JP2001511797A - 創傷の治癒 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、創傷治癒の速度を増加する、創傷治療のための潜在性関連ペプチドまたはその機能的類縁体の使用に関する。このような治療に好適な作用剤として、潜在性ペプチドを発現している細胞から単離された該ペプチドおよびその機能的類縁体が挙げられる。

Description

【発明の詳細な説明】 創傷の治癒 本発明は、創傷の治癒に関する。 成人における創傷治癒は、複雑な修復プロセスである。たとえば、皮膚の治癒 プロセスは、創傷部位における種々の特殊細胞の漸増、細胞外マトリックスおよ び基底膜の蓄積、血管形成、選択的プロテアーゼ活性および再上皮形成を含んで いる。 創傷の治癒を促進する医薬を提供する必要がある。たとえば、急性創傷陣（刺 し傷、火傷、電気的外科手術の結果生じる神経損傷または創傷など）、慢性創傷 （糖尿病性潰瘍形成、静脈潰瘍形成および床ずれ潰瘍形成など）または一般に治 癒が困難となっている個体（老年者など）の場合、治癒進度の増進を所望される ことが多い。これらの例において、創傷は、生命の状況に重大な影響を及ぼし、 死に至らしめることさえもあるので、臨床的に可能な限り、治癒進度の増進が必 要とされる。 本明細書で用いる語句「創傷」は、皮膚への損傷を意味するがこれに限定され るものではない。他のタイプの創傷には、肺、腎臓、心臓、腸、腱または肝臓な どの内部組織あるいは臓器への障害、損傷または外傷が含まれる。 創傷治癒、瘢痕形成および線維性障害の分野において、最近幾つかの発展が見 られる。これらの発展の幾つかは、成長因子が組織の修復に深くかかわっている という最近の知識に関連するものである。特に、トランスフォーミング成長因子 β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーが、創傷治癒において重要な役 割を演じることが発見されている。少なくとも２５個の分子が、該ＴＧＦ−βス ーパーファミリーのメンバーであることがわかっている。これらには、ＴＧＦ− β１〜５、ＤＶＲグループ（ｄｐｐおよびＶｇなど）、骨形態形成因子、ノーダ ル、アクチビンおよびインヒビンといったような多数のサイトカインが含まれる 。 ＴＧＦ−β（および該スーパーファミリーの他のメンバー）は、潜在性ＴＧＦ −βとして知られるプロタンパク質として細胞から分泌される。該プロタンパク 質は、Ｎ末端潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ：Latency Associated Peptide）およ びＴＧＦ−βからなり、スモール潜在性複合体と呼ばれる。さらに、該スモール 潜在性複合体は、潜在性ＴＧＦ−β結合タンパク質（ＬＴＢＰ）と呼ばれる種々 の大きさの他のペプチド（異なる遺伝子から誘導されたもの）に結合することが でき、この場合、該複合体全体はラージ潜在性ＴＧＦ−β複合体として知られて いる。 プロタンパク質が細胞外環境に分泌されると、ＴＧＦ−βからＬＡＰ（および ＬＴＢＰ）がタンパク質分解的に分割される。ＬＡＰから解離されたときにＴＧ Ｆ−βは活性化される。この解離は、マンノース−６−ホスフェート／インスリ ン様成長因子ＩＩ受容体（Ｍ６Ｐ−Ｒ）で調整することができ、プラスミンなど のプロテアーゼ、組織トランスグルタミナーゼによって細胞表面に結合されてい る基質が関わっている。フリーラジカルおよび活性酸素なども、ＬＡＰからの解 離を引き起こすことによってＴＧＦ−βを活性化することができる。 ＴＧＦ−β（特にＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２）は、創傷治癒を促進する が、瘢痕形成および線維症にも関連している。事実、ＴＧＦ−βの調節における 臨床的対象は、瘢痕形成を軽減する（このことは、創傷治癒速度を遅くするが） ためにその活性を阻害することに関わっている。