JP2001517066A - Homolog of human mouse RAB18 gene - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト下垂体において発現されるヒトのマウスＲＡＢ１８ホモログ（ＨＲＡＢ１８）を同定しコードするヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を提供する。本発明は、ＨＲＡＢ１８をコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス分子、ＨＲＡＢ１８をコードするヌクレオチド配列の検出のためのハイブリダイゼーションプローブまたはオリゴヌクレオチド、及びＨＲＡＢ１８をコードする核酸分子に基づく診断テスト方法も提供する。本発明は更に、ＨＲＡＢ１８の発現のための遺伝子工学的処理をなされた宿主細胞、生物学的に活性なＨＲＡＢ１８、ＨＲＡＢ１８に特異的に結合し得る抗体、及びＨＲＡＢ１８に結合し得る化合物の投与を含む治療方法を提供する。 (57) SUMMARY The present invention provides nucleotide and amino acid sequences that identify and encode a human mouse RAB18 homolog (HRAB18) expressed in the human pituitary. The invention also provides antisense molecules to the nucleotide sequence encoding HRAB18, hybridization probes or oligonucleotides for the detection of the nucleotide sequence encoding HRAB18, and diagnostic test methods based on the nucleic acid molecule encoding HRAB18. The invention further includes the administration of genetically engineered host cells for expression of HRAB18, biologically active HRAB18, antibodies capable of specifically binding to HRAB18, and compounds capable of binding to HRAB18. A method of treatment is provided.

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトのマウスＲＡＢ１８遺伝子のホモログ 技術分野 本発明は分子生物学の分野に属し、特に、本発明は、ヒトのマウスＲＡＢ１８ 遺伝子のホモログの核酸配列及びアミノ酸配列について記述したものである。 背景技術 ＲＡＢタンパク質はＧタンパク質のＲＡＳスーパーファミリーに属し、分子量 約２万〜３万の近縁関係にある低分子量のＧＴＰアーゼを概ね５０含むものであ る。低分子量Ｇタンパク質は、いくつかのタイプのエフェクタータンパク質と相 互作用し、特定の細胞反応のトリガーとなる。ＲＡＢタンパク質は細胞内膜輸送 、エキソサイトーシス、及びエンドサイトーシスの特定のレギュレータとしての 役目を果たし、小胞の出芽、ターゲティング及び融合を制御する。ＲＡＳタンパ ク質はセリン／スレオニンプロテインキナーゼのカスケードを活性化し、細胞成 長及び分化を調節する。ＲＨＯ及びＲＡＣタンパク質は細胞表面受容体からアク チン細胞骨格のシグナルの中継に関与する（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，３ｒｄ ｅｄ ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉ ｔｙ，ＮＹ（１９９４））。 Ｇタンパク質は２つの形態即ちエフェクタータンパク質を活性化しそ れと相互作用するＧＴＰ結合形態と不活性のＧＤＰ結合形態での平衡状態で存在 する。活性Ｇタンパク質と不活性Ｇタンパク質の分布は、Ｇタンパク質によるＧ ＤＰ放出またはＧＴＰ加水分解速度に影響を及ぼすある種の調節タンパク質によ って部分的に調節されるようである。例えば、グアニンヌクレオチド放出タンパ ク質（ＧＮＲＰ）は、結合ＧＤＰの放出を触媒する。次いでＧＴＰはヌクレオチ ド結合部位に結合し、かつＧタンパク質は活性化される。別の形態では、ＧＴＰ アーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）がＧＴＰの加水分解、及びそれと同時に起こ るＧＤＰ及びリン酸塩の生成速度を増加させる。ＧＤＰはＧタンパク質に結合し た状態のままで維持され、タンパク質を不活性化する。その他、Ｇタンパク質は ＧＤＰの放出を抑制するグアニンヌクレオチド解離抑制因子（ＧＤＩ）と相互作 用する（Ｂａｒａｎｇａｒ（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：１３ ６３７−４３）。 低分子量Ｇタンパク質についての情報の大半は、Ｈｅｓｋｅｔｈ Ｒ，Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｇ ｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ（１９９５）に記載のようにＲＡＳタンパク質の構造 及び機能の研究によって得られたものである。ＲＡＳスーパーファミリーの他の メンバーの活性に関して重要な構造的特徴については、分かっていることはごく わずかである。ＲＡＢタンパク質 現在までに、ほ乳類の細胞において３０以上のＲＡＢタンパク質が同定されて きており、これらのタンパク質は広い範囲の機能的特殊性を示す３５％から９５ ％の間の配列を共有することを特徴としている。通例、これらのタンパク質は特 定のオルガネラに局在化している。例えば、ＲＡＢ１は小胞体（ＥＲ）及びゴル ジ複合体に局在しており、ＲＡＢ２は移行型小胞体及びシスゴルジ網に局在して おり、ＲＡＢ３は分泌小胞に 局在しており、ＲＡＢ４は初期エンドソームに局在しており、ＲＡＢ５は初期エ ンドソーム及び原形質膜に局在しており、ＲＡＢ６は中間部及びトランス部ゴル ジ層板に局在しており、ＲＡＢ７は後期エンドソームに局在しており、ＲＡＢ９ は後期エンドソーム及びトランスゴルジ網に局在している（Ａｌｂｅｒｔｓ，ｓ ｕｐｒａ）。 更に、ＲＡＢタンパク質は特定の組織タイプに局在している。例えば、ＲＡＢ １７は個別のアピカル輸送経路、側底輸送経路、及び経細胞輸送性輸送経路を含 む上皮細胞において見いだされる。約７７〜８５％の相同性を有するＲＡＢ３の アイソフォームは、ニューロン、内分泌、及び外分泌細胞のような調節分泌経路 を含む細胞系譜に大部分が制限されているようである（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｖｏｎ Ｍｏｌｌａｒｄ（１９９４）Ｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：１０９７１− ７４）。ＲＡＢ１８はマウスの脳において高いレベルで発現され、脳下垂体にお いて中間的なレベルで発現され、肝臓において低いレベルで発現されることが分 かっている。このタンパク質は、分泌小胞リサイクリングにおいて一定の役割を 果たし得る（Ｙｕ Ｈ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｇｅｎｅ １３２−２７３−８ ）。 ＲＡＢ及びＲＡＳタンパク質の双方は、グアニンヌクレオチド結合に関与する か、ＧＴＰ結合及びＧＴＰ加水分解に関連するコンフォメーションの変化に関与 する保存領域を共有しているようである。ＧＴＰ結合部位に関連する特徴的構造 的モチーフは、第１モチーフＧＸ₄ＧＫ（Ｓ／Ｔ）を含み、これはＧＤＰまたは ＧＴＰのα及びβリン酸基と相互作用する。別のモチーフ、ＤＸＸＧも、γリン 酸基と相互作用しているようである。第３モチーフ、（Ｎ／Ｔ）（Ｋ／Ｑ）ＸＤ は、グアニンリングと相互作用する。強固に結合されたＭｇ₊は保存的スレオニ ン残基、及びＧＴＰのβ及びγリン酸基に配位される。更にこのＭｇ₊は、第１ モチーフのセリン／スレオニン残基、及び第３モチーフの不変アスパラギン酸と 相互作用する。コンフォメーションの変化について重要と思われるドメインには 、エフェクターＬ２ループ及びヘリックスａ２／ループ５（ａ２Ｌ５）が含まれ 、これらは特定のＧＥＰ及びＧＡＰとの相互作用に関与しているようである（Ｆ ｅｒｒｏ−Ｎｏｖｉｃｋ Ｓ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ｌ．９：５７５−９９）。 更に、脂質部分による翻訳後修飾はＲＡＢの膜局在化及び適当な活性にとって 重要である。この修飾はＲＡＢタンパク質のＣ末端において発生し、これにより ゲラニルゲラニル（ＧＧ）部分、２０−Ｃイソプレン単位が通常チオエーテル結 合を介して２つのシステイン残基の１つに結合する。多くのＲＡＢタンパク質は −ＸＸＣＣ（３５％）、−ＸＣＸＣ（３７％）、−ＣＣＸＸ（１５％）、−ＣＣ ＸＸＸ（８％）、−ＣＸＸＸ（５％）で終了するＣ末端を有している。ＲＡＢ３ Ａのようなある種のＲＡＢタンパク質で−ＸＣＸＣモチーフを有するものは、隣 接するシステイン残基のそれぞれがゲラニルゲラニル化されるようである（Ｆａ ｒｎｓｗｏｒｔｈ（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：１１９６３−７）。この修飾反応は、脂質部分を異なるＲＡＢモチーフ に転移させる１つのＲＡＢ特異的ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ＲＡＢ ＧＧＴアーゼ ＩＩ）が関与しているようである。ＲＡＢエスコートタンパク 質（ＲＥＰ）はタンパク質基質を結合し、次いでＲＡＢ ＧＧＴアーゼ ＩＩと の複合体を形成することによって脂質化反応に追加的に関与している。次いで、 このＧＧＴアーゼ ＩＩはゲラニルゲラニル部分をゲラニルゲラニルピロリン酸 からタンパク質基質に転移させる。 ＲＡＢタンパク質の細胞内区画間の膜輸送のレギュレータとしての作 用の形態は、良く分かっていない。可溶形態と膜結合形態との間のＲＡＢタンパ ク質の周期的な形態の変化及び小胞及び標的膜結合タンパク質との相互作用が提 案された。ＲＡＢタンパク質がＧＤＰ（即ち不活性形態）により結合されたとき 、ＲＡＢタンパク質はその脂質部分がタンパク質内部に隠されるようなコンフォ メーションで存在する。従って、このタンパク質は可溶形態のままであることに なる。ひとたび、ＲＡＢタンパク質がＧＮＲＰにより活性化されると、ＧＤＰは ＧＴＰと交換され、これによってタンパク質のコンフォメーションが変化し、脂 質部分が露出された状態となり、ＲＡＢが膜結合形態となる。 ヌクレオチド結合部位にＧＴＰを有する膜結合型ＲＡＢは、膜小胞が摘み取ら れて、ある種の小胞特異的タンパク質（ｖ−ＳＮＡＲＥ）の複合体に結合してい るところに局在している。ＲＡＢタンパク質は、ｖ−ＳＮＡＲＥが標的依存ＳＮ ＡＲＥ（ｔ−ＳＮＡＲＥ）と相互作用するとき、小胞が標的膜とドッキングする まで小胞表面に結合したままの状態でいる。このとき、ＲＡＢに結合しているＧ ＴＰは加水分解されてＧＤＰとなる。同時に、ＲＡＢはコンフォメーションを変 え、その脂質部分が露出されず、ＲＡＢが標的膜表面から放出されることになる 。従って、ＳＮＡＲＥ複合体はＲＡＢによる調節の最終的な標的として機能しう る（Ａｌｂｅｒｔｓ，ｓｕｐｒａ）。 発明の開示 本発明は、ヒトのマウスＲＡＢ１８ホモログ（本明細書においてはＨＲＡＢ１ ８と表現する）のポリヌクレオチド及びポリペプチドに関する。本発明は、ＨＲ ＡＢ１８アンチセンスＤＮＡ及びＨＲＡＢ１８をコードするポリヌクレオチドを 含む宿主細胞及び発現ベクターも提供する。 更に、本発明は、ＨＲＡＢ１８の産生方法、及び配列番号：２に示す配列を有 する生成ＨＲＡＢ１８ポリペプチドを提供する。 本発明は、ＨＲＡＢ１８の変質発現に関連する障害の検出、特に脳下垂体の障 害の検出のための診断テスト方法及び組成物にも関する。 ＨＲＡＢ１８に結合する化合物を同定するための複数の試験化合物のスクリー ニング方法も、そのＨＲＡＢ１８の変質発現に関連する障害の治療のための治療 的化合物としての使用と共に提案されている。 図面の簡単な説明 第１図は、インサイト社クローンＮｏ．１１２３５２において見いだされたＨ ＲＡＢ１８のヌクレオチド配列（配列番号：１）及び予測アミノ酸配列（配列番 号：２）を示した図である。 第２図は、ＨＲＡＢ１８のマウスＲＡＢ１８とのアミノ酸アライメントを示し た図である。ここに示されたアライメントは、ＤＮＡＳＴＡＲ ｓｏｆｔｗａｒ ｅのマルチシーケンスアライメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ，Ｍａ ｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて作成された。 第３図は、ＤＮＡＳＴＡＲの疎水性プログラムを用いて作成された、ＨＲＡＢ １８のアミノ酸配列の疎水性プロットを示した図である。 発明の実施の形態定義 本明細書において、“ヒトのマウスｒａｂ１８ホモログ”または“ＨＲＡＢ１ ８”なる用語は、配列番号：２に示すポリペプチドを意味する。ＨＲＡＢ１８を コードするポリヌクレオチド配列は、ヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリーにおいて 見いだされた。ＨＲＡＢ１８は低分子量Ｇタン パク質のＲＡＢサブファミリーのメンバーであり、分泌小胞体リサイクリングの 調節に関与し得る。ここに開示する一実施例において、ＨＲＡＢ１８は配列番号 ：１に示すポリヌクレオチドの４５番目のヌクレオチドに始まり６６４番目のヌ クレオチドで終了する配列によってコードされる。本発明は、配列番号：１に示 す上流及び下流の配列、即ち、配列番号：１における１番目から４４番目のヌク レオチド及び６６５番目から１１４８番目のヌクレオチドにも関連し、このヌク レオチド配列は、ｍＲＮＡ転写の安定性に影響し得る。ＨＲＡＢ１８は自然発生 のもの、組み替えにより賛成されたもの、若しくは化学的に合成されたものがあ り得る。また、本発明の範囲には、ＨＲＡＢ１８の活性フラグメントも含まれる 。本明細書において、“ｈｒａｂ１８”は、核酸配列を表し、“ＨＲＡＢ１８” はタンパク質、ペプチド、またはアミノ酸配列を表す。 本明細書において、“活性”なる用語は、自然発生ＨＲＡＢ１８の生物学的及 び／または免疫学的活性を保持しているＨＲＡＢ１８の形態を意味する。 本明細書において、“自然発生ＨＲＡＢ１８”なる用語は、生物工学的処理を 受けていないヒト細胞により産生されたＨＲＡＢ１８を意味し、より具体的には 、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipidation ）及びアシル化を含む翻訳後修飾されたポリペプチドから生成される様々なＨＲ ＡＢ１８の形態を表現する用語である。 本明細書において、“誘導体”なる用語は、ユビキチン化、ラベリング（例え ば放射性核種や、様々な酵素修飾による標識付け）、ペジレーション（ポリエチ レングリコールによる誘導体化）のような化学的修飾されたＨＲＡＢ１８、若し くは例えばオルニチンのような通常はヒトタンパク質において自然発生しないア ミノ酸の挿入（または化学合成による置換）によって得られるポリペプチドを意 味する。 本明細書において、“組換え変異体”なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて 生成されるアミノ酸の挿入、除去、及び／または置換により自然発生ＨＲＡＢ１ ８とは異なるものとなった任意のポリペプチドを意味する。酵素活性のような、 興味の対象となる活性を損なわずに置換、付加、あるいは除去され得るアミノ酸 残基を決定するためには、特定のＨＲＡＢ１８の配列と相同な分子の配列とを比 較し、相同性の高い領域でのアミノ酸配列の変化の数を最小にすればよい。 アミノ酸の“置換”では、例えばロイシンからイソロイシンまたはバリンへの 置換、アスピレートからグルタメートへの置換、スレオニンからセリンへの置換 、即ち保存的アミノ酸置換のような１個のアミノ酸が構造的及び／または化学的 特性がそれに類似した他の１個のアミノ酸で置換されるのが好ましい。アミノ酸 の“挿入”または“除去”は、通常１〜５個のアミノ酸の範囲で行われる。組換 えＤＮＡ技術を用いてＨＲＡＢ１８分子のアミノ酸の挿入、除去、または置換を 体系的に行い、得られた組換え変異体の活性を検定することにより、許容される 変異体が実験的に決定され得る。 必要ならば、ＨＲＡＢ１８ポリペプチドを細胞膜を通して移動せしめる“シグ ナル配列またはリーダー配列”を含むようにすることができる。当業者には理解 されようが、このような配列は、本発明のポリペプチド上に自然に存在するか、 あるいは組換えＤＮＡ技術により異種タンパク質源から得られる。 本明細書において、ポリペプチド“フラグメント（断片）”、“部分”、また は“セグメント”なる用語は、少なくとも約５個のアミノ酸、少なくとも約７個 のアミノ酸、または少なくとも約９〜１３個のアミノ酸からなり、別の実施例で は約１７個またはそれ以上のアミノ酸をからなるアミノ酸残基の伸展（ストレッ チ）を意味する。 本明細書において、“オリゴヌクレオチド”またはポリヌクレオチド“フラグメ ント”、“部分”、または“セグメント”なる用語は、ポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）法や、同一の若しくは近縁関係にあるｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子を増幅 、または単に明らかにするための当業者には周知の様々なハイブリッド形成法に おいて使用するのに十分な長さを有するヌクレオチド残基のストレッチを意味す る。 本発明は、天然または組換えポリペプチド源、即ちＨＲＡＢ１８をコードする 組換え核酸分子で形質転換された細胞から得られた精製ＨＲＡＢ１８ポリペプチ ドを含む。ＨＲＡＢ１８ポリペプチドを単離するための様々な方法は、当業者の 周知となっている。例えば、このようなポリペプチドの精製のために、本発明の 提供する抗体を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーを利用することが できる。タンパク質精製のための他の周知の方法は、例えば、“Ｄｅｕｔｓｃｈ ｅｒ Ｍ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １８２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ”及び“Ｓｃｏｐ ｅｓ Ｒ（１９８２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃ ｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ ＹＣ”に記載されており、これらの文献を本明細書と共に参照されたい。 本明細書において、“組換え体”なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製 される、ＨＲＡＢ１８をコードするポリヌクレオチドも意味する。ＨＲＡＢ１８ をコードするＤＮＡも対立形質の変異体または組換え変異体、及びその突然変異 体を含み得る。 本明細書において、“オリゴヌクレオチド”または“核酸プローブ”は、ＨＲ ＡＢ１８をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：２）に基づいて調製される。オ リゴヌクレオチドは、１０から６０ヌクレオチド、好 ましくは１５ヌクレオチドから６０ヌクレオチドのＤＮＡ配列の部分を含む。核 酸プローブは、約６ｋｂより少ない塩基対数の、通常は約１ｋｂ未満の配列の部 分からなり得る。本発明の一実施例においては、オリゴヌクレオチドプローブは 、従来より周知の分子と一致した部分や相補的な部分がごくわずかである、ＨＲ ＡＢ１８の部分と配列が一致した、または相補的な配列を含む。偽陽性を除去す るための適切な試験の後、これらのプローブをＣＡＬＲをコードするメッセンジ ャーＲＮＡが細胞または組織内に存在するか否かを判定したり、Ｗａｌｓｈ Ｐ Ｓ ｅｔ ａｌ（１９９２，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ １：２４１− ５０）に記載のように染色体ＤＮＡからの天然核酸配列に類似したものを単離す るために用いることができる。 プローブは、自然発生核酸、組換え一本鎖または二本鎖核酸から誘導されるか 、若しくは化学的に合成され得る。プローブの標識化は、ニックトランスレーシ ョン法、クレノウフィルイン反応法、ＰＣＲ法、または当分野において周知の他 の方法を用いて行われ得る。本発明のプローブを調製し、標識する方法は、“Ｓ ａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ”または“Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ（ １９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ”に詳しく述 べられており、これらの文献を本明細書と共に参照されたい。 別の形態として、ＨＲＡＢ１８をコードする組換え変異体は、当業者に周知の 技術を用いて、遺伝暗号の“重複性”を利用することにより合成、または選択さ れ得る。様々な切断部位を作り出すサイレント変化の ような、様々なコドン置換を導入することで、プラスミドやウィルスベクターへ のクローニング、または特定の原核細胞系または真核細胞系における発現を最適 化することができる。また、突然変異を導入することによって、それがＨＲＡＢ １８ポリペプチドまたはＨＲＡＢ１８ポリペプチドに付加された他のペプチドの ドメインにおいて反映され得ることになり、ポリペプチドの特質を修正したり、 リガンド結合親和力、鎖間親和力、または変性／ターンオーバー速度のような特 性を変えることもできる。 本発明は、その一つの実施形態において、インサイト１１２３５２において同 定された、ＨＲＡＢ１８、ヒトのマウスｒａｂ１８遺伝子のホモログをコードす るヌクレオチド配列を提供する。別の実施形態として、本発明は、天然または組 換えポリペプチド源から得られた精製ＨＲＡＢ１８ポリペプチドを提供する。ア ミノ酸配列は、配列番号：２に示されている。 本発明の一実施例は、ＨＲＡＢ１８をコードする自然発生ヌクレオチド配列と ハイブリッド形成し得るｈｒａｂ１８特異的核酸ハイブリダイゼーションプロー ブを提供するものである。更に、本発明の一実施例では、ＨＲＡＢ１８をコード する組換え核酸分子で形質転換された細胞、及びＨＲＡＢ１８に対する抗体が提 供される。 ＨＲＡＢ１８に対する抗体、及びポリヌクレオチド、ポリペプチドは、例えば エンドサイトーシスやエキソサイトーシスのような膜間輸送の調節の障害の検出 のための診断アッセイにおいて有用であり、また、分泌組織、特に神経組織や下 垂体組織の障害の検出のための診断的組成物として有用である。更に、これらの 診断用のツールは、組織損傷に関連する障害の診断において有用であり得る。 ＨＲＡＢ１８をコードするヌクレオチド配列は、分子生物学の分野に おける当業者には周知の技術において数多くの用途を有する。これらの技術には 、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、ＰＣＲ用オリゴマーの構築の ための使用、染色体及び遺伝子マッピングにおける使用、ＨＲＡＢ１８の組換え 体産生における使用、及びアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの、またはこれらの 化学的類似体等の生成における使用等が含まれる。但し、ここに開示するＨＲＡ Ｂ１８をコードするヌクレオチド配列の使用方法は既知の技術の一例に過ぎず、 当業者に周知の任意の技術における使用を制限しようとするものではない。更に 、未だ開発されていない分子生物学的技術であっても、それが例えばトリプレッ ト遺伝暗号及び特異的な塩基対相互作用のような既知のポリヌクレオチド配列の 特性に基づく技術である限り、ここに開示するヌクレオチド配列を、その分子生 物学的技術において使用することができる。 遺伝暗号の同義性（degeneracy）の結果、その一部に既知のヌクレオチド配列 及び自然発生遺伝子のヌクレオチド配列に対する最小限の相同性を有するヌクレ オチド配列を有するようなＨＲＡＢ１８をコードする多種のヌクレオチド配列が 生成され得るが、このことは当業者には理解されよう。本発明は、より具体的に は可能なコドン選択に基づいて組合せを選択することにより作られ得る全ての可 能なヌクレオチド配列をその範囲に含んでいる。これらの組合せは、自然発生Ｈ ＲＡＢ１８のヌクレオチド配列に対して適用されるような標準的なトリプレット 遺伝暗号に基づいて形成される。また、このような全ての変異体は、具体的にこ こで開示されたものと考えられたい。 ＨＲＡＢ１８及び／またはＨＲＡＢ１８変異体をコードするヌクレオチド配列 は、厳格な条件の下で自然発生ＨＲＡＢ１８遺伝子のヌクレオチド配列とハイブ リッド形成可能なものであるのが好ましいが、実質的に異なるコドン使用をプロ セシングしたＨＲＡＢ１８誘導体またはＨＲ ＡＢ１８をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。コド ン選択では、特定の原核細胞または真核細胞の発現宿主におけるペプチドの発現 速度を高めるように選択することができ、このときこの発現速度は、その宿主に おける特定のコドンの使用頻度に基づいて決まる。本発明のＨＲＡＢ１８及び／ またはＨＲＡＢ１８誘導体をコードするヌクレオチド配列を、このコードされた アミノ酸配列を変えることなく実質的に変える他の理由は、より望ましい特性、 例えば自然発生ヌクレオチド配列から形成されるものより長い半減期を有するＲ ＮＡ転写物を作り出すためである。 ＨＲＡＢ１８をコードするヌクレオチド配列を、完全に確立された組換えＤＮ Ａ技術（“Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．上述）を用いて、様々な他のヌ クレオチド配列と結合してもよい。ｈｒａｂ１８を結合するのに有用なヌクレオ チド配列には、例えば従来より周知のプラスミド、コスミド、λファージ誘導体 、ファージミド等の各種クローニングベクターが含まれる。興味の対象となるベ クターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及びシーク エンシングベクター等が含まれる。一般に、興味の対象となるベクターは、少な くとも１つの生物において複製起点機能を発揮する便利な制限エンドヌクレアー ゼ検知部位群、及び宿主細胞のための選択可能なマーカー群を含み得る。 本発明の別の実施例では、ＨＲＡＢ１８をコードする自然発生ヌクレオチド配 列とハイブリッド形成可能なｈｒａｂ１８特異的核酸ハイブリダイゼーションプ ローブが提供される。このようなプローブは、類似なＨＲＡＢ１８をコードする 配列を検出するのにも用いることができ、好ましくは、保存領域または活性部位 のヌクレオチドの少なくとも５０％を含む。本発明のハイブリダイゼーションプ ローブは、配列番号：１のヌクレオチド配列、または自然発生ｈｒａｂ１８のプ ロモータ、エンハ ンサー要素、及びイントロンを含むゲノムの配列に由来するものであり得る。ハ イブリダイゼーションプローブは、様々なリポーター群により標識され得るが、 このリポーター群には、³²Ｐまたは³⁵Ｓのような放射性核種、若しくはアルカリ ホスファターゼのような酵素標識が含まれ、これらはアビジン／ビオチン結合系 を介してプローブに結合する。この他当業者に周知の技術を用いてプローブを標 識することができる。 更に、本発明により、ＨＲＡＢ１８の翻訳において１つの役割を果たし得る上 流または下流の配列とハイブリッド形成可能な核酸ハイブリダイゼーションプロ ーブが提供される。このようなプローブは、ポリペプチド翻訳のための類似な調 節配列を検出するためにも用いられ得る。 米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１９５号及び第４，９６５ ，１８８号明細書に記載されているようなＰＣＲ法の実施において、ＨＲＡＢ１ ８をコードするヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドの別の使用方法が ある。このようなＰＣＲで使用されるプローブは、組換えにより得られたもので あるか、化学的に合成されたものであるか、若しくは両者の混合であり得、また 、診断的な使用に供される個別のヌクレオチドまたは近縁関係にあるゲノム配列 の同定に用いられる可能な縮重配列のプール（degenerate pool）を含み得る。 完全長遺伝子は、長いＤＮＡを増幅するためのＸＬ−ＰＣＲ（Ｐｅｒｋｉｎ− Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いた新規な方法を用いて既知 の配列からクローニングされる。この方法の開発によって、一人の研究者が一度 に多数の遺伝子（最大２０以上）を処理し、６〜１０日以内に延長された配列（ 場合によっては完全長配列）を得ることが可能となった。この方法はライブラリ ーのスクリーニングをするために標識されたプローブを使用し、一人の研究者が １４〜４０日で約３〜５個の遺伝子しか処理できない現在の方法に取って代わる もの である。 第１ステップは約２日間で実行され得るものであるが、ここでは既知の部分的 配列に基づいてプライマーがデザインされ合成される。ステップ２は約６〜８時 間かかるものであるが、ここでは選択されたライブラリーのＰＣＲ増幅により配 列が延長される。ステップ３及び４は約１日かかるものであるが、ここでは増幅 されたｃＤＮＡの生成及び適切なベクターへのそのｃＤＮＡのディゲーションが 行われる。ステップ５は約１日かかるものであるが、ここでは宿主細菌の形質転 換と増殖が行われる。ステップ６は約５時間かかるものであるが、ここではＰＣ Ｒ法を用いて細菌のクローンから延長された配列をスクリーニングする。最終ス テップは約１日かかるものであり、ここでは選択されたクローンの調製及びシー クエンシングが行われる。完全長ｃＤＮＡが得られなかった場合は、元のライブ ラリーまたは他の好適なライブラリーを用いて全行程が反復される。 好適なライブラリーは、大きいｃＤＮＡしか含まないように、あるいはＧｉｂ ｃｏ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）から購入された肺、肝臓、心 臓、及び脳のような市販のライブラリーの単体またはそれを組み合わせたものか らなり得るようにサイズ選択されたものであり得る。ｃＤＮＡライブラリーはオ リゴｄＴまたはランダムプライマーと共に調製された。