JP2001511007A

JP2001511007A - 低温誘発性甘味増加の減少を伴うαグルカンＬ−タイプまたはＨ−タイプ塊茎ホスホリラーゼのレベルの低下したトランスジェニックポテト

Info

Publication number: JP2001511007A
Application number: JP53344998A
Authority: JP
Inventors: マイケルカウチュックローレンス; ディビットアームストロングジョン; ロボーグリンチダーモット; リチャードノウレスノーマン
Original assignee: Agriculture and Agri Food Canada AAFC
Current assignee: Agriculture and Agri Food Canada AAFC
Priority date: 1997-02-10
Filing date: 1998-02-05
Publication date: 2001-08-07
Also published as: PL334962A1; AR011121A1; AU5849398A; CA2275885C; AU724942B2; WO1998035051A1; NZ336766A; CN1246894A; CA2275885A1; BR9807214A; CN1113143C; EP1009839A1; CN1300338A; HUP0000542A2; HUP0000542A3

Abstract

(57)【要約】ポテト塊茎中のαグルカンＬ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＬＴＰ）またはαグルカンＨ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＨＴＰ）が低レベルを示すポテト植物を提供する。ＧＬＴＰまたはＧＨＴＰ酵素活性の低下したポテト塊茎におけるデンプンから糖への変換は、特に７℃を下回る温度で貯蔵した場合に減少する。より低温で貯蔵することによりポテトの低温−誘発性の甘味増加が減少し、その結果休眠期間の延長、病気の発生率の低下、および保存期間の長期化が可能となる。ＧＬＴＰまたはＧＨＴＰ酵素活性の低下した塊茎を産生するポテト植物の製造方法も提供する。ポテト塊茎中のＧＬＴＰまたはＧＨＴＰ活性の低下は、相同アンチセンスＲＮＡによる遺伝子発現の抑圧、共抑圧、サイレンシング配列の制御、化学薬品およびプロテインインヒビターの使用、またはデンプンとの親和性や活性の低下したＧＬＴＰまたはＧＨＴＰ変異体獲得のための位置指定突然変異誘発または選択的対立遺伝子の単離といった技術により達成できる。

Description

【発明の詳細な説明】低温誘発性甘味増加の減少を伴うαグルカンＬ−タイプまたはＨ−タイプ塊茎ホスホリラーゼのレベルの低下したトランスジェニックポテト発明の属する技術分野本発明は、ポテト植物中のαグルカンＬ−タイプ塊茎ホスホリラーゼの酵素活性またはαグルカンＨ−タイプ塊茎ホスホリラーゼの酵素活性のレベル低下による、ポテトへの糖蓄積の阻害に関する。発明の背景植物のストレスは、ポテトの塊茎(Solanum tuberosum)の病気、環境、およびを貯蔵をはじめとする、塊茎の質の主要決定因子に相当する様々なファクターによって引き起こされる。収穫から発芽までの休眠期間中に上質なポテトを保持するのは、困難なことである。加工用のポテトは通常７〜１２℃で貯蔵される。２〜６℃の低温貯蔵は、７〜１２℃の貯蔵と比較して、呼吸、水分損失、微生物感染、電熱費、および化学的発芽抑制剤の必要性が減少するため、非常に優れた長期貯蔵が可能となる(Burton,1989)。しかし低温は、低温誘発性の甘味を引き出し、結果的に高レベルとなった糖が、揚げ物製品に好ましくない褐色または黒色をもたらす(Coffin等，1987，Weaver等，1987)。蓄積性の糖には主として、グルコース、フルクトース、およびスクロースがある。揚げ物のような、メイラード反応を介する様々な調理過程において、加熱時には、まず最初にグルコースおよびフルクトース（還元糖）が遊離アミノ基と反応し、褐色色素を生成する(Burton，1989，Shallenberger等，1959)。スクロースは、カラメル化および焦化するまで揚げると黒い着色を形成する。理想的な還元糖の含有量は通常、生の塊茎重量の０.１％であり、上限は０.３３％と考えられており、それより高レベルの還元糖では褐色および黒色色素形成を十分に惹起し、その結果好ましくない揚げ物製品となる（DaviesおよびViola，1992）。より高温（７〜１２℃）の貯蔵では還元糖の蓄積速度を遅延できるものの、微生物の感染および発芽抑制剤の使用の必要性を助長する。化学薬品の使用に関連した環境および健康へ負の危険性、殺虫剤耐性の病原菌の発生、公用される発芽抑制剤の使用が近い内に禁止されるであろう事実から、ストレスおよび化学薬品未使用の低温貯蔵に抵抗性で、還元糖の蓄積を示さず、より優れたデンプン保持能を有するポテト種の必要性が生じる。植物細胞内における糖質代謝は複雑な過程である。多くの異なる酵素過程の働きが、低温貯蔵中の還元糖の蓄積に対し潜在的な影響を及ぼす。例えば、デンプンの分解阻害は、遊離糖の蓄積を低下させる。還元糖を利用したデンプンの再合成、解糖および呼吸を介した糖の除去、またはメイラード反応に関与しない別の形への糖の変換のようなその他の手段でも、糖の含有量の低下によりポテトの低温貯蔵特性を強化できる。しかし多くの酵素過程は可逆的であり、かつ糖質代謝に関わる酵素の多くは、その働きが明らかにされていない。望ましい結果をもたらし、低温で機能を獲得し、かつ生産、加工、および消費段階で求められる製品の質を保持できる酵素を同定するための努力が続けられている。ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）が低温−誘発性の甘味をもたらすのに重要な役割を果たしていることが示唆された(KrugerおよびHammond，1998，ap Rees 等，1998，Dixon等，1981，Claassen等，1991)。レッセ(Resse)等(1998)は、低温処理が糖質代謝に関する種々の経路に不均化効果をもたらし、中でも、解糖はＰＦＫの低温−感受性により厳しく抑制されることを示唆した。ＰＦＫの活性が減少すると、引き続き、スクロース産生のためのヘキソース−リン酸塩の利用度の上昇が誘導される。ヨーロッパ特許明細書第０４３８９０４号(Burrell等,7月 31日,1991)には、ＰＦＫ活性の上昇が、解糖およびその他の代謝を介したヘキソースの除去により、貯蔵期間中の糖の蓄積を減少させることについての記載がある。大腸菌（E.coli）由来ＰＫＦ酵素をポテトの塊茎に発現させたが、塊茎中のＰＦＫ活性の上昇およびスクロースの含有量の低下を述べた報告書は収穫時に分析したものである。しかし、ピロホスフェート：すなわちフルクトース６−ホスフェートホスホトランスフェラーゼ（ＰＦＰ）が低温でも活性を保有していることが確認された(Claassen等,1991)。ＰＦＰおよびＰＦＫの二つの酵素は同一反応系を触媒するので、ＰＦＰ活性はＰＦＫと同様にして解糖のためにフルクトース６−ホスフェートを供給できる。それゆえ、ポテト塊茎の低温貯蔵の質を向上するための、この理論の有効性は疑わしいままである。さらに、解糖およびその他の代謝を介した糖の除去は、呼吸による有価の乾燥物質を結果的に喪失させるため、ポテト塊茎の貯蔵特性を増強する手段として有利とは言えない。ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＤＰＧＰＰ）もまた、甘味の低温− 誘発過程において重要な役割を果たすことが示唆されている。国際特許明細書第ＷＯ９４２８１４９号(Barry,等,5月18日，1994出願)には、ＡＤＰＧＰＰ活性が増加すると、還元糖を利用したデンプンの再合成により貯蔵期間中の糖の蓄積が軽減することについての記載がある。大腸菌(E.Coli)由来ＡＤＰＧＰＰ酵素を低温−誘発性プロモーターの制御下にポテトの塊茎中に発現させたが、この報告書は、収穫時および低温貯蔵後に分析されたＡＤＰＧＰＰ活性の増加および減少した還元糖の含有量について述べたものである。しかしながら、この理論ではデンプンの異化を除くことなく、デンプンの再合成率が増加すると見なしている。このように、解糖および呼吸を通じた糖の異化が起こり、デンプンへの再構築は制限される。ＡＤＰＧＰＰのアップレギュレーションは、呼吸による有価の乾燥物質を結果的に喪失させるため、ポテトの塊茎の貯蔵特性を増強する手段として有利とは言えない。他方、デンプンの異化作用減少を伴う手段は乾燥物質を保持するので有利である。デンプンの分解には、α−アミラーゼ（エンドアミラーゼ）、β−アミラーゼ（エキソアミラーゼ）、アミログルコシダーゼ、およびα−グルカンホスホリラーゼ（デンプンホスホリラーゼ）を含有する数種類の酵素が関与すると信じられている。デンプンの異化速度の減少により、還元糖の蓄積は回避されるとともに、解糖およびその他の代謝による糖の除去を最低限に抑えることができる。３種類の異なるαグルカンホスホリラーゼのアイソザイムが記載されている。塊茎Ｌ−タイプα１,４グルカンホスホリラーゼ(EC 2.4.1.1)アイソザイム（ＧＬＴＰ）(NakanoおよびFukui，1986)はグリコーゲンのような多分枝鎖グルカンに低親和性を示し、アミロプラスト中に局在する。このモノマーは９１６個のアミノ酸を含有し、その配列をうさぎの筋肉および大腸菌由来ホスホリラーゼと比較すると、それぞれ５１％および４０％という高レベルのアミノ酸相同性を示す。ＧＬＴＰ遺伝子のヌクレオチド配列およびＧＬＴＰ酵素のアミノ酸配列を、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：１およびＳＥＱＩＤＮＯ：２に示す。Ｈ−タイプ塊茎α−グルカンホスホリラーゼアイソザイムＨ（ＧＨＴＰ）(Mori等,1991)はグリコーゲンに高親和性を示し、細胞質に局在する。この遺伝子は８３８個のアミノ酸をコードし、塊茎Ｌ−タイプホスホリラーゼと６３％の相同性を示すが、Ｌ−タイプホスホリラーゼで確認される７８残基分の挿入および５０残基分のアミノ末端伸長が欠失している。ＧＨＴＰ遺伝子のヌクレオチド配列およびＧＨＴＰ酵素のアミノ酸配列を、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：３およびＳＥＱＩＤＮＯ：４に示す。三種類目のアイソザイムは、９７４個のアミノ酸から成り、塊茎Ｌ−タイプホスホリラーゼのポリペプチドのほとんどと、８１％の同一性をもって高い相同性を示す。しかし、トランジットペプチドおよび挿入配列を含む領域はかなりの相違が認められる。塊茎Ｌ−タイプホスホリラーゼのｍＲＮＡがポテトの塊茎に主に分布し、葉組織にはわずかしか分布しないのと異なり、このアイソザイムのｍＲＮＡはポテトの葉および塊茎に等しく分布するため、このアイソザイムを葉Ｌ−タイプホスホリラーゼと呼ぶ。塊茎Ｌ−タイプホスホリラーゼは主として塊茎中に存在し、葉Ｌ−タイプホスホリラーゼは葉中により多く存在する(Sonnewald等，1995)。葉Ｌ−タイプホスホリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列および葉Ｌ−タイプホスホリラーゼ酵素のアミノ酸配列を、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：５およびＳＥＱＩＤＮＯ：６に示す。様々なデンプン分解酵素の役割は明らかにされていないが、矛盾する結果に対してかなりの議論が起きている。例えば、葉Ｌ−タイプホスホリラーゼ(Sonnewa ld等,1995)の発現を抑制してもデンプンの蓄積には大した影響がない。ソネワルド(Sonnewald)等(1995)は、葉Ｌ−タイプ遺伝子に特異的なアンチセンスＲＮＡの構成性発現が葉組織中のαグルカンホスホリラーゼＬ−タイプ活性を強く抑制するのに対し、ポテトの塊茎組織には影響を及ぼさなかったことを報告した。α グルカンホスホリラーゼ活性のアンチセンスによる抑圧がトランスジェニックポテト植物の葉へのデンプンの蓄積に殆ど影響を及ぼさなかったことから、筆者らはデンプン分解がホスホリラーゼに触媒されないと結論づけた。同定されたαグルカンホスホリラーゼのアイソザイム間において高レベルの配列相同性が認知されることから、Ｈ−タイプ（ＧＨＴＰ）およびＬ−タイプ（ＧＬＴＰ）塊茎アイソザイムに同様の負の応答が期待された。前記の見解から、繁殖期および周囲温度が特に７℃を下回るような低温での貯蔵期に、デンプンから糖への変換の抑制を示す塊茎を生産する、ポテト植物が依然として必要とされている。発明の要約本発明は意外にも、ポテト塊茎中のαグルカンＬ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＬＴＰ）またはαグルカンＨ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＨＴＰ）の酵素活性レベルの低下が、野生株ポテトと比較して、繁殖期および貯蔵期、特に１０℃を下回る温度での貯蔵、さらに特に４℃での貯蔵における塊茎への糖の蓄積を強く低下させることを見出した。特筆すべきは、塊茎における糖代謝の複雑性にもかかわらず、１種類の酵素の活性の低下が塊茎中への還元糖の蓄積に影響を及ぼすことである。本発明の発見はソネワルド等(1995)が報告している、葉Ｌ− タイプホスホリラーゼの発現低下が、ポテト植物の葉へのデンプンの蓄積に著しい影響を及ぼさなかったという前記の議論の存在においても、より一層驚異的なものである。本発明は非常に商業的な利益を提供する。低温−誘発性甘味増加が阻害された、または減少した塊茎は、ポテトの揚げ物製品に好ましくない黒ずみをもたらす還元糖を塊茎中で高レベルに産生することなく、より低温で貯蔵することができる。塊茎の低温貯蔵は、貯蔵期間の延長、呼吸抑制および発芽遅延による休眠期間延長および病気の発生率低下をもたらす。ポテト植物および塊茎中のＧＬＴＰまたはＧＨＴＰの活性低下は、これらに限定するわけではないが、ＧＬＴＰまたはＧＨＴＰｍＲＮＡのアンチセンスによる阻害、共抑制、野生株ＧＬＴＰまたはＧＨＴＰ遺伝子の部位特異的突然変異誘発、化学薬品またはプロテインによる阻害、または植物発芽プログラムなど、種々の公知の方法により達成できる。