【発明の詳細な説明】
ヒト腫瘍形成関連タンパク質、HTAP技術分野
本発明は、新規な腫瘍形成タンパク質の核酸及びアミノ酸配列、及び細胞増殖
及び炎症に関連する疾病の診断、予防、及び治療におけるこれらの配列の使用に
関するものである。背景技術
癌、つまり悪性腫瘍は、無限の細胞増殖と細胞死を特徴とし、三種、即ち癌腫
、肉腫、及び白血病に分類され得る。最近の報告から、概ね女性の8名に1人が
乳癌を患い、年齢50歳以上の男性が前立腺癌を患う危険性は約9.5%である
ことがわかった(Helzlsouer,K.J.(1994)Curr.Opin.Oncol.6:541-548;Harris,
J.R.等(1992)N.Engl.J.Med.327:319-328)。
癌は、発癌遺伝子の活性化と関連を有する。発現遺伝子は、正常な細胞の遺伝
子、即ちプロトオンコジーンに由来する。これらのプロトオンコジーンは、それ
らがコードするタンパク質である腫瘍性タンパク質が、正常な細胞を悪性細胞に
変換したとき活性化される。腫瘍性タンパク質のなかには、正常なタンパク質の
突然変異体アイソフォームであるものや、細胞の位置及び発現レベルについて異
常な形で発現されたものがある。後者の種類の腫瘍性タンパク質の場合は、細胞
増殖の転写性調節を変えることによって癌を発生させる。5つのクラスの腫瘍性
タンパク質が、細胞周期の調節に影響を及ぼすことが知られている。これらのク
ラスには、成長因子、成長因子受容体、細胞内シグナル伝達因子、核転写因子、
及び細胞周期調節タンパク質が含まれる。場合によっては、レトロウイルス及び
DNAウイルスによって発現遺伝子が活性化され得る。発癌遺伝子の活性化は、
ウイルスのゲノムが宿主細胞のDNAに組込ま
れる結果生じ、また感染された細胞を連続的細胞分割の条件に維持し得る、2以
上の発現遺伝子が活性化されることもある。
多種の発癌遺伝子が同定され、特性化されてきた。このような発癌遺伝子には
、sis、erbA、erbB、her−2、変異Gs、src、abl、ra
s、crk、jun、fos、myc、及びRB、p53、mdm2、Cipl
、p16、及びサイクリンDのような変異癌抑制遺伝子が含まれる。詳述すると
、mycはbmi−1と協働して、マウスのモロニー白血病ウイルスを感染され
たE±mycトランスジェニックマウスにおけるリンパ腫形成を促進する(Haup
t,Y.等(1991)Cell 65:753-763;van Lohuizen,M.P.等(1991)Cell 65:737-752)
。bmi−1の遺伝子座は、bmi−1のみならず、195個のアミノ酸残基か
らなるポリペプチドであるBUPをコードする遺伝子bupも上流に有すること
がわかった(Haupt,Y.等(1992)Mol.Biol.Rep.17:17-20)。
腫瘍形成タンパク質に関連するタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオ
チドの発見は、細胞増殖及び炎症に関連する疾患の診断、予防、及び治療におい
て役立つ新たな物質を提供することによって、当分野における必要性を満たすも
のである。発明の開示
本発明は、リンパ腫形成タンパク質BUPに類似性を有することを特徴とする
、新規な腫瘍形成タンパク質(以下HTAPと称する)を提供する。
従って本発明は、配列番号:1に示すアミノ酸配列を有する実質的に精製され
たHTAPを提供する。
本発明の或る態様は、HTAPをコードする単離され実質的に精製されたポリ
ヌクレオチドを提供する。特定の態様では、このポリヌクレオ
チドは、配列番号:2のヌクレオチド配列である。
また本発明は、配列番号:2又はその変異体の相補配列を含むポリヌクレオチ
ド配列に関連する。更に本発明は、配列番号:2の配列と厳密な条件の下でハイ
ブリダイズするポリヌクレオチド配列を提供する。
更に本発明は、該ポリペプチドをコードする核酸配列、オリゴヌクレオチド、
ペプチド核酸(PNA)その断片、一部分又はアンチセンス分子や、HTAPを
コードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び宿主細胞を提供する。また
本発明は、HTAPに特異的に結合する抗体や、実質的に精製されたHTAPを
含む医薬品組成物を提供する。また本発明は、HTAP又はそのアゴニストを用
いる細胞増殖を刺激する方法や、HTAPのアンタゴニストを用いる細胞増殖及
び炎症が関連する疾病の治療又は予防方法を提供する。図面の簡単な説明
第1A図及び第1B図は、HTAPのアミノ酸配列(配列番号:1)及び核酸
配列(配列番号:2)を示す。配列アライメントは、MacDNASISPROTMソフトウェ
ア(Hitachi Software Engineering Co.,Ltd.,San Bruno,CA)を用いて作成し
た。
第2図は、HTAP(配列番号:1)及びマウスのBUP(配列番号:3)の
間のアミノ酸配列アライメントを示す。この配列アライメントは、DNASTARTMソ
フトウェア(DNASTAR Inc,Madison WI)のマルチシーケンスアライメントプログ
ラムを用いて作成した。
第3A図及び第3B図はそれぞれ、HTAP(配列番号:1)とBUP(配列
番号:3)の疎水性プロット(MacDNASIS PROTMソフトウェアを用いて作成)を
示す。X軸は正の方向にアミノ酸の位置を表し、Y軸は負の方向に疎水性のレベ
ルを表す。発明の実施の形態
本発明のタンパク質、核酸配列、及び方法について説明する前に、本発明は、
ここに開示した特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター、及び試薬に限定
されず、当然のことながらこれらを変えて実施することができるものと理解され
たい。また、ここで用いられる用語法は、特定の実施例のみを説明する目的で用
いられたものであり、請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定す
ることを意図したものではないということも理解されたい。
本明細書及び請求の範囲において、単数を表す「1つの」及び「その」と形容
されたものは、前後関係でそうでないことが明らかである場合以外は、複数の意
味も含んでいることに注意しなければならない。従って、例えば「宿主細胞」な
る表記が表すものには、複数のそのような宿主細胞が含まれ、「抗体」なる表記
は、1またはそれ以上の抗体及び当業者に周知のその等価物等も表している。
本明細書における全ての科学技術専門用語は、別の意味で定義されていない場
合には、本発明の属する技術分野の専門家に一般に理解されるのと同じ意味を有
する。ここに説明したものと類似のまたは等価な方法や材料を本発明の実施や試
験において用いることができるが、好適な方法、装置、及び材料はここに説明さ
れている。本明細書に記載された全ての文献は、本発明の関連において用いられ
得る文献で報告された細胞系、ベクター、及び方法論を説明し開示する目的で引
用されたものであり、この引用により本明細書と一体にされる。
定義
本明細書において「核酸配列」は、一本鎖か二本鎖の、センス鎖又はアンチセ
ンス鎖である、ゲノム起源又は合成起源のDNA、RNAや、オリゴヌクレオチ
ド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びその
断片又は一部分である。同様に、本明細書において「アミノ酸配列」は、自然発
生の分子または合成分子の、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド若しくは
タンパク質配列及びその断片又は一部分である。
ここでは「アミノ酸配列」は、自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を指す
ものとして説明されているが、「アミノ酸配列」や類似の用語、例えば「ポリペ
プチド」又は「タンパク質」は、アミノ酸配列を、説明されるタンパク質分子に
関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定する意味で用いられてるのではな
い。
本明細書において「ペプチド核酸」は、リジンのようなアミノ酸残基及びアミ
ノ基が加えられたオリゴマーを含む分子である。これらの小分子は抗遺伝子剤と
も称され、それに対して相補的な核酸の鎖に結合することにより転写物の伸長を
停止させる(Nielsen,P.E.等(1993)Anticancer Drug Des 8:53-63)。
本明細書において、HTAPは、任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス
、ウマ、及び好ましくはヒトを含む哺乳類から得られる、天然の、合成の、半合
成の、又は組換え体を起源とする実質的に精製されたHTAPのアミノ酸配列で
ある。
本明細書において「コンセンサス」は、再度シークエンシングされて不要な塩
基が分離された核酸配列か、XL-PCRTM(Perkin Elmer,Norwalk,CT)を用いて5
’方向及び/または3’方向に延長されて、再度シークエンシングされた核酸配
列か、GELVIEWTMFragment Assembly system(GCG,Madison WI)を用いて2以上
のインサイト社クローンの重複した配列を元に組み合わせて構成された核酸配列
か、若しくは延長と組み合わせの双方によって形成された核酸配列の何れかであ
る。
本明細書においてHTAPの「変異体」は、1又は2箇所以上のアミ
ノ酸が変異したアミノ酸配列である。この変異体は「保存的」変化を含むもので
あり得、この保存的変化においては、例えばロイシンをイソロイシンで置き換え
る場合のように置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性を有する。稀
に、変異体が「非保存的」に変化する場合もあり、この非保存的変化では例えば
グリシンがトリプトファンで置換される。類似した小変化には、アミノ酸の欠失
か挿入、若しくはその両方も含まれる。例えばDNASTARソフトウエアのよ
うな良く知られたコンピュータプログラムを用いて、生物学的或いは免疫学的活
性を損なわずに置換、挿入、又は除去できるアミノ酸が何れかということ、及び
そのようなアミノ酸がいくつかということを決定することができる。
本明細書において「欠失」は、1または2以上のヌクレオチド若しくはアミノ
酸残基が欠ける、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化である。
本明細書において「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子と比較して、そ
れぞれ1または2以上のヌクレオチド、アミノ酸残基が加わるような、ヌクレオ
チド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。
本明細書において「置換」は、それぞれ1または2以上のヌクレオチド或いは
アミノ酸を、異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置換することによって生ずる
変化である。
本明細書において、用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造的機能
、調節機能、又は生化学的機能を有するタンパク質である。同様に「免疫学的に
活性」は、天然の、組換え体の、又は合成のHTAP、若しくはその任意のオリ
ゴペプチドが適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体に
結合する能力である。
本明細書において、用語「アゴニスト」は、HTAPに結合したとき、HTA
Pの活性を変調するようなHTAPの変化を生じさせる分子であ
る。アゴニストには、HTAPに結合するタンパク質、核酸、糖質や、任意の他
の分子が含まれ得る。
本明細書において、用語「アンタゴニスト」または「インヒビター」は、HT
APに結合したとき、HTAPの活性を阻害する分子である。アンタゴニスト及
びインヒビターには、HTAPに結合するタンパク質、核酸、糖質や、任意の他
の分子が含まれ得る。
本明細書において、用語「変調」は、HTAPの生物学的活性の変化又は変質
である。変調は、タンパク質活性の上昇や低下、結合特性の変化、又はHTAP
の生物学的、機能的、免疫学的特性の他の変化であり得る。
本明細書において、用語「擬似物」は、HTAPまたはその一部分の構造の知
識からその構造を知ることができ、そのようなものとして、腫瘍形成タンパク質
様分子の作用の一部または全てに影響を与え得る分子である。
本明細書において、用語「誘導体」は、HTAPをコードする核酸又はコード
されたHTAPを化学的に修飾したものを意味する。このような修飾の例には、
水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換がある。核酸誘導体は、
未修飾HTAPの必須の生物学的特性を保持しているポリペプチドをコードする
。
本明細書において、用語「実質的に精製」は、天然の環境から取り除かれ、天
然にはそれが結合して存在する他の構成要素から単離又は分離されて、その構成
要素が60%以上、好ましくは75%以上、最も好ましくは90%以上除去され
た核酸配列又はアミノ酸配列である。
本明細書において「増幅」は、核酸配列の更なる複製物を生成することであり
、通常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を用いて行われる(D
ieffenbach,C.W.及びG.S.Dveksler(1995)PCR Primer.a Laboratory Manual
,Cold Spring Harbor Press,Plainview,NY)。
本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション(ハイブリッド形成)」は
、核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する過程である。
本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なG塩
基とC塩基の間及び相補的なA塩基とT塩基の間での水素結合の形成によって、
2つの核酸配列で形成された複合体である。これらの水素結合は、塩基スタッキ
ング相互作用(base stacking interaction)により更に安定化され得る。この
2つの相補的核酸配列は水素結合して、逆平行構造をなす。ハイブリダイゼーシ
ョン複合体は、溶液中で形成されるか(例えばC0t又はR0t解析)、或いは核
酸は溶液中に存在する一方の核酸と、固定支持体(例えばin situハイブリダイ
ゼーションのために細胞が固定されるメンブラン、フィルタ、ピン、またはスラ
イドガラス)に固定化された他方の核酸との間で形成され得る。
本明細書において、用語「相補的」または「相補性」は、許容的な塩及び温度
の条件の下での塩基対によるポリヌクレオチド同士の自然の結合である。例えば
、配列「A−G−T」は相補的配列「T−C−A」に結合する。2つの二本鎖分
子間の相補性は、核酸の幾つかのみが結合している「部分的」なものであるか、
若しくは一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合は完全に相補的であり得る
。核酸鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブリダイゼーションの効率及
び強度に有意な影響を与える。このことは、核酸鎖同士の結合によって左右され
る増幅反応において特に重要である。
本明細書において、用語「相同性」は、相補性の程度である。部分的な相同性
と、完全な相同性(即ち同一性)の場合があり得る。部分的に相補的な配列は、
同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズするのを少