ランダムプライミングさ れたライブラリーを用いることの利点は、遺伝子の５’末端を含む配列を一般に より多く含むことができるという点である。ランダムにプライミングされたライ ブラリーは、オリゴｄＴライブラリーが完全な遺伝子を生み出さない場合に特に 有用であり得る。また、タンパク質が大きくなるほど、１つのプラスミドにおい て完全な遺伝子が見いだされる可能性が低くなることは明らかである。 ｈｒａｂ１８ＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブを作り 出すための他の方法には、ｍＲＮＡプローブの形成のためのベクターへの、ＨＲ ＡＢ１８及びＨＲＡＢ１８誘導体をコードする核酸配列のクローニングが含まれ る。このようなベクターは従来より周知であって市販されており、例えばＴ７ま たはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのような適当なＲＮＡポリメラーゼ及び適当な 放射性標識をなされたヌクレオチドを添加することによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＲ ＮＡプローブを合成するのに使用することができる。 現在は、完全に化学合成によりＨＲＡＢ１８及びＨＲＡＢ１８誘導体をコード するＤＮＡ配列、またはその一部分を生成することが可能であり、それを後で従 来より周知の試薬、ベクター、及び細胞を用いて様々な市販のＤＮＡベクターに 挿入することができる。更に、化学合成を用いて、ｈｒａｂ１８ポリヌクレオチ ド配列若しくはその一部分に突然変異を起こさせることも可能である。ＨＲＡＢ １８をコードする核酸のヌクレオチド配列は、ＤＮＡシークエンシング技術によ って確認されうる。 ＤＮＡ配列決定の方法は、従来より周知である。従来の酵素を用いる方法では 、ＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメント、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（登録商標） （ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）また はＴａｑポリメラーゼを用いて、興味の対象のＤＮＡ鋳型にアニーリングされた オリゴヌクレオチドプライマーからＤＮＡ鎖を延長する。この方法は、一本鎖及 び二本鎖の双方の鋳型を用いるのに開発されたものである。チェーンターミネー ション反応の生成物は、通常ユリアアクリルアミドゲル上で電気泳動処理され、 オートラジオグラフィ（放射性核種で標識された前駆体の検出）、または蛍光体 （蛍光体で標識化された前駆体の検出）の何れかにより検出される。機械を用い た反応調製、蛍光体検出を利用した分析及び配列決定の 技術の近年の進歩により、１日当たりに決定され得る配列数は増加した（ここで は、例えばＣａｔａｌｙｓｔ ８００及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３７７または３７３ＤＮＡシーケンサのような機械を用いる）。別の形態では 、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅ ｎｏ ＮＶ）、を４台のＰｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴ Ｃ２００；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びｔｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７及び３７３ ＤＮＡ ｓｅｑｕ ｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍとともに用いてｃＤＮＡインサートの配列決定が行 われる。 このヌクレオチド配列を用いて、ＨＲＡＢ１８の変質発現に関連する障害の検 出のためのアッセイを構築することができる。このヌクレオチド配列は、従来よ り周知の方法で標識した上で、ハイブリッド形成条件の下で患者の体液または組 織の試料に添加することができる。インキュベーション時間の経過後、ヌクレオ チドが酵素で標識されていた場合には、所望に応じて染料（または他の展開剤を 必要とする標識）を含有する適合性の液体で試料が洗浄される。この適合性の液 体を洗い流した後、染料を定量し、標準値と比較する。染料の量が著しく多い場 合には、このヌクレオチド配列は試料とハイブリッド形成したことになり、この アッセイにより膜輸送の障害の存在が確認されたことになる。 ｈｒａｂ１８のヌクレオチド配列を用いて、その遺伝子のマッピングのための ハイブリダイゼーションプローブを構築することができる。ここに開示するヌク レオチド配列の染色体及び染色体の特定の領域へのマッピングを、周知の遺伝子 及び／または染色体マッピング技術を用いて行うこともできる。このような技術 には、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する リンケージ分析、既知の染 色体に対して特異的なライブラリまたはフローソートされた染色体調合物を用い たハイブリダイゼーションスクリーニング、または人工染色体合成物ＹＡＣまた はＰ１合成物が含まれる。染色体延展（chromosome spread）の蛍光ｉｎ ｓｉ ｔｕハイブリダイゼーション技術については、他の文献、即ち“Ｖｅｒｍａ ｅ ｔ ａｌ（１９８８）Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹＣ”に記載されている。 染色体調合物の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び他の物理的染 色体マッピング技術は、追加的な遺伝子地図データと関連付けられ得る。遺伝子 地図データの例としては、“１９９４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｓｃ ｉｅｎｃｅ（２６５：１９８１ｆ）”がある。物理的染色体地図上でのｈｒａｂ １８の位置と特定の疾病（若しくは特定の疾病に対する素因）との間の相関関係 は、この遺伝病に関連するＤＮＡの領域の範囲を特定するための助けとなる。本 発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者の遺伝子配列と、キャリアまたは遺伝 病の保因者の遺伝子配列との相違を検出することができる。 ＨＲＡＢ１８をコードするヌクレオチド配列を用いて、周知の組換えＤＮＡ技 術を利用して精製ＨＲＡＢ１８を作り出すことができる。遺伝子を単離した後、 その遺伝子を発現させる方法を記した文献は数多くあるが、その例としてはＧｏ ｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １８５，Ａｃａ ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡがある。精製ステップは生 成プロセスや作り出される特定のタンパク質によって異なる。ＨＲＡＢポリペプ チドの単離のための様々な方法は、周知の手順によって実行され得 るが、その手順は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ Ｍ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １８２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓ ａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ及びＳｃｏｐｅｓ Ｒ（１９８２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｑ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙに記載されてお り、これらを本明細書と共に参照されたい。 ＨＲＡＢ１８は、原核細胞または真核細胞の何れかの様々な宿主細胞内におい て発現され得る。宿主細胞は、ｈｒａｂ１８ヌクレオチド配列が内生である種と 同一の種、あるいは異なる種の何れからでも得ることができる。組換えＤＮＡ技 術によってＨＲＡＢ１８を産生することの利点には、精製用として高濃度に濃縮 されたタンパク質源が得られること、及び精製のための簡単な手順が利用できる ようになることがある。 ＨＲＡＢ１８をコードするＤＮＡによって形質転換された細胞は、ＨＲＡＢ１ ８の発現及び細胞培地からのタンパク質の回収に適切な条件の下で培養され得る 。組換え細胞により産生されたＨＲＡＢ１８は、使用される特定の遺伝子構造に 応じて、分泌されるか、あるいは細胞内に保持され得る。一般に、組換えタンパ ク質は、分泌される形態で準備しておくのがより便利である。 組換え体の産生に加えて、固相技術を用いた直接のペプチド合成によりＨＲＡ Ｂ１８フラグメントを産生することもできる。（“Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ （１９６９）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅ ｌｄ Ｒ（１９６３）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９−２１５４ ”参照）。ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成は、手作業、あるいは機械により自 動 的に行うことができる。自動的な合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造業者の指示に従って用いることによ り行うことができる。ＨＲＡＢ１８の様々なフラグメントを個別に化学合成し、 化学的な方法により結合することによって完全長分子を産生することもできる。 抗体の誘発において使用するためのＨＲＡＢ１８は、生物学的活性を有してい る必要はないが、そのタンパク質は抗原性でなければならない。ＨＲＡＢ１８特 異的抗体の誘発のために使用するペプチドは、少なくとも５個、好ましくは少な くとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むものでありうる。このペプ チドは、タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であるはずで、ＨＲＡＢ１８の ような小型の自然発生分子の全アミノ酸配列を含んでいてもよい。ＨＲＡＢ１８ のアミノ酸配列の短いストレッチは、ヒザラガイヘモシアニン（ＫＬＨ，Ｓｉｇ ｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）や抗体産生に使用されるキメラ分子のような他 のタンパク質のストレッチと融合され得る。 ＨＲＡＢ１８に対して特異的な抗体は、ポリペプチドまたは抗体フラグメント を適切な動物に接種することによって産生され得る。抗体は、それがポリペプチ ドのエピトープに対して産生され、かつ天然または組換えタンパク質の少なくと も一部に結合する場合にＨＲＡＢ１８に対して特異的である。抗体産生の方法は 、動物に注射をすることにより免疫反応を刺激することのみならず、組換え免疫 グロブリンライブラリーのスクリーニング（Ｏｒｌａｎｄｉ Ｒ ｅｔ ａｌ（ １９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３−３ ８３７，ｏｒ Ｈｕｓｅ ＷＤ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５ ６：１２７５−１２８１）または白血球集団のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激のような抗体や他の特異的結合分子の合成による産生のための類 似した手順も含まれる。現在の技術（Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅ ｉｎ Ｃ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９）により、抗体形 成の原理に基づく多数の高度に特異的に結合する試薬が提供されている。これら の技術は、ＨＲＡＢ１８に特異的に結合する分子の産生に適用され得る。 本発明は、天然または組換え源、即ちＨＲＡＢ１８をコードする組換え核酸分 子で形質転換された細胞から選べた精製ＨＲＡＢ１８ポリペプチドを含む。ＨＲ ＡＢ１８ポリペプチドを単離するための様々な方法が周知の手順により達成され 得る。例えば、このようなポリペプチドを、本発明による抗体を用いてイムノア フィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。従来より周知の タンパク質精製のための他の様々な方法としては、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ Ｍ（１ ９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １８２，Ａｃ ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ及びＳｃｏｐｅｓ Ｒ（ １９８２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｑ，Ｎｅｗ Ｙｏ ｒｋ Ｃｉｔｙが含まれ、これらを本明細書と共に参照されたい。 ＨＲＡＢ１８の以上発現に関連する、下垂体の特異的受容体の発現やホルモン分 泌の調節のために使用され得る薬物のスクリーニングやデザインのためにＨＲＡ Ｂ１８を使用することができる。別の形態として、ＨＲＡＢ１８そのものを特異 的受容体の発現の調節または過剰ホルモン分泌の制御のために用いることもでき る。更に、ＨＲＡＢ１８は、他の神経組織、特に分泌経路がその機能について重 要な役割を果たすような部位において類似した機能を発揮し得る。 生理活性薬剤または組成物としてのＨＲＡＢ１８は、最大許容投与量を決めるた めの哺乳類での臨床研究及び安全投与量を決定するための通常の人体での臨床研 究を含むいくつかの方法論の何れかにより決定された適切な治療的投与量だけ投 与され得る。更に、この生理活性薬剤は、安定性または半減期のような薬理学的 な特性を強化する様々な十分に確立された化合物または組成物と合成され得る。 また、この治療的生理活性組成物が、静脈注射による血流への供給か、若しくは ＲＡＢタンパク質の変質発現や活性に関連する状態の治療に用いられ得る他の効 果的な手段によって投与されることも企図されている。 以下の実施例は、本発明を例示するために提供されている。これらの実施例は 、例示を意図するものであり、本発明の限定を意図するものではない。 産業的応用性 １．ｍＲＮＡの単離及びｃＤＮＡライブラリーの構築 インサイト社クローンＮｏ．１１２３５２は、年齢１６歳から７０歳の白人男 性及び女性の脳に由来する通常のヒト脳下垂体の２１個のプールされたサンプル から構築されたヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリーの配列の中から同定された。ポ リＡ＋ＲＮＡは、ビオチニル化オリゴｄ（Ｔ）プラィマー及び常磁性粒子（ｐｒ ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）ストレプトアビジンを用いて単 離され、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に送られた。 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社は、オリゴｄ（Ｔ）プライミングを用いてｃＤＮＡラ イブラリーを調製した。合成アダプターオリゴヌクレオチドがｃＤＮＡ分子にリ ゲートされ、Ｕｎｉ−Ｚａｐ（商標）ベクターシステ ムへの挿入が可能となるようにされた。このシステムにより高い効率の一方向性 （センス方向）のλライブラリー構築が可能となり、ｃＤＮＡが挿入されたクロ ーンを検出するのに青／白色選択を備えたファージミドシステムを使用できると いう利点が得られた。 ｃＤＮＡライブラリーの品質は、ＤＮＡプローブでスクリーニングされ、次い でｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が切除された 。このファージミドにより重合タンパク質の発現、一方向性の欠失の生成、部位 特異的突然変異誘発、インサートの特徴付け、及び配列決定を容易にするための プラスミドシステムの使用が可能となる。続いてカスタムメイドのライブラリー ファージ粒子が、Ｅ．Ｃｏｌｉ宿主株ＸＬ１ Ｂｌｕｅ（登録商標）（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ）に感染させられた。この菌株は高度な形質転換効率を有する。こ の高い効率によりｃＤＮＡライブラリーにおける頻度の少ない、過小表現型の（ under-represented）クローンを得る確率が高められる。別の一方向性ベクター にはｐｃＤＮＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）及びｐ ＳＨｌｏｘ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）が含まれるが、これ らに限定されない。 ２．ｃＤＮＡクローンの単離 個々のｃＤＮＡクローンのファージミド形態は、ｉｎ ｖｉｖｏ切除プロセス により得られた。このプロセスでは、ＸＬＩ−ＢＬＵＥ（登録商標）が、ｆ１ヘ ルパーファージと共感染された。ラムダファージ及びｆ１ヘルパーファージの双 方から誘導されたタンパク質は、ラムダ標的ＤＮＡ上の定められた配列から新た なＤＮＡ合成を開始し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド及びｃ ＤＮＡ挿入断片の全てのＤＮＡ配列を含む小型の１本鎖環状ファージミドＤＮＡ 分子を作り出す。このファージミドＤＮＡは、細胞から放出され、精製されて、 次いで新 鮮な細菌性宿主細胞（ＳＯＬＲ）に再感染するのに使用されて、二重鎖のファー ジミドＤＮＡが産生された。ファージミドがβ−ラクタマーゼに対する遺伝子を 保有していることから、新たに形質転換された細菌がアンピシリンを含む培地上 で選択された。 ファージミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＤＮＡ精製システムからの ＱＩＡＷＥＬＬ−８プラスミド精製システム（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ，Ｃｈａｔ ｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）を用いて精製された。この技術は、細菌細胞を溶解し、高 度に精製されたファージミドＤＮＡを単離するための高速で信頼性が高く高スル ープットの方法である。精製樹脂から溶離されたこのＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定 及び他の分析操作に適したものである。 ファージミドを精製する別の方法が最近利用できるようになった。この方法で は、ミニプレップキット（Miniprep Kit）（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．７７４６８ ：Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ． Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）を使用する。このキットは９６穴の形態で、 ９６０個の精製のために十分な試薬を提供するものである。推奨プロトコルを採 用したが、以下の点を変更した。第１に、９６穴のそれぞれが、２５ｍｇ／ｌの カルベニシンと０．４％のグリセリンを含む滅菌液体培地１ｍｌで満たされる。 細菌が穴の中に接種され、２４時間培養されて、溶解緩衝液の６０μｌに溶解さ れる。このブロックは遠心分離処理（２９００ｒｐｍで５分間）され、次いでこ のブロックの内容分（contents）が第１フィルタプレートに加えられる。所望に 応じて加えられるステップであるＴＲＩＳ緩衝液にイソプロパノールを添加する ステップは、定例的には実行されない。プロトコルにある最終ステップの後、試 料は保存のためＢｅｃｋｍａｎ９６穴ブロックに送られる。 ３．ｃＤＮＡクローンの配列決定 これらの視床下部ライブラリからランダム単離されたｃＤＮＡ挿入断片は、Ｈ ａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ ＮＶ）、を４台のＰｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ２ ００；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びｔｈｅ Ａｐ ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７及び３７３ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎ ｃｅｒｓとともに用いて、Ｓａｎｇｅｒ Ｆ．ａｎｄ ＡＲ Ｃｏｕｌｓｏｎ（ １９７５；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９４：４４１ｆ）の方法で配列決定され、読 み枠が決定された。 ４．ｃＤＮＡクローン及び演繹されたタンパク質の相同性検索 このようにして得られた各配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社 製の検索アルゴリズムを、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍに組み込んで用いて、ＧｅｎＢａｎｋの配列と 比較された。このアルゴリズムでは、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉ ｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ（ＴＲＷ Ｉｎｃ．，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ ＣＡ） を用いて、相同性領域を決定した。配列比較をどのように行うかを定める３つの パラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセット、及び誤差許容度であ った。これら３つのパラメータの組合せを用いて、興味の対象である配列に対し て相同性を有する領域を含む配列を、ＤＮＡデータベースから検索し、適当な配 列に対して初期値と共にスコアが付けられた。続いて、これらの相同領域を、ド ットマトリクス相同性プロット法を用いて検定し、偶然の一致と真の相同領域と を区別した。相同性検索の結果を表示するためにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ アライメントを用いた。 ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６ ７０ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ＤＮＡ配 列の相同性の検査に類似した方法で確認された。Ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｐｅｃｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ及びパラメータウィンドウを用いて、相同性 領域を含むタンパク質配列のデータベースを検索し、相同性領域は初期値と共に スコアを付けられて表示された。ドットマトリクス相同性プロット法により検定 を行い、有意な相同性領域を偶然の一致と区別した。 別の形態として、ＢＬＡＳＴ（ベーシック局部的一致検索ツール）（“Ｂａｓ ｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（Ａｌｔｓｃ ｈｕｌ ＳＦ（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００，Ａｌ ｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５： ４０３−１０）”参照）を用いて、局部的な配列の一致を検索した。ＢＬＡＳＴ は、ヌクレオチド及びアミノ酸配列双方のアライメントを検出して、配列の類似 性を決定する。アライメントが局部的であることから、ＢＬＡＳＴは、正確な一 致の決定、または相同性検索に特に有用である。一致はギャップを含まないのが 理想であるが、モチーフスタイルの検索は適切ではない。ＢＬＡＳＴアルゴリズ ム出力の基本単位は、Ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｐａｉｒ（ ＨＳＰ）である。 ＨＳＰは、アライメントが局部的に最大となる部分の長さが等しく、アライメ ントスコアがユーザがセットしたカットオフスコアまたは閾値スコア以上である ような２つの配列フラグメントからなる。ＢＬＡＳＴを用いる方法により、興味 の対象となる配列と、データベース配列とのＨＳＰを捜し、発見された一致の統 計的優位性を評価し、ユーザが選択した優位性の閾値を超える一致のみを知るこ とができる。パラメータＥは、データベース配列との一致で報告されるものを選 択するための、統 計的優位性の閾値を設定するパラメータである。Ｅは、データベース検索全体の 文脈の中で、ＨＳＰ（若しくはＨＳＰの組）の偶然の一致の予定頻度の上限と解 釈される。Ｅを満たすデータベース配列は、プログラムの出力において報告され る。 ヒトのマウスＲＡＢ１８のホモログＨＲＡＢ１８の全コード領域（配列番号： １に含まれる）のヌクレオチド配列は、第１図に示されている。 ＢＬＡＳＴを用いた検索の結果、マウスｒａｂ１８遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ Ｘ８０３３３ ａｎｄ Ｌ０４９６６） との比較を行ったとき本発明のクローンのコード配列はＥパラメータ値として１ ５６を有していた。このコード配列は、ヒトｒａｂ２コード配列（ＧｅｎＢａｎ ｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ Ｍ２８２１３）とＥ値にして５４、 ヒトｒａｂ１３コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅ ｒｓ Ｘ７５５９３）とＥ値にして５１のＨＳＰ配列の共有部分を有している。 このコード配列は、そのＨＳＰ配列をＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）データベー ス（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ Ｃ ａｌｉｆｏｒｎｉａ）におけるいくつかのクローンとも共有しており、このよう なクローンには、角膜支質に由来するインサイトクローン４５３３４（Ｅ＝３７ ）、骨格筋に由来するインサイトクローン５７２９１（Ｅ＝３７）、及びヒト胎 盤に由来するインサイトクローン１８１２８８（Ｅ＝３６）が含まれる。これら ３つの組織は全て弱化（enervated）されている。これらの組織タイプにおける ｈｒｂ１８に近縁関係を有するヌクレオチド配列の存在は、分泌小胞輸送に関与 する近縁なｒａｂタンパク質を含む神経細胞の存在の結果である。更に、神経株 化細胞（ｈＮＴ）に由来するインサイトクローン２６９５０２は、マウスｒａｂ １８遺伝子と高い相同性（８７％）を共有するコード配列 を含んでいる。 ５．遺伝子の同定及び完全長配列決定 完全なｈｒａｂ１８ヌクレオチド配列はインサイト社クローン１１２３５２か ら得られた。完全長ｈｒａｂ１８遺伝子の配列は翻訳され、推定上のフレーム内 翻訳は第１図に示されている。この配列の３つの可能な予測翻訳の全てをＳｗｉ ｓｓＰｒｏｔやＰＩＲのようなタンパク質データベースで検索したが、ＨＲＡＢ １８の可能な翻訳に完全に一致するものは見いだされなかった。第２図に示すの は、ＨＲＡＢ１８アミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋマウスＲＡＢ１８の配列との比 較である。これらの分子における実質的な相同領域には、２０７個の残基のうち 保存されないただ２つの残基を有する完全長分子が含まれている。 ６．アンチセンス分析 このｈｒａｂ１８遺伝子のｃＤＮＡ配列を知ることにより、遺伝子機能の調査 でのアンチセンス技術に、これを適用することが可能になる。ｈｒａｂ１８のア ンチセンス鎖を含むゲノムのまたはｃＤＮＡのフラグメントやオリゴヌクレオチ ドをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで用いて、特定のタンパク質の発現 を阻害することができる。このような技術は周知であり、ヌクレオチド配列の様 々な部位に付くプローブがデザインされる。細胞または実験動物の全身をこのよ うなアンチセンス配列で処理することより、興味の対象である遺伝子の機能を効 果的に遮断することができる。多くの場合、細胞レベル、組織レベル、若しくは 生物体全体のレベルでの挙動（例えば死亡率、分化した機能の消失、形態の変化 等）を観察することにより、その遺伝子の機能を確認することができる。 開放された読み枠の転写を妨害するように構築された配列を用いることに加え て、イントロン領域、プロモータ／エンハンサー要素、または トランス作用調節遺伝子に対するアンチセンス配列をデザインすることにより、 遺伝子発現を修飾することかできる。同様に、“三重らせん体（トリプルヘリッ クス）”塩基対として知られるＨｏｇｅｂｏｏｍ塩基対を用いて阻害を達成する ことができる。 ７．ＨＲＡＢ１８の発現 ｈｒａｂ１８の発現は、ｃＤＮＡを適切な発現ベクターにサブクローニングし 、そのベクターを適切な発現ホストに感染させることによって達成される。組織 ライブラリーの生成のために使用されるこのクローニングベクターは、Ｅ．ｃｏ ｌｉにおけるｈｒａｂ１８の発現のために用いられる。クローニング部位の上流 において、このベクターは、βガラクシトダーゼに対するプロモータ、それに続 くアミノ末端Ｍｅｔをコードするヌクレオチド配列、その次のβガラクシトダー ゼの７つの残基を含んでいる。これら８つの残基の直後には、人工的プライミン グ及び転写に有用な工学的処理されたバクテリオファージプロモータ、及びＥｃ ｏＲＩを含む多数のクローニングのための独特な制限部位が存在する。 標準的方法を用いて、単離されＩＰＴＧのトランスフェクションをなされた菌 種の誘発により、βガラクトシダーゼの始めの７つの残基とリンカーの約１５個 の残基に対応する融合タンパク質、及びｃＤＮＡにコードされたペプチドが生成 される。ｃＤＮＡクローン挿入断片は必ずランダムプロセスによって生成される ことから、含まれたｃＤＮＡが適切な翻訳のための正しい読み枠内に存在する機 会は３つに１つだけである。