たとえば、ＷＯ９２／１７２０ ６は、トランスフォーミング成長因子β１およびβ２の活性を阻害し、瘢痕形成 を軽減するのに特に有用である組成物を開示している。 当該技術分野における他の発展として、マンノース−６−ホスフェートを、Ｔ ＧＦ−βの濃度上昇に関連した線維性障害の治療に使用することが挙げられる（ ＧＢ２２６５３１０）。マンノース−６−ホスフェートは、Ｍ６Ｐ−Ｒにおける ＬＡＰからのＴＧＦ−βの解離を競合的に妨げることによって、ＴＧＦ−βの活 性化を阻害し、線維症および瘢痕形成を予防すると考えられる。 ＷＯ９１／０８２９１およびＷＯ９４／０９８１２は、ＴＧＦ−β活性の調節 におけるＬＡＰの役割に関するものであり、ＬＡＰおよびラージ潜在性ＴＧＦ− βそれぞれの製造方法について開示している。これらの文献は、ＴＧＦ−βに結 合し、ＴＧＦ−βを潜在状態にもどすことによってＴＧＦ−βの活性をアンタゴ ナイズまたは中和するためのＬＡＰの使用も提供する。この拮抗作用によって創 傷形成後の瘢痕形成が軽減されることが主張されている。 本発明の第１の態様は、創傷治癒速度を増加するための医薬の製造に潜在性関 連ペプチド、またはその機能的類縁体を使用することである。 本発明の第２の態様は、創傷部位に治療上有効量の潜在性関連ペプチドまたは その機能的類縁体を適用することを特徴とする、創傷治癒速度を増加する方法で ある。 本発明で用いる潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）は、少なくとも１つのＴＧＦ− βスーパーファミリーのメンバーを潜在状態に維持する能力を有する、ＴＧＦ− βスーパーファミリーの分子のプロタンパク質のＮ末端領域である。ＬＡＰは、 ＴＧＦ−βを潜在状態に維持する能力を有するものが好ましく、ＴＧＦ−β１お よび／またはＴＧＦ−β２を潜在状態に維持しうるものが最も好ましい。 本発明にしたがって、発明者らは、創傷治癒速度を増加するためにＬＡＰを使 用しうることを確立した。我々は、たとえば皮膚において、ＬＡＰまたはその類 縁体が、皮膚の治癒速度を増加すること（すなわち、ＬＡＰを創傷に適用すると 、開口した創傷が、より速く閉じること）を見出した。この治癒速度の増加は、 創傷部位における種々の特殊細胞（線維芽細胞、白血球など）の漸増、細胞外マ トリックスおよび基底膜の蓄積、血管形成、選択的プロテアーゼ活性および再上 皮形成のいずれかによって、さらに特徴付けることができる。 一般に受容されている、上述のＴＧＦ−βとＬＡＰとの相互作用から見ると、 これは驚くべき発展である。先行技術の教示にしたがって、ＬＡＰが、ＴＧＦ− βの効果をアンタゴナイズするかまたは中和し、瘢痕形成および／または線維症 を軽減することが予測される。常套的に、このような効果によって創傷治癒速度 が低下すること（たとえば、皮膚の切開創傷が閉じるのが遅くなること）もまた 予測される。 本発明は、予想に反してＬＡＰが創傷治癒速度を増加することを明らかにした 本発明者らの実験に基づいている。これらの発見から、ＬＡＰが、実際にＴＧＦ −β（および関連分子）の創傷治癒効果を促進し、少なくとも創傷治癒に関して は、ＷＯ９１／０８２９１に示唆されたようにＴＧＦ−βをアンタゴナイズまた は中和しないことことが理解されるにいたる。 発明者らはいずれの仮説による強要も望まないけれども、ＬＡＰが創傷治癒速 度の増加において効果的であるためのメカニズムが、ＬＡＰがＴＧＦ−βに結合 し、タンパク質分解的崩壊から保護されることによるものである可能性があると 考えている。このことから、通常は創傷治癒の間に存在する活性ＴＧＦ−β（特 に、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２）が一次的に抑制されているという結果が 導かれる。この一次的に抑制されたＴＧＦ−βは、次いで、創傷内へ放出されて ＴＧＦ−βが治癒を促進する時間をとおして、その半減期を効果的に増加する蓄 えとなる。 我々は、創傷治癒速度を増加するために、ＬＡＰを投与することによって外来 性のＴＧＦ−βが使用できるという利点が提供されることを見出した。