JP2001514850A - タンパク質のスクリーニング方法 - Google Patents

タンパク質のスクリーニング方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、個々のタンパク質／ポリペプチドのライブラリーの供給に基づいた、タンパク質／ポリペプチドのスクリーニングの新しい方法を提供するものであり、これにより、順に細胞結合活性、生物学的活性等のスクリーニングが可能となる。このようなタンパク質／ポリペプチドをコードする遺伝子の回収方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、タンパク質及びポリペプチドのスクリーニングのための方法及び組
成物に関する。詳しくは、本発明は、遺伝子ライブラリーの形成及び様々な方法
でスクリーニング可能な個々のタンパク質又はポリペプチドの合成を含む方法に
関する。特別の態様では、いわゆる「リボソーム提示」タンパク質又はポリペプ
チドアレイの使用を含む。したがって、本発明は、生物学的活性ポリペプチド、
受容体に結合するタンパク質、及びタンパク質と他の分子との相互作用、のスク
リーニングにおける提示されたタンパク質又はポリペプチドアレイの新規な実用
的な適用を提供する。
【０００２】 配列決定を先導して進めていることから、ヒトゲノムは、ヒト疾患との因果関
係を有するかも知れないヒトゲノムにおける多型性又は突然変異、さらに疾患に
関連するかも知れない遺伝子の発現変化を発見するための主な主導的役割を果た
してきた。これは、そのような多型性、突然変異又は遺伝子発現における変化を
見出すために、多くの高処理量スクリーニング技術を生じさせた。さらに、その
ような分析は、ある種の治療に対するヒトの応答を分析し、それによりこれらの
治療に対する応答性を予想するためにも現在着手されつつある。一般に、多型性
、突然変異及び遺伝子発現変化は、これらの遺伝子により産生されるタンパク質
に反映され、疾患の発生又は治療に対する応答等の生物学的な結果を直接決定す
ることができるのはこれらのタンパク質の作用である。さらに、ほとんどの真核
生物のタンパク質は翻訳後修飾される。そして、そのような修飾は遺伝子レベル
では分析することができない。したがって、タンパク質及びタンパク質修飾のス
クリーニングの分析は、ＤＮＡ又はＲＮＡの分析に比べて変化と疾患との正確な
相関関係を示す可能性がより高いということになる。
【０００３】 今日までタンパク質と疾患との関連性の分析は、ヒト組織又は細胞からの２Ｄ
（二次元）タンパク質ゲル分析が優勢であった。この技術では、通常、細胞タン
パク質を一次元で電荷に基づいてそして他の次元でサイズに基づいて分離する。
タンパク質は、既知のタンパク質の電気泳動上の移動パターンを参照するか、又
は電気泳動により分離したスポットからタンパク質を溶出して質量分析及び核磁
気共鳴等の方法で分析することにより同定することができる。しかしながら、２
Ｄタンパク質ゲル法には、細胞由来のタンパク質の分解能及び検出の限界（通常
５０００細胞タンパク質のみしか明確に検出されない）、分離したタンパク質の
同定に対する限界（例えば、質量分析は通常、同定のために１００フェムトモル
以上のタンパク質を要する）及び技術の専門家的性質などの限界がある。さらに
、２Ｄゲル分析によるタンパク質の翻訳後修飾の分析には限界があり、タンパク
質−タンパク質結合相互作用はこの方法では検出することができない。
【０００４】 細胞の多数のプロセスは、修飾酵素とそのタンパク質基質との間の一過性の相
互作用により制御される。そのような相互作用は慣用の方法により検出すること
が困難である。キナーゼ、ホスファターゼ、トランスフェラーゼ、プロテアーゼ
等のタンパク質修飾酵素は、根本的な細胞プロセスのすべての様式を制御し（ポ
ーソン（Pawson) ，Nature, 373 (1995), 573 頁) 、そして疾患経路にも関与す
ることが示された。これらの一過性タンパク質／タンパク質相互作用は幾つかの
異なる効果を生じることができ、その一部は測定可能である。タンパク質の動力
学的性質は変化させることができ、これは基質の結合の変化（プレリッヒ（Prel
ich)ら，Nature, 326, (1989), 517頁) 又は変化した触媒（ポルパシー(Porpacz
y)ら，Biochim. Biophys. Acta, 749 (1983), 172 頁) を結果として生じさせる
。タンパク質／タンパク質相互作用は新しい結合部位の形成の原因となることが
でき、例えば、ＡＴＰ結合部位は、大腸菌ＡＴＰアーゼのａ及びｂサブユニット
間の相互作用により形成される（ウェーバー（Weber)ら，J. Biol. Chem., 268,
(1993), 6241 頁) 。タンパク質の基質特異性は、特異的プロモーターにポリメ
ラーゼを配向させる種々の転写因子とＲＮＡポリメラーゼとの相互作用により例
示されるように、タンパク質／タンパク質相互作用により変化しうる（ホワイト
（White)とジャクソン(Jackson) 、Trends Genet., 8, (1988), 284 頁) 。また
、タンパク質／タンパク質相互作用は、例えば、タンパク質が阻害剤と相互作用
する場合に不活性化を生じさせうる（ビンセント(Vincent) とラズンスキー(Laz
dunski) ，Biochemistry, 11, (1972), 2967頁) 。
【０００５】 遺伝子ライブラリー由来のタンパク質又はポリペプチドの産生に依存する諸方
法が、当該技術分野で開示されている。しかしながら、そのような方法に伴う一
つの主要な不都合は、タンパク質又はポリペプチドが「プール」として産生され
、次いでスクリーニングされるということである。個々のタンパク質又はポリペ
プチドの迅速な同定を可能にし、次にはそのようなタンパク質又はポリペプチド
をコードする遺伝子の同定をも可能にするスクリーニング方法が必要である。
【０００６】 したがって、第１の側面において、本発明は遺伝子ライブラリーを作製する工
程、及び次いでスクリーニングされうる個々のタンパク質又はポリペプチドを合
成する工程を含むタンパク質又はポリペプチドのスクリーニング方法を提供する
。本発明においては、「個々のタンパク質又はポリペプチド」という用語は、遺
伝子ライブラリーから発現されたタンパク質又はポリペプチドがプールの一部を
形成するというよりはむしろ別々に同定可能であることを意味する。したがって
、例えば、タンパク質又はポリペプチドは、アレイとして発現可能である。ここ
で、各タンパク質又はポリペプチドは、アレイ内の別個の点又は領域を占有する
。例えば、遺伝子ライブラリーは、コロニー又はプラークの形で作製し、次にそ
れらを別個に拾い上げてアレイに配列することができる。次に、遺伝子を発現さ
せると、アレイフォーマット中でタンパク質又はポリペプチドのアレイが生じる
。そしてアレイ中のタンパク質又はポリペプチドのそれぞれは別個の点又は領域
を占有する。
【０００７】 遺伝子ライブラリーから形成させたタンパク質又はポリペプチドは、イン・ビ
トロ転写及び翻訳、リボソーム提示並びにファージ提示等のイン・ビトロでの方
法により製造された「合成タンパク質又はポリペプチド」と称してもよい。した
がって、それらは、その基準に基づいて、組織又は細胞抽出物から直接に由来す
る「天然のタンパク質」とは区別することができる。
【０００８】 こうして、本明細書に記載された方法は、「合成」タンパク質又はポリペプチ
ドの合成に関する出発点として遺伝子ライブラリーを用いて、タンパク質及びポ
リペプチド並びに翻訳後修飾のスクリーニングを可能にする。一般的に、これは
、それらをスクリーニングするための手段としてのタンパク質又はポリペプチド
のアレイの作製により達成される。特に、アレイは、イン・ビトロの転写及び翻
訳方法により作製される。
【０００９】 本発明の共通のテーマは、提供される方法それぞれがその対応するｍＲＮＡ又
は遺伝子配列の助けにより「合成」タンパク質又はポリペプチドの迅速な同定を
可能にすることである。
【００１０】 本発明の他の態様は、リボソーム上にタンパク質を提示する新規な技術、タン
パク質又はポリペプチド及び翻訳後修飾のスクリーニングのためのそのような方
法の使用、並びに受容体等の他の分子に結合する特異的タンパク質又はポリペプ
チドのスクリーニングのための新規な方法を提供する。
【００１１】 リボソームは、その協調された活性が翻訳の行為を完成させるタンパク質の集
合を表す。原核生物及び真核生物のリボソーム並びにオルガネラにおいてＲＮＡ
とタンパク質のサイズと割合にははっきりと感知できる相違があるけれども、リ
ボソームの基本的な型は保存されている。すべてのリボソームは、二つの主要な
サブユニット、細菌では５０Ｓ及び３０Ｓサブユニット、そして真核生物では６
０Ｓ及び４０Ｓサブユニットから構成される。タンパク質合成は、真核生物では
５’キャップで又は原核生物では翻訳開始コドン（通常ＡＵＧ）に隣接してリボ
ソームがｍＲＮＡに付着したときに開始し、ｍＲＮＡ配列に指示されながら、発
生期のポリペプチド鎖を保持するペプチジル−ｔＲＮＡ分子上にアミノ酸を連続
的に結合させることにより続いていく。翻訳は、通常、リボソームがｍＲＮＡか
ら解離する所である停止コドンで終結する。停止コドンの非存在下では、リボソ
ームは、解離が放出因子の助けにより起こる前にｍＲＮＡ分子の末端まで進行す
ると考えられる。したがって、翻訳終結は、タンパク質をコードするｍＲＮＡ分
子からそのタンパク質を切り離す。リボソームがタンパク質合成中に阻止された
ときは、タンパク質とｍＲＮＡはリボソームと複合体を形成している間は結合し
た状態に留まるであろう。
【００１２】 リボソーム上で合成タンパク質を生成する生化学的過程は、生きた生物を用い
る合成タンパク質の生成のための現存する方法を越えるいくつかの利点を有する
。特定の表現型の保持体としてのタンパク質を選択し、その後に対応する遺伝型
を決定する方法は、所望のタンパク質を提示するバクテリオファージ、ウイルス
及び細菌細胞を通常用いて、遺伝子とタンパク質との間の連結を提供するために
生きた細胞に主として依存してきた。ＤＮＡライブラリーによりコードされるタ
ンパク質の多様な収集のための生きた細胞の使用は、いくつかの不都合を有する
。例えば、タンパク質の多様性は、ＤＮＡまたは感染性粒子の取り込みの低効率
により制限される細菌細胞又は真核細胞の形質転換又は感染を必要とすることに
より低下しうる。さらに、多様なタンパク質の生物学的生産は、所定のタンパク
質に対して選択可能な生きた細胞の特定の環境、及び所定のタンパク質に対して
も選択可能なタンパク質の折り畳みにおける変化を生じ得る環境に曝される。最
後に、連続的な選択ラウンドの間に個々のタンパク質の多様性が要求される場合
、遺伝子突然変異技術は、多様化及びスクリーニングのためにＤＮＡと生きた細
胞との間の切替えが必要であることにより、イン・ビボの系に適用することが困
難である。
【００１３】 ポリペプチド選択のためのイン・ビトロの方法は、遺伝子の細胞内への取り込
みの必要性を除くことにより、そしてｍＲＮＡ及びタンパク質の製造のための環
境を制御することにより、イン・ビボの方法に優る長所を潜在的に提供する。イ
ン・ビトロの転写及び翻訳反応は、何年もの間ＤＮＡから直接ポリペプチドを生
産させる手段として用いられており、特異的なポリペプチドを選択するための抗
体を用いてポリソームの免疫沈降（例えば、ペイバー(Payvar, F.)とシムケ(Sch
imke, R. T.)、Eur. J. Biochem., 第101 巻 (1979) 1844-1848 頁）により特異
的なｍＲＮＡを濃縮できることがわかった。このいわゆる「リボソーム提示」技
術は、ごく最近、ペプチドの選択（マッテアキス(Mattheakis, L.)ら，PNAS 91:
9022, 1994 及びPCT95/11922)及びタンパク質の選択（カワサキ(Kawasaki, G.)
、PCT91/05058 及びハーネス(Hanes) とプラックタン(Pluckthun) ，PNAS, 第94
巻[10]: 4937, 1997) に適応されている。
【００１４】 マッテアキス(Mattheakis, L.)ら(PNAS 91: 9022, 1994) により記載された方
法は、ペプチドライブラリーからリガンドを同定するためのリボソーム提示系を
用いる。前記方法は、原核細胞のリボソーム複合体の５０Ｓサブユニットに結合
することによりリボソーム翻訳での失速を誘導するリボソーム翻訳停止用のクロ
ラムフェニコールを用いる。この方法の不利な点は、発生期のペプチドの長さに
関わらず翻訳停止を生じさせ、こうして、ほとんどのポリペプチド分子が不完全
となるという点である。転写／翻訳後のＤＮＡライブラリーからのポリペプチド
の効率的なスクリーニングのためには、ｍＲＮＡに関連する全長ポリペプチドの
収率を最大にすることが明らかに望まれる。
【００１５】 マッテアキス(Mattheakis)とドーワー(Dower) がPCT95/11922 に記載した方法
は、融合ポリペプチド分子のペプチド部であり、スクリーニングのためのポリペ
プチド部に隣接し、ｍＲＮＡに関連する全長のポリペプチドの収率を最大にする
ためにコードするポリヌクレオチドと相互作用するか結合する「つながれた発生
期のペプチド」の使用を通じて原理的にリボソームを失速させるさらなる手段を
含む。マッテアキス(Mattheakis, L.)ら(PNAS,同書) と同様に、この方法は、未
成熟な翻訳停止を生じさせると予想され、スクリーニングのためのいくつかのタ
ンパク質の適切な折り畳みをも歪めると予想されるであろう。従って、ポリペプ
チド分子のサイズ範囲はマッテアキスとドーワーにより記載された方法により予
想され、ＤＮＡライブラリーによりコードされる特異的なポリペプチドを単離す
る蓋然性を低減するであろう。ヘインズ(Hanes) とプラックタン(Pluckthun) （
同書）の方法において、正しく折り畳まれたタンパク質とそれをコードするｍＲ
ＮＡの収量をその両者がリボソームにまだ付着している間に最適化する方法が提
供される。前記方法は、酢酸マグネシウムの濃度を増加させることにより翻訳過
程を失速させる工程及び物理的反応条件の操作によるタンパク質の正しい折り畳
み工程を含む。しかしながら、全長タンパク質の収量を増加させる唯一の手段は
、リボソーム上の折り畳まれたタンパク質をつなぐために、対応する遺伝子を操
作し、３’スペーサー領域を付加することによりｍＲＮＡから停止コドンを除く
ことである。この方法は、初期の方法に比べた場合全長ポリペプチドの割合を増
加させるであろうが、一方、この方法は、ｍＲＮＡの末端からのラン−オフ翻訳
を予防する何の手段も提供せず、提供された失速ストラテジーは、マッテアキス
とドーワー（同書）と同様の制限を欠点にもち、それによって未成熟な翻訳上の
停止が予想されるであろう。前記方法のそれぞれに関して記載した制限に加え、
翻訳されたポリペプチドの試験に先立って翻訳反応の後期の新しい翻訳開始を阻
止する手段を提供する方法は存在しない。したがって、ポリペプチド分子のサイ
ズ範囲はこれらの方法により予想され、ＤＮＡライブラリーによりコードされる
特異的なポリペプチドを単離する蓋然性を低下させるであろう。したがって、特
異的ポリペプチドに関してＤＮＡライブラリーを効率的にスクリーニングするた
めに、発生期の不完全ポリペプチド鎖の存在を最小限にしながら、全長ポリペプ
チドの収量を最大にするリボソーム提示に関する新規な方法が必要である。
【００１６】 したがって、本発明の別の態様（「リボソーム提示」）は、対応するｍＲＮＡ
に連結したリボソーム上のタンパク質を提示するための新規なイン・ビトロの方
法を提供する。本発明のさらなる態様は、生物学的に活性な又は阻害的なポリペ
プチドをこれらのポリペプチドに対する分子標的のいかなる知識もなく特異的に
発見するため、細胞又は組織に結合するポリペプチドの分子結合部位を特異的に
発見するために、及び新規なタンパク質−タンパク質結合相互作用を特異的に発
見するために、ポリペプチド提示法、特にリボソーム提示を用いる。
【００１７】 生物学的に活性なポリペプチドの発見（「生物学的スクリーニング」）のため
の本発明の特別の態様においては、ＤＮＡライブラリーによりコードされ、ポリ
ペプチド提示を介して発現される生物学的な表現型を直接選択する新規な方法が
提供される。微生物上でのポリペプチドの提示法及び転写／翻訳法が、有用な結
合表現型と遺伝子型との間の連結を提供する一方、これらの方法は、抗原又は化
学品等の既知であって、通常適度に純粋な標品で利用可能なリガンドへの結合に
よるポリペプチドの検出に大部分限定されている。生きた細胞全体への直接的な
結合により提示されたポリペプチドの同定は困難であることが証明された。多く
の場合、結合する表現型のスクリーニングは、標的の生きた細胞との相互作用の
際に有用な生物学的な表現型を提示する生物学的活性ポリペプチドの単離の代用
である。そのような場合、結合する表現型を単離し、対応する遺伝型を決定し、
次いで、生物学的活性に関して結合する表現型を試験することが必要である。特
異的な結合表現型を有するポリペプチドの割合のみが要求される生物学的活性を
提供するので、この表現型選択過程は効率的でなく、生物学的活性ポリペプチド
を選択しない代理結合スクリーンに依存する。表現型スクリーニング用のリガン
ドが利用できないか又は知られていない場合には、新規な生物学的活性ポリペプ
チドのスクリーニングは可能でないことがある。したがって、本発明は、ＤＮＡ
ライブラリーによってコードされポリペプチド提示を介して発現される生物学的
な表現型を直接選択する新規な方法も提供する。
【００１８】 細胞又は組織に結合するポリペプチドの分子結合部位を発見するための本発明
の特別の態様（「リガンド配向性スクリーニング」）においては、目的のタンパ
ク質分子をコードするＤＮＡ分子、特に本発明の方法で標識されるものの複製を
可能にするような様式でスクリーニング可能な、タンパク質分子をコードする大
きなＤＮＡライブラリーに適用する方法が提供される。特定のリガンド分子に対
する標的受容体タンパク質を決定するために、標的のその後の分析及びその分子
の同定に先立ち、標的受容体の選択的単離のためにそのリガンドを用いることが
可能である。しかしながら、その受容体へのリガンドの結合親和性が低いか、リ
ガンド及び／又は受容体が豊富に存在しない場合、そのリガンドを用いて受容体
を単離することは非常に困難であり、受容体の同一性を決定するためには通常、
競合検定法等により普通の候補受容体を試験しなければならない。さらに、リガ
ンド結合を阻害する分子（受容体アンタゴニスト等）又はリガンドの結合を代替
する分子（アゴニスト等）のその後の解明のためには、精製又は濃縮受容体標品
を、リガンド結合部位で結合する分子の単離のために、結合分子候補（抗体等）
の範囲を試験しなければならない。受容体が精製又は濃縮型で利用できない場合
か、受容体の同一性が知られていない場合は、受容体結合分子の単離が非常に困
難であることは明らかである。したがって、標的受容体の効率的な単離のため、
そして、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト又は単純な標的化分子等として作
用するかも知れない受容体上のリガンド結合部位に特異的に結合する分子の単離
のために新規な道具が要求される。細胞又は組織に結合するポリペプチドの分子
結合部位を発見しうることが、本発明の特別な側面である。この方法は、リガン
ドに直近の受容体に結合する他のタンパク質複合体を標識するため、タンパク質
性受容体に結合するリガンドを用いるという原理に基づいている。次いで、これ
に基づいて、これらの隣接して結合するタンパク質は、受容体を単離するために
、そして、場合によっては、受容体に隣接したタンパク質分子を単離するために
も、結合剤として使用することができる。さらに、これらの隣接して結合したタ
ンパク質は、リガンド結合部位で結合するタンパク質を含む他のタンパク質に沿
って受容体にその後に再結合することができる。そのときは隣接して結合したタ
ンパク質は、リガンド結合部位で結合するタンパク質を含む自身に直近して結合
する他のタンパク質複合体を標識することができる。このようにして、リガンド
結合部位で結合する一以上のタンパク質複合体を標識し、その後、単離し、そし
て受容体阻害、受容体のアゴニズム又はアンタゴニズム等の有用な性質について
試験することができる。本発明は、細胞表面上、特に組織全体の分子の標識化及
び単離に特に有用である。したがって、本発明は、目的のタンパク質分子をコー
ドするＤＮＡ分子の複製を可能にするように、タンパク質分子をコードするＤＮ
Ａライブラリーのスクリーニング方法を提供する。
【００１９】 細胞内ポリペプチド間で起こるものを含め、新規なタンパク質−タンパク質結
合相互作用（「タンパク質−タンパク質相互作用」）に特異的に関連する本発明
のさらなる態様においては、次には結合するポリペプチドをコードする遺伝子の
単離を可能にする検出可能又は選択可能な特性を創出するように、ポリペプチド
とリガンド又はポリペプチドと他のポリペプチドとの結合方法が提供される。
【００２０】 以下、本発明の様々な態様をさらに詳細に記載する。
【００２１】 タンパク質「アレイ」−本発明のこの態様では、合成タンパク質の合成の開始
点として遺伝子ライブラリーを用いるタンパク質及びポリペプチド及び翻訳後修
飾の新規なスクリーニング方法が提供される。この態様において、これらの遺伝
子ライブラリーは、ポリペプチドの検出及びポリペプチド修飾の検出のために、
個々のタンパク質又はタンパク質群を分離する基礎を提供する。その方法は、タ
ンパク質ゲル電気泳動の使用を回避する。本発明は、原理的には正常タンパク質
と疾患タンパク質との間の相違を検出するため、また薬物と他の疾患治療との関
係におけるタンパク質の変化を分析するためにも、正常及び疾患の組織又は細胞
におけるタンパク質の高処理量分析方法を提供する。また、この方法は、生きた
細胞又は組織に曝した場合にタンパク質又はポリペプチドのライブラリーの結合
又は生物学的活性の高処理量分析をも提供する。さらに、この方法は、個体及び
異なる組織又は細胞を同定するために、遺伝子のフィンガープリント法の代替物
として、個体のタンパク質「フィンガープリント法」をも提供する。タンパク質
がプールの状態で又は個々のタンパク質のアレイ中で分析され、それにより、一
旦修飾、結合又は生物学的活性が種々の方法で検出されたならば、タンパク質の
同一性は、特定のプール中でのその局在によるか又はアレイ中での特定の位置で
のその局在のいずれかにより直接又は間接に決定されうることが、本発明の重要
な性質である。同様に、この方法が異なる組織又は細胞間でのタンパク質又はタ
ンパク質修飾の相違の比較検出を可能にし、したがって、この方法がこれらの相
違のスクリーンを構成するということが、本発明の重要な側面である。
【００２２】 この方法は、第一に、組換えＤＮＡ法により形成された合成タンパク質、特に
イン・ビトロの転写及び翻訳（ＩＶＴＴ）により１以上の遺伝子から形成された
タンパク質、の使用に基づいている。本発明の一つの好ましい側面は、タンパク
質修飾又はタンパク質−タンパク質結合相互作用のスクリーニングに先立ち、固
相上へのその後の固定を伴う、ＩＶＴＴによる合成タンパク質の形成である。合
成タンパク質がタンパク質の修飾、結合活性又は生物学的活性について試験され
た場合、これらの合成タンパク質をコードする元の遺伝子を参照することにより
容易に同定されうるように、遺伝子（ＩＶＴＴを容易にするように設計されたベ
クターにクローニングされたｃＤＮＡ等）のアレイからの合成タンパク質の形成
が行なわれること、そしてそれによりこの遺伝子配列がタンパク質の同一性を明
らかにすること、が本発明のこの態様の重要な側面である。そのような遺伝子ア
レイは、例えば、個々のｃＤＮＡクローン又はクローン混合物を一つのアレイの
特定の位置（ミクロタイタープレートのウェル中等）に拾い上げることにより作
成される。ＩＶＴＴの後（通常、ＰＣＲ等の方法によるｃＤＮＡの増幅の後）、
前記アレイ中の各位置からタンパク質試料を取り出し、別のアレイの特定の位置
、例えば、代わりのミクロタイタープレート内又は個々の位置に試料を分配でき
る固相上に固定又は分配することができる。特異的なタンパク質の修飾又はタン
パク質の結合事象が前記アレイにおけるタンパク質試料から検出されるときは、
目的のタンパク質を同定するために、これらのタンパク質をコードする特異的遺
伝子の位置を決めてその配列決定をすることができる。
【００２３】 ｃＤＮＡライブラリーが免疫グロブリン可変領域（通常、一本鎖Ｆｖ領域とし
て、ＳＣＡｓ（単鎖抗体）と称する）等の１組の可変分子をコードしてもよいこ
とも、本発明の好ましい態様の範疇である。そのような可変分子は、アレイ中の
特定の位置に分配されたときは細胞又は組織の試料由来の他の特異的分子（通常
はタンパク質）に結合する能力を有する。次いで、これらの細胞又は組織の分子
は、アレイ中の可変分子への結合により、細胞又は組織の分子の整列したアレイ
を本質的に生ずる。次いで、そのようなアレイ中の細胞又は組織の分子の存在、
又はリン酸化又は他の分子との相互作用等によるのこれらの分子の修飾に対し、
アレイ中で番地を付与することができる。そのような細胞又は組織の分子の同一
性は、特に元の可変分子を単離状態で回収し、単離状態の細胞又は組織の分子（
単数又は複数）を回収するために用いる場合、その後にいくつかの方法により決
定することができる。次いで、そのような細胞又は組織の分子の同一性は、古典
的な生化学手段により、あるいはこれらがタンパク質の場合タンパク質の配列決
定又は２Ｄゲル移動特性等の方法により決定することができる。あるいは、その
ようなタンパク質性の細胞又は組織の分子の同一性は、本願特許に含まれるリボ
ソーム系等のタンパク質提示系を用いて決定することができ、それによりｃＤＮ
Ａライブラリーを用いて、特定の可変分子に結合する際にその結合タンパク質の
同一性を関連する遺伝子のヌクレオチド配列を決定することにより決定すること
が可能であるように、それらの遺伝子（又は遺伝子のＲＮＡ表示）に連結したタ
ンパク質のライブラリーを作製する。
【００２４】 タンパク質アレイの作製における合成タンパク質の生産のためのＩＶＴＴの使
用の代替として、本発明のミクロアレイ態様の別の側面は、ポリペプチドの大規
模な混合物をコードする遺伝子ライブラリーから有用な表現型を有する合成ポリ
ペプチドを生成させ、それにより対応する遺伝子が迅速かつ容易に回収可能な「
ポリペプチド提示」法の使用である。細胞に基づく提示系そして特に対応するｍ
ＲＮＡ（次いでタンパク質の同一性を解明するために配列決定されうる）へのリ
ボソーム複合体を介して連結したタンパク質を提供可能なリボソームに関連する
タンパク質の特定の提示（「リボソーム提示」）よりもタンパク質の種類に関し
てより大きな範囲を提示させるイン・ビトロのポリペプチド提示法が、開発され
た。また、本発明の方法は、ファージ提示等の他のタンパク質提示法をも取り込
むことができる。
【００２５】 本発明の方法の一つの態様において、タンパク質の修飾は、遺伝子ライブラリ
ーの形成によってスクリーニングされ、次いで、前記ライブラリーを用いて、好
ましくはｍＲＮＡから解離した全長の合成タンパク質の収量を最大にするような
条件下で、そのようなベクターから連続的にｍＲＮＡとタンパク質を製造するＩ
ＶＴＴ等により合成タンパク質を作成する。豊富なｍＲＮＡ種からのタンパク質
又はポリペプチドの過剰提示を回避するために、遺伝子ライブラリーを規格化す
る。ビオチン化リジン等の修飾アミノ酸の取り込み又はプラスミドベクターによ
りコードされるかＰＣＲにより導入されるアミノ酸配列タグの取り込みを通じて
、あるいはタンパク質の化学修飾を通じて、次に合成タンパク質を、ビオチン結
合性タンパク質（ストレプトアビジン等）を介し又は抗タグ抗体等のタグ結合性
タンパク質配列を介し磁気ビーズ等の固相上に固定化することができる。タンパ
ク質の修飾のスクリーニングにおいて、出発遺伝子の適当な分布を通じて、タン
パク質の小さなプール又は個々のタンパク質を、ミクロタイターウェル内等のア
レイに形成させ、これらのアレイに固定する。
【００２６】 あるいは、合成タンパク質は、タンパク質の個々の小さなプール又は個々のタ
ンパク質としてアレイ中に製造され、次いで、個々にガラス「チップ」上等の平
坦な固相上の異なる位置に（手動によるか又は自動分配機の使用によるかして）
移されるかも知れず、それにより、タンパク質は固相上の官能部と相互作用し、
固定化を生ずる。次に、これらの合成タンパク質を組織又は細胞の抽出物で処理
し、それにより、これらの組織又は細胞中に存在する酵素が合成タンパク質を修
飾することができる。次いで最後に、そのような修飾を、蛍光標識抗ホスホチロ
シン抗体等の特異的検出系を用いて検出する。前記検出系から得られるシグナル
を組織又は細胞の異なる抽出物により修飾した合成タンパク質の複製アレイと比
較すると、複製合成タンパク質間のこれらのシグナルの相違から、これらの異な
る組織又は細胞由来のタンパク質修飾活性における相違が示される。
【００２７】 本発明の方法の別の態様において、タンパク質−タンパク質結合相互作用を遺
伝子ライブラリーの創出によりスクリーニングし、次いで、前記ライブラリーを
用いて、好ましくはｍＲＮＡから解離した全長の一次合成タンパク質の収量を最
大にするようなベクター及び条件下で、ＩＶＴＴ等により合成タンパク質を生成
させる。修飾アミノ酸又はアミノ酸配列タグの取り込みを通じて、あるいはタン
パク質の化学修飾を通じて、あるいは化学反応性固相の使用により、合成した一
次タンパク質を合成直後に又はタンパク質−タンパク質相互作用を形成させる二
次タンパク質との相互作用後に固相に固定化することができる。出発遺伝子の適
当な分布を通じて、タンパク質の修飾に関するスクリーニングの場合と同様に、
一次タンパク質の小さなプール又は個々のタンパク質を、ミクロタイターウェル
中又はガラスチップ上等のアレイ中で形成させ、これらのアレイに固定化する。
次に、これらの合成した一次タンパク質を任意選択的に組織又は細胞の抽出物で
処理してもよく、それによりこれらの組織又は細胞中に存在する酵素が合成タン
パク質に対して修飾をもたらしうる。次に、前記一次タンパク質と適当な二次タ
ンパク質との適当な結合相互作用を形成させるために、一以上の二次タンパク質
（二次タンパク質のライブラリーを含む）を添加する。任意選択的に、これらの
二次タンパク質を合成し、二次タンパク質の同一性がその後決定できるようにリ
ボソーム又はファージ上に提示してもよい。
【００２８】 また、二次タンパク質は、組織又は細胞由来の天然のタンパク質であってもよ
いであろう。次いで、一次タンパク質と二次タンパク質の間のタンパク質−タン
パク質結合相互作用を種々の方法により検出することができる。例えば、一次タ
ンパク質を固相上に固定化し、合成した二次タンパク質の存在を、蛍光標識抗タ
グ抗体等の特異的検出系を用いる検出で、二次タンパク質内に取り込まれたアミ
ノ酸配列タグを介して決定することができる。あるいは、二次タンパク質がリボ
ソーム又はファージ提示等に関してそれをコードする核酸と会合するときは、二
次タンパク質を会合した核酸についてのＰＣＲ法により検出することができる。
あるいは、二次タンパク質の結合は、前記アッセイ系で検出されて二次タンパク
質が結合するとブロックされるようになる、合成した一次タンパク質上の部位の
ブロッキングにおける二次タンパク質の作用を通じて検出してもよい。あるいは
、二次タンパク質が天然のタンパク質の場合、ＵＶ活性化が可能なビオチン分子
の付加等により、結合後に直接標識化して直接検出してもよく、又は二次タンパ
