JP2001511360A - アレイエレメント内での複数機能性およびその使用 - Google Patents

アレイエレメント内での複数機能性およびその使用

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JP2001511360A JP2000504287A JP2000504287A JP2001511360A JP 2001511360 A JP2001511360 A JP 2001511360A JP 2000504287 A JP2000504287 A JP 2000504287A JP 2000504287 A JP2000504287 A JP 2000504287A JP 2001511360 A JP2001511360 A JP 2001511360A
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ジョン シー． タボーン，
ネス， ジェフリー バン
クリステン モイニハン，
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、固体基板上のオリゴヌクレオチドのアレイを提供し、ここで別個の領域が、異なる配列を有する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを有する。これらのアレイは、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、特に切断可能な質量分析タグと併用して、有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般的に、表面にプリントされたオリゴヌクレオチドのアレイを有
する固体基板に関し、特にこのアレイの別個の領域における種々の配列の複数の
オリゴヌクレオチドを有するアレイに関する。
【０００２】 （発明の背景） 多くの試料の平行試験を容易にするために、生物学的因子の複製アレイを使用
してきた。例えば、異なる増殖表現型についての多くの独立コロニーを迅速にス
クリーニングする手段として長い間、無菌ビロードクロスおよびピストンリング
装置を使用して、それぞれ異なる増殖培地を含む寒天プレートに対して、細菌お
よび酵母コロニーの複製物を作製してきた（ＬｅｄｅｒｂｅｒｇおよびＬｅｄｅ
ｒｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６３：３９９，１９５２）。同様に、９
６ウェルマイクロタイタープレートを使用して、容易に接近される様式で、多く
の、例えば、細胞株、組換えＤＮＡライブラリーを表すウィルス分離株、または
モノクローナル抗体細胞株を組織化および貯蔵する。
【０００３】 大規模ゲノム計画の出現および分子診断の使用の増加が、核酸をスクリーニン
グする大容量処理能力方法の開発を必要としてきた。最近、あり得るヌクレオチ
ド配列の全てまたは全てのうちのサブセットを表す、ガラスまたはケイ素表面に
結合した短いオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の大きなアレイを合成する
方法が、開発された（ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６７５，１９９２）。これらのＯＤＮアレイは、ハイブ
リダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３：１００８，
１９９２；Ｄｒｍａｎａｃら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１６４９，１９９３）
によるＤＮＡ配列解析を行い、発現プロフィールを決定し、変異をスクリーニン
グするためなどに利用されてきた。これらの使用全てについて、必要とされるオ
リゴヌクレオチドの数は大きく、従って高密度アレイ（１ｃｍ2あたり＞１００ ０オリゴヌクレオチド）が開発されてきた。しかし、より低い密度のアレイを使
用することは、時間に関して有利であり、経済的である。現在、このようなアレ
イはこのオリゴヌクレオチド（しばしばインサイチュ合成）およびこの種々の検
出可能マーカーを付着することにより限定される。
【０００４】 本発明は、別個の領域あたり１つより多くのヌクレオチド配列を有するアレイ
を生成するための方法および組成物を開示し、さらに他の関連した利点を提供す
る。
【０００５】 （発明の要旨） 本発明の１つの局面では、核酸分子、好ましくはオリゴヌクレオチドの別個の
領域を含有する表面を有する固体基板を備える、オリゴヌクレオチドのアレイで
あって、ここで少なくとも１つの領域が、異なる配列を有するように選択された
少なくとも２つの核酸分子を含む、アレイが提供される。好ましくは、１０００
未満の別個の領域がある。また好ましくは、各領域は、異なる配列を有する少な
くとも２つのオリゴヌクレオチドを含み、より好ましくは、少なくとも１つの領
域が、２〜約１００の異なるオリゴヌクレオチド配列を含む。
【０００６】 特定の実施態様について、このアレイの領域は、直径約２０〜約５００ミクロ
ンであり、領域間の中心間距離が約５０〜１５００ミクロンである。
【０００７】 好ましい実施態様において、このオリゴヌクレオチドは公知の配列を有する。
他の好ましい実施態様において、このオリゴヌクレオチドは、好ましくはポリ（
エチレンイミン）のようなアミン結合を介して、この基板の表面に共有結合的に
付着される。
【０００８】 別の局面において、本発明は、ハイブリダイゼーション分析の方法であって、
以下の工程（ａ）標識化核酸分子を、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのア
レイにハイブリダイズする工程；および（ｂ）このアレイの領域中の標識を検出
し、それによりこのアレイ上のどのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたか
を決定する工程、を包含する方法を提供する。好ましい実施態様において、この
アレイの少なくとも１つの領域が公知の配列のオリゴヌクレオチドを含み、この
標識化核酸分子の１つが、このオリゴヌクレオチドに相補性である。好ましくは
、この標識化核酸分子は、各々異なる標識をもつ、異なる配列を有する核酸分子
を含む。このような標識は放射性分子、蛍光分子、および切断可能な質量分析タ
グの群から選択され得る。
【０００９】 別の局面において、本発明は、試料中の核酸分子を同定する方法であって、以
下の工程（ａ）標識化オリゴヌクレオチドをこの核酸分子にハイブリダイズし、
二重鎖を形成させる工程；（ｂ）この二重鎖を単離する工程；（ｃ）この二重鎖
を変性する工程；（ｄ）この標識化オリゴヌクレオチドを、本明細書中に記載し
たオリゴヌクレオチドのアレイにハイブリダイズする工程であって、ここでこの
アレイ上のオリゴヌクレオチドが、この標識化オリゴヌクレオチドに相補性であ
る、工程；および（ｅ）このアレイの領域中の標識を検出し；これによりこの試
料中の核酸分子を同定する工程、を包含する方法を提供する。
【００１０】 なお別の局面において、試料中の核酸分子を同定する方法であって、以下の工
程（ａ）オリゴヌクレオチドをこの核酸分子にハイブリダイズする工程；（ｂ）
単一の標識化ヌクレオチドの存在下でこのオリゴヌクレオチドを伸長し、二重鎖
を形成させる工程；（ｃ）この二重鎖を変性する工程；（ｄ）この標識化オリゴ
ヌクレオチドを、本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドのアレイにハイブリダ
イズする工程であって、ここでこのアレイ上のオリゴヌクレオチドがこの標識化
オリゴヌクレオチドと相補性である、工程；および（ｅ）このアレイの領域内の
標識を検出し；それによりこの試料中の核酸分子を同定する工程、を包含する方
法が、提供される。好ましい実施態様において、このアレイの別個の領域におけ
るオリゴヌクレオチドは、この核酸分子の伸長生成物に相補性である。
【００１１】 なお別の局面において本発明は、試料中の核酸分子を同定するための方法であ
って、以下の工程（ａ）少なくとも２つのオリゴヌクレオチドをこの核酸分子に
ハイブリダイズし、二重鎖を形成させる工程であって、ここで少なくとも１つの
オリゴヌクレオチドが標識され、そしてこのオリゴヌクレオチドはこの核酸分子
上の隣接する配列にハイブリダイズする、工程；（ｂ）このオリゴヌクレオチド
を連結する工程；（ｃ）この二重鎖を変性する工程；（ｄ）この標識化オリゴヌ
クレオチドを、本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドのアレイにハイブリダイ
ズする工程であって、ここでこのアレイ上のオリゴヌクレオチドがこの連結オリ
ゴヌクレオチドに相補性であり；そしてここでハイブリダイゼーションは非連結
オリゴヌクレオチドには生じない、工程；および（ｅ）このアレイの領域内の標
識を検出し；それによりこの試料中の核酸分子を同定する工程、を包含する方法
を提供する。
【００１２】 なお別の局面において、試料中のｍＲＮＡ分子を同定するための方法であって
、以下の工程（ａ）標識化オリゴヌクレオチドをこのｍＲＮＡ分子にハイブリダ
イズし、二重鎖を形成させる工程；（ｂ）この二重鎖を単離する工程；（ｃ）こ
の二重鎖を変性する工程；（ｄ）この標識化オリゴヌクレオチドを、本明細書中
に記載のオリゴヌクレオチドのアレイにハイブリダイズする工程であって、ここ
でこのアレイ上のオリゴヌクレオチドがこの標識化オリゴヌクレオチドに相補性
である、工程；および（ｅ）このアレイの領域内の標識を検出し；それによりこ
の試料中のｍＲＮＡ分子を同定する工程、を包含する方法が提供される。好まし
い実施態様において、このｍＲＮＡ分子は、毒であると疑われる化合物で処理し
た細胞から単離される。他の好ましい実施態様において、このアレイ上のオリゴ
ヌクレオチドはサイトカインの配列である。
【００１３】 本発明のこれらのおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参
照して明白になる。さらに、種々の参考文献が以下に示され、これはより詳細に
特定の手順または組成物（例えばプラスミドなど）を記載し、従ってその全体が
参考として援用される。
【００１４】 本発明の生体分子アレイは、タグ化生体分子、例えば切断可能なタグに共有結
合したオリゴヌクレオチドを含有し得るか、これと共に使用され得る。これらの
タグ化生体分子は、本発明の方法、ならびに中でもオリゴヌクレオチド配列決定
および遺伝子発現アッセイのようなアッセイ手順において使用され得る。模範的
なタグ化生体分子、およびこの同一物を使用し得るアッセイは、各々１９９７年
１月２２日に出願された米国特許出願第０８／７８６，８３５号；同第０８／７
