JP2001518451A - アレルゲンの非アナフィラキシー形およびその使用 - Google Patents
アレルゲンの非アナフィラキシー形およびその使用Info
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Abstract
Description
び、例えば、インビトロタイプIアレルギー(IgE介在アレルギー)の診断に関
連したアレルゲンに対する抗体(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)の測
定への該形の使用に関する。本発明はまた、タンパク質アレルゲンに対するタイ
プIアレルギーに罹患している哺乳類個体、特にヒトの減感作の方法に関する。
/ポリペプチドを意味する。従って、本用語は、哺乳類、最も重要にはヒトでタ
イプIアレルギー反応をもたらす、最小フラグメントを含む自然に存在するタン
パク質アレルゲンを含む。
major birch pollen allergen, Bet v 1, into two non-anaphylactic T cell e
pitope containing fragments", J. Clin. Invest. 99(7) April 1997, 1673-16
81参照。
vingstone, New York (1985))。花粉、ダニおよび動物鱗屑からの環境的タンパ ク質が、エフェクター細胞(肥満細胞、好塩基球)結合特異的IgE抗体の架橋に
より、生物学的メディエーター(例えば、ヒスタミン)の放出を誘導する主要な因
子に属す。B−細胞からの特異的IgEの産生は、その大半がTH2タイプに属
するアレルゲン特異的T−ヘルパー細胞により刺激される(Romagnani, Immunol.
Today 13 (1992) 379-381)。タイプIアレルギー性疾患の治療は、現在、薬理 学的処置および特異的免疫治療により行われる。特異的免疫治療は、今世紀の最
初に既に確立されており(Noon, Lancet 1 (1911) 1572-1573)、長期間のアレル ゲンの漸増量の全身投与を含む。特異的免疫治療は有効な処置であると認識され
ているが、アナフィラキシー副作用の発生が本治療の主要な欠点の一つである。
アナフィラキシー反応を減少させるために、T−細胞エピトープの使用がアレル
ゲン特異的免疫治療のために現在提案されている(Briner et al., Proc. Natl.
Acad. Sci, USA 90 (1993) 7608-7612, およびNorman, Curr. Opin. Immunol. 5
(1993) 986-973)。
., J. Immunol 150 (1993) 1047-1054; Joost-van-Neerven et al., J. Immunol
. 151 (1993) 2326-2335; およびSchenk et al., J. Allergy Clin. Immunol. 9
6 (1995) 986-996)、これは連続的IgE−エピトープとオーバーラップし得る 。エフェクター細胞(肥満細胞、好塩基球)結合IgEの架橋およびメディエータ
ー放出を予防するために、T−細胞エピトープおよびIgEエピトープは全裂さ
れる必要がある。主要なアレルゲンのT−細胞ワクチンへの変換の概念に従って
、本発明者らは、モデルとして主要な樺花粉(birch pollen)アレルゲンであるBe
t v 1(Breiteneder et al., EMBO J. 8 (1989) 1935-1938)を選択した。
2; およびLaffer et al., J. Immunol. 157 (1996) 4953-4962)。加えて、Bet v
1は、木花粉および食物アレルギー個体の95%で認識されており、その殆ど6
0%がBet v 1に対して排他的に感作されている最も一般的なアレルゲンの一つ である(Jarolim et al., Allergy 44 (1989) 385-394)。Bet v 1をコードするc
DNAは、近年単離されており(Breitender et al., EMBO J. 8 (1989) 1935-19
38)、組換えBet v 1がEcherichia coliで発現された(Valenta et al., J. Aller
gy Clin. Immunol. 88 (1991) 889-894; およびFerreira et al., J. Biol. Che
m. 268 (1993) 19574-19580)。組換えBet v 1は、天然Bet v 1と同程度のIgE
結合能を有し、種々の木の花粉および植物由来食物に提示されるBet v 1ホモロ グタンパク質とIgEおよびT−細胞エピトープを共有する(Ebner et al., J.
