JP2001511151A

JP2001511151A - 表皮又は皮膚疾患部の処理方法と形質転換動物

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Publication number: JP2001511151A
Application number: JP53314898A
Authority: JP
Inventors: エイ．ラーナー，イーサン; エイ．クレシ，アブラル; エイチ．ラーナー，リーザ
Original assignee: ザジェネラルホスピタルコーポレイション
Priority date: 1997-02-04
Filing date: 1998-02-03
Publication date: 2001-08-07
Also published as: EP1001677A4; WO1998033379A1; AU6139798A; EP1001677A1; US6160021A

Abstract

(57)【要約】皮膚の酸化窒素（ＮＯ）の量を調整する処置剤を被処置動物に投与することによりなる、不所望の表皮又は皮膚疾患を処置する方法。

Description

【発明の詳細な説明】表皮又は皮膚疾患部の処理方法と形質転換動物発明の背景本発明は酸化窒素（ＮＯ）を表皮又は皮膚疾患部の治療又は処置を行うために変性することに関する。有機硝酸塩とその気体状代謝最終生成物である酸化窒素（ＮＯ）は今日まで広範囲な生物学的な各種の活性に関連して来た(Snyder et al．(1992)Sci Amer 5: 68-77)。ＮＯの生物学的な効果に対する増大する関心は、血管の弛緩（血管拡張）が、内皮層が血管から剥離されるともはや生じないことが分かった１９８０年に始まっている。この作用を媒介する分子は内皮由来緩和因子(EDRF)と呼ばれている。１９８７年には内皮由来緩和因子EDRFは酸化窒素（ＮＯ）であることが示された。三種の酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）同型体の特性決定がなされた。構造形態 (constitutive form)は神経細胞(riNOS)中に見いだされている。(Schmidt et al ．(1991)Biochem Biophys Res Comm 181:1372-77)、誘導形態(iNOS)はマクロファージ中に見いだされている(Xie et al.(1992)Science 256:225-28;Lyons et a l.(1992)J Bio Chem 267:6370-74)。一方、他の構造形態は内皮細胞(eNOS)により生成される(Janssens et al.(1992)JBiol Chem 267:14519-22)。これらは又タイプI、II、IIIとしてそれぞれ知られている(Pollock et al.(1991)Proc Natl A cad Sci USA 88:10480-84)。血管系におけるＮＯの役割は広範囲であることが示された(Vane et al.(1990) New Eng JMed 323:27-36)。ＮＯは、eNOS遺伝子が相同性組み替えにより排除されているマウスの高血圧により証明されるような全身血圧の調整に寄与している (Huang et al.(1995)Nature 377:239-42)。肺の血管系におけるＮＯに対する減少した反応性は肺の高血圧に寄与するが、ＮＯの血管拡張効果は陰茎***には必要である(Saenz et al.(1989)New Eng JMed 320:1025-30)。皮膚血管系は、真皮が広範囲な毛細血管網を有すること及びこれらの毛細血管網が人の微細循環系を研究する良好なモデルとして役立つためにある程度の関心を引いている。他の血管と同様に、皮膚毛細血管の裏打ちをなす内皮はeNOSを発現する。ＮＯの存在下には人の皮膚の微細循環系の血流は著しく増大し、ＮＯＳのインヒビターの存在下には血管拡張は害されることが観察されている(Warren JB（1994）FASEB J 8:247-51;Ralevic et al.(1992)Br J Pharmacol 106:650-655)。大量のNOはマクロファージがインターフェロンγ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子α(T NF-α)又は少量のリポポリサッカライド(LPS)で培養されたときに生成する(Stue hr et al.(1985)Proc Natl Acad Sci USA 82:7738-42)。マクロファージによるＮＯの産生はバクテリア及び寄生物に対して害をする(Liew et al.(1991)Immuno l Today 12(3):A17-A21)。例えば、マウスのリーシュマニア症主感染に対する耐性はマクロファージ中のＮＯＳの誘導に関連付けられる(Liew et al.(1990)J Im munol 144:4794-97)。ｉＮＯＳが欠失（ノックアウト）したマウスでは、リーシュマニア症感染は重症である。ＮＯが神経メッセンジャーである事実は、小脳の顆粒細胞がグルタミン酸塩アゴニストに露出した後にＮＯを放出することが示されたときに初めて評価された (Garthwaite、J.(1991)Trends Neurosci 14:60-67)。ニューロンを含有している NOSは中心及び周辺神経系を通じて見いだされている(Bredt et al.(1992)Neuron 8:3-11)。NOは神経系の形態形成並びにシナプス可能性(plasticity)において重要な役割を果たす。発明の要約本発明は例えば人のような動物の望ましくない表皮又は皮膚疾患の治療を行う方法を特徴とする。この方法は被験動物又は患者に、皮膚の酸化窒素（ＮＯ）の量を調整するような処置薬を投与することを含む。所望されない細胞により特徴づけられる症状又は疾患部、例えば、メラニン細胞、又はケラチン合成細胞、かかる細胞の増殖物、又はかかる細胞のアポプトシス欠陥、又は不所望の色素沈着は、これらは皮膚中のＮＯの量を増すことにより処置される。例えばメラニン細胞又はケラチン合成細胞のような真皮又は皮膚細胞の欠損又は不足、例えば色素不足等により特徴づけられる症状又は疾患部は、皮膚中のＮＯの量を減少することにより処置される。好ましい実施例では、表皮又皮膚症はメラニン細胞関連の疾患であり、皮膚又は毛髪中の沈着色素の不足により特徴づけられる疾患であり、例えば髪の灰色化その他の色素欠失、不所望の又は過剰な皮膚又は髪の着色により特徴づけられる疾患、メラニン細胞の数または活動の欠陥により特徴づけられる疾患、不所望のメラニン細胞の死滅により特徴づけられる疾患、不所望のメラニン細胞のアポプトシス（壊死）により特徴づけられる疾患等である。好ましい実施例では、症状又は疾患は白斑、炎症後の色素減少、炎症後の色素増大、又は特発性の滴状高メラニン色素沈着(IGH)である。好ましい実施例では表皮又は皮膚疾患はケラチン合成細胞関連疾患、ケラチン合成細胞の数又は活性の不足により特徴づけられる疾患、不所望のケラチン合成細胞の死滅により特徴づけられる疾患、不所望のケラチン合成細胞のアポプトシスにより特徴づけられる疾患である。好ましい実施例では、症状又は疾患は、ケラチン合成細胞中の欠失によるなどにより引き起こされる不所望のケラチン合成細胞の増殖により特徴づけられる。好ましい実施例では、症状又は疾患は、ケラチン合成細胞アポプトシスにおける欠損によるなどにより引き起こされる不所望のケラチン合成細胞の増殖である。好ましい実施例では、症状又は疾患は、皮膚炎、乾癬、毒性皮膚壊死（ＴＥＮ）等の炎症性皮膚疾患である。好ましい実施例では、症状又は疾患は扁平苔癬である。好ましい実施例では、症状又は疾患は日焼けである。好ましい実施例では、症状又は疾患は対宿主性移植片病(GVHD)である。他の好ましい実施例では、処置剤は局所的に又は静脈内注射により投与される。好ましくは、治療は反復されて例えば少なくとも１、２、３、４、５回行われる。