JP2001510044A

JP2001510044A - 改変された、背側組織に影響する因子および組成物

Info

Publication number: JP2001510044A
Application number: JP2000503202A
Authority: JP
Inventors: ネイルスタール，; リチャードエム．ハーランド，; アリスエヌ．エコノマイデス，
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-07-17
Filing date: 1998-07-17
Publication date: 2001-07-31
Anticipated expiration: 2018-07-17
Also published as: DE69819167D1; IL134042A; CA2296769A1; AU8570898A; US20030129703A1; US6075007A; ATE252639T1; AU735851B2; EP1003860B1; WO1999003996A1; HK1026229A1; US6500640B1; DE69819167T2; JP4181300B2; IL134042A0; CA2296769C; EP1003860A1

Abstract

(57)【要約】改変されたノギンムテイン、該ムテインを含む組成物、および該ムテインのコード（センス）もしくはアンチセンス配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

本国際出願は、１９９７年７月１７日出願の米国特許出願第８９７,２３６号の優先権を主張する。この出願の開示を本明細書に参考として援用する。本明細
書中には、種々の刊行物が引用される。これら刊行物の開示を、全体として、本
明細書に、参考として援用する。

【０００１】本発明は、一般に、背方成長誘導活性を有する成長因子に関する。より詳細に
は、本発明は、シュペーマン（Ｓｐｅｍａｎｎ）オーガナイザーシグナルである
ノギンの改変された形態、この改変されたノギンを含む組成物、改変されたノギ
ンのコード（センス）もしくはアンチセンス配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列
に関する。

【０００２】（発明の背景）成長因子は、インビボもしくはインビトロで、動物細胞の規定された集団の成
長（増殖）に影響するが、栄養素物質ではない、ポリペプチドホルモンのような
物質である。組織の成長または分化に関与するタンパク質は、成長または分化を
促進し得るかまたは阻害し得る。したがって、一般的用語「成長因子」は、サイ
トカインおよび栄養因子を含む。

【０００３】成長因子、そのレセプター、そのＤＮＡもしくはＲＮＡのコードもしくはアン
チセンス配列およびフラグメントは、多くの治療、臨床、研究、診断、および薬
物設計の適用において有用である。例えば、１９８９年８月１５日発行の米国特
許第４,８５７,６３７号（動物をその成長ホルモンレセプターに対して免疫する
方法）；１９９０年６月１２日発行の米国特許第４,９３３,２９４号（ヒトＥＧ
Ｆレセプターを含むアッセイおよび治療法）；１９９１年７月９日発行の米国特
許第５,０３０,５７６号（製薬産業による薬物設計および薬物スクリーニングに
おけるレセプターおよびレセプターハイブリッドの役割）；１９９２年２月１１
日発行の米国特許第５,０８７,６１６号（成長因子結合体を含む組成物を使用す
る、腫瘍細胞を破壊する方法）；１９９２年３月２４日発行の米国特許第５,０９８,８３３号（治療もしくは診断組成物に有用な発現系）；および１９９２年４月２日公開の国際出願公開第ＷＯ９２/０５２５４号（新規神経栄養因子についての単離、調製、および適用の種々の局面）を参照。これらはそれぞれ、本明
細書中に参考として援用される。

【０００４】シュペーマンオーガナイザーは、Ｘｅｎｏｐｕｓにおいて、背側外胚葉から神
経組織を誘導しそして側板中胚葉および腹側中胚葉を背方化する。予測された性
質を有する、シュペーマンオーガナイザーシグナルの最初の分子は、Ｘｅｎｏｐ
ｕｓ胚において背側構造を誘導する活性についての発現スクリーニングで同定さ
れ、そしてノギンと呼ばれた（Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｃ．およびＨａｒｌａｎｄ，Ｒ
．Ｍ．Ｃｅｌｌ７０：８２９−８４０（１９９２））。ノギンのようなオー
ガナイザーシグナルは、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）遺伝子
スーパーファミリーの骨誘導因子（ＢＭＰ）クラスのメンバーによって拮抗され
得る。ノギンタンパク質が、ＢＭＰ−４と高い親和性で結合し、そして同族の細
胞表面レセプターへの結合をブロックすることによってＢＭＰ−４活性を廃止す
ることが最近報告された（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｌ．ＢらＣｅｌｌ８６：５
９９−６０６（１９９６））。

