain reaction-amplified metalloprpteinase complementary D
NAs and their inhibitors with prognosis in cervical carcinoma,"Cancer Re
s.，Vol．55，267-275(1995)；およびG.J．Nuovo， in situ Hybridizatjon．P
rotocols and Applications，2nd edition，Raven Press，New York 1994に記載
された方法に従い、インサイチュRT-PCRに供した。ジゴキシゲニン（dUTPの形態
の）をPCRのためのリポーター分子として用いた。色素体と共に用いたアルカリ
ホスファターゼにカップリングした抗ジゴキシゲニン抗体を利用してPCR産物を
可視化（青色染色）した。
RT-PCR実験のための対照は、以下の様式において調製した。陰性対照は、非関
連Ｃ型肝炎ウイルスRNAに関するPCRプライマー（センス配置、TCCGCGGCCGCACTCC
ACCATGAATCACTCCCC(配列番号：５)、アンチセンス配置、AGTCTTGCGGCCGCAGCGCCA
AATC（配列番号：６）を用いてDNase消化後に調製した。陰性対照は、図３のパ
ネルＢに示す。陽性対照は、MAPキナーゼに関するPCRプライマー（センス配置、
GCAGGTGTTCGACGTGGG(配列番号：７)；アンチセンス配置、GTGCAGAACGTTAGCTGAAT
（配列番号：８））およびゲノミックDNAを用いて、DNaseの前処理なしに調製し
た。陽性対照を図３のパネルＣに示す。高いレベルのMAPキナーゼmRNA発現が強
い青色染色として観察できる。
試験切片は、DNAse処理後にMAPキナーゼのためのPCRプライマーを用いて分析
して、RT-PCRを行った。分析された切片を図３のパネルＤ，ＥおよびＦに示す。
単
一の患者からの良性組織サンプルと悪性組織サンプルの間の比較を提供するため
に、患者DWからのサンプルをMAPキナーゼのmRNAのインサイチュRT-PCRにより分
析した。これらの結果をパネルE（良性サンプル）およびパネルＦ（悪性サンプ
ル）に示す。
分析された切片からは、驚くべきことに、MAPキナーゼmRNAが初期胸部カルシ
ノーマサンプルの上皮細胞においてのみ高く発現されたことがわかった。DNAse
消化に続くインサイチュRT-PCRは、癌性上皮細胞の細胞質中の高いレベルのMAP
キナーゼmRNAに関する最初の証拠（強い青色染色）を提供した(矢印により示さ
れる)。しかしながら、パネルＤおよびＦにおいて観察されうるとおり、周囲の
間質および脂肪細胞は強い染色を示さなかった。同様に、良性線維腺腫症の組織
は上皮細胞にときおり弱いシグナルを示しただけであった(データは示さず)。即
ち、上皮起源の癌細胞におけるインビボのMAPキナーゼの過剰発現の発見は診断
および治療のための唯一の機会を提供する。
実施例４
インサイチュRT-PCRを、転移した初期胸部カルシノーマを有するリンパ節組織
に実施することにより、転移癌のMAPキナーゼの過剰発現を調査した。約４ミク
ロン厚の薄い切片を、転移した初期胸部カルシノーマを有するリンパ節組織のパ
ラフィンブロックから切り出した。実施例３に記載された方法に従い、切片を分
析した。
分析されたリンパ節組織の結果を図４に示すが、以下の様式により記述するこ
とができる。図４のパネルＡは、エオシンおよびヘマトキシリン染色により分析
された切片を示し、矢印により示されたとおりリンパ節中の転移癌細胞を明らか
にする。図４のパネルＢは、陰性対照として働く切片を示し、青色染色を示さな
い。パネルＣは、全部の癌細胞を染色する強い核の青色を示す陽性対照として働
く切片を示す。パネルＤは、全部の癌細胞において強い核の青色染色を示すが周
囲の間質細胞には事実上染色をしない試験切片を示す。これらの結果は、過剰発
現のMAPキナーゼは上皮癌の転移部位にも局在することを証明する。
実施例５
初期胸部カルシノーマおよび転移したリンパ節組織の切片を免疫組織化学分析
に供して、インビボにおいてMAPキナーゼの発現を確認した。慣用の組織病理学
に従い、切片をエオシンおよびヘマトキシリンで全て染色した。次に、切片をNu
ovo et al.，"In situ detection of PCR-ampilfied HIV-1 nucleic acids and
tumor necrosis factor cDNA in cervical tissues,"Amer．J．Pathol.，Vol．1
43，40-48(1993)に記載されたとおりに分析し、ヒトMAPキナーゼに対するマウス
モノクローナル抗体（Zymed，South San Francisco，CA）を利用して、二次ビオ