ＴＧＦ− βは創傷治癒速度を増加し、瘢痕形成または線維症を誘発するので、外来性のＴ ＧＦ−βを投与すると、受諾しがたい瘢痕形成または線維症を引き起こしうる、 ＴＧＦ−βの濃度の不適切な局所的増大が起こる。ＬＡＰまたはその機能的類縁 体の投与は、このような逆効果をもたらすことがなく、外来性のＴＧＦ−βの活 性を調節するのみである。したがって、ＬＡＰまたはその機能的類縁体は、不適 切な瘢痕形成または線維症を引き起こすことなく創傷治癒速度を増加することに おいて特に有用である。 我々は、ＬＡＰおよびその機能的類縁体が、急性創傷（刺し傷、火傷、電気的 外科手術の結果生じる神経損傷または創傷など）を含む種々の創傷の治癒速度を 増加しうることを見出した。しかし、ＬＡＰは慢性創傷の治療に用いられること が好ましい。このような慢性創傷の例として、糖尿病性潰瘍形成、静脈潰瘍形成 および床ずれ潰瘍形成などが挙げられる。ＬＡＰの好ましい使用は、一般に治癒 が困難となっている個体（老年者など）に対してである。 外来的に発現されたＬＡＰのアミノ酸を、ＬＡＰペプチドの機能的特性を無効 にすることなく、容易に修飾、置換または欠失しうることが理解されよう。した がって、ＬＡＰの機能的類縁体は本発明において簡便に使用することができる。 これらの類縁体は、一般に、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーに結合す ると、該メンバーを潜在状態に戻し、ＴＧＦ−βをタンパク質分解的崩壊および ／またはクリアランスから保護する。このような類縁体の例は、外来性ＬＡＰま たは外来性ＬＡＰの化学的修飾体のＴＧＦ−β結合特性を保持する、遺伝子的に 修飾されたＬＡＰの変異体である。他の類縁体は、ＴＧＦ−βスーパーファミリ ーのメンバーに対してＬＡＰと同様の結合親和性をもつ、化学的に合成された化 合物である。本明細書における機能的類縁体には、ＴＧＦ−βスーパーファミリ ーのメンバーに対してＬＡＰの結合親和性を保持するＬＡＰフラグメントも包含 される。 ＴＧＦ−βスーパーファミリーの異なるメンバーから誘導されたＬＡＰは、ア ミノ酸配列においては種々の変化を呈するが、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの メンバーに対して結合し、該メンバーを潜在状態に戻すことができるという機能 的特徴を依然として保持することもまた理解されよう。 本発明に用いるＬＡＰまたはそのタンパク質類縁体は、ＴＧＦ−βスーパーフ ァミリーの少なくとも１つのメンバーを発現する組織または培養細胞から得られ る。組織または細胞が、ＴＧＦ−βを発現するのが好ましく、ＴＧＦ−β１また はＴＧＦ−β２を発現するのが最も好ましい。 別法として、ＬＡＰまたはそのタンパク質類縁体は、遺伝子工作されてＬＡＰ またはそのタンパク質類縁体を発現する細胞から（たとえばＷＯ９１／０８２９ １に開示されているように）、あるいは遺伝子工作されてＬＡＰまたはそのタン パク質類縁体を発現するトランスジェニック動物から得ることができる。トラン スジェニック動物がＬＡＰまたはそのタンパク質類縁体を分泌するのが理想的で ある。たとえば、トランスジェニック哺乳動物は、その乳にＬＡＰまたはそのタ ンパク質類縁体を分泌する。 治療用途のために充分な量のＬＡＰを産生源から簡便に産生することができる ので、遺伝子工作された細胞由来の組換えＬＡＰを本発明に使用するのが好まし い。この組換えＬＡＰは外来性ＬＡＰと同じアミノ酸配列をもつことができる。 別法として、ＬＡＰを必要に応じて修飾してもよい。たとえば、ＬＡＰのＣｙｓ ３３を変異させてセリン残基にして望ましくないジスルフィド結合の形成を防止 することができる。 本発明組成物は、特に該組成物が用いられるべき作法に応じて多くの異なる形 態をとることができる。したがって、たとえば、組成物は、液剤、軟膏、クリー ム剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、粉剤、エアロゾル剤またはインプラント可能なデ バイス（バイオポリマー（コラーゲンまたはプロテオグリカン）スポンジに複合 させたものなど）の形態であってよい。 