【発明の詳細な説明】
臓器培養内角膜の脱水用試薬技術分野
本発明は、培養基及び解膨潤物質を含有する、器官培養における皮膚、特に角
質皮、ヒト及び動物の、好ましくはヒトの角質皮、特に眼の角膜の解膨潤剤に関
するものであり、さらに皮膚、特に角質皮、更に特に眼の角膜の器官培養におけ
る解膨潤物質としてヒドロキシエチル澱粉を利用すること、またはその器官培養
において角質皮、特に眼の角膜の解膨潤剤の製造のためにヒドロキシエチル澱粉
を利用することに関するものである。背景技術
とくに、増量剤や血液希釈剤の分野で利用されている周知のヒドロキシエチル
澱粉は、様々な平均分子量Ｍw、及び置換度ＭＳ（モル置換）とＤＳ（置換度）
、さらに種々の置換型をもっている。これらの特性は文献に記載されている(K.S
ommermeyer et al.，「臨床的に使用されるヒドロキシエチル澱粉：その物理化学
的性質」病院調剤法、“Klinisch
Charakterisierung”、Krankenhauspharmazie,271頁、(1987)、及びEP-0402 724
B1参照)。
ここで言う「角質皮」とは、角質皮一般、特に眼の角膜のことである。この皮
膚は、ヒト由来のものであっても、動物（例えばブタ）由来のものであってもよ
い。
以下、説明のために眼の角膜についての発明を述べるが、本発明はこれに限る
ものではない。
今日、ヒトの（眼の）角膜は器官培養を利用すると移植前４週間の保存が可能
である。しかしこの間角膜は、少なからぬ量の水を吸収し、膨潤してしまう。通
常、角膜の厚さは約0.5mmである。ところが、培養中にこの値は0.9mmにも達して
しまう。それ故、保存された角膜を使用する場合には、移植前に適度な解膨潤が
必要となる。この解膨潤は、現在全てのヨーロッパ諸国の角膜銀行では、培養基
にデキストラン５００を添加することによって行われている。その濃度は5-8%で
あり、保存期間に続く解膨潤期間は1-7日間となっている。
しかし、デキストランを使用する解膨潤では、角膜のエネルギー供給型代謝が
著しく損なわれるという報告が出されている（Redbrake，C.：「ドナー基準と臓
器培養による保存の観点から行なった、エネルギー供給型代謝に着目したヒト角
膜の組織状態の研究」(“Untersuchungen der
Spenderkriterien und Lagerung in der Organkulutur unter besonderer
格取得論文アーヘン、１９９６、Salla S．et al.,Cornea １４（５）、502-508
、１９９５）。同時に、移植の成否に決定的な影響を及ぼす内皮細胞の数も減少
する。さらに、大きなデキストラン分子は１日間の使用で既に角膜に吸収される
ために有害な作用を与えるらしいことも研究によって明らかにされた。また、浸
透圧の作用も細胞破壊をもたらしていることを考慮しなくてはならない。それゆ
え、デキストラン含有培養基での保存が続くと、角膜の内皮細胞も他の層も徐々
に損傷されていくことになる。デキストランによる細胞破壊は、これ以前の研究
でも報告されている(Sperling S.、Acta Ophthalmoligica．Vol．57(1979)，269
-276頁参照)。他の解膨潤物質を求めて、ヒドロキシエチル澱粉450,000を使用し
た試みが既に行われている(Reim．M．et al.,Klin．Mbl．Augenheilk．196．76-
80頁、(1990))。そこでは、デキストランの
代替物質を探すことよりも、移植前に必要となっている解膨潤期間をなくすため
に、角膜が保存期間中に膨潤しないようにすることに重点が置かれた。この試験
ではヒドロキシエチル澱粉450,000は、たしかに良好な浸透圧効果を示したが、
分子分解により培養基が極度に糖過剰な状態になり、角膜の代謝には不利な影響
を与えてしまった。養分が豊富な培養基での器官培養では、通常角膜の代謝は回
復されるはずである。発明の開示
本発明の課題は、保存中の角膜を膨潤しない状態に保ち、または保存された角
膜を移植前に解膨潤するのに適しており、かつ従来の剤が示したような不利な効
果を持たない剤を提供することである。
本発明では驚くべきことに、平均分子量Ｍw70,000-200,000を持ち、置換度Ｍ
Ｓは0.15-0.5、置換度ＤＳも0.15-0.5、無水グルコース単位におけるＣ２置換の
Ｃ６置換に対する比は≧８であるようなヒドロキシエチル澱粉を解膨潤物質とし
てデキストランの代りに使用すると、内皮細胞の破壊が増大することなく、角膜
の解膨潤に、より良好な結果が得られ、さらに角膜の代謝状況もはるかに改善さ
れることが解った。
本発明に適したヒドロキシエチル澱粉とは、平均分子量Ｍw70,000-200,000を
持ち、置換度ＭＳは0.15-0.5、置換度ＤＳも0.15-0.5、無水グルコース単位にお
けるＣ２置換のＣ６置換に対する比は≧８であるようなもの、特に平均分子量Ｍw
100,000-160,000を持ち、置換度ＭＳは0.2-0.45、置換度ＤＳは0.2-0.4、無水
グルコース単位におけるＣ２置換のＣ６置換に対する比は8-20であるようなもの
である。とりわけ、平均分子量Ｍw130,000±20,000(HES 130)、置換度ＭＳは0.3
8-0.45、置換度ＤＳは0.32-0.40、無水グルコース単位におけるＣ２置換のＣ６
置換に対する比は8-20であるようなヒドロキシエチル澱粉が適している。
例えば、平均分子量Ｍw117,000、置換度ＭＳ0.39、置換度ＤＳ0.34、無水グルコ
ース単位におけるＣ２置換のＣ６置換に対する比は11であるヒドロキシエチル澱
粉、平均分子量Ｍw133,800、置換度ＭＳ0.44、置換度ＤＳ0.38、無水グルコース
単位におけるＣ２置換のＣ６置換に対する比は12.4であるヒドロキシエチル澱粉
、平均分子量Ｍw148,700、置換度ＭＳ0.42、置換度ＤＳ0.37、無水グルコース単
位におけるＣ２置換のＣ６置換に対する比は11.7であるヒドロキシエチル澱粉な
どである。
本発明に使用されるヒドロキシエチル澱粉は、EP 0 402 724 B1及びDE 39 19
729に記載された方法によって製造することができる。ここで、EP 0 402 724 B1
及びDE 39 19 729は、開示する目的で特にここに関連することを示すものである
。
本発明による剤すなわち本発明で使用されるヒドロキシエチル澱粉は、全保存
期間にわたって角膜を膨潤しない状態に保つ（長期間培養）、つまり角膜の膨潤
を予め防ぐことと、既に保存中に膨潤してしまった角膜を移植前に解膨潤するこ
とを目的に、本発明の方法に従って添加されるものである。
ここで使われている「解膨潤物質」又は「解膨潤剤」という言葉は、保存後の