なくとも部分的に阻害するものであり、これを機能的な用語「実質的に相同な」
を用いて表す。完全に相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻
害は、低い厳密性の条件の下で、ハイブリダイゼーションアッセイ(サザンブロ
ット法またはノーザンブロット法、溶液ハイブリダイゼーション等)を用いて検
定することができる。実質的に相同な配列またはプローブは、低い厳密性の条件
の下で標的の配列と、完全に相同な配列またはプローブとの結合(即ちハイブリ
ッド形成)について競合し、それを阻害する。これは、低い厳密性の条件が、非
特異的な結合を許容するようなものであると言っているのではない。低い厳密性
の条件では、2つの配列の相互の結合が特異的(即ち選択的)相互作用であるこ
とが必要である。非特異的結合が存在しないことは、部分的な程度の相補性(即
ち約30%未満の同一性)を有していない第2の標的配列を用いることにより試
験できる。非特異的結合が存在しない場合、プローブは第2の非相補的標的配列
とハイブリダイズしない。
周知のように、多数の等価な条件を用いて、低い厳密性条件か高い厳密性条件
の何れかを含むようにすることができる。例えば配列の長さ及び性質(DNA、
RNA、塩基構成)、標的の性質(DNA、RNA、塩基構成、溶液中に存在す
るか或いは固定化されているか等)、及び塩や他の成分の濃度(例えばホルムア
ミド、デキストラン硫酸、及び/またはポリエチレングリコールの有無)のよう
な要素を考慮してハイブリダイゼーション溶液を変え、上に列挙した条件とは異
なるが等価である低い厳密性または高い厳密性の何れかの条件を作り出すことが
できる。
本明細書において、用語「厳密な条件」は、約(Tm−5)℃(プローブの融
解温度(Tm)より5℃下)からTmの約20〜25℃下まで範囲で生ずる「厳
密性」である。当業者には理解されるように、ハイブリダイゼーションの厳密性
は、同一のポリヌクレオチド配列の同定や検
出のためであるか、或いは近縁なポリヌクレオチド配列の同定や検出のためであ
るかによって変えることができる。
本明細書において用語「アンチセンス」は、特定のDNAまたはRNA配列に
対して相補的なヌクレオチド配列である。「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖
に対して相補的な核酸鎖の意味で用いられる。アンチセンス分子は、相補的鎖の
合成が可能なウイルスプロモータに、目的の遺伝子を逆方向に結合することによ
る合成を含む任意の方法で作り出すことができる。この転写された鎖は、一度細
胞内に導入されると、細胞によって作られた天然の配列と結合して二重鎖を形成
する。次にこれらの二重鎖は更なる転写や翻訳を阻害する。このようにして、変
異体の表現型を作り出すことができる。「ネガティブ」なる表現はアンチセンス
鎖の意味で時折用いられ、「ポジティブ」はセンス鎖の意味で用いられることが
ある。
本明細書において、(「指定のタンパク質の一部分」と用いられるような)タ
ンパク質に関連する用語「一部分」は、そのタンパク質の断片である。この断片
のサイズは4つのアミノ酸残基から、(全アミノ酸配列−1)個のアミノ酸の範
囲に亘る。従って、「配列番号:1のアミノ酸配列の少なくとも一部分を含む」
タンパク質は、完全長ヒトHTAPとその断片を含む。
本明細書の定義では、「形質転換」は、外来DNAが入り込みレシピエント細
胞を変化させるプロセスを意味する。このプロセスは、よく知られた種々の方法
を用いた天然または人工の条件の下で生じ得る。形質転換は、外来核酸配列を原
核細胞または真核細胞の宿主細胞に導入するための任意の既知の方法に基づいて
いる。この方法は形質転換される宿主細胞によって選択され、以下のものに限定
されないが、ウイルス感染、電気穿孔法、リポフェクション、及び微粒子銃を用
いる方法が含まれ得
る。このように「形質転換された」細胞は、その中で挿入されたDNAが自律的
に複製するプラスミドとして、或いは宿主の染色体の一部として複製が可能な安
定的に形質転換された細胞を含む。またこのような細胞は、限られた時間だけ導
入されたDNAの一過性の発現をする細胞も含む。
本明細書において、用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の一部
分(即ちエピトープ)である。タンパク質またはタンパク質の断片を用いてホス
トの動物を免疫すると、このタンパク質の種々の領域が、該タンパク質上の所定
の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。これらの
領域または構造を抗原決定基と称する。抗原決定基は、抗体への結合について、
そのままの抗原(即ち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原)と競合し得
る。
本明細書において、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、抗体
及びタンパク質またはペプチドの相互作用が、タンパク質上の特定の構造(即ち
抗原決定基またはエピトープ)の存在に左右されることを意味している。つまり
、この抗体はタンパク質全体ではなく、特定のタンパク質構造を認識して結合す
る。例えば、抗体がエピトープ「A」に対して特異的である場合、標識した「A
」及びその抗体を含む反応において、エピトープA(つまり結合していない、無
標識のA)を含むタンパク質が存在すると、抗体に結合した標識Aの量が低下す
る。
本明細書において、用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。H
TAPをコードする核酸またはその断片を含む疑いのある生物学的サンプルは、
細胞、細胞から単離された染色体(例えば中期染色体の展開物)、(溶液中の、
または例えばサザンブロット解析用に固体支持体に結合した)ゲノムのDNA、
(溶液中の、または例えばノーザンブロット解析用に固体支持体に結合した)R
NA、(溶液中の、または
固体支持体に結合した)cDNA、細胞や組織からの抽出物、その他を含み得る
。
本明細書において、「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」なる表現は
、ノーザン解析ハイブリダイゼーションアッセイにより、配列番号:2に類似な
リボ核酸の存在が検出されることが、サンプル内のHTAPをコードするmRN
Aの存在を表しており、従って該タンパク質をコードする遺伝子からの転写物の
発現と相関性を有しているということを表している。
本明細書において、配列番号:2のポリヌクレオチドにおける「変異」は、ハ
イブリダイゼーションアッセイを用いて検出され得る欠失、挿入、及び点変異を
含む、HTAPをコードするポリヌクレオチドの配列における変化を含む。この
定義に含まれる変異は、(例えば、配列番号:2とハイブリダイズし得る制限断
片長の多形性のパターンの変化による)HTAPをコードするゲノムのDNA配
列に対する変異の検出、(例えばアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブを用
いる)ゲノムDNAのサンプルと配列番号:2の選択された断片とがハイブリダ
イズ不可能であること、及び(例えば中期染色体展開物との蛍光in situハイブ
リダイゼーション(FISH)を用いた)HTAPをコードするポリヌクレオチド配
列に対する正常な遺伝子座以外の遺伝子座とのハイブリッド形成のような、不適
当な或いは予期していないハイブリダイゼーションによって検出される。
本明細書において、用語「抗体」は、そのままの抗体分子及び、例えば抗原決
定基と結合し得るFa、F(ab')2、及びFvのようなその断片である。HTAPポリ
ペプチドに結合する抗体は、そのままのポリペプチド、或いは免疫化する抗原と
しての目的の小型のペプチドを含む断片を用いて調製することができる。動物を
免疫するのに用いられるポリペプチド
またはペプチドは、翻訳されたcDNAまたは化学的合成物を起源とするもので
あり得、必要ならば担体タンパク質と結合することができる。ペプチドに化学的
に結合する通常用いられる担体には、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン
が含まれる。次にこの結合したペプチドを用いて動物(例えばマウス、ラット、
またはウサギ)を免疫する。
本明細書において、用語「ヒト化抗体」は、元の結合能力をそのまま保持しつ
つ、ヒトの抗体により近づけるために非抗体結合領域においてアミノ酸を置換し
た抗体分子である。
発明
本発明は、新規なヒト腫瘍形成タンパク質(HTAP)の発見、HTAPをコ
ードするポリヌクレオチド、及び細胞増殖及び炎症が関連する疾病の診断、予防
、又は治療のためのこれらの物質の使用に基づくものである。
本発明のヒトHTAPをコードする核酸は、子宮cDNAライブラリー(UTRS
NOT02)を起源とするインサイト社クローンNo.2267574において、アミノ酸配列
アライメントのコンピュータ検索によって初めに同定された。コンセンサス配列
の配列番号:2は、以下の重複及び/又は延長された核酸配列、即ちインサイト
社クローンNo.44421(TBLYNOT01を起源)、1287285(BRAINOT11を起源)、22675
74(UTRSNOT02を起源)、及び2372540(ADRENOT07を起源)から構成されたもの
である。
或る実施例では、本発明は第1A図及び第1B図に示すような配列番号:1の
アミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。HTAPは195個のアミノ酸なる
長さを有し、残基S(35番)〜D(38番)、T(85番)〜E(88番)、及びS(
162番)〜E(165番)の3ヶ所のカゼイ
ンキナーゼIIリン酸化可能部位、及び残基S(129番)〜R(131番)の1ヶ所の
プロテインキナーゼCリン酸化可能部位を有する。HTAPは、マウスのリンパ
腫形成関連タンパク質BUP(GI 265569;配列番号:3)と化学的及び構造的
相同性を有する。詳述すると、HTAPとBUPとは89%の配列同一性を共有
する。第3A図及び第3B図に示すように、HTAPとBUPは、かなり類似し
た疎水性プロットを示す。ノーザン解析の結果から、種々のcDNAライブラリ
ー(その58%以上は不死化又は癌性のライブラリー、その14%は炎症関連の
ライブラリー、その14%は胎仔又は子供の組織において生ずる正常な成長及び
発達に関連するライブラリー)におけるこの配列の発現が分かる。
また本発明は、HTAP変異体を包含する。好適なHTAP変異体は、HTA
Pアミノ酸配列(配列番号:1)とのアミノ酸配列類似性が、80%以上、より
好適には90%以上のものである。最も好適なHTAP変異体は、配列番号:1
と95%以上のアミノ酸配列類似性を有するものである。
また本発明は、HTAPをコードするポリヌクレオチドを包含する。従って、
HTAPのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、HTAPを発現
する組換え分子をつくり出すことができる。特定の実施例では、本発明は、第1
A図及び第1B図に示す配列番号:2の核酸配列を含むポリヌクレオチドを包含
する。
当業者には理解されるように、遺伝暗号の縮重の結果、任意の既知の自然発生
遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の相同性しか有していないものも含めて、多
種のHTAPコーディングヌクレオチド配列が作り出され得る。本発明は、可能
なコドン選択に基づく組み合わせを選択することにより作り出され得る、全ての
可能な核酸配列の変異をその範囲に含んでいる。それらの組み合わせは、自然発
生のHTAPのヌクレオチ
ド配列に適用されるような標準的なトリプレット遺伝暗号に基づいて作り出され
るものであり、このような全ての変異は、ここに具体的に示されたものと考えら
れたい。
HTAP及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は、適切に選択された
厳密性の条件の下で自然発生配列のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能な
ものであるのが好ましいが、実質的に異なるコドンの使用頻度を有するHTAP
又はその変異体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る
。コドン選択は、特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従って、特定の
原核細胞又は真核細胞の発現宿主におけるペプチド発現の発生率を高めるように
選択することができる。HTAP及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列
を、コードされるアミノ酸配列を変えないように実質的に変更する理由は、例え
ば自然発生配列から作り出される転写物より長い半減期のような、より望ましい
特性を有するRNA転写物を作り出すためである。
本発明の範囲には、HTAP又はその誘導体をコードするDNA配列又はその
一部の、完全な合成ケミストリによる作製も含まれる。作製したこの合成遺伝子
を、この出願時点において周知の試薬を用いて任意の入手可能なDNAベクター
及び細胞系に挿入することができる。更に、合成ケミストリを用いてHTAPを
コードする配列又はその任意の一部分に突然変異を誘発させることができる。
また本発明の範囲に含まれるものとして、種々の厳密性の条件の下で請求項に
記載のヌクレオチド配列、特に配列番号:2のヌクレオチド配列とハイブリダイ
ズし得るポリヌクレオチド配列がある。ハイブリダイゼーション条件は、Wahl,G
.M.及びS.L.Berger(1987;Methods Enzymol.152:399-407)及びKimmel,A.R.(1987
;Methods in Enzymol.152:507-511)に記載されているように、核酸結合複合体
またはプロー
ブの融解温度(Tm)に基づいており、規定の厳密性において用いられ得る。
本発明の範囲に含まれるHTAPをコードする変異核酸配列は、異なるヌクレ
オチド残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に同一の、または機能的に等
価のHTAPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとなるものである。コ
ードされたタンパク質も、サイレント変化を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入並
びに置換を含み、結果的に機能的に等価なHTAPとなる。意図的な(delibera
te)アミノ酸置換は、HTAPの生物学的活性が保持される限りにおいて、残基
の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性並びにまた両親媒性についての類似性に
基づいてなされ得る。例えば負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグル
タミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、
近い親水性値を持つ荷電していない極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、
イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリ
ン、スレオニン、フェニルアラニン並びにチロシンが含まれる。
更に本発明の範囲に含まれるものとして、HTAPのアレルがある。ここで用
