JP2001511134A - Treatment of autoimmune diseases using resistance enhancement combined with methotrexate - Google Patents

Treatment of autoimmune diseases using resistance enhancement combined with methotrexate

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Abstract

(57)【要約】 粘膜に投与可能なバイスタンダー抗原と、経口的に、経腸的に又は非経口的に投与可能なメトトレキサートが、製薬製剤を作製するために及び自己免疫疾患を治療するため又は予防するために用いられる。上記バイスタンダー抗原とメトトレキサートの量は、自己免疫疾患と結合した自己免疫応答を抑制するための組み合わせにおいて有効とされる。   (57) [Summary] Bystander antigens that can be administered to the mucosa and methotrexate that can be administered orally, enterally or parenterally are used to make pharmaceutical preparations and to treat or prevent autoimmune diseases Can be The amount of bystander antigen and methotrexate is effective in a combination for suppressing an autoimmune response associated with an autoimmune disease.

Description

【発明の詳細な説明】 メトトレキサートと組合せる耐性化を用いる自己免疫疾患の治療 発明の分野 本発明は、耐性化(tolerization)による自己免疫疾患の治療の分野に関する。 本発明はまた、メトトレキサートの投与による自己免疫疾患の治療の分野にも関 する。 発明の背景 自己免疫疾患は、自己の(自身の)通常の組織に対して向けられた異常な免疫応 答により特徴付けされる。 包含される免疫応答(又は免疫反応)の型に基づき、哺乳動物における自己免疫 疾患は、二つの異なるカテゴリーの一つ：細胞仲介(すなわち、Ｔ細胞仲介)又は 抗体仲介(すなわちβ細胞仲介)疾患、に一般に分類され得る。Ｔ細胞仲介自己免 疫疾患の非制限的な実例は、多発性硬化症(ＭＳ)、慢性関節リウマチ(ＲＡ)、糖 尿病の自己免疫段階(若年開始又はＩ型糖尿病)及び自己免疫性ぶどう膜網膜炎(a utoimmune uveoretinitis)(ＡＵＲ)を含む。抗体仲介自己免疫疾患は、制限さ れること無しに、重症筋無力症(ＭＧ)、自己免疫性甲状腺炎(ＡＴ)、及び全身性 エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含む。 自己免疫疾患の両方のカテゴリーは、非特異的手法で全身的に免疫応答を抑制 する医薬、すなわち異常な免疫応答の選択的抑制化ができない医薬によって目下 のところ治療されている。そのような医薬の一つは、細胞の急速な成長を選択的 に阻害する生物学的応答変更剤、メトトレキサート(methotrexate)である。しか しながら、メトトレキサートは、重大な毒性と他の副作用を有し、且つ治療して いる対象者において「グローバルな」免疫抑制を結局は誘発する。換言すれば、 メトトレキサートの通常のコースによる延長した治療は、病原体に対する通常の 保護的な免疫応答をダウンレギュレートし、それによって感染のリスクが増大す る。加えて、延長したグローバルな免疫抑制に罹った患者は、悪性の、肝、及び 腎不全のような、治療から危険な医療の合併症に進行する増大したリスクを有す る。 自己免疫疾患を治療するため、メトトレキサートは、高い投薬量、例えば７． ５から２５ｍｇを週に一度通常的に投与される。そのような治療は、慢性関節リ ウマチを治療するために慣習的に使用され、且つ多発性硬化症を治療するために 有効に用いられている(Goodkinら、Ann.Neurology.37:30,1995)。経口投与が最 も通例であるとしても、メトトレキサートはまた、その治療のため非経口投与用 にも商業的に利用される。 最近、新規の方法と製薬調製物が、自己免疫疾患(及び同種移植拒絶及びレト ロウイルス関連死亡統計学的疾患のようなＴ細胞仲介炎症性疾患に関係した)を 治療するために有用とされることが見出されている。これらの治療は、自己抗原 耐性剤として、バイスタンダー抗原、又は自己抗原又はバイスタンダー抗原の疾 患抑制フラグメント又は類似物を用いて、経口的に又は粘膜に、例えば吸入によ り耐性を誘発する。そのような治療は、1993年2月25日に提出したPCT特許出願PC T/US93/01705、1991年3月4日に提出したPCT/US91/01466、1990年12月17日に提出 したPCT/US90/07455、1990年7月16日に提出したPCT/US90/03989、1991年10月10 日に提出したPCT/US91/07475、1993年8月17日に提出したPCT/US93/07786、1993 年9月24日に提出したPCT/US93/09113、1991年10月31日に提出したPCT/US91/0814 3、1991年3月29日に提出したPCT/US91/02218、1993年4月20日に提出したPCT/US9 3/03708、1993年4月9日に提出したPCT/US93/03369、及び1991年10月15日に提出 したPCT/US91/07542中に記載される。自己抗原及びバイスタンダー抗原は、以下 に定義される。 自己抗原(及びそれの分子の免疫優性エピトープ領域を含むそれのフラグメン ト)の静脈内投与は、クローナルアネルギーと称されるメカニズムを経て免疫抑 制を誘発することが見出されている。クローナルアネルギーは、特有の抗原に対 するＴ細胞特異性のみの免疫攻撃の不活性化の原因となり、その結果、この抗原 に対する免疫応答を顕著に減じさせる。かくして、一度アネルギー化した、自己 抗原に対するＴ細胞特異性自己免疫応答促進化は、もはやその抗原への応答を増 殖しない。増殖におけるこの減少は、自己免疫疾患の徴候(ＭＳにおいて観測さ れる神経組織の損傷のような)のために応答可能な免疫反応をも減じる。自己抗 原(又は免疫優性フラグメント)の単一投薬量及び「活性抑制」を誘発するそれよ りも十分に大量での経口投与が、アネルギー(又はクローナル削除)を経て耐性を も誘導し得る証拠もある。 治療方法は、活性抑制により起因することも開示されている。活性抑制はクロ ーナルアネルギーのそれからの異なるメカニズムを経て機能化する。ＰＣＴ出願 PCT/US93/01705中に広範に論じられたこの方法は、自己免疫攻撃の下で、組織に 特異的な抗原の経口又は粘膜投与を含む。これらは「バイスタンダー(bystander) 抗原」と称され、且つ以下に定義される。この治療は、消化管結合リンパ組織(Ｇ ＡＬＴ)、又は気管支結合リンパ組織(ＢＡＬＴ)、又は最も一般的な粘膜結合リ ンパ組織(ＭＡＬＴ)(ＭＡＬＴはＧＡＬＴとＢＡＬＴを含む)において誘導される べき調節(抑制)Ｔ細胞をもたらす。これらの調節細胞は、血液又はリンパ組織内 に放出され、次いで自己免疫疾患によってさいなまれた器官または組織に移動し 、且つそのさいなまれた器官又は組織の自己免疫攻撃を抑制する。バイスタンダ ー抗原によって引き出されたＴ細胞(それを引き出すために用いたバイスタンダ ー抗原の少なくとも一つの抗原決定基を認識する)は、それらが例えばトランス フォーミング成長因子ベータ(ＴＧＦ-β)、インターロイキン-４(ＩＬ-４)、及 び／又はインターロイキン-１０(ＩＬ-１０)のようなある種の免疫調節因子及び サイトカインの局部的な放出を仲介する場合には自己免疫攻撃の位置に標的化さ れる。勿論、ＴＧＦ-βは、その攻撃を起こすその抗原に関係なくそれが免疫攻 撃を抑制することにおいて抗原非特異性免疫抑制因子である。（しかしながら、 バイスタンダー抗原による経口又は粘膜耐性化は自己免疫攻撃の近くでＴＧＦ- βの放出のみを生じるために、全身的な免疫抑制を確保しない）ＩＬ-４とＩＬ- １０はまた、抗原非特異性免疫調節サイトカインでもある。ＩＬ-４は特にＴｈ ２応答を増大し、すなわちＴ細胞前駆体の状態で作用し且つＴｈ１応答を犠牲に してＴｈ２細胞内に差別的に分化するそれの原因となる。ＩＬ-４はまた、Ｔｈ １増悪を間接的に阻害する。ＩＬ-１０は、Ｔｈ１応答の直接のインヒビターで ある。バイスタンダー抗原によって自己免疫疾患にさいなまれた哺乳動物を経口 的に耐性化した後、ＴＧＦ-β、ＩＬ-４及びＩＬ-１０の増加したレベルが自己 免疫攻撃の位置で観測される。Chen,Y.ら、Science,265:1237-1240,1994。その バイ スタンダー抑制のメカニズムは、von Herrethら、J.Clin.Invest.,96:1324-1331 ,1996年9月、によって確認されている。 Ｉ型インターフェロン、又はＩ型インターフェロン活性を有するポリペプチド の経口又は非経口投与、自己抗原又はバイスタンダーの経口又は粘膜投与の一方 又は結合のいずれか一方は、自己免疫疾患の徴候の減少化に有益となることが開 示されている。Ｉ型(α又はβ)インターフェロンの最適以下の投与量は、自己抗 原及びバイスタンダー抗原の耐性化効果を高める。この働きは、04/07/95に提出 したＰＣＴ出願PCT/US95/04120中により詳細に記載してある。Ｉ型インターフェ ロン、特にβ-ＩＦＮは、ある種の免疫調節特性、例えばγ-インターフェロン( ＩＦＮ−γ)の活性の阻害などを有することが知られる。ＩＦＮ-γは、ＭＳを悪 化させることが示されており、且つＭＳ損傷の病因中に包含され得る。かくして 、ＩＦＮ-γは、Ｔ細胞によるＩＦＮ-γ発現を阻害するそれの能力の部分のため に有益な効果を有することが明らかである。 04/07/95に提出したPCT/US95/04512は、自己抗原又はバイスタンダー抗原を用 いる経口的な耐性と共同したＴｈ-２増幅化サイトカインの使用を記載する。 これらの出願にない、しかしながらメトトレキサート治療と組合せる耐性化の いずれかのフォームが記載される。また、本発明の前に、細胞***を阻害する、 メトトレキサートが、自己免疫疾患の治療において粘膜の耐性を仲介することに 含まれる細胞を阻害するかどうかは知られていない。 本発明の一の目的は、自己免疫疾患の治療において毒性の劣る量のメトトレキ サートの投与を許すことである。 付加的な目的は、一度で投与される量を減じるためにより頻繁な投与において メトトレキサートの投与を許すことである。 別の目的は、メトトレキサート単独の投与又は経口、又はより一般的には粘膜 の耐性化剤単独の投与のいずれか一方よりもより有効である自己免疫疾患のため の治療を提供することである。 発明の概要 一つの実施態様において、本発明は自己免疫疾患を治療するための方法に関す る。該方法は、バイスタンダー抗原を粘膜に投与することを含む。該方法はまた 、経口、経腸、又は非経口的にメトトレキサートを投与することをも含む。バイ スタンダー抗原とメトトレキサートの量は、自己免疫疾患と結合した自己免疫応 答を抑制するための組み合わせにおける有効量とされる。 別の実施態様において、本発明は、自己免疫疾患を治療するための経口又は経 腸投与用の製薬組み合わせに関する。その組み合わせは、メトトレキサートとバ イスタンダー抗原とを備え、そのバイスタンダー抗原とメトトレキサートの量は 、自己免疫疾患と結合した自己免疫応答を抑制するための組み合わせの有効量と される。 別の実施態様において、本発明は、自己免疫疾患を治療するための方法に関す る。該方法は、自己抗原を粘膜に投与することを含む。該方法はまた、経口、経 腸、又は非経口的にメトトレキサートを投与することをも含む。自己抗原とメト トレキサートの量は、該疾患に結合した自己免疫応答を抑制するための組み合わ せの有効量とされる。 別な実施態様において、本発明は、自己免疫疾患を治療するための経口又は経 腸投与用の製薬組み合わせに関する。その組み合わせはメトトレキサートと自己 抗原を備え、且つ自己抗原とメトトレキサートの量は、その自己免疫疾患と結合 した自己免疫応答を抑制するための組み合わせの有効量とされる。 図面の簡単な説明 図１は、メトトレキサートの最適及び最適以下の投薬量の投与のＥＡＥ臨床ス コアに関する効果を示すグラフである。 図２は、メトトレキサートの最適投薬量又はＭＢＰの１ｍｇ投薬量のいずれか の投与のＥＡＥ臨床スコアに関する効果を示すグラフである。 図３は、メトトレキサートの最適投薬量の投与との比較として、ＭＢＰととも にメトトレキサートの最適投薬量の組み合わせのＥＡＥ臨床スコアに関する効果 を示すグラフである。 図４は、いずれかの単独の投与に比較した４０μｇメトトレキサートの最適以 下の投薬量とＭＢＰの１ｍｇ投薬量との組み合わせの投与のＥＡＥの効果を示す グラフである。 図５は、いずれかの単独の投与に比較した２０μｇメトトレキサートの最適以 下の投薬量とＭＢＰの１ｍｇ投薬量との組み合わせの投与のＥＡＥの効果を示す グラフである。 図６は、経口II型コラーゲンと経口メトトレキサート(中空ダイアモンド)の組 合わせ又は経口タイプIIコラーゲンのみ(中実ボックス)のいずれか一方が投与さ れた、臨床実験の８週で開始時点である慢性関節リウマチ患者で測定した腫脹関 節カウント(swollen joint count)を示すグラフである。 図７は、経口II型コラーゲンと経口メトトレキサート(中空ダイアモンド)の組 合わせ又は経口タイプIIコラーゲンのみ(中実ボックス)のいずれか一方が投与さ れた、臨床実験の８週で開始時点である慢性関節リウマチ患者で測定した圧痛関 節カウント(tender joint count)を示すグラフである。 図８は、II型コラーゲンとメトトレキサートの組合わせ、又はタイプIIコラー ゲンのみのいずれか一方が投与されたそれの累積パウルス(Paulus)２０応答を達 成する患者のパーセントを示す。 発明の詳細な説明 メトトレキサートの経口又は非経口投与と共同しての、バイスタンダー抗原( 又は自己抗原)の経口、又はより一般的に粘膜投与が、それぞれの治療法の効果 に比較して、実質的に増大した自己免疫反応の抑制の結果となることが見出され ている。 一つの実施態様において、本発明は、他に必要とされる(最適値以下の投与量) であろうよりも自己免疫疾患の治療のために投与されるべきメトトレキサート量 を少なくすることを許す。これはメトトレキサートの高い毒性のため、より高い 有効性である。かくして、例えば、メトトレキサートとＭＢＰの組み合わせの投 与の抑制効果は、いずれかの単独の投与の効果よりもより効果的であることが見 出される。 メトトレキサートは、たとえメトトレキサートが細胞***を阻害すること、す なわちそれが耐性化によって自己免疫疾患の治療を仲介する細胞に有害に作用し ないとしても、粘膜耐性化によって治療を予防しないことが見出されている。さ らに、耐性化剤の投与は、メトトレキサートの阻害性効果に干渉しないことが見 出されている。 さらに、メトトレキサート投与に結合した「リバウンド」効果を減少させ得る。 ＥＡＥラットにおいて及びヒトにおいてメトトレキサートの投与は、抑制に続き (投与のコースが完結された後)疾患のリバウンドの結果を生じる。そのようなリ バウンドは、経口、又は粘膜耐性化では観測されない。ＭＢＰとメトトレキサー トは、リバウンド作用を生じない。かくして、メトトレキサート投与は、粘膜耐 性化のこの有益性に干渉しない。 加えて、メトトレキサートと耐性化剤の組み合わせは、投与当たりの低い投薬 量で頻繁に投与され得る。メトトレキサートが自己免疫疾患を治療するための高 い投薬量で週に一度通常的に投与される一方、本発明の組み合わせは、低い投薬 量で週に３回投与した場合、有効とされることが見出されている。上述した通り 、本発明に従いメトトレキサートの総合的に低い投薬量での投与は、毒性を減じ るように作用する。週のインターバルの間でさらに小分割した形態において低い 投薬量の投与は、毒性を減じるようにさらに作用する。 かくして、例えば、もしメトトレキサートが自己免疫疾患を治療するために、 週当たり１０ｍｇの最適投薬量でそれ自身によって通常的に投与されるなら、耐 性化剤の有効量と共同して、週に三回、約３ｍｇの投与量でメトトレキサートを 投与することが、本発明の方法に従い可能となる。代替的に、耐性化剤の有効量 と結合した、最適以下の投薬量、例えば５ｍｇで週に一度、メトトレキサートを 投与することが可能である。代替的に、週に３回、２ｍｇの最適値以下の投薬量 が、耐性化剤の有効量とともに投与され得る。 本発明はメトトレキサートによる自己免疫状態の治療に関する改善として見な し得る一方、経口(又は粘膜)耐性化による自己免疫疾患の治療に関する改善とし てもまた見なし得る。 定義 この開示中で用いる場合、以下の用語は後述するそれらの持つ意味を有する： 「バイスタンダー抗原(bystander antigen)」又は「バイスタンダー」は、タ ンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド、グリコプロテイン、又は、(i) 自己免疫攻撃の下で器官又は組織に特異的な成分又はそれから誘導される；及び (ii)自己免疫破壊に寄与する細胞を攻撃する及びそれによる免疫攻撃を抑制する 下で器官又は組織で放出されるべき少なくとも１の抗原非特異性免疫抑制因子ま たは免疫調節サイトカイン(ＴＧＦ-β、ＩＬ-４又はＩＬ-１０のような)を生じ る調節(抑制)Ｔ細胞(ＣＤ４＋またはＣＤ８＋タイプとされ得る)を引き出す経口 又は経腸投与において、いずれかの他の免疫原性物質(すなわち、免疫応答の引 き出しができる物質)である。該用語は、自己免疫攻撃に含まれる自己抗原とそ れのフラグメントを含むが、しかしそれに限定されない。加えて該用語は自己免 疫組織破壊の結果となる自己免疫攻撃の位置において露出されるようになる免疫 機構に通常的にさらされない抗原を含む。実例は、特有の組織が免疫機構との接 触から通常的に保護されるものに対して特異的でないとしても、熱ショックタン パク質である。 「バイスタンダー抑制(bystander suppression)」は、自己免疫破壊に寄与す る細胞の自己免疫攻撃の位置で抑制される；この抑制は、バイスタンダー抗原の 経口摂取(又は吸入)によって引き出されたサプレッサー細胞からの１又はそれ以 上の免疫抑制因子(Ｔｈ２-増大化サイトカイン及びＴｈ１-阻害化サイトカイン を含む)の放出によって仲介され且つ免疫破壊に寄与する細胞が見出される場合 に該サイトに補充される。その結果は、抗原-非特異的であるが、組織破壊のた めに応答可能な自己免疫応答のダウンレギュレーションが局部的に制限される。 「自己免疫疾患」は、哺乳動物及び／又は自己の物質内の異物的な免疫原性物 質との間を区別するのに失敗した該免疫機構において、ヒトを含む哺乳動物の免 疫機構の自然発生的な又は不調を誘導されるとして、且つ結果としてまるでそれ がそれに対する免疫応答が異物的であり且つマウントされるようなに自己組織と 物質を治療するとしてここに定義される。該用語は、ヒト自己免疫疾患とそれの 動物モデルを含む。 「自己抗原」は、免疫機構による攻撃の最初の(又は第１の)標的となる、自己 免疫疾患における、哺乳動物内に通常的に見出されるいずれかの物質又はそれの 部分である。該用語はまた、哺乳動物に投与される際に、自己免疫疾患の特徴を 有する状態を誘導する抗原物質をも含む。加えて、該用語は、自己抗原の免疫優 性エピトープ又は免疫優性エピトープ領域から本質的になる消化性サブクラスを 含む。自己免疫状態を誘導する免疫優性エピトープ又は領域は、該疾患を誘導す るような全体の自己抗原に代えて使用され得る自己抗原のフラグメントである。 自己免疫疾患に罹ったヒトにおいて、免疫優性エピトープ又は領域は、自己免疫 攻撃の下で組織または器官に特異的な抗原のフラグメントであり且つ自己免疫攻 撃Ｔ細胞の相当なパーセンテージ(例えば絶対多数が必要でないが多数の)によっ て認識される。 「治療(treatment)」は、自己免疫疾患の開始を予防する又は遅らせるための 予防的治療(又は臨床的又は無症状の発現、例えば組織学的なそれの徴候)、同じ く自己免疫攻撃を減衰すること及び自己免疫組織破壊を防止すること又は遅らせ ることによって、自己免疫疾患の徴候の後の症状の抑制又は緩和の治療の両方を 含むことを意図する。自己免疫攻撃又は反応の「緩和」、「抑制」又は「減少」は 、その攻撃又は反応の１又はそれ以上の徴候の部分的な減少又は改良を包含する 。自己免疫反応の「実質的に」増加した抑制効果(又は改良又は減少)は、自己免 疫反応又は疾患の１又はそれ以上のマーカー又は組織学的又は臨床学的指標を有 意に減じることを意味する。非制限的実例は、手足(limb)スコアにおいて又は関 節炎スコアにおいて少なくとも１単位の減少、自己反応性Ｔ細胞の頻度における 有意な減少、及びインスリン炎スコアリング(例えば、Zhangら、PNAS，1991，88 :10252-10256中に記載されたように測定した)における少なくとも約０．５単位 の減少である。 「経口」投与は、経口、経腸又は胃内投与を含む。吸入による投与もまた自己 免疫疾患における耐性化効果を達成する。 「非経口」投与は、皮下、経皮、筋肉内、静脈内、腹腔内又は鞘内投与を含む 。 投与に「結合する」は、同時に又は連続的投与、同じく結合した又は分離した 形態での投与を包含する。 動物モデル 本明細書を通して、参考文献は、自己免疫疾患を実験するために開発されてい る各種のモデル系とする。実験的自己免疫脳脊髄炎(ＥＡＥ)は、多発性硬化症( ＭＳ)用のモデルとしてマウス及び他の齧歯動物種において実験されている。当 業者であれば、ＭＳのための多くの潜在的な免疫治療がこの動物モデル系におい て最初に試験されることを認識する。その疾患は、ミエリン塩基性タンパク質( ＭＢＰ)、ミエリンオリゴオリゴデンドロサイトタンパク質(ＭＯＧ)、又はプロ テオリピドタンパク質(ＰＬＰ)及びアジュバント(完全フロイントアジュバント 、「ＣＦＡ」のような)による免疫化によって誘導される。その疾患の誘導のた めに使用される抗原は、そのモデルにおいて自己抗原である。いずれかの抗原に よるこの治療は、脱ミエリン化疾患の単相又は増悪／弛張性形態のいずれか一方 を誘導する(齧歯動物の型と種及び誘導の周知の詳細に基づく)。誘導された疾患 は、自己免疫疾患ＭＳの多くの特徴を有し且つそれの動物モデルとして奉仕する 。さらに、経口耐性化によるＥＡＥの成功した治療、及びヒトにおける疾患誘導 化細胞の頻度の減少化における相当の成功、及び多くのケースにおいて、ミエリ ンの経口投与を用いる、ＭＳの徴候を改善することは、異なる経口耐性養生の成 功を予測するためのモデル系としてＥＡＥの使用を実証する。 マイコバクテリウム ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis)による又 は感染しやすい哺乳動物の後根の尾内の油でのＣＦＡによる免疫化は、ヒト慢性 関節リウマチのためのモデルとして用いる疾患を誘導する。同様の手法において 、アジュバントと共にII型コラーゲンによる免疫化もまた、ヒト慢性関節リウマ チのためのモデルとして奉仕する疾患(コラーゲン誘導化関節炎又は「ＣＩＡ」) を誘導する。これらの動物モデルはまた、バイスタンダー抗原を用い成功した経 口耐性化の良好なプレディクターとして奉仕する。 Ｓ-抗原又はＩＲＢＰ抗原(インターフォトレセプター結合タンパク質)及びア ジュバントによるルイスラットの免疫化は、自己免疫ぶどう膜網膜炎(uveroreti nitis)を誘導する。最後に、Ｉ型糖尿病用のモデルは、ＮＯＤマウスにおいて自 然発生的に進展する。 上記したモデル系の１又はそれ以上は、本発明により提供される有効性及び改 善された治療を実証するために使用され得る。実際、その動物モデルは、正確に はこの抑制メカニズムが抗原非特異性のために、バイスタンダー抑制を含む治療 を試験するために特に好適である。経口耐性化のケースにおいて、それ故に、該 モデルにおいて得られた徴候の抑制は、ヒトの自己免疫疾患とそれの動物モデル の間に多くの実際の又は潜在的な相違とは関係がない。 上記動物モデルは、かくして本発明の成功した使用を実証するために使用され 得る。例えば、多発性硬化症自己抗原、ウシミエリンは、有意な患者の部分集合 に相当な有益性を与えた二重盲験においてヒトに経口的に投与される(Weiner,H ．ら、Science 259:1321-1324,1993)。加えて、関節圧痛、ＡＭ硬直、握力等の ような慢性関節リウマチの徴候は、経口コラーゲン受容(一日0.1-0.5mgの単一投 薬量)のヒトにおいて首尾良く抑制された。(Trentham,D.ら、Science 261:1727, 1993)最後に、経口Ｓ-抗原による予備のヒトでの試行は、ぶどう膜網膜炎のため に推奨される結果を示した。大規模なヒトの実験は、多発性硬化症、ぶどう膜網 膜炎、慢性関節リウマチ及び糖尿病のためにまもなく実施される。自己免疫疾患 の経口耐性化治療のための動物モデルの予測値は、これらのヒトの臨床的研究に よって支持される。 バイスタンダー抑制の記述 クローナルアネルギーに対して、バイスタンダー抗原の粘膜投与によって仲介 される抑制は、トランスフォーミング増殖因子-ベータ(ＴＧＦ-β)のような１又 はそれ以上の免疫抑制因子；及び／又はインターロイキン４(ＩＬ-４)のような Ｔｈ２-増加サイトカイン；及び／又は自己免疫攻撃の位置でインターロイキン １０(ＩＬ-１０)を放出する標的化可能な免疫調節Ｔ細胞の引き出しによって生 じる。これらの調節Ｔ細胞は、高レベルのＩＬ-２又はγ-ＩＦＮを放出しない。 調節Ｔ細胞が引き出されるために、作動でのメカニズムは活性な抑制として関係 される。引き出された調節性細胞によって放出された免疫調節性サイトカインは 、たとえこれらの調節Ｔ細胞が、粘膜投与された抗原上の一つと同じ抗原決定基 により誘発される場合にのみ免疫調節性サイトカインを放出(又は放出を誘導)す るとしても、抗原非特異性である。器官又は組織の自己免疫破壊に寄与する細胞 が 濃縮される動物の内部の位置への免疫調節Ｔ細胞の補充は、自己免疫攻撃の周囲 での免疫調節性物質の放出を与え、且つそのような攻撃に対応可能な全てのタイ プの免疫機構を抑制する。 Ｔサプレッサー細胞が組織又は器官特異的抗原による粘膜耐性化への応答中で 引き出されているために、Ｔサプレッサー細胞のための標的は、その破壊細胞が 関係した特有な自己免疫疾患における免疫攻撃下の器官又は組織である。かくし て、そのバイスタンダー抗原は、自己抗原又は自己抗原の免疫優性エピトープを 含むペプチドとされ得る。代替的に、バイスタンダー抗原は、自己抗原ではない 別の組織特異性抗原として良く；従って自己抗原(又は複数の自己抗原)は、同定 されることが必要でない治療される特有な疾患に包含される。 より詳細には、組織特異的(バイスタンダー)抗原のためのバイスタンダー抑制 の活性な抑制メカニズムの実例は、次の通りである：組織特異的(バイスタンダ ー)抗原が経口的に(又は経腸的に、すなわち胃内に直接的に)投与された後、腸 管壁の下に配される非常に多数の免疫細胞のコレクションである、パイアー斑と 絨毛、それが接触が起こる場合に小腸管内を通過する。これらの細胞は、順に、 脾臓及びリンパ腺を含む免疫機構に伝えられる。その結果、サプレッサー(ＣＤ ８＋又はＣＤ４＋)Ｔ細胞が血液又はリンパの循環内に誘導され放出され、次い で、哺乳動物自身の組織に対して向けられた活性化したヘルパーＴ細胞同じくＢ 細胞をダウンレギュレートするＴＧＦ-β及び／又は他の免疫調節性物質の放出 をそれらが生じる場合、自己免疫攻撃のエリアに補充される。Chen,Y.ら、Scien ce,1994上掲。この手法で誘導した抑制は、抗原非特異性である。しかしながら 、得られる耐性は、特有の自己免疫疾患のために、すなわちバイスタンダー抗原 が、損害を受けている組織で又はその近傍で見出される免疫攻撃細胞を抑制する バイスタンダー抗原の摂取によって攻撃及び抑制細胞が引き出された下での組織 のために特異的であるという事実によって、自己免疫攻撃下の特有な組織のため に特異的である。 バイスタンダー抗原と自己抗原(同じくそれらのいずれかのフラグメント及び 類似物)は、天然ソース(それらが普通に発生する組織又は器官)から精製され得 るし、且つ当業者において周知の技術を用いて細菌、酵母、昆虫(例えばバキュ ロウイルス)及び哺乳動物細胞中で、組換えＤＮＡ技術を用い得ることもできる 。多くの潜在的及び現実のバイスタンダー抗原のためのアミノ酸配列は、周知で ある：例えば、Hunt,C.ら、PNAS（USA）82:6455-6459,1985(熱ショックタンパク 質ｈｓｐ７０)；Burkthardt,H.ら、Eur.J.Immunol.21:49-54,1991(抗原コラーゲ ンIIエピトープ)；Tuohy,V.K.ら、J.Immunol.142:1523-1527,1989(マウス中のマ ウスＰＬＰの脳炎誘発性決定)；Shinohara,T.ら、In Progress in Retinal Rese arch,Osborne,N & Chader,J.Eds,Pergamon Press 1989,pp.51-55(S-抗原)；Dono so,L.A.ら、J.Immunol.143:79-83,1989(ＩＲＢＰ)；Borst,D.E.ら、J.Biol.Chem .264:115-1123,1989(ＩＲＢＰ)；Yamaki,K.ら、FEBS 234:39-43,1988(Ｓ-抗原) ；Donoso,L.A.ら、Eye Res.7:1087,1988(ＩＲＢＰ)；Wyborski,R.J.ら、Mol.Bra in Res.8:193-198,1990(ＧＡＤ)を参照。 ウシ及びマウスＰＬＰ；ウシ、ヒト、チンパンジー、ラット、マウス、ブタ、 ウサギ、モルモットＭＢＰ；ヒトとウシコラーゲンアルファ-Ｉ(II)とウシコラ ーゲンアルファ-Ｉ(I)；ニワトリコラーゲンII、及びヒトインスリンのためのア ミノ酸配列は、周知であり且つ公表され且つこれらの抗原は当該分野で周知であ るような組換え技術によって合成することができる。