角膜の解膨潤のための利用や、保存中の角膜を膨潤しない状態に保つために培養
基に継続的に加える添加物としての利用を意味する。
本発明の剤には、ヒドロキシエチル澱粉を含有する様々な培養基も含まれる。
本発明では、ヒドロキシエチル澱粉は培養基の中に1-20%(重量/容量)の濃度で
使われる。特に2-15%（重量/容量）、とりわけ5-10％（重量/容量）、例えば7.5
%（重量/容量）の濃度で培養基中に含有されている
のが好ましい。
全保存期間にわたって角膜の膨潤を抑えるためには、本発明で使用するヒドロ
キシエチル澱粉は1-10%（重量/容量）、特に1-5%（重量/容量）、とりわけ2-7.5
%（重量/容量）の濃度で培養基に添加するのが好ましい。
保存中に膨脹してしまった角膜を移植前に解膨潤するためには、ヒドロキシエ
チル澱粉は培養基に対して1-20%（重量/容量）、特に2-15%（重量/容量）、とり
わけ5-10%（重量/容量）、例えば7.5%（重量/容量）の濃度で添加するのが好ま
しい。
培養基内の角膜の保存は、角膜銀行で通常使われている条件、例えば冷蔵庫内
の温度（約４℃）や30-37℃の温度範囲内で開放された、または密封された培養
システムのもとで実施される。
培養基としては、ヒト及び動物の角膜の器官培養のために、細胞及び組織用培
養基として周知のものは全て適している。角膜に適した培養基
44-53頁)、改良TC199-培養基(Reim，M．Klin．Mbl．Augenheilk．196(1990)，76
-80頁)、MEM(Minimum Essential Medium)(Invest Ophthalmol Vis sci 12(1973)
，176-180頁)、及び改良MEM(例えばRedbrake，C.，教授資格取得論文アーヘン、
1996，15頁；「アールの塩、ハンクの塩等を使用するMEMの改良」)が挙げられる
。本発明では好ましくはMEM、改良MEMまたはTC199が培養基として用いられる。
本発明では、平均分子量Ｍw117,000を持ち、置換度ＭＳ0.39、置換度ＤＳ0.34
、無水グルコース単位におけるＣ２置換のＣ６置換に対する比が11であるヒドロ
キシエチル澱粉を10％、7.5%及び5%の濃度で培養基に添加した実験から得られた
図５から解る通り、角膜の解膨潤の程度は、
使用したヒドロキシエチル澱粉の濃度に関係することが分かった（実施例１―３
を参照）。角膜の保存期間の長さには違いがあったにも関わらず、解膨潤度とヒ
ドロキシエチル澱粉の濃度との間には明確な依存関係が認められた。これは、ヒ
ドロキシエチル澱粉が、様々な膨潤程度に対して等しい解膨潤効果をもたらすこ
とができることを示している。
本発明で用いられるヒドロキシエチル澱粉は、角膜の厚さ測定値及び含水値が
低いことから分るように、角膜の極めて良好な解膨潤をもたらし、また内皮細胞
の破壊を増大しない。さらに、良好な解膨潤に加えて、本発明のヒドロキシエチ
ル澱粉は角膜の代謝値を大幅に改善し、器官培養における代謝の回復も損なわれ
ない。さらに、デキストランで考えられたような毒性効果は認められなかった。
つまり、本発明のヒドロキシエチル澱粉を使用して解膨潤すると、デキストラン
を用いて解膨潤した角膜材料よりも良好なエネルギー状態にある、それゆえ移植
にもより良く耐え得る移植用角膜材料を入手することができることになる。
本発明のヒドロキシエチル澱粉を解膨潤に利用するのであれば、解膨潤用培養
基内での保存期間をこれまでの４日間以上に延長することも可能になるし、また
器官培養全期間にわたって解膨潤物質として長期的に添加することも可能になる
。図面の説明
図１は例１と２に関し、HES(Mw117,000，MS 0.39，DS 0.34，無水グルコース
単位におけるＣ２置換のＣ６置換に対する比11)を培養基に対して5％及び10％の
濃度で使用した場合と、デキストラン５００を5％の濃度で使用した場合の、１
日間解膨潤後の角膜の厚さ（ＨＨ―厚さ）を示している。
図２は例２に関するもので、培養基に対してHES(Mw117,000，MS 0.39，
DS 0.34，無水グルコース単位におけるＣ２置換のＣ６置換に対する比が１１）
またはデキストラン５００をそれぞれ5％の濃度で使用し、１日間解膨潤した後
の角膜内皮細胞数を示している。
図３及び４は例３に関するもので、培養基に対してHES(Mw117,000，MS 0.39，
DS 0.34，無水グルコース単位におけるＣ２置換のＣ６置換に対する比が１１)を
7.5%の濃度で、デキストラン５００を5%の濃度で使用し、１日間解膨潤した後の
角膜の厚さ及び内皮細胞数を示したものである。
図５は、角膜の解膨潤度が、使用したHES(Mwll7,000，MS 0.39，DS 0.34,無水
グルコース単位におけるＣ２置換のＣ６置換に対する比が11)の培養基に対する
濃度(5%，7.5%，または10%)に依存していることを示している（例１、２及び３
を参照）。
図６から１１までは例４に関連し、培養基に対してHES(Mw133,800，MS 0.44，
DS 0.38，無水グルコース単位におけるＣ２置換のＣ６置換に対する比が12.4)を
7.5%の濃度で、またデキストラン５００を5%の濃度で使用した場合の、それぞれ
の解膨潤剤が１日間の解膨潤によって角膜の代謝状況に与える影響を比較した研
究の結果が示されている。具体的には、
図６は、角膜の異なった含水量、
図７は、角膜のグルコース含有量、
図８は、それぞれについて測定した角膜の乳酸エステル含有量、
図９は、それぞれについて測定した角膜のATP、ADP及びAMPの含有量、
図１０は、角膜内の測定されたアデノシン燐酸エステルの測定合計値、
図１１は、それぞれの角膜のエネルギー状態を示している。
図７から１１までには、同様に角膜を培養基(MEM)内で15日間保存した後に得
られた値も示されている。発明を実施するための形態
以下、本発明を例を挙げて説明する。例中、角膜としては常に眼の角膜を使用
した。
例１
平均分子量Ｍw117,000を持ち、MS 0.39、DS 0.34、無水グルコース単位における
Ｃ２置換のＣ６置換に対する比が11であるヒドロキシエチル澱粉(HES)を培養基
に対して10％の濃度で使用した場合
３枚のヒト角膜を、10％（重量/容量）の濃度で上記ヒドロキシエチル澱粉を
含有する培養基の中で１日間解膨潤した。これらの角膜は、この操作以前に32日
間HESを含有しない培養基の中で角膜銀行の培養条件のもとに保存されたもので
ある。膨潤は通常14日後に最高値に達するので、それよりも長い保存期間では膨
潤の結果は同様である。図１から解るように、ヒドロキシエチル澱粉を10％含有
する培養基を１日間使用すると、極めて強い解膨潤がおこる。ヒドロキシエチル
澱粉含有培養基内での１日間の解膨潤後の角膜の厚さ（ＨＨ−厚さ）は0.517±0
