【発明の詳細な説明】
ステロイドホルモンの永久に荷電された誘導体の増進された抗血管形成誘導活性
発明の分野
本発明は病理学的血管形成または血管形成の予防を必要とする症状の治療また
は予防に有益である医薬組成物に関する。更に特別には、本発明は改良された抗
血管形成誘導特性を有するステロイドアゴニストまたはアンタゴニストの四級誘
導体の使用に関する。
発明の背景
血管形成
血管形成は、毛細血管が規則的なイベントの順序で成長する複雑なプロセスで
ある(Folkman及びKlagsbrun，Science 235，442-447，1987;Folkman及びShing,J
.Biol.Chem．267，10931-10934，1992)。証拠の実体は、主要血管形成が充実性
腫瘍の増殖及び転移の基礎であるという仮説を支持する(Folkman及びKlagsbrun
の上記文献，1987;Weidnerら，Amer.J.Pathol．143，401-409,1993;O'Reillyら
，Cell 79，316-328，1994)。実際に、臨床腫瘍の大半は新血管形成の発生後ま
で臨床上検出できず、充実性腫瘍中のその誘導は一つ以上の血管形成誘導因子に
より媒介される。
更に、血管形成はまた関節炎、乾癬、糖尿病性網膜症、早熟の網膜症、黄斑変
性、硬皮症、血管腫、水晶体後線維増殖、血友病関節中の異常な毛細管増殖、延
長された月経及び女性の生殖系のその他の疾患を含むが、これらに限定されない
幾つかのその他の病理学的プロセスに重要である。こうして、血管形成の阻止方
法が明らかに必要である。
血管形成の基本的メカニズムは以下のように簡単に概説し得る。新しい毛細管
が細静脈の側から出芽する時、内皮細胞が基底膜を分解し、血管形成誘導源に向
かって移動し、増殖し、管腔を形成し、二つの新芽の先端を結合して毛細管ルー
プを生じ、新しい基底膜をつくる(Folkman，Perspectives in Biology and Med-
icine，29，1-36，1985)。
細胞外マトリックス(ECM)の分解及びリモデリング(remodeling)が血管形成の
メカニズムに必須のプロセスである。加えて、内皮細胞により合成されたECM成
分（即ち、コラーゲン、ラミニン、トロンボスポンジン、フィブロネクチン及び
SPARC)が内皮細胞成長、移動及び成形を調節するように機能する(Bischoff，Tr-
ends Cell Biol．5，69-744，1995)。ウシ大動脈内皮細胞(BAE)は、出芽及び管
形成を行う間に、コラーゲン及びSPARCを合成する。型ＩコラーゲンがBAE細胞の
移動及び集合を誘導するのに関係し得ることが提案されていた（Iruela-Arispe
ら，Lab.Invest．64，174-186，1991)。
血管形成関連疾患を治療するために、血小板因子４、フマギリン誘導体AGH147
0、インターフェロン（α2ａ、トロンボスポンジン、血管血行静止ステロイド、
及びアンギオスタチン(Folkmanの上記文献，1995;O'Reillyらの上記文献，1994)
を含む血管形成メカニズムの幾つかのインヒビターが研究されている。加えて、
アンチ−エストロゲンがまた血管形成を抑制することが示されていた(Ga-rliard
i及びCollins，Cancer Res．53，533-535，1993)。不運なことに、これらのイン
ヒビターの多くの全てがそれらの効果において比較的非特異性であり、ひいては
潜在的に毒性である性質を共有する。更に特定のインヒビター、特にその他の生
理機能に悪影響しないで血管形成の基礎となるメカニズムを選択的に阻止するイ
ンヒビターが最も有益であろう。更に、現在抗血管形成誘導剤として評価されて
いる化合物の多くは、一般に不十分な生物利用可能性を問題とし、また生体中で
容易に分解されるタンパク質（例えば、抗体、トロンボスポンジン、アンギオス
タチン及び血小板因子IV）である。それ故、それらは高用量及び高頻度で投与さ
れる必要がある。
こうして、その他の生理学的プロセスに実質的に影響しないで血管構造の増殖
を特異的に阻止する血管形成のインヒビター（腫瘍増殖または進行と関連する血
管形成のインヒビターを含む）に対する広く認められている満たされていない要
望がある。
永久に荷電されたステロイドホルモン及びそれらのアンタゴニスト
乳癌に関する医薬療法は現在ホルモン剤及び細胞毒性剤からなる。ホルモン
療法は、多くの婦人では、乳癌細胞がステロイドホルモンエストロゲンのレセプ
ターを有するので開発された。これらのエストロゲンレセプター陽性癌細胞の増
殖はエストロゲンにより刺激し得る。アンチ−エストロゲン療法はエストロゲン
の合成を低下または停止し、または癌細胞に対するエストロゲンの作用を阻止し
ようと試みる。
全てのホルモナールの中で、タモキシフェン（米国特許第4,536,516号）が優
位な位置を保持する。エストロゲンレセプター陽性腫瘍を有する患者で乳癌を治
療するためにアンチ−エストロゲンとして初期に使用されていた薬剤がまたエス
トロゲンレセプター陰性腫瘍を有する婦人の乳癌の増殖を遅くすることがわかっ
た。それ故、タモキシフェンは殆どの患者に有益である。アンチ−エストロゲン
タモキシフェンは乳癌患者の再発の遅延及び進行した転移性乳癌の待期療法に特
に有効である。それはまたグリオーム及び肝癌並びに子宮内膜、子宮、卵巣及び
前立腺の腫瘍の治療に有益である(Litherland,S.ら，Cancer Treatment Reviews
,15，183，1988;Jordan,C.，Br.J.Pharmacol.，110，507，1993)。
タモキシフェンを含むアンチ−エストロゲンは癌組織中のレセプター部位に対
しエストロゲンと競合する。アンチ−エストロゲンによるレセプター部位の占有
はエストロゲンにより生じる転写作用の全スペクトルを誘発することができなく
し、こうして、それらの活性を阻止する。一般に、エストロゲンは最初に標的細
胞シトゾルレセプターに結合し、次いで細胞核に移動し、そこでそれらがDNA転
写に影響することにより機能すると考えられる。
かなりの努力がアンチ−エストロゲン化合物としてのそれらの増大された選択
性（例えば、米国特許第4,973,755号;EP 0 168,175)またはエストロゲンレセプ
ターに対するそれらの高いアフィニティー(WO 92/06068)のために、改良された
治療潜在性を有すると推測された新規なタモキシフェン類縁体の開発に投じられ
ていた。
親水性化合物、特にイオン電荷（陽イオンまたは陰イオン）を有する化合物は
しばしばCNS及び脳に非常に不十分に分配される。何とならば、親油性バリヤー
（血液脳関門）が存在するからである。薬剤に永久電荷を生じる一つの方法は四
級アンモニウム塩（結合された四つの炭化水素基を有する窒素）の組込みであ
る。
タモキシフェン及びアミノ基を含むその他のアンチ−エストロゲンは四級化し
得る（四級アンモニウム基に変換し得る）。このような四級化は永久の正の電荷
を親分子に付与することをもたらし、これは生理学的膜（これらは本来親油性で
あり、しかもイオン、特に大きいイオンの侵入に対し耐性である）を横切るその
分子の侵入を有効に低下すべきである。
タモキシフェンの幾つかの四級塩が調製され、科学文献(Jarmanら，Antican-c
er Drug Design，1，259，1986)に記載されていた。in vitroで試験した場合、
これらの誘導体は培養中に増殖した胸部腫瘍細胞系の増殖を停止しないと報告さ
れた。それ故、これらの化合物はin vivoの治療価値がないと予測された。
WO 95/26720は、予期しないことに、アンチ−エストロゲンタモキシフェンの
のイオン誘導体（これらはそれらのin vitroの活性の欠如に基いてin vivoで価
値がないと予測された）が実際に親化合物よりもin vivoで抗癌剤として活性で
あることを開示していた。この発明は、原則として、副作用がCNSへの薬剤の接
近を防止することにより軽減または排除し得る多種のその他のアンチ−エストロ
ゲンに適用し得る。
ヌードマウスに移植されたMCF-7ヒト乳癌の研究において、TMIはその抗癌作用
においてタモキシフェンよりもかなり効力があることが判明した。TMIは投与開
始直後に殆ど開始し、試験した動物の40％で移植された癌の完全な退行(regress
ion)をもたらす腫瘍退行を誘発した。親化合物であるタモキシフェンはその研究
中に腫瘍増殖を単に遅延した(Cancer Res．56，4238，1996)。
タモキシフェン及びその他のアンチ−エストロゲンは腫瘍中で血管血行静止活
性を有すると報告されたが、血管形成の抑制のメカニズムは明らかではない(Can
cer Res．54，5511，1994;Cancer Res．53，533，1993)。
発明の要約及び目的
本発明によれば、永久に荷電されたステロイドアゴニスト及びアンタゴニスト
が予期しないことに強力な抗血管形成誘導剤であることが今開示される。更に、
永久に荷電されたアンチ−エストロゲンが細胞外マトリックスの再構築に必要と
されるコラゲナーゼを含むメタロプロテアーゼの転写を抑制することによりそれ
らの抗血管形成誘導作用を媒介し得ることが開示される。
また、本発明の目的は遅延血管形成並びに血管形成を伴うその他の疾患及び症
状の臨床治療のための永久に荷電されたステロイドアゴニスト及びアンタゴニス
トを提供することである。本発明の方法は、グルココルチコイド、エストロゲン
、アンドロゲン及びプロゲスチンの荷電された誘導体またはそれらの夫々のアン
タゴニストを含むが、これらに限定されない種々のステロイドアゴニスト及びア
ンタゴニストとともに有益であろう。
現在好ましい実施態様において、本発明の目的は遅延血管形成並びにその他の
疾患及び症状の臨床治療のための永久に荷電されたアゴニスト及びアンタゴニス
トを提供することである。これらの抗血管形成誘導アンチ−エストロゲンはエス
トロゲンアンタゴニスト活性を有し、かつ部分エストロゲンアゴニスト活性また
は混合活性を有し得るが、永久に荷電されることにより生体分布に制限され、そ
れにより低下された副作用を示し、かつ臨床使用に有益である。本発明の別の目
的及び臨床上の利益はそれらが脂肪組織中で金属イオン封鎖されないという事実
のためにこれらの薬剤の循環からの比較的迅速な排除であり、それにより毒性を
低下し、かつ投薬の正確な調節を可能にする。本発明の更に別の目的は前記抗血
管形成誘導アンチ−エストロゲン剤の製剤化及び薬剤送出を提供することである
。
本発明のこれらの目的及びその他の目的は活性成分として医薬有効量の一般式
Ｉ：
の化合物を含む組成物を提供することにより達成される。
式中、
Ｙは無毒性の医薬上許される陰イオンであり、
薬剤はステロイドアゴニストまたはアンタゴニスト、混合アゴニスト−アンタ
ゴニスト、及び部分アゴニストからなる群から選ばれた基であり、
Ｘは直接結合または-O-、-NH-、-NR-（式中、Ｒは10個未満の炭素を有するア
ルキル基またはアリール基である）、-PO3-、-S-、-SO-、及び-SO2-からなる群
から選ばれた基であり、
Ｒ1及びＲ2は同じであり、または異なり、Ｈ、1-10個の炭素原子のアルキル、
7-16個の炭素のアリールアルキル、及びアリールからなる群から選ばれた基であ
ってもよく、
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は独立に1-10個の炭素原子の分岐または非分岐、環状または
非環状アルキル；カルボキシ基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、ハロ基もしくは