ク質をレーザー気化してＭＡＬＤＩ（マトリックス補助レーザー脱着イオン化）
及び質量分析法により検出してもよい。合成した一次タンパク質の複製アレイへ
の二次タンパク質の結合を組織又は細胞の異なる抽出物間で比較すると、複製し
た合成タンパク質間のこれらのシグナルにおける相違から、これらの異なる組織
又は細胞由来のタンパク質−タンパク質結合活性における相違が示される。
【００２９】 タンパク質の修飾の範囲を検出することにより、そしてタンパク質タグ又はエ
ピトープに対する蛍光標識抗体の使用による等の慣用の検出フォーマットでタン
パク質−タンパク質結合を検出することにより、多数の異なるタンパク質の修飾
についての同時スクリーニングが、異なる組織及び細胞間の相違をスクリーニン
グするために行ないうるであろうことは明らかである。
【００３０】 本発明の別の態様においては、タンパク質−タンパク質相互作用は、二次タン
パク質、特に標準的な技術を用いて包括的に整列化させることが通常非常に困難
であると思われる天然の組織又は細胞由来のタンパク質のアレイを形成させるた
めの基礎として用いられる。一次タンパク質には、組織若しくは細胞抽出物由来
の天然のタンパク質又はリボソーム若しくはファージに提示されたタンパク質ラ
イブラリー由来の合成タンパク質等の二次タンパク質のセットに対する様々なセ
ットの結合特異性を提供する免疫グロブリン等の高度に多様なセットのタンパク
質が含まれる。一例として、一次タンパク質は、哺乳動物Ｂリンパ球由来の免疫
グロブリン可変領域の直接ＰＣＲ増幅により形成され、イン・ビトロ転写用の適
当なベクターにクローニングされたリボソームに提示された単鎖抗体（ＳＣＡ）
可変領域ライブラリーから誘導されるであろう。ＳＣＡライブラリーの構成物は
、ミクロタイターウェル中に別々に又は群として、又はガラスチップ等の固相上
に直接のいずれかで整列させ、ＳＣＡタンパク質をＩＶＴＴにより形成させ、タ
ンパク質タグを介し又は直接化学カップリングにより固相に固定化する。次いで
、組織若しくは細胞抽出物由来の天然のタンパク質の混合物又は遺伝子ライブラ
リーに起源を有する合成タンパク質の混合物（例えば、リボソーム又はファージ
に提示されたタンパク質）を、ＳＣＡｓ等の一次タンパク質のアレイにまとめて
添加し、それにより、一次タンパク質により二次タンパク質に伝えられる結合特
異性が、個々のＳＣＡｓに結合する単一の二次タンパク質又は二次タンパク質群
のいずれかを有する二次タンパク質の整列化に導く。達成された二次タンパク質
のアレイを組織又は細胞の異なる抽出物の間で比較し、次いで、複製した合成タ
ンパク質間のこれらのシグナルにおける相違がこれらの異なる組織又は細胞由来
のタンパク質の存在における相違を示すことになる。あるいは、これらのタンパ
ク質を、リン酸化等の種々の修飾を例えば、これらの修飾を検出する蛍光標識化
抗体を用いることにより試験することもできる。
【００３１】 アレイの個々の単一又は複数のタンパク質の構成物の存在又は修飾を異なる組
織又は細胞抽出物間で比較するために、あるいは、生きた細胞又は組織上のこれ
らのタンパク質構成物の結合又は生物学的活性を分析するために、合成か又は天
然のタンパク質を単一又は複数のタンパク質のアレイ中に分配することは、本発
明の具体的な側面である。ミクロタイタープレートの個々のウェル中のｃＤＮＡ
ライブラリー由来のクローン群の個々の構成物を分配することにより、アレイを
そのプレート中で容易に行なうことができるが、この手動の（又はロボット管理
の）整列化技術は、異なる試料間でウェルの壁という物理的バリアーを生じさせ
、これは、洗浄溶液や二次タンパク質ライブラリー等のその後の溶液を迅速かつ
正確に添加することを困難にする。さらに、ミクロタイタープレートの使用は、
整列化したタンパク質の密度に対して一つの制限を与え、そのような制限は、利
用可能なミクロタイタープレート内のウェルの密度により規定される。したがっ
て、タンパク質間に物理的なバリアーなしにタンパク質の整列化を要しない方法
が望まれる。
【００３２】 タンパク質のアレイが物理的なバリアーなしに形成される本発明の別の態様に
おいては、アレイ内のタンパク質の空間的な分布は、リボソーム提示等の遺伝子
ライブラリーに由来する個々の合成タンパク質を直接空間的に固定化させること
によるか、あるいは、タンパク質ライブラリーの構成物を間接的に空間的に固定
化させるために合成タンパク質ライブラリーと会合した核酸がアニーリングする
核酸、特に合成ＤＮＡを空間的に固定化することのいずれかにより達成される。
直接の空間的固定化のためには、組織又は細胞遺伝子ライブラリー由来の合成タ
ンパク質を固定化するか又は、二次タンパク質の混合物を次に添加でき、それに
より、これらは個々のタンパク質プローブに対する結合特異性に従って空間的に
分配されるであろうように、ＳＣＡｓ等の合成タンパク質プローブを固定化する
。したがって、本発明は、新規な型のタンパク質チップを提供する（ハッチェン
ス(Hutchens)とイップ(Yip) 、Rapid Comms. Mass Spec. 7, (1993), 576頁を参
照のこと) 。チップ上の合成タンパク質の固定化は、共有結合又は非共有結合の
いずれかにより達成される。翻訳反応中にビオチン化リジンｔＲＮＡの添加によ
りタンパク質に取り込まれたビオチン部分を用いる固定化が、特に便利である。
ビオチンを取り込むと、合成タンパク質分子は、次に、固相ストレプトアビジン
又は固相抗ビオチン抗体上に容易に固定化することができる。典型的には、これ
は、イン・ビトロ転写及び翻訳により製造されたタンパク質試料を、マルチウェ
ルプレートの特定の位置又はガラスチップ等の固相上に等分に分けることができ
るロボット分配機の使用により簡便化される。そのようなロボット分配機は、複
製固相内の同一の位置で同一のタンパク質を固定化して作成する合成タンパク質
の複製アレイを作製するのに特に重要である。ビオチン化リジンを用いる直接固
定化に関連して、合成タンパク質中に取り込まれなかった遊離のビオチン化リジ
ンｔＲＮＡは、いくつかの試料で、遊離のビオチン基が、固定化されたストレプ
トアビジン分子へのアクセスをブロックするという困難な問題を生じうる。都合
のよいことに、これは、翻訳反応混合物中のビオチン化リジンｔＲＮＡの枯渇を
確保することにより克服することができる（次いで、発生期のタンパク質は、非
修飾リジンｔＲＮＡの添加により完成されうる）；これに代わるストラテジーは
、固相のビオチン結合部位数に比べて過剰のリジン結合ビオチン分子数を使用す
るか又はビオチン化リジンｔＲＮＡ等の小分子を除去するための分子ふるい濾過
工程の使用である。別のストラテジーは、翻訳期間の終わりにリジンの豊富な（
ポリ）ペプチドをコードする合成ｍＲＮＡ鋳型を翻訳反応混合物中に添加するこ
とである。この鋳型は過剰の遊離ビオチン化ｔＲＮＡを取り込むことが可能であ
る。そのような鋳型は、反応混合物からリジンの豊富な合成タンパク質を除去す
るために後で使用できる（例えば、ポリヒスチジンテールに対する抗体を有する
ビーズを用いて）ペプチド配列（例えば、ポリヒスチジンテール）もコードする
であろう。そのような様式で、合成タンパク質の固定化に先立ち、遊離のビオチ
ン化リジン基は翻訳混合物から除去されるであろう。
【００３３】 また、タンパク質の非共有結合による付着は、次にはアビジンと反応するＳｕ
ｌｆｏ−ＳＢＥＤ(Pierce & Wariner, Chester, UK) 等の市販の試薬を用い、ビ
オチン等でタンパク質を標識することによっても容易にできる。タンパク質の共
有結合による付着は、オーサリバン(OSullivan) ら(Anal. Biochem. 100 (1979)
, 108)に記載されたもの等のいかなる慣用の方法でも架橋を容易にする反応種で
、タンパク質を活性化させることによっても達成されうる。タンパク質の付着は
、固定化の達成手段として次に固相のニッケルキレートか又は抗ポリヒスチジン
抗体に結合可能な末端のポリヒスチジン配列等の合成タンパク質内の特異的アミ
ノ酸配列を包含させることによっても容易になりうる。合成タンパク質の直接結
合の代替法には、例えば、ＲＮＡ結合タンパク質（ＨＩＶｔａｔタンパク質等）
を用いて会合したＲＮＡを固定化することによるか又は固相上の合成ＤＮＡ分子
にＲＮＡをアニーリングさせることによるリボソーム提示タンパク質の結合が含
まれよう。
【００３４】 核酸を介するタンパク質の間接的な固定化に関しては、タンパク質−リボソー
ム−ｍＲＮＡ複合体中の会合したｍＲＮＡを、そのｍＲＮＡをコードするプラス
ミドベクターにより元々コードされるヌクレオチド配列タグとともに調製しても
よい。ヌクレオチド配列タグは可変性であってもよく、例えば、（ベクターにア
ニーリングする適当な末端を有する）ランダムオリゴヌクレオチド混合物により
コードされる合成領域を用いてプラスミドベクターを作成して、例えば、ｍＲＮ
Ａの５’末端に配列標識をランダムに置くことにより、プラスミドベクター標品
中でランダム化されてもよい。遺伝子ライブラリーからタンパク質−リボソーム
−ｍＲＮＡ複合体を調製した後、ｍＲＮＡ配列タグを、スライドグラス（「ＤＮ
Ａバイオチップ」）等の固相表面に個々に位置する合成オリゴヌクレオチドのア
レイにアニーリングさせてもよい。このようにして、個々のタンパク質を、バイ
オチップ上の特定の位置に最後に配置してもよい。次いで、空間的に整列化され
たタンパク質を、これらの修飾のスクリーニングのために蛍光抗体等を用いて組
織又は細胞抽出物による修飾について分析してもよい。さらに、アレイは、バイ
オチップ上の個々のタンパク質に結合するかそのタンパク質を修飾するタンパク
質の同定に使用してもよい。修飾されたタンパク質、又はタンパク質−タンパク
質相互作用に関わるタンパク質の同一性については、前記チップ上に固定化され
たオリゴヌクレオチドの知られた配列からその後に決定してもよく、それにより
、この配列は、プラスミドライブラリー中の相補的配列タグと会合する特定の遺
伝子を同定するために、（例えば、ＰＣＲにより）プラスミドライブラリーを探
索するために用いられる。あるいは、タンパク質の同一性は、個々のタンパク質
に会合するｍＲＮＡ配列のＰＣＲ増幅により達成されてもよい。したがって、こ
の態様は、原理的にはチップ上の個々の位置に配置された個々のタンパク質を有
するタンパク質アレイバイオチップに関連する。あるいは、タンパク質の同一性
は、一次又は二次合成タンパク質が生産されているかどうかをタンパク質配列タ
グに対する抗体の混合物等を用いて探索可能なタンパク質配列タグのランダムセ
ットを用いて、決定してもよい。例えば、合成タンパク質は、一方の末端がアミ
ノ酸のランダム又はセミランダムストレッチのいずれかを含み、その各々が適当
な標識を有する抗体のライブラリー由来の抗体により検出可能なときは、一以上
の特異的抗体の結合が合成タンパク質の同一性を決定することができる。例えば
、タンパク質の一方の末端がランダムな８アミノ酸配列タグを含み、そしてＳＣ
Ａｓのライブラリーが構築され合成ペプチドの等価な混合物に対するＳＣＡｓの
結合が濃縮されているときは、個々の又は小さい群のＳＣＡｓは特異的ペプチド
に結合し、そのペプチド（したがって合成タンパク質）は、個々のＳＣＡｓの特
異性という知見により同定することができる。
【００３５】 また、異なる組織又は細胞間の相違の分析に先立って、修飾されたタンパク質
又は相互作用するタンパク質の混合物が予め選択されるという方法も、本発明に
包含される。例えば、タンパク質をコードする個々のｍＲＮＡ分子がタンパク質
に付着したままであるリボソーム提示等の提示法により作製される一次合成タン
パク質 を、組織又は細胞の抽出物による処理に付し、次いで、固相に固定化さ
れたこれらの修飾に対する抗体を用いる選択に付す。こうして、会合した核酸を
有する修飾されたタンパク質を単離し、例えば、アガロースゲル電気泳動等のＰ
ＣＲ産物の単純分析及び異なる細胞又は組織での処理から得られる結果の比較を
含むいくつかの手段により、単離されたタンパク質のプロフィールを決定するこ
とができる。同様に、タンパク質−タンパク質結合による二次合成タンパク質を
「捕捉」するために次に使用される一次天然タンパク質に関しては、相互作用す
るタンパク質を、例えば、二次合成タンパク質上のタグに対する抗体及び前記合
成タンパク質と会合する核酸由来のＰＣＲ産物の分析により再び決定される相互
作用するタンパク質のプロフィールを用いて単離することができる。
【００３６】 また、遺伝子ライブラリーから作製された合成タンパク質を、タンパク質の修
飾又はタンパク質−タンパク質結合の分析用のタンパク質ゲル電気泳動に付す方
法も本発明に包含される。タンパク質の加水分解又はリン酸化等の翻訳後修飾が
タンパク質の電気泳動上の移動度を変化させることは、よく証明されている（フ
ィジッキー(Phizicky)とフィールド(Fields) Microbiol. Rev., 59, (1995), 94
頁) 。したがって、本発明の１つの態様は、疾患に関連するタンパク質の修飾が
２Ｄゲル電気泳動を用いて検出される方法を提供する。例えば、その後のＩＶＴ
Ｔ又はリボソーム提示用のｃＤＮＡライブラリーを構築することになろう。タン
パク質のその後の精製を容易にするために、Ｈｉｓ又はＦｌａｇ等の３タグを、
用いる転写ベクター中に取り込んでもよい。これは、当業者によく知られた標準
的な分子生物学的技術により達成される。タンパク質のその後の検出を容易にす
るために、それらを３５Ｓ又はビオチン等の標識で翻訳過程中に標識してもよい
。翻訳後、必要ならばタンパク質を精製して、例えば、タンパク質が３ｆｌａｇ
又はポリヒスチジンタグを有する場合抗Ｆｌａｇ抗体又はニッケル等のリガンド
を含むアフィニティー媒体に翻訳混合物を通過させることにより、抗リボソーム
抗体を用いてリボソーム成分を固相上に除去することにより、あるいはリボソー
ムの単純な限外濾過によりリボソーム及び他の因子を除去することができよう。
次いで、臨床試料由来のタンパク質（未標識又は蛍光部との反応等を通じて標識
された）を、精製したイン・ビトロ翻訳ライブラリーと共にインキュベートし、
修飾したり又は合成タンパク質とのタンパク質相互作用を生じたりするであろう
。次いで、全反応物を２Ｄゲル電気泳動により分離し（キャッシュ(Cash)、J. C
hromatography 698 (1995), 203 頁) 、Ｐｈｏｒｅｔｉｘ−２Ｄ(Phoretix Inte
rnational, Newcastle upon Tyne, UK) 等の適当なコンピュータソフトウエアを
用いて得られたゲルを分析することになろう。対照反応は、合成タンパク質ライ
ブラリーが臨床試料代替物、例えば、最初の試料が疾患試料の場合は正常試料、
由来の全タンパク質と反応するように行なうことになろう。疾患関連修飾又はタ
ンパク質／タンパク質相互作用は、疾患試料で見られ、対照タンパク質では見ら
れないユニークバンドとして同定されるであろう。２Ｄゲル分析により同定され
たタンパク質に関連する遺伝子の迅速な同定を容易にするために、合成タンパク
質ライブラリーを最初に、各プールがライブラリーの一部を含むようないくつか
のプールに再分割することができる。これは、遺伝子の最初の混合物を分割する
ことにより達成される。次いで、各プールを前記したようにスクリーニングして
、目的のタンパク質を含むプールを同定することになろう。次いで、そのプール
に対する転写混合物を再び細分割して、スクリーニング過程を繰り返す。この手
法は、目的のタンパク質をコードする単一のクローンが同定されるまで、リボソ
ームに提示されたタンパク質を段々小さくしたプールを用いて繰り返されるであ
ろう。あるいは、２Ｄゲル分析による潜在的な疾患関連タンパク質の同定の後、
そのタンパク質を標準的なプロトコールによりゲルから精製し（ハガー(Hager)
とバーゲス(Burgess) 、Anal. Biochem., 109, (1980), 76 頁）、精製したタン
パク質をｓｃＦｖライブラリーで探索し、そのタンパク質を認識する抗体（１又
は複数）を同定する。次いで、その抗体（単数又は複数）を用いて、疾患試料の
ｃＤＮＡから構築された合成タンパク質ライブラリーをスクリーニングし、会合
した遺伝子タグを有するタンパク質を同定することになろう。タンパク質の同定
のための代替となる高度に革新的な方法として、例えば、ベクター由来の若しく
はベクターへのその後のクローニングのためのｃＤＮＡをコピーするために使用
される合成オリゴヌクレオチドの混合物由来のクローニングされたｃＤＮＡ中に
リーダー配列を取り込むことにより、元々プラスミドベクターにコードされ、そ
の後にタンパク質中に取り込まれるアミノ酸配列タグを持つ各組換えタンパク質
を作成してもよい。ヌクレオチド配列タグは可変性であってもよく、例えば、（
ベクターにアニーリングする適当な末端を有する）ランダムオリゴヌクレオチド
混合物によりコードされる合成領域を用いてプラスミドベクターを作成し、ｍＲ
ＮＡの５’末端等に配列タグをランダムに置くことにより、プラスミドベクター
標品中でランダム化されてもよい。ＩＶＴＴ又はリボソーム提示等によるタンパ
ク質混合物の製造及び２Ｄゲル電気泳動によるこれらのタンパク質の分離後、個
々のタンパク質を、配列の様々な並べ替えに特異的な抗体を用いる探索により分
析することができよう。
【００３７】 主な適用がヒト疾患又はヒトの健康管理、個体若しくは薬物治療状態に関連す
るタンパク質、タンパク質の修飾及びタンパク質−タンパク質相互作用の分析に
あるであろうことは、本発明にとって自明である。本発明は、「臨床試料」の使
用を取り込み、そのような用語は、組織、血液又は特定の疾患により影響される
と予想されうるその他のものであってもよい試料をいう。疾患試料とは疾患、健
康管理又は薬物治療状態により影響されると示唆されうる試料をいう。正常試料
とは、疾患により影響されない試料をいい、正常な健康管理状態を表すが、個体
間で変化してもよく、その後の薬物治療の結果に関連性があってもよい。疾患に
関連するタンパク質又はタンパク質修飾／相互作用の探究における比較目的のた
めに、正常及び疾患試料は、集団に誘導された不均一性を低減するように理想的
に適合されるであろう。これは、ひとりの患者から正常及び疾患試料を得ること
（例えば癌の胸部組織と癌に冒されていない胸部組織）により、あるいは、多数
の異なる患者から疾患及び正常試料をプールすることにより達成してもよい。
【００３８】 正常及び臨床試料の両方からのｃＤＮＡライブラリーの作製は、ｍＲＮＡの単
離後に逆転写によるｃＤＮＡを生成させることを含む標準的な技術により行なう
（サムブルック(Sambrook)ら、Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 第
2 版,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))か、あるいは、ＰｏｌｙＡ
Ｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ(Promega, Southampton, UK)等の市販のキットを用い
て達成してもよい。リボソーム提示によるイン・ビトロ提示及びタンパク質のイ
ン・ビトロ提示に関する条件等の合成タンパク質の生成に適するベクターへのｃ
ＤＮＡのクローニングは、以前に記載された通りである（例えば、ハーネス(Han
es) とプラックタン(Pluckthun) 、Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (1997) 4937 頁
に記載) 。試料からの全タンパク質の単離は、ボラーグ(Bollag)とエーデルスタ
イン(Edelstein)(Protein Methods, Wiley-Leiss, 1991) に詳細に記載されてい
る標準的な方法で達成される。リボソーム提示−本発明の第２の態様において、
リボソーム複合体が全長ポリペプチドに連結したままであるように、ｍＲＮＡの
３’末端でｍＲＮＡの翻訳を選択的に停止することによりリボソームからの全長
ポリペプチドの発現を最大にする新規なイン・ビトロリボソーム提示法が提供さ
れる。本発明は、ｍＲＮＡ分子の特異的部位に結合したタンパク質がポリペプチ
ドに会合したｍＲＮＡ−リボソーム複合体の失速を可能にするｍＲＮＡのさらな
る翻訳をブロックするであろうという発見に基づいている。また、本発明は、ポ
リペプチドのスクリーニングの直前に新規な翻訳開始を防止する任意の手段をも
含む。
【００３９】 まず、本発明の方法は、通常プラスミドベクター中にＤＮＡ分子のライブラリ
ーの創出を含む、そのようなＤＮＡ分子は様々なポリペプチドをコードし、それ
により、これらのポリペプチドをコードするＤＮＡがｍＲＮＡ分子に転写される
。通常、ＤＮＡ分子のクローニングベクターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター等の上流のプロモーターを含む。したがって、ＤＮＡ分子のプールされ
たライブラリーを、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及びリボヌクレオチドの添
加により転写し、ｍＲＮＡ分子のライブラリーを作製する。その後、ＲＮＡ分子
のライブラリーを大腸菌Ｓ−３０画分等のリボソーム標品を用いて翻訳する（チ
ェン(Chen H Z)とツバイ(Zubay G), Methods in Enzymology, 第101 巻 (1983)
674-690 頁) 。その後、連結したポリペプチド、リボソーム及びｍＲＮＡを含有
するリボソーム複合体を、典型的には固相に固定化したリガンドへの結合に関し
てスクリーニングし、標的リガンドに結合するポリペプチドをコードするＤＮＡ
分子を濃縮するための逆転写及びＰＣＲによる増幅のため、生じた固定化複合体
からｍＲＮＡを放出する。これらのＤＮＡ分子は、直接転写に使用可能であり、
あるいは標的分子に結合するポリペプチドをコードするＤＮＡの配列を決定する
ためにクローニングすることができる。本発明のこの態様に目的のため、ＤＮＡ
分子によりコードされるｍＲＮＡは、５’から３’にむかって、任意に可変セグ
メントの５’側に抗開始セグメントを有する可変セグメント、スペーサーセグメ
ント及び終結セグメントを含有する３つのセグメントを含むと考えられる。ポリ
ペプチドは、リボソーム複合体を介してｍＲＮＡの可変セグメントからタンパク
質に翻訳されたタンパク質又はペプチド配列を意味する。可変セグメントは、全
長のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ配列を意味する。スペーサーセグメント
は、完成したタンパク質がリボソームから完全に現われ、かつ、リボソーム複合
体を通じてコードするｍＲＮＡにまだ付着している間最適の三次元構造を採用す
ることを可能にする可変セグメントにつながったタンパク質セグメントをコード
するｍＲＮＡ配列を意味する。終結セグメントは、直接若しくは間接に結合部が
付着するｍＲＮＡ配列、あるいは、翻訳をブロックするために特異的タンパク質
が付着するスペーサーセグメントにつながって若しくは上流にポリペプチド結合
部をコードするｍＲＮＡを意味する。結合部は、リボソーム複合体上のｍＲＮＡ
に結合可能ないかなる分子又は翻訳の停止を生じさせるリボソーム複合体上の翻
訳されたポリペプチドに結合可能ないかなる分子のいずれかを意味する。通常、
結合部は、配列特異的様式でｍＲＮＡに直接結合するか又は、合成ＤＮＡ若しく
はＲＮＡ分子をｍＲＮＡにアニーリング後にこれらの分子上のリガンドを介する
結合部の付加等、ｍＲＮＡに間接的に結合してもよい。任意の抗開始セグメント
は、翻訳開始コドンに隣接し、異なる結合部の付着のための配列を通常提供する
。抗開始セグメントは、翻訳されたポリペプチドのスクリーニングの直前の新規
な翻訳開始を防止するであろう。標的リガンドは、特異的タンパク質の結合及び
会合したｍＲＮＡのその後の回収に関してライブラリーをスクリーニングする対
象である。
【００４０】 ｍＲＮＡ分子の可変セグメントは、単鎖抗体（ＳＣＡｓ、重鎖及び軽鎖に由来
し、共に連結して一官能性結合ドメインを生じる免疫グロブリン可変領域を含有
する）等の全長の公知のポリペプチド型又はランダム又はセミランダム配列のい
ずれかを含有する。公知のポリペプチド型又は領域のランダム／セミランダム会
合により創出されたキメラ配列も使用してもよい。ＳＣＡｓ等の公知のポリペプ
チド型に関しては、遺伝子の特異的セグメントを、ＳＣＡｓにおけるＣＤＲｓの
ようにランダム化してもよい。公知、ランダム又はセミランダム配列をコードす
るＤＮＡ分子の大収集物を最初に製造し、次いで、転写ベクターにクローニング
する。この転写ベクターは、以下に詳細に記載するその後のｍＲＮＡ分子におけ
る封入に関して他のセグメントを提供する。通常、前記ベクターは、翻訳開始コ
ドン及びｍＲＮＡに対するリボソーム結合部位をも提供するであろう。ＤＮＡに
よりコードされるさらに長いポリペプチド分子に関しては、翻訳を終結させるｍ
ＲＮＡの停止コドンの存在を減らすか除去する必要があるであろう。特定のタン
パク質にとっては天然である停止コドンを含むそのような停止コドンを、全長の
ポリペプチドを得るために除去することは、本発明の必要条件である。単鎖抗体
等の公知のタンパク質をコードするＤＮＡに関しては、これは、通常の停止コド
ンの除去かあるいは、停止コドンの位置で特異的アミノ酸を挿入するために翻訳
反応でナンセンスサプレッサーｔＲＮＡの使用を単に要求するだけである。化学
合成により製造されたランダム又はセミランダムＤＮＡの混合物に関しては、い
かなる特定の配列に存在する停止コドンの頻度は、合成反応中のＤＮＡ塩基組成
の操作により低下させることができ、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡも、翻訳
反応に使用することができるであろう。ｍＲＮＡ分子のスペーサーセグメントは
、全長ポリペプチドをリボソームから十分に出現することを可能にして適切なタ
ンパク質の折り畳み及び標的リガンドへの妨害されない接近を可能にするために
、リボソームの溝にまたがる可変セグメントの下流のポリペプチド領域を提供す
る。通常、このセグメントは、５０アミノ酸を越える領域をコードし、別のタン
パク質由来の完全なドメイン等の全長ポリペプチド又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１０
等のグリシン／アラニンの豊富なリンカーの折り畳みを妨害しそうにない領域を
コードするであろう。いくつかの翻訳されたタンパク質に関しては、スペーサー
セグメントは、タンパク質自体から連続する部分を含み、この部分は、可変セグ
メントの正しい折り畳み又は標的リガンドへの結合には要求されない。
【００４１】 終結セグメントは、完全な可変セグメントの翻訳後の翻訳終結を防止するよう
設計された結合部の直接又は間接付着のための下流のｍＲＮＡ配列を提供する。
結合部の特に好ましい結合方法は、終結セグメントに最初に付着する中間の合成
オリゴヌクレオチド分子を間接的に用いることである。そのような合成ヌクレオ
チドを結合部の特異的結合部位に装着した場合、そのときは、結合部が今度はア
ニーリングされた合成オリゴヌクレオチドに結合し、それによりｍＲＮＡの下流
端に付着して翻訳をブロックすることができる。この好ましい方法の一例は、そ
の後にストレプトアビジンが結合し、よって翻訳をブロックする分子を提供する
１以上のビオチン化ヌクレオチドを取り込んだオリゴヌクレオチドを使用するこ
とである。また、ストレプトアビジン等の分子の使用は、発生中のタンパク質が
イン・ビトロ翻訳反応混合物中で取り込まれたビオチン化リジン（又は別のビオ
チン化アミノ酸）によりそれ自体ビオチン化されうる、発生中のタンパク質のｍ
ＲＮＡ分子への架橋の単なる可能性をも提供する。この好ましい方法の別の例は
、次にはモノクローナル抗体若しくはその断片に結合しうる蛍光又はジニトロフ
ェノール等のリガンドを有する１以上のヌクレオチド誘導体を取り込んだオリゴ
ヌクレオチドを使用することである。また、これは、一方で合成オリゴヌクレオ
チドを介してｍＲＮＡに結合し、他方が翻訳されたタンパク質又はポリペプチド
上のアミノ酸配列により翻訳されたタンパク質又はポリペプチドにも結合する二
重特異性抗体等の二重特異性分子の使用も可能にする。その他の方法は、いかな
る中間のアニーリング工程もなく直接特異的タンパク質が結合する配列を有する
終結セグメントを提供することを含む。そのような結合部の一例は、鉄制御タン
パク質（ＩＲＰ）である。終結セグメントは、低濃度の鉄の条件下でのＩＲＰの
添加により安定化され、よってリボソーム翻訳に対して立体障害を生じさせるス
テム−ループ構造を提供するであろう。この後、発生中のペプチドの選択が起こ
りうる。リボソームを停止させるためのＩＲＰの使用は、鉄の添加が翻訳を再開
させそして終結させるように可逆的なブロックを導入する。これは、その後の転
写、配列決定又はｃＤＮＡクローニングに関するポリペプチドの選択後にｍＲＮ
Ａの放出を容易にするであろう。終結セグメント中の配列に結合するｍＲＮＡ結
合部のさらなる例は、ＴＡＲと称するＲＮＡステム−ループに結合するＨＩＶタ
ンパク質ｔａｔ（ディングウォール(Dingwall)ら，PNAS, 第86巻 (1989) 6925-6
929 頁）、ＲＮＰモチーフに結合するＬａ抗原（チャン(Chan E K L)とタン(Tan
E M), Mol. Cell. Biol. 第7 巻 (1987) 2588-2591 頁）及び一本鎖若しくは二
本鎖ＲＮＡのいずれかで、後者はヘアピンループを介してｍＲＮＡに創出可能な
特異的ＲＮＡ配列に結合するその他のＲＮＡウイルス由来のタンパク質を含む。
あるいは、終結セグメントは、翻訳終結の防止に関して結合部をさらに安定化さ
せるために合成されたポリペプチド自体又はリボソームタンパク質複合体に付加
的に結合する結合部の付着部位をコード可能である。任意に、終結セグメントは
、ｌｐｐ（大腸菌リポタンパク質）及びファージＴ３ターミネーター等のエキソ
ヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの安定性を高める１以上のさらなるｍＲＮＡの領
域を含むであろう。本発明のこの他の主要な側面に関して、ｍＲＮＡは、様々な
結合部が合成オリゴヌクレオチド若しくは他の分子の最初のアニーリングを通じ
て間接的に、又はｍＲＮＡ分子に対する直接的な認識及び直接的な結合部の結合
を介してのいずれかで結合可能な様々な終結セグメントとともに製造することが
できる。
【００４２】 隣接する任意の抗開始セグメントは、全長のポリペプチドを生ぜずそれ故に標
的リガンドへの非特異的結合を提供する恐れのある不完全な折り畳みを有するポ
リペプチドを提供するかもしれない翻訳反応の後期で翻訳開始を防止するように
設計される。抗開始セグメントは、例えば、シグナル認識タンパク質（ＳＲＰ）
が結合可能な翻訳されたポリペプチド中の分泌性リーダー配列をコードしてもよ
い。一旦、ＳＲＰがポリペプチドに結合したならば、ポリペプチドとｍＲＮＡと
の架橋によりさらなる翻訳の停止を生じさせる。また、翻訳停止は、発生中のペ
プチド及びｍＲＮＡにそれぞれ結合するＳＲＰのＳＲＰ５４とＳＲＰ９／１４サ
ブユニットとの組合せを用いることによっても達成されるかもしれない（シーゲ
ル(Siegel)とウォルター(Walter)，Cell Biol., 第100 巻 (1985) 1913-1921)。
抗開始配列の別の例は、下流のシストロンの翻訳を抑制する上流の２２コドンを
含むヒトサイトメガロウイルスｇｐ４８遺伝子のもの等の一定の真核細胞転写リ
ーダーにより提供される（ガオ(Gao J) とゲバーレ(Geballe A P), Mol. Cell.