.063mmだった。
培養基としては、以下の組成を持つ改良MEMを使用した。
アールの塩を含有するMEM粉状培養基10g
ペニシリン/ストレプトマイシン10ml
アンフォテリシンＢ1ml
牛の胎児の血清100ml
HEPES緩衝剤3.57g
NaHCO3によるｐＨ値の7.2への調整
全体量を１ｌ（リットル）にする量の水
ヒドロキシエチル澱粉含有培養基を作るために、上記改良MEM１リットルあた
りに100gのヒドロキシエチル澱粉を添加した（つまり10％）。
保存条件は、以下の通り：
培養基100mlを内容量150mlのガラス瓶に入れ、密封システム内で、31℃で保存。
使用したアールの塩含有MEM粉状培養基は、以下の成分を含む（それぞれmg/l）
。アミノ酸
Ｌ―アラニン 8.9 Ｌ―リシン 73.0
Ｌ―アルギニンxHCl 126.0 Ｌ―メチオニン 15.0
Ｌ―アスパラギン酸 13.3 Ｌ―フェニルアラニン 32.0
Ｌ―アスパラギン 12.3 Ｌ―プロリン 11.5
Ｌ―シスチン 24.0 Ｌ―セリン 10.5
Ｌ―グルタミン 292.0 Ｌ―トレオニン 48.0
Ｌ―グルタミン酸 14.7 Ｌ―トリプトファン 10.0
グリシン 7.5 Ｌ―チロシン 36.0
Ｌ―ヒスチジンxHClxH2O 42.0 Ｌ―バリン 46.0
L-950ロイシン 52.5 Ｌ―イソロイシン 52.4無機塩
CaCl2無水 200
KCl 400
MgSO4X7H2O 200
NaCl 6800
NaHCO3 2200
NaH2PO4 140ビタミン
塩化コリン 1
葉酸 1
i-イノシット 2
ニコチンアミド 1
パントテン酸Ca塩 1
ピリドキサールHCl 1
リボフラビン 0.1
チアミンHCl 1
その他の成分
グルコース 1000
フェノールレッド 10個々の添加物
インシュリンZn錯体 4
EGF(Epidermal Growth Factor) 150ng/l
アデノシン−5'−燐酸Na塩 4
グアノシン−3'−燐酸Na(2)塩 4.5
2'デソキシチミジン 0.08
シチジン 2.5
ウリジン 2.5
ビタミンAアルコール結晶 1
例２
平均分子量Ｍw117,000を持ち，MS 0.39、DS 0.34、無水グルコース単位におけ
るＣ２置換のＣ６置換に対する比が11であるヒドロキシエチル澱粉を、培養基に
対して5％（重量/容量）の濃度で使用した場合と、デキストラン５００を培養基
に対して5％（重量/容量）の濃度で使用した場合の比較研究
この研究は、ペア（対）の研究として行なった。つまり、同一のドナーから得
られた１枚の角膜をデキストラン５００を5％含有する培養基において、もう１
枚の角膜をヒドロキシエチル澱粉を5％含有する培養基において解膨潤した。合
計で６対調べた。これに先立つ培養期間は、４２日間であった。解膨潤期間は１
日間であった。デキストランを使用した解膨潤には標準的な角膜銀行培養基を使
用したが、これには10％の
牛の胎児の血清が含まれていた。ヒドロキシエチル澱粉での解膨潤の場合も標準
的な角膜銀行培養基を用いたが、これには牛の血清は添加しなかった。この実験
では、角膜の厚さ及び内皮細胞数を測定した。得られた結果は、図１及び２に示
してある。ここから、ヒドロキシエチル澱粉含有培養基での角膜の厚さは0.790
±0.0969mm、デキストラン含有培養基での角膜の厚さは0.7253±0.1251mmである
ことが解る。また、内皮細胞数は、ヒドロキシエチル澱粉含有培養基では、mm2
あたり2.231±296、デキストラン含有培養基では、mm2あたり2.102±283であっ
た。
角膜の保存、角膜の厚さ測定及び内皮細胞数の測定は、C．Redbrakeの教授資
格取得論文アーヘン、１９９６「ドナー基準と器官培養による保存の観点から行
なった、エネルギー供給型代謝に着目したヒト角膜の組織状態の研究」（14頁他
参照）に記載された方法で実施した。
角膜は、凍結点前でPach pens(Meuter社製)を用いて、それぞれ５回ずつ角膜
尖において厚さ測定を行なった。引き続き、内皮細胞の記録写真を撮影した。角
膜１枚につき５枚の写真を撮影し（中央、上、下、右、左からそれぞれ１枚づつ
）、写真ごとに1mm2当たりの内皮細胞数を２回数えた。
結果の統計学的評価は、ペアになった学生のt-Testまたは抜き取り検査のため
のWilcoxon signed rank-Testに従った。
培養基：培養基としては、例１に記載されたものと同じものを使用したが、ヒド
ロキシエチル澱粉含有培養基調整のためには改良MEMに50ｇのヒドロキシエチル
澱粉を添加し、デキストラン含有培養基調整のためには、改良MEMに50ｇのデキ
ストラン５００を添加した。
保存条件は、例１に記載されたものと同様であった。
例３
平均分子量Ｍw117,000を持ち、MS 0.39、DS 0.34、無水グルコース単位におけ
るＣ２置換のＣ６置換に対する比が11であるヒドロキシエチル澱粉を、培養基に
対して7.5%（重量/容量）の濃度で使用した場合と、デキストラン５００を培養
基に対して5%（重量/容量）の濃度で使用した場合の比較研究
この研究もペアの研究として行なった。実施した数は、１３対であった。培養
期間は15日間で、解膨潤期間はわずか１日間だった。本研究で得られた結果は、
図３及び４に示されている。7.5%ヒドロキシエチル澱粉含有培養基での解膨潤結
果は極めて良好で（角膜の厚さ：ヒドロキシエチル澱粉含有培養基では0.634±0
.072mm;デキストラン含有培養基では0.805±0.085ｍｍ）、同時に内皮細胞の破
壊も増大してはいなかった。内皮細胞数は、オキシエチル澱粉含有培養基では１
mm2につき2,310±289でありデキストラン含有培養基では1mm2につき2,272±276
であった。
培養基としては例１記載のものと同じ改良MEMを使用したが、ヒドロキシエチ
ル澱粉含有培養基の場合には改良MEMに75gのヒドロキシエチル澱粉（濃度7.5%）
を添加し、デキストラン含有培養基の場合には改良MEMに50ｇ（濃度5％）のデキ
ストラン５００を添加した。培養条件は、前述の例で述べた条件に従った。
例４比較例
以下の比較研究では、分子量Ｍw133,800を持ち、MS 0.44、DS 0.38、無水グル
コース単位におけるＣ２置換のＣ６置換に対する比が12.4であるヒドロキシエチ
ル澱粉を培養基に対して7.5%（重量/容量）の濃度で使用した場合と、デキスト
ラン５００を培養基に対して5％（重量/容量）の濃度で使用した場合の、それぞ
れの用いられた解膨潤作用のある物質からの解膨潤剤が角膜の代謝状況に与える
影響を調べた。
この研究では、１２対のヒト角膜を標準条件下で15日間保存した。同一のドナ
ーの片眼の角膜を5％のデキストラン５００含有培養基で、他方の眼の角膜を7.5