ｃＤＮＡが適当な読み枠内にない場合には、それは 周知の方法で適切な数の塩基の削除若しくは挿入を行うことによって得られる。 このような方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、エキソヌクレアーゼ ＩＩＩ若しくは大豆ヌクレアーゼによる消化、若しくはオリゴヌクレオチドリン カー混入などがある。 ｈｒａｂ１８のｃＤＮＡは、特異的宿主におけるタンパク質の発現のために有 用であると知られている他のベクター内にシャトルされる。標的ｃＤＮＡ（２５ 個の塩基）の両端のストレッチに対してハイブリッド形成するのに十分なＤＮＡ のセグメントとクローニングサイトを含むオリゴヌクレオチドアンプリマーは、 標準的方法によって化学的に合成され得る。次いでこれらのプライマーを用いて 、ＰＣＲにより所望の遺伝子セグメントが増幅される。得られた新たな遺伝子セ グメントは、標準状態のもとで適当な制限酵素で消化され、ゲル電気泳動法によ って単離される。これとは別の方法では、類似する遺伝子セグメントを、ｃＤＮ Ａを適当な制限酵素と共に消化し、欠失した遺伝子セグメントを化学的に合成さ れたオリゴヌクレオチドで埋めることによって生成する。１または２以上の遺伝 子からのコーディング配列のセグメントを互いに連結し、適切なベクターにクロ ーニングすることにより、組換え配列の発現が最適化される。 このようなキメラ分子のための適切な発現宿主にはチャイニーズハムスターの 卵巣（ＣＨＯ）及びヒト２９３細胞のようなほ乳類の細胞や、Ｓｆ９細胞のよう な昆虫の細胞や、サッカロミセスセレビシエのような酵母菌細胞や、Ｅ．ｃｏｌ ｉのような細菌があるが、これらに限定されるものではない。このような細胞系 のそれぞれに対して有用な発現ベクターは、バクテリア内での増殖を可能にする 複製起点、及び細菌内での選択を可能にするβラクタマーゼ抗生物質抵抗性遺伝 子のような選択可能なマーカーを含んでいる。更に、このベクターは、真核生物 の宿主細胞へのトランスフェクションに役立つネオマイシンホスホトランスフェ ラーゼ遺伝子のような第２の選択可能なマーカーを含む。真核生物の発現宿主に おいて使用するために、ベクターは、それが目的のｃＤＮＡの一部分でない場合 には、３’ポリアデニル化配列のようなＲＮＡプロセ シング要素を必要とすることがある。 更にこのベクターは、遺伝子発現を増加させるエンハンサまたはプロモータを 含む。このようなプロモータは宿主特異的であって、ＣＨＯ細胞に対してはＭＭ ＴＶ、ＳＶ４０、及びメタロチオネインプロモータ、細菌宿主に対してはｔｒｐ 、ｌａｃ、ｔａｃ、及びＴ７プロモータ、また酵母菌に対してはα因子、アルコ ールオキシダーゼ、及びＰＧＨプロモータ等がある。ラウス肉腫ウィルス（ＲＳ Ｖ）エンハンサのような転写エンハンサは、ほ乳類宿主細胞において使用される 。標準的な培養方法により、組換え細胞の均質な培養物がひとたび得られたなら ば、組換えにより生成された大量のＨＲＡＢ１８が条件培地から回収され、周知 のクロマトグラフィー法を用いて分析される。 ８．組換えＨＲＡＢ１８の単離 ＨＲＡＢ１８は、タンパク質精製を促進するべく添加された１または２以上の 付加的ポリペプチドドメインを有するキメラタンパク質として発現される。この ような精製促進ドメインには、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン− トリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド、固定免疫グロブリン 上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ延長／アフィニ ティ精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）におい て使用されるドメインなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。精 製ドメインとｈｒａｂ１８配列との間のＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎ ｖｔｒｏｇｅｎ）のような切断可能なリンカー配列を含むことが、融合タンパク 質複合体からの精製を促進するのに役立っている。 ９．ＨＲＡＢ１８特異的抗体の生成 ＨＲＡＢ１８に対する抗体を生成するのに２つの方法が用いられる。それぞれ の方法はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の何れか を生成するために有用なものである。その方法の１つでは、逆相ＨＰＬＣ分離に より、変性タンパク質が最大７５ｍｇ得られる。変性タンパク質は標準的なプロ トコルを用いてマウス若しくはウサギを免疫化するのに用いられる。即ちマウス の免疫化に対しては約１００μｇが適切であり、ウサギの免疫化には最大１ｍｇ が用いられ得る。マウスハイブリドーマの同定のためには、変性タンパク質が放 射性沃素で標識して、抗体を産生し得るネズミのＢ細胞ハイブリドーマのスクリ ーニングを行うのに用いる。この手順で必要となるタンパク質はごく少量で、即 ち数千のクローンの標識付け及びスクリーニングのためには２０ｍｇで十分であ る。 第２の方法においては、ｃＤＮＡの転写から演繹されるＨＲＡＢ１８のアミノ 酸配列が分析されて、免疫抗原性の高い領域が決定される。適当な親水性領域を 含むオリゴペプチドが合成され、抗体を産生するための適切な免疫化プロトコル において使用される。適当なエピトープを選択するための分析は、Ａｕｓｕｂｅ ｌ ＦＭ等（上述）によって説明されている。免疫化のための最適なアミノ酸配 列が通常存在するのは、Ｃ末端、Ｎ末端、及びそれらの間に挟まれた、タンパク 質がその自然な配座にあるとき外部環境にさらされることの多いポリペプチドの 親水性領域である。 典型的には、約１５個の残基を有する長さの選択されたペプチドは、ｆｍｏｃ −ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐ ｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４３１Ａを用いて合成され、 Ｍ−メイルイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（M-male imidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester）と反応（ＭＢＳ；Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ等，上述）させることによってキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬ Ｈ，Ｓｉｇｍ ａ）に結合される。必要ならば、ＫＬＨと結合できるようにするため、システイ ンがペプチドのＮ末端に挿入される。ウサギは、フロイント完全アジュバントの ペプチド−ＫＬＨ複合体と共に免疫化される。得られた抗血清は、ペプチドとプ ラスチックを結合し、１％のウシ血清アルブミンでブロックし、抗血清と反応さ せ、洗浄し、かつ（放射性またはけい光剤により）標識されたアフィニティ精製 された特異的ヤギ抗ウサギｌｇＧと反応させることによって抗ペプチド活性がテ ストされる。 ハイブリドーマは標準的な技術を用いて調製されスクリーニングされる。目的 のハイブリドーマは、標識されたＨＲＡＢ１８と共にスクリーニングを行うこと によって検出され、所望の特異性を有するモノクローナル抗体を産生する融合体 が同定される。典型的なプロトコルにおいては、プレートの穴（ＦＡＳＴ；Ｂｅ ｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）が、１０ｍｇ／ｍ ｌの、アフィニティ精製された特異的ウサギ抗マウス（または適当な抗−種１ｇ ）抗体によってコーティングされる。コーティングされた穴は１％のＢＳＡでブ ロックされ、洗浄されて、ハイブリドーマからの上澄みに曝される。インキュベ ーションの後、穴は１ｍｇ／ｍｌの標識されたＨＲＡＢ１８に曝される。抗体を 産生するクローンは、上述のバックグラウンドにおいて検出され得る量の標識さ れたＨＲＡＢ１８と結合する。このようなクローンはが拡大され、限界希釈（１ 細胞／３穴）で２サイクルのクローニングを受ける。クローン化されたハイブリ ドーマはプリスタン処理されたマウスに注射されて、それが腹水を生成し、プロ テインＡ上のアフィニティクロマトグラフィーによってマウスの腹水からモノク ローナル抗体が生成される。少なくとも１０⁸／Ｍ、好ましくは１０⁹〜１０¹⁰ま たはそれ以上の親和性を有するモノクローナル抗体は、典型的には、Ｈａｒｌｏ ｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ及 びＧｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐ ｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙに記載されているような標準的な手順によって 生成される。ここではこの２つの資料を参照されたい。 １０．ＨＲＡＢ１８特異的抗体を用いる診断テスト 特定のＨＲＡＢ１８抗体は、下垂体や他の神経細胞由来の細胞におけるＨＲＡ Ｂ１８の量若しくは分布の差によって特徴付けられる障害の診断に役立つ。ＨＲ ＡＢ１８に対する診断テスト方法には、人体の体液、組織、若しくはそのような 組織の抽出物におけるＨＲＡＢ１８を検出するべく抗体及び標識を使用する方法 が含まれる。本発明のポリペプチド及び抗体は修飾して使用されるか、または修 飾することなく使用される。このポリペプチド及び抗体は、多くの場合、検出可 能なシグナルを出す物質と共有結合、若しくは非共有結合の何れかで結合するこ とによって標識される。さまざまな標識及びその関連技術が知られており、科学 文書及び特許明細書の双方において広く報告されてきた。適切な標識としては、 放射性核種、酵素、基質、共同因子（cofactors）、インヒビター、蛍光剤、化 学ルミネセンス剤、磁性粒子等がある。このような標識の使用方法は、米国特許 出願第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０ 号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９ 号、及び第４，３６６，２４１号明細書に記載されている。また組換え免疫グロ ブリンは、米国特許出願第４，８１６，５６７号明細書に記載の方法により生成 することができる。これらの明細書を本明細書とともに参照されたい。 該タンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体、若しくはモノクローナル 抗体の何れかを用いた可溶性ＨＲＡＢ１８または膜結合ＨＲＡＢ１８の測定のた めのプロトコルは、様々なものが周知となっている。この例を挙げると、酵素結 合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、 及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）等がある。好適なのは、ＨＲＡＢ１８上 の２つの非干渉エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を用いる二点（ two sites）モノクローナル免疫アッセイであるが、競合的結合アッセイを用い てもよいる。これらのアッセイは例えばＭａｄｄｏｘ，ＤＥ等（１９８３，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５８：１２１１）のような他の文書に記載されている。 １１．特異的抗体を用いた天然ＨＲＡＢ１８の精製 天然ＨＲＡＢ１８または組換えＨＲＡＢ１８は、ＨＲＡＢ１８に対して特異的 な抗体を用いる免疫性アフィニティクロマトグラフィーによって精製される。一 般に、免疫アフィニティカラムは、抗ＨＲＡＢ１８抗体と活性化クラマトグラフ ィー樹脂とを共有結合することによって構成される。 ポリクローナル免疫グロプリンは、硫酸アンモニウムとともに沈殿させるか、 固定プロテインＡ上で精製させることによって免疫血清から調製される（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿か固定プロテイ ンＡ上でのクロマトグラフィーによって、マウスの腹水から調製される。部分的 に精製された免疫グロプリンは、ＣｎＢｒ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のようなクロマトグラフ ィー樹脂に共有結合される。製造者の指示に従った処理により、抗体は樹脂に結 合 し、この樹脂はブロックされた上で、誘導体樹脂が洗浄される。 このような免疫アフィニティカラムは、ＨＲＡＢ１８を含む細胞の分画を調製 することによってＨＲＡＢ１８の精製を行うときに使用される。この調製は、全 ての細胞の可溶化を行い、異なる遠心分離法を用いて得られる細胞小分画の単離 を行う方法か、若しくは周知の他の方法によって誘導される。別の方法では、シ グナル配列を含む可溶性ＨＲＡＢ１８が、細胞が成長する媒質に有用な量だけ分 泌される。 可溶性ＨＲＡＢ１８含有沈殿物は免疫アフィニティカラムを通され、このカラ ムがＨＲＡＢ１８の優先吸収が可能な条件（即ち、洗剤が存在する高イオン強度 の緩衝液を使用）のもとで洗浄される。次いで、このカラムは抗体／ＨＲＡＢ１ ８結合を切断するような条件（即ち、尿素またはチオシアネートイオンのような 高濃度のカオトロープまたはｐＨ２〜３の緩衝液を使用）の下で溶離され、ＨＲ ＡＢ１８が回収される。 １２．ＨＲＡＢ１８の局在及び活性 ＨＲＡＢ１８は神経細胞、特に下垂体細胞に以下のように局在し得る。第１に 、そのＣ末端がｉｎ ｖｉｔｒｏでプレニル化されたタンパク質を発現するＥ． Ｃｏｌｉから精製されたＨＲＡＢ１８または自然発生ＨＲＡＢ１８の何れかが得 られる。このプレニル化により、ＨＲＡＢ１８が、周期エンドソーム、トランス ゴルジ網、シスゴルジ網、または小胞体のような細胞内部の細胞内区画に局在す るようにすることが可能となる。プレニル化ＨＲＡＢ１８は原形質膜がジギトニ ンによって可溶化されたもののような除細胞系に加えられる。このＨＲＡＢ１８ はＨＲＡＢ１８が特定の細胞内分画に特異的に結合したことが観測されるような 濃度で添加される。この局在は放射標識された抗体を用いてモニタされる。 ＨＲＡＢ１８がひとたび特定の細胞分画に局在化されると、その機能を調査す るための除細胞系の研究を行うことが可能となる。例えば、除 細胞系は、小胞体からトランスゴルジ網への小胞輸送の測定が可能なように作る ことができる。好ましくは、この除細胞系は自然発生ＨＲＡＢ１８を枯渇させて 、小胞輸送上でＲＡＢ１８を欠いた除細胞系の効果の研究ができるようにされる 。ＨＲＡＢ１８の濃度は徐々に増加され、小胞輸送におけるＨＲＡＢ１８の活性 が回復する。この方法は、ＨＲＡＢ１８誘導体の生物学的活性を試験するのに用 いられる。 １３．薬物スクリーニング ＨＲＡＢ１８またはＨＲＡＢ１８を含む宿主細胞は、ＨＲＡＢ１８、そのアイ ソフォーム、または他のＲＡＢタンパク質により小胞輸送に影響を及ぼしうる化 合物をスクリーニングするのに用いられる。このような試験に利用されるポリペ プチドまたはフラグメントは、除細胞系において用いられるか、細胞内に配置さ れる。化合物スクリーニングの一方法では、フラグメントのポリペプチドを発現 する組換え核酸で安定に形質転換された真核生物または原核生物の宿主細胞を用 いる。薬物は、共合的結合アッセイでそのような形質転換された細胞に対してス クリーニングされる。例えば、特定のペプチドまたは神経伝達物質の小胞輸送の 交互変化を測定することができる。 従って、本発明は、ＨＲＡＢ１８の活性に影響補及ぼすテスト化合物をスクリ ーニングする方法を提供する。この方法では、化合物とＨＲＡＢ１８とを接触さ せる過程と、従来より周知の方法により化合物とＨＲＡＢ１８との複合体の存在 を検定する過程とを有する。適当なインキュベーションを行った後、遊離された 化合物が結合形態のものから分離され、結合化合物の量がＨＲＡＢ１８の調節機 能に緩衝しうるその能力の測定基準となる。 薬物スクリーニングのための他の技術では、ＨＲＡＢ１８に対する適切な結合 アフィニティを有する化合物のスクリーニングの高スループッ トが得られるが、これについては１９８４年９月１３日に公開されたヨーロッパ 特許第８４／０３５６４号に詳細に記載されており、ここではこれを参照された い。 ＨＲＡＢ１８と結合し得る中和抗体がＨＲＡＢ１８に結合するテスト化合物と 競合する競合的薬物スクリーニングアッセイを用いて、ＨＲＡＢ１８に特異的に 結合する化合物を決定する。この方法においては、抗体がＨＲＡＢ１８と１また は２以上の抗原決定基を共有する任意のペプチドの存在を検出するために用いら れる。 １４．合理的薬物デザイン 合理的薬物デザインの目的は、目的の生物学的に活性のポリペプチドの、もし くはそれらが相互作用する小さい分子（例えば、ＧＴＰの非加水分解性の類似体 ）の構造的類似体を生成することである。これらの例の何れもが、ポリペプチド の活性及び安定性がより勝っている薬物、もしくはｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチ ド機能に干渉する薬物を形成するために用いることが可能である。（Ｈｏｄｇｓ ｏｎ Ｊ（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ ９：１９−２１参照） １つの方法では、目的のタンパク質、もしくはタンパク質−インヒビター複合 体の三次元構造が、Ｘ線結晶法、コンピュータによるモデル化、もしくは最も典 型的にはこの二つの方法を組み合わせることによって決定される。ポリペプチド の形状及び電荷は、構造を明瞭にし分子の活性部位を決定するため、双方ともに 確認されなければならない。ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同タ ンパク質の構造に基づいてモデル化することによって得られることもある。どち らの場合においても、得られる構造情報が、効果的な阻害剤をデザインするのに 用いられる。合理的薬物デザインの有用な例には、Ｂｒａｘｔｏｎ Ｓ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ ＪＡ（１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：７７９ ６−７８０１）によって示されたような活性及び安定性を改善した分予、もしく はＡｔｈａｕｄａ ＳＢ等（１９９３ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１３：７４２− ７４６）によって示されたような天然ペプチドの阻害剤、アゴニスト、もしくは アンタゴニストとして機能する分子があり、ここではこれらの資料を参照された い。 上述のような機能的アッセイによって選択された標的特異的抗体を単離し、つ いでその結晶構造を解明することも可能である。この方法は、原則として、次の 薬物デザインのベースとなるファーマコア（pharmacore）を形成する。機能的で 、薬理学的に活性な抗体に対する坑イデオタイプ抗体（ａｎｔｉ−ｉｄｓ）を生 成することによってタンパク質結晶分析を飛ばすことも可能である。鏡像の鏡像 という関係で、ａｎｔｉ−ｉｄｓの結合サイトは、もとの受容体の類似体である と予想される。次いでこのａｎｔｉ−ｉｄｓは、化学的に若しくは生物学的に生 成されたペプチドのＢａｎｋからペプチドを同定し単離するのに用いられる。単 離されたペプチドはファーマコアとして機能する。 ＨＲＡＢ１８は、Ｘ線結晶学のような分析研究を行うのに使用することができ る。更に、ここで用いられたＨＲＡＢ１８アミノ酸配列を知ることによって、そ れをＸ線結晶分析の代わりに用いたり、更にそれに加えてコンピュータによるモ デル化技術を用いる場合の手引きが得られる。 １５．薬物の使用及び投与 多くの疾病が、ホルモンの分泌異常や、分泌組織、特に下垂体組織における表 面受容体の異常リサイクリングに関連を有している。例えば、萎縮症は多くの場 合下垂体前葉の全ての分泌の欠損によって生じ、巨人症は、ソマトロピン細胞に よるＧＨの過剰活性及び分泌によって生ずる。これら全ての疾病は、ＨＲＡＢ１ ８の異常発現に関連する小胞輸送、融合、ターゲティングの調節の異常に関連し 得る。更に、ＨＲＡＢ１８が エンドサイトーシスにおいて一定の役割を果たし得ることから、ＨＲＡＢ１８の 異常発現は受容体の異常リサイクリングに関与する障害をもたらし得る。ＨＲＡ Ｂ１８が細胞内区か区間の小胞輸送の調節を行っているらしいことから、ＨＲＡ Ｂ１８に結合する化合物は下垂体細胞表面の受容体の異常レベルや下垂体ホルモ ンの異常分泌を治療するために治療的に使用され得る。これとは別に、これらの 化合物は神経細胞からの神経伝達物質の異常分泌の調節も行い得る。更に、ＨＲ ＡＢ１８それ自体を投与して、ＨＲＡＢ１８の異常発現に関連する障害の治療を 行うことも可能である。 治療的化合物は、非中毒性、不活性、薬学的な許容範囲にある水性担体媒質で 配合される。媒質のｐＨは、好ましくは約５〜８、特に好ましくは６〜８である 。しかし、このｐＨは配合や投与の特性によって変化しうる。分子の溶解度、半 減期及び抗原性／免疫抗原性のようなこれらの特性及び他の特性が効果的な担体 を決める助けとなる。薬物デザインで得られた組換え分子や有機分子または合成 分子も同様に効果的であり得る。 治療的化合物は周知の投与経路で投与される。この投与経路には、局所的クリ ーム及びゲル、経粘膜スプレー及びエアロゾル、経皮パッチ及び帯具、注射可能 な静脈の潅注配合物、及び液体及び錠剤の経口薬であって胃酸及び酵素に対して 抵抗性を有するように配合されたもの等があるが、これらに限定されない。特定 の配合、正しい投与量、及び投与経路は病院所属医師によって決定されるが、状 況に応じて様々に変化し得る。 このような決定は、治療条件、投与される治療的化合物、または特定の治療的 化合物の薬動力学的プロファイルのようなさまざな要素を考慮することによって なされる。考慮に入れるべき他の因子には、患者の病 状（例えば重症であるかどうか）、年齢、体重、性別、食事、時間、及び投与の 頻度、薬物の組合せ、反応感受性及び治療に対する耐性／反応性などがある。長 時間作用するＬＳＴの配合物の投与頻度には、３〜４日に１回の投与、毎週１回 の投与、若しくは２週間に１回の投与程度であるが、この頻度は特定の治療的Ｈ ＲＡＢ１８の半減期及びクリアランス速度によって決まる。 通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの間であり、総投与量の上限は約 １ｇであるが、これは投与経路によって異なる。特定の投与量及び投与方法に関 する手引きは、米国特許出願第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号 または第５，２２５，２１２号明細書に記載されている。また、異なる治療的化 合物の投与に対しては異なる配合が効果的であり、ある組織や器官への投与には 特定の投与方法が求められることが予想される。 本明細書に記載した全ての文献及び特許明細書は、本明細書と一体に参照され たい。上述の明細書は、当業者が本発明を実施することが可能となるに十分なも のであると考えられる。実際、本発明の実施においては、当業者には明らかな上 述の実施例の様々な変更が、請求項に記載の本発明の範囲を逸脱することなく行 われることが意図されている。 Description: TECHNICAL FIELD The present invention belongs to the field of molecular biology, and in particular, the present invention describes a nucleic acid sequence and an amino acid sequence of a homolog of human mouse RAB18 gene. It is. BACKGROUND ART The RAB protein belongs to the RAS superfamily of G proteins and contains approximately 50 closely related low molecular weight GTPases having a molecular weight of about 20,000 to 30,000. Low molecular weight G proteins interact with several types of effector proteins and trigger certain cellular responses. RAB proteins serve as specific regulators of intracellular membrane trafficking, exocytosis, and endocytosis, controlling vesicle budding, targeting and fusion. The RAS protein activates the serine / threonine protein kinase cascade and regulates cell growth and differentiation. RHO and RAC proteins are involved in the relaying of actin cytoskeletal signals from cell surface receptors (Alberts, B et al. Molecular Biology of the Cell, 3rd ed, Garland Publishing, Inc., New York City, New York, 1992. )). G proteins exist in equilibrium in two forms, a GTP-bound form that activates and interacts with the effector protein and an inactive GDP-bound form. The distribution of active and inactive G proteins appears to be partially regulated by certain regulatory proteins that affect the rate of GDP release or GTP hydrolysis by G proteins. For example, guanine nucleotide releasing protein (GNRP) catalyzes the release of bound GDP. GTP then binds to the nucleotide binding site and the G protein is activated. In another form, GTPase-activating protein (GAP) increases the rate of GTP hydrolysis and concomitant production of GDP and phosphate. GDP remains bound to the G protein and inactivates the protein. In addition, the G protein interacts with a guanine nucleotide dissociation inhibitor (GDI) that inhibits the release of GDP (Barangar (1994) J Biol Chem 269: 13 637-43). Most of the information about low molecular weight G proteins has been obtained by studying the structure and function of RAS proteins as described in Hesketh R, The Oncogene Facts Book, Academic Press, Great Britain (1995). Very little is known about the structural features important for the activity of other members of the RAS superfamily. RAB protein To date, more than 30 RAB proteins have been identified in mammalian cells, and these proteins are characterized by sharing between 35% and 95% sequence exhibiting a wide range of functional specificities. . Typically, these proteins are localized to specific organelles. For example, RAB1 is localized in the endoplasmic reticulum (ER) and the Golgi complex, RAB2 is localized in the transitional endoplasmic reticulum and the cis-Golgi network, RAB3 is localized in secretory vesicles, and RAB4 is localized in secretory vesicles. RAB5 is located in the early endosome and plasma membrane, RAB6 is located in the middle and trans Golgi lamina, and RAB7 is located in the late endosome. RAB9 is localized in late endosomes and the trans-Golgi network (Alberts, supra). Furthermore, RAB proteins are localized to specific tissue types. For example, RAB 17 is found in epithelial cells, including distinct apical, basolateral, and transcellular transport pathways. RAB3 isoforms with about 77-85% homology appear to be largely restricted to cell lineages that include