８６，８３４号；および同第０８／７８７，５２１号；ならびに各々１９９７年
７月２２日に出願された出願第０８／８９８，１８０号；同第０８／８９８，５
６４号；および同第０８／８９８，５０１号を有する３つの米国一部継続特許出
願；ならびにＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ９７／２７３３１号；同第ＷＯ ９７／
２７３２５号；および同第ＷＯ９７／２７３２７号に記載される。これら６つの
米国特許出願および３つのＰＣＴ国際公開は各々、本明細書中にその全体が参考
として援用される。
【００１５】 本発明の生体分子アレイはまた、１９９７年７月２２に出願された、「Ａｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅａｃｔ
ｉｏｎｓ Ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ Ｏｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｒｒａｙｓ」と題さ
れる米国仮特許出願第６０／０５３，４２８号、および同時出願した、同様に題
される米国非仮特許出願第（ ）号（これらは共に、その全体が本明細書中
に参考として援用される）に記載されるように、増幅および他の酵素反応の実施
において使用され得る。
【００１６】 本発明の生体分子アレイ、および本発明の方法に有用なアレイは、例えば１９
９７年７月２２日に出願された、「Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｆｏｒ Ａｒｒａｙｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｏｎｔｏ Ａ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔ」と題される米国仮特許出願第６０／０５３，４３５号、およ
び同時出願した、同様に題される米国非仮特許出願第（ ）号（これらは共
に、その全体が本明細書中に参考として援用される）に開示された技術に従って
調製され得る。
【００１７】 本発明の生体分子アレイ、および本発明の方法に有用なアレイは、例えば１９
９７年７月２２日に出願された、「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−Ｂａｓ
ｅｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｒｒａｙｓ」と題される米国仮特許出願第６
０／０５３，３５２号、および同時出願した、同様に題される米国非仮特許出願
第（ ）号（これらは共に、その全体が本明細書中に参考として援用される
）に開示された技術に従って調製され得る。
【００１８】 例えば１９９７年７月２２日に出願された、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏ
ｄ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ Ｄａｔａ」と題
される米国仮特許出願第６０／０５３，４２９号、および同時出願した、同様に
題される米国非仮特許出願第（ ）号（これらは共に、その全体が本明細書
中に参考として援用される）に開示されたような、コンピュータシステムおよび
データを相関する方法は、本明細書中に記載のとおりの生体分子アッセイおよび
方法と共に使用され得る。
【００１９】 （発明の詳細な説明） 上記に記載されるように、本発明は、単一の別個の領域において、複数配列を
アレイに提供する。特定の実施態様において、本発明は、アレイ内の単一エレメ
ントにおいて、１より多い、そして好ましくは１０〜１００の種々のオリゴヌク
レオチド配列またはポリヌクレオチド配列を提供する。オリゴヌクレオチドの場
合では、２と約１００との間のオリゴヌクレオチドは、市販の合成機で個々に合
成され、アレイの別個の領域において単一エレメントとして組み合わされ、そし
てプリントされる。ＤＮＡ、ＲＮＡまたは両方を含む、一本鎖または二本鎖であ
る核酸は、固体基板へ結合され得る。二本鎖分子は、増幅、酵素消化などによっ
て作製され得る。必然的に、第一級アミン基（ポリエチレンイミンに結合させる
ための）または他の反応基を有する任意の核酸分子は、本発明内のアレイと結合
され得る。本発明内でまた、特定の領域内の全ての個々の核酸の配列は、未知で
あり得る。
【００２０】 本明細書中で使用されるように、アレイとは、別個の領域において固体支持体
上に置かれるオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の集合をいう
。好ましくは、この領域は、ある同定可能なパターンまたは規則的な間隔を形成
する。アレイは、代表的には、２から１０００までのエレメントから構成される
が、また１０００を超えるエレメント（別個の領域）からも構成され得る。各領
域は、核酸もオリゴヌクレオチドも結合も沈着もされない、いくらかの距離によ
って分離される。代表的な領域の大きさは２０から５００ミクロンであり、そし
てその領域の代表的な中心間距離は、５０から１５００ミクロンの範囲である。
【００２１】 本発明はまた、アレイ内の単一エレメント内での複数配列の使用を記載する。
この方法は、多くの目的のための、低エレメントアレイ（すなわち、１０エレメ
ントから例えば４００エレメント）の使用を可能にする。例えば、これらの組合
わせ配列である、低エレメントアレイは、病原体の同定、プロファイリング決定
、毒物学試験などのために使用され得る。
【００２２】 （Ｉ．固体基板への鋳型の適用） （Ａ．基板調製） アレイの基板は適切な材料から調製される。この基板は好ましくは剛直であり
、そして好ましくは実質的に平担である表面を有する。幾つかの実施態様におい
て、領域を示すために、この表面は***した部分を有し得る。代表的な基板はシ
リコンウエハおよびホウケイ酸スライド（例えば、顕微鏡ガラススライド）であ
るが、当該分野で既知の他の材料で代用され得る。特に有用な固体支持体の例は
シリコンウエハであり、これは、半導体の構築において電子産業において代表的
に使用される。このウエハは、１つの面が極めて研磨加工され反射性であり、そ
して種々のリンカー、例えばシラン化学を使用するポリ（エチレンイミン）で容
易にコートされ得る。ウエハは、ＷａｆｅｒＮｅｔ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡの
ような会社から市販されている。
【００２３】 核酸分子または他の生体高分子、例えばペプチドは、合成され、作製されるか
または単離され、そして固体基板に適用され得る。核酸およびペプチドは、市販
の機械を使用して自動化方法で合成され得る。好ましい実施態様において、この
分子は固体基板上に沈着され、そして固体基板へ共有結合的に付着される。
【００２４】 特定の実施態様において、上記基板の表面はオリゴヌクレオチドのために調製
される。この表面は、例えば、疎水性を増加もしくは減少させる化学物質でコー
ティングすること、または上記核酸分子もしくは他の重合配列の共有結合を可能
にする化学物質でコーティングすることにより調製され得る。幾つかの化学的な
コーティングは、疎水性を変化させると共に、共有結合を可能にし得る。固体基
板上の疎水性は、当該分野で公知のシラン処理または他の処理により容易に増加
され得る。共有結合を可能にする化学物質は、一般的にリンカーと呼ばれる。こ
れらのリンカー分子は、上記基板の表面に付着し、生体分子と反応する官能基を
含む。多くのこのようなリンカーは容易に入手できる。例えば、固体支持体は、
感光保護した（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）水酸基（米国特
許第５，４１２，０８７号；同第５，５７１，６３９号；同第５，５９３，８３
９号を参照のこと）、アルコキシまたは脂肪族で誘導体化した水酸基（米国特許
第５，４３６，３２７号）、または他の化学物質（例えば、米国特許第５，４４
５，９３４号；ＥＰ特許第ＥＰ−Ｂ１−０，３７３，２０３号；米国特許第５，
４７４，７９６号；米国特許第５，２０２，２３１号を参照のこと）を用いて改
変される。
【００２５】 疎水性を減少させると共に、リンカーを提供する好ましいコーティングは、ポ
リ（エチレンイミン）である。さらに、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）でコ
ーティングした固体基板は、長い貯蔵寿命安定性という利点を有する。ポリマー
、例えばポリ（エチレンイミン）でのシリコンウエハおよびガラススライドのコ
ーティングは、社内で、またはＣｅｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ
，Ｔｅｘａｓ）のような会社を通して実施され得る。ガラススライドはまた、反
射性材料でコーティングされ得るか、またはシラン化学を使用してＰＥＩでコー
ティングされ得る。このＰＥＩコーティングは、一本鎖もしくは二本鎖のオリゴ
ヌクレオチド、一本鎖もしくは二本鎖の長いＤＮＡ分子もしくはフラグメント、
または任意の他のアミン含有生体分子の、上記固体支持体への共有結合的付着を
可能にする。オリゴヌクレオチドは、ヘキシルアミン修飾を使用して５’で共有
結合的に付着し得、この修飾は、上記オリゴヌクレオチドの５’末端に一級アミ
ンを配置する。次に、上記オリゴヌクレオチド上の５’アミンは、架橋剤と反応
し得、その結果、このオリゴヌクレオチドは、上記固体支持体上にコーティング
されたポリマーに共有結合的に付着される。
【００２６】 任意の核酸型は、この核酸が一級アミンを含有する限りは、ＰＥＩでコーティ
ングした表面に共有結合的に付着され得る。増幅産物（例えば、ＰＣＲによる）
は、５’ヘキシルアミン結合体化プライマーを使用することにより、一級アミン
を含有するように改変され得る。アミン基は、アリル−ｄＵＴＰ（Ｓｉｇｍａ，
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用するニックトランスレーションにより、増幅産
物および他の核酸二重鎖に導入され得る。その上、アミンは、ポリメラーゼ、例
えば、ターミナルトランスフェラーゼにより、または短いアミン含有オリゴヌク
レオチドの連結により核酸に導入され得る。当該分野において公知の他の適切な
方法が代用され得る。
【００２７】 アミン基に適切な架橋剤は一般的に市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ，
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬを参照のこと）。代表的な架橋剤は、トリクロロトリア
