JP2001514844A - ベロ細胞に適応させた弱毒化日本脳炎ウィルスおよび日本脳炎ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ベロ細胞における継代操作によってベロ細胞に適応させた弱毒化日本脳炎ウィルス、およびその弱毒化日本脳炎ウィルスを含む日本脳炎ワクチンに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

『発明の属する技術分野』 本発明は、ベロ細胞における継代操作によってベロ細胞に適応させた弱毒化日
本脳炎ウィルス、およびその弱毒化日本脳炎ウィルスを含む日本脳炎ワクチンに
関する。

【０００１】 『発明の背景および従来技術の説明』 日本脳炎（ＪＥ）は、アジアの公衆衛生において非常に重要な、蚊媒介のアル
ボウイルス疾患である。アジア大陸においては、年間３５，０００件を越える症
例および１０，０００人を越える死者が報告されているが、公式の報告が実症例
数を過少に見積もっていることに疑いはない（Ｔ．オクノ、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａ
ｌｔｈ Ｓｔａｔ Ｑ、３：１２０〜３１、１９７８；Ｔ．ウメネイら、Ｂｕｌ
ｌ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇ．６３：６２５〜３１、１９８５）。日
本脳炎は、発熱を伴う頭痛症状、無菌性髄膜炎または脳炎を呈し、生残者の約半
数が恒久的な神経学的および精神医学的後遺症を有する傾向にある（Ｄ．Ｓ．ブ
ルケら、アルボウイルス：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ
３：６３〜９２．１９８８；Ｔ．Ｐ．モナース、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６３〜
８１４、１９９０）。

【０００２】 ＪＥウイルスは、フラビウイルス科に属する６６のウイルスの一種であり、エ
ンベロープを有すると共に、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡをゲノムとするＲＮＡウイ
ルスであって、主にベクターによって運ばれる（Ｔ．Ｊ．チャンバースら、Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６４９〜８８、１９９０）。形態学的
には、フラビウイルスは直径約４０ｎｍの球状で、カプシド（Ｃ）タンパク質と
複合化した１１ｋｂのゲノムを含むヌクレオカプシドを包囲する脂質二重層で構
成されている（Ｃ．Ｍ．ライスら、サイエンス２２９：７２６〜３３、１９８５
）。膜表面の突起はグリコシル化エンベロープ（Ｅ）タンパク質および膜（Ｍ）
タンパク質からなる。細胞内の発生期のビリオンに存在するプレＭグリコプロテ
インは開裂して、Ｍタンパク質となるが、これは成熟した細胞外ビリオン中に見
出される。重要な生理活性は５３ｋｄのＥタンパク質に関連するものであり、こ
れには血球凝集、ウイルス中和、ビリオンアッセンブリー、膜融合および細胞レ
セプターへのウイルス結合が含まれる（Ｅ．コシニら、Ｖｉｒｏｌ．１８８：７
１４〜２０、１９９２）。

【０００３】 ヒトに対するＪＥワクチンは三種類存在する（Ｔ．ツァイら、Ｖａｃｃｉｎｅ
ｓ ６７１〜７１３、１９９３）。これら三種のうち、マウスの脳で生産される
不活化ＪＥワクチンのみが国際的に入手可能なものである。一製造者、即ち大阪
大学微生物病研究財団（微研）が、国際的に流通している不活化ＪＥワクチンの
大部分を生産しており、このワクチンは１９９２年に米国で許可され、コンノー
ト・ラボラトリー社によりＪＥ−ＶＡＸ（商標）という名称で頒布されている。
一次ハムスター腎細胞（ＰＨＫ）中で調製される不活化ＪＥワクチンおよび弱毒
化ＪＥ生ワクチンは、中国のみで流通している。

【０００４】 マウスの脳で生産される不活化ＪＥワクチンは、１９５４年に日本で許可され
た。このワクチンは幼年マウスの脳への注射によって生産されるため、製造に手
間がかかり、また、ワクチン関連の神経病理学的副作用の可能性も懸念された。
引き続き製造プロセスを改良することによってワクチンの純度と効力は増大した
ものの（Ａ．オーヤ、Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａ
ｃｔｉｃｅ ６９〜８２、１９７５；Ａ．オーヤ、Ａｃｔａ Ｐｅｄｉａｔｒ
Ｊｐｎ．３０：１７５〜８４、１９８８；Ｋ．タカク、Ｂｉｋｅｎ Ｊ．１１：
２５〜３９、１９６８）、最近まで中程度の頻度で局所的反応や軽度の全身反応
が報告されている（Ｃ．Ｈ．ホークら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３１９
：６０８〜１４、１９８８；Ｊ．Ｄ．ポーランドら、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ
．１６１：８７８〜８２、１９９０；Ｊ．Ｌ．サンチェスら、Ｌａｎｃｅｔ ３
３５：９７２〜７３、１９９０）。注射部位の局所圧痛、発赤および／または腫
脹が２０％のワクチンで起きている。軽い全身的症状、主に頭痛、軽度の発熱、
筋肉痛、倦怠感および胃腸の症状が１０〜３０％のワクチンで報告されている。
明らかに新しいタイプの副作用としては、蕁麻疹、血管浮腫、呼吸困難、多形紅
斑、結節性紅斑および重度の神経病理学的疾患が、１９８９年以来、主にオース
トラリア、ヨーロッパ、および北アメリカでワクチン接種した旅行者において報
告されている（Ｍ．Ｍ．アンダーソンら、Ｌａｎｃｅｔ．３３７：１０４４、１
９９１；Ｔ．Ａ．ラッフら、Ｌａｎｃｅｔ．２２８：８８１〜２、１９９１）。
更に、１９９２年および１９９５年にオータキは、ＪＥワクチン接種後に、磁気
共鳴イメージ（ＭＲＩ）の変化を伴う急性伝搬性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）を発症し
た子供の７例について報告した（Ｅ．オータキら、Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏ
ｌ．８：１３７〜９、１９９２；Ｅ．オータキら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒ
ｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ５９：３１６〜７、１９９５）。また、動
物の脳組織を含有する狂犬病ワクチンの接種により重度の神経病理学的合併症が
引き起こされたことも注目に値する（Ｓ．Ａ．プロトキンら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ
６６１〜２、１９９４）。これらの理由からＷＨＯは、ＪＥワクチンの開発の
優先度を高いものとしている。