これらの抗原のフラグメン トは化学的に合成でき且つ組換え技術によっても合成できる。 幾つかの組織特異性抗原は、商業的に利用可能である：例えばインスリン、グ ルカゴン、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリン、コラーゲンＩ、コラーゲンII 、プロテオリピドタンパク質など。 バイスタンダー抗原は、ルーチン的に同定され得る。さいなまれた組織(affli cted tissue)からのいずれかの抗原は、潜在的にバイスタンダー抗原である。そ の潜在的なバイスタンダー抗原は、哺乳動物、及び同じ抗原によってインビトロ で除去され且つ刺激され得るこれら哺乳動物からの、例えばＥＡＥ又はＭＳのケ ースにおける血液又は脳脊髄液からの脾臓細胞又は循環性Ｔ細胞で培養され得る 。刺激により引き出されたＴ細胞は精製可能であり、且つ上清は、ＴＧＦ-β、 ＩＬ-４、ＩＬ-１０、又は他の免疫調節性物質のそれの含量を試験できる。特に 、ＴＧＦ-βは、好ましくは適当な商業的に利用し得るポリクローナルな又は最 も好ましくはＴＧＦ-βに対して生じたモノクローナルな抗体(例えば、Ｒ＆Ｄ S ystems, Minneapolis,MN；Celtrix Pharmaceuticals,Santa Clara,CA)を用いるＥＬＩＳ Ａによって定量的に及び／又は定性的に測定され得る。Miller,A.ら、J.Immunol .,148:1106,1992。代替的に、ＴＧＦ-β検出用の別な周知のアッセイが、商業的 に利用し得るミンク上皮細胞系を用い、後述の実施例において記載するように、 利用され得る。もしバイスタンダー抗原がＴＧＦ-βを放出しないＴサプレッサ ー細胞を引き出すならば、そのＴ細胞は、ＩＬ-４又はＩＬ-１０の分泌を同様に 試験できる(ＩＬ-４とＩＬ-１０のための抗体は、例えばPharmigen,San Diego,C Aから、商業的に利用され得る)。有効なバイスタンダー抗原でない組織特異性抗 原は、放出した免疫調節性サイトカインが抑制効果を発揮するには炎症の位置か らは遙か遠くに移動されるように炎症位置(自己免疫攻撃の)から分離されるよう なそれらである。 粘膜に誘導したバイスタンダーサプレッサーの有効性は、例えば：自己免疫攻 撃の標的である器官又は組織に対し向けられた多数の活性化Ｔ細胞クローンのよ うな、一定の炎症マーカーの縮小；同じ位置でのＩＬ-２又はＩＦＮ-βレベルの 増加；さいなまれた器官又は組織の組織学的評価(例えば、バイオプシー又は磁 気共鳴イメージングによって)；又は自己免疫疾患に結合した臨床学的徴候の数 及び／又は程度における減少、を評価できる。 耐性化剤の使用-投薬量 本発明のバイスタンダー抗原により誘導した耐性は、経口(又は経腸)又は吸入 可能な投薬量の広い範囲にわたり、投薬量従属性である。しかしながら、有効な 投薬量の最小値と最大値がある。換言すれば、自己免疫疾患の臨床学的及び組織 学的な徴候の活性抑制は、特異的な投薬量の範囲内で起こり、しかしながら、疾 患から疾患、哺乳動物から哺乳動物、及びバイスタンダー抗原からバイスタンダ ー抗原まで変化する。例えば、その疾患がマウスにおけるＰＬＰ-誘導化ＥＡＥ である場合、ＭＢＰがバイスタンダー抗原として用いられる場合、抑制投薬量範 囲は、約０．１から約１ｍｇ／マウス／摂取(例えば一日おきに１０-１４-日ピ リオドにわたり５−７摂取に関して生じる摂取によって)までである。最も好ま しい投薬量は、０．２５ｍｇ／マウス／摂取である。ラットにおけるＭＢＰ誘導 疾患の抑制のため、約０．５から約２ｍｇ／マウス／摂取であり、最も好ましい 投薬量は、１ｍｇ／マウス／摂取である。ＭＢＰが経口耐性化剤として用いられ る場合、ＭＳに罹ったヒトのための有効な投薬量の範囲は、一日当たり約１と約 １００の間、好ましくは約１と約２０ｍｇＭＢＰであり(数ヶ月から数年までの 範囲内の時間のピリオドの間、毎日又は一日おきに投与した)、最適値は一日当 たり約７と１０mgとされる。 慢性関節リウマチのために、Ｉ型コラーゲン又はIII型コラーゲンのいずれか 一方を受容しているヒトのための有効な投薬量の範囲は、一日当たり約０．００ ５と約１ｍｇの間である。好ましい投薬量は、一日当たり約０．００５と約．５ ｍｇの間である。 患者のモニタリングは、投与の投薬量と頻度を最適化するために望ましくなさ れ得る。患者への投与の正確な量と頻度は、段階、患者の疾患の徴候の頻度及び 程度及び患者の生理学的状態に基づいて、同じく当該分野で良く認識されるよう に変更され得る。そのような最適化は、ケースバイケースにおいて好ましくは有 効とされる。免疫抑制に必要な投薬量の最適化は、ルーチンの実験よりも多くな く含まれ、ここに開示したガイドラインを与える。 疾患の程度の評価は、疾患のタイプに基づいて周知の方法に従い達成され得る 。そのような方法は制限されること無しに含む： ＭＳ： 時間のピリオドにわたる攻撃の程度と数；障害の進行累積(例 えば延長障害状態スケール(Expanded Disability Status Scal e)において測定され得る)；脳内の病変の数と広さ(例えば磁気 共鳴イメージングによって明示される)；及び自己反応性Ｔ細 胞の頻度。 ＥＡＥ：次のようにスコアされ得る四肢の麻痺：０-疾患無し；１-増加 した活性、活性のない尾；２-軽度の麻痺、歩行不安定；３-中 度の麻痺、四肢扇形化発現；４-四肢麻痺；及び５-死亡。 ＲＡ： 関節腫脹、関節圧痛、早朝硬直化、握力、関節イメージング技 術 ＡＵＲ：視力；眼中Ｔ細胞数及び眼中の「混濁」。 Ｉ型糖尿病：膵臓Ｔ細胞機能(例えばＯＧＴＴグルコース耐性試験によ って評価した)。 ＮＯＤモデル：インスリン及び糖尿病開始の遅延。 ＣＩＡ：関節炎スコアは４本の足のそれぞれで影響を受けた関節の数及 び次の１−４の任意のスコアに各等級化することに基づく：０ ＝通常；１＝赤みのみ；２＝赤みプラス腫脹；３＝激しい腫脹 及び４＝関節変形。トータルの関節炎スコアは、全ての足のス コアの総計である。最大の関節炎スコアは、該疾患のコースを 越える動物の最も高いスコアである。 この等級化法に従い可能性のある最も高い関節炎スコアは１６ である(４足Ｘ４足毎のスコア)。 コントロール患者又は実験動物は徴候の悪化している条件下での徴候の安定化 は、抑制治療の有効性の一つの指標である。改善の別の測定は、他の医薬、例え ばステロイド又は他の抗炎症薬、及び生物学的応答修正剤を減らす又はやめるこ との能力である。バイスタンダー抗原又は自己抗原の最適投薬量は、上述した通 り評価した最大の有益な効果を生じる一つである。有効な投薬量は、上述した通 りに治療されている疾患の少なくとも一つの特徴のマーカー、徴候又は組織学的 証拠の少なくとも統計学的に又は臨床学的な顕著な証明の根拠となる。（臨床的 に顕著な証明は、特有な自己免疫疾患の分野において熟練した臨床家によって観 測される一つである） メトトレキサート治療と組み合わせる場合、バイスタンダー抗原(又は自己抗 原)の投薬量は、もしバイスタンダー抗原(又は自己抗原)が単独で投与され、自 己免疫反応を減じるのにより有効とされるその組合せを除いて、使用されている であろうそれと等しくされ得る。 メトトレキサートの投薬量は、メトトレキサートが単独で使用されると同じく 高い場合、バイスタンダー抗原又は自己抗原との組合せは、増大した抑制効果を 与えることができる。代替的に、メトトレキサートの最適値以下の投薬量は、メ トトレキサートの毒性作用を少なくするために投与され得る。このケースにおい て、その組合せによって達成される増加した抑制は、例えばメトトレキサートの 最適投薬量により達成されたと同じく高くできる。 バイスタンダー抗原の最適量と同じく有効な投薬量の範囲の確定は、通常の方 法及び本出願の教示を用いて決定される。例えば、哺乳動物とヒトの投薬量は、 相対的に低い投薬量(例えば１ミリグラム)によって開始し、それを増進的に増加 し(例えば対数的)、且つＴＧＦ-ベータ(及び／又はＩＬ-４又はＩＬ-１０)分泌 細胞の数を測定すること及び／又は血液中の免疫攻撃Ｔ細胞の数と活性を評価す ること(例えば、制限化希釈分析及び分化する能力によって)及び／又は上述した 通りの、疾患の重症度の評価によって決定され得る。最適投薬量は、血液中の抑 制サイトカインの最大値及び／又は疾患の徴候における最大の減少を原因を生成 する。有効な投薬量は、治療している疾患の少なくとも一つの徴候の特徴の少な くとも統計学的又は臨床学的な有意の証明の原因となる。 バイスタンダー抗原の最大の有効投薬量は、動物における累進的により高い投 薬量で試験すること、次いでヒトへの推論によって確認され得る。例えば、齧歯 動物のために、上記で与えた投薬量に基づき、ヒトにおけるＭＢＰの最大有効投 薬量は、５０と１００ｍｇ／投与の間に見積もられている。同様に、ヒトのため のコラーゲンII型の最大有効量は、約１ｍｇ／一日で見積もられている。 本発明は、自己免疫疾患リスクで感染しやすい個人での自己免疫疾患の開始を 予防するためにもまた、有効に使用され得る。例えば、Ｉ型糖尿病に進展するリ スクのある患者の同定のための方法は、現存し、且つ信頼でき且つ米国糖尿病協 会(ＡＤＡ)によって実際に支持されている各種のアッセイ機構が、Ｉ型糖尿病に 対する感受性を評価する高い予測値を有して(特に組合せにおいて)開発されてい る(Diabetes Care 13:762-775,1990)。一つの好ましいスクリーニング試験の詳 細は、当業者において利用可能である(Bonifacio,E.ら、The Lancet 335:147-14 9,1990)。 実用的な観点から、自己免疫疾患の開始の防止は、Ｉ型糖尿病において最も重 要である。他の自己免疫疾患(例えば、ＭＳ、ＲＡ、ＡＴ及びＡＵＲ)は、実際の 組織ダメージが起こる前に、組織破壊のより早期の段階で宣せられ；それ故に、 これら疾患の予防的治療は、Ｉ型糖尿病におけると同様に重要ではない。Ｉ型糖 尿病において、膵臓島細胞の実質的に全ての実際の破壊の前に有効な治療によっ て収めることが最良である。島細胞が破壊された後、その治療は島細胞移植と結 合して用いない限り、有効とされ得ない。 自己免疫疾患と、経口又は吸入形態において投与した場合、これらの疾患の治 療において有効な組織-又は器官-特異的を確証した又は潜在的なバイスタンダー 抗原及び自己抗原の非制限的なリストが、後述の表１中に記載される。各個別の 疾患に記した抗原の組合せもまた投与され得る。 バイスタンダー抗原と自己抗原は、吸入によっても投与され得る。吸入される ことが必要なバイスタンダーの量は、経口投与のためにそれらよりも一般的によ り少ない。吸入治療のための有効な量は、上記に提供された同じ方法論を用い評 価され得る。 いずれかの自己免疫疾患のため、関連組織の抽出物、同様に特異的バイスタン ダー抗原又はそれのフラグメントは、粘膜耐性化剤として使用され得る。換言す れば、バイスタンダー抗原は、精製する必要がない。例えば、ＭＳ用に使用され ているミエリン(異なる種から得ることができる)、Ｉ型糖尿病用に使用されてい る膵臓細胞抽出物、同種移植拒絶(これは自己免疫現象ではない)を防止するため に用いられている脾臓抽出物、及び筋炎を治療するために用いられる筋肉抽出物 。しかしながら、１またはそれ以上の個別の抗原又はフラグメントが好適である 。 かくして、本発明に従って、Ｉ型糖尿病を治療する場合、グルカゴンの有効量 (上述した通りに決定した)が、経口的に投与され得る。グルカゴンは、膵臓にお いて特異的に存在する。しかしながら、グルカゴンは、Ｉ型糖尿病のコースにお いて破壊された膵臓ベータ細胞においてそれが発現しないために、自己抗原でな いことが明らかである(グルカゴンは、アルファ細胞、異なる細胞型中に排他的 に見出される)。かくして、グルカゴンは「純粋な」バイスタンダーである：そ れは、いずれかの自己抗原活性を有することが明らかでない。（推定上、膵臓細 胞内環境においてそれの高い局部濃度の結果からして、グルカゴンのバイスタン ダー活性は、アルファ細胞からのそれに分泌による。） インスリンは、Ｉ型糖尿病のためのバイスタンダー活性を有する。たとえ抗イ ンスリン自己抗体がＩ型患者において見出されたとしても、インスリンもまた自 己抗原であるかどうかは目下のところ知られていない。しかしながら、作用のメ カニズムはどんなものでも、経口、経腸又は吸入可能なインスリン製剤は、膵臓 ベータ細胞の自己免疫破壊を防止することによってそれのためにＩ型糖尿病と動 物モデルの抑制において有効とされる。 多発性硬化症とそれに動物モデルのために、ＭＢＰのフラグメントを含む又は 含まない疾患の両方は、ＭＢＰ誘導化疾患のみでなくＰＬＰ誘導化疾患もまたバ イスタンダー活性を有する。ラットにおいて、バイスタンダー抗原の摂取は、マ ウスにおいてＣＤ８+サプレッサーとＣＤ４+調節細胞の両方が生成されるのに対 し、制限されたクラスＩであるＣＤ８+サプレッサー細胞を殆どすべて生成する( その後者は制限されたクラスIIとされるであろうと思う)。Chen,Y.ら、Science, 1994,上掲。 慢性関節リウマチ及びそれの動物モデルのために、Ｉ型、II型及びIII型コラ ーゲンは、粘膜耐性化剤として活性を有する。他のコラーゲンは、類似した活性 とされるように思われる。 ぶどう膜網膜炎とそれの動物モデルのために、Ｓ-抗原とＩＲＢＰ及びそれの フラグメントがバイスタンダー活性を有する。 バイスタンダー抗原のフラグメントもまた利用され得る。有用なフラグメント は、オーバーラッピングペプチド法を用いて同定でき、且つ摂取動物からのＴ細 胞は、ＴＧＦ-β、及び／又はＩＬ-４及び／又はＩＬ-１０の分泌を試験でき、 且つサブタイプにより同定することがさらにできる(ＣＤ８+及び／又はＣＤ４+) 。 粘膜投与したバイスタンダー抗原は、調節Ｔ細胞を引き出し且つそれによって ＴＧＦ-β、及び／又はＩＬ-４及びＩＬ-１０の生産と放出を誘導する。そのよ うなＴ細胞の一つは、ＣＤ４＋サプレッサーＴ細胞としてＥＡＥに対して経口的 に耐性化したマウスにおいて同定されており、且つＣＤ８＋サプレッサーＴ細胞 は、ラットにおいて同定されている。自己抗原、例えばＭＢＰの等しい免疫優性 エピトープは、そのような調節Ｔ細胞を含めることができる。付加的なそのよう なエピトープは、哺乳動物にバイスタンダー抗原を与えること、及び抗原のフラ グメント(及びかくして同定した抑制フラグメント)を認識する哺乳動物Ｔ細胞か ら分離することによって、又は未実験の(摂取無し)動物に対する保護を選択的に 移すことができるバイスタンダー摂取動物からのＴ細胞を同定することによって 、同定することができる。 自己抗原投与は、1993年2月25日に提出したＰＣＴ出願PCT/US93/01705、1991 年3月4日に提出したPCT/US91/01466、1990年12月17日に提出したPCT/US90/07455 、1990年7月16日に提出したPCT/US90/03989、1991年10月10日に提出したPCT/US9 1/07475、1993年8月17日に提出したPCT/US93/07786、1993年9月24日に提出したP CT/US93/09113、1991年10月31日に提出したPCT/US91/08143、1991年3月29日に提 出したPCT/US91/02218、1993年4月20日に提出したPCT/US93/03708、1993年4月9 日に提出したPCT/US93/03369、及び上述した1991年10月15日に提出したPCT/US91 /07542中に記載された通りに 実行される。 加えて、他のサイトカイン及び非サイトカイン相乗剤は、メトトレキサートと 共に経口耐性化の有効性を増加するために治療において結合させ得る。他のサイ トカイン相乗剤(Ｉ型インターフェロン)の経口又は非経口的な使用は、04/07/95 に提出したPCT/US95/04120中に記載されている。Ｔｈ２増加サイトカインの投与 は、04/07/95提出のＰＣＴ出願番号PCT/US95/04512中に記載される。例えば、Ｉ Ｌ-４とＩＬ-１０は、PCT/US95/04512中に記載された手法で投与され得る。本発 明において使用するための非サイトカイン相乗剤の非制限的な実例は、大腸菌と サルモネラ菌の各種サブタイプのようなグラム陰性細菌の広いバラエティーから の細菌リポポリサッカリド(ＬＰＳ、Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO;Difco,De troit,MI;BIOMOL Res.Labs.,Plymouth,PA)、リピドＡ(Sigma Chemical Co.,St.L ouis,MO;ICN Biochemicals,Cleveland,OH;Polysciences,Inc.,Warrington,PA)； Deres,K.ら(Nature,342:561-564,1989)中に開示された通りに得ることができる トリパルミトイル-Ｓ-グリカリルシステイニル-セリル-セリン(P3C55)に共有結 合したペプチドのような免疫調節リポプロテイン又はBraun,V.,Biochem.Biophys .Acta 435:335-337,1976中に開示された通りに得ることができる大腸菌からの「 ブラウンズ」リポプロテイン；及びその相乗効果がSun,J-Bら1994 PNAS(USA)91, 1994年11月により記載されている(自己免疫反応の減少に関してでないが)コレラ 毒β鎖(ＣＴＢ)を含む。リピドＡは、それが完全なＬＰＳ分子よりも毒性が劣る ことから本発明において使用するためにＬＰＳ以上に好適である。本発明におい て使用するためのＬＰＳは、Galanesら(Eur.J.Biochem.9:245,1969)及びSkelly, R.R.ら(Infect.Immun.23:287,1979)の方法を用い、グラム陰性細菌から抽出され 精製することができる。哺乳動物のための非サイトカイン相乗剤の有効な投薬量 範囲は、体重ｋｇ当たり約１５μｇから約１５ｍｇまで、好ましくは体重ｋｇ当 たり３００μｇ−１２ｍｇまでである。哺乳動物のための経口Ｉ型インターフェ ロンの有効投薬量範囲は、認識されている最大有効投薬量でない1,000-150,000 単位である。 耐性化剤とメトトレキサートの両方の投与のための最適な摂取の確定は、ここ に開示した情報と、バイスタンダー抗原、自己抗原及びメトトレキサートの投与 に関する周知の情報に照らして決定される。投薬量のルーチンのバリエーション 、組合せ及び治療の継続は、自己免疫反応の程度が測定され得る環境下で実行さ れる。有用な投薬量と投与パラメーターは、多数の自己反応Ｔ細胞を、又は該疾 患の少なくとも１の臨床学的又は組織学的徴候の出現又は程度を減じることを含 む自己免疫反応の減少を結果として得るそれらである。 耐性化剤は、メトトレキサートの投与の２４時間以内に好ましくは投与される 。より好ましくは、それはメトトレキサートと同時に投与される。最も好ましく は、両者は組み合わされた経口製剤で投与される。 本発明において使用するためのメトトレキサートは、経口又は非経口投薬形態 の両方において通常商業的に利用される。代替的に、メトトレキサートは、さら に後述するようなキャリア及び他の剤を用い、経口又は非経口投薬を通常的に形 成する。 本発明に従う各経口(又は非経口)製剤は、当該分野で周知であるような、製薬 的に許容されるキャリア、希釈剤、フィラー、可溶化剤、または乳化剤、及び塩 を含む不活性成分を含み得る。例えば、錠剤は、当該分野で周知の固体キャリア を用いる通常の方法に従って製剤化され得る。本発明において用いられるカプセ ルは、ゼラチン又はセルロース誘導体のようないずれかの製薬的に許容される材 料から作製され得る。持続放出性経口デリバリーシステム及び／又は経口投与投 薬形態のための腸溶コーティングはまた、1987年11月3日発行の米国特許第4,704 ,295号；1985年12月3日発行の米国特許第4,556,552号；1982年1月5日発行の米国 特許第4,309,404号；及び1982年1月5日発行の米国特許第4,309,406号中に記載さ れるようなそれらも意図される。 固体キャリアの実例は、デンプン、糖、ベントナイト、シリカ、及び他の通例 使用されるキャリアを含む。本発明の製剤において使用され得るキャリアと希釈 剤との更なる非制限的な実例は、塩溶液、シロップ、デキストロース及び水を含 む。 吸入により投与される耐性化剤の実例は、12/17/90提出のPCT/US90/07455中に 提供される。本発明の吸入により投与するための製薬用製剤は、任意の成分とし て、製薬的に許容されるキャリア、希釈剤、可溶化剤及び乳化剤、及び当該分 野において周知とされるタイプの塩を含有させ得る。そのような物質の実例は、 生理学的に緩衝化した塩溶液のような通常の塩溶液、及び水を含む。 本発明のこの相互の実施態様に従う耐性化剤の投与のルートは、エアゾル又は 吸入形態においてである。該抗原は、ドライパウダー粒子として又はキャリアガ ス(例えば空気又はＮ2)中に懸濁した霧化水溶液として投与され得る。好ましい エアゾル製薬製剤は、例えば、約１ｍｇと約３００ｍｇの間の抗原を含有する生 理学的に許容される緩衝化塩溶液を含有し得る。 液体中に溶解又は懸濁されない耐性化抗原の微細な分割された固体粒子の形態 のドライエアゾルもまた、本発明の実施において有用である。該耐性化抗原は、 ダスティングパウダーの形にでき、約１と５ミクロンの間、好ましくは２と３ミ クロンの間の平均粒子サイズを有する微細な分割した粒子を含有する。徴細な分 割した粒子は、当該分野で周知の技法を用い粉砕及びスクリーン濾過によって調 製され得る。その粒子はパウダーの形とされ得る、微細に分割した材料の予め決 定した量の吸入によって投与され得る。 吸入による製薬製剤において使用されるキャリア及び／又は希釈剤の特有の非 制限的な実例は、水と、ｐＨ7.0-8.0リン酸緩衝化塩溶液のような生理学的に許 容される緩衝化溶液を含む。本発明の吸入による製薬製剤又は投薬形態において 使用するための適当なキャリア又は希釈剤の補足の非制限的実例は、1987年4月2 1日発行の米国特許第4,659,696号、1989年9月5日発行の4,863,720号及び1987年1 0月6日発行の4,698,332号中に開示される。 本発明の製薬製剤は、例えば、1986年11月25日発行の米国特許第4,624,251号 、1972年11月21日発行の3,703,173号、1971年2月9日発行の3,561,444号及び1971 年1月13日発行の4,635,627号中に開示されるそれらのようなネブライザーを用い エアゾルスプレーの形で投与され得る。該エアゾル材料は治療すべき対象者によ り吸入される。 Newman,S.P.Aerosols and the Lung中,Clarke,S.W.とDavia,D.eds.pp.197-224 ,Butterworths,London,England,1984中に開示されるような加圧メーター測定投 薬吸入器(ＭＤＩ)及びドライパウダー吸入器のようなエアゾルデリバリーの他の システムが、本発明を実施する場合使用され得る。 ここに開示したタイプのエアゾルデリバリーシステムは、Fisons Corporatio n(Bedford,MA)，Schering Corp.(Kenilworth,NJ)及びAmerican Pharmoseal C o.(Valencia,CA)を含む複数の販売元から利用される。 この明細書中に引用した全ての特許出願、特許及び学術文献は、それの全体に おける参照によりそれにより併合される。矛盾のある場合、本開示の定義及び説 明を含む記述が優先する。 以下の実施例は、本発明の説明であり、それの範囲を制限することを意図しな い。 実施例１：メトトレキサートと耐性化剤の最適投薬量の組合せによるラットにお けるＥＡＥの抑制 後述の実験において以下の材料と方法を用いた。 動物． メスのルイスラットをHarlan-Sprague Dawley Inc.(Indianapolis,IN )から得た。動物は、標準的な実験食と適宜に水とを維持した。動物は、Committ ee on care of Laboratory Animals of the Laboratory Research Council(Pub. #DHEW:NIH,85-23,1985改訂)のガイドラインに従い維持した。 抗原と試薬． モルモットＭＢＰは、Deiblerら(Prep.Biochem.2:139,1972)の 変法により脳組織から精製した。タンパク質含量と純度は、ゲル電気泳動及びア ミノ酸分析によりモニターした。メトトレキサートは、Roxane Lab.Inc.(Columb us,OH)から得た。メトトレキサート錠剤(２．５ｍｇ)は、メトトレキサート／緩 衝液ｍｌの濃度が得られるように緩衝液(Ｈ2Ｏ：ＰＢＳが１：１の比で)と混合 した。 耐性の誘導． 経口耐性のため、ラットは１８ゲージのステンレス鋼製動物摂 取ニードル(Thomas Scientific,Swedesboro，NJ)により胃内挿管によりＰＢＳ( 0.5X)中に溶かしたＭＢＰを摂取させた。動物は、免疫化の前に、７投与又は１ ４投与のいずれか一方のため、月曜日、水曜日、及び金曜日の週３回("ＱＯＤ") 摂取させた。 ＥＡＥの誘導． 実際に誘導した疾患のために、ルイスラットは各エマルジョ ンの５０μｌにより足肉趾において免疫化した。０．１ｍｌのエマルジョンは、 モルモットＭＢＰの２５μｇと完全フロイントアジュバント中マイコバクテリウ ム ツベルクロシスの２００μｇを含有した。 臨床的評価． 動物は、ＥＡＥの証拠のために毎日盲験方式において評価した 。ＥＡＥの臨床的重症度は、次の通りスコア化した：０，疾患無し；１尾の活気 無し；２，後足麻痺；３，抑制できない後足麻痺；４，四肢麻痺；及び５死亡。 「ＭＭＣＳ」は、平均最大臨床スコアに関する。疾患の継続は、各動物の疾患の 開始から完全な回復(又は死亡)までのトータルの日数をカウントすることにより 計測した。 組織学的分析． 臨床スコアは、スコアサンプルのための２-テイルWilcoxon ランク合計試験によって分析し、ｃｈｉスクエア分析はグループ間の発生率の比 較において用い、且つ平均の比較は、ステューデントのｔ-テストを用いて実行 した。ここの実験のために、５匹の動物をグループ当たり用いた。 以下の表は、ラットの各グループへの投与のためのプロトコルをを示す。「Ｑ ＯＤｘ７」は、トータル７投与のため週３回の投与を示す。「ＱＯＤｘ１４」は 、トータル１４投与のため週３回の投与を示す。該プロトコルは、２度実施した (実験＃１と実験＃２)。 この実験においてメトトレキサートの８０μｇは、それ自身、及びＧＰ-ＭＢ Ｐ(モルモットＭＢＰ)の１ｍｇと組み合わせて投与した。週に３回の頻度で投与 したメトトレキサートの８０μｇは、重量を調整した場合、ヒトに投与したメト トレキサートの最適投薬量に相当する。特に、６０Ｋｇ個人のために推奨される 投薬量は、週当たりメトトレキサートの１０ｍｇである。ラット投与のための７ の化学療法国立癌学会転換ファクターを用い、これは週当たり２３８μｇメトト レキサートの２１２．２ｇラットへの投与、又は週当たり３回の８０μｇメトト レキサートに相当する。 抗原１４回の投与を含む実験の結果を以下の表中に示した。これらの結果は、 メトトレキサートと組み合わせて投与した場合、ＭＢＰはメトトレキサートの作 用に干渉しないことを示した。それらはまた、最適な抑制がメトトレキサート単 独の８０μｇを用いて達成されたことをも立証した。 以下の表は、抗原７回の投与で得られた結果を示した。これらの結果は、メト トレキサートとＭＢＰの組合せが、いずれかの化合物それ自身を投与したよりも より大きな抑制を達成したことを示した。該組合せによって達成された抑制は、 いずれかの物質単独によるよりも実質的により一層大きかった。実施例２：メトトレキサートの最適以下の投薬量と耐性化剤の組合せによるラッ トにおけるＥＡＥの抑制 実施例１において記載した手順を、以下に示したプロトコルについて続けた。 ４０μｇ及び２０μｇの最適以下の投薬量を、１４日の期間にわたり、ＭＢＰの １ｍｇとの組合せにおいて投与した。８０μｇの最適投薬量もまた投与した。この実験で得られた結果を以下の表中に示した。 図１−５は、完全フロイントアジュバント中のＭＢＰにより免疫化した２０日 後のこの実験からの臨床データを示す。 図１は、メトトレキサート単独の投与の結果を示す。メトトレキサートの最適 投薬量(８０μｇ)と最適以下の投薬量(４０μｇと２０μｇ)によるＥＡＥの抑制 は、投薬従属応答に従うと見ることができる。そのグラフは、１８日目で抑制の 最も高い度合に続いて、疾患の臨床徴候が再び現れる、メトトレキサート投与に 結合したリバウンド効果を示す。 図２は、ＭＢＰの最適投薬量と比較してメトトレキサートの最適投薬量の投与 の臨床スコアについての影響を示す。リバウンド効果は、メトトレキサートを投 与したラットについては２０日で見られたが、ＭＢＰを投与したラットでは無い 。 図３は、メトトレキサートの最適投薬量とＭＢＰの最適投薬量の組合せとの比 較として、メトトレキサートの最適投薬量の投与の臨床スコアについての効果を 示す。メトトレキサートの最適投薬量へのＭＢＰの添加は、メトトレキサートの 効果に干渉しない。２０日でのリバウンドを削除するＭＢＰの効果にメトトレキ サートが干渉することもない。かくして、ＭＢＰとメトトレキサートの一様な最 適投薬量の組合せの投与で得られた効果は、いずれかの剤のそれ自身による投与 から見られるものに対して優るものである。 図４は、２つの組合せの投与との比較としてＭＢＰ単独とメトトレキサート単 独の４０μｇの最適以下の投与量の投与の結果を示す。その組合せは、いずれか の単独で達成されるよりもより一層大きな抑制が達成され、且つメトトレキサー ト単独で見られるリバウンド効果が回避される。抑制の度合は、メトトレキサー ト単独の最適値投与で観測されたのと本質的に同じである。 図５は、２つの組合せの投与との比較としてＭＢＰ単独とメトトレキサート単 独の２０μｇの最適以下の投与量の投与の結果を示す。その組合せは、いずれか の単独で達成されるよりもより一層大きな抑制が達成される。抑制の度合は、メ トトレキサート単独の最適投与で観測されたのと類似している。 かくして、本発明に従い、メトトレキサートの最適値よりもより低い投薬量を 、ＭＢＰとの組合せることの結果として投与することができ、抑制効果はメトト レキサート単独の最適投薬量のそれに類似したそれが達成される。