ジン（塩化シアヌル）（Ｖａｎ Ｎｅｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１９：３３４５−３３５０，１９９１）である。簡単には、過剰の塩化シ
アヌルが、０．０１〜１μｇ／ｍｌ、および好ましくは約０．１μｇ／ｍｌの代
表的なオリゴヌクレオチド濃度のオリゴヌクレオチド溶液（例えば、アミンの１
０〜１０００倍モル過剰の塩化シアヌル）に添加される。この反応は、一般的な
緩衝液、例えば、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、また
はＴｒｉｓ ＨＣｌを７．０〜９．０のｐＨ範囲で使用して緩衝化される。好ま
しい緩衝液は、新しく調製されたｐＨ８．３〜ｐＨ８．５の０．２Ｍ ホウ酸Ｎ
ａである。１０μｌの塩化シアヌルの１５ｍｇ／ｍｌ溶液が、添加され、１〜１
２時間および好ましくは約１時間、一定に攪拌しながら反応させる。反応温度は
、２０〜５０℃の範囲であり得、好ましい反応温度は、２５℃（または周囲温度
）である。
【００２８】 塩化シアヌルが架橋剤として使用される場合、上記核酸を固体基板にプリント
する前に過剰な架橋剤を除去する必要は無い。上記反応混合物中の過剰の塩化シ
アヌルは、上記核酸またはオリゴヌクレオチドの上記ＰＥＩコーティングした固
体基板との共有結合的付着を妨害も競合もしない。なぜなら、上記固体基板上の
アミンが、塩化シアヌル分子の数よりも過剰であるからである。好ましい実施態
様において、架橋したオリゴヌクレオチドはプリントする工程の前に精製されな
い。
【００２９】 核酸または他のアミン含有ポリマーを共有結合的に付着させる場合、上記活性
化ポリマーを、１〜２０時間、２０〜５０℃で、好ましくは１時間２５℃で、上
記固体支持体と反応させる。次にこの固体支持体上の遊離アミンはキャップされ
、他の核酸の非特異的な付着が防止される。キャップ化は、上記固体支持体を７
０％ ｍ−ピロール（ｐｙｒｏｌ）および０．１Ｍホウ酸Ｎａ中で０．１〜２．
０Ｍ無水コハク酸、好ましくは１．０Ｍ無水コハク酸と、１５分間〜４時間、好
ましくは２５℃で３０分間の反応時間で、反応させることにより達成される。次
に上記固体支持体は、０．１〜５Ｍグリシン（好ましくは０．２Ｍグリシン）を
含有する、ｐＨ７〜ｐＨ９の０．１〜１０．０Ｍホウ酸Ｎａ（好ましくはｐＨ８
．３の０．１Ｍ ホウ酸Ｎａ）溶液中でインキュベートされ、次に界面活性剤含
有溶液で洗浄される。このことは、上記ＰＥＩ表面に共有結合し得る任意のジク
ロロトリアジンをキャップする。好ましくは、上記固体支持体は、０．０１Ｍ
ＮａＣｌ、０．０５Ｍ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中で
５分間、９５℃にさらに加熱され、全ての非共有結合的に付着する核酸が除去さ
れる。二本鎖核酸が固体基板上にプリントされる場合、この工程はまた、この二
本鎖を一本鎖形態に変換（変性）する。
【００３０】 現在使用されるアレイ型式では、このアレイは、最も低い可能性ある情報内容
を含む：アレイの各エレメントは、ちょうど１つの配列に対応する。それゆえ、
アレイ中の各エレメントは、既知の配列のものであり、そしてエレメントスコア
がアレイ中でポジティブである場合（例えば、ハイブリダイズする）、的中の配
列がわかる。本質的に、アレイのエレメントに含まれる材料の１つに対して１つ
の対応性およびアレイ内に含まれる情報内容が存在する。
【００３１】 本発明のアレイにおいて、さらなる情報内容が、各エレメントに複数配列を有
することによって提供される。最も簡単な形態では、アレイの各領域は、アレイ
中のエレメントあたり、材料の量を測定するための固有の配列およびコントロー
ル配列を含む。２つのオリゴヌクレオチドが、単一エレメント内に固定化される
場合、１つのオリゴヌクレオチドは、アレイ上の品質コントロールまたは品質の
確かさを指揮するための手段のために使用され得る。「コントロール」オリゴヌ
クレオチド配列は、検出可能なある標識を含むかまたは有する、相補的なオリゴ
ヌクレオチドのための捕獲部位として役立ち得る。「コントロール」オリゴヌク
レオチドはまた、アレイするプロセスおよび方法のための内部コントロールとし
て役立ち得る。
【００３２】 このフォーマットでは、以下に記載されるフォーマット同様に、少なくとも１
つの領域が、複数の核酸配列を含む。好ましい実施態様において、各領域は、複
数配列を含む。いくつかの目的のために、中間値すなわちある割合の領域が、複
数配列を有し、そして残りの割合は単一配列を有する。同様に、複数配列が存在
する場合、少なくとも２つの配列、一般には１０００を超えない、そして好まし
くは２から１００の配列が存在する。
【００３３】 好ましい局面では、このアレイは、中間量の情報内容を含む。例えば、１つの
実施態様において、このアレイは、エレメントあたり２つの配列を含む。従って
、エレメントあたりの情報内容とアレイあたりのエレメント数との間には２：１
の対応関係が存在するが、このフォーマットにおいて単一標識を使用すると正確
な配列アイデンティティーの損失が存在する。このアレイにおける全てのエレメ
ントは、２つの可能性のある既知の配列から構成され、そしてエレメントスコア
がアレイにおいてポジティブである場合、的中の配列は、２つの異なる配列の可
能性である。しかし、ポジティブのアイデンティティーは、複数の検出分子の使
用によって決定され得る。以下に記載されるように、種々の蛍光分子、着色され
たミクロビーズ、放射活性分子、色素原性基板、これらのマーカーの組み合わせ
、これらのマーカーの１つと化学発色団との組合わせ、または切断可能な質量分
析タグの使用は、アレイの領域のどの配列が、ハイブリダイズしたかという情報
を提供し得る。
【００３４】 以下の表で示されるように、異なる配列の数が、アレイの各領域で増加するに
つれて、明白な同定のために実施されることが必要とされる反復反応（デコンボ
リューション）の数が増加するか、または必要とされる種々のタグ数が増加する
かのいずれかである。
【００３５】
【表１】
【００３６】 ここでｎは、好ましくはアレイ中のエレメントあたり１〜１００の範囲である
。エレメントあたりの配列の数は、アレイあたりの単一エレメントに置かれた、
異なる配列の数である。「配列は既知であるか？」の欄は、単一の標識によって
標的（試験）試料の配列を決定する能力を表す。対応性は、任意の所定の配列が
、アレイまたはサブアレイを用いて単一エレメント内で表される情報または可能
性の量である。デコンボリューションの欄は、標的（試験試料）の正確な配列（
これは、アッセイにおいてポジティブのスコアであった）を決定するために実施
されることを必要とするサブアッセイの数を表す。例えば、的中が１０の異なる
配列を含む領域に生じる場合、明白な決定は、１０の異なる配列を別々にプリン
トし、そしてハイブリダイズさせることによって作製され得る。
【００３７】 実質的でそして無数の利点は、アレイ内のエレメントあたり１つを超える核酸
配列または１つを超えるオリゴヌクレオチドを使用して達成される。例えば、関
連する核酸配列のファミリーは、アレイの単一エレメント内に置かれ得、それゆ
え、任意の試験試料の遺伝子活性は、アレイを横切るハイブリダイゼーションの
パターンを試験することによって決定され得る。毒物学試験の場合では、以下の
エレメントを有するアレイが構築され得る：炎症誘発性サイトカイン誘導（ＩＬ
−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８）のための配列を含むエレメント、抗炎症
性サイトカイン誘導（ＩＬ−４、ＩＬ−１２）のための配列を含むエレメント、
脂質改変酵素（血小板活性化因子アセチルトランスフェラ−ゼ（血小板活性化因
子アセチルヒドロラーゼ）のための配列を含むエレメント、およびＴＮＦ（ＴＮ
ＦαおよびＴＮＦβ）のための配列を含むエレメントなど。当業者は、核酸配列
の選択が、部分的に、何が試験されるかに依存することを認識する。
【００３８】 （Ｂ．核酸分子を固体基板に適用する方法） オリゴヌクレオチド、核酸分子、または他の生体高分子は固体基板上に「プリ
ント」（送達または適用）される。好ましい実施態様において、このポリマーは
規則的なパターンまたはアレイで適用される。
【００３９】 種々のプリント方法が、アレイパターンで、核酸、例えば、オリゴヌクレオチ
ドまたはＤＮＡフラグメントを固体基板に適用するために利用可能である。一般
的なガイドラインとして、この送達機構は、非常に少量の液体（例えば、ナノリ
ッター）を、互いに非常に近接している（例えば、１ｍｍ以下の間隔）小さい領
域（例えば３００μｍ直径のドット）に位置決めすることが可能でなければなら
ない。好ましくはプリント技術は自動化できる。１つのこのような技術は複数の
ヘッドを使用するインクジェットプリントである。非常に微細なピペッターもま
た使用され得る。プリントする好ましい手段は、本明細書に記載したとおりのス
プリングプローブ（ｓｐｒｉｎｇ ｐｒｏｂｅｓ）を使用している。
【００４０】 試料のピックアップ、移動、および微小液滴沈着は、親水性の表面を有する液
体移動デバイスを使用する場合に、特にこのデバイスが改変されたスプリングプ
ローブである場合に、非常に増強される。スプリングプローブは、このプローブ
の表面を改変するように作用する化学薬剤の使用を通して、または親水性物質で
このプローブをコーティングすることを通して親水性にされる。好ましい方法に
おいて、上記スプリングプローブのチップは、１，４−ジチオスレイトール、０
．１Ｍホウ酸ナトリウムの２５〜２００ｍＭ溶液中に、１５分間〜２時間浸漬さ
れる。ジチオスレイトールは、チオール−金配位を通して金表面と反応し、この
ことは上記表面を本質的に水酸化し、上記表面を親水性にする。
【００４１】 上記親水性表面は、上記スプリングプローブを溶液中に浸漬した場合、試料の
均一なコーティングを促進する。溝つきプローブは、その親水性の性質により、
上記プローブ表面に引き上げられた液体が一様におよび一貫してロードされるよ
うになる。グリセロールのような粘性増強化学物質を有する溶液は、親水性表面
を使用する操作能力の改善を特に提供する。これらの溶液を用いると、液体の供
給源から引き出された場合に、このグリセロールは上記プローブに一様に接着す
る。試料がその供給源から固体支持体へと移されたとき、上記プローブの親水性
表面は、移された上記試料を保持すること、および輸送の間にこの試料を無作為
に滴下または流すことを防止することにより、液体操作で利益を受け続ける。ス
プリングプローブを有する試料が固体支持体と接触する場合、特に粘度増強溶液
を含有する試料の場合、この試料はこのスプリングプローブのチップからこの固
体支持体の表面に沈着される。スポットされる領域のサイズは一般的に、１０〜
２００μｍの範囲であり、代表的な中心間距離は２５〜５００μｍである。
【００４２】 簡単には、代表的な手順において、上記核酸の溶液は、５７％グリセロール中