【０００５】 更に最近になって、中国の不活化ＪＥワクチンおよび弱毒化ＪＥ生ワクチンが
有効であり、ウイルス中和抗体の高力価を引き出し確実な防御作用を与えること
が判明した（Ｔ．ツァイら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ６７１〜７１３、１９９３）。
しかし、この中国製ワクチンの製造に用いたＰＨＫ細胞は、世界保健機構（ＷＨ
Ｏ）によるウイルスワクチン製造のための認可をうけておらず、また、先進国で
はヒト用途として許可されていない。ワクチン製造に一次ハムスター細胞を用い
る主な欠点は、ワクチンの品質に関する不確実さである。仮に病原体に汚染され
ていないハムスターを用いたとしても、動物は予期せず感染する可能性があり、
ワクチン製造には問題である。また、時として、この種の感染は長期間検出され
ないこともある。これらの批判をもとに、ワクチンの広範囲の使用に関して信頼
を得るためには、ワクチンの安全性に関する一層注意深い研究が必要である。一
次細胞からワクチンを製造する他の欠点は、ウイルス採取率が低いことと大量生
産が不可能な高いコストである。

【０００６】 上記に鑑み、ヒト用ワクチン基材として受け入れられてきたベロ細胞やヒト二
倍体細胞等の標準的な細胞系を用いて、良好な費用効果をもって製造できる新規
ＪＥワクチンが切望されている。ベロ細胞はサル腎由来の形質転換細胞であるが
、腫瘍原細胞ではない。ベロ細胞系は、より容易に大規模細胞培養に適合させる
ことができると共に形質転換細胞として恒久の寿命を有する点において、他の標
準的な細胞系に比べより有利である。

【０００７】 このたび、ＪＥウイルスはベロ細胞培養において生育可能であることが見出さ
れた。ＪＥワクチンの分野において、大容積の細胞培養を可能ならしめる標準的
な細胞を用いてワクチンを製造するために、かなりの努力がなされてきた。にも
かかわらず、遺伝的安定性、収率、およびベロ細胞を用いた培養によるワクチン
の商品化に必要なプロセスを含むウイルスの特徴づけはこれまでにヒト用ワクチ
ンの要求に合致するものではなかった。これらの事実および他のウイルス培養に
おいて得られた知識をＪＥウイルスに適用する困難性から、先行技術においては
、遺伝的に安定で且つ連続細胞系からの高い免疫原性を有するＪＥウイルスワク
チンの開発は成功していなかった。これらの全研究者の中で、本背景に述べた基
準を満足する新規ワクチン製造に成功した者は唯一人としていなかった。

【０００８】 本発明は、マウス脳細胞系や一次細胞系中で産生されたＪＥウイルスにおける
過去の問題点を克服したワクチン製造のために、連続細胞系であるベロ細胞を用
いてＪＥウイルスを開発・増殖させることを提案するものである。また、本発明
は、ＪＥウイルスを培養するために開発された方法および費用効果の良いワクチ
ン製造の下流プロセスを特定するものである。

【０００９】 更に本発明は、従来の市販ＪＥワクチンを以下の点で改善した方法を特定する
ものである。

【００１０】 １．安全性： 本発明ウイルスはベロ細胞培養によってビルレンスを獲得しな
かったことより、製造における危険性を減少し、ウイルス不活化プロセス全体に
亘って厳格な制御を行った場合の安全性レベルを超えるより高い安全性レベルを
レシピエントにもたらす。この長所は、従来の市販ＪＥワクチンによっては決し
てもたらされていなかった。

【００１１】 ２．より安全な製造用細胞基材中での供給の増加： 本発明のＪＥワクチンは
ウシ血清を用いずに製造するので、従来の市販ＪＥワクチンでは達成し得なかっ
た高収率、安価、規模調節可能な製造を実現する。

【００１２】 ３．低反応原性： 本発明のＪＥワクチンには、ゼラチン安定剤を添加しない
ため、既存のワクチンに見られるようなワクチン反応のリスクは低減する（Ｍ．
サカグチら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ６８〜６９、１９９８）。更に、既存のＪＥワ
クチンに含まれる好ましくないウシ由来成分が効果的に除去される。すなわち、
本発明のこの安全性の観点は、従来の市販ＪＥワクチンによっては決してもたら
されていなかった。

【００１３】 ４．効力増大：ベロ細胞を用いた規模調節可能な製造およびサプリメント不要
の製造が成功したことは、効果的な精製と相まって、有効なアジュバントをＪＥ
ワクチンに処方することを可能とした。ワクチンの処方におけるアジュバントの
使用は他のワクチンには行われていたものの、既存のＪＥワクチンの製造安全性
は保障されていなかったため、この知識をＪＥワクチンに適用することは困難で
あった。

【００１４】 結論として、これまでに、ＪＥワクチンの商品化にあたり上記諸利点を満足す
る新規なワクチンを見い出した者はなかった。

【００１５】 従って、本発明の一目的は、多くの国での受容可能性を向上するために、標準
的な細胞基材中で生産される安全で効果的なＪＥワクチンを提供することである
。本発明の更なる目的は、高度に精製された安定なワクチンを製造し且つ少量の
抗原で高度な免疫原特性を有するワクチンを処方するための、効果的なプロセス
を提供することである。

【００１６】 『発明の概要』 本発明は、その一様相において、ベロ細胞に継代接種することによりベロ細胞
に適応させた弱毒化日本脳炎ウィルスを提供する。特許手続上の微生物の寄託の
国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、本発明の弱毒化日本脳炎ウィルス
（本明細書においてＣＪ５０００３と記す）を、１９９８年４月２０日、韓国微
生物培養センター（大韓民国、ソウル所在）における恒久保存用に寄託した。そ
の継代培養物は、受託番号ＫＣＣＭ−１０１２５の下で保管庫から入手可能であ
る。

【００１７】 本発明は、他の一様相においては、ベロ細胞に継代接種することによりベロ細
胞に適応させた弱毒化日本脳炎ウィルスを含む日本脳炎ワクチンを提供する。

【００１８】 上に記載した、またその他の本発明の特徴、様相および効果は、以下の記述、
特許請求の範囲、および添付図面を参照することにより、より良く理解されるで
あろう。

【００１９】 『好適な実施例の詳細な説明』 本発明は、ＪＥワクチンを調製するのに望ましい性質を有するＪＥウイルス株
に関する。このウイルスは弱毒化ウイルスであり、連続細胞系、即ちＷＨＯがヒ
ト用ワクチン製造に用いる細胞基材として認めたベロ細胞中で増殖可能である。
従って、現行のワクチンよりも安全な不活化ＪＥワクチンおよび弱毒化ＪＥ生ワ
クチンの製造に、本ウイルスを使用できることが期待される。

