JP2001516341A - 造血細胞の増強 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は造血幹細胞又は前駆細胞をプロラクチンを含む組成物と接触させることにより造血を増強する方法に関する。好ましくは使用されるプロラクチンは組換えプロラクチンである。造血の刺激は、造血細胞が治療薬又は処置のために除去されるとき、それを置換するのに役立ち得る。この増強はまた、枯渇した又は機能が弱まった細胞集団に対して新たな又は追加的な細胞系統を補充するためにも機能し得る。さらに本発明は、プロラクチンを含む薬剤的に許容される組成物を投与することによって、造血を増強する又は造血抑制を予防するために動物を処置する方法に関する。さらに本発明は、造血を増強し得るサイトカイン及びプロラクチンを含む組成物に関する。さらに本発明は、造血抑制を起こし得る治療薬及びプロラクチンを含む組成物に関する。
Description
【発明の詳細な説明】
造血細胞の増強
関連出願への相互参照
本出願は、1997年1月21日に提出された米国仮出願第60/035,8
75号に関連し、その優先権を伴う。
従来の技術
胎児期の間、全血液細胞の産生は、始めは血島で、次いで肝臓及び脾臓で起こ
る。この機能は次第に骨髄に、そしてますます扁平骨に取って代わられる。それ
で、思春期までには、このプロセスは主として胸骨、脊椎、腸骨及び肋骨で起こ
るようになる。これらの骨に見出される赤色骨髄は、長柱の間に存在するスポン
ジに似た網様状の外郭構造より構成される。この外郭構造中の空間は脂肪細胞に
満たされていて、脂肪細胞は成熟すると濃密な脈管洞の網から出て循環系の一部
になる。
すべての血液細胞は共通の幹細胞を起源とし、これが特殊な系統(即ち、赤血
球系、巨核球系、顆粒球系、単球系及びリンパ球系)だけに専ら分化するように
なる。骨髄中の前駆細胞の増殖及び分化はある種のサイトカインによって刺激さ
れる。これらサイトカインの多くが「コロニー刺激因子」とも呼ばれるのは、骨
髄細胞由来の種々の白血球コロニーの成長及び発達を刺激するその能力によって
アッセイされるからである。様々なサイトカインが様々な系統の骨髄前駆細胞の
増殖及び成熟化を促進することが知られているが、自己再生的な多能性幹細胞の
本質やそれが特定の系統だけに分化することを調節するメカニズムについてはほ
とんどわかっていない。
上記のサイトカインはますます研究されていて、その造血調節的な性質に関連
した潜在的な臨床応用に使用される場合もある。それらの潜在能力のために、同
様な性質を有する物質の発見にも臨床応用の可能性があるかもしれない。そのよ
うな物質を発見する必要性が存在するのである。
発明の概要
本発明は造血多能性幹細胞又は前駆細胞をプロラクチンを含む組成物と接触さ
せることにより造血を増強する方法に関する。好ましくは使用されるプロラクチ
ンは組換えプロラクチンである。造血の刺激は、造血細胞が治療薬又は処置のた
めに除去されるとき、それを置換するのに役立ち得る。この増強はまた、枯渇し
た又は機能が弱まった細胞集団に対して新たな又は追加的な細胞系統を補充する
ためにも機能し得る。
さらに本発明は、プロラクチンを含む薬剤的に許容される組成物を投与するこ
とによって、造血を増進する又は造血抑制を予防するために動物を処置する方法
に関する。
さらに本発明は、造血を増強し得るサイトカイン及びプロラクチンを含む組成
物に関する。
さらに本発明は、造血抑制を起こし得る治療薬及びプロラクチンを含む組成物
に関する。
図面の簡単な説明
図1Aは、増進された累積細胞充実度によって証明されるように、組換えヒト
プロラクチンが長期骨髄培養において造血前駆細胞の成長を促進することを示す
グラフ図である。
図1Bは、コロニー形成単位−培養系アッセイによって測定されるように、組
換えヒトプロラクチンが長期骨髄培養において造血前駆細胞の成長を促進するこ
とを示すグラフ図である。
図1Cは、バースト形成単位−赤芽球系アッセイによって測定されるように、
組換えヒトプロラクチンが長期骨髄培養において造血前駆細胞の成長を促進する
ことを示すグラフ図である。
図2は、アジドチミジン(AZT)が骨髄細胞中の造血前駆細胞含量を有意に
