JP2001518449A - アポリポタンパク質ｅ／成長因子複合体およびその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本明細書において、アポリポタンパク質Ｅと、神経成長因子、ニューロトロフィン４またはγ型インターフェロンとの複合体を含む組成物を提供する。アポリポタンパク質Ｅはいずれのイソ型であってもよいが、アポリポタンパク質Ｅ３が好ましい。また、アポリポタンパク質Ｅと、神経成長因子、γ型インターフェロンまたはニューロトロフィン４との共有結合型複合体も好ましい。さらに、アポリポタンパク質Ｅと、神経成長因子またはニューロトロフィン４との複合体を含む組成物を投与して神経細胞の生存を促進する方法も提供される。また、アポリポタンパク質Ｅとγ型インターフェロンとの複合体を含む組成物を投与して、ウイルス感染からの防御、糖尿病の治療、骨質喪失の治療、血管外傷の治療および抗腫瘍作用の生成を行う方法も開示される。本発明の方法はｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも実施することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願情報 本願は、１９９７年９月３０日出願の米国仮出願第６０／０６０，５３３号の
権利を主張するものであり、この仮出願はその全文を参照として本明細書に組み
込むものとする。

【０００２】連邦資金援助の申告 本発明は、米国国立予防衛生研究所（ＮＩＨ）からの交付番号（ｇｒａｎｔ
ｎｕｍｂｅｒ）Ｒ０１ＡＧ１２５３２−０１の元に米国連邦政府の資金援助（Ｇ
ｏｖｅｒｎｍｅｎｔ ｓｕｐｐｏｒｔ）を受けて行われた。米国連邦政府は本発
明に特定の権利を有する。

【０００３】発明の分野 本発明は、アポリポタンパク質Ｅと、神経成長因子、ニューロトロフィン（ｎ
ｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）４またはγ型インターフェロンとを含有する複合体を
含む組成物ならびにこの組成物の投与法に関する。

【０００４】発明の背景 アポリポタンパク質Ｅ（タンパク質：アポＥ；対立遺伝子：ＡＰＯＥ）は、脳
〔概説については、マーリー（Ｍａｈｌｅｙ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、６２
２ページ、１９８８年参照〕および脳脊髄液（ＣＳＦ）〔ピタス（Ｐｉｔａｓ）
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２、１４３５２ページ、１９８７年〕におけ
る主要アポリポタンパク質である。いくつかの観察結果は、損傷を受けた神経系
においてアポＥが関与していることを示している。嗅脳溝内皮質の病変後には、
海馬の神経膠星状細胞によるアポＥ ｍＲＮＡの発現が増大する〔ポワリエ（Ｐ
ｏｉｒｉｅｒ）ら、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１１、９７ページ、１９９１
年〕。希突起神経膠細胞およびマクロファージは、それぞれ視神経損傷後および
坐骨神経損傷後にアポＥの発現を増大させる〔視神経：ストール（Ｓｔｏｌｌ）
ら、ＧＬＩＡ ２、１７０ページ、１９８９年；座骨神経：スキーンおよびシュ ーター（Ｓｋｅｎｅ ａｎｄ Ｓｈｏｏｔｅｒ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０、４１６９ページ、１９８３年；ストールおよびミュー
ラー（Ｓｔｏｌｌ ａｎｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ）、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．
７２、２３３ページ、１９８６年〕。また、アポＥタンパク質は、末梢神経系（
ＰＮＳ）の損傷後には細胞外総タンパク質の５％にまで増える（スキーンおよび
シューター、前掲）。ＡＰＯＥは、家族性および遅発性アルツハイマー病感受性
遺伝子である〔アルツハイマー病：ストリットマター（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅ
ｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０、１９７７ページ
、１９９３年；概説については、ストリットマターおよびローゼス（Ｓｔｒｉｔ
ｔｍａｔｔｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｅｓ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９２、４７２５ページ、１９９５年参照〕。ヒトＡＰＯＥの３つの主
要対立遺伝子の１つであるＡＰＯＥ４の遺伝子量は、アルツハイマー病の発症リ
スクの増大および平均発症年齢の低下と相関している。これらの観察結果は、損
傷または罹患神経系において、アポＥが関与していることを示している。

【０００５】 ヒトアポＥの主要イソ型、アポＥ２、アポＥ３およびアポＥ４は、１１２位お
よび１５８位のシステイン−アルギニン置換によって識別される。最も一般的な
イソ型であるアポＥ３は、１１２位に１個のシステインおよび１５８位に１個の
アルギニンを有する２９９アミノ酸タンパク質として分泌され、アポＥ２は、１
５８位に１個のシステインを含み、アポＥ４は１１２位に１個のアルギニンを含
んでいる。アポＥは、構造的かつ機能的に異なる２つの領域、疎水性領域と親水
性受容体結合領域とを含んでいる〔ワイスグレーバー（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ）
、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．４５、２４９ページ、１９９４年〕。アポＥの
親水性領域の結晶構造は、毛様体神経栄養因子を含めた４へリックス束成長因子
ファミリーと相同であるが、これらのタンパク質の配列は大きく異なっている〔
ＣＮＴＦ；バザン（Ｂａｚａｎ）による概説Ｎｅｕｒｏｎ ７、１９７ページ、
１９９１年；モットおよびキャンベル（Ｍｏｔｔ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ）
、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．５、１１４ページ、１９９５年
；ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら、アポＥ結晶構造、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２、
１８１７ページ、１９９１年；マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）ら、ＣＮＴＦ
結晶構造、ＥＭＢＯ Ｊ．１４、２６８９ページ、１９９５年〕。

【０００６】 神経成長因子（ＮＧＦ）は、脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロト
ロフィン３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン４／５（ＮＴ４／５）およびニュー
ロトロフィン６（ＮＴ６）を含むニューロトロフィンファミリーに属する。これ
らのタンパク質は全て低親和性ＮＧＦ受容体ｐ７５およびチロシンキナーゼ受容
体のｔｒｋファミリーのある特定のメンバーと結合する。ＮＧＦの場合、これは
ｔｒｋＡ受容体である。ＮＧＦの２６ｋＤａホモ二量体がｔｒｋＡと結合すると
、ｔｒｋＡの自己リン酸化で始まる細胞内シグナリングカスケードが誘発される
。最終的に、ｔｒｋＡが活性化されて、遺伝子発現が変化し、神経の生存、生長
（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）、興奮性および分化が生じる。

【０００７】 ＮＧＦが発育中の交換神経および神経堤由来の感覚細胞の生存および神経突起
の生長を促進することは立証されている〔概説については、スナイダーおよびジ
ョンソン（Ｓｎｉｄｅｒ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ａｎｎｕａｌ Ｎｅｕｒ
ｏｌｏｇｙ ２６、４８９ページ、１９８９年参照〕。これは、ＮＧＦまたはｔ
ｒｋＡについてホモ接合体の突然変異体であるマウスが、上頚神経節（ＳＣＧ；
＞９０％）および後根神経節（ＤＲＧ、７０〜８０％）にひどい細胞喪失を有し
ていること〔クローリー（Ｃｒｏｗｌｅｙ）ら、Ｃｅｌｌ ７８、１００１ペー
ジ、１９９４年；スメイン（Ｓｍｅｙｎｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８、２４６
ページ、１９９４年〕、および生後３週間以内に死亡するという事実によって立
証される。ＮＧＦの神経突起生長促進能力はＮＧＦの最も劇的な活性の１つであ
る。確かに、外殖されたヒヨコ胚ＤＲＧからの神経突起の生長はＮＧＦ活性をテ
ストするための標準バイオアッセイである。ＤＲＧおよびＳＣＧの解離培養細胞
もＮＧＦに応答し、神経突起の生長が増大する。ラット副腎皮質由来のＰＣ１２
細胞系は、ＮＧＦの神経突起生長効果および生存効果を研究するための優れた系
を提供してきた。ウシ胎児血清およびウマ血清を添加した培地でＰＣ１２細胞を
培養すると、ＰＣ１２細胞は増殖し、小型で球形の明位相（ｐｈａｓｅ−ｂｒｉ
ｇｈｔ）細胞として出現する。培地にＮＧＦを添加すると、これらの細胞は***
を停止し、多重神経突起および大型細胞体を有する交換神経様ニューロン表現型
に分化する。ＮＧＦは、無血清環境でのＰＣ１２細胞の生存にも必要とされる。
このパラダイムは容易に得られるので、ＮＧＦ作用機構を解明しようとする研究
のほとんどはＰＣ１２細胞を用いている。

【０００８】 ＤＲＧニューロンが成熟するにつれ、それらが生存するためのＮＧＦ依存の時
間経過と感受性が変化する。これを例証するように、新生児ラットの座骨神経を
横断面切断してから２４時間後には、対応ＤＲＧに４５％の細胞喪失が存在する
〔イップ（Ｙｉｐ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４、２９８６ページ、１９８４
年〕。ＮＧＦを全身投与すると、細胞の死滅は１８％まで減少する（前掲）。そ
れに対し、成体ラットでは、再生させずに横断面切断すると、軸索切断の３週間
後には、ＤＲＧの軸索切断細胞の２２％が死滅する。基端断端に直接ＮＧＦを適
用すると、軸索切断による細胞死の全てが阻止される〔リッチ（Ｒｉｃｈ）ら、
Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．Ｃｙｔｏｌ．１６、５６９ページ、１９８７年〕。

【０００９】 外来性ＮＧＦは、横断面切断した座骨神経の生存および再生を促進することが
できる。多くの研究により、ＮＧＦを充填したシラスティックチューブインプラ
ントが知覚機能の回復速度および回復度を促進することが確認されている〔リッ
チら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．Ｃｙｔｏｌ．１６、１９８７年；リッチら、Ｊ．Ｎｅｒ
ｕｒｏ．Ｃｙｔｏｌ．１８、５６９ページ、１９８９年；ダービー（Ｄｅｒｂｙ
）ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１９、１７６ページ、１９９３年〕。