【００２０】 本発明は、現在の要求を満足するワクチンを提供する。ＪＥウイルスは３５℃
以下における連続的な継代操作により、ベロ細胞に適応させた。ベロ細胞中にお
けるこの連続的継代操作によって、培養上清１ｍｌあたり１０⁷ｐｆｕを超える までに向上したウイルス力価を得、ピークウイルス力価を示すに至る培養時間を
短縮した。本発明は、サプリメントとしての血清を必要としない、高ウイルス生
産収率をもたらす多数回採取プロセスの開発に係る。高ウイルス生産収率は、同
ワクチンを費用効果良く大規模に製造するために商業的に適した性質である。本
発明に従えば、ウイルス培養における多数回採取プロセスにより、感染細胞の細
胞変性効果（ＣＰＥ）度が減少する。本発明のＪＥワクチンは、ＣＰＥレベルを
減少させたため、残存細胞由来物質は極く少量しか含まない。更に本発明のＪＥ
ワクチンは、現行のＪＥワクチンと比較してより高い免疫原性とより優れた疾病
防御効果をもたらすと期待される。本発明の精製ＪＥワクチンは、培養ベロ細胞
より得た精製ウイルスがヒト用ワクチンの開発要求に合致するという点において
、現行のＪＥワクチンより非常に有利である。

【００２１】 本発明はまた、このワクチンの調製方法に関する。本方法は、同ワクチンの高
生産性、高純度および有効性を提供する。ＪＥウイルスＣＪ５０００３は、ＪＥ
ウイルスＳＡ１４−１４−２（ＰＤＫ）を３５℃以下の温度で４回以上継代させ
てベロ組織培養細胞に適応させ、ベロ細胞および／またはＬＬＣ−ＭＫ２細胞に
生成したフォーカスの数に基づいてウイルスの増殖をモニターしながら培養ウイ
ルスを選択することにより得られる。適応化によって得たウイルスは、ベロ細胞
培養における培養上清の１×１０⁷ｐｆｕ／ｍｌ以上のピークウイルス力価を有 し、採取までのインキュベーション時間が短縮される。ＪＥウイルスＳＡ−１４
−１４−２は、蚊由来の野生ＪＥウイルス株ＳＡ１４を一次ハムスター腎（ＰＨ
Ｋ）組織培養細胞または一次イヌ腎（ＰＤＫ）組織培養細胞に適応させて得る（
ケネス Ｈ．エッケルスら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ６５１３〜５１８、１９９８）
。しかし、ＰＨＫ細胞およびＰＤＫ細胞はＷＨＯに承認されておらず、ヒトに適
用するワクチンの調製には適さない。ベロ細胞はＷＨＯによってヒトへの使用が
認められているので、ベロ適応化ＪＥウイルス株、ＣＪ５０００３は、ヒトワク
チン製造のための良好な基材である。

【００２２】 ＳＡ１４−１４−２（ＰＤＫ）ウイルスはフラビウイルス科に属し、物理化学
的性質が、一本鎖で、５’メチル化末端と３’末端を有しポリＡ構造を有さない
プラス鎖ＲＮＡをゲノムとするＲＮＡウイルスであることが知られている。ＲＮ
Ａゲノムのサイズは約１１ｋｂで、このゲノムは１３，５００Ｄａのヌクレオカ
プシド（Ｃ）タンパク質と結合した状態にある。更に、このウイルスは、８，７
００Ｄａの膜（Ｍ）タンパク質、５３，０００Ｄａのエンベロープ（Ｅ）タンパ
ク質、およびＮＳ１、２ａ、２ｂ、３、４ａ、５等の非構造的タンパク質を含む
。

【００２３】 ベロ適応ＪＥウイルス株ＣＪ５００３は、ベロ細胞に３０回を超えて継代させ
た。ウイルス力価およびプラークの形態は継代によって変化せず、このウイルス
が安定な表現形特性を有することを示唆している。

【００２４】 ＪＥウイルスＣＪ５００３の生物学的特性の分子的基礎を考察するために、当
該ウイルスの物理化学的性質を分析した。ウイルスゲノムの塩基配列をｃＤＮＡ
クローニングおよびシークエンシングで決定した。この結果、ＳＡ１４−１４−
２（ＰＤＫ）ウイルスのＥタンパク質遺伝子の１０３２、１５０６および１７０
４位の三箇所のアデニン塩基および１７６９位のグアニン塩基が、ＪＥＣＪ５０
００３ウイルス中の三つのグアニンおよびチミンによってそれぞれ置換されてい
ることが見出された。従って、Ｅタンパク質のアミノ酸配列は、１９位のスレオ
ニン、１７７位のスレオニン、２４３位のリシンおよび２６４位のグルタミンが
アラニン、アラニン、グルタメートおよびヒスチジンにそれぞれ変化した。Ｅタ
ンパク質におけるアミノ酸変化は、少なくとも本発明者らによる研究の期間中は
、ベロ細胞へのウイルスの継代を通して維持されていた。

【００２５】 ベロ細胞における継代数が異なるウイルスを若年マウス脳内に注射したが、Ｊ
ＥウイルスＣＪ５０００３によるマウスの死亡例はなかった。従って、ベロ適応
化ＪＥウイルスＣＪ５０００３は、神経毒性(neurovirulence)がないか、あって
も極く微弱な弱毒化安定ウイルス株であると言える。この性質は、このウイルス
をＪＥウイルス生ワクチンおよび／または弱毒化ワクチンに使用する重要な点の
ひとつである。

【００２６】 本発明は、未精製または中間純度の素材を凍結することなく細胞培養からウイ
ルスを精製する方法をも提供する。本発明方法は、細胞破砕物を除去し；ウイル
スを濃縮し；細胞由来物を沈澱させ更にショ糖勾配超遠沈によりウイルスを精製
し；勾配を分画化し；ウイルスの分画をアッセイする工程を含む。より具体的に
は、本発明は、血清タンパク質サプリメントの存在下または非存在下、連続細胞
系中で高力価になるまでウイルスを増殖させ；遠沈によりウイルスを精製し；ウ
イルス陽性分画をプールすることによって精製ＪＥウイルスを製造する方法を提
供する。