加えて、その 組 合せは、メトトレキサート単独投与と結合したリバウンド効果を取り去る。 実施例３：メトトレキサートと耐性化剤の組合せによるコラーゲン誘導関節炎の 抑制 ＤＢＡ／Ｊ１マウスは、II型コラーゲン(０．２５ｍｌ中３００μｇ)、メトト レキサート(０．２５ｍｌ中１０μｇ)、その二つの組合せによって、又は０．１ Ｎ酢酸(０．２５ｍｌ)のコントロール溶液によって連続５日間、一日一度経口的 に投薬した。そのII型コラーゲンは、ニワトリ胸骨II型コラーゲン(1.2mg/ml)(S igma chemical Co.,St.Louis,MO)とした。メトトレキサートは、２．５ｍｇ錠剤 として得た(Roxane Lab.Inc.)。その錠剤は、２．５mg/ml溶液を形成するため、 ０．１規定酢酸と混合した。投与したメトトレキサートの量は、マウス用の１２ の変換ファクター(Chemotherapy National Cancer Institute)を用い、且つマウ ス当たり２６ｇの平均重量に基づいて、１０ｍｇ／週の６０Ｋｇヒトに対する最 適投薬量に基づいて決定した。 最終経口投与の３日後、各動物は、II型コラーゲンの１００μｇとマイコバク テリウム ブチリクムの１００μｇを含むエマルジョンの０．１ｍｌによって、 それの毛を剃った背に皮内注射した。３週後、全てのマウスを０．１Ｎ酢酸中の II型コラーゲンの１００μｇの腹腔内注射によってブーストした。動物は、６０ 日間、関節炎の開始についてモニターした。開始日＋１０、動物は０から４のス コアについて関節炎の徴候についてスコア付けした。各動物の関節炎スコアは、 ４本の足のそれぞれのスコアの合計とした。 結果は以下の表６中に示した。 ＤＢＡ／１オスマウスにおけるコラーゲン誘導関節炎は、慢性関節炎リウマチ よりも遙かに臨床的により激しく、ヒトにおけるメトトレキサートの１０ｍｇ投 薬量に基づいて計算したとしても、マウス中メトトレキサートの１０μｇは、コ ラーゲン誘導関節炎を抑制するために十分に高い投薬量でないことは明白である 。実際に、その疾患の重症度は、コントロール緩衝液が投与された場合よりも悪 かった。これは、メトトレキサートの投与を免疫化の前に停止したことから、リ バウンド効果の結果とされ得る。これらの結果は、しかしながらコラーゲン誘導 関節炎が、いずれかの材料単独を投与する場合よりも、II型コラーゲンとメトト レキサートとを組み合わせた場合に実質的により大きいレベルにまで抑制された ことを示した。 実施例４：ＴＧＦ-β誘導のためのアッセイ 血清フリー培養上清中のＴＧＦ-βの測定。 血清フリー培養上清は、試験動物からの細胞から捕集した。例えば、Kemri,ら 、J.Exp.Med.163:1037-1050,1986；及びWahl,ら、J.Immunol.145:2514-2419,199 0を参照。概略的には、モジュレーター細胞は、増殖培地中の抗原(５０μｌ／ｍ ｌ)と共に８時間最初に培養される。その後で細胞は、３回洗浄し、血清フリー 培地中に再懸濁して残りの７２時間培養し、上清を捕集し、分析するまで凍結し た。ＴＧＦ-β含量及び上清中イソ型の測定は、Danielpourら(Danielpour,D.ら 、J.Cell.Physiol.138:79-86,1989)に従い、ミンク肺上皮細胞系(American Type Culture Collection,Bethesda,MD ＃CCL-64)を用いて実行し、且つ予め記載さ れたようなサンドウイッチ酵素結合免疫ソルベントアッセイ(ＳＥＬＩＳＡ)アッ セイによって確認した。活性ＴＧＦ-βのパーセントは、サンプルの酸活性化前 を除きアッセイにより測定した。 このアッセイは、バイスタンダー抑制のインデューサーとして使用するための 候補であるいずれかの抗原を試験するために適応させ得る。それらの抗原、抗原 フラグメント及び／又はこのアッセイによって測定したようなＴＧＦ-βの最も 高い濃度を誘導する抗原の量は、本発明の治療方法において使用するために適当 とされる。代替的に、後述したトランスウェル培養システムは、誘発されている ＴＧＦ-βのレベルを示すために使用され得る。この培養システムは、細胞増殖 の抑制の機能としてＴＧＦ-βの作製を意味する。 抗原刺激化細胞の培養上清中のＩＬ-４及び／又はＩＬ-１０の出現は、その抗 原がバイスタンダー抑制のインデューサーとして使用するために好適である指標 としても奉仕させ得る。 ＩＬ-４、ＩＬ-１０(及びＴＧＦ-β)は、Chen,Y.ら、Schience,1994,上掲中に 記載した通りの各ポリペプチドに商業的に利用可能な抗体を用いるＥＬＩＳＡに よって分析され得る。 トランスウェル培養． 直径が２４．５ｍｍで且つ０．４μｍのポアサイズを 持つ、半透膜ポリカーボネート膜によって分離された２つの区画からなる２重チ ャンバートランスウェル培養システム(Costar,Cambridge,MA)が用いられる。そ の２つのチャンバーは、１ｍｍ間隔とされ、直接細胞対細胞の接触なしに非常に 近接した共インキュベートされるべき細胞を与える。トランスウェル培養におい て増殖応答のインビトロ抑制を測定するため、例えば、予め記載された通り(Ben -Nun,A.ら、Eur.J.Immunol.11:195,1981)生起させ且つ維持した、５ｘ１０4抗原 特異的系細胞が、下方のウェル中で増殖培地の６００μｌ中、１０6の照射した( 2,500rad)胸腺細胞と共に培養される。経口耐性化した動物(例えばラット)又は コントロール(ＢＳＡ摂取)からの脾臓細胞が、上方のウェルに加えられる(２０ ０μｌ中、５ｘ１０5細胞)。脾臓は、最終の摂取後７−１４日で取り出され、単 細胞懸濁液が、ステンレス鋼メッシュを通して該脾臓をプレスすることによって 調製される。その抗原(５０ｍｇ／ｍｌ)は、２０μｌの容量で加えられる。モジ ュレーター細胞が半透膜によってレスポンダー細胞から分離されるため、それら は照射を要求されない。幾つかの実験において、インディケーター細胞は、レス ポンダー細胞と一緒に下方のウェル中に添加され、且つこれらの場合においてモ ジュレーター細胞は培養に配される直前に照射(1,250rad)される。増殖培地は、 ２ｘ１０5Ｍ ２-メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０(Gibco Labo ratories,Grand Island,NY)、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン及び ストレプトマイシン、１％グルタミン、１％ＨＥＰＥＳ緩衝液、１％非必須アミ ノ酸、及び１％自己血清からなる。各トランスウェルは、４重で実施される。 そのトランスウェルは、湿った６％ＣＯ2と９４％空気雰囲気中、３７℃で７２ 時間インキュベートされる。培養の５４時間後、それぞれの下方のウェルは、[3 Ｈ]チミジンの４μＣｉによりパルスされ、７２時間で破砕し、ファイバーグラ スフィルター上に収穫するため丸底９６ウェルプレート(Costar)中の３つのウェ ルに再シード化し、標準的な液体シンチレーション技術を用いてカウントする。 抑制パーセント＝１００ｘ(１−Δｃｐｍモジュレーターと培養したレスポンダ ー／レスポンダーのΔｃｐｍ)。 実施例５： 慢性関節リウマチの治療 慢性関節リウマチにかかった患者は、メトトレキサート治療の突然の使用中止 の後の偽薬の投与と共に経口II型コラーゲンの投与と比較するために定義した臨 床実験の一部として、経口II型コラーゲン単独、又は経口II型コラーゲンと経口 メトトレキサートの組合せのいずれか一方を投与した。 この実験における患者は、週当たり２０ｍｇの最大投薬量においてメトトレキ サートを全てが予め受けており、全てが機能クラスＩ、II及びIIIで型分けされ る重症の慢性関節リウマチに罹っている。機能クラスIV中に分類した患者のみは 除外した。機能クラスIVは、日常のセルフケア、職業及び副業上の活動を実行す るためのそれの能力において制限される患者を含む。全ての患者は、少なくとも ６の圧痛のある関節、及び少なくとも３の腫脹関節を示した。持続性ステロイド 、ＮＳＡＩＤＳ(非ステロイド抗炎症剤、及びある種の鎮痛薬がそれらの使用を 欲するそれらに投与した)。 ２０３名の患者が該実験において登録した。実験の開始の直前に、メトトレキ サート使用を完全に停止した。全ての患者は、その日の最初の食事の前に、オレ ンジジュース中のII型コラーゲンの２０μｇ／日を経口的に投与した。 そのようなII型コラーゲンの調製方法は、ＷＯ 97/25435中に記載される。こ の実験において用いたII型コラーゲンは、テロペプチドを取り除くため、酢酸中 で通常的にペプシン処理されている。II型コラーゲンの２０μｇを含む組成物、 そのような投薬量の投与方法、及びそのような投与の有益な結果は、ＷＯ 97/02 837中に記載される。 ２４週で終えた実験の間、患者は、圧痛関節カウント及び腫脹関節カウントを 含む幾つかの測定によって評価した。累積パウルス２０応答は、慢性関節リウマ チにおける改善の周知の尺度であり、効果を評価するために用いた。Paulusら、 Arthritis and Rheum.1990;33:477-484。 この実験の８週で、徴候が発赤した(「スパイクした」)それらの患者は、７． ５と１０ｍｇ／週の間の投薬量において商業的に利用可能なメトトレキサートに よる経口治療を再開した。該実験を完結したトータル１０１名の患者の比較は、 II型コラーゲンとメトトレキサートを組み合わせ投与した４７名の患者と、II型 コラーゲンのみを投与した５４名の患者の間の応答を形成した。 その結果を図６-８中に示した。図６は、該実験の期間に測定した腫脹関節カ ウントを示す。８週で悪化した徴候を持つ患者のグループは、その時点で増加し た腫脹関節カウントを示した。II型コラーゲン治療と結合したメトトレキサート 治療を受けた後、患者のこのグループは、多数の腫脹関節の減少を示し、且つ組 合せ治療の８週後(図６中の１６週マークに相当する)、II型コラーゲンのみを受 けた患者よりも(それのベースライン数)腫脹関節のより大きな減少を示した。そ の結果は、類似したパターンを示す圧痛関節カウントに関して図７中に示した。 図８中に示した累積パウルス２０応答を達成する患者のパーセントは、経口II 型コラーゲンのみを受けたそれらよりも、組合せ治療を受けた患者でより高かっ た。共経口(colloral)メトトレキサート組合せを受けた患者のパウルス応答は、 メトトレキサートが８週でII型コラーゲンと組み合わされた時点から算出した。 かくして、経口のII型コラーゲンとメトトレキサートの組合せの使用は、経口II 型コラーゲン単独の使用と比較して疾患の抑制を増す結果が得られた。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION        Treatment of autoimmune diseases using resistance enhancement combined with methotrexate Field of the invention   The present invention relates to the field of treatment of autoimmune diseases by tolerization. The invention also relates to the field of treatment of autoimmune diseases by administration of methotrexate. I do. Background of the Invention   Autoimmune diseases are abnormal immune responses directed against one's own (own) normal tissue. Answer.   Autoimmunity in mammals based on the type of immune response (or immune response) involved Disease can be in one of two distinct categories: cell-mediated (ie, T-cell mediated) or Antibody-mediated (ie, β-cell mediated) diseases can be generally classified. T cell-mediated self-immunity Non-limiting examples of epidemics include multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis (RA), The autoimmune stage of urine disease (early onset or type I diabetes) and autoimmune uveitis retinopathy (a utoimmune uveoretinitis) (AUR). Antibody-mediated autoimmune diseases are limited Without any treatment, myasthenia gravis (MG), autoimmune thyroiditis (AT), and systemic Includes lupus erythematosus (SLE).   Both categories of autoimmune diseases suppress the immune response systemically in a non-specific manner Drugs that do not selectively suppress abnormal immune responses It has been treated. One such drug is selective for rapid cell growth Is a biological response modifier, methotrexate. Only However, methotrexate has significant toxicity and other side effects, and Eventually elicit "global" immunosuppression in certain subjects. In other words, Prolonged treatment with a normal course of methotrexate is a Down-regulates a protective immune response, thereby increasing the risk of infection You. In addition, patients with prolonged global immunosuppression may have malignant, hepatic, and Have an increased risk of progressing from treatment to dangerous medical complications, such as renal failure You.   To treat autoimmune diseases, methotrexate is used in high dosages, eg, 7. 5 to 25 mg is usually administered once a week. Such treatments are Used conventionally to treat equine, and to treat multiple sclerosis Effectively used (Goodkin et al., Ann. Neurology. 37:30, 1995). Oral administration is best Methotrexate is also used for parenteral administration for its treatment, even if it is customary. Also used commercially.   Recently, new methods and pharmaceutical preparations have been used for autoimmune diseases (and allograft rejection and Related to T cell-mediated inflammatory diseases such as It has been found to be useful for treating. These treatments are self-antigen Bystander antigens, or autoantigen or bystander antigen Orally or mucosally, for example by inhalation, using a suppression fragment or analog. Induces resistance. Such treatment is available in PCT Patent Application PC filed February 25, 1993. T / US93 / 01705, PCT / US91 / 01466 filed March 4, 1991, filed December 17, 1990 PCT / US90 / 07455, PCT / US90 / 03989 filed July 16, 1990, October 10, 1991 PCT / US91 / 07475, filed on August 17, PCT / US93 / 07786, 1993 filed on August 17, 1993 PCT / US93 / 09113 filed on September 24, 1991, PCT / US91 / 0814 filed on October 31, 1991 3, PCT / US91 / 02218 filed on March 29, 1991, PCT / US9 filed on April 20, 1993 3/03708, PCT / US93 / 03369 filed on April 9, 1993, and filed on October 15, 1991 PCT / US91 / 07542. Autoantigens and bystander antigens are: Is defined as   The autoantigen (and its fragment containing the immunodominant epitope region of its molecule) Intravenous administration of g) immunosuppresses via a mechanism called clonal anergy. Has been found to induce control. Clonal anergy is a unique antigen T cells only cause inactivation of the immune attack and consequently this antigen Significantly reduces the immune response to Thus, once anergic, self Enhancing the T cell-specific autoimmune response to an antigen no longer increases the response to that antigen Does not breed. This decrease in proliferation is a sign of autoimmune disease (observed in MS). (Such as damage to nerve tissue). Self-resistance A single dose of the original (or immunodominant fragment) and one that induces "activity suppression" Oral administration in a sufficiently large dose may result in tolerance through anergy (or clonal deletion). There is also evidence that can be induced.   It is also disclosed that the method of treatment results from activity suppression. Activity suppression is black It functions through a different mechanism from that of the internal anergy. PCT application This method, discussed extensively in PCT / US93 / 01705, has been used to treat tissues under autoimmune attacks. Includes oral or mucosal administration of specific antigens. These are `` bystanders '' Antigen "and is defined below. This treatment involves gastrointestinal connective lymphoid tissue (G ALT), or bronchial connective lymphoid tissue (BALT), or the most common mucosal Is induced in damper tissues (MALT) (MALT includes GALT and BALT) Resulting in regulatory (suppressed) T cells. These regulatory cells are located in blood or lymph And then migrate to the organs or tissues affected by the autoimmune disease And suppresses the autoimmune attack of the organ or tissue involved. Bystander -T cells extracted by the antigen (bystander used to extract it) (Recognizing at least one antigenic determinant of an antigen) Forming growth factor beta (TGF-β), interleukin-4 (IL-4), Certain immunomodulators such as and / or interleukin-10 (IL-10); Targeted at the location of autoimmune attack when mediating local release of cytokines It is. Of course, TGF-β is immune immune irrespective of its antigen causing the attack. It is an antigen non-specific immunosuppressive factor in suppressing strike. (However, Oral or mucosal tolerance by bystander antigens is associated with TGF- Do not ensure systemic immunosuppression because only release of β occurs) IL-4 and IL- 10 is also an antigen non-specific immunoregulatory cytokine. IL-4 is especially Th 2 increase the response, ie, act in the state of a T cell precursor and sacrificing the Th1 response And differentiate it into Th2 cells. IL-4 is also Th 1 Indirectly inhibits exacerbations. IL-10 is a direct inhibitor of Th1 response is there. Oral administration of mammals affected by autoimmune disease by bystander antigen After becoming chemically resistant, increased levels of TGF-β, IL-4 and IL-10 Observed at the location of the immune attack. Chen, Y. Et al., Science, 265: 1237-1240, 1994. That by The mechanism of stander suppression is described in von Herreth et al., J. Clin. Invest. , 96: 1324-1331 , September 1996.   Type I interferon or polypeptide having type I interferon activity Oral or parenteral administration, oral or mucosal administration of self antigen or bystander Or binding can be beneficial in reducing the symptoms of an autoimmune disease. It is shown. Sub-optimal doses of type I (α or β) interferon may be Enhances the effect of making the original and bystander antigens resistant. This work was submitted on 04/07/95 PCT application PCT / US95 / 04120. I-type interface Ron, especially β-IFN, has certain immunomodulatory properties, such as γ-interferon ( It is known to have an inhibition of IFN-γ) activity and the like. IFN-γ harms MS And may be involved in the pathogenesis of MS damage. Thus , IFN-γ is part of its ability to inhibit IFN-γ expression by T cells It is clear that this has a beneficial effect.   PCT / US95 / 04512 filed on 04/07/95 uses autoantigen or bystander antigen The use of Th-2 amplifying cytokines in conjunction with oral tolerance is described.   Not in these applications, however, the development of resistance in combination with methotrexate treatment Either form is described. Also, prior to the present invention, inhibit cell division, Methotrexate mediates mucosal resistance in the treatment of autoimmune diseases It is not known whether it inhibits the cells involved.   One object of the present invention is to provide a less toxic amount of methotrex in the treatment of autoimmune diseases. To allow administration of the salt.   An additional purpose is to use more frequent dosing to reduce To allow the administration of methotrexate.   