低下させること及びプロラクチンがヘマトクリットによって測定されるようにそ
の効果を中和することを示すグラフ図である。
図3Aは、増進された累積細胞充実度によって証明されるように、骨髄細胞中
の造血前駆細胞含量を有意に低下させるアジドチミジンの骨髄抑制効果をプロ
ラクチンが中和することを示すグラフ図である。
図3Bは、コロニー形成単位−培養系アッセイによって測定されるように、骨
髄細胞中の造血前駆細胞含量を有意に低下させるアジドチミジンの骨髄抑制効果
をプロラクチンが中和することを示すグラフ図である。
図3Cは、バースト形成単位−赤芽球系アッセイによって測定されるように、
骨髄細胞中の造血前駆細胞含量を有意に低下させるアジドチミジンの骨髄抑制効
果をプロラクチンが中和することを示すグラフ図である。
図4は、ヘマトクリットによって測定されるように、前処置したマウスにおい
て、プロラクチンがAZTの骨髄抑制効果を予防することを示すグラフ図である
。
図5は、ヘマトクリットによって測定されるように、プロラクチンがAZTの
骨髄抑制効果を逆転させ得ることを示すグラフ図である。
図6Aは、プロラクチンが血小板含量を増加させることを示すグラフ図である
。
図6Bは、プロラクチンが白血球数を増加させることを示すグラフ図である。
図7A及び7Bは、血球百分率分析によって、血液中のリンパ球及び好中球の
比率が有意に増加し、プロラクチンが末梢リンパ球及び好中球の発達を増進させ
たことを示唆するグラフ図である。
図8は、KLH(アオガイ[keyhole limpet]ヘモシアニン)
特異的IgG及びIgMの増加した産生によって測定されるように、KHLに対
する応答性を増進することによってプロラクチンがB細胞の前駆細胞に影響を及
ぼしたことを示すグラフ図である。
図9は、細胞毒性によって評価されるように、プロラクチンがナチュラルキラ
ー細胞の機能を強めることを示すグラフ図である。
発明の詳細な説明
[定義]
ここに使用される「プロラクチン」とは、当業者に知られた組織培養又は組換
え技術及び他の技術によって得られるポリペプチドを指し、このタンパク質を特
徴付ける活性スペクトルを示すものである。この言葉はヒトプロラクチン(hP
RL)だけでなく、マウス、ラット、霊長類、ウサギ、ブタ(ヒツジ)及び雌牛
(ウシ属)のプロラクチンのような他の哺乳類のプロラクチンも含む。組換えP
RL(r−PRL)は、任意の活性フラグメント又は活性プロラクチン配列を含
む。
「組換えPRL」なる用語は、r−PRLと略記され、好ましくはヒトプロラ
クチンであり、当業者に知られている組換えDNA技術によって製造される天然
のプロラクチンに匹敵する生物活性を有するプロラクチンを指す。
「血液形成(hematopoiesis)」又は「造血(hemopoies
is)」なる用語は、多能性幹細胞、骨髄性前駆細胞、リンパ様の前駆細胞及び
それらから派生する血小板等の血液産物を含む種々のタイプの細胞の形成及び発
達を含む従来からの言葉の意義を指す。
「薬剤的に許容される組成物」という句は、動物に投与したときにその動物に
よって許容される任意のフォーミュレーション又は調製物を指す。投与には、経
口投与及び皮下、腹膜腔内、静脈内、皮内、筋肉内投与等を含む注射がある。
「造血抑制」なる用語は、AZT、放射線、細胞減少性の処置、化学療法、細
胞溶解療法、免疫細胞溶解療法又はそれらの組み合わせのような処置によって引
き起こされる骨髄抑制又はリンパ抑制を含む。
ここに使用される「サイトカイン」又は「サイトカイン類」なる用語は、幹細
胞又は前駆細胞の増大及び分化を刺激し得る任意のサイトカイン又は成長因子又
はコロニー刺激因子を意味するとされている。サイトカインには、インターロイ
キン−1、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−
4、インターロイキン−6、インターロイキン−7、インターロイキン−9、イ
ンターロイキン−11,インターロイキン−15、c−Kitリガンド、顆粒球
単球コロニー刺激因子、単球コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、Fl