いる「アレル」或いは「アレル配列」とは、HTAPの対立形である。アレルは
変異、すなわち核酸配列の変化によって生じ、一般に変異したmRNA或いはポ
リペプチドを生成するが、そのmRNA或いはポリペプチドの構造或いは機能は
、変わる場合もあれば変わらない場合もある。遺伝子によっては、アレル形が存
在しないもの、1つ存在するもの、或いは多数存在するものがある。一般にアレ
ルを生じる変異はアミノ酸の自然な欠失、付加並びに置換に起因する。このタイ
プの変化はそれぞれ単独で、或いは他の変化と同時に、与えられた配列内で1又
は2回以上生じ得る。
当業者が一般に利用可能な周知のDNA配列決定のための方法が、本発明の実
施において用いられ得る。この方法では酵素、例えばDNAポ
Cleveland OH)、Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer)、熱安定性T7ポリメラーゼ
(Arnersham,Chicago IL)、或いはGibco BRL(Gaithersburg MD)Methods社から
市販されているELONGASE増幅システムのような校正エキソヌクレアーゼと組換え
体ポリメラーゼとの組み合わせのような酵素を使用する。この処理は、Hamilton
Micro Lab2200(Hamilton,Reno,NV)、Peltier Thermal Cycler(PTC200;MJ R
eserch,Watertown MA)並びにABI377DNAシーケンサ(Perkin Elmer)のような装
置を用いて自動化するのが好ましい。
HTAPをコードするポリヌクレオチド配列は、部分的なヌクレオチド配列と
、プロモーター及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当業者に
は周知の様々な方法とを用いて伸長させることができる。例えば、「制限部位」
PCR法を用いることができる或る方法では、汎用プライマーを用いて既知の座
位に隣接する未知の配列を得る(Sarkar,G.(1993)PCR Methods Applic 2:318-32
2)。詳述すると、まずゲノムDNAを、既知の領域に対して特異的なプライマ
ー及びリンカー配列に対するプライマーの存在下で増幅する。増幅された配列を
、その同じリンカープライマー及び最初のプライマーの内部に含まれる別の特異
的プライマーを用いてPCRの2巡目にかける。PCRの各回の生成物を、適切
なRNAポリメラーゼを用いて転写させ、逆転写酵素を用いて配列決定する。
逆PCR法を用いて、既知領域に基づく多様なプライマーを利用した配列の増
幅、または伸長を行うことができる(Triglia,T.等(1988)
Biosciences社,Plymouth MN)や別の適切なプログラムを用いて、長さが22〜
30ヌクレオチドで、50%以上のGC含量を有し、かつ約68〜72℃の温度
で標的配列にアニールするように設計される。この方法ではいくつかの制限酵素
を用いて遺伝子の既知領域の適当な断片を作り出す。次にこの断片を分子内ライ
ゲーションにより環状にし、PCR用の鋳型として使用する。
使用できる別の方法はキャプチャPCR法であり、この方法ではヒト及び酵母
菌人工染色体DNA内の既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する(Lag
erstrom,M.等(1991)PCR Methods Applic 1:111-19)。この方法では、PCR処
理の前に、DNA分子の未知の部分に、複数の制限酵素による消化及びライゲー
ションによって組換え二本鎖配列を配置しておいてもよい。
未知の配列を得るために用いることができる別の方法は、Parker,J.D.等の方
法(1991;Nucleic Acids Res 19:3055-3060)である。更に、PCR、ネスト化
プライマー、PromoterFinderTMライブラリーを用いて、ゲノムDNA内歩行を行
うことができる(Clontech,Palo Alto CA)。このプロセスは、ライブラリーを
スクリーニングする必要がなく、イントロン/エクソン接合部を探し出すのに有
用である。
完全長cDNAをスクリーニングするときに好適なライブラリーは、サイズ選
択された、より大きなcDNAを含むライブラリーである。またランダムプライ
ミングした(rondom primed)ライブラリーは、遺伝子の5’及び上流領域を含
む配列をより多く含むという点で好適である。ランダムプライミングしたライブ
ラリーは、オリゴd(T)ライブラリーで完全長cDNAが得られない場合に特
に有用である。またゲノムライブラリーは、5’及び3’非翻訳領域への配列の
伸長のために役立ち得る。
配列決定やPCRの産物のヌクレオチド配列をサイズ分析したり確認するため
には、市販のキャピラリー電気泳動システムを用いることができる。詳述すると
、キャピラリーシークエンシングでは、電気泳動による分離のための流動性ポリ
マー、レーザーで活性化される4つの異なる蛍光色素(各ヌクレオチドに対して
1つ)を使用し、CCDカメラにより放射線の波長の検出を行う。出力/光強度
は適切なソフトウエア(例えばPerkin elmer製のGenotyperTM及びSequence Navi
gatorTM)を用いて電気信号に変換され、サンプルの負荷からコンピュータ解析
及び電子データ表示までの全過程がコンピュータ制御される。キャピラリー電気
泳動法は、特定のサンプル内に限られた量だけ存在するDNA小片の配列決定に
特に適している。
本発明の別の実施例では、HTAP、融合タンパク質或いはその機能的等価物
をコードするポリヌクレオチド配列を、適切な宿主細胞内でのHTAPの発現を
誘導する組換えDNA分子において用いることができる。遺伝暗号固有の縮重の
ために、同一か機能的に等価なアミノ酸配列を実質的にコードする他のDNA配
列も、HTAPのクローニングや発現のために用いることができる。
当業者には理解できるように、非自然発生コドンを有するHTAPコードディ
ングヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。特定の原核細胞或いは
真核細胞の宿主において選好されるコドンを選択して、例えば、HTAP発現率
を増大させたり、或いは自然発生配列から生成された転写物より長い半減期のよ
うな望ましい特性を有する組換えRNA転写物を生成することができる。
本発明のヌクレオチド配列は、様々な目的、例えば、以下のものに限定はしな
いが遺伝子産物のクローニング、プロセシング及び/又は発現を変えるようにH
TAPをコードする配列を改変するために既知の方法
を用いて組換えることができる。無作為断片によるDNA再編成や遺伝子断片の
PCR再会合及び合成オリゴヌクレオチドを用いて、ヌクレオチド配列を組換え
ることができる。例えば、特定部位突然変異誘発のような当業者には周知の技術
を用いて突然変異を誘発させることによって、新しい制限部位の挿入、グリコシ
ル化パターンの変更、コドン選好の変化、スプライスバリアントの生成等をもた
らすことができる。
本発明の別の実施例では、未改変HTAPコーディング配列、変異HTAPコ
ーディング配列、又は組換えHTAPコーディング配列を異種の配列に結合して
、融合タンパク質をコードする配列にする。例えば、HTAP活性のインヒビタ
ーをペプチドライブラリーからスクリーニングする場合、市販の抗体により認識
される異なるペプチドを発現するキメラHTAPタンパク質をコードすることが
役立つ。融合タンパク質はHTAP配列と異種のタンパク質配列との間の位置に
切断部位を有するように設計することもでき、これによってHTAPを切断して
、ヘテロの部分から分けて精製することが可能となる。
本発明の別の実施例では、当業者によく知られた化学的方法(Caruthers.M.H.
等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223;Horn,T.等(1980)Nucl.Acids Res
Symp.Ser.225-232参照)を用いて、HTAPコーディング配列の全体、或いは
その一部を合成することができる。別法では、化学的方法を用いてタンパク質自
体を作り出して、HTAPアミノ酸配列の全体或いはその一部を合成することが
できる。例えば、種々の固相技術(Roberge,J.Y.等(1995)Science 269:202-204
)でペプチド合成を行うことができ、合成の自動化は、例えばABI431Aペプチド
シンセサイザ(Perkin Elmer)を用いることにより達成することができる。
この新たに合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィ
により実質的に精製することができる(例えばCreighton T.(1983)Proteins St ructure And Molecular Principles
,WH Freeman and Co.,NY参照)。合成された
ペプチドの構成は、アミノ酸解析或いはシークエンシングにより確認することが
できる(例えばエドマン分解法;Creighton,上述)。さらにHTAPのアミノ
酸配列或いはその任意の部分を、その直接の合成の際の改変することにより、及
び/又は化学的方法を用いた他のタンパク質或いはその任意の部分に由来する配
列との結合することによって変異体ポリペプチドを作ることができる。
生物学的に活性なHTAPを発現させるために、HTAPコーディングヌクレ
オチド配列或いはその機能的等価物を、適切な発現ベクター、すなわち挿入され
たコーディング配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入する。
HTAPコーディング配列及び適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベクタ
ーを作製するために当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、in v
itro組換えDNA技術、合成技術、並びにin vivo組換え技術、又は遺伝子組換
え技術が含まれる。このような技術は、Sambrook,J.等(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual
,Cold Spring Harbor Press,Planview NY及びAusubel,F.M
.Current Protocol in Molecular Biology,John Wilky & Sons,New York NYに記
載されている。
種々の発現ベクター/宿主系を、HTAPコーディング配列を保持し、かつ発
現するために利用することができる。このようなものには、以下のものに限定は
されないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドDNA発現
ベクターで形質転換した細菌のような微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換
した酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)を感染させた
昆虫細胞系や、ウイルス発現ベク
ター(例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMV、タバコモザイクウイルスTMV
)をトランスフェクトした、或いは細菌の発現ベクター(例えばTi、或いはpBR3
22プラスミド)で形質転換した植物細胞系や、或いは動物細胞系が含まれる。
これらの系の「調節領域」或いは「制御配列」は、転写及び翻訳を実行するた
めに宿主細胞のタンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域、即ちエンハン
サー、プロモーター及び3’非翻訳領域である。このようなエレメントの、強さ
及び特異性は様々であり得る。利用されるベクター及び宿主に応じて、構成的及
び誘導的プロモーターを含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントを用いる
ことができる。例えば、細
(Stratagene,La Jolla CA)のハイブリッドlacZプロモーター及びptrp-lacハイ
ブリッド等のような誘導的プロモーターを用いることができる。バキュロウイル
スポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞において用いることができる。植物細胞
のゲノムに由来するプロモーター或いはエンハンサ(例えば熱ショック遺伝子,R
UBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子)、若しくは植物ウイルスに由来するプロモー
ター或いはエンハンサ(例えばウイルス性プロモータ或いはリーダー配列)を、
ベクターにクローン化してもよい。哺乳動物細胞では、哺乳類遺伝子或いは哺乳
類ウイルス由来のプロモーターが最適である。HTAPをコードする配列の多数
の複製を含む株細胞を作る必要がある場合には、SV40或いはEBVに基づくベクタ
ーを適切な選択マーカーと共に用いる。
細菌系では、HTAPの用途に応じて多数の発現ベクターを選択することがで
きる。例えば抗体誘発のために大量のHTAPが必要とされる場合は、容易に精
製される融合タンパク質を高レベルで発現できるベクターが望ましい。そのよう
なベクターには、以下のものに限定はしない
(Stratagene)(このベクターでは、HTAPをコードする配列を、アミノ末端
メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼの7残基の配列を備えたフレーム内
においてベクターに結合してハイブリッドタンパク質を生成できる)や、pINベ
クター(Van Heeke,G.及びS.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.264:5503-5509)
等が含まれる。またpGEXベクター(Promage、Madison WI)も、グルタチオンS−
トランスファーゼ(GST)を有する融合タンパク質として異種ポリペプチドを発
現するため用いることができる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性で
あり、グルタチオンアガロースビーズへ吸着させた後、遊離グルタチオンの存在
下で溶出させることにより溶解した細胞から容易に精製できる。その系において
生成されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン或いはXA因子プロテアーゼ切
断部位を含めて、目的のクローン化ポリペプチドをGST部分から随意に放出させ
ることができるように設計される。
酵母菌、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)では、α因
子、アルコールオキシダーゼ及びPGHのような構成的或いは誘導的プロモーター
を含む多数のベクターを用いることができる。その概要を知るには、Ausubel等
(前出)及びGrant等(1987)Methods Enzymol 153:516-544を参照されたい。
植物発現ベクターを用いる場合には、HTAPをコードする配列の発現は、多
数のプロモーターの何れかで促進される。例えばCaMVの35S及び19Sプロモーター
のようなウイルスのプロモーターを、単独で、或いはTMV(Takamatsu,N.等(198
7)EMBO J 6:307-311)由来のオメガリーダー配列と共に用いることができる。
別法として、RUBISCOの小サブユニット、或いは熱ショックプロモーターのよう
な植物プロモー
ターが用いてもよい(Coruzzi,G.等(1984)EMBO J 3:1671-1680);Broglle,R.