%のヒドロキシエチル澱粉含有培養基で、それぞれ１日間解膨潤した（培養基と
保存条件は、例１から３までに記載されたものと同様であるが、HES及びデキス
トランは上述のものを使用した）。次いでグルコース、乳酸エステル、ATP、ADP
及びAMPの定量のための生化学的研究を、生物発光を利用して実施した（定量は
、C．Redbrakeの教授資格取得論文アーヘン、１９９６、「ドナー基準と器官培
養による保存の観点から行なった、エネルギー供給型代謝に着目したヒト角膜の
組織状態の研究」、１４頁他の方法に従った）。生化学的研究に先立って行われ
る組織の湿潤状態での重量及び乾燥状態での重量の測定によって、角膜ごとに含
水量を算出することができ、これによって解膨潤の程度を知ることができる。通
常、ヒト角膜の含水量は約80%とされている。
結果の統計学的評価には、アップル社のStat-Works-Programmを使用した。Man
-Whitney U-Testも使用した。評価のため含水量の他に、グルコース、乳酸エス
テル、ATP、ADP、AMPの含有量及びアデニル酸エネルギー充率を測定した。
ヒト角膜は主に眼房水からグルコースを摂取し、これを角膜内で解糖によりピ
ルビン酸に、さらに嫌気的条件下で乳酸エステルに変換するこ
とによって養分を得ている。酸素が充分に存在する場合には、クエン酸回路を通
る好気的過程も通り、呼吸鎖をたどることになる。嫌気的解糖と好気的解糖の割
合は65%対35%で、圧倒的に嫌気的解糖が勝っている。ゆえに、エネルギー取得の
基質としてグルコースが、そして主たる代謝の最終生産物として乳酸エステルが
、ヒト角膜の代謝成果の重要なパラメーターとなる。解糖によってエネルギーを
得る際、細胞はアデノシン三燐酸(ATP)、アデノシン二燐酸(ADP)、アデノシン一
燐酸(AMP)というエネルギー豊富なアデノシン燐酸をとり入れる。これらのエネ
ルギー豊富な燐酸エステルは、例えば細胞移動、細胞***、能動的な移動メカニ
ズムなどのような、全ての重要な細胞機能にとって必要不可欠である。アデノシ
ン燐酸の量が多ければ多い程、細胞はより多くの機能を発揮することができる。
また、他の全ての組織の場合と同様に、角膜においてもアデノシン燐酸の合計は
、細胞量を反映することになる。これとは逆に、アデニル酸エネルギー充率は相
対的なパラメーターであり、個々の細胞の状態やエネルギー平衡を示している。
本研究から、以下の結果が得られた。
ａ） 角膜の含水量は、7.5%ヒドロキシエチル澱粉(HES)を使用して解膨潤し
た場合の方が、5%のデキストラン５００を使用した解膨潤の場合よりもはるかに
小さくなっていた。HES解膨潤角膜の生理学的含水量は79.95%±1.83%であり、デ
キストラン解膨潤角膜では82.76±1.66%であった（図６参照）。
ｂ） 解膨潤していない角膜内のグルコース濃度に比べると、解膨潤後の角膜
内のグルコース濃度は低くはなっていたが、その差は統計的には意味がなかった
。デキストラン解膨潤角膜に比べると、HES解膨潤角膜においては標準偏差は極
めて小さかった。HES解膨潤角膜では湿潤重量１ｇあたりのグルコース含有量は0
.1595±0.085μmol、デキストラン解膨潤角膜では湿潤重量１ｇあたり0.1825±0
.3356μmolだった（図７
参照）。
ｃ） グルコース濃度の場合と同様に、乳酸エステル濃度も低下していたが、
ここでも有意差はなかった。HES解膨潤角膜の湿潤重量１ｇあたりの乳酸エステ
ル含有量は3.4896±1.6016μmolであり、デキストラン解膨潤角膜の湿潤重量１
ｇあたりでは3.3708±2.0025μmolであった（図８参照）。
ｄ） いずれにせよ、解膨潤によってATPは減少した、がその減少度はHESを使
用した解膨潤の場合の方が小さく、15日間保存のものと比べてもあまり差がなか
った。これに対してデキストランを使用した解膨潤ではATP濃度は統計的に高い
有意差であった。デキストラン解膨潤に比べると、HES解膨潤の場合の方が明ら
かに高いATP値を示した。HES解膨潤の場合は角膜乾燥重量１ｇあたり124.6525nm
ol、デキストラン解膨潤の場合は角膜乾燥重量１ｇあたり29.6136nmolであった
（図９参照）。
ｅ） ADP測定でもATP測定の場合と似たような結果が見られた。HES使用の場
合は、ADP濃度はほとんど安定していた。これに対して、デキストラン解膨潤後
のADP濃度は解膨潤をせずに保存した場合のADP濃度と比較すると、著しく低下し
ていた。これに対して、HES解膨潤では、顕著な低下は見られなかった。HES使用
の場合の乾燥重量１ｇ当たりのADP含有量は104.3943±117.6315nmolであり、デ
キストラン使用では乾燥重量１ｇあたり39.4678±48.8060nmolであった（図９参
照）。
ｆ） よりエネルギーの豊富な二つのアデノシン燐酸とは異なり、AMPはHES使
用の解膨潤により増加した。この差はデキストラン使用の解膨潤の場合と比べて
も、また解膨潤前のAMP値と比べても、統計的に有意であった。HES使用の値は、
乾燥重量１ｇあたり58.8233±46.5900nmolであり、デキストラン使用では乾燥重
量１８ｇあたり32.0286±
47.4505nmolであった（図９参照）。
ｇ） 全燐酸エステルの合計（ATP+ADP+AMPの総和）：
HES解膨潤の場合は、解膨潤前後でほぼ同じ値が得られたが、これに対しデキ
ストラン使用の場合はエネルギーの豊富な燐酸エステルは著しく減少した。また
、HES使用解膨潤の場合の値とデキストラン使用解膨潤の場合の値との差は極め
て大きかった。乾燥重量１ｇあたりにつき、HES使用では280.6866±294.1l84nmo
lであり、デキストラン使用では乾燥重量１ｇ101.1101±124.0265nmolであった
（図１０参照）
ｈ） アデニル酸エネルギー充率：
エネルギー状態は、比較した３つのグループ間でほとんど差が見られなかった
。HES使用の場合の値は0.55±0.16であり、デキストラン使用の場合は0.65±0.1
6だった(図１１参照)。
図６から１１では、比較のために解膨潤前の平均値±標準偏差も追記してある
。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Reagent for dehydration of cornea in organ cultureTechnical field
The present invention relates to a skin, especially a corn, for organ culture, comprising a culture medium and a swelling substance.