【００２７】 本発明ウイルスはベロ組織培養細胞中で増殖する。ローラー瓶中でコンフルエ
ントとなったベロ細胞をＣＪ５０００３ウイルスに感染させ、インキュベートす
る。ウイルスは、多数回採取法で採取可能である。培養上清の採取は、感染のｍ
ｏｉに従って感染後２または３日の時点で開始し、新鮮培地を培養物へ再度供給
した。この培養物を二日間インキュベートした後、培養上清を再度採取した。採
取は、ウイルス力価が培養上清の１０⁷ｐｆｕ／ｍｌを超えるレベルに維持され るように、感染後８日または９日までに４回まで繰り返すことが可能である。多
数回採取法により、単位ローラー瓶当たりの高いウイルス収率を得られるので、
本発明は市場原理により合致したものになる。更に、このプロセスにより感染細
胞のＣＰＥ度が低下する。ＣＰＥレベルが低下すると、本発明ＪＥワクチン中に
残留細胞由来成分が非常に少なくなる。採取した培養上清は精製開始まで４℃で
貯蔵することが可能である。採取した培養上清の清澄は、低速遠沈、例えば、１
５００ｇで１０分間等の当技術分野で知られている普通の方法、および／または
ポアサイズ０．４５のフィルターを用いた濾過によって行うことができる。採取
した培養液は、濃縮まで４℃で貯蔵する。ウイルスを濃縮するためには、培養液
を限外濾過し、残留物を回収する。他の濃縮方法においては、ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）８０００を培養液に１０％までの濃度で溶解させ、生じた沈澱
をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）等の適切なバッファーに溶解す
る。ＤＮＡその他の細胞由来物を除去するために、硫酸プロタミン沈澱を行う。
硫酸プロタミン沈澱は、硫酸プロタミンを濃縮ウイルス溶液に添加し、高速遠沈
を例えば１２，０００ｇで５分間行うことにより可能である。ウイルスを更に精
製するためには、密度勾配遠沈を、１５〜６０％連続または多段階のショ糖勾配
で行う。ショ糖勾配は分画化し、得られた各分画のウイルスアッセイを行う。ウ
イルス陽性分画のアッセイ方法の例としては、プラークアッセイ、血球凝集アッ
セイ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の他、イムノアッセイ等の抗原アッセイ
が挙げられる。更なるプロセスに付す分画は、ウイルス力価の高さと他の不純物
のレベルの低さに基づきプールした。プールされた精製ウイルスの純度はベロ細
胞由来染色体ＤＮＡおよびタンパク質の試験により見積もった。その結果、宿主
細胞ＤＮＡおよびタンパク質の含有量は、精製ＪＥウイルス５μｇ当たりそれぞ
れ２．５ｐｇおよび２ｎｇと低く、前記の本精製方法によって、ウイルス抗原か
ら他の不純物を効果的に除去できたことが示された。感染培養液ｌＬから得られ
るＪＥウイルスの収量は、約２．３ｍｇと見積もられる。

【００２８】 本発明は、ウイルスの抗原性を維持しつつ、その感染力を失わせるためにＪＥ
ウイルスを不活化する方法をも提供する。この方法は、有効量のホルムアルデヒ
ドを添加し、ＪＥウイルスが不活化されるような一定の条件下でをホルムアルデ
ヒドと共にウイルスをインキュベートすることを含む。具体的には、分画プール
を、ＰＢＳ等の適切なバッファーを用いて適切なタンパク質濃度まで希釈し、ホ
ルムアルデヒドを希釈分画プールに添加した。ホルムアルデヒドとのインキュベ
ーションは２２℃および４℃で行った。ウイルスの抗原性を失うこなく、その感
染力を完全に失わせるためには、２２℃および４℃においてそれぞれ少なくとも
４日または４６日間必要であった。大規模培養を簡便に行うために２２℃におけ
るＪＥウイルスの不活化プロセスを選択し、インキュベーション時間は、安全の
ための余裕を考慮して７日まで延長した。しかし、不活化剤として有効であった
ものは、ホルムアルデヒドに限定されない。一般に、不活化は化学的手段または
物理的手段により達成できる。化学的不活化は、ウイルスを、例えば酵素、β−
プロピオンラクトン、エチレンイミンまたはその誘導体およびＴｗｅｅｎ、Ｔｒ
ｉｔｏｎ、デオキシコール酸ナトリウム、スルホベタイン等の有機溶媒で処理す
ることで実行できる。不活化物質は、必要ならば後で中和する。即ち、ホルムア
ルデヒド不活化物は例えば、チオサルフェートで中和できる。物理的不活化は、
ウイルスをＵＶ光、Ｘ線、γ線等の高エネルギー線に曝露して行うのが好ましい
。

【００２９】 ＪＥワクチンは、注射剤として液状溶液または懸濁液のいずれかに調製する。
炭水化物（ソルビトール、マンニトール、でんぷん、ショ糖、グルコース等）、
タンパク質（アルブミン、カゼイン等）、タンパク質含有剤（ウシ血清、スキム
ミルク等）およびバッファー（アルカリ金属リン酸塩等）の安定化剤を添加でき
る。この製剤は安定剤を添加した後、凍結乾燥でき、真空または窒素下で貯蔵可
能である。必要ならば、アジュバント作用を有する一種以上の化合物を添加する
ことができる。この目的に好ましい化合物としては、アルミニウムの水酸化物、
リン酸塩または酸化物、鉱油（バイオール、マーコール５２等）およびサポニン
が挙げられる。更に、必要ならば、Ｔｗｅｅｎ、スパン等の一種以上の乳化剤も
ウイルス材料に添加する。

【００３０】 アジュバントの有効性は、不活化ウイルスを含み、アジュバントにも吸収され
ているワクチンを投与することで得られるウイルスに対する中和抗体の量を測定
して決定した。有効なアジュバントの例としては、水酸化アラムに限定されない
。得られたワクチンの効力を、ワクチンで免疫したマウスの血清を用いたプラー
クリダクション中和（ＰＲＮＴ）および神経毒性を有するウイルスを用いた免疫
マウスで直接調査した。その結果、このワクチンは、比較ワクチンと同程度また
はより高い中和抗体を惹起する効力を有していた。

【００３１】 様々な継代数のベロ適応化ウイルスの免疫原性における各種変化を調査するた
めに、異なる継代数でワクチンを調製し、各々のワクチンの効力を比較した。ベ
ロ細胞中での継代操作を継続したものの中で、継代数が異なるウイルスから調製
したワクチン間における効力の顕著な差異はなかった。従って、ベロ適応化ウイ
ルス株ＣＪ５０００３は安定な免疫原性を有すると言える。

【００３２】 以下、実施例により本発明のベロ細胞適応弱毒化ＪＥウイルスおよび本発明の
該弱毒化ＪＥウイルスを含むＪＥワクチンを説明する。上記説明と以下の実施例
から、当技術分野の熟練者であれば本発明を完全に実施できるであろうことは明
らかである。