このように広い見地から、本発明は、非修飾ポテト植物が産生する塊茎と比較して、植物が産生する塊茎中に低レベルのαグルカンＬ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＬＴＰ）またはαグルカンＨ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＨＴＰ）を有する、修飾ポテト植物を提供する。より有利な実施形において本発明は、植物での転写時に内在性ＧＬＴＰ遺伝子またはＧＨＴＰ遺伝子の発現を阻害するＤＮＡ配列へ、使用可能に連結した植物プロモーター配列を有する発現カセットで形質転換したポテト植物を提供する。詳細については以後検討するが、前記のＤＮＡ配列は発現カセット中にセンスまたはアンチセンスのいずれの方向でも挿入できる。本発明のポテト植物はＧＬＴＰまたはＧＨＴＰいずれか一方の活性レベルを独立して低下させることも、ＧＬＴＰおよびＧＨＴＰの両方の活性レベルを低下させることも可能である。前記の議論ように、ポテト植物中のＧＬＴＰまたはＧＨＴＰ酵素の活性レベルの低下が、ポテト塊茎中への糖の蓄積を、特に１０℃を下回る温度で長期貯蔵した場合に、減少させることを見出した。それゆえ本発明は、ポテト植物中のＧＬＴＰまたはＧＨＴＰ活性レベルが低下したポテト植物が産生する塊茎における、還元糖の生成を減少させる方法でもある。より有利な実施形においては、植物での転写時に内在性ＧＬＴＰ遺伝子またはＧＨＴＰ遺伝子の発現を阻害するＤＮＡ配列へ、使用可能に連結した植物プロモーター配列を有する発現カセットのポテトへの導入を含む。前記のように、ＤＮＡ配列は発現カセット中にセンスまたはアンチセンスのいずれの方向でも挿入が可能である。詳細は実施例で記載するが、低温−貯蔵特性の向上が、本発明の方法により形質転換したポテトデジリー(Desiree)系統種で確認された。低温−貯蔵特性の向上を直接的に示す尺度として、収穫および低温−貯蔵後にポテト中で検出されるＧＬＴＰまたはＧＨＴＰの酵素活性レベルの低減がある。４℃で１８９日間貯蔵した植物の塊茎中におけるαグルカンホスホリラーゼ全活性を、μモルＮＡＤＰＨｍｇ^-1タンパク^-1ｈ^-1として測定し、それが同様の条件で貯蔵した非形質転換植物の塊茎中におけるαグルカンホスホリラーゼ全活性より７０％下回ることを特徴とする形質転換ポテトが開発されている。低温−貯蔵特性の向上を比較的直接的に示す尺度の他の例としては、低温−貯蔵後に検出されるポテトの甘味増加の減少がある。４℃で９１日間貯蔵した塊茎中のグルコースおよびフルクトース総濃度が、同様の条件で貯蔵した非形質転換植物の塊茎中のグルコースおよびフルクトース総濃度より３９％下回ることを特徴とする形質転換ポテトが開発されている。さらなる低温−貯蔵特性向上の尺度には、本発明の実質的利点を示すことにもなるが、加工段階（調理）におけるポテト片の黒ずみの軽減がある。前記のように、低温−貯蔵中のポテトへの糖の蓄積が揚げ物製品に対し好ましくない黒ずみをもたらす。揚げ物の黒ずみの減少は、揚げたポテト片の反射率、すなわちチップスコア、の測定により定量化できる。チップスコアの測定方法は後記する。４ ℃で１２４日間貯蔵した植物の塊茎のチップスコアが、同様の条件で貯蔵した非形質転換植物の塊茎のチップスコアを８９％上回ることを特徴とする形質転換ポテト系統種が、本発明により開発された。ポテト植物の塊茎中のＧＬＴＰおよび／またはＧＨＴＰ活性の低下により、低温−貯蔵時の糖の蓄積が阻害され、このことにより本発明は、同一栽培種野生株ポテトで可能な温度よりも低い温度での貯蔵を可能にする。前記のように、従来より低温でのポテトの貯蔵は、貯蔵期間の長期化、呼吸および発芽抑制による休眠期間の延長、病気の発現低下をもたらす。このような付加価値もまた低温−貯蔵特性の向上に寄与しており、慣用の技術により測定および定量が可能であることは、当業者に明らかである。図面の簡単な説明図面により本発明をより詳細に示す。図１ｐＢＩ１２１形質転換ベクターに挿入した塊茎Ｌ−タイプαグルカンホスホリラーゼアンチセンス配列を示す概略図である。図２ｐＢＩ１２１形質転換ベクターに挿入した塊茎Ｈ−タイプαグルカンホスホリラーゼアンチセンス配列を示す概略図である。図３３種の単離イソ型グルカンホスホリラーゼの基本構造を示す図である。トランジットペプチド（ＴＳ）および挿入配列（ＩＳ）はＬ−タイプホスホリラーゼに特徴的であり、Ｈ−タイプホスホリラーゼには見出されない。パーセントはイソ型間での核酸配列の相同性を示す。図４ポテト中の糖質相互変換の概略図である(Sowokinos 1990)。図５実施例で使用したアンチセンスＧＬＴＰ構造による標的領域においてポテト中で見出された３種のイソ型ホスホリラーゼのアミノ酸配列を比較した図である。印の付いたアミノ酸は同一アミノ酸である。一番上が葉Ｌ−タイプαグルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列であり（ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸２１〜２３８）、真ん中が塊茎Ｌ−タイプαグルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列であり（ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸４９〜２６６）、一番下が塊茎Ｈ−タイプαグルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列である（ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸４６〜２６４）。図６Ａおよび６Ｂ実施例で使用したアンチセンスＧＬＴＰ構造による標的領域においてポテト中で見出された３種のイソ型ホスホリラーゼのヌクレオチド配列を比較した図である。印の付いたヌクレオチドは同一である。一番上が葉Ｌ−タイプαグルカンホスホリラーゼのヌクレオチド配列であり（ＳＥＱＩＤＮＯ：５のヌクレオチド３８９〜１０４５）、真ん中が塊茎Ｌ−タイプαグルカンホスホリラーゼのヌクレオチド配列であり（ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸３３８〜９９３）、一番下が塊茎Ｈ−タイプαグルカンホスホリラーゼのヌクレオチド配列である（ＳＥＱＩＤＮＯ：３のヌクレオチド１４７〜８０５）。図７野生株および塊茎Ｌ−タイプαグルカンホスホリラーゼの形質転換株３、４、５および９のポテトの塊茎から単離したポリアデニル化ＲＮＡのノーザンブロットの結果を示す図である。ブロットには、塊茎Ｌ−タイプαグルカンホスホリラーゼに特異的な放射線標識プローブを使用した。図８野生株および塊茎Ｈ−タイプαグルカンホスホリラーゼの形質転換株１および２のポテトの塊茎から単離した総ＲＮＡのノーザンブロットの結果を示す図である。ブロットには、塊茎Ｈ−タイプαグルカンホスホリラーゼに特異的な放射線標識プローブを使用した。図９屋外で栽培し、続けて４℃で８６日間貯蔵した野生株（Ａ）および塊茎Ｌ−タイプαグルカンホスホリラーゼの形質転換株（Ｂ）ＡＴＬ１（Ｃ）ＡＴＬ２（Ｄ）ＡＴＬ３（Ｅ）ＡＴＬ５（Ｆ）ＡＴＬ９の揚げ物製品の図である（ＡＴＬとはアンチセンス塊茎Ｌ−タイプ形質転換を意味する）。図１０野生株の塊茎およびＬ−タイプイソ型アンチセンス構造の形質転換株の塊茎から抽出したα１,４グルカンホスホリラーゼのＬ−タイプおよびＨ−タイプイソ型の活性検出ゲルおよびウェスタンブロットを示した図である。図１１野生株の塊茎およびＨ−タイプイソ型アンチセンス構造の形質転換株の塊茎から抽出したα１,４グルカンホスホリラーゼのＬ−タイプおよびＨ−タイプイソ型の活性検出ゲルおよびウェスタンブロットを示した図である。発明の詳細な説明未修飾のポテト植物から収穫した塊茎と比較して、植物の塊茎中に低レベルの αグルカンＬ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＬＴＰ）またはαグルカンＨ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＨＴＰ）活性を有するポテト植物を提供する。例にあげたケースでは、転写時に内在性ＧＬＴＰ遺伝子またはＧＨＴＰ遺伝子の発現を阻害するＤＮＡ配列へ、使用可能に植物プロモーター配列を連結した発現カセットを用いてポテト植物を形質転換することにより、αグルカンホスホリラーゼ活性の低下を獲得している。例にあげたケースでは、このＤＮＡ配列は発現カセット中にアンチセンスの方向で挿入されているが、ＤＮＡ配列をアンチセンスまたはセンスの方向のいずれで発現カセット中に挿入しても、αグルカンホスホリラーゼ活性の低下を獲得することが可能である。１.相同依存性サイレンシング（Silencing）センスおよびアンチセンス遺伝子断片を用いた遺伝子発現の制御は標準的な実験手段であり、文献においても公知である。アンチセンスおよびセンスによる抑圧は、いずれも遺伝子配列の相同性に依存した現象で、「相同依存性サイレンシング」現象として記載される。１９９６年に公表された化学研究文書においてトランスジェニック植物の相同依存性サイレンシングに関する数百の報告がある。相同依存性サイレンシングの根本的な作用機序の詳細は知られていないが、この現象の特徴について、様々な植物の遺伝子で研究されており、該研究の実質は広範囲に渡り検討されている(M ayerおよびSaedler 1996，MatzkeおよびMatzke 1995，Jorgensen 1995，Weintra ub 1990，Van der Krol等1988)。相同依存性サイレンシングは、多くの内在性遺伝子の活性の制御に利用できる一般的現象と考えられる。相同配列の導入後に発現低下が認められる遺伝子群の例として、ジヒドロフラバノールリダクターゼ(V an der Krol 1990)、ポリガラクツロニダーゼ(Smith等1990)、フィトエンシンターゼ(FrayおよびGrierson 1993)、ペクチンエステラーゼ(Seymour等1993)、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ(De Carvalho等1992)、β−１,３−グルカナーゼ(Hart等1992)、キチナーゼ(Dorlhac等1994)、ニトレートリダクターゼ(Napo li等1990)、およびカルコンシンターゼがある（１４）。ポテト葉巻きウイルス（leafroll virus）のコートタンパク遺伝子のセンスまたはアンチセンス構造のいずれかを導入したルセットバーバンク(Russet Burbank)ポテト植物の形質転換体は、ポテト葉巻きウイルスの感染に対し、抵抗性を獲得することが報告された（Kawchunk等1991）。相同センスまたはアンチセンス配列の移入は、通常、内在性遺伝子の発現の低下した形質転換体を生成する。詳細は実施例で述べるが、ＧＬＴＰまたはＧＨＴＰの発現低下を示す表現型を有する形質転換ポテト植物を容易に同定できる。アンチセンスによる抑圧技術において、遺伝子構造または発現カセットをアセンブリーし、植物細胞への導入により標的遺伝子が産生したｍＲＮＡに対する相補的配列を有するＲＮＡを発現する。相補的ＲＮＡ配列は二重らせんを形成し、タンパクへの翻訳を阻害すると提唱される。センスおよびアンチセンス両者による阻害の基本理論はAntisense Research and Applications(CRC Press，1993)頁１２５〜１４８などの文献に記載がある。この相補配列は標的遺伝子の全配列に相当する長さを有するが、一般的には断片で充分であり、操作にもより便利である。例えば、キャノン(Cannon)等（1990）は、遺伝子阻害の獲得には４１塩基対のアンチセンス配列で充分であることを示している。アメリカ特許明細書第５５８５５４５号（Bennett等12月17日，1996）には僅か２０塩基対のアンチセンス配列による遺伝子阻害について記載されている。詳細な説明および請求項を含む特許文献中にも、有機体にアンチセンス配列を導入して遺伝子発現を抑圧する方法に関する多くの例があり、例えば、アメリカ特許明細書第５５４５８１５号（ Fischer等8月13,1996）、アメリカ特許明細書第５３８７７５７号（Bridges等2月7,1995）を挙げることもできる。センス配列相同依存性サイレンシングはアンチセンスによる抑圧と類似の用法で実施するが、ただし、ヌクレオチド配列を正規のセンスの方向で発現カセット中に挿入する。アメリカ特許明細書第５０３４３２３号、第５２３１０２０号および第５２８３１８４号のように多くの特許で、遺伝子発現抑圧を誘導するセンス配列導入について記載されている。センス−抑圧およびアンチセンス−抑圧のいずれの相同依存性サイレンシングも形も、本発明のＧＬＴＰまたはＧＨＴＰのダウンレギュレーションの達成に有効である。両技術が遺伝子抑圧に等しく有効な方法であることは従来技術において認識されている。例えば、アメリカ特許明細書第５５８５５４５号（Bennett 等,12月17日,1996）およびアメリカ特許明細書第５４５１５１４号（Boudet等,9 月15日,1995）のいずれも、遺伝子発現の阻害方法またはセンス−抑圧およびアンチセンス−抑圧技術による遺伝子発現抑圧法に有効な組み替えＤＮＡについて述べている。２.塊茎中のＧＨＴＰおよび／またはＧＬＴＰ活性を減少させるためのその他の技術相同依存性サイレンシングが、本発明の、ポテト植物中ＧＬＴＰまたはＧＨＴＰのダウンレギュレーションに有利な技術であるにもかかわらず、当業者が本発明に適用可能であると判断するであろう特異遺伝子産物の活性を減少させるのに有効で公知の手法が他にもある。関連遺伝子またはプロモーターの植物への挿入は、相同内在性遺伝子転写産物の速やかな代謝を誘導するが、この過程は共−抑制と呼ばれ、アンチセンスＲＮＡ阻害が担う作用機序と多くの類似点を有すると信じられている（Jorgensen,1995;BrusslanおよびTobin,1995）。