に一様に混合され、次に上記固体支持体にプリントされる。本発明の文脈では、
上記生体高分子は、核酸分子またはタンパク質分子のいずれかであり得る。核酸
を使用する場合、これらは、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ、一本鎖もしくは二
本鎖のＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡ分子、または
二重鎖、タンパク質骨格を有するＰＮＡ核酸などを含み得る。
【００４３】 （ＩＩ．反応成分および条件） 上記のとおり、本発明は、固体基板上で核酸をハイブリダイズする方法を提供
する。上記のとおり、この核酸はこの基板の表面に共有結合的に付着し得るか、
または付着せずにこの基板上に沈着し得る。代表的には、このオリゴヌクレオチ
ドが最初にプリントされ、他の試薬が続いて添加される。
【００４４】 （Ａ．試薬、緩衝液、補因子など） ハイブリダイゼーションを受けるアレイの各領域は、鋳型核酸に加えて、適切
な標識化核酸、緩衝液、補因子などを有する。ハイブリダイゼーション条件は周
知であり（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， １９９５； Ｓａｍｂｒｏｏｋら、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９８７を参照のこと）、そして核酸の短い小片
を使用するハイブリダイゼーションについて十分に記載されている。
【００４５】 好ましい実施態様において、ハイボトロープが付加され、鋳型へのオリゴヌク
レオチドプライマーのアニーリングを改善し得る（米国出願第６０／０２６，６
２１号（１９９６年９月２４日に出願された）；同第０８／７１９，１３２号（
１９９６年９月２４日に出願された）；同第０８／９３３，９２４号（１９９７
年９月２３日に出願された）；同第０９／００２，０５１号（１９９７年１２月
３１日に出願された）；およびＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ９８／１３５２７号（
これらは全て、それらの全体が、本明細書中で参照として援用される））。ハイ
ボトロープとは、標準塩溶液（すなわち、０．１６５Ｍ ＮａＣｌ）に対して言
及される場合、核酸二重鎖のエンタルピーを２０％以上増加させ得る任意の化学
物質をいう。化学物質は、溶液として、５０％がＧ＋Ｃである、１８ｂｐオリゴ
ヌクレオチド二重鎖が、１５℃以下のヘリックス−コイル転移（ＨＣＴ）を有す
る場合、ハイボトロピック特性を示す。ＨＣＴは、８０％および２０％の二重鎖
が、一本鎖である温度差である。次いで、アニーリングのための温度が、識別温
度（この温度で、ハイブリダイゼーション反応がミスマッチ二重鎖と完全にマッ
チした二重鎖との間の区別が検出可能となるように実施される）であるように選
択される。温度の範囲は、識別温度の判定基準を満たす。
【００４６】 （ＩＩＩ．反応産物の検出） 反応産物は、種々の方法で検出され得る。好ましくは、反応成分の１つは、標
識される。増幅反応においては、オリゴヌクレオチドプライマーまたはヌクレオ
チドが、都合よく標識される。好ましくは、プライマーが標識を含有する。単一
ヌクレオチド伸長アッセイにおいては、付加されたヌクレオチドが、一般的に標
識され、オリゴヌクレオチド連結アッセイにおいては、１つ以上のオリゴヌクレ
オチドが標識され、他の合成反応においては、プライマーまたはヌクレオチドの
いずれかが、代表的に標識される。
【００４７】 一般的に使用される標識としては、ビオチン、蛍光分子、放射性分子、色素生
産性物質、化学発光剤などが挙げられるが、これらに限定されない。核酸のビオ
チン化のための方法は、蛍光分子および放射性分子のオリゴヌクレオチドおよび
ヌクレオチドへの導入方法と同様に、当該分野において周知である。
【００４８】 ビオチンが使用される場合、ビオチンは、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ）または放射性標識（例えば、32Ｐ、35Ｓ、33Ｐ）のような検出可能な
マーカーと結合体化された、アビジン、ストレプトアビジンなどによって検出さ
れる。酵素結合体は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕ
ｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）から市販されている。ストレプトアビジンは、高親和
性でビオチンと結合し、結合しないストレプトアビジンは、洗浄除去され、そし
て次に西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素の存在が、ペルオキシドおよび適切な緩
衝液の存在下において沈殿する基質を用いて検出される。その産物は、可視光線
供給源およびＣＣＤカメラを備えた顕微鏡を使用して検出され得る（Ｐｒｉｎｃ
ｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）。そのような
機器を用いて、一度に約１０，０００μＭ×１０，０００μＭの画像がスキャン
され得る。
【００４９】 検出方法は、蛍光標識または放射性標識のような上記標識について周知である
。蛍光標識は、その吸収および蛍光発光波長および強度によってほとんど直接的
に同定および定量され得る。蛍光光源を使用する顕微鏡／カメラ装備が、蛍光標
識の検出に都合のよい手段である。放射性標識は、標準的なオートラジオグラフ
ィー、ホスホル（ｐｈｏｐｈｏｒ）イメージング分析またはＣＣＤ検出器によっ
て可視化され得る。他の検出系が、利用可能であり、そして当該分野において公
知である。ビオチン、放射性、蛍光のような標識について、一度に検出され得る
異なる反応の数は、限られている。例えば、４つの蛍光分子（例えば、ＤＮＡ配
列決定分析において一般に使用される）の使用は、分析を、一度に４つの試料に
限定する。本質的に、この限定のために、これらの検出器方法を使用する場合、
各反応は、個別に評価されなければならない。
【００５０】 より有利な検出方法は、試料反応物を少なくとも１つのアレイにプールして、
産物の同時分析を可能にする。各反応において異なる分子量または他の物理的性
質を有するタグを使用することにより、反応産物のセット全体がともに収集され
、そして分析され得る。（例えば、米国特許出願第０８／７８６，８３５号、同
第０８／７８６，８３４号、同第０８／７８７，５２１号（それぞれ１９９７年
１月２２日出願）、同第０８／８９８，１８０号、同第０８／８９８，５６４号
、同第０８／８９８，５０１号（それぞれ１９９７年７月２２日出願）、ならび
に、ＰＣＴ国際公開第９７／２７３３１号、同第９７／２７３２５号、および同
第９７／２７３２７号を参照のこと。）簡潔には、「タグ」分子は、標識として
使用される。本明細書において使用する場合、「タグ」とは、「目的の分子」を
独自に同定するために使用される化学部分をいい、そしてより具体的には、タグ
可変成分、ならびに任意のタグ反応物、タグ成分およびタグ部分において、どん
なものであっても、それに最も近接して結合し得るものをいう。
【００５１】 本発明において有用なタグは、いくつかの性質を有する： （１）他の全てのタグから区別され得る。他の化学部分からのこの区別は、タグ
のクロマトグラフィー挙動（特に切断反応後）、その分光学的または電位差測定
での特性、あるいはそのいくつかの組み合わせに基づき得る。タグが有用に区別
される分光学的方法としては、質量分析法（ＭＳ）、赤外（ＩＲ）、紫外（ＵＶ
）、および蛍光が挙げられ、ＭＳ、ＩＲおよびＵＶが好ましく、そしてＭＳは最
も好ましい分光学的方法である。電位差測定の電流測定方法は、好ましい電位差
測定方法である。 （２）タグは、１０-22〜１０-6モル存在する場合、検出され得る。 （３）タグは、化学的なハンドル（このハンドルを介して、タグは、タグが独自
に同定することが意図されるＭＯＩに結合され得る）を有する。結合は、ＭＯＩ
に対して直接的にか、または「リンカー」基を介して間接的になされ得る。 （４）タグは、それが供される全ての操作（ＭＯＩへの結合およびＭＯＩからの
切断、ならびにタグが結合している間の、ＭＯＩの任意の操作を含む）に対して
、化学的に安定である。 （５）タグは、そのタグが結合している間、ＭＯＩ上で行われる操作を有意には
妨げない。例えば、タグがオリゴヌクレオチドに結合している場合、そのタグは
、オリゴヌクレオチド上で行われる任意のハイブリダイゼーションまたは酵素反
応（例えば、増幅反応）を有意に妨げてはならない。
【００５２】 特定の分光学的または電位差測定方法によって検出されることが意図されるタ
グ部分は、その方法による検出感度および特異性を増強する特性を有するべきで
ある。代表的には、そのタグ部分は、それらの特性がタグ部分の主要な部分を代
表的に構成するタグ可変成分中に設計されていることによって、それらの特性を
有する。以下の議論において、用語「タグ」の使用とは、代表的にタグ部分をい
う（すなわち、タグ可変成分を含む切断産物）が、タグ可変成分自体をいうこと
もまた考慮され得る。なぜなら、それは代表的に独自の検出可能な特性を提供す
る原因であるタグ部分の一部分であるからである。式Ｔ−Ｌ−Ｘの化合物におい
て、「Ｔ」部分は、そのタグ可変成分を含有する。そのタグ可変成分が、例えば
、質量分析によって特徴づけられるように設計されている場合、Ｔ−Ｌ−Ｘの「
Ｔ」部分は、Ｔmsと称され得る。同様に、Ｔを含むＴ−Ｌ−Ｘ由来の切断産物は
、Ｔms含有部分と称され得る。以下の分光学的および電位差測定方法は、Ｔms含
有部分を特徴づけるために使用され得る。
【００５３】 従って、本発明の１つの局面の中で、核酸分子またはフラグメントの同一性を
決定するための方法（または選択された核酸分子またはフラグメントの存在を検
出するための方法）が提供される。この方法は、以下の工程を包含する、（ａ）
１つ以上の選択された標的核酸分子からタグ化された核酸分子をハイブリダイズ
する工程であって、ここでタグは、特定の核酸分子と相関して、そして非蛍光分
光測定または電位差測定によって検出可能である、工程、（ｂ）ハイブリダイズ
されなかった、タグ化された核酸を洗浄する工程、（ｃ）そのタグを、そのタグ
化分子から切断する工程、および（ｄ）そのタグを、非蛍光分光測定または電位
差測定によって検出し、そしてそれにより核酸分子の同一性を決定する工程。そ
のような技術の例としては、例えば、質量分析法、赤外分光測定法、定電位電流
測定法またはＵＶ分光測定法が挙げられる。
【００５４】 （ＩＶ．使用） 上記のように、本明細書に記載されるこの方法は、種々の目的のために適用可
能である。例えば、オリゴヌクレオチドのアレイは、アレイを作製する質、核酸
分子の定量または定性分析、変異の検出、発現プロフィールの決定、毒物学試験