Allergy Clin. Immunol. 95 (1995) 962-969; Ebner et al., J. Immunol. 150
(1993) 1047-1054; およびSchenk et al., Eur. J. Biochem. 224 (1994) 717-7
24)。組換えBet v 1の生物学的活性は、アレルギー患者のヒスタミン放出実験お
よび皮膚刺試験(skin prick testing)により証明されている(Valenta et al., J
. Allergy Clin. Immunol. 91 (1993) 88-97; Pauli et al., J. Allergy Clin.
Immunol. 98 (1996) 1100-1109; およびMenz et al., Clin. Exp. Allergy 26
(1995) 50-60)。
来したタンパク質アレルゲンと比較して、猛烈に減少したアナフィラキシー能を
有し、従って、本発明の中では非アナフィラキシーと呼ぶ。免疫原は: a)フラグメントがタンパク質アレルゲンのIgEエピトープと全体的にではな く部分的にオーバーラップするIgGエピトープを含み、ポリマー形において、
フラグメントがモノマー単位を構成するものである、タンパク質アレルゲンの非
アナフィラキシー免疫原組換えフラグメントのポリマー形;または b)タンパク質アレルゲンがモノマー単位を構成する、該タンパク質アレルゲン の組換えポリマー形 を含むことにより特徴付けられる。
ント化または重合化により減少される。
いて、IgEエピトープは、フラグメント形成により分割されている。“分割I
gEエピトープ”なる用語は、フラグメント形成が、対応する出発花粉アレルゲ
ンに存在するIgEエピトープの一部のみを含むフラグメントをもたらすことを
意味する。該エピトープは、立体配置的または直線状であり得、上記ポリマー形
(a)に従ったフラグメントの場合、IgEエピトープが立体配置的であることを
特に強調する。本明細書の実験部分およびVratala et al., J. Clin. Invest. 9
9(7) April 1997, 1673-1681に記載のようなBet v 1フラグメントaa1−74お よび75−160の比較。
イズは、特異的アレルゲンに依存して変化する。通常、最大サイズは、完全なア
レルゲンにより誘導される反応の10%に対応するアナフィラキシー反応を産生
することなく製造できるアレルゲンの最大フラグメントであると言える(皮膚試 験または好塩基球ヒスタミン放出で測定して)。
2−10を含むことを意味する。優先日において、2、3および4モノマー単位
を含むポリマー形で結果が得られている。
に組換え法により製造し得る。(a)に関して、ポリマー形はまた2個またはそれ
以上の組換えフラグメント分子の、所望により共通担体分子への共有結合的結合
により達成し得る。減感作療法またはインビトロアッセイに使用する最終免疫原
において、(a)および(b)に従ったポリマー形は、免疫原性を増加させるために
担体に結合していてもよい。この場合、担体はタンパク質であり、直線状免疫原
が望まれる場合、原核生物(例えば、E. coli)または真核生物(酵母または哺乳類
細胞系)細胞のような適当な宿主細胞内での対応する遺伝子構築物の発現により 一段階で免疫原を製造することが可能である。更に、Scheiner O and Kraft D,
Allergy 50 (1995) 384-391; およびValenta R and Kraft D, Current Opinion
in Immunology 7 (1995) 751-756を参照。
モノマー単位の間に、オリゴペプチドリンカーを挿入するのは容易である。リン
カーにおける適当なアミノ酸残基は、疎水性または親水性、もしくは塩基性、酸
性または中性アミノ酸の中から選択し得る。疎水性アミノ酸はTrp、Gly、
Ala、Phe、Pro、Met、Val、LeuおよびIleである。親水性
アミノ酸は、例えば、Gln、Ser、Gly、Glu、Pro、Hisおよび
Argである。オリゴペプチドリンカーの長さは、典型的に0−30の間、例え
ば、0−10の間の整数のアミノ酸残基である。優先日に、好ましいリンカーは
トリペプチドLeu−Val−Proであった。 実験部分において、本発明は樺花粉アレルゲンBet v 1で説明する。
ンに関して当分野で既知のように行い得、タンパク質アレルゲンに対するタイプ