等(1984)Science 224:838-843;及びWinter,J.等(1991)Results Probl.Cell
Differ.17:85-105)。これらの構成は、直接のDNA形質転換或いは病原体によ
るトランスフェクションにより植物細胞内に導入できる。このような技術の種々
の一般に入手可能な文献に記載されている(Hobbs,S.又はMurry,L.E.McGraw Hill
Yearbook of Science and Technology(1992)McGraw Hill NY,pp191-196を参
照されたい)。
HTAPの発現のために用いることができる別の発現系は昆虫系である。その
ような系の一つでは、Spodoptera frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの幼虫に
おいて外来遺伝子を発現するためのベクターとして、Autographa californica核
多角体病ウイルス(AcNPV)が用いられる。HTAPをコードする配列は、ポリ
ヘドリン遺伝子のようなウイルスの非必須領域にクローニングされ、ポリヘドリ
ンプロモーターの制御下に置かれ得る。HTAPコーディング配列の挿入が成功
すると、ポリヘドリン遺伝子が不活性になり、コートタンパク質膜が欠如した変
異体ウイルスが生成される。次に、この変異体ウイルスを用いて、S.frugiperda
細胞或いはTrichoplusiaの幼虫へ感染させ、その中でHTAPが発現される(En
gelhard,E.K.等(1994)Proc Nat Acad Sci 91:3224-3227)。
哺乳類宿主細胞では、多数のウイルス性発現系を利用することができる。発現
ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、HTAPをコードする配
列は、後期プロモータ及び三連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物/翻
訳物複合体内に結合され得る。ウイルスのゲノムの非必須E1又はE3領域へ挿入す
ることにより、感染した宿主細胞でHTAPを発現できる生ウイルスになる(Lo
gan,J.及びShenk,T.(1984)Proc Nat Acad Sci 81:3655-3659)。さらに、哺乳
類宿主細胞
内の発現を増加させるためにラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサのような転
写エンハンサを用いることができる。
また、HTAP配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要で
ある。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接する配列が含まれる。H
TAP及びその開始コドン及び上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場
合には、翻訳制御シグナルを加える必要はない。しかしながらコーディング配列
又はその一部のみが挿入される場合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制御
シグナルを与えなければならない。さらに、全インサートの転写が確実に行われ
るようにするために、開始コドンは正しい読み枠に存在しなければならない。外
来転写エレメント及び開始コドンは、自然及び合成両方の様々な起源に由来する
ものであり得る。発現の効率は、その細胞系に適切なエンハンサーを含めること
により高めることができる(Scharf,D.等(1994)Results Probl Cell Differ 2
0:125-162)。
さらに宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節したり、発現したタンパク
質を望ましい形にプロセシングする能力で選択される。このようなポリペプチド
の修飾には、以下のものに限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリ
コシル化、リン酸化、脂質化(lipidation)並びにアシル化が含まれる。またタ
ンパク質の「プレプロ」部分を切り離す翻訳後プロセシングも、正しい挿入、折
り畳み、及び/又は機能の発揮のために重要である。CHO,HeLa、MDCK、293、WI
38等のような異なる宿主細胞は、そのような翻訳後の活動のための特定の細胞装
置及び特徴的な機構を有しており、導入される異種タンパク質の修飾やプロセシ
ングが確実に行われるように選択され得る。
長期間にわたって変異体タンパク質の高収率の産生を確保するためには安定し
た発現が望ましい。例えば、ウイルスの複製起源や内在性発現
エレメント及び選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて、HTAPを安
定的に発現する株細胞を形質転換し得る。ベクターの導入の後、細胞を、選択培
地に切り替える前に濃縮培地内で1〜2日間増殖させる。選択マーカーの目的は
、選択のための耐性を与え、その存在によって導入された配列をうまく発現する
細胞を増殖、回収できるようにすることである。安定的に形質転換された細胞の
耐性凝集塊は、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖することができる
。
形質転換された株細胞を回収するために任意の数の選択系を用いることができ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ(tk)(Wigler,M.等(1977)Cell 11:223-32)及びアデニンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ(aprt)(Lowy,I.等(1980)Cell 22:817-23)遺伝子
が含まれ、それぞれtk及びaprt細胞において用いられる。また代謝拮抗物質、抗
生物質或いは除草剤への耐性を選択の基礎として用いることができる。例えばdh
frはメトトレキセートに対する耐性を与え(Wigler,M.等(1980)Natl Acad Sci 77
:3567)、nptはアミノ配糖体のネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え(Colb
erre-Garapin,F.等(1981)J Mol Biol 150:1)、als或いはpatはクロルスルフ
ロン(chlorsulfuron)、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(pho
sphinotricin acetyltransferase)に対する耐性を与える(Murry,前出)。さ
らに選択に利用できる遺伝子として、例えば細胞がトリプトファンの代わりにイ
ンドールを利用できるようにするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノー
ル(histinol)を利用できるようにするhisDが文献に記載されている(Hartman,
S.C.及びR.C.Mulllgan(1988)Proc Nalt Acad Sci 85:8047-51)。最近になっ
て、形質転換体を特定するためばかりではなく、特定ベクター系による一過性の
或いは安定的なタンパク質発現の量を定量するために広く用い
られる、例えばアントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質、GUS、及
びルシフェラーゼ及びその基質、ルシフェリンのような可視マーカーがよく利用
されるようになった(Rhodes,C.A.等(1995)Methods Mol.Biol.55:121.131)。
マーカー遺伝子発現の存在/不存在によって目的の遺伝子の存在も示されるが
、その存在及び発現は確認すべきである。例えばHTAPをコードする配列がマ
ーカー遺伝子配列内に挿入された場合は、HTAPをコードする配列を含む組換
え体細胞をマーカー遺伝子の機能の存在により確認できる。別法では、マーカー
遺伝子をHTAPをコードする配列と直列に配置して、両者が単一プロモータの
制御下となるようにすることができる。誘導に応じてのマーカー遺伝子の発現、
つまり選択は、通常直列に配置された配列の発現をも同時に示すことになる。
この他当業者には周知の様々な方法により、HTAPのコーディング配列を含
みHTAPを発現する宿主細胞を識別できる。このような方法には、以下のもの
に限定はしないが、DNA-DNA或いはDNA-RNAハイブリダイゼーション及び、核酸及
びタンパク質を検出及び/又は定量するための膜ベース、溶液ベース或いはチッ
プベースの技術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイが含まれ
る。
HTAPをコードする配列のプローブ、一部、或いは断片を用いるDNA-DNA又
はDNA-RNAハイブリダイゼーション若しくは増幅により、HTAPポリヌクレオ
チド配列の存在を検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイでは、HT
APをコードするDNA或いはRNAを含む形質転換体を検出するために、核酸配列に
基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーを用いる。本明細書において「オリ
ゴヌクレオチド」或いは「オリゴマー」とは、プローブ或いは、PCRで増幅さ
れるセグメントであるアンプリマーとして用いることができる核酸配列であって
、
長さが約10ヌクレオチド以上、最大60ヌクレオチド程度、好適には15〜3
0ヌクレオチド、より好適には20〜25ヌクレオチドであるものを指す。
このタンパク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいず
れかを用いてHTAPポリペプチドの発現を検出し、測定するための種々のプロ
トコルが当業者には周知である。このようなプロトコルの例には、酵素結合免疫
検定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)及び蛍光表示式細胞分取器法(FACS
)を含まれる。HTAPポリペプチド上で2つの非干渉なエピトープに対して反
応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナルベースのイムノアッ
セイ(two-site,monoclonal-based limmunoassay)が好適であるが、競合的結
合アッセイも用いられる。これらアッセイの並びに他のアッセイは、他の文献、
Hampton,R等(1990;Serologivcal Methods,a Laboratory Manual,APS Press,St
Paul MN)及びMaddox,D.E.等(1983,J.Exp.Med.158:1211-1216)に記載されてい
る。
さらに多くの標識及び結合技術が当業者には周知であり、種々の核酸及びアミ
ノ酸のアッセイにおいて用いることができる。近縁な配列を検出するための、標
識されたハイブリダイゼーションプローブやPCRプローブを作成するための手
段には、オリゴ標識、ニックトランスレーション法、末端標識、或いは標識ヌク
レオチドを用いるPCR増幅などが含まれる。別法としては、HTAPコーディ
ング配列、或いはその任意の部分を、mRNAプローブの作成のためのベクター
にクローン化する。そのようなベクターは当分野では周知で、市販されており、
例えばT7、T3、或いはSP6のような適切なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌ
クレオチドを加えることにより、in vitroでRNAプローブを合成するために用
いることができる。これらの方法は、種々の市販のキット
(Pharmacia Upjohn(Kalamazoo,MI);Promega(Madison WI);US Biochemica
l Corp(Cleveland OH))を用いて実行することができる。適切なリポーター分
子、すなわち標識には、放射性核種、酵素、フルオレセント(蛍光剤)、化学発
光剤或いは色素剤や、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子等が含まれる。
HTAPをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、コード
されたタンパク質を細胞培地で発現させ、そこから回収するのに適した条件下で
培養することができる。組換え体細胞により生成されるタンパク質は、用いられ
る配列及び/またはベクターに応じて、細胞内に分泌、つまり細胞内に含まれる
ようにすることができる。当業者には理解されるように、HTAPをコードする
ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞か真核細胞の細胞膜を通して
のHTAP分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計することができる。他
の組換え体作製物では、HTAPをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製
を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合するこ
とができる。そのような精製を容易にするドメインには、以下のものに限定はし
ないが、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュー
ルのような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にす
るプロテインAドメイン、並びにFLAGS伸長/アフィニティ精製システムにおい
て用いられるドメイン(Immunex、Seattle WA)が含まれる。精製ドメインとH
TAPの間にXA因子或いはエンテロキナーゼ(Invitrogen,San Diego CA)に
対して特異的な配列のような切断可能なリンカー配列を含めるのは精製を促進す
るのに役立つ。HTAPをコードする配列とともに、6個のヒスチジン残基、そ
れに続くチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位をコードする核酸配列を
含むこのような発現ベクターの1つは、融合タ
ンパク質を発現する。ヒスチジン残基がIMIAC(Porath,J等(1992;Protein Exp.