ニトロ基により置換された10個までの炭素原子のアルキル；7-16個の炭素原子の
分岐または非分岐、環状または非環状アリールアルキル；及びアリールからなる
群から選ばれた基であり、かつ
ｎは0-12である。
Ｙは下記の陰イオン：リン酸イオン、硫酸イオン、塩化物イオン、臭化物イオ
ン、ヨウ化物イオン、アルキルスルホン酸イオンもしくはアリールスルホン酸イ
オン、または有機陰イオン、例えば、酢酸イオン、クエン酸イオンまたはシュウ
酸イオンにより例示されるが、これらに限定されない。
その一般式の更に特別な場合及び好ましい実施態様は
である。
式中、
Ｙは無毒性の医薬上許される陰イオンであり、
アンチ−エストロゲンはエストロゲンアンタゴニスト、混合アゴニスト−アン
タゴニスト、及び部分アゴニストからなる群から選ばれた基であり、
Ｘは直接結合または-O-、-NH-、-NR-（式中、Ｒは10個未満の炭素を有するア
ルキル基またはアリール基である）、-PO3-、-S-、-SO-、及び-SO2-からなる群
から選ばれた基であり、
Ｒ1及びＲ2は同じであり、または異なり、Ｈ、1-10個の炭素原子のアルキル、
7-16個の炭素原子のアリールアルキル、及びアリールからなる群から選ばれた基
であってもよく、
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は独立に1-10個の炭素原子の分岐または非分岐、環状または
非環状アルキル；カルボキシ基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、ハロ基もしくは
ニトロ基により置換された10個までの炭素原子のアルキル；7-16個の炭素原子の
分岐または非分岐、環状または非環状アリールアルキル；及びアリールからなる
群から選ばれた基であり、かつ
ｎは0-12である。
本発明の最も好ましい実施態様は一般式III:
の抗血管形成誘導化合物を含む。
式中、
Ｘは直接結合または-O-、-NR-、-S-、-SO-、-SO2-、及び-PO3-からなる群から
選ばれた基であり、
Ｒ、Ｒ1及びＲ2は独立にＨ、1-10個の炭素原子のアルキル、7-16個の炭素原子
のアラルキル、及びアリールからなる群から選ばれた基であり、
ｎは0-12であり、
Ｇは-N(R')(R")(R"')、-(O)N(R')(R")、-S(R')(R")、及び-P(R')(R")(R"')か
らなる群から選ばれた陽イオン基であり、
R'は1-10個の炭素原子のアルキル；カルボキシ基、ヒドロキシ基、アルコキシ
基、ハロ基もしくはニトロ基により置換された10個までの炭素原子のアルキル；
4-8個の炭素原子のシクロアルキル；5-18個の炭素原子のシクロアルキル−アル
キル；及び7-16個の炭素原子のアラルキルからなる群から選ばれた基であり、
R"及びR"'は独立に1-7個の炭素原子のアルキル及び４〜８員の窒素を含む環か
らなる群から選ばれた基であり、
Ｂは1-7個の炭素原子のアルキル、ハロゲン、窒素、及びフェニル（これはＢ
と同じエチレン炭素に結合されたフェニルまたは永久イオン基Ｇを含む基により
置換されたフェニルではない）の２位に結合され、かつ-CH2C(R1)(R2)-及び-CH2
-O-からなる群から選ばれる部分からなる群から選ばれた基であり、
Ｌ及びＭは独立に0-3であり、
ｌ及びｍは独立に1-7であり、かつ
Ｙは医薬上許される陰イオンである。
図面の簡単な説明
図１．ヌードマウスの腹側脂肪パッドに移植されたMCF-7腫瘍の増殖に関するエ
ストラジール、タモキシフェン、TMIまたは偽薬の効果。左パネルはタモキシフ
ェン、TMI及び偽薬に関するデータを示し、一方、右パネルはエストラジールで
治療されたグループを加える。
図２．ヌードマウスに移植されたMCF-7ヒト胸部腫瘍中でTMIまたは偽薬により誘
発された０日目に対する全壊死の変化率（％）。
図３．偽薬またはTMI治療後のヌードマウスに移植されたMCF-7腫瘍の毛細管密度
(n=5腫瘍／グループ)。全ての差異は(-5mm)及び(6mm)を除いて有意であった。
図４．偽薬またはTMI治療後のヌードマウスに移植されたMCF-7腫瘍の生存領域中
の毛細管密度(n=5腫瘍／グループ)。
図５．GSL-1標識腫瘍切片中の内皮細胞領域に関するTMIの効果。動物を３日間に
わたってTMIまたは偽薬ペレットで治療した。
図６．細胞の暴露後の６時間（左）または24時間（右）に測定されたゲラチナー
ゼＡ活性（72kDaイソ型系）に関するタモキシフェンまたはTMIの効果。
図７．薬剤投与後の６時間及び24時間にザイモグラフィーを使用して測定された
72kDa及び92kDaイソ型系の両方についてのコラゲナーゼ活性に関する20μMタモ
キシフェンまたはTMIの効果。
図８．ウシ内皮細胞中のゲラチナーゼＡ活性に関するTMIの効果。
図９．ヒト繊維肉腫細胞(HT-1018)中の膠原溶解活性(ゲラチナーゼＡ、MMP-2及
びゲラチナーゼＢ、MMP-9)に関するTMIまたはTBBの効果。
図10．トランスフェクトされたウシ内皮細胞中のMMP-2(ゲラチナーゼＡ)関連CAT
活性に関するTMIの効果。
図11．トランスフェクトされたウシ内皮細胞中のMMP-2(ゲラチナーゼＡ)関連CAT
活性に関するTMIの効果。
発明の詳細な説明
本発明の主目的は、病的血管形成が生じることが知られている疾患または障害
において抗血管形成誘導活性を与える有効な組成物を提供することである。本発
明の別の目的は治療有効量の永久に荷電されたステロイドアゴニストまたはアン
タゴニストを含む組成物を使用するこのような症状、疾患及び障害の予防または
回復のための治療方法を提供することである。本発明の現在好ましい実施態様に
おいて、永久に荷電されたアンチ−エストロゲンが血管形成の治療に有効な薬剤
を調製するのに使用し得ることが今開示される。
アンチ−エストロゲンとして設計された化合物はエストロゲンレセプター陰性
腫瘍中でさえも有効な抗腫瘍剤であり、それによりこれらの薬剤に関する作用の
付加的なメカニズムを示すことが知られている。それ故、本発明の最も好ましい
薬剤は、その永久イオン性のために、その生体分布に制限されると同時に（関係
するメカニズムにもかかわらず）効力がある。
アンチ−エストロゲンの種々のクラスが上記教示に従って使用し得る。これら
として、(a)トリフェニルエチレンから誘導されたアンチ−エストロゲン、例え
ば、タモキシフェン、トレミフェン及びクロミフェン、(b)ジフェニルナフタレ
ンから誘導されたアンチ−エストロゲン、例えば、ナフオキシジン、及び(c)ト
リフェニルエタノールから誘導されたアンチ−エストロゲン、例えば、エタモキ
シトリフェトールが挙げられる。
永久に荷電された誘導体を生成するための薬剤の修飾は四級塩の調製により最
も都合よく行い得る。このような化合物は種々の化学反応により調製し得る。ア
ミノ基を含むアンチ−エストロゲンの場合、一つのこのような方法はアンチ−エ
ストロゲンをアルキル化剤と反応させることである。アルキル化剤はアルキルハ
ライド、トシレート、アルキルスルフェートもしくはジアルキルスルフェートま
たはその他の適当な部分であってもよい。アルキル化は適当な場合に有機溶媒を
添加して、または添加しないで行われてもよく、冷却下もしくは室温で、または
その反応が完結まで満足に進行することを確実にするのに適当な場合に加熱して
行われてもよい。反応は薄層クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー
、核磁気共鳴分光分析法またはあらゆる好適な方法を含む当業者に知られている
通常の分析方法により監視し得る。得られる四級塩は、通常再結晶を伴う少なく
とも一つの工程を含む当業者に知られている通常の方法により精製されてもよい
。会合した陰イオンは所望によりイオン交換カラムの如き通常の操作により交換
されてもよい。
薬理学
提供された化合物は患者への投与に適した医薬組成物を与えるのに必要とされ
る方法により製剤化し得る。
新規組成物は、活性成分に加えて、通常の医薬上許される担体、希釈剤等を含
む。経口投与のための固体組成物、例えば、錠剤、ピル、カプセル等は活性成分
を通常の医薬上許される成分、例えば、トウモロコシ澱粉、ラクトース、蔗糖、
ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カ
ルシウム及びガム、医薬上許される希釈剤と混合することにより調製し得る。錠
剤またはピルは延長された作用または持続放出を与える投薬形態を与えると当業
界で知られている医薬上許される物質で被覆または配合し得る。その他の固体組
成物は非経口投与のためのマイクロカプセルとして調製し得る。液体形態は経口
投与または注射のために調製されてもよく、その用語は投与の皮下経路、筋肉内
経路、静脈内経路、及びその他の非経口経路を含む。液体組成物は水溶液（有機
補助溶媒を含み、または含まない）、水性または油懸濁液、食用油を含むエマル
ション、並びに同様の医薬ビヒクルを含む。加えて、本発明の組成物は持続送出
のためにカプセル化されたペレットまたはその他のデポー剤として形成されても
よい。
ヒトに関する活性用量は一般に１日1-4回のレジメで体重1kg当たり0.01mgから
約10mgの範囲である。しかしながら、更に長い間隔の投与がまた延長された作用
を有する化合物または製剤について可能であり得る。
用量の好ましい範囲は体重1kg当たり0.05mgから5mgまでである。投薬形態及び
レジメは治療すべき疾患、投与の方法、及び患者の全般の状態に応じて担当医師
により決められることが当業者に明らかである。本発明の医薬組成物の投与の最
も適した形態は何はさておき治療される臨床指示に依存することが理解されるで
あろう。病的血管形成について高いリスクのある健康な個体の予防治療は持続さ
れた維持投薬レジメを必要とするであろう。この型の治療が糖尿病性網膜症、早
熟の網膜症、黄斑変性及び患者の特別な組を冒すことが知られているその他の症
状についてリスクのある個体に適用し得る。反対に、既存の疾患の治療は更に頻
繁な間隔で高用量を必要とし得る。更に、再狭窄を含む異常な血管平滑筋細胞増
殖を伴うことが知られている一定の症状の治療は本発明の組成物で有益に治療さ
れると予想される。
生物活性
本発明はWO95/25720に開示されたような或る種の既知化合物及び上記一般式Ｉ
の付加的なステロイドアゴニスト及びアンタゴニストの両方についての新規な医
療使用を提供する。タモキシフェンの或る種の荷電された誘導体はタモキシフェ
ンと較べた時に改良された抗腫瘍活性を有することが示されていた。これらの誘
導体は、タモキシフェンそれ自体が活性を欠いている系中でさえも強力な抗血管
形成誘導活性を示すことが今開示される。
作用の潜在的なメカニズムを評価するために、タモキシフェン類縁体、タモキ
シフェンメチオジド(TMI)、タモキシフェンベンジルブロミド(TBB)及びタモキシ
フェンそれ自体が血管形成に関する種々の生化学アッセイで調べられた。血管形
成及び分解は、既存の血管の基底膜が分解し、内皮細胞移動、増殖及び基底膜の
再構築が続く一連のイベントを伴う。こうして、基底膜製剤（マトリゲル）に接
種された時に管に集合し、伸びるウシ内皮細胞の能力に関するTMIの効果が評価
された。更に、血管形成は基底膜タンパク質（型IVコラーゲンを含む）の分解を
伴うので、マトリックスメタロプロテアーゼ活性を阻止する際のTMI、TBB及びタ
モキシフェンの効力が全細胞（ヒト繊維肉腫及びウシ内皮細胞）及び無細胞系の
両方を使用してザイモグラフィーにより調べられた。最後に、種々のコラゲナー
ゼの転写に関するTMIの特定の作用が調べられた。
本発明を更に説明するために、特別な実施例が以下に示される。示された実施