t3リガンド、Mplリガンド、エリスロポエチン(Epo)、トロンボポエチン
(Tpo)、成長ホルモン(GH)、インスリン様増殖因子(IGF)、トランスフォ
ーミング増殖因子−β(TGF−β)及びそれらの混合物がある。
実施例I:プロラクチンの造血前駆細胞含量に対するインビボ効果
BALB/c及びC57BL/6(B6)マウス(8〜12週齢)に、0.2
mLのハンクスの平衡塩類溶液(HBSS)[メディアテック社、ハーンドン、
VA]に再懸濁した組換えヒトプロラクチン(r−hPRL、ジェンザイム社)
を10μg注射した。動物は10日間隔日に腹膜腔内注射を受けた(全5回の注
射)。
マウスは週毎に体重を測定した。抗凝固剤としてEDTAを用いてマウスの外
側尾静脈より血液を採取した。
全血球計算はHC820血液分析計(ダーナム・エレクトロニクス社、ダラス
、TX)を用いて又はメトパス(Metpath)(ロックビル、MD)によって
実施した。骨髄及び脾臓の細胞充実度はコウルター(Coulter)カウンタ
ー(コウルター・エレクトロニクス、ハイアレア、FL)を用いてアッセイした
。
1つの脛骨から採取した脾臓細胞及び骨髄細胞(BMC)は、10%のウシ胎
仔血清(FBS)、1%のL−グルタミン及び抗生物質を含むイスコーヴ(Isc
ove)改良型ダルベッコ培養液(IMDM)で洗浄し、再懸濁した。
長期骨髄培養(LTBMC)は、ステムセルテクノロジーズ(ブリティッシュ
コロンビア、カナダ)より購入したLTBMC用の無血清培地にて維持した。こ
れには、BMCのインビトロ発育に必要なすべての栄養成分とサイトカインが含
まれる。
マウス大腿骨より採取したBMCは、24穴プレートにて、1x106/mL
の開始濃度で培養した。3日毎に、培養液の半量を新鮮な培地と交換した。この
細胞濃度が2x106/mL以上になったとき、培養物を希釈して、2つの穴に
分けた。10日毎に培養物の細胞充実度を評価するとともに、CFU−c及びB
FU−eのコロニーアッセイを実施した。
コロニー形成単位−培養系(CFU−c)アッセイは、Murphy等(19
92)、Blood 80:1443〜1447の記載に従って実施した。簡略
に言うと、CFU−cアッセイのためには、35mmルクスシャーレ(マイルズ
ラボラトリーズ社、ナパービル、IL)の0.3%細菌用寒天培地(ディフコラ
ボラトリーズ、デトロイト、MI)にて、1プレートあたり1x106の脾臓細
胞又は2x105のBMC濃度で、細胞を培養した。コロニー形成は、組換えマ
ウス顆粒球マクロファージ刺激因子(GM−CSF)10ng/mL(アムジェ
ン社、サウザンドオークス、CA)及び組換えマウスインターロイキン−3(I
L−3)10ng/mL(生体反応修飾物質プログラムレポジトリー(Biologica
l Response Modifiers Repository)、フレデリック、MDより提供)のような、
至適濃度が前もって決定された成長促進サイトカインによって刺激された。プレ
ートは37℃、湿度100%、5%CO2の空気条件にて7日間保温し、コロニ
ー数を数えた。コロニーとは50個以上の細胞の成長集団として定義された。
バースト形成単位−赤芽球系(BFU−e)アッセイは、Stephenso
n JR等(1971)、Proc Natl Acad USA,68:154
2の記載に従って実施した。バーストBFU−eアッセイには、5mLの懸濁液
(細胞液1.5mL、FBS1.5mL、10%BSA0.5mL、1.0mM
2−メルカプトエタノール0.5mL、Epo0.5mL及び組換えマウスIL
−3(rmIL−3)0.5mL)を調製した。エリスロポエチン(Epo、ス
テムセルテクノロジーズ、ブリティッシュコロンビア、カナダ)、rmIL−3
、細胞の最終濃度は、それぞれ、2U/mL、20ng/mL、1x105/m
Lであった。BFU−eは保温12日後にスコア化した。BFU−eとは、50
又はそれ以上のベンチジン陽性細胞を含む集団として定義された。すべてのアッ
セイには各群少なくとも3匹のマウスを用いて少なくとも3回実施し、代表的な
実験結果を示した。 この軟寒天コロニーアッセイは、プロラクチンがBMC及び脾臓の造血前駆細