Purif.3:263-281)に記載のような固定化金属イオンアフィニティクロマトグラ
フィー)精製を促進するとともに、エンテロキナーゼ切断部位が融合タンパク質
からのHTAPの精製のための手段となる。融合タンパク質を含むベクターにつ
いての解説は、Kroll,D.J.等(1993;DNA Cell Biol 12:441-453)に記載されて
いる。
組換え体の産生に加えて、HTAPの断片を、固層技術を用いた直接のペプチ
ド合成で形成することもできる(Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85:21.49-
2154参照)。in vitroタンパク質合成は手作業で行えるが、自動化することもで
きる。自動的な合成は、例えば、Applied Biosystem 431Aペプチドシンセサイザ
(Perkin Elmer)を用いて行うことができる。HTAPの種々の断片を個別に化
学的に合成し、化学的方法を用いて結合して完全長分子を作り出してもよい。
治療
HTAPは、マウスのリンパ腫形成関連タンパク質BUP(GI 265569)と化
学的及び構造的相同性を共有している。ノーザン解析の結果から、HTAPの発
現が細胞増殖及び炎症と関連を有することが分かる。
従って或る実施例では、細胞増殖を剌激するために、HTAP又は断片若しく
は誘導体を細胞又は細胞群に加え得る。詳述すると、細胞又は細胞群の再生又は
分化を促進する目的で、例えばリポソーム、ウイルスベースのベクター、又はエ
レクトロインジェクションのようなデリバリー機構を用いてHTAPをin vivo
で細胞に与えることができる。更に、異種移植又は自家移植のために細胞増殖を
刺激する目的で、HTAPをin vitro又はex vivoで細胞、細胞系、組織又は器
官の培地に加えること
ができる。場合によっては、癌又は感染症と闘うその能力又は鎌状赤血球性貧血
、β地中海貧血等のような遺伝子欠損を修復するその能力について細胞を選択し
ておく。別の実施例では、上述のように細胞増殖を刺激するために、HTAP又
はその断片若しくは誘導体を発現し得るベクターを用いて細胞を形質転換するこ
ともできる。別の実施例では、上述のような細胞増殖の刺激においてHTAPの
活性を変調するために、HTAP又はその断片若しくは誘導体のアゴニストを用
いることができる。
別の実施例では、細胞増殖に関連する疾病の治療又は予防のために、HTAP
又はその断片若しくは誘導体のアンタゴニスト又はインヒビターを患者に投与し
得る。このような疾患には、以下に限定されないが腺癌、黒色腫、肉腫、リンパ
腫、及び白血病を含む種々のタイプの癌、詳述すると、膀胱、骨、脳、***、神
経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、傍神経節、副甲状腺、陰茎
、副腎、前立腺、精嚢、皮膚、胃、精巣、甲状腺、舌、扁桃、尿管、及び子宮の
癌が含まれる。更に別の実施例では、限定されないが、上述したもののような細
胞増殖に関連する疾患の治療又は予防のために、HTAPをコードするポリヌク
レオチドの相補配列、つまりアンチセンスを発現するベクターを患者に投与し得
る。
更に別の実施例では、炎症に関連する疾患の治療又は予防のために、HTAP
又はその断片若しくは誘導体のアンタゴニスト又はインヒビターを患者に投与し
得る。このような炎症の疾患は、ウイルス、細菌、真菌、蠕虫又は原虫の感染;
外傷;又は以下に限定されないが、溶血性貧血、動脈硬化症、喘息、胆汁性肝硬
変、気管支炎、クローン病、嚢胞性線維症、皮膚炎、糖尿病、肺気腫、腎炎、甲
状腺機能冗進症、肺線維症、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無
力症、骨粗鬆症、膵炎、リウマチ様関節炎、シェーグレン症候群、強皮症、及び
甲状腺炎を
含む免疫疾患によって発生し得る。更に別の実施例では、限定されないが、上述
のものを含む炎症に関連する疾患の治療又は予防のために、HTAPをコードす
るポリヌクレオチドの相補配列、つまりアンチセンスを発現するベクターを患者
に投与し得る。
或る態様では、HTAPに特異的な抗体をアンタゴニストとして直接的に用い
たり、或いはHTAPを発現する増殖中又は炎症性の細胞又は組織に薬物を送達
するためのターゲティング又はデリバリー機構として間接的に用いることができ
る。
他の実施例では、上述の治療用タンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニス
ト、アンチセンス配列又はベクターのいずれかを、他の適切な薬剤と組み合わせ
て投与し得る。当業者であれば、従来の医薬上の原理に基づいて、併用療法にお
いて使用するために適切な薬剤を選択することができよう。治療薬を組み合わせ
ることにより、上述の種々の疾患の治療又は予防に有効な相乗作用を与え得る。
この方法を用いると、より少ない投与量の各薬剤で、治療効果を上げることがで
き、従って副作用を低下させることができる。
HTAPのアンタゴニスト又はインヒビターは、周知の方法を用いて製造する
ことができる。詳述すると、精製されたHTAPを抗体をつくり出すために用い
たり、或いはHTAPに特異的に結合するものを同定するべく薬物のライブラリ
ーをスクリーニングする際に用いることができる。
HTAPに特異的な抗体は、周知の方法を用いて製造することができる。この
ような抗体には、以下に限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル
抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリーに
よって産生された断片が含まれ得る。中和抗体(即ち2量体形成を阻害するもの
)は、治療上の使用のために特に好
適である。
抗体を産生するため、HTAP或いは免疫学的特性を保持するその任意の一部
、断片或いはオリゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、
マウス等を含む種々の宿主を免疫することができる。宿主の種に応じて、種々の
アジュバントを免疫学的反応を増強するために用いることができる。そのような
アジュバントには、以下のものに限定はしないが、フロイントのアジュバント、
水酸化アルミニウムのような無機質ゲルアジュバント、リゾレシチンのような界
面活性物質アジュバント、プルロニックポリオールアジュバント、ポリアニオン
アジュバント、ペプチドアジュバント、油性乳剤アジュバント、キーホールリン
ペットヘモシニアンアジュバント並びにジニトロフェノールアジュバントが含ま
れる。BCG(カルメット-ゲラン杆菌)及びコリネバクテリウム−パルヴム(C
orynebacterium parvum)は有用なヒトアジュバントである。
好ましくは、HTAPに対する特異的抗体を誘発するために用いられるペプチ
ドは、5個以上のアミノ酸、より好ましくは10個以上のアミノ酸からなるアミ
ノ酸配列を有し得る。また好ましくは、これらの配列は、自然タンパク質のアミ
ノ酸配列の一部と同一であり、小形の自然発生の分子の全アミノ酸配列を含んで
いてもよい。HTAPアミノ酸の短いストレッチを、キーホールリンペットヘモ
シアニン及びキメラ分子に対して産生された抗体のような他のタンパク質の配列
に融合してもよい。
HTAPのモノクローナル抗体は、培地内の連続株細胞によって抗体分子を産
生する任意の技術を用いて調製できる。このような技術には、以下のものに限定
はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV
−ハイブリドーマ技術(Koehler,G.等(1975)Nature 256:495-497;Kozbor,D.等(
1983)Immunol Today 4:72;Cote,
R.J.等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80:2026-2030;Cote,S.P.等(1985)Monoclonal Antibbodies and Cancer Therapy
,Alan R Liss Inc,pp77-96)が含まれる。
さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための「キメラ
抗体」の産生、即ちヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子の結合のために開発さ
れた技術が用いられる(Morrison,S.L.等(1984)Proc Natl Acad Sci 81:6851-68
55;Neuberger,M.S.等(1984)Nature 312:604-608;Takeda,S.等(1985)Natur
e 314:452-454)。別法として、一本鎖抗体の生成のための周知技術を適用して
、HTAP特異的一本鎖抗体を作り出すことができる。近縁な特異性を有するが
、イディオタイプの構成が異なる抗体は、無作為の免疫グロブリン組み合わせラ
イブラリーからの鎖再編成(chain shuming)により生成することができる(Bur
ton D.R.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88:11120-3)。
また抗体は、リンパ球集団でのin vivo産生を誘導することにより、或いは文
献(Orlandi等(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.86:3833-3837;Winter,G.等1991,Natu
re 349:293-299)に開示されているような高度に特異的な結合試薬のパネルや組
換え免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることによっても生成する
ことができる。
HTAPに対する特異結合部位を含む抗体フラグメントも生成することができ
る。このようなフラグメントには例えば、限定はしないが、抗体分子のペプシン
による消化で生成することができるF(ab’)2フラグメントや、F(ab’)2フラグメ
ントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるFabフラグメ
ントが含まれる。別法として、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグ
メントを迅速かつ容易に同定できるように、Fab発現ライブラリーを作製しても
よい(Huse,W.D.等(1989)Science 256:1275-1281)。
所望の特異性を有する抗体を同定するための選別のために種々のイムノアッセ
イを用いることができる。確立された特異性を有するモノクローナル抗体或いは
ポリクローナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射線測
定法の種々のプロトコルが当分野ではよく知られている。このようなイムノアッ
セイでは、HTAPとその特異的抗体との複合体の形成、並びに複合体形成の測
定が行われる。特定のHTAPタンパク質上の2つの互いに非干渉なエピトープ
に対して反応するモノクローナル抗体を用いる二部位モノクローナルベースイム
ノアッセイが好適であるが、競合的結合アッセイも用いられる(Maddox(1983),
前出)。
本発明の別の実施例では、HTAPをコードするポリヌクレオチド、またはそ
の任意の断片やアンチセンス配列を、治療目的で用いることができる。或る態様
では、このタンパク質の合成を阻害することが望ましいような状況において、H
TAPをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスを用いることができ
る。詳述すると、HTAPをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス
配列で細胞を形質転換することができる。従って、アンチセンス配列を用いて、
HTAP関連の組織損傷を予防したり、遺伝子機能の調節を達成することができ
る。このような技術は現在周知となっており、センス又はアンチセンスオリゴマ
ー、若しくはより大きな断片を、HTAPコーディング配列のコード領域や調節
領域の種々の位置から設計することができる。
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルスに由来
する発現ベクター、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、
標的の器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられ
る。当業者によく知られた方法を用いて、HTAPをコードする配列のアンチセ
ンスを発現する組換えベクターを作
り出すことができる。これらの技術はSambrook等(上記)及びAusubel等(上記)
に記載されている。
所望のHTAP断片を高レベルで発現する発現ベクターを細胞または組織にト
ランスフェクトすることにより、HTAPをコードする遺伝子の機能を停止させ
ることができる。このような作製物は、翻訳不可能なセンス配列或いはアンチセ
ンス配列で細胞に導入するために用いることができいる。このようなベクターは
、DNAへ組み込まれない場合ですら、全ての複製物が内在性ヌクレアーゼによ
り分解されるまで、RNA分子を転写し続ける。このような一過性の発現は、非
複製ベクターでも1ヶ月以上、適当な複製エレメントがベクター系の一部である
場合には更に長い期間継続し得る。
上述のように、HTAPをコードする配列の制御領域、即ちプロモータ、エン
ハンサ或いはイントロンに対するアンチセンス分子、DNA、RNAまたはPN
Aを設計することにより遺伝子発現を改変することができる。転写開始部位、例
えばリーダー配列の+10〜−10領域の間に由来するオリゴヌクレオチドが好
適である。また、転写産物がリボソームへの結合するのを防止することによりm
RNAの翻訳を阻止するアンチセンス分子も設計される。同様に、「三重らせん
」塩基対合法を用いて阻害を達成することができる。三重らせん対合は、二重ら
せんが十分にほどけないことでポリメラーゼ、転写因子、或いは調節分子が結合
できないようにする。三重らせんDNAを用いた最近の治療法は、文献(Gee,J.