regulatory secretory pathways such as neuronal, endocrine, and exocrine cells (Fischer von Mollard (1994). ) L Biol Chem 269: 10971-74). RAB18 has been found to be expressed at high levels in the mouse brain, at intermediate levels in the pituitary gland, and at low levels in the liver. This protein may play a role in secretory vesicle recycling (Yu H et al (1993) Gene 132-273-8). Both RAB and RAS proteins appear to share conserved regions that are involved in guanine nucleotide binding or in conformational changes related to GTP binding and GTP hydrolysis. The characteristic structural motif associated with the GTP binding site is the first motif GX _Four GK (S / T), which interacts with the α and β phosphate groups of GDP or GTP. Another motif, DXXG, also appears to interact with the gamma phosphate group. The third motif, (N / T) (K / Q) XD, interacts with guanine rings. Strongly bound Mg ₊ Is coordinated to a conserved threonine residue and the β and γ phosphate groups of GTP. Furthermore, this Mg ₊ Interacts with serine / threonine residues in the first motif and invariant aspartic acid in the third motif. Domains that appear to be important for conformational changes include the effector L2 loop and helix a2 / loop 5 (a2L5), which appear to be involved in specific GEP and GAP interactions (F erro-Novick S. (1993) Ann. Rev. Cell Bio 1.9: 575-99). In addition, post-translational modifications by lipid moieties are important for RAB membrane localization and proper activity. This modification occurs at the C-terminus of the RAB protein, whereby the geranylgeranyl (GG) moiety, a 20-C isoprene unit, is attached to one of the two cysteine residues, usually via a thioether bond. Many RAB proteins have a C-terminus that ends in -XXCC (35%), -XCXXC (37%), -CCXX (15%), -CCXXX (8%), -CXXX (5%). . Certain RAB proteins, such as RAB3A, with the -XCXC motif appear to be geranylgeranylated at each of the adjacent cysteine residues (Farnsworth (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 11963-7). ). This modification reaction appears to involve one RAB-specific geranylgeranyltransferase (RAB GGTase II) that transfers the lipid moiety to a different RAB motif. RAB escort protein (REP) is additionally involved in the lipidation reaction by binding the protein substrate and then forming a complex with RAB GGTase II. This GGTase II then transfers the geranylgeranyl moiety from geranylgeranyl pyrophosphate to the protein substrate. The mode of action of the RAB protein as a regulator of membrane traffic between intracellular compartments is not well understood. Cyclic morphological changes of the RAB protein between soluble and membrane bound forms and interaction with vesicles and target membrane bound proteins have been proposed. When the RAB protein is bound by GDP (ie, the inactive form), the RAB protein exists in a conformation such that its lipid portion is hidden inside the protein. Thus, the protein will remain in a soluble form. Once the RAB protein is activated by GNRP, GDP is exchanged for GTP, which changes the conformation of the protein, leaving the lipid moieties exposed and the RAB in a membrane-bound form. Membrane-bound RAB with GTP at the nucleotide binding site is localized where the membrane vesicles are excised and bound to a complex of certain vesicle-specific proteins (v-SNAREs). The RAB protein remains attached to the vesicle surface until the vesicle docks with the target membrane when v-SNARE interacts with the target-dependent SN ARE (t-SNARE). At this time, GTP bound to RAB is hydrolyzed to GDP. At the same time, RAB changes conformation, leaving its lipid moiety unexposed and RAB being released from the target membrane surface. Thus, the SNARE complex may serve as the ultimate target of RAB regulation (Alberts, supra). DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention relates to polynucleotides and polypeptides of the human mouse RAB18 homolog (herein referred to as HRAB18). The present invention also provides host cells and expression vectors comprising HR AB18 antisense DNA and a polynucleotide encoding HRAB18. Further, the present invention provides a method for producing HRAB18, and a resulting HRAB18 polypeptide having the sequence shown in SEQ ID NO: 2. The present invention also relates to diagnostic test methods and compositions for detecting disorders associated with altered expression of HRAB18, particularly for detecting pituitary disorders. Methods for screening multiple test compounds to identify compounds that bind to HRAB18 have also been proposed, along with their use as therapeutic compounds for the treatment of disorders associated with the altered expression of HRAB18. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. FIG. 1 shows the nucleotide sequence of HRAB18 (SEQ ID NO: 1) and predicted amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) found in 112352. FIG. 2 shows an amino acid alignment of HRAB18 with mouse RAB18. The alignments shown here were created using the DNASTAR software multisequence alignment program (DNASTAR Inc, Madison WI). FIG. 3 is a diagram showing a hydrophobicity plot of the amino acid sequence of HRAB 18 prepared using the hydrophobicity program of DNASTAR. Embodiment of the Invention Definition As used herein, the term "human mouse rab18 homolog" or "HRAB18" refers to the polypeptide shown in SEQ ID NO: 2. A polynucleotide sequence encoding HRAB18 was found in a human pituitary cDNA library. HRAB18 is a member of the RAB subfamily of small G proteins and may be involved in regulating secretory ER recycling. In one embodiment disclosed herein, HRAB18 is encoded by a sequence beginning at nucleotide 45 and ending at nucleotide 664 of the polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 1. The present invention also relates to the upstream and downstream sequences shown in SEQ ID NO: 1, that is, nucleotides 1 to 44 and nucleotides 665 to 1148 in SEQ ID NO: 1, wherein the nucleotide sequence Can affect stability. HRAB18 can be naturally occurring, endorsed by recombination, or chemically synthesized. The scope of the present invention also includes an active fragment of HRAB18. As used herein, “hrab18” represents a nucleic acid sequence, and “HRAB18” represents a protein, peptide, or amino acid sequence. As used herein, the term "activity" refers to a form of HRAB18 that retains the biological and / or immunological activity of naturally occurring HRAB18. As used herein, the term "naturally occurring HRAB18" refers to HRAB18 produced by human cells that have not been subjected to biotechnological treatment, and more specifically, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation. A term that describes the various forms of HR AB18 produced from post-translationally modified polypeptides, including lipidation and acylation. As used herein, the term "derivative" refers to chemically modified HRAB18, such as ubiquitination, labeling (eg, labeling with radionuclides or various enzymatic modifications), PEGylation (derivatization with polyethylene glycol), Or a polypeptide obtained by insertion (or substitution by chemical synthesis) of an amino acid not normally occurring in human proteins, such as, for example, ornithine. As used herein, the term “recombinant variant” refers to any polymorph that differs from naturally occurring HRAB18 by the insertion, removal, and / or substitution of amino acids produced using recombinant DNA technology. Means peptide. To determine the amino acid residues that can be substituted, added, or removed without impairing the activity of interest, such as enzymatic activity, compare the sequence of a particular HRAB18 with the sequence of a homologous molecule, The number of amino acid sequence changes in a region of high homology may be minimized. In "substitution" of an amino acid, one amino acid is structurally and / or chemically substituted, such as, for example, leucine for isoleucine or valine, aspirate for glutamate, threonine for serine, ie, a conservative amino acid substitution. It is preferred that the characteristic be replaced by another amino acid analogous to it. "Insertion" or "deletion" of amino acids is usually performed in the range of 1 to 5 amino acids. By systematically inserting, removing or substituting amino acids in the HRAB18 molecule using recombinant DNA technology and assaying the activity of the resulting recombinant mutant, the acceptable mutants are determined experimentally. obtain. If necessary, the HRAB18 polypeptide may contain a "signal sequence or leader sequence" that allows it to translocate through the cell membrane. As will be appreciated by those skilled in the art, such sequences may be naturally present on the polypeptides of the invention, or may be obtained from heterologous protein sources by recombinant DNA technology. As used herein, the term polypeptide "fragment", "part", or "segment" refers to at least about 5 amino acids, at least about 7 amino acids, or at least about 9-13 amino acids. In another embodiment, it refers to the stretching of amino acid residues consisting of about 17 or more amino acids. As used herein, the term "oligonucleotide" or polynucleotide "fragment,""part," or "segment" refers to the polymerase chain reaction (PCR) method or to the same or related mRNA or DNA molecule. Amplification, or simply a stretch of nucleotide residues of sufficient length to be used in various hybridization methods well known to those of skill in the art for clarification. The present invention includes purified HRAB18 polypeptides obtained from cells transformed with a source of natural or recombinant polypeptide, ie, a recombinant nucleic acid molecule encoding HRAB18. Various methods for isolating HRAB18 polypeptides are well known to those of skill in the art. For example, for the purification of such a polypeptide, immunoaffinity chromatography using the antibody provided by the present invention can be used. Other well-known methods for protein purification are described, for example, in "Deutscher M (1990) Methods in Enzymology Vol 182, Academic Press, San Diego" and "Scopes R (1982) Protein Purification.Pricing. Verlag, NYC ", which are hereby incorporated by reference. As used herein, the term "recombinant" also refers to a polynucleotide encoding HRAB18, prepared using recombinant DNA technology. The DNA encoding HRAB18 may also include allelic or recombinant variants, and mutants thereof. As used herein, an “oligonucleotide” or “nucleic acid probe” is prepared based on the cDNA sequence encoding HR AB18 (SEQ ID NO: 2). Oligonucleotides comprise a portion of a DNA sequence of 10 to 60 nucleotides, preferably 15 to 60 nucleotides. Nucleic acid probes can consist of portions of the sequence of less than about 6 kb, usually less than about 1 kb. In one embodiment of the present invention, the oligonucleotide probe has a sequence that is identical or complementary to a portion of HR AB18, where the portion that matches or complements the molecule known so far is negligible. Including. After appropriate testing to eliminate false positives, these probes can be used to determine whether messenger RNA encoding CALR is present in cells or tissues, and to determine whether Walsh PS et al (1992, PCR Methods Appl. 1: 241-50) can be used to isolate analogs of natural nucleic acid sequences from chromosomal DNA. Probes can be derived from naturally occurring nucleic acids, recombinant single or double stranded nucleic acids, or can be chemically synthesized. Labeling of the probe can be performed using nick translation, Klenow fill-in reaction, PCR, or other methods well known in the art. The method of preparing and labeling the probe of the present invention is described in "Sambrook J et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed, Cold Spring Harbor, NY" or "Ausubel FM et al. Protocols in Molecular Biology, Vol 2, John Wiley & Sons ", which is hereby incorporated by reference. Alternatively, recombinant variants encoding HRAB18 may be synthesized or selected by utilizing the "redundancy" of the genetic code, using techniques well known to those skilled in the art. Introducing various codon substitutions, such as silent changes that create various cleavage sites, can optimize cloning into plasmid or viral vectors, or expression in certain prokaryotic or eukaryotic cell lines . Also, by introducing a mutation, it may be reflected in the domain of the HRAB18 polypeptide or other peptides added to the HRAB18 polypeptide, which may modify the properties of the polypeptide, alter ligand binding affinity, Properties such as interchain affinity, or denaturation / turnover rates can also be altered. The present invention provides in one embodiment, a nucleotide sequence encoding HRAB18, a homolog of the human mouse rab18 gene, identified at insight 112352. In another embodiment, the invention provides a purified HRAB18 polypeptide obtained from a natural or recombinant polypeptide source. The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2. One embodiment of the present invention provides an hrab18-specific nucleic acid hybridization probe capable of hybridizing to a naturally occurring nucleotide sequence encoding HRAB18. Further, in one embodiment of the present invention, there is provided a cell transformed with a recombinant nucleic acid molecule encoding HRAB18, and an antibody against HRAB18. Antibodies to HRAB18, as well as polynucleotides and polypeptides, are useful in diagnostic assays for detecting disorders in the regulation of transmembrane transport such as, for example, endocytosis and exocytosis, and are also useful in secretory tissues, particularly neural tissues. Or a diagnostic composition for the detection of disorders of the pituitary tissue. In addition, these diagnostic tools may be useful in