胞含量を変化させ得ることを示した。上記表1に示された結果は、r−hPRL
の投与がマウスの2つの系統において脾臓及びBMCのコロニー形成単位−培養
系(CFU−c)及びバースト形成単位−赤芽球系(BFU−e)の有意な(p
<0.01)増加をもたらすことを示した。しかしながら、BMC及び脾臓の細
胞充実度については有意な効果を検出しなかったし(上記の表1)、r−hPRL
を100μg投与しても正常レシピエントの末梢血球百分率数は変化しなかった
(データ示さず)。さらに、r−hPRLを10μg注射されたレシピエントの体
重にも優位な増加を認めなかった(データ示さず)。従って、r−hPRLはイン
ビボ投与後に造血性の成長促進効果を有意に発揮すると思われる。
実施例II.プロラクチンの造血前駆細胞含量に対するインビトロ効果
造血成長に対するr−hPRLの直接効果を証明するために短期コロニー培養
系(CFU−c及びBFU−e)及び長期懸濁培養系(LTBMC)が評価され
た。この軟寒天培地のコロニーアッセイの方法は上記の実施例1に記載された。
上記実験の結果は、r−hPRLが用量依存的にCFU−c及びBFU−eの形
成を促進することを実証した(下記の表2)。マウスのCFU−c及びBFU−e
形成の至適用量はプロラクチン50ngであり、ヒトの系での最適用量は100
ngであった。また、懸濁培養の累積細胞充実度が50日間の培養の間増加する
ことを示し、r−hPRLがLTBMCにおいて造血前駆細胞の成長を促進する
ことも認められた(図1a)。長期BM培養においては、造血前駆細胞含量(CF
U−c及びBFU−e)もr−hPRL処置後に増加した(図1b及び図1c)。
実施例III.骨髄抑制を誘発する手段としてAZTを投与されたマウスにおけ る造血前駆細胞含量に対するプロラクチンの効果
AZTの用量制限毒性のひとつがその骨髄毒性的な性質に由来する貧血である
ので、マウスをr−hPRL及びAZTで同時に処置することが血液学的パラメ
ータの改善をもたらすかどうかを決定するための試験が行われた。
B6マウスにAZT(飲料水1mLあたり2.5mg)を数週間与えた。分析
すると、これらのマウスは、正常マウスに比べて、CFU−c及びBFU−eで
測定される(下記の表3)ように有意に低い(p<0.01)造血前駆細胞含量
と有意に低いヘマトクリット(HCT)を示した(図2)。これらの効果はAZT
をより長く与えるとよりはっきりした。ほとんどの血液学的数値が対照値のほぼ
半分に近づいたからである。
数群のマウスに同時に1、10又は100μgのr−hPRLを20日間隔日
に腹膜腔内投与した。細胞充実度及びコロニーアッセイ(CFU−c及びBFU
−e)を14日目又は28日目に測定した。上記表3に示された結果は造血及び
血液学的パラメータがプロラクチンの同時投与で有意に(p<0.01)改善し
たことを示している。CFU−c/大腿骨又はBFU−e/大腿骨は、コロニー
数/2x105x大腿骨の細胞充実度、として計算した。造血前駆細胞含量(C
FU−c及びBFU−e)は正常値又はそれ以上に完全に回復した。HCT値も
r−hPRLの処置に反応して増加し(図2)、AZT投与と同時にr−hPRL
で処置した後14日目に検査したマウスでは、29.5+/−1.3%から40
.3+/−3.2%へ増加していた。同様の結果は28日目でも得られた。さら
に、r−hPRLの反復注射に由来する明らかな病理効果をマウスは示さなかっ
た。マウスは試験期間中ずっと良好な健康状態であったと考えられる。それらは
一定の体重を維持し、試験終了時に屠殺したマウスは肉眼的に見て病的異常性を
示さなかった。
r−hPRLがAZTの骨髄抑制効果を直接中和し得るかどうかを決定するた
めの実験も行われた。AZT及び様々な用量のr−hPRLの存在下でCFU−
c及びBFU−eコロニーアッセイを行った。マウス及びヒトのコロニー培養系
において、プロラクチンは、AZT誘発性のCFU−c及びBFU−e形成抑制
を用量依存的に中和し得た(下記の表4)。さらに、すでに記載されたようにして
実施した長期BM培養系(図3)において、r−hPRLは、増進された累積細
胞充実度(図3a)及び増加した造血前駆細胞含量(CFU−c、図3b及びB