局所適用用医薬が好ましい。該医薬は、皮膚または創傷への局所適用に用いる のに最も適している。 医薬のビヒクルは、患者にとって充分に寛容であり、ＬＡＰまたはその機能的 類縁体を創傷へ放出するものであるべきであることが理解されよう。該ビヒクル を滅菌し、賦形剤および／または安定化剤ならびにＬＡＰおよびその機能的類縁 体と組み合わせて医薬を形成するのが理想的である。このようなビヒクルは、生 体崩壊性、生体分解性、生体吸収性および／または非炎症性であることが好まし い。 本発明組成物は、多くの経路で使用しうる。したがって、たとえば、創傷の治 癒を調節するために、患者の創傷の内部および／または周囲に適用することがで きる。本発明組成物を“現存する”創傷に適用する場合、医薬的に許容し得るビ ヒクルは炎症応答を引き起こさないような、あるいは組織に対する毒性がないよ うな“刺激性の少ない”ものである。 本発明の医薬は、治療される創傷を覆うかまたは包むのに用いる滅菌包帯また はパッチ剤として提供してもよい。 本発明の医薬は、該医薬をよく放出する植え込み可能なデバイスとして提供す ることもできる。たとえば、該医薬は、デバイスの生理的溶解または崩壊によっ て放出される。別法として、超音波などの外部刺激によって植え込み体からＬＡ Ｐまたはその機能的類縁体を放出させることができる。該医薬は、（たとえば適 当なリンカーを用いるデバイスの結合によって）活性を現状に維持するような植 え込みデバイスに配合してもよい。 本発明組成物は、体内創傷の治癒にも適用しうる。したがって、たとえば、該 組成物を、肺の創傷治癒に用いるための吸入剤として製剤するか、または体内創 傷の治癒を促進するために臓器（肝臓または腸など）に適用することができる。 本発明医薬は、予防剤としても使用しうる。たとえば、本発明医薬は、外科手 術によって形成される創傷の治癒を調節するために、外科手術の前に使用するこ とができる。この場合、局所適用された組成物のビヒクルは、皮膚のケラチン層 を透過しうるものであることが必要である。この目的に適当なビヒクルとして、 ジメチルスルホキシドおよび酢酸が挙げられる。また、本発明医薬は、皮内注射 によって創傷形成前に予防的に投与することもできる。ＬＡＰまたはその機能的 類縁体がＬＡＰそれ自身または他のタンパク質類縁体である場合、注射による投 与が特に好適である。 創傷治癒の速度を増加するのに必要なＬＡＰまたはその機能的類縁体の量は、 化合物の生物学的活性およびバイオアベイラビィティなどの複数の因子、さらに 投与形態ならびにＬＡＰまたはその機能的類縁体の生理化学的特性に依存するこ とが理解されよう。他の因子として、 Ａ)治療される特定の容体； Ｂ)容体の重篤度 Ｃ)迅速治癒または瘢痕形成軽減のいずれを所望するか； Ｄ)患者の年齢； Ｅ)処置される患者における化合物の半減期； が挙げられる。 また、投与頻度は、上記因子、特に、処置された患者の体内における化合物の 半減期によって影響される。 一般に、治療される患者は、創傷形成後３日以内、好ましくは４８時間以内、 、さらに好ましくは２４時間以内、なおさらに好ましくは１２時間以内に投与さ れる場合に、ＬＡＰまたはその機能的類縁体のに適用によって恩恵を受ける。組 成物を存在する創傷に用いる場合、ＬＡＰまたはその機能的類縁体は、創傷が生 じた直後に投与すべきである。ＬＡＰまたはその機能的類縁体を用いる療法は、 臨床医が満足する創傷治癒結果が得られるまで継続すべきである。 急性の創傷および回復しやすい患者（若者など）の創傷に対しては、ＬＡＰま たはその機能的類縁体は、創傷形成時、好ましくは、創傷形成後１２時間以内、 遅くとも２、３日以内に適用するのが理想的である。慢性創傷または回復しにく い創傷（老年者など）に対しては、できるだけ早くに投与を行うべきであるが、 これらの創傷は長期間存在しているので、ＬＡＰを数週間後に使用しても、患者 は恩恵を受けることができる。 