Another purpose is to administer methotrexate alone or orally, or more commonly mucosal For autoimmune diseases that are more effective than either one of the tolerizing agents alone Is to provide treatment. Summary of the Invention   In one embodiment, the invention relates to a method for treating an autoimmune disease. You. The method includes administering a bystander antigen to the mucosa. The method may also include Also includes administering methotrexate parenterally, orally, enterally, or parenterally. by The amount of the standard antigen and methotrexate is dependent on the autoimmune response associated with the autoimmune disease. It is the effective amount in the combination for suppressing the answer.   In another embodiment, the invention is directed to an oral or transdermal treatment for treating an autoimmune disease. It relates to a pharmaceutical combination for enteral administration. The combination is methotrexate and ba And an amount of the bystander antigen and methotrexate An effective amount of a combination to suppress an autoimmune response combined with an autoimmune disease Is done.   In another embodiment, the invention is directed to a method for treating an autoimmune disease. You. The method comprises administering a self-antigen to the mucosa. The method may also be oral, transdermal, It also includes the administration of methotrexate enterally or parenterally. Self-antigen and met The amount of trexate is a combination to suppress the autoimmune response associated with the disease. It is considered to be an effective amount.   In another embodiment, the invention is directed to an oral or transdermal system for treating an autoimmune disease. It relates to a pharmaceutical combination for enteral administration. The combination is methotrexate and self With antigen and the amount of autoantigen and methotrexate binds to the autoimmune disease The effective amount of the combination for suppressing the established autoimmune response. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 shows an EAE clinical study of the administration of optimal and suboptimal dosages of methotrexate. 5 is a graph showing an effect on a core.   FIG. 2 shows either the optimal dosage of methotrexate or the 1 mg dosage of MBP. 4 is a graph showing the effect of the administration of E on the EAE clinical score.   FIG. 3 shows a comparison with the administration of MBP as a comparison with the administration of the optimal dosage of methotrexate. Of optimal dosage combination of methotrexate on EAE clinical score in rats FIG.   FIG. 4 shows the suboptimal 40 μg methotrexate compared to either single administration. Figure 9 shows the EAE effect of administration of the combination of the lower dosage and the 1 mg dosage of MBP It is a graph.   FIG. 5 shows that sub-optimal 20 μg methotrexate compared to either single administration. Figure 9 shows the EAE effect of administration of the combination of the lower dosage and the 1 mg dosage of MBP It is a graph.   FIG. 6 shows the combination of oral type II collagen and oral methotrexate (hollow diamond). Either combined or oral type II collagen alone (solid box) Swelling measured in patients with rheumatoid arthritis, starting at 8 weeks of clinical trials It is a graph which shows a joint count (swollen joint count).   FIG. 7 shows the combination of oral type II collagen and oral methotrexate (hollow diamond). Either combined or oral type II collagen alone (solid box) Tenderness measured in patients with rheumatoid arthritis, starting at 8 weeks of clinical trials It is a graph which shows a joint count (tender joint count).   FIG. 8 shows the combination of type II collagen and methotrexate, or type II collagen. Gen-only one of the doses achieved its cumulative Paulus 20 response Indicate the percentage of patients who will develop. Detailed description of the invention   Bystander antigen (in conjunction with oral or parenteral administration of methotrexate) Orally, or more commonly, mucosal administration, the effect of each treatment Was found to result in a substantially increased suppression of the autoimmune response as compared to ing.   In one embodiment, the present invention provides that another is required (suboptimal dosage). Methotrexate should be administered for the treatment of autoimmune diseases than would be Allow less. This is higher due to the high toxicity of methotrexate Effectiveness. Thus, for example, the injection of a combination of methotrexate and MBP The inhibitory effect was found to be more effective than the effect of either treatment alone. Will be issued.   Methotrexate can be used even if methotrexate inhibits cell division. That is, it has a detrimental effect on the cells that mediate the treatment of autoimmune diseases by making them resistant. If not, it has been found that mucosal resistance does not prevent treatment. Sa Furthermore, it was found that administration of a tolerizing agent did not interfere with the inhibitory effects of methotrexate. Has been issued.   In addition, the "rebound" effect associated with methotrexate administration may be reduced. Administration of methotrexate in EAE rats and in humans follows suppression This results in disease rebound (after the course of administration is completed). Such a re No bouncing is observed with oral or mucosal tolerance. MBP and methotrexer Does not cause a rebound effect. Thus, administration of methotrexate is Does not interfere with this benefit of sexing.   In addition, the combination of methotrexate and a tolerizing agent may result in lower dosing per dose. It can be administered in frequent amounts. Methotrexate is high for treating autoimmune diseases While usually administered once a week at a low dosage, the combination of the present invention provides It has been found to be effective when administered in an amount three times a week. As mentioned above Administration of methotrexate at an overall lower dosage according to the present invention reduces toxicity Acts as follows. Low in subdivided form during weekly intervals The administration of the dosage acts further to reduce toxicity.   Thus, for example, if methotrexate is to treat an autoimmune disease, If normally administered by itself at an optimal dosage of 10 mg per week, Methotrexate at a dose of about 3 mg three times a week in conjunction with an effective amount of Administering is enabled according to the method of the present invention. Alternatively, an effective amount of a tolerizing agent Once a week at a suboptimal dosage, eg, 5 mg, combined with It is possible to administer. Alternatively, sub-optimal dosage of 2 mg three times a week Can be administered with an effective amount of a tolerizing agent.   The present invention is viewed as an improvement for the treatment of autoimmune conditions with methotrexate. On the other hand, improvements in the treatment of autoimmune diseases through oral (or mucosal) resistance Can also be considered. Definition   As used in this disclosure, the following terms have their meanings as set forth below:   "Bystander antigen" or "bystander" Protein, protein fragment, peptide, glycoprotein, or (i) A component specific to or derived from an organ or tissue under an autoimmune attack; and (ii) Attack cells that contribute to autoimmune destruction and thereby suppress immune attack At least one antigen-nonspecific immunosuppressive factor to be released in an organ or tissue Or immunomodulatory cytokines (such as TGF-β, IL-4 or IL-10) To elicit regulatory (suppressed) T cells (which can be CD4 + or CD8 + type) Or, for enteral administration, any other immunogenic substance (i.e., triggering an immune response). Substances that can be exuded). The term refers to autoantigens involved in an autoimmune attack Including, but not limited to, these fragments. In addition, the term is self- Immunity exposed at the site of an autoimmune attack that results in destruction of epidemic tissues Includes antigens not normally exposed to the mechanism. Illustratively, distinctive tissues connect with the immune system. Heat shock tanks, even if not specific for those normally protected from touch It is a park.   "Bystander suppression" contributes to autoimmune destruction Is suppressed at the site of an autoimmune attack on cells; One or more from suppressor cells derived by ingestion (or inhalation) Immunosuppressive factors (Th2-enhancing cytokine and Th1-inhibiting cytokine) Are mediated by the release of At the site. The result is antigen-nonspecific but Down-regulation of the autoimmune response that can respond is locally restricted.   An "autoimmune disease" is a foreign immunogenic substance in a mammal and / or its own substance. In the immune system that failed to distinguish between quality and immunity, As a spontaneous or upset of the epidemic mechanism, and as a result Is self-organizing such that the immune response to it is foreign and mounted It is defined herein as treating a substance. The term refers to human autoimmune disease and its Including animal models.   "Self-antigen" refers to the first (or first) target of an attack by the immune system, In immunological diseases, any substance or its substance normally found in mammals Part. The term also describes the characteristics of an autoimmune disease when administered to a mammal. Also includes an antigenic substance that induces a condition having the disease. In addition, the term refers to the immunogenicity of the self antigen. Digestive subclass consisting essentially of a non-human epitope or an immunodominant epitope region Including. An immunodominant epitope or region that induces an autoimmune condition will induce the disease A fragment of an autoantigen that can be used in place of the whole autoantigen. In humans with an autoimmune disease, immunodominant epitopes or regions are A fragment of an antigen specific for a tissue or organ under attack and an autoimmune attack By a significant percentage of T cells that have been struck (e.g. Is recognized.   "Treatment" is intended to prevent or delay the onset of an autoimmune disease. Prophylactic treatment (or clinical or asymptomatic manifestations, e.g. histological signs thereof), the same Attenuate autoimmune attacks and prevent or delay autoimmune tissue destruction To provide both treatment for suppression or alleviation of symptoms following signs of autoimmune disease. It is intended to include. "Relief", "suppression" or "reduction" of an autoimmune attack or response , Including partial reduction or improvement of one or more symptoms of the attack or response . An `` substantially '' increased inhibitory effect (or improvement or reduction) of the autoimmune response is Having one or more markers or histological or clinical indicators of epidemics or disease It means to be reduced at will. Non-limiting examples can be found in limb scores or At least one unit decrease in the colitis score, in the frequency of autoreactive T cells Significant reduction and insulitis scoring (eg, Zhang et al., PNAS, 1991, 88 : 10252-10256). 5 units Is the decrease.   "Oral" administration includes oral, enteral or intragastric administration. Also self-administered by inhalation Achieves a resistance effect in immune diseases.   "Parenteral" administration includes subcutaneous, transdermal, intramuscular, intravenous, intraperitoneal or intrathecal administration .   "Bind" to administration refers to simultaneous or sequential administration, also associated or separate Administration in the form. Animal model   Throughout this specification, references are being developed to study autoimmune diseases. Various model systems. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) occurs in multiple sclerosis ( (MS) has been tested in mice and other rodent species. This Many potential immunotherapies for MS have been identified in this animal model system by those skilled in the art. To be tested first. The disease is caused by myelin basic protein ( MBP), myelin oligo oligodendrocyte protein (MOG), or Theolipid protein (PLP) and adjuvant (complete Freund's adjuvant , (Such as "CFA"). Induction of the disease The antigen used for this is the autoantigen in that model. To any antigen This treatment by either monophasic or exacerbating / relaxed forms of demyelinating disease (Based on well-known details of rodent type and species and induction). Induced disease Has many features of autoimmune disease MS and serves as an animal model for it . Furthermore, successful treatment of EAE by oral tolerance and disease induction in humans Considerable success in reducing the frequency of keratinocytes, and in many cases Improving the symptoms of MS using oral dosing of cancer can be a consequence of different oral tolerance regimens. We demonstrate the use of EAE as a model system to predict success.   Mycobacterium tuberculosis Immunization with CFA with oil in the tail of the tail of susceptible mammals is chronic in humans Induce a disease to use as a model for rheumatoid arthritis. In a similar way Immunization with type II collagen along with adjuvant has also been used in human rheumatoid arthritis. A disease that serves as a model for cancer (collagen-induced arthritis or "CIA") To induce. These animal models have also been successfully used with bystander antigens. Serve as a good predictor of oral resistance.   S-antigen or IRBP antigen (interphotoreceptor binding protein) and Immunization of Lewis rats with adjuvant is autoimmune uveitis retinitis (uveroreti nitis). Finally, a model for type I diabetes is self-reliant in NOD mice. Naturally evolves.   