Biol. 第16巻 (1996) 7109-7114 頁) 。そのようなリーダーは、下流のシストロ
ンに対するリボソームの進行をブロックするペプチドをコードすると考えられる
。抗開始配列のさらなる例は、前記した終結セグメント等の結合部により認識さ
れる配列であり、これらは、ＩＲＰ、ｔａｔ、Ｌａ抗原及びその他のウイルスタ
ンパク質により結合される配列を含む。
【００４３】 したがって、本発明は、任意に抗開始セグメントを有する可変、スペーサー及
び終結セグメントを有するｍＲＮＡ分子をコードするｃＤＮＡライブラリーの組
成物を提供する。好ましくは、本発明は、スペーサー及び終結セグメントをコー
ドし、抗開始セグメントは任意であるＤＮＡベクターを提供する。通常、ＤＮＡ
ベクターは、翻訳開始コドンも提供し、原核細胞のリボソームを用いる翻訳に対
しては、リボソーム結合部位はシャイン−ダルガーノ配列を含む。真核細胞の翻
訳系に対しては、共通のＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧを有するコザックの翻訳開
始配列を含んでもよく、翻訳開始部位から上流に、タバコモザイクウイルス等の
ある種のウイルス由来の非翻訳リーダー配列を含むエンハンサー又はアクティベ
ーター配列等の翻訳を促進する他の公知の配列を含むことが望ましい。通常、Ｄ
ＮＡベクターは、ＲＮＡポリメラーゼとともに用いてＤＮＡライブラリーに対応
するｍＲＮＡ分子のライブラリーを作製する強力な転写プロモーターも提供する
。そのようなプロモーターには、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラ
ーゼ及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのものが含まれ、さらに、ＲＮＡ依存性ポリ
メラーゼ、ＱｂレプリカーゼのプロモーターもＤＮＡによりコードされてもよい
。ＤＮＡベクターは、例えば、大腸菌リポタンパク質のターミネーター又はファ
ージＴ３の初期ターミネーター等の強力な転写ターミネーターも提供する。本発
明の方法において、可変セグメントを含むＤＮＡ断片をＤＮＡベクターにクロー
ニングし、それによりＤＮＡ断片は最小の停止コドンを持つか全く持たない。Ｓ
ＣＡｓ等の公知のポリペプチド型をコードするライブラリーに関しては、ＤＮＡ
断片を適当な制限部位を用いて単一の方向にクローニングする。プラスミド、バ
クテリオファージ、ファージミド及びウイルスベクターを含む様々な複製可能な
ＤＮＡベクターを本発明の方法に用いることができることは当業者にとって明ら
かであろう。ＰＣＲ等の方法によるＤＮＡ増幅を生きた細胞中のＤＮＡの複製の
ための代替として使用できることも、明らかであろう。ＤＮＡライブラリーを創
出するための可変セグメントが、ＤＮＡ断片、合成ＤＮＡ又は増幅したＤＮＡの
ベクターライブラリーを含む多数の供給源から提供されうることも、明確であろ
う。また、可変セグメントは、エラーしやすいＰＣＲ等を用いて、固定された鋳
型を用いる突然変異導入反応の結果として提供されうる。可変セグメントＩＲＰ
は、生きた生物のゲノムから直接に又はその生物のｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーか
らＤＮＡを構成させうることも、明確である。例えば、ＤＮＡライブラリーが単
鎖抗体断片を含有する場合、これらの断片は、免疫グロブリン可変領域をコード
するｍＲＮＡに由来し、生物内でＢ細胞により発現されうる。あるいは、前記断
片は、ゲノムの可変領域に由来することができる。そのような様式で、本発明は
、ヒト等の特定の生物由来の単鎖抗体ライブラリーの創出を提供する。
【００４４】 また、本発明は、任意に抗開始セグメントを有する可変、スペーサー及び終結
セグメントを有するｍＲＮＡ分子のライブラリーの組成物をも提供する。好まし
くは、本発明は、スペーサー及び終結セグメントをコードし、任意に抗開始発現
を有するｍＲＮＡ分子のライブラリーを提供する。ｍＲＮＡ分子は、それぞれ、
翻訳開始コドンを含み、原核細胞のリボソームを用いる翻訳に対しては、リボソ
ーム結合部位はシャイン−ダルガーノ配列を含む。真核細胞のリボソームを用い
る翻訳に対しては、ｍＲＮＡは、５’キャッピングヌクレオチドとともに合成さ
れてもよく、あるいは、これは、前もって合成されたｍＲＮＡに酵素により導入
されてもよい。翻訳開始部位から上流に、共通のコザックの翻訳開始配列及びあ
る種のウイルス由来の非翻訳リーダー配列を含むエンハンサー又はアクティベー
ター配列等の翻訳を促進する他の公知の配列をも含まれてもよい。翻訳過程の前
に又は最中に、１以上の結合部をｍＲＮＡ分子の終結セグメントと会合するよう
にし、よって、翻訳を失速させるであろう。また、翻訳過程の最中に、１以上の
結合部をｍＲＮＡ分子内又はｍＲＮＡ分子にコードされる任意の抗開始セグメン
トに会合するようにし、よって、新規な翻訳の開始を防止してもよい。
【００４５】 また、本発明は、任意に抗開始リーダー配列を有する可変及びスペーサーセグ
メントを有する翻訳されたポリペプチド分子のライブラリーの組成物をも提供す
る。これらのタンパク質分子は、結合部とｍＲＮＡとの相互作用を介してリボソ
ーム内に引き止められたさらに長いポリペプチドの一部として全長の可変セグメ
ントを提供する。ポリペプチドの５’末端 本発明は、リボソームとの作用に関し、よって、ｍＲＮＡ分子上のさらなる翻訳
を防止する。あるいは、５’末端は、５’末端の相補的配列への合成オリゴヌク
レオチドのアニーリングし、合成オリゴヌクレオチド中に取り込まれたビオチン
分子を介する等のその後の結合部のこのオリゴヌクレオチドへの結合等を介して
、間接的に結合部と会合するようになってもよい。
【００４６】 本発明の方法の範疇において、様々な手段を用いて、特にＲＮＡｓｅによる分
解からｍＲＮＡ分子の安定性を最適化することは、当業者にとって明らかであろ
う。例えば、Ｒｎａｓｉｎ及びバナジルリボヌクレオシド複合体等のＲＮＡｓｅ
の様々な阻害剤を転写反応に使用することができる。
【００４７】 代替として又は追加として、様々な構造が、通常、転写のターミネーターによ
り提供されるもののような３’ステム−ループを含むｍＲＮＡ分子に含まれうる
。また、転写及び翻訳反応は別々に行なわれるか又は特に原核細胞系を用いて、
共役したイン・ビトロ転写／翻訳反応に結合されるかのいずれかであることは、
当業者にとって明らかである。好ましくは、転写及び翻訳反応は、異なる最適試
薬を要求するであろうｍＲＮＡ及びポリペプチドの産生を最適化するために別々
に行なう。
【００４８】 本発明の方法の範疇で、様々な手段を用いてタンパク質分子の折り畳み及び特
にプロテアーゼによる分解からタンパク質分子の安定性を最適化することは、当
業者にとって明らかである。正しいタンパク質の折り畳みに関しては、例えば、
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ等の分子シャペロンの使用を通じて、ジス
ルフィド結合の形成を最適化するための特別の手段で、最適の酸化的タンパク質
折り畳み条件を翻訳反応に使用する。安定性に関しては、大腸菌のペプチドタグ
付加システムは、ハーネス(Hanes) とプラックタン(Pluckthun) （同書）の方法
等の方法を用いて、ｓｓｒＡ ＲＮＡの阻害により機能停止されうる。一旦最終
のポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体が形成されたなら、クロラムフェ
ニコール等の標準的な翻訳阻害剤を用いてこれらの複合体を安定化させることが
有益であるかもしれない。ポリペプチド鎖及び／又はｍＲＮＡとリボソームとの
追加の化学的、光化学的又は酵素的架橋も有益であるかもしれない。例えば、酵
素トランスグルタミナーゼは、発生中のポリペプチド鎖上に位置するＣ末端グル
タミンを使用して用い、遊離のアミノ基に架橋するための基質を提供してもよく
、好ましくは相補的合成オリゴヌクレオチドを使用してＲＮＡ分子の３末端に提
供する。代替例として、化学的に修飾したアミノ酸（セレニウムアミノ酸等）を
、チオール化ヌクレオチド等の化学的に修飾したＲＮＡヌクレオチドとのその後
の反応にために、タンパク質鎖中に取り込む。
【００４９】 一旦ポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体が形成されたなら、次いで、
うまく結合した複合体を連続的に回収できるような様式で、標的リガンドへの結
合に関して、混合物をスクリーニングすることができる。これは、プラスチック
若しくはガラス表面又はラテックス若しくは磁気ビーズの表面等の固相上に固定
した標的リガンドへの結合により達成されうる。本発明の他の態様は、細胞及び
組織への結合並びにポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体を形成するため
に使用したのと同じｍＲＮＡによりコードされるタンパク質分子を含有する溶液
中の他の分子への結合を含む。また、これは、その後に複合体の分離の基礎を提
供する別の反応又は一連の反応に影響を及ぼす標的リガンドの結合によっても達
成することができ、例えば、ここで、細胞の表面での標的リガンドへの結合は、
表面抗原の出現等のその細胞における変化を生じさせ、それにより、その細胞は
、結合したポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体とともに集団内の他の細
胞から分離することができる。
【００５０】 別法として、ポリペプチドを特定の酵素活性に関してスクリーニングすること
ができ、それにより、標的リガンドは、例えば、酵素に不可逆的に結合する酵素
基質であり、又は、ここで、基質は酵素により、ポリペプチド／リボソーム／ｍ
ＲＮＡ複合体に結合できるか又は酵素活性を含むポリペプチド／リボソーム／ｍ
ＲＮＡ複合体の全混合物から分離できるようにある種の他の変化を及ぼすことが
できる産物に変換される。
【００５１】 標的リガンドへの非特異的結合を回避するために、様々なブロッキング剤を、
特にｍＲＮＡと標的との非特異的会合を回避するために、標的リガンドとのイン
キュベーションの際にポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体に添加する。
血清アルブミン又はカゼイン等の様々な標準ブロッキング剤が有益であるが、非
特異的ｍＲＮＡ結合を特異的にブロックする好ましい方法は、合成オリゴヌクレ
オチド及び逆転写酵素を用いてポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体の結
合の前にｃＤＮＡを生成させることである。標的リガンドへの結合後に、ｍＲＮ
Ａ：ｃＤＮＡハイブリッド中のｍＲＮＡを分解するＲＮアーゼＨを用いるｍＲＮ
Ａのその後の酵素による破壊を可能にするが、この工程の使用は、酵素による分
解からのｍＲＮＡの保護をも提供する。
【００５２】 一旦、ポリペプチド／リボソーム／ｍＲＮＡ複合体が標的リガンドへの結合に
より分離されたなら、その複合体を標準法により調製的に精製するか又はＥＤＴ
Ａ等を用いて単にＲＮＡを放出させるか又はｃＤＮＡへの逆転写の前に単に加熱
するかのいずれかが可能である。あるいは、ｍＲＮＡを、ポリペプチド／リボソ
ーム／ｍＲＮＡ複合体の結合の前にｃＤＮＡにコピーし、次いで、前記したよう
にＲＮアーゼＨで破壊することができる。次いで、ＰＣＲ等の方法によるｃＤＮ
Ａの増幅が行なわれる。次いで、増幅したＤＮＡを、ライブラリーをさらに分割
するために再び転写及び翻訳するか又はサブライブラリーを作製するためのクロ
ーニングすることのいずれかができる。標的リガンドに結合するポリペプチドが
突然変異により進化する分子進化ストラテジーに関しては、突然変異導入は、エ
ラーしやすいＰＣＲ等を用いるｃＤＮＡの増幅の段階で影響されうるか又はポリ
ペプチドをコードするＤＮＡセグメントの特異的領域に突然変異を導入する混合
オリゴヌクレオチド等を用いて、クローニングされたサブライブラリーを突然変
異導入に付すことにより影響されうるのいずれかである。必要ならば、転写／翻
訳用の最初のＤＮＡライブラリー又はスクリーニング後のサブライブラリーを、
スクリーニングに付されたポリペプチドの混合物の複雑さを低下させるために、
スクリーニング用のプール又は個々のクローンに再分割することができる。ＤＮ
Ａライブラリー由来の１以上のポリペプチドを最終的に同定した後、次いで、必
要ならばスペーサーセグメント又はいかなるその他のフランキングセグメントな
しに高レベルの所望タンパク質を製造するために、目的の特定のポリペプチドを
コードするＤＮＡを発現ベクターにサブクローニングすることができる。
【００５３】 本発明は、ＳＣＡｓ等の公知のポリペプチド型の改変体又は現存するタンパク
質よりも優れた生化学的若しくは生物学的活性を有する全体的に新規なタンパク
質の単離を含む様々な適用を有することは、当業者にとって明らかであろう。公
知のポリペプチド由来の領域と新規なポリペプチド配列の領域とのハイブリッド
として創出されたキメラタンパク質も、製造されるかもしれない。抗体等の複数
鎖ポリペプチド型に関しては、重鎖及び軽鎖可変領域の機能的又は新規な組合わ
せも製造されるかもしれない。
【００５４】 生物学的スクリーニング−本発明の第３の態様において、ＤＮＡライブラリー
によりコードされポリペプチド提示を介して発現される生物学的表現型を直接選
択する新規な方法が提供される。前記方法は、提示されたポリペプチドの結合表
現型の前知識を要することなく、生物学的表現型と遺伝子型との直接な連結を提
供する。本発明のこの態様の１つの側面において、提示された生物学的に活性な
ポリペプチドの結合による生物学的応答の刺激（又は阻害）は、標的の生きた細
胞での変化を生じさせ、このことは変化した細胞の分離の基礎を提供する。次に
は、生物学的に活性なポリペプチドをコードする１又は複数の遺伝子が、変化し
た細胞の回収を介して次いで回収されうる。この態様の別の好ましい側面におい
て、提示された生物学的に活性なポリペプチドの結合による生物学的応答の刺激
（又は阻害）は、標的の生きた細胞からの分子（本明細書において「モジュレー
ター」と称する）の製造（又は製造の休止）を生じさせ、このことは、次には生
物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子の回収に導く。本発明は、以下
のように、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子の２つの広範な回
収方法を提供する。
【００５５】 （１）「タグ付加」−この方法において、標的の生きた細胞により製造されたモ
ジュレーターは、提示されたタンパク質／ポリペプチドを含む複合体に結合し、
よって、その後の単離のためにこの複合体にタグを付加する。例えば、標的の生
きた細胞は、生物学的に活性なポリペプチドの結果として、そのポリペプチドを
コードするｍＲＮＡを含む生物学的に活性なポリペプチドを提示するリボソーム
複合体に結合するタンパク質又はタンパク質性複合体を生成するかもしれない。
モジュレーターと生物学的に活性なポリペプチドを提示する複合体との好ましい
結合は、例えば、標的細胞の表面で又は標的細胞内で、この複合体の標的の生き
た細胞への非常な接近の結果としてであろう。標的細胞によるモジュレーターの
製造後、次いで、提示されたポリペプチドを含むタグ付加複合体を、例えば、モ
ジュレーターに結合して生物学的に活性なポリペプチドを提示する複合体を生物
学的に活性なポリペプチドを欠く他の複合体から分離する抗体を用いることによ
り、単離することができる。これらの複合体を分離した後、生物学的に活性なポ
リペプチドをコードする遺伝子型を決定することができる。リボソーム提示にお
けるその適用に加えて、タグ付加法は、生きた微生物を用いるポリペプチド提示
法とともに用いることもできる。例えば、モジュレーターを用いて、その後のタ
グ付加ファージの単離及び生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子の
回収のためにバクテリオファージにタグを付加する。
【００５６】 （２）「相補性」−この方法において、標的の生きた細胞により製造されたモジ
ュレーターは、生きた微生物のその後の生存力に必要である。例えば、標的の生
きた細胞は、生物学的に活性なポリペプチドの結果として、生物学的に活性なポ
リペプチドを提示する欠陥バクテリオファージの感染能を回復させるのに必要な
モジュレーターを製造し、それによりそれをコードする遺伝子を含む。次いで、
感染能の回復の際に、バクテリオファージを、生物学的に活性なポリペプチドを
コードする遺伝子を増幅するために、感染した宿主を通じて増殖することができ
る。モジュレーターと生物学的に活性なポリペプチドを提示するバクテリオファ
ージとの好ましい結合は、例えば、標的細胞の表面で又は標的細胞内で、この複
合体が標的の生きた細胞に非常に接近したことの結果としてであろう。バクテリ
オファージの増幅後、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子型を決
定することができる。バクテリオファージ提示におけるその適用に加え、相補性
方法も、生きた細菌を用いるポリペプチド提示法とともに使用できるであろう。
例えば、モジュレーターは、適当な選択条件下で、標的の生きた細胞に非常に接
近した細菌の選択的生育を可能にし、よって、生物学的に活性なポリペプチドを
コードする遺伝子型の増幅を可能にする抗生物質、薬剤耐性酵素／因子又は必須
栄養素でありうる。
【００５７】 タグ付加又は相補性方法のための標的の生きた細胞から放出されたモジュレー
ターが、例えば、誘導されたリポソームの溶解を介するリポソーム又は他の分子
区画からのこれらの放出により、間接的にタグ付加又は相補性部をも提供でき、
ここでモジュレーターはホスホリパーゼ又はある種のリポポリサッカリドに基づ
くリポソーム、ガラクトシダーゼ等であることは、当業者にとって明らかであろ
う。リポソーム又は他の分子区画から放出された可能なタグ付加部又は相補的部
の中では、核酸又は感染性微生物でありうる。放出された核酸は、アニーリング
により提示された生物学的に活性なポリペプチドを含むリボソーム複合体のｍＲ
ＮＡ又はｒＲＮＡ成分にタグを付加することができる合成オリゴヌクレオチドを
含有することができる。放出された感染性微生物は、生物学的に活性なポリペプ
チドを提示する細菌細胞に感染し、その細胞のその後の生存力、よって遺伝子型
の増幅につながる１以上の遺伝子を提供することができることができるバクテリ
オファージを含みうる。放出されたモジュレーターは、基質をタグ付加部又は相
補性部として作用する産物に変換する効果を有する酵素でもありうる。モジュレ
ーターが、そのような放出が生物学的に活性なポリペプチドによりブロックされ
うる標的細胞から構成的に放出されうることも当業者にとって明らかであろう。
また、生物学的に活性なポリペプチドによる結合の結果として、標的の生きた細
胞中の他の変化が、タグ付加又は相補性のいずれかに生じるということも自明で
ある。例えば、標的の生きた細胞中の生物学的な変化は、生物学的に活性なポリ
ペプチドを含む複合体又は微生物との相互作用のために放出されるモジュレータ
ーを含むリポソームを有するその細胞の融合に導くかもしれない。
【００５８】 本発明のこの態様を実施するための最初の方法において、異なる遺伝子を含む
プラスミドのライブラリーを、転写及び次いで、哺乳動物細胞で生物学的効果を
試験するポリペプチド分子に翻訳する。具体的には、プラスミドライブラリーは
、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの下流にクローニングされ、ｍＲＮＡ転写
物を生成し、次いでイン・ビトロで翻訳される遺伝子のライブラリーを含む。次
いで、そのＲＮＡがまだ会合したままの翻訳されたポリペプチド混合物を、細胞
に投与して細胞の表現型の変化が測定される。次いで、所望の変化した表現型を
有する細胞を単離し、リボソーム／ポリペプチド複合体にまだ会合したままのｍ
ＲＮＡ分子に特異的なプライマーを用いるＰＣＲに付す。この様式において、所
望の細胞表現型効果を誘導するポリペプチドをコードする遺伝子を増幅し、配列
を決定し、遺伝子によりコードされるタンパク質のその後の再試験のために発現
ベクターに再クローニングするか転写ベクターに再クローニングすることができ
る。したがって、エラーしやすいＰＣＲの使用等による突然変異導入ストラテジ
ーの使用を通じて、タンパク質は、最大の生物学的活性を有するポリペプチドを
生成させるために、必要な表現型の誘導のための連続回の試験を通じて進化され
うる。
【００５９】 転写され、ｍＲＮＡが翻訳されるプラスミドベクターの代替として、他の方法
を本発明の範囲内で使用し、決定可能な遺伝子型に連結したポリペプチドを製造
してもよく、そのような方法は、バクテリオファージ粒子の表面上でのタンパク
質の提示用のバクテリオファージベクター及びこのポリペプチドをコードするＤ
ＮＡに結合することを試験されるポリペプチドを生じさせるＤＮＡ結合ポリペプ
チドに融合するポリペプチドをコードするプラスミドベクターを含む。
【００６０】 決定可能な遺伝子型に連結したポリペプチドを製造し、本発明は、標的の生き
た細胞で生物学的な活性を誘導するための方法の範囲を提供し、それにより生物
学的な活性の遺伝子型を決定することができる。１つの単純な方法は、細胞表面
マーカーの出現又は消滅により生物学的な活性を検出することであり、そのマー
カーは、次いで、生物学的に活性な細胞を不活性な細胞から分離するための基礎
として使用することができる。通常、これは、細胞表面マーカーに結合する抗体
を用いて、次いで抗体結合細胞を未結合細胞から分離するための方法を用いて達
成されるであろう。そのような方法は、抗体への磁気ビーズの結合を介する（例
えば、ビーズ会合抗免疫グロブリンを用いて）か又は蛍光標示式細胞分取法（Ｆ
ＡＣＳ）を介するものであり、それにより、抗体（又は二次抗体）を蛍光標識す
る。要求される生物学的な活性を有する細胞を単離し、次いで、対応する遺伝子
型を、試験ポリペプチドと会合した核酸のＰＣＲによる増幅か又は分離した細胞
に結合したバクテリオファージの増殖により決定することができる。
【００６１】 遺伝子型に対して生物学的な活性を連結する別の方法は、試験ポリペプチドを
その遺伝子型に連結する複合体に直接結合する１以上のタグ付加部を製造（又は
製造を中断する）ために、標的細胞を操作することである。例えば、細胞を操作
して、ｍＲＮＡ／リボソーム／ポリペプチド複合体と会合するｍＲＮＡに結合す
るＲＮＡ結合ポリペプチド（ＨＩＶ ｔａｔタンパク質等）を製造する。そのよ
うなプロモーターの一例は、Ｔ細胞受容体の刺激等の結果として活性化されたＩ
Ｌ−２プロモーターである。このＲＮＡ結合ポリペプチドは、生物学的効果の一
部として活性化されたプロモーターに連結してもよく、生物学的効果の一部とし
て活性化された別のポリペプチドに関連した融合タンパク質として製造してもよ
い。細胞溶解又は試験ポリペプチドの生物学的に活性な細胞への結合の他の放出
後、次いで、ｍＲＮＡを、タグ付加部に結合する抗体等を用いて単離することが
できる。また、細胞を操作して、損傷したファージにおける他のポリペプチドを
相補可能なバクテリオファージポリペプチドを製造し、よって、そのファージを
感染性にしてもよい。
【００６２】 生物学的な活性が細胞表面マーカーの出現又は消滅により伴う場合において、
本発明の別の適用は、この表面マーカーをタグ付加部又は相補性部の放出又は創
出に関連付けることである。これは、例えば、様々なタグ付加部又は相補性部を
放出するためにホスホリパーゼＣ（又はある種のリポポリサッカリドを含むリポ
ソームに対してはβ−ガラクトシダーゼ）によるリポソームの酵素による溶解に
より、あるいは例えば、反応性ビオチン部を創出させるためにビオチニル−チラ
ミドの西洋ワサビペルオキシダーゼによる酵素による変換により、細胞表面マー
カーに結合しその後タグ付加部又は相補性部の放出を触媒する抗体−酵素コンジ
ュゲート等の使用により達成することができる。
【００６３】 表面抗原に対する代替として、細胞内で製造された部分を選択の基礎として使
用することができることは、当業者により理解されるであろう、それにより、生
物学的応答の刺激（又は阻害）の後に細胞を浸透性にし、この部分を抗体等の結
合タンパク質により接近させるか、又はタグ付加部若しくは相補性部が最終的に
創出され次いでポリペプチド提示複合体に結合できるような方法で、酵素による
変換のために使用する。
【００６４】 リガンド指向スクリーニング−本発明のこの態様は、表面受容体の付近で分子
を標識するために、細胞又は組織の表面に受容体を結合するリガンドを用いる方
法を提供する。特に、本発明は、細胞表面上のリガンドに付着した別の分子を案
内するためのリガンドを使用し、ここで、この他の分子は、次いで、標識反応を
行なうことができる。特に、この態様は、提示されたタンパク質をコードする対
応する遺伝子を単離することができるように、リガンドの付近で細胞／組織に前
もって結合した提示されたタンパク質の標識を提供する。以下の本明細書におい
て、受容体という用語は、リガンドが結合できるタンパク質性部分をいう。リガ
ンドという用語は、受容体に結合する通常はタンパク質の分子をいう。結合タン
パク質という用語は、ＤＮＡライブラリーによりコードされるタンパク質をいう
。タンパク質−複合体とは、結合タンパク質と核酸との複合体をいい、それによ
り、標的分子に結合する際に、結合タンパク質をコードする個々の遺伝子は結合
タンパク質が再生できるように回収することができる。標識とは、標識部により
放出され、かつ、標識−受容体を介してタンパク質−複合体と結合又は反応可能
な分子をいう。標識部とは、一般に、その後に標識の放出を触媒することが可能
な酵素をいう。標識−受容体とは、標識な結合するタンパク質−複合体上の部位
をいう。
【００６５】 本発明のこの態様の好ましい特徴は、リガンドに隣接して直結したタンパク質
−複合体を標識する標識を提供するための標識部としてのリポソームの使用であ
り、それにより、リガンドは、リガンドの付近で包まれた内容物を放出させるリ
ポソームと会合するか又は会合するようになりうる。これは、本発明の方法にお
ける異なる標識の使用での多用途性を提供する。ＵＳ５１９６３０６に記載の酵
素活性化系等の他の標識系も、本発明の方法の範疇で使用することができる。
【００６６】 この態様の好ましい特徴は、それぞれがｍＲＮＡ分子、１以上のリボソーム及
び１以上の翻訳されたタンパク質を含有するタンパク質−複合体の使用である。
そのような複合体において、１又は複数のタンパク質は、１又は複数の結合タン
パク質として作用し、それにより、うまく結合した際に、タンパク質−複合体を
回収することができ、ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡへの変換、一般にはＰＣＲを用いて
、及びその後の転写（合成ＤＮＡにより導入された転写プロモーターにより）又
は複製可能なベクターへのクローニングにより、通常複製される。この態様の別
の好ましい特徴は、タンパク質−複合体が派生されうる複製可能な核酸遺伝子ラ
イブラリーである。他のタンパク質のライブラリーは、外部アミノ酸及びタンパ
ク質構造／形の変化を有する保存された内部タンパク質枠組みをコードするライ
ブラリーをも特に使用することができるけれども、一般に、このライブラリー由
来の遺伝子は、抗体可変領域（一般に、単鎖Ｆｖ’ｓ又はｓｃＦｖｓの型で）を
コードする。タンパク質−複合体を、標識されたタンパク質−複合体が未標識タ
ンパク質−複合体から優先的に単離できるような方法で、標識により標識できる
ことは、本発明の態様の必要条件である。
【００６７】 好ましくは、本発明のこの態様において、細胞又は組織切片の表面で前もって
キャラクタライズされていない受容体に結合するタンパク質性リガンドが提供さ
れる。前記リガンドは、化学結合による細菌性ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）との
結合前に直接結合されるか又は通常ＰＬＣにコンジュゲート化した抗リガンド抗
体自体等との結合後に間接的に結合される。リガンドの細胞への結合後に、ＤＮ
Ａライブラリーに由来するタンパク質−複合体を細胞／組織に添加してタンパク
質成分を細胞／組織に結合させ、過剰の非結合剤を洗浄により除去する。これは
、そのリガンドのキャラクタライズされていない受容体に実際に結合したものを
含む結合したリガンドに非常に近接したいくつかの複合体を含む表面に結合した
タンパク質−複合体の多重度のままに細胞又は組織を有効にしておく。次の工程
で、標識を包むリポソームの標品を添加する。リポソームと表面に結合したタン
パク質−複合体を有する細胞又は組織との接触の際に、脂質の頭部を分解してＰ
ＬＣの接触点でリポソームを脱安定化させるＰＬＣとの接触を通じてリポソーム
の溶解のみが起こるであろう。これは、リポソームからの標識の漏れとなる。
【００６８】 標識がＰＬＣの接触部位から拡散されうる間、適当な標識がＰＬＣの付近のみ
の適当な標識受容体と効率的に反応することができることは、本発明の原理であ
る。そのような標識は、通常、アニーリングした合成オリゴヌクレオチドにより
ｍＲＮＡ成分上で、タンパク質−複合体と会合したビオチン分子と強固に結合可
能なストレプトアビジンである。代替標識は、適当なｍＲＮＡ分子上のヘアピン
−ループ（ＴＡＲ）に結合可能なＨＩＶ ｔａｔタンパク質又はそのペプチド断
片である。隣接するタンパク質−複合体と反応させ、過剰のリポソーム及び標識
を細胞／組織から洗浄除去し、標識されたタンパク質−複合体を回収する。回収
は、通常、固定化された標識又は標識誘導体（ビオチン等）又は標識に特異的に
結合する抗体（抗ビオチン、抗ｔａｔ等）を用いて行なうことができる。タンパ
ク質−複合体の遺伝子成分は、ＥＤＴＡ等の添加によい優先的に除去さてｍＲＮ
Ａ／リボソーム／タンパク質複合体を解離することもできるけれども、様々な手
段を用いて、タンパク質−複合体を解離させることなく、細胞／組織表面から標
識したタンパク質−複合体を除去することができる。次いで、回収された標識さ
れたタンパク質−複合体又はタンパク質−複合体の遺伝子成分は、核酸分子の数
を拡大させて適当な複製可能なベクターへのＤＮＡのその後の再クローニングを
容易にするために、転写／翻訳を用いる場合は、遺伝子増幅に使用した合成ＤＮ
Ａを介して導入したプロモーターによるその後の転写を可能にするために、核酸
増幅に付すことができる。したがって、リガンドに近接した細胞／組織に結合す
る１以上の結合タンパク質をコードする遺伝子は、それ故に、受容体の分子単離
及び恐らく細胞内部へのシグナル伝達において受容体により活性化される分子を
含むかもしれない受容体付近の分子の分子単離をもを容易にする豊富な結合タン
パク質源を提供するために単離することができる。
【００６９】 受容体の分子単離を容易にすることに加えて、本発明のこの態様の方法により
単離された結合タンパク質は、それ自体、細胞／組織結合のその後のラウンドの
リガンドとして有効に使用することができ、それにより、最初の結合タンパク質
は、それ自体、１以上のＰＬＣ分子にコンジュゲート化又は付着化される。細胞
／組織への受容体部位でのこれらの結合タンパク質−ＰＬＣコンジュゲートの結
合後、次いで、遺伝子−由来タンパク質−複合体のライブラリーを細胞／組織へ
の結合のために添加する。適当なライブラリーから、これは、受容体自体の天然
のリガンド結合部位に及び受容体の付近の他のタンパク質にも両方に結合する結
合タンパク質を提供するだろう。ＰＬＣ分子との接触の際のリポソームの添加と
溶解の際に、新規なタンパク質−複合体をその後の単離又は濃縮を可能にするス
トレプトアビジン又はｔａｔ等の標識で標識する。これらの標識された結合タン
パク質−複合体における結合タンパク質をコードする遺伝子の回復により、受容
体及び隣接する分子の単離のための多数の追加の道具が提供されるかもしれない
。しかしながら、より望ましいいくつかの場合において、１以上の新らしく標識
されたタンパク質−複合体が天然のリガンド結合部位に結合し、よって、天然の
リガンドの結合をブロックするか又は受容体の活性化において天然のリガンドと
置換するか又は天然のリガンドにより正常にアップ−レギュレーションされた活
性の受容体により誘導されたダウンレギュレーションを通じて受容体でアンタゴ
ニスト様の応答を誘導する新規の結合タンパク質を提供するだろう。いくつかの
場合において、個々の結合タンパク質は、医薬候補分子を提供するであろう。
【００７０】 本発明のこの態様の方法は、その内のいくつかは標的受容体に結合するかもし
れない異なるタンパク質型をコードする遺伝子のコレクションを含有するＤＮＡ
ライブラリーを用いて通常行なわれるであろうことは、当業者により認識される
であろう。
【００７１】 リガンド分子は、直接若しくは間接のいずれかで付着可能であり、標識部が標
識を放出してタンパク質−複合体に付着可能な天然のタンパク質性又は非タンパ
ク質性のいかなる分子でもありうるということは、当業者により認識されるであ
ろう。
【００７２】 結合タンパク質は、いくつかの分子型に基づきうることは、当業者により認識
されるであろう。タンパク質型が通常抗体可変領域によりコードされる抗体であ
ろうが（通常、単鎖Ｆｖ’ｓ又はｓｃＦｖｓの型で）、他のタンパク質は、特に
保存された内部タンパク質の枠組みを有するものも使用可能であり、それにより
、外部アミノ酸における変化及びタンパク質の構造／形は、異なるタンパク質分
子のライブラリーを創出するであろう。そのような非抗体タンパク質分子に採用
される形のいくつかは、比較的平らな結合面を有する他のタンパク質分子への結
合に適するが大きなタンパク質性リガンドを適応させるための凹状等の複雑な形
を有するタンパク質分子への結合にはあまり適さない抗体自体よりも、標的受容
体への結合により適合するかもしれない。
【００７３】 タンパク質−複合体は複数の型の内の１つでありうるし、それにより、結合タ
ンパク質が直接又は間接のいずれかでそれをコードする核酸配列に連結するとい
うことは、当業者により認識されるであろう。好ましい態様において、タンパク
質−複合体は、すでに終結してリボソームよってｍＲＮＡとの会合から遊離する
ようになる翻訳されたタンパク質にとって好ましいように複合体の収量を最適化
するように設計された条件下で、ｍＲＮＡの翻訳により形成されたｍＲＮＡ／リ
ボソーム／タンパク質の複合体である。他の態様において、タンパク質−複合体
は、ファージ表面に結合タンパク質を提示する遺伝子ライブラリー由来のバクテ
リオファージ粒子を含有するであろう。
【００７４】 あるいは、タンパク質−複合体は、細菌表面に結合タンパク質を提示する遺伝
子ライブラリー由来の細菌粒子を含有するであろう。他の態様は、ｌａｃＩと結
合タンパク質との融合物を含有するｌａｃＩ融合タンパク質を含むであろう、そ
れにより、ｌａｃは、結合タンパク質をコードするプラスミド並びにバキュロウ
イルス及びレトロウイルスを含む他のウイルスタンパク質提示系上のｌａｃオペ
レーターに結合する。
【００７５】 標識は、標識を放出する標識部の付近でタンパク質−複合体中の他のタンパク
質性分子又は核酸分子に結合可能な多くの分子の内の１つでありうることは、当
業者により認識されるであろう。また、対応する標識受容体は、標識に適合する
いくつかの分子の内の１つでありうることも、当業者により認識されるであろう
。適する標識（及び標識受容体）は、ストレプトアビジン（ビオチン）、ｔａｔ
（ｍＲＮＡ上のＴＡＲヘアピンループ）、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）（タンパ
ク質の真核細胞リーダー配列）、抗体（抗原）、ＲＮＡ結合分子（ｍＲＮＡ）、
特異的タンパク質結合分子（タンパク質の結合配列）、Ｆ線毛（バクテリオファ
ージＦ受容体）及びニッケル（タンパク質上のヒスチジン「タグ」）を含むであ
ろう。
【００７６】 標識部は、通常、標識の放出を生じさせる酵素であろうことは、当業者により
認識されるだろう。そのような標識部は、ＰＬＣ（リポソーム、赤血球又は他の