【００１０】 ニューロトロフィン４（ＮＴ４）は、ニュートロフィンファミリーの別のメン
バーである。ＮＴ４が、新生児ラットの皮質脊髄運動ニューロンの生存を促進す
ること〔ユンガーおよびバロン（Ｊｕｎｇｅｒ ａｎｄ Ｖａｒｏｎ）、Ｂｒａ
ｉｎ Ｒｅｓ．７６２、５６ページ、１９９７年〕、正常条件下およびストレス
条件下に培養したラット中隔ニューロンの生存を増大させること〔ノナー（Ｎｏ
ｎｎｅｒ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６、６６６５ページ、１９９６年〕、
培養内のラット胚線条体ニューロンの生存と生態学的かつ生化学的分化とを促進
すること〔ヴェンティミリア（Ｖｅｎｔｉｍｉｇｌｉａ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉ．７、２１３ページ、１９９５年〕、および培養内のラット前庭神
経節ニューロンの生存を促進しかつこれらの細胞を神経毒物質から防御すること
〔ツェング（Ｚｈｅｎｇ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２８、３３０ページ、
１９９５年〕が報告されている。

【００１１】 インターフェロン（ＩＦＮ）は、ウイルス感染後の真核細胞から分泌されるタ
ンパク質であり、インターフェロンが今度は細胞をウイルス感染から防御する。
現在のところ、３種のインターフェロンが知られている。これらは、ＩＦＮα、
ＩＦＮβおよびＩＦＮγと称され、それぞれ構造も生物学的作用も異なる。これ
までに同定されたＩＦＮγは全てグリコシル化されているが、グリコシル化は生
物活性に影響を与えないようである〔ケラー（Ｋｅｌｌｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２５８、８０１０ページ、１９８３年〕。ガンマ型インターフェロ
ンはリンホカインと見なされている。というのは、ガンマ型インターフェロンは
、抗原により特異的または非特異的刺激を受けた後でリンパ球によって産生され
るからである。ガンマ型インターフェロンは抗ウイルス剤および抗腫瘍剤として
周知である〔ハウプトマン（Ｈａｕｐｔｍａｎｎ）らに付与された米国特許第５
，６０２，０１０号参照〕。他の研究により、ＩＦＮγはＣｌインヒビター欠損
を示すかその危険がある被験者の血管内Ｃｌインヒビター濃度を増大させること
が認められた〔ロッツ（Ｌｏｔｚ）らに付与された米国特許第５，２７１，９３
１号〕。Ｃｌインヒビターは、補体系、接触系、凝固系およびフィブリン溶解系
を含めた数種のタンパク分解系の調節に関与するセリンプロテアーゼインヒビタ
ーである〔デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６、
５９５ページ、１９８８年〕。ＩＦＮγの他の活性には、多核巨細胞生成の促進
およびマクロファージの活性化〔ワインバーグ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１、４５５４ページ、１９８４年
〕、骨吸収の阻害〔ピーターリック（Ｐｅｔｅｒｌｉｋ）らに付与された米国特
許第４，９２１，６９７号〕、ならびにＩ型糖尿病の防止〔ソウベル（Ｓｏｂｅ
ｌ）に付与された米国特許第５，６２４，８９５号〕が含まれる。

【００１２】 このように、ＮＧＦ、ＮＴ４およびＩＦＮγは生物学的に重要な活性を有して
いる。従って、当業界においては、これらの因子の活性を増強する方法が必要と
されている。特に、本発明の目的は、神経栄養性成長因子であるＮＧＦおよびＮ
Ｔ４の活性を促進する手段を提供すること、神経変性疾患の進行を遅らせること
、損傷後の神経変性から防御すること、および神経再生を促進することである。

【００１３】発明の要旨 本明細書において、アポＥが神経栄養因子ＮＧＦに結合し、ＮＧＦの生物学的
作用を増強するという新規な発見を開示する。「増強する」（ｐｏｔｅｎｔｉａ
ｔｅ）とは、アポＥが、成長因子の達成された最大応答を増大させるかおよび／
または効力を増大させる（即ち、用量応答曲線を左にシフトさせる）ことにより
ＮＧＦの少なくとも１種の生物学的作用を促進することを意味する。あるいは、
用語「増強する」とは、アポＥがＮＧＦ分子を安定化し、その分解を低減させる
ことを表す。さらに、アポＥがＮＴ４およびＩＦＮγに結合すると有利であると
いう知見も開示する。

【００１４】 本発明は、第１の態様として、アポＥとＮＧＦとの複合体を含む組成物を提供
する。また、アポＥとＮＴ４との複合体を含む組成物も開示する。さらに、アポ
ＥとＩＦＮγとの複合体を含む組成物も開示する。アポＥ成分は、アポＥ２、ア
ポＥ３またはアポＥ４であってよく、天然の脂質結合状態であっても脱脂（ｄｅ
ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）状態であってもよい。さらに、複合体は、アポＥと、ＮＧ
Ｆ、ＮＴ４またはＩＦＮγ分子との共有結合または非共有結合相互作用によって
生成してもよい。

【００１５】 本発明は、第２の態様として、神経細胞の生存を促進する方法を提供する。こ
の方法は、神経細胞に、生存促進量の、アポＥとＮＧＦまたはＮＴ４との複合体
を投与することを含む。

【００１６】 本発明は、第３の態様として、治療を要する被験者に、治療上有効量の、アポ
ＥとＮＧＦまたはＮＴ４との複合体を含む組成物を投与する方法を提供する。

【００１７】 本発明は、第４の態様として、ウイルス感染から細胞を防御する方法を提供す
る。この方法は、細胞に、抗ウイルス有効量の、アポＥとＩＦＮγとの複合体を
含む組成物を投与することを含む。さらに、治療を要する被験者に抗ウイルス有
効量のＩＦＮγを投与する方法を提供する。

【００１８】 本発明は、他の態様として、治療を要する被験者に抗腫瘍有効量のＩＦＮγを
投与する方法を提供する。

【００１９】 以下の本発明の説明において、本発明の上記および他の態様をより詳細に述べ
る。

【００２０】発明の詳細な説明 Ａ．神経栄養因子−ＮＧＦおよびＮＴ４ 神経系は、急性損傷や慢性神経変性疾患に対して、成長因子や生存因子、細胞
表面受容体、および分泌される細胞外タンパク質を含めた多くのタンパク質を協
調発現させて応答する。これらのタンパク質の多く、特に神経栄養因子は、損傷
からの回復や神経変性疾患からの防御に関与している。外傷を受けた神経系の複
雑な環境内では、どれか１種の因子だけが機能するとは考えられない。成長因子
と他のタンパク質との協調的相互作用が、成長因子の安定性、局在化または提示
に重要な役割と果たしていると考えられる。神経外傷を回復させるには、損傷部
位で放出される成長因子および生存因子を最適に機能させることが重要である。
末梢神経系においても中枢神経系においても、急性および慢性ストレス下にアポ
Ｅが増大する。

【００２１】 本明細書において、アポＥが神経栄養因子ＮＧＦおよびＮＴ４に結合するとい
う発見を開示する。さらに、アポＥがＮＧＦの生物活性を増強するという発見も
開示する。上述のように、「増強する」とは、アポＥが、成長因子の達成された
最大応答を増大させるかおよび／または効力を増大させる（すなわち、用量応答
曲線を左にシフトする）ことにより、ＮＧＦの少なくとも１つの生物学的作用を
促進することを意味する。あるいは、用語「増強する」とは、アポＥがＮＧＦ分
子を安定化し、その分解を低減させることを表す。

【００２２】 本発明の特定の定理に固執するのは本意ではないが、アポＥがＮＧＦおよびＮ
Ｔ４に結合するという知見は、アポＥがこれらの成長因子に対する補助タンパク
質として作用し、成長因子の代謝または生物活性を調節し得ることを示唆してい
る。ある機構により、アポＥ分子を介して成長因子が結合されることにより成長
因子が細胞外マトリックスに局在化されるのかも知れない。アポＥが細胞外マト
リックスのタンパク質ラミニンと結合し、それによってニューロンの付着が増大
して、成長円錐の伸張度が変わることは既に証明されている〔フアン（Ｈｕａｎ
ｇ）ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １３６、２５１ページ、１９９５年〕。
アポＥはさらに、成長因子に結合すると、成長因子のタンパク分解性不活化の阻
害などの他の機構により、または成長因子の細胞表面受容体との相互作用能力を
変えることにより、成長因子の生物活性を変える可能性がある。アポＥとＮＧＦ
および／またはＮＴ４との相互作用は、神経系の急性疾患および慢性疾患のいず
れにおいても、神経変性応答におけるこれらの成長因子の役割の調節のために重
要であろう。

【００２３】 本明細書において、アポＥ：ＮＧＦ複合体およびアポＥ：ＮＴ４複合体を含む
組成物を開示する。本発明（ｃｌａｉｍｅｄ）の複合体は、単にアポＥと神経栄
養因子との混合（一般的には水溶液）により、または当業界において公知の他の
適当な方法により形成することができる。組成物は、アポＥとＮＧＦとの複合体
およびアポＥとＮＴ４との複合体を共に含んでいてよい。さらに、アポＥ：ＮＧ
Ｆ複合体および／またはアポＥ：ＮＴ４複合体、および／またはアポＥと毛様体
神経栄養因子などの他の神経栄養因子との複合体を含む組成物も本発明に包含さ
れる。