などについての制御のために使用し得る。
【００５５】 （Ａ．ハイブリダイゼーションまたはアレイの作製における内部コントロール
） この実施態様において、アレイの各領域は、任意の他の配列に加えて同じ核酸
配列を含む。従って、１つの共通配列が、各エレメントに位置される。共通配列
が、アレイを作製するための質コントロールまたは質の確かさをモニターするた
めのコントロールとして使用され得る。「コントロール」配列は、検出可能標識
を含むかまたは有する、相補的オリゴヌクレオチドのための捕獲部位として役立
ち得る。このように、各領域における核酸の量の再現性が決定され得る。必要で
あれば、結果は、コントロール配列に対して正規化され得る。コントロール配列
は、本明細書中に記載される任意の使用へ組み込まれ得る。
【００５６】 （Ｂ．プローブ定量または型決め） この実施態様において、エレメントあたり２〜１００のオリゴヌクレオチドが
、アレイ（ここで、エレメントにおける各オリゴヌクレオチドは、異なるかまた
は関連する配列である）に固定化される。好ましくは、各エレメントは、既知ま
たは関連するセットの配列を有する。このようなアレイへの標識化プローブのハ
イブリダイゼーションは、プローブの特徴付けおよびプローブ集団に含まれる配
列の同定および定量を可能にする。
【００５７】 以下で議論される特定の適用に使用され得る、一般化されたアッセイ形式は、
サンドイッチアッセイ形式である。この形式は、既知の配列の複数のオリゴヌク
レオチド（例えば、２〜１００）が、アレイの同じエレメントに固定化される。
従って、各エレメントは、既知または関連したセットの配列を有する。固定化さ
れたオリゴヌクレオチドが使用され、核酸（例えば、ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＰＣＲ
産物、フラグメント化ＤＮＡ）を捕獲し、次いで、シグナルプローブが、捕獲さ
れた標的核酸の異なる部分へハイブリダイズされる。
【００５８】 別の一般化アッセイ形式は、二次検出システムである。この形式において、ア
レイが使用され、一次結合アッセイに使用された標識化核酸を同定し、そして定
量する。例えば、アッセイが、標識化核酸を生じる場合、その核酸のアイデンテ
ィティー同定は、アレイへのハイブリダイゼーションによって決定され得る。こ
れらのアッセイ形式は、切断可能な質量分析タグと組合わせた場合、特に有用で
ある。
【００５９】 （Ｂ．変異検出） 疾患の検出は、予防および処置において、ますます重要である。多因子性疾患
のための遺伝子試験を開発するのは困難であるが、２００を超える既知のヒトの
障害が単一遺伝子における欠損、しばしば、疾患を生じる単一のアミノ酸残基の
変化によって生じる（Ｏｌｓｅｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａｎ Ｉｎｄ
ｕｓｔｒｙ ｃｏｍｅｓ ｏｆ ａｇｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、１９８６）。
【００６０】 分析は、受精卵の移植（ＨｏｌｄｉｎｇおよびＭｏｎｋ、Ｌａｎｃｅｔ ３：
５３２，１９８９）前または、健康診断に関連して気道または膀胱から剥離され
た細胞（Ｓｉｄｒａｎｓｋｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：７０６、１９９１）
において実施され得る。また、未知の遺伝子が遺伝子疾患を生じる場合、ＤＮＡ
配列改変体をモニターするための方法は、遺伝子連関分析を通して、疾患の遺伝
を研究するために有用である。
【００６１】 単一ヌクレオチドが関与する変異は、物理的、化学的、または酵素学的手段に
よって試料において同定され得る。一般的に、変異検出の方法は、以前には未知
であった変異の同定に適切であるスキャニング技術と、既知の配列変異体の検出
、識別または定量のために設計される技術とに分類され得る。変異検出のための
いくつかのスキャニング技術は、野生型および変異型配列由来のミスマッチした
相補的ＤＮＡ鎖のヘテロ２重鎖が、異常な移動挙動を示すという観察に基づいて
、開発されている。
【００６２】 本明細書中に記載される方法は、変異スクリーニングのために使用され得る。
ＤＮＡ鎖における変異を検出するための１つの戦略は、野生型配列または変異体
配列である標的配列への試験配列のハイブリダイゼーションによってである。ミ
スマッチした配列は、標的配列に対する、短いオリゴヌクレオチドプローブのハ
イブリダイゼーションに対する不安定化効果を有する（Ｗｅｔｍｕｒ．Ｃｒｉｔ
．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６：２２７，１９９１）。
試験核酸供給源は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはこれらの核酸のいず
れかの増幅であり得る。好ましくは、試験配列の増幅をまず実施し、続いてアレ
イ上に固定された短いオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション
を行う。増幅産物は、固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイに対する
ハイブリダイゼーションパターンを決定することによって、多くの可能性ある配
列についてスキャンされ得る。
【００６３】 本明細書中に記載されるような標識は、一般に、標識化ヌクレオチドを使用す
ることによって、または標識化プライマーを使用することによって最終増幅産物
へ組み込まれる。この増幅産物は、変性されそしてアレイへハイブリダイズされ
る。非結合産物は、洗い落されそしてアレイへ結合した標識は、本明細書中の１
つの方法によって検出される。例えば、切断可能な質量分析タグが使用される場
合。
【００６４】 （Ｄ．発現プロフィール／ディファレンシャルディスプレイ） 人類のような哺乳動物は、それらのゲノムに約１００，０００の異なる遺伝子
を有し、それらの内、小さな割合、おそらく１５％が任意の個々の細胞で発現し
ている。正常な細胞増殖および分化のプロセス、ならびにガンのような病気で生
じる病理的変化は、すべて遺伝子発現における変化によって駆動される。ディフ
ァレンシャルディスプレイ技術によって、個々の細胞タイプに特異的な遺伝子の
同定が可能になる。
【００６５】 簡潔には、ディファレンシャルディスプレイにおいてｍＲＮＡの３’末端部分
は増幅されそしてサイズに基づいて同定される。逆転写のためにポリ（Ａ）テイ
ルの５’境界に結合するように設計されたプライマーを使い、続いて上流の任意
配列プライマーでｃＤＮＡを増幅して、ｍＲＮＡのサブ集合が得られる。このデ
ィファレンシャルディスプレイ法は、複数のプライマーの組み合わせを用いるこ
とによって哺乳動物細胞で発現された遺伝子（約１０，０００〜１５，０００の
ｍＲＮＡ種）をすべて可視化する能力を有する。
【００６６】 アレイの同じエレメントに固定した複数のオリゴヌクレオチドへの増幅したｃ
ＤＮＡのハイブリダイゼーションは、増幅した配列、従って、開始ｍＲＮＡ集団
の同定および定量を可能にし、アレイ上で、２〜１００オリゴヌクレオチドが、
エレメント（ここで、このエレメント中の各オリゴヌクレオチドは、異なる配列
であるかまたは関連配列である）あたりに固定され得る。ハイブリダイズする配
列の同定は、プローブが産生される標的核酸の配列の発現プロファイリングを可
能にする。発現プロファイリングが使用され、細胞シグナル、刺激などに応答す
る遺伝子およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の調節を測定し得る。例えば
、毒物学試験のためのアレイは、個々の領域が種々のサイトカイン（上記を参照
のこと）に対して相補的な配列を含むように構築され得る。毒物学試験のために
、刺激は、一般的に、毒性であることが疑われる、小さな有機化合物または小さ
な有機分子である。またはここで、小さな有機分子の毒物学が決定されるべきで
ある。
【００６７】 本明細書中に開示されるように、多数の遺伝子（例えば、１〜２０００）の発
現を測定するための高処理量方法が開示される。本発明の１つの実施態様内で、
（ａ）１つ以上のタグ化プライマーを使用して、生物学的試料からｃＤＮＡを増
幅するための工程であって、ここでこのタグが特定の核酸分子プローブと相関関
係があり、そして非蛍光分光測定または電位差測定によって検出し得る、工程、
（ｂ）本明細書中で記載されるように、オリゴヌクレオチドのアレイに、増幅し
たフラグメントをハイブリダイズさせる工程、（ｃ）ハイブリダイズしなかった
物質を洗い流す工程、および（ｄ）非蛍光分光測定または電位差測定によってタ
グを検出し、そしてそこから、生物学的試料の遺伝子発現のパターンを決定する
工程を含む、選択された生物学的試料からの遺伝子発現のパターンを分析するた
めの方法が提供される。
【００６８】 固体基板上で、特に切断可能な質量分析タグを使用するタグベースのディファ
レンシャルディスプレイは、異なって発現する遺伝子の特徴付けを可能にする。
これは、目的の２つ以上の細胞タイプまたは試料において発現されるほとんどの
ｍＲＮＡが、サブセットのｍＲＮＡからの部分的なｃＤＮＡ配列の増幅後と直接
比較され得るという原理に基づく。簡潔には、３種類の１塩基が固着したオリゴ
ｄＴプライマーは、目的の細胞または試料からｍＲＮＡを逆転写および増幅させ
るために、一連の任意の１３塩基オリゴヌクレオチドと組合わせて使用される。
１５，０００遺伝子の発現をモニターリングするために、好ましくは少なくとも
９つの異なる任意のプライマーが使用される。目的の２つの細胞集団または２つ
の試料の完全なディファレンシャルディスプレイ分析のために、少なくとも４０
０の増幅反応が実施される。２つの細胞型のタグベースのディファレンシャルデ
ィスプレイ分析と共に、少なくとも１５００の増幅反応が、容易におよび迅速に
実施される。
【００６９】 （Ｅ．単一ヌクレオチド伸長アッセイ） プライマー伸長法は核酸鋳型における単一ヌクレオチドの検出に使用され得る
（Ｓｏｋｏｌｏｖ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３６７１、
１９８９）。元の形式において、嚢胞性線維症遺伝子の既知配列に相補的な３０
塩基のオリゴヌクレオチドおよび２０塩基のオリゴヌクレオチドが、単一の標識
されたヌクレオチドの存在下で伸長され、その遺伝子内の単一ヌクレオチド変化
を正しく同定した。この技術は一般的に任意の１塩基変異の検出に適用できる( Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
８：１１４３−１１４７、１９９１）。
【００７０】 簡潔には、この方法は、最初に既知の単一ヌクレオチド多型に隣接する配列に