【０００５】正常な骨形成における役割に加えて、ＢＭＰは、ＢＭＰが異常な骨成長を促進
する疾患に関与しているようである。例えば、ＢＭＰは、患者が、動作を妨げる
異常な「第２の骨格」を成長させる進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）とし
て公知である疾患において原因的役割を演じていると報告されている。

【０００６】（発明の要旨）本発明のポリペプチドは、脊椎動物において背方成長を誘導し、そして多くの
治療、臨床、および診断適用のために、可溶性で生理学的に活性な形態で調製さ
れ得る。

【０００７】好ましい実施態様において、図１Ａ〜１Ｂに示されるヒトノギンタンパク質（
配列番号２）、または例えば図１４に示される改変されたノギンタンパク質（配
列番号２３）は、治療、臨床、および診断適用における使用のために調製される
。

【０００８】本発明の別の局面において、配列番号１に対して実質的に類似性を有するオリ
ゴヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ）が提供される。このオリゴヌクレオチドは
、一本鎖または二本鎖であり得、ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基から形成され得、そし
て配列番号１に関してアンチセンス方向であり得る。配列番号１は、発現する場
合、脊椎動物において背方発生を誘導し得る、本発明者らが「ノギン」と名付け
た機能的なポリペプチドをコードする。

【０００９】ノギンまたはそのフラグメントもしくはムテイン（これもまたインビトロ方法
によって合成され得る）は、（組換え発現またはインビトロ共有法により）免疫
原性ポリペプチドに融合され得、そしてこれは、次に、ノギンエピトープに対す
る抗体を惹起させるため、動物を免疫するために使用され得る。抗ノギンは、免
疫した動物の血清から回収可能である。あるいは、モノクローナル抗体が、従来
の様式で、免疫した動物の細胞から調製され得る。慣用的なスクリーニングによ
り同定された抗体は、ノギンに結合するが、「ｗｎｔ」または他の成長因子とは
実質的に交差反応しない。固相化した抗ノギン抗体は、ノギンの診断（インビト
ロまたはインビボ）または精製に特に有用である。

【００１０】ノギンの置換、欠失、もしくは挿入変異体が、インビトロもしくは組換え法に
より調製され得、ノギンとの免疫交差反応性およびノギンアンタゴニストもしく
はアゴニスト活性についてスクリーニングされ得る。

【００１１】ノギンまたはそのフラグメントもしくはムテインはまた、ノギンもしくはその
抗体の診断のため、またはノギン抗体のアフィニティー精製のため、固相化され
たノギンおよび標識されたノギンを調製するために、インビトロで誘導体化され
得る。

【００１２】本発明はさらに、原核生物および真核生物の発現系における生物学的に活性な
ノギン分子の発現を提供する。

【００１３】本発明はさらに、治療および診断適用に十分な量でのノギンまたはそのフラグ
メントもしくはムテインの産生を提供する。同様に、抗ノギン抗体は、治療およ
び診断適用に利用され得る。ほとんどの目的について、治療または診断目的には
、同じ種由来のノギン遺伝子または遺伝子産物を使用することが好ましいが、ノ
ギンの種間利用が、本発明の特定の実施態様において有用であり得る。

【００１４】さらなる実施態様において、本発明のノギン核酸、タンパク質、およびペプチ
ドは、哺乳動物における神経組織形成の誘導またはＢＭＰ活性のブロックに使用
され得る。（発明の詳細な説明）本明細書を通じて、ポリペプチドをコードする核酸配列が示される場合、その
ことにより、そのコード配列の相補鎖もまた教示されると理解される。

【００１５】本発明者らは、実質的に純粋な可溶性形態で容易に入手可能である構造的に独
特な成長因子を見出した。本発明者らは、本発明のポリペプチドを「ノギン」と
名付けた。この成長因子は、脊椎動物において、背方発生を誘導し、そしてＢＭ
Ｐ活性をブロックする。

【００１６】背方発生を誘導するタンパク質のより早く記載されたファミリーは、「ｗｎｔ
」タンパク質である。しかし、これらは、ノギンとは対照的に、細胞表面に強固
に結合したままである。ノギンを用いた本発明者らの最初の研究は、Ｘｅｎｏｐ
ｕｓ胚においてであった。しかし、ノギンは、マウスノギンを用いた本発明者ら
の研究が証明したように、脊椎動物間で高度に保存されている。先行技術である
公知のＦＧＦ増殖因子ファミリーもまた、初期の胚性誘導に関与することが知ら
れている。しかし、ＦＧＦタンパク質およびそのレセプターはともに、ノギンと
は明確に異なる。ノギンは、例えば、増殖を増強することによって、ＦＧＦ（お
よびアクチビンもまた）の作用を改変し、したがって（治療アジュバントととし
て）他の成長因子と組み合わせて使用するための治療組成物において、例えば、
その効果を改変または増強することが特に示唆される。