FU−e、図3c)によって示されるように、AZTによる成長阻害を逆転させ
た。
実施例IV.プロラクチンの早期投与はマウスにおけるAZT誘発性骨髄抑制を 予防する。
AZTによって引き起こされるような骨髄抑制の前に投与されたプロラクチン
が造血パラメータを予防及び改善するかを確かめるための試験がなされた。B6
マウスに14日間隔日に10μgのr−hPRLを腹膜腔内に注射した後、さら
に14日間、r−hPRLの注射をせずに、AZTを飲料水で投与した(飲料水
1mLあたり2.5mg)。種々の時点で細胞充実度及び前駆細胞含量(CFU
−c及びBFU−e)を決定した。AZTによって誘発される骨髄抑制に対する
有意な予防が観察された。HCT値は29日目から34日目にかけて有意に(p
<0.01)増加した(図4)。造血前駆細胞(CFU−c及びBFU−e)もr
−hPRLで前処置したマウスにおいてAZT投与期間に有意に(p<0.01
)増加した(下記の表5)。以上の結果は、r−hPRLがインビボで前駆細胞を
予防し得ること及びその骨髄抑制へ抵抗する能力を高め得ることを示唆している
。 実施例V.プロラクチンの後期投与はマウスにおいてAZT誘発性骨髄抑制を逆 転する。
AZTによって引き起こされるような骨髄抑制の後にr−hPRLを投与する
と造血及び血液学パラメータが改善するかを決定するための試験がなされた。B
6マウスに14日間AZTを飲料水で投与した(飲料水1mLあたり2.5mg)
。この2週間後に、マウスを評価して骨髄抑制されていることを確かめた。動物
はその後20日間隔日に10μgのr−hPRLを腹膜腔内注射された(全10
回の注射)。動物は種々の時点で細胞充実度及び前駆細胞含量を評価された。2
9日目(7回のr−hPRL注射)にr−hPRL処置マウスにおいてBMC造
血細胞含量の有意な改善が認められた(下記の表6)。CFU−c/大腿骨又はB
FU−e/大腿骨は、コロニー数/2x105x大腿骨の細胞充実度、として計
算した。数値は各群3〜4匹のマウスを含む3回の実験結果を代表している。H
CT値も24日目(r−hPRL処置後10日目)までにはほぼ正常レベルに回
復し、HBSS対照よりも有意に高かった(図5)。以上の知見は、r−hPRL
がAZTに誘発される骨髄抑制を逆転し得ることを示唆している。実施例VI.プロラクチンは致死的放射線照射に次ぐ骨髄移植後の造血復元を促 進する。
レシピエントのBALB/cマウス(8〜12週齢)を137Csの放射線源に
さらし、細胞復元試験のためにその動物を致死的に放射線照射した。マウスは全
身に850センチグレイ(cGy)の放射線を受けた。このマウスに1x106
個の同系BMCを静脈内(iv)投与した。この方法は同系骨髄移植(SBMT
)として知られている。各群5匹のマウスに対し、各実験を3〜4回実施した。
同系骨髄移植(SBMT)後1日目に、10μgr−hPRL又は対照として
ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)の処置を開始した。0.2mLのHBSSに
再懸濁したr−hPRLを隔日腹膜腔内注射して、その後マウスはアッセイする
か又は20日間にわたり全10回の注射をした。マウスは週毎に体重を測定した
。
抗凝固剤としてEDTAを用いてマウスの外側尾静脈より血液を採取した。全
血球計算はHC820血液分析計(ダーナム・エレクトロニクス社、ダラス、T
X)を用いて又はメトパス(Metpath)(ロックビル、MD)によって実施
した。骨髄、脾臓及び胸腺の細胞充実度はコウルター(Coulter)カウン
ター(コウルター・エレクトロニクス、ハイアレア、FL)を用いてアッセイし
た。脾臓細胞及び骨髄細胞は、その細胞充実度及びそのコロニー形成能によって
決定される前駆細胞含量を評価された。
要約すると、インビトロ造血アッセイはすでに記載されたようにして実施され
た。要約すると、脾臓細胞及び骨髄細胞(BMC)は1つの脛骨から採取し、1
0%のウシ胎仔血清(FBS)、1%のL−グルタミン及び抗生物質を含むイスコ
ーヴ(Iscove)改良型ダルベッコ培養液(IMDM)で洗浄し、再懸濁し
た。コロニー形成アッセイ(CFU−c及びBFU−e)は上記実施例Iに記載