Iアレルギーに罹患している哺乳類、典型的にヒトに、タンパク質アレルゲンに
対するIgG免疫応答を惹起できる免疫原を反復投与することを含む。投与は、
全身的に、例えば、注射、輸液等で行い得るが、経口経路も免疫系の腸部分を曝
すために提案されている。免疫原は、酸化アルミニウムのような適当なアジュバ
ントと混合し得る。更に、Norman PS, "Current status of immunotherapy for
allergies and anaphylactic reactions" Adv. Internal. Medicine 41 (1996)
681-713。
ク質アレルゲン群に対するIgA、IgD、IgE、IgGまたはIgMクラス
の特異的抗体の検出のための免疫アッセイにおける、第1の態様の、特に、(b)
形に従った免疫原の抗原としての使用である。適当なアッセイ変法は、免疫原、
サンプル抗体および目的のIg−クラスに対する抗体の3成分系免疫複合体の形
成を含む。サンプルは、Ig−含有体液、例えば、血液由来サンプル(血清、血 漿、全血)、CSF等であり得る。
ここで、3つの非限定的実施例により説明する。
pollen allergen Bet v 1 is highly homologous to a pea resistance respons
e gene", EMBO J. 8 (1989) 1935-1938)を、以下のオリゴマープライマーとPC
R−増幅した:
構築と同じプライマーを使用した。 第2Bet v 1−セグメント:
anchburg, N.J. USA):44μl H2Odd、10×l 10×PCR緩衝液、4 μl 5mM dATP、4μl 5mM dCTP、4μl 5mM dGTP 、4μl 5mM dGTP、4μl 25mM MgCl2、3μl 10×M
プライマー1、3μl 10×M プライマー2、10μl 1ng/μl Bet v 1
。10×PCR緩衝液:100mM トリス−HCl、pH8.3および500 mM KCl。反応混合物を5分、94℃で加熱し、その後、94℃で1分、4
0℃で2分および72℃で3分の35サイクルを行った。最初のサイクルの間に
、10μlのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(2.5U/10μl)を添加した。
部位を含むプライマーを、最初にEco RIで消化して、サブクローニングを促進さ
せた。消化フラグメントをNickカラム(Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden
)を使用して精製し、pET-17bプラスミド(Novagen, Madison, USA)にライゲート した。第1Bet v 1セグメントを含むプラスミドを、更にBet v 1−ダイマーの場
合Kpn I/Xho Iで、Bet v 1−トリマーの場合Kpn I/Spe Iで消化してベクターを 得、その中に第2Bet v 1−セグメントを挿入した。Bet v 1−トリマーの場合、
この構築物を更にSpe I/Eco RIで消化し、第3のBet v 1−セグメントを添加し た。
ルβ−チオガラクトピラノシドの導入によりE. coli BL21(DE3)に発現させた。E
. coli細胞を遠心により採取し、洗浄して培養培地を除去した。 LB−培地:10g塩化ナトリウム、10gペプトン、5g酵母抽出物、NaO
HでpH7.5、使用前にオートクレーブ。
tala et al., "Immunologic characterization of purified recombinant timot
hy grass pollen (Phleum pratense) allergens (Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5)"
, J. Allergy Clin. Immunol. 97 (1996) 781-786)。封入体は、8M尿素、10
mMトリス、pH8、1mM EDTA、5mM β−メルカプトエタノールで
可溶化し、10mMトリス、pH8で6M尿素の濃度に希釈し、15分、10, 000gで遠心して不溶性物質を除去した。組換えタンパク質を含む上清を最終
濃度2M尿素に透析した。遠心(15分、10,000g)後、上清をDEAE Sephar
ose(Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)を充填したカラムに付し、タンパ