細胞の溶解用）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ビオチン化チラミド用）及び細
菌酵素β−ガラクトシダーゼ（グリコリポソームの溶解用）を含むであろう。
【００７７】 他のリポソームの溶解機構は、酵素溶解に対する代替として本発明の範囲内で
用いられうることは、当業者により認識されるであろう。例えば、受容体へのリ
ガンド結合をまだ可能にするような様式で、脂質尾部でリガンドをリポソーム膜
にカプセル化することによる等の直接的に、又は表面抗体で飽和させたリポソー
ム若しくはリポソームをリガンドに標的化させる他の結合タンパク質を用いるこ
とによる等の間接的にのいずれかでリポソーム全体をリガンドに付着することは
、可能であるかもしれない。そのような環境下では、リポソーム溶解は、界面活
性剤による溶解又は加熱又はリポソーム溶解を達成させる他のいかなる方法によ
り単純に達成されうるであろう。
【００７８】 本発明の方法を用いて、タンパク質−複合体を標識することよりもむしろ受容
体の付近で受容体及び他の分子を直接標識することができることは、当業者によ
り認識されるであろう。例えば、ストレプトアビジンを含むＰＬＣをコンジュゲ
ートしたリガンド及びリポソームを用いて、ビオチン−ＮＨＳエステル等を用い
て細胞／組織全体を化学的にビオチン化することができ、次いで、ＰＬＣ−リガ
ンド及びその後のリポソーム溶解を、受容体を含むリガンドの付近で特異的にス
トレプトアビジン分子を置くであろう、よって、それはストレプトアビジンで標
識されるようになり、固定化されたビオチン等を用いる分子分離の基礎を提供す
るであろう。
【００７９】 タンパク質−タンパク質相互作用 −本発明のこの態様は、遺伝子の単離の基
礎としてタンパク質／ポリペプチドとリガンドの両方に分子タグを提供すること
により、リガンドに結合する提示されたタンパク質又はポリペプチドをコードす
る遺伝子の単離方法を提供する。前記方法は、特に、リガンド自体が提示された
タンパク質／ポリペプチドである遺伝子の単離を含む。本発明のこの態様は、ポ
リペプチドのリガンド（又は他のポリペプチド）への結合に基づいており、それ
により、ポリペプチド及びリガンド上の分子タグを未結合のポリペプチド及びリ
ガンドから結合したポリペプチド−リガンドの分子分離の基礎として使用するこ
とができ、それにより、ポリペプチドはその遺伝子（又は遺伝子転写物）と会合
したままである。リガンドに結合するポリペプチドの選択に関して、特に好まし
い方法は、ポリペプチドとそのリガンドの両方に分子タグを提供することであり
、それにより、方法は、次いで、両方の分子タグを含む複合体の単離に適用され
る。例えば、リポソーム提示の技術を用いて、ｍＲＮＡをＲＮＡ結合タンパク質
（ＨＩＶ ｔａｔタンパク質等）でタグ付加してもよいが、リガンド（ポリペプ
チドの場合）は、抗タグ抗体及びニッケルを含有するアフィニティーマトリック
スでのｍＲＮＡ−リポソーム−ポリペプチド複合体のライブラリーの連続的な継
代がポリペプチドの会合したｍＲＮＡへの結合を選択するように、ポリヒスチジ
ンテールでタグ付加されてもよく、次いで、これは、結合したポリペプチドをコ
ードする遺伝子配列を提供することができる。あるいは、リポソーム提示を用い
て、例えば、ポリヒスチジンテールでポリペプチドのみをタグ付加し、ニッケル
キレート等のアフィニティーマトリックスを通過させてもよく、会合したいかな
るＲＮＡも、ＰＣＲによるｃＤＮＡコピーへの変換により単純に入手してもよい
。２以上の結合ポリペプチドの選択に関して、特に好ましい方法は、１以上のＤ
ＮＡライブラリー由来の結合ポリペプチド候補の生成のためにジ（又はポリ）シ
ストロニックｍＲＮＡを使用するリポソーム提示の技術を用いることである。ポ
リペプチドの内の一方に対するシストロンが、翻訳されたポリペプチドを翻訳後
にｍＲＮＡから解離するように構築され、他方のポリペプチドに対するシストロ
ンが、翻訳されたポリペプチドが翻訳後もｍＲＮＡと会合したままであるように
構築される場合、そのときは、２つのポリペプチドの翻訳の並置は、適用可能な
らばこの並置により会合が容易になるようなものであり、よって、結合ポリペプ
チド（単数又は複数）及びｍＲＮＡを含む複合体の分離のための分子的基礎を提
供し、後者は、次いで、結合ポリペプチド（単数又は複数）をコードする遺伝子
の同一性のために使用されうる。
【００８０】 本発明のこの態様の別の側面は、２つのポリペプチドの結合に基づいており、
その内の１つ又は両方は、対応する遺伝子と会合し、他のポリペプチド鎖と融合
（又は会合）し、並置された場合に選択可能な特性を生じ、次いで、結合ポリペ
プチド（１又は複数）に対する遺伝子（１又は複数）をコードする生きた微生物
の単離を可能にする。この態様の範囲内では、２つのポリペプチドの会合による
酵素活性の生成が特に興味深い。そのように生成された酵素活性は、様々な選択
方法に使用することができる。これらは、うまく対合したポリペプチドと、会合
した遺伝子（又はｍＲＮＡ）との複合体に付着する分子タグを生成する酵素活性
を含む。微生物でのポリペプチド提示に関して、これらは、リガンドに結合する
ＤＮＡライブラリーに由来するポリペプチドを提示する微生物の選択に導く微生
物の付近で分子を生成（又は放出）する酵素活性をも含む。この態様の範囲内で
は、２つのポリペプチドの会合による結合タンパク質活性の生成が特に興味深く
、それにより、結合タンパク質は、結合タンパク質（１又は複数）をコードする
遺伝子の同定の基礎として使用することができる選択可能な特性を間接的に生じ
させる。例えば、結合タンパク質は、抗生物質耐性タンパク質又は栄養素生成タ
ンパク質等の微生物に対して有利な選択を提供する遺伝子を活性化する転写活性
因子等のＤＮＡ結合タンパク質でありうる。
【００８１】 微生物に提示された結合ポリペプチドに対する本発明の適用に関して、ポリペ
プチドとリガンドとの会合が、結合ポリペプチドを提示する微生物の選択又は分
離の基礎を提供する新しい分子（１又は複数）を生成させうる両方の場合におい
て、本発明は、リガンド（又は第２のポリペプチド）を外部から微生物に添加す
る方法又はリガンドが微生物中で内部から合成される方法を提供する。本発明は
、ともに会合した場合に酵素活性を再構成する酵素の２つ（以上）のサブユニッ
トの組合せを通じた酵素活性の相補性に基づくことができる。次いで、酵素活性
の再構成は、酵素活性を提供する微生物の正又は負の選択のいずれかを提供する
であろう。本発明のこの態様の１例において、微生物又は細胞で発現可能な改変
体ポリペプチドをコードするＤＮＡライブラリーが提供され、それにより、結合
ポリペプチドをコードする遺伝子が酵素の酵素的に不活性な断片をコードする遺
伝子の一部に融合し、それにより、酵素のこの部分は、酵素活性を再構成するた
めに酵素の別の部分を相補することができる。適する酵素は、大腸菌β−ガラク
トシダーゼ及びシー．ペルフリンゲンス（C. perfringens) ホスホリパーゼＣを
含む。酵素の他の部分は、イン・ビトロ選択用の微生物培養培地中に提供される
か又はイン・ビボ選択用の同一の微生物内でこの部分をコードする遺伝子の発現
により提供されるかのいずれかである。大腸菌β−ガラクトシダーゼ及びシー．
ペルフリンゲンス（C. perfringens) ホスホリパーゼＣ等の酵素は、酵素の不活
性サブユニットが溶液中で自己会合して酵素活性を再構成することができるとい
う特性を有し、よって、本発明は、不活性な酵素断片をコードする遺伝子に融合
された結合ポリペプチドがそのリガンドに結合して、結合を促進（リガンドが他
の不活性サブユニットに融合する場合）又は抑制（立体障害を通じてポリペプチ
ド−リガンド結合が不活性な酵素サブユニットにより酵素活性の再構成を抑制す
る場合）のいずれかをすることができる。酵素活性の回復又は廃止は、ポリペプ
チド／酵素サブユニット遺伝子融合物を発現する微生物に有益な又は有害な効果
を有するかもしれない。これは、非毒性基質の毒性基質への変換を生じさせる等
、再構成された酵素の直接的な酵素作用によるものか又は、毒物若しくは微生物
の成長／増殖用の必須の栄養素／因子を含む外部からのリポソームの溶解を生じ
させる等、再構成された酵素の間接的な酵素作用によるものかのいずれかであろ
う。
【００８２】 本発明のこの態様の別の側面は、非タンパク質又は一定のタンパク質部分を有
するポリペプチドの結合に基づいており、それにより、ポリペプチド又は非タン
パク質又は一定のタンパク質部分上の分子タグは、未結合のポリペプチド及び非
タンパク質又は一定のタンパク質部分から非タンパク質又は一定のタンパク質部
分と相互作用するポリペプチドの単離の基礎として使用することができ、それに
よりポリペプチドは、その遺伝子（又は遺伝子転写物）といまだ会合したままで
ある。非タンパク質部分は、核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）又は化学品（合成若
しくは天然）等の主として非アミノ酸成分からなる分子として定義してもよい。
一定のタンパク質部分は、例えば、全血清免疫グロブリン標品等のその同一性が
公知であるタンパク質であろう。それにより、血清免疫グロブリンは、一定のポ
リペプチドの相互作用するであろう。ポリペプチドとその遺伝子転写物との会合
は、ポリペプチドがリポソーム／ｍＲＮＡ複合体に付着したままである発生中の
タンパク質の一部であり、ｍＲＮＡ自体が非タンパク質又は一定のタンパク質部
分をコンジュゲートした（又は連結した）ＲＮＡ結合タンパク質（ＨＩＶ ｔａ
ｔタンパク質等）オリゴヌクレオチドでタグ付加されてもよく、あるいはｍＲＮ
Ａが非タンパク質又は一定のタンパク質部分をコンジュゲートした（又は連結し
た）ハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドでタグ付加されてもよいリポソ
ーム提示の技術を用いて達成されるであろう。タンパク質と非タンパク質又は一
定のタンパク質との並置は、非タンパク質部分をｍＲＮＡ分子にハイブリダイズ
する合成オリゴヌクレオチドに付着させることにより達成することができる。あ
るいは、非タンパク質又は一定のタンパク質部分は、ポリヒスチジン等でタグ付
加されてもよいが、ポリペプチド部分は、ｍＲＮＡ−リボソーム−ポリペプチド
及び非タンパク質又は一定のタンパク質部分の複合体のライブラリーを抗タグ抗
体及びニッケルを含有するアフィニティーマトリックスを通した連続的な継代が
会合したｍＲＮＡを有する結合ポリペプチドを選択するように、前記したように
ｍＲＮＡに連結される。例えば、非タンパク質部分はＤＮＡ及び結合したポリペ
プチドＤＮＡ結合タンパク質でありうるし、別の例において、一定のタンパク質
部分は、リンホカイン及び結合したポリペプチドリンホカイン受容体又はその領
域であってもよい。
【００８３】 非タンパク質又は一定のタンパク質部分のハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チド又はｍＲＮＡ結合タンパク質への付着は、一般にオーサリバン(Osullivan)
ら(Anal. Biochem. 100 (1979), 108)に記載されたもの等の架橋ポリペプチドの
いかなる慣用の方法でも達成されうる。そのような架橋は、一定のタンパク質又
はｍＲＮＡ結合タンパク質に、特異的アミノ酸、特に遊離のシステイン残基又は
遊離のリジン残基を導入することにより容易になるであろう。あるいは、一定の
タンパク質部分の付着は、ビオチンをハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又
はｍＲＮＡ結合タンパク質と非タンパク質又は一定のタンパク質部分との両方に
取り込んだ後（ランガー(Langer)ら, PNAS 78, (1981), 6633 により記載された
ように）、アビジンを添加してオリゴヌクレオチド又はｍＲＮＡ結合タンパク質
を非タンパク質又は一定のタンパク質部分に架橋することにより達成されてもよ
い。
【００８４】 本発明のこの態様の別の側面は、一定の生化学的経路のアゴニスト及びアンタ
ゴニストのスクリーニングを提供し、それにより、前記経路の成分を含有する個
々のタンパク質を、失速されたリボソームを介してポリシストロニックｍＲＮＡ
に付着したままである全長のポリペプチドとして連続的に発現するであろう。例
えば、リボソーム提示の技術を用いて、生物学的経路を含有するタンパク質を適
当なベクターに連続的にクローニングして提示させることができるであろう。密
接な物理的近接により促進されたポリペプチド間の相互作用は、その経路での最
終のポリペプチドでの検出可能な変化を生じるであろう。例えば、ポリペプチド
の連続的な会合は、末端のリン酸化又は構造変化等の他の事象を生じさせるリン
酸化カスケードを生じるであろう。活性化及び非活性化の両状態での最終ポリペ
プチドのリン酸化又は構造の検出のための特に好ましい方法は、抗体を用いるこ
とであろう。前記経路のアンタゴニストの選択に関して、特に好ましい方法は、
生化学的経路におけるタンパク質の提示に対する連続的に並置されたポリシスト
ロニックｍＲＮＡを用いるリボソーム提示の技術を使用することである。次いで
、提示されたタンパク質を候補分子でスクリーニングし、それにより、候補分子
は、例えば、１以上のＤＮＡライブラリーに由来するリボソーム提示されたポリ
ペプチドであってもよく、経路タンパク質の活性の阻害を測定する。
【００８５】 以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるが、本発明の範疇を限定
するものと見なすべきではない。
【００８６】 実施例１ 合成タンパク質ライブラリーの新たな作成と組織による修飾 出発点は、クローンテック・ユーケー社(Clontech UK Ltd) （バサインストー
ク(Basingstoke) 、英国）から購入した「マラソン−レディー」ヒトクローンｃ
ＤＮＡから、ｃＤＮＡライブラリーを調製することであった。アドバンテージｃ
ＤＮＡキットを用いて、供給者（クローンテック社）の推奨条件にて、プライマ
ーＡＰ１[5'ccatcctaatacgactcactatagggc] とプライマーＡＰ２[5'-ttctagaatt
cagcggccgc(t)30nn]を用いてのＰＣＲによってこのライブラリーを増幅した。得
られたＰＣＲ産物を、マーチュック(Marchuck)ら（マーチュック ディー(March
uck D.) ら、1991, Nucl. Acids Res. 19:1154）の方法で調製した、ＳｍａＩで
直線化したｐＵＣ１９中に、Ｔ／Ａクローニング手法を用いてクローニングした
。一方、モレキュラークローニング、アラボラトリーマニュアル、サンブロック
ジェー、フリッツ イーエフ、マニアティス ティー編、コールドスプリング
ハーバーラボラトリープレス(Molecular Cloning, A Laboratory Manual eds. S
ambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Cold Spring Harbor Laboratory Press)
、1989、ニューヨーク、アメリカ合衆国に記載の標準的な方法を用いて組織から
直接的にヒトクローンｍＲＮＡを単離し、このものからヒトクローンｃＤＮＡラ
イブラリーを構築した。（前掲のモレキュラークローニング）ＲＮアーゼＨ法を
用いてこのｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ
ーを具備するｐＧＥＭＴ７ＧＥＭＴ７／ＳＰ６プラスミド（プロメガ社、サザン
プトン(Promega, Southampton)、英国）のＳｍａＩサイトに再びクローニングし
た。ハーネスとプルクサン(Hanes and Pluckthun) 、Proc. Natl. Acad. Sci. 9
4(1997),p4937 に記載のように、長鎖の合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲを適用
して、上流側に細菌のリボソーム結合部位、下流側にＭ１３ファージ遺伝子III
由来のスペーサー及び大腸菌ｌｐｐターミネーター由来の３’転写ターミネータ
ーを提供した。
【００８７】 ＲｉｂｏＭＡＸTMキット（プロメガ社、サザンプトン、英国）を用いて、メー
カーの説明書に従って、ｐＴ７プラスミドのインビトロ転写を実施した。得られ
たｍＲＮＡを、メーカーの手順に従って精製した。35Ｓメチオニン含有物が備わ
った大腸菌Ｓ３０エキストラクトシステム(Extract System)（プロメガ社、サザ
ンプトン、英国）を用いて、メーカーの説明書に従って、ｐＴ７プラスミドのイ
ンビトロ翻訳を実施した。（前掲の）ハーネスとプルクサンによって記載された
ように、ＥＤＴＡ処理を行ってタンパク質からリボソームを解離させ、（100,00
0gで３０分間の）遠心分離によってリボソームを除去した。
【００８８】 冷ＲＩＰＡ緩衝液（ＲＩＰＡ緩衝液＝５０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ７．４、
１％(v/v) のＮＰ−４０、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍ
ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのＮａ3 ＶＯ4 、
１ｍＭのＮａＦ及びそれぞれ１μｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチン及びペ
プスタチン）中で組織を破壊することによって、正常の結腸サンプルと結腸ガン
のサンプルから粗タンパク質抽出物を調製した。いくつかの実験では、ホスファ
ターゼ活性を示した抽出成分もあり、本ケースでは、１ｍＭのＮａ3 ＶＯ4 を含
まないＲＩＰＡ緩衝液を用いて溶解物を得た。組織サンプルを氷上で溶かし、滅
菌処理済みの使い捨て組織用粉砕機（「ペレットペストル(pellet pestle) 」ア
ナケム社(Anachem Ltd) 、ルートン、英国）を用いて破壊した。ホモゲナイズは
、１容量の組織に対して２容量の氷冷ＲＩＰＡ緩衝液を用いて実施した。この溶
解物を氷上で１５分間ゆっくりとかきまぜながらインキュベートし、次いで、４
℃、13,000×ｇで１０分間の遠心分離によって不溶性の成分の清澄化を行った。
上清を取り除き、供給者（ピアース社、チェスター、英国、カタログ番号２３２
２５）が提供した手順に従って、ビシンコニン酸法(bicinhoninic acid method)
を用いてタンパク質濃度を測定した。この溶解物を等量ずつ複数に分割し、ドラ
イアイス上で瞬間的に凍結させ、液体チッ素中で保存した。
【００８９】 １ｍｇ／ｍｌのバナジル(vanadyl) リボヌクレオシド複合体と１０単位のＲＮ
アシンとの存在下で、溶かした溶解物を３７℃で３０分間インキュベートするこ
とによって、正常の結腸溶解物と結腸ガン溶解物をインビトロ翻訳化タンパク質
と反応させた。次いで、このタンパク質混合物をカッシュ(Cash)ら(Electrophor
esis 18 (1997)、p2580)のプロトコールに従って可溶化した。溶解性タンパク質
を次いで二次元ＰＡＧＥ（カッシュら、前掲）で分析し、オートラジオグラフィ
ーでタンパク質を検出した（パットン(Patton)ら、BioTechniques 8 (1990)、p5
18）。画像解析システムに結合したビデオカメラを用いてゲルの画像を取り込み
、次いで、さらなる分析のためにフォレティックス−２Ｄ(Phoretix-2D) に転送
した。メーカーの説明書に従って、フォレティックス−２Ｄを用いて分析を行っ
た。
【００９０】 正常のものと結腸ガンの抽出物とを比較した場合、インビトロ翻訳化タンパク
質混合物から検出された全２２６２のタンパク質スポットのうちの１２スポット
が異なる移動度を示していた。
【００９１】 実施例２ 合成タンパク質のリン酸化 ポリヒスチジンタグを含みそのタンパク質のアミノ末端が融合されている精製
組み換えラットＥＲＫ−２を、ストラタジーン社(Stratagene)、ラジョラ(La Jo
lla)、アメリカ合衆国（カタログ番号２０６１２）から購入した。この産物は、
タンパク質の非活性体であり、リン酸化部位を含まない。０．５μｇの非活性化
ＥＲＫ−２を、（２ｍｇ／ｍｌの全タンパク質を含む）５μｌのＡ４３１細胞溶
解物と（アップステートバイオテクノロジーズ社(Upstate Biotechnologies) 、
レークプラシッド、ニューヨーク州、アメリカ合衆国、カタログ番号１２−１１
０）又は組織培養中に生育した細胞からここで代替的に生産したものと反応させ
た。細胞溶解物又は組織用怪物と標的タンパク質とを反応させる手法は、コンデ
ィショニングリアクション(Conditioning Reaction) として言及している。
【００９２】 ５００μｌの氷冷ＲＩＰＡ緩衝液中に、約５×１０6 個のサブコンフルエント
な(sub-confluent) 細胞を懸濁することによって細胞溶解物を得た。氷冷ＰＢＳ
を用いて、培地の洗浄を前もって行っておいた細胞を、氷上のＲＩＰＡ緩衝液中
で１５分間緩やかに振とうしてインキュベートした。４℃、13,000×ｇで１０分
間遠心分離することにより、この溶解物の不溶物の清澄化を行った。上清を除去
し、供給者（ピアース社、チェスター、英国、カタログ番号２３２２５）が提供
した手順に従って、ビシンコニン酸法を用いてタンパク質濃度を測定した。この
溶解物を等量ずつ複数に分割し、ドライアイス上で瞬間的に凍結させ、コンディ
ションリアクションで用いる前に液体チッ素中で保存した。組織サンプル及び他
の細胞型由来の溶解物を同様に処理した。
【００９３】 ３７℃で１５分間にてコンディションリアクションを実施し、次いで氷上に置
いた。磁力による分類（試験管１）又はマイクロタイタープレートウェルへの結
合（試験管２）のいずれかを用い、両者の場合のいずれも捕捉試薬として抗ヒス
チジン抗体を用いて、リン酸化ＥＲＫ−２を検出するために反応物を２本の試験
管に（容量で）等量に分割した。
【００９４】 試験管１では、供給者が推奨する被覆条件を用いて抗ヒスチジン抗体（シグマ
社、プール、英国、カタログ番号１０２９）で前もって被覆したマグネチックビ
ーズ（ダイナル社(Dynal) 、ウィラール(Wirral)、英国、カタログ番号１１０．
１１）を用いてＥＲＫ−２を捕らえた。４℃で１時間の間を通してビーズが懸濁
し続けるようなゆるやかな混合を一定的に行って捕捉反応を実施した。捕捉した
後、磁性粒子濃縮器を用いてこのビーズを集め、ＰＢＳで十分に洗浄した。ビー
ズを最終的に４０μｌの容量で再懸濁し、１０μｌずつの等量をマイクロタイタ
ープレートウェルに入れ、そして、個々のものを、抗リン酸化ＥＲＫ抗体（アッ
プステートバイオテクノロジーズ社、カタログ番号０５−４８１）、抗ホスホチ
ロシン−ＨＲＰ複合モノクローナルカクテル（ザイメド社(Zymed) 、ケンブリッ
ジ、英国、番号１３６６２０）、抗ホスホセリン／ホスホトレオニン／ホスホチ
ロシンポリクローナル調製物（ザイメド社、カタログ番号９０−０２００）又は
ネガティブコントールとしての、ヒト免疫グロブリン軽鎖特異的抗ＨＲＰ複合物
（バインディングサイト社(The Binding Site)、バーミンガム、英国、カタログ
番号ＡＰＯ０１５）のいずれかの希釈物と反応させた。それぞれの二次試薬／発
色基質で検出する前に、抗体を４℃で１時間インキュベートした。プレートを４
５０ｎｍで読んだ。
【００９５】 前もって抗ヒスチジン抗体（シグマ社、プール、英国、カタログ番号Ｈ１０２
９）で一番被覆し、室温下ＰＢＳ／５％(w/v) ＢＳＡ溶液で４０分間インキュベ
ートして予備ブロックしておいたマイクロタイタープレートウェルを用いて、試
験管２のＥＲＫ−２を捕捉した。ＰＢＳを用いてコンディションリアクションを
希釈して総容量１００μｌとし、マイクロタイタープレートに添加した。捕捉反
応は室温下、１時間で行った。上記のネガティブコントロール試薬を含む抗体の
パネルを用いて、直接ＥＬＩＳＡ形式でリン酸化ＥＲＫ−２を検出した。
【００９６】 上記の両検出法を利用して、次の、Ａ４３１細胞由来の溶解物とのインキュベ
ーションによってリン酸化ＥＲＫ−２の存在を明確に示した。
【００９７】 実施例３ ストレプトアビジン被覆化プレート上でのアレイング(arraying)のための、イン
ビトロ翻訳化ｃＤＮＡクローンの調製方法。 ヒト胎児全脳ｃＤＮＡライブラリーをストラタジーンクローニングシステム社
(Stratagene Cloning System) 、（ラジョラ、アメリカ合衆国）から得た。 供給されたそのライブラリーを、ラムダベクターＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲに、平均
挿入サイズが１．３ｋｂｐで一方向クローニングした。このライブラリーは２×
１０6 ｐｆｕを含んでいると算出され、約２．４×１０10ｐｆｕ／ｍｌの力価を
与えた。原版のラムダＵｎｉ−ＺＡＰ ＸＲライブラリーを、次の単一ラウンド
の複製に付した。この１×の増幅物についての（以下の）マスエクシジョン反応
を実行することにより、生育できる大腸菌の個々のクローンであって、次に続く
ラムダファージの感染の細胞溶解性プラークとしてではないクローンの濃度にま
で実施されるプレーティング、産物の複製及び原版のストックの貯蔵等の操作を
可能とする（ジェルセス、ビー(Jerseth, B.) ら(1992)、Strategies 5:81-83）
。標準的な手法（モレキュラークローニング、アラボラトリーマニュアル、サン
ブロック ジェー、フリッツ イーエフ、マニアティス ティー編、コールドス
プリングハーバーラボラトリープレス、1989、ニューヨーク、アメリカ合衆国）
にて、残りのライブラリーをさらにもう一回増幅し、原版のストックと同じよう
に、複数のグリセリンストックを−８０℃で保存した。
【００９８】 マスエクシジョン反応のためと、供給者（ストラタジーン社、ラジョラ、アメ
リカ合衆国）によるプロトコールに従った、細菌コロニーとしてプレーティング
を行うために、このライブラリーを調製した。概略を言えば、ライブラリーから
供給された細菌株（ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ及びＳＯＬＲ’）を選択培地（それぞれ
ＬＢテトラサイクリン及びＬＢカナマイシン）上に広げ、そして０．２％(w/v)
のマルトースと１０ｍＭのＭｇＳＯ4 を追加した５０ｍｌのＬＢブロス（１０ｇ
／リットルのＮａＣｌ、１０ｇ／リットルのトリプトン、５ｇ／リットルのイー
ストエキストラクト、ｐＨ７．０）中に３０℃で一晩培養するために、単一のコ
ロニーを選び出した。遠心分離により細胞を集め、１０ｍＭのＭｇＳＯ4 中に、
８×１０8 細胞／ｍｌの濃度（ＯＤ600 ＝１．０）で再懸濁した。ＸＬ−１ Ｂ
ｌｕｅ細胞には、ラムダファージ：細胞が１：１０の感染多重度にて、ラムダＵ
ｎｉ−ＺＡＰ ＸＲライブラリーの一部が結合されていた。ヘルパーファージ株
ＥｘＡｓｓｉｓｔを基礎としたＭ１３（ストラタジーン社、ラジョラ、アメリカ
合衆国）を、ヘルパーファージ：細胞が１０：１の割合で添加し、この混合物を
３７℃で１５分間インキュベートした。２０ｍｌのＬＢブロスを添加し、この混
合物を３７℃でさらに３時間、振とうしながらインキュベートした。この混合物
を７０℃で２０分間加熱し、遠心分離により細胞部分を集めた。削り取られたフ
ァージミドを含有する上清を集め、２００μｌのＳＯＬＲ’細胞に対して１μｌ
添加した。この混合物をＬＢアンピシリンプレート上に広げ、３７℃で一晩イン
キュベートした。典型的な例として、各プレートには多くの１０００のコロニー
が生じ、削り取られたファージミドのさらなる希釈物には、コロニーを選び出す
ための好ましいプレーティング密度を得ることを必要とした。
【００９９】 格子形成の実行を可能とするためには、ライブラリーの発現が維持できる程度
にまで個々のｃＤＮＡクローンの総数を減らすことである。この標準化は、次の
ソアレス(Soares)ら（ソアレス，エム．ビー．ら、1994、Proc. Natl. Acad. Sc
i USA vol 91:922-923）の手法により達成される。この手法には、ファージミド
ライブラリーのヘルパーファージ感染による単鎖分子の生産が必要であった。こ
の単鎖環は、制御されたプライマー伸張処理に付され、次いで、極めて多様な分
子が再会合する（低Ｃ0 ｔ）という条件下で変性と再アニーリングが行われ、そ
してヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーによって混合物から除去で
きた。再会合しない環は流出液から回収し、コンピテント細菌に直接形質転換し
た。
【０１００】 ヘルパーファージＶＣＭ１３と、供給者（ストラタジーン社）によるプロトコ
ールを用いて、ファージミドライブラリー上で単鎖の回収を行った。回収された
単鎖ＤＮＡをソアレスら（前掲のソアレス）の方法にしたがって精製し、特定の
工程に組み込むことにより混入した二本鎖ＤＮＡを減らした。制御されたプライ
マー伸張は、ソアレスらの条件を用いて、5'ggaaacagctatgaccatg のプライマー
を用いて単鎖環状ＤＮＡの精製を行っている。ＤＮＡポリメラーゼはベーリンガ
ー社から得、ヌクレオチドトリホスファターゼはライフテクノロジーズ社(Life
Technologies) （ペーズリー、英国）から得た。トレーサとしての32ＰｄＣＴＰ
は、アマシャムインターナショナル社(Amersham International)（アマシャム(A
mersham)、英国）から得た。ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーは
、ソアレスらに記載の６０℃にて実施した。標準化された単鎖環の回収の後、精
製ＤＮＡをコンピテントＸＬ１−ｂｌｕｅ大腸菌細胞に直接的に形質転換し、既
に述べたようにして、ＬＢ−アンピシリンプレート上に広げた。
【０１０１】 標準化されたライブラリーからのＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞の個々のクローンを、
さらなる分析と複製の生産のために選び出した。概略は、１００μｌＬＢアンピ
シリン培地を含む９６穴プレートへ、コロニーを手動で選び出し、３７℃で３時
間培養した。各プレートの一つの複製を実施するために、BioRobot9600 (キアゲ
ンユーケーリミテッド(Qiagen UL Ltd) 、クローレイ(Crawley) 、英国）ラボラ
トリーワークステーションを使用した。１０％(v/v) グリセリンを含む培地に培
養物の５０μｌをピペットで入れるようにこのロボットをプログラムし、このプ
レートを密封して原版と同じく−８０℃で貯蔵した。残りの５０μｌの培養物を
、１．８ｍｌのＬＢ−アンピシリン培地を含む、２ｍｌ容の正方形ウェルを具備
する９６穴平底ブロックに植菌した。各ブロックの頂部に微孔のあるシート上テ
ープを貼り、３７℃にて一晩、そのブロックを軌道を描くように振とうしてイン
キュベートした。インキュベートの後、BioRobot9600 (キアゲンユーケーリミテ
ッド、クローレイ、英国）上で標準プログラムと、供給者 (キアゲンユーケーリ
ミテッド、クローレイ、英国）が提供したキューアイエーウルトラリージェント
システム(QIAwell Ultra reagent system)とを用いて、９６ウェルのそれぞれか
らファージミドＤＮＡを調製した。
【０１０２】 Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ及びプロメガユーケーリミテッド（サザンプトン、英
国）が提供するウサギ網状赤血球溶解物システムを用いて、リンクしたインビト
ロ転写翻訳（ＩＶＴＴ）のための精製ＤＮＡの一部を鋳型として直接使用した。
残りのＤＮＡは密封して−２０℃で保存した。ＩＶＴＴ反応混合物には、ストレ
プトアビジンで被覆された固相上でインビトロ翻訳化タンパク質を捕捉できるよ
うに、２％(v/v) のｔＲＮＡ−ビオチニル−リジン（プロメガユーケーリミテッ
ド、サザンプトン、英国）を追加した。ＩＶＴＴ反応を、総容量２５μｌの９６
ウェルアレイにて、３０℃で６０分間実施した。インキュベートの後、予めReac
ti-Bind TMストレプトアビジンで被覆した予備ブロック済のプレート（ピアース
社、チェスター、英国）に添加していたｐＨ８．０、１００μｌのＴＳＢ（５０
ｍＭのトリス、１３８ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍｌのＫＣｌ）に、それぞれ５μ
ｌの反応物を加えた。残りのＩＶＴＴ反応プレートを密閉し、−２０℃で保存し
た。、スミゾノ及びタザキ(Nishiguchi, M., Yoshida, K., Sumizono, T. and T
azaki, T.)(1997)。ロビニア シュードアカシア由来樹皮レクチンの糖結合特性
についての、部位特異的突然変異誘発法による研究。FEBS Letters, 403, 294-2
98。Reacti-Bind TMストレプトアビジンプレートを室温で６０分間、緩やかに振
とうさせながらインキュベートし、ビオチン化ＩＶＴＴ産物のプレート表面への
結合を促進した。組織タンパク質結合アッセイに使用する前に、このプレートを
３×２００μｌの洗浄緩衝液（ＴＢＳ、０．１％(w/v) のＢＳＡ、０．０５％(v
/v) のツィーン２０）で洗浄した。
【０１０３】 実施例４ インビトロ翻訳タンパク質アレイの組織抽出物の修飾の実現方法と、アレイ化タ
ンパク質のリン酸化の検出 ニューロリソース社(NeuroResouce)（ロンドン、英国）からヒト脳組織サンプ
ルを得た。正常の脳とアルツハイマー病の脳の適合したサンプルが提供された。
一般的に、各サンプルの１〜１０ｇが提供され、全ての症例のサンプルについて
、解剖学的に準じた位置が知られており、全ての臨床的な詳細事項について相互
に参照付けられていた。全てのサンプルはサンプリングの時点で瞬間的に凍結さ
れ、ドライアイスの上で輸送され、処理前まで液体チッ素中で保存されていた。
カテゴリー２の封じ込めレベル下で処理を実施した。
【０１０４】 組織を氷冷ＲＩＰＡ緩衝液中で破壊することにより、脳組織リン酸化成分抽出
物を得た。いくつかの実験では、ホスファターゼ活性のための抽出成分は次のよ
うにしても得た：この場合、１ｍＭのＮａ3 ＶＯ4 を抜いたＲＩＰＡ緩衝液を用
いて溶解物を得た。組織サンプルは氷上で溶解させ、滅菌処理済みの使い捨て組
織用粉砕機（「ペレットペストル」アナケム社、ルートン、英国）を用いて破壊
した。ホモゲナイズは、１容量の組織に対して２容量の氷冷ＲＩＰＡ緩衝液を用
いて実施した。この溶解物を氷上で１５分間ゆっくりと振とうしながらインキュ
ベートし、次いで、４℃、13,000×ｇで１０分間の遠心分離によって不溶性の成
分の清澄化を行った。供給者（ピアース社、チェスター、英国、カタログ番号２
３２２５）が提供した手順に従って、ビシンコニン酸法を用いてタンパク質濃度
を測定した。この溶解物を等量ずつ複数に分割し、ドライアイス上で瞬間的に凍
結させ、液体チッ素中で保存した。
【０１０５】 溶かした溶解物と、３７℃で３０分間洗浄したアレイとのインキュベートによ
り、９６穴に区切った中で、脳組織溶解物をＩＶＴＴタンパク質アレイと反応さ
せた。一般的に、１０μｌの溶解物をタンパク質アレイの各ウェルに添加した。
インキュベートの後、１ウェル当たり２００μｌの洗浄緩衝液を用いてそのプレ
ートを３回洗浄し、いくつかの、希釈された抗リン酸化タンパク質抗体調製物の
すべてとインキュベートした。抗ホスホチロシン−ＨＲＰ複合モノクローナルカ
クテル（ザイメド社、ケンブリッジ、英国、番号１３６６２０）を用いてリン酸
化タンパク質を検出した。抗ホスホセリン／抗ホスホトレオニン／ホスホチロシ
ンのポリクローナル調製物（ザイメド社、ケンブリッジ、英国、番号９０−０２
０００）を用いてホスホセリン／ホスホトレオニン修飾を検出した。全てのケー
スにおいて、５％ＢＳＡを含むＴＢＳで希釈した抗体を用いて、少なくとも３７
℃で１時間、あるケースでは４℃で一晩の間抗体のインキュベートを実施した。
次の標準プロトコール（アンティボディーズ アラボラトリー マニュアル、
ハーロウ，イー．及びレイン，ディー編(Antibodies A Laboratory Manual eds.