【００２４】 当業者には、このようにして産生された本発明のアポＥ複合体を含む組成物が
、通常、アポＥ、ＮＧＦおよび／またはＮＴ４単量体、ホモ二量体および多量体
を含むことが理解されよう。一般に、組成物中では、３５％、２５％、２０％、
１５％もしくはそれより低い低率のＮＧＦ分子、または４０％、５０％、７０％
、８５％、９０％、９５％、９９％もしくはそれより高い高率のＮＧＦ分子がア
ポＥと複合体を形成しているであろう。本明細書に用いられている用語「アポＥ
：ＮＧＦ」および「アポＥ：ＮＴ４」は、それぞれＮＧＦまたはＮＴ４の単量体
、二量体、三量体およびそれより大きい多量体を含むアポＥ：ＮＧＦ複合体およ
びアポＥ：ＮＴ４複合体を包含する。あるいは、アポＥ単量体、ホモ二量体、ホ
モ三体量体などがＮＧＦまたはＮＴ４の単量体、ホモ二量体、ホモ三量体などと
会合していてもよい。従って、本発明は、１種以上のアポＥ分子と１種以上のＮ
ＧＦまたはＮＴ４分子との複合体を包含する。

【００２５】 本発明の特定の定理に固執することは本意ではないが、ＮＧＦの活性形態はホ
モ二量体であり、ＮＧＦホモ二量体はアポＥ単量体と複合体を形成すると考えら
れる。ヘテロ二量体アポＥ：ＮＧＦ複合体およびヘテロ三量体アポＥ：（ＮＧＦ
）_２複合体が好ましい。同様に、アポＥとＮＴ４のヘテロ二量体も好ましい。１
種以上のアポＥ分子と１種以上のＮＴ４分子との複合体も本発明の態様である。
当業者には、アポＥ：ＮＧＦ複合体およびアポＥ：ＮＴ４複合体が追加の分子と
よりゆるく会合していてもよいことが理解されよう。

【００２６】 あるいは、先ず、アポＥを高分子表面（すなわち、組織培養プレート、試験管
）などの基体と結合させてから、ＮＧＦまたはＮＴ４に暴露して、ＮＧＦまたは
ＮＴ４との複合体を形成してもよい。そのようなアポＥ結合基体は、ＮＧＦまた
はＮＴ４を溶液から捕集するのに有用である。他の代替法としては、アポＥ：Ｎ
ＧＦ複合体またはアポＥ：ＮＴ４複合体を形成してから、基体と結合させること
もできる。そのような基体は細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養する場合に有用である
。

【００２７】 アポＥとＮＧＦまたはＮＴ４との結合相互作用力は強力である。アポＥ複合体
の解離定数は、１０^−７以上、好ましくは１０^−８以上、より好ましくは１０^{− ９} 以上である。複合体は、共有結合型相互作用によっても非共有結合型相互作用
によっても形成できるが、アポＥとＮＧＦまたはＮＴ４との共有結合型複合体が
好ましい。典型的には、アポＥ：ＮＧＦ複合体およびアポＥ：ＮＴ４複合体は、
１％以上のＳＤＳを含む溶液中で安定である。また、アポＥ３とＮＧＦまたはＮ
Ｔ４とで形成された複合体も好ましい。

【００２８】 本発明の複合体のアポＥ成分は、アポＥ２、アポＥ３、アポＥ４またはそれら
の組み合わせであってよい。複合体がアポＥ３を含むのが好ましい。アポＥ受容
体に結合するかおよび／またはＮＧＦおよび／またはＮＴ４と複合体を形成して
、ＮＧＦおよび／またはＮＴ４の生物学的作用を増強するアポＥ変異体およびア
ポＥ断片も本発明に包含される。アポＥはいずれの起源種由来であってもよいが
、哺乳動物起源由来であるのが好ましく、ヒト起源由来であればなお好ましい。
アポＥ分子は天然の脂質結合状態であっても、脱脂状態であってもよいが、脱脂
状態が好ましい。

【００２９】 アポＥは天然源（すなわち、血液、血清または腹膜液）から精製することがで
きる。米国特許第５，６７２，６８５号は、腹膜液から天然アポＥを分離する方
法を記載しており、この特許の開示はその全文を参照として本明細書に組み込む
ものとする。大部分の血清由来アポＥは、リポタンパク質粒子と会合している。
血清からアポＥを精製するには、有機溶媒または界面活性剤で脱脂する必要があ
るが、これは重大なタンパク質変性を引き起こす。リポタンパク質を、超遠心分
離し、次いで、凍結乾燥、脱脂して、アポＥをクロマトグラフィー分離する方法
が、ロール（Ｒａｌｌ）ら、Ｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８、２
７３ページ、１９８６年に記載されている。アポリポタンパク質混合物からアポ
Ｅを分離するための代替法はゲル電気泳動を利用する。アポＥイソ型の精製は等
電点電気泳動法を用いて実施し得る（ロールら、前掲）。

【００３０】 アポＥのヘパリン結合特性を利用するヘパリン−セファロースクロマトグラフ
ィーを用いて混交るタンパク質からアポＥを分離してもよい（ロールら、前掲）
。アポＥは、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィ
ー、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣおよびそれらの組み合わせなどの慣用法
を用いて分離および／または精製し、場合によって均質化してもよい。混交シス
テイン含有タンパク質からアポＥのシステインを含まないＥ４イソ型を分離する
には、チオプロピルセファロース上のチオプロピルクロマトグラフィーを用いる
〔ワイスグレーバー（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
５８、２５０８ページ、１９８３年〕。

【００３１】 組換えアポＥは、当業界で公知の方法を用いて生成することができ、ヒト組換
えアポＥは市販されている。しかし、組換えタンパク質は天然のグリコシル化形
態ではなく、従って、精製中に変性または酸化される傾向がある。

【００３２】 複合体のＮＧＦ成分も天然源由来でも組換え源由来でもよく、当業界で公知の
いずれかの手段によって生成することができる。天然体：デラ・バレ（Ｄｅｌｌ
ａ Ｖａｌｌｅ）らに付与された米国特許第５，２１０，１８５号および同第５
，０５７，２２３号；ヤング（Ｙｏｕｎｇ）に付与された米国特許第４，４０７
，７４４号。組換え体：チャン（Ｃｈａｎ）らに付与された米国特許第５，２７
２，０６３号；グレイ（Ｇｒａｙ）らに付与された米国特許第５，２８８，６２
２号；ハインリック（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ）に付与された米国特許第５，０８２，
７７４号。さらに、本発明のアポＥ：ＮＧＦ複合体のＮＧＦ成分は、いずれの起
源種由来であってもよいが、哺乳動物起源由来であるのが好ましく、ヒト起源由
来であればなお好ましい。用語「ＮＧＦ」は、ＮＧＦの変異体、類似体および誘
導体を包含する。例えば、パーソン（Ｐｅｒｓｓｏｎ）らに付与された米国特許
第５，３４９，０５５号は、低親和性ｐ７５受容体との結合が著しく低減しるが
ｔｒｋ受容体との結合は実質的に変っていないＮＧＦ類似体を開示している。さ
らに、この参考文献には、安定性が増大したＮＧＦ類似体も開示されている。ま
た、当業界では、ＮＧＦペプチド領域が脳由来成長因子（ＢＤＧＦ）の対応残基
で置換されているキメラＮＧＦ分子も公知となっている〔イバネツ（Ｉｂａｎｅ
ｚ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０、２１０５ページ、１９９１年〕。最後に、用語「
ＮＧＦ」は、ＮＧＦ受容体に結合するかおよび／またはＮＧＦの神経栄養作用を
誘発させるＮＧＦ断片も包含する。例えば、モブレー（Ｍｏｂｌｅｙ）らに付与
された米国特許第５，１３４，１２１号は、ＮＧＦ会合性生物応答を誘発させる
ＮＧＦペプチドおよびその類似体を開示している。

【００３３】 同様に、開示されているアポＥ：ＮＴ４複合体のＮＴ４成分は、天然源由来で
も組換え源由来でもよく、当業界で公知のいずれかの手段を用いて生成すること
ができる。組換え体：ローゼンタール（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）に付与された米国
特許第５，３６４，７６９号。さらに、本発明のアポＥ：ＮＴ４複合体のＮＴ４
成分は、いずれの起源種由来であってもよいが、哺乳動物起源由来であるのが好
ましく、ヒト起源由来であればなお好ましい。用語「ＮＴ４」は、ローゼンター
ルに付与された米国特許第５，３６４，７６９号およびパーソンに付与された米
国特許第５，３４９，０５５号に開示されているものなどの、ＮＧＦの変異体、
類似体および誘導体をも包含する。用語「ＮＴ４」は、ＮＧＦ受容体に結合する
かおよび／またはＮＴ４の神経栄養作用を誘発させるＮＴ４断片も包含する。

【００３４】 アポＥ：ＮＧＦ複合体および／またはアポＥ：ＮＴ４複合体を投与することに
よって神経細胞の生存を促進する方法も本発明の１つの態様である。神経細胞の
「生存を促進する」という用語は、広義に解釈されることを意図とし、本発明の
組成物の神経栄養作用および神経再生作用を包含する。あるいは、神経細胞の「
生存を促進する」という表現は、神経細胞の損傷からの防御および／または神経
損傷からの回復の増進における本発明の組成物の作用を指す。「生存を促進する
」とは、本発明の複合体が、上記定義のように、神経細胞の生存をある程度改善
することを意味する。神経細胞の生存改善率は、５％、１０％、２５％、５０％
、７５％、１００％またはそれ以上であり得る。「神経細胞」には、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの中枢神経系および末梢神経系の細胞および組織が
包含される。本発明の方法に用いるためのアポＥ：ＮＧＦ複合体および／または
アポＥ：ＮＴ４複合体を含む組成物は、より詳細に上述されている通りである。

【００３５】 本発明のアポＥ複合体は、神経細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏ投与することができる
。通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏ投与は、アポＥ：ＮＧＦ複合体および／またはアポＥ
：ＮＴ４複合体を含む溶液（すなわち、水溶液）を培地に添加するだけでよい。
あるいは、アポＥ成分とＮＧＦまたはＮＴ４成分とを培地に個別、同時または順
次添加することができる。他の代替法としては、アポＥ分子またはアポＥ：成長
因子複合体を、好ましくは基体（すなわち、組織培養皿またはシャーレ）上で細
胞を培養する前に、基体に結合させることができる。アポＥが、組織培養プレー
トの高分子表面または（ラミニンなどの細胞外マトリックスタンパク質で）コー
トされた表面に結合することは当業界では周知である。