ク質を0−0.5M NaCl−勾配で溶出した。>80%純粋な組換えタンパ ク質を含むフラクションを6M尿素、10M NaH2PO4、pH4.8に対し て透析し、SP Sepharose(Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)を充填した カラムで再クロマトグラフィーした。>95%純度の組換えBet v 1−ダイマー または組換えBet v 1−トリマーを含むフラクションを、再び10mMトリス、 pH7.5に対して透析し、−20℃で使用するまで貯蔵した。
を、異なる制限酵素開裂部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーでPCR−増
幅した。PCR−生産物を次いでスキームに示すようにライゲートし、プラスミ
ドpET-17b(Novagen, Madison, USA)にサブクローン化した。
染色SDS-PAGEゲル レーンM:分子量マーカー;レーン1は3μgの精製、組換えBet v 1モノマー、
レーン2は3μgの精製、組換えBet v 1ダイマー、およびレーン3は3μgの精 製、組換えBet v 1トリマーを含む。 結果:精製タンパク質は95%以上純粋であった。溶解タンパク質をサンプルの
充填前に高速遠心により不溶性物質から分離した。
清(レーン1−8)および非アレルギー患者からの血清(レーン9)をブロットした
アレルゲンの検出に使用した。結合IgEを125I標識抗−ヒト>IgE抗体(Ph
armacia & Upjohn Diagnositics, Uppsala, Sweden)で検出し、オートラジオグ ラフィーで検出した。 結果:ニトロセルロースブロットBet v 1−ポリマーのIgE−結合能は、Bet v
1モノマーと同等であった。
のIgE−反応性の決定 4名の花粉アレルギー患者の血清(A−D)を1:2(1)、1:10(2)、1:
20(3)、1:40(4)および1:80(5)に希釈し、精製、組換えBet v 1− モノマー、Bet v 1−ダイマーおよびBet v 1−トリマーとのIgE−反応性を試
験した。OD値をy軸に示す。 結果:アレルギー患者からの血清IgEは、Bet v 1−ポリマーにBet v 1−モノ
マーと同等な方法で結合した。
合の阻害 4名の樺花粉アレルギー患者からの血清(A−D)を異なる濃度(5μg、500
ng、50ngおよび5ng)の精製、組換えBet v 1−モノマー、Bet v 1−ダイマー およびBet v 1−トリマーとプレインキュベートした。プレインキュベート血清 を、次いで精製、組換えBet v 1−モノマーへのIgE−反応性に関してELISAで
試験した。光学密度(OD)をy軸に示す。 結果:Bet v 1−モノマーへのIgE−結合は、漸増濃度のBet v 1−ポリマーに
より、用量依存的に阻害された。一定濃度(50ng対5ng)での阻害に必要なBet
v 1−ポリマーの量は、しかしながら、モノマーと比べて約10倍高かった。
ュバントとしてのAl(OH)3で免疫化し、8匹のBalb/cマウスを毎月5μgの精
製、組換えBet v 1−トリマー−Al(OH)3で免疫化し、血液サンプルを各免疫
化後に取った。免疫化19週後および25週後に得た血清サンプルおよび免疫化
前に取った血清(免疫前血清0=)を1:1000に希釈し、精製、組換えBet v
1−モノマーとのIgG1−反応性をELISAで試験した。記号は、8匹の異なるBet
v 1−ダイマーまたはBet v 1−トリマーマウスのIgG1−結合に対応するOD
値を示す。 結果:Bet v 1−ポリマーは高レベルのIgG1−抗体を誘導することができ、こ
れはBet v 1−モノマーと交差反応する。
l、1μg/mlおよび10μg/ml)の精製、組換えBet v 1−モノマー、Bet v 1−
ダイマー、Bet v 1−トリマー、Bet v 1−テトラマーおよび陽性コントロールと
して抗−IgE抗体とインキュベートした。無細胞上清中のヒスタミン放出をR
IA(Immunotech, Marseille)により測定し、全ヒスタミン放出の割合として表 現した。 結果:Bet v 1−ダイマーはモノマーと比べて僅かに減少したヒスタミン放出を 、患者好塩基球から誘導するが、Bet v 1−トリマーおよびテトラマーは、ヒス タミン誘導の約100倍減少した能力を有した。ドナー試験において、Bet v 1 −モノマーは0.01μg/mlで、Bet v 1−トリマーおよびテトラマーは1μg/