チン化抗体、続いてアルカリホスファターゼ−結合ストレプトアビジンおよび即
効性の赤色基質の使用により可視化された。
図５のパネルＡおよびＢから、MAPキナーゼの過剰発現が、それぞれ初期およ
び転移性乳癌の分析された切片において明瞭に観察される。強い赤色染色は、初
期並びに転移部位の両者において眼上皮細胞の細胞質（矢印により示される）に
おいて観察された。
実施例６
実施例２に従い、組織サンプルを切り出し、切片にし、凍結し、そして抽出物
を調製した。細胞蛋白質のサンプルを次に以下に記載される３つの様式の一つに
おいてさらに処理した。
実施例２の方法に従い、組織抽出物サンプルの一つのセットを直接SDS-PAGEに
供して、免疫ブロット染色したが、２つの修飾を伴った。第１に、実施例５のマ
ウスモノクローナル抗体を一次抗体として用いた。第２に、蛋白質マーカーを利
用することにより、MAPキナーゼの移動度を測定した。３つの病理状態（正常(Ｃ
)、線維性嚢胞(FC)、およびカルシノーマ(CA)）に関する免疫ブロット染色の結
果を図６のパネルＡに示す。
組織抽出物サンプルの第２のセットを以下の様式において、免疫沈殿、SDS-PA
GEおよび免疫ブロット染色に供した。サンプリング組織抽出物（約0.6mgの蛋白
質）を、二重リン酸化された（セリンおよびスレオニン）活性形態のMAPキナー
ゼに特異的な、実施例５のマウスモノクローナル抗体またはウサギポリクローナ
ル抗体（ProMega，Madison，WI）の何れかを用いて免疫沈殿させた。免疫ブロッ
ト染色の結果を図６のパネルＣに示す。免疫沈殿物は、次に、この実施例におい
て前に記載されたとおりにSDS-PAGEおよび免疫染色に供したが、一次抗体として
ホ
スホチロシン抗体（Transduction Laboratories，Lexington，KY）を用いた。免
疫ブロット染色の結果を図６のパネルＢに示す。
組織抽出物サンプルの第３のセットは、この実施例において前に記載されたと
おりにSDS-PAGEおよび免疫ブロット染色に直接供したが、一次抗体として前に記
載したウサギポリクローナル抗体を用いた。免疫ブロット染色の結果を図６のパ
ネルＣに示す。
免疫ブロットの結果は以下の様式において要約できる。パネルＡは、非悪性組
織中においていくらかの限られたMAPキナーゼ発現があったが、初期胸部カルシ
ノーマは顕著に高いレベルのMAPキナーゼをまだ示したことを証明する。パネル
Ｂは、初期胸部カルシノーマの患者もチロシン残基においてリン酸化されたMAP
キナーゼの増大したレベルを示したことを証明する。同様に、パネルＣは、初期
胸部カルシノーマの患者が二重にリン酸化された、即ち完全に活性なMAPキナー
ゼの増大したレベルを示すことを証明する。即ち、初期胸部カルシノーマの患者
は増大したレベルのMAPキナーゼ発現を示すのみではなく、増大したレベルの完
全に活性なMAPキナーゼを示す。
実施例７
実施例６において見いだされたMAPキナーゼ過剰発現の発見を確認するために
、追加の免疫ブロット分析を実施した。線維性嚢胞（FC）の患者（VH）および初
期胸部カルシノーマ（CA）の患者からの組織抽出物のサンプルを実施例２に従い
SDS-PAGEおよび免疫ブロットのために調製したが、以下の修飾を伴った。免疫ブ
ロットはMAPキナーゼ（MAPK）またはホスホチロシン（PY）の何れかに対する、
前に記載した抗体で染色した。免疫ブロットの結果を図７に示す。
図７から、チロシン残基上のリン酸化が初期胸部カルシノーマにおいて過剰発
現されたMAPキナーゼにおいて上昇することが容易に認識される。両方の患者か
ら採取したサンプルの同量の蛋白質負荷（50μg/レーン）は、MAPキナーゼの量
が増加したのみならず、リン酸化状態が初期胸部カルシノーマにおいて増加する
ことを確証する。
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(31)優先権主張番号 ０８／９０９，７４２
(32)優先日 平成９年８月12日(1997．8．12)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
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ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ
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ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ
Ｕ，ＺＷ
(72)発明者 マルボン，クレイグ・シー
アメリカ合衆国ニューヨーク州11733，セ
トーケット，ホイラー・コート １