ＤＮＡの様々な調節配列を改変したり（プロモーター、ポリアデニル酸シグナル、転写後プロセッシングサイト）、特異的ｍＲＮＡの発現レベルの改変に利用したり（エンハンサー、サイレンサー）できる。遺伝子およびその遺伝子がコードするタンパク質の発現を抑制する別の方法には、標的ｍＲＮＡを特異的に切断するように設計したリボザイムを使用して完全な機能を有するタンパク質の産生を不可能にする方法がある（HasseloffおよびGerlach,1998）。特異的性質を決定するのに重要であると考えられる酵素の、自然対立遺伝子の同定または遺伝子操作による対立遺伝子の作製により活性レベルを改変したり、それを古典増殖プログラムに利用することが可能である（OritzおよびHuaman,1994）。位置指定突然変異誘発はしばしば、同定された遺伝子産物の活性の修飾に利用される。ホスホリラーゼ酵素の構造コード配列は大腸菌またはその他の好適な宿主内で突然変異を誘起し、デンプンの加リン酸分解の減少に関してスクリーニングされる。この他に、親和性および／または特異活性の減少を伴うホスホリラーゼの自然対立遺伝子が同定されている。さらに、様々なインヒビターを用いて特定の酵素活性を改変することが可能である。これらの方法は慣用であり、サンブルック (Sambrook)等の著書のようなテキストにも記載がある。３.ＧＬＴＰおよびＧＨＴＰ酵素の変異および相同依存性サイレンシングに使用する配列発明の背景中で、およびより詳細にナカノ（Nakano）等（1986）、モリ(Mori) 等（1991）、およびソネワルド等（1990）が述べるように、ポテト植物中に存在する３種類のαグルカンホスホリラーゼアイソザイムが知られている。本発明はＧＬＴＰおよび／またはＧＨＴＰアイソザイムのダウンレギュレーションに関する。全ての既知の商業用ポテト変種のＧＬＴＰおよびＧＨＴＰ遺伝子が本質的に同一だと信じられている反面、本発明の原理および技術が、記載のＧＬＴＰおよびＧＨＴＰ酵素のデンプン代謝酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはサブ配列の変異全長を有するポテト植物に効果的であると期待されている。明細書および請求項で使用する”ＧＬＴＰ”および”ＧＨＴＰ”の用語は、前記の変異株を包括するものとする。前記の変異株は、例示したものとは異なるが、コドンの縮重のために同一のポリペプチドをコードするか、または、ＳＥＱＩＤＮＯ２および４に記載のＧＬＴＰおよびＧＨＴＰアミノ酸配列を基に作製した抗体により認知することが可能なタンパクをコードする、ＧＬＴＰおよびＧＨＴＰヌクレオチド配列の変異を含む。また当業者は、ポテト植物ＧＬＴＰおよび／またはＧＨＴＰの相同依存性サイレンシングが、例示した意外のセンスまたはアンチセンス配列により達成できることを認識している。まず、アンチセンスが由来するＧＬＴＰまたはＧＨＴＰのｃＤＮＡ配列領域は必須ではない。次に、前記のように、使用するアンチセンスの長さはかなり広く選択できる。さらにセンスまたはアンチセンス配列は、抑圧する標的ＧＬＴＰまたはＧＨＴＰ遺伝子に限定する必要はない。実施例中に記載するように、本発明により、ＧＨＴＰ遺伝子由来のアンチセンスＤＮＡ配列によるポテト植物形質転換体が、ＧＨＴＰ遺伝子活性の抑圧のみを実質的に示すだけでなく、ＧＬＴＰ遺伝子活性にもある程度の抑圧を示すことが見出された。ＧＨＴＰおよびＧＬＴＰ遺伝子のアンチセンス配列は５６.８％の相同性を示す。ＧＬＴＰアンチセンス配列およびソネワルド等記載（1990）の葉タイプαグルカンホスホリラーゼ配列との配列の同一性は７１.３％である。これまでの研究で、ポテト植物をＧＬＴＰ遺伝子由来のアンチセンスＤＮＡで形質転換させた場合には、類似の交差ダウンレギュレーション現象を認めなかった。それでもやはり、標的ＧＬＴＰ配列と約５７％の同一性を示すアンチセンス配列がＧＬＴＰ活性を抑制したので、これらの結果から標的内在性αグルカンホスホリラーゼ遺伝子および組み替えＤＮＡ間に配列の絶対的同一性が必須ではないことは明らかである。従って、当業者は、ここで例示した以外の、および標的内在性ＧＬＴＰまたはＧＨＴＰ遺伝子と絶対的な配列の同一性を有する配列以外の、センスまたはアンチセンス配列が、ポテト植物細胞への導入時に内在性ＧＬＴＰまたはＧＨＴＰ遺伝子を効果的に抑圧することを認識するであろう。有効なセンスまたはアンチセンス配列は例示のアンチセンス配列と異なるかもしれないし、保存アミノ酸置換により、または比較の目的で並列した配列の一部以上で対応するヌクレオチドまたはアミノ酸の割合が異なるために、内在性ＧＨＴＰまたはＧＬＴＰ遺伝子配列由来の配列と異なるかもしれない。アメリカ特許明細書第５５８５５４５号（Bennett等,12月17日,1996）は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する配列の同一性の比較、保存アミノ酸置換、および配列の相同性率を示すハイブリダイゼーション条件などの技術に関する有益な議論を提供する。論議の関連部分をここに要約する。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列の同一性の割合は、比較枠（wind ow）に至適に並列した２つの配列を比較することで決定されるが、２つの配列を至適に並列した状態で、対照配列（添加と欠失を含まない）と比較すると、比較枠中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド部分には、添加または欠失（例；ギャップ遺伝子）が存在する。割合の計算は；（ａ）対応する位置の数の確認のために、両配列中に存在する同一核酸塩基またはアミノ酸残基の数を決定する；（ｂ）対応する位置の数を比較枠中の全位置の数で割る；（ｃ）配列の同一性の確認のため、結果に１００をかける。比較のための配列の至適な並列方法は、既知アルゴリズム（例；ウィスコンシン遺伝子ソフトウェアパッケージ中のＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、遺伝子コンピューターグループ（ＧＣＧ）575 Sience D r.,Madison,WI、または生化学情報国際センターから入手したＢｌａｓｔＮおよびＢｌａｓｔＸ）のコンピューター化処理、または検査により導かれた。前記の本質的に類似の配列を有するポリペプチドは、残基位置の非対応以外では、保存アミノ酸の変化により相違することがある。保存アミノ酸置換とは、類似側鎖を有する残基の相互交換可能性をいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；水酸化−脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド−含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；硫黄−含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。ヌクレオチド配列が本質的に同一であることを示す別のものは、２分子がストリンジェントな条件下に特異的にハイブリダイズする場合である。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、状況に応じて変化する。通常、ストリンジェントな条件では、一定のイオン強度およびｐＨにおける特異配列の融点（Ｔｍ）より、約１０℃下回った温度を選択する。Ｔｍ（一定のイオン強度およびｐＨの条件下）は、標的配列の５０％が完全に対応するプローブとハイブリダイズする温度である。プローブの長さおよび塩基配列の両方と相関を成すハイブリッドのＴｍをサンブルック等（1989）の記載を基に算出できる。特に、サザンブロット法のプロトコールでは、ストリンジェントな条件として、０.２ＸＳＳＣを用いた６５℃の洗浄がある。オリゴヌクレオチドプローブの場合、洗浄条件は、特に、６ＸＳＳＣで約４２℃が有利である。４.一般的方法様々な方法が、植物細胞中に外来ＤＮＡ配列を導入および発現させるのに有効である。例えば、アンチセンスαグルカンホスホリラーゼｃＤＮＡの合成およびそれらの植物細胞への導入に関する手順は：（１）ポテト植物からのｍＲＮＡの単離およびｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成；（２）要求配列に関するｃＤＮＡのスクリーニング；（３）ホスホリラーゼ遺伝子発現のため、要求ｃＤＮＡへプロモーター配列を逆方向で連結；（４）好適な宿主植物細胞の形質転換；および（５）配列を逆転写した細胞の選択および再生、を含む。例示のケースでは、植物での転写時に内在性ＧＬＴＰ遺伝子またはＧＨＴＰ遺伝子の発現を阻害するＤＮＡ配列へ植物プロモーター配列を使用可能に連結した発現カセットの構築に、ポテトＧＬＴＰおよびＧＨＴＰ遺伝子由来ＤＮＡを使用する。ポテト植物の発芽した茎外植体へのＤＮＡの遺伝媒体としてAgrobacteriu m tumefaciensを利用する。形質転換した外植体から再生した植物は、酵素活性を阻害するアンチセンスＤＮＡを転写する。ここに記載した組み替えＤＮＡ技術は、従来技術で公知の標準的実験室技術であり、サンブルック等（1989）のような標準的な参考文献に記載されている。一般に、ＤＮＡライゲース、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼおよびそれに類似の酵素を含む酵素反応は、製造者の仕様書に従って実施される。５.ＧＨＴＰｃＤＮＡおよびＧＬＴＰｃＤＮＡの合成ｃＤＮＡは、単離したポテト塊茎ｍＲＮＡから逆転写により合成する。プライマーをｍＲＮＡにアニーリングし、逆転写酵素による伸長が可能なように３’末端をフリーにしておく。この酵素は、鋳型ｍＲＮＡと相補的な塩基と対を成すことによって、相補的ｃＤＮＡ鎖と塩基対を形成したＲＮＡ鋳型鎖を含むハイブリッド分子を形成することにより通常の５’−３’方向の伸長に働く。最初のｍＲＮＡを切断後、ＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖ＤＮＡを合成し、一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する。ＤＮＡ増幅後、大腸菌内で増殖させるため、二本鎖ｃＤＮＡをベクターに挿入する。特に発現ベクターを使用した場合、要求のｃＤＮＡを内在したクローンの同定には、核酸のハイブリダイゼーションまたはコードタンパクの免疫学的検出のいづれかを実施する。例にあげたケースでは、ＧＬＴＰおよびＧＨＴＰ遺伝子のＤＮＡ配列が既知で、同様に好適なプライマー配列も既知であるため、方法は簡略化できる（Bris son等,1990；Fukui等,1991）。このプライマーをＧＬＴＰおよびＧＨＴＰ遺伝子内のハイブリダイズに使用する。こうして、さらなる分析を実施することなく、増幅されたｃＤＮＡの合成物が、ＧＬＴＰおよびＧＨＴＰ遺伝子に相当する部分を有することが期待される。ホスホリラーゼＤＮＡの挿入部を保持するｐＵＣ１９プラスミドで形質転換した大腸菌を色選択により判定した。挿入部を保持していないプラスミドで形質転換した特定の大腸菌株はブルーコロニーとなる。挿入部を保持するｐブルースクリプト(pBluescript)プラスミドでの形質転換株はホワイトコロニーとなる。形質転換大腸菌から単離したプラスミドはホスホリラーゼ挿入部の配列の確認のためにシークエンスを実施した。６.ベクター構築ポテト塊茎中のＧＬＴＰおよび／またはＧＨＴＰの発現を阻害するため、ポテト植物の形質転換用発現ベクター中の発現カセットに合成ｃＤＮＡをアンチセンスまたはセンス方向で挿入できる。例示のケースでは、アンチセンスによる抑圧が挙げられており、要求の組み替えベクターは植物中のアンチセンスｃＤＮＡの転写開始を設計した発現カセットを含む。ベクターによるバクテリアまたはファージ宿主中でのクローン化のために、その他の配列も含有する。ベクターは、広い範囲の宿主に存在する原核生物の複製起点を有利に含有する。選択マーカーも、バクテリア細胞が要求に応じて構築されているかを識別するために含有する必要がある。好適な原核生物の選択マーカーは、アンピシリンのような抗生物質に対する耐性を含む。他の機能をコードする別のＤＮＡ配列もこのベクターには存在していてよく、このことは従来技術で公知である。例えばAgrobacteriumの形質転換の場合、Ｔ − ＤＮＡ配列をも、その後の植物染色体への移入のために含有する。植物中での発現のために組み替え発現カセットは、要求の配列に加え、植物プロモーター領域、転写開始点（転写されるべき配列がこれを欠失している場合）、および転写終結配列を含む。先在のベクター（pre−existing vector）への挿入を容易にする目的で、カセットの５’および３’末端に特有の制限酵素部位を含有する。真核生物の遺伝子発現を制御する配列は従来技術において公知である。ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写は、プロモーターと称されるＤＮＡ領域により制御されている。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡの連結を促すシグナルを送る塩基配列を有し、ＤＮＡ鎖の一方を鋳型としてｍＲＮＡの転写を開始し、相応する相補的ＲＮＡ鎖を形成する。プロモーター配列エレメントはＴＡＴＡボックス共通配列（ＴＡＴＡＡＴ）を含有し、これは通常、転写開始点の上流の２０〜３０塩基対である（通常転写開始点から見て−３０〜−２０塩基対を表す）。多くの場合、ＴＡＴＡボックスは正確な転写開始に必須である。ＴＡＴＡボックスは開始点に対して相対的に固定の位置を有する、唯一の上流プロモーターエレメントである。ＣＡＡＴボックス共通配列は−７５の位置に中心を有するが、開始点からかなりの距離があっても機能を果たしており、両方向性である。別の公知のプロモーターエレメントは−９０の位置にあるＧＣボックスで、共通配列ＧＧＧＣＧＧを有する。マルチコピーおよび両方向性が見出される。組織特異性、環境シグナル応答、または転写の最大効率を付与するその他の配列もプロモーター領域内に見出されている。このような配列はしばしば、転写開始部の大きさが４００塩基対を下回るものの、２０００塩基対を上回って伸長されてもよい。