例は説明のみのためであり、何ら限定するものではないことが理解されるべきで
ある。
実施例
評価の方法
化学−タモキシフェン（アルドリッチ・ケミカル社、セントルイス、MO）2.0g
を0℃で24時間にわたってヨウ化メチルと反応させることにより、タモキシフェ
ンメチオジドを調製した。次いで酢酸エチルを添加して白色の沈殿を得、これを
メタノールで再結晶して>99％のタモキシフェンメチオジドを得た。タモキシフ
ェンをベンジルブロミドと反応させることによりタモキシフェンベンジル
ブロミドを合成した。
化学構造 細胞培養物−ヒト繊維肉腫の転移病巣に由来するHT-1080細胞(CCL 121)及び一
次ウシ内皮細胞をATCC（ロックビル、MD）から得た。細胞を10％ウシ胎児血清、
グルタミン、ビタミン、非必須アミノ酸及び抗生物質（バイオロジカル・インダ
ストリイズ、Kibbutz Beth HaEmek、イスラエル）を補給したダルベッコの最小
必須培地(DMEM)中で５％CO2の雰囲気下で管理した。
コラゲナーゼIV発現の分析−リポーター遺伝子としてクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ(CAT)に結合された関係するプロモーターの活性化を
測定することにより、コラゲナーゼ遺伝子発現(MMP-2及びMMP-9に関する）の調
節を研究した。関係するベクターを製造業者により示されたようなリポフェクシ
ョンにより繊維肉腫及び内皮細胞に導入した。CAT活性を種々の濃度のTMIの不在
下または存在下で３時間後、６時間後及び24時間後に測定した。
細胞系中のコラゲナーゼ活性の分析−集密以下の細胞培養物を種々の濃度のTMI
またはタモキシフェンを用いて、または用いずに無血清DMEM中で６〜24時間イン
キュベートし、得られた上澄みを膠原溶解活性について分析した。前記の
ようにわずかに修飾してゼラチン含浸(１mg/ml、ジフコ、デトロイトMI)SDS-PAG
E８％ゲルを使用して、膠原溶解活性を測定した。簡単に言えば、培地サンプル
を非還元条件下で基質含浸ゲルで分離し、続いて2.5％トリトンX-100(BDH、UK)
とともに30分間インキュベートした。次いでゲルを37℃で16時間にわたって50mM
トリス、0.2M NaCl、５mM CaCl2、0.02％BRIJ 35(w/v)中でpH7.6でインキュベー
トした。インキュベーション期間の終了時に、ゲルをメタノール／酢酸／H2O(30
:10:60)中で0.5％クーマシーG250(バイオーラド、リッチモンド、CA)で染色した
。次いでコンピュータ化デンシトメーター(モレキュラー・ダイナミクス・モデ
ル300A)を使用して染色バンドの強さを測定した。
無細胞系中のコラゲナーゼ活性の分析
内皮細胞管形成−ウシ内皮細胞を１mM EDTAへの短い暴露により回収し、0.1％
ウシ血清アルブミンを含むDMEMで洗浄し、ウェル当たり50,000細胞の密度まで24
ウェルプレート中のマトリゲル（基底膜成分）の層に添加した。付着後に、培地
(1.0ml)を添加し、プレートを種々の濃度のTMIの存在下または不在下で単層培養
物としてインキュベートした。内皮管形成及び増殖についてホフマン光学装置を
使用してプレートを毎時分析した。顕微鏡写真を相対抑制作用の推定のために撮
影した。
動物評価−雌のCD1-nu/nu胸腺欠損マウス（生後６週）をアニマル・サービシ
ズのワイツマン・インスティチュート部門から得た。上記のように連続継代した
MCF-7細胞を食塩加リン酸緩衝液(PBS)中0.03％EDTAで培養フラスコから脱着し、
通常の食塩水中で数回洗浄した。次いで細胞（107/接種物）を胸部のレベルで腹
側脂肪パッドに注射した。細胞導入と一致して、エストラジオールの徐放ペレッ
ト(0.72mg/ペレット、45日放出プロフィール；イノバチブ・リサーチ、サラソタ
、FL)を動物の側腹部に皮下移植した。マウスを手術操作のためにケタミン／ロ
ムプン(i.p.)で麻酔した。３−６週以内に、約１cm3の平均サイズに達した充実
性腫瘍を全ての動物で観察した。この時点で、動物を四つの研究グループにラン
ダム化した。第一グループでは、エストロゲンペレットを除去し、徐放TMIを含
むペレット(6.3mg、45日放出)と交換した(n=5)。第二グループでは、
エストロゲンペレットを除去し、タモキシフェンペレットと交換した(n=7)。第
三グループをブランク（偽薬）ペレットで治療し(n=5)、一方、第四グループを
エストラジオールペレットで再移植した(n=4)。TMI及び偽薬治療した動物をペレ
ット交換の直前（０日目）またはペレット交換後の３日目、６日目、12日目及び
25日目に像撮影した（ケタミン／ロムプン麻酔のもとに）。
NMR測定−MRI像をブルーカー4.7(テスラ)/30バイオスペック・スペクトロメー
ター（ブルーカー・メジジンテクニック、ラインステッテン、ドイツ）で記録し
た。256x128ピクセルの像データマトリックスを含む特注の4.5cmrfコイルを使用
して、1Hスピン−エコー像を200.12MHzで記録した。高速横方向のマルチ−スラ
イススピン−エコーシーケンス（T1加重スペクトルを与える；インター−エコー
時間(TE)=16ミリ秒、回復時間(TR)=500ミリ秒）、続いてT2加重シーケンスを使
用して、腫瘍のパイロットスキャンを完成し、スピンに垂直の軸方向のスライス
（即ち、コロナ配向）を記録した。後者の場合、４cmの視野、1mmのスライス厚
さ、1.2mmのスライス間の距離及び４シーケンス平均を使用して、スピン−エコ
ー像を得た。TE及びTRを最適化して、夫々80ミリ秒及び3200ミリ秒の値を生じる
最良の像コントラストを得た。これは約30分の全像形成時間を生じた。報告した
条件下で、面内解像度は155x310μmであった。スライス間の再構築を使用して腫
瘍サイズを計算し、そのスライス表面積を、下記の関係を使用して常駐ブルーカ
ーソフトウェアパッケージにより得られたヒストグラムから得た。
体積(cm3)＝ΣXSA・(l+ssd)+ΣES・(l+ssd/2)
（式中、XSAは内部スライスの断面積であり、ESは端部スライスの断面積であり
、ｌはスライス厚さであり、かつssdは一つのスライスの中央から次のスライス
の中央までの距離である）。像分析のために、専用ブルーカー・ソフトウェア・
パッケージから生じたヒストグラムを使用して、MCF-7腫瘍の生存部分の平均ピ
クセル強さを中央腫瘍スライスから測定した。ピクセルｘピクセル分析を使用し
て壊死及び線維症を推定し、壊死を生存領域にわたって25％の強さの増加を示す
領域と定義した。線維症を50％のピクセル強さの減少を発現するこれらの領域と
定義した。
組織学−TMI治療動物及び偽薬治療動物からの腫瘍を頸部脱臼後に除去した。
組織切片がMRIスライス像と同じ方向に配向し得るように、腫瘍を生物学的色素(
デビッドソン・マーキング・システムズ、ブラッドリイ・プロダクツ、ブルーミ
ントン、MN)で処理した。MRI研究の中央スライスに相当する組織面を腫瘍中の単
一の切断により樹立した。この面はスペクトロメーターの腫瘍の位置、サジタル
像、横方向の像及びコロナ像並びに解剖学的ランドマークを基準とした。２回切
開した腫瘍を10％ホルマリン中に固定し、70％エタノール中で脱水し、パラフィ
ン中にブロックした。４μmの組織切片を切断し、スライドの上に置き、ヘマト
キシリン−エオシンまたは改良トリクロム方法で染色した。ヘマトキシリン−エ
オシンを使用して生存度、壊死及び着色を評価した。改良トリクロム方法を線維
症領域の同定に適用した（即ち、その色素はムコ多糖について染色する）。
二つの技術：組織切片の体型測定分析による技術及びGSL-1レクチン染色切片
の像分析による技術を使用して、血管密度を測定した。顕微鏡分析のために、４
μmの腫瘍切片を改良トリクロム方法で染色した。100の正方形に分けられた１cm
のグリッドをアイピースに入れた。使用した倍率(400x)で、グリッドは面積250
μm2を覆い、夫々のグリッド正方形は25μm2に相当した。夫々の視野で、赤血球
または特有の内皮細胞の存在により特定されるような毛細管を含むグリッド正方
形の数を記録した。分析の二つの組を完結した：(1)全腫瘍の試験、及び(2)生存
領域の評価。後者の場合、切片の長い軸に垂直に配向した三つの経線をつくった
。腫瘍−カプセル界面内で開始して、腫瘍の反対端部に達するまで、血管密度測
定を１mm毎に行った。最小三つの経線（即ち、９回測定／mm／腫瘍）を行った。
生存組織の分析のために、先に概説したように、最高の血管分布の領域を考慮し
、腫瘍当たり8-12の視野を調べた。加えて、内皮細胞学を注目した。
内皮細胞の特殊染色のために、パラフィン封入切片（４μm）を脱パラフィン
し、再度水和した。切片を30分間にわたって室温で非免疫ヤギ血清を含むブロッ
キング溶液で最初に処理し、次いで60分間にわたってビオチニル化グリフォニア
・シンプリシフォリアレクチン(GSL-1)の0.1mg/ml溶液で処理した。GSL-1レクチ
ンはα−ガラクトシル残基を特異的に結合し、マウス中の血管内皮をマークする
。次いで切片を食塩加TRIS緩衝液(TBS)で洗浄し、30分間にわたってア
ビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ベクター・ラボラトリイズ、バー
リンガム、CA）で処理し、その後にペルオキシダーゼを５−10分間にわたって３
％H2O2及び３％３−アミノ−９−エチルカルバゾールを含む0.1M酢酸緩衝液(pH5
.2)と一緒の切片のインキュベーションにより活性化した。次いで切片を蒸留水
で洗浄し、ヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、パーマウントでカバースリッ
プに取り付けた。50xの対物レンズを備えたGALAI CUE-2システムを使用して、染
色切片の像分析を完結した。全ての切片を、測定に選んだ最高の染色の領域につ
いてスキャンした。夫々のスライス中のペルオキシダーゼ反応生成物の閾値強さ
(赤46-165;緑25-119;青37-94)より上の領域を測定することにより、染色内皮細
胞の領域を測定した。染色領域対目視領域の比が５％の実験誤差内で平均内皮密
度を与えた。切片当たり10〜15の領域を偽薬及びTMIのいずれかで３日間治療さ
れた腫瘍について記録した。
評価の結果
胸部腫瘍の磁気共鳴像形成(MRI)は腫瘍異常形態学に関する薬剤治療の効果の
非観血的評価を可能にする。この手段を適用して胸腺欠損ヌードマウス中の移植
ヒト胸部腫瘍に関するTMIの効果を調べた。TMI治療動物に加えて、三つの対照グ
ループ、詳しくは、(1)支持エストロゲンペレットが除去され、偽薬ペレットと
交換された動物のグループ、(2)エストロゲンペレットが第二エストロケンペレ
ットと交換されたグループ、及び(3)エストロゲンペレットがタモキシフェンを
含むペレットと交換されたグループがこの研究に含まれた。この研究において、
胸部腫瘍を腹側脂肪パッド中の乳腺のレベルで移植した。このパラダイムに従っ
た。何とならば、それが通常の側腹部移植モデルよりもヒト症状に代表的である
ことが明らかであるからである。胸部中の腫瘍細胞の移植により生じた腫瘍は、
速い増殖速度及びタモキシフェンの効果に対する高いトレランスを含む、側腹部
移植モデルからの相違を発現する。
腫瘍スライスのその後の再構築による経時のMR像の分析は、エストロゲン治療
対照が迅速な増殖速度を発現し、腫瘍が25日の時間経過にわたってサイズで２倍
以上になることを示した。また、偽薬治療腫瘍は０日目の値に対し成長した
が、極めて遅いペースで成長し、約20％だけサイズを増大した。増殖速度の低下