好ましい実施例においては、処置は、皮膚のＮＯの量を抑制する物質の投与のような物質の投与を含み、例えばＮＯシンターゼ又はＮＯ捕捉体、例えばヘモ化合物、ヘモグロビンの投与、細胞死皮膚細胞（例えばばメラニン細胞又はケラチン合成細胞）を減少（或いは生存皮膚細胞の数を増加）させる。好ましい実施例においては、処置は、皮膚のＮＯの量を増大する物質の投与のような物質の投与を含み、例えばＮＯのドナー物質、例えばニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）又はその誘導体の投与により、好ましくは細胞死皮膚細胞（例えばメラニン細胞又はケラチン合成細胞）の量を増大（或いは生存皮膚細胞の数を減少）する。好ましい実施例においては、皮膚のＮＯの量はランゲルハンス細胞又はケラチン合成細胞によるＮＯの生成を抑制することにより調整される。他の好ましい実施例では、かかる調整はメラニン細胞又はケラチン合成細胞の量を減少し、メラニン細胞又はケラチン合成細胞の細胞死の量を減少する。他の形態では、本発明は毛髪の色素を減少するように被処置動物を処置する方法に関する。この方法は皮膚の酸化窒素（ＮＯ）の量を減少する処置剤をたとえば頭皮に投与することを含む。処置剤は局部的に又は皮下注射により頭皮に投与することができる。例えば投与は１、２、３、４、または５回行うことが可能である。好ましい実施例では、処置は皮膚中のＮＯの量を減少する物質の投与のような物質、例えばＮＯシンターゼ又はＮＯ捕捉体、例えばヘモグロビンのようなヘモ化合物の投与により、好ましくはメラニン細胞の細胞死を減少する。好ましい実施例では、ＮＯの量はランゲルハンス細胞又はケラチン合成細胞によるＮＯの生成を抑制することにより調整される。他の形態では、本発明は被処置動物例えばヒトを紫外線への露出による日焼け、或いは皮膚の老化による不所望の効果の処置を行う方法を提供する。この方法は被処理動物に皮膚の酸化窒素（ＮＯ）の量を減少する処置剤を投与することを含む。処置剤は局部又は皮下の、例えば患部に投与することができ、或いは静脈経由で少なくとも１、２、３、４、又は５回反復投与できる。好ましい実施例では、処置は皮膚中のＮＯの量を抑制する物質のような物質、例えばＮＯシンターゼ又はＮＯ捕捉体のインヒビター、例えばヘモグロビンのようなヘモ化合物のインヒビターの投与により、好ましくはメラニン細胞の細胞死を減少する。好ましい実施例では、皮膚のＮＯの量はランゲルハンス細胞又はケラチン合成細胞によるＮＯの生成の抑制により調整される。他の形態では、有害な表皮の壊死に対して被処理動物例えばヒトを処置する方法を提供する。この方法は被処理動物に皮膚の酸化窒素（ＮＯ）の量を減じる処理剤を投与することを含む。処理剤は例えば皮膚の罹患箇所に局部的に又は皮下的に又は静脈経由で、少なくとも１、２、３、４又は５回投与できる。好ましい実施例では、処理は被処理動物のＮＯの量を抑制する物質などの物質、例えばＮＯシンターゼまたはＮＯ捕捉体、例えばヘモ化合物（例えばヘモグロビン）の投与を含み、それにより、好ましくはメラニン細胞又はケラチン合成細胞の細胞死を減じる。好ましい実施例においては皮膚のＮＯの量はランゲルハンス細胞又はケラチン合成細によるＮＯの生成の抑制により調整できる。他の形態では、本発明は白斑に対して被処理動物を処置する方法を含む。この方法は皮膚中の酸化窒素ＮＯの量を減少する処理剤を被処理動物に投与することを含む。処理剤は皮膚の罹患部に対して局部又は皮下投与しても良いし、静脈投与しても良いし、或いは少なくとも１、２、３、４、又は５回繰り返して投与しても良い。好ましい実施例では、処理は皮膚のＮＯの量を抑制する物質、例えばＮＯシンターゼ又はＮＯ捕捉体、例えばヘモ化合物（例えばヘモグロビン）を投与することにより、メラニン細胞、ケラチン細胞の細胞死の量を減少する。好ましい実施例では、皮膚のＮＯの量はランゲルハンス細胞又はケラチン合成細胞によるＮＯの生成の抑制により調整される。他の形態では、本発明は皮膚の外観を、好ましくは被処置動物、例えばヒトの皮膚を色素沈着を減少し、或いは一般的には淡泊化することにより変更する方法である。この方法は被処置動物に皮膚中のＮＯの量を増大する処置剤を投与することを含む。好ましい実施例では、処置剤は局部又は静脈投与できる。好ましくは例えば、少なくとも１、２、３、４、又は５回繰り返して投与される。他の好ましい実施例では、処置は、皮膚中のＮＯの量を増大する物質のような物質、例えばＮＯのドナー化合物、例えばニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）又はその誘導体の投与により、好ましくは細胞死皮膚細胞（例えばメラニン細胞又はケラチン合成細胞）の量を増大（或いは生存皮膚細胞の数を減少）する。他の形態においては、本発明は皮膚の外観を、好ましくは被処置動物、例えばヒトの皮膚を色素沈着を増大し、或いは一般的には黒化することにより変える方法である。この方法は被処置動物に皮膚中のＮＯの量を減少する処置剤を投与することを含む。好ましい実施例では、処置剤は局部又は静脈投与できる。好ましくは投与は例えば少なくとも１、２、３、４、又は５回繰り返して投与される。好ましい実施例においては、処置は、被処理動物のＮＯの量を抑制する物質のような物質、例えばＮＯシンターゼまたはＮＯ捕捉体のインヒビター、例えばヘモ化合物（例えばヘモグロビン）の投与を含み、それにより、好ましくはメラニン細胞又はケラチン合成細胞の細胞死を減じる。他の形態においては、本発明は毛髪の外観を、好ましくは被処置動物、例えばヒトの毛髪を色素沈着を減少し、或いは一般的には淡泊化することにより変更する方法である。この方法は被処置動物に皮膚又は頭皮中のＮＯの量を増大する処置剤を投与することを含む。好ましい実施例では、処置剤は局部又は静脈投与できる。好ましくは例えば少なくとも１、２、３、４、又は５回繰り返して投与される。他の好ましい実施例では、処置は毛髪中のＮＯの量を増大する物質のような化合、例えばＮＯのドナー物質、例えばニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）又はその誘導体の投与により、好ましくは細胞死皮膚細胞（例えばメラニン細胞又はケラチン合成細胞）の量を増大（或いは生存皮膚細胞の数を減少）する。他の形態においては、本発明は毛髪の外観を、好ましくは被処置動物、例えばヒトの毛髪を色素沈着を増大し、或いは一般的には黒化することにより変更する方法である。この方法は被処置動物に皮膚又は頭皮中のＮＯの量を減少する処置剤を投与することを含む。好ましい実施例では、処置剤は局部又は静脈投与できる。好ましくは例えば少なくとも１、２、３、４、又は５回繰り返して投与される。好ましい実施例では、処置は皮膚中のＮＯの量を抑制する物質のような物質、例えばＮＯシンターゼ又はＮＯ捕捉体のインヒビター、例えばヘモグロビンのようなヘモ化合物のインヒビターの投与により、好ましくはメラニン細胞の細胞死を減少する。本発明者は皮膚中のＮＯの量を増大する遺伝子に結合された皮膚プロモータを含む一個以上の構成部を有する形質転換動物が、毛髪又は皮膚（特に毛髪又は皮膚の色素沈着）の健康又は外観、を増進するのに使用される物質を評価するのに使用できることを見いだした。従って、本発明は物質の毛髪又は皮膚への作用を評価する方法を特徴とする。この方法は、皮膚中のＮＯの量を増大する遺伝子に結合された皮膚プロモータを含む一個以上の構成部を有する形質転換動物を用意し、被験物質を形質転換動物に投与し、そして毛髪又は皮膚に対する作用を検査することよりなる。物質は経口的に、又は注射、好ましくは皮膚又は皮下注射により投与される。好ましい実施例においては、物質は適当な投与媒体、例えば界面活性剤又は皮膚への浸透性を増す助剤例えばSDSまたはDMSOを含有している組成物を使用して投与される。ここに形質転換動物はヒト以外の動物である。例えば形質転換動物は形質転換したミニブタ、モルモット、ラット、またはマウスである。最も好ましいものはマウスである。特に好ましい実施例では皮膚プロモータは被膜プロモータ、例えばケラチン１４プロモータ、チロシナーゼプロモータ等がある。