Cortices, human and animal, preferably human keratin, especially eye cornea swelling agents
In the culture of organs of the skin, especially the corneum, and more particularly the cornea of the eye.
Using hydroxyethyl starch as a de-swelling substance or organ culture
Hydroxyethyl starch for the preparation of keratodermis, especially ocular corneal de-swelling agent
It is about using.Background art
In particular, the well-known hydroxyethyl used in the field of bulking agents and blood diluents
Starch has various average molecular weights MwAnd substitution degree MS (molar substitution) and DS (degree of substitution)
And various substitution types. These properties are described in the literature (K.S.
ommermeyer et al., “Clinically Used Hydroxyethyl Starch: Its Physical Chemistry
Characteristic ”hospital dispensing law,“ Klinisch
Charakterisierung ", Krankenhauspharmazie, p.271, (1987), and EP-0402 724
B1).
As used herein, the “keratin skin” refers to keratin in general, particularly the cornea of the eye. This skin
The skin may be of human or animal (eg, pig) origin
No.
Hereinafter, the invention relating to the cornea of the eye will be described for explanation, but the invention is not limited thereto.
Not something.
Today, the human (eye) cornea can be stored for 4 weeks before transplantation using organ culture
It is. However, during this time, the cornea absorbs a considerable amount of water and swells. Through
Usually, the thickness of the cornea is about 0.5 mm. However, this value reached 0.9 mm during culturing.
I will. Therefore, when using preserved corneas, moderate swelling before transplantation
Required. This swelling is currently occurring in corneal banks in all European countries.
By adding Dextran 500. Its concentration is 5-8%
Yes, the swelling period following the storage period is 1-7 days.
However, dextran-based swelling causes corneal energy-fed metabolism.
There have been reports of significant impairment (Redbrake, C .: "Don't
Horns focused on energy-supplied metabolism from the perspective of storage by incubator culture
Study of the Tissue State of the Membrane ”(“ Untersuchungen der
Spenderkriterien und Lagerung in der Organkulutur unter besonderer
Aachen, 1996, Salla S. et al., Cornea 14 (5), 502-508
, 1995). At the same time, the number of endothelial cells, which has a decisive effect on the success of the transplant, has been reduced
I do. In addition, large dextran molecules are already absorbed into the cornea after one day of use
Studies have shown that it may have harmful effects. Also dipped
One must take into account that the effect of osmotic pressure also leads to cell destruction. Soy sauce
As storage in dextran-containing media continues, corneal endothelial cells and other layers gradually
Will be damaged. Dextran-induced cell destruction was an earlier study
(Sperling S., Acta Ophthalmoligica. Vol. 57 (1979), 269)
-Refer to page 276). Use 450,000 hydroxyethyl starch to determine other swelling substances.
(Reim. M. et al., Klin. Mbl. Augenheilk. 196.76-
80, (1990)). There, dextran
To eliminate the necessary swelling period before transplantation, rather than looking for alternatives
The emphasis was on preventing the cornea from swelling during storage. This test
Although hydroxyethyl starch 450,000 certainly showed a good osmotic effect,
Degradation of the culture medium into extreme sugar excess due to molecular degradation, adversely affecting corneal metabolism
Has been given. In organ cultures in nutrient-rich media, corneal metabolism is usually
It should be restored.Disclosure of the invention
It is an object of the present invention to keep the cornea during storage in a non-swelling state, or to preserve the stored cornea.
Suitable for de-swelling the membrane before transplantation and has the disadvantageous effects shown by conventional agents
The aim is to provide a fruitless agent.
In the present invention, surprisingly, the average molecular weight Mw70,000-200,000, with a degree of substitution M
S is 0.15-0.5, substitution degree DS is 0.15-0.5, and C2-substitution in anhydroglucose unit is
Hydroxyethyl starch whose ratio to C6 substitution is ≧ 8 is used as a de-swelling substance.
When used in place of dextran, the cornea can be used without increasing endothelial cell destruction.
Results in better swelling of the corneal swelling and much better corneal metabolic status
I understood that it would be.
Hydroxyethyl starch suitable for the present invention refers to an average molecular weight Mw70,000-200,000
The substitution degree MS is 0.15-0.5, the substitution degree DS is 0.15-0.5, and
In which the ratio of C2 to C6 substitution is ≧ 8, in particular the average molecular weight Mw
100,000-160,000, substitution degree MS is 0.2-0.45, substitution degree DS is 0.2-0.4, anhydrous
Such that the ratio of C2 to C6 substitution in the glucose unit is 8-20
It is. In particular, the average molecular weight Mw130,000 ± 20,000 (HES 130), substitution degree MS is 0.3
8-0.45, substitution degree DS is 0.32-0.40, C6 substituted C6 in anhydroglucose unit
Hydroxyethyl starch with a ratio to substitution of 8-20 is suitable.