は部分ホルモン切除のためである。タモキシフェンはこの研究では腫瘍静止性で
あり、25日目の結果が０日目の腫瘍寸法と実質的に同じであった。TMIは腫瘍退
行を誘発し、MCF-7腫瘍は25日の時間経過にわたって平均20％収縮した。アンチ
−エストロゲンの効果はエストロゲンペレットの除去のためだけではなかった。
何とならば、偽薬治療動物に移植された腫瘍が経時増殖し続けたからである。こ
のデータは側腹部移植モデルで既に得られたデータを確認した（図１）。
図１はヌードマウスの腹側脂肪パッドに移植されたMCF-7腫瘍の増殖に関する
エストラジオール(n=4)、タモキシフェン(n=7)、TMI(n=5)または偽薬(n=5)の効
果を示す。左パネルはタモキシフェン、TMI及び偽薬に関するデータを示し、一
方、右パネルはエストラジオールグループからのデータを加える。薬剤を側腹部
に移植(s.c.)された徐放ペレットとして投与した。
T2加重MR像を使用して、in vivo腫瘍組織をTMI治療腫瘍及び偽薬治療腫瘍につ
いて評価した。タモキシフェン及びエストラジオール治療の効果の評価のために
開発された手段を使用して、組織切片及びTMI/偽薬像の比較は、(1)生存腫瘍領
域がT2加重スピン−エコー像中に灰色（中間の強さ）に見え、(2)壊死領域が増
大されたプロトン密度（即ち、高い含水量）の若干の寄与とともに主として長い
スピン−スピン緩和時間のために白色（高い強さ）に見え、また(3)線維症領域
が短いスピン−スピン緩和時間及び低含水量のために暗色（低い強さ）に見える
ことを示した。これらの定義によれば、偽薬投与は３日目までに腫瘍壊死の有意
な変化をもたらさなかったが、６日目までに壊死の増加を生じた（図２）。この
時点で、壊死の領域は０日目に観察されたものよりも２倍高かった（平均で20％
から約40％までの増加）。図２はヌードマウスに移植されたMCF-1ヒト胸部腫瘍
中でTMIまたは偽薬により誘発された０日目に対する全壊死の変化率（％）を示
す。
TMIによる腫瘍の治療は幾つかの面で異なる応答を誘発した。腫瘍の広い壊死
の開始が偽薬の場合のように６日目ではなく最初のサンプリング点（３日目）に
起こった。加えて、壊死の合計領域は０日目の平均約25％から３日目の平均72％
までほぼ３倍に増加した。腫瘍構造のこれらの初期変化の全ては、腫瘍サイ
ズの有意な変化が明らかになる前に起こった。TMI治療及び偽薬治療の両方にお
いて、壊死の退行が線維症浸潤と関連した。再切開した腫瘍の組織分析はMRI記
載と良い相関関係があった。
TMIは速い開始を発現し、部分エストロゲン切除（即ち、エストロゲンペレッ
トの除去）により誘発されたものよりも広範である腫瘍壊死を誘発する。腫瘍サ
イズに関する効果に加えて、予備研究はまたTMIが壊死の誘発にタモキシフェン
よりも強力であることを示唆する。こうして、タモキシフェンは、TMIと同様に
、MRIにより評価されるように迅速な壊死（３日目まで）を誘発することがわか
ったが、壊死の最大程度は50％（TMIに関して72％と比較して）であった。重要
なことに、タモキシフェンで治療された腫瘍の一部が薬剤の効果に対し耐性にな
り、経時で再増殖し始めた。この現象はTMIでは起こらなかった。
タモキシフェンの場合、壊死が起こる速度、及び腫瘍中の毛細管の数が減少さ
れるという知見は、タモキシフェンがin vivo抗血管形成誘導作用を与えて、腫
瘍飢餓及び観察された細胞死滅をもたらすという提案(Furman-Haranら，Cancer
Res．54，5511-5514，1994)をもたらした。TMIがこれらの効果を共有するかどう
かを見るために、二つの技術：顕微鏡体型測定及び免疫染色を使用して、血管密
度をTMI治療腫瘍切片及び偽薬治療腫瘍切片で測定した。Bremら(JNCI，48，347-
356，1972)により記載された組織選別系の改良を使用して、体型測定血管領域を
測定した。このアプローチでは、毛細管（赤血球または特有の内皮細胞により形
成される）を含む種々の顕微鏡視野（250μm2グリッド）の％を推定した（図３
）。
これを腫瘍全体並びに腫瘍内の生存領域の両方について完結した。毛細管の密
度はTMI暴露後に減少されることがわかった。全腫瘍の評価において、腫瘍カプ
セルは不変に高度に血管であったが、密度がこの界面内でかなり低下した。壊死
の領域は一般に血管を含まなかった。TMIは偽薬治療腫瘍と較べて高度の壊死を
誘発したので、これらの腫瘍は低い全血管密度を発現することが驚くべきことで
はない。しかしながら、その分析は生存領域のみに制限された場合、TMI治療後
に血管形成の有意な減少があり、偽薬と較べて50％の毛細管領域の減少があった
（図４）。血管カウント及び領域に加えて、その内皮細胞学及び異常が注目
された。注目され、記録された細胞学的異常として、プランプ(plump)核、***
核小体を含むプランプ核、高色素性核及び有糸***像が挙げられた。
GSL-1レクチン（ヒト内皮系に関する因子VIII抗体染色の均等物）、続いて得
られる切片の着色像分析を使用して、マウス内皮細胞の血管密度を特殊染色によ
り評価した。対照腫瘍の生存領域中の内皮細胞領域の平均％は14％であり、TMI
治療領域の生存領域中の内皮細胞領域の平均％は５％であった。内皮細胞の３倍
の減少が高度に有意であった（図５）。これらの二つのイベント、減少された血
管領域及び内皮密度並びに同時の腫瘍壊死の増大は、TMIが血管の数の減少によ
り細胞致死活性を誘発して腫瘍飢餓をもたらすという仮説を高度に支持する。ま
た、MCF-7モデルにおけるTBBに関する予備データが生じられた。TMIと同様に、T
BBは10mg/kg程度に高い用量でマウスに良く寛容され、２週の時間経過にわたっ
て毎日投与された時に副作用を誘発しなかった。MCF-7腫瘍を有するマウスへのT
BBの投与は毎日投薬の２週にわたって32％の量の有意な腫瘍退行を生じた。TMI
は25日の時間経過にわたって20％退行を誘発した。このデータは、TBBがタモキ
シフェンメチオジドよりもその抗癌性の点で強力であることを示唆する。
in vitro技術を使用して、血管形成に関するTMIの作用を評価した。マトリゲ
ル（ラミニン、コラーゲン型IV、ヘパリンスルフェートプロテオグリカン及びエ
ンタクチンからつくられた基底膜製剤）に接種されたウシ内皮細胞は時間の関数
として伸びる管を形成するであろう。TMIは１μMから20μMまでの投薬範囲にわ
たって濃度依存様式で管形成及び増殖を抑制した。TMIの10μMの用量は像分析に
より測定して70％より大きく管領域を減少した。
コラゲナーゼ活性に関するタモキシフェンに対するTMIの効果を全細胞及び無
細胞系の両方で考慮した。ヒト繊維肉腫細胞を培養物に塗布し、0.5μMから20μ
Mまでの範囲の用量のTMIまたはタモキシフェンに暴露した。６時間及び24時間の
インキュベーション後に、上澄みのサンプルを取り出し、２種のコラゲナーゼイ
ソ酵素(ゲラチナーゼＡ及びＢ(MMP-2及びMMP-9))と関連する膠原溶解活性につい
てザイモグラフィー（基質含浸非還元活性ゲル）により評価した。TMIは用量依
存様式で両方のイソ酵素を抑制し、完全抑制が20μMレベルで観察され
た（図６及び７）。一方、タモキシフェンは20μMでの用量（20μMを含む）で有
意な抑制活性を示さなかった。
図７は薬剤投与の６時間後及び24時間後にザイモグラフィーにより測定して72
kDa及び92kDaのイソ型系の両方についてコラゲナーゼ活性に関する20μMのタモ
キシフェンまたはTMIの効果を示す。加えて、TMIは１μM〜５μMのIC50でウシ内
皮細胞中のコラゲナーゼ（ゲラチナーゼＡ）活性の強力なインヒビターであるこ
とが判明した（図８）。
また、TBBをこのアッセイで試験し、TMIと直接比較した。TBBはコラゲナーゼ
の72kDaのイソ型(ゲラチナーゼＡ、MMP-2)及び92kDaのイソ型(ゲラチナーゼＢ、
MMP-9)の両方のインヒビターとしてTMIよりも強力であった（図９）。
無細胞系では、TMIを評価して、抑制効果が酵素のレベルまたはその他の遺伝
子座で発現されるかどうかを測定した。試験した濃度で酵素活性に関するTMIの
効果がなかった。このデータは、TMIが試験した濃度範囲でゲラチナーゼＡ及び
Ｂ生合成及び／または遺伝子発現を抑制することを示唆する。
TMIの抑制効果が発現される場所を更に試験するために、ヒト繊維肉腫細胞並
びにウシ内皮細胞を型IVコラゲナーゼ（MMP-2及びMMP-9の両方）のプロモーター
及びリポーターとして作用するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ(CAT)構築物を含むプラスミドでトランスフェクトした。シミアンウィルス40(
SV-40)が陽性対照として利用することができた。TMIをトランスフェクトされた
細胞に２日間にわたって１μM、５μM及び10μMの濃度で添加し、その時点で細
胞生存度をトリパンブルー排除及び細胞カウンティングにより確認した。繊維肉
腫細胞では、TMIは用量依存様式で両方のイソ酵素のプロモーターにより誘導さ
れた転写を抑制することがわかり、最低用量のTMIでさえもが有意な抑制作用を
与えた（図10）。図10はコラゲナーゼの92kDaのイソ型のプロモーター（634塩基
対プロモーター）または72kDaのイソ型のプロモーター（基本プロモーター−Ｂ
またはプロモーター＋エンハンサー−Ｅ）を含むプラスミドでトランスフェクト
された細胞系中で発現されたCAT活性に関する１μM、５μM及び10μMの濃度のTM
Iの効果を示す。
内皮細胞では、TMIはCAT活性を1.0μMで45％低下し、10μMで80％低下し
た。このデータは、コラゲナーゼの発現に関するTMIの作用が血管系に密接な関
係があることを示唆する(図11)。
結論：
１．TMIについて、血管密度の減少が体型測定及び内皮細胞特異性染色により測
定して全腫瘍領域並びに生存領域の両方で顕著であった。
２．TMIはウシ内皮細胞中でMMP-2のインヒビターであり、ヒト繊維肉腫細胞系中
でMMP-2/MMP-9のインヒビターである。
３．TBBは試験した系でメタロプロテアーゼの抑制の点でTMIよりも強力である。
４．繊維肉腫細胞及び内皮細胞の両方中のトランスフェクトされたCAT系におけ
る研究は、TMIが生合成または発現のレベルでマトリックスメタロプロテアーゼ
を抑制することを示す。更に、無細胞系中のタモキシフェン類縁体の活性の欠如
は、TMIがこれらの酵素を直接抑制しないことを示す。
それ故、TMI及びTBBはメタロプロテアーゼの転写または発現を抑制するそれら
の能力と相関関係があることが明らかである強力な抗血管形成誘導作用を与える
。
本発明が種々の好ましい実施態様に関して説明されたが、当業者は種々の改良
、置換、省略及び変化がその精神から逸脱しないでなし得ることを理解するであ
ろう。従って、本発明の範囲は以下の請求の範囲のみにより限定されることは意
図されていない。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Enhanced anti-angiogenic activity of permanently charged derivatives of steroid hormones
Field of the invention
The present invention relates to the treatment or treatment of pathological angiogenesis or a condition in need of prevention of angiogenesis.