予防的に使用する場合（たとえば、外科手術前）、ＬＡＰまたはその機能的類 縁体は、創傷形成が確認されたらできだけ早くに、特に創傷治癒の進度が遅いと いうリスクがある場合（老年者の患者の場合など）すぐに、投与すべきである。 たとえば、電気的外科手術が行われる予定であり、その後の創傷治癒の速度を増 加したい患者の皮膚の部位に、ＬＡＰまたはその機能的類縁体を含有するクリー ム剤または軟膏剤を適用する。この場合、患者に手術前処置をしているとき、ま たは、外科手術の数時間前もしくは数日前に、（患者の健康状態および年齢なら びに形成される予定の創傷の大きさに応じて）組成物を適用するのが望ましい。 投与頻度は、使用する化合物の生物学的半減期によって決定する。典型的には 、創傷部位における化合物の濃度が、治療効果を得るのに適した濃度に維持され るように、標的組織にＬＡＰまたはその機能的類縁体を含有するクリーム剤また は軟膏剤を投与すべきである。このためには、一日一回投与または一日数回投与 が必要である。 製薬業界において通例用いられる公知の操作（インビボ実験用、臨床施療用な ど）を用いて、特定の組成物を配合し、厳密な（化合物の一日投与量および投与 頻度について）治療養生法を行う。 通常、本発明医薬を使用する場合、ＬＡＰ１ｎｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは １μｇ〜１ｍｇを含む医薬を、直線創傷１センチメートルに対し、適用する。単 に例として挙げるに過ぎないが、直線切開創傷１センチメートル当たり、５μｇ のＬＡＰを含有する医薬を適用するのが好適である。急性創傷よりも慢性創傷の 治癒を促進する場合に、投与量を多くすることが必要である。 医薬、特に慢性創傷に適用するために製剤された医薬の効能は、プロテアーゼ インヒビター（ガラドリンなど）と組み合わせた場合に強化される。プロテアー ゼインヒビターは、創傷、特に慢性創傷中に高濃度で見られるプロテアーゼによ る適用したＬＡＰまたはその機能的類縁体の分解を予防または阻止する。プロテ アーゼインヒビターは、広範囲に適用可能なプロテアーゼインヒビターが好まし い。 ＬＡＰを他の創傷治癒剤または他の作用剤（瘢痕形成予防剤など）と組み合わ せて用いることが可能であることが理解されよう。 ＬＡＰのタンパク質またはペプチドを使用するための好ましい方法は、遺伝子 療法の手段によって創傷中に該化合物をもたらすことである。したがって、本発 明の第３の態様は、遺伝子療法技術で用いるデリバリーシステムを提供するもの であり、該システムは、創傷治癒を調節するＬＡＰまたはその機能的ペプチド類 縁体をコードするＤＮＡ分子を特徴とし、該ＤＮＡ分子は、転写されてＬＡＰま たはその機能的ペプチド類縁体を発現しうるものである。 本発明の第４の態様は、前パラグラフで定義した、創傷の治療用の医薬の製造 に用いるデリバリーシステムの使用を提供する。 本発明の第５の態様は、治療を必要とする患者に、治療上有効量の、本発明の 第４の態様で定義したデリバリーシステムを投与することを特徴とする、創傷治 癒速度を増加する方法を提供する。 該デリバリーシステムは、大部分の慣例のデリバリーシステムと比較して、Ｌ ＡＰまたはその機能的ペプチド類縁体の濃度を創傷部位において長期にわたって 維持するのに非常に適している。創傷部位において、本発明の第３の態様におけ るＤＮＡ分子で形質転換された細胞から、ＬＡＰまたはその機能的ペプチド類縁 体が継続的に発現される。したがって、ＬＡＰまたはその機能的ペプチド類縁体 が、インビボにおいて作用剤としての半減期が非常に短かったとしても、治療上 有効量が、処置された組織から継続的に発現される。 さらに、本発明のデリバリーシステムを用いて、創傷に塗布される軟膏剤また はクリーム剤に必要であった慣例の医薬的ビヒクルを使用することなく、ＤＮＡ 分子（およびそれによって、有効な治療剤であるＬＡＰまたはその機能的ペプチ ド類縁体）が提供される。創傷治癒に使用する化合物用の満足できるびビヒクル （非炎症性、生体適合性、生体吸収性であることが必要であり、保管中あるいは 使用中に有効成分を分解または不活性化してはならない）を提供するのが難しい ことが多いので、このことは特に利点である。 