、プライマーをハイブリダイズさせる。次いで、プライムされたＤＮＡは、鋳型
中の次の塩基が反応混合物における標識化ヌクレオチドと相補的である場合に、
ＤＮＡポリメラーゼが、標識化ｄＮＴＰ、代表的にはｄｄＮＴＰを付加する条件
へ供される。改変において、ｃＤＮＡは最初に、２つの対立遺伝子の間に単一の
塩基差異を含む、目的の配列について増幅される。次いで、各増幅された産物は
、多型に対して１塩基だけ５’側であるプライマーをアニーリングし、そして１
つの標識化塩基（一般にはジデオキシヌクレオチド）だけ伸長することによって
、各対立遺伝子の存在、非存在、または相対量について分析される。正確な塩基
が反応に利用可能な場合のみ、プライマーの３’末端へ塩基が組み込まれる。次
いで、伸長産物は、伸長されない産物がハイブリダイズしないように、オリゴヌ
クレオチドのアレイに対するハイブリダイゼーションによって分析される。
【００７１】 簡潔には、本発明において、各ジデオキシヌクレオチドは、固有のタグで標識
される。４つの反応混合物のうち、ただ１つが、プライマー配列に対してジデオ
キシターミネーターを付加する。変異が存在する場合、これは、アレイへのハイ
ブリダイゼーション後のジデオキシヌクレオチド上の固有のタグによって検出さ
れる。複数の変異が、同様に、固有のタグでＤＮＡプライマーをタグ化すること
によって同時に決定され得る。従って、ＤＮＡフラグメントが、異なるタグ化ジ
デオキシターミネーターを含む、４つの別々の反応物の各々において反応し、こ
こで、このタグは、特定のジデオキシヌクレオチドと相関し、そして非蛍光分光
測定または電位差測定によって検出可能である。ＤＮＡフラグメントは、アレイ
に対してハイブリダイズされ、そしてハイブリダイズしない物質は、洗い流され
る。このタグは、ハイブリダイズしたフラグメントから切断され、そして、それ
ぞれの検出技術（例えば、質量分析、赤外分光測定、定電位電流測定またはＵＶ
／可視分光光度測定）によって検出される。検出されたタグは、研究中の特定の
ＤＮＡフラグメントおよび変異ヌクレオチドのアイデンティティーと相関させら
れ得る。
【００７２】 本発明のアレイが使用され、単一ヌクレオチド伸長アッセイ（ＳＮＥＡ）の産
物を検出し得る。エレメントあたり２〜１００オリゴヌクレオチドが、アレイ（
ここで、このエレメントにおける各オリゴヌクレオチドは、異なるかまたは関連
する配列であり、単一ヌクレオチド伸長アッセイ（ＳＮＥＡ）の所定の産物と相
補的である）に固定され得る。好ましくは、ＳＮＥＡを検出するために使用され
る各オリゴヌクレオチド配列は、隣接するエレメントに含まれる。例えば、ＳＮ
ＥＡの「Ａ」産物が、エレメント１に含まれ、ＳＮＥＡの「Ｔ」産物がエレメン
ト２に含まれ、ＳＮＥＡの「Ｃ」産物がエレメント３に含まれ、ＳＮＥＡの「Ｇ
」産物がエレメント４に含まれる。
【００７３】 （Ｆ．オリゴヌクレオチド連結アッセイ） オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）（Ｌａｎｄｅｇｅｎら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４１：４８７、１９８８）は、大変大きくそして複雑なゲノムにおけ
る既知配列の同定に使用される。ＯＬＡの原理は、所定のＤＮＡ標的で互いに隣
接してハイブリダイズしたとき、２つの診断オリゴヌクレオチドを共有結合する
リガーゼの能力に基づく。もしプローブの接合点の配列が、完全に塩基対合して
いなければ、そのプローブはリガーゼによって結合されない。「上流」プローブ
の３’末端に位置しているときに、可能性のある１塩基対の差異を識別する熱安
定リガーゼの能力によって、１塩基対の解像度を得る機会が提供される（Ｂａｒ
ｏｎｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８：１８９、１
９９１）。タグが使用されたとき、それらはプローブに付着され、プローブは増
幅された産物に連結される。ＯＬＡの終了後、フラグメントは、相補的配列のア
レイにハイブリダイズされ、そのタグは切断され、そして質量分析により検出さ
れる。
【００７４】 本発明の方法の１つの実施態様において、オリゴヌクレオチド連結アッセイの
技術を利用して、例えば、生物学的試料において、核酸分子のアイデンティティ
ーを決定するための方法、あるいは選択する核酸分子を検出するための方法が提
供される。簡潔には、そのような方法は一般に、標的ＤＮＡについて増幅を実行
する工程、続いて、５’タグ化したレポーターＤＮＡプローブおよび５’リン酸
化プローブとハイブリダイズする工程を包含する。その試料はＴ４ ＤＮＡ リ
ガーゼとともにインキュベートされる。連結されたプローブを有するＤＮＡ鎖は
、アレイ（ここでは、連結されない産物は、ハイブリダイズしない）へのハイブ
リダイゼーションによって、アレイ上に捕獲される。このタグは分離されたフラ
グメントから切断され、次いでそれぞれの検出技術（例えば、質量分析法、赤外
分光光度法、定電位電流測定法または紫外／可視分光光度法）で検出される。
【００７５】 本発明において、複数の試料および複数の変異は同時に分析され得る。簡潔に
は、その方法は、目的の変異を含む遺伝子フラグメントを増幅する工程から成る
。その増幅された産物は、次いで共通プローブまたは２つの対立遺伝子特異的な
オリゴヌクレオチドプローブ（一方は変異を含むが、他方は含まない）とハイブ
リダイズし、その結果、対立遺伝子特異的プローブの３’末端は、共通プローブ
の５’末端にすぐ隣接する。このことによってそれぞれの遺伝子座で２つの対立
遺伝子プローブと共通プローブとの間で競合的なハイブリダイゼーション−連結
プロセスが組み立てられている。
【００７６】 本発明の方法の１つの実施態様において、同時複数試料検出のためのオリゴヌ
クレオチド連結アッセイ技術を利用して、例えば、生物学的試料において、核酸
分子のアイデンティティーを決定する、または選択する核酸分子を検出する方法
が提供される。簡潔には、そのような方法は一般に、標的ＤＮＡを増幅する工程
、続いて共通プローブ（非タグ化）および本発明の明細書に従ってタグ化された
２つの対立遺伝子特異的プローブとハイブリダイズさせる工程を包含する。この
試料はＤＮＡリガーゼと共にインキュベートされ、フラグメントがハイブリダイ
ゼーションによってアレイ上に捕獲される。そのタグは、この分離されたフラグ
メントから切断され、次いでそれぞれの検出技術（例えば、質量分析法、赤外分
光光度法、定電位電流測定法および紫外／可視分光光度法）によって検出される
。
【００７７】 Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（Ｌａｎｄｅｇｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４８
７、１９８８）によって本来記載されるようなオリゴヌクレオチド連結アッセイ
は、非常に大きくそして複雑なゲノムにおける配列（既知の）の同定のために有
用な技術である。ＯＬＡ反応の原理は、これらが所定のＤＮＡ標的において、互
いに隣接してハイブリダイズするとき、２つの診断的オリゴヌクレオチドを共有
結合させるリガーゼの能力に基づく。プローブ接合部の配列が、完全な塩基対で
ない場合、このプローブはリガーゼによって結合されない。可能性のある１塩基
対差異を区別する熱安定リガーゼの能力は、「上流」プローブの３’末端に位置
する場合、単一塩基対分解能のための機会を提供する（Ｂａｒｏｎｙ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１８９、１９９１）。タグの適用において、このタグは、増幅
産物に連結されるプローブに付着する。ＯＬＡの完了後、フラグメントが、アレ
イにハイブリダイズされ、タグが切断されそして質量分析によって検出される。
【００７８】 別の実施態様において、オリゴヌクレオチド−連結アッセイは、２つの隣接す
るオリゴヌクレオチドを使用する：「レポーター」プローブ（５’末端でタグ化
される）および５’リン酸化／３’タグ化「アンカー」プローブ。異なるタグを
組み込んだ、２つのオリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡに対してアニーリングさ
れ、そして完全に相補的である場合、２つのプローブはＴ４ ＤＮＡリガーゼに
よって連結される。１つの実施態様において、３’タグはビオチンであり、そし
て固定されたストレプトアビジン上のビオチン化アンカープローブを捕獲し、そ
して標的配列の存在または非存在についての共有結合レポータープローブ試験を 分析する。
【００７９】 （Ｇ．他のアッセイ） 本明細書に記載された方法はまた、ウイルスまたは微生物の遺伝子型決定また
は同定に対しても利用され得る。例えば、Ｆ＋ＲＮＡコリファージは、腸ウイル
ス汚染の指標として有用な候補であり得る。核酸の増幅およびハイブリダイゼー
ション法による遺伝子型の決定は、信頼でき、早く、単純であり、そして高価で
ない、血清型決定の代替である（Ｋａｆａｔｏｓら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．７：１５４１、１９７９）。増幅技術および核酸のハイブリダイゼ
ーション技術は大腸菌（Ｆｅｎｇ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ７：１５
１、１９９３）、ロタウイルス（Ｓｅｔｈａｂｕｔｒら Ｊ．Ｍｅｄ Ｖｉｒｏ
ｌ ３７：１９２、１９９２）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｓｔｕｙｖｅｒら、Ｊ．Ｇ
ｅｎ Ｖｉｒｏｌ．７４：１０９３、１９９３）および単純ヘルペスウイルス（
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４０：１１９、１９
９２）を含む様々な微生物を分類するために首尾よく利用されつづけている。
【００８０】 遺伝子改変は、様々な実験哺乳動物新生物およびヒト新生物において記載され
ており、そして、発ガン現象で観察される形態学的変化の続発の形態的な基礎を
示す（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎら、ＮＥＪＭ ３１９：５２５、１９８８）。近年
、分子生物学技術の到来と共に、特定染色体上のアレイの欠如または腫瘍抑制遺
伝子の変異およびいくつかのガン遺伝子（例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎおよ
びｒａｓファミリー）における変異が、最も研究されている事柄である。以前の
研究（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎら、 Ａｒｃｈ Ｓｕｒｇ．１２８：５２６、１