Harlow, E. and Lane, D.) 、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス
、1988、ニューヨーク、アメリカ合衆国）に従って、それぞれの二次試薬／発色
基質で検出する前に、前もってプレートを洗っておいた。４９２ｎｍでプレート
を読んだ。
【０１０６】 実施例５
インビトロ翻訳化タンパク質アレイ上での、ラベルされた組織を用いてのタンパ
ク質−タンパク質結合の検出方法 シグマ社（プール、英国）から供給されるFluroTagTMFITCコンジュゲーション
システムを用いて、脳組織溶解物のタンパク質をフルオレセインで標識化した。
典型的な例として、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の０．１Ｍ
の炭酸−重炭酸緩衝液の溶液の１ｍｇ／ｍｌ希釈液の２５０μｌと、５ｍｇの脳
タンパク質を反応させた。Ｇ−２５セファデックスカラムクロマトグラフィーを
用いて組み込まれていないＦＩＴＣを精製する前に、標識化反応を室温で２時間
的続けた。カラムや操作はFluroTagTMキット（シグマ社、プール、英国）中にあ
った通りとした。標識化された脳タンパク質を含むカラム溶出物を、遮光下４℃
で保存した。
【０１０７】 標識化組織溶解物を、既述のように、ＩＶＴＴタンパク質アレイと反応させた
。ＩＶＴＴタンパク質アレイの一部に捕捉された標識化脳タンパク質を検出する
ために、プレートを前もって洗っておき、そして抗フルオレセイン抗体（シグマ
社番号Ｆ−５６３６、シグマ社、プール、英国）と共にインキュベートした。５
％のＢＳＡを含むＴＢＳにて１／２５００に抗体を希釈し、室温で３０〜６０分
間インキュベートした。抗マウスＨＲＰ複合体を用いて抗体を検出し、次いで、
標準的な手法（前掲のアンティボディーズ アラボラトリー マニュアル）に従
って発色基質のｏ−フェニレンジアミン（シグマ社、プール、英国）と反応させ
た。４９２ｎｍでプレートを読んだ。
【０１０８】 実施例６ リボソーム提示ライブラリーによって同定されるタンパク質−タンパク質結合パ
ートナー この実施例では、インビトロタンパク質アレイは結合パートナーのためのリボ
ソーム提示ライブラリーを検索するために用いられ、ライブラリーに存在する結
合パートナーのための遺伝子は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
によって同定される。本実施例でのこの目的のために、リボソーム提示ライブラ
リーは実施例１に記載されているように必須であり、実際のところ、スクリーニ
ングのためにＩＶＴＴタンパク質アレイを使用する時点では、リボソーム提示ラ
イブラリーは、起源が同じｍＲＮＡ分子への連鎖によって、それぞれが個々に発
生期のタンパク質につながるリボソームの大集団（１０9 〜１０12）からなって
いる。
【０１０９】 氷冷希釈緩衝液（５０ｍＭのトリス酢酸、ｐＨ７．５、１５０ｍＭの塩化ナト
リウム、５０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のツィーン２０、２００単位／
ｍｌのＲＮアシン（プロメガユーケーリミテッド、サザンプトン、英国））５中
にライブラリーを１で希釈した。希釈ライブラリーの５０μｌを、ＩＶＴＴタン
パク質アレイの各ウェルに添加し、４℃でゆるやかに振とうさせながら１時間イ
ンキュベートした。インキュベートの後、アレイのウェルを１００μｌの氷冷希
釈緩衝液で５回洗浄した。ｍＲＮＡ／リボソーム／タンパク質複合体に結合する
あらゆるものからのｍＲＮＡを、５０ｍＭのトリス酢酸、ｐＨ７．５、１５０ｍ
Ｍの塩化ナトリウム、２０ｍＭのＥＤＴＡの２０μｌを加えて溶出し、氷上で１
０分間緩やかに振とうさせながらインキュベートした。溶出されたｍＲＮＡを第
二の９６穴プレートに集め、グリコーゲン担体（ベーリンガー社、ルイス、英国
）の２０ｇの存在下でエタノールを用いて−２０℃で一晩かけて沈殿させること
によって濃縮した（前掲のモレキュラークローニング、アラボラトリーマニュア
ル）。得られたｍＲＮＡをＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）による逆転写の鋳型と
して使用し、プライマーＲＤ３[5'(T)18nn] の１ｎＭの存在下でｍＲＮＡを７０
℃、１０分間で熱変性させた。２００単位のＭ−ＭＬＶ−ＲＴと反応緩衝液（ラ
イフテクノロジーズ社、ペーズリー、英国）の添加の前に、氷上でこの混合物を
冷却した。この混合物を３７℃で６０分間インキュベートし、次いで、７０℃で
１５分間に移してＲＴを不活性化した。これに続くＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド
を、プライマーＴ７５Ｌ[5'cggtttccctctagaaata] とＲＤ３を用いて、ＰＣＲの
鋳型として用い、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間のサ
イクルを４０回行った。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ExpandTM、ハイフィデリテ
ィ(High Fidelity) ）、反応緩衝液及びヌクレオチド三リン酸は、ベーリンガー
社（べーリンガー社、ルイス、英国）から得た。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電
気泳動によって解析した（前掲のモレキュラークローニング、アラボラトリーマ
ニュアル）。ＰＣＲ産物の存在により、ＩＶＴＴタンパク質アレイにおける推定
される正の結合パートナーが同定された。タンパク質アレイが翻訳され、ファー
ジミドＤＮＡが配列解析のために同定された。ポリソーム提示ライブラリーから
のＰＣＲ産物の配列解析は、プライマーＴ７５Ｌを用いて直接なされた。供給者
（アマシャムインターナショナル社、アマシャム、英国）からのプロトコールに
従ったダイターミネーター現象を用いて配列解析を行った。自動化された配列解
析システム（アプライドバイオシステムズ社(Applied Biosystems)、ウォリント
ン、英国）を用いて反応物の分析を行った。
【０１１０】 実施例７ 表面をストレプトアビジンで被覆したガラス上でのインビトロ翻訳化タンパク質
ライブラリーのマイクロアレイ 表面をストレプトアビジンで被覆したガラス上に、ロボットに個々のＩＶＴＴ
タンパク質で格子を作らせることによって、ＩＶＴＴタンパク質アレイの縮小型
を作成した。一方の表面にストレプトアビジンが共有結合的に付着したガラス「
チップ」は、ラディアス社(Radius Inc)（メドフィールド(Medfield)、マサチュ
ーセッツ州、アメリカ合衆国）から購入した。ガラスチップは５５ｍｍ×２５ｍ
ｍであった。グリッディングロボット(gridding robot)（ラディアス社、メドフ
ィールド、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）を使って、９６ＩＶＴＴ反応
のそれぞれの０．５μｌを、８×１２の低密度アレイにてチップの乾燥面に添加
した。さらなる実験では、グラスチップ１枚あたり１９２の個々のタンパク質で
ある倍密度アレイが作られた。以下に続く実験では、多量のスクリーニング処理
量に適した超高密度のアレイを組み立てた。格子を作らせた後、チップの表面を
リン酸緩衝化塩水溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、３％(w/v) のＢＳＡと０．０２％の
アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で４℃にてスライドガラスを保存した。
【０１１１】 ＩＶＴＴタンパク質チップアレイを組織溶解物で処理し、脳組織溶解物のイン
キュベートの前に、実施例２で得られた抗リン酸化タンパク質抗体で広範囲に綿
密に調べた。タンパク質チップアレイをトリス緩衝化塩水溶液（ＴＢＳ）で浸漬
法にて広範囲に洗浄した。１５μｌの脳組織溶解物を直接タンパク質アレイを包
む領域上の表面に添加する前に、残りの洗浄溶液をスライドガラスから振り落と
した。アレイの領域全体に溶解物を広げるのを助けたり、次に続くインキュベー
トの間に毛細管効果の停止による明らかな溶液の不足を抑制するために組織溶解
物溶液上にカバーガラスを置いた。加湿容器中にガラスチップを置き、３７℃で
３０分間のインキュベートを行った。インキュベートの後、カバーガラスを取り
除き、スライドガラスを洗浄緩衝液を用いて浸漬法にて洗浄した。実施例２のよ
うに希釈した抗リン酸化タンパク質抗体の一つかそれを組み合わせたもので、ガ
ラスチップをインキュベートした。タンパク質アレイに抗体溶液を少量（１０〜
２０μｌ）添加し、既述のようにカバーガラスの下の同じ場所で保持した。スラ
イドガラス上で得られた不溶性の沈殿の発色基質を使用して、結合した抗体の検
出を行った。典型的な例としては、基質ＤＡＢ（ジアミノベンジジン テトラヒ
ロクロライド）（シグマ社、プール、英国）を用いた。低拡大率下での目視試験
により低密度アレイでの陽性シグナルを同定した。いくつかの実験のために、強
化化学ルミネセンス基質（ピアースアンドワリナー社(Pierce and Warriner Ltd
) 、チェスター、英国）を、一次又は二次抗体を結合させたペルオキシダーゼと
組み合わせて用いた。モレキュラーイメージャー(Molecular Imager)ＦＸ（バイ
オラッドラボラトリーズ社(BioRad Laboratories Ltd) 、ハートフォードシア(H
erts) 、英国）ホスホルイメージャーシステム(phosphor imager system)を用い
て陽性シグナルを検出した。
【０１１２】 ＦＩＴＣ標識化脳タンパク質を使用し、実施例５であまねく記載したように、
ＩＶＴＴタンパク質ガラスチップアレイ上でタンパク質−タンパク質結合アッセ
イを行った。１０〜２０μｌのＦＩＴＣ標識化脳タンパク質調製物を、洗浄済み
のＩＶＴＴタンパク質アレイの表面に直接添加した。標識化組織溶解物溶液の上
にカバーガラスを置き、そして、３７℃で３０分間、加湿容器中で、この完成し
たスライドガラスをインキュベートした。
【０１１３】 いくつかの実験においては、ＦＩＴＣ標識化タンパク質の結合したものを、蛍
光顕微鏡で直接検出した。顕微鏡観察のために、一滴の抗消失マウンタント(ant
ifade mountant) （ベクターラボズ(Vector Labs) 、ピーターバラ、英国）と油
浸蛍光顕微鏡観察のための常用のカバーガラスとでタンパク質アレイを覆った。
顕微鏡は、蛍光顕微鏡観察のためのＦＩＴＣ互換性フィルターセットを備えたニ
コン１０５型であった。蛍光照明下での顕微鏡のステージからのＸ−Ｙ軸の３桁
の示数を参照して、陽性シグナルを与えるタンパク質スポットの位置を解読した
。ロボットによる格子形成の前に各ガラス表面に描いたインデックススポットの
試験の後で、これらの示数はタンパク質アレイの座標と関連性を示す。タンパク
質アレイに対応するその位置についてのＸ−Ｙ示数を与える通常の照明下で、こ
のインデックススポットを同定した。
【０１１４】 結合した標識化タンパク質の間接検出を用いていくつかの実験を行った。この
ために、抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体を用い、次いで抗マウスペルオキシダー
ゼ複合体とレポーター基質としてのＤＡＢを使用しての比色分析検出を行った。
この例においては、試薬はシグマ社（プール、英国）から得、希釈抗体を少量（
１０〜２０μｌ）用いて、直接ガラス表面に添加し、既述のようにカバーグラス
下で保持してインキュベートした。通常の照明下、低拡大率にてアレイの目視に
よる試験により、陽性シグナルを同定した。また、さらなる実験でも、強化化学
ルミネセンス基質（ピアースアンドワリナー社、チェスター、英国）と既述のホ
スホルイメージャーシステムを使用しての画像化を用いた。
【０１１５】 実施例８ 組織抽出物との反応のための、固相アレイ上に固定化された単鎖抗体ライブラリ
ーの生産方法。 実施例４で調製された正常ヒト脳抽出物を用いて、２匹のBalbC マウスを免疫
した。投与の間としては４週間の間隔を空けて、腹膜内への２回の投与を行った
。２回目の接種後から３〜４日目にマウスを殺し、切開して脾臓を取り出した。
２５ｃｍ2 の組織培養フラスコを、炭酸／重炭酸緩衝液、ｐＨ９．０の１ｍｌあ
たり２５μｇの脳抽出物タンパク質で覆った。１時間で３７℃のインキュベート
の後、抗原調製物を取り除き、滅菌済みブロッキング緩衝液（２％脱脂粉乳を含
むＰＢＳ）を加えて１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、組織
培養培地中の脾臓細胞懸濁液の２５ｍｌをそのフラスコに添加し、５％ＣＯ2 雰
囲気中で３７℃で一晩インキュベートした。非付着性脾臓細胞を含む培地を除去
した。次いで、QuickPrep TMｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア社、セントオー
ルバンズ、英国）の抽出緩衝液の１．５ｍｌをフラスコに添加して表面を攪拌す
ることによって、付着した選択細胞からのＲＮＡの調製を開始した。次いで、３
ｍｌの溶出緩衝液を添加して混合した。次いで、このフラスコの内容物を１５ｍ
ｌの遠心分離に移して、メーカーの説明書に従ってQuickPrep TMｍＲＮＡ精製を
続けた。
【０１１６】 ファルマシアリコンビナントファージアンチボディーシステム（ファルマシア
社、ミルトンキーンズ、英国）を用いて、抗ヒト脳マウス単鎖Ｆｖｓ（ＳｃＦｖ
）のライブラリーを作成した。Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素とランダムの６塩基プラ
イマーを用いて、ｍＲＮＡから単鎖ｃＤＮＡを新たに作成した。次いで、抗体の
可変ドメインに隣接する保存配列に相補的な特定の重鎖と軽鎖プライマーを用い
て、抗体の重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を増幅した。重鎖ＤＮＡと軽鎖ＤＮＡのそれ
ぞれに対応して新たに作成された３４０塩基対生産物及び３２５塩基対生産物を
、次のアガロースゲル電気泳動で別々に精製した。次いで、ＤＮＡリンカー−プ
ライマー混合物を用いて、これらを一つのＳｃＦｖ構築物となるように組み立て
て、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）3 ペプチドがＶＬ領域に結合したＶＨ領域を得た。それ
ぞれ５’末端と３’末端の位置にＳｆｉＩサイトとＮｏｔＩサイトが挿入される
ように設計されたプライマーを用いて、組み立てられたＳｃＦｖを増幅し、８０
０塩基対の生成物を得た。この断片を精製し、ＳｆｉＩとＮｏｔＩとで連続的に
消化して再精製した。
【０１１７】 インビトロ転写され翻訳されたＳｃＦｖライブラリーの生産のために、ベクタ
ーpBluescript SK+ の多重クローニングサイト領域中のＨｉｎｄIII サイトとＥ
ｃｏＲＩサイトの間に、リンカーを挿入するという修飾を施した。 リンカー配列：
【０１１８】
【外１】
【０１１９】 Ｔ７プロモーターからの転写が正しい方向となるように挿入されるように、こ
のベクターのＳｆｉＩサイトとＮｏｔＩサイトの間に増幅されたＳｃＦｖをクロ
ーニングした。一方、ヒトネイティブファージ抗体ライブラリー（ニッシン(Nis
sin)、ＭＲＣ）を使用した。ファージミドＤＮＡを調製し、ＳｆｉＩとＮｏｔＩ
とで連続的に切断した。ＳｃＦｖ断片を精製し、上記の修飾されたpBluescript
SK+ ベクター中にクローニングした。
【０１２０】 固相アレイとして使用するために、個々のpBluescript クローンを取り出し、
実施例３のマルチウェルディッシュ中で培養した。ＤＮＡの調製、ＩＶＴＴ及び
ビオチン化タンパク質のアレイは実施例３に記載の通りとした。
【０１２１】 ファージ抗体ライブラリーとして使用するために、ファルマシア社のプロトコ
ールに従った。それぞれ５’末端と３’末端の位置にＳｆｉＩサイトとＮｏｔＩ
サイトが挿入されるように設計されたプライマーで、組み立てられたＳｃＦｖを
増幅し、８００塩基対の産物を得た。この断片を精製し、ＳｆｉＩとＮｏｔＩと
で連続的に消化し、再精製して、ＳｆｉＩとＮｏｔＩとで切断したpCANTAB 5 フ
ァージミドベクター中に結合した。pCANTAB 5 はファージ遺伝子３タンパク質（
ｇ３ｐ）をコードする遺伝子を含み、そしてｇ３ｐ融合タンパク質として発現さ
れるように、ｇ３シグナル配列に隣接したところにＳｃＦｖを挿入する。pCanta
b 5/ScFvファージミドを用いて、大腸菌ＴＧ１の内容物の形質転換を行い、次に
、M13KO7ヘルパーファージを用いて連続的に感染させた。得られた組み換えファ
ージはＳｃＦｖ遺伝子をコードする遺伝子を含んでおり、末端の位置の融合タン
パク質としての組み換え抗体の一以上のコピーを提示した。
【０１２２】 次いで、ヒト脳抗原に結合するファージに提示されるＳｃＦｖをパニング(pan
ning) により選択又は濃くした。概略は、９６穴マイクロタイタープレートのウ
ェル上で脳抗原調製物が被覆された。２％の脱脂粉乳を含むＰＢＳでブロッキン
グをした後、ファージ調製物を添加して１時間インキュベートした。ＰＢＳで十
分に洗浄した後、組み換えファージに反応性を示す脳抗原を含むウェルを、西洋
ワサビペルオキシダーゼ結合抗Ｍ１３抗体を用いて検出し、ｏ−フェニレンジア
ミン発色性基質で示された。
【０１２３】 実施例９ 標識化組織タンパク質により格子を形成され、処理されたＩＶＴＴ提示ライブラ
リー 単鎖抗体ＩＶＴＴ提示ライブラリーをインビトロにて翻訳し、実施例３に記載
のように、ストレプトアビジン表面に整列させた。単鎖抗体アレイは、実施例５
に調製されたＦＩＴＣ標識化タンパク質と反応した。反応の手順とタンパク質の
検出：タンパク質の結合は実施例５の通りとした。異なる組織タンパク質を用い
て処理した複製ＩＶＴＴアレイからの陽性シグナルのパターンを比較した。アレ
イの特定の位置における個々のタンパク質を同定するために、ｃＤＮＡライブラ
リーの原版のプレートから対応する単鎖抗体遺伝子を回収した。次いで、対象の
単鎖抗体遺伝子を、より規模の大きいＩＶＴＴに再び付し、そして、実施例６に
記載のＩＶＴＴタンパク質ライブラリーからの結合パターンの検索と同定のため
か、又は実施例１に記載の天然組織タンパク質の（二次元ゲルによる）検索と同
定のために使用した。
【０１２４】 実施例１０ リボソーム提示を形成するためのＤＮＡチップの使用 ｃＤＮＡをＩＶＴＴベクターにクローニングするために使用するプライマーの
一つが、チップ上のＤＮＡ分子にアニーリングされるように設計され転写された
配列の中に種々の配列の広がりを伴った混合プライマーであること以外は、実施
例１の記載に本質的に従って、ＤＮＡチップ上で連続的な固定化を行うためのポ
リソーム提示ライブラリーを形成するためにライブラリーを形成した。一方、転
写された配列及びクローニングされた合成オリゴヌクレオチドの混合物の中で、
提示ライブラリーからのプラスミドプールがただ一つの制限酵素によって消化さ
れた。よって、生産されたｍＲＮＡ分子のそれぞれがただ一つの配列タグ、これ
は少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは約２０ヌクレオチドである、を含む
ように、このライブラリーは構築された。
【０１２５】 単鎖抗体（ｓｃＡｂｓ）遺伝子の修飾されたものの一対を用いて、ＤＮＡチッ
プタンパク質アレイ法を試験するための実験を行った。二つの修飾されたｓｃＡ
ｂｓは、Ｎ末端エピトープタグ、重鎖可変領域（ＶＨ）、１４アミノ酸リンカー
（ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んで調製され、
ヒトκ定常領域のｃＤＮＡに融合したものであった。ヒトκ定常領域配列、これ
はポリヒスチジンタグを３’末端に含む、は修飾を受けて停止コドンが削除され
ていた。ヒトκ定常領域はスペーサーとして機能するものが含まれ、インビトロ
翻訳システムにおいてリボソーム複合体になお付着している場合であっても、生
成期の単鎖Ｆｖを正しくフォールディングさせる。
【０１２６】 これらの構築物はベクターｐＥＴ ５ｃ（ローゼンベルグ(Rosenberg AH)ら、
Gene, 56:125-135. 1987）にクローニングされ、これはＴ７プロモーターと、そ
れに次くＴ７の遺伝子１０からリボソーム結合サイトを提供した。エピトープタ
グと、次のＴ７の遺伝子１０最初のＡｔｇとをコードする配列となるように、ｓ
ｃＡｂ構築物はベクターのＮｄｅＩの位置に挿入された。シュードモナス・アエ
ルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)に対するｓｃＡｂからなる構築物（モリー
(Molloy P.) ら、Journal of applied Bacteriology, 78:359-365, 1995 ）であ
って、ＦＬＡＧエピトープ（ＭＤＹＫＤＤＤＫ）（ナピックとプルックサム(Kna
ppik A and Pluckthum A) 、Bio Techiques, 17:754-761, 1994 ）を持つ最初の
ものをＮ末端に加えた。第二のものは、抗体３４０（デュラント(Durrant LG)ら
、Prenatal Diagnosis, 14:131-140, 1994）のＮ末端にポリヒスチジンタグが付
いたものから構築されたｓｃＡｂからなっていた。
【０１２７】 これらのプラスミドは次の誘導タンパク質の親の役割をした。抗シュードモナ
ス・アエルギノーサ（α−Ｐｓ）とその３４０ｓｃＡｂは次のようにして構築し
た。それぞれ５’ＦＬＡＧエピトープ配列を導入し、３’停止コドンを除去する
プライマーＲＤ５’ＦＬＡＧ：5'gcggatcccatatggactacaaagacgatgacgacaaacagg
tgcagctgcag3' （ゲノシスバイオテクノロジーズユーラポ社(Genosys Biotechno
logies Europe Ltd)、ケンブリッジ、英国）及びＲＤ３’：5'gcgaattcgtggtggt
ggtggtggtgtgactctcc3' （ゲノシス社）を用いて、ベクターｐＰＭ１Ｈｉｓ（前
掲のモリーら）中のα−ＰｓｓｃＡｂＤＮＡを増幅した。反応混合物は、０．１
μｇの鋳型ＤＮＡ、２．６単位のExpandTMハイフィデリティＰＣＲ酵素混合物（
ベーリンガーマンハイム社、ルイス、英国）、エキスパンドＨＦ緩衝液（ベーリ
ンガーマンハイム社）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、２００μＭのデオキシヌクレ
オチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）（ライフテクノロジーズ社、ペーズリー、英国）
及び２５ピコモルの各プライマーを含んでいた。サイクルは、９６℃で５分間、
次いで〔９５℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間〕を５回、〔９５℃
で４５秒間、５０℃で１分間、７２℃で１分３０秒間〕を８回、〔９５℃で４５
秒間、５０℃で１分間、７２℃で２分間〕を５回、最後に７２℃で５分間という
ものであった。得られた１１２３塩基対生成物をＢａｍＨIII とＥｃｏＲＩとで
切断し、ベクターｐＵＣ１９（ベーリンガーマンハイム社）中にクローニングし
た。[33P] ジデオキシヌクレオチドを用いたサーモシーケナーゼラジオラベルド
ターミネーターサイクルシーケンシングキット(Thermo Sequenase radiolabeled
terminator cycle sequencing kit) （アマシャムライフサイエンス社(Amersha
m Life Science) 、アマシャム、英国）を使用してこのＤＮＡ配列を確認した。
この構築物を、ＮｄｅＩからＥｃｏＲＩへの断片（モレキュラークローニング、
アラボラトリーマニュアル、サンブロック ジェー、フリッツ イーエフ、マニ
アティス ティー編、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、1989、
ニューヨーク、アメリカ合衆国を参照すること）としてｐＥＴ５ｃベクター（プ
ロメガユーケー社、サザンプトン、英国）中にクローニングした。Wizard（登録
商標）プラスエスブイミニプレップスディーエヌエーピューリフィケーションシ
ステム(Plus SV Minipreps DNA purifications System)（プロメガユーケー社）
を使用して、又はより大規模のキアゲンプラスミドミディキット(Qiagen Plasmi
d Midi Kit) （キアゲン社、クローレイ、英国）を使用してプラスミドＤＮＡを
調製した。新しく作成されたこの新規プラスミドを、ｐＥＴ５ｃ ＦＬＡＧ−α
Ｐｓ ｓｃＡｂと名付けた。
【０１２８】 ｐｐＭ１ＨｉｓのαＰｓＶＨとＶＫの代わりに抗体３４０のＶＨとＶＫを置換
することによって、３４０ｓｃＡｂを生産した。プライマー5'cagctgcaggagtctg
ggggaggcttag3'（ゲノシス社）や5'tcagtagacggtgaccgaggttccttgaccccagta3'（
ゲノシス社）を用いて３４０ＶＨを増幅した。反応混合物は、０．１μｇの鋳型
ＤＮＡ、２．６単位のExpandTMハイフィデリティＰＣＲ酵素混合物、エキスパン
ドＨＦ緩衝液、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、２００μＭのｄＮＴＰｓ及び２５ピコ
モルの各プライマーを含んでいた。サイクルは、９６℃で５分間、次いで〔９５
℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間〕を５回、〔９５℃で４５秒間、
５０℃で１分間、７２℃で１分３０秒間〕を８回、〔９５℃で４５秒間、５０℃
で１分間、７２℃で２分間〕を５回、最後に７２℃で５分間というものであった
。得られた３５７塩基対生成物をＰｓｔＩとＢｓｔＥIIとで切断し、ＰｓｔＩと
ＢｓｔＥIIとで切断したｐＰＭ１Ｈｉｓ（前掲のモレキュラークローニング、ア
ラボラトリーマニュアル）中にクローニングした。同様に、プライマー5'gtgaca
ttgagctcacacagtctcct3'や5'cagcccgttttatctcgagcttggtccg3'（ゲノシス社）を
用いて３４０ＶＫを増幅した。３３９塩基対生成物をＳｓｔＩとＸｈｏＩとで切
断し、ＳｓｔＩとＸｈｏＩとで切断した、修飾されたｐＰＭ１Ｈｉｓ（上記で生
産されたもの）中にクローニングした。[33P] ジデオキシヌクレオチド（アマシ
ャム）を用いたサーモシーケナーゼラジオラベルドターミネーターサイクルシー
ケンシングキットを使用してこのＤＮＡ配列を確認した。それぞれ５’末端にヒ
スチジン６残基を導入し、３’停止コドンを除去するプライマーＲＤ５’ＨＩＳ
：5'gcggatcccatatgcaccatcatcaccatcaccaggtgcagctgcag3' （ゲノシス社）及び
（上記の）ＲＤ３’を用いてベクターｐＰＭ１Ｈｉｓ中の３４０ｓｃＡｂのＤＮ
Ａを増幅した。試薬と増幅条件は、α−Ｐｓ構築物のそれと全く同じであった。
得られた１１１４塩基対の産物を、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとで切断し、ベクタ
ーｐＵＣ１９にクローニングした（前掲のモレキュラークローニング、アラボラ
トリーマニュアルを参照すること）。このＤＮＡ配列を前記のようにして確認し
、この構築物をＮｄｅＩからＥｃｏＲＩへの断片としてベクターｐＥＴ５ｃにク
ローニングして、プラスミドｐＥｔ５ｃ ＨＩＳ ３４０ ｓｃＡｂを新たに作
成した。
【０１２９】 核酸「捕捉ドメイン」配列を含有させるためにモデル遺伝子を修飾した。使用
した合成オリゴヌクレオチドは次の通りであった。
【０１３０】
【外２】
【０１３１】 捕捉ドメイン配列は、SFFVフレンド赤白血病ウイルス由来であり、哺乳動物ｃ
ＤＮＡデータベースには相補的配列がないことが以前より知られている（タビチ
アン(Tavitian)ら(1998)、Nature Medicine 4:467-471 ）。捕捉ドメインは上記
のモデル遺伝子の５’ＵＴＲ配列中に挿入されているか、又は該遺伝子の３’領
域に融合されている。構築物はそれぞれＣＡＰ５変異体又はＣＡＰ３変異体と名
付けられた。ＣＡＰ５ドメイン及びＣＡＰ３ドメインの挿入は、利用可能なモデ
ル遺伝子のそれぞれに万能となるように設定されたプライマーを用いてのＰＣＲ
により実施された。ＣＡＰ５の挿入のために、プライマーＣＡＰ５インナーとＲ
Ｄ３とを用い、次いで、プライマーＣＡＰ５アウターとＲＤ３を用いる第二のＰ
ＣＲという二連続のＰＣＲを実施した。得られた産物を精製し、インビトロ転写
反応に直接使用した。同じ計画にてＣＡＰ３ドメインの挿入を続けたものの、プ
ライマーＣＡＰ３インナーはプライマーＴ７ループと共に最初のＰＣＲにて使用
し、次いで、第二のＰＣＲにてプライマーＣＡＰ３アウターとＴ７ループを使用
した。精製産物はインビトロ転写反応に直接使用した。Ｔ７ポリメラーゼとRibo
MAX システム（プロメガ社、サザンプトン、英国）を使用し、供給者の推奨する
条件にて転写反応を実施した。
【０１３２】 マイクロタイタープレートの表面に共有結合させた合成オリゴヌクレオチドに
ＲＮＡをハイブリダイズさせた。捕捉オリゴヌクレオチドはＲＮＡ内の捕捉ドメ
インと相補的な配列であった。いくつかの実験において、捕捉オリゴヌクレオチ
ドは５’アミノ−リンカー部位を介して付着しており、他の実験においては、付
着はその分子の３’末端を介したものであった。オリゴヌクレオチドが付着した
マイクロタイタープレートは、ゲノシスバイオテクノロジーズユーラポ社（ケン
ブリッジ、英国）と契約して提供を受けた。ハイブリダイズ反応は、マスコスと