Relates to pharmaceutical compositions which are beneficial for prevention. More particularly, the present invention provides an improved anti-
Quaternary induction of steroid agonists or antagonists having angiogenesis-inducing properties
Related to the use of conductors.
Background of the Invention
Angiogenesis
Angiogenesis is a complex process in which capillaries grow in a regular sequence of events.
(Folkman and Klagsbrun, Science 235, 442-447, 1987; Folkman and Shing, J
.Biol.Chem. 267, 10931-10934, 1992). The body of evidence is that solid angiogenesis is solid
Supports the hypothesis that it is the basis for tumor growth and metastasis (Folkman and Klagsbrun
1987; Weidner et al., Amer. J. Pathol. 143, 401-409, 1993; O'Reilly et al.
Cell 79, 316-328, 1994). In fact, the majority of clinical tumors occur after neovascularization has occurred.
Is clinically undetectable, and its induction in solid tumors may be
More mediated.
In addition, angiogenesis also causes arthritis, psoriasis, diabetic retinopathy, precocious retinopathy, macular degeneration
Sex, scleroderma, hemangiomas, retro-lens fibroplasia, abnormal capillary proliferation in haemophilia joints,
Including but not limited to prolonged menstruation and other disorders of the female reproductive system
Important for some other pathological processes. Thus, how to prevent angiogenesis
The law is clearly needed.
The basic mechanism of angiogenesis can be briefly outlined as follows. New capillary
Endothelial cells break down the basement membrane when they sprout from the side of the venules,
Once migrated, proliferated and formed a lumen, the two sprout tips joined to form a capillary loop.
Create a new basement membrane (Folkman, Perspectives in Biology and Med-
icine, 29, 1-36, 1985).
Extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling
This is an essential process for the mechanism. In addition, ECM synthesis synthesized by endothelial cells
Minutes (ie collagen, laminin, thrombospondin, fibronectin and
SPARC) functions to regulate endothelial cell growth, migration and formation (Bischoff, Tr-
ends Cell Biol. 5, 69-744, 1995). Bovine aortic endothelial cells (BAE)
During the formation, collagen and SPARC are synthesized. Type I collagen in BAE cells
It has been proposed that it may be involved in guiding movement and aggregation (Iruela-Arispe
Et al., Lab. Invest. 64, 174-186, 1991).
Platelet factor 4, fumagillin derivative AGH147 for treating angiogenesis-related diseases
0, interferon (αTwoa, thrombospondin, vasostatic steroids,
And angiostatin (Folkman, supra, 1995; O'Reilly et al, supra, 1994)
Several inhibitors of angiogenesis mechanisms have been studied, including in addition,
Anti-estrogens have also been shown to inhibit angiogenesis (Ga-rliard
i and Collins, Cancer Res. 53, 533-535, 1993). Unfortunately, these inns
Many of the inhibitors are relatively non-specific in their effect, and thus
Shares potentially toxic properties. In addition, certain inhibitors, especially other raw materials
To selectively block the underlying mechanisms of angiogenesis without adversely affecting physiological functions
Inhibitors would be most beneficial. Furthermore, it is currently evaluated as an anti-angiogenesis inducer
Many of the compounds present generally have poor bioavailability issues and
Easily degraded proteins (eg, antibodies, thrombospondin, angios
Statins and platelet factor IV). Therefore, they are administered in high doses and frequently.
Need to be done.
Thus, the growth of vasculature without substantially affecting other physiological processes
Inhibitors of angiogenesis that specifically block tumor growth (blood associated with tumor growth or progression)
(Including inhibitors of tube formation)
There is hope.
Permanently charged steroid hormones and their antagonists
Pharmacotherapy for breast cancer currently consists of hormonal and cytotoxic agents. hormone
Therapy is that, in many women, breast cancer cells are treated with the steroid hormone estrogen receptor.
It was developed because it has Increase of these estrogen receptor positive cancer cells
Propagation can be stimulated by estrogen. Anti-estrogen therapy is estrogen
Reduce or stop the synthesis of or inhibit the action of estrogen on cancer cells
Try to do so.
Tamoxifen (US Pat. No. 4,536,516) is superior among all formonals
Position. Cure breast cancer in patients with estrogen receptor-positive tumors
Drugs that were initially used as anti-estrogens to treat
Slow growth of breast cancer in women with trogen receptor negative tumors
Was. Therefore, tamoxifen is beneficial to most patients. Anti-estrogen
Tamoxifen is particularly useful in delaying recurrence of breast cancer patients and palliative treatment of advanced metastatic breast cancer.
It is effective for It is also glioma and liver cancer and endometrium, uterus, ovary and
Beneficial in treating prostate tumors (Litherland, S. et al., Cancer Treatment Reviews
, 15, 183, 1988; Jordan, C., Br. J. Pharmacol., 110, 507, 1993).
Anti-estrogens, including tamoxifen, bind to receptor sites in cancer tissue.
Compete with estrogen. Occupation of the receptor site by anti-estrogens
Fails to elicit the full spectrum of estrogen-induced transcription
And thus block their activity. In general, estrogen is initially targeted
Binds to the vesicle cytosolic receptor and then translocates to the cell nucleus where they transduce DNA.
It is thought to work by affecting the photo.
Considerable effort has been directed to their increased selection as anti-estrogenic compounds
Sex (eg, US Pat. No. 4,973,755; EP 0 168,175) or estrogen receptor
Improved due to their high affinity for tar (WO 92/06068)
Invested in the development of novel tamoxifen analogs with potential therapeutic potential
I was
Hydrophilic compounds, especially compounds having an ionic charge (cation or anion)
Often very poorly distributed to the CNS and brain. What a lipophilic barrier
(The blood-brain barrier). One way to create a permanent charge on a drug is
Incorporation of quaternary ammonium salts (nitrogen with four attached hydrocarbon groups)
You.
Tamoxifen and other anti-estrogens containing amino groups are quaternized.
(Can be converted to a quaternary ammonium group). Such quaternization is a permanent positive charge
To the parent molecule, which is a physiological membrane (which is lipophilic in nature
And that are resistant to penetration of ions, especially large ions)
The entry of molecules should be effectively reduced.
Several quaternary salts of tamoxifen have been prepared and are described in the scientific literature (Jarman et al., Antican-c
er Drug Design, 1, 259, 1986). When tested in vitro,
These derivatives have not been reported to arrest growth of breast tumor cell lines grown in culture.
Was. Therefore, these compounds were predicted to have no therapeutic value in vivo.
WO 95/26720 unexpectedly describes the anti-estrogen tamoxifen
Ionic derivatives (which are titrated in vivo based on their lack of in vitro activity)
Value was predicted to be no) but was actually more active as an anticancer drug in vivo than the parent compound
There was a disclosure. This invention is based on the principle that side effects of drugs on the CNS
A variety of other anti-estros that can be reduced or eliminated by preventing access
Applicable to Gen.
In studies of MCF-7 human breast cancer transplanted into nude mice, TMI has anticancer effects
Found to be significantly more potent than tamoxifen. TMI is open
Almost immediately after initiation, complete regression of the transplanted cancer in 40% of the animals tested
ion) induced tumor regression. Tamoxifen, the parent compound
During merely delaying tumor growth (Cancer Res. 56, 4238, 1996).
Tamoxifen and other anti-estrogens are vasostatic in tumors
However, the mechanism of suppression of angiogenesis is not clear (Can
cer Res. 54, 5511, 1994; Cancer Res. 53, 533, 1993).
Summary and purpose of the invention
According to the present invention, permanently charged steroid agonists and antagonists
Are now unexpectedly potent antiangiogenic agents. Furthermore,
Permanently charged anti-estrogens are required for extracellular matrix remodeling
By suppressing the transcription of metalloproteases, including collagenases
It is disclosed that they can mediate their anti-angiogenesis-inducing action.
It is also an object of the present invention to provide delayed angiogenesis and other diseases and
Charged Steroid Agonist and Antagonis for Clinical Treatment of Insulin
Is to provide The method of the present invention comprises a glucocorticoid, an estrogen.
, Androgen and progestin charged derivatives or their respective enantiomers
Various steroid agonists and agents, including but not limited to
Will be beneficial with the agonists.