For example, the average molecular weight Mw117,000, substitution degree MS0.39, substitution degree DS0.34, anhydrous gluco
The ratio of C2 to C6 substitution in the base units is 11
Powder, average molecular weight Mw133,800, substitution degree MS0.44, substitution degree DS0.38, anhydrous glucose
Hydroxyethyl starch wherein the ratio of C2 to C6 substitution in units is 12.4
, Average molecular weight Mw148,700, substitution degree MS0.42, substitution degree DS0.37, anhydrous glucose
The ratio of C2 to C6 substitution at the 1-position is 11.7, such as hydroxyethyl starch.
What is it?
The hydroxyethyl starch used in the present invention is EP 0 402 724 B1 and DE 39 19
729. Where EP 0 402 724 B1
And DE 39 19 729 indicate that it is particularly relevant here for the purpose of disclosure
.
The agent according to the invention, i.e. the hydroxyethyl starch used according to the invention, is completely preserved.
Keep the cornea unswelled for a period of time (long-term culture), ie swelling of the cornea
To prevent corneal swelling during storage and to swell before transplantation.
And for the purpose of adding according to the method of the present invention.
As used herein, the term “defelling substance” or “defelling agent” is used after storage.
Use for corneal de-swelling and culture to keep the cornea during storage in a non-swelling state
It refers to its use as an additive that is continuously added to the group.
The agents of the present invention also include various culture media containing hydroxyethyl starch.
In the present invention, hydroxyethyl starch is present at a concentration of 1-20% (weight / volume) in the culture medium.
used. Especially 2-15% (weight / volume), especially 5-10% (weight / volume), for example 7.5
% (Weight / volume) contained in the culture medium
Is preferred.
To reduce corneal swelling over the entire storage period, the hydro-
Xyethyl starch is 1-10% (weight / volume), especially 1-5% (weight / volume), especially 2-7.5%
Preferably, it is added to the culture medium at a concentration of% (weight / volume).
In order to de-swell the cornea that has expanded during storage before transplantation, use hydroxy
Chill starch is 1-20% (weight / volume), especially 2-15% (weight / volume),
For example, it is preferable to add at a concentration of 5-10% (weight / volume), for example, 7.5% (weight / volume).
New
The preservation of the cornea in the culture medium should be performed under the conditions normally used for corneal banks, for example, in a refrigerator.
Open or sealed culture at a temperature of about 4 ℃ or 30-37 ℃
Implemented under the system.
As a culture medium, a culture medium for cells and tissues for human and animal corneal organ culture is used.
All well-known nutrient groups are suitable. Culture medium suitable for cornea
44-53), modified TC199-culture medium (Reim, M. Klin. Mbl. Augenheilk. 196 (1990), 76)
-80), MEM (Minimum Essential Medium) (Invest Ophthalmol Vis sci 12 (1973)
, Pp. 176-180), and improved MEMs (eg, Redbrake, C., Dissertation Aachen,
1996, p.15; "Improvement of MEM using Earl's salt, Hank's salt, etc.")
. In the present invention, MEM, modified MEM or TC199 is preferably used as a culture medium.
In the present invention, the average molecular weight MwHas 117,000, substitution degree MS0.39, substitution degree DS0.34
Wherein the ratio of C2 substitution to C6 substitution in anhydroglucose units is 11,
Obtained from experiments in which xylethyl starch was added to the culture medium at concentrations of 10%, 7.5% and 5%
As can be seen from FIG. 5, the degree of swelling of the cornea is
It was found to be related to the concentration of hydroxyethyl starch used (Examples 1-3)
See). Despite the difference in the length of corneal storage, the degree of swelling and
There was a clear dependence between the concentration of droxyethyl starch and the concentration. This is
The ability of droxyethyl starch to produce an equal de-swelling effect for various degrees of swelling.
And can be done.
The hydroxyethyl starch used in the present invention has a measured corneal thickness and a water content.
As can be seen from the low, it leads to a very good swelling of the cornea and
Does not increase the destruction of Furthermore, in addition to good de-swelling, the hydroxyethyl acrylate of the present invention
Starch greatly improves corneal metabolism and impairs metabolic recovery in organ culture
Absent. In addition, no toxic effects were observed as expected with dextran.
That is, when the hydroxyethyl starch of the present invention is de-swelled, dextran
Is in a better energy state than corneal material de-swelled using
Thus, a corneal material for transplantation that can withstand the above can be obtained.
If the hydroxyethyl starch of the present invention is used for swelling, culturing for swelling
It is possible to extend the storage period in the base to more than the previous four days,
Long-term addition as a swelling substance over the entire organ culture
.Description of the drawings
FIG. 1 relates to Examples 1 and 2 for HES (Mw117,000, MS 0.39, DS 0.34, anhydrous glucose
The ratio of C2 substitution to C6 substitution in the unit 11) was 5% and 10%
1 when dextran 500 was used at a concentration of 5%.
The corneal thickness (HH-thickness) after one day of swelling is shown.
FIG. 2 relates to Example 2, wherein HES (Mw117,000, MS 0.39,
DS 0.34, the ratio of C2 substitution to C6 substitution in anhydroglucose units is 11)
Or use Dextran 500 at a concentration of 5% each and de-swell for 1 day
Shows the number of corneal endothelial cells.
FIGS. 3 and 4 relate to Example 3, in which HES (Mw117,000, MS 0.39,
DS 0.34, the ratio of C2 substitution to C6 substitution in anhydroglucose units is 11)
After using dextran 500 at a concentration of 5% at a concentration of 7.5% and de-swelling for 1 day
It shows the thickness of the cornea and the number of endothelial cells.
FIG. 5 shows that the degree of swelling of the cornea was determined by the HES (Mwll 7,000, MS 0.39, DS 0.34, anhydrous
The ratio of C2 substitution to C6 substitution in the glucose unit is 11)
Depending on the concentration (5%, 7.5% or 10%) (Examples 1, 2 and 3)
See).
6 to 11 relate to Example 4 and show that HES (Mw133,800, MS 0.44,
DS 0.38, the ratio of C2 substitution to C6 substitution in anhydroglucose units is 12.4)
7.5% and dextran 500 at 5%, respectively.
Study of the effects of different swelling agents on corneal metabolism by one day of swelling
Results are shown. In particular,
FIG. 6 shows the different water contents of the cornea,
FIG. 7 shows the corneal glucose content,
FIG. 8 shows the lactate content of the cornea measured for each,
FIG. 9 shows the corneal ATP, ADP and AMP contents measured for each,
FIG. 10 shows the measured total value of adenosine phosphate measured in the cornea,
FIG. 11 shows the energy state of each cornea.