E.等(1994)於Huber,B.E.及びB.I.Carr,Molecular and Immunologic Apporoache s
,Futura Publishing Co,Mt Kisco NY)に記載されている。
リボザイムはRNAの特異的切断を触媒することができる酵素性RNA分子で
ある。リボザイムの作用機序では、相補的標的RNAへのリボ
ザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションが行われ、その後エンドヌクレ
アーゼによる切断(endonucleolytic cleavage)がなされる。発明の範囲内には
、HTAPのエンドヌクレアーゼによる切断を特異的かつ効果的に触媒し得る人
工合成のハンマーヘッド型リボザイム分子も含まれている。
任意のRNA標的可能部分内の特異的なリボザイム切断部位を、初めに、配列
GUA、GUU並びにGUCが後続するリボザイム切断部位に対する標的分予を調べるこ
とによって同定する。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対
応する15〜20個のリボヌクレオチドの間の短いRNA配列を、そのオリゴヌ
クレオチドの機能を停止させる2次構造の特徴について評価することが可能とな
る。候補の標的部分の適切性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的
なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に対する接触性をアッセイすること
により評価することができる。
本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、RNA分子を合成するのための
当分野で周知の方法により調製することができる。これらの技術には、固相ホス
ホラミダイト(phosphoramidite)化学合成のようなオリゴヌクレオチドの化学
的合成技術が含まれる。この他、RNA分子を、HTAPをコードするDNA配
列のin vivo及びin vitro転写により生成することができる。このようなDNA
配列は、T7或いはSP6のような適切なRNAポリメラーゼプロモーターを有
する多種のベクターに組み込むことができる。更に別の方法として、構成的に或
いは誘導的にアンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA作成物を、株
細胞、細胞或いは組織内に導入することができる。
RNA分子は細胞内安定性を高め及び半減期を長くするために修飾することが
できる。可能な修飾には、限定はしないが、その分子の5’末
端か3’末端、或いはその両方へのフランキング配列の付加や、分子のバックボ
ーン内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート(phosph
orothioate)或いは2’O−メチルを使用することが含まれる。このコンセプト
は、PNA生成固有のものであり、内在性エンドヌクレアーゼにより容易に認識
されないアデニン、グアニン、シチジン、チミン、及びウリジンの、アセチル−
、メチル−、チオ−形態、及び類似の改変形態とともに、イノシン、キュエオシ
ン(queosine)、及びワイブトシン(Wybutosine)のような従来あまり用いられ
なかった塩基を含めることによって、これら全ての分子に拡張することができる
。
細胞或いは組織内にベクターを導入するための方法には、上述の方法が含まれ
、これらの方法は、in vivo、iv vitro、及びex vivoの使用に対しても同様に適
切なものである。exvivo治療法の場合には、患者から採取された幹細胞にベクタ
ーを導入し、自家移植用のクローンとして増殖して同じ患者に戻す方法がある。
またトランスフェクションによるデリバリー、リポソームによるデリバリーは、
当分野でよく知られている。
上述の治療法の任意のものは、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、及び最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む、任意の適切な被験体に適用す
ることができる。
更に別の実施例は、上述の治療効果のいずれかを発揮させるべく、薬学的に許
容される担体とともに医薬品組成物を投与することに関連する。このような医薬
品組成物は、HTAP、HTAPに対する抗体、HTAPの擬似物、アゴニスト
、アンタゴニスト、又はインヒビターからなるものであり得る。この医薬品組成
物は、単体で、或いは例えば安定剤のような1種以上の他の薬剤と組み合わせて
、任意の無菌の生体適合性製薬用担体に含めて投与される。このような担体には
、限定はしないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水が含まれる。こ
れらの分子
は、患者に対して、単体で、或いは他の薬品やホルモンと結合して、賦形剤或い
は製薬学的に許容される担体と混合される他の医薬品組成物に含めて投与され得
る。本発明の或る実施例では、製薬学的に許容される担体とは、製薬学的に不活
性なものである。
本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路には、以下の経路に限定されない
が、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下内投
与、心室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局
所投与、舌下投与、或いは直腸内投与が含まれ得る。
活性成分に加えて、これらの薬品組成物は、薬学的に用いられ得る調合物内へ
の活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び補助剤を含む適切な製薬学的に許容
される担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、“Remington's
Pharmaceutical Sciences”(Maack Publishing Co,Easton PA)の最新版において
見ることができる。
経口投与用の医薬品組成物は、当分野でよく知られる製薬学的に許容される担
体を用いて適切な剤形に製剤される。このような担体により、薬品組成物は、治
療を受ける患者による経口及び鼻腔摂取のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、液
体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液或いは類似の製剤として処方さ
れる。
経口投与するための製剤は、活性化合物と固形の賦形剤とを結合することによ
って得ることができるが、所望に応じて、必要なら適切な補助剤を添加した後、
得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、錠剤或いは糖衣剤核を得る
ことができる。適切な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール或いは
ソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク質充填剤、とうもろこし、
小麦、米、じゃがいも等からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース
或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、アラビア
ゴム或いはトラガカントのようなゴム、並びにゼラチン或いはコラーゲンのよう
なタンパク質である。必要ならば、架橋結合したポリビニルピロリドン、寒天、
アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸或いはアルギン酸ナトリウムや、その
塩のような、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられる。
糖衣剤核は、濃縮砂糖溶液のような適切な錠皮を与えられるが、溶液はアラビ
アゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤、ポリエチレングリ
コール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混
合物が含み得る。錠剤の識別のため、すなわち活性化合物の量、すなわち投与量
を特徴付けるために染料或いは色素が錠剤或いは糖衣錠皮に加えられてもよい。
経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル及びゼラ
チンからなる柔らかい、密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビ
トールのような錠皮を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはで
んぷんのような充填剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムの
ような潤滑剤、並びに付加的には安定剤と混合された活性処方組成物を含み得る
。柔らかいカプセルでは、活性化合物は、安定剤があるなしにかかわらず、脂肪
油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或
いは懸濁される。
非経口投与用の製剤は、水溶性の活性化合物の水溶液を含む。注射用として、
本発明の薬品組成物を水溶液、好適にはハンクの溶液、リンゲル溶液或いは生理
緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液に入れて製剤することができる。
水性の注入懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール
或いはデキストランのような懸濁
剤の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性成分の懸濁液は、適切な油性注入
懸濁剤として調製される。適切な親油性の溶媒或いは媒介物は、胡麻油のような
脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合成脂
肪酸エステルを含む。また懸濁剤は、所望に応じて、それにより溶解度を増加し
、非常に濃縮された溶液の調製ができるようになる適切な安定剤或いは薬剤を含
んでもよい。
局所的投与または経鼻粘膜投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な
浸透剤を用いて調合が行われる。このような浸透剤は、一般に周知である。
本発明の薬品組成物は周知の方法、例えば従来の混合処理、溶解処理、顆粒化
処理、糖衣形成処理、研和処理、乳化処理、封入処理(entrapping)処理或いは凍
結乾燥処理により製造される。
この医薬品組成物は塩類として提供されることもあり、限定はしないが、塩酸
、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む、多くの酸とともに
形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性或いはプロトニ
ック溶剤において、より可溶性が高くなる傾向がある。他の場合には、好適な製
剤は、1mM〜50mMのヒスチジン、0.1%〜2%のショ糖、使用前に緩衝
剤と結合させたpH範囲4.5〜5.5にある2%〜7%のマンニトールにおけ
る凍結乾燥粉末である。
製薬学的に許容される担体内に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調
製された後、適切な容器内に入れて、さらに提示した疾病状態の治療のためにラ
ベル付けすることができる。HTAPの投与の場合、このようなラベルには、投
与の量、頻度、方法が表示される。
本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、活性成分を所望の目的
を達成するための有効量含む組成物である。有効量の決定は、
当業者の能力の範囲内で十分行うことができる。
任意の化合物について、治療的有効量は、初めに、新生物細胞、或いは通常マ
ウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のアッセイか
ら推定される。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける有効量や投与経
路を決定することができる。
治療的有効量とは、症状や状態を改善するタンパク質、その抗体、アンタゴニ
スト、またはインヒビターの量である。そのような化合物の毒性及び治療的有効
性は、例えばLD50(個体群の50%の致死投与量)及びED50(個体群の
50%における治療的有効量、50%有効量)を決定するための、細胞培地或い
は実験動物における標準的な製薬学的方法により決定することができる。毒性と
治療有効性との間の投与量比は治療指数であり、LD50/ED50の比として
表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい。これらの細
胞培地のアッセイ及び付加的な動物研究から得られるデータは、ヒトへの使用に
対する投与量の範囲を決める際に用いることができる。そのような化合物の投与
量は、毒性がほとんど或いは全くなく、ED50を達成する循環濃度の範囲内に
あることが望ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並びに投与経路
に応じてこの範囲内で変化する。
正確な投与量は治療されるべき患者を考慮して個々の医師により選択される。
投与量及び投薬量は、十分なレベルの活性成分を与え、かつ所定の効果を維持す
るために調節される。考慮すべき付加的な要因は、疾患状態の重症度、または患
者の年齢、体重並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感
受性、並びに治療への耐性/反応を含む。長期的に作用する薬品組成物は3〜4
日毎に、1週間毎に、或いは半減期及び特定の処方のクリアランス速度に応じて
2週間に1度投与してもよい。
通常の投与量は0.1〜100,00μgの範囲にあって、全投与量は最大約
1gであり、投与経路に応じて変わってくる。特定の投与量或いは送達の方法に
関する手引きは、当分野の実施者が通常入手できる文献において見出すことがで
きる。当業者なれば、ヌクレオチドに対しては、タンパク質やインヒビター用の
剤形とは異なる剤形を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドの送達方式は、特定の細胞、状態、位置等によって決まってくる。
診断
別の実施例において、HTAPに特異的な抗体は、HTAPの発現を特徴とす
る状態や疾病の診断や、HTAPで治療を受けている患者のモニタリングのため
のアッセイにおいて役立つ。診断目的で有用な抗体は、上述の治療用のものと同
じように調製することができる。HTAPの診断的測定法には、ヒトの体液、細
胞或いは組織の抽出物においてHTAPを検出するために抗体或いは標識を利用
する方法が含まれる。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾したものでも、修
飾なしでも用いることができ、共有結合、或いは非共有結合かのいずれかでリポ
ーター分子と結合することにより標識することができる。種々のリポーター分子
が周知となっており、その幾つかについては上記した。
例えばELISA(酵素結合免疫測定法)、RIA(ラジオイムノアッセイ)並びにFA
CS(蛍光表示式細胞分取器法)を含む、HTAPを測定するための種々のプロト
コルが当分野では周知であり、これによってHTAP発現の変化や異常を診断す
るための基礎が得られる。HTAPの発現の正常値、つまり標準値は、哺乳類、