【００３３】 実施例１ ベロ細胞におけるＳＡ１４−１４−２（ＰＤＫ）ウイルスの適応化 犬の腎細胞培養中での継代数８のＪＥＳＡ１４−１４−２（ＰＤＫ）、ＳＡ１
４−１４−２ウイルスを用いて、ベロ細胞培養中で連続継代操作を行った。細胞
一個当たり０．１ｐｆｕのｍｏｉで、ベロ細胞単層に、ＪＥ ＳＡ１４−１４−
２（ＰＤＫ）を接種した。約５%ＣＯ₂含有空気雰囲気中、温度は約３５℃以下、
通常３２℃から３５℃、好ましくは３５℃で、ウシ胎児血清１０%を加えたイー グル最小必須培地からなる培養液５ｍｌの入った、２５ｃｍ²培養フラスコ中で 感染細胞を培養した。細胞変性効果（ＣＰＥ）の顕微鏡観察、および、血清吸着
アッセイ（ＨＡ）、プラークアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ
）等の、ウイルス抗原の存在を調べる様々なアッセイにより、ウイルスの増殖を
モニターした。ウイルス力価がピークとなる接種後５日目に、ＪＥウイルスを採
取し、遠沈により清澄した。清澄した上清から、単一プラークを精製し、ベロ細
胞中で増幅した。更なる継代操作のために、その増幅したウイルスを、ベロ細胞
に再度感染させた。上述したように、継続的なウイルス感染、タイトレーション
、プラーク形成により、引き続き継代数３０まで継代手続きを行った。図１に示
すように、ウイルス力価は、ベロ細胞への継代数４で、培養上清１ｍｌ当たり４
×１０⁷ｐｆｕに達し、更なる継代でもこのレベル近くに維持された。更に、ウ イルスの最適採取期間が、継代数１での５日から、継代数４では２〜３日に減少
した。ウイルス収率が１０⁵ｐｆｕ／ｍｌから１０⁷ｐｆｕ／ｍｌへと著しく増加
したことと、インキュベーション時間が減少したことから、ＪＥワクチン候補の
調製用出発物質として、ベロ細胞へのＪＥ継代数４を選択した。ベロ細胞中にお
けるこのＪＥ継代数４は、ＣＪ５０００３（Ｖｅｒｏ、ＰＳ４）と命名された。
略記ＰＳは、指定した細胞でのウイルス継代数を意味する。

【００３４】 実施例２ ＣＪ５０００３ウイルスの特徴付け；エンベロープ遺伝子の配列決定と神経毒性
の研究 ＣＪ５０００３株の生物学的特徴を分子レベルで考察するため、主要な中和化
エピトープを持つエンベロープ（Ｅ）遺伝子をコードする１５００のヌクレオチ
ドの配列を決定し、親ワクチン株、即ちＳＡ１４−１４−２（ＰＤＫ）、ＳＡ１
４−１４−２（ＰＨＫ）および野生型ＳＡ１４ウイルスのヌクレオチド配列と比
較した（Ｓ．アイヒラ、ら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ、５：９５〜１０９、１９
９１；Ｈ．ニーら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．７６：４０１〜４０７、１９９５
；Ｈ．ニーら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．７６：４０９〜４１３、１９９５；Ｓ
．ニタヤファンら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７：５４１〜５４２、１９９０）。
ＣＪ５０００３ウイルス（ベロ、ＰＳ４）を配列分析に用いた。その結果、Ｃ末
端領域（アミノ酸２８０−５００）は完全に保存されているのに対し、Ｎ末端領
域（アミノ酸１−２７９）はウイルス株間で配列に変化のあることが明らかにな
った。Ｎ末端領域における突然変異は、ほぼ均一に分布していた。ＣＪ５０００
３のＥタンパク質遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＡ１４／ＣＤＣと比較して、
８つのヌクレオチドおよび７つのアミノ酸が異なっており、一方、ＳＡ１４−１
４−２（ＰＤＫ）は、ＳＡ１４／ＣＤＣと比較して、７つのヌクレオチドと５つ
のアミノ酸が異なっていた。その結果を表１に示す。

【００３５】 ＣＪ５０００３ウイルスの配列は、ＳＡ１４−１４−２（ＰＤＫ）ウイルスの
刊行物記載の配列と以下の５点で異なる。即ち、１０３２位、１５０６位、１７
０４位、１７６９位でヌクレオチドが変化し、その結果、ＳＡ１４−１４−２（
ＰＤＫ）とＣＪ５０００３ウイルス間で４つのアミノ酸が異なった。一方、９８
９位でのヌクレオチドの変化はアミノ酸の置換をもたらさなかった。ＣＪ５００
０３ウイルスのより高い継代数、即ち継代数１５および３０においては、付加的
なヌクレオチド変化は見られなかった。即ち、ＣＪ５０００３と親ウイルスであ
るＳＡ１４−１４−２（ＰＤＫ）との間で明確な５つのヌクレオチド変化と４つ
のアミノ酸変化があり、これらの変化は、細胞培養におけるこのウイルスの継代
を通し安定して起こる。他の弱毒化されたＪＥウイルスと比較して特徴的に異な
っているＳＡ１４−１４−２（ＰＤＫ）の２４３位にあるリシン残基は、ＣＪ５
０００３ではグルタミン酸残基によって置換された。

【００３６】 ＣＪ５０００３の配列は、刊行物記載のＳＡ１４−１４−２（ＰＨＫ）ウイル
スの配列とも異なる（Ｓ．アイヒラ、ら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ、５：９５−
１０９、１９９１）。１０３２位におけるヌクレオチドの相違はＥ１９位でのア
ミノ酸の相違を引き起こしたが、ヌクレオチドの９８９位における変化は、アミ
ノ酸置換を引き起こさなかった。ＣＪ５０００３ウイルスにおける１５０６位お
よび１７０４位でのヌクレオチドは、ＳＡ１４−１４−２（ＰＨＫ）のその位置
におけるヌクレオチドと同じであったが、一方、ＳＡ１４−１４−２（ＰＤＫ）
のその位置におけるヌクレオチドとは異なっていた。ＣＪ５０００３およびＳＡ
１４−１４−２（ＰＨＫ）Ｅ遺伝子のＮ末端領域における置換のパターンは、Ｅ
１９位でのアミノ酸置換を除いて殆ど同じである。