異種プロモーター／構造遺伝子の組合せにおいて、プロモーターは異種転写開始点と自然の状態での転写開始点とから、だいたい等距離に位置するのが有利である。しかしこの距離は、プロモーター機能が欠失しない範囲である程度調整が可能である。発現カセットに使用されたこの特徴的なプロモーターは、本発明に必須ではない。植物細胞内での転写を誘導するプロモーターの多くが好適である。このプロモーターは構成性または誘導性のいずれでも良い。植物細胞内で活性を有するプロモーターの多くは文献に記載されている。これにはノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーターおよびオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（Agrobacterium tumefaciensの腫瘍−誘導プラスミド上で保持される）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓおよび３５Ｓのようなカウリモウイルス(Caulimovirus)プロモーター、フィグワートモザイクウイルス３５Ｓ−プロモーター、リブロース−１, ５−ビス−ホスフェートカルボキシラーゼ（ssRUBISCO,非常に豊富な植物ポリペプチド）の小サブユニット由来光−誘導プロモーター、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター、等が含まれる。これらの全てのプロモーターは、植物内で発現する多種類のＤＮＡ構造を構築するのに利用される；ＰＣＴＷＯ第８４０２９１３号を例として参照のこと。実施例ではＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを使用しているが、これは高活性でほとんどの組織中に構成的に発現する(Bevan等,1986)。ポテト塊茎ＡＤＰＧＰＰ遺伝子の大および小サブユニットを含む、塊茎−特異性または発現強化を伴う別の多くの遺伝子が知られている(Muller等,1990)。本発明に有効であると考えられるその他のプロモーターには、ポテト塊茎中に強化されてまたは特異的に発現するプロモーター、通常はデンプンの生合成または修飾に働く酵素遺伝子に関連するプロモーター、または異なる発現パターンを示す、例えば塊茎の発育期の異なる時期に発現するようなプロモーターが含まれる。これらのプロモーターの例には、顆粒−結合型およびその他のデンプン合成酵素、分枝酵素(Blennow等,1991; WO9214827;WO9211375)、不均化酵素（Takaha等,1993）、脱分枝酵素、アミラーゼ、デンプンホスホリラーゼ（Nakano等,1989;Mori等,199 1）、ペクチンエステラーゼ（Ebbelaar等,1993）、４０ｋＤａのグリコプロテイン；ユビキチン、アスパラギン酸プロテイナーゼインヒビター（Stukerlj等,199 0）、カルボキシペプチダーゼインヒビター、塊茎ポリフェノールオキシダーゼ（Shahar等,1992;遺伝子バンク登録番号Ｍ95196およびＭ95197）、推定トリプシンインヒビターおよびその他の塊茎ｃＤＮＡ（Stiekema等,1988）、およびアミラーゼおよびスポラミン(Yoshida等,1992;Ohta等,1991)の遺伝子に対するプロモーターを含む。効果的な終結を得るため、発現カセットにはプロモーター配列に加え、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含む必要がある。終結領域はプロモーター配列と同一の遺伝子または異なる遺伝子から得られる。実施例ではノパリンシンターゼＮＯＳ３'終結配列(Bevan等,1983)を使用した。構造遺伝子によりコードされたｍＲＮＡが効率的に翻訳される場合、ポリアデニル化配列も一般的に構築ベクターに添加される（AlberおよびKawasaki,1982) 。ポリアデニル化はｍＲＮＡの安定化に効果があると信じられている。ポリアデニル化配列はAgrobacteriumオクトピンシンターゼシグナル（Gielen等,1984）またはノパリンシンターゼシグナル（Depicker等,1982）を含有するがこれに限定するものではない。ベクターは通常、形質転換した植物細胞を培養中に同定できるように選択マーカーも含有する。多くの場合、マーカー遺伝子は抗生物質耐性をコードしている。これらのマーカーには、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、およびゲンタマイシン耐性がある。実施例のマーカー遺伝子はカナマイシン耐性を付与する。植物細胞を形質転換後、ベクターを含有するこれらの細胞は、特別な抗生物質を添加した培地で生育できるかどうかにより同定される。７.植物細胞の形質転換実施例のケースではポテト植物の発芽した茎外植体を、バイナリーベクターへ連結したアンチセンス配列を保持するAgrobacterum tumefaciensで感化させて形質転換したが、従来公知の直接形質転換技術を組み替えＤＮＡの移入に利用することも可能である。ベクターは植物細胞内へ直接微量注入できる。また、粒子のマトリクス内または粒子表面に関連する核酸を埋め込んだ小粒子を用い、核酸を高速弾動浸透法(bllistic penetrarion)により植物細胞内に導入できる。関連のＤＮＡを保持するミニセル、細胞またはリソソームのような脂質−表面体とプロトプラストの融合体を使用することも可能である。ＤＮＡは電気穿孔により植物細胞中に導入できるが、この場合植物のプロトプラストを発現カセットを保持するプラスミドの存在下に電気穿孔する。実施例では、直接形質転換法と対照を成すAgurobac terium tumefaciensを用いたベクターによる形質転換を利用する。Agurobacteri um tumefaciensはグラム陰性の土壌細菌で、双子葉植物にクラウンゴールとして知られる腫瘍を引き起こす。腫瘍の誘導はＴｉプラスミドとして知られる腫瘍− 誘導性プラスミドによって引き起こされる。Ｔｉプラスミドは感染植物中でオピン合成を誘導する。オピンはアグロバクテリアにより炭素および／または窒素源として利用される。細菌は植物細胞内には侵入せず、Ｔ−ＤＮＡと呼ばれる部分、すなわちＴｉプラスミドのみが移入されるが、これは植物ゲノム中に安定に組み込まれ、そこでオピン合成および植物細胞の形質転換に必須の機能を発現する。Ｔｉプラスミド上のＶｉｒ（有毒）遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡ領域の外側に存在するが、Ｔ−ＤＮＡの移入に必要である。しかし、このＶｉｒ領域は移入しない。事実、Ｖｉｒ領域がＴ−ＤＮＡの移入に必須であるにもかかわらず、物理的にＴ−ＤＮＡと結合する必要はなく、別のプラスミド上に存在しても良い。移入および組み込み機能を失わずにＴ−ＤＮＡの腫瘍−誘導部を妨害または削除すると、Ｔ−ＤＮＡの特定部位、特にＴ−ＤＮＡ境界領域をなおも保存し、発現するにもかかわらず、腫瘍細胞の特性を全て喪失した正常で健康な形質転換植物細胞を産生できる。それゆえ、疾患誘導性の遺伝子を削除した修飾Ｔｉプラスミドを、本発明のセンスおよびアンチセンス遺伝子構造のポテト植物への移入用のベクターとして使用できる（Winnacker，1987参照）。アグロバクテリアを用いた植物細胞の形質転換および全植物の再生には、一般的に、アグロバクテリアと培養単離プロトプラストとの共培養、またはインタクトな細胞や組織のアグロバクテリアによる形質転換のいずれかの過程を含む。実施例のケースでは、ポテトの茎頂培養による茎外植体をアグロバクテリアを用いて形質転換した。別の方法として、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）をナス科ファミリーの植物へセンスまたはアンチセンスＤＮＡを導入するためのベクターとして利用することができる。例えば、アメリカ特許明細書第４４０７９５６号（Howe ll,10月４日,1983）ではカリフラワーモザイクウイルスＤＮＡの植物媒体としての利用について示唆されている。８.形質転換植物細胞の選択および再生形質転換後、アンチセンスもしくはセンスＤＮＡを保持する形質転換植物細胞または形質転換植物を同定しなければならない。抗生物質耐性のような選択マーカーが主に利用される。実施例では、カナマイシン含有増殖培地上で細胞を増殖させることにより形質転換植物細胞を選択した。他の選択マーカーが従来技術で明らかである。例えば、アグロバクテリアで植物を形質転換した場合にはオピンの存在により形質転換体を確認できる。外来ＤＮＡの発現を、ノーザンブロットハイブリダイゼーションのような公知の方法を用い、挿入ＤＮＡでコードされたＲＮＡを検出することにより確認できる。挿入ＤＮＡ配列自体は、サザンブロットハイブリダイゼーションまたはＰＣＲでも同定できる（Sambrook等（1989）参照）。一般的に、形質転換植物細胞が組み替えＤＮＡを保持することを確認した後、全植物を再生する。実施例では、要求のアンチセンスＤＮＡおよびカナマイシンマーカー遺伝子を保持する培養Agrobacterium tumefaciensを、ポテトの茎頂培養で得た茎および葉の外植体に接種した。形質転換体をカナマイシン含有増殖培地で選択した。発芽の誘導に好適な培地へ移動後、発芽体を根付けに好適な培地へ移動した。続いて、植物を土壌に移し、徐々に丈夫にした。培養により再生した植物を移植し、温室条件下に成熟するまで育成した。９.形質転換塊茎中のＧＨＴＰおよびＧＬＴＰの活性レベル分析ＧＨＴＰおよびＧＬＴＰ遺伝子由来アンチセンスＤＮＡ配列で形質転換したポテト植物の再生に続き、形質転換塊茎組織の生化学的特徴を様々な方法で分析した。加リン酸分解におけるαグルカンホスホリラーゼのｉｎｖｉｔｒｏ活性をステアップ（1990）（表１）の方法に従って検定した。グリコーゲン含有ポリアクリルアミドゲルで酵素のイソ体を電気泳動分離後に、合成時の酵素活性および総タンパク質量を比較した（図７）。グルコース−１−ホスフェートおよびデンプンプライマーとともにインキュベートした後、ゲルのイオジン染色により塊茎Ｌ−タイプおよびＨ−タイプイソ体によるデンプンの合成量を測定した(Steup,1 990)。同様の、インキュベートしていないネイティブゲルからニトロセルロースへタンパク質をブロッティングし、塊茎タイプＬおよびタイプＨグルカンホスホリラーゼイソ体に特異的なポリクローナル抗体をプローブとしてウェスタン分析を実施した。塊茎組織中の還元糖（グルコースおよびフルクトース）のレベルをＨＰＬＣにより定量化した（表２,３および４）。塊茎中の還元糖濃度に比例するメイラード反応の程度を、揚げ加工後にチップスコアを測定することで検査した。１０.定義明細書および請求項で使用する言葉： ”約３カ月”、”約４カ月”および”約６カ月”とは、それぞれ３カ月プラスマイナス２週間の期間、４カ月プラスマイナス２週間の期間、６カ月プラスマイナス２週間の期間を示す； ”アンチセンス方向”とは自然誘起的な方向と反対の方向で発現カセットに挿入された、構造遺伝子の核酸配列の方向を示す。配列が２本鎖であった場合には、自然誘起的な方向において鋳型鎖であったものがコード鎖となり、逆もまた同様である；塊茎の”チップスコア”とは、２０５Ｆ°の大豆油中で、泡立ちがおさまるまで約３分間揚げたセンターカットのポテト片をＡｇｔｒｏｎｍｏｄｅｌＥ− １５−ＦＰ直読短縮分光光度計（Direct Reading Abridged Spectrometer，Agtr on Inc．1095 Spice Island Drive ＃ 100，sparks Nevada 89431）で記録した反射測定値を意味する； ”低温貯蔵”および”低下させた温度での貯蔵”またはそれに類似の表現は、１０℃を下回る温度での貯蔵を意味し、この温度は冷却行為または周辺の温度により獲得できる； ”内在性”は、ポテト植物のαグルカンホスホリラーゼ遺伝子に言及する際に使用されるが、αグルカンホスホリラーゼ遺伝子由来ＤＮＡ配列を保持する発現カセットを導入する以前からポテト植物のゲノム中に存在した自然発生的遺伝子を意味する； ”発現”は構造遺伝子の転写および翻訳、すなわちタンパクが合成されることを示す； ”異種配列”または”異種発現カセット”は外来種を起源としたものであり、同種から得られた場合でも、原型から根本的に改変していることを示す； ”低温−貯蔵特性の向上”は、これらに限定はしないが、チップスコアの向上および収穫時または１０℃ を下回る温度での貯蔵期間後に測定される塊茎中の糖の蓄積量の減少、さらに、これに限定するのではないが、ポテトの貯蔵期間の長期化、ポテトの呼吸および発芽抑制による休眠期間の延長、病気の発現低下などの、従来よりも低温でポテトを貯蔵することで得られた向上点、利点および利益を意味する。特別な測定または試験でより詳しい評価を行わずとも、低温−貯蔵特性の向上は、野生株または非修飾ポテト植物のようなコントロールと、記載の特性を比較した場合の差で確認できる； ”修飾”またはその類似表現をポテト植物および塊茎の記載に用いるが：センスまたはアンチセンス方向のいずれかで、組み替えＤＮＡ技術または修飾構造配列や調節配列の導入を含む従来の交雑種法のいずれかを用い、同種または異種由来ヌクレオチド配列を導入する方法；部位特異的突然変異誘発またはその他の方法でネイティブのヌクレオチド配列を修飾する方法；または化学薬品やプロテインインヒビターでポテトを処理する方法を通じて、本来の状態を変化させたポテト植物および塊茎を区別するために使用する。”未修飾”ポテト植物および塊茎はコントロール、すなわち野生株または前記のような修飾をうけていない本来のポテト植物または塊茎を意味する。 ”核酸配列”または”核酸分節”は、５’から３’末端へ向けて解読されるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の１本鎖または２本鎖ポリマーを示す。