7 to 11 show that the cornea was similarly obtained after storage in culture medium (MEM) for 15 days.
The values given are also shown.BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples. In some cases, the cornea of the eye is always used as the cornea
did.
Example 1
Average molecular weight MwHas 117,000, in MS 0.39, DS 0.34, anhydroglucose unit
Hydroxyethyl starch (HES) having a ratio of C2 substitution to C6 substitution of 11 was added to the culture medium.
When used at 10% concentration
Three human corneas were treated with the above hydroxyethyl starch at a concentration of 10% (weight / volume).
Deswelled for one day in the containing culture medium. These corneas are 32 days prior to this operation
Stored under culture conditions of the corneal bank in a culture medium containing no HES
is there. Swelling usually peaks after 14 days, so swelling for longer storage periods
The results for Jun are similar. As can be seen from FIG. 1, it contains 10% of hydroxyethyl starch
The use of a culturing medium for one day results in a very strong swelling. Hydroxyethyl
The corneal thickness (HH-thickness) after one day of swelling in a starch-containing medium is 0.517 ± 0.
It was .063mm.
As a culture medium, an improved MEM having the following composition was used.
10g MEM powdered medium containing Earl's salt
Penicillin / Streptomycin 10ml
Amphotericin B 1ml
100 ml of bovine fetal serum
3.57g HEPES buffer
NaHCOThreePH value to 7.2 by pH
Water to bring the total volume to 1 liter
To produce a hydroxyethyl starch-containing culture medium, 1 liter of the above modified MEM was added.
To this was added 100 g of hydroxyethyl starch (ie 10%).
The storage conditions are as follows:
100 ml of culture medium is placed in a 150 ml glass bottle and stored at 31 ° C in a sealed system.
The Earl's salt-containing MEM powder culture medium used contains the following components (mg / l each)
.amino acid
L-alanine 8.9 L-lysine 73.0
L-arginine xHCl 126.0 L-methionine 15.0
L-aspartic acid 13.3 L-phenylalanine 32.0
L-asparagine 12.3 L-proline 11.5
L-cystine 24.0 L-serine 10.5
L-glutamine 292.0 L-threonine 48.0
L-glutamic acid 14.7 L-tryptophan 10.0
Glycine 7.5 L-tyrosine 36.0
L-histidine x HCl x HTwoO 42.0 L-valine 46.0
L-950 leucine 52.5 L-isoleucine 52.4Inorganic salt
CaClTwoAnhydrous 200
KCl 400
MgSOFourX7HTwoO 200
NaCl 6800
NaHCOThree 2200
NaHTwoPOFour 140vitamin
Choline chloride 1
Folic acid 1
i-Inosit 2
Nicotinamide 1
Pantothenic acid Ca salt 1
Pyridoxal HCl 1
Riboflavin 0.1
Thiamine HCl 1
Other ingredients
Glucose 1000
Phenol red 10Individual additives
Insulin Zn complex 4
EGF (Epidermal Growth Factor) 150ng / l
Adenosine-5'-phosphate sodium salt 4
Guanosine-3'-phosphate Na (2) salt 4.5
2 'desoxythymidine 0.08
Cytidine 2.5
Uridine 2.5
Vitamin A alcohol crystals 1
Example 2
Average molecular weight MwHas 117,000, MS 0.39, DS 0.34, in anhydrous glucose units
Hydroxyethyl starch having a ratio of C2 to C6 substitution of 11
5% (weight / volume) of dextran 500
Study when used at a concentration of 5% (weight / volume)
This study was performed as a pair study. In other words, the same donor
One of the obtained corneas was cultured in a culture medium containing 5% of Dextran 500 for another one.
The corneas were swelled in a culture medium containing 5% hydroxyethyl starch. Combination
A total of six pairs were examined. The preceding culture period was 42 days. The swelling period is 1
Days. De-swell with dextran using standard corneal bank culture media.
Used, but this included 10%
Fetal bovine serum was included. Standard for de-swelling with hydroxyethyl starch
A typical corneal bank culture medium was used without the addition of bovine serum. This experiment
Then, the thickness of the cornea and the number of endothelial cells were measured. The results obtained are shown in FIGS.
I have. From this, the thickness of the cornea in the hydroxyethyl starch containing medium was 0.790.
± 0.0969mm, corneal thickness in dextran containing medium is 0.7253 ± 0.1251mm
I understand. In addition, the number of endothelial cells was mm in the hydroxyethyl starch-containing culture medium.Two
2.231 ± 296 per mm, in dextran containing mediumTwo2.102 ± 283 per
Was.
The preservation of the cornea, the measurement of the thickness of the cornea, and the measurement of the number of endothelial cells were performed as described in C.I. Redbrake teaching resources
Aachen, 1996 "Doing from the perspective of donor standards and preservation by organ culture"
Research on Human Corneal Tissue Focusing on Energy-Supplied Metabolism ”
Reference).
The corneas were washed 5 times each with Pach pens (Meuter) before the freezing point.
Thickness measurements were made at the cusps. Subsequently, a recorded photograph of the endothelial cells was taken. Corner
Take 5 photos per film (one each from center, top, bottom, right, left)
), 1mm per photoTwoThe number of endothelial cells was counted twice.
Statistical evaluation of results is for t-Test or sampling testing of paired students
According to Wilcoxon signed rank-Test.
Culture medium: The same culture medium as described in Example 1 was used.
For the preparation of the medium containing loxyethyl starch, 50 g of hydroxyethyl was added to the improved MEM.
Starch was added and 50 g of dextran was added to the improved MEM to prepare a dextran-containing medium.
Strand 500 was added.
Storage conditions were similar to those described in Example 1.
Example 3
Average molecular weight MwHas 117,000, MS 0.39, DS 0.34, anhydroglucose unit
Hydroxyethyl starch having a ratio of C2 to C6 substitution of 11
Dextran 500 when used at a concentration of 7.5% (weight / volume)
Comparative study when used at a concentration of 5% (weight / volume) based on the group
This study was also performed as a pair study. The number performed was 13 pairs. culture
The duration was 15 days and the swelling period was only one day. The results obtained in this study
This is shown in FIGS. De-swelling in medium containing 7.5% hydroxyethyl starch
Fruits are extremely good (corneal thickness: 0.634 ± 0 in hydroxyethyl starch containing medium)
.072 mm; 0.805 ± 0.085 mm for dextran-containing medium)
The destruction had not increased. The number of endothelial cells was 1 in the culture medium containing oxyethyl starch.
mmTwo2,310 ± 289 per dextran-containing mediumTwo2,272 ± 276 per
Met.