【００３７】 ＳＡ１４−１４−２（ＰＨＫ）、ＳＡ１４−１４−２（ＰＤＫ）およびＣＪ５
０００３ウイルスにおいては、その親ウイルスであるＳ１４ウイルスの配列と比
較して、Ｅ１０７、Ｅ１３８、Ｅ１７６およびＥ２７９の各位置での４つのアミ
ノ酸が同様に置換されている。これらの内、Ｅ１３８およびＥ１７６の位置にあ
るアミノ酸は（Ｈ．ニーら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ７６：４０９−４１３
、１９９５）弱毒化に寄与することが知られていたが、ベロ適応化の後も保存さ
れており、このことから、ＣＪ５０００３は弱毒化された性質を失っていないこ
とが示された。

【００３８】

【表１】

【００３９】 ＣＪ５０００３およびその親ウイルスであるＳＡ１４−１４−２（ＰＤＫ）の
マウスにおける神経毒性については、４週令のＢＡＬＢ／ｃマウスへの大脳内（
ｉ．ｃ．）注射によって評価した。結果を表２に示す。若年成熟マウスの致死率
は、ＳＡ１４−１４−２（ＰＤＫ）およびＣＪ５０００３ウイルス間で有意差は
無く、また、野生種ＳＡ１４ウイルスの致死率と比較しても非常に低い。このこ
とから、ベロ細胞基材へ導入してもＳＡ１４−１４−２（ＰＤＫ）には神経毒性
の表現型が付与されず、またＣＪ５０００３ウイルスには弱毒化された性質がな
お存在することが明らかになった。

【００４０】

【表２】

【００４１】 実施例３ ウイルスの増殖および精製 生産のための種ウイルスはベロ細胞におけるウイルス継代数５［ＣＪ５０００
３（ベロ、ＰＳ５）］を用いて調製し、ディープ・フリーザーに保存した。ベロ
細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ギブコ製）含有イーグル最小必須培地（Ｅ
ＭＥＭ、ギブコ製）で増殖させた。ベロ細胞単層のローラー瓶培養は、細胞一個
当たり０．０１〜０．１ｐｆｕのｍｏｉで種ウイルスに感染させることによって
行った。ウイルス吸着を２時間実施した後、培地をＰＢＳで３回洗浄し、血清を
含まないＥＭＥＭを添加し、３５℃でインキュベートした。感染ベロ細胞の培養
において、感染２〜３日目には、ウイルスの力価は約１０⁷〜１０⁸ｐｆｕ／ｍｌ
に達した。感染２〜３日目から始めて８〜９日目まで２日間隔で４回、ウイルス
を採取したが、ウイルスの力価は１０⁷ｐｆｕ／ｍｌを超えた値で維持され、Ｃ ＰＥも非常に弱かった。しかし、感染から９日後に力価は１０⁷ｐｆｕ／ｍｌを 下回った（図２）。プールされた採取物は、８，０００ｒｐｍで１５分間遠沈操
作を行い、上清は０．４５μｍのフィルターを用いて濾過した。ウイルス培養上
清は限外濾過（ウルトラセッテ、フィルトン、１００ｋ）またはＰＥＧを用いた
沈降によって濃縮した。ＰＥＧによって沈降したウイルスは遠沈によって採取し
、ＰＢＳまたはＳＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ）緩衝液中に浮遊させた。限外濾過後の保持物（retentat
e）は２５０ｍｌまで濃縮し、カセットは１００ｍｌのＰＢＳで洗浄した。ウイ ルス濃縮物は、０．５〜２ｍｇ／ｍｌの硫酸プロタミンおよび１０，０００ｒｐ
ｍ、５分間の遠沈操作によって得られた上清を添加した後、氷中で２時間冷却し
た。濃縮したウイルスは、ショ糖勾配超遠沈によって精製した。超遠沈は３８，
０００ｇで１８時間行った。分画を界面活性ドデシル硫酸ナトリウム含有ポリア
クリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上の電気泳動に付した。ヌクレオカプシ
ドタンパク質（Ｃ、１３，５００Ｄａ）、膜タンパク質（Ｍ、８，７００Ｄａ）
およびエンベロープタンパク質（Ｅ、５３，０００Ｄａ）のバンドがＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで見られた（図３、パネルＡ）。エンベロープ抗原（Ｅ）はマウス抗ＪＥ
ウイルスモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットによって検出された（
図３、パネルＣ）。ウイルス陽性の分画である分画Ｎｏ．４〜９については、銀
染色ゲルでは、ウイルス性タンパク質を除いた他のタンパク質バンドは明確では
なかった（図３、パネルＢ）が、これらの分画をプールして、ローリー法による
タンパク質濃度分析を行った。結果の詳細を感染ベロ培養から得た二種類の精製
物について示すが、この内の一方は接線流（tangential flow）限外濾過によっ て濃縮し、もう一方はＰＥＧ８０００沈降によって濃縮したものである（表３お
よび４）。精製したウイルスは２倍量のＰＢＳで希釈し、最終濃度０．０１％の
Ｔｗｅｅｎ８０に添加した後、０．２２μｍのフィルターを用いて濾過した。

【００４２】

【表３】

【００４３】

【表４】

【００４４】 各ウイルス調製物について、比活性測定値（即ち、ｐｆｕ／ｍｇタンパク質）
によって相対純度を比較した。限外濾過による濃縮物から精製したウイルスはＰ
ＥＧ８０００沈降による濃縮物から精製したウイルスとほぼ同等の活性を有した
。また、プールした精製ウイルスの純度は、ベロ細胞由来の染色体ＤＮＡおよび
タンパク質を調べることによって評価した。その結果、濃縮方法とは関係無く、
宿主細胞ＤＮＡおよびタンパク質の量は、精製ＪＥウイルス５μｇ当たりそれぞ
れ２．５ｐｇ、２ｎｇ程度と低かったが、このことは、上記のいずれの精製方法
においてもウイルス性抗原から他の不純物が効果的に除去されることを示してい
る。しかし、精製ウイルスのタンパク質収率に関しては、限外濾過を用いた精製
方法の方がＰＥＧ８０００沈降を用いた精製方法に比べて２倍優れている。

【００４５】 実施例４ ウイルス不活化 精製ウイルスはＰＢＳによる透析後、弱毒化ワクチンの調製用に直接使用する
か、または、不活化ワクチンの調製用にホルムアルデヒドを用いて不活化した。
０．０１８％ホルムアルデヒドを用いた不活化は２２℃または４℃で行った。サ
ンプルを一定の間隔で採取し、プラークタイトレーションによって感染性ウイル
スの有無に関し直接アッセイした（図４）。直接プラークアッセイによって陰性
であったサンプルは、低レベルのウイルスを増幅するためベロ細胞単層上でブラ
インド継代操作を実施した後、再プラークキングに付した。感染力を完全に不活
化させるには２２℃で４日間、４℃では４６日間必要であることが確認された（
表５および６）。不活化の際、精製ウイルスの抗原性は、抗原スポットブロット
アッセイおよびポリクローナル抗血清を用いたサンプル評価によってモニターし
た。このアッセイの結果、０．０１８％ホルムアルデヒドに２２℃で最高１０日
間、４℃で最高１５日間曝露した後、検出可能な抗原性の喪失は見られなかった
。