これは、両自己複製プラスミド、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡの感染型ポリマーおよび非機能型ＤＮＡまたはＲＮＡを含む； ”使用可能に連結した”とは、プロモーターと２次配列間の機能的連結を示し、プロモーターは、２次配列に対応してＲＮＡの転写を開始する； ”植物”とは植物全体、植物小器官（例：葉、茎、根等）、種子および植物細胞を含む； ”プロモーター”とは、構造遺伝子より上流のＤＮＡ領域を指し、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写開始にかかわる他のタンパク質を認識し結合する。”植物プロモーター”とは、植物細胞内で転写を開始することが可能なプロモーターである。 ”活性低下”またはその類似表現を、ＧＬＴＰまたはＧＨＴＰ酵素活性の低下を含む、ポテト塊茎中のＧＬＴＰまたはＧＨＴＰの酵素活性レベルに言及する際に使用するが、この結果、ＧＬＴＰまたはＧＨＴＰ遺伝子産物の発現低下、ＧＬＴＰまたはＧＨＴＰ酵素の基質親和性低下、およびＧＬＴＰまたはＧＨＴＰの触媒活性の低下が起こる。 ”ストレス”またはその類似表現を、ポテト植物または塊茎が経験するストレスに関連して使用するが、植物または塊茎の質に影響を与える環境、生産力、湿度、温度、取り扱い、病気、大気および老化の影響を意味し、ポテト植物ではその生活サイクルの全ステージを通して、塊茎では増殖および発育サイクル、続く収穫、運搬、貯蔵および加工過程の全ステージでストレスを経験する。 ”ストレス耐性”またはその類似表現に関し、温度、老化、病気、大気、物理的取り扱い、湿度、残留化学薬品、環境、害虫およびその他のストレスの影響の減少を意味する。 ”好適な宿主”とは、組み替えプラスミド、ＤＮＡ配列、または組み替え発現カセットに適合し、プラスミドの複製、ゲノムへの挿入、または発現を可能にする微生物または細胞を示す。 ”連続した”とは、介在配列、すなわち非翻訳配列が欠失した読みとり枠からなるＤＮＡ配列を示す（例えばｃＤＮＡ）。実施例１この実施例は、アンチセンス方向でプロモーターに連結したＧＬＴＰおよびＧＨＴＰ遺伝子配列由来のＤＮＡ配列を含有する発現カセットで形質転換したポテト植物の塊茎中のＧＨＴＰおよび／またはＧＨＴＰ活性の低下について記載する。Ａ.ポテト塊茎ｍＲＮＡの単離加圧滅菌試薬を用い、乳鉢と乳棒で液体窒素下に微分末に粉砕した塊茎組織１ｇから、４℃でポテトの全ＲＮＡを精製した。粉末を３０ｍｌコレックスチューブ(corex tube)に移し、０.２％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳおよび０.５％（Ｖ／Ｖ）２− メルカプトエタノールを含む１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８.０、１００ｍＭＮａＣｌ、および１０ｍＭＥＤＴＡ（１０ｘＴＮＥ）３容量を添加した。フェノール−クロロホルム（１：１）を等量添加し、ＳＳ３４ローターで８,０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心する前に、サンプルをゆるくボルテックスにかける。有機相を０.２％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳおよび０.５％（Ｖ／Ｖ）２−メルカプトエタノールを含む１０ｘＴＮＥ０.５容量で再抽出し、合した水相をクロロホルムで抽出した。核酸を酢酸ナトリウムおよび無水エタノールで水相から沈澱させ、遠心によりペレット化し、１ｘＴＮＥ３ｍｌ中に再懸濁した。５ＭＬｉＣｌを等量添加し、ＳＳ３４ローターで８,０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心する前に、サンプルを−２０℃で４時間保存した。ＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、ＤＥＰＣ−処理水中に再懸濁した。ポリ（Ａ⁺）ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース（ベーリンガーマンハイム）カラムクロマトグラフィーにより単離した。ポリ（Ａ⁺）ＲＮＡをＲＮＡｓｅフリーの水中に再懸濁した全ＲＮＡより単離した。カラムを、加圧滅菌したバイオ −ラッドポリ−プレップ１０ｍｌカラムを用いて、これに２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７.４、０.１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、および０.１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを含有するローディングバッファーＢ１ｍｌ中に懸濁したオリゴ（ｄＴ）セルロース５０ｍｇを添加することにより製造した。カラムを５ｍＭＥＤＴＡを含む０.１ＭＮａＯＨ３容量で洗浄し、ｐＨ試験紙による測定で流液のｐＨが８を下回るまでＤＥＰＴ−処理水で洗浄した。次に、カラムを４０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、および０.１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを含むローディングバッファーＡ５容量で洗浄した。ＲＮＡサンプルを６５℃で５分間加熱したが、その際予め６５℃に加熱しておいたローディングバッファーＡ４００μｌを添加した。サンプルを混合し、カラムに通す前に室温で２分間冷ました。溶出液を集め、６５℃で５分間加熱し、室温で２分間冷却し、再度カラムに通した。続いて、ローディングバッファーＡ５容量およびローディングバッファーＢ４容量で洗浄した。ポリ（Ａ⁺）ＲＮＡを１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７.４、１ｍＭＥＤＴＡ、および０.０５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ３容量で溶出した。フラクションを集め、ＲＮＡを含有するこれらのフラクションをエチジウムブロマイドプレート分析、すなわちエチジウムブロマイド含有ＴＡＥで作製した１％アガロースのペトリ皿、により同定した。ＲＮＡを沈澱させ、１０μｌ中に再懸濁し、アリコート１μｌを分光計で定量化した。Ｂ.ＧＬＴＰおよびＧＨＴＰ配列の単離アンチセンス構造の開発に利用するヌクレオチド配列をＧＬＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）およびＧＨＴＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）の５’配列より任意に選択した。アンチセンス構造の開発に利用するＤＮＡ配列を逆転写−ＰＣＲにより獲得した。ＧＬＴＰ（ＳＰＬ１およびＳＰＬ２）−特異プライマーおよびＧＨＴＰ（ＳＰＨ１およびＳＰＨ２）−特異プライマーを公知の配列（Brisson等1 990、Fukui等1991）に従い、酵素による制限を促進するためにわずかな修飾を加えて設計した：逆転写を１ｘＰＣＲバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ８.２、５０ｍＭＫＣｌ、０.００１％ゼラチン、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂）、各ｄＮＴＰ６７０μ Ｍ、全ポテト塊茎ｃｖ．ルセットバーバンク(Russet Burbank)ＲＮＡ６μｇ、各プライマー１ｍＭ（ＳＰＨ１およびＳＰＬ２、またはＳＰＨ１およびＳＰＨ２）およびマロニー(Maloney)マウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＢＲＬ）２００Ｕを含有する１５μｌ容量中で実施した。この反応は３７℃で３０分に設定され、次に９４℃で５分間ヒートブロック(heat−killed)し、速やかに氷上で冷却した。逆転写反応液に、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）２.５Ｕを含む１ｘＰＣＲバッファー３５μｌ溶液を添加した。ＤＮＡ複製を、９４℃で１分間の変性段階を３０サイクル、５６℃ で１分間（ＳＰＬ１およびＳＰＬ２）または５８℃で１分間（ＳＰＨ１およびＳＰＨ２）のアニーリング段階、および７２℃で２分間の伸長段階にプログラムしたペルキンエルマー(Perkin Elmer)４８０中で実施した。ＰＣＲは７２℃で１０分間の最終伸長を行い終了した。Ｃ.ホスホリラーゼ阻害のためのＳＰベクターの構築植物細胞内にアンチセンス構造を発現するためには、適当な植物の調節領域へ遺伝子を融和させる必要がある。このことは要求の配列を含むプラスミドベクター中へアンチセンスＤＮＡをクローニングすることにより達成される。複製ＤＮＡは平滑末端であり、ＳｍａＩ部位でｐＵＣ１９ベクター中へクローニングされた。組み替えプラスミドをサブクローニングに有効な大腸菌ＤＨ５α 細胞（ＢＲＬ）へ導入した。形質転換細胞を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有ＬＢ（１５ｇ／ｌバクトチプトン、５ｇ／ｌ酵母抽出液、１０ｇ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ７.３を１.５％のアガーで凝固させる）プレート上に載せる。挿入した植物ホスホリラーゼ配列を含むプラスミド含有バクテリアの選択は、色選択により実施された。ポリリンカーおよびＴ３ＲＮＡおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、ｌａｃＺ遺伝子断片のＮ−末端部に存在する。ポリリンカー中に挿入のないｐＵＣ１９プラスミドは、ＤＨ５ａのような適当な細菌株中でブルーコロニーとして増殖する。色選択は、形質転換体をプレートに載せる３０分前に、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢプレート上に２％Ｘ−gal１００μｌ(ジメチルホルムアミド中で合成)を塗布することで実施された。挿入のないプラスミド含有コロニーは、３７℃で１２〜１８時間インキュベーションした後に青くなり、挿入のあるプラスミドは白いままである。ホスホリラーゼ挿入配列の確認のために、単離プラスミドのシークエンスを実施した。シークエンスは、ＡＢＩプリズムダイターミネーターサイクルシークエンシングコアキット（Prism Dye Terminal Cycle Sequencing Core Kit）(Bio systems適用、Foster City,CA)、Ｍ１３ユニバーサルおよびリバースプライマー、およびＡＢＩ自動化ＤＮＡシークエンサーを用いて測定した。一晩培養体５ｍｌから、高速アルカリ抽出法により操作プラスミドを精製した（Birn boinおよびDoly,1979）。ＳＰＬおよびＳＰＨ断片のｐＵＣ１９中の方向を制限酵素による切断で決定した。組み替えｐＵＣ１９ベクターおよびバイナリーベクターｐＢＩ１２１(Clonetech)を制限し、アガロースゲル上に流し、ツリング(Thuring)等記載（1975）のゲル分離法により断片を精製した。連結反応によりアンチセンス配列をバイナリーベクターｐＢＩ１２１へ融合した。連結体には、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで切断されたｐＢＩ１２１ベクターの他に、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩでｐＵＣサブクローンから切り出したＳＰＬまたはＳＰＨホスホリラーゼＤＮＡ産物が含まれた。連結ＤＮＡをＳＣＥ大腸菌ＤＨ５α細胞に導入し、形質転換細胞をアンピシリン含有ＬＢプレート上に載せた。アンチセンスＤＮＡのＳＰＬおよびＳＰＨヌクレオチド配列は、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：１の３３８〜９９３ヌクレオチドおよびＳＥＱＩＤＮＯ：３の１４７〜７９９ヌクレオチドである。ホスホリラーゼを挿入したｐＢＩ１２１の選択をＣＡＭＶおよびＮＯＳ特異的プライマーで実施した。塊茎Ｌ−タイプおよび塊茎Ｈ−タイプホスホリラーゼＤＮＡ断片を表すサンプル１および２を一晩の増殖の後にプレートから採取した。これらのサンプルをＬＢ培地５ｍｌ中に植え付け、３７℃で一晩増殖させた。プラスミドを高速アルカリ抽出法で単離し、ＤＮＡをAgrobacterium tumefaciens中へ電気穿孔した。構造体をＣａＭＶ３５Ｓプロモーター配列（Kay等,1987）およびＮＯＳ３’ターミネーター配列(Bevan 等,1983)を含むｐＢＩ１２ｌベクター中へ組み込んだ。ｐＢＩ１２１プラスミドを、次に挙げる非常に特徴的なＤＮＡ分節により完成させた。バクテリアのスペクチノマイシン／ストレプトマイシン（Ｓｐｃ／Ｓｔｒ）耐性をコードし、大腸菌およびAgrobacterium tumefaciens(Fling等,1985)の選択決定因子となるトランスポゾンＴｎ７から、０.９３ｋｂの断片を単離した。これを、形質転換組織の選択を可能にする植物を発現させるよう操作した、キメラカナマイシン耐性遺伝子へと接合した。このキメラ遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｐ−３５Ｓ）（Odell等,1985）０.３５ｋｂ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタイプＩＩ遺伝子（ＮＴＰＩＩ）０.８３ｋｂおよびノパリンシンターゼ遺伝子の３’非翻訳領域（ＮＯＳ３’）（Fraley等,1983）を含む。次の分節は、ＲＫ２プラスミド由来の複製起点０.７５ｋｂ（ｏｒｉ−Ｖ）（Stalker等,1981）である。これを、大腸菌中に維持するための複製起点（ori −322）およびAgrobacterium tumefaciens細胞中への接合移入のためのｂｏｍサイトを提供するｐＢＲ３２２のＳａｌＩからＰｖｕＩの３.１ｋｂの分節へと接合する。その次は、ノパリン−タイプＴ−ＤＮＡの右側の境界領域を含むｐＴｉＴ３７プラスミド由来のＰｖｕＩ断片０.３６ｋｂである（Fraley等,1985）。アンチセンス配列を構成性組織非−特異的プロモーターの制御下に遺伝子導入することにより、塊茎での発現を操作した。Ｄ.