As the culture medium, the same improved MEM as described in Example 1 was used,
75% hydroxyethyl starch (7.5% concentration) in modified MEM in the case of starch-containing medium
And add 50 g (5% concentration) to the improved MEM in the case of a dextran-containing culture medium.
Strand 500 was added. The culture conditions were in accordance with the conditions described in the above example.
Example 4Comparative example
In the comparative studies below, the molecular weight Mw133,800, MS 0.44, DS 0.38, anhydrous glue
Hydroxyethyl having a ratio of C2 substitution to C6 substitution of 12.4 in the course unit.
When using starch at a concentration of 7.5% (weight / volume) based on the culture medium,
When run 500 was used at a concentration of 5% (weight / volume) based on the culture medium,
Deswelling agents from the used swelling substances give corneal metabolic status
The effects were investigated.
In this study, 12 pairs of human corneas were stored under standard conditions for 15 days. Same Donna
Of one eye was cultured in a culture medium containing 5% dextran 500, and
% Of hydroxyethylstarch-containing culture medium, respectively, for 1 day.
The storage conditions are the same as those described in Examples 1 to 3, but with HES and dex.
Tran was used as described above). Then glucose, lactate, ATP, ADP
Biochemical studies for quantification of AMP and AMP were performed using bioluminescence.
, C. Redbrake's teaching qualification dissertation Aachen, 1996, "Donor criteria and organ culture.
Of human cornea focusing on energy-supplied metabolism
Study of Tissue Condition ", page 14, and other methods). Done prior to biochemical research
By measuring the wet and dry weights of the tissue,
The amount of water can be calculated, and thereby the degree of swelling can be known. Through
Normally, the water content of human cornea is about 80%.
Stat-Works-Programm from Apple Inc. was used for statistical evaluation of the results. Man
-Whitney U-Test was also used. In addition to water content, glucose, lactate
The contents of tellurium, ATP, ADP, AMP and adenylate energy charge were measured.
The human cornea ingests glucose mainly from the aqueous humor and pips it in the cornea by glycolysis.
Can be converted to rubic acid and further to lactate under anaerobic conditions.
And get nutrients by. If sufficient oxygen is present, pass through the citric acid cycle.
It follows the aerobic process and follows the respiratory chain. Anaerobic and aerobic glycolysis
At 65% vs. 35%, anaerobic glycolysis predominates. Therefore, energy acquisition
Glucose as a substrate and lactate as the main end product of metabolism
, Is an important parameter of metabolic outcome in human cornea. Energy by glycolysis
When obtaining, cells are treated with adenosine triphosphate (ATP), adenosine diphosphate (ADP), adenosine monophosphate.
Incorporates energy-rich adenosine phosphate called phosphoric acid (AMP). These energy
Lug-rich phosphates can be used, for example, for cell migration, cell division, and active migration mechanisms.
It is essential for all important cellular functions, such as rhythms. Adenoshi
The higher the amount of phosphoric acid, the more cells the cell can perform.
Also, as in all other tissues, the total amount of adenosine phosphate in the cornea is also
Will reflect the amount of cells. Conversely, adenylate energy charge rate is
It is a contradictory parameter, indicating the state and energy balance of individual cells.
The following results were obtained from this study.
a) The water content of the cornea was swelled using 7.5% hydroxyethyl starch (HES).
Is much better than swelling with 5% Dextran 500
It was getting smaller. The physiological water content of the HES de-swelled cornea is 79.95% ± 1.83%,
It was 82.76 ± 1.66% in the kisslan-unswelled cornea (see FIG. 6).
b) Compared to the concentration of glucose in the uncornered corneas,
Glucose concentration was low, but the difference was not statistically significant
. Compared to dextran swelled corneas, the standard deviation is very small in HES swelled corneas.
It was small. The HES de-swelled cornea has a glucose content of 0 g / g wet weight
.1595 ± 0.085 μmol, 0.1825 ± 0 / g wet weight for dextran de-swelled cornea
.3356 μmol (Fig. 7
reference).
c) As in the case of the glucose concentration, the lactate concentration also decreased.
Again, there was no significant difference. Lactic acid esthetic per 1 g wet weight of HES de-swelled cornea
Content is 3.4896 ± 1.6016 μmol, and the wet weight of dextran de-swelled cornea is 1
It was 3.3708 ± 2.0025 μmol / g (see FIG. 8).
d) In any case, ATP decreased due to swelling, but the degree of the decrease was determined using HES.
Swelling was smaller than that used for 15 days
Was. In contrast, ATP concentration is statistically higher in swelling with dextran
There was a significant difference. Compared to dextran swelling, HES swelling is clearer
A high ATP value was shown. 124.6525nm per 1g of corneal dry weight for HES de-swelling
ol, 29.6136 nmol per gram of corneal dry weight in the case of dextran de-swelling
(See FIG. 9).
e) Similar results were obtained in ADP measurement as in ATP measurement. Place of HES use
In this case, the ADP concentration was almost stable. In contrast, after dextran de-swelling
ADP concentration was significantly lower than the ADP concentration when stored without swelling.
I was In contrast, no significant decrease was observed in HES swelling. HES used
The ADP content per 1 g of dry weight in the case of is 104.3943 ± 117.6315 nmol,
The amount of kisstran used was 39.4678 ± 48.8060 nmol / g dry weight (see FIG. 9).
See).
f) Unlike two more energy-rich adenosine phosphates, AMP uses HES.
Increased by swelling. This difference is greater than in swelling with dextran.
Was also statistically significant when compared to the AMP values before swelling. The value of using HES is
58.8233 ± 46.5900 nmol per gram dry weight.
32.0286 ± per 18g
It was 47.4505 nmol (see FIG. 9).
g) Sum of all phosphates (sum of ATP + ADP + AMP):
In the case of HES swelling, almost the same values were obtained before and after swelling.
In the case of using the stran, the energy-rich phosphate ester was significantly reduced. Also
The difference between the value for swelling using HES and the value for swelling using dextran is extremely small
It was big. 280.6866 ± 294.1l84nmo with HES per 1g dry weight
l and the dry weight was 1 g 101.1101 ± 124.0265 nmol when dextran was used.
(See Fig. 10)
h) Adenylic acid energy charge:
Energy status showed little difference between the three groups compared
. The value when using HES is 0.55 ± 0.16, and when using dextran is 0.65 ± 0.1
6 (see FIG. 11).
6 to 11, the average value ± standard deviation before swelling is also added for comparison.
.