diagnosing disorders related to tissue damage. The nucleotide sequence encoding HRAB18 has numerous uses in techniques well known to those skilled in the field of molecular biology. These techniques include use as hybridization probes, use for the construction of oligomers for PCR, use in chromosome and gene mapping, use in recombinant production of HRAB18, and use of antisense DNA or RNA, or Use in the production of chemical analogs and the like is included. However, the method of using the nucleotide sequence encoding HRA B18 disclosed herein is merely an example of a known technique, and is not intended to limit use in any technique known to those skilled in the art. In addition, molecular biology techniques that have not yet been developed, as long as they are based on the properties of a known polynucleotide sequence, such as, for example, the triplet genetic code and specific base-pairing interactions, are not described herein. The disclosed nucleotide sequences can be used in the art of molecular biology. The degeneracy of the genetic code results in the generation of a variety of HRAB18-encoding nucleotide sequences, some of which have a known nucleotide sequence and a nucleotide sequence with minimal homology to the nucleotide sequence of a naturally occurring gene. But this will be understood by those skilled in the art. The present invention includes within its scope all possible nucleotide sequences which can be made more specifically by selecting combinations based on possible codon choices. These combinations are formed based on the standard triplet genetic code as applied to the nucleotide sequence of naturally occurring H RAB18. Also, all such variants are to be considered specifically disclosed herein. The nucleotide sequence encoding HRAB18 and / or the HRAB18 variant is preferably one that is capable of hybridizing under stringent conditions to the nucleotide sequence of the naturally occurring HRAB18 gene, but is capable of processing substantially different codon usage. It may be advantageous to create a nucleotide sequence that encodes a derivative or HR AB18. Codon selection can be selected to increase the rate of expression of the peptide in a particular prokaryotic or eukaryotic expression host, where the rate of expression is based on the frequency of use of particular codons in that host. . Another reason for altering the nucleotide sequence encoding the HRAB18 and / or HRAB18 derivative of the present invention substantially without altering the encoded amino acid sequence is that it has more desirable properties, such as those formed from naturally occurring nucleotide sequences. To create RNA transcripts with long half-life. The nucleotide sequence encoding HRAB18 may be linked to a variety of other nucleotide sequences using fully established recombinant DNA technology ("Sambrook J et al. Supra."). Useful nucleotide sequences include various cloning vectors, such as, for example, well-known plasmids, cosmids, lambda phage derivatives, phagemids, etc. Vectors of interest include expression vectors, replication vectors, probe generation vectors, and In general, vectors of interest include convenient restriction endonuclease detection sites that exert an origin of replication function in at least one organism, and selectable markers for host cells. In another embodiment of the present invention, the HRA A hrab18-specific nucleic acid hybridization probe is provided which is capable of hybridizing to a naturally occurring nucleotide sequence encoding B18, which probe can also be used to detect similar HRAB18 encoding sequences, and is preferably Contains at least 50% of the nucleotides of the conserved region or active site.The hybridization probes of the present invention may comprise the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the sequence of the genome including the promoter, enhancer element, and intron of naturally occurring hrab18. The hybridization probes can be labeled with various groups of reporters, which include: ³² P or ³⁵ Includes a radionuclide such as S, or an enzyme label such as alkaline phosphatase, which binds to the probe via an avidin / biotin binding system. In addition, the probe can be labeled using techniques well known to those skilled in the art. Further, the present invention provides a nucleic acid hybridization probe capable of hybridizing to an upstream or downstream sequence that can play a role in the translation of HRAB18. Such probes can also be used to detect similar regulatory sequences for polypeptide translation. Oligomers based on the nucleotide sequence encoding HRAB18 in the performance of PCR methods as described in U.S. Patent Nos. 4,683,195, 4,800,195 and 4,965,188. There are other uses for nucleotides. Probes used in such PCR may be recombinantly obtained, chemically synthesized, or a mixture of both, and may be used for diagnostic use. And a pool of possible degenerate sequences used to identify individual nucleotides or closely related genomic sequences. Full length genes are cloned from known sequences using a novel method using XL-PCR (Perkin-Elmer, Foster City, CA) to amplify long DNA. The development of this method allows one researcher to process a large number of genes (up to 20 or more) at a time and obtain extended sequences (possibly full-length sequences) within 6 to 10 days. Was. This method uses labeled probes to screen libraries and replaces the current method, in which one researcher can process only about 3-5 genes in 14-40 days. The first step can be performed in about two days, where primers are designed and synthesized based on known partial sequences. Step 2 takes about 6-8 hours, but here the sequence is extended by PCR amplification of the selected library. Steps 3 and 4 take about one day, but here the generation of the amplified cDNA and the delegation of the cDNA into a suitable vector takes place. Step 5 takes about one day, where the transformation and growth of the host bacteria takes place. Step 6, which takes about 5 hours, uses the PCR method to screen for extended sequences from bacterial clones. The final step takes about one day, in which the preparation and sequencing of the selected clones is performed. If full-length cDNA is not obtained, the entire procedure is repeated using the original library or another suitable library. Suitable libraries are those containing only large cDNAs or commercial libraries such as lung, liver, heart and brain purchased from Gib co / BRL (Gaithersburg MD) alone or in combination. May be size-selected to consist of cDNA libraries were prepared with oligo dT or random primers. An advantage of using a randomly primed library is that it can generally contain more sequences that include the 5 'end of the gene. Randomly primed libraries can be particularly useful when the oligo dT library does not yield a complete gene. It is also clear that the larger the protein, the less likely it is to find the complete gene in one plasmid. Other methods for creating hybridization probes specific for hrab18 DNA include cloning nucleic acid sequences encoding HRAB18 and HRAB18 derivatives into a vector for the formation of an mRNA probe. Such vectors are well known in the art and are commercially available, for example, by adding an appropriate RNA polymerase, such as T7 or SP6 RNA polymerase, and an appropriate radiolabeled nucleotide to the RNA probe in vitro. Can be used to synthesize. At present, it is possible to generate DNA sequences encoding HRAB18 and HRAB18 derivatives, or portions thereof, entirely by chemical synthesis, which can later be transformed into a variety of commercially available reagents, vectors, and cells using a variety of well-known reagents, vectors, and cells. DNA vector. In addition, chemical synthesis can be used to mutate the hrab18 polynucleotide sequence or a portion thereof. The nucleotide sequence of a nucleic acid encoding HRAB 18 can be confirmed by DNA sequencing techniques. Methods for DNA sequencing are well known in the art. Conventional enzymatic methods use DNA polymerase Klenow fragment, SEQUENASE® (US Biochemical Corp. Cleveland, OH) or Taq polymerase to convert DNA from oligonucleotide primers annealed to the DNA template of interest. Extend the chain. This method was developed to use both single-stranded and double-stranded templates. The products of the chain termination reaction are usually electrophoresed on a urea acrylamide gel and autoradiography (detection of radionuclide-labeled precursors) or fluorophore (detection of fluorophore-labeled precursors) ) Is detected. Recent advances in machine-based reaction preparation, fluorometric detection-based analysis and sequencing techniques have increased the number of sequences that can be determined per day (here, for example, Catalyst 800 and Applied Biosystem 377 or 373 DNA sequencers). Use a machine like.) In another form, a Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno NV) is used with four Peltier Thermal Cyclers (PTC200; MJ Research, Watertown MA) and the Applied Biosystems cDNA System 37 with the Applied Biosystems cDNA System 37. Is determined. This nucleotide sequence can be used to construct an assay for detection of a disorder associated with altered expression of HRAB18. This nucleotide sequence can be labeled by a conventionally known method and added to a sample of a patient's body fluid or tissue under hybridization conditions. After the incubation period, if the nucleotide has been labeled with an enzyme, the sample is washed with a compatible liquid containing a dye (or a label requiring other developing agents), if desired. After washing off this compatible liquid, the dye is quantified and compared to a standard value. If the amount of dye is significantly higher, the nucleotide sequence has hybridized to the sample and the assay has confirmed the presence of a disruption in membrane transport. The nucleotide sequence of hrab18 can be used to construct a hybridization probe for mapping the gene. The mapping of the nucleotide sequences disclosed herein to chromosomes and specific regions of chromosomes can also be performed using well-known gene and / or chromosome mapping techniques. Such techniques include in situ hybridization, linkage analysis for known chromosomal markers, hybridization screening using libraries or flow-sorted chromosomal preparations specific for known chromosomes, or artificial chromosome synthesis. YAC or P1 compounds are included. The fluorescence in situ hybridization technique of chromosome spread is described in other literature, that is, "Verma et al (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Technologies, Pergamon Press, NYC". Fluorescence in situ hybridization of chromosomal preparations and other physical chromosome mapping techniques can be linked to additional genetic map data. An example of genetic map data is "1994 Genome Issue of Science (265: 1981f)". The correlation between the location of hrab 18 on the physical chromosomal map and a particular disease (or predisposition to a particular disease) helps to define the extent of the region of DNA associated with this genetic disease. . The nucleotide sequence of the present invention can be used to detect differences between the gene sequence of a healthy individual and the gene sequence of a carrier or carrier of a genetic disease. The nucleotide sequence encoding HRAB18 can be used to create purified HRAB18 using well known recombinant DNA techniques. There are many literatures describing methods for expressing a gene after isolating the gene, and examples thereof include Go eddel (1990) Gene Expression Technology, Methods and Enzymology, Vol 185, and Academic Press, San Diego. There is. Purification steps will vary with the production process and the particular protein produced. Various methods for the isolation of HRAB polypeptides can be performed by known procedures, which are described in Deutscher M (1990) Methods in Enzymology, Vol 182, Academic Press, San Diego CA and Scopes R ( 1982) Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlaq, New York City, which is hereby incorporated by reference. HRAB18 can be expressed in various host cells, either prokaryotic or eukaryotic. Host cells can be obtained from the same species as the endogenous hrab18 nucleotide sequence, or from a different species. Advantages of producing HRAB18 by recombinant DNA technology include obtaining a highly concentrated source of protein for purification and making simple procedures available for purification. Cells transformed with the DNA encoding HRAB18 can be cultured under conditions suitable for expressing HRAB18 and recovering the protein from the cell culture medium. HRAB18 produced by recombinant cells can be secreted or retained intracellularly, depending on the particular gene structure used. Generally, it is more convenient to prepare the recombinant protein in a secreted form. In addition to recombinant production, HRA B18 fragments can be produced by direct peptide synthesis using solid phase technology. (See: Stewart et al (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co. San Francisco; Merriffid R (1963) J Am Chem Soc 85: 2149-2154). In vitro protein synthesis can be performed manually or automatically by machine. Automatic synthesis can be performed, for example, by using Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Foster City, California) according to the manufacturer's instructions. Various fragments of HRAB18 can also be chemically synthesized separately and combined by chemical methods to produce full-length molecules. HRAB18 for use in eliciting antibodies need not have biological activity, but the protein must be antigenic. The peptide used for eliciting an HRAB18-specific antibody may comprise an amino acid sequence consisting of at