【００４６】 これらの条件下でのホルムアルデヒドを用いた不活化は、２２℃で少なくとも
７日間、４℃で６０日間実施し、余裕をもって安全性を確保した。不活化した後
、サンプル中の遊離ホルムアルデヒドは０．０３８％のメタ重亜硫酸ナトリウム
を添加することによって中和した。同時に、ＰＢＳを用いた透析を行った後、０
．２２μｍのフィルターを用いて濾過した。

【００４７】

【表５】

【００４８】

【表６】

【００４９】 実施例５ マウスにおけるＣＪ５０００３精製不活化ウイルス（ＰＩＶ）および弱毒化ウイ
ルス（ＬＡＶ）の免疫原性 ＬＡＶおよびＰＩＶの免疫原性は、予め市販のビケン（Biken）不活化ワクチ ンを用いてマウスにて評価した。一群２０匹からなる６週令のＢＡＬＢ／ｃマウ
スに対し、三種類の免疫原によって腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫を行った。免疫はア
ジュバントを用いずに２週間間隔で２回接種して行った。２回目の免疫の２週間
後、血清を各グループのマウスから採取して、プールした後、ＰＲＮＴ法を用い
て中和抗体の存在を調べた（表７）。表７に示すように、三種類の免疫原を投与
されたグループ間で中和抗体の力価について有意差は無かった。

【００５０】

【表７】

【００５１】 ＰＩＶの免疫原性を、更にマウスにて評価した。成熟同系マウスを、アラム（
alum）アジュバントを使用してまたは使用せずに不活化したウイルスの希釈物（
各希釈倍率）で免疫した。一群２０匹からなる６週令のＢＡＬＢ／ｃマウス２０
匹に対し、生理食塩水または水酸化アルミニウムを含む生理食塩水（Ｒｅｈｙｄ
ｒａｇｅｌ）にＰＩＶを５００、５０および５ｎｇ溶解した液を用いて皮下に免
疫した。マウスへの免疫は、３週間間隔で２回行った。２回目の接種から３週間
後、各グループのマウスから血清をプールした後、中和ウイルスとしてマウス脳
で継代させた中山株を用いて中和抗体の存在を評価した（表８）。いずれの用量
においてもＰＩＶはビケンワクチンより優れており、またアジュバントによって
、ＰＩＶ５０ｎｇおよび５００ｎｇに対するマウスの免疫応答がそれぞれ約４倍
、８倍と有意に高まった。

【００５２】

【表８】

【００５３】 次いで、ＰＩＶのインビボでの防御効力（protective efficacy）をＢＡＬＢ ／ｃマウスにて評価した。防御アッセイにあたり、一群１０匹からなる３週令の
ＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、各マウスの臀部に、生理食塩水または水酸化アルミ
ニウムを含む生理食塩水（Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ）に溶解した不活化ＪＥウイル
スを皮下接種した。週令を合わせた（age-matched）対照群マウスにはＰＢＳま たはアラムに溶解した非特異性抗原を接種した。３週間後、マウスを等量投与で
ブーストした。免疫から３週間後に、ＰＢＳ３０μｌに溶解したマウス神経毒性
(neurovirulent)ＪＥウイルス（中山、マウス脳適応）５００ｐｆｕをマウス に脳内接種してチャレンジした。脳内接種したマウスの罹患率と死亡率を毎日モ
ニターし、それを２１日間続けた。表９に示すように、ＰＩＶ５０ｎｇで免疫し
たマウスは防御率９０％を示した。更に、アラムと混合したＰＩＶを５０ｎｇ、
５ｎｇ免疫したマウスはそれぞれ１００％、７０％の防御率を示した。一方、１
／１００のビケンワクチンは免疫したマウスのちょうど５０％しか防御しなかっ
た。これに対し、対照グループの全マウスは、脳内接種によるチャレンジ後５〜
７日目には罹患および死亡し始めた。

【００５４】

【表９】

【００５５】 ベロ細胞での継代操作を通したＣＪ５０００３ウイルスの免疫学的安定性を調
査するため、ベロ細胞中で継代させた各種継代数のウイルスを各々精製し、各ウ
イルスの免疫原性を表８に記載の方法で評価した。表１０に示すように、ベロ細
胞における各ウイルス継代数のウイルスから調製したワクチン間で、中和抗体を
誘発させる能力における顕著な差は無かった。このことは、ベロ細胞を用いた継
代操作において、ＣＪ５０００３ウイルスが免疫原性について非常に安定である
ことを示している。

【００５６】

【表１０】

【００５７】 ここに示した結果より、不活化ＪＥウイルスワクチンおよびＣＪ５０００３株
を用いた弱毒化ワクチンのいずれも有用であることがわかった。ベロ細胞内でＪ
Ｅウイルスを増殖させ、濃縮し、ヒトの使用に適する程度まで精製し、そして測
定可能な抗原性の喪失が無いように不活化する、比較的迅速で効率的なプロセス
が開発された。これらのワクチン調製物は、マウスにおいて免疫原性を有すると
共に防御を与えることが判明した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ベロ細胞におけるＪＥウイルスＳＡ１４−１４−２（Ｐ
ＤＫ）の継代数と適応化を示す。０．１ｍｏｉのＳＡ１４−１４−２（ＰＤＫ）
株をベロ細胞単層に接種し、その５日後、継代数１のウイルス１を採取した。ベ
ロ細胞単層上でのプラークアッセイにより、そのＪＥウイルス力価を測定した。
実施例１に記載のように、継続的なウイルス感染とタイトレーションにより、継
代数１のウイルスを出発物質として、引き続き継代数３０まで継代培養した。

【図２】 図２は、感染後３日〜１７日の間で１日おきに採集したローラー
瓶中のＪＥウイルスＣＪ５０００３を示す。ベロ細胞単層は、細胞当たり０．０
１プラーク形成単位（ｐｆｕ）の感染効率（ｍｏｉ）で感染させた。ウイルスを
３５℃で２時間吸着させた後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、無血清ＥＭＥＭ１０
０ｍｌを加え、３５℃でインキュベートした。接種後３日〜１７日の間４８時間
ごとに、培養上清を新鮮な無血清ＥＭＥＭと交換した。採取したウイルスの感染
力のタイトレーションは、ベロ細胞単層上のプラーキングにより行った。