本発明のデリバリーシステムは、ＤＮＡ分子が発現して（該デリバリーシステ ムが患者に投与された場合に）、創傷治癒活性をもつＬＡＰまたはその機能的ペ プチド類縁体を産生しうるものである。 該ＤＮＡ分子を、適当なベクターに導入して組換えベクターを作製することが できる。ベクターは、たとえば、プラスミド、コスミドまたはファージである。 このような組換えベクターは、本発明のデリバリーシステムにおいて、該ＤＮＡ 分子で細胞を形質転換するのに非常に有用である。 組換えベクターには他の機能要素を含めることもできる。たとえば、細胞の核 内で自律複製するように、組換えベクターを設計することができる。この場合、 ＤＮＡ複製を誘発する要素は、組換えベクター内に必要である。別法として、ベ クターおよび組換えＤＮＡ分子が細胞のゲノムに組み込まれるように、組換えベ クターを設計することができる。この場合、標的となる組み込み（相同的組換え など）に有利なＤＮＡ配列が望ましい。組換えベクターは、クローニング過程に おいて選択可能なマーカーとして用いる遺伝子をコードするＤＮＡを含むことも できる 組換えベクターは、さらに、遺伝子発現のコントロールに必要とされる、プロ モーターまたはレギュレーターを含むこともできる。 ＤＮＡ分子は、必須ではないが、治療される患者の細胞のＤＮＡに組み入れら れてもよい。未分化細胞は、安定に形質転換されて、遺伝子的に修飾された娘細 胞が産生される（この場合、患者における発現の調節には、たとえば、特異的転 写因子または遺伝子アクチベーターが必要である）。別法として、治療される患 者の分化細胞の不安定または過渡的形質転換を補助するように、該デリバリーシ ステムを設計することができる。この場合、ＤＮＡ分子の発現は、形質転換細胞 が死亡するかまたはタンパク質の発現を止めた時に停止するので、発現の調節は 、さほど重要ではない（理想的には、創傷、線維症もしくは瘢痕形成が治療され るかまたは予防された時点）。 デリバリーシステムは、ベクターに組み入れることなく、患者にＤＮＡ分子を 提供することができる。たとえば、ＤＮＡ分子をリポソームまたはウイルス粒子 に組み入れることができる。別法として、直接のエンドサイトーシスによる飲み 込みなどの適当な手段により、“裸の（naked）”ＤＮＡ分子を患者の細胞に挿 入することができる。 ＤＮＡ分子を、トランスフェクション、感染、マイクロインジェクション、細 胞融合、原形質融合または弾道衝撃によって、治療される患者の細胞に移入する ことができる。たとえば、被覆金粒子を用いる弾道トランスフェクション、ＤＮ Ａ分子を含むリポソーム、ウイルスベクター（アデノウイルスなど）および、局 所適用または注射によりプラスミドＤＮＡを直接創傷領域に適用することによる 直接ＤＮＡ取り込みを提供する手段（エンドサイトーシスなど）などによって、 移入を行う。 上記考察は、ヒトの創傷に主として適用されるものではあるが、他の動物（特 に、ウシ、ウマ、イヌ、ネコなどの家畜や愛玩動物など）においても創傷の治癒 というものは問題の多いものであることが理解されよう。たとえば、腹部の創傷 または癒着は、ウマを安楽死させねばならない主な理由である。上記医薬および デリバリーシステムは、このような動物に対して使用するのにも適している。 本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、もちろんこれらに限 定されるものではない。実施例 １．方法 以下に記載する実験操作の全詳細は、すべて慣例の方法であり、Shahらの（１ ９９４）J.Cell Sci．１０７ｐ１１３７−１１５７に開示されている。実験操作 について簡単に述べる。 体重２２５〜２５０ｇの成体の雄性スプラーグ−ドーリーラットにハロタン、 二酸化窒素および酸素で麻酔処理をした。動物の背部に、皮筋層に達する長さ１ ｃｍの全厚直線切開を４箇所行った。切開は正中線から等距離かつ四肢に隣接し た位置で行った。 創傷のうち１つは、コントロールとして何も処置を行わなかった。２つの創傷 に組換えＬＡＰ（０．