【００１７】本発明者らは、ノギンのｃＤＮＡをクローニングした。ノギンｃＤＮＡは、疎
水性アミノ末端配列を有する２６ｋＤａタンパク質をコードする、単一のリーデ
ィングフレームを含む。ノギンは分泌される。ノギンのｃＤＮＡは、タンパク質
を２６ｋＤａタンパク質としてコードするが、本発明者らは、ノギンが、外見上
、約３３ｋＤａの開始の見かけの分子量を有する二量体糖タンパク質として（野
生型サブユニットとして）、インビボで分泌されると決定した。グリコシル化さ
れない場合、モノマー単位は、約２５〜３０ｋＤａのＳＤＳＰＡＧＥ上の見か
けの分子量を有する。

【００１８】本発明者らは、ヒトノギンの遺伝子（図１Ａ〜１Ｂ；配列番号１）をクローニ
ングした。この配列は、ノギン活性を有するタンパク質（配列番号２）をコード
する。ノギンのカルボキシ末端領域は、クニッツ型プロテアーゼインヒビターと
の相同性を示す。このことは、ノギンタンパク質またはそのフラグメントが、プ
ロテアーゼインヒビターの活性を示し得ることを示す。

【００１９】本発明者らは、真核生物および原核生物の両方の宿主細胞において、生物学的
に活性なノギンを発現させ得た。本発明者らが生物学的に活性なノギンを発現さ
せるために使用することに成功した２つの発現系は、哺乳動物細胞株（ＣＯＳお
よびマウス２９３）であった。第３の発現系は、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞への合
成ｍＲＮＡの注射である。さらに、本発明者らは、原核生物系、Ｅ．ｃｏｌｉ、
およびバキュロウイルスにおいて、生物学的に活性なヒトノギンを発現させるこ
とに成功した。

【００２０】これらいくつかの異なる系における発現はまた、ノギンに関する高度な保存を
示す。本発明者らは、例えば、多くの完全に保存されたストレッチを有する、カ
エルノギンとマウスノギンとの間の実質的な配列類似性を見出した。したがって
、以下のアミノ酸配列は、カエルノギンとマウスノギンとの間のように、完全に
保存された部分を示す：ＱＭＷＬＷＳＱＴＦＣＰＶＬＹ（配列番号３）；ＲＦＷＰＲＹＶＫＶＧＳＣ（配列番号４）；ＳＫＲＳＣＳＶＰＥＧＭＶＣＫ（配列番号５）；ＬＲＷＲＣＱＲＲ（配列番号６）；およびＩＳＥＣＫＣＳＣ（配列番号７）。

【００２１】マウス配列とカエル配列との間に約８７％の全体的な保存が存在し、本発明者
らはまた、この２つの間で独特なシステイン分布を観察した。

【００２２】ノギン核酸またはオリゴヌクレオチドは、ノギンポリペプチドをコードするか
、またはそのようなＤＮＡとハイブリダイズし、そしてストリンジェントな条件
下でこれと安定に結合したままであり、そして長さが約１０塩基より大きい。し
かし、ただし、このようなハイブリダイズする核酸は、他の成長因子をコードす
るか、またはこれをコードする核酸と相補的であるものを含む従来技術の核酸に
対して、新規でかつ非自明である。

【００２３】「ストリンジェントな条件」とは、（１）洗浄のためには、低イオン強度およ
び高温、例えば、５０℃の０.１５ＭＮａＣｌ/０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム/０.１％ＮａＤｏｄＳＯ₄を用いるか、または（２）ハイブリダイゼーションの間には、ホルムアミドのような変性剤、例えば、０.１％ウシ血清アルブミン/
０.１％Ｆｉｃｏｌｌ/０.１％ポリビニルピロリドン/５０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６.５、７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む）を含む４２℃の５０％（ｖｏｌ/ｖｏｌ）ホルムアミドを使用する条件を意味する。

【００２４】「実質的な類似性」とは、本発明者らがヌクレオチド配列に言及する場合には
、標準的な緩衝液（Ｗａｈｌら、ＰＮＡＳ７６：３６８３）中で３０℃にて１
００ヌクレオチド長を超えるプローブを使用し、そして３００ｍＭＮａＣｌ、
３０ｍＭクエン酸ナトリウム、０.２％ＳＤＳ（ｐＨ７）中で３７℃にて洗浄する、中程度のストリンジェンシー条件下での配列のクロスハイブリダイゼーショ
ンを意味する。あるいは、配列番号３〜７のものをコードする縮重配列のプライ
マーを使用する場合、ポリメラーゼ連鎖反応により、ノギンまたはノギンファミ
リーのメンバーをコードするＤＮＡのフラグメントを単離し得る。