植物の形質転換／再生ＳＰＬおよびＳＰＨベクターをブロック(Block)等（1988）の方法に従いデジリーポテト栽培種へ導入した。”デジリー”ポテトへの導入のために”デジリー ”ポテトを、Ｓ１（２％スクロースおよび０.５ｇ／ｌＭＥＳｐＨ５.７を添加し６ｇ／ｌフィトアガーで凝固させたＭＳ培地（Murashige Skoog培地））８ｍｌを入れた試験管で無菌茎頂培養した。苗木が約５ｃｍの長さに到達した時、葉部分を付け根に沿って一枚づつ切り取りAgrobacterium tumefaciensの一晩培養体１：１０希釈液に接種した。茎外植体をＳ１培地上で２０℃で２日間共培養した (De Block 1998)。共培養に続き、外植体をＳ４培地（スクロースを除き、０.５ｇ／ｌＭＥＳｐＨ５.７、２００ｍｇ／ｌグルタミン、０.５ｇ／ｌＰＶＰ、２０ｇ／ｌマンニトール、２０ｇ／ｌグルコース、４０ｍｇ／ｌアデニン、１ｍｇ／ｌトランスゼアチン、０.１ｍｇ／ｌＮＡＡ、１ｇ／ｌカルベニシリン、５０ｍｇ／ｌカナマイシンを添加し、６ｇ／ｌフィトアガーで凝固させたＭＳ培地）へ１週間移動し、さらにカルス形成を誘導するため２週間培養した。３週間後、外植体をＳ６培地（ＮＡＡを除き、カルベニシリン濃度を半分（５００ｍｇ／ｌ）にしたＳ４培地）へ移動した。さらに２週間後、外植体を発芽形成促進のためにＳ８培地（２５０ｍｇ／ｌだけのカルベニシリン、０.０１ｍｇ／ｌギベレリン酸、ＧＡ３を含むＳ６）へ移動した。Ｓ８発芽誘導培地へ移動後約２週間で、発芽が開始した。発芽体を切り取り、根付けのためにＳ１培地の入ったバイアルへ移動した。根付け用の培地で約６週間増殖した後、植物を土壌へ移し、徐々に強くした。培地で再生したデジリー植物を１ガロンのポットに移植し、温室条件下に成熟するまで育成した。塊茎を収穫し、室温で２日間コルク化させた。２ｃｍ以上の長さの塊茎を全て集め、高湿度下に４℃で貯蔵した。Ｅ.フィールド試験未修飾のコントロール、ＳＰＬ構造を発現した植物、およびＳＰＨ構造を発現した植物を単複製ランダム設計により実地試験で増殖させた。全ての植物を同一の土地に共存させて育成し、同種類の殺虫剤、化学肥料、および潅概設備に曝露した。塊茎を収穫し、それぞれの株からランダムに選択した塊茎を４℃の貯蔵に移行する前に１０℃で２週間貯蔵した。Ｆ.糖分析塊茎を４℃で貯蔵し、糖分析前に室温状態に復帰することのないようにした。傷のない縦切り片（厚さ１ｃｍ、幅は塊茎の外側寸法に等しくまちまちである）を各塊茎の中心部分から切り出したが、これにより全塊茎組織を表すものとする。それぞれの収穫時に、クローン（３複製）につき４個の塊茎の中心片を、１ｃｍ角の賽の目に共通にして切り、集めた組織から１５ｇを分析用としてランダムに選択した。グルカンホスホリラーゼ（下記参照）および糖を、２ｍＭ亜硫酸ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、０.５ｍＭＰＭＳＦおよび１０％（Ｗ／Ｗ）グリセロールを含むＴｒｉｓバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７.０）１５ｍｌで、ポリトロンホモジナイザーを用い、４℃で抽出した。抽出液を４℃で遠心（３０,０００ｇ、３０分）し、屈折率検出器を接続した分光物理高性能液体クロマトグラフにより、還元糖（グルコースおよびフルクトース）を１０倍希釈した上清で測定した。分離は８０℃で３０ｘ０.７８ｃｍのアミネックスＨＰＸ８７Ｃ(Aminex HPX 87C)カラム(Biorad) を使用し、移動層に水０.６ｍｌ／ｍｉｎを用いて実施した。装置の検量線はｄ −グルコースおよびｄ−フルクトースの確かな標準液で作製した。Ｇ.ｄ−グルカンホスホリラーゼ活性の分析４℃で貯蔵した塊茎は、抽出やαグルカンホスホリラーゼ活性分析およびアイソザイム分析の前に温まらないようにした。加リン酸分解方向でのグルカンホスホリラーゼのｉｎｖｉｔｒｏ活性はステアップ記載の方法（1990）により検定した。簡単に説明すると、糖分析で得た抽出サンプル（前記参照）を、ホスホグルコムターゼおよびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼの連続作用を介するＮＡＤＰの還元にデンプン加リン酸分解を組み合わせた反応培地へ添加した。反応中のＮＡＤＰの還元率は、基質デンプン由来のグルコース−１−ホスフェートの生成率と化学量論的関係を有する。ＮＡＤＰの還元を、バリアンカリーダブルビーム分光光度計（Varian Carydouble−bea m spectrophotometer）の３４０ｎｍで測定した。抽出液中のタンパク質レベルをブラッドフォード(Brad ford)の方法（1976）に従って測定した。グルカンホスホリラーゼ活性ゲル法をステアップの方法（1990）に忠実に従って実施した。タンパク質はグリコーゲンを１.５％含有するネイティブポリアクリルアミドゲル（８.５％）上で分離した。続いて８０Ｖで１５時間（４℃）電気泳動し、ゲルを、２０ｍＭグルコース−１−Ｐおよび０.０５％（Ｗ／Ｖ）加水分解ポテトデンプンを含む０.１Ｍクエン酸−ＮａＯＨバッファー(ｐＨ６.０) 中３７℃でインキュベートした（１〜２時間）。次いでゲルを洗浄し、イオジン溶液で染色した。ウェスタンブロット分析用に、前記のようにしてグリコーゲン含有ポリアクリルアミドゲルを用いてタンパク質を電気泳動した。このタンパク質をニトロセルロースへ電気ブロットし、このブロットをＧＨＴＰおよびＧＬＴＰに対するポリクローナル抗体で検出した。免疫ブロット法はアルカリホスファターゼ結合抗−ウサギ二次抗体(Sigma)を用いて実施した。Ｈ.チップの色測定ＧＬＴＰアンチセンス配列を発現した５種類のトランスジェニックポテト株、ＧＨＴＰアンチセンス配列を発現した２種類のトランスジェニック株、非−トランスジェニックデジリーコントロール株、およびｐＢＩ１２１ベクターＴ−ＤＮＡで形質転換した２種類のコントロール株を、カナダのアルベルタで野外条件下に育成した。塊茎を収穫し、１０℃または４℃で貯蔵した。各株の代表サンプルの中心を切り、華氏２０５度の大豆油中で約３分間、泡立ちがおさまるまで揚げ、全種ポテト株のチップの色を測定した。Ｉ.結果全ての塊茎は同一栽培株（デジリー種）、同年齢、同一生育条件下に共存させて育成した植物から収穫した。塊茎のノーザン分析により、相同アンチセンス転写産物を発現したトランスジェニック植物中で内在性ＧＬＴＰ転写産物量が顕著に低下することが見出された（図７）。グルカンホスホリラーゼ分析では、ＧＬＴＰアンチセンスＤＮＡを発現したトランスジェニックポテトにおける収穫時および収穫後少なくとも６カ月で活性（μモルＮＡＤＰＨｍｇ^-1タンパクｈ^-1）が低下することが見出された（表１）。表１に表記された結果は、４℃で１８９日間貯蔵した塊茎におけるαグルカンホスホリラーゼ活性が、野生株コントロール株と比較して、各形質転換ポテト変種で約１６〜７０％低下していることを示している。活性ゲルおよびウェスタンブロット分析により、相同酵素発現の特異的な低下および異種酵素のよりわずかな低下が見出された（図１０および図１１）。この相同産物への特異性は、ホスホリラーゼ間の違いから来るものと考えられる（図６Ａおよび図６Ｂ）。収穫時（０日）の塊茎の分析により、アンチセンスＧＬＴＰ転写産物を発現した場合にはコントロールの塊茎と比較して還元糖が５分の１程度になることが見出された（表２）。さらに４℃で９１日間の貯蔵後では、形質転換した塊茎は野生株コントロール種と比較して還元糖濃度が２８〜３９％低下した。グルコースおよびフルクトース濃度が、アンチセンスＧＬＴＰ転写産物を発現した塊茎で顕著に低下した（図３および図４）。これらの結果から、コントロールの塊茎では糖が引き続き蓄積されるのに対し、ＧＬＴＰ活性が低下すると、塊茎におけるデンプンの還元糖への代謝が遅延することが示唆された。ホスホリラーゼの全活性および還元糖濃度間の相関関係は直接なものではなく、デンプンの代謝に、ホスホリラーゼの特定のアイソザイムがより重要な役割を果たすこと、特定のホスホリラーゼアイソザイムの発現が特異的レベルに低下すると他と比べてより有効に働くこと、および／または還元糖レベルの低下に関わる確認できていない相互作用があることが示唆される。アンチセンスＧＬＴＰまたはアンチセンスＧＨＴＰ転写産物を発現したトランスジェニックポテト植物を野外条件下に育成し、その塊茎を４℃で貯蔵した。糖の含有量と相関関係を示すチップの色を、低温貯蔵前および低温貯蔵開始後８６日および１２４日で測定した。アンチセンスＧＬＴＰ転写産物を発現した全てのトランスジェニック植物由来の塊茎のチップの色は、同一条件下に貯蔵したコントロールの塊茎（より暗い）と比較して顕著に向上した（より明るい）（表５および図９）。ＧＬＴＰ転写産物を発現した”デジリー”ポテト植物由来の塊茎のチップスコアをアグトロンモデルＥ−１５−ＦＰ直読短縮分光光度計(Agtron mo del E−15−FP Direct Reading Abridged Spectrophotometer)(Agtron Inc.1095 Spice Island Drive #100、Sparkes Nevada 89431)で測定したところ、１０℃ および４℃で８６日間貯蔵した場合に、それぞれ少なくとも４.３および８.９ポイントの向上が見られた。４℃で１２４日間貯蔵後に測定したＧＬＴＰ形質転換体のチップスコアは野生株と比較して４４％〜８９％向上した（表５）。デジリー栽培株はチップ加工するとして、そこに自然に含有される高濃度の糖および低温貯蔵により速やかに増甘する性質ゆえに、商業的に好ましくないポテト種である。にもかかわらず、形質転換”デジリー” ポテトにおいて、揚げたチップの色が著しく改良された。本発明の方法を商業加工用ポテト変種に適用すると、有利な色の明色化が期待できる。１０℃および４℃で貯蔵した塊茎の分析において、アンチセンスＧＨＴＰ転写産物を発現した形質転換体が、時折コントロール塊茎よりも明色に揚がるチップを提供するが、これは還元糖の蓄積がより低いことを示す（表５）。異種および相同ホスホリラーゼ活性の低下（図１０および図１１）の結果は、これらの向上が１種または両種塊茎ホスホリラーゼの低下により誘導されたことを示す。しかし、これらの結果はＬ−タイプホスホリラーゼがデンプンを還元糖に代謝する際により重要な役割を果たすことを示唆している。さらにこの結果は、野生株植物の塊茎および塊茎ホスホリラーゼアンチセンスＲＮＡを発現した塊茎間の還元糖レベル（表２）およびチップスコア（表５）の相違が長期貯蔵期間中で維持されることを示す。表５が示すように、チップスコアは８６日および１２４日でほぼ同値である。４℃での４９日および９１日の貯蔵では還元糖含有量の一層の増加は確かに認められなかった（表２）。糖の含有量の均衡はおそらく塊茎ホスホリラーゼの動力学と関連がある。より低い糖レベルを維持する能力があれば、少なくとも数カ月、貯蔵期間を延長することが可能である。現在加工用ポテトは、通常、糖の蓄積量が質の低下を招くまでの最高３〜６カ月間１０℃〜１２℃で貯蔵される。生の生産物はポテトの利用される季節までに輸入しなくてはならない。ポテトの貯蔵期間の延長が長期であるほど、輸入費用は軽減される。表６は、非形質転換コントロール植物と比較した、ＧＬＴＰ遺伝子配列由来アンチセンスＤＮＡで形質転換したポテト植物（ＡＴＬ３〜ＡＴＬ９），ＧＨＴＰ遺伝子配列由来アンチセンスＤＮＡで形質転換したポテト植物（ＡＴＨ１およびＡＴＨ２）の低温−貯蔵特性の様々な向上点についてその向上を割合にし、総括して提供している。塊茎における低温−貯蔵特性の実質的な向上は、本発明の方法を通じて普遍的に獲得できることが、表６に総括された結果より明らかである。特筆すべきは、４℃で約４カ月（１２４日）の貯蔵後に野生株と比較して測定したチップスコアの上昇率である。野生株と比較して、比較チップスコアの上昇は８９％まで観察された。チップスコアの上昇は、本発明の商業利点に影響する。すなわち、低温−誘発性の甘味増加の減少により、ポテト揚げ物製品の不適当な黒ずみを引き起こさずに塊茎をより低温で貯蔵することが可能になる。収穫期、貯蔵後９１日のいずれでも、野生株と比較して形質転換ポテト株の糖の蓄積が減少したことは、本発明の利点を顕著に表すものである。糖蓄積の減少は、観察されたチップスコアの上昇と関連し、塊茎の比重の向上、その他の塊茎の質の重要な商業利点にもまた影響を及ぼす。収穫時でさえ、チップスコアおよび糖蓄積の減少における本質的な向上は野生株と比較して形質転換株で顕著であった。つまり、本発明の利点は、低温保存の延長期間後にのみにその向上が限定されるのではなく、収穫時でも認められるのである。ある意味で、本発明は低温−貯蔵特性の向上に限定されるのではなく、収穫時のチップスコアまたは糖蓄積などの塊茎の質の特性向上をも包括しており、早期成熟を誘起する。特徴的な向上を総括した表６を参照すると、ＧＬＴＰタイプの形質転換体（ＡＴＬ３〜ＡＴＬ９）では、収穫時、貯蔵後９１日および１８９日において、野生株と比較してαグルカンホスホリラーゼ活性がそれぞれ６６％、７０％、および６９％まで減少している。大部分では、収穫時、貯蔵後９１日および１８９日において野生株と比較して１０％から３０％以上の向上が認められた。ＧＨＴＰ−タイプ形質転換体（ＡＴＨ１およびＡＴＨ２）では、貯蔵後９１日および１８９日において、野生株と比較してそれぞれ２８％および３９％までの向上が認められ、全体的にも最低１０％の向上が見出された。ＧＬＴＰ−タイプ形質転換体では、収穫時および９１日後において、それぞれ８０％および３９％までの糖蓄積の減少が認められた。収穫時、全ＧＬＴＰ−タイプ形質転換体で相対的に少なくとも１０％および少なくとも３０％の向上が認められた。９１日後では、全ＧＬＴＰ−タイプ形質転換体で相対的に少なくとも１０％、および大部分で少なくとも３０％の向上が認められた。ＧＬＴＰ−タイプ形質転換体では、収穫時、貯蔵後８６日および１２４日で野生株と比較して、チップスコアがそれぞれ４６％、８９％および８９％まで向上した。ほとんど全てで、収穫時および貯蔵後８６日と１２４日において、相対的に少なくとも１０％および３０％向上した。ＧＨＴＰ−タイプ形質転換体の少なくともひとつで、収穫時、および貯蔵後８６日および１２４日において、少なくとも５％および少なくとも１０％野生株に比較して向上した。貯蔵後１２４日では、ＧＨＴＰ−タイプ形質転換体の少なくともひとつでチップスコアが相対的に２５％向上した。この結果は、塊茎の低温−貯蔵特性の本質的向上が本発明の方法により速やかに獲得できることを明白に示すものである。結果は、多くの要因の中でも、植物ゲノムへ組み替えアンチセンスまたはセンスＤＮＡを挿入した位置、挿入操作の回数により変化する。特筆すべきは、多種形質転換株の結果が変化に富むにもかかわらず、一種形質転換ポテト株から得たサンプルの結果には変化が殆ど認められないことである（表１〜５の説明書き参照）。ＧＨＴＰまたはＧＬＴＰのアンチセンスＤＮＡを巧く導入したポテト全植物株の結果を表６に示す。ここで示されるように、全ての形質転換体が、チップスコアの上昇（調理時の明色化）および糖蓄積の減少のような低温−貯蔵特性の少なくとも１つ以上の向上点を有し、大部分において非常に優れて向上を示すことが分かる。実施例において、正の形質転換体が得られた割合が大きかったので、実施例に記載の低温−貯蔵測定のための試験方法を適用し、本発明の方法により形質転換したポテト植物を速やかにスクリーニングし、低温−貯蔵特性が優れて向上した形質転換株を同定することができると期待される。商業的に重要なポテト変種に記載の技術を応用することにより、低温−貯蔵特性が優れて向上した形質転換体を速やかに産出し、選択することが可能になるであろう。野生株コントロールと比較して優れた向上を示す形質転換体を新規商業ポテト変種の開発に利用できる。明細書中に記載した全ての刊行物は、本発明が関与する従来技術のレベルを示す。ここに記載する全ての刊行物は、それぞれが特別に、かつ個別にして記載されているのと同じである。より明確に理解する目的で、図および実施例を通して本発明の詳細を記載したが、特定の変更および改変は、従属請求項の範囲内で実施されうるものであることは明らかである。