least 5, preferably at least 10, amino acids. This peptide should be identical to a portion of the amino acid sequence of the protein and may include the entire amino acid sequence of a small, naturally occurring molecule such as HRAB18. Short stretches of the amino acid sequence of HRAB18 can be fused to stretches of other proteins such as chimney hemocyanin (KLH, Sigma, St Louis, MO) and chimeric molecules used for antibody production. Antibodies specific for HRAB18 can be produced by inoculating a suitable animal with a polypeptide or antibody fragment. An antibody is specific for HRAB18 when it is raised against an epitope on a polypeptide and binds to at least a portion of a native or recombinant protein. The method of antibody production involves not only stimulating an immune response by injecting an animal but also screening a recombinant immunoglobulin library (Orlandi R et al (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 3833-3 837, or Huse WD et al (1989) Science 256: 1275-1281) or similar procedures for the production of antibodies and other specific binding molecules by synthesis, such as in vitro stimulation of leukocyte populations. included. Current technology (Winter G and Milstein in C (1991) Nature 349: 293-299) provides a number of highly specific binding reagents based on the principle of antibody formation. These techniques can be applied to the production of molecules that specifically bind to HRAB18. The present invention includes purified HRAB18 polypeptides selected from natural or recombinant sources, ie, cells transformed with a recombinant nucleic acid molecule encoding HRAB18. Various methods for isolating the HR AB18 polypeptide can be achieved by well-known procedures. For example, such polypeptides can be purified by immunoaffinity chromatography using an antibody according to the present invention. Various other methods for protein purification that are well known in the art include Deutscher M (1990) Methods in Enzymology, Vol 182, Academic Press, San Diego CA and Scopes R (1982) Protein Purification Promotion: PrinciplePricationPricingPrication: Springer-Verlaq, New York City, which is incorporated herein by reference. HRAB18 can be used for screening and designing drugs that can be used for regulating the expression of pituitary specific receptors and hormone secretion, which are related to the above expression of HRAB18. Alternatively, HRAB18 itself can be used to regulate the expression of specific receptors or to control excess hormone secretion. In addition, HRAB18 may exert a similar function in other nervous tissues, especially where the secretory pathway plays an important role in its function. HRAB18 as a bioactive agent or composition may be administered by any of several methodologies, including clinical studies in mammals to determine the maximum tolerated dose and routine human studies to determine a safe dose. Only the determined appropriate therapeutic dose can be administered. In addition, the bioactive agent can be synthesized with various well-established compounds or compositions that enhance pharmacological properties such as stability or half-life. Also, the therapeutic bioactive composition may be administered to the bloodstream by intravenous injection or other effective means that can be used to treat conditions associated with altered expression or activity of RAB protein. Is also contemplated. The following examples are provided to illustrate the invention. These examples are intended to be illustrative and not limiting of the present invention. Industrial applicability 1. Isolation of mRNA and construction of cDNA library Incyte Clone No. 112352 was identified among the sequences of a human pituitary cDNA library constructed from 21 pooled samples of normal human pituitary gland from the brains of Caucasian men and women aged 16 to 70 years. Was. Poly A + RNA was isolated using biotinylated oligo d (T) primer and paramagnetic particles (promega Corp, Madison WI) streptavidin and sent to Stratagene (La Jolla, CA). Stratagene has prepared a cDNA library using oligo d (T) priming. A synthetic adapter oligonucleotide was ligated to the cDNA molecule to allow insertion into the Uni-Zap ™ vector system. This system allows the construction of a highly efficient unidirectional (sense direction) lambda library and has the advantage that a phagemid system with blue / white selection can be used to detect clones into which cDNA has been inserted. Was. The quality of the cDNA library was screened with a DNA probe and then pBluescript® (Stratagene) was excised. This phagemid allows the expression of polymerized proteins, the generation of unidirectional deletions, site-directed mutagenesis, characterization of inserts, and the use of plasmid systems to facilitate sequencing. Subsequently, custom-made library phage particles were used. Infected with the E. coli host strain XL1 Blue® (Stratagene). This strain has a high transformation efficiency. This high efficiency increases the probability of obtaining infrequent, under-represented clones in a cDNA library. Other unidirectional vectors include, but are not limited to, pcDNAI (Invitrogen, San Diego CA) and pSHlox-1 (Novagen, Madison WI). 2. Isolation of cDNA clones Phagemid forms of individual cDNA clones were obtained by an in vivo excision process. In this process, XLI-BLUE® was co-infected with fl helper phage. Proteins derived from both lambda phage and the fl helper phage initiate new DNA synthesis from defined sequences on the lambda target DNA and replace the entire DNA sequence of the pBluescript® plasmid and cDNA insert. Create small single-stranded circular phagemid DNA molecules containing This phagemid DNA was released from the cells, purified, and then used to re-infect fresh bacterial host cells (SOLR) to produce double-stranded phagemid DNA. Freshly transformed bacteria were selected on media containing ampicillin because the phagemid carries the gene for β-lactamase. Phagemid DNA was purified using the QIAWELL-8 plasmid purification system from the QIAGEN® DNA purification system (QIAGEN Inc, Chat swallow CA). This technique is a fast, reliable and high-throughput method for lysing bacterial cells and isolating highly purified phagemid DNA. The DNA eluted from the purified resin is suitable for DNA sequencing and other analytical procedures. Alternative methods for purifying phagemids have recently become available. In this method, a Miniprep Kit (Catalog No. 77468: Advanced Genetic Technologies Corp., Gaithersburg MD) is used. This kit provides enough reagents for the purification of 960 in a 96-well format. The recommended protocol was adopted, but the following points were changed. First, each of the 96 wells is filled with 1 ml of sterile liquid medium containing 25 mg / l carbenicin and 0.4% glycerin. Bacteria are inoculated into the wells, cultured for 24 hours and lysed in 60 μl of lysis buffer. The block is centrifuged (2900 rpm for 5 minutes), then the contents of the block are added to the first filter plate. The optional step of adding isopropanol to the TRIS buffer, which is an optional step, is not routinely performed. After the final step in the protocol, the sample is sent to a Beckman 96-well block for storage. 3. Sequencing of cDNA clones The cDNA inserts randomly isolated from these hypothalamus libraries were Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno NV), and four Peltier Thermal Cyclers (PTC200; MJ Research, Watertown MA) and the theme of the patents. Used with Sanger F. 377 and 373 DNA sequencers. and AR Coulson (1975; J. Mol. Biol. 94: 441f) and the reading frame was determined. 4. Homology search for cDNA clones and deduced proteins Each sequence obtained in this way was compared to the GenBank sequence using a search algorithm from Applied Biosystems incorporated into the INHERIT ™ 670 Sequence Analysis System. In this algorithm, the region of homology was determined using Pattern Specification Language (TRW Inc., Los Angeles CA). The three parameters that determine how the sequence comparison is performed were window size, window offset, and error tolerance. Using a combination of these three parameters, sequences containing regions of homology to the sequence of interest were searched from a DNA database and appropriate sequences were scored with initial values. Subsequently, these homologous regions were tested using the dot matrix homology plot method to discriminate between accidental matches and true homologous regions. A Smith-Waterman alignment was used to display the results of the homology search. Peptide and protein sequence homology was confirmed using an INHERIT ™ 670 Sequence Analysis System in a manner similar to DNA sequence homology testing. Using a Pattern Specification Language and a parameter window, a database of protein sequences containing homologous regions was searched, and the homologous regions were scored and displayed along with the initial values. The test was performed by the dot matrix homology plot method to distinguish significant regions of homology from accidental matches. As another form, BLAST (Basic Local Matching Search Tool) (“Basic Local Alignment Search Tool (Altsch hul SF (1993) J Mol Evol 36: 290-300, Altschul, SF et al (1990) J Mol Biol)” 215: 403-10) ") was searched for local sequence matches. BLAST detects both nucleotide and amino acid sequence alignments to determine sequence similarity. BLAST is particularly useful for determining exact matches or for homology searching because of the locality of the alignment. Ideally, matches should not include gaps, but motif style searches are not appropriate. The basic unit of the output of the BLAST algorithm is a High-scoring Segment Pair (HSP). The HSP consists of two sequence fragments whose lengths where the alignment is locally maximal are equal and whose alignment score is greater than or equal to the cut-off or threshold score set by the user. Searching for HSPs between the sequence of interest and the database sequence by the method using BLAST, assessing the statistical significance of the found matches, and knowing only those matches that exceed the user-selected superiority threshold Can be. Parameter E is a parameter that sets a threshold of statistical significance for selecting the one reported on a match with the database sequence. E is interpreted as an upper bound on the expected frequency of accidental matches of the HSP (or set of HSPs) in the context of the overall database search. Database sequences that satisfy E are reported in the output of the program. The nucleotide sequence of the entire coding region of the human mouse RAB18 homolog HRAB18 (included in SEQ ID NO: 1) is shown in FIG. As a result of a search using BLAST, when compared with the mouse rab18 gene (GenBank accession numbers X80333 and L04966), the coding sequence of the clone of the present invention had 156 as the E parameter value. This coding sequence has an E value of 54 with the human rab2 coding sequence (GenBank accession numbers M28213), and has a shared portion of 51 HSP sequences with the E value with the human rab13 coding sequence (GenBank accession numbers X75593). I have. This coding sequence also shares its HSP sequence with several clones in the LIFESEQ® database (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto California), which include insights from corneal stroma Clone 45334 (E = 37), insight clone 57291 (E = 37) derived from skeletal muscle, and insight clone 181288 (E = 36) derived from human placenta. All three of these tissues are enervated. The presence of nucleotide sequences closely related to hrb18 in these tissue types is a consequence of the presence of neurons containing closely related rab proteins involved in secretory vesicle trafficking. In addition, the insight clone 269502 from the neural cell line (hNT) contains a coding sequence that shares high homology (87%) with the mouse rab 18 gene. 5. Gene identification and full-length sequencing The complete hrab 18 nucleotide sequence was obtained from Incyte clone 112352. The sequence of the full-length hrab18 gene was translated and putative in-frame translation is shown in FIG. A search of all three possible predicted translations of this sequence in a protein database such as SwissProt or PIR did not find an exact match for the possible translation of HRAB18. FIG. 2 shows a comparison between the HRAB18 amino acid sequence and the sequence of GenBank mouse RAB18. Substantial homologous regions in these molecules include full-length molecules with only two of the 207 residues that are not conserved. 6. Antisense analysis Knowing the cDNA sequence of the hrab18 gene makes it possible to apply it to the antisense technology for studying gene function. Genomic or cDNA fragments or oligonucleotides containing the antisense strand of hrab18 can be used in vitro or in vivo to inhibit the expression of certain proteins. Such techniques are well known and probes are designed to attach to various sites in the nucleotide sequence. By treating cells or whole animals with such antisense sequences, the function of the gene of interest can be effectively blocked. In many cases, the function of the gene can be confirmed by observing behavior at the cellular, tissue, or whole organism level (eg, mortality, loss of differentiated function, morphological changes, etc.). it can. Modifies gene expression by designing antisense sequences to intron regions, promoter / enhancer elements, or trans-acting regulatory genes, in addition to using sequences constructed to prevent open reading frame transcription I can do it. Similarly, inhibition can be achieved using Hogeboom base pairs known as "triple helix" base pairs. 