【００２５】「実質的な類似性」とは、タンパク質に対してなされた言及の場合には、異な
る種由来のノギンまたは１種内のノギンファミリーのメンバーが、そのタンパク
質を通じて、少なくとも８０％の位置において、システイン残基の位置を保存す
ることである。ニューロトロフィンファミリーと同様に、成熟形態のノギンおよ
びノギン関連ポリペプチドの配列は、少なくとも４０％の位置が同一である。タ
ンパク質レベルでの実質的な類似性は、レセプターとの結合、およびノギンエピ
トープに対して惹起させたいくつかの（しかしすべてではない）モノクローナル
抗体との結合についてノギンと競合する、主題のタンパク質の能力を誘導する。

【００２６】図１３Ａ〜１３Ｂに示されるような、マウスノギンの完全配列についてのｃＤ
ＮＡがクローニングされた（配列番号１０）。ヒト配列は、本明細書中で配列番
号１と呼ばれる。本発明者らは、胚をレスキューし、そしてノギンＲＮＡを腹方
化胚に注入した場合、それらを実質的に正常な発生に復帰させるために、カエル
ノギンクローン由来のＲＮＡ転写物を使用した。高用量において、これは、過剰
な頭部発生を生じ、そして本発明者らがこのタンパク質を「ノギン」と名付けた
のはこの理由のためである。ノーザンブロット分析において、ノギンｃＤＮＡは
、母系的および接合生殖的の両方で発現する２つのｍＲＮＡにハイブリダイズす
る。

【００２７】本発明のノギンの部分またはすべてをコードするヌクレオチド配列を使用する
場合、配列の長さは、少なくとも、サイズが、脊椎動物自身のノギンの内因性ｍ
ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分であるべきである。代表的には、（例えば
、診断プローブとしての使用のために）十分な配列サイズは、約１５の連続する
塩基（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。いくつかの診断および治療適用において、
ヌクレオチドノギンコード配列（配列番号１０または配列番号１または図１４（
配列番号２３）のすべてもしくは部分と類似）を、配列番号１０または１または
図１４（配列番号２３）のいずれかに関してアンチセンス方向で使用することが
、望まれ得る。

【００２８】本発明者らは、他の種（例えば、ヒト）からノギンを増幅させるための数個の
好ましいプライマーとして示唆する：５'プライマー１配列番号１２。

【００２９】ＣＡＡ/ＧＡＣＮＴＴＣ/ＴＴＧＣ/ＴＣＣＮＧＴＮ５'プライマー２配列番号１３ＴＴＣ/ＴＴＧＧＣＣＮＣ/ＡＧＮＴＡＣ/ＴＧＴＮＡＡＡ/ＧＧＴＮＧＧ５'プライマー３配列番号１４ＣＣＮＧＡＡ/ＧＧＧＮＡＴＧＧＴＮＴＧ３'プライマー１配列番号１５ＣＡＮＣ/ＧＴ/ＡＡ/ＧＣＡＣ/ＴＴＴＡ/ＧＣＡＣ/ＴＴＣ３'プライマー２配列番号１６ＣＡＮＡＣＣＡＴＮＣＣＣ/ＴＴＣＮＧＧ３'プライマー３配列番号１７ＣＧ/ＴＮＣＧ/ＴＴ/ＣＴＧＧ/ＡＣＡＮＣＧ/ＴＣＣＡここで、Ｎは、４種すべてのヌクレオチドの混合物を示し、２つのヌクレオチド
の混在は代替物を示す（例えば、Ａ/Ｇ）。

【００３０】ノギン転写物は卵母細胞および卵割期胚に局在しないが、接合体転写物は、最
初は、推定に基づく背側中胚葉に限定され、そして原口背唇（シュペーマンのオ
ーガナイザー）において原腸胚期に最高レベルに達する。神経胚において、ノギ
ンは、脊索および脊索前方中胚葉で転写される。