サザン(Maskos and Southern)(Maskos U and Southern E.M. (1992) Nucleic Ac
ids Res. 20:1675-1678)の記載に従って、テトラメチルアンモニウムクロライド
を含有する反応緩衝液中で５５℃、６０分間で実施した。ハイブリダイズ後の洗
浄を、０．１％(v/v) ＳＤＳを含むＳＳＰＥ緩衝液（１×ＳＳＰＥ緩衝液＝１８
０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭのエチレ
ンジアミン四酢酸）の希釈液を用いて高いストリンジェンシーで行った。
【０１３３】 最後の洗浄に続けて、完全アミノ酸混合物を追加したウサギ網状赤血球溶解物
（プロメガ社）の２５μｌを添加することによりインビトロ翻訳反応を開始した
。いくつかの実験においては、アミノ酸混合物からメチオニンを引いたものを使
用し、この場合、35Ｓ−メチオニン（アマシャム）を加えた。３０℃で６０分間
の翻訳反応を行い、次いで氷上に置いた。１％(w/v) のＢＳＡを含む氷冷ＰＢＳ
を用いてウェルを洗浄した。モデル遺伝子構築物のそれぞれについて計画された
Ｆｌａｇか又はｈｉｓ６エピトープのいずれかに対する抗体を用いて翻訳産物を
検出した。希釈したＰＢＳで洗浄したウェルに抗体を添加した。ゆるやかに混合
しながら、４℃で６０分間インキュベートした。推奨された希釈の程度となるよ
うに二次試薬（抗マウス−ＨＲＰ複合体）をＰＢＳ中に加え、４℃で３０分間イ
ンキュベートした。発色基質で発色させる前に、２００μｌのＰＢＳを用いてウ
ェルを３回洗浄した。４９２ｎｍでプレートを読んだ。反応混合物に35Ｓ−メチ
オニンを含めたものについては、シンチレーションの測定により翻訳産物を検出
した。この結果から、会合したｍＲＮＡへの付着によって正しいタンパク質の固
定化が成功したことが、次には相補領域の配列によって対応する固定化ＤＮＡに
アニーリングすることが示された。
【０１３４】 実施例１１ ｔａｔ及びＳＲＰによるリボソーム提示 抗体３４０由来の上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）に特異的な、そして抗
体Ｊ５９１由来の前立腺表皮膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的な二つの単鎖抗体遺伝
子（ｓｃＦｖ）、それぞれ大腸菌発現ベクターｐＰＭｈｉｓにクローニングされ
ている、が出発点であった。長鎖合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲとを使用する
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターを上流に備えたｐＧＥＭ Ｔ７／
ＳＰ６プラスミド（プロメガ社、サザンプトン、英国）にｓｃＦｖ断片が再クロ
ーニングされ、そして上流の細菌リボソーム結合部位、下流のＭ１３ファージ遺
伝子III 由来のスペーサーセグメント、及び大腸菌ｌｐｐターミネーター由来の
３’転写末端領域が提供された。ｓｃＦｖの両者について、翻訳停止コドンをＰ
ＣＲ反応により除去した。結果として得られたプラスミドを、ｐＴ７３４０Ａ（
ＥＧＦＲのためのもの）及びｐＴ７５９１Ａ（ＰＳＭＡのためのもの）と名付け
た。
【０１３５】 上記の基本的なプラスミドの変異体として、ストランドオーバーラップエクス
テンションＰＣＲによって抗開始セグメントと下流側の末端セグメントとが提供
され、ＡＴＧ開始コドンとｓｃＦｖ遺伝子間の分泌性リーダー配列と、スペーサ
ーセグメントと転写末端配列間の末端配列ＴＡＲ配列のそれぞれを挿入した。結
果として得られたプラスミドを、ｐＴ７３４０Ｂ（ＥＧＦＲのためのもの）及び
ｐＴ７５９１Ｂ（ＰＳＭＡのためのもの）と名付けた。
【０１３６】 ＲｉｂｏＭＡＸTMキット（プロメガ社、サザンプトン、英国）を用いて、メー
カーの説明書に従ってｐＴ７プラスミドのインビトロ転写を行った。得られたｍ
ＲＮＡをメーカーのプロトコールに従って精製した。
【０１３７】 （前掲の）ハーネスとプルクサンに記載されたように変更し、そしてＨＩＶの
Ｔａｔ３７〜７２ペプチドを追加した（前掲の）チェンとズバイ(Chen and Zuba
y)に記載されたように、大腸菌Ｓ−３０システム中でインビトロ翻訳を行った。
翻訳から１０分後、（ロミシュ、ウェブ、ヘルツ、プレーン、フランク、ブレナ
ー及びワルター(Romisch K, Webb J, Herz J, Prehn S, Frank R, Brenner S an
d Walter P) 、Nature vol 340 (1989) p478-482の方法で生産された）ＳＲＰの
調製物を添加し、翻訳をさらに１０分間続けた。翻訳を停止し、混合物を（前掲
の）ハーネスとプルクサンに記載されたように遠心分離した。次いで、プレート
内をＥＧＦＲ又はＰＳＭＡのいずれかで被覆したマイクロタイタープレート上で
、翻訳反応物を室温で１時間インキュベートした。残ったリボソーム複合体を洗
浄して解離させ、ｍＲＮＡの単離、逆転写ＰＣＲ及び転写−翻訳の繰り返しを、
（前掲の）ハーネスとプルクサンに記載されたように行った。配列決定と、選択
された遺伝子集団における原版のｓｃＦｖの発現の測定のために、リボソーム提
示の５ラウンド後のＰＣＲ産物をｐＵＣ１８中にクローニングした。この測定の
ために、少なくとも５０のｐＵＣ１８クローン中の挿入物の配列を決定した。
【０１３８】 ＥＧＦＲ抗原調製物のスクリーニングのために、１：１のモル比のｐＴ７３４
０Ａ：ｐＴ７５９１Ａを含む原版のプラスミド混合物を、最終的なｐＵＣ１８ラ
イブラリーが８４％のｐＴ７３４０Ａ配列と１６％のｐＴ７５９１Ａからなるよ
うに上昇させた。１：１のモル比のｐＴ７３４０Ａ：ｐＴ７３４０Ｂ、又は１：
１のモル比のｐＴ７３４０Ｂ：ｐＴ７５９１Ｂによって、最終的なｐＵＣ１８ラ
イブラリーは、両方のケースともにｐＴ７３４０Ｂが１００％となった。
【０１３９】 実施例１２ 出発点は、二つの単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一方がジゴキシンに特異的なもの（
タン(Tang)ら、Journal of Biological Chemistry 270 (1995) p7829-7835 ）で
、もう一方がフルオレセインに特異的なもの（デンジンとボス(Denzin and Voss
) 、Journal of Biological Chemistry 267 (1992) p8925-8931 ）であった。フ
ォワードプライマー、ｆｄｉｇ１：CCG TAT AGA TCT CAG GTC AAA CTG CAG GAG
TCT 及びリバースプライマー、ｒｄｉｇ１：CCG TAT GGA TCC CCG TTT TAT TTC
CAA CTT TGT を用いて、ｐＣＡＮＴＡＢベクター（タンら）から抗ジゴキシンｓ
ｃＦｖをＰＣＲ増幅した。ベーリンガーエキスパンドハイフィデリティＰＣＲシ
ステムを用いてＰＣＲ増幅反応を行った。ＤＮＡ断片の増幅のための反応条件は
、１×エキスパンドＨＦ緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、４ｍＭの各種ｄＮＴ
Ｐ、２．５単位のポリメラーゼ、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び３０ピコモルのプラ
イマーＤＮＡであった。反応物をサーマルサイクラー中で、次のプログラム：９
２℃で５分間、（プライマー配列によって）５３〜６７℃で５分間、７２℃で１
分間、次いで、９２℃で１分間、５３〜６７℃で１分間、７２℃で１分間の３０
サイクルにてインキュベートした。得られた７２０塩基対断片を、次に、ウィザ
ードＰＣＲ精製カラム（プロメガ社）を用いて精製し、メーカーの説明書に従っ
てＰＣＲ産物とベクターとをＢｇｌIIとＢａｍＨＩとで消化することにより、大
腸菌発現ベクターｐＥＴ−９（プロメガ社）のＢａｍＨＩサイトにクローニング
した。このプラスミドは、バクテリオファージＴ７遺伝子１０由来のプロモータ
ー、翻訳開始サイト、及びターミネーターを含むものである。得られたプラスミ
ドをｐＤＩＧ１と名付けた。マレンダー、カレロ及びボス(Mallender, Carrero
and Voss) 、(Journal of Biological Chemistry 271 (1996), p5338-5346)に記
載のようにして、フォワードプライマー、ｆｏｘ１：CCG TAT AGA GAT GTC GTG
ATG ACC CAA ACT 及びリバースプライマー、ｒｏｘ１：CCG TAT GGA TCC TGA GG
A GAC GGT GAC TGA GGT を用いて、発現ベクターｐＧＸ８７７３から抗フルオレ
セインｓｃＦｖＤＮＡ配列を新たに作成した。この断片はＰＣＲによって新たに
作成されたものであり、次いで、上記のようにしてｐＥＴ−９ベクター中へクロ
ーニングされてｐＯＸ１と名付けた。
【０１４０】 次の２セットのプライマーを用いての、二本鎖Ｍ１３ＤＮＡの調製物について
のＰＣＲの実施によって、繊維状ファージＭ１３の遺伝子III のグリシンリッチ
リンカーに基いたスペーサー配列を新たに作成した。
【０１４１】
【外３】
【０１４２】 ｍ１３ｆ１とｍ１３ｒ１とのプライマーの組み合わせ、又はｍ１３ｆ２とｍ１
３ｒ２とのプライマーの組み合わせを用いて、２セットのＰＣＲ反応を行った。
これら２セットの反応によって、二つの産物の集団、一つは５’ＢｇｌIIと３’
ＸｈｏＩに制限サイトを持つものであり、もう一つは５’ＳａｌＩと３’Ｂｃｌ
Ｉに制限サイトを持つものが新たに作成された。制限サイトには、３０アミノ酸
のリンカーの多量体の構築を促進するものが含まれていた。ＢｇｌII／ＸｈｏＩ
ＰＣＲ産物を２回消化し、リン酸化して、次に、ＳａｌＩ／ＢｃｌＩで消化した
もののＰＣＲ産物と結合した。このようにして、５’から３’のみに結合された
多量体（これは消化によって確認できた。）を形成させた。９００塩基対の断片
を、アガロースゲル電気泳動によって単離し、そして、メーカーの説明書に従っ
て、ウィザードＰＣＲ精製カラム（プロメガ社）を用いて精製した。次いで、こ
の断片をＢｇｌIIとＢｃｌＩで消化し、そしてｓｃＦｖ断片の下流にある、ｐＤ
ＩＧ１とｐＯＸ１のＢａｍＨＩサイトにクローニングして、それぞれｐＤＩＧ２
とｐＯＸ２とを新たに作成した。
【０１４３】 上記の基本的なプラスミドの変異体として、ＡＵＧ開始コドンとｓｃＦｖ遺伝
子間に上流の抗開始セグメントを挿入したものがあった。これは、ネズミＶｈシ
グナル配列をこのｓｃＦｖプライマーｆｄｉｇ１とｆｏｘ１とに組み込むことに
よって実施した。
【０１４４】
【外４】
【０１４５】 ｒｄｉｇ１とｒｏｘ１を組み合わせてＰＣＲを行った後、得られたそれぞれの
ＰＣＲ産物をＢｇｌIIとＢａｍＨＩとで消化して、既に記載したようにしてｐＥ
Ｔベクター中にクローニングし、ｐＤＩＧ３とｐＯＸ３を新たに作成した。
【０１４６】 さらに、（上記のようにして新たに作成された）ＢｃｌＩで消化した９００塩
基対を次のとおりのＨＩＶのＴＡＲをコードする自己アニーリングしたオリゴヌ
クレオチドへ結合することにより、ＨＩＶのトランスアクチベーション応答因子
（ＴＡＲ）配列をＭ１３スペーサーセグメントから下流側に挿入した。
【０１４７】
【外５】
【０１４８】 この断片を精製し、ｐＤＩＧ３とｐＯＸ３のＢａｍＨＩサイトにクローニング
してｐＤＩＧ４とｐＯＸ４を新たに作成した。
【０１４９】 クローニングの後に、ＰＣＲで新たに作成した挿入物の配列解析を、二本鎖プ
ラスミドＤＮＡ鋳型（クラフト(Kraft) ら、Bio Techniques 6 (1988), p544 ）
とＴ７シークエンシングプライマーを用いるシークエナーゼ（アマシャム社）を
用いてのチェインターミネーター法にて行った。
【０１５０】 メーカーの説明書に従って、RiboMAX ラージスケールＲＮＡ生成システム（プ
ロメガ社）を用いて、構築物ｐＤＩＧ３、ｐＯＸ３及びｐＤＩＧ４、ｐＯＸ４の
インビトロ転写を行った。得られたｍＲＮＡを、ポリＡトラクトシステム（プロ
メガ社）を用いて精製した。
【０１５１】 （前掲の）ハーネスとプルクサンに記載されたように変更し、そして１０μｇ
／ｍｌのＨＩＶのＴａｔ３７〜７２ペプチド（ナリシュキン(Naryshkin) ら、Bi
ochemistry 36 (1997), p3496-3505）の存在下又は非存在下で、（前掲の）チェ
ンとズバイに記載されたように、大腸菌Ｓ−３０システム中で抗ジゴキシンｓｃ
ＦｖのｍＲＮＡと抗フルオレセインｓｃＦｖのｍＲＮＡの混合物のインビトロ翻
訳を行った。いくつかのサンプルでは、翻訳から１０分後、（ロミシュら、Natu
re vol 340 (1989) p478-482の方法で生産された）ＳＲＰの調製物を添加し、翻
訳をさらに１０分間続けた。翻訳を停止し、混合物を（前掲の）ハーネスとプル
クサンに記載されたように遠心分離した。次いで、プレート内をジゴキシン又は
フルオレセインのいずれかで被覆したマイクロタイタープレート上で、翻訳反応
物を室温で１時間インキュベートした。残ったリボソーム複合体を洗浄して解離
させ、ｍＲＮＡの単離、逆転写ＰＣＲ及び転写−翻訳の繰り返しを、（前掲の）
ハーネスとプルクサンに記載されたように行った。配列決定と、選択された遺伝
子集団における原版のｓｃＦｖの発現の測定のために、リボソーム提示の５ラウ
ンド後のＰＣＲ産物をｐＵＣ１８中にクローニングした。この測定のために、少
なくとも５０のｐＵＣ１８クローン中の挿入物の配列決定を行った。
【０１５２】 表１には、ＳＲＰの添加による選択の増加を示唆するいくつかのものと共に、
ｔａｔを添加したことによる翻訳反応が標的リガンドに対するｓｃＦｖをコード
するｍＲＮＡの選択を増加させたことを示す分析結果が示されている。
【０１５３】 実施例１３ ジシストロニック(dicistronic) ｍＲＮＡ由来のタンパク質−タンパク質結合 ジシストロニック構築物の使用によって、リボソーム提示がタンパク質の相互
作用を同定するのに使用できることを示すために、ヒトＩＬ−５タンパク質が用
いられた。三つの基本的な発現プラスミドが、下記のようにして構築された。
【０１５４】 構築物１： ヒトＩＬ−５遺伝子を、下記のプライマーを用いてｐＵＣ１８（アールアンド
ディーシステムズ社(R and D Systems) 、アビンドン(Abingdon)、英国）から増
幅した。
【０１５５】
【外６】
【０１５６】 ベーリンガーエキスパンドハイフィデリティＰＣＲシステム（ベーリンガー社
、ルイス、英国）を用いてＰＣＲ増幅反応を行った。ＤＮＡ断片の増幅のための
反応条件は、１×エキスパンドＨＦ緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、４ｍＭの
各種ｄＮＴＰ、２．５単位のポリメラーゼ、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び３０ピコ
モルのプライマーＤＮＡであった。反応物をサーマルサイクラー中で、次のプロ
グラム：９２℃で５分間、（プライマー配列によって）５３〜６７℃で５分間、
７２℃で１分間、次いで、９２℃で１分間、５３〜６７℃で１分間、７２℃で１
分間の３０サイクルにてインキュベートした。得られた４４８塩基対断片を、次
に、ウィザードＰＣＲ精製カラム（プロメガ社）を用いて精製し、メーカーの説
明書に従ってＰＣＲ産物とベクターとをＢｇｌIIとＢａｍＨＩとで消化すること
により、大腸菌発現ベクターｐＥＴ−９（プロメガ社）のＢａｍＨＩサイトにク
ローニングした。このプラスミドは、バクテリオファージＴ７遺伝子１０由来の
プロモーター、翻訳開始サイト、及びターミネーターを含むものである。得られ
たプラスミドをｐＩＬ５ａと名付けた。
【０１５７】 構築物２： 下記のプライマーを用いてｐＵＣ１８からヒトＩＬ−５遺伝子を増幅した。
【０１５８】
【外７】
【０１５９】 ＰＣＲ増幅と精製は上記のようにして行った。ＰＣＲ産物を次にＢｇｌIIとＢ
ａｍＨＩとで消化し、ｐＥＴ９ベクター（プロメガ社）のＢａｍＨＩサイトにク
ローニングして、ｐＩＬ５ｂと名付けた。 配列が上記にある、次のプライマーｍ１３ｆ１、ｍ１３ｒ１、ｍ１３ｆ２、ｍ
１３ｒ２を用いての、二本鎖Ｍ１３ＤＮＡの調製物についてのＰＣＲの実施によ
って、繊維状ファージＭ１３の遺伝子III のグリシンリッチリンカーに基いたス
ペーサー配列を新たに作成した。
【０１６０】 ｍ１３ｆ１とｍ１３ｒ１とのプライマーの組み合わせ、又はｍ１３ｆ２とｍ１
３ｒ２とのプライマーの組み合わせを用いて、２セットのＰＣＲ反応を行った。
これら２セットの反応によって、二つの産物の集団、一つは５’ＢｇｌIIと３’
ＸｈｏＩに制限サイトを持つものであり、もう一つは５’ＳａｌＩと３’Ｂｃｌ
Ｉに制限サイトを持つものが新たに作成された。制限サイトには、３０アミノ酸
のリンカーの多量体の構築を促進するものが含まれていた。ＢｇｌII／ＸｈｏＩ
ＰＣＲ産物を２回消化し、リン酸化して、次に、ＳａｌＩ／ＢｃｌＩで消化した
もののＰＣＲ産物と結合した。このようにして、５’から３’のみに結合された
多量体（これは消化によって確認できた。）を形成させた。９００塩基対の断片
を、アガロースゲル電気泳動によって単離し、そして、メーカーの説明書に従っ
て、ウィザードＰＣＲ精製カラム（プロメガ社）を用いて精製した。
【０１６１】 （上記のようにして新たに作成された）ＢｃｌＩで消化した９００塩基対のス
ペーサーセグメントを、ＨＩＶのＴＡＲをコードする自己アニーリングしたオリ
ゴヌクレオチドＴＡＲ１、ＴＡＲ２へ結合することにより、ＨＩＶのトランスア
クチベーション応答因子（ＴＡＲ）配列をＭ１３スペーサーセグメントから下流
側に挿入した。
【０１６２】 この断片を再精製し、ＢｇｌIIで消化してｐＩＬ５ｂのＢａｍＨＩサイトにク
ローニングしてｐＩＬ５ｃを新たに作成した。
【０１６３】 構築物３： ｐＩＬ５ｃをＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩとで消化して、構築物２において記載
の挿入物を放出させ、次いで、これを、同じくＨｉｎｄIII とＢａｍＨＩとで消
化しておいたｐＩＬ５ａの中にクローニングした。得られた構築物をｐＩＬ５ｄ
と名付けた。
【０１６４】 クローニングの後に、ＰＣＲによって新たに作成された挿入物の配列解析を、
二本鎖プラスミドＤＮＡ鋳型（クラフトら、Bio Techniques 6 (1988), p544 ）
とＴ７シークエンシングプライマーを用いるシークエナーゼ（アマシャム社、リ
トルカルフォント(Little Chalfont) 、英国）を用いてのチェインターミネータ
ー法にて行った。
【０１６５】 メーカーの説明書に従って、RiboMAX ラージスケールＲＮＡ生成システム（プ
ロメガ社）を用いて、構築物ｐＩＬ５ａ、ｐＩＬ５ｃ及びｐＩＬ５ｄのインビト
ロ転写を行った。得られたｍＲＮＡを、ポリＡトラクトシステム（プロメガ社）
を用いて精製した。
【０１６６】 （前掲の）ハーネスとプルクサンに記載されたように変更し、そしてＨＩＶの
ｔａｔ３７〜７２ペプチド（ナリシュキンら、Biochemistry 36 (1997), p3496-
3505）を追加して、（前掲の）チェンとズバイに記載されたようにして大腸菌Ｓ
−３０システム中でインビトロ翻訳を行った。翻訳を停止し、混合物を（前掲の
）ハーネスとプルクサンに記載されたように遠心分離した。ノバジェン(Novagen
) （ケンブリッジバイオサイエンス社(Cambridge Biosciences) 、ケンブリッジ
、英国）に記載されたようにｐＥＴ−Ｈｉｓ−Ｔａｇシステムを用いての迅速ア
フィニティーカラムクロマトグラフィーを使用して、変性条件下で翻訳混合物の
精製を行った。結合したタンパク質をメーカーの説明書に記載の方法によって溶
出した。
【０１６７】 前掲のアンティボディーズ、アラボラトリー マニュアルに記載のＭＢＳを使
用し、Ｎ末端システイン残基を介してＫＬＨに複合化したｔａｔペプチド３７〜
７２を用いて抗ｔａｔ抗体を作成した。上記のようにして、１０μｇの複合体を
用いてBalb/cマウスを免疫し、血清を集めて１：１００に希釈してさらなる実験
に使用した。上記からのｐＥＴ−Ｈｉｓ−ＴａｇＡ−溶出物を希釈したものを、
メーカーの説明書に従って、イムロン２ ９６穴マイクロタイタープレート（ダ
イナテック社(Dynatech)、シャンティー(Chantilly) 、バージニア州、アメリカ
合衆国）に添加し、次いで、抗ｔａｔ抗体を添加して室温下２時間インキュベー
トした。次に、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ標識化ヤギ抗マウス抗体
複合体（番号Ａ４４１６、シグマ社、プール、英国）の１：１０００希釈液を添
加し、さらに室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、前掲のア
ンティボディーズ、アラボラトリー マニュアルに従ってＴＭＢ基質を添加した
。
【０１６８】 この結果から、ジシストロニックプラスミドｐＩＬ５ｄ由来のＥＬＩＳＡアッ
セイにおいて、溶出されたＨｉｓタグが付着したタンパク質はｔａｔタンパク質
と関係があることが示され、しかしながら、ｔａｔの結合が検出されなかったモ
ノシストロニックプラスミドｐＩＬ５ａとｐＩＬ５ｃとの１：１混合物に由来し
ないことが示された。このことは、翻訳されたＩＬ−５はジシストロニックプラ
スミドからホモダイマー化されたものであり、モノシストロニックプラスミドか
らではないことを示した。
【０１６９】 実施例１４ ビオチン化オリゴヌクレオチド及びストレプトアビジンを用いるリボソーム提示
ヒトκ定常領域のｃＤＮＡに融合させたＮ−末端エピトープ・タグ、重鎖可変
領域（ＶH ）、１４アミノ酸リンカー（ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ）、軽鎖
可変領域（ＶL ）からなる二個の修飾単鎖抗体（ｓｃＡｂ’ｓ）を調製した。こ
のヒトκ定常領域配列は、３’末端にポリ−ヒスチジンタグを含んでおり、停止
コドンを欠失するように修飾したものであった。
【０１７０】 修飾された抗−シュードモナスｓｃＡｂ及び修飾された３４０ｓｃＡｂは、実
施例１０に記述したように構築した。上記プラスミドのイン・ビトロの共役した
転写及び翻訳は、環状ＤＮＡに対する大腸菌Ｔ７Ｓ３０エキストラクト・システ
ム（プロメガ社）を用い、すべての反応にＲＮａｓｉｎ（登録商標）（プロメガ
社）を８０ユニット／反応加えて、プロメガ・テクニカル・ブレタンＮｏ．２１
９に記述されたように行った。ビオチン化オリゴヌクレオチドＣκ３’ブロック
（５’ＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＴＧＴＧＡＣＧＧＧＣＧＡＡＣＴＣ３’）及びス
トレプトアビジンを添加しそして添加せずに、２μｇの鋳型ＤＮＡ，ｐＥＴ５ｃ
ＦＬＡＧ−αＰｓ・ｓｃＡｂ又はｐＥＴ５ｃＨＩＳ−３４０ｓｃＡｂを反応混合
物中で転写及び翻訳した。さらに、反応混合物には、総量５０μｌに１μｌのＵ
ＴＰα33Ｐ（０．３７ＭＢｑ）（ＩＣＮリミティッド、テーム、オックスフォー
ドシャー、英国）を含ませた。これらの反応液は、５μＭの３’ビオチン化Ｃκ
３’ブロックオリゴヌクレオチド及び１ｎｇのストレプトアビジン（ベーリンガ
ー・マンハイム）を含んでいた。反応液を３０℃で３０分間インキュベートし、
５０ｍＭまで酢酸マグネシウムを添加し氷上で冷却して反応を停止させた（ヘイ
ンズ及びプルックサン，Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 4937-4942, 1997）。２０
０μｌの氷冷洗浄緩衝液（５０ｍＭのトリス−塩酸，ｐＨ７．５、１５０ｍＭの
塩化ナトリウム、５０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のトゥイーン２０（ヘ
インズ及びプルックサン，上記）並びに１μｌ（４０ユニット）のＲＮａｓｉｎ
（登録商標）（プロメガユーケイリミティッド））を添加して、反応混合物を五
倍に希釈した。
【０１７１】 生産されたタンパク質は、標準的プロトコル（アンティボディーズ アラボラ
トリー マニュアル、 ハーロウ，イー．及びレイン，ディー編、コールドスプ
リングハーバーラボラトリープレス、1988、ニューヨーク、アメリカ合衆国、並
びにキアゲンウエスタンアンドドットブロッティングプロトコールズ 1997年９
月）を用い、翻訳されたタンパク質をＰｅｎｔａ Ｈｉｓ（登録商標）抗体（０
．１μｇ／ｍｌ）（キアゲンリミティッド）又は抗−ＦＬＡＧＭ２抗体（１．４
μｇ／ｍｌ）（コダック・サイエンティフィック・イメージング・システムズ・
リミティッド、ニューヨーク、アメリカ合衆国）を用いて検出するウエスタン・
ドットブロットにより、そしてその後抗−マウスＩｇＧＨＲＰ複合体（０．５μ
ｇ／ｍｌ）（シグマ、プール、英国）で処理することにより、特性決定を行った
。抗−ヒトＣκ特異的ＨＲＰ複合体（０．５μｇ／ｍｌ）（ザ・バインディング
・サイト、バッキンガム、英国）は直接使用した。タンパク質は化学発光検出法
（ＥＣＬ、アマシャム・インターナショナル・リミティッド）によりそしてオー
トラジオグラフィーにより可視化した。既知の濃度の抗−シュードモナス・アエ
ルギノーザｓｃＡｂ（モロイら，上記）及びＴ７Ｓ３０エキストラクト（プロメ
ガユーケイリミティッド）と共に供給されたＰｉｎｐｏｉｎｔ（登録商標）対照
プラスミドから転写翻訳されたタンパク質をそれぞれ正及び負の対照として使用
するウエスタン・ドット・プロットによる分析に付した。
【０１７２】 イミュロン４ＨＢＸ９６ウェルプレート（ダイナテック）のウェルを、５０ｍ
Ｍの炭酸−重炭酸緩衝液ｐＨ９．５（シグマ）中の２μｇ／ウェルでの抗−ＦＬ
ＡＧＭ２抗体、５０ｍＭの炭酸−重炭酸緩衝液ｐＨ９．５中の２μｇ／ウェルで
のＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ（登録商標）抗体、５０ｍＭの炭酸−重炭酸緩衝液ｐＨ９
．５中の５μｇ／ｍｌＢＳＡ（シグマ）又は５０μｌ／ウェルの加熱殺菌したシ
ュードモナス・アエルギノーザ調製物（マックグレゴル，ディーら、上記）で被
覆した。ウェルを１％ ベーリンガーブロック剤（ベーリンガー・マンハイム）
で室温で６０分間ブロックした。氷冷洗浄緩衝液でウェルを３回洗浄した後、転
写／翻訳反応物の試料５０μｌを種々の捕獲ウェル中に注入して０度で６０分間
ゆすりながらインキュベートした。未結合の物質を新たなチューブに除去した。
このウェルを氷冷洗浄緩衝液で５回洗浄した。５０ｍＭのトリス−塩酸ｐＨ７．
５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭのＥＤＴＡの２０μｌを添加し、氷上
で１０分間インキュベートすることによりｍＲＮＡを溶出した。収穫したＲＮＡ
の量を定性的に評価するため、未結合物質の２μｌ及び溶出された物質の２０μ
ｌニトロセルロース膜上にスポットし、風乾してオートラジオグラフにかけた。
より定量的測定のために、未結合物質及び溶出物質の二連各５μｌをマークされ
たＧＦ／Ｃガラスファイバーフィルター（ワットマン・インターナショナル・リ
ミティッド、メイドストーン、ケント、英国）上にスポットし、室温で乾燥させ
た。フィルターの各対の一方を氷冷した５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）及び２０
ｍＭのピロリン酸ナトリウムを含むビーカーに移し、２分間かき混ぜた。フィル
ターを次いで、ＴＣＡ／ピロリン酸塩を含む新たなビーカーに移し、そしてこの
洗浄操作をさらに２回繰り返した。洗浄したフィルターを７０％エタノールに短
時間移し、ついで室温で乾燥した。洗浄したフィルター及び洗浄しないフィルタ
ーをシンチレーションバイアルに移し、シンチレーション液を添加した。液体シ
ンチレーションカウンター中でフィルターのカウントを行った。洗浄しないフィ
ルターは試料中の放射活性の総量を示し、洗浄したフィルターは核酸に取り込ま
れた放射活性の量を示す。
【０１７３】 この分析の結果を表１に示す。表１は、ビオチン化ブロッキングオリゴヌクレ
オチド及びストレプトアビジンを添加した翻訳反応液が標的リガンドに対するｓ
ｃＦｖをコードするｍＲＮＡの選択を増加させる結果となることを示す。
【０１７４】 これらの実験は環状ＤＮＡに対する大腸菌Ｔ７Ｓ３０エキストラクト・システ
ムの代わりにＴＮＴ（登録商標）カプルッド・レティキュロサイト・ライゼート
・システム（プロメガユーケイリミティッド）を用いて繰り返された。転写翻訳
反応液は、プロメガ・テクニカル・ブレタンＮｏ．１２６の指示のように構成し
、ＴＮＴ（登録商標）ラビット・レティキュロサイト・ライゼート、ＴＮＴ（登
録商標）緩衝液、完全アミノ酸混合物、ＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレア
ーゼ阻害剤、ＴＮＴ（登録商標）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、１μｇの鋳型ＤＮＡ
，ｐＥＴ５ｃＦＬＡＧ−αＰｓｓｃＡｂ又はｐＥＴ５ｃＨＩＳ−３４０ｓｃＡｂ
を含んでいた。この反応は３０℃で行われた。
【０１７５】 この実験の結果は、表２に要約されている。表２は、ビオチン化ブロッキング
オリゴヌクレオチド及びストレプトアビジンを添加した翻訳反応は標的リガンド
に対するｓｃＦｖをコードするｍＲＮＡの選択を増加させる結果となることを示
す。
【０１７６】 実施例１５ 実施例１４に詳述した実験を大腸菌Ｔ７Ｓ３０エキストラクト・システムを用
いて繰り返した。転写／翻訳反応は、１ｎｇのストレプトアビジンに対しブロッ
キングオリゴヌクレオチドの濃度をそれぞれ１０ｎＭ及び２０ｎＭに増加させた
こと及び反応を二時間行わせたことを除き、上に述べたと全く同様に行った。
【０１７７】 翻訳されたタンパク質の部分標本を上述のようにウエスタン・ドット・ブロッ