０４μｇ、０．４μｇまたは４．０μｇ）を含むリン酸緩 衝食塩水１００μｌ（各創傷の縁では５０μｌに下げた）を皮内注入した。４番 目の創傷には、偽コントロールとして、ＬＡＰを溶解した等量のビヒクル（リン 酸緩衝食塩水）（１００μｌ−５０μｌ：創傷の縁）を皮内注入した。動物への 注射は、創傷形成直後、２４時間後および４８時間後に行った。 創傷形成後２時間後、３時間後、１２時間後、４日後、７日後、４０日後およ び８０日後に屠殺し、創傷を採取した。各時点において、１つの処置をしたマウ スを少なくとも４匹処理した（すなわち、ＬＡＰの各用量あたり、ｎ＝少なくと も４である）。 創傷に対し、通例の組織学的処理、すなわち、固定、ワックス包埋、切片作製 および染色を行った。これとは別に、免疫細胞化学的処理、すなわち、ＯＣＴ化 合物に包埋し、液体窒素中で凍結し、凍結切片を作製し、次いで、ＴＧＦ−β１ 、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、II型のＴＧＦ−β受容体、フィブロネクチン、 コラーゲン、単球およびマクロファージなどを検出するための種々の抗体による 免疫染色を行った。 組織学的および免疫細胞学的調製物について、創傷治癒におけるＬＡＰの効果 （特に先行技術から予測される抗瘢痕形成効果）を綿密に研究した。創傷部位に 蓄積されたコラーゲンの組織形成と配向性ならびに細胞外マトリックス分子につ いては特に注意を払った。 ２．結果 抗瘢痕形成効果は、どの処置においても認められなかった。創傷形成後８０日 および４０日において、コントロールとＬＡＰ処置創傷の間には、瘢痕の質およ び量に関して差異はなかった。 しかし、驚いたことに、創傷形成後の早い時点では、ＬＡＰ処置創傷は、コン トロールおよび偽コントロール創傷に対して多くの差異を示した。すべてのケー スにおいて、これらの応答は用量依存性であり、０．０４μｇのＬＡＰにおいて 最小の効果がみられ、４μｇのＬＡＰにおいて最大の効果がみられた。 ＬＡＰ処置創傷においては、炎症細胞（単球およびマクロファージ）の用量依 存性増加があった。同様に、早期創傷（すなわち、創傷形成後１４日まで）のフ ィブロネクチン染色およびコラーゲン蓄積において用量依存性増加がみられた。 ＬＡＰ処置創傷は、コントロール創傷と比較して、フィブロネクチンおよびコラ ーゲン蓄積ならびに炎症細胞の増加も示した。興味深いことには、創傷形成後３ 時間から１４日後では、ＬＡＰ処置創傷は、Ｉ型およびII型ＴＧＦ−β受容体染 色において用量依存性増加を示した。このＴＧＦ−β受容体染色の増加は、コン トロールおよび偽コントロールの創傷とは異なっている。ＰＢＳ処置偽コントロ ール創傷では、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体染色は創傷形成後３時間目で増加したが、 ２４時間以内に減少した。非処置創傷では、創傷部位におけるＴＧＦ−β受容体 の早期増加はなかった。それに対して、ＬＡＰ処置創傷は、ＴＧＦ−β受容体染 色の用量依存性増加を示し、創傷形成後１４日間増加したままであった。 ＬＡＰ処置創傷は、創傷部位においてＴＧＦ−β３染色の用量依存性減少も示 した。このＴＧＦ−β３染色の減少は、コントロールおよび偽コントロール創傷 と比較した場合、創傷形成後２４時間および４日の時点で最も著しかった。 ＬＡＰの外来性添加によるこれらの効果（上述したもの）、すなわち炎症細胞 、特に単球およびマクロファージの増加、細胞外マトリックス、たとえばフィブ ロネクチンおよびコラーゲンなどの蓄積の減少、ＴＧＦ−β受容体染色の増加は 、外来性ＴＧＦ−β１を創傷に加えた場合にみられた効果と同じである。 さらに、ＬＡＰ処置創傷においては、創傷の治癒は、多数のパラメーター（上 皮形成の完了、肉芽形成組織の成熟またはコラーゲンの早期蓄積など）において 用量依存的様式で促進された。したがって、ＬＡＰの外来性添加は、創傷の治癒 において、ＴＧＦ−βの外来性添加について報告された効果と同様の効果を有す るといえる。 