mlの濃度で最大ヒスタミン放出を誘導した。
ム1において、エピトープの位置を示す)に特異性を有する異なる花粉アレルギ ードナー(カラム2はドナーのイニシャルを示す)からのT−細胞クローンを、精
製、組換えBet v 1−モノマー(カラム4)、Bet v 1−ダイマー(カラム5)、Bet
v 1−トリマー(カラム6)およびBet v 1−テトラマー(カラム7)とインキュベー
トした。陰性コントロールとして、クローンを培地単独(カラム3)と試験した。
増殖を3Hチミジン取り込みにより測定し、カウント/分(cpm)で示す(カラム3 −7)。 結果:Bet v 1−ポリマーおよびBet v 1−モノマーは特異的T細胞クローンの同
等の増殖を誘導した。
よび4名の非アレルギーコントロール個体を、天然樺花粉抽出物、陽性コントロ
ールとしてヒスタミンおよび10μg/mlおよび100μg/mlの精製、組換えBe
t v 1−モノマー、Bet v 1−ダイマーおよびBet v 1−トリマーで前腕を皮膚刺 試験した。平均膨疹直径(DM)を表に示す。
反応をアレルギー患者で誘導するが、Bet v 1−トリマーは100μg/mlの濃度
まで、ある患者では全く膨疹反応を誘導しなかった。膨疹反応はタンパク質濃度
の用量依存的に増加した。非アレルギーコントロール個体は、ヒスタミンでのみ
皮膚反応を示したが、Bet v 1−調製物では示さなかった。ヒスタミン放出アッ セイおよび皮膚試験の両方は、Bet v 1−ポリマーが、Bet v 1−モノマーと比較
して非常に(100倍まで)減少したアナフィラキシー活性を有することを示す。
アナフィラキシーの可能性の減少は、重合度と比例する。
ovagen, Madison, USA)で高レベルで発現され、均質に精製された。Bet v 1−ポ
リマーは、免疫ブロッティングおよびELISAにより示されるように、IgE−結 合能を維持した。Bet v 1に対して特異的な樺アレルギードナーからのT細胞ク ローンは、全てのポリマーとのインキュベーションにより増殖し、ポリマーがBe
t v 1の適切なT細胞エピトープを含むことを示す。Bet v 1−トリマーおよびテ
トラマーは、患者好塩基球からのヒスタミン放出誘導に約100倍減少した能力
を有し、皮膚試験で評価されるように、非常に減少したアナフィラキシーの可能
性を有した。そのアナフィラキシー活性の減少のために、Bet v 1−ポリマーは 木花粉および関連食物アレルギーの特異的免疫治療の安全なツールとして考慮し
得る。アレルギー患者は、減少したアナフィラキシー副作用の危険性のこれらの
誘導体の高投与量で処置し得る。組換えポリマーと、アレルゲン誘導体を含む非
アナフィラキシーT細胞エピトープの差異は、それらがIgE結合部位を含むが
、減少したアナフィラキシーの可能性を有することである。
Bet v 1−由来ペプチドと、ELISAで使用した。3種のペプチドの配列は、図の下
部に示してあり、Bet v 1のaa49−60(p17)、aa52−63(p18)およびaa5 5−66(p19)に対応する。ペプチドを、Bet v 1特異的モノクローナルへの結合
に関して試験した。OD値をy軸に示す。両方のmoAbはペプチドp18およびp
19に結合し、それらはBet v 1の最初の半分に位置する。
v 1抗体(A、B)はヒトIgEの組換えBet v 1への結合を阻害する。ドットブロ
ットしたBet v 1は、60名のBet v 1アレルギー個体からの血清IgEとプロー
ブする前に、MoAB AおよびBとプレインキュベートした。結合IgEを125I−標
識抗−ヒトIgE抗体で検出し、ガンマ計数により定量した。IgE結合の阻害
は下記のように決定した: 100−(cpm1/cpm2)100=阻害% cpm1=moAbとのインキュベーションに関するカウント/分 cpm2=緩衝液とのインキュベーションに関するカウント/分 緩衝液とのプレインキュベーションと比較したIgE−結合の阻害%は、表に
示す。
et v 1, into two non-anaphylactic T cell epitope containing fragments",
J. Clin. Invest. 99(7) April 1997) 1673-1681を参照。
記載のように組換えアレルゲンと試験した(Valenta et al., J. Allergy Clin.