【００３６】 アポＥとＮＧＦまたはＮＴ４との複合体は、これらの神経栄養因子の活性を増
強するので、不死化ＰＣ１２細胞などの神経細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養（例え
ば、パーソンらに付与された米国特許第５，３４９，０５５号参照）およびニュ
ーロンの初代培養〔例えば、バロン（Ｖａｒｏｎ）、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．７６
２、５６ページ、１９９７年；バレットおよびバレット（Ｂａｒｒｅｔｔ ａｎ
ｄ Ｂａｒｒｅｔｔ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６、６６６５ページ、１９９
６年；アビル（Ａｂｉｒｕ）ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒ
ｅｓ．９１、２６０ページ、１９９６年；スナイダーおよびジョンソン（Ｓｎｉ
ｄｅｒ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ａｎｎｕａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２６
、４８９ページ、１９８９年；イップ（Ｙｉｐ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４
、２９８６ページ、１９８４年〕に有用である。

【００３７】 モブレーに付与された米国特許第５，１３４，１２１号により提供されている
ように、ＮＧＦは、ニューロンの生存を促進する培地の成分としても利用される
。また、アルツハイマー病、ハンチントン病および他の神経変性疾患の治療にＮ
ＧＦを用いる方法も開示されている。ケスラー（Ｋｅｓｓｌｅｒ）らに付与され
た米国特許第５，６０４，２０２号で立証されているように、ＮＧＦは薬剤誘発
性神経障害の治療法にも利用される。従って、神経栄養活性が強化された本発明
のＮＧＦ複合体は、既知のＮＧＦ組成物と同様な利用法で用いられる。

【００３８】 ローゼンタールに付与された米国特許第５，３６４，７６９号によって立証さ
れているように、ＮＴ４は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで神経細胞の生存を促進したり、
生長を誘発させたりする培地の成分として用いられる。また、神経変性疾患の治
療におけるＮＴ４の使用も開示されている。従って、神経栄養活性が強化された
本発明のＮＴ４複合体は既知のＮＴ４組成物と同様な利用法で用いられる。

【００３９】 本発明のアポＥ：ＮＧＦ複合体およびアポＥ：ＮＴ４複合体は、複合体を形成
した成長因子がタンパク分解性破壊から防御されるので、組織培養にも用いられ
る。

【００４０】 最後に、本発明の複合体は、ＮＧＦもしくはＮＴ４受容体またはこれらの神経
栄養因子と結合する他のタンパク質の定量法または精製法に用いられる。アポＥ
は試験管やマイクロタイタープレートなどの表面に容易に結合する。従って、Ｎ
ＧＦまたはＮＴ４は、当業者には周知のサンドイッチアッセイ法や親和精製法に
用いるために表面に結合させることができる。

【００４１】 本発明のアポＥ：ＮＧＦ複合体またはアポＥ：ＮＴ４複合体は、被験者にｉｎ
ｖｉｖｏ投与することもできる。本発明の組成物の投与法および医薬調剤は、
以下にさらに詳細に記載されている。本発明の方法は、神経変性疾患に悩む被験
者や、神経組織に損傷または外傷を受けた被験者の治療に有用である。そのよう
な被験者には、アルツハイマー病、パーキンソン病、末梢神経損傷、末梢神経障
害（特に、糖尿病誘発性末梢神経障害）、筋萎縮性側索硬化症、頭部損傷および
卒中に悩む被験者が含まれるが、それらには限定されない。本発明は、アルツハ
イマー病および糖尿病誘発性末梢神経障害の治療に特に有用である。

【００４２】 本発明の実施に適した被験者は、一般に、ヒト、サル、ウマ、ヤギ、ウシ、ヒ
ツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、ハムスター、マウス、ウズラ、ニワ
トリおよびシチメンチョウなどを含めた（但し、それらには限定されない）哺乳
動物および鳥類である。ｉｎ ｖｉｖｏ投与には、ヒト被験者が好ましい。同様
に、本発明に用いるための培養神経組織／細胞としては、ヒト、サル、ウマ、ヤ
ギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、ハムスター、マウス、
ウズラ、ニワトリおよびシチメンチョウ由来の神経組織や細胞を含めた（但し、
それらには限定されない）哺乳動物および鳥類の組織や細胞が挙げられる。

【００４３】 開示されている組成物は、生理的に許容し得る担体（好ましくは滅菌担体）中
に含まれていてよく、担体としては、細胞に対して過度に有害ではなく、医薬上
許容し得る担体が含まれる。

【００４４】 以下に医薬調剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）
と称されている本発明の薬剤の製造において、本発明の組成物は、典型的には医
薬上許容し得る担体と混合する。注射剤の場合、担体は典型的には液体であろう
。他の投与法の場合、担体は、固体であっても、発熱物質を含まない滅菌水また
は発熱物質を含まないリン酸緩衝塩類溶液などの液体であってもよい。あるいは
、本発明の複合体を適当なポリマーマトリックス、リポソームまたは膜中に組み
込むかまたはカプセル封入して、局所治療すべき部位近傍への移植に適した徐放
性送出装置を提供してもよい。

【００４５】 被験者に投与するためにこれらの組成物を調製する場合、慣用の投与形態、例
えば、注射液剤、錠剤、カプセル剤、糖剤、シロップ剤、溶剤、懸濁剤などに適
合した医薬担体を用いることができる。注射媒質としては、安定剤、塩もしくは
塩類溶液および／または緩衝液などの注射液剤の場合に有用な添加剤を含む水を
用いるのが好ましい。栄養媒質内、例えば、栄養剤中には、活性剤またはその医
薬調剤が含まれていてよい。経口調剤は、徐放性製剤または小腸へのペプチドの
送出を容易にする腸溶剤皮製剤であってよい。

【００４６】 治療を要する被験者に本発明のアポＥ複合体を投与する場合には、任意の適当
な投与経路を用いてよい。適当な投与経路には、非経口注射（例えば、皮下、筋
肉内または皮内注射）、または経口、直腸内、局所、鼻腔内、眼内、鞘内および
大脳内投与が含まれる。アポＥ：ＮＧＦ複合体およびアポＥ：ＮＴ４複合体は目
的の治療の実施に有効な量で含まれる。一般に、本発明のアポＥ複合体は神経細
胞の生存促進に有効な量で存在する。アポＥ：ＮＧＦ複合体およびアポＥ：ＮＴ
４複合体は、他の作用物質と同時にまたは他の物質と組み合わせて投与してよい
。特に、アポＥ：ＮＧＦ複合体および／またはアポＥ：ＮＴ４複合体は、ＣＮＴ
Ｆなどの他の神経栄養因子と共に投与することができる。

【００４７】 アポＥ：ＮＧＦ複合体またはアポＥ：ＮＴ４複合体の厳密な投与量は慣用的に
決定され、被験者の年齢や種、所望の効果、アポＥのイソ型および投与経路に応
じて異なる。好ましい用量は、当業者には公知のように、単に、既知量のアポＥ
：ＮＧＦ複合体またはアポＥ：ＮＴ４複合体を含む組成物を被験者にｉｎ ｖｉ
ｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ投与し、所望の効果に関して細胞、組織または被験
者をモニターして決定してよい。

【００４８】 本発明に従って投与されるアポＥ：ＮＧＦ複合体またはアポＥ：ＮＴ４複合体
の用量には特定の上限も下限も存在しない。ｉｎ ｖｉｖｏ投与の場合、用量は
、体重１ｋｇあたり１０、３、１、０．５もしくは０．１ｇまたはそれ以上の低
量であってよい。ｉｎ ｖｉｖｏ用量は、体重１ｋｇあたり、１０ｇ、３０ｇ、
５０ｇもしくは１００ｇまたはそれ以上の高量であってよい。一般に、投与され
るアポＥ：ＮＧＦ複合体またはアポＥ：ＮＴ４複合体のｉｎ ｖｉｖｏ用量は、
１リットルあたり約１×１０^−１、１×１０^０または１×１０^１ピコモルから約
１×１０^２、１×１０^３または１×１０^４ピコモルまでもの複合体ピーク血漿濃
度を得るに十分な量であろう。

【００４９】 同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ投与される本発明の複合体の用量にも特定の下限ま
たは上限は存在しない。ｉｎ ｖｉｔｒｏ投与の場合、用量は、媒質１ｍｌあた
り、１０、５、１、０．５もしくは０．１ｎｇまたはそれ以下の低量であってよ
い。ｉｎ ｖｉｔｒｏ用量は、媒質１ｍｌあたり、１０、５０、１００、５００
、１，０００もしくは１，５００ｎｇまたはそれ以上の高量であってよい。

【００５０】 Ｂ．ガンマ型インターフェロン 本発明の別の態様はアポＥ：ＩＦＮγ複合体である。好ましい実施態様におい
て、ＩＦＮγの生物活性は、アポＥと複合体を形成することにより（ＮＧＦとＮ
Ｔ４に関して定義したように）増強される。アポＥ：ＩＦＮγ複合体は、アポＥ
：ＮＧＦ複合体およびアポＥ：ＮＴ４複合体について上述したように形成するこ
とができる。

【００５１】 当業者には、本発明のアポＥ：ＩＦＮγ複合体を含む組成物が、通常、アポＥ
およびＩＦＮγの単量体、ホモ二量体および多量体をも含むことが理解されよう
。一般に、組成物中では、３５％、２５％、２０％、１５％もしくはそれより以
下の低率、または４０％、５０％、７０％、８５％、９０％、９５％、９９％も
しくはそれ以上の高率のＩＦＮγ分子がアポＥと複合体を形成している。本明細
書に記載の用語「アポＥ：ＩＦＮγ」は、ＩＦＮγの単量体、二量体、三量体お
よびそれより大きな多量体を含むアポＥ：ＩＦＮγ複合体を包含する。あるいは
、アポＥの単量体、ホモ二量体、ホモ三量体などが、ＩＦＮγの単量体、ホモ二
量体、ホモ三量体などと会合していてよい。従って、本発明は、１種以上のアポ
Ｅ分子と１種以上のＩＦＮγ分子との複合体を包含する。本発明の特定の原理に
固執するのは本意ではないが、ＩＦＮγの活性形態はホモ二量体であり、ＩＦＮ
γホモ二量体がアポＥ単量体と複合体を形成すると考えられる。そのようなアポ
Ｅ：ＩＦＮγヘテロ三量体複合体が好ましい。当業者には、アポＥ：ＩＦＮγ複
合体が追加の分子とよりゆるく会合していてよいことも理解されよう。