９９３）は、Ｋ−ｒａｓガン遺伝子中の特定の型の点変異と結腸直腸ガン腫にお
ける診断のステージとの間の相関を同定した。この結果は、変異分析が、転移の
パターンおよび広がりを含む、腫瘍の攻撃性に関する重要な情報を提供し得るこ
とを示唆した。結腸の第３期ガン腫におけるＴＰ５３およびＫ−ｒａｓ−２変異
分析の予後の値が、より最近になって示された（Ｐｒｉｃｏｌｏら、Ａｍ．Ｊ．
Ｓｕｒｇ．１７１：４１、１９９６）。したがって、腫瘍および前ガン状態細胞
の遺伝子型決定、および特定の変異の検出は、ヒトにおけるガンの処置において
ますます重要になることが明らかである。
【００８１】 以下の実施例は、例示のために提供され、限定ではない。
【００８２】 （実施例） （実施例１：市販のスプリングプローブからのアレイ化チップ（ａｒｒａｙｉ
ｎｇ ｔｉｐ）の調製） この実施例は、アレイに試料を沈着することにおける使用のための、スプリン
グプローブチップの製造および改変を記載している。
【００８３】 ＸＰ５４Ｐスプリングプローブは、Ｏｓｂｙ−Ｂａｒｔｏｎ（Ｅｖｅｒｅｔｔ Ｃｈａｒｌｅｓ（Ｐｏｍｏｎａ、ＣＡ）の１部門）から購入する。このプロー
ブを、超微細ダイヤモンド砥石上に「チップダウン（ｔｉｐ−ｄｏｗｎ）」に配
置し、そして緩やかな圧力で約０．５ｃｍ、その石の上を移動させた。顕微鏡で
観察して、金属の約０．００５インチ（０．００１〜０．０１インチ）をチップ
の末端から取り除く。このチップ末端を皮細片を横切ってチップをこすることに
より磨き、次いで水で洗浄した。チップは乾燥して保存されるかまたは−２０℃
で５０％グリセロール中で保存される。アレイの調製における使用のために、こ
のチップを、アレイの様式で頭部に取り付ける。この頭部をＺ軸で制御し得る動
作を所有するロボットアーム上に取り付ける。
【００８４】 （実施例２：ガラススライド上のマイクロスフェアのアレイの調製） ガラススライド上で容易に検出し得るマイクロスフェアの沈着は、アレイ形成
の再現性を示している。この手順では、５６％グリセロール、０．０１Ｍ Ｔｒ
ｉｓ、ｐＨ ７．２、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ サルコシルおよび１％
ｖ／ｖ Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ Ｐｌａｉｎ ０．５μＭ マイクロスフェ
ア（２．５％ 固体ラテックス）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇ
ｔｏｎ、ＰＡ）からなる溶液が調製される。アレイピンを５秒間、この溶液に５
ｍｍ浸漬する。次いでマイクロスフェアをガラススライド上に繰り返し並べる。
スライドの顕微鏡写真を蛍光用のフィルターを用いて蛍光光下で撮影する。図１
は、このアレイの各領域における沈着された溶液の量が非常に一致していること
を示す。さらに、少なくとも１００の沈着物がピックアップ当たりに作製され得
、これらは実質的に同一である。
【００８５】 （実施例３：修飾された親水性スプリングプローブを用いたアレイ調製） 試料のピックアップ、移入およびミクロ小滴沈着は、親水性の表面を有する液
体移入デバイスを用いるとき、特にこのデバイスが修飾されたスプリングプロー
ブであるとき大いに高められる。プローブの表面を修飾するために作用する化学
薬剤の使用によるか、または親水性物質を用いたプローブのコーティングにより
スプリングプローブは親水性となる。好ましい方法では、スプリングプローブの
チップは、２５〜２００ｍＭの１，４−ジチオスレイトール溶液、０．１Ｍ ホ
ウ酸ナトリウム中に１５分〜２時間浸される。ジチオスレイトールは、チオール
−金の配位により金表面と反応し、これは、その表面を本質的に水酸化し、それ
を親水性にする。
【００８６】 アレイ化溶液は、５６％グリセロールおよび食用青で着色した４４％の水から
成っている。アレイ化チップをアレイ化溶液中に２秒間５ｍｍ浸す。次いで、グ
リセロールを保持するチップをロボットにより制御して、シリコンウエハ上に１
２×６グリッド中７２の微小スポットをプリントする。生成されたスポットは、
直径が約１００〜１５０ミクロンであり、スポット間の中心間の間隔が２００ミ
クロンである。図２は、生成されたグリッドのＣＣＤカメラ画像を示す。スポッ
ト直径の標準偏差は約１５％である。
【００８７】 （実施例４：アレイオリゴヌクレオチドの比色検出） 鋳型オリゴヌクレオチド（０．５μｇ／μｌの７５μｌ） （５’−ヘキシル
アミンＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣＴ−ＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧ−３
’）を室温で３０分間、２０μｌの１Ｍホウ酸ナトリウム中で５μｌの２０ｍｇ
／ｍｌ 塩化シアヌルと反応させる。この反応から、アレイ化溶液が作製され、
５６％ グリセロ−ル、５６ｎｇ／μｌ オリゴヌクレオチド、０．０６ｍＭ
ホウ酸ナトリウムおよび０．３ｍｇ／ｍｌ 塩化シアヌルからなる。このアレイ
化チップを２秒間アレイ化溶液に５ｍｍ浸す。次いで、この溶液を保持するチッ
プをロボットにより制御して、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をコートしたシリ
コンウエハに、１２×６グリッド中７２の微小スポットをプリントする。生成さ
れたスポットは、直径が約１００〜１５０ミクロンであり、スポット間の中心間
の間隔が２００ミクロンである。アレイ化の後、ウエハの未反応のＰＥＩ部位を
１５分間１００％のｎ−メチルピロリニドン中の１００ｍｇ／ｍｌ 無水コハク
酸でブロックし、水で３回洗浄する。未反応塩化シアヌル部位は、１５分間、０
．０１Ｍ Ｔｒｉｓ中の０．１Ｍ グリシンでブロックし、Ｔｅｎｓ緩衝液（０
．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、０．０１ＭＴｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）
で４回洗浄する。次いで、鋳型オリゴマーをそのビオチン化した相補体（５’ビ
オチン−ＴＧＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＡＴＧ−３’）と２０分
間３７℃でハイブリダイズさせ、次いで、６×Ｔｅｎｓおよび２×ＯＨＳ（０．
０６Ｍ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、６×ＳＳＣ
（３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、３．６８ｍ
Ｍ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．００５％ ＮＰ−４０）で洗浄する。次いで
、ウエハを０．５μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン
に、１５分間浸し、次いで、２×Ｔｅｎｓ、４×ＴＷＳ（０．１Ｍ ＮａＣｌ、
０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ）で洗浄する。次いで、微
小スポットをＶｅｃｔｏｒ Ｂｌｕｅ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）（キットのプロトコールに
従って）を用いて発色させ、そしてＣＣＤカメラおよび顕微鏡で画像化する。図
３は、生成された画像を示す。得られた微小スポットは、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ（
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ、ＭＤ）によって測定すると直径で約１５％の変動および約１０％の変動のす
る強度値を有する。
【００８８】 （実施例５：単一のアレイレメント内の複数オリゴ） ２つの鋳型オリゴ（＃１、５’−ヘキシルアミン−ＴＧＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡ
ＡＧＣＡＧＧＡＧＴＡＴＧ−３’、＃２、 ５’−ヘキシルアミン−ＡＣＴＡＣ
ＴＧＡＴＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’
）を０．５μｇ／μｌで別々に、５μｌの２０ｍｇ／ｍｌ 塩化シアヌルおよび
２０μｌの１Ｍ ホウ酸ナトリウムと、室温で３０分間、全反応容量１００μｌ
で反応させる。これらの２つの反応から、アレイ化溶液を、５６％のグリセロー
ルと２つの反応させたオリゴの希釈組み合わせとから作製する（以下の表を参照
のこと）。８つのアレイ化チップを２秒間、８つのアレイ化溶液の各々に５ｍｍ
浸す。この溶液を保持するチップをロボットにより制御して、２セットの８つの
１２×６グリッドをプリントする。各グリッドはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
をコートしたシリコンウエハ上に７２の微小スポットを含んでいる。各グリッド
は単一アレイ化溶液を表している。この生成されたスポットは、直径が約１００
〜１５０ミクロンであり、スポット間の中心間の間隔が２００ミクロンである。
【００８９】 アレイ化に続いて、ウエハ上の未反応のＰＥＩ部位を１００％ ｎ−メチルピ
ロリニドン中の１００ｍｇ／ｍｌ 無水コハク酸で１５分間ブロックし、水で３
回洗浄する。未反応の塩化シアヌル部位は、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ中の０．１Ｍ
グリシンで１５分間ブロックし、４×Ｔｅｎｓ（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄する。次いで、２
回のハイブリダイゼーションを実施する。最初のハイブリダイゼーションでは、
１セットの８つのアレイオリゴの組み合わせをオリゴ＃１と相補的であるオリゴ
ヌクレオチド ５’−ビオチン−ＴＧＴＧＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴ
ＡＴＧ−３’とハイブリダイズさせる。第２のハイブリダイゼーションでは、他
のセットの８つのアレイオリゴの組み合わせをオリゴ＃２と相補的であるオリゴ
ヌクレオチド（５’−ビオチン−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧ
ＧＣＧＣＧＣＣＴＧＡＴＣＡＧＴＡＧＴ）とハイブリダイズさせる。これらのハ
イブリダイゼーションは、Ｈｙｂｒｉｗｅｌｌ Ｓｅａｌｉｎｇ Ｃｏｖｅｒｓ
（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔ Ｐｒｏｓｐｅｃｔ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）の下で
２０分間、３７℃で同時におこなわれ、続いて、６×Ｔｅｎｓ、２×ＯＨＳ（０
．０６Ｍ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、６×ＳＳ
Ｃ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、３．６８
ｍＭ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．００５％ ＮＰ−４０）で洗浄する。ハ
イブリダイゼーション後、このウエハを０．５μｇ／ｍｌの西洋ワサビペルオキ
シダーゼストレプトアビジン中に１５分間浸し、次いで、２×Ｔｅｎｓ、４×Ｔ
ＷＳ（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０．０５Ｍ Ｔｒｉ
ｓ）で洗浄する。次いで、この微小スポットを、０．４ｍｇ／ｍｌ ４−メトキ
シ １−ナフトール（０．０２％過酸化水素、１２％メタノール、ＰＢＳ）を用
い発色させ、最後に３回水で洗浄する。
【００９０】 オリゴ＃１の相補体とハイブリダイズする混合オリゴのセットは、最高濃度の
オリゴ＃１を含むグリッドに対して最大の色強度を示し、そして最低濃度のオリ
ゴ＃１を含むグリッドと最小の色強度を示す。その一方、オリゴ＃２の相補体と
ハイブリダイズする混合オリゴのセットは、最高濃度のオリゴ＃２を含むグリッ
ドに対して最大の色強度を示し、そして最低濃度のオリゴ＃２を含むグリッドと
最小の色強度を示した（図４を参照のこと）。
【００９１】
【表２】
【００９２】 前記から、本発明の具体的な実施態様が例示の目的で本明細書に記載されてい
るが、様々な改変が本発明の思想および範囲を逸脱することなくなされ得ること
が理解される。従って、本発明は、添付の請求の範囲によることを除いて制限さ
れない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、可視光照射（上のパネル）および蛍光照射（下のパネル）下で撮影さ
れたアレイ化したミクロスフェアの顕微鏡写真を示す。
【図２】 図２は、本発明の方法論を使用してロボットにより生成したアレイのＣＣＤカ
メラ画像を示し、このドメインは、平均直径が約１００〜１５０ミクロンであり
、各スポット間の中心間の間隔が２００ミクロンである。このスポット直径の標
準偏差は約１５％である。
【図３】 図３は、本発明に従って調製され、ベクターブルー（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して
発色され、ならびにＣＣＤカメラおよび顕微鏡を用いて画像化した微小スポット
のアレイを示す。
【図４】 図４は、共に単一のアレイエレメント内に存在する２つの異なるオリゴヌクレ
オチドが、本発明に従って、いかにして同定され、そして部分的に定量され得る
かを示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 モイニハン， クリステン アメリカ合衆国 ワシントン 98105， シアトル， ９ティーエイチ アベニュー ノースイースト 5026 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 CA11 CA12 CA20 HA13 HA14 4B063 QA01 QA13 QQ42 QQ53 QR08 QR32 QR35 QR38 QR42 QR55 QR62 QR84 QS24 QS34 QX02 QX07 QX10

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 核酸分子のアレイであって、核酸分子の別個の領域を含む表
    面を有する固体基板を備え、ここで少なくとも１つの領域が、異なる配列を有す
    るように選択された少なくとも２つの核酸分子を含有する、アレイ。
  2. 【請求項２】 １０００未満の別個の領域がある、請求項１に記載のアレイ
    。
  3. 【請求項３】 前記核酸がオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のア
    レイ。
  4. 【請求項４】 各領域が異なる配列を有する少なくとも２つの核酸分子を含
    有する、請求項１に記載のアレイ。
  5. 【請求項５】 少なくとも１つの領域が、２〜約１００の異なる核酸配列を
    含有する、請求項１に記載のアレイ。
  6. 【請求項６】 領域が直径約２０〜約５００ミクロンである、請求項１に記
    載のアレイ。
  7. 【請求項７】 領域間の中心間距離が約５０〜１５００ミクロンである、請
    求項１に記載のアレイ。
  8. 【請求項８】 前記核酸分子が公知の配列を有する、請求項１に記載のアレ
    イ。
  9. 【請求項９】 前記核酸分子が前記基板の表面に共有結合的に付着される、
    請求項１に記載のアレイ。
  10. 【請求項１０】 前記共有結合性付着がアミン結合を介する、請求項９に記
    載のアレイ。
  11. 【請求項１１】 前記基板の表面がポリ（エチレンイミン）でコートされる
    、請求項１０に記載のアレイ。
  12. 【請求項１２】 ハイブリダイゼーション分析の方法であって、以下の工程
    ： （ａ）標識化核酸分子を、請求項１に記載の核酸分子のアレイにハイブリダイ
    ズする工程；および （ｂ）該アレイの領域で標識を検出し、それにより該アレイ上のどの核酸分子
    がハイブリダイズしたかを決定する工程、 を包含する、方法。
  13. 【請求項１３】 前記アレイの少なくとも１つの領域が公知の配列を含有し
    、前記標識化核酸分子の１つが該公知の配列に相補性である、請求項１２に記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】 前記アレイの各領域が前記公知の配列を含有する、請求項
    １３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記標識化核酸分子が、異なる配列を有する核酸分子を含
    み、各々異なる標識を有する、請求項１２に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記標識が放射性分子、蛍光分子、および切断可能な質量
    分析タグの群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 試料中の核酸分子を同定する方法であって、以下の工程： （ａ）標識化オリゴヌクレオチドを該核酸分子にハイブリダイズし、二重鎖を
    形成させる工程； （ｂ）該二重鎖を単離する工程； （ｃ）該二重鎖を変性する工程； （ｄ）該標識化オリゴヌクレオチドを、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド
    のアレイにハイブリダイズする工程であって、ここで該アレイ上のオリゴヌクレ
    オチドは該標識化オリゴヌクレオチドに相補性である、工程；および （ｅ）該アレイの領域で標識を検出し；それにより該試料中の核酸分子を同定
    する工程； を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 試料中の核酸分子を同定する方法であって、以下の工程：
    （ａ）オリゴヌクレオチドを該核酸分子にハイブリダイズする工程； （ｂ）単一の標識化ヌクレオチドの存在下で該オリゴヌクレオチドを伸長し、
    二重鎖を形成させる工程； （ｃ）該二重鎖を変性する工程； （ｄ）該標識化オリゴヌクレオチドを、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド
    のアレイにハイブリダイズする工程であって、ここで該アレイ上のオリゴヌクレ
    オチドは該標識化オリゴヌクレオチドに相補性である、工程；および （ｅ）該アレイの領域で標識を検出し；それにより該試料中の核酸分子を同定
    する工程； を包含する、方法。
  19. 【請求項１９】 前記アレイの別個の領域内のオリゴヌクレオチドが該核酸
    分子の伸長生成物に相補性である、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 試料中の核酸分子を同定する方法であって、以下の工程： （ａ）少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを該核酸分子にハイブリダイズし
    、二重鎖を形成させる工程であって、ここで少なくとも１つのオリゴヌクレオチ
    ドが標識され、そして該オリゴヌクレオチドは該核酸分子上の隣接する配列にハ
    イブリダイズする、工程； （ｂ）該オリゴヌクレオチドを連結する工程； （ｃ）該二重鎖を変性する工程； （ｄ）該標識化オリゴヌクレオチドを、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド
    のアレイにハイブリダイズする工程であって、ここで該アレイ上のオリゴヌクレ
    オチドは該連結オリゴヌクレオチドに相補性であり；そしてここでハイブリダイ
    ゼーションは非連結オリゴヌクレオチドには生じない、工程；および （ｅ）該アレイの領域で標識を検出し；それにより該試料中の核酸分子を同定
    する工程； を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 試料中のｍＲＮＡ分子を同定する方法であって、以下の工
    程： （ａ）標識化オリゴヌクレオチドを該ｍＲＮＡ分子にハイブリダイズし、二重
    鎖を形成させる工程； （ｂ）該二重鎖を単離する工程； （ｃ）該二重鎖を変性する工程； （ｄ）該標識化オリゴヌクレオチドを、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド
    のアレイにハイブリダイズする工程であって、ここで該アレイ上のオリゴヌクレ
    オチドは該標識化オリゴヌクレオチドに相補性である、工程；および （ｅ）該アレイの領域で標識を検出し；それにより該試料中のｍＲＮＡ分子を
    同定する工程； を包含する、方法。
  22. 【請求項２２】 前記ｍＲＮＡ分子が、毒であると疑われる化合物で処理さ
    れた細胞から単離される、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記アレイ上のオリゴヌクレオチドがサイトカインの配列
    である、請求項２２に記載の方法。
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