Immunol. 88 (1991) 889-894; Valenta et al., Int. Arch. Allergy Immunol.
97 (1992) 287-294)。加えて、全ての患者を病歴および皮膚刺試験により特徴付
けした。Bet v 1のaa40−65に特異性を有するマウスモノクローナル抗体moa
b 14を記載する(Labecque et al., J. Allergy Clin. Immunol. 99(3) (1997) 3
74-384)。天然樺花粉抽出物を記載のように調製した(Vrtala et al., Int. Arch
. Allergy Immunol. 102 (1993) 160-169)。アンピリシン耐性およびT7プロモ
ーターを含むプラスミドpET-17bをNovagen, Madison, USAから得た。組換えBet
v 1フラグメントを、E. coli株BL21(F-ompTrb-mB-)由来のリソゲンλDE3中で発 現させた(Studier et al., Meth. Enzymol. 185 (1990) 60-89)。
えBet v 1フラグメント(aa1−74、aa75−160)を、アレルギー患者のI gEのBet v 1への結合を阻害する(Lebecque et al., J. Allergy Clin. Immuno
l. 99(3) (1997) 374-384)マウスモノクローナル抗体のエピトープ(aa40−6 5)を維持するために、およびBet v 1配列に従って合成された重複ペプチドを使
用して地図作成されている主要T細胞エピトープを防止するために(Ebner et al
., J. Immunol. 150 (1993) 1047-1054)産生した。フラグメントaa1−74およ
びaa75−160をコードするcDNAは、Bet v 1 cDNAのPCR増幅により、
以下のオリゴヌクレオチドを使用して得た(Pharmacia Biotech AB, Upsala Swed
en):
は斜体である。サブクローニング効能を改善するために、PCR生産物を最初に
Eco RIおよびKpn Iで切断し、分取アガロースゲル電気泳動で精製し、プラスミ ドpEt-17b(Novagen, Madison, USA)のEco RIおよびKpn I部位にサブクローン化 し、E. coli BL21(DE3)(Novagen, Madison, USA)にエレクトロポレーションによ
り形質転換した。次いで、挿入物をNde I/Kpn Iで摘出し、再びプラスミドpET-
17bにサブクローン化し、形質転換した。正確なフラグメントを発現するコロニ ーを、Bet v 1 aa1−74に関してはmab 14およびBet v 1 aa 75-160に関して
はウサギ抗−Bet v 1 C−末端抗血清を使用した免疫スクリーニングにより同定
した。陽性クローンからのDNAをQuiagenチップ(Quiagen, Hilden, Germany)を使
用して単離し、両方のDNA鎖をSangerに従って、T7ポリメラーゼ配列決定キ
ット(Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)および35S dCTP(NEN, Ste
vehage, UK)(24)を使用して配列決定した。組換えBet v 1(aa1−74)およびBe
t v 1(aa75−160)を、0.5mM IPTGの、0.5−0.8のOD600
で5時間、37℃の液体培養による挿入により発現させた。
aa1−74)およびBet v 1(aa75−160)を、封入体として発現させ、記載の
ように発現した(Vrtala et al., J. Allergy Clin. Immunol. 97 (1996) 781-78
7)。封入体は、8M尿素、10mMトリス、pH8、1mM EDTA(エチレ ンジアミンテトラ酢酸)、5mM β−メルカプトエタノールで可溶化し、10 mMトリス、pH8で6M尿素の濃度に希釈し、15分、10,000×gで遠 心して不溶性物質を除去した。組換えタンパク質を含む上清を最終濃度2M尿素