【００５２】 あるいは、先ず、アポＥを基体と結合させてからＩＦＮγに暴露して、ＩＦＮ
γとの複合体を形成させてもよい。他の代替法としては、アポＥ：ＩＦＮγ複合
体を形成した後で基体と結合させることもできる。

【００５３】 アポＥとＩＦＮγとの結合相互作用力は、アポＥ：ＮＧＦ複合体およびアポＥ
：ＮＴ４複合体について上述した通りである。

【００５４】 開示されている複合体のアポＥ成分は、アポＥ：ＮＧＦ複合体およびアポＥ：
ＮＴ４複合体について上述した通りである。複合体のＩＦＮγ成分は天然源由来
のものでも組換え源由来のものでもよく、当業界で公知のいずれかの手段によっ
て生成することができる。天然体：栗本（Ｋｕｒｉｍｏｔｏ）に付与された米国
特許第５，５１８，８９９号；ジョージアデス（Ｇｅｏｒｇｉａｄｅｓ）らに付
与された米国特許第４，７２３，０００号；フレイシュマン（Ｆｌｅｉｓｃｈｍ
ａｎｎ）らに付与された米国特許第５，１３２，１１０号；組換え体：ハウプト
マン（Ｈａｕｐｔｍａｎｎ）らに付与された米国特許第５，６０２，０１０号；
角谷（Ｋａｋｕｔａｎｉ）らに付与された米国特許第４，９７０，１６１号；レ
ベル（Ｒｅｖｅｌ）らに付与された米国特許第４，８８９，８０３号。さらに、
本発明のアポＥ：ＩＦＮγ複合体のＩＦＮγ成分はいずれの起源種由来であって
もよいが、哺乳動物起源由来であるのが好ましく、ヒト起源由来であればなお好
ましい。用語「ＩＦＮγ」はさらに、ＩＦＮγの生物活性を保持しているＩＦＮ
γの変異体、類似体および誘導体をも包含する。その例としては、カウリング（
Ｃｏｗｌｉｎｇ）に付与された米国特許第４，８４５，１９６号；ＰＣＴ出願第
８３／０４０５３号；伊藤（Ｉｔｏｈ）らに付与された米国特許第４，８９８，
９３１号および同第４，７５８，６５６号；フランク（Ｆｒａｎｋｅ）ら、ＤＮ
Ａ １、２２３ページ、１９８２年；キング（Ｋｉｎｇ）ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉ
ｒｏｌ．６４、１８１５ページ、１９８３年に開示されているＩＦＮγの変異体
、類似体および誘導体である。用語「ＩＦＮγ」はさらに、ＩＦＮγ受容体に結
合しているかおよび／またはＩＦＮγの生物学的作用を誘発させるＩＦＮγ分子
の断片も包含する。

【００５５】 本発明の他の態様は、アポＥ：ＩＦＮγ複合体を含む組成物を生物学的に有効
な量で細胞に投与する方法である。アポＥ：ＩＦＮγ複合体を含む組成物は、ウ
イルス感染から細胞を防御する方法に用いられ、そのような方法は、細胞に、抗
ウイルス有効量の、アポリポタンパク質ＥとＩＦＮγとの複合体を含む組成物を
投与することを含む。例えば、ウィーロック（Ｗｈｅｅｌｏｃｋ）、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ １４９、３１０ページ、１９６５年を参照されたい。ウイルス感染から細
胞を「防御する」とは、開示されている方法により、ウイルス感染率を低下させ
るかもしくは排除すること、またはすでに存在している感染を軽減させるかもし
くは排除することを意味する。そのような方法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでは培
養細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏでは被験者を防御することができる。

【００５６】 本発明の別の態様は、抗腫瘍有効量の、アポＥ：ＩＦＮγ複合体を含む組成物
を投与する方法である。本発明の複合体の「抗腫瘍有効量」は、腫瘍発生率を低
下させるか、または腫瘍の大きさ、増殖または転移を低減させるのに有効な用量
である。また、本発明のアポＥ：ＩＦＮγを投与して、腫瘍に悩む被験者を（例
えば、腫瘍の大きさ、増殖または転移を低減させることにより）治療するか、ま
たは腫瘍発生のリスクがある被験者の腫瘍発生率を減少させるために本発明を用
いることができる。

【００５７】 本発明のアポＥ複合体は細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏ投与することができる。典型
的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ投与は、単に、アポＥ：ＩＦＮγ複合体を含む溶液（
すなわち、水溶液）を培地に添加するだけでよい。あるいは、アポＥ成分とＩＦ
Ｎγ成分とを培地に個別、同時または順次添加することもできる。他の代替法と
しては、アポＥ分子またはアポＥ複合体を、好ましくは基体（すなわち、組織培
養皿またはシャーレ）上で細胞を培養する前に、基体に結合させることができる
。アポＥが、組織培養プレートの高分子表面または（ラミニンなどの細胞外マト
リックスタンパク質で）コートされた表面に結合することは当業界では周知であ
る。

【００５８】 開示されているアポＥ：ＩＦＮγ複合体は被験者にｉｎ ｖｉｖｏ投与するこ
ともできる。適当な被験者、投与法、アポＥ：ＩＦＮγ含有組成物の医薬調剤お
よびその適当な用量は、アポＥ：ＮＧＦ複合体およびアポＥ：ＮＴ４複合体に関
して上述した通りである。開示されているアポＥ：ＩＦＮγ複合体は単独で投与
することも、他の治療剤と組み合わせて投与することもできる。

【００５９】 アポＥ：ＩＦＮγ複合体含有組成物は、抗ウイルスおよび抗腫瘍治療を要する
被験者にｉｎ ｖｉｖｏ投与することができる。本発明の複合体は、例えば、高
齢者、閉経後の女性、および骨粗しょう症に悩んでいるか、または骨粗しょう症
発症のリスクがある女性の骨質喪失（ｂｏｎｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）およ
び骨吸収の治療用に投与することもできる。最後に、ＩＦＮγは、血中Ｃｌイン
ヒビターレベルの刺激による血液凝固の促進やＩ型糖尿病の治療用に投与するこ
とができる。

【００６０】 ＩＦＮγの活性を増強するアポＥ：ＩＦＮγ複合体は、骨細胞を含めた（但し
、それには限定されない）ＩＦＮγ応答性細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に有用で
ある〔ピータリック（Ｐｅｔｅｒｌｉｋ）らに付与された米国特許第４，９２１
，６９７号参照〕。

【００６１】 ブランデリー（Ｂｒａｎｄｅｌｙ）らに付与された米国特許第６，２６８，１
６９号によって立証されているように、ＩＦＮγは卵巣ガンの治療法に有用であ
る。Ｉ型糖尿病の治療にＩＦＮγを用いることも公知である〔ソウベル（Ｓｏｂ
ｅｌ）に付与された米国特許第５，６２４，８９５号参照〕。さらに、ＩＦＮγ
が、血管外傷〔ロッツ（Ｌｏｔｚ）らに付与された米国特許第５，２７１，９３
１号〕および骨質喪失〔ピータリック（Ｐｅｔｅｒｌｉｋ）、前掲〕の治療法に
有用であることも立証されている。従って、生物活性が強化された本発明のＩＦ
Ｎγ複合体は既知のＩＦＮγ組成物と同じ利用法で用いられる。

【００６２】 本発明のアポＥ：ＩＦＮγ複合体は、複合体を形成したＩＦＮγ分子がタンパ
ク分解性破壊から防御されるので、組織培養にも用いられる。

【００６３】 最後に、アポＥ：ＩＦＮγ複合体はＩＦＮγ受容体またはＩＦＮγに結合する
他のタンパク質の定量法または精製法に用いられる。アポＥは試験管やマイクロ
タイタープレートなどのプラスチック表面に容易に結合する。従って、ＩＦＮγ
は、当業者には周知のサンドイッチアッセイ法または親和精製法に用いるために
プラスチック表面に結合させることができる。

【００６４】 以下の実施例は本発明を説明するために提供されており、本発明を限定するも
のと解釈してはならない。

【００６５】

【実施例】

実施例１ゲルシフトアッセイ 先の記載〔ロール（Ｒａｌｌ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８
、２７３ページ、１９８６年〕のように、アポＥ３またはアポＥ４ホモ接合個体
から脱脂アポＥを精製した。アポＥ３またはアポＥ４をトリス緩衝塩類溶液（Ｔ
ＢＳ）中３７℃で４時間まで成長因子と共にインキュベートした。還元剤は加え
ずに４×ＳＤＳ−レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液を添加してインキュベーショ
ンを終了させた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動分離し、ＰＶＤ
Ｆ膜〔イモビロンＰ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ）、ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ）、マサチューセッツ州ベッドフォード所在〕に移した。膜をブロット（Ｂ
ｌｏｔｔｏ）（ＴＢＳ中５％の粉乳、ｐＨ７．６、０．０５％のトゥイーン（Ｔ
ｗｅｅｎ）［サーファクト・アンプス−２０（Ｓｕｒｆａｃｔ Ａｍｐｓ−２０
）、ピアース社（Ｐｉｅｒｃｅ）、イリノイ州ロックフォード所在］を含む）中
で１時間ブロックし、次いで、一次抗体中で１時間インキュベートした。抗アポ
Ｅ抗体は、ブロットに１：２０００希釈したポリクローナルヤギ抗ヒトアポＥ〔
カルビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、カリフォルニア州サンディエゴ所在
〕であった。膜をブロット中で各１０分間３回洗浄し、次いで、二次抗体と共に
１時間インキュベートした。インキュベーションおよび洗浄は全て２５℃で行っ
た。