One or more of the model systems described above may be useful for improving and modifying the functionality provided by the present invention. Can be used to demonstrate an improved treatment. In fact, the animal model Is a treatment that includes bystander suppression because this suppression mechanism is antigen nonspecific. It is particularly suitable for testing In the case of oral tolerance, therefore, Suppression of the signs obtained in the model is related to human autoimmune diseases and its animal models Has nothing to do with many actual or potential differences.   The above animal model is thus used to demonstrate the successful use of the present invention. obtain. For example, the multiple sclerosis autoantigen, bovine myelin, is a significant subset of patients Is orally administered to humans in a double-blind fashion, which provided considerable benefit to (H. Weiner, H. . Et al., Science 259: 1321-1324, 1993). In addition, joint tenderness, AM stiffness, grip strength, etc. Symptoms of rheumatoid arthritis such as oral collagen receptivity (0. 1-0. 5 mg single dose Dose was successfully suppressed in humans. (Trentham, D. Et al., Science 261: 1727, (1993) Finally, a preliminary human trial with oral S-antigen was performed due to uveal retinitis. Recommended results are shown. Extensive human experimentation with multiple sclerosis, uveal network It will soon be implemented for meningitis, rheumatoid arthritis and diabetes. Autoimmune disease The predictive value of animal models for oral tolerance treatment of Therefore, it is supported. Description of Bystander Control   Mediated clonal anergy by mucosal administration of bystander antigen Suppression is one or more such as transforming growth factor-beta (TGF-β). Is a further immunosuppressive factor; and / or such as interleukin 4 (IL-4) Th2-increased cytokines; and / or interleukins at the site of an autoimmune attack 10 (IL-10) to release targetable immune regulatory T cells I will. These regulatory T cells do not release high levels of IL-2 or γ-IFN. In order for regulatory T cells to be elicited, the mechanism at work is related as active suppression Is done. Immunomodulatory cytokines released by the extracted regulatory cells Even if these regulatory T cells have the same antigenic determinant as one on the mucosally administered antigen Releases (or induces release of) immunomodulatory cytokines only when triggered by If any, it is antigen non-specific. Cells that contribute to autoimmune destruction of organs or tissues But Recruitment of immunoregulatory T cells to an internal location in the animal to be enriched occurs around autoimmune attacks. All ties that give release of immunomodulators in the Suppress the immune system of   In response to T suppressor cells responding to mucosal resistance by tissue or organ specific antigens Due to being withdrawn, the target for T suppressor cells is that Organs or tissues under immune attack in the specific autoimmune disease concerned. Hide Thus, the bystander antigen may be a self antigen or an immunodominant epitope of the self antigen. Containing peptide. Alternatively, the bystander antigen is not a self antigen May be another tissue-specific antigen; thus, the self antigen (s) may be identified It is included in the specific diseases to be treated that need not be done.   More specifically, bystander suppression for tissue-specific (bystander) antigens Illustrative examples of active suppression mechanisms of: are tissue-specific (bystander). -) After the antigen is administered orally (or enterally, i.e. directly into the stomach), Peyer's patches, a large collection of immune cells located beneath the tube wall Villi, which pass through the small intestinal tract when contact occurs. These cells, in turn, It is transmitted to the immune system, including the spleen and lymph glands. As a result, the suppressor (CD 8+ or CD4 +) T cells are induced and released into the blood or lymph circulation, And activated helper T cells directed against the mammal's own tissue, as well as B Release of TGF-β and / or other immunomodulatory substances that downregulate cells When they occur, they are replenished to the area of the autoimmune attack. Chen, Y. Et al., Scien ce, 1994 supra. The suppression induced in this manner is antigen non-specific. However , The resulting resistance is due to a unique autoimmune disease, ie bystander antigen Suppresses immune-attack cells found in or near damaged tissues Tissue under which attack and suppressor cells have been extracted by ingestion of bystander antigen Due to the fact that it is specific for a specific tissue under an autoimmune attack Is specific to   Bystander antigen and self-antigen (also fragments of any of them and Analogs) can be purified from natural sources (tissues or organs in which they commonly occur) And bacteria, yeast, insects (e.g., vaccum) using techniques well known to those skilled in the art. Virus) and in mammalian cells, recombinant DNA technology can also be used. . Amino acid sequences for many potential and real bystander antigens are well known. There are: For example, Hunt, C. Et al., PNAS (USA) 82: 6455-6459,1985 (Heat shock protein Quality hsp70); Burkthardt, H. Eur. J. Immunol. 21: 49-54, 1991 (Antigen Collage Tuohy, V. K. J. Immunol. 142: 1523-1527, 1989 (Ma Determining the Encephalitis Inducibility of US PLP); Shinohara, T .; In Progress in Retinal Rese arch, Osborne, N & Chader, J. Eds, Pergamon Press 1989, pp. 51-55 (S-antigen); Dono so, L. A. J. Immunol. 143: 79-83, 1989 (IRBP); Borst, D. E. J. Biol. Chem . 264: 115-1123, 1989 (IRBP); Yamaki, K. FEBS 234: 39-43,1988 (S-antigen) Donoso, L. A. Et al., Eye Res. 7: 1087, 1988 (IRBP); Wyborski, R. J. Mol. Bra in Res. 8: 193-198, 1990 (GAD).   Bovine and mouse PLP; bovine, human, chimpanzee, rat, mouse, pig, Rabbit, guinea pig MBP; human and bovine collagen alpha-I (II) and bovine cola Antigen alpha-I (I); chicken collagen II, and human insulin The amino acid sequence is well known and published and these antigens are well known in the art. It can be synthesized by such a recombinant technique. Fragments of these antigens Can be synthesized chemically and also by recombinant techniques.   Several tissue-specific antigens are commercially available: for example, insulin, Lucagon, myelin basic protein, myelin, collagen I, collagen II , Proteolipid proteins and the like.   Bystander antigens can be routinely identified. Affected organization (affli Any antigen from cted tissue) is potentially a bystander antigen. So Potential bystander antigens are mammalian, and in vitro by the same antigen For example, EAE or MS from these mammals that can be removed and stimulated with Spleen cells from blood or cerebrospinal fluid in blood or circulating T cells . T cells extracted by stimulation can be purified, and the supernatant contains TGF-β, The content of IL-4, IL-10, or other immunomodulators can be tested. In particular , TGF-β is preferably a suitable commercially available polyclonal or Also preferably, monoclonal antibodies raised against TGF-β (eg, R & D S ystems, ELISA using Minneapolis, MN; Celtrix Pharmaceuticals, Santa Clara, CA) A can be measured quantitatively and / or qualitatively. Miller, A. J. Immunol . , 148: 1106,1992. Alternatively, another well-known assay for TGF-β detection is commercially available. Using a mink epithelial cell line available for, as described in the Examples below, Can be used. T suppressor if bystander antigen does not release TGF-β -If cells are to be extracted, the T cells will also secrete IL-4 or IL-10 Can be tested (antibodies for IL-4 and IL-10 are described, for example, in Pharmigen, San Diego, C A, can be used commercially). Tissue-specific antibodies that are not effective bystander antigens Is the site of inflammation necessary for released immunomodulatory cytokines to exert an inhibitory effect? May be separated from inflammatory sites (of autoimmune attack) as they are moved farther away Are those.   Efficacy of bystander suppressors induced in mucous membranes is eg: autoimmune attack Many activated T cell clones are directed against the organ or tissue that is the target of the strike. Reduction of certain inflammatory markers; IL-2 or IFN-β levels at the same location Histological assessment of the affected organ or tissue (eg, biopsy or magnetic Or by the number of clinical signs associated with the autoimmune disease) And / or a reduction in magnitude. Use of tolerizing agents-dosage   The tolerance induced by the bystander antigen of the invention may be oral (or enteral) or inhaled. It is dosage dependent over a wide range of possible dosages. However, valid There is a minimum and maximum dosage. In other words, clinical and histological of autoimmune diseases Inhibition of biological symptoms occurs within a specific dosage range, however, From disease to disease, from mammal to mammal, and bystander antigen to bystander -Changes to the antigen. For example, if the disease is PLP-induced EAE in mice If MBP is used as a bystander antigen, the suppression dosage range The box is approx. 1 to about 1 mg / mouse / dose (e.g., 10-14-days every other day) Up to 5-7 intake over the period). Most preferred A suitable dosage is 0. 25 mg / mouse / ingestion. MBP induction in rats Approx. 5 to about 2 mg / mouse / dose, most preferred The dosage is 1 mg / mouse / uptake. MBP is used as an oral tolerance agent In the case of MS, the effective dosage range for humans with MS is between about 1 and about Between 100 and preferably about 1 and about 20 mg MBP (from months to years) Administered daily or every other day during the period of time in the range), the optimal value is It is about 7 and 10 mg.   Either type I collagen or type III collagen for rheumatoid arthritis The effective dosage range for humans receiving one is about 0,1 per day. 00 Between 5 and about 1 mg. A preferred dosage is about 0,1 per day. 005 and about. 5 mg.   Patient monitoring is not desirable to optimize dosage and frequency of administration. Can be The exact amount and frequency of administration to a patient will depend on the stage, the frequency of symptoms of the patient's disease, and Based on the degree and physiological condition of the patient, as is also well recognized in the art Can be changed to Such optimization is preferably enabled on a case-by-case basis. It is effective. Optimizing the dosage required for immunosuppression is more than routine experimentation. And provide the guidelines disclosed herein.   Assessment of the degree of disease can be achieved according to well-known methods based on the type of disease . Such methods include, without limitation:         MS: Extent and number of attacks over a period of time; progressive accumulation of disability (eg                 For example, the Extended Disability Status Scal                 e) can be measured); number and extent of lesions in the brain (eg magnetic                 And self-reactive T cells                 Vesicle frequency.         EAE: limb paralysis that can be scored as: 0-no disease; 1-increase                 Active, inactive tail; 2-mild paralysis, gait instability; 3-medium                 Degree of paralysis, limb fanning; 4-limb paralysis; and 5-death.         RA: joint swelling, joint tenderness, morning stiffness, grip strength, joint imaging techniques                 Art         AUR: visual acuity; number of T cells in the eye and "turbidity" in the eye.         Type I diabetes: Pancreatic T cell function (eg, by OGTT glucose tolerance test)                 Was evaluated).         NOD model: insulin and delayed onset of diabetes.         CIA: Arthritis score is the number of joints affected on each of the four feet                 And based on each grading to an arbitrary score of 1-4: 0                 = Normal; 1 = redness only; 2 = redness plus swelling; 3 = severe swelling                 And 4 = joint deformation. The total arthritis score is the                 It is the total of the core. The largest arthritis score is the course of the disease                 It is the highest score of the animal that surpasses.                 The highest possible arthritis score according to this grading method is 16                 (Score for every four feet × four feet).   Control patients or experimental animals stabilize symptoms under conditions of worsening symptoms Is an indicator of the effectiveness of suppression therapy. Another measure of improvement is that other medications, such as Reduce or stop steroids or other anti-inflammatory drugs and biological response modifiers And ability. The optimal dosage of bystander antigen or autoantigen is It is one of the most beneficial effects evaluated. Effective dosages are as described above. Markers, signs or histology of at least one characteristic of the disease being treated At least statistical or clinical evidence of evidence is warranted. (Clinical Most notable evidence has been observed by clinicians skilled in the field of specific autoimmune diseases. Is one that is measured)   When combined with methotrexate treatment, bystander antigen (or autoantigen The dose of `` raw '' is that if the bystander antigen (or autoantigen) is administered alone, Used, except for those combinations that are made more effective at reducing the autoimmune response Could be equal to that.   