したようにして実施した。
表7(下記に示す)に示された結果は、r−hPRLの投与が、SBMT後1
4日目又は21日目のCFU−c及びBFU−eによって決定されるように、B
MCと脾臓の両方の前駆細胞含量を有意に(p<0.01)増加させることを証
明している。大腿骨又は脾臓当たりの全前駆細胞数(大腿骨の細胞充実度/2x
105BMCxCFU−c又はBFU−e/大腿骨又は脾臓のプレート)は、r
−hPRLを受けたマウスで増加した。BMCの全造血前駆細胞(CFU−c)
数は14日目に6.2倍に、21日目に11.7倍に増加した。r−hPRLを
受けたマウスにおいて、脾臓のCFU−cは14日目に5.4倍に、21日目に
10.8倍に増加した。
r−hPRLがSBMT後の造血復元を促進し得ることを上記の結果が示唆し
たので、成熟細胞集団におけるその後の変化を調べるために末梢血を検査した。
図6aに示されるように、r−hPRL10μgの投与は15日、18日、21
日(p<0.01)及び28日(p<0.05)において血小板含量を有意に増
加させた。この濃度で、プロラクチンはまた白血球数を有意に(7、15、18
日はp<0.01、21日はp<0.05)増加させた(図6b)。血球百分率分
析(図7)は、血液中のリンパ球及び好中球の比率が7日及び21日目に有意に
(p<0.01)増加したことを示したが、このことはr−hPRLが末梢リン
パ球と好中球の発達を増進したことを示唆している。
顆粒球に対するプロラクチン投与の効果もフローサイトメトリーによって上記
のマウスで評価した。14日目又は21日目まで隔日にr−hPRLを受けたマ
ウスを4群に分ける一方で、HBSSを受けた対照動物も他の4群に分けた。2
つのr−hPRL処置マウス群及び2つのHBSS処置マウス群の脛骨(BM)
より単一細胞懸濁液を採取した。脾臓由来の単一細胞懸濁液は、r−hPRL及
びHBSS処置群の残り2つの群より採取した。BM及び脾臓細胞の両方をすで
に記載された(Murphy等、1992.J.Immunol 148:37
99〜3805)二重色サイトメトリック分析法によって分析した。要約すると
、ベクトンディキンソン(マウンテンビュー、CA)より入手したラットFIT
C標識抗5E6(ナチュラルキラー(NK)細胞)抗体及びラットPE標識8C
5(顆粒球)抗体で細胞を染色した。この細胞を100%パラホルムアルデヒド
に固定し、EPCISフローサイトメーターで分析した。対照としてFITC又
はPEで標識した正常ラットの免疫グロブリン(NRIg)を用いて、各群あた
り3〜4匹のマウスを使用した。この方法を用いると、8C5+(顆粒球マーカ
ー)細胞の含量がBMと脾臓の両方で増加していることが認められた。BMと脾
臓の細胞充実度も増加した(BM群対BM+r−hPRL群:BMでは7.8x
106対12.6x106、脾臓では54.5x106対78.5x1O6)ので、
BMと脾臓における8C5+顆粒球の絶対数も14日目にはそれぞれ2.24倍
と2.85倍に増加した。この細胞集団は21日目には2.03倍と1.92倍
に増加した。
まとめれば、上記の実験結果は、r−hPRL処置がBMCの生着を促進し、
造血前駆細胞の発達を増進させ、成熟細胞集団数の増加をもたらしたことを証明
している。
実施例VII.BMT後のプロラクチン処置はB細胞系統の発達を増進する。
B細胞前駆体含量及び、B細胞の機能性アッセイとして、B細胞***誘発因子
への応答性をSBMT後のマウスを用いて評価した。6群のマウスがr−hPR
L処置を受けた(14日又は21日目まで隔日10μgの注射)のに対し、6群
の対照マウスはHBSSを受けた。B細胞前駆体含量は、上記の二重標識法及び
ベクトンディキンソンより入手したFITC標識抗B220及びPE標識sIg
Mを用いたフローサイトメトリーによって決定された。B細胞前駆体はB220
マーカーには陽性に、表面IgM(sIgM)には陰性に染色される。このB細
胞前駆体(B220+sIgM-細胞)の含量は、r−hPRL処置後14日及び
21日目のBM及びリンパ節(LN)では増加したが、脾臓では増加しなかった
。処置後14日目のBM及びLNにおけるB細胞前駆体の絶対数はそれぞれ2.