7. Expression of HRAB18 Expression of hrab18 is achieved by subcloning the cDNA into a suitable expression vector and infecting the vector with a suitable expression host. This cloning vector used for the generation of tissue libraries is described in E. coli. It is used for expression of hrab18 in E. coli. Upstream of the cloning site, the vector contains the promoter for β-galactosidase, followed by the nucleotide sequence encoding the amino-terminal Met, followed by the seven residues of β-galactosidase. Immediately following these eight residues are engineered bacteriophage promoters useful for artificial priming and transcription, and unique restriction sites for multiple clonings, including EcoRI. Induction of the isolated IPTG transfected strain using standard methods resulted in the fusion protein and cDNA corresponding to the first seven residues of β-galactosidase and about 15 residues of the linker. An encoded peptide is generated. Since the cDNA clone insert is always generated by a random process, there is only one in three chances that the contained cDNA will be in the correct reading frame for proper translation. If the cDNA is not in the proper reading frame, it can be obtained by deleting or inserting an appropriate number of bases in a known manner. Such methods include in vitro mutagenesis, digestion with exonuclease III or soy nuclease, or contamination with oligonucleotide linkers. The hrab18 cDNA is shuttled into other vectors known to be useful for expression of the protein in a specific host. Oligonucleotide amplimers containing enough segments of DNA and cloning sites to hybridize to the stretches at both ends of the target cDNA (25 bases) can be chemically synthesized by standard methods. The desired gene segment is then amplified by PCR using these primers. The resulting new gene segment is digested with appropriate restriction enzymes under standard conditions and isolated by gel electrophoresis. Alternatively, similar gene segments are generated by digesting cDNA with appropriate restriction enzymes and filling in the missing gene segments with chemically synthesized oligonucleotides. By linking segments of the coding sequence from one or more genes to each other and cloning into an appropriate vector, the expression of the recombinant sequence is optimized. Suitable expression hosts for such chimeric molecules include mammalian cells such as Chinese hamster ovary (CHO) and human 293 cells, insect cells such as Sf9 cells, and yeast cells such as Saccharomyces cerevisiae. Cells or E. coli. Bacteria such as, but not limited to, coli. Useful expression vectors for each of these cell lines include origins of replication that allow for growth in bacteria, and selectable sources such as the beta-lactamase antibiotic resistance gene that allow for selection in bacteria. Contains various markers. In addition, the vector contains a second selectable marker, such as the neomycin phosphotransferase gene, which is useful for transfection of eukaryotic host cells. For use in eukaryotic expression hosts, the vector may require RNA processing elements, such as a 3 'polyadenylation sequence, if it is not part of the cDNA of interest. In addition, the vector contains an enhancer or promoter that increases gene expression. Such promoters are host specific, such as the MM TV, SV40, and metallothionein promoters for CHO cells, the trp, lac, tac, and T7 promoters for bacterial hosts, and for yeast. α factor, alcohol oxidase, and PGH promoter. Transcriptional enhancers, such as the Rous Sarcoma Virus (RSV) enhancer, are used in mammalian host cells. Once a homogenous culture of recombinant cells is obtained by standard culture methods, large amounts of recombinantly produced HRAB18 are recovered from the conditioned medium and analyzed using well-known chromatographic methods. . 8. Isolation of recombinant HRAB18 HRAB18 is expressed as a chimeric protein with one or more additional polypeptide domains added to facilitate protein purification. Such purification-promoting domains include metal-chelating peptides such as the histidine-tryptophan module, which allow for purification on immobilized metals, protein A domains, which allow for purification on immobilized immunoglobulins, and FLAGS extensions / It includes, but is not limited to, domains used in affinity purification systems (Immunex Corp. Seattle WA). The inclusion of a cleavable linker sequence, such as factor XA or enterokinase (In vtrogen), between the purification domain and the hrab18 sequence has helped facilitate purification from the fusion protein complex. 9. Generation of HRAB18-specific antibodies Two methods are used to generate antibodies to HRAB18. Each method is useful for producing either polyclonal or monoclonal antibodies. In one such method, reverse phase HPLC separation yields up to 75 mg of denatured protein. Denatured proteins are used to immunize mice or rabbits using standard protocols. Thus, about 100 μg is appropriate for immunization of mice, and up to 1 mg can be used for immunization of rabbits. For identification of mouse hybridomas, the denatured protein is labeled with radioactive iodine and used to screen for murine B-cell hybridomas capable of producing antibodies. Only a small amount of protein is required for this procedure, i.e., 20 mg is sufficient for labeling and screening thousands of clones. In the second method, the amino acid sequence of HRAB18 deduced from the transcription of the cDNA is analyzed to determine a region with high immunogenicity. Oligopeptides containing the appropriate hydrophilic regions are synthesized and used in an appropriate immunization protocol to raise antibodies. Assays for selecting appropriate epitopes are described by Ausubel FM et al. (Supra). Optimal amino acid sequences for immunization usually reside in the C-terminus, the N-terminus, and the poly- sandwich between them, which is often exposed to the external environment when the protein is in its natural conformation. The hydrophilic region of the peptide. Typically, selected peptides of length about 15 residues are synthesized using an Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 431A using fmoc-chemistry, and M-mailimidobenzoyl-N-hydroxysuccinate. Reaction with an acid imide ester (M-male imidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester) (MBS; Ausubel FM, etc., supra) binds to keyhole limpet hemocyanin (KLH, Sigma). If necessary, a cysteine is inserted at the N-terminus of the peptide to allow it to bind to KLH. Rabbits are immunized with complete Freund's adjuvant peptide-KLH complex. The resulting antiserum was obtained by binding the peptide to plastic, blocking with 1% bovine serum albumin, reacting with the antiserum, washing, and labeling (with a radioactive or fluorescent agent) affinity purified specific. The anti-peptide activity is tested by reacting with a typical goat anti-rabbit IgG. Hybridomas are prepared and screened using standard techniques. Hybridomas of interest are detected by screening with labeled HRAB18 to identify fusions producing monoclonal antibodies with the desired specificity. In a typical protocol, the wells of the plate (FAST; Becton-Dickinson, Palo Alto, Calif.) Contain 10 mg / ml of an affinity-purified specific rabbit anti-mouse (or 1 g of appropriate anti-species) antibody. Coated by The coated holes are blocked with 1% BSA, washed and exposed to the supernatant from the hybridoma. After incubation, the wells are exposed to 1 mg / ml of labeled HRAB18. Antibody-producing clones bind to detectable amounts of labeled HRAB18 in the background described above. Such clones are expanded and undergo two cycles of cloning at limiting dilution (1 cell / 3 well). The cloned hybridoma is injected into a pristane-treated mouse, which generates ascites, and monoclonal antibodies are generated from the mouse ascites by affinity chromatography on protein A. At least 10 ⁸ / M, preferably 10 ⁹ -10 ^Ten Monoclonal antibodies with or higher affinity are typically described in Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY and 86Med. generated by standard procedures such as those described in Rinciples and Practice, Academic Press, New York City. Please refer to these two materials here. 10. Diagnostic test using HRAB18-specific antibodies Certain HRAB18 antibodies are useful in diagnosing disorders characterized by differences in the amount or distribution of HRAB18 in cells from the pituitary and other neurons. Diagnostic tests for HR AB18 include methods that use antibodies and labels to detect HRAB18 in human body fluids, tissues, or extracts of such tissues. The polypeptides and antibodies of the present invention may be used with or without modification. The polypeptides and antibodies are often labeled by binding, either covalently or non-covalently, a substance that produces a detectable signal. Various labels and their related technologies are known and have been widely reported in both scientific documents and patent specifications. Suitable labels include radionuclides, enzymes, substrates, cofactors, inhibitors, fluorescent agents, chemiluminescent agents, magnetic particles, and the like. Methods of using such labels are described in U.S. Patent Application Nos. 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350, 3,996,345, and 4,277,437. Nos. 4,275,149 and 4,366,241. Recombinant immunoglobulins can be produced by the method described in US Patent Application No. 4,816,567. Reference is made to these specifications together with the present specification. Various protocols are known for measuring soluble or membrane-bound HRAB18 using either polyclonal or monoclonal antibodies specific for the protein. Examples include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), and fluorescence activated cell sorting (FACS). Preferred is a two sites monoclonal immunoassay using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering epitopes on HRAB18, but a competitive binding assay may be used. These assays are described in other documents such as, for example, Maddox, DE et al. (1983, J Exp Med 158: 1211). 11. Purification of native HRAB18 using specific antibodies Native or recombinant HRAB18 is purified by immunoaffinity chromatography using an antibody specific for HRAB18. Generally, an immunoaffinity column is constructed by covalently linking an anti-HRAB18 antibody and an activated chromatographic resin. Polyclonal immunoglobulin is prepared from immune serum by precipitation with ammonium sulfate or by purification on immobilized Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway NJ). Similarly, monoclonal antibodies are prepared from mouse ascites by ammonium sulfate precipitation or by chromatography on immobilized Protein A. The partially purified immunoglobulin is covalently attached to a chromatography resin such as CnBr-activated Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology). By processing according to the manufacturer's instructions, the antibody binds to the resin, which is blocked and the derivative resin is washed. Such an immunoaffinity column is used when purifying HRAB18 by preparing a fraction of cells containing HRAB18. This preparation is derived by solubilizing all cells and isolating the resulting subcellular fraction using different centrifugation methods, or by other methods well known in the art. In another method, soluble HRAB18 containing a signal sequence is secreted in an amount useful for the medium in which the cells grow. The soluble HRAB18-containing precipitate is passed through an immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that allow for preferential absorption of HRAB18 (ie, using a high ionic strength buffer in the presence of detergent). The column is then eluted under conditions that cleave the antibody / HRAB18 bond (ie, using a high concentration of chaotropes such as urea or thiocyanate ions or a buffer of pH 2-3) and HRAB18 is recovered. Is done. 12. Localization and activity of HRAB18 HRAB18 may be localized to neurons, especially pituitary cells, as follows. First, E. coli expressing a protein whose C-terminus is prenylated in vitro. Either purified HRAB18 or naturally occurring HRAB18 from E. coli is obtained. This prenylation allows HRAB18 to be localized to intracellular compartments inside the cell, such as the cycle endosome, trans-Golgi network, cis-Golgi network, or endoplasmic reticulum. Prenylated HRAB18 is added to cell-free systems such as those in which the plasma membrane has been solubilized by digitonin. This HRAB18 is added at a concentration such that it is observed that HRAB18 specifically bound to a specific subcellular fraction. This localization is monitored using a radiolabeled antibody. Once HRAB18 is localized to a particular cell fraction, it is possible to study cell delineation systems to investigate its function. For example, a cell depletion system can be created that allows measurement of vesicle transport from the endoplasmic reticulum to the trans-Golgi network. Preferably, the cell depletion system depletes naturally occurring HRAB18 so that the effect of the cell depletion system lacking RAB18 on vesicle trafficking can be studied. The concentration of HRAB18 is gradually increased and the activity of HRAB18 in vesicle transport is restored. This method is used to test the biological activity of HRAB18 derivatives. 