Methotrexate dosage is the same as methotrexate used alone When high, the combination with bystander or self-antigens can result in increased suppression Can be given. Alternatively, suboptimal dosages of methotrexate may be taken It may be administered to reduce the toxic effects of totrexate. Smell in this case Thus, the increased suppression achieved by the combination is, for example, that of methotrexate It can be as high as achieved with optimal dosage.   Determining the effective dosage range as well as the optimal amount of bystander antigen is routine. Determined using the teachings of the present application. For example, dosages for mammals and humans are: Start with a relatively low dose (eg 1 milligram) and increase it incrementally (Eg, logarithmic) and secretes TGF-beta (and / or IL-4 or IL-10) Measuring the number of cells and / or assessing the number and activity of immune challenged T cells in the blood (E.g., by limited dilution analysis and the ability to differentiate) and / or As determined by an assessment of the severity of the disease. The optimal dosage is Causes maximal decrease in anti-cytokine and / or maximal decrease in disease symptoms I do. An effective dosage is one that is characteristic of at least one symptom of the disease being treated. It is at least responsible for statistical or clinical significance.   The maximum effective dosage of bystander antigen is progressively higher in animals. Testing at a dose can then be confirmed by inference to humans. For example, rodent For animals, based on the dosages given above, the maximum effective dose of MBP in humans Dosages are estimated between 50 and 100 mg / dose. Similarly for humans The maximum effective amount of collagen type II has been estimated at about 1 mg / day.   The present invention provides for the initiation of autoimmune disease in individuals susceptible to infection at autoimmune disease risk. It can also be used effectively to prevent. For example, resources that progress to type I diabetes Methods for the identification of patients with risks are existing, reliable and A variety of assay mechanisms that are actually supported by the Association (ADA) are Developed with high predictive value (especially in combination) (Diabetes Care 13: 762-775, 1990). Details of one preferred screening test Details are available in the art (Bonifacio, E. Et al., The Lancet 335: 147-14 9,1990).   From a practical point of view, prevention of the onset of autoimmune diseases is of paramount importance in type I diabetes. It is important. Other autoimmune diseases (eg, MS, RA, AT and AUR) Called at an earlier stage of tissue destruction, before tissue damage occurs; Prophylactic treatment of these diseases is not as important as in type I diabetes. Type I sugar In urine, an effective treatment prior to the actual destruction of substantially all of the pancreatic islet cells It is best to fit. After islet cells are destroyed, the treatment is linked to islet cell transplantation. It cannot be valid unless used in combination.   Autoimmune diseases and treatment of these diseases when administered in oral or inhaled form Tissue- or organ-specifically confirmed or potential bystander A non-limiting list of antigens and autoantigens is set forth in Table 1 below. Each individual Combinations of the antigens mentioned in the diseases may also be administered.   Bystander and self antigens can also be administered by inhalation. Inhaled The amount of bystander needed is generally higher than for oral administration. Less. Effective amounts for inhalation therapy are assessed using the same methodology provided above. Can be valued.  For any autoimmune diseases, extracts of related tissues, as well as specific bystanders Dar antigens or fragments thereof can be used as mucosal resistance agents. Paraphrase If so, the bystander antigen does not need to be purified. For example, used for MS Myelin (obtainable from different species), used for type I diabetes Pancreatic cell extract to prevent allograft rejection (this is not an autoimmune phenomenon) Extract used for the treatment of muscle and muscle extract used for treating myositis . However, one or more individual antigens or fragments are preferred .   Thus, when treating type I diabetes according to the present invention, an effective amount of glucagon (As determined above) can be administered orally. Glucagon causes pancreas And exists specifically. However, glucagon has been included in the course of type I diabetes. Is not an autoantigen because it is not expressed in damaged and destroyed pancreatic beta cells. (Glucagon is exclusive in alpha cells, different cell types Found in). Glucagon is thus a "pure" bystander: It is not clear that it has any autoantigen activity. (Estimated pancreatic Glucagon's Bystan, due to its high local concentration in the intracellular environment Dar activity is due to its secretion from alpha cells. )   Insulin has bystander activity for type I diabetes. Even if anti-a Even if insulin autoantibodies are found in type I patients, insulin is also autologous. Whether it is a self antigen is currently unknown. However, the mechanism of action Whatever canism, oral, enteral or inhalable insulin preparations Prevents autoimmune destruction of beta cells thereby preventing type I diabetes It is effective in suppressing the object model.   For multiple sclerosis and its animal models, contain fragments of MBP or Both diseases that do not include not only MBP-induced disease but also PLP-induced disease Has istander activity. In rats, the intake of bystander antigen was CD8 in the mouse+Suppressor and CD4+Although both regulatory cells are produced, And restricted class I CD8+Produces almost all suppressor cells ( I think the latter would be class II restricted). Chen, Y. et al., Science, 1994, supra.   For rheumatoid arthritis and animal models thereof, type I, II and III collagen Sources have activity as mucosal resistance agents. Other collagens have similar activity Seems to be.   For Uveal Retinitis and its animal model, S-antigen and IRBP and its The fragment has bystander activity.   Fragments of bystander antigens may also be utilized. Useful fragments Can be identified using the overlapping peptide method, and T cells from ingested animals Vesicles can test for secretion of TGF-β, and / or IL-4 and / or IL-10, And can be further identified by subtype (CD8+And / or CD4+) .   Bystander antigen administered mucosally elicits regulatory T cells and thereby Induces the production and release of TGF-β, and / or IL-4 and IL-10. That's it One such T cell is orally to EAE as a CD4 + suppressor T cell. CD8 + suppressor T cells that have been identified in mice that have become resistant to Has been identified in rats. Equal immunodominance of self antigens, eg MBP Epitopes can include such regulatory T cells. Additional such A unique epitope is one that provides a mammal with a bystander antigen, Mammalian T cells recognizing fragments (and thus repressed fragments identified) Or selective protection for unexperimented (no ingestion) animals. By identifying T cells from bystander-fed animals that can be transferred , Can be identified.   Autoantigen administration is described in PCT application PCT / US93 / 01705, 1991, filed February 25, 1993. PCT / US91 / 01466 filed on March 4, 1990; PCT / US90 / 07455 filed on December 17, 1990 PCT / US90 / 03989 filed on July 16, 1990, PCT / US9 filed on October 10, 1991 PCT / US93 / 07786 filed on 1/07475, August 17, 1993, P filed on September 24, 1993 CT / US93 / 09113, PCT / US91 / 08143 filed October 31, 1991, filed March 29, 1991. PCT / US91 / 02218, PCT / US93 / 03708 filed on April 20, 1993, April 9, 1993 PCT / US93 / 03369 filed on Oct. 15, and PCT / US91 filed on Oct. 15, 1991, mentioned above. / 07542 as described in Be executed.   In addition, other cytokines and non-cytokine synergists may be combined with methotrexate. Both can be combined in therapy to increase the effectiveness of oral tolerization. Other rhino Oral or parenteral use of tocaine synergists (type I interferons) is described in 04/07/95 PCT / US95 / 04120 filed in Administration of Th2 increasing cytokine Is described in PCT Application No. PCT / US95 / 04512 filed on 04/07/95. For example, I L-4 and IL-10 can be administered in the manner described in PCT / US95 / 04512. Departure Non-limiting examples of non-cytokine synergists for use in Ming From a wide variety of Gram-negative bacteria such as various subtypes of Salmonella Bacterial lipopolysaccharide (LPS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; Difco, De) troit, MI; BIOMOL Res. Labs., Plymouth, PA), lipid A (Sigma Chemical Co., St. L.) ouis, MO; ICN Biochemicals, Cleveland, OH; Polysciences, Inc., Warrington, PA); Deres, K. et al. (Nature, 342: 561-564, 1989). Tripalmitoyl-S-glycarylcysteinyl-seryl-serine (PThree(C55) Immunomodulatory lipoproteins such as combined peptides or Braun, V., Biochem. Biophys. Acta 435: 335-337, from E. coli that can be obtained as disclosed in 1976. Browns' lipoprotein; and its synergistic effect is described by Sun, J-B et al. 1994 PNAS (USA) 91, Cholera as described by November 1994 (but not with regard to reduced autoimmune response) Contains venom β-chain (CTB). Lipid A is less toxic than it is a whole LPS molecule Therefore, it is more suitable than LPS for use in the present invention. In the present invention LPS for use by Galanes et al. (Eur. J. Biochem. 9: 245, 1969) and Skelly, Extracted from Gram-negative bacteria using the method of R.R. et al. (Infect.Immun. 23: 287, 1979). It can be purified. Effective dosage of non-cytokine synergist for mammals The range is from about 15 μg to about 15 mg / kg body weight, preferably It is up to 300 μg-12 mg. Oral type I interface for mammals Ron's effective dosage range is not the maximum recognized effective dosage of 1,000-150,000 Is a unit.   Determination of optimal intake for both tolerant and methotrexate administration can be found here. And the administration of bystander antigens, autoantigens and methotrexate Is determined in light of known information about Variation of dosage routine , Combination and continuation of therapy are performed in an environment where the extent of the autoimmune response can be measured. It is. Useful dosages and dosing parameters will determine the number of autoreactive T cells Reducing the appearance or extent of at least one clinical or histological sign of the disease Those resulting in a reduced autoimmune response.   The tolerizing agent is preferably administered within 24 hours of the administration of methotrexate . More preferably, it is administered simultaneously with methotrexate. Most preferred Are administered in a combined oral formulation.   Methotrexate for use in the present invention is an oral or parenteral dosage form. Both are commonly used commercially. Alternatively, methotrexate is more Oral or parenteral dosage forms are usually administered using carriers and other agents as described below. To achieve.   Each oral (or parenteral) formulation according to the present invention may be a pharmaceutical, as is well known in the art. Acceptable carriers, diluents, fillers, solubilizers or emulsifiers, and salts And inactive ingredients including: For example, tablets may be solid carriers well known in the art. Can be formulated according to the usual method using Capse used in the present invention Can be any pharmaceutically acceptable material such as gelatin or cellulose derivatives. Can be made from the material. Sustained release oral delivery systems and / or oral administration Enteric coatings for pharmaceutical forms are also disclosed in US Pat. No. 4,704, issued Nov. 3, 1987. U.S. Pat. No. 4,556,552 issued Dec. 3, 1985; U.S. Pat. No. 4,309,404; and U.S. Pat. No. 4,309,406, issued Jan. 5, 1982. They are also intended.   Examples of solid carriers include starch, sugar, bentonite, silica, and other customary Including the carrier used. Carriers and dilutions that can be used in the formulations of the invention Further non-limiting examples of agents include salt solutions, syrups, dextrose and water. No.   An example of a tolerant administered by inhalation is found in PCT / US90 / 07455 filed on 12/17/90. Provided. Pharmaceutical formulations for administration by inhalation according to the present invention may comprise any optional ingredients. Pharmaceutically acceptable carriers, diluents, solubilizers and emulsifiers, and It may contain salts of the type well known in the field. Examples of such substances are It includes normal saline solutions, such as physiologically buffered saline solutions, and water.   The route of administration of the tolerizing agent according to this mutual embodiment of the present invention may be aerosol or In inhalation form. The antigen may be provided as dry powder particles or as a carrier powder. (For example, air or NTwo) May be administered as an aqueous solution in suspension. preferable Aerosol pharmaceutical preparations contain, for example, a raw material containing between about 1 mg and about 300 mg of antigen. It may contain a physiologically acceptable buffered salt solution.   