【図３】 図３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるショ糖勾配超遠沈とウェスタン
ブロッティングによって精製したＪＥウイルスＣＪ５０００３の分析結果を示す
。濃縮培養上清６０ｍｌを、１５〜６０％のショ糖勾配液４０ｍｌに適用し、１
２℃で１８時間、２２，０００ｒｐｍで回転する４５Ｔｉローターで遠沈した。
チューブ底部から２ｍｌの試料を得、４〜２０％の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付
し、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移行させた。タンパク質をクー
マシーブリリアントブルー（パネルＡ）或いは硝酸銀（パネルＢ）で染色して可
視化した。抗原は、ＪＥウイルスのＥタンパク質に反応するモノクロナール抗体
との反応により可視化した（パネルＣ）。レーン１は、上から順に２５０、９８
、６４、５０、３６、３０、１６、６ｋＤａの分子量を示す予め染色した標準タ
ンパク質標品（Ｎｏｖｅｘ Ｓｅｅｂｌｕｅ（商標））、レーン２〜１０は超遠 沈後の下から３〜１１番目の分画、Ｅはエンベロープタンパク質、Ｃはカプシド
タンパク質、Ｍは膜タンパク質を示す。

【図４】 図４は、精製ＪＥウイルスＣＪ５０００３のホルムアルデヒドに
よる不活化速度論を示す。４℃または２２℃で０．０１８％のホルムアルデヒド
を用いて精製ＪＥウイルス調製物を不活化した。所定時間に採取した試料の残存
感染性ウイルスを、ベロ細胞単層上の直接プラーキングによりタイトレートした
。更に、以下のようにして増幅アッセイを行い、低レベルのウイルスを検出した
。ベロ細胞単層を含むフラスコを２つ用意し、ウイルスが不活化された時点でこ
れらに試料を接種した。３５℃で２時間吸着させた後、細胞に再フィーディング
し、３５℃でインキュベートした。細胞には、感染の７日後および１４日後にフ
ィーディングした。感染性ウイルスを検出するため、培地を採取し、プラーキン
グを行った。独立した２つの実験における不活化の時点を示す：４℃（黒四角）
、２２℃（黒丸）。対照として熱による不活化（ホルムアルデヒドを用いない）
も平行して行った（４℃：白四角、２２℃：白丸）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 キム、ヒュン、スー 大韓民国、134−766、ソウル特別市、カン ドン−ク、ジル・２−ドン、シンドン− Ａ・アパートメント、32−707 (72)発明者 ヨー、ワン、ドン 大韓民国、156−020、ソウル特別市、ドン ジャク−ク、ダエバン−ドン、ダエリム・ アパートメント、108−1001 (72)発明者 キム、ソー、オク 大韓民国、138−160、ソウル特別市、ソン パ−ク、ガラク−ドン、プラザ・アパート メント、10−601 (72)発明者 リー、スン、ヒー 大韓民国、442−372、キュンギド、スーウ ォン、パルダル−ク、マイタン・２−ド ン、ハンクック・アパートメント、102− 808 (72)発明者 ムーン、サン、ブム 大韓民国、467−810、キュンギド、イーチ ェオン、マジャンミュン、ドゥクピュン リ、サン・522−１ (72)発明者 ホン、スン、ピョ 大韓民国、449−840、キュンギド、ヨンギ ン、スジ−ウプ、ジュキュンリ、339、ダ エジン・アパートメント、106−502 (72)発明者 シン、ヨン、チェオル 大韓民国、137−761、ソウル特別市、セオ チョー−ク、バンポ・１−ドン、サムホガ ーデン・アパートメント、２−809 (72)発明者 チュン、ヨン、ジュ 大韓民国、156−011、ソウル特別市、ドン ジャク−ク、シンダエバン・１−ドン、ヒ ュンダエ・アパートメント、104−1504 (72)発明者 エッケルス、ケネス、エイチ アメリカ合衆国、20307−5100、ワシント ン、ディーシー、ウォルター、リード、ア ーミー、インスティテュート、オブ、リサ ーチ内 (72)発明者 イニス、ブルース アメリカ合衆国、20307−5100、ワシント ン、ディーシー、ウォルター、リード、ア ーミー、インスティテュート、オブ、リサ ーチ内 (72)発明者 プットナック、ジョセフ、アール アメリカ合衆国、20307−5100、ワシント ン、ディーシー、ウォルター、リード、ア ーミー、インスティテュート、オブ、リサ ーチ内 (72)発明者 ビン、レオナルド、エヌ アメリカ合衆国、20307−5100、ワシント ン、ディーシー、ウォルター、リード、ア ーミー、インスティテュート、オブ、リサ ーチ内 (72)発明者 スリバスタバ、アショック、ケイ アメリカ合衆国、20307−5100、ワシント ン、ディーシー、ウォルター、リード、ア ーミー、インスティテュート、オブ、リサ ーチ内 (72)発明者 デュボイス、ドリア、アール アメリカ合衆国、20307−5100、ワシント ン、ディーシー、ウォルター、リード、ア ーミー、インスティテュート、オブ、リサ ーチ内 Ｆターム(参考） 4B065 AA90X AA96X BA14 CA45 4C085 AA03 BA62 CC04 CC08 DD01 DD02 DD03 DD23 DD42 EE05 GG04

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ベロ細胞における継代によってベロ細胞に適応させた弱毒化
   日本脳炎ウイルス。
2. 【請求項２】 ベロ細胞内の多重度が１×１０（７）ＰＦＵ／ｍｌより大き
   く、若年成熟マウスのＬＤ₅₀／ｐｆｕが０．０００００１未満であることを特徴
   とする請求項１に記載の弱毒化日本脳炎ウイルス。
3. 【請求項３】 弱毒化日本脳炎ウイルスがＣＪ５０００３であることを特徴
   とする請求項１または２に記載の弱毒化日本脳炎ウイルス。
4. 【請求項４】 請求項１に記載の弱毒化日本脳炎ウイルスを含有することを
   特徴とする日本脳炎ワクチン。
5. 【請求項５】 ウイルスが不活化剤によって不活化されていることを特徴と
   する請求項４に記載の日本脳炎ワクチン。
6. 【請求項６】 ウイルスが不活化剤によって処理されていない弱毒化生日本
   脳炎ウイルスであることを特徴とする請求項４に記載の日本脳炎ワクチン。
7. 【請求項７】 医薬として許容される添加物を更に含有することを特徴とす
   る請求項４または請求項５または請求項６に記載の日本脳炎ワクチン。