【００６６】 抗アポＥ抗体検出用の二次抗体は、ブロットに１：３０００希釈した西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ〔ＨＲＰ；ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル社（
Ｂｅｏｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、イン
ディアナ州インディアナポリス所在〕に結合させたブタ抗ヤギＩｇＧであった。
先に記載〔ストリットマター（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０、１９７７ページ、１９９３年〕のよう
に、酵素と結合した抗体にＥＣＬ化学発光基質〔アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）、イリノイ州アーリントンハイツ所在〕を添加して視覚化し、ハイパーフ
ィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ、アマーシャム社）に暴露した。

【００６７】 実施例２ アポＥ３はＮＧＦ、ＩＦＮγおよびＮＴ４とＳＤＳ安定性複合体を形成する 実施例１に記載のゲルシフトアッセイを用いてアポＥと結合する成長因子につ
いてスクリーニングをした。５０ｎｇのアポＥ３またはアポＥ４と５０ｎｇの成
長因子とを一緒に４時間までインキュベートした。評価した成長因子は、ヒト組
換え毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＩＦＮγ、ニューロトロフィン−３（Ｎ
Ｔ３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ４）、ＮＧＦ、線維芽細胞増殖因子ｂＦ
ＧＦおよびＬＩＦであった。ＣＮＴＦ、ＩＦＮγおよびＬＩＦは、４へリックス
束成長因子ファミリーのメンバーである。成長因子源は以下の通りである：ＣＮ
ＴＦ：リジェネロン・ファーマスーティカル社〔（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ニューヨーク州タリータウン（Ｔａｒｒｙｔｏｗ
ｎ）所在）より恵与；ＩＦＮγ：ヒト、組換え体 ＃４００４４、コラボラティ
ブ・バイオメディカル・プロダクツ社〔（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏ
ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、マサチューセッツ州ベッドフォード所在
〕；ＮＴ３：リジェネロン・ファーマスーティカル社；ＮＴ４：ヒト、組換え体
＃Ｇ１５１１、プロメガ社（ウィスコンシン州マディソン所在）；ＮＧＦ：マ
ウス、天然 ＃４０００５、コラボラティブ・バイオメディカル・プロダクツ社
（同上）；ｂＦＧＦ：コラボラティブ・バイオメディカル・プロダクツ社（同上
）；およびＬＩＦ：Ｒ＆Ｄシステムズ社〔（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネソ
タ州ミネアポリス所在〕。

【００６８】 試料を非還元性ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離、ＰＶ
ＤＦ紙に移し、抗アポＥおよびペルオキシダーゼに結合した二次抗体でプローブ
した。アマーシャム化学発光検出試薬を用いて免疫反応性を検出した。

【００６９】 アポＥ３は還元剤の不在下にＣＮＴＦ、ＩＦＮγ、ＮＧＦおよびＮＴ４とＳＤ
Ｓ安定性複合体を形成する。アポＥ３とＩＬ−６、ＬＩＦ、ＮＴ３、ｂＦＧＦま
たはＢＤＮＦとの間では複合体は認められなかった。アポＥ４はこれらの成長因
子のいずれともＳＤＳ安定性複合体を形成しない。各アポＥ／成長因子複合体の
ゲル移動度は、アポＥ３と成長因子との２分子複合体と一致する（ＮＧＦおよび
ＩＦＮγの活性形態は二量体であり、従ってアポＥ３／ＮＧＦ複合体は三量体で
あると考えられる）。

【００７０】 他の実験で、アポＥ３のＮＧＦおよびＣＮＴＦとの複合体が３０分間のインキ
ュベーション中に検出され、３〜６時間までに平衡に達することが認められた。
ＳＤＳ安定性アポＥ３／ＣＮＴＦ複合体はβ−メルカプトエタノールで還元可能
であり、これはジスルフィド結合の生成を示唆している。これらのバンドの１つ
が真の分子複合体であるという厳密な証拠は、ＣＮＴＦ／アポＥ複合体がＣＮＴ
Ｆ抗体とアポＥ抗体のどちらにも免疫反応性であることを証明することによって
得られた。

【００７１】 実施例３アポＥはＰＣ１２細胞のＮＧＦ活性を促進する ＰＣ１２細胞は無血清培地中で生存するためにはＮＧＦを必要とする。ＮＧＦ
、アポＥ３またはＮＧＦ＋アポＥ３を含む無血清培地存在下のＰＣ１２細胞の生
存を評価する実験を行った。

【００７２】 ＰＣ１２細胞をポリ−１−リシンで予備コートした９６ウエル皿で平板培養し
、次いで、一緒に予備インキュベートしておいたＮＧＦとアポＥ３の系列希釈液
を含む溶液で処理した。これらの条件下にアポＥ３が組織培養皿に吸収されるこ
とは公知である。予備インキュベーションでは、ＮＧＦの系列希釈液を恒量のア
ポＥ３（５０ｎｇ／ｍｌ）に加え、３７℃で３時間インキュベートし、次いで各
ウエルに加えた。これらのタンパク質を３７℃でさらに３時間基体に結合させた
。最終処理は５０ｎｇ／ｍｌのアポＥ３＋０、１００および１，０００ｎｇ／ｍ
ｌのＮＧＦであった。全てのウエルをＰＢＳで３回洗浄して可溶性ＮＧＦおよび
アポＥを除去した。別セットのウエルには、同濃度の可溶性ＮＧＦを加えたが、
全てウエルに吸収された（０、１００および１，０００ｎｇ／ｍｌ）。

【００７３】 ＰＣ１２細胞を、無血清培地だけか、基体に結合させたアポＥ３＋ＮＧＦまた
は上述の可溶性ＮＧＦを加えて、７２時間インキュベートした。７２時間後に、
実施例４に記載のように、プロメガ・セルタイター・アクエアスＭＴＳアッセイ
（Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ａｑｕｅｏｕｓ ＭＴＳ Ａｓｓａｙ
）を用いて細胞の生存力を評価した。各条件を３回ずつ行い、非特異的バックグ
ラウンドを差引いた。

【００７４】 基体に結合させたアポＥ３とＮＧＦとの複合体は、基体に結合させたＮＧＦま
たは可溶性ＮＧＦだけのものより高度に無血清ＰＣ１２細胞の生存を促進した（
図１）。実際、１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦと混合し、基体に結合させた５０ｎｇ
／ｍｌのアポＥ３は、１００ｎｇ／ｍｌの可溶性ＮＧＦだけのものに比べ２倍以
上ＰＣ１２細胞の生存を促進した（ｐ＜０．００１）。１，０００ｎｇ／ｍｌの
ＮＧＦでの差も著しく、ｐ＜０．００１レベルであった。アポＥが基体に吸収さ
れているか、培地に含まれているかに係わらず、アポＥだけでは（１μｇ／ｍｌ
でも）ＰＣ１２細胞に対して生存促進活性がない。

【００７５】 アポＥ／ＮＧＦ複合体の生存促進活性を最もよく表すのはＮＧＦ活性の促進で
ある。従って、アポＥはＮＧＦ応答性末梢神経細胞の維持におけるＮＧＦの活性
を増強する。

【００７６】 実施例４ＭＴＳ生存アッセイ プロメガ生存力アッセイ〔セルタイター ９６ アクエアス（ＣｅｌｌＴｉｔ
ｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ）、プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン所在
〕を用いてＰＣ１２細胞の生存力をアッセイした。イプおよびヤンコプーロス（
Ｉｐ ａｎｄ Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ）、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗ
ｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ．４、１ページ、１９９２年；リドゥル（Ｒｉｄｄ
ｌｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３７８、１８９ページ、１９９５年を参照されたい。
これは、コロメトロアッセイ（ｃｏｌｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）であり、こ
のアッセイでは、テトラゾリウム化合物（３−（４，５−ジメチルチアゾル−２
−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニ
ル）２Ｈ−トラゾリウム（ＭＴＳ）を生存可能な細胞で還元して可溶性ホルマザ
ン生成物を得る。ホルマザンの吸光度は直接９６ウエルプレートから測定する。
４９０ｎｍの吸光度で測定したホルマザン生成物の量は生存可能細胞の数に比例
する。このアッセイを実施する際には、１００μｌの培地を各ウエルから除去し
た後で、２０μｌのＭＴＳ溶液を各ウエルに加えた。プレートをインキュベータ
に戻し、４時間インキュベートした後で、吸光度をダイナテック（Ｄｙｎａｔｅ
ｃｈ）ＭＲ５０００マイクロプレートリーダー（ダイナテックラボラトリーズ社
）で読み取った。データを収集し、各実験について、各治療グループとマッチさ
せた対照（無アポＥ／無ＮＧＦ条件）との間のパーセント較差を計算した。無ア
ポＥ／無ＮＧＦ条件の場合の値を１００％に設定した。次いで、それぞれの実験
のパーセント較差を平均した。

【００７７】 実施例５アポＥは神経突起生長に関するＮＧＦ活性を増強する ＮＧＦの別の公知活性は、神経突起の生長を促進するＮＧＦの能力である。こ
の点に関して、アポＥがＮＧＦの活性を促進するかどうかを評価する研究をＰＣ
１２細胞で行った。先ず、ＰＣ１２細胞を５００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦと血清中で
７日間増殖させて神経突起の生長を感作した。この時点では、全ての細胞は直径
が１細胞体より大きい神経突起を有していた。細胞を９６ウエルプレートに植え
替えるときに、これらの神経突起を機械的に除去した。このＮＧＦ感作により、
実験条件下の神経突起の急速な成長が可能になる。