【手続補正書】【提出日】平成１１年９月２２日（１９９９．９．２２）【補正内容】請求の範囲１．未修飾のポテト植物が産生する塊茎と比較して、植物の産生する塊茎中の αグルカンＬ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＬＴＰ）およびαグルカンＨ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＨＴＰ）から成る群より選択されたαグルカンホスホリラーゼ酵素の活性が低下した修飾ポテト植物であることを特徴とする、向上した塊茎低温−貯蔵特性を有するポテト植物。２．植物における転写時に、ＧＬＴＰ遺伝子およびＧＨＴＰ遺伝子から成る群より選択される内因性αグルカンホスホリラーゼ遺伝子の発現を抑制するＤＮＡ配列へ使用可能に結合した植物プロモーター配列を有する発現カセットにより形質転換した請求項１記載のポテト植物。３．αグルカンＬ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＬＴＰ）およびαグルカンＨ−タイプ塊基ホスホリラーゼ（ＧＨＴＰ）から成る群より選択されるαグルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を少なくとも２０ヌクレオチド含有するＤＮＡ配列へ使用可能に結合した植物プロモーター配列を有する発現カセットにより形質転換したポテト植物であることを特徴とする、向上した低温−貯蔵特性を有するポテト植物。４．コードされたαグルカンホスホリラーゼがＧＬＴＰである、請求項３記載のポテト植物。５．コードされたαグルカンホスホリラーゼがＧＨＴＰである、請求項３記載のポテト植物。６．コードされたαグルカンホスホリラーゼが、ＳＥＱＩＤＮＯ：２記載のアミノ酸配列から成る、請求項３記載のポテト植物。７．ＤＮＡ配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：１記載のαグルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子の少なくとも２０ヌクレオチドを含む、請求項３記載のポテト植物。８．コードされたαグルカンホスホリラーゼが、ＳＥＱＩＤＮＯ：４記載のアミノ酸配列から成る、請求項３記載のポテト植物。９．ＤＮＡ配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：３記載のαグルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子の少なくとも２０ヌクレオチドを含む、請求項３記載のポテト植物。１０．ＤＮＡ配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１の３３８〜９９３ヌクレオチドから成る、請求項３記載のポテト植物。１１．ＤＮＡ配列がＳＥＱＩＤＮＯ：３の１４７〜７９９ヌクレオチドから成る、請求項３記載のポテト植物。１２．ＤＮＡ配列がアンチセンス方向でプロモーター配列へ結合した、請求項２から１１までのいずれか一項記載のポテト植物。１３．収穫時に測定した植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度が、収穫時に測定した非形質転換植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度よりも、少なくとも１０％低下している、請求項４記載のポテト植物。１４．収穫時に測定した植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度が、収穫時に測定した非形質転換植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度よりも、少なくとも３０％低下している、請求項４記載のポテト植物。１５．収穫時に測定した植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度が、収穫時に測定した非形質転換植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度よりも、少なくとも８０％低下している、請求項４記載のポテト植物。１６．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度よりも、少なくとも１０％低下している、請求項４記載のポテト植物。１７．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度よりも、少なくとも３０％低下している、請求項４記載のポテト植物。１８．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度よりも、少なくとも３９％低下している、請求項４記載のポテト植物。１９．収穫時の植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、収穫時に測定した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも１０％低下している、請求項４記載のポテト植物。２０．収穫時の植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、収穫時に測定した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも３０％低下している、請求項４記載のポテト植物。２１．収穫時の植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、収穫時に測定した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも６６％低下している、請求項４記載のポテト植物。２２．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも１０％低下している、請求項４記載のポテト植物。２３．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも３０％低下している、請求項４記載のポテト植物。２４．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも７０％低下している、請求項４記載のポテト植物。２５．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも１０％低下している、請求項５記載のポテト植物。２６．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも２８％低下している、請求項５記載のポテト植物。２７．４℃で約６カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも１０％低下している、請求項４記載のポテト植物。２８．４℃で約６カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも３０％低下している、請求項４記載のポテト植物。２９．４℃で約６カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも６９％低下している、請求項４記載のポテト植物。３０．４℃で約６カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも１０％低下している、請求項５記載のポテト植物。３１．４℃で約６カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも３９％低下している、請求項５記載のポテト植物。３２．収穫時に測定した植物塊茎のチップスコアが、収穫時に測定した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも５％上昇した、請求項４記載のポテト植物。３３．収穫時に測定した植物塊茎のチップスコアが、収穫時に測定した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも３０％上昇した、請求項４記載のポテト植物。３４．収穫時に測定した植物塊茎のチップスコアが、収穫時に測定した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも４６％上昇した、請求項４記載のポテト植物。３５．収穫時に測定した植物塊茎のチップスコアが、収穫時に測定した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも５％上昇した、請求項５記載のポテト植物。３６．収穫時に測定した植物塊茎のチップスコアが、収穫時に測定した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも１０％上昇した、請求項５記載のポテト植物。３７．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも５％上昇した、請求項４記載のポテト植物。３８．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも３０％上昇した、請求項４記載のポテト植物。３９．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも８９％上昇した、請求項４記載のポテト植物。４０．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも５％上昇した、請求項５記載のポテト植物。４１．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも１０％上昇した、請求項５記載のポテト植物。４２．４℃で約４カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも５％上昇した、請求項４記載のポテト植物。４３．４℃で約４カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも３０％上昇した、請求項４記載のポテト植物。４４．４℃で約４カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも８９％上昇した、請求項４記載のポテト植物。４５．４℃で約４カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも５％上昇した、請求項５記載のポテト植物。４６．４℃で約４カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも２５％上昇した、請求項５記載のポテト植物。４７．ａグルカンＬ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＬＴＰ）およびαグルカンＨ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＨＴＰ）から成る群より選択されるαグルカンホスホリラーゼ酵素の塊茎中における活性レベルが低下するよう改変されたポテト植物を得ることを特徴とする、ポテト塊茎の低温−貯蔵特性を向上させる方法。４８．植物における転写時にＧＬＴＰ遺伝子およびＧＨＴＰ遺伝子から成る群より選択される内因性αグルカンホスホリラーゼ遺伝子の発現を抑制するＤＮＡ配列へ使用可能に結合した植物プロモーター配列を有する発現カセットを、ポテト植物内に導入することから成る、請求項４７記載の方法。４９．αグルカンＬ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＬＴＰ）およびαグルカンＨ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＨＴＰ）から成る群より選択されるαグルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を少なくとも２０ヌクレオチド含有するＤＮＡ配列へ使用可能に結合した植物プロモーター配列を有する発現カセットを、ポテト植物内に導入することから成る、ポテト塊茎の低温−貯蔵特性を向上させる方法。５０．コードされたαグルカンホスホリラーゼがＧＬＴＰである、請求項４９記載の方法。５１．コードされたαグルカンホスホリラーゼがＧＨＴＰである、請求項４９記載の方法。５２．コードされたαグルカンホスホリラーゼがＳＥＱＩＤＮＯ：２記載のアミノ酸配列から成る、請求項４９記載の方法。５３．ＤＮＡ配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１記載のαグルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子の少なくとも２０ヌクレオチドを含む、請求項４９記載の方法。５４．コードされたαグルカンホスホリラーゼがＳＥＱＩＤＮＯ：４記載のアミノ酸配列から成る、請求項４９記載の方法。５５．ＤＮＡ配列がＳＥＱＩＤＮＯ：３記載のαグルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子の少なくとも２０ヌクレオチドを含む、請求項４９記載の方法。５６．ＤＮＡ配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１の３３８〜９９３ヌクレオチドから成る、請求項４９記載の方法。５７．ＤＮＡ配列がＳＥＱＩＤＮＯ：３の１４７〜７９９ヌクレオチドから成る、請求項４９記載の方法。５８．ＤＮＡ配列がアンチセンス方向でプロモーター配列へ結合した、請求項４８から５７までのいずれか一項記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ダーモットロボーグリンチカナダ国ティー１ケー３エヌ９アルバータレスブリッジグレイシャーアヴェニューサウス 3821 (72)発明者ノーマンリチャードノウレスカナダ国ティー６エル１ピー４アルバータエドモントンヒルヴュークレセント 3507