56倍及び3.78倍(細胞充実度x陽性細胞数)に増加したが、このことはr
−hPRLがB細胞系統の生着及び発達を促進させることを示唆している。また
、成熟B細胞(B220+sIgM+細胞)含量も、SBMT後14日及び21日
目で脾臓とLNのいずれでも増加していることが認められた。
B細胞数の増加に加えて、脾臓B細胞の機能性も評価された。このことは、標
準的なトリチウム化チミジン増殖アッセイを利用して、B細胞の***誘発因子で
あるLPSへの増殖応答性を評価することによってなされた。下記の表8に示さ
れるように、r−hPRL処置群のCPM(カウント毎分)は対照群よりも有意
に高く(いずれのLPS用量でもp<0.01)、各LPS用量で刺激指数(SI
)が増加していることから、r−hPRLを受けたマウスの脾細胞で、B細胞分
裂誘発因子に対する増殖応答性が増加したことが証明された。BMC移植マウス
は、KLHで免疫しその後のIgG及びIgM応答を測定することにより、さら
にB細胞機能を評価した。21日目(例えば、KLH免疫化の2週間後)に脾臓
を採取し、細胞懸濁液を用いてKLHに特異的な応答を評価した。r−hPRL
処置
マウスでは、KLH特異的IgG及びIgMのいずれもが増加していた(図8参
照)。
上記の知見は、PRLが造血前駆細胞由来のB細胞系統の発達及び機能をSB
MT後に増進させ得ることを証明している。
実施例VIII.BMT後のプロラクチン処置はT細胞系統の発達を増進する。
SBMT後r−hPRLで処置した動物の胸腺におけるT細胞前駆体(CD4+
CD8+細胞)含量とT細胞の機能を評価した。T細胞前駆細胞の含量はすでに
記載した二重色フローサイトメトリー分析法によって分析した。使用した試薬は
、ベクトンディキンソンより入手したFITC標識抗Lyt−2(CD8)及び
PE標識抗L3T4(CD4)を含む。胸腺中のT細胞前駆体含量(CD4+C
D8+細胞)は、SBMT後14日目及び21日目に試験したとき増加していた
。脾臓及びリンパ節の成熟T細胞(CD4+CD8-又はCD4-CD8+細胞)含
量もまた増加していた。
T細胞機能に対するr−hPRL投与の効果も評価された。一次免疫応答時の
抗原特異的T細胞に対するプロラクチンの効果は、SBMT後にKLHで免疫し
たマウスにおけるKLHに対する脾臓T細胞の増殖性を検査することによって評
価した。
マウスは、SBMT後7日目に、完全フロインドアジュバントに溶かした10
0μgのKLHを皮下注射して免疫した。21日目(即ち、KLH免疫後2週目
)に脾臓を採取し、細胞懸濁液を用いてKLH特異的な増殖性を評価した。要約
すると、平底96穴プレート(コスター)にKLH(100μg/mL)及び脾
細胞(1x106/200mL/穴)を加えた。4日後、1mCiの3H−チミジ
ン(6.7Ci/mmol、ニューイングランドヌクレア、ボストン、MA)で
8時間パルスし、次いでMASHII装置(ミクロバイオロジカルアソシエーツ
、ベテスダ、MD)を用いて細胞を採取することすることにより増殖性をアッセ
イした。取り込まれた標識DNAをシンチレーションカウンターを用いてカウン
トした。この実験の結果を表9に示す。
このデータは、r−hPRL処置を受けたマウスにおいてKHLに対するイン
ビトロの増殖性が有意に増加したことで示されるように、r−hPRL投与が有
意な免疫増強効果を発揮したことを示している。このデータは、r−hPRLが
造血前駆細胞由来のT細胞系統の発達及び機能をSBMT後に増進させ得ること
を証明している。
実施例IX.プロラクチンはBMT後のNK回復を増進する。
NK細胞は、腫瘍及びウィルス被感染細胞に対するMHC非拘束性の殺傷反応
を仲介するリンパ系細胞である。最近、NK細胞が造血において重要な役割を果
たしていることが報告された。それ故、SBMT後、r−hPRL処置の有無で
のNK細胞の発達及び機能を検査する試験がなされた。全NK細胞(5E6+細
胞)含量に対する効果は、すでに記載したフロ−サイトメトリーを用いて評価し
た。下記の表10に示したように、BM及び脾臓のNK(5E6+細胞)含量は
、SBMT後にr−hPRL投与を受けたマウスで増加した。BMと脾臓、いず
れの細胞充実度も増加した(BM群対BM+r−hPRL群:BMでは7.8x
106対12.6x106、脾臓では54.5x106対78.5x106)ので、
BMと脾臓におけるNK細胞の絶対数も14日目にはそれぞれ5.41倍と4.