トにより特性決定した。反応混合物の残りの４５μｌを氷上で急速に冷却し、酢
酸マグネシウムを最終濃度が５０ｍＭになるまで添加した。ついで、この反応混
合物を氷冷洗浄緩衝液で２００μｌに希釈した。この反応混合物の５０μｌを４
本の被覆したＥＬＩＳＡプレートウェル（５０μｌの加熱殺菌したシュードモナ
ス・アエルギノーザ細胞又は１００μｌの抗−ＦＬＡＧＭ２モノクローナル抗体
（２．８μｇ／ｍｌ）、又は１００μｌのＰｅｎｔａ−Ｈｉｓ（登録商標）抗体
（０．２μｇ／ｍｌ）又は１００μｌの２％ＢＳＡ）のそれぞれに添加し、次い
で洗浄し、そしてブロック（上述のように）し、そして氷上で１．５時間インキ
ュベートした。ウェルを氷冷洗浄緩衝液で５回洗浄した。溶出緩衝液（上述のよ
うな）と共に氷上でさらに１０分間振盪しながらインキュベートすることにより
洗浄したプレートからｍＲＮＡを溶出した。
【０１７８】 このｍＲＮＡを２０μｇのグリコーゲンキャリア（ベーリンガー・マンハイム
）の存在下に−２０℃に一晩おいてエタノールで沈殿させた（モレキュラー・ク
ローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル，上記）。その結果得られたｍＲＮ
ＡをＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）と共に逆転写反応の鋳型として使用した。簡
単に述べれば、ｍＲＮＡを７０℃、１０分間で加熱変性させ、そして氷上で冷却
して１ｎＭのプライマーＨｕＣＫ・ＦＯＲ：５’ＡＧＧＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴ
ＴＴＣ３’、配列２ｓｃＡｂ：５’ＧＴＧＡＧＣＴＣＧＡＴＧＴＣＡＴＣＣ３’
及びＲＤ３’とアニーリングさせた。Ｍ−ＭＬＶ・ＲＴ（ライフテクノロジーズ
）の２００ユニットを添加しそして３７℃で６０分間インキュベートし、その後
７０℃で１５分間加熱してこのＲＴを失活させた。次に、その後得られるＤＮＡ
：ＲＮＡハイブリッドを、上記の正向きプライマー（１０ｎＭ）と共にＲＤ５’
Ｆｌａｇ逆向きプライマーを用いるＰＣＲの鋳型として使用した。サーマルサイ
クラー中で、反応液を９６℃で５分間、それに続く４０サイクルの９５℃で３０
秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、次いで７２℃で６分間、インキュ
ベートした。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により分析した。
【０１７９】 この実験から得られた結果から、ブロッキングオリゴヌクレオチドの濃度を増
加するとｓｃＦｖ遺伝子の選択を増加させる結果となることが証明された。
【０１８０】 実施例１６ 実施例１４に記述した実験を繰り返した。転写／翻訳反応は、鋳型がｐＥＴ５
ｃＦＬＡＧαＰｓｓｃＡｂ及びｐＥＴ５ｃＨＩＳ３４０ｓｃＡｂの等量混合物で
あったことを除き、上に述べた方法と全く同様に行った。ＥＬＩＳＡプレートの
ウェルを、前と同様に、１００μｌの２．８μｇ／ｍｌαＦＬＡＧＭ２抗体及び
５０μｌの加熱殺菌ピー．アエルギノーザ調製物で被覆した。タンパク質−リボ
ソーム−ｍＲＮＡ複合体を捕獲し、溶出し、そして核酸を沈殿させた後、ＤＮア
ーゼ処理を実施例４で述べたように行った。この生産物を低溶融点アガロースゲ
ル（ライフ・テクノロジーズ）を通す電気泳動により分離し、そして全長ＰＣＲ
生産物（約１１００ｂｐ）を単離した。これは、それぞれ原核的及び真核的翻訳
に対するＴ７プロモーター、リボソーム結合部位及びＫｏｚａｋ配列（Ｋｏｚａ
ｋ，Ｍ．Nucl. Acids Res. 18: 2828, 1990)を含む上流の非翻訳ＤＮＡ配列、及
び翻訳開始コドンを導入するためのプライマーを用いるさらなるラウンドのＰＣ
Ｒのための鋳型として使用した。その結果得られるＰＣＲ産物を、次に、直鎖状
ＤＮＡ（プロメガユーケイリミティッド）用に調製されたＳ３０抽出物を用いて
転写し翻訳した。前と同様に、タンパク質−リボソーム−ｍＲＮＡ複合体を捕獲
し、ｍＲＮＡを溶出し、核酸を回収し、そしてＤＮアーゼで処理した後、ＲＴ・
ＰＣＲ及び次のラウンド用の鋳型ＤＮＡを作成するためＰＣＲによるプロモータ
ー及びリボソームの結合部位の導入を行った。リボソーム提示の４から５ラウン
ドの後に、回収したＤＮＡを元のベクター中に挿入しそし２０クローンのＤＮＡ
配列を決定した。２０クローンすべてが抗−シュードモナスｓｃＦｖ配列を含む
ことが見出された。
【０１８１】 実施例１７ 生物学的スクリーニング 生物学的応答の刺激の結果としてモジュレーターを生産する細胞系のモデルと
して、細胞系Ａ４３１（ＥＣＡＣＣ No.85090402, ＥＣＡＣＣ、ポートンダウン
、英国から）及びヒーラのＥＧＦＲ変異体（ＥＣＡＣＣ No.85060701)(ホスフォ
リパーゼＣに結合した抗−ＥＧＦＲ抗体を用いて選択される）がこの実験に使用
された。両ケース共、モジュレータータンパク質であるＨＩＶｔａｔを分泌する
変異体を使用した。細胞を１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ中で生育させた。両
方の系から下記のように、ｔａｔタンパク質を分泌する組み換え体細胞系が誘導
された。すなわち、合成ＨＩＶｔａｔ遺伝子をアールアンドディー・システムズ
（エイビングドン、英国）から購入し、そして下記のプライマーを用いてＰＣＲ
増幅した。
【０１８２】
【外８】
【０１８３】 その結果得られるＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化しそしてＸｈｏ
Ｉ及びＥｃｏＲＩで消化したｐＣＩ−ｎｅｏベクター（プロメガ、サウサンプト
ン、英国）中にサブクローニングした。このｔａｔ発現プラスミドをＡ４３１及
びＥＧＦＲヒーラ中にバイオラド・ジーンパルサーII（バイオラド、ヘメル・ヘ
ンプステッド、英国）を用いる電気穿孔法によりトランスフェクトさせ、そして
Ｇ４１８で選択した。ｔａｔの選択は次のようにしてＥＬＩＳＡにより確認した
。すなわち、ｔａｔペプチド３７−７２を用いて抗−ｔａｔ抗体を作成した。こ
れを Antibodies, A Laboratory Manual上記に従ってＭＢＳを用いてそのＮ−末
端システイン残基を介してＫＬＨに結合させた。この複合体の１０μｇを用いて
、上記のように、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、そして血清を集め、１：１０
０の希釈でＥＬＩＳＡ実験に用いた。抗体の１０μｇ部分を、製造業者の指示に
従ってイミュロン２・９６ウェルミクロタイタープレート（ダイナテック、チャ
ンティリー、ＶＡ、米国）中に注入し、次いで細胞上清の試料を添加して室温で
二時間インキュベートし、プレートを次にＰＢＳで３回洗浄し、そして１：１０
００希釈のＨＲＰ−標識化ヤギ抗−マウス抗体複合体（＃Ａ４４１６、シグマ、
プール、英国）を添加し、室温でさらに 1時間インキュベートした。ＰＢＳで３
回洗浄した後、 Antibodies, A Laboratory Manual（上記）に従ってＴＭＢ基質
を添加した。これにより、トランスフェクトされたＡ４３１及びＥＧＦＲヒーラ
細胞の培養上清中にＨＩＶｔａｔタンパク質が存在することそしトランスフェク
トされていないＡ４３１及びＥＧＦＲヒーラ細胞の培養上清中には存在しないこ
とが確認された。
【０１８４】 モデルのタンパク質リガンドとしては、抗−ＥＧＦＲ（表皮成長因子受容体）
（ＰＣＴ 00443) 及び抗−フルオレッセイン（デニジン及びボス，Journal of B
iological Chemistry, vol267 (1992) p8925-8931)をコードする二個の単鎖抗体
（ｓｃＦｖ）遺伝子を使用した。この抗−ＥＧＦＲｓｃＦｖは下記のプライマー
を用いてクローニングされたＶｈ及びＶｋ鎖からＰＣＲ修飾されたものであった
。
【０１８５】
【外９】
【０１８６】 ＰＣＲ増幅反応は拡大高忠実度ＰＣＲシステム（ベーリンガー、リューズ、英
国）を用いて行った。ＤＮＡ断片の増幅のための反応条件は、１×拡大ＨＦ緩衝
液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、４ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．５ユニットのポリメラ
ーゼ、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び３０ｐモルのプライマーＤＮＡであった。反応
液は、サーマルサイクラー中、次のプログラムを用いてインキュベートした。す
なわち、９２℃で５分間、５３−６７℃（プライマー配列に依存する）で５分間
、７２℃で１分間、その後９２℃で１分間、５３−６７℃で１分間、そして７２
℃で１分間の３０サイクル。その結果得られた断片を、次に、ウィザードＰＣＲ
精製カラム（プロメガ）を用いて精製した。Ｖｈ及びＶｋのこのＰＣＲ断片をＰ
ｓｔＩ／ＢｓｔＥII及びＳａｃＩ／ＸｈｏＩでそれぞれ消化した。このｓｃＦｖ
ベクターはｐＰＭ１Ｈｉｓ（モロイら、上記）であった。これをＰｓｔＩ及びＢ
ｓｔＥIIで消化し、その３．５ｋｂベクター断片を精製し、そしてＰｓｔＩ／Ｂ
ｓｔＥIIＶｈＰＣＲ断片をライゲートして大腸菌ＴＧ１中に形質転換して３４０
Ｖｈ組み換え体を作成した。この３４０Ｖｈプラスミドを次にＳａｃＩとＸｈｏ
Ｉで消化し、そしてＳａｃＩ／ＸｈｏＩＶｋＰＣＲ断片をそのベクター断片中に
クローニングして３４０ｓｃＦｖ−生産性ＴＧ１細胞を作成した。
【０１８７】 Ｔ７ポリメラーゼ転写ベクター中にクローニングするため、前向きプライマー
５’−ＣＣＧＴＡＴＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧ
ＴＣＴＧＧＧ−３’及び逆向きプライマー５’−ＣＣＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧ
ＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴＧＡＴ−３’を用いて前記３４０ｓｃＦｖを
増幅した。このＰＣＲ断片をＢｇｌII及びＢａｍＨＩで消化し、そして大腸菌発
現ベクターｐＥＴ−９（プロメガ）のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。この
プラスミドはバクテリオファージＴ７遺伝子１０由来のプロモーター、翻訳開始
部位及び翻訳停止部位を含んでいる。その結果得られるプラスミドはｐＥＧＦＲ
１と名づけた。抗−フルオレセインｓｃＦｖＤＮＡ配列は、前向きプライマー、
ｆｏｘ１ ５’−ＣＣＧＴＡＴＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣ
ＡＡＡＣＴ−３’及び逆向きプライマー、ｒｏｘ１ ５’−ＣＣＧＴＡＴＧＧＡ
ＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴ−３’を用い、発現ベクタ
ーｐＧＸ８７３３から、マレンダー、カレロ及びボス（Journal Biological Che
mistry, vol 271 (1996), p5338-5346) により記述されたように形成した。この
断片をＰＣＲにより形成させ、ついで上述のようにｐＥＴ−９ベクター中にクロ
ーニングし、そしてｐＯＸ１と名づけた。
【０１８８】 繊維状ファージＭ１３の遺伝子III のグリシンの多いリンカーに基づくスペー
サー配列は、二本鎖Ｍ１３ＤＮＡの調製に関するＰＣＲをプライマーｍ１３ｆ１
、ｍ１３ｒ１、ｍ１３ｆ２及びｍ１３ｒ２を用いて従来のように行うことにより
形成させた。
【０１８９】 二セットのＰＣＲ反応は、ｍ１３ｆ１とｍ１３ｒ１又はｍ１３ｆ２とｍ１３ｒ
２のプライマー組合せを用いて行った。これらの二セットの反応により、２集団
の生産物、すなわち、５’ＢｇｌII及び３’ＸｈｏＩ制限部位及び５’ＳａｌＩ
及び３’ＢｃｌＩ制限部位を持つ集団を形成した。これらの制限部位は、３０ア
ミノ酸リンカーのマルチマーの構築を容易にするために含められた。ＢｇｌII／
ＸｈｏＩＰＣＲ産物は二重消化しそしてリン酸化し、次いで消化したＳａｌＩ／
ＢｃｌＩ産物と連結した。このようにして、５’から３’に連結したマルチマー
（これは消化により確認できるであろう）のみが形成されるであろう。９００ｂ
ｐの断片をアガロースゲル電気泳動により単離し、そして製造者の指示に従いウ
ィザードＰＣＲ精製カラム（プロメガ）を用いて精製した。次いで、この断片を
ＢｇｌII及びＢｃｌＩで消化し、ｐＥＧＦＲ１のＢａｍＨＩ部位及びｓｃＦｖ断
片の下流のｐＯＸ１中にクローニングしてそれぞれｐＥＧＦＲ２及びｐＯＸ２を
形成させた。
【０１９０】 このＨＩＶトランス活性化応答因子（ＴＡＲ）配列を、ＢｃｌＩで消化した９
００ｂｐのスペーサー断片（上記のようにして形成したもの）を従来のようにＨ
ＩＶ・ＴＡＲをコードする自己アニールしたオリゴヌクレオチドＴＡＲ１及びＴ
ＡＲ２に連結することにより、Ｍ１３スペーサー断片の下流に挿入した。
【０１９１】 この断片を精製し、ｐＥＧＦＲ２及びｐＯＸ２のＢａｍＨＩ部位にクローニン
グしてｐＥＧＦＲ３及びｐＯＸ３を形成させた。クローニングの後、二本鎖プラ
スミドＤＮＡ鋳型（クラフトら，Bio Techniques 6 (1988), p544)及びＴ７配列
決定用プライマーを用いるシーケナーゼ（アマシャム）を用いるジデオキシ・チ
ェイン・ターミネーション法によりＰＣＲで形成させた挿入物の配列決定を行っ
た。
【０１９２】 構築物ｐＥＧＦＲ３及びｐＯＸ３のイン・ビトロ転写は、製造者の指示に従い
、リボマックス・ラージスケールＲＮＡ生産システム（プロメガ）を用いて行っ
た。その結果得られたｍＲＮＡをポリＡＴトラクト・システム（プロメガ）を用
いて精製し、そして１：１の比（ｗ／ｗ）で混合した。
【０１９３】 イン・ビトロ翻訳は、チェン及びズベイ（上記）により記述され、ヘインズ及
びプルックサン（上記）により修正された大腸菌Ｓ−３０システムで行った。翻
訳の１０分後に、ＳＲＰ（ロミッシュら，Nature 340, (1989), p478-482) の調
製物を添加し、そしてその翻訳をさらに１０分間継続した。翻訳を停止し、混合
物をヘインズ及びプルックサン（上記）により記述されたように遠心分離した。
この翻訳反応物を次いでＰＢＳ中に希釈した。細胞を成長させ、トリプシン／Ｅ
ＤＴＡ中に収穫し、ＰＢＳ中で２回洗浄した後、１０6 Ａ４３１と１０6 ／ｍｌ
ＥＧＦＲ−ヒーラ細胞の混合物としてか又は個々の細胞型のそれぞれの２×１０ 6 ／ｍｌかの２×１０6 細胞／ｍｌでＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中に再懸濁した。
それぞれの場合に、ｔａｔ+ 形質転換細胞又はｔａｔ- 形質転換細胞のいずれか
を用いた。次いで、１００μｌの細胞懸濁液を、１００μｌＢＢＳ＋０．１％ソ
ジウムカルボキシメチルセルロース（ＩＣＩ、ティーサイド、英国）中のライブ
ラリーＤＮＡの最初の１μｇ由来の翻訳反応物と３７℃で１時間混合した。次い
で、細胞を遠心分離し、０．１％（ｖ／ｗ）ＢＳＡを含むＰＢＳ中で２回洗浄し
、この緩衝液の１００μｌ中に再懸濁した。
【０１９４】 ヘインズ及びプルックサン（上記）により記述されたようにＥＤＴＡ緩衝液中
でｍＲＮＡを解離させた後、Antibodies, A Laboratory Manual （上記）に従っ
て調製されたタンパク質Ａビーズ上のポリクローナル抗−ｔａｔ抗体を含むカラ
ムを通すことにより、ｔａｔに結合したｍＲＮＡを回収した。保持されたリボソ
ーム複合体の洗浄及び解離、ｍＲＮＡの単離、逆転写ＰＣＲ及び転写−翻訳の繰
り返しは、ヘインズ及びプルックサン（上記）により記述された通りに行った。
リボソーム提示の２ラウンドの後、選択された遺伝子集団における最初のｓｃＦ
ｖの決定及び配列決定のために、そのＰＣＲ産物をｐＵＣ１８中にクローニング
した。この決定のため、少なくとも５０ｐＵＣ１８クローン中の挿入物について
、クローンの同一性を決定するため、部分的に配列決定した。その結果、表３に
示すように、Ａ４３１細胞から分泌されるｔａｔは、Ａ４３１に結合しない抗−
フルオレセインｓｃＦｖよりも翻訳された抗−ＥＧＦＲｍＲＮＡに対し優先的な
選択性を示すことが明らかになる。ｔａｔもＥＧＦＲヒーラ細胞もそのような優
先的選択性を与えないことから、標的細胞への結合とｔａｔ分泌の両者が選択の
ために要求されることが示される。
【０１９５】 実施例１８ リガンド配向性リボソームの提示 モノクローナル抗体３４０（ＰＣＴ00443 ）を表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ
）リガンドとして用いた。１ｍｇの抗体３４０を、架橋剤としてスルホ−ＭＢＳ
（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル）（ピ
アス、チェスター、英国、＃22312 ）を用いて１０ｍｇのＰＬＣ（シグマ、プー
ル、英国、＃Ｐ4039）に結合させた。結合は、製造者の推奨するプロトコルを用
いて行った。試薬類は結合の後Ｇ２５セフェデックスカラム（ファルマシア、ミ
ルトンケインズ、英国、＃17-0851-01）及び透析を用いて脱塩し精製した。結合
は、標準的プロトコル（ Antibodies, A Laboratory Manual、上記）に従って、
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びクーマシーブルー染色により確認し
た。
【０１９６】 モノクローナル及びポリクローナル抗−ＥＧＦＲ抗体を生産する方法は、実質
的には Antibodies, A Laboratory Manual、上記に記述された通りの標準的方法
であった。ＥＧＦＲに反応性のマウスモノクローナル抗体は、ヒト乳癌ＭＤＡ−
ＭＢ４６８をＢＡＬＢ／ｃマウスに対する免疫原として用いて得た。一次及び二
次注射は両方とも５×１０5 細胞を用いて腹腔内に行い、３週間後に尾部静脈に
２日にわたって４回の注射を行った。さらに５日後に、脾臓を取り出し、ケネッ
ト，Ｒ．Ｈ．Methods Enzymol. vol 58 (1978) p345-359 の手順に従って、ＳＰ
２／０マウス骨髄腫細胞に融合させた。プールしたハイブリドーマを、モジタヘ
ディ，エイチら、Br. J. Cancer, vol 67 (1993) p247-253 により記述されたよ
うに、ＥＧＦＲ結合活性についてテストし、そして５×１０7 細胞まで増殖させ
、ファスト・トラックｍＲＮＡ単離キット（インビトロゲン、ＮＶリーク、オラ
ンダ国）を用いてｍＲＮＡを単離した。次いで、ファルマシア・リコンビナント
・ファージ・抗体・システム・キット（ファルマシア、ミルトンケインズ、英国
）を用い、製造者の指示に従ってｍＲＮＡを処理し、ｐＣＡＮＴＡＢ５ベクター
から１０7 ｃｆｕのライブラリーを作成した。
【０１９７】 転写のために、バクテリオファージＴ７遺伝子１０由来のプロモーター、翻訳
開始部位及び停止部位を具備するベクターｐＥＴ−５（プロメガ、サウサンプト
ン、英国）を使用した。まず、３’スペーサー配列を繊維状ファージＭ１３の遺
伝子III のグリシンの多いリンカーに基づき、従来のように、下記のプライマー
ｍ１３ｆ１、ｍ１３ｒ１、ｍ１３ｆ２及びｍ１３ｒ２を用いてＰＣＲにより作成
されたこのベクターの中にクローニングした。
【０１９８】 ２セットのＰＣＲ反応をｍ１３ｆ１とｍ１３ｒ１又はｍ１３ｆ２とｍ１３ｒ２
のプライマー組合せを用いて行った。これらの２セットの反応は２集団の生産物
を形成した。すなわち、５’ＢｇｌIIと３’ＸｈｏＩの制限部位を持つもの及び
５’ＳａｌＩと３’ＢｃｌＩの制限部位を持つものである。この制限部位は３０
アミノ酸リンカーのマルチマーの構築を容易にするために含められた。ＢｇｌII
／ＸｈｏＩＰＣＲ産物を二重に消化しそしてリン酸化し、ついで消化したＳａｌ
Ｉ／ＢｃｌＩＰＣＲ産物と連結した。このようにして、５’から３’に連結した
マルチマーはだけが形成された。９００ｂｐのマルチマーを選択し、ＢｃｌＩで
消化し、従来同様に、ＨＩＶ・ＴＡＲ応答因子をコードする自己アニールした合
成オリゴヌクレオチドＴＡＲ１及びＴＡＲ２に連結した。
【０１９９】 この断片を精製し、ＢｇｌIIで消化し、ｐＥＴ−５のＢａｍＨＩ部位にクロー
ニングして、遺伝子III ／ＴＡＲ挿入物、下流のＢａｍＨＩ部位を含むが下流に
は部位を持たないプラスミドｐＥＴ−５III を作成する。
【０２００】 ｐＣＡＮＴＡＢ５中の挿入物は下記のプライマーを用いて増幅した。すなわち
前向き：５’ＣＣＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧ
ＧＣ３’、 逆向き：５’ＣＣＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧ
ＡＴＧ３’。 ＰＣＲ増幅反応はベーリンガー拡大高忠実度ＰＣＲシステムを用いて行った。Ｄ
ＮＡ断片の増幅のための反応条件は、１×拡大ＨＦ緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣ
ｌ2 、４ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．５ユニットのポリメラーゼ、１０ｎｇの鋳型Ｄ
ＮＡ及び３０ｐモルのプライマーＤＮＡであった。反応物はパーキンエルマー・
サーマル・サイクラー４８０中、次のプログラムを用いてインキュベートした。
すなわち、９２℃で５分間、６７℃で５分間、７２℃で１分間、その後９２℃で
１分間、６７℃で１分間及び７２℃で１分間の３０サイクルであった。その結果
得られた７９５ｂｐの断片を、次に、ウィザードＰＣＲ精製カラム（プロメガ）
を用いて精製し、そしてそのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩでそしてベクターをＭｂｏ
Ｉで消化することにより修飾されたベクターｐＥＴ−５III 中にクローニングし
た。
【０２０１】 混合したＤＮＡライブラリー１０μｇのイン・ビトロ転写を、製造者の指示に
従って、リボマックス・ラージスケールＲＮＡ生産システム（プロメガ）を用い
て行った。その結果得られたｍＲＮＡをポリＡＴトラクトシステム（プロメガ）
を用いて精製した。
【０２０２】 イン・ビトロ翻訳はチェン及びズベイ（上記）により記述され、ヘインズ及び
プルクサン（ＰＮＡＳ，vol 94 [10]:4937, 1997) により修正された大腸菌Ｓ−
３０システムに、ＨＩＶｔａｔ３７−７２ぺプチド（ナリシュキンら，Biochemi
stry vol 36 (1997) p3496-3505)を補足して行った。翻訳は１０分後に停止させ
、混合物をヘインズ及びプルクサン（上記）が記述したように遠心分離した。
【０２０３】 リポソーム−ｔａｔ調製のために、脂質Ｌ−ホスファチジルコリン及びオレオ
イル−パルミトイルコレステロールを混合することによりリポソーム小胞を作成
した。１０ｍＭのトリスｐＨ８．０中１００ｍＭ濃度のｔａｔ３７−７２ぺプチ
ドを、１．５：１のＬ−アルファ−ホスファチジルコリンとコレステロール（シ
グマ、プール、英国、＃ 13906 )の混合物１０ｍｇに添加した。激しい攪拌と室
温での放置のサイクルの繰り返しの後、小胞が形成された。このリポソーム溶液
の容積は１０ｍＭトリスｐＨ８．０の添加により増加し、そしてホウ酸緩衝化食
塩水（ＢＢＳ：０．２Ｍメタホウ酸ナトリウム、７．５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１．
８ｇ／ｌのＣａＣｌ2 ２Ｈ2 Ｏ、ｐＨはホウ酸で７．０に調整）を用いてＧ２５
セファデックスカラムを通すゲル濾過により未取り込み成分からリポソームを精
製した。溶出されたリポソームの完全性は顕微鏡により評価した。顕微鏡下で、
１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０の溶液（ピアス、チェスター、英国、＃ 28324) で処
理することにより溶解した対照調製品と完全なリポソームを比較した。リポソー
ムは、最終濃度が１０ｍＭｔａｔ３７−７２ぺプチドになるようにＢＢＳで希釈
した。
【０２０４】 抗−ｔａｔ抗体はｔａｔぺプチド３７−７２を用いて調製した。ｔａｔぺプチ
ド３７−７２を、Antibodies, A Laboratory Manual 上記に従いＭＢＳを用いて
そのＮ−末端システイン残基を介してＫＬＨに結合させた。その複合体１０μｇ
を用いて上記のようにＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、血清を集め、さらなる実
験では１：１００希釈で使用した。７９１Ｔ／３６細胞（ドーラン，エムら，Br
J Cancer, vol 62 (1990) p500)に対するウサギのポリクローナル抗体をAntibo
dies, A Laboratory Manual 上記に従って調製した。
【０２０５】 ７９１Ｔ／３６細胞は、生育させ、トリプシン／ＥＤＴＡ中で回収し、ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で２回洗浄した後、５×１０5 細胞／ｍｌでＰＢＳ／０．１％Ｂ
ＳＡ中に再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を、次に、０．１％（ｗ／ｖ）牛
血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ、＃Ａ7906、プール、英国）を補充したＰＢ
Ｓ中、１００μｇ／ｍｌの３４０−ＰＬＣ複合体の１００μｌと混合し、３７℃
で１時間インキュベートした。次に、細胞を遠心分離し、氷冷ＰＢＳ／０．１％
ＢＳＡで２回洗浄し、１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。ついで、ライブラリ
ーＤＮＡの元の１μｇから誘導された翻訳反応液に１００μｌのＰＢＳを添加し
てさらに１時間３７℃でインキュベートした。細胞を再び遠心分離し、ＰＢＳ／
０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、そしてこの緩衝液の１００μｌに再懸濁した。１
００μｌの調製したリポソーム懸濁液を添加し、３７℃で１時間インキュベート
した。続いて細胞をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で５分間×３回洗浄した。
【０２０６】 ｔａｔ−結合ｍＲＮＡは、ヘインズ及びプルクサン（上記）により記述された
ようにＥＤＴＡ緩衝液中でのｍＲＮＡの解離により、そしてその後のAntibodies
, A Laboratory Manual 上記に従って調製されたタンパク質Ａビーズ上のポリク
ローナル抗−ｔａｔ抗体を含むカラムを通過させることにより回収された。保持
されたリボソーム複合体の洗浄及び解離、ｍＲＮＡの単離、逆転写ＰＣＲ、及び
５０μＣｉ／ｍｌの３５Ｓメチオニン標識（アマシャム・インターナショナル、
アマシャム、英国）を用いる最終ラウンドでの標識化を伴う転写−翻訳の繰り返
しは、ヘインズ及びプルクサン（上記）により記述されたとおりに行った。７９
１Ｔ細胞上でのリボソーム提示の３ラウンドの後、そのＰＣＲ産物は３５Ｓメチ
オニンで転写されそして翻訳され、そしてこの混合物は次に抗体３４０免疫アフ
ィニティカラム（ＰＣＴ0043) を用いて調製されたヒト胎盤由来のＥＧＦＲ抗原
調製物で被覆されそして製造者のプロトコルに従って被覆緩衝液中でプレート上
に被覆されたイミュロン２・９６−ウェルミクロタイタープレート（ダイナテッ
ク、チャンティリ、ＶＡ、米国）に注入した。約１μｇの翻訳されたタンパク質
複合体を０．１μｇのＢＳＡ単独か又は１μｇの３４０抗体又は５μｇのポリク
ローナル抗−ＥＧＦＲ（上記のようなもの）と共に各ウェルに添加した。プレー
トを１時間インキュベートし、０．１％トゥイーン２０（シグマ）を含むＰＢＳ
で５回洗浄し、そして結合しているタンパク質を０．１Ｍトリエチルアミンで溶
出し、シンチレーションカウンターで計測した。３回の測定の平均として（ＳＤ
＜１０％）表４に示すように、その結果は、抗−ｔａｔカラムを用いて７９１Ｔ
細胞から溶出されたｍＲＮＡ／リボソーム／タンパク質の三重複合体から誘導さ
れた翻訳されたタンパク質が特異的に結合すること、しかし抗−ｔａｔ富化なし
に溶出され処理された三重複合体又はＤＮＡライブラリーから直接の三重複合体
由来のものは結合しないことが示された。さらに、３４０抗体による結合の阻害
の欠如、これは本実験におけるＰＬＣ−標識化リガンドを含むが、そしてポリク
ローナル抗−７９１Ｔ血清による陽性の阻害は、結合が３４０のそれ以外のＥＧ
ＦＲ上のエピトープに特異的であることを示すものである。
【０２０７】 実施例１９ リポソーム選択によるタンパク質−タンパク質結合 自己ダイマー化ヒトＩＬ−５タンパク質を用いてその二つの不活性サブユニッ
ト、ＰＬＣ１−２４６（ＰＬ１）及びＰＬＣ２４７−３７０（ＰＬ２）由来のホ
スフォリパーゼＣ（ＰＬＣ）の相補性及びその後のリポソームの溶解を明らかに
した。ヒトＩＬ−５遺伝子（アールアンドディー・システムズ、エイビングドン
、英国）を、下記のプライマーを用いてｐＵＣ１８からＰＣＲ増幅した。
【０２０８】
【外１０】
【０２０９】 ＩＬ−５の対照として、ジゴキシンに特異的な単鎖抗体遺伝子（ｓｃＦｖ）
（タングら，Journal of Biological Chemistry 270 (1995) p7829-7835)をも、
前向きプライマー、fdig1:ＣＣＧＴＡＴＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＴＣＡＡＡＣＴＧ
ＣＡＧＧＡＧＴＣＴ及び逆向きプライマー、rdig1:ＣＣＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣ
ＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴを用い、ｐＣＡＮＴＡＢベクター（
タングら）から出発してクローニングした。
【０２１０】 ＰＣＲ増幅反応は、ベーリンガー拡大高忠実度ＰＣＲシステム（ベーリンガー
、リューズ、英国）を用いて行った。ＤＮＡ断片の増幅のための反応条件は、１
×拡大ＨＦ緩衝液、２．５ｍＭののＭｇＣｌ2 、４ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．５ユ
ニットのポリメラーゼ、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び３０ｐモルのプライマーＤＮ
Ａであった。反応物はサーマル・サイクラー中、次のプログラムを用いてインキ
ュベートした。すなわち、９２℃で５分間、５３−６７℃（プライマー配列に依
存する）で５分間、７２℃で１分間、その後９２℃で１分間、５３−６７℃で１
分間及び７２℃で１分間の３０サイクルであった。その結果得られた断片を、次
にウィザードＰＣＲ精製カラム（プロメガ）を用いて精製し、製造者の指示に従
いそのＰＣＲ産物とベクターをＢｇｌII及びＢａｍＨＩで消化することにより大
腸菌発現ベクターｐＥＴ−９（プロメガ、サウサンプトン、英国）のＢａｍＨＩ
部位にクローニングした。このプラスミドはバクテリオファージＴ７遺伝子１０
由来のプロモーター、翻訳開始部位及びターミネーターを含む。結果として得ら
れるプラスミドをｐＩＬ５ａ（ＳｍａＩ部位）及びｐＩＬ５ｂ（ＳｍａＩ及びＮ
ｃｏＩ部位）又はｐＤＩＧ（抗−ジゴキシンｓｃＦｖ）と名づけた。
【０２１１】 ｐＩＬ５ｂとｐＤＩＧはさらに下記のように修飾した。すなわち、繊維状ファ
ージＭ１３の遺伝子III のグリシンの多いリンカーに基づくスペーサー配列を、
実施例１７に記述したように、プライマーｍ１３ｆ１、ｍ１３ｒ１、ｍ１３ｒ２
及びｍ１３ｆ２を用い、二本鎖Ｍ１３ＤＮＡの調製品についてのＰＣＲを行うこ
とにより作成した。
【０２１２】 ２セットのＰＣＲ反応をｍ１３ｆ１とｍ１３ｒ１又はｍ１３ｆ２とｍ１３ｒ２
のプライマー組合せを用いて行った。これらの２セットの反応は二つの集団の生
産物を形成した。すなわち、５’ＢｇｌIIと３’ＸｈｏＩの制限部位を持つもの
及び５’ＳａｌＩと３’ＢｃｌＩの制限部位を持つものである。これらの制限部
位は３０アミノ酸リンカーのマルチマーの構築を容易にするために含められた。
ＢｇｌII／ＸｈｏＩＰＣＲ産物を二重に消化しそしてリン酸化し、ついで消化し
たＳａｌＩ／ＢｃｌＩＰＣＲ産物と連結した。このようにして、５’から３’に
連結したマルチマーはだけが形成されるであろう（これは消化により確認される
であろう）。９００ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動により単離し、製造者
の指示に従ってウィザードＰＣＲ精製カラム（プロメガ）を用いて精製した。Ｈ
ＩＶトランス活性化応答因子（ＴＡＲ）配列は、実施例１７に記述したように、
ＢｃｌＩで消化した９００ｂｐスペーサー断片（上記のようにして形成したもの
）をＨＩＶ・ＴＡＲをコードする自己アニールしたオリゴヌクレオチドＴＡＲ１
及びＴＡＲ２に連結することによりＭ１３スペーサー断片から下流に挿入した。
【０２１３】 この断片を再精製し、ＢｇｌIIで消化し、ｐＩＬ５ｂ又はｐＤＩＧのＢａｍＨ
Ｉ部位にクローニングして、それぞれｐＩＬ５ｂ／Ｍ１３／ＴＡＲ及びｐＤＩＧ
／Ｍ１３／ＴＡＲを得た。
【０２１４】 このＰＬＣをコードするプラスミドｐＴ２．２（ティトボール，アールら，In
fection and Immunity, 57 (1989) p367-376) を下記のプライマー対を用いてＰ
ＣＲ（条件は上記の通り）に付した。
【０２１５】
【外１１】
【０２１６】 ＰＬ１プライマー対でＰＣＲにより得られたＰＬ１断片を、ＮｃｏＩ及びＳｍ
ａＩで消化し、ＮｃｏＩ／ＳｍａＩ消化ｐＩＬ５ｂ（又はｐＤＩＧ）／Ｍ１３／
ＴＡＲ中にクローニングしてｐＩＬ５ｂ（ｐＤＩＧ）／ＰＬ１／Ｍ１３／ＴＡＲ
を得た。ＰＬ２ｆｏｒ１及びＰＬ２ｂｃｋ１のプライマーを用いてＰＣＲから得
られたＰＬ２断片は、ＳｍａＩ及びＨｉｎｄIII で消化し、ＳｍａＩ／Ｈｉｎｄ
III 消化ｐＩＬ５ａ中にクローニングしてｐＩＬ５ａ／ＰＬ２を生じた。ＰＬ２
ｆｏｒ２及びＰＬ２ｂｃｋ２のプライマーを用いてＰＣＲから得られたＰＬ２断
片をＢｇｌII及びＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩ消化ｐＥＴ−９中にクローニ
ングするとＰＬ２を生じた。
【０２１７】 これらのプラスミド構築物のイン・ビトロ転写は、製造者の指示に従い、リボ
マックス・ラージスケールＲＮＡ生産システム（プロメガ）を用いて行った。そ
の結果得られたｍＲＮＡはポリＡＴトラクトシステム（プロメガ）を用いて精製
した。
【０２１８】 リポソーム−ｔａｔ調製物のためには、脂質Ｌ−ホスファチジルコリンとオレ
オイル−パルミトイルコレステロールを混合することによりリポソーム小胞を調
製した。１０ｍＭトリスｐＨ８．０中１００ｍＭの濃度でｔａｔ−３７−７２ぺ
プチドを、１．５：１のＬ−アルファ−ホスファチジルコリンとコレステロール
（シグマ、プール、英国、＃ 13906) の混合物の１０ｍｇに添加した。小胞は激
しい攪拌と室温でのその溶液の放置のサイクルを繰り返した後に形成された。リ
ポソーム溶液の容積は１０ｍＭのトリスｐＨ８．０の添加により増加し、そして
ホウ酸緩衝化食塩水（ＢＢＳ：０．２Ｍメタホウ酸ナトリウム、７．５ｇ／ｌの
ＮａＣｌ、１．８ｇ／ｌのＣａＣｌ2 ２Ｈ2 Ｏ、ｐＨはホウ酸で７．０に調整）
を用いてＧ２５セファデックスカラムを通すゲル濾過により未取り込み成分から
リポソームを精製した。溶出されたリポソームの完全性は顕微鏡により評価した
。顕微鏡下で、１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０の溶液（ピアス、チェスター、英国、
＃ 28324) で処理することにより溶解した対照調製品と完全なリポソームを比較
した。リポソームは、最終濃度が１０ｍＭｔａｔ３７−７２ぺプチドになるよう
にＢＢＳで希釈した。
【０２１９】 抗−ｔａｔ抗体はｔａｔぺプチド３７−７２を用いて調製した。ｔａｔぺプチ
ド３７−７２を、Antibodies, A Laboratory Manual （上記）に従いＭＢＳを用
いてそのＮ−末端システイン残基を介してＫＬＨに結合させた。その複合体１０
μｇを用いて上記のようにＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、血清を集め、さらな
る実験では１：１００希釈で使用した。
【０２２０】 イン・ビトロ翻訳は、チェン及びズベイ（上記）により記述され、ヘインズ及
びプルックサン（上記）により修正された大腸菌Ｓ−３０システムで行った。翻
訳を停止し、混合物をヘインズ及びプルックサン（上記）により記述されたよう
に遠心分離した。調製されたリポソーム−ｔａｔ懸濁液の１００μｌを１００μ
ｌの翻訳混合物に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、翻訳反
応物を Antibodies, A Laboratory Manual (上記) に従って調製されたタンパク
質Ａビーズ上にポリクローナル抗−ｔａｔ抗体を含むカラムを通過させた。保持
されたリポソーム複合体の洗浄及び解離、ｍＲＮＡの単離、逆転写ＰＣＲ及び転
写−翻訳の繰り返しはヘインズ及びプルックサン（上記）により記述された通り
であった。
【０２２１】 ｔａｔぺプチド−標識ｍＲＮＡのその後の翻訳と分離のために、プラスミドｐ
ＩＬ５ａ、ｐＩＬ５ａ／ＰＬ２又はｐＰＬ２（「モデルリガンド」ＩＬ５、ＩＬ
５／ＰＬ２融合タンパク質又はＰＬ２単独をコードする）のいずれかから誘導さ
れるｍＲＮＡの部分標品とウサギベータグロブリンｍＲＮＡ（「グロブリン」）
を、プラスミドｐＩＬ５ｂ／ＰＬ１／Ｍ１３／ＴＡＲとｐＤＩＧ／ＰＬ１／Ｍ１
３／ＴＡＲ（「モデル受容体」ＩＬ−５／ＰＬ１融合タンパク質又は抗−ジゴキ
シンｓｃＦｖ／ＰＬ１融合体をコードする）の１：９ｗ／ｗ混合物と１：１ｗ／
ｗ比で混合した。すべての反応は三連で行った。ｍＲＮＡ（ＩＬ−５又はＤＩＧ
）の同一性は、ｐＵＣ１８中の５０のクローンの最少からその後に決定された。
この分析の結果は表５に示す（３回の決定の平均、ＳＤ＜１０％）。表５から、
ＩＬ−５／ＰＬＣリガンドを使用すると、抗−ジゴキシンｓｃＦｖに優る、ＩＬ
−５をコードするｍＲＮＡの強い選択が得られることが示される。このことは、
ＩＬ−５のホモダイマー化がＰＬＣのＰＬ１サブユニットとＰＬ２サブユニット
を結合させリポソームの効率的に溶解させ、そしてＩＬ−５ダイマーと会合した
翻訳複合体において抗−ＩＬ−５ｍＲＮＡに結合するｔａｔの放出を有利にする
ことを示す。
【０２２２】
【表１】
【０２２３】
【表２】
【０２２４】
【表３】
【０２２５】
【表４】
【０２２６】
【表５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 14/16 Ｃ０７Ｋ 14/54 14/54 16/00 16/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ９７２０１８４．２ (32)優先日 平成９年９月24日(1997．9．24) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９７２０５２２．３ (32)優先日 平成９年９月29日(1997．9．29) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９７２０５２５．６ (32)優先日 平成９年９月29日(1997．9．29) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９７２０５２３．１ (32)優先日 平成９年９月29日(1997．9．29) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９７２０５２４．９ (32)優先日 平成９年９月29日(1997．9．29) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ６０／０７０，０６３ (32)優先日 平成９年12月30日(1997．12．30) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０７０，０６２ (32)優先日 平成９年12月30日(1997．12．30) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０７０，０３７ (32)優先日 平成９年12月30日(1997．12．30) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０７０，０５０ (32)優先日 平成９年12月30日(1997．12．30) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ９８０１２５５．２ (32)優先日 平成10年１月22日(1998．1．22) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９８０３８２８．４ (32)優先日 平成10年２月25日(1998．2．25) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９８０７７６０．５ (32)優先日 平成10年４月14日(1998．4．14) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９８１１１３０．５ (32)優先日 平成10年５月23日(1998．5．23) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 グラハム カーター イギリス国、エイビー22 ８ジーユー、ア バディーン、バルゴウニー ドライブ、ア バディーン サイエンス パーク、クロム ビー ロッジ、バイオヴェイション リミ ティッド (72)発明者 アニタ アンネ ハミルトン イギリス国、エイビー22 ８ジーユー、ア バディーン、バルゴウニー ドライブ、ア バディーン サイエンス パーク、クロム ビー ロッジ、バイオヴェイション リミ ティッド (72)発明者 フィオナ スザンヌ アデーヤ イギリス国、エイビー22 ８ジーユー、ア バディーン、バルゴウニー ドライブ、ア バディーン サイエンス パーク、クロム ビー ロッジ、バイオヴェイション リミ ティッド (72)発明者 ステフェン ウイリアムズ イギリス国、エイビー22 ８ジーユー、ア バディーン、バルゴウニー ドライブ、ア バディーン サイエンス パーク、クロム ビー ロッジ、バイオヴェイション リミ ティッド Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA26 CA04 CA09 CA12 EA04 HA01 HA12 HA15 4B033 NA22 NA42 NA45 NB15 NB22 NC04 ND05 ND08 ND12 NF07 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ53 QR56 QR62 QR77 QR80 QR84 QS03 QS25 QS34 QS39 4B064 AG01 AG03 CA02 CA12 CB24 DA13 DA14 4H045 AA11 AA30 CA40 CA45 DA02 DA76 DA86 EA50 FA70 FA74

Claims (57)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 遺伝子ライブラリーを形成する工程、及び続いてスクリーニ
    ングされ得る、個々のタンパク質を合成する工程を含んで成る、タンパク質又は
    ポリペプチドのスクリーニング方法。
  2. 【請求項２】 その個々のタンパク質又はポリペプチドが、（ａ）酵素によ
    るタンパク質修飾について及び／又は（ｂ）一以上の他の分子／リガンドとの結
    合について及び／又は（ｃ）細胞又は組織上の結合活性又は生物学的活性につい
    てスクリーニングされ得るものである請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 その遺伝子ライブラリーが一以上の細胞又は組織からのｍＲ
    ＮＡに由来するものである請求項１又は請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 その遺伝子ライブラリーが、抗体の可変領域の断片等の可変
    可能な分子のライブラリーを含むタンパク質又はポリペプチドをコードするもの
    である請求項１又は請求項２記載の方法。
  5. 【請求項５】 そのタンパク質又はポリペプチドが、細胞又は組織由来の他
    の一以上のタンパク質又はポリペプチドとの結合についてスクリーニングされる
    ものである請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 細胞又は組織由来の、あらゆる結合性のタンパク質又はポリ
    ペプチドそのものが、酵素による修飾についてスクリーニングされるものである
    請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 その遺伝子ライブラリーの個々の構成物が一以上のアレイに
    まず分配され、それにより、各遺伝子が次いで発現して一以上のタンパク質又は
    ポリペプチドアレイを形成するものである請求項１〜請求項６のいずれか１項に
    記載の方法。
  8. 【請求項８】 そのタンパク質又はポリペプチドが、スクリーニングの前に
    固相上に固定化されるものである請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】 その固相がマルチウェルプレートである請求項８記載の方法
    。
  10. 【請求項１０】 その固相が、スライドグラス等の接触する面であり、その
    タンパク質又はポリペプチドがこの面上の特定の位置に固定されるものである請
    求項８記載の方法。
  11. 【請求項１１】 そのタンパク質又はポリペプチドが、インビトロの転写及
    び翻訳によって発現されるものである請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】 そのタンパク質又はポリペプチドが、リボソーム上での提
    示によって発現されるものである請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の
    方法。
  13. 【請求項１３】 そのタンパク質又はポリペプチドが、バクテリオファージ
    上での提示によって発現されるものである請求項１〜１０のいずれか１項に記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】 リボゾーム提示複合体中のｍＲＮＡの、固相上に位置する
    相補的核酸分子とのアニーリングを介して、そのタンパク質又はポリペプチドが
    間接的に固相上に固定化されるものである請求項１２記載の方法。
  15. 【請求項１５】 タンパク質又はポリペプチドをスクリーニングする方法で
    あって、 (i) ＤＮＡ、ＲＮＡ、コロニー又はプラークの形態の遺伝子ライブラリーを形
    成させる工程、 (ii)インビトロ翻訳を用いて、各クローンからの核酸を変換してタンパク質又
    はポリペプチドを形成させる工程、 (iii) マルチウェルプレート中の又は固相上の特定の位置に、各タンパク質又
    はポリペプチドを等量ずつ分配して、タンパク質又はポリペプチドアレイを形成
    させる工程、及び、 (iv)タンパク質若しくはポリペプチドの修飾について又は一以上の抽出物由来
    の一以上の分子との結合についてスクリーニングすることを目的として、(iii)
    で形成されたアレイを、細胞若しくは組織由来の一以上の抽出物と又は一以上の
    細胞若しくは組織そのものと接触させる工程を含んで成る方法。
  16. 【請求項１６】 ｍＲＮＡと直接的に又は間接的に結合する一以上の分子を
    、ｍＲＮＡ、リボソーム及びタンパク質からなる混合物に添加する工程を含む、
    該ｍＲＮＡ、リボソーム及びタンパク質からなる複合体を形成する方法。
  17. 【請求項１７】 その添加される一以上の分子が、ｍＲＮＡ、リボソーム及
    びタンパク質からなる複合体中のタンパク質に結合するものである請求項１６記
    載の方法。
  18. 【請求項１８】 その添加される一以上の分子がタンパク質である請求項１
    ６又は請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 その添加される分子が二重特異性抗体である請求項１８記
    載の方法。
  20. 【請求項２０】 その添加される分子が、ｍＲＮＡとアニールする合成オリ
    ゴヌクレオチドを介してそのｍＲＮＡと結合するものである請求項１８記載の方
    法。
  21. 【請求項２１】 その添加される分子がｍＲＮＡと直接結合するものである
    請求項１８記載の方法。
  22. 【請求項２２】 その合成オリゴヌクレオチドがビオチン部位に付加してお
    り、その添加される分子がストレプトアビジンである請求項２０記載の方法。
  23. 【請求項２３】 その添加される分子が、ＨＩＶｔａｔ（又はその断片）、
    鉄制御タンパク質、Ｌａ抗原又はＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ結合性タンパク質
    である請求項２１記載の方法。
  24. 【請求項２４】 ｍＲＮＡの翻訳開始を阻害する一以上の分子を添加する工
    程をさらに含む請求項１６〜請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 開始を阻害するために添加されるその分子が、シグナル認
    識タンパク質、サイトメガロウイルスｇｐ４８（若しくはその断片）又はＲＮＡ
    ウイルス由来のＲＮＡ結合性タンパク質である請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 タンパク質又はポリペプチドをスクリーニングする方法で
    あって、 (i) ＤＮＡ、ＲＮＡ、コロニー又はプラークの形態で遺伝子ライブラリーを形
    成する工程、 (ii)インビトロ翻訳を行ってタンパク質又はポリペプチドを生産する工程であ
    って、その翻訳反応がｍＲＮＡと直接的又は間接的に結合し、かつｍＲＮＡ、リ
    ボゾーム及びタンパク質又はポリペプチドからなる複合体の形成を促進する分子
    の添加を含むものである工程、 を含んで成る方法。
  27. 【請求項２７】 請求項１〜請求項２６のいずれか１項に記載の方法を実行
    する工程、次に、一以上の提示されるタンパク質又はポリペプチドを標的細胞と
    会合させてその一以上のタンパク質又はポリペプチドをその細胞と結合させる工
    程を含む、生物学的表現型を直接選択する方法。
  28. 【請求項２８】 標的細胞との結合がその標的細胞を結果として変化させ、
    それが次にその標的細胞の単離及び提示されるタンパク質又はポリペプチドをコ
    ードする遺伝子の回収を可能とさせるものである請求項２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 標的細胞との結合が結果として標的細胞を変化させ、それ
    が標的細胞からの一以上の分子の生産、又は生産の中止をもたらし、次いでそれ
    が提示されるタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の回収を可能とす
    るものである、請求項２７記載の方法。
  30. 【請求項３０】 標的細胞が生産する一以上の分子が、複合体の構成物の一
    以上と結合するものである請求項２９記載の方法。
  31. 【請求項３１】 標的細胞が生産する一以上の分子が、生きている微生物の
    その後の生存に要求されるものである請求項２９記載の方法。
  32. 【請求項３２】 微生物がバクテリオファージ又は細菌である請求項３１記
    載の方法。
  33. 【請求項３３】 標的細胞が生産する一以上の分子がその細胞から放出され
    そしてその結果リポソームから他の分子の放出が起こるものである請求項２９記
    載の方法。
  34. 【請求項３４】 細胞に与える変化によって、その細胞上の細胞表面マーカ
    ーの出現又は消失が生ずる結果となるものである請求項２８記載の方法。
  35. 【請求項３５】 標的細胞由来の分子が、ＨＩＶのｔａｔ等のＲＮＡ結合性
    ポリペプチドである請求項３０記載の方法。
  36. 【請求項３６】 標的細胞由来の分子が、バクテリオファージポリペプチド
    又は抗生物質若しくは薬剤の耐性酵素／因子又は必須栄養素である請求項３１記
    載の方法。
  37. 【請求項３７】 請求項１〜請求項２６のいずれか１項に記載の方法を実行
    する工程、次に、細胞又は組織の表面レセプターと結合する修飾されたリガンド
    の近傍に一以上の合成タンパク質又はポリペプチドを持ってきて、その合成タン
    パク質又はポリペプチドを細胞／組織の表面上で標識化する工程を含んで成る、
    タンパク質又はポリペプチドのスクリーニング方法。
  38. 【請求項３８】 その提示されるタンパク質又はポリペプチドが、細胞表面
    分子を単離するために用いられるものである請求項３７記載の方法。
  39. 【請求項３９】 そのリガンドがタンパク質であり、かつ標識の全体又は一
    部として機能し得るか標識化反応を開始し得る一以上の他の分子への付着により
    修飾されるものである請求項３７又は請求項３８記載の方法。
  40. 【請求項４０】 ホスホリパーゼＣがリガンドに付着しており、リガンドの
    細胞又は組織表面への結合の後にリポソームが加えられ、それによりホスホリパ
    ーゼＣがリポソーム内容物を放出する結果となるものである請求項３９記載の方
    法。
  41. 【請求項４１】 リポソームがストレプトアビジン、ＨＩＶｔａｔ、シグナ
    ル認識粒子（ＳＲＰ）、抗体（若しくはその断片）、特定のｍＲＮＡ若しくはタ
    ンパク質結合性分子、Ｆ線毛又はニッケルを含むものである請求項４０記載の方
    法。
  42. 【請求項４２】 西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又は
    ポーリンがリガンドに付着しているものである請求項３９記載の方法。
  43. 【請求項４３】 細胞又は組織表面上の一以上の分子を標識化し単離する方
    法であって、 (i) 細胞／組織表面上に修飾されたリガンドを結合し、平行して合成タンパク
    質／ポリペプチドのライブラリーを結合する工程、 (ii)リガンドからの標識化反応を開始し、それによりリガンド近傍の合成タン
    パク質／ポリペプチドを標識化する工程、 (iii) 合成タンパク質／ポリペプチド上の標識を用いて、合成タンパク質／ポ
    リペプチドをコードする遺伝子を回収する工程、及び (iv)細胞／組織表面上の、合成タンパク質／ポリペプチドが結合した分子を単
    離することを目的として、回収された遺伝子を用いて個々の合成タンパク質／ポ
    リペプチドを形成させる工程、 を含んで成る方法。
  44. 【請求項４４】 請求項１〜請求項２６のいずれか１項に記載の方法を実行
    する工程、及び合成タンパク質又はポリペプチドをリガンドと会合させて、その
    タンパク質又はポリペプチドとそのリガンドとの間の結合を生じさせ、次に合成
    タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の回収を可能とする工程を含む
    、リガンド結合性タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を単離する方
    法。
  45. 【請求項４５】 回収が合成タンパク質／ポリペプチド及びリガンドの一方
    又は両方を具備する分子タグを用いることによって達成されるものである請求項
    ４４記載の方法。
  46. 【請求項４６】 そのリガンドが、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の
    方法によって生産されたタンパク質又はポリペプチドそのものである請求項４４
    又は請求項４５記載の方法。
  47. 【請求項４７】 タンパク質又はポリペプチドの両方が同じｍＲＮＡ分子に
    コードされているものである請求項４６記載の方法。
  48. 【請求項４８】 その分子タグが、タンパク質又はポリペプチドをコードす
    るｍＲＮＡと結合するＨＩＶのｔａｔである請求項４４〜請求項４７のいずれか
    １項に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 その分子タグがポリヒスチジンペプチドである請求項４４
    〜請求項４７のいずれか１項に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 一つのタンパク質又はポリペプチド上のその分子タグがＨ
    ＩＶのｔａｔであり、他のタンパク質又はポリペプチド上のものがポリヒスチジ
    ンペプチドである請求項４６又は請求項４７記載の方法。
  51. 【請求項５１】 個々のタンパク質又はポリペプチドが、会合して酵素活性
    を与えるものである請求項４４記載の方法。
  52. 【請求項５２】 その酵素活性がβ−ガラクトシダーゼ又はホスホリパーゼ
    Ｃである請求項５１記載の方法。
  53. 【請求項５３】 個々のタンパク質又はポリペプチドが、会合して転写アク
    チベーター又は転写リプレッサーを与えるものである請求項４６又は請求項４７
    記載の方法。
  54. 【請求項５４】 個々のタンパク質又はポリペプチドが、生きている微生物
    内で会合して、その微生物に対し正の選択又は負の選択を与えるものである請求
    項４６又は請求項４７記載の方法。
  55. 【請求項５５】 請求項１〜請求項２６のいずれか１項に記載の、提示され
    たタンパク質又はポリペプチドのライブラリーを形成する工程、リガンドのライ
    ブラリーを形成する工程であって、タンパク質又はポリペプチドのライブラリー
    及びリガンドのライブラリーがそれぞれ同一又は異なる分子タグを与えられる工
    程、タンパク質又はポリペプチドのライブラリーとリガンドのライブラリーとを
    会合させる工程、及び、該分子タグの単離の一以上の工程によってリガンド結合
    性のこれらタンパク質又はポリペプチドを単離する工程を含んで成る、リガンド
    結合性タンパク質をコードする遺伝子の単離方法。
  56. 【請求項５６】 提示されたタンパク質を同定することを目的として、リガ
    ンド結合性のこれらタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子が回収され
    るものである請求項５５記載の方法。
  57. 【請求項５７】 請求項１〜請求項２６のいずれか１項に記載の方法によっ
    て生産される、タンパク質／ポリペプチドのアレイ又はライブラリー。
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