Morphology of finely divided solid particles of the tolerizing antigen that are not dissolved or suspended in the liquid Dry aerosols are also useful in the practice of the present invention. The resistant antigen is Can be in the form of dusting powder, between about 1 and 5 microns, preferably 2 and 3 microns. It contains finely divided particles having an average particle size between the clones. Minute minute The broken particles are prepared by grinding and screen filtration using techniques well known in the art. Can be made. The particles are pre-determined of finely divided material, which can be in the form of a powder. It can be administered by a fixed amount of inhalation.   The specific non-specificity of the carrier and / or diluent used in the pharmaceutical formulation by inhalation A limiting example is water and physiologically acceptable salts such as pH 7.0-8.0 phosphate buffered saline. Containing buffered solution. In a pharmaceutical formulation or dosage form by inhalation of the invention A non-limiting example of a suitable carrier or diluent supplement for use is April 2, 1987. U.S. Pat.No. 4,659,696 issued on the 1st, 4,863,720 issued on September 5, 1989 and January 1987. It is disclosed in No. 4,698,332 issued on 6th October.   Pharmaceutical formulations of the present invention include, for example, U.S. Pat.No. 4,624,251 issued Nov. 25, 1986. No. 3,703,173 issued on November 21, 1972; 3,561,444 and 1971 issued on February 9, 1971 Nebulizers such as those disclosed in 4,635,627 issued January 13, 2013 It can be administered in the form of an aerosol spray. The aerosol material depends on the subject to be treated. Inhaled.   Newman, S.P.Aerosols and the Lung, Clarke, S.W. and Davia, D.eds.pp. 197-224. , Butterworths, London, England, 1984. Others for aerosol delivery such as drug inhalers (MDI) and dry powder inhalers A system may be used when implementing the present invention.   An aerosol delivery system of the type disclosed herein is provided by Fisons Corporatio n (Bedford, MA), Schering Corp. (Kenilworth, NJ) and American Pharmoseal C o. (Valencia, CA).   All patent applications, patents, and academic literature cited in this specification are incorporated by reference in their entirety. It is merged thereby by reference. In case of conflict, the present disclosure, definitions and statements Descriptions that include a statement take precedence.   The following examples are illustrative of the present invention and are not intended to limit its scope. No. Example 1: Rats with optimal dosage combinations of methotrexate and a tolerizing agent EAE suppression   The following materials and methods were used in the experiments described below.   animal. Female Lewis rats were purchased from Harlan-Sprague Dawley Inc. (Indianapolis, IN ). Animals maintained a standard laboratory diet and water ad libitum. Animal Committ ee on care of Laboratory Animals of the Laboratory Research Council (Pub. #DHEW: NIH, 85-23, revised 1985).   Antigens and reagents. Guinea pig MBP was obtained from Deibler et al. (Prep. Biochem. 2: 139,1972). Purified from brain tissue by a modified method. Protein content and purity were determined by gel electrophoresis and Monitored by amino acid analysis. Methotrexate is available from Roxane Lab. us, OH). Methotrexate tablets (2.5 mg) Buffer solution (HTwoO: PBS in 1: 1 ratio) did.   Induction of tolerance. Due to oral tolerance, rats were fed an 18 gauge stainless steel animal feed. PBS (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ) by gastrointestinal intubation 0.5X) was taken in. Animals receive 7 doses or 1 dose prior to immunization. Three times a week on Monday, Wednesday and Friday for any one of the four doses ("QOD") Ingested.   Induction of EAE. Because of the disease actually induced, Lewis rats Were immunized in the foot pads. 0.1 ml of emulsion Mycobacterium in 25 μg of guinea pig MBP and complete Freund's adjuvant It contained 200 μg of M. bellcrosis.   Clinical evaluation. Animals were evaluated daily in a blinded fashion for evidence of EAE . The clinical severity of EAE was scored as follows: 0, no disease; one liveness None; 2, Hind foot paralysis; 3, Uncontrollable hind foot paralysis; 4, Quadriplegia; and 5 deaths. "MMCS" refers to the average maximum clinical score. Disease continuity depends on the disease in each animal. By counting the total number of days from initiation to complete recovery (or death) Measured.   Histological analysis. Clinical scores are 2-tail Wilcoxon for score samples Analyzed by rank sum test, chi square analysis is the ratio of incidence between groups Used in comparisons, and the comparison of the averages was performed using the Student's t-test. did. For the experiments here, five animals were used per group.   The table below shows the protocol for administration to each group of rats. "Q "ODx7" indicates administration three times a week for a total of seven administrations. "QODx14" Shows three doses per week for a total of 14 doses. The protocol was performed twice (Experiment # 1 and Experiment # 2).  In this experiment, 80 μg of methotrexate was used by itself and GP-MB It was administered in combination with 1 mg of P (guinea pig MBP). Administered three times a week 80 μg of the methotrexate that was administered to humans It corresponds to the optimal dosage of Trexate. Especially recommended for 60Kg individuals The dosage is 10 mg of methotrexate per week. 7 for rat administration Chemotherapy National Cancer Society conversion factor using 238 μg / w Lexate administered to 212.2 g rats or 80 μg methot three times a week It corresponds to Lexate.   The results of experiments involving 14 doses of antigen are shown in the table below. These results When administered in combination with methotrexate, MBP produces methotrexate It did not interfere with the use. They also show that optimal suppression is methotrexate alone. What was achieved with 80 μg of Germany was also demonstrated.  The table below shows the results obtained with seven administrations of the antigen. These results are The combination of Trexate and MBP is better than administering either compound itself It indicated that greater suppression was achieved. The suppression achieved by the combination is It was substantially larger than with either substance alone.Example 2: Rats with a combination of suboptimal dosage of methotrexate and a tolerizing agent EAE suppression in   The procedure described in Example 1 was continued for the protocol indicated below. Suboptimal dosages of 40 μg and 20 μg were administered over a period of 14 days of MBP Administered in combination with 1 mg. An optimal dosage of 80 μg was also administered.The results obtained in this experiment are shown in the table below.  FIG. 1-5 shows 20 days immunization with MBP in complete Freund's adjuvant. Shown is the clinical data from this experiment later.   FIG. 1 shows the results of the administration of methotrexate alone. Optimal for methotrexate Inhibition of EAE with dosages (80 μg) and suboptimal dosages (40 μg and 20 μg) Can be viewed as following a medication dependent response. The graph shows suppression on day 18. Following the highest severity, methotrexate administration, when clinical signs of disease reappear Figure 4 shows the combined rebound effect.   FIG. 2 shows the administration of the optimal dosage of methotrexate compared to the optimal dosage of MBP. 7 shows the effect on the clinical score of. The rebound effect was methotrexate Rats that were given were seen at day 20, but not rats that received MBP .   FIG. 3 shows the ratio between the optimal dosage of methotrexate and the optimal dosage of MBP. In comparison, the effect on the clinical score of the administration of the optimal dose of methotrexate was Show. The addition of MBP to the optimal dosage of methotrexate is Does not interfere with the effect. Methotreki on the effect of MBP to eliminate rebound in 20 days There is no interference of the sart. Thus, the uniform maximum of MBP and methotrexate The effect obtained by administration of the appropriate dosage combination is that the administration of any agent by itself It is superior to that seen from.   FIG. 4 shows MBP alone and methotrexate alone as compared to the administration of the two combinations. The results of the administration of a suboptimal dose of 40 μg of Germany are shown. The combination is one of Greater inhibition than achieved alone and methotrexer The rebound effect seen alone is avoided. The degree of suppression is methotrexer Is essentially the same as that observed with optimal dose administration alone.   FIG. 5 shows MBP alone and methotrexate alone as compared to the administration of the two combinations. The results of the administration of a suboptimal dose of 20 μg of Germany are shown. The combination is one of Even greater suppression is achieved than is achieved alone. The degree of suppression is Similar to that observed with optimal administration of totrexate alone.   Thus, in accordance with the present invention, lower than optimal dosages of methotrexate may be used. , Can be administered as a result of combination with MBP, the inhibitory effect is methot It is similar to that of the optimal dosage of lexate alone. In addition, set Combination removes the rebound effect associated with methotrexate administration alone. Example 3: Collagen-induced arthritis by combination of methotrexate and a resistance agent Suppression   DBA / J1 mice received type II collagen (300 μg in 0.25 ml), methot Lexate (10 μg in 0.25 ml), by a combination of the two, or 0.1 Oral once daily for 5 consecutive days with a control solution of N acetic acid (0.25 ml) Was administered. The type II collagen is chicken sternum type II collagen (1.2 mg / ml) (S igma chemical Co., St. Louis, MO). Methotrexate is a 2.5 mg tablet (Roxane Lab. Inc.). The tablets form a 2.5 mg / ml solution, It was mixed with 0.1 N acetic acid. The amount of methotrexate administered was 12 for mice. Using the conversion factor (Chemotherapy National Cancer Institute) Based on an average weight of 26 g / s, a maximum of 10 mg / week for a 60 Kg human The decision was based on the appropriate dosage.   Three days after the final oral administration, each animal received 100 μg of type II collagen and mycobacterium. With 0.1 ml of an emulsion containing 100 μg of terium butyricum, It was injected intradermally into the shaved back. After three weeks, all mice were reconstituted in 0.1 N acetic acid. Boosted by intraperitoneal injection of 100 μg of type II collagen. Animals are 60 During the day, the onset of arthritis was monitored. Start date +10, animals are 0-4 Cores were scored for signs of arthritis. The arthritis score for each animal is The sum of the scores for each of the four feet was taken. The results are shown in Table 6 below.  Collagen-induced arthritis in DBA / 1 male mice is associated with rheumatoid arthritis. Much more clinically intense than 10 mg of methotrexate in humans Even if calculated based on dose, 10 μg of methotrexate in mice would Obviously not a dosage high enough to suppress lagen-induced arthritis . In fact, the severity of the disease is worse than when control buffer is administered. won. This was due to the discontinuation of methotrexate administration prior to immunization. This can be the result of a bound effect. These results, however, indicate that collagen induction Arthritis is more likely to occur with type II collagen and methotrex than with either material alone Substantially greater levels when combined with Lexate That was shown. Example 4: Assay for TGF-β induction       Measurement of TGF-β in serum-free culture supernatant.   Serum-free culture supernatants were collected from cells from test animals. For example, Kemri, et al. Med. 163: 1037-1050,1986; and Wahl, et al., J. Immunol. 145: 2514-2419,199. See 0. Schematically, the modulator cells are treated with antigen (50 μl / m Cultured first for 8 hours with l). The cells are then washed three times and serum free Resuspend in medium and incubate for the remaining 72 hours, collect supernatant and freeze until analyzed. Was. The TGF-β content and the determination of the isoform in the supernatant were determined by Danielpour et al. (Danielpour, D. et al.). , J. Cell.Physiol. 138: 79-86, 1989), and a mink lung epithelial cell line (American Type  Culture Collection, Bethesda, MD # CCL-64) Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (SELISA) Confirmed by Say. The percentage of active TGF-β is the percentage before acid activation of the sample Were measured by the assay except for.   This assay is intended for use as an inducer of bystander suppression. Any antigen that is a candidate may be adapted for testing. Those antigens, antigens Most of the fragments and / or TGF-β as measured by this assay The amount of antigen that induces high concentrations is suitable for use in the therapeutic methods of the invention. It is said. Alternatively, the transwell culture system described below is triggered Can be used to indicate the level of TGF-β. This culture system is Means the production of TGF-β as a function of suppressing TGF-β.   