に透析した。遠心(15分、10,000×g)後、上清をDEAE(ジエチルアミノエ
チル)Sepharose(Pharmacia Biotech AB)を充填したカラムに付し、タンパク質を
0−0.5M NaCl濃度勾配で溶出した。純度80%以上の組換えタンパク 質を含むフラクションを6M尿素、10M NaH2PO4、pH4.8に対して 透析し、SP Sepharose(Pharmacia Biotech AB)を充填したカラムで再クロマトグ
ラフィーした。純度95%以上の組換えBet v 1(aa1−74)または組換えBet v
1(aa75−160)を含むフラクションを、10mMトリス、pH7.5に対し て透析し、使用するまで凍結乾燥した。
1およびBet v 1フラグメント(aa1−74、aa75−160)を、ウェスタンブロ
ッティングおよびドットブロッティングアッセイによりIgE−結合能を試験し
た。免疫ブロッティングのために、約1μg/cm精製タンパク質をSDS-PAGE(Flin
g et al., Anal. Biochem. 155 (1986) 83-88)により分離し、Towbin(Towbin et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4353)に従ってニトロセル ロースにブロットした。タンパク質の変性を避けるために、ドットブロット実験
を並行して行った。1μgの精製組換えBet v 1、1μgの各Bet v 1フラグメント
および1μgのウシ血清アルブミンおよびヒト血清アルブミン(HSA)(陰性コント ロール)をニトロセルロース片にドットした。ウェスタンブロットしたアレルゲ ンまたはドットプロットしたタンパク質を含むニトロセルロース片をアレルギー
個体、非アレルギー個体由来の血清および記載のように血清の添加無しの緩衝液
とインキュベートした(Valenta et al., J. Exp. Med. 175 (1992) 377-385)。 結合IgE抗体を125I標識抗−ヒトIgE抗体で検出し、オートラジオグラフ ィーで可視化した。
ラグメントとはしなかった。草花粉アレルギー個体の血清は組換えBet v 1とも 組換えBet v 1フラグメントとも反応しなかった。
、デキストラン沈降により単離した(Valent et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 86 (1989) 5542-5547)。細胞を異なる濃度(0.001μg/ml−10μg/ml)
の精製組換えBet v 1、組換えBet v 1フラグメント(aa1−74、aa75−16 0)と別々におよび等モル混合物で、または抗ヒトIgE抗体とインキュベート した。上清に放出されたヒスタミンを放射免疫アッセイ(RIA)により測定した(Im
munotech, Marseille, France)(Valenta et al., J. Allergy Clin. Immunol. 9
1 (1993) 88-97)。全ヒスタミンを凍結融解後に細胞融解物から測定した。結果 はトリプリケート測定の平均値として得、全ヒスタミン放出のパーセントとして
示した。
球からのヒスタミン放出の誘導の約1000倍減少された能力を有する。Bet v
1フラグメントの両方の等モル混合物は、試験した各混合物と比較して、有意に ヒスタミンの放出を誘導しなかった。
al., Clin. Exp. Allergy 26 (1996) 50-60)。組換えBet v 1および組換えBet v
1フラグメントを0.9%w/v滅菌塩化ナトリウム溶液に、100μg/mlおよび 10μg/mlの濃度で新たに溶解した。コントロールとして、樺花粉SQ(標準品
質)抽出物、塩化ナトリウム溶液(陰性コントロール)およびヒスタミン塩酸塩(陽
性コントロール)(ALK, Horsholm, Denmark)を使用した。各滴を新しいプリック ・ランセット(ALK, Horsholm, Denmark)で刺し、結果を20分後にボールペンで