Claims

【特許請求の範囲】 1. 未修飾のポテト植物が産生する塊茎と比較して、植物の産生する塊茎中の αグルカンＬ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＬＴＰ）およびαグルカンＨ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＨＴＰ）から成る群より選択されたαグルカンホスホリラーゼ酵素の活性が低下した修飾ポテト植物であることを特徴とする、向上した塊茎低温−貯蔵特性を有するポテト植物。 2. 植物における転写時に、ＧＬＴＰ遺伝子およびＧＨＴＰ遺伝子から成る群より選択される内因性αグルカンホスホリラーゼ遺伝子の発現を抑制するＤＮＡ配列へ使用可能に結合した植物プロモーター配列を有する発現カセットにより形質転換した請求項１記載のポテト植物。 3. αグルカンＬ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＬＴＰ）およびαグルカンＨ−タイプホスホリラーゼ（ＧＨＴＰ）から成る群より選択されるαグルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を少なくとも２０ヌクレオチド含有するＤＮＡ配列へ使用可能に結合した植物プロモーター配列を有する発現カセットにより形質転換したポテト植物であることを特徴とする、向上した低温−貯蔵特性を有するポテト植物。 4. コードされたαグルカンホスホリラーゼがＧＬＴＰである、請求項３記載のポテト植物。 5. コードされたαグルカンホスホリラーゼがＧＨＴＰである、請求項３記載のポテト植物。 6. ＤＮＡ配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１の３３８〜９９３ヌクレオチドから成る、請求項３記載のポテト植物。 7. ＤＮＡ配列がＳＥＱＩＤＮＯ：３の１４７〜７９９ヌクレオチドから成る、請求項３記載のポテト植物。 8. ＤＮＡ配列がアンチセンス方向でプロモーター配列へ結合した、請求項２，３，４，５，６または７のいずれか一項記載のポテト植物。 9. 収穫時に測定した植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度が、収穫時に測定した非形質転換植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度よりも、少なくとも１０％低下している、請求項４記載のポテト植物。 10．収穫時に測定した植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度が、収穫時に測定した非形質転換植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度よりも、少なくとも３０％低下している、請求項４記載のポテト植物。 11．収穫時に測定した植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度が、収穫時に測定した非形質転換植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度よりも、少なくとも８０％低下している、請求項４記載のポテト植物。 12．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度よりも、少なくとも１０％低下している、請求項４記載のポテト植物。 13．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度よりも、少なくとも３０％低下している、請求項４記載のポテト植物。 14．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎中のグルコースおよびフルクトースの総濃度よりも、少なくとも３９％低下している、請求項４記載のポテト植物。 15．収穫時の植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1 ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、収穫時に測定した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも１０％低下している、請求項４記載のポテト植物。 16．収穫時の植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1 ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、収穫時に測定した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも３０％低下している、請求項４記載のポテト植物。 17．収穫時の植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1 ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、収穫時に測定した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも６６％低下している、請求項４記載のポテト植物。 18．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも１０％低下している、請求項４記載のポテト植物。 19．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも３０％低下している、請求項４記載のポテト植物。 20．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも７０％低下している、請求項４記載のポテト植物。 21．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも１０％低下している、請求項５記載のポテト植物。 22．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも２８％低下している、請求項５記載のポテト植物。 23．４℃で約６カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも１０％低下している、請求項４記載のポテト植物。 24．４℃で約６カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも３０％低下している、請求項４記載のポテト植物。 25．４℃で約６カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも６９％低下している、請求項４記載のポテト植物。 26．４℃で約６カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも１０％低下している、請求項５記載のポテト植物。 27．４℃で約６カ月貯蔵した植物塊茎中の、産生されるＮＡＤＰＨのμモルｍｇ^-1タンパク質^-1ｈ^-1として測定したαグルカンホスホリラーゼ全活性が、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物の塊茎中αグルカンホスホリラーゼ全活性よりも、少なくとも３９％低下している、請求項５記載のポテト植物。 28．収穫時に測定した植物塊茎のチップスコアが、収穫時に測定した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも５％上昇した、請求項４記載のポテト植物。 29．収穫時に測定した植物塊茎のチップスコアが、収穫時に測定した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも３０％上昇した、請求項４記載のポテト植物。 30．収穫時に測定した植物塊茎のチップスコアが、収穫時に測定した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも４６％上昇した、請求項４記載のポテト植物。 31．収穫時に測定した植物塊茎のチップスコアが、収穫時に測定した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも５％上昇した、請求項５記載のポテト植物。 32．収穫時に測定した植物塊茎のチップスコアが、収穫時に測定した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも１０％上昇した、請求項５記載のポテト植物。 33．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも５％上昇した、請求項４記載のポテト植物。 34．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも３０％上昇した、請求項４記載のポテト植物。 35．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも８９％上昇した、請求項４記載のポテト植物。 36．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも５％上昇した、請求項５記載のポテト植物。 37．４℃で約３カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも１０％上昇した、請求項５記載のポテト植物。 38．４℃で約４カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも５％上昇した、請求項４記載のポテト植物。 39．４℃で約４カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも３０％上昇した、請求項４記載のポテト植物。 40．４℃で約４カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも８９％上昇した、請求項４記載のポテト植物。 41．４℃で約４カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも５％上昇した、請求項５記載のポテト植物。 42．４℃で約４カ月貯蔵した植物塊茎のチップスコアが、同一条件下に貯蔵した非形質転換植物塊茎のチップスコアよりも少なくとも２５％上昇した、請求項５記載のポテト植物。 43．ａグルカンＬ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＬＴＰ）およびαグルカンＨ−タイプ塊茎ホスホリラーゼ（ＧＨＴＰ）から成る群より選択されるαグルカンホスホリラーゼ酵素の塊茎中における活性レベルが低下するよう改変されたポテト植物を得ることを特徴とする、ポテト塊茎の低温−貯蔵特性を向上させる方法。 44．植物における転写時にＧＬＴＰ遺伝子およびＧＨＴＰ遺伝子から成る群より選択される内因性αグルカンホスホリラーゼ遺伝子の発現を抑制するＤＮＡ配列へ使用可能に結合した植物プロモーター配列を有する発現カセットを、ポテト植物内に導入することから成る、請求項４３記載の方法。 45．ＧＬＴＰ遺伝子およびＧＨＴＰ遺伝子から成る群より選択されるαグルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を少なくとも２０ヌクレオチド含有するＤＮＡ配列へ使用可能に結合した植物プロモーター配列を有する発現カセットを、ポテト植物内に導入することから成る、ポテト塊茎の低温−貯蔵特性を向上させる方法。 46．コードされたαグルカンホスホリラーゼがＧＬＴＰである、請求項４５記載の方法。 47．コードされたαグルカンホスホリラーゼがＧＨＴＰである、請求項４５記載の方法。 48．ＤＮＡ配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１の３３８〜９９３ヌクレオチドから成る、請求項４５記載の方法。 49．ＤＮＡ配列がＳＥＱＩＤＮＯ：３の１４７〜７９９ヌクレオチドから成る、請求項４５記載の方法。 50．ＤＮＡ配列がアンチセンス方向でプロモーター配列へ結合した、請求項４４,４５,４６,４７,４８または４９のいずれか一項記載の方法。