The appearance of IL-4 and / or IL-10 in the culture supernatant of antigen-stimulated cells indicates that Indicator that Hara is suitable for use as an inducer of bystander suppression Can be served as well.   IL-4, IL-10 (and TGF-β) are described in Chen, Y. et al., Science, 1994, supra. ELISA using commercially available antibodies for each polypeptide as described Thus it can be analyzed.   Transwell culture. Pore size 24.5mm in diameter and 0.4μm Having a double-layer consisting of two compartments separated by a semipermeable polycarbonate membrane A chamber transwell culture system (Costar, Cambridge, MA) is used. So The two chambers are spaced 1 mm apart and are very tight without direct cell-to-cell contact. Give cells to be co-incubated in close proximity. Transwell culture smell To measure the in vitro suppression of the proliferative response, e.g., as previously described (Ben -Nun, A. et al., Eur. J. Immunol. 11: 195,1981)Fourantigen Specific lineage cells were grown in 600 μl of growth medium in the lower wells.6Irradiated ( 2,500 rad) cultured with thymocytes. Orally tolerated animals (e.g. rats) or Spleen cells from control (BSA ingestion) are added to upper wells (20 5 × 10 in 0 μlFivecell). The spleen is removed 7-14 days after the last ingestion and A cell suspension is prepared by pressing the spleen through a stainless steel mesh. Prepared. The antigen (50 mg / ml) is added in a volume of 20 μl. Mogi The translator cells are separated from the responder cells by a semipermeable membrane. Is not required to be irradiated. In some experiments, the indicator cells were It is added into the lower wells along with the Ponder cells and in these cases the The durator cells are irradiated (1,250 rad) immediately before being placed in culture. The growth medium is 2x10FiveRPMI 1640 supplemented with M2-mercaptoethanol (Gibco Labo ratories, Grand Island, NY), 1% sodium pyruvate, 1% penicillin and Streptomycin, 1% glutamine, 1% HEPES buffer, 1% non-essential amino acid Noic acid and 1% autoserum. Each transwell is performed in quadruplicate. The transwell contains 6% COTwoAnd 72% at 37 ° C in a 94% air atmosphere Incubate for hours. After 54 hours of culture, each lower well contains [Three [H] thymidine pulsed with 4 μCi, crushed in 72 hours, Three wells in a round bottom 96 well plate (Costar) for harvesting on a filter And recounted using standard liquid scintillation techniques. Percent inhibition = 100 × (responder cultured with 1-Δcpm modulator -/ Responder Δcpm). Example 5: Treatment of rheumatoid arthritis   Sudden discontinuation of methotrexate treatment in patients with rheumatoid arthritis Defined to compare with oral type II collagen administration with placebo administration after As part of the floor experiment, oral type II collagen alone, or oral type II collagen and oral Either one of the methotrexate combinations was administered.   Patients in this experiment were treated with methotrex at a maximum dose of 20 mg per week. All claims are pre-received and all are typed in functional classes I, II and III Severe rheumatoid arthritis. Only patients classified into functional class IV Excluded. Function class IV performs daily self-care, occupational and side-job activities. Includes patients who are limited in their ability to All patients have at least There were 6 tender joints and at least 3 swollen joints. Persistent steroids NSAIDS (non-steroidal anti-inflammatory drugs and certain analgesics Administered to those who want).   203 patients were enrolled in the study. Immediately before the start of the experiment, methotrex The use of the sert was stopped completely. All patients should take me before the first meal of the day. 20 μg / day of type II collagen in orange juice was orally administered.   A method for preparing such type II collagen is described in WO 97/25435. This The type II collagen used in the experiment was used in acetic acid to remove telopeptides. Is usually pepsin-treated. A composition comprising 20 μg of type II collagen, Methods of administration of such dosages, and the beneficial results of such administration, are described in WO 97/02. 837.   During the study, which ended at 24 weeks, patients received tender and swollen joint counts. It was evaluated by several measurements including: Cumulative Paulus 20 response is associated with rheumatoid arthritis And is a well-known measure of improvement in the United States and was used to assess efficacy. Paulus et al. Arthritis and Rheum. 1990; 33: 477-484.   At week 8 of the experiment, those patients who had reddened signs ("spiked") had 7. To commercially available methotrexate at dosages between 5 and 10 mg / week Oral treatment was resumed. A comparison of a total of 101 patients who completed the experiment, 47 patients who received a combination of type II collagen and methotrexate A response was formed between 54 patients who received only collagen.   The results are shown in FIGS. 6-8. FIG. 6 shows the swollen joints measured during the experiment. Indicates und. The group of patients with signs worsening at 8 weeks increased at that time Showed swollen joint counts. Methotrexate combined with type II collagen treatment After receiving treatment, this group of patients showed a number of swollen joint loss and Eight weeks after the combined treatment (corresponding to the 16-week mark in FIG. 6), only type II collagen was received. It showed a greater decrease in swollen joints (its baseline number) than in gig patients. So Are shown in FIG. 7 for tender joint counts showing a similar pattern.   The percentage of patients achieving the cumulative Paulus 20 response shown in FIG. Higher in patients receiving combination therapy than those receiving type collagen alone Was. The Paulus response of patients receiving a coloral methotrexate combination was Calculated from the time when methotrexate was combined with type II collagen at 8 weeks. Thus, the use of a combination of oral type II collagen and methotrexate requires oral II The results obtained increased disease suppression compared to the use of type collagen alone.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/51 Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ 39/00 37/06 Ａ６１Ｐ 3/10 Ｃ０７Ｄ 475/08 19/04 Ａ６１Ｋ 31:519） 27/02 37/02 29/00 １０１ 37/12 37/06 37/26 // Ｃ０７Ｄ 475/08 37/28 (Ａ６１Ｋ 38/00 37/56 31:519） 31:519） (72)発明者 ネルソン，パトリシア エー アメリカ合衆国 マサチューセッツ ベル モント（番地なし)──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 38/51 A61P 29/00 101 39/00 37/06 A61P 3/10 C07D 475/08 19/04 A61K 31: 519) 27/02 37/02 29/00 101 37/12 37/06 37/26 // C07D 475/08 37/28 (A61K 38/00 37/56 31: 519) 31: 519) (72 Nelson, Patricia A, United States Massachusetts Belmont (no address)

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． （ａ）バイスタンダー抗原を粘膜に投与すること；及び （ｂ）メトトレキサートを経口的に、経腸的に又は非経口的に投与する こと； ここで、上記バイスタンダー抗原とメトトレキサートの量は、自己免疫 疾患と結合した自己免疫応答を抑制するための組み合わせにおいて有効とされる 、 を含む自己免疫疾患の治療方法。 ２． 上記バイスタンダー抗原と上記メトトレキサートが、それぞれ単独での投 与により達成された抑制効果に比較して、組合せにおいて上記応答の抑制化にお いてより有効とされる請求項１記載の方法。 ３． 上記バイスタンダー抗原が経口、経腸、又は吸入により投与される請求項 １記載の方法。 ４． 上記メトトレキサートが非経口的に投与される請求項１記載の方法。 ５． 上記メトトレキサートが経口的に投与される請求項１記載の方法。 ６． 上記疾患が、多発性硬化症である請求項１記載の方法。 ７． 上記バイスタンダー抗原が、ミエリン塩基性タンパク質(ＭＢＰ)、プロテ オリピドタンパク質(ＰＬＰ)、ミエリン結合グリコプロテイン(ＭＡＧ)、ミエリ ンオリゴデンドロサイトグリコプロテイン(ＭＯＧ)熱ショックタンパク質、及び それの自己免疫抑制フラグメントからなる群から選択される請求項６の方法。 ８． 上記バイスタンダー抗原がミエリンである請求項６記載の方法。 ９． 上記疾患が、慢性関節リウマチであり、且つ上記バイスタンダー抗原が、 Ｉ型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、及びそれの自己免疫抑制 フラグメントからなる群から選択される請求項１記載の方法。 １０． 上記疾患がＩ型糖尿病のそれによるものであり、且つ上記バイスタンダ ー抗原が、グルカゴン、インスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素、熱ショックタン パク質、及びそれの自己免疫抑制フラグメントからなる群から選択される請求項 １記載の方法。 １１． 上記疾患が、ぶどう膜網膜炎であり、且つ上記バイスタンダー抗原がＳ -抗原、インターフォトレセプターレチノイド結合タンパク質(ＩＲＢＰ)、及び それの自己免疫抑制フラグメントからなる群から選択される請求項１記載の方法 。 １２． 上記バイスタンダー抗原と上記メトトレキサートが、実質的に同時に投 与される請求項１記載の方法。 １３． 上記疾患が多発性硬化症であり、ＭＢＰとメトトレキサートを含む組成 物を経口的に投与することを含む請求項１の方法。 １４． 上記自己免疫疾患が、Ｔ細胞仲介される請求項１記載の方法。 １５． 多発性硬化症の治療方法であり： （ａ）ＭＢＰを含む組成物の一定量を経口、経腸、又は吸入によって投 与すること；及び （ｂ）メトトレキサートの一定量を経口、経腸、又は吸入によって投与 すること； ここで上記組成物及びメトトレキサートの量は、上記疾患と結合した自己免 疫応答を抑制するための組み合わせにおいて有効とされる、 を備える方法。 １６． 上記組成物が、ミエリンを含む請求項１５記載の方法。 １７． 上記組成物と上記メトトレキサートが経口的に投与される請求項１５記 載の方法。 １８． 上記組成物と上記メトトレキサートが実質的に同時に投与される請求項 １７記載の方法。 １９． 上記組成物が、ウシミエリンである請求項１８記載の方法。 ２０． 自己免疫疾患の治療方法であり： （ａ）自己抗原を粘膜に投与すること；及び （ｂ）メトトレキサートを経口、経腸、又は非経口的に投与すること； ここで上記自己抗原及びメトトレキサートの量は、上記疾患と結合した自己免 疫応答を抑制するための組み合わせにおいて有効とされる、 を備える方法。 ２１． 上記疾患が、重症筋無力症であり、上記自己抗原が、アセチルコリンレ セプターと熱ショックタンパク質からなる群から選択される請求項２０の方法。 ２２． 自己免疫疾患を治療するための経口又は経腸投与用の製薬製剤であり、 上記製剤は、メトトレキサートとバイスタンダー抗原を含み、上記バイスタンダ ー抗原とメトトレキサートの量は、上記疾患と結合した自己免疫応答を抑制する ための組み合わせにおいて有効とされる、製薬製剤。 ２３． 自己免疫疾患を治療するための経口又は経腸投与用の製薬製剤であり、 上記製剤は、メトトレキサートと自己抗原を含み、上記自己抗原とメトトレキサ ートの量は、上記疾患と結合した自己免疫応答を抑制するための組み合わせにお いて有効とされる、製薬製剤。[Claims] 1. (A) administering the bystander antigen to the mucosa; and         (B) administering methotrexate orally, enterally or parenterally thing;         Here, the amounts of the above-mentioned bystander antigen and methotrexate are Effective in combination to suppress autoimmune responses associated with disease , A method for treating an autoimmune disease, comprising: 2. The bystander antigen and the methotrexate are each administered alone. Compared to the suppression effect achieved by 2. The method of claim 1, wherein the method is more effective. 3. The claim wherein the bystander antigen is administered orally, enterally, or by inhalation. The method of claim 1. 4. 2. The method of claim 1, wherein said methotrexate is administered parenterally. 5. 2. The method of claim 1, wherein said methotrexate is administered orally. 6. The method according to claim 1, wherein the disease is multiple sclerosis. 7. The bystander antigen is myelin basic protein (MBP), protein Olipid protein (PLP), myelin-linked glycoprotein (MAG), myeri Oligodendrocyte glycoprotein (MOG) heat shock protein; and 7. The method of claim 6, wherein the method is selected from the group consisting of autoimmune suppressive fragments thereof. 8. 7. The method according to claim 6, wherein said bystander antigen is myelin. 9. The disease is rheumatoid arthritis, and the bystander antigen is Type I collagen, type II collagen, type III collagen and autoimmune suppression thereof The method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of fragments. 10. The disease is of type I diabetes and the bystander is -Antigen is glucagon, insulin, glutamate decarboxylase, heat shock protein Claims selected from the group consisting of protein and autoimmune suppressive fragments thereof. The method of claim 1. 11. The disease is uveal retinitis, and the bystander antigen is S -Antigen, interphotoreceptor retinoid binding protein (IRBP), and 2. The method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of autoimmune suppressive fragments thereof. . 12. The bystander antigen and the methotrexate are administered substantially simultaneously. The method of claim 1 provided. 13. The above-mentioned disease is multiple sclerosis, and a composition comprising MBP and methotrexate. 2. The method of claim 1, comprising administering the substance orally. 14． 2. The method of claim 1, wherein said autoimmune disease is T cell mediated. 15. Treatment methods for multiple sclerosis are:         (A) An aliquot of the composition containing MBP is administered orally, enterally, or by inhalation Giving; and         (B) A certain amount of methotrexate is administered orally, enterally, or by inhalation To do;     Here, the amount of the composition and methotrexate is determined by the amount of Validated in combination to suppress epidemic response, A method comprising: 16. 17. The method of claim 15, wherein said composition comprises myelin. 17． 16. The composition of claim 15, wherein the composition and the methotrexate are administered orally. The method described. 18. Wherein the composition and the methotrexate are administered substantially simultaneously. The method of claim 17. 19. 19. The method of claim 18, wherein said composition is bovine myelin. 20. Methods for treating autoimmune diseases are:         (A) administering the autoantigen to the mucosa; and         (B) administering methotrexate orally, enterally, or parenterally;   Here, the amount of the self antigen and methotrexate is determined by the Validated in combination to suppress epidemic response, A method comprising: 21. The disease is myasthenia gravis, and the autoantigen is acetylcholine receptor. 21. The method of claim 20, wherein the method is selected from the group consisting of sceptors and heat shock proteins. 22. A pharmaceutical preparation for oral or enteral administration for treating an autoimmune disease, The formulation comprises methotrexate and a bystander antigen, wherein the bystander is -The amount of antigen and methotrexate suppresses the autoimmune response associated with the disease Pharmaceutical formulations that are effective in combinations for 23. A pharmaceutical preparation for oral or enteral administration for treating an autoimmune disease, The formulation comprises methotrexate and an autoantigen, wherein the autoantigen and methotrexate The amount of the salt in the combination to suppress the autoimmune response associated with the disease Pharmaceutical preparations that are effective.
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