【００３１】理論に拘束されることなく、本発明者らは、発現する場所、および胚における
ＲＮＡ注入の効果に基づいて、ノギンの胎生学的効果についての仮説を案出した
。ノギンは、シュペーマンオーガナイザーにおいて発現するので、本発明者らは、
ノギンが、シュペーマンオーガナイザーの効果（すなわち、中胚葉の神経誘導お
よび背方化）のメディエーターであると考えた。本発明者らは、ノギンが、神経
組織形成を直接誘導し得ることを示した。ノギンは、脊索および頭部中胚葉のお
いて発現するので、本発明者らは、ノギンが、神経板の背側−腹側パターンまた
は前方−後方パターンのいずれかに影響すると考えた。ノギンは鰓弓性神経堤に
発現するので、本発明者らは、ノギンが、神経堤細胞が軟骨に堆積するかどうか
に影響し得、そしてより後期の鰓弓成長および再造形に影響すると考えた。ノギ
ンは,尾部ヒレ神経堤（ｔａｉｌｆｉｎｎｅｕｒａｌｃｒｅｓｔ）で発現し、そして神経堤がそのヒレの成長に必要とされるので、ノギンは、表皮または
間葉の成長因子として作用し得る。

【００３２】本発明者らの実験的研究の多くが、胚発生のレスキューを含んでいたが、脊索
における発現が成長中の尾芽において持続し、そして染色された細胞の不連続線
（新たな部位で開始されたノギンの発現を示す）が、神経管の上衣板の端から端
まで走る（頭部中胚葉においてもまた明らかである）ので、本発明者らは、ノギ
ンが生体細胞機能としてもまた発現されると考えた。

【００３３】ノギンについて多くの適用が、その特性から示唆される。ノギンｃＤＮＡは、
診断ツールとして有用であるはずである（例えば,そのオリゴヌクレオチドプライマーと配列類似性を有するオリゴヌクレオチドを増幅するため、およびどのく
らいのノギンが存在するかを調べるための、ＰＣＲ試験におけるプライマーとし
てのオリゴヌクレオチド、例えば、５'プライマー１〜３および３'プライマー１
〜３のようなプライマーの使用）。

【００３４】ノギンは、胚頭部における軟骨産生を調節するため使用されると示唆する、発
現パターンを有するので、軟骨および骨の成長を調節するための臨床的使用が、
少なくともいくつかの成長因子を増強するノギンの特性に起因して、治療組成物
におけるノギン、特に、他の成長因子との組み合わせたノギンについて示唆され
る。神経堤細胞は、おたまじゃくしヒレが成長するために必要とされるので、ノ
ギンは、組織マトリクスおよび表皮の成長因子であるようであり、そして例えば
創傷治癒組成物において有用であると証明されるはずである。

【００３５】ノギンを複合体中のリガンドとしてみる場合、本発明の複合体は、ノギンに結
合される抗体、ノギンから誘導したペプチドに結合される抗体、そのレセプター
に結合されるノギン、またはそのレセプターに結合されるノギンから誘導された
ペプチドを含む。変異体形態のノギン（これは、より強力なアゴニストまたはア
ンタゴニストのいずれかであるか、または改善された特性、例えば、増大したバ
イオアベイラビリティーを有する）は、臨床上有用であると考えられる。ノギン
とその結合タンパク質パートナーとのこのような複合体は、多くの適用における
使用が見出される。

【００３６】本発明の実施には、哺乳動物、細菌、またはウイルス発現ベクターにおける、
ノギンおよびノギンに作動可能に連結されたプロモーター配列をコードする配列
を含むオリゴヌクレオチド構築物の使用を包含する。発現およびクローニングベ
クターは、そのベクターを、１またはそれ以上の選択された宿主細胞において、
複製可能にするヌクレオチド配列を含む。一般に、クローニングベクターにおい
て、この配列は、そのベクターを宿主の染色体とは独立して複製可能にし、そし
て複製起点または自律複製配列を含む配列である。周知のプラスミドｐＢＲ３２
２は、ほとんどのグラム陰性細菌に適切であり、２μプラスミド起源は酵母に適
切であり、そして種々のウイルス起源（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス
、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有用で
ある。

【００３７】発現およびクローニングベクターは、選択遺伝子（選択マーカーとも呼ばれる
）を含むべきである。代表的には、これは、上記ベクターで形質転換された宿主
細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子である。この遺伝
子の存在は、上記ベクターを欠失するいずれの宿主細胞も、形質転換された宿主
を超える増殖または生殖における利点を入手しないことを確実にする。代表的な
選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（アンピシリン、ネオマイシン、
メトトレキサート、またはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するタンパク
質、（ｂ）栄養素要求性欠損を補償するタンパク質をコードする。