、膨疹領域をテープペーパーに写すことにより、および写真により記録した。平
均膨疹直径(Dm)を最大長手方向直径(D)および最大横断直径(d)の測定により、
式(D+d)/2=Dmに従って計算した。
ーマシー染色SDS-PAGEゲルである。
Bet v 1モノマー、ダイマーおよびトリマーとのIgE−反応性を示す図である 。
gE−結合の阻害の結果を示す図である。
種の合成Bet v 1−由来ペプチドと試験した結果である。
Claims (16)
- 【請求項1】 免疫原が a)フラグメントがタンパク質アレルゲンのIgEと全体的にではなく部分的に オーバーラップするIgGエピトープを含み、ポリマー形において、フラグメン
トがモノマー単位を構成するものである、タンパク質アレルゲンの非アナフィラ
キシー免疫原組換えフラグメントのポリマー形;または b)タンパク質アレルゲンがモノマー単位を構成する、該タンパク質アレルゲン の組換えポリマー形 を含むことにより特徴付けられる、花粉アレルゲン由来の免疫原。 - 【請求項2】 該フラグメントのポリマー形を組替え的に産生することによ
り特徴付けられる、請求項1の免疫原。 - 【請求項3】 該モノマー単位が、疎水性であり得る典型的に1−30アミ
ノ酸からなるオリゴペプチドリンカーにより互いに分けられることを特徴とする
、請求項1または2記載の免疫原。 - 【請求項4】 該免疫原が、各々(a)または(b)の該ポリマー形のための担
体も含むことを特徴とする、請求項1から3のいずれかに記載の免疫原。 - 【請求項5】 タンパク質アレルゲンがBet v 1であることを特徴とする、 請求項1から4のいずれかに記載の免疫原。
- 【請求項6】 モノマー単位が2−10の整数から選択される数であること
を特徴とする、請求項1から5のいずれかに記載の免疫原。 - 【請求項7】 哺乳類個体におけるタイプIアレルギーのインビトロ診断の
ための、請求項1から6のいずれかに記載の免疫原の使用。 - 【請求項8】 モノマー単位が2−10の整数から選択される数であること
を特徴とする、請求項7記載の使用。 - 【請求項9】 タイプIアレルギーに罹患している哺乳類個体の減感作に使
用するための医薬の製造のための、またはタイプIアレルギーのインビボ診断に
使用するための試薬の製造のための、請求項1から6のいずれかに記載の免疫原
の使用。 - 【請求項10】 モノマー単位が2−10の整数から選択される数であるこ
とを特徴とする、請求項9記載の使用。 - 【請求項11】 免疫原が a)フラグメントがタンパク質アレルゲンのIgEと全体的にではなく部分的に オーバーラップするエピトープを含み、ポリマー形において、フラグメントがモ
ノマー単位を構成するものである、タンパク質アレルゲンの非アナフィラキシー
免疫原組換えフラグメントのポリマー形;または b)タンパク質アレルゲンがモノマー単位を構成する、該タンパク質アレルゲン の組換えポリマー形 を含むことにより特徴付けられる、アレルゲンに対して哺乳類を免疫原減感作す
るのに有効な量の免疫原に哺乳類の免疫系をインビボで曝す段階を含む、タンパ
ク質アレルゲンに対するIgE介在アレルギーに罹患している哺乳類の減感作法
。 - 【請求項12】 免疫原が該フラグメントのポリマー形であり、組換え的に
産生されることを特徴とする、請求項11記載の方法。 - 【請求項13】 該モノマー単位が、疎水性であり得る典型的に1−30ア
ミノ酸からなるオリゴペプチドリンカーにより互いに分けられることを特徴とす
る、請求項11または12記載の方法。 - 【請求項14】 該免疫原が、各々(a)または(b)の該ポリマー形のための
担体も含むことを特徴とする、請求項11から13のいずれかに記載の方法。 - 【請求項15】 タンパク質アレルゲンがBet v 1であることを特徴とする 、請求項11から14のいずれかに記載の方法。
- 【請求項16】 モノマー単位が2−10の整数から選択される数であるこ
とを特徴とする、請求項11から15のいずれかに記載の方法。
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