13. Drug screening HRAB18 or a host cell containing HRAB18 is used to screen for compounds that can affect vesicle trafficking by HRAB18, its isoforms, or other RAB proteins. The polypeptides or fragments utilized in such tests are used in cell-free systems or are located intracellularly. One method of compound screening employs a eukaryotic or prokaryotic host cell that has been stably transformed with a recombinant nucleic acid that expresses the polypeptide of the fragment. Drugs are screened against such transformed cells in a combined binding assay. For example, the alternation of vesicular transport of a particular peptide or neurotransmitter can be measured. Accordingly, the present invention provides a method of screening for a test compound that affects the activity of HRAB18. This method includes a step of bringing a compound into contact with HRAB18 and a step of assaying the presence of a complex between the compound and HRAB18 by a conventionally known method. After a suitable incubation, the released compound is separated from the bound form, and the amount of the bound compound is a measure of its ability to buffer the regulatory function of HRAB18. Other techniques for drug screening provide high throughput of screening for compounds with appropriate binding affinity to HRAB18, which is described in EP 84/03564 published September 13, 1984. It is described in detail and reference is made here. Compounds that specifically bind to HRAB18 are determined using a competitive drug screening assay in which neutralizing antibodies capable of binding to HRAB18 compete with test compounds that bind to HRAB18. In this method, antibodies are used to detect the presence of any peptide that shares one or more antigenic determinants with HRAB18. 14． Rational drug design The goal of rational drug design is to generate structural analogs of the biologically active polypeptides of interest or of the small molecules with which they interact (eg, non-hydrolysable analogs of GTP). It is. Any of these examples can be used to form drugs where the activity and stability of the polypeptide are better, or which interfere with polypeptide function in vivo. (See Hodgs on J (1991) Bio / Technology 9: 19-21) In one method, the three-dimensional structure of the protein of interest or protein-inhibitor complex is determined by X-ray crystallography, computer modeling, or Typically, it is determined by combining these two methods. Both the shape and charge of the polypeptide must be confirmed to clarify the structure and determine the active site of the molecule. Useful information about the structure of a polypeptide may be obtained by modeling based on the structure of homologous proteins. In both cases, the resulting structural information is used to design effective inhibitors. Useful examples of rational drug design include fractions with improved activity and stability as shown by Braxton S and Wells JA (1992 Biochemistry 31: 779 6-7801), or Athauda SB and the like (1993 J Biochem). 113: 742-746), there are molecules that function as inhibitors, agonists or antagonists of natural peptides, to which reference is now made. It is also possible to isolate a target-specific antibody selected by a functional assay as described above and then elucidate its crystal structure. This method, in principle, forms the pharmacore upon which the next drug design is based. It is also possible to skip protein crystal analysis by generating anti-ids to functional, pharmacologically active antibodies. In the context of a mirror image of a mirror image, the binding site of anti-ids is expected to be an analog of the original receptor. The anti-ids are then used to identify and isolate peptides from Bank, a chemically or biologically produced peptide. The isolated peptide functions as a pharmacore. HRAB18 can be used to perform analytical studies such as X-ray crystallography. Further, knowing the HRAB18 amino acid sequence used herein provides guidance on using it in place of X-ray crystallography, and additionally using computer modeling techniques. 15. Use and administration of drugs Many diseases are associated with abnormal secretion of hormones and abnormal recycling of surface receptors in secretory tissues, especially pituitary tissue. For example, atrophy is often caused by a deficiency in all secretions of the anterior pituitary gland, and giantosis is caused by overactivity and secretion of GH by somatropin cells. All of these diseases can be associated with dysregulation of vesicle trafficking, fusion, and targeting associated with aberrant expression of HRAB18. Furthermore, because HRAB18 may play a role in endocytosis, aberrant expression of HRAB18 may result in disorders involving aberrant receptor recycling. Compounds that bind to HRA B18 treat abnormal levels of pituitary cell surface receptors and abnormal pituitary hormone secretion, as HRA B18 appears to regulate vesicle trafficking in subcellular compartments or intervals. Can be used therapeutically. Alternatively, these compounds may also regulate abnormal secretion of neurotransmitters from nerve cells. Furthermore, HR AB18 itself can be administered to treat disorders associated with aberrant expression of HRAB18. The therapeutic compound is formulated in a non-toxic, inert, pharmaceutically acceptable aqueous carrier medium. The pH of the medium is preferably about 5 to 8, particularly preferably 6 to 8. However, this pH can vary with formulation and administration characteristics. These and other properties, such as the solubility, half-life and antigenicity / immunoantigenicity of the molecule will help determine an effective carrier. Recombinant or organic or synthetic molecules obtained from drug design can be effective as well. The therapeutic compound is administered by well known routes of administration. This route of administration includes topical creams and gels, transmucosal sprays and aerosols, transdermal patches and bandages, injectable intravenous irrigation formulations, and oral liquid and tablet preparations for gastric acids and enzymes. Examples include, but are not limited to, compounds formulated to have resistance. The particular formulation, correct dosage, and route of administration are determined by the hospital physician, but may vary depending on the situation. Such a determination is made by considering various factors, such as the therapeutic condition, the therapeutic compound to be administered, or the pharmacokinetic profile of the particular therapeutic compound. Other factors to consider include the patient's medical condition (eg, seriousness), age, weight, sex, diet, time, and frequency of administration, drug combinations, response sensitivities, and tolerance / responsiveness to treatment. and so on. The frequency of administration of a long-acting formulation of LST may be as low as once every 3 to 4 days, once a week, or once every two weeks, depending on the particular therapeutic Determined by the half-life and clearance rate of HRAB18. Typical doses are between 0.1 and 100,000 μg, with an upper limit of about 1 g for a total dose, which depends on the route of administration. Guidance as to particular dosages and modes of administration is provided in U.S. Patent Nos. 4,657,760, 5,206,344 or 5,225,212. It is also anticipated that different formulations will be effective for the administration of different therapeutic compounds, and that specific administration methods will be required for administration to certain tissues and organs. All publications and patent specifications mentioned in this specification are to be incorporated herein by reference. The above specification is believed to be sufficient to enable one skilled in the art to practice the invention. Indeed, various modifications of the above-described embodiments, which will be apparent to those skilled in the art, are intended to be made in the practice of the invention without departing from the scope of the invention as set forth in the claims below.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＩＬ，ＪＰ， ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ (72)発明者 シールヘイマー、ジェフリー・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94022・ ロスアルトスヒルズ・ラクレスタ 12555──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12P 21/02 G01N 33/15 Z C12Q 1/68 33/50 Z G01N 33/15 C12N 15/00 ZNAA 33 / 50 5/00 A (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AT, AU, BR, CA, CH, CN, DE, DK, ES, FI, GB, IL, JP, KR, MX, N , NZ, RU, SE, SG (72) inventor seal Hamer, Jeffrey Jay, California, USA 94022 Los Altos Hills Rakuresuta 12555

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．配列番号：２に示された配列、またはその相補的な配列を有するポリペプチ ドをコードする核酸配列を含む精製ポリヌクレオチド。 ２．前記核酸配列が配列番号：１に示された配列の４５番目から６６４番目のヌ クレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ３．配列番号：１の核酸配列の１番目から４４番目のヌクレオチドを含むことを 特徴とする精製ポリヌクレオチド。 ４．配列番号：１の核酸配列の６６５番目から１１４８番目のヌクレオチドを含 むことを特徴とする精製ポリヌクレオチド。 ５．請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 ６．請求項５の発現ベクターを含む宿主細胞。 ７．請求項２のポリヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的なポリヌク レオチド配列を含むアンチセンス分子。 ８．配列番号：２に示された配列を含むポリペプチドを生成するための方法であ って、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項６の宿主細胞を培養 する過程と、 ｂ）前記細胞培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを有することを特徴 とする配列番号：２に示された配列を含むポリペプチドの生成方法。 ９．配列番号：２に示されたアミノ酸配列を有する精製ＨＲＡＢ１８。 １０．請求項９に記載の精製ポリペプチドに対して特異的な抗体。 １１．複数のテスト化合物から、請求項９のポリペプチドまたはその部分に結合 するものをスクリーニングする方法であって、 ａ）複数のテスト化合物を提供する過程と、 ｂ）適切な条件の下で、請求項９のポリペプチドまたはその部分と、 前記複数の化合物のそれぞれとを結合し得るだけの十分な時間をかけて結合する 過程と、 ｃ）請求項９のポリペプチドまたはそのフラグメントと前記複数の化合物のそ れぞれとの結合を検出し、請求項９のポリペプチドまたはそのフラグメントに特 異的に結合する化合物を同定する過程とを含むことを特徴とする複数のテスト化 合物から、請求項９のポリペプチドまたはその部分に結合するものをスクリーニ ングする方法。 １２．生物学的試料においてＨＲＡＢ１８をコードする核酸配列を検出するため の診断テスト方法であって、 ａ）前記生物学的試料における配列番号：１の核酸配列と相補的な核酸配列と の核酸ハイブリダイゼーション複合体の形成のために適切な条件の下で、配列番 号：１の核酸配列またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドと前記生物学 的試料とを結合する過程と、 ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程と、 ｃ）前記ハイブリダイゼーション複合体の量と標準値とを比較する過程とを有 することを特徴とし、 前記ハイブリダイゼーション複合体の異常レベルの存在がＨＲＡＢ１８の異常 発現に関連する状態と正の相関性を有することを特徴とする生物学的試料におい てＨＲＡＢ１８をコードする核酸配列を検出するための診断テスト方法。 １３．生物学的試料においてＨＲＡＢ１８をコードするヌクレオチド配列を検出 するための診断テスト方法であって、 ａ）核酸増幅に適切な条件の下で、前記生物学的試料とＰＣＲプライマーとを 結合する過程であって前記プライマーが配列番号：１のヌクレオチド配列の断片 を含む、該過程と、 ｂ）増幅されたヌクレオチド配列を検出する過程と、 ｃ）前記生物学的試料における増幅されたヌクレオチド配列の量と標準値とを 比較して、前記ヌクレオチド配列の量が前記標準値からずれているか否かを判定 する過程とを有することを特徴とし、 前記ヌクレオチド配列の異常レベルの存在が、ＨＲＡＢ１８の異常発現に関連 する状態と正の相関性を有することを特徴とする生物学的試料においてＨＲＡＢ １８をコードするヌクレオチド配列を検出するための診断テスト方法。[Claims] 1. Polypeptide having the sequence shown in SEQ ID NO: 2 or its complementary sequence A purified polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding a code. 2. The nucleic acid sequence is a nucleotide from position 45 to position 664 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1. The polynucleotide of claim 1, comprising a nucleotide. 3. SEQ ID NO: 1 contains the nucleotides from position 1 to position 44 of the nucleic acid sequence. A purified polynucleotide characterized by: 4. It contains nucleotides 665 to 1148 of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1. A purified polynucleotide, characterized in that: 5. An expression vector comprising the polynucleotide according to claim 1. 6. A host cell comprising the expression vector of claim 5. 7. A polynucleotide that is complementary to at least a portion of the polynucleotide of claim 2. An antisense molecule containing a reotide sequence. 8. A method for producing a polypeptide comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 2. What   a) culturing the host cell of claim 6 under conditions suitable for expression of the polypeptide; The process of   b) recovering the polypeptide from the cell culture medium. A method for producing a polypeptide comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 2. 9. Purified HRAB18 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. 10. An antibody specific for the purified polypeptide of claim 9. 11. Binding to the polypeptide of claim 9 or a portion thereof from a plurality of test compounds. A method of screening for   a) providing a plurality of test compounds;   b) under appropriate conditions, the polypeptide of claim 9 or a portion thereof; Binding for a time sufficient to bind to each of the plurality of compounds Process   c) combining the polypeptide of claim 9 or a fragment thereof with said plurality of compounds. The binding to each of them is detected, and the polypeptide or fragment thereof according to claim 9 is detected. Identifying a compound that binds differentially. 10. A compound which binds to the polypeptide of claim 9 or a portion thereof from the compound. How to play. 12. To detect a nucleic acid sequence encoding HRAB18 in a biological sample Diagnostic test method,   a) a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the biological sample Under conditions appropriate for the formation of the nucleic acid hybridization complex of SEQ ID NO: No. 1. A polynucleotide comprising the nucleic acid sequence of 1 or a fragment thereof, Combining the target sample with   b) detecting the hybridization complex;   c) comparing the amount of the hybridization complex with a standard value. Is characterized by   The presence of an abnormal level of the hybridization complex is indicative of an abnormality of HRAB18. A biological sample characterized by a positive correlation with an expression-related condition Diagnostic test method for detecting a nucleic acid sequence encoding HRAB18 by immunoassay. 13. Detects nucleotide sequence encoding HRAB18 in biological sample Diagnostic test method for performing   a) combining the biological sample with PCR primers under conditions suitable for nucleic acid amplification; Wherein the primer is a fragment of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 The process comprising:   b) detecting the amplified nucleotide sequence;   c) determining the amount of the amplified nucleotide sequence in the biological sample and a standard value; Comparing to determine whether the amount of the nucleotide sequence deviates from the standard value Characterized by having a process of   The presence of abnormal levels of said nucleotide sequence is associated with abnormal expression of HRAB18 HRAB in a biological sample characterized by having a positive correlation with A diagnostic test method for detecting the nucleotide sequence encoding 18.