【００７８】 １００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦと１μｇ／ｍｌのアポＥ３、アポＥ４またはＢＳＡ
（対照として）とを含む無血清培地中で３日間培養した後、細胞の位相イメージ
をデジタル収集した。ＩＭＡＧＥ １（商標）分析ソフトウエア〔ユニバーサル
イメージング社（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）、ペンシ
ルベニア州ウエストチェスター所在〕を用い、ランダムフィールドで神経突起の
測定を行った。アポＥ４ではなくアポＥ３が、感作したＰＣ１２細胞からの神経
突起の生長を増強した（図２）。アポＥ３＋ＮＧＦ中で増殖した細胞の神経突起
の生長は、ＢＳＡまたはアポＥ４中で増殖した細胞の１．５倍も大きかった。

【００７９】 実施例６アポＥ「ノックアウト」マウスは末梢神経障害を示す ３回の別個の実験で、アポＥノックアウトマウス由来および対照マウス由来の
座骨神経の超微細構造を分析した。胚幹細胞での遺伝子ターゲティングを用いて
アポＥノックアウトマウスを産ませた〔ピエドラヒタ（Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａ）
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９、４４７ページ、１
９９２年〕。１２週齢の野生型ノックアウトマウスの座骨神経を慎重に解剖し、
２．５％グルタルアルデヒドに液浸して固定し、１％四酸化オスミウム中で後固
定した。試料をリンスし、次いで、エタノールグラジエントで脱水し、プロピレ
ンオキシド中で最終リンスした。神経をエポキシ樹脂に包埋し、これを６０℃で
２４時間硬化させた。８０ｎｍの薄い切片をダイヤモンドナイフで切り出し、フ
ォームバー（ｆｏｒｍｖａｒ）で被覆したスロットグリッド（ｓｌｏｔ ｇｒｉ
ｄｓ）上に拾い上げて、全断面が見えるようにした。フィリップス（Ｐｈｉｌｌ
ｉｐｓ）４１０型電子顕微鏡で顕微鏡写真を撮った。

【００８０】 ３回の実験全てにおいて、特に神経周辺部で無髄線維の顕著な喪失が観察され
た。ノックアウトマウスと野生型マウスとでは、有髄線維の数は実質的に等しい
が、無髄線維の数は、アポＥノックアウトマウスでは５０％も少ない（図３）。
さらに、残っている無髄線維の形態は極めて異常である。野生型の無髄線維は円
形であり、シュワン細胞の細胞質で互いに明確に分離されているのに対し、ノッ
クアウトマウスの線維は不規則な形状をなし、極めて少ないシュワン細胞細胞質
で取り囲まれている。また、ノックアウトマウスでは、軸索とシュワン細胞細胞
質の間がはっきり識別できない。

【００８１】 アポＥノックアウトマウスに見られるこれらの異常性は、ＮＧＦのｉｎ ｖｉ
ｖｏ活性を増強するアポＥの役割と一致する。坐骨神経内の無髄線維は、ｔｒｋ
Ａ ＮＧＦ受容体を発現し、ＮＧＦに対して応答性である。これらの線維は抗Ｎ
ＧＦ抗体で処理した動物からは失われるが、神経の横断面切断後に、これらのニ
ューロンをＮＧＦによって救助することができる。これらの結果は、ＮＧＦ感受
性ニューロンが易感染性である糖尿病性神経障害にも有意義である。

【００８２】 実施例７ 新生児ラットの神経突起の生長およびシュワン細胞の移動 ＤＲＧはアポＥノックアウトマウスのＮＧＦ処理遠位断端では壊れている 新生児ラットの後根神経節（ＤＲＧ）の神経突起の生長およびシュワン細胞の
移動を、アポＥノックアウトマウスと野生型マウスのＮＧＦ処理遠位断端で測定
した。これらの実験では、新生児ラットのＤＲＧをアポＥノックアウト動物また
は野生型動物の遠位断端のクリオスタット切片上に外殖した。横断面切断してか
ら５日目に、遠位断端を除去し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物中で新鮮凍結し、厚さ２０
μｍの縦切片に切断した。切片を１００μｌの１００ｎｇ／ｍｌＮＧＦ中３７℃
で３時間インキュベートした。次いで、神経を洗浄して、結合していないＮＧＦ
を除去し、新生児ＤＲＧ外植片を神経上に置き、無血清培地中で培養した。７２
時間後に、生体染色色素カルボキシフルオレセインおよび蛍光顕微鏡検査法を用
いて、神経突起の生長およびシュワン細胞の移動のイメージを得た。

【００８３】 アポＥノックアウトマウスから調製した横断面切断坐骨神経のＮＧＦ処理遠位
断端では、神経突起の生長もシュワン細胞の移動も低下した。ＮＧＦが神経突起
の生長（実施例３参照）およびシュワン細胞の移動を共に促進することは既に立
証されている。従って、これらの研究は、ｉｎ ｖｉｖｏＮＧＦ作用の促進にお
けるアポＥの関与を示すさらなる証拠となる。

【００８４】 実施例８アポＥノックアウトマウスは有害熱刺激に対して遅延応答を有する 無髄線維は、疼痛および温度感度を伝達する線維である。従って、アポＥノッ
クアウト動物では無髄線維が実質的に減少しているという知見（実施例６）は、
これらの動物は有害熱刺激に対する応答が低下していることを示唆している。こ
れをテストすべく、野生型マウスとアポＥノックアウトマウスの温水浴からの引
っ込め（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）潜伏時間を測定した。

【００８５】 野生型マウスとノックアウトマウスが５５℃の水浴から後足を引っ込める引っ
込め潜伏時間を測定した。図４に示されているように、アポＥノックアウトマウ
スはその応答潜伏時間において５０％以上の増大を示す（ｐ＜０．００１）。尾
の引っ込めパラダイムでも同様な結果が観察された（データは示さず）。

【００８６】 これらのデータは、ＮＧＦとの相互作用による無髄線維の健康および生存の促
進にアポＥが果たす役割をさらに支持するものである。

【００８７】 実施例９ 主要知見の要約アポＥがＮＧＦ活性を増強するという仮説の支持 上記実施例で提示されたデータは、アポＥがＮＧＦ活性を増強することを強力
に示唆している。その証拠を以下に要約する。

【００８８】 ● アポＥ４ではなくアポＥ３がＮＧＦとのＳＤＳ安定性複合体を形成する。

【００８９】 ● 基体に結合したアポＥ３とＮＧＦとの複合体はＮＧＦの生存促進活性を増 強する。

【００９０】 ● アポＥ４ではなくアポＥ３がＮＧＦの神経突起生長活性を増強する。

【００９１】 ● ＮＧＦ依存性神経突起の生長およびシュワン細胞の移動はアポＥノックア ウト動物由来の基質上では減少する。

【００９２】 ● アポＥノックアウト動物は、ＮＧＦ感受性無髄知覚線維が５０％失われて いる。

【００９３】 ● アポＥノックアウトマウスは有害熱刺激に対して遅延応答を有する。

【００９４】 上述の発明は、明快さおよび理解を得るために図面および実施例を介してかな
り詳細に記載されているが、添付請求の範囲内であれば、特定の変更および改変
を実施し得ることは自明であろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 アポＥ３がＰＣ１２細胞におけるＮＧＦの生存促進活性を増強す
ることを示す図である。データは、アポＥは用いずに１，０００ｎｇ／ｍｌのＮ
ＧＦのみで処理した対照と比較した平均生存率±標準偏差として表されている。
平均値間の差についてはスチューデントのティ検定を用いると、１００および１
，０００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦではｐ＜０．００１であった。斜線間隔の広い棒：
０、１００および１，０００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで予備インキュベートした基体
結合アポＥ３（５０ｎｇ／ｍｌ）。斜線間隔の狭い棒：０、１００および１，０
００ｎｇ／ｍｌで添加した可溶性ＮＧＦのみ。

【図２】 アポＥ４ではなくアポＥ３がＮＧＦに応答してＰＣ１２細胞から
の神経突起の生長を促進することを示す図である。神経突起の生長は、１００ｎ
ｇ／ｍｌのＮＧＦと、１μｇ／ｍｌのアポＥ３、アポＥ４または対照タンパク質
としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とを含む無血清培地で３日間培養後に測
定した。細胞の位相イメージはＩＭＡＧＥ １（商標）分析ソフトウエア〔ユニ
バーサルイメージング社（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）
、ペンシルベニア州ウエストチェスター所在〕を用い、ランダムフィールドでデ
ジタル収集した。神経突起の長さは、対照処理の生長のパーセント（ＮＧＦ＋Ｂ
ＳＡ）±ＳＥＭとして示されている。１対のスチューデントのティ検定を用いる
と、アポＥ３対ＢＳＡの場合はｐ＜０．００５であり、アポＥ３対アポＥ４の場
合は、ｐ＜０．０１であった。

【図３】 アポＥノックアウト（ＫＯ）マウスが、野生型（ＷＴ）マウスに
比べて無髄神経線維の数が減少していることを示す図である。３匹の野生型動物
と３匹のノックアウト動物の高性能電子顕微鏡写真によってカバーされた全面積
は、各グループにつき約１８，０００μｍ^２（野生型マウス：１７，９００、ノ
ックアウトマウス：１８，２００）であった。この面積における有髄軸索および
無髄軸索の総数を計測した。ノックアウト動物の神経は、野生型動物の神経と比
べると、無髄神経線維が５０％減少しているが、有髄神経線維の数は等しいこと
が判明した。