好ましくはヒトの正常被験者から得られる体液或いは細胞抽出物とHTAPに対
する抗体とを、複合体形成に適した条件の下で結合することによって得ることが
できる。標準の
複合体形成量は、種々の方法、好ましくは測光手段を用いることにより定量する
ことができる。被験者、対照標準、及び生検組織からの患部組織サンプルにおい
て発現されたHTAPの量を、標準値と比較する。標準値と被験者の値との偏差
で、疾病診断のパラメータが確立される。
本発明の別の実施例では、HTAPをコードするポリヌクレオチドを、診断目
的で用いることができる。使用できるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチ
ド配列、アンチセンスRNA及びDNA分子、及びペプチド核酸(PNA)が含
まれる。このポリヌクレオチドは、HTAPの発現が疾病と相関性を有する生検
組織における遺伝子発現を検出し、定量するために用いられる。診断的測定は、
HTAPが存在、不存在、及び過剰発現の何れの状態にあるかを区別したり、治
療的介入の際にHTAPレベルの調節をモニタリングするのに役立つ。
或る態様では、HTAPまたは近縁な分子をコードする、ゲノム配列を含むポ
リヌクレオチド配列を検出できるハイブリダイゼーションプローブ或いはPCR
プローブを用いて、HTAPをコードする核酸配列を同定することができる。そ
して、そのプローブの特異性、即ち、そのプローブが非常に高度な保存領域(例
えば5’調節領域における10個の独特のヌクレオチド)と、保存的である度合
いの低い領域(例えば特に3’領域におけるシステイン残基の間の領域)の何れ
に由来するのかということ、及びハイブリダイゼーション或いは増幅の(高い、
中程度の或いは低い)厳密性によって、そのプローブが自然発生HTAPのみを
同定するものであるか、或いはアレル配列や近縁な配列も同定するものであるか
ということが決まってくる。
プローブは、近縁なインヒビターをコードする配列を検出するためにも用いる
ことができ、好ましくは、これらのHTAPをコードする任意の配列から得られ
るヌクレオチドを少なくとも50%含むべきである。
本発明のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号:2のヌクレオチド配列
か、自然発生HTAPのイントロン、プロモータ、及びエンハンサーエレメント
を含むゲノムの配列に由来するものであり得る。
HTAPをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプロー
ブの作製のための他の手段には、HTAPやHTAP誘導体をコードする核酸配
列を、mRNAプローブ生成のためのベクターにクローン化する方法がある。こ
のようなベクターは周知で市販されており、適切なRNAポリメラーゼや適切な
放射性標識ヌクレオチドを付加することにより、in vitroでのRNAプローブを
合成のために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは種々のリ
ポータ分子により標識することができ、この標識には、32Pや35Sのような放射
性核種、アビジン/ビオチン結合系によりプローブに結合するアルカリホスファ
ターゼのような酵素標識等が含まれる。
HTAPをコードするポリヌクレオチド配列を、HTAPの発現が関係する疾
患の診断のために用いることができる。このような疾患の例には、以下に限定さ
れないが、例えば腺癌、黒色腫、肉腫、リンパ腫、及び白血病、より詳細には、
膀胱、骨、脳、***、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、傍
神経節、副甲状腺、陰茎、副腎、前立腺、精嚢、皮膚、胃、精巣、甲状腺、舌、
扁桃、尿管、及び子宮の癌のような細胞増殖の疾患;及びウイルス、細菌、真菌
、蠕虫又は原虫の感染症、外傷、又は例えば溶血性貧血、動脈硬化症、喘息、胆
汁性肝硬変、気管支炎、クローン病、嚢胞性線維症、皮膚炎、糖尿病、肺気腫、
腎炎、甲状腺機能冗進症、肺線維症、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、
重症筋無力症、骨粗鬆症、膵炎、リウマチ様関節炎、シェーグレン症候群、強皮
症、及び甲状腺炎のような免疫疾患によって発生する炎症の疾患が含まれる。H
TAPをコードするポリヌクレオチド配列は、HTA
P発現の変化を検出するための生検組織や体液を試験するための、サザンブロッ
ト法或いはノーザンブロット法、ドットブロット法或いは他の膜ベース技術、P
CR技術、ディップスティック試験法(試験紙法)、ピン或いはチップ技術及び
ELISAアッセイにおいて用いることができる。このような定性的或いは定量的試
験方法は当分野ではよく知られている。
特定の態様では、種々の癌、特に上述の癌の活性化または誘導を検出するアッ
セイにおいてHTAPをコードするヌクレオチド配列が役立ち得る。HTAPを
コードするヌクレオチド配列を標準的な方法で標識し、ハイブリダイゼーション
複合体の形成に適した条件の下で患者の体液や組織サンプルに加える。適切なイ
ンキュベーション時間の経過後、このサンプルを洗浄しシグナルを定量して、標
準値を比較する。生検サンプルまたは抽出サンプルにおけるシグナルの量が、比
較できる対照サンプルのシグナル量と有意に異なっている場合、このヌクレオチ
ド配列はサンプルのヌクレオチド配列とハイブリダイズしており、サンプルにお
けるHTAPをコードするヌクレオチド配列のレベルの変化が存在することは、
関連疾患の浮在を示している。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験、ま
たは個々の患者の治療のモニタリングにおける特定の治療措置の効果を評価する
ために用いることもできる。
HTAPの発現が関係する疾病の診断の基礎を得るために、正常な、或いは標
準の発現プロフィールを確立する。この標準プロフイールは、動物或いはヒト何
れかの正常な被験者から得られる体液或いは細胞抽出物を、ハイブリダイゼーシ
ョン或いは増幅に適切な条件下で、HTAPをコードする配列又はその一部分と
結合することにより確立される。標準のハイブリッド形成量は、既知の量の実質
的に精製されたHTAPが用いられる同一の実験で得られる値と、正常被験者に
対して得られる値
とを比較することにより定量することができる。正常なサンプルから得られた標
準値は、疾病の症状を示す患者からのサンプルから得られる値と比較することが
できる。標準値と被験者値との偏差を用いて疾病の存在を確認する。
ひとたび疾患が確認され、治療プロトコルが開始されると、患者での発現レベ
ルが正常な患者において観察されるレベルに近づき始めたか否かを評価するため
に、このようなアッセイが定期的に繰り返される。継続的なアッセイから得られ
る結果を用いて、数日間或いは数ヶ月の期間にわたる治療効果を知ることができ
る。
癌については、患者の生検組織において転写物が比較的少ない量存在すること
が疾病の発生の素因を示し、つまり実際の臨床的症状が現れる前に疾病を検出す
る手段となり得る。この型の一層確定的な診断により、医療従事者が予防的処置
を講じたり、より早期に積極的な治療を開始することが可能となり、疾病の発生
や更なる進行を予防することができるようになり得る。
HTAPをコードするオリゴヌクレオチドの別の診断目的の使用では、PCR
を使用することがある。このようなオリゴマーは一般には化学的に合成するが、
酵素を用いて作製したり、或いは組換え体を起源として作り出すこともできる。
オリゴマーは、特定の遺伝子或いは状態を識別するために最適な条件下で用いら
れる2つのヌクレオチド配列、即ちセンス方向(5’→3’)のヌクレオチド及
びアンチセンス方向(3’←5’)のヌクレオチドからなる。同一の2つのオリ
ゴマー、入れ子オリゴマーの組、或いはオリゴマーの縮重プールでさえ、近縁な
DNAまたはRNA配列の検出や定量のためのより厳密性の低い条件の下であっ
ても用いることができる。
さらにHTAPの発現を定量するための方法には、放射性標識
(radiolabeling)或いはビオチン標識ヌクレオチドの利用、コントロールの核
酸の同時増幅(coamplification)の利用、並びに実験結果を補完して引かれた
標準的なグラフ曲線の利用も含まれる(Melby PC等1993J Immunol Methods 159:
235-44;Duplaa C等1993 Anal Biochem 229-36)。多数のサンプルの定量は、EL
ISA形式の連続アッセイを実行することにより一層迅速に行うことができる。こ
のアッセイでは目的のオリゴマーが様々な希釈溶液中に存在し、分光光度計を用
いる分析或いは比色分析反応により迅速に定量することができる。
本発明の別の実施例では、HTAPをコードする核酸配列を用いて、自然発生
のゲノム配列マッピングのためのハイブリダイゼーションプローブを生成するこ
とができる。この配列を、よく知られた技術を用いて特定の染色体或いはその染
色体の特定領域に対してマッピングすることができる。このような技術には、FI
SH、FACSや人工染色体作製物の使用、例えば酵母菌人工染色体、細菌性人工染色
体の細菌性P1作製物、Price,C.M.(1993;Blood Rev 7:127-34)及びTrask,B.J
.(1991;Trends Ganet 7:149-54)に概要が示されている単染色体cDNAライ
ブラリーの使用が含まれる。
FISH(Verma等(1988)Human Chromosomes:A Manual of Basic Technique,Perga
mon Press,New York”に記載)は、他の染色体マッピング技術及び遺伝子地図
データと関係を有し得る。遺伝子地図データの例は、1994 Genome Issue of Sci
ence(265:1981f)に見ることができる。物理的染色体地図上でのHTAPをコー
ドする配列の位置と、特定の疾病(または特定の疾病の素因)との相関関係を助
けとして、ある遺伝病が関係するDNAの領域の限界決定ができる。本発明のヌ
クレオチド配列を用いて、正常者とキャリアまたは患者との遺伝子配列の違いを
検出することができる。
染色体調製物のin situハイブリダイゼーション及び確定された染色体マーカ
ーを用いる連鎖解析のような物理的地図作成技術は、遺伝子地図を延長するため
に大変重要である。多くの場合、特定のヒト染色体の数或いは腕が未知であって
も、マウスのような別の哺乳類種の染色体上の遺伝子配置から、関連するマーカ
ーがわかる。新しい配列は、物理的マッピングにより染色体のアーム、或いはそ
の一部へ割当てることができる。これは位置クローニング或いは他の遺伝子発見
技術を用いて疾患遺伝子を調査する研究者に貴重な情報を提供する。ひとたび毛
細血管拡張性運動失調(AT)のような疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域へ
、例えばATならば11q22-23(Gatti,R.A.等(1988)Nature 336:577-580)へ、遺伝子
連鎖によって粗い局所化がなされれば、その領域にマッピングされる任意の配列
は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは調節遺伝子ということになる
。本発明のヌクレオチド配列は、正常者とキャリアまたは患者との間の、転座、
逆位等による染色***置の違いを検出するために用いることもできる。
本発明の別の実施例では、HTAPや、その触媒作用性または免疫原性フラグ
メント或いはオリゴペプチドを、種々の薬物スクリーニング技術において治療用
化合物のスクリーニングのために用いることができる。そのような試験において
用いられるフラグメントは、溶液に遊離した形態か、固体支持体へ付着したもの
か、細胞表面へ付着したものか、或いは細胞内に存在するものであり得る。HT
APと試験される薬剤との結合複合体形成が測定され得る。
HTAPポリペプチドへの適切な結合親和性を有する化合物の高スループット
スクリーニングのために用いることができる別の薬物スクリーニング技術が、公
開されたPCT出願WO84/03564に詳細に記載されている。この方法をHTAPに適
用する場合には、多数の異なる小形ペプ
チドの試験用化合物を、プラスチックピン或いは他の表面のような固体基質上で
合成する。ポリペプチド試験用化合物をHTAP又はその断片と反応させ、洗浄
する。次いで結合HTAPを当分野で周知の方法により検出する。また、前述の
薬物スクリーニング技術において使用するために、精製HTAPをプレート上に
直接コーティングすることもできる。この他、ペプチドを捕捉し固体支持体上に
ペプチドを固定するために非中和抗体を用いることができる。
別の実施例では、HTAPに結合し得る中和抗体が、HTAPとの結合につい
て試験化合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイを使用する
ことができる。このように、抗体を用いて、1または2以上のHTAPと共通の
エピトープを有する任意のペプチドの存在を検出することができる。
更に別の実施例では、ここに開示するHTAPをコードするヌクレオチド配列
は、その新技術が、以下に限らないが、例えばトリプレット遺伝暗号及び特異的
塩基対合相互作用のような特性を含む、現在周知のヌクレオチド配列の特性に基
づく技術であれば、まだ開発されていない分子生物学的技術においても用いるこ
とができる。
以下に示す本発明の実施例は、単なる例示であって、本発明をこの実施例に限
定しようとするものではない。実施例
1 UTRSNOT02 cDNAライブラリーの作製
UTRSNOT02cDNAライブラリーを、年齢34歳の白人女性から膣式子宮摘出
術の際に切除された、顕微鏡検査で正常な子宮組織から作製した。病理報告では
、子宮又は子宮頚において診断上の異常は認められなかった。しかし、左卵巣組
織には、全て埋没した拡張型濾胞性嚢胞が
存在していた。また患者は腹部の痛みを訴えていた。患者の病歴には、月経困難
、***疼痛、痔疾の診断及びアルコール乱用が含まれていた。
冷凍組織を、Brinkmann Homogenizer Polytron PT-3000(Brinkmann Instrume
nts,Westbury,NJ)を用いて、グアニジウムイソチオシアネート溶液の中でホモ
ジナイズし溶解した。この溶解産物を、Beckman L81-70M超遠心分離機においてB
eckman SW28 rotor(Beckman Instruments)を用いて、5.7Mの塩化セシウムクッ
ションを通して、外界温度で18時間、25,0O0rpmで遠心分離した。pH4.7の酸性フ
ェノールを用いてRNAを抽出し、0.3Mの酢酸ナトリウム及び2.5倍量のエタノ
ールを用いて沈殿させ、無RNアーゼ水に再懸濁し、37℃でDNアーゼ処理した
。更に、抽出と沈殿を前回と同様に反復した。次にmRNAを、Qiagen Oligote
x kit(QIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA)を用いて単離し、cDNAライブラリの作製
に用いた。
このmRNAは、SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plas
mid Clorling(Cat.#18248-013,Gibco/BRL,Gaithersburg,MD)の推奨プロトコル
に従って取り扱った。cDNAはSepharose CL4Bカラム(Cat.#275105,Pharmaci
a)で分画化し、400bpを越えるcDNAをpSport 1にリゲートした。次にこのプ
ラスミドpSport 1をDH5aTMコンピテント細胞(Cat.#18258-012,Gibco/BRL)に入
れて形質転換させた。
2 cDNAクローンの単離及び配列決定
プラスミドDNAは細胞から放出され、REAL Prep 96 Plasmid Kit for Rapid
Extraction Alkaline Lysis Plasmid Minipreps(Catalog #26173,QIAGEN,Inc.