これらの発見は、外来性ＬＡＰがＴＧＦ−β１を中和し、それによって抗瘢痕 形成活性をもつことが期待されるということを教示する先行技術から予測可能な ものではまったくない。ＬＡＰの外来性添加は、ＴＧＦ−β１の外来性添加と同 様に作用して創傷治癒速度を増加するけれども、抗瘢痕形成活性をもたない。 したがってＬＡＰの外来性添加は、創傷治癒を刺激することにおいて有用であ る。ＬＡＰは、慢性創傷（静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍、床ずれ潰瘍など）および急 性外科切開に対して特に有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．創傷治癒速度を増加する医薬の製造のための潜在性関連ペプチドまたはそ の機能的類縁体の使用。 ２．潜在性関連ペプチドまたはその機能的類縁体が、トランスフォーミング成 長因子βを潜在状態に維持する能力を有する請求項１に記載の使用。 ３．潜在性関連ペプチドまたはその機能的類縁体が、トランスフォーミング成 長因子β１またはトランスフォーミング成長因子β２を潜在状態に維持する能力 を有する請求２に記載の使用。 ４．医薬が、急性創傷の治癒速度を増加するためのものである前記請求項のい ずれかに記載の使用。 ５．急性創傷が、刺し傷、火傷、電気的外科手術の結果生じる神経損傷または 内臓の創傷のいずれか一つである、請求項４に記載の使用。 ６．医薬が慢性創傷の治癒速度を増加するためのものである請求項１〜３のい ずれかひとつに記載の使用。 ７．慢性創傷が、糖尿病性潰瘍形成、静脈潰瘍形成および床ずれ潰瘍形成のい ずれか一つである、請求項６に記載の使用。 ８．医薬が、治癒が困難となっている個体の創傷治癒速度を増加するためのも のである前記請求項のいずれかに記載の使用。 ９．治癒が困難となっている個体が、老年のヒトまたは動物である請求項８に 記載の使用。 １０．液剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、粉剤、エアロゾル剤 またはインプラントの形体である前記請求項のいずれかに記載の使用。 １１．局所適用のための前記請求項のいずれかに記載の使用。 １２．医薬が、潜在性関連ペプチドまたはその機能的類縁体を１ｎｇ〜１０ｍ ｇ含有する前記請求項のいずれかに記載の使用。 １３．潜在性関連ペプチドまたはそのタンパク質類縁体が使用され、該ペプチ ドまたは類縁体が、トランスフォーミング成長因子β発現組織、培養物中で成長 したトランスフォーミング成長因子β発現細胞、該ペプチドまたは類縁体を発現 するように遺伝子工作された細胞あるいは該ペプチドまたは類縁体を発現するよ うに遺伝子工作されたトランスジェニック動物から得られる前記請求項のいずれ かに記載の使用。 １４．潜在性関連ペプチドの機能的類縁体が使用され、該ペプチドが化学的ま たは遺伝子工作的に修飾された潜在性関連ペプチドまたは化学的に合成された化 合物である請求項１〜１２のいずれかひとつに記載の使用。 １５．治療上有効量の潜在性ペプチドまたはその機能的類縁体を創傷の部位へ 適用することを特徴とする創傷治癒の速度を増加する方法。 １６．治療上有効量の潜在性ペプチドまたはその機能的類縁体および医薬的に 許容しうる担体を含む、創傷治癒の速度を増加するための組成物。 １７．液剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、粉剤、エアロゾル剤 またはインプラントの形体である請求項１６に記載の組成物。 １８．遺伝子療法技術に使用するためのデリバリーシステムであって、創傷の 治癒を調節する潜在性関連ペプチドまたはその機能的類縁体をコードするＤＮＡ 分子を特徴とし、該ＤＮＡ分子が、転写されて該ペプチドまたは類縁体を発現す る能力を有する分子である、デリバリーシステム。 １９．創傷治癒の速度を増加する医薬の製造のための請求項１８に記載のデリ バリーシステムの使用。 ２０．治療を必要とする患者に、治療上有効量の請求項１８に記載のデリバリ ーシステムを投与することを特徴とする創傷治癒の速度を増加する方法。