好ましい実施例では、遺伝子は酸化窒素合成酵素、例えば誘導性酸化窒素合成酵素（シンターゼ）である。好ましい実施例においては、本方法はさらに物質を形質転換動物１回又はそれ以上の回数で投与する方法を含む。好ましくは、少なくとも１、２、３、又は４週にわたって形質転換動物に投与される。物質は一定量で又は異なった量の範囲で投与できる。好ましい実施例では、物質は化粧品、非毒性物質、一つ以上の管轄地域でヒトの薬剤又は化粧品として承認されている物資などである。他の形態において、本発明は、皮膚プロモータ、例えば被膜プロモータ（例えばケラチン例えばケラチン１４プロモータ、チロシナーゼプロモータ）と結合した、皮膚のＮＯの量を増大する遺伝子例えばiNOS遺伝子を有する非ヒト形質転換動物を含む。好ましい実施例では、形質転換動物は非ヒト形質転換動物であり、例えば、形質転換したミニブタ、モルモット、ラット、マウス例えば老化加速マウス、又は加速加齢の表現型を示す突然変異マウスたである。最も好ましい動物はマウスである。他の形態において、本発明はここに記載したプロモーター遺伝子構造体である。本発明の方法は、完全な動物については生体内で、ここに記載した形質転換動物から採取した組織(例えば皮膚)、細胞、或いはプロモーター遺伝子構造体で形質転換された細胞からの細胞（例えば皮膚細胞）又は組織についてはインビトロで実施できる。本書で、「表皮又は皮膚疾患(condition)」とは、不所望な状態、例えば疾患、病気、自己免疫疾患、又は、老化、ストレス、もしくは日焼け関連した毛髪又は皮膚の状態を表すものとする。本書で、「調整」とは、被処置動物の皮膚又は髪のＮＯの量を増加又は減少させることを表す。例えば、皮膚のＮＯの量はＮＯシンターゼ又はＮＯ捕捉体（ヘモ化合物、例えばヘモグロビン）のインヒビターを、例えば局部的に又は静脈経由で投与することにより減少できる。皮膚のＮＯの量はＮＯドナー例えばニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）又はその誘導体を、局所的に又は静脈経由で投与することにより増大できる。調整は遺伝子レベルで起きうるものであり、例えば細胞発現のレベルでＮＯ合成を増大させる遺伝子又は細胞療法をこのなうことにより、或いは酵素レベルでＮＯＳ発現を抑制するアンチセンス分子の投与することにより、或いは捕捉体分子を追加することにより、或いはＮＯを吸収することにより、或いはＮＯを投与することにより、調整できる。本書で「被処置動物」とは不所望の表皮又は皮膚疾患にかかりやすい哺乳動物を指す。哺乳動物にはヒト、犬、猫、豚、牛、馬、ラット、ネズミ等がある。「疾患部を処置する」とは疾患の進行を阻止し、抑制し、減じ、或いは遅延することを指す。本書で「形質転換動物」とは非ヒト動物、例えばミニブタ、モルモット等の動物、マウスやラットのような齧歯類、その他細胞の一部、好ましくは実質的に全部に形質転換遺伝子を含んでいる動物である。形質転換遺伝子は細胞に直接的に導入しても良いし、又は細胞の前駆体に導入することにより間接的に導入しても良く、例えばマイクロ注入、トランスフェクション、又は感染（組み換えウイルスによる感染等）によることができる。「遺伝子操作」の語は組み換えＤＮＡ分子を導入することを意味する。この分子は染色体に組み込んでも良いし、或いは染色体外の複製ＤＮＡでも良い。本書で「齧歯類」とは系統学上のRodentia目に属する全ての種を含む。本書で「皮膚プロモータ」とは皮膚内で転写活性を有するプロモータを指す。それは皮膚特異性を有しなくて良い。プロモータが天然に見いだされるような遺伝子は皮膚の保持又は適正な機能に関与する遺伝子であり得る。本書で「物質を動物に投与する」とは処理剤を動物又は細胞に分注し、与え、又は塗布することを指す。投与は局部投与でも良いし、非経口又は経口投与、筋肉注射、皮下注射、皮膚内注射、静脈注射、頬投与、経皮投与、鼻孔又は気管経由によるものでもよい。最も好ましい投与法は局部投与又は皮下注射又は皮膚内注射である。本発明者はＮＯが皮膚の生理において重要な媒体であることを見いだした。本発明の方法は皮膚における生理学的過程に対処し、診断上の困難を解決し、皮膚医学者が利用できる治療手段の数を増加する。皮膚病がストレスによって悪化するような患者が多数存在する。この現象に対し、神経がランゲルハンス細胞を刺激してｉＮＯＳを生成し、通常の生理学的過程と免疫作用の関連した修正を伴って、大量のＮＯを生成する媒体を釈放するという説明が可能である。従って、ＮＯＳの遮断が有利な効果を有する。本発明の実施には特に断らない限り当業者に知られている細胞生物学、細胞培養、分子生物学、形質転換生物学、ミクロ生物学、組み換えＤＮＡ、及び免疫学の手段が使用される。かかる技術は例えば次の文献に記載されている。Molecula r Cloning A Laboratory Manual、2nd Ed.、ed．by Sambrook、Fritsch and Man iatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989);DNA Cloning、Volumes I a nd II(D．N．Glover ed.、1985);Oligonucleotide Synthesis(M．J．Gait ed.、 1984);Mullis et al．U.S．Patent No:4,683,195;Nucleic Acid Hybridization( B．D．Hames & S．J．Higgins eds．1984);Transcription And Translation(B.D .Hames & S.J.Higgins eds.1984);Culture Of Animal Cells (R.I.Freshney、Al an R.Liss、Inc.、1987);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press、1986);B .Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning(1984); the treatise、Methods In Enzymology(Academic Press、Inc.、N.Y);Gene Tran sfer Vectors For Mammalian Cells(J．H．Miller and M．P．Caloseds.、1987 、Cold Spring Harbor Laboratory);Methods In Enzymology、Vols．154 and 15 5(Wu et al.eds.)、Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(M ayer and Walker、eds.、Academic Press、London、1987);Handbook Of Exper imental Immunology、Volumes I-IV(D.M．Weir and C.C.Blackwell、eds.、198 6);Manipulating the Mouse Embryo、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor、N.Y、1986)。本発明の他の特徴及び効果は以下の詳細な説明からかとなろう。図面の簡単な説明図１Ａ及び１ＢはＬＰＳの存在下にＬＣおよびＳＸ−５２細胞のＮＯの産生を示すグラフである。図１Ａは２４時間後におけるＳＸ−５２細胞のからの上澄みにおける亜硝酸塩の量を示す(200、000細胞／ウエル)。図１Ｂは長時間後のＮＯ増加を示す(50、000細胞／ウエル)。実験は三回行たもので、棒は標準偏差付きの平均値を示す。図２はＬ−ＮＡＭＥによるＸＳ−５２におけるＮＯ産生の抑制を示す棒グラフである。ＸＳ−５２細胞からの上澄みがＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）中でＬ−ＮＡＭＥ−ｉＮＯＳのインヒビターと共に３７℃で一晩培養され、グリース反応を利用してＡ硝酸塩の量が検出された(200、000細胞／ウエル)。