)を用いて精製した。このキットは、マルチチャネル試薬ディスペンサーを用い
て、96穴のブロックにおける96個のサンプルの同時精製が可能である。推奨プロ
トコルを用いたが、以下の点
を変更した。(1)25mg/Lのカルベニシリン及び0.4%のグリセロールと共に1mlの
滅菌Terrific Broth(Catalog#22711,Life Technologies)において細菌を培養
した。(2)植菌の後、培地を19時間インキュベートし、インキュベーションの
終わりに、細胞を0.3mlの溶解バッファに溶解した。(3)イソプロパノール沈
殿の後、プラスミドDNAペレットを0.1mlの蒸留水に再懸濁した。プロトコル
の最終ステップの後、サンプルを96穴ブロックに移し4℃で保管した。
このcDNAの配列決定は、Peltier Thermal Cyclers(PTC200 from MJ Rese
arch,Watertown,MA)及びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systemsと組
み合わせてHamilton Micro Lab 2200(Hamilton,Reno,NV)を用いてSangerらの
方法(1975,J.Mol.Biol.94:441f)により行い、読み枠を決定した。
3 cDNAクローン及びそれらの類推されるタンパク質の相同性検索
読み枠を決定した後、配列表のヌクレオチド配列及び、それらから類推される
アミノ酸配列を問い合わせ配列として用いて、例えばGenBank、SwissProt、BLOC
KS、及びPima IIのようなデータベースを検索した。これらのデータベースには
既に同定された配列が注釈付きで含められており、BLAST(Basic Local Alignmen
t Toolを表す)を用いて相同性(類似性)を有する領域をこのデータベースのな
かから検索した(Altschul S.F.(1993)J.Mol.Evol.36:290-300;Altschul.S.F.等
(1993)J.Mol.Biol.215:403-410)。
BLASTはヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを生成して配列
類似性を決定する。そのアライメントの局所性のために、BLASTは厳密な一致、
すなわち原核生物(細菌)や真核生物(動物、菌類、又は植物)を起源とするホ
モログを求める際に特に有効である。一次配列パターンや二次構造ギャップペナ
ルティを処理する際には、本
明細書に一体に引用されたSmith等(1992,Protein Engineering 5:35-51)に記載
のもののような他のアルゴリズムを用いることができる。本明細書に開示された
配列の長さは少なくとも49ヌクレオチドであり、不必要な塩基は12%以下である
(ここで、NはA、C、G、又はT以外と記録されたものである)。
BLAST法は、本明細書に一体に引用されたKarlin等(前出)に詳細に記載され
ているように、問い合わせ配列とデータベースの配列の一致を検索する。BLAST
は発見したあらゆる配列の一致の統計的有意性を評価して、ユーザが選択した有
意性の閾値を満たす一致のみを報告する。本出願での閾値は、ヌクレオチドで1
0-25、ペプチドで10-14に設定した。
4 ノーザン法による解析
ノーザン解析は、標識されたヌクレオチド配列と特定の細胞型または組織に由
来するRNAが結合したメンブランとのハイブリッド形成を伴う、遺伝子の転写
物の存在を検出するために用いられる実験技術である(Sambrook等、上述)。
BLAST(Altschul,S.F.1993及び1990,上述)を用いる類似のコンピュータ技術
で、GenBankまたはLIFESEQTMデータベース(Incyte,Palo Alto CA)のようなデ
ータベースにおける同一のまたは近縁な分子を検索した。この解析は、多くの膜
ベースのハイブリダイゼーションより非常に短時間で行うことができる。更に、
コンピュータ検索の感度を変更して、ある一致が正確な一致か、相同的であるか
の分類を決定することができる。
検索の基準値は、積スコアであり、これは以下の式で定義されるものである。
(配列の一致(%)×最大BLASTスコア(%))/100
この積スコアでは、2つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致の双方
が考慮されている。例えば、積スコアが40の場合は、一致は誤差が1〜2%の
範囲で正確であり、スコアが70の場合は正確に一致している。相同な分子は、
通常積スコアとして15〜40を示すものを選択することにより同定されるが、
スコアの低いものは近縁関係にある分子として同定される。
検索の結果は、完全長配列、又はその部分が存在するライブラリー、配列の存
在量(abundance)、及びパーセント存在量(percent abundance)のリストとし
て報告される。存在量は、特定の転写物の検出回数を直接反映し、パーセント存
在量は、存在量をライブラリー内で検出された配列の総数で除したものである。
5 HTAPをコードする配列の完全長又は調節エレメントを回復するまでの伸
長
完全長HTAPコード化核酸配列(配列番号:2)を用いて、部分的ヌクレオ
チド配列を完全長まで伸長させるための、或いはゲノムライブラリーから5’ま
たは3’配列を得るためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができ
る。一方のプライマーはアンチセンス方向(XLR)の延長を開始するために合成
され、他方のプライマーはセンス方向(XLF)に配列を延長するために合成さ
れる。これらのプライマーにより、周知のHTAP配列を「外側に」延長し、対
象の制御領域の新しい未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成できる
ようにな
Plymouth MN)、或いは他の適切なプログラムを用いて、長さが22〜30ヌク
レオチドで50%以上のGC含量を有し、かつ約68〜72℃の温度で標的配列
にアニールするように設計することができる。アピン構造及びプライマー−プラ
イマー二量体化を生じるような任意のヌクレ
オチドのストレッチの延長は回避される。
元の選択されたcDNAライブラリーか、ヒトゲノムライブラリーを用いて配
列を延長する。後者のライブラリーは、5’上流配列を得るために最も役立つ。
必要なら、既知領域をさらに延長するために追加のプライマーの組が設計される
。
XL-PCRキット(Perkin Elmer)の説明書の指示に従って、酵素と反応混合物と
を完全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られる。40pmolの各プラ
イマーと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始する場合
、PCRはPeltier Thermal Cycler(PTC200;MJ Reserch,Watertown MA)を用
いて、以下のパラメータで実行される。
ステップ1 94℃で1分間(初期変性)
ステップ2 65℃で1分間
ステップ3 68℃で6分間
ステップ4 94℃で15秒間
ステップ5 65℃で1分間
ステップ6 68℃で7分間
ステップ7 ステップ4〜6をさらに15サイクル反復
ステップ8 94℃で15秒間
ステップ9 65℃で1分間
ステップ10 68℃で7分15秒間
ステップ11 ステップ8〜10を12サイクル反復
ステップ12 72℃で8分間
ステップ13 4℃(その温度を保持)
反応混合物の5〜10μlのアリコットを、低濃度(約0.6〜0.8%)ア
ガロースミニゲル上での電気泳動で解析して、反応物が配列を
延長することに成功したか否かを決定する。最も大きな生成物或いはバンドを選
択して、ゲルから切り出した。さらなる精製には、QIAQuickTM(QIAGEN,Chatswo
rth CA)のような市販のゲル抽出法を用いる。DNA回収の後、クレノウ酵素を
用いて一本鎖ヌクレオチドの延び出しを切り取り、再結合及びクローニングを容
易にする平滑末端を作った。
エタノール沈殿の後、生成物を13μlのリゲーション緩衝液内に再溶解し、
1μlのT4−DNAリガーゼ(15単位)及び1μlのT4ポリヌクレオチド
キナーゼを加えて、その混合物を室温で2〜3時間、或いは16℃で一昼夜イン
キュベートする。コンピテントな大腸菌細胞(40μlの適切な溶媒内にある)
を、3μlのリゲーション混合物を用いて形質転換し、80μlのSOC培地(
Sembrook等、上記)で培養する。37℃で1時間のインキュベーションの後、全
ての形質転換混合物を、2xCarbを含むLuria Bertani(LB)寒天(Sembrook等、
上記)上にのせる。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択し
、適切な市販の無菌の96穴マイクロタイタープレートの個々のウェル内に入れ
られた150μlの液状LB/2xCarb培地で培養する。さらに後日、5μlの各一
昼夜の培養物を非無菌96穴プレート内に移し、水で1:10に希釈した後、そ
れぞれ5μlのサンプルをPCRアレイに移す。
PCR増幅のため、4単位のrTthDNAポリメラーゼを含む18μlの濃
縮PCR反応混合物(3.3x)、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い
られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以
下の条件に従って行う。
ステップ1 94℃で60秒間
ステップ2 94℃で20秒間
ステップ3 55℃で30秒間
ステップ4 72℃で90秒間
ステップ5 ステップ2〜4をさらに29サイクル反復
ステップ6 72℃で180秒間
ステップ7 4℃(そのまま保持)
PCR反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動
させる。PCR生成物のサイズを元の部分的なcDNAと比較して、適切なクロ
ーンを選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行う。
6 ハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
配列番号:2の配列に基づくハイブリダイゼーションプローブを用いて、cD
NA、mRNA並びにゲノムDNAをスクリーニングする。約20の塩基対から
なるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、大きなcDNAフラグメン
トの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、50pmolの各
オリゴマーと、250mCiの[γ-32P]アデノシン三リン酸(Amersham)及び
T4ポリヌクレオチドキる。標識されたオリゴヌクレオチドを、SephadexG-25超精細樹脂カラム(Pharma
cia)を用いて精製する。毎分107カウントのセンス及びアンチセンスオリゴヌ
クレオチドのそれぞれを含む部分を、エンドヌク
の1つを用いて切断したヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼ
ーション解析において用いる。
各消化物からのDNAを、0.7%アガロースゲル上で分画化して、ナイロン
膜(Nytran Plus,Schleicher & Schuell,Durham NH)にトランスファーする。ハ
イブリダイゼーションは40℃で16時間かけて行う。非特異的シグナルを取り
除くため、ブロットを、0.1xクエン酸
ナトリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸ナトリウムまで段階的に厳密性が増
す条件下で、室温にて順次洗浄する。XOMAT ARTMフィルム(Kodak,Rochester NY
)を、Phosphoimager cassette(Molecular Dynamics,Sunnyvale CA)において
ブロットに数時間露光した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較
する。
7 アンチセンス分子
HTAPをコードする配列のアンチセンス分子或いはその任意の一部分は、自
然発生の配列のin vivoまたはin vitro発現を阻害するために用られる。約20
塩基対からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用について特に記すが、よ
り大きなcDNAフラグメントの場合でも概ね同じ方法を用いることができる。
第1A図及び第1B図に示すようなHTAPをコードする配列に基づくオリゴヌ
クレオチド用いて、自然発生HTAPの発現を阻害することができる。相補的な
オリゴヌクレオチドを、第1A図及び第1B図に示す最も独特な5’配列から設
計し、これを用いてプロモーターが結合するのを阻害することにより転写を抑制
したり、リボソームが転写物に結合するのを阻害してHTAP転写物の翻訳を抑
制することができる。配列番号:2の5’配列の適切な部分を用いることにより
、効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが、第1A図及び第1B図に示すポ
リペプチドのシグナル配列または5’コーディング配列に翻訳される領域全体に
わたる15〜20個のヌクレオチドを含むようになる。
8 HTAPの発現
HTAPの発現は、cDNAを適切なベクター内にサブクローニングし、その
ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって行われる。この場合、
前にcDNAライブラリーの作製の際に用いたクローニング用のpSportベクター
を用いて、大腸菌においてHTAPを発現
させる。クローニング部位の上流には、β−ガラクトシダーゼに対するプロモー
タが存在し、その後ろにはアミノ基末端Met及びβ−ガラクトシダーゼの7残基
が存在する。後続のこれら8つの残基は、転写に役立つバクテリオファージプロ
モーターであり、多くの独特の切断部位を含むリンカーである。
単離されたトランスフェクト菌株を、IPTGを用いて標準的な方法で誘導し、初
めのβガラクトシダーゼの7残基、約5〜15残基のリンカー、及び完全長HT
APからなる融合タンパク質を作り出す。このシグナル配列は菌培地へのHTA
Pの分泌を誘導し、この培地は後の活性のアッセイにおいて直接用いることがで
きる。
9 HTAP活性の確認
配列番号:1の配列を含むベクターで形質転換した細胞系又は組織を、免疫ブ
ロットにより、HTAPの活性についてアッセイすることができる。βメルカプ
トエタノールの存在下で、SDSによって細胞を変性させ、エタノール沈殿によ
り核酸を取り除き、アセトン沈殿によってタンパク質を精製する。ペレットをpH
7.5の20mMのトリスバッファに再懸濁し、HTAPに特異的な抗体をプレコーテ
ィングしたProtein G-Sepharoseと共にインキュベートする。洗浄の後、Sepharo
seのビーズを電気泳動サンプルバッファにて煮沸し、溶出したタンパク質をSD
S−PAGEにかける。SDS−PAGEの結果は免疫ブロットのためにミクロ
セルロース膜にトランスファーし、一次抗体としてHTAPに特異的な抗体を、
二次抗体として一次抗体に特異的な125I標識した1gGを用いてブロットバン
ドを可視化し、定量することにより評価する。
10 HTAP特異的抗体の産生
標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化及び抗体の産生には、PAGE電
気泳動法(Sambrook前出)を用いて実質的に精製されたHT
APを用いる。配列番号:2から類推されるアミノ酸配列をDNAStarソフトウエ
ア(DNASTAR社)を用いて解析して免疫抗原性の高い領域を決定し、対応するオ
リゴペプチドを当業者には周知の手段により合成して、当業者に周知の方法で抗
体を産生するために用いる。C末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピ
トープのような、適切なエピトープを選択するための解析法は、Ausubel等(上
記)の論文他に記載されている。
通常、約15残基の長さを有するオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペ
プチド合成機Model 431Aを用いてfmoc法のケミストリにより合成し、M−マ
レイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS:Ausube
l等、上記)を用いた反応によりキーホールリンペットヘモシニアン(KLH、S
igma)に結合する。フロイントの完全アジュバントにおいてオリゴペプチド−K
LH複合体を用いてウサギを免疫する。得られた抗血清の抗ペプチド活性を検査
するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、1%BSAを用いてブロック
し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウ
サギIgGと反応させる。
11 特異的抗体を用いる自然発生HTAPの精製
自然発生HTAP或いは組換えHTAPは、HTAPに特異的な抗体を用いる
イムノアフィニティークロマトグラフィにより精製することができる。イムノア
フイニティーカラムは、CnBr-activated Sepharose(Pharmacia Biotech社)の
ような活性化クロマトグラフレジンとHTAP抗体とを共有結合させることによ
り構築される。結合後、そのレジンを使用説明書の指示に従って、ブロックし洗
浄する。
HTAPを含む培地をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをHT
APを優先的に吸着できる条件下で(例えば界面活性剤の存在
下において高イオン強度バッファで)洗浄する。このカラムを、抗体/HTAP
結合を切るような条件下(例えばpH2〜3のバッファ、或いは高濃度の尿素ま
たはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオン)で溶出させ、HTA
Pを回収する。
12 HTAPと相互作用する分子の同定
HTAP又は生物学的に活性なその断片を、125Iボルトンハンター試薬(Bol
tonら(1973)Biochem.J.133:529)で標識する。マルチウェルプレートに予め配列
しておいた候補の分子を、標識したHTAPとともにインキュベートし、洗浄し
て、標識HTAP複合体を有する任意のウェルをアッセイする。異なる濃度のH
TAPを用いて得られたデータを用いて、候補の分子とHTAPの会合、親和性
、数の数値を計算する。
上記のすべての刊行物及び特許明細書は、本明細書と一体に参照されたい。本
発明の記載した方法及びシステムの種々の改変は、本発明の範囲及び精神から逸
脱しないことは当業者には明らかであろう。本発明は特に好適な実施例に関連し
て記載されているが、本発明の請求の範囲は、そのような特定の実施例に不当に
制限されるべきではないことを理解されたい。実際には、本発明を実施するため
に記載された方法の種々の改変は、分子生物学或いは関連する分野の専門家には
明らかなように、請求の範囲内に含まれるものである。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61P 35/00 C07K 16/32
C07K 14/82 C12N 1/15
16/32 1/19
C12N 1/15 1/21
1/19 C12P 21/02 C
1/21 C12Q 1/68 A
5/10 C12N 15/00 ZNAA
C12P 21/02 5/00 A
C12Q 1/68 A61K 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,LS,M
W,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY
,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AT,AU
,BR,CA,CH,CN,DE,DK,ES,FI,
GB,IL,JP,KR,MX,NO,NZ,RU,S
E,SG,US