83倍に増加した。この数値は21日目には2.34倍と1.78倍に増加した
。
NK細胞毒性を評価することによって上記NK細胞の機能性も試験した。YA
C−1(NK感受性の標的細胞)をNa51CrO4(ニューイングランドヌクレ
ア、ボストン、MA、比活性約400μCi/μg)とともに37℃1時間保温
して標識した。保温後、この標的細胞を、アッセイ使用前に2%FCSを補充し
たRPMI1640で3回洗浄した。エフェクタ細胞(脾細胞)と標的細胞を、
エフェクター/標的(E/T)細胞比が、40/1、20/1、10/1及び5
/1になるように合わせて丸底96穴プレート(コスター)に入れた。4複製穴
を用いた。標準的な4時間保温の後、上澄液を回収し、ガンマカウンター(モデ
ル5000、ベックマンインスツルメント、アービン、CA)を用いて分析した
。特異的細胞溶解比率は以下のように計算された:特異的細胞溶解(%)=(C
PM試験−CPM自発/CPM最大−CPM自発)x100。
この方法を用いたとき、標準的なYAC−1細胞標的を用いた細胞毒性によっ
て評価されるように、SBMTを受けたマウスにおいて、r−hPRLがNK機
能を確かに増強させていることが観察された(図9)。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 マーフィー,ウィリアム・ジェイ
アメリカ合衆国メリーランド州21701,フ
レデリック,スクーナー・コート 7996
(72)発明者 ロンゴ,ダン・エル
アメリカ合衆国メリーランド州20895―
3503,ケンジントン,バーロール・レイン
9610
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.造血幹細胞又は前駆細胞にプロラクチンを含む組成物を加えることから成 る造血を増強する方法。 2.プロラクチンが組換えプロラクチンである請求項1の方法。 3.プロラクチンがヒトプロラクチンである請求項1の方法。 4.プロラクチンを含む薬剤的に許容される組成物の有効量を投与することか ら成る、造血を増進するために動物を処置する方法。 5.プロラクチンが組換えプロラクチンである請求項4の方法。 6.プロラクチンがヒトプロラクチンである請求項4の方法。 7.動物が造血抑制を蒙っている請求項4の方法。 8.AZT、放射線曝露、細胞減少性の処置、化学療法、細胞溶解療法、免疫 細胞溶解療法及びそれらの組み合わせより構成されるグループから選択される治 療的処置によって造血抑制が引き起こされている請求項7の方法。 9.プロラクチンを含む薬剤的に許容される組成物の有効量を投与することか ら成る、造血抑制を予防するために動物を処置する方法。 10.プロラクチンが組換えプロラクチンである請求項9の方法。 11.プロラクチンがヒトプロラクチンである請求項9の方法。 12.AZT、放射線曝露、細胞減少性の処置、化学療法、細胞溶解療法、免 疫細胞溶解療法及びそれらの組み合わせより構成されるグループから選択される 治療的処置によって造血抑制が引き起こされる請求項9の方法。 13.造血を増強し得るサイトカイン及びプロラクチンを含む組成物。 14.プロラクチンが組換えプロラクチンである請求項13の組成物。 15.プロラクチンがヒトプロラクチンである請求項13の組成物。 16.インターロイキン−1、インターロイキン−2、インターロイキン−3 、インターロイキン−4、インターロイキン−6、インターロイキン−7、イン ターロイキン−9、インターロイキン−11、インターロイキン−15、c−K itリガンド、顆粒球単球コロニー刺激因子、単球コロニー刺激因子、顆粒球コ ロニー刺激因子、Flt3リガンド、Mplリガンド、Epo、Tpo,GH、 IGF、TGF−β及びそれらの混合物より構成されるグループからサイトカイ ン が選択される請求項13の組成物。 17.造血抑制を起こす可能性がある治療薬及びプロラクチンを含む組成物。 18.プロラクチンがヒトプロラクチンである請求項17の組成物。 19.プロラクチンが組換えプロラクチンである請求項17の組成物。 20.プロラクチンが組換えヒトプロラクチンである請求項17の組成物。 21.AZT、化学療法薬、抗細胞溶解薬、免疫細胞溶解薬及びそれらの組み 合わせより構成されるグループから治療薬が選択される請求項17の組成物。
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