棒はミクロ滴定プレート上の３個のウエルの平均を表す。1=(LPS(-)、2-LPS(+)１μg/ml、3+LPS+L-NAM E(5mM)、4=LPS+D-NAME(5mM)。図３はＸＳ−５２細胞中のＮＯ産生のＩＬ−１０抑制を示す棒グラフである。ＩＬ−１０は棒３からわかるように、ＬＰＳ単独の存在下の最適のＮＯ産生（棒２）に比して、ＮＯ産生を抑制する。IL-IO（lOng/ml）は実際にiNOS誘導に影響するが、この影響は最終生成物ＮＯ量でもみられる。全ての棒には標準偏差が付されている。図４はiNOSの発現の抑制を示すゲルの写真である。対照（１）ＲＡＷ２６４．７（マウスマクロファージ細胞系）細胞抽出のウエスタンブロットは、ＩＬ−１０により抑制されるＬＰＳ（３）の存在下でのｉＮＯＳ発現の増加を示している。 L-NAMEとD-NAMEはXS-52中でのiNOSの量に影響しない。1=RAW 264.7細胞(LPS)、2 =LPS(-)、3=LPS(+)、4=LPS+IL-10(50ng/ml)、5=LPS+L-NAME(5mM)、6=LPS+D-NAME (5mM)。ランゲルハンス細胞及びＮＯランゲルハンス細胞（ＬＣ）は皮膚免疫反応における重要な役割を果たす樹状細胞である。これらは外的刺激に対する歩哨であると考えることができる。それらの作用はサンプル抽出し、自身に応答し、残りの免疫系に環境の変化を通報する。ＬＣは表皮の基底又は上部基底層に存在し、樹状のネットワークを形成し、それを通してＬＣは近接したケラチン合成細胞及び神経と相互作用する。それらは移動性であり、リンパ節のＴ細胞依存領域に移動できる。マクロファージと同様に、それらは骨髄由来であり、構造的にMHC-IIを発現し、内在した抗原提示特性を有する。しかしマクロファージとは異なり、ＬＣはナイーブＴ細胞を感作する。１９８１年にTannenbaum氏は感染性下痢症に罹患した患者が非常に高いレベルの尿中亜硝酸塩を分泌していることを発見し、これによりマクロファージ中のＮＯの発見を導いた一連の研究の端緒を開いた(Snyder et al.(1992)Sci Amer 5 :68-77)。今ではマクロファージが酵素酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）の誘導性同型を発現することが知られており、それらの遺伝子がクローン化されその発現が内毒素、リポポリサッカライドの存在下に劇的に増大した(LPS)(Xie et al. (1992)Science 256:225-28;Lyons et al.(1992)J Bio Chem 267:6370-74)。iNOS はＬアルギニンをテトラヒドロビオプテリンのような補助因子を使用する一連のレドックす反応を経由してＮＯに変換する。酸化窒素は細胞を拡散して近傍の細胞に影響する能力を有する短命で高活性のガスである。従って、それは実際の作用部位から遠い側で生成できる。潜在的に有毒なＮＯは、関連した生物学的系内で逆説的作用を行うことを可能にする豊富なレドックス及び追加的な化学特性を有する。それはメッセンジャーであると同時にエフェクター（毒素）でもある。それは血管拡張におけるメディエータであり、中央及び周辺神経系のニューロトランスミッタであり、マクロファージ細胞毒性と神経毒性における活性成分である。NOは神経伝達物質として同定されており、又酵素ｉＮＯＳの同型体が神経（神経NOS、ncNOS）内で発現される。マクロファージからのNOは、細菌及び寄生体に対して直接に毒性がある遊離ラジカルの生成に関与しているので、寄生病に対する非特異的な防御に関係する。従って、NOはサーボ調整作用と細胞毒機能の両者を媒介するが、これは関連した系内で逆説的作用を及ぼすその生物学的な特性によるものであろう。ＮＯは皮膚に関しては余り詳しくは記載されていないが、皮膚血管拡張のレスポンスにおいて役割を果たすことが示されている。物質Ｐはマウスの皮膚に水腫を誘発し、マスタード油はラットの皮膚に炎症を誘発する。皮膚は敵対的な環境に対する最初の防御手段である。従って、それは各種の潜在的に有害な有機物や物質に対処する能率的な免疫系を有するに違いない。ランゲルハンス細胞はこの系の求心性のアームを形成する。表皮ではマクロファージが漸増しうるが、ランゲルハンス細胞は主な抗原提示細胞である。酸化窒素はマクロファージにおける重要なエフェクター分子である。理論に拘束されるつもりはないが、ケラチン合成細胞もまた酸化窒素シンターゼによるＮＯの産生の原因であり得る。ＮＯシンターゼのインヒビター本書で「ＮＯシンターゼインヒビター」とは、ＮＯシンターゼの競合的又は非競合的インヒビターのことを指す。ＮＯＳインヒビターとしての化合物の有効性及びその相対的な能力は、例えば小脳のホモジェネートにおけるＮＯＳによるアルギニンのシトルリンへの変換を監視することによってＮＯＳ活性の抑制を測定することによ、試験され及びルーチンに決定されうる。シトルリン形成の減少は物質の抑制活性を示す。被験物質の存在下に形成されたシトルリンの量に対比した、シトルリン形成の減少率は、ＮＯＳインヒビターとしての能力を示した。本発明で使用できる酸化窒素シンターゼのインヒビターには、例えばアミノグニジン、Ｎ^G−ニトロ−Ｌ−アルギニン、Ｎ^G−メチル−Ｌ−アルギニン、Ｎ^G− ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル、及Ｎ^G−イミノエチル−Ｌオルニチンのような基質アナログ、例えばジフェニル沃素、沃素ジフェニル、及びジ−２− チエニル沃素のような、フラビン蛋白質バインダー、カルシネウリン、トリフロロペンタジン、N-(4-アミノブチル)-5-クロロ0-2-ナフタレンスルフォンアミド、及びN-(6-アミノヘキシル)-1-ナフタレンスルフォンアミド、一酸化炭素のようなヘモバインダー、2.4-ジアミノ-6-ヒドロキシピリミジンのような除去剤又はアナログ、コルチコステロイドのような誘導インヒビター、TGF-β^C-1、-2、-3、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、及びマクロファージ脱活性化因子がある(Nathan、the FASEB Journal、Vol.6、Sept．1992、pp．3051-3064)。好ましいものは酸化窒素シンターゼの基質アナログ、N^Gアミノ-L-アルギニン、N^G メチル-L-アルギニン、N^Gニトロ-L-アルギニン、N^Gニトロ-L-アルギニンメチルエステル、及びN^Gイミノエチル-L-オルニチンである。特に好ましいものはN^Gアミノ-L-アルギニン、N^Gメチル-L-アルギニン、N^Gニトロ-L-アルギニン、及びアミノグアニジンである。最も好ましいものはN^Gメチル-L-アルギニンである。これらのインヒビターのうちの多くのものは、例えばCalbiochem、Sigma、及びAld richとして市販されている。製薬上許容される塩もまた投与することができる。適当な塩の例には塩化水素、臭化水素、沃化水素等の酸性塩、硫酸塩、酢酸塩、及びアミン、アンモニウム、アルカリ金属、及びアルカリ土類金属のような塩基性塩が含まれる。他の実施例では、ＮＯシンターゼ共同因子テトラヒドロプテリンのインヒビタが使用できる。このようなインヒビターの一つにはアミノプテリンがある。酸化窒素（ＮＯ）捕捉体本書で「ＮＯ捕捉体(scavenger)」とは遊離ＮＯに結合してＮＯの濃度を局部的に又は全身的に減少する分子種のことを指す。かかる捕捉体には、限定ではないが、メタロプロテイン、特にヘモグロビン、ミオグロビン、サイトクロームP- 450、ヘモアルブミンのような蛋白質含有ヘモ類、サイトクロームＣのウンデカペプチドのようなヘモ含有ペプチド、及び水溶性ヘモグロビン（Traylor and Tr aylor(1982)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.11：105-127等）及びピケットフェンスポルフィリン(Collman et al.(1975)J.Am.Chem.Soc.97:1427-1439)がある。