【図４】 アポＥノックアウトマウスが有害熱刺激に対して遅延応答を有す
ることを示す図である。この実験では、マウスが５５℃の水浴から後足を引き出
す引っ込め潜伏時間（秒）を測定した。示されているデータは、各グループ３匹
のマウスの各マウスの後足あたり３回の測定値の平均値±ＳＥＭである。ノック
アウトマウスは、野生型マウスに比べ、応答潜伏時間が５０％以上増大している
。１対のスチューデントのティ検定を用いると、２つの平均値の差のｐ値はｐ＜
０．００１である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/16 Ａ６１Ｐ 35/00 25/28 43/00 １１１ 31/12 Ａ６１Ｋ 37/02 35/00 37/24 43/00 １１１ 37/66 Ｇ Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ストリットマッター ワーレン ジェイ アメリカ合衆国 ノースカロライナ州 27707 デュルハム チッペンハム ロー ド 3817 (72)発明者 グトマン キャサリン アール アメリカ合衆国 ノースカロライナ州 27701 デュルハム ダブリュー リンチ ストリート 109 (72)発明者 フラートン ステファニー エム アメリカ合衆国 ノースカロライナ州 27705 デュルハム モレーン ロード 305 ビー Ｆターム(参考） 4B065 AA90X AA93X BB19 BB34 CA44 4C084 AA02 AA03 AA23 BA41 BA44 DA24 DB59 NA14 ZA022 ZA162 ZA212 ZB262 ZB332

Claims (57)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アポリポタンパク質Ｅと神経成長因子との複合体を含む組成
   物。
2. 【請求項２】 アポリポタンパク質Ｅとニューロトロフィン４との複合体を
   さらに含むことを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の組成物。
3. 【請求項３】 前記アポリポタンパク質Ｅが脱脂アポリポタンパク質Ｅであ
   ることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の組成物。
4. 【請求項４】 前記複合体が共有結合型複合体であることを特徴とする、請
   求の範囲第１項に記載の組成物。
5. 【請求項５】 前記複合体が非共有結合型複合体であることを特徴とする、
   請求の範囲第１項に記載の組成物。
6. 【請求項６】 前記複合体が基体に結合していることを特徴とする、請求の
   範囲第１項に記載の組成物。
7. 【請求項７】 前記アポリポタンパク質Ｅがアポリポタンパク質Ｅ２である
   ことを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の組成物。
8. 【請求項８】 前記アポリポタンパク質Ｅがアポリポタンパク質Ｅ３である
   ことを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の組成物。
9. 【請求項９】 前記アポリポタンパク質Ｅがアポリポタンパク質Ｅ４である
   ことを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の組成物。
10. 【請求項１０】 前記アポリポタンパク質Ｅがヒトアポリポタンパク質Ｅで
    あることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の組成物。
11. 【請求項１１】 前記神経成長因子がヒト神経成長因子であることを特徴と
    する、請求の範囲第１項に記載の組成物。
12. 【請求項１２】 前記組成物が生理的に許容し得る担体中にあることを特徴
    とする、請求の範囲第１項に記載の組成物。
13. 【請求項１３】 神経細胞に、生存促進量の、アポリポタンパク質Ｅと神経
    成長因子との複合体を含む組成物を投与することを含む、神経細胞の生存を促進
    する方法。
14. 【請求項１４】 組成物がアポリポタンパク質Ｅとニューロトロフィン４と
    の複合体をさらに含むことを特徴とする、請求の範囲第１３項に記載の方法。
15. 【請求項１５】 アポリポタンパク質Ｅが脱脂アポリポタンパク質Ｅである
    ことを特徴とする、請求の範囲第１３項に記載の方法。
16. 【請求項１６】 複合体が共有結合型複合体であることを特徴とする、請求
    の範囲第１３項に記載の方法。
17. 【請求項１７】 複合体が非共有結合型複合体であることを特徴とする、請
    求の範囲第１３項に記載の方法。
18. 【請求項１８】 アポリポタンパク質Ｅがアポリポタンパク質Ｅ２であるこ
    とを特徴とする、請求の範囲第１３項に記載の方法。
19. 【請求項１９】 アポリポタンパク質Ｅがアポリポタンパク質Ｅ３であるこ
    とを特徴とする、請求の範囲第１３項に記載の方法。
20. 【請求項２０】 アポリポタンパク質Ｅがアポリポタンパク質Ｅ４であるこ
    とを特徴とする、請求の範囲第１３項に記載の方法。
21. 【請求項２１】 アポリポタンパク質Ｅがヒトアポリポタンパク質Ｅである
    ことを特徴とする、請求の範囲第１３項に記載の方法。
22. 【請求項２２】 神経成長因子がヒト神経成長因子であることを特徴とする
    、請求の範囲第１３項に記載の方法。
23. 【請求項２３】 ｉｎ ｖｉｔｒｏ投与することを特徴とする、請求の範囲
    第１３項に記載の方法。
24. 【請求項２４】 複合体が基体に結合していることを特徴とする、請求の範
    囲第２３項に記載の方法。
25. 【請求項２５】 アポリポタンパク質Ｅを基体に結合させた後で、神経成長
    因子との複合体を形成することを特徴とする、請求の範囲第２４項に記載の方法
    。
26. 【請求項２６】 ｉｎ ｖｉｔｒｏ投与することを特徴とする、請求の範囲
    第１３項に記載の方法。
27. 【請求項２７】 神経細胞がヒト神経細胞であることを特徴とする、請求の
    範囲第２６項に記載の方法。
28. 【請求項２８】 神経細胞が神経変性疾患に悩むヒト被験者の神経細胞であ
    ることを特徴とする、請求の範囲第２７項に記載の方法。
29. 【請求項２９】 神経細胞が神経組織に対する損傷または外傷を受けたヒト
    被験者の神経細胞であることを特徴とする、請求の範囲第２７項に記載の方法。
30. 【請求項３０】 神経細胞が、アルツハイマー病、パーキンソン病、末梢神
    経損傷、末梢神経障害、筋萎縮性側索硬化症、頭部損傷および卒中からなる群か
    ら選択される症状に悩むヒト被験者の神経細胞であることを特徴とする、請求の
    範囲第２７項に記載の方法。
31. 【請求項３１】 治療を要する被験者に、治療上有効量の、アポリポタンパ
    ク質Ｅと神経成長因子との複合体を含む組成物を投与する方法。
32. 【請求項３２】 複合体が共有結合型複合体であることを特徴とする、請求
    の範囲第３１項に記載の方法。
33. 【請求項３３】 複合体が非共有結合型複合体であることを特徴とする、請
    求の範囲第３１項に記載の方法。
34. 【請求項３４】 アポリポタンパク質Ｅがアポリポタンパク質Ｅ２であるこ
    とを特徴とする、請求の範囲第３１項に記載の方法。
35. 【請求項３５】 アポリポタンパク質Ｅがアポリポタンパク質Ｅ３であるこ
    とを特徴とする、請求の範囲第３１項に記載の方法。
36. 【請求項３６】 アポリポタンパク質Ｅがアポリポタンパク質Ｅ４であるこ
    とを特徴とする、請求の範囲第３１項に記載の方法。
37. 【請求項３７】 アポリポタンパク質Ｅがヒトアポリポタンパク質Ｅである
    ことを特徴とする、請求の範囲第３１項に記載の方法。
38. 【請求項３８】 神経成長因子がヒト神経成長因子であることを特徴とする
    、請求の範囲第３１項に記載の方法。
39. 【請求項３９】 被験者がヒト被験者であることを特徴とする、請求の範囲
    第３１項に記載の方法。
40. 【請求項４０】 ヒト被験者が神経変性疾患に悩んでいることを特徴とする
    、請求の範囲第３９項に記載の方法。
41. 【請求項４１】 ヒト被験者が神経組織に対する損傷または外傷を受けてい
    ることを特徴とする、請求の範囲第３９項に記載の方法。
42. 【請求項４２】 ヒト被験者が、アルツハイマー病、パーキンソン病、末梢
    神経損傷、末梢神経障害、筋萎縮性側索硬化症、頭部損傷および卒中からなる群
    から選択される症状に悩んでいることを特徴とする、請求の範囲第３９項に記載
    の方法。
43. 【請求項４３】 アポリポタンパク質Ｅとニューロトロフィン４との複合体
    を含む組成物。
44. 【請求項４４】 医薬上許容し得る担体中にあることを特徴とする、請求の
    範囲第４３項に記載の組成物。
45. 【請求項４５】 神経細胞に、生存促進量の、アポリポタンパク質Ｅとニュ
    ーロトロフィン４との複合体を含む組成物を投与することを含む、神経細胞の生
    存を促進する方法。
46. 【請求項４６】 治療を要する被験者に、治療上有効量の、アポリポタンパ
    ク質Ｅとニューロトロフィン４との複合体を含む組成物を投与する方法。
47. 【請求項４７】 アポリポタンパク質Ｅとγ型インターフェロンとの複合体
    を含む組成物。
48. 【請求項４８】 生理的に許容し得る担体中にあることを特徴とする、請求
    の範囲第４７項に記載の組成物。
49. 【請求項４９】 細胞に、抗ウイルス有効量の、アポリポタンパク質Ｅとγ
    型インターフェロンとの複合体を含む組成物を投与することを含む、ウイルス感
    染から細胞を防御する方法。
50. 【請求項５０】 治療を要する被験者に、抗ウイルス有効量の、アポリポタ
    ンパク質Ｅとγ型インターフェロンとの複合体を含む組成物を投与する方法。
51. 【請求項５１】 被験者がウイルス感染症に悩んでいることを特徴とする、
    請求の範囲第５０項に記載の方法。
52. 【請求項５２】 被験者がウイルス感染症を発症する危険があることを特徴
    とする、請求の範囲第５０項に記載の方法。
53. 【請求項５３】 治療を要する被験者に、抗腫瘍有効量の、アポリポタンパ
    ク質Ｅとγ型インターフェロンとの複合体を含む組成物を投与する方法。
54. 【請求項５４】 被験者が腫瘍に悩んでいることを特徴とする、請求の範囲
    第５３項に記載の方法。
55. 【請求項５５】 腫瘍が悪性であることを特徴とする、請求の範囲第５４項
    に記載の方法。
56. 【請求項５６】 被験者が腫瘍を発症する危険があることを特徴とする、請
    求の範囲第５３項に記載の方法。
57. 【請求項５７】 治療を要する被験者に、治療上有効量の、アポリポタンパ
    ク質Ｅとγ型インターフェロンとの複合体を含む組成物を投与する方法。