In a presently preferred embodiment, the object of the invention is to provide delayed angiogenesis as well as other
Permanently charged agonists and antagonis for clinical treatment of diseases and conditions
Is to provide These anti-angiogenic anti-estrogens are
Has a trogen antagonist activity and a partial estrogen agonist activity or
May have mixed activity, but are permanently charged and restricted to biodistribution,
It has reduced side effects and is beneficial for clinical use. Another eye of the invention
And clinical benefit is the fact that they are not sequestered in adipose tissue
Due to the relatively rapid elimination of these drugs from the circulation, thereby reducing toxicity.
Lowers and allows precise adjustment of dosing. Yet another object of the present invention is
To provide tube formation inducing anti-estrogenic agents and drug delivery
.
These and other objects of the present invention are to provide a pharmaceutically effective amount of the general formula
I:
Is achieved by providing a composition comprising the compound of formula (I).
Where:
Y is a non-toxic pharmaceutically acceptable anion;
Drugs may be steroid agonists or antagonists, mixed agonist-antagonists
Gonist, and a group selected from the group consisting of partial agonists,
X is a direct bond or —O—, —NH—, —NR— (where R is an atom having less than 10 carbons).
Alkyl or aryl)), -POThree-, -S-, -SO-, and -SOTwo-A group consisting of
Is a group selected from
R1And RTwoAre the same or different, H, alkyl of 1-10 carbon atoms,
A group selected from the group consisting of arylalkyl of 7 to 16 carbons and aryl.
May be
RThree, RFourAnd RFiveIs independently 1-10 carbon atom branched or unbranched, cyclic or
Acyclic alkyl; carboxy, hydroxy, alkoxy, halo or
Alkyl of up to 10 carbon atoms substituted by a nitro group; of 7-16 carbon atoms
Branched or unbranched, cyclic or acyclic arylalkyl; and aryl
Group selected from the group, and
n is 0-12.
Y is the following anion: phosphate ion, sulfate ion, chloride ion, bromide ion
Ion, iodide ion, alkyl sulfonate ion or aryl sulfonate ion
On, or an organic anion such as acetate, citrate or oxalate
Examples thereof include, but are not limited to, acid ions.
More special cases and preferred embodiments of the general formula are
It is.
Where:
Y is a non-toxic pharmaceutically acceptable anion;
Anti-estrogens are estrogen antagonists, mixed agonists
Tagonist, and a group selected from the group consisting of partial agonists,
X is a direct bond or —O—, —NH—, —NR— (where R is an atom having less than 10 carbons).
Alkyl or aryl)), -POThree-, -S-, -SO-, and -SOTwo-A group consisting of
Is a group selected from
R1And RTwoAre the same or different, H, alkyl of 1-10 carbon atoms,
Arylalkyl of 7-16 carbon atoms, and a group selected from the group consisting of aryl
May be
RThree, RFourAnd RFiveIs independently 1-10 carbon atom branched or unbranched, cyclic or
Acyclic alkyl; carboxy, hydroxy, alkoxy, halo or
Alkyl of up to 10 carbon atoms substituted by a nitro group; of 7-16 carbon atoms
Branched or unbranched, cyclic or acyclic arylalkyl; and aryl
Group selected from the group, and
n is 0-12.
A most preferred embodiment of the present invention has the general formula III:
Of the present invention.
Where:
X is a direct bond or -O-, -NR-, -S-, -SO-, -SOTwo-And-POThree-From the group consisting of
Is the chosen group,
R, R1And RTwoIs independently H, alkyl of 1-10 carbon atoms, 7-16 carbon atoms
Aralkyl, and a group selected from the group consisting of aryl,
n is 0-12,
G is -N (R ') (R ") (R"'),-(O) N (R ') (R "), -S (R') (R"), and -P (R ') (R ") (R" ') or
A cationic group selected from the group consisting of
R 'is alkyl of 1 to 10 carbon atoms; carboxy, hydroxy, alkoxy
Alkyl of up to 10 carbon atoms substituted by a group, halo group or nitro group;
Cycloalkyl of 4-8 carbon atoms; cycloalkyl-alkyl of 5-18 carbon atoms
And a group selected from the group consisting of aralkyl of 7-16 carbon atoms;
R "and R" 'are independently rings containing alkyl of 1-7 carbon atoms and a 4-8 membered nitrogen.
Group selected from the group consisting of
B is an alkyl of 1 to 7 carbon atoms, halogen, nitrogen, and phenyl (this is B
Phenyl or a group containing a permanent ionic group G attached to the same ethylene carbon as
Is not substituted phenyl), and is attached to the 2-position ofTwoC (R1) (RTwo)-And -CHTwo
A group selected from the group consisting of moieties selected from the group consisting of -O-,
L and M are independently 0-3,
l and m are independently 1-7, and
Y is a pharmaceutically acceptable anion.
BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
FIG. D. Growth of MCF-7 tumor implanted in ventral fat pad of nude mouse
Effects of straziel, tamoxifen, TMI or placebo. The left panel is tamoxif
Data for the drug, TMI and placebo, while the right panel
Add the treated group.
FIG. Induced by TMI or placebo in MCF-7 human breast tumor implanted in nude mice
Percent change in total necrosis relative to day 0 of the onset.
FIG. Capillary density of MCF-7 tumors implanted in nude mice after placebo or TMI treatment
(n = 5 tumors / group). All differences were significant except for (-5mm) and (6mm).
FIG. In the surviving area of MCF-7 tumor implanted in nude mice after placebo or TMI treatment
Capillary density (n = 5 tumors / group).
FIG. Effect of TMI on endothelial cell areas in GSL-1-labeled tumor sections. Animals in three days
Treated with TMI or placebo pellets throughout.
FIG. Gelatiner measured 6 hours (left) or 24 hours (right) after exposure of cells
Effect of tamoxifen or TMI on ZeA activity (72 kDa isoform system).
FIG. Measured using zymography at 6 and 24 hours after drug administration
20 μM tamper for collagenase activity for both 72 kDa and 92 kDa isoform systems
The effect of Xiphen or TMI.
FIG. Effect of TMI on gelatinase A activity in bovine endothelial cells.
FIG. Collagenolytic activity in human fibrosarcoma cells (HT-1018) (gelatinase A, MMP-2 and
Effect of TMI or TBB on protein and gelatinase B, MMP-9).
FIG. MMP-2 (gelatinase A) -related CAT in transfected bovine endothelial cells
Effect of TMI on activity.
FIG. MMP-2 (gelatinase A) -related CAT in transfected bovine endothelial cells
Effect of TMI on activity.
Detailed description of the invention
The primary object of the present invention is to provide a disease or disorder for which pathological angiogenesis is known to occur.
And to provide an effective composition that provides an anti-angiogenesis inducing activity. Departure
Another purpose of Ming is to provide a therapeutically effective amount of a permanently charged steroid agonist or antagonist.
Prevention of such symptoms, diseases and disorders using a composition comprising a tagonist or
It is to provide a treatment method for recovery. In a presently preferred embodiment of the invention
Introduces permanently charged anti-estrogens as effective drugs for treating angiogenesis
It is now disclosed that it can be used to prepare
Compounds designed as anti-estrogens are estrogen receptor negative
It is an effective antitumor agent even in tumors, thereby
It is known to exhibit additional mechanisms. Therefore, the most preferred of the present invention
Drugs are restricted to their biodistribution due to their permanent ionic properties, while
(In spite of the mechanism that does it).
Various classes of anti-estrogens may be used in accordance with the above teachings. these
(A) anti-estrogens derived from triphenylethylene, such as
For example, tamoxifen, toremifene and clomiphene, (b) diphenylnaphthale
Anti-estrogens derived from butane, such as naphoxidine, and (c)
Anti-estrogens derived from riphenylethanol, such as etamoki
Citrifetol.
Modification of drugs to produce permanently charged derivatives is best accomplished by the preparation of quaternary salts.
Can also be conveniently performed. Such compounds can be prepared by various chemical reactions. A
In the case of anti-estrogens containing amino groups, one such method is anti-estrogens.
Reacting strogen with an alkylating agent. The alkylating agent is alkyl ha
Ride, tosylate, alkyl sulfate or dialkyl sulfate.
Or any other suitable part. Alkylation involves the use of organic solvents where appropriate
May be performed with or without addition, with or without cooling, or
Heat when appropriate to ensure that the reaction proceeds satisfactorily to completion.
May be performed. The reaction is thin layer chromatography, high pressure liquid chromatography
Known to those skilled in the art, including nuclear magnetic resonance spectroscopy or any suitable method
It can be monitored by conventional analytical methods. The resulting quaternary salts are usually low with recrystallization.
It may be purified by a usual method known to those skilled in the art, including both one step
. The associated anions are optionally exchanged by normal operation such as ion exchange columns
May be done.
Pharmacology
The provided compounds are required to provide a pharmaceutical composition suitable for administration to a patient.
It can be formulated by the following method.
The novel composition contains, in addition to the active ingredient, ordinary pharmaceutically acceptable carriers, diluents, and the like.
No. Solid compositions for oral administration include, for example, tablets, pills, capsules and the like.
The usual pharmaceutically acceptable ingredients, for example, corn starch, lactose, sucrose,
Sorbitol, talc, stearic acid, magnesium stearate, diphosphate
It can be prepared by mixing the calcium and gum with a pharmaceutically acceptable diluent. Lock
Agents or pills are useful in providing dosage forms that provide extended action or sustained release.
It can be coated or formulated with pharmaceutically acceptable substances known in the art. Other solid sets
The composition may be prepared as a microcapsule for parenteral administration. Liquid form is oral
It may be prepared for administration or injection, the terms of which are subcutaneous route of administration, intramuscular
Includes routes, intravenous, and other parenteral routes. The liquid composition is an aqueous solution (organic
Emulsions with or without co-solvents), aqueous or oil suspensions, edible oils
And similar pharmaceutical vehicles. In addition, the compositions of the present invention provide sustained delivery.
Also formed as encapsulated pellets or other depots for
Good.
Active doses for humans generally range from 0.01 mg / kg body weight in a regimen of 1-4 times daily.
It is in the range of about 10 mg. However, administration at longer intervals also has prolonged effects
May be possible for compounds or formulations having
The preferred range of dosage is 0.05 mg / kg to 5 mg / kg body weight. Dosage form and
The regimen depends on the disease to be treated, the mode of administration and the general condition of the patient
It is apparent to those skilled in the art that In administering the pharmaceutical composition of the present invention,
It is also understood that the appropriate form depends aside from the clinical indication being treated aside.
There will be. Preventive treatment of healthy individuals at high risk for pathological angiogenesis persists
Would require an improved maintenance dosing regime. This type of treatment can lead to diabetic retinopathy, early
Mature retinopathy, macular degeneration and other diseases known to affect a special set of patients
Applicable to individuals at risk for conditions. Conversely, treatment of existing diseases is more frequent.
High doses may be required at frequent intervals. In addition, abnormal vascular smooth muscle cell proliferation, including restenosis
The treatment of certain conditions known to be associated with multiplication is beneficially treated with the compositions of the present invention.
It is expected to be.
Biological activity
The present invention relates to certain known compounds as disclosed in WO 95/25720 and to the above general formula I
New physicians for both additional steroid agonists and antagonists
Provide therapeutic use. Certain charged derivatives of tamoxifen are tamoxifen
Have been shown to have improved antitumor activity when compared to These invitations
The conductor is a powerful anti-vascular, even in systems where tamoxifen itself lacks activity
It is now disclosed to exhibit formation inducing activity.
To evaluate potential mechanisms of action, tamoxifen analogs, tamaki
Ciphene methiozide (TMI), tamoxifen benzyl bromide (TBB) and tamoxi
Fen itself was examined in various biochemical assays for angiogenesis. Blood vessel shape
Formation and destruction occurs when the basement membrane of existing blood vessels is degraded, endothelial cell migration, proliferation and
With a series of events followed by a rebuild. In this way, contact with the basement membrane preparation (Matrigel)
TMI's effect on the ability of bovine endothelial cells to assemble and grow in tubes when seeded is evaluated
Was done. In addition, angiogenesis causes degradation of basement membrane proteins (including type IV collagen)
As such, TMI, TBB and
Moxifen is effective in whole cells (human fibrosarcoma and bovine endothelial cells) and cell-free
Both were examined by zymography. Finally, various collagen
The specific effect of TMI on ze transcription was examined.
Specific examples are set forth below to further illustrate the invention. Indicated implementation
It should be understood that the examples are for illustration only and are not limiting.
is there.
Example
Evaluation method
Chemistry-Tamoxifen (Aldrich Chemical Company, St. Louis, MO) 2.0 g
By reacting it with methyl iodide at 0 ° C for 24 hours.
Nmethiodide was prepared. Then ethyl acetate was added to give a white precipitate, which was
Recrystallization from methanol gave> 99% tamoxifen methiodide. Tamoxiv
Tamoxifen benzyl by reacting
Bromide was synthesized.
Chemical structure Cell culture-HT-1080 cells (CCL 121) and one from metastatic foci of human fibrosarcoma
Next bovine endothelial cells were obtained from ATCC (Rockville, MD). 10% fetal calf serum,
Glutamine, vitamins, non-essential amino acids and antibiotics (Biological Ind.
Dulbecco's smallest restocked with Streize, Kibbutz Beth HaEmek, Israel
5% CO in essential medium (DMEM)TwoIt managed under the atmosphere of.
Analysis of collagenase IV expression-chloramphenicol as a reporter gene
Activation of the relevant promoter linked to cetyltransferase (CAT)
By measuring, regulation of collagenase gene expression (for MMP-2 and MMP-9)
Studied the clause. Relevant vectors as indicated by the manufacturer
Introduced into fibrosarcomas and endothelial cells by means of a solution. CAT activity in the absence of various concentrations of TMI
Measured at 3, 6, and 24 hours in the presence or absence.
Analysis of collagenase activity in cell lines-Subconfluent cell cultures can be treated with various concentrations of TMI
Or 6-24 hours in serum-free DMEM with or without tamoxifen
Cuvated and the resulting supernatant was analyzed for collagenolytic activity. The above
Gelatin-impregnated (1 mg / ml, Difco, Detroit MI) SDS-PAG
Collagenolytic activity was measured using an E8% gel. Simply put, a medium sample
Was separated on a substrate impregnated gel under non-reducing conditions, followed by 2.5% Triton X-100 (BDH, UK)
For 30 minutes. The gel is then run at 37 ° C for 16 hours at 50 mM
Tris, 0.2M NaCl, 5mM CaClTwoIncubate at pH 7.6 in 0.02% BRIJ 35 (w / v)
I did it. At the end of the incubation period, the gel was run with methanol / acetic acid / HTwoO (30
: 10: 60) stained with 0.5% Coomassie G250 (Bio-Rad, Richmond, CA)
. Next, a computerized densitometer (Molecular Dynamics Model)
300A) was used to measure the intensity of the stained band.
Analysis of collagenase activity in cell-free systems
Endothelial cell tube formation-Bovine endothelial cells were harvested by short exposure to 1 mM EDTA, 0.1%
Wash with DMEM containing bovine serum albumin, 24 to a density of 50,000 cells per well
It was added to the Matrigel (basement membrane component) layer in the well plate. After attachment, the medium
(1.0 ml) and grow the plate in monolayer in the presence or absence of various concentrations of TMI
And incubated. Hoffman optics for endothelial tube formation and proliferation
Plates were analyzed every hour using. Photomicrographs taken to estimate relative suppression
Shadowed.
Animal evaluation-Female CD1-nu / nu athymic mice (6 weeks old) were treated with Animal Service
Obtained from the Weizmann Institute Division of the United States. Continuous passage as above
MCF-7 cells were detached from the culture flask with 0.03% EDTA in phosphate buffered saline (PBS),
Washed several times in normal saline. Then the cells (107/ Inoculum) belly at the level of the chest
The side fat pad was injected. Consistent with cell introduction, a sustained release pellet of estradiol was
(0.72 mg / pellet, 45-day release profile; Innovative Research, Sarasota
, FL) was implanted subcutaneously in the flank of the animal. Ketamine / B for mouse operation
Anesthetized with mupun (i.p.). About 1cm within 3-6 weeksThreeFulfilled the average size of
Sexual tumors were observed in all animals. At this point, the animals are run in four study groups.
It became a dam. The first group removes estrogen pellets and includes sustained release TMI.
(6.3 mg, released for 45 days) (n = 5). In the second group,
The estrogen pellet was removed and replaced with a tamoxifen pellet (n = 7). No.
Three groups were treated with blank (placebo) pellets (n = 5), while the fourth group
Reimplanted with estradiol pellets (n = 4). Pellet animals treated with TMI and placebo
Immediately before the exchange (day 0) or the third, sixth, and twelfth day after the pellet exchange.
Images were taken on day 25 (under ketamine / lompun anesthesia).
NMR measurement-MRI image is converted to Bluecar 4.7 (Tesla) / 30 Biospec
Recorded on the ter (Breaker-Meditine Technique, Rheinstetten, Germany)
Was. Uses custom 4.5cmrf coil with 256x128 pixel image data matrix
Then, a 1H spin-echo image was recorded at 200.12 MHz. High-speed lateral multi-slur
Ispin-echo sequence (giving T1 weighted spectrum; inter-echo
Time (TE) = 16 ms, recovery time (TR) = 500 ms), followed by a T2 weighted sequence.
Complete a pilot scan of the tumor using an axial slice perpendicular to the spin
(Ie, corona orientation) was recorded. In the latter case, 4 cm field of view, 1 mm slice thickness
Now, using a 1.2 mm distance between slices and a 4-sequence average, spin-eco
-I got an image. Optimize TE and TR to produce values of 80 ms and 3200 ms respectively
The best image contrast was obtained. This resulted in a total imaging time of about 30 minutes. reported
Under the conditions, the in-plane resolution was 155 × 310 μm. Tumors using interslice reconstruction
Calculate the tumor size and determine its slice surface area using the following relationship:
-Obtained from the histogram obtained by the software package.
Volume (cmThree) = ΣXSA ・ (l + ssd) + ΣES ・ (l + ssd / 2)
(Where XSA is the cross-sectional area of the internal slice, and ES is the cross-sectional area of the end slice.
, L is the slice thickness and ssd is the next slice from the center of one slice
Is the distance to the center of Dedicated Bruker software for image analysis
Using the histograms generated from the package, the mean pi
Xerel strength was measured from central tumor slices. Use pixel x pixel analysis
To estimate necrosis and fibrosis, showing necrosis a 25% increase in strength over the surviving area
Defined as area. With these areas to express fibrosis a 50% reduction in pixel strength
Defined.
Histology-Tumors from TMI and placebo treated animals were removed after cervical dislocation.
The tumor is treated with a biological dye (so that the tissue section can be oriented in the same direction as the MRI slice image).
Davidson Marking Systems, Bradley Products, Bloomy
(MN, MN). The tissue surface corresponding to the central slice of the MRI study was
Established by one cut. This surface is the location of the tumor in the spectrometer, sagittal
Images, lateral and corona images and anatomical landmarks were referenced. Cut twice
Opened tumors are fixed in 10% formalin, dehydrated in 70% ethanol,
I blocked while running. Cut a 4 μm tissue section, place on a slide,
Stained with xylin-eosin or modified trichrome method. Hematoxylin-E
Osin was used to assess viability, necrosis and coloration. Fiber improved trichrome method
Applied to the identification of affected areas (ie, the dye stained for mucopolysaccharide).
Two techniques: morphometric analysis of tissue sections and GSL-1 lectin stained sections
Vessel density was measured using the image analysis technique of R. K. 4 for microscopic analysis
μm tumor sections were stained with the modified trichrome method. 1cm divided into 100 squares
Was placed in the eyepiece. At the magnification used (400x), the grid has an area of 250
μmTwoEach grid square is 25μmTwoWas equivalent to Red blood cells in each field of view
Or grid squares containing capillaries as identified by the presence of distinct endothelial cells
The number of shapes was recorded. Two sets of analyzes were completed: (1) testing of all tumors, and (2) survival
Evaluation of the area. In the latter case, three meridians were oriented perpendicular to the long axis of the section
. Starting at the tumor-capsule interface, vascular densitometry is performed until the opposite end of the tumor is reached.
Measurement was performed every 1 mm. A minimum of three meridians (ie, 9 measurements / mm / tumor) were performed.
For viable tissue analysis, consider the area of highest vascularity as outlined above.
8-12 fields per tumor were examined. In addition, attention was paid to endothelial cytology.
Deparaffinized paraffin-embedded sections (4 μm) for special staining of endothelial cells
And hydrated again. Sections are incubated for 30 minutes at room temperature in blocks containing non-immune goat serum.
First treated with King's solution, then biotinylated glyphonia for 60 minutes
-The cells were treated with a 0.1 mg / ml solution of Simplicifolia lectin (GSL-1). GSL-1 Rectic
Specifically binds α-galactosyl residues and marks vascular endothelium in mice
. The sections were then washed in TRIS buffer (TBS) with saline and allowed to stand for 30 minutes.
Vidin-biotin-peroxidase conjugate (Vector Laboratories, Bar
Ringingham, CA) followed by peroxidase for 3-10 minutes.
% HTwoOTwo0.1 M acetate buffer containing 3% 3-amino-9-ethylcarbazole (pH 5
Activated by incubation of sections with .2). The sections are then distilled
Wash, counterstain with hematoxylin, dehydrate, and cover slip with permount.
Attached to the pump. Using a GALAI CUE-2 system with a 50x objective,
Image analysis of the color sections was completed. All sections should be taken along the area of highest staining chosen for the measurement.
And scanned. Threshold strength of peroxidase reaction products in each slice
(Red 46-165; Green 25-119; Blue 37-94)
The area of the vesicle was measured. Average endothelial density within 5% of experimental error with stained area to visual area.
Gave the degree. 10-15 areas per section were treated with either placebo or TMI for 3 days
The tumors that were recorded were recorded.
Evaluation results
Magnetic Resonance Imaging (MRI) of Breast Tumor Shows the Efficacy of Drug Treatment on Tumor Abnormal Morphology
Enables non-invasive evaluation. Transplantation in athymic nude mice by applying this method
The effect of TMI on human breast tumor was investigated. In addition to TMI-treated animals, three control groups
Loop, specifically (1) the supporting estrogen pellets are removed and placebo pellets
Group of animals exchanged, (2) estrogen pellets
Tamoxifen in the group exchanged for citrate and (3) estrogen pellets
Groups exchanged for containing pellets were included in this study. In this study,
Breast tumors were implanted at the level of the mammary gland in the ventral fat pad. Follow this paradigm
Was. What if it is more representative of human symptoms than the normal flank transplant model
This is because it is clear. Tumors arising from transplantation of tumor cells in the chest
Flank, including fast growth rate and high tolerance to the effects of tamoxifen
Express differences from the transplant model.
Analysis of MR images over time by subsequent reconstruction of tumor slices is estrogen-treated
Controls develop rapid growth rates and tumors double in size over a 25 day time course
It has been shown that this is the case. Also, placebo-treated tumors grew to day 0 values
However, it grew at an extremely slow pace, increasing in size by about 20%. Decrease in growth rate
Is for partial hormone resection. Tamoxifen is tumor-static in this study
Yes, the results on day 25 were substantially the same as the tumor size on day 0. TMI regression
Rows were induced, and the MCF-7 tumor shrank on average 20% over the 25 day time course. Anti
-The effect of estrogen was not only for the removal of estrogen pellets.
This is because the tumor implanted in the placebo-treated animals continued to grow over time. This
Data confirmed the data already obtained in the flank transplant model (FIG. 1).
Figure 1 shows the growth of MCF-7 tumors implanted in the ventral fat pad of nude mice
Estradiol (n = 4), tamoxifen (n = 7), TMI (n = 5) or placebo (n = 5)
The result is shown. The left panel shows data for tamoxifen, TMI and placebo.
On the other hand, the right panel adds data from the estradiol group. Drug on flank
Were administered as sustained-release pellets implanted (s.c.) into the mice.
Using T2-weighted MR images, in vivo tumor tissues were identified for TMI-treated and placebo-treated tumors.
And evaluated. To evaluate the effects of tamoxifen and estradiol treatment
Comparison of tissue sections and TMI / placebo images using (1)
Region appears gray (medium intensity) in the T2-weighted spin-echo image, and (2) the necrotic area increases
Mainly long with some contribution of increased proton density (ie high water content)
Appears white (high intensity) due to spin-spin relaxation time and (3) fibrotic areas
Looks dark (low intensity) due to short spin-spin relaxation time and low water content
That was shown. According to these definitions, placebo treatment had significant tumor necrosis by day 3.
No significant changes, but increased necrosis by day 6 (FIG. 2). this
At time points, the area of necrosis was twice as high as that observed on day 0 (average 20%
From about 40% increase). Figure 2 shows MCF-1 human breast tumor implanted in nude mice
% Change in total necrosis relative to day 0 induced by TMI or placebo in
You.
Treatment of tumors with TMI elicited different responses in several aspects. Wide necrosis of the tumor
Start at the first sampling point (day 3) instead of day 6 as in the case of placebo
Happened. In addition, the total area of necrosis averages about 25% on day 0 to 72% on day 3.
Up to almost three-fold. All of these initial changes in tumor structure are
Occurred before any significant changes in For both TMI treatment and placebo treatment
And regression of necrosis was associated with fibrosis infiltration. The tissue analysis of the re-excised tumor was performed by MRI.
There was a good correlation with the listing.
TMI develops a fast onset, partial estrogen ablation (ie, estrogen
Induction of tumor necrosis that is more extensive than that induced by the removal of Tumor
In addition to its effects on isuzu, preliminary studies also show that TMI
Suggests that it is more powerful. Thus, tamoxifen, like TMI,
Induces rapid necrosis (up to 3 days) as assessed by MRI
However, the maximum extent of necrosis was 50% (compared to 72% for TMI). important
In particular, some tumors treated with tamoxifen become resistant to the effects of the drug.
And began to regrow over time. This phenomenon did not occur with TMI.
Tamoxifen reduces the rate of necrosis and the number of capillaries in the tumor
The findings suggest that tamoxifen provides an anti-angiogenic effect in vivo,
Proposal to cause tumor starvation and observed cell death (Furman-Haran et al., Cancer
Res. 54, 5511-5514, 1994). Whether the TMI will share these effects
To determine whether vascular consolidation is achieved using two techniques: microscopy and immunostaining
Degree was measured on TMI-treated and placebo-treated tumor sections. Brem et al. (JNCI, 48, 347-
356, 1972), using a modification of the tissue sorting system described in
It was measured. In this approach, capillaries (formed by red blood cells or unique endothelial cells)
Various microscope fields (250 μmTwo% Of the grid (Fig. 3)
).
This was completed for both the entire tumor as well as the surviving area within the tumor. Capillary dense
The degree was found to be reduced after TMI exposure. In assessing all tumors, the tumor cap
The cells were unchanged and highly vascular, but the density dropped considerably within this interface. Necrosis
Areas generally did not contain blood vessels. TMI shows higher necrosis compared to placebo-treated tumors
It is surprising that these tumors express low total vascular density
There is no. However, if the analysis is limited to the survival area only, after TMI treatment
Had a significant reduction in angiogenesis and a 50% reduction in capillary area compared to placebo
(FIG. 4). Note endothelial cytology and abnormalities in addition to vessel count and area
Was done. Notable and documented cytological abnormalities include plump nuclei, bumps
Plump nuclei, including nucleoli, hyperpigmented nuclei and mitotic figures were mentioned.
GSL-1 lectin (equivalent of factor VIII antibody staining for human endothelial system), followed by
Using a stained image analysis of sections taken, the vascular density of mouse endothelial cells was determined by special staining.
Was evaluated. The average percentage of endothelial cell area in the control tumor survival area was 14%, and TMI
The average percentage of endothelial cell area in the surviving area of the treatment area was 5%. 3 times of endothelial cells
Was highly significant (FIG. 5). These two events, reduced blood
Increased ductal area and endothelial density and concomitant tumor necrosis were due to TMI due to reduced number of vessels.
It strongly supports the hypothesis that it induces cell killing activity and leads to tumor starvation. Ma
Also, preliminary data on TBB in the MCF-7 model was generated. Like TMI, T
BB was well tolerated by mice at doses as high as 10 mg / kg, and over a two week period.
Did not induce any side effects when administered daily. T to mice with MCF-7 tumor
Administration of BB resulted in significant tumor regression in an amount of 32% over the two weeks of dosing daily. TMI
Induced a 20% regression over the 25 day time course. This data is based on TBB
Suggests that it is more potent than cifenmethiodide in its anticancer properties.
The effect of TMI on angiogenesis was evaluated using in vitro techniques. Matrige
(Laminin, collagen type IV, heparin sulfate proteoglycan and
Bovine endothelial cells inoculated with a basement membrane formulation made of contactin
As will form a tube that extends. TMI ranges from 1 μM to 20 μM.
Thus, tube formation and proliferation were inhibited in a concentration-dependent manner. 10 μM dose of TMI for image analysis
More than 70% reduced tube area as measured.
The effect of TMI on tamoxifen on collagenase activity
Both cell lines were considered. Human fibrosarcoma cells are applied to the culture and 0.5 μM to 20 μM
Exposure to doses of TMI or tamoxifen ranging up to M. 6 hours and 24 hours
After the incubation, a sample of the supernatant was removed and the two collagenases were removed.
The collagenolytic activity associated with sonoenzymes (gelatinases A and B (MMP-2 and MMP-9)).
And evaluated by zymography (substrate-impregnated non-reducing active gel). TMI is dose dependent
Inhibit both isoenzymes in a manner that is complete, with complete inhibition observed at the 20 μM level.
(FIGS. 6 and 7). Tamoxifen, on the other hand, is available at a dose of 20 μM (including 20 μM).
It did not show any significant inhibitory activity.
FIG. 7 shows 72 hours after zymography measured at 6 and 24 hours after drug administration.
20 .mu.M ash for collagenase activity for both kDa and 92 kDa isoform systems
Shows the effects of xifene or TMI. In addition, TMI is 1 μM to 5 μM IC50In cattle
It is a potent inhibitor of collagenase (gelatinase A) activity in skin cells
(FIG. 8).
TBB was also tested in this assay and compared directly with TMI. TBB is collagenase
72 kDa isoforms (gelatinase A, MMP-2) and 92 kDa isoforms (gelatinase B,
MMP-9) was more potent than TMI as both inhibitors (FIG. 9).
In cell-free systems, TMI can be evaluated to determine if inhibitory effects are at enzyme levels or other genetic
It was determined whether it was expressed at the locus. TMI for enzyme activity at tested concentrations
No effect. This data shows that TMI has been tested for gelatinase A and
B suggests inhibiting biosynthesis and / or gene expression.
To further test where the inhibitory effect of TMI is expressed, human fibrosarcoma cells and
And bovine endothelial cells with type IV collagenase (both MMP-2 and MMP-9) promoters
And chloramphenicol acetyl transferer acting as reporter
Transfected with a plasmid containing the ZE (CAT) construct. Simian virus 40 (
SV-40) could be used as a positive control. Transfected with TMI
Cells were added to the cells at concentrations of 1 μM, 5 μM and 10 μM for 2 days, at which point the cells were
Vesicle viability was confirmed by trypan blue exclusion and cell counting. Fiber meat
In tumor cells, TMI is driven by promoters of both isoenzymes in a dose-dependent manner.
Transcripts, and even the lowest dose of TMI has a significant inhibitory effect.
(Figure 10). FIG. 10 shows the promoter of the collagenase 92 kDa isoform (634 bases).
Promoter or a 72 kDa isoform promoter (basic promoter-B)
Or a plasmid containing a promoter + enhancer-E)
At concentrations of 1 μM, 5 μM and 10 μM for CAT activity expressed in the expressed cell line
The effect of I is shown.
In endothelial cells, TMI reduced CAT activity by 45% at 1.0 μM and 80% at 10 μM
Was. This data shows that the effects of TMI on collagenase expression are closely related to the vasculature.
This suggests that there is a relationship (FIG. 11).
Conclusion:
1. For TMI, the decrease in vascular density was measured by morphometry and endothelial cell-specific staining.
In all cases, it was prominent in both the whole tumor area and the surviving area.
2. TMI is an inhibitor of MMP-2 in bovine endothelial cells and in human fibrosarcoma cell lines
Is an inhibitor of MMP-2 / MMP-9.
3. TBB is more potent than TMI in inhibiting metalloproteases in the system tested.
4. In transfected CAT lines in both fibrosarcoma cells and endothelial cells
Studies have shown that TMI can be used at the level of biosynthesis or
Is shown to be suppressed. Furthermore, lack of activity of tamoxifen analogs in cell-free systems
Indicates that TMI does not directly inhibit these enzymes.
Therefore, TMI and TBB are those that suppress the transcription or expression of metalloproteases.
Exerts strong anti-angiogenesis-inducing actions that are clearly correlated with the ability of
.
Although the present invention has been described in terms of various preferred embodiments, those skilled in the art will recognize various modifications.
, Substitutions, omissions and changes can be made without departing from the spirit thereof.
Would. Accordingly, it is intended that the scope of the invention be limited only by the following claims.
Not illustrated.
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 17/06 Ａ６１Ｐ 17/06
19/02 19/02
27/02 27/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
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，ＶＮ，ＹＵ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 17/06 A61P 17/06 19/02 19/02 27/02 27/02 (81) Designated country EP ( AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ) , MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CU, CZ, EE, GE, GH, GW, HU, ID, IL , IS , JP, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, US, UZ, VN, YU