好ましい実施例では、捕捉体はインビトロ、インビボ、又は動物モデル実験においてＬアルギニンによって反転されない鬱血を起こすことができるものから使用選択される。本発明による多くの捕捉体の使用は、細胞内のＮＯ酸性又は血管外のＮＯ活性に影響することなく血管系への制限ＮＯの減少を生じる利点を有する。従って、神経系における可溶性グアニル酸シクラーゼに対する形質導入手段としての NO活性は及び免疫細胞の機能は最低の影響に抑制され、従って、ＮＯ捕捉体による治療における可能な副作用を減じる。ＮＯ活性の他のインヒビターＮＯシンターゼのインヒビターの他に、本発明の方法はＮＯによって活性化される第２のメッセンジャー系のインヒビター、特に第２のメッセンジャー（下流信号伝達物質）グアニル酸シクラーゼ及び環状CMPを使用することができる。非限定的なグアニル酸シクラーゼの例はメチレンブルーである。環状CMPの活性はM &B 22948のようなアルニノグアニジンにより抑制することができる。正常組織におけるＮＯ合成インヒビター本発明の方法はＮＯシンターゼインヒビター（競合インヒビター例えば基質アナログ）の投与に続き、ＮＯシンターゼ基質の投与を行うことを含む。これにより正常組織へのインヒビターの影響を選択的に逆転する。ＮＯシンターゼ基質としては、非限定的な例として、スクシン酸グアニジン及びＬアルギニンがある。ＮＯドナー本発明の方法はＮＯドナーの治療投与を含むことができる。本書で「ＮＯドナー」とはＮＯを放出することができる分子種を意味する。ＮＯドナーの例はニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）又はその誘導体を含む。形質転換動物本発明で使用できる形質転換動物には、例えばミニピッグ、モルモットのような豚類、マウス又はラットの要は齧歯類等の非ヒト動物がある。マウスは好ましい動物である。各種の動物を調整する方法は当業界に知られている。形質転換豚を製造するための方法はWhite及びYannoutsos著、Current Topics in Complemen t Research、64th Forum in Immunology、pp.88-94;米国特許第5523226号、米国特許第5573933号、PCT特許公開WO93/25071、及びPCT特許公開WO95/04744号に記載されている。形質転換ラットを製造するための方法はBader及びGanten著、Cli nical and Experimental Pharmacology and Physiology、Supp.3:S81-S87、1996 に記載されている。形質転換牛を製造するための方法はTransgenic Animal Tech nology、A Handbook、1994、ed.、Carl A.Pinkert、Academic Press、Inc.に記載されている。形質転換羊を製造するための方法はTransgenic Animal Technology、A Handbook、1994、ed.、Carl A.Pink ert、Academic Press、Inc.Allに記載されている。これらの特許及び参照文献は引用して記載の一部とする。薬剤組成物本発明の物質は単独で又は適当な薬剤組成物の形で投与することができる。投与の方法は当業界に周知であり、経口、非経口(静脈経由)、局部投与等が可能である。静脈投与が好ましく又局部投与が特に好ましい。好ましくは物質は薬剤的に許容しうる担体との混合物の形で製造できる。ここに「担体」とは希釈剤、賦形剤、その他薬剤組成物の混合物を調整するために使用される物質を指す。適当な薬剤担体として使用できる非限定的な物質は、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース又はでんぷん等の炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、滑石、けい酸、各種パラフィン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルローズ、ポリ塩化ピロリドン等である。薬剤組成物は殺菌でき、所望により助剤、例えば潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整用塩類、緩衝剤、香料、着色料、及び・又は芳香物質等であって、活性成分と不利な反応をしない物質を含みうる。非経口投与に対しては、特に適したものは終車可能な清浄溶液であり、好ましくは油性の又は水性の溶液、懸濁液、エマルジョン、または埋込剤、或いは座薬である。アンプルは便利な単位分量を有する。経口投与は好ましくはカプセル、錠剤、及び・又は液体組成物の形で行う。単位分量の投与が好ましい。処置剤の分量と処置の長さは処理すべ患部の状態に依存する。処置の期間は一日、一週、又はそれより長くて良く、慢性的な進行性症状の場合には患者の一生に及んでも良い。.本発明の組成物は又症状が続く限り毎日投与しても良い。インヒビターは有効量を投与する。ＮＯインヒビターの典型的な投与量は体重基準で約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、分割又は単一投与される。投与量は使用されるＮＯシンターゼインヒビター又は捕捉体とその相対的な納涼区に依存する。処理剤の分量と投与の長さは症状と病気の段階に基づいて医師が容易に決定できる。一般に化合物又は組成物は単一のボーラス量を投与されるが、本発明は継続投与、例えばIV点滴やポンプによりもの、或いは多数回ボーラスによりものも意図している。本発明の物質は好ましくは、皮膚に塗布するのに適した皮膚学的に許容される無毒性の媒体又は担体を含む局部組成物或いは化粧組成物に含有させることができる。適当な媒体には活性物質を効果的に運ぶことができるアセトン、アルコール、又はクリーム、ローション、又はゲルがある。このような媒体の一つはPCT／US93／05068に記載されている。さらに、浸透向上剤を媒体に添加することによりさらに組成物の有効性を向上することができる。本発明の物質の濃度は局部用物質としては飽和溶液まで、好ましくは０.０１％から３０％の範囲で変わりうる。効果的に投与できる最大量は本発明の物質が皮膚に浸透する速度によってのみ制限される。一般に効果的な量は皮膚の単位平方センチあたり１〜３０００μｇ以上である。物質を投与するための技術及び組成物ないし配合物は、Reminton's Pharmaceu tical Sciences、Meade Publishing Col.、Easton、PAに記載されている。酸化窒素（ＮＯ）の量の分析半減期(６秒)、酸素の存在下における不安定性、生成量が少量なことのため、ＮＯの直接的な測定が困難であるが、ＮＯ感受性電極により可能である(Archer S.(1993)FASEB J 7:349-60)。機能分析は、Ｌアルギニン中のグアジニノ−窒素の酸化を介するＮＯ形成を触媒してＮＯとシトルリンを生成する酵素、酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の存在を検出する。間接分析はグリース反応を利用してＮＯの酸化生成物の一つである亜硝酸塩を測定する(Green et al.(1982)nalytical Biochem 126:131-38)。第２メッセンジャー環状GMP(cGMP)の量の決定は、ＮＯによって活性化されてcGMPを生成する酵素グアニン酸シクラーゼに対するＮＯの効果を評価する(MCKee et al.(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91:12056-60)。ノーザンブロット上のNOSRNAの検出及びウエスタンブロット上のＮＯＳ蛋白質の検出はＮＯ調整の研究に対する他の手段を与える。組織化学を使用してＮＯＳの原位置での発現を検討することができる。これらの全ての手段はＮＯの皮膚生理の研究に使用することができる。本発明はさらに以下の実施例により詳しく説明するが、本発明を制限するものと解してはならない。本書で引用した各種の文献、特許等は引用により本書の一部とする。例次の材料及び方法を実施例１〜６で使用した。動物ＬＣ調製のため８〜１２週の時齢のBALB/CマウスをJackson Laboratory(Bar H arbor、メイン州)を取得した。組織培養剤、媒体、化学剤次の組織培養剤をLife Technologies社（Grand Island、ニューヨーク州）から入手した：１００％胎児子牛血清（ＦＣＳ）により補足したRPMI1640よりなる完全媒質(ＣＭ)、ヘペス(10mM)、ストレプトマイシン(100ug/ml)、ペニシリン(1 00U/ml)、２−メルカプトエタノール(0.1M)、ピルビン酸ナトリウム(1mM)、非必須アミノ酸(0.1mM)及びL-グルタミン(2mM)。組み換えネズミＩＬ−１０をBiosou rce社から又L−NAME及びD-NAME Sigma社(St.Louis、ミズーリ州)から入手した。抗体と関連試薬は次の通りであった。アンチ-Thy-1.2mAb、(Sigma社)、低毒性ラビット補体(Cedarlane社、Hornby、カナダオンタリオ州)、マウスアンチマウスI -A^d(Pharmingen社、San Diego、カリフォルニア州)、磁性微小球に結合したヤギアンチマウスlgG(Dynabeads M-450;Dynal A.S社、ノルウエー、オスロー)、Lymp holyte M(密度1.0875、Cedarlane社、Hornby、ON)、及び、マウスマクロファージＮＯＳのアミノ酸９６１−１１４４に相当する２１ｋＤａの蛋白質断片に対してアンチ-iNOS FITCに接合したモノクローナル抗体(IgG)(Transduction Laborat ories社、ケンタッキー州Lexington)。他の全ての化学剤はSigma社から入手した。ＥＣの調製ネズミＥＣの単細胞懸濁液を上記のように用意した。Thy-1+細胞をアンチThy- 1.2mAb及び補体と共に定温培養することにより枯渇させた。死滅細胞をLympholy teM上に除去した。境界部細胞を洗浄し、アンチマウスI-A^dを使用して３０分間処理し、磁性微小球に結合したヤギアンチマウスＩｇＧと共に定温培養し、次いで磁場にさらすことにより、磁性微小球分離を行ってＬＣを単離した。表面に磁性微小球を有する細胞は磁場により分離された。付着した磁気ビードを有するこれらはLCである。LCを無血清のCMで培養した。ランゲルハンス細胞様細胞系（XS-52）前に述べたように新生BALB/c皮膚から樹状細胞系を確立した。この細胞系はランゲルハンス細胞の特徴である樹状を有し、バーベック顆粒を含み、抗原を提示し、採取したばかりのＬＣの多く表現型の特性を有する。この細胞系は１０％ＦＣＳ、５０Ｕ／ｍｌの組換えネズミＧＭ−ＣＳＦおよび１０％ＮＳ細胞上澄み液 (新生BALB/cネズミから培養した基質細胞から得た上澄み液)を含むＰＲＭＩ１６４０中で増殖した。これらの細胞は実験に先立って２日間、GM-CSF及びNSの無いＣＭ中で成長させた。逆転写酵素(RT)-PCR 磁性微小球(Dynabeads社のmRNA DIRECT kit、Dynal、Oslo、Norway)を使用して、ポリA⁺RNAをＬＣＰの存在下及び不存在下に定温培養した精製ＬＣから分離し、次いでRT-PCRを実施した(Geneamp社のRNA PCR kit、Perkin Elmer、Branchb urg、NJ)。iNOS、ecNOS、又はncNOSを増殖するように設計された縮退プライマー（Dept.of Cardiology、University of Vienna、AustriaのJohanna Wolframm博士の好意で入手）と、マウス、ラツト及びヒトの種にわた５’プライマー(Deg-A )CAYRTCAAGTAYGCCACCAACAAAGGGAA及び３’プライマー(Deg-C)RCCRATCTCHGTGCYCA TGTACCWRCを使用した。これらのプライマーはマウスマクロファージ−iNOSにおいて４１９塩基対配列にまたがる。ＰＣＲ条件は次の通りであった。RT反応−室温２０分、４２℃１５分、９９℃５分、及び５℃５分。PCR反応−９４℃３分、変性９４℃３０秒、アニール−５５℃３０秒、伸長−７２℃１分−４０サイクル、７２℃７分、４℃。PCR産生物を１．５％Ａがロースゲル中で分離し、臭化エチヂウムで染色した。得られた断片をゲル精製し、クローン増殖し(TA cloning kit、Invitrogen社、Sorrento Valley、CA)、次いで配列決定した(Sequenase 2. 0、USB社、Ocala、FL)。 XS-52細胞からのPolyA+RNA（上記のようにして抽出）をiNOS特異性のプライマー、５’プライマー(iNOS-A)：AGCATCAGAGGGGATGCTGC、及び３’プライマー(iNO S-C)：ATCCTTCGGCCCACTTCCTCでＰＣＲにかけた。これらのプライマーはマウスマクロファージ−iNOSにおいて、３７０ｂｐ、iNOS-A(９９２〜１０１１ヌクレオチド)、及びiNOS-C（１３６２〜１３４３ヌクレオチド）にわたる。これらの反応はGAPDHプライマーと並行して行われて、ＬＰＳの不存在下及び存在下に得られるバンドの強度を標準化した。RT反応の後、反応混合物はiNOS(40サイクル)及びGAPDH(25サイクル)のためにＰＣＲ分割した。GAPDHのためのプライマーはヒト、ニワトリ、及びラットの間の相同な５’プライマー(G APDH-A)：ACTACATGGTTTACATGTTC及び３’プライマー(GAPDH-C)：TTCCCGTTCAGCAC TGGGATGA（それぞれ、ヒトGAPDH CDNAのヌクレオチド183-201 and 740-719に相当）であった。対照として、マウスのncNOS-特異性のプライマーも使用された。免疫蛍光染色 XS-52細胞を８個のウエルを有するチャンバースライド（Nunc Inc.、Napervil le、IL）内で２日間成長させ、冷ＰＢＳで洗浄し、１：１メタノール：アセトンで５分間固定し、ＰＢＳ中０.２％のTriton-X １００溶液で２０分間透過性化し、２％ウマ血清でブロックした。ＰＢＳ中０．２％のＢＳＡ溶液で２回洗浄した後、アンチ-iNOS FITCをウエルに１：１００希釈で添加し、３７℃で１時間培養した。ＰＢＳで各１０分間洗浄した後、スライドをゲルマウント(Biomeda社、Fo ster City、CA)に取り付けた。グリース反応（亜硝酸塩の測定） LPS（1μg/ml）の不存在下及び存在下に、XS-52細胞を２４個のウエルプレートで培養した。３７℃で２４時間温置した後、反応ウエルからの上澄みを分析して亜硝酸塩の存在を検出した。このときグリース反応のSaville修正法を使用した(Green et.al.(1982)Analytical Biochem 126：131-38)。LPS、L-NAME又はIL- 10の存在下又は不存在下に定温培養した細胞からの、細胞のない上澄みの５０μ ｌ分画を、９６個の平底ウェルプレート中で、５０μｌの０．５ＮＨＣｌ中１％スルファニルアミドと、５０μｌの０．０２％ナフチルエチレンジアミンジヒドロクロライドで５分間室温で培養した。吸光率をＥＬＩＳＡプレートリーダーにて５４０ｎｍで測定した。培地上澄み中のＡ逃散塩の定量に対する標準として亜硝酸ナトリウムを使用した。ウエスタンブロットとアンチｉＮＯＳ抗体Ｘ−５２細胞を２４ウエルプレート中でＣＭ−ＣＳＦ無しでＣＭ中にて２日間成長させ、それをＬＰＳ(１μｇ／ｍｌ)、ＬＰＳ＋Ｌ１０(５０μｇ／ｍｌ)、ＬＰＳ＋Ｌ−ＮＡＭＥ(５ｍＭ)、及びＬＰＳ＋Ｄ−ＮＡＭＥ（５ｍＭ）により３７ ℃で２４時間処理した。細胞を血清のない媒体で洗浄し、沸騰するＳＤＳゲル負荷緩衝液（２ｘ：１００ｍＭのTris.Cl[pH6.8]、２００mMのジチトレイトール、４％SDS、０．２％ブロモフェノールブルー、及び２０％グリコール）を添加した。細胞を掻き取って緩衝液に入れ、それをエッペンドルフ管に移し、夾雑物を除くために広げた。上澄みを５分間煮沸し、２０μｌの分画を７％のポリアクリルアミドゲルのうに負荷した。蛋白質を電気ブロッタ（Transblot SD,カナダHer cules,Bio-Rad社）によりゲルからＰＶＤＦ膜(Immobilon,0.4μＭ細孔径、Milli pore社、Bedford,MA)に移した。膜をWash Buffer(WB:10mM Tris[pH7.5],100mMの NaCl,0.1％Tween20)中１％ウシ血清アルブミン(BSA)により４℃で１夜ブロックし、マウスアンチiNOS(1:500)IgGlaモノクローナル（Transduction Laboratorie s社）で定温培養し、WB中１％のBSAにより室温で一時間希釈し、そしてWBで３０分洗浄した。第２の抗体、アンチマウスIgG（１：３０００）ショウガペロキシダーゼ複合体（Bio-Rad社）を、WB中５％の乾燥ミルクで希釈し、撹拌しながら１時間室温で培養した。膜をWBで一時間充分に洗浄し、ECLウスタンブロット検出試薬(Amersham,Arlington Height,IL)で現像し、フィルムに露出した(X-OMA T AR,Eastman Kodak社、Rochstoer,NY)。実施例１：逆トランスクリプターゼＰＣＲＬＣ中のＮＯＳの発現を調べるために、ＲＮＡを新たに精製したネズミＬＣから抽出し、ｉＮＯＳ、ｅｃＮＯＳ、及びｎｃＮＯＳにわたる縮退プライマーによりＲＴ−ＰＣにかけた。約４００ｂｐのバンドが増殖され、未処理細胞に比して処理したＬＰＳ中でより明確であった。ＮＯＳの型を特定するために、ＰＣＲ産生物のヌクレオチド配列を決定したところ、マウスマクロファージのｉＮＯＳに等しいことがわかった。次に、マウスｉＮＯＳに対して特異性のプライマーを使用した。これは、上で得られたメッセージが汚染ケラチン合成細胞その他の細胞から得られる可能性を排除するたである。これらの実験では、ＬＣ系ＸＳ−５２からのＲＮＡを、ＰＣＲにかけ、特異的産生物を増殖した。次の説明に基づき、このバンドはｉＮＯＳであった。先ず、バンドの長さは約３７０ヌクレオチドであった。第２にバンドはＬＰＳに露出された細胞な存在しない。第３にｎｃＮＯＳ特異性のプライマーレーンには産生物が見られなかった。GAPDH標準バンド強度に比較すると、注目しているＲＮＡの転写はＬＰＳ依存性であるように思われる。上に述べたように、弱いバンドはＬＰＳレーンに露出されていない精製ＬＣに見られ、一方、ＸＳ −５２細胞には見られない。実施例２：アンチ-iNOS免疫蛍光検査ＬＰＳ刺激ＸＳ−５２細胞のＦＩＴＣ結合アンチｉＮＯＳモノクローナル抗体の免疫蛍光検査は、ＬＰＳの無い媒体中での培養に比して顕著な染色を示した。染色は核が欠乏する細胞質であり、ある細胞中では粒状に見える。この結果はＬＣがＬＰＳにより誘導できるｉＮＯＳを発現することを示唆している。ＢＡＬＣ／ｃ表皮細胞の懸濁液から精製したＬＣの染色は、抗体の最大限に希釈でもＬＣ分離に使用した磁性微小球が優先的にフルオレセインを吸着するため実行できなかった。実施例３：ＸＳ−５２によるインビトロのＮＯの産生グリース反応を使用してXS-52培養物を分析しＮＯの存在を検出した。ＬＰＳ存在下での培養で得た細胞からの分析では、亜硝酸塩の劇的な増大が見られた。これはＮＯ産生の増大を反映している。これに対してＬＰＳで刺激しなかった細胞はｎｃＮＯを殆ど産生しなかった(図１Ａ)。ｉＮＯＳの誘導とそれに続くＮＯの産生に要する時間を評価するために、ＸＳ−５２細胞を培養し異なった時間の経過毎に分析した。上澄み液を各時点でそれぞれのウエルから得て試験して、サンプリングによる亜硝酸塩の濃度の変動を防止した。８時間後に亜硝酸塩のわずかな増大が見られたが、１６時間後には実質的なレベルが得られた(図１Ｂ)。精製ＬＣ調製物についてもＬＰＳ中での培養後に亜硝酸塩を分析した。高い亜硝酸塩がこれらの細胞に中に見られたが、結果は再現できなかった。亜硝酸塩のレベルはＸＳ−５２細胞ほどには高くなく、おそらくこれらの細胞は精製が困難であり、それらの表面に磁性球が付着しており、数が少ないのであろう。従って、ＬＰＳに対するそれらの応答は最適でないであろう。実施例４：Ｌ−ＮＡＭＥによるＮＯ産生の抑制インビトロのＮＯ産生を確認するために、亜硝酸塩の量をＬＰＳの存在下に測定し、そしてｉＮＯＳの競合的Ｌアルギニンの左旋性及び右旋性メチル化誘導体インヒビターを検出した。これらの２つの物質はＮｗ−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）及びＮｗ−ニトロ−Ｄ−アルギニンメチルエステル（Ｄ−ＮＡＭＥ）が使用された。ＬＰＳの存在下の亜硝酸塩の量はＸＳ−５２細胞によるＮＯ産生の対照量として使用された。L-NAMEはＮＯ産生をＬＰＳの存在下でかなり抑制しているが、D-NAMEはそうではなかった(図２)。これはＸＳ −５２細胞中でのＬＰＳ誘導によるＮＯ産生がＬアルギニンのＬメチル化型により特異的に抑制されうることを確認するものである。実施例５：ＩＬ−１０にＮＯ産生の抑制各種の免疫修正の現象に関与するサイトカインＩＬ−１０はＬＣ抗体提示に影響することが示された。ＩＬ−１０はさらにマクロファージ中のＬＰＳによるＮＯＳ誘導を抑制することが観察された。以前の実験はＮＯＳの作用の抑制のみに向けられていた。一方、ＩＬ−１０はｉＮＯＳの誘導の抑制を行う。ＸＳ−５２細胞はＩＬ−１０及びＬＰＳと共に培養され、上澄み液における再現性の良い亜硝酸産生（１５〜２０％）を示した(図３)。実施例６：ｉＮＯＳ発現に対するＬＰＳ、ＩＬ−１０及びＬ−ＮＡＭＥの効果ウエスタンブロット法を実施して、ＬＰＳの存在下にＩＬ−１０およびＬ−ＮＡＭＥで処理されたｉＮＯＳの量を特徴付けた。Ｌ−ＮＡＭＥ及びＩＬ−１０はいずれも上記のようにＮＯ産生を抑制する。ただし、それらの機構は異なっている。低レベルのｉＮＯＳがＩＬ−１０で処理された細胞中に見られた(図４)。これに対してＬ−ＮＡＭＥはｉＮＯＳの発現に影響しなかった。このように、ＩＬ −１０はＸＳ−２中でのｉＮＯＳの発現を抑制するが、Ｌ−ＮＡＭＥは酵素活性部位に対してＬ−アルギニンと競合する。ネズミの皮膚及びＸＳ−５２細胞から精製したＬＣはｉＮＯＳの量を発現し、ＬＰＳに応答してＮＯ産生を行うことが示された。精製したＬＣから単離されたＲＮＡは先ず縮退プライマーにより検査された。なぜならＬＣがＮＯＳを発現するかどうか又それはｉＮＯＳ、ｅｃＮＯＳまたはｎｃＮＯＳのどの同型なのかが判断できなかったからである。皮膚細胞懸濁液からのＬＣの精製に対する困難は、他の源からの汚染の可能性があるため、ＰＣＲで誤った結果を導く可能性があるからである。従って、一旦電気泳動で期待される寸法を検査して、配列データを確認し、ｉＮＯＳを同定し、より特異的なＰＣＲ反応を使用し、マクロファージに対して見られたように、ｉＮＯＳのｍＲＮＡの存在を確認した(Denis M．(1994)J．Leuk Biol 55:682-84)。ＲＮＡを次にＸＳ−５２細胞から分離することにより汚染の可能性を回避し、そしてｉＮＯＳ特異性のプライマーが特定の生産生物の増殖を示し、これらの細胞中のｉＮＯＳの発現を確認した。この様な発現はマイクロファージの場合のようにＬＰＳ依存性であった。ＬＰＳの不存在下には、ネズミの皮膚から精製したｉＮＯＳの増殖はＸＳ−５２細胞には検出されない弱いバンドを示した。この結果は培養された細胞中では、ＬＰＳはｉＮＯＳ転写を刺激する必要がないことを示す。しかし、環境にさらされた「最近まで生きていた」マウスから単離したＬＣ中では、あるＬＣが生体内で又は単離中に活性化され、ｉＮＯＳの転写を引き起こしたのであり、これが弱いバンドを示した理由であり得る。この結果はＬＣ中でのＮＯの機能的な役割を示している。これらの知見はさらにＬＰＳの不存在下に培養されたＸＳ−５２細胞に見られる殆ど無視できる程度の免疫蛍光強度により確認された。これに対して、この細胞系のＬＰＳ刺激はアンチＮＯＳにより染色される結果を生じ、転写された蛋白質の量の増大を生じたことを示した。染色は強く染色された細胞基質、ある時は顆粒状、ある時は樹状であった。ＬＰＳの不存在下での最低の染色は少量のｉＮＯＳが構造的に存在していること、一方ＬＰＳは染色を劇的に増大することを示している。細胞基質内のｉＮＯＳの正確な位置は分からない。顆粒または小胞内にあるかも知れないし、ＮＯＳ（例えばニトロベシクル）に対して特異的かも知れないしそうでないかも知れないし、遊離蛋白質として見いだされるかも知れない。ｉＮＯＳがこれらの細胞内でＬＰＳ刺激を受けた後に顆粒と細胞基質の間で再配置されるかどうかを検討することは興味深いであろう。図１に示された結果はｉＮＯＳの長時間にわたる誘導を示している。これらのデータは機能的ｉＮＯＳが作られること、それはインビトロでのＮＯの産生ができることを示している。６時間の転写とそれに続く翻訳をさせると、ＬＣが１６時間内にＮＯを産生することにより刺激に応答することができる。単離したＬＣは又ＬＰＳによる一夜の培養の後にＮＯを産生するように誘導される。これらの知見は誘導されたときに、特定のレベルで構造的に発現するｎｃＮＯＳやｅｃＮＯＳとは異なって、ｉＮＯＳは大量のＮＯを産生することができるので、多くの興味ある可能性を提示する。ＮＯの毒性及び腫瘍発生作用はより高い誘導レベルで見られる(Klostergaard J.(1993)Res Immunol 144(4):274-76;Cui et al.(199 4)Cancer Res 56:2462-67;Ohshima et al.(1994)Mutation Res 305:253-64)。ＬＣはｉＮＯＳを発現するので、また表皮中でそれを行う唯一の細胞種であり得るので、少なくともある条件下（例えば内毒素の存在下）では、ＬＣ内で産生されるＮＯは皮膚のＮＯＳの最も豊富な形態であり得る。ＬＣ内でのＮＯ産生がＬ−アルギニンの同族体を使用することにより阻止できる事実は(Moncada et al.(1993)New Eng J Med 329:2002-12)(図２)、皮膚の病理生態学にとって重要な示唆を与える。局所L-AME(１％)はアトピー性の症状を軽減することが示された(Morita et al.(1994)Internat J Dermatol 34:294)。その点に関する作用機構はＬＣのＮＯ産生抑制によるものである。免疫調整体であるＩＬ−１０は、マクロファージと同様に程度は低いが、ＸＳ −５２細胞におけるＮＯ産生を一貫して抑制する。ＩＬ−１０はＢ７（ＭＨＣ− １により発現される共刺激分子）の抑制を介して抗原提示を抑制する(Chang et al.(1995)Eur J Immunol 25:394-398)。ＩＬ−１０に次ぐＮＯ産生の減少はＮＯが部分的にＩＬ−１０の効果に部分的に介在していることを意味している可能性がある。またＩＬ−１０で処理された細胞は、Ｌ−ＮＡＭＥにより処理された細胞とは違って、ｉＮＯＳの量を低下させることを示している(これら両物質はＮＯの産生を抑制するが)。実施例７：メラミン細胞に対する酸化窒素の毒性ＮＯに対するメラニン細胞の感受性を，ＮＯドナー化合物及びランゲルハンス細胞様細胞系により放出されたＮＯを使用して試験した。ニトロプルシドナトリウム(SNP)は水性溶液中でNＯのドナーである。メラニン細胞分解は０．０１−１ｍＭのＳＮＰの存在下に２４時間にわたって観察され、クロムの釈放により定量された。クロムの放出は時間とＳＮＰの量に依存した。より高いＳＮＰ濃度及びより長い時間では、より多い分量のタロムがメラニン細胞から放出された。最大のクロム釈放量は１ｍＭのＳＮＰの添加の後１６時間後に８０〜９０％まで達した。ランゲルハンス細胞（ＬＣ）は誘導性のＮＯＳを発現し、大量のＮＯを生成した。ＬＣは表皮のメラニン細胞に近接して存在するので、ＬＣに産生される大量のＮＯはメラニン細胞の機能と生存に影響し、その結果病理学的な症状を生じることが推定された。メラニン細胞とのＬＣ様細胞系（ＸＳ細胞）の共培養と、それに続くＬＰＳによるｉＮＯＳの誘導とにより、メラニン細胞の死滅が生じた。メラニン細胞はｉＮＯＳを発現しないので、ＬＰＳはＸＳ細胞の不存在下にはＬＰＳにより刺激されたメラニン細胞に対して何の影響も与えない。メラニン細胞の分解は又、培養がＸＳ細胞とメラニン細胞との間の細胞間接触がない状態でTr answells（商品名）を介して行われた時に見られた。このようにして、ＬＣで誘導されるメラニン細胞の死滅はＮＯに一致する拡散因子に依存した。この物質が本当にＮＯであることを確認するために、共培養をＬ−アルギニン欠乏媒体(Ｌ −アルギニンを添加することにより可逆的)中で、またはＮＯ凍結剤（つまり減少したヘモグロビン）の存在下で行った。メラニン細胞毒性は両条件下に著しく減少した。これらの結果はＮＯ依存性の相互作用がＬＣとメラニン細胞とのあだに存在することを示している。従って、ＬＣ及びＮＯドナーからの酸化窒素はメラニン細胞に対する細胞毒である。以上本発明を説明したが、本発明は単なる日常的な実験によりここに記載した方法や物質に対する多くの均等物を確認できることが当業者には明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 17/06 Ａ６１Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者ラーナー，リーザエイチ. アメリカ合衆国 02159 マサチューセッツ，ニュートン，ノブスコットロード４

Claims

【特許請求の範囲】１．皮膚の酸化窒素（ＮＯ）の量を調整する処置剤を被処置動物に投与することによりなる、不所望の表皮又は皮膚疾患を処置する方法。２．疾患は不所望の細胞または不所望の色素沈着であり、処置剤は皮膚のＮＯの量を増大させるもの作用を有する請求項１の方法。３．疾患は皮膚又は表皮細胞の欠失または不足、又は色素沈着の欠失又は不足であり、処置剤は皮膚のＮＯの量を減少する作用を有する請求項１の方法。４．疾患は白斑、炎症後の色素減少、炎症後の色素増大、又は特発性の滴状高メラニン色素沈着(IGH)である請求項１の方法。５．疾患はケラチン合成細胞関連疾患、ケラチン合成細胞の数又は活性の不足により特徴づけられる疾患、不所望のケラチン合成細胞の死滅により特徴づけられる疾患、不所望のケラチン合成細胞のアポプトシスにより特徴づけられる疾患である請求項１の方法。６．疾患は不所望のケラチン合成細胞の増殖である請求項１の方法。７．疾患は炎症皮膚である請求項１の方法。８．疾患は皮膚炎又は朝癬である請求項１の方法。９．疾患は毒性表皮壊死症(TEN)である請求項１の方法。１０．疾患は扁平苔癬である請求項１の方法。１１．疾患は日焼けである請求項１の方法。１２．疾患は対宿主性移植片症(GVHD)である請求項１の方法。１３．処置剤は被処理動物の皮膚におけるＮＯの量を抑制する化合物である請求項１の方法。１４．処置剤はＮＯシンターゼ又はＮＯ捕捉体である請求項１の方法。１５．処置剤は被処置動物の皮膚のＮＯの量を増大させる作用を有する請求項１の方法。１６．処置剤はＮＯドナーである請求項１の方法。１７．毛髪のＮＯを減じる処置剤を被処置動物に投与することにより、毛髪の色素沈着不足を処置する方法。１８．処置剤は頭皮に局部投与するものである請求項１７の方法。１９．処置剤は皮膚のＮＯの量を抑制する物質である請求項１７の方法。２０．被処理動物に皮膚の酸化窒素（ＮＯ）の量を減少する処置剤を投与することを含む、被処置動物を紫外線への露出による日焼け、或いは皮膚の老化による不所望の効果の処置を行う方法。２１．被処理動物に皮膚の酸化窒素（ＮＯ）の量を増大する処置剤を投与することを含む、被処置動物の皮膚の色素沈着を減少する方法。２２．被処理動物に皮膚の酸化窒素（ＮＯ）の量を減少する処置剤を投与することを含む、被処置動物の皮膚の色素沈着を増大する方法。２３．被処理動物に皮膚の酸化窒素（ＮＯ）の量を増大する処置剤を投与することを含む、被処置動物を毛髪の色素沈着を減少する方法。２４．被処理動物に皮膚の酸化窒素（ＮＯ）の量を減少する処置剤を投与することを含む、被処置動物を毛髪の色素沈着を増大する方法。２５．皮膚プロモータに結合した、皮膚内のＮＯの量を増大する遺伝子を有する形質転換動物を用意し、被験物質を前記形質転換動物に投与し、次いで毛髪又は皮膚に対する影響を評価することを評価することを含む前記物質の毛髪又は皮膚に対する評価を行う方法。２６．皮膚プロモータに結合した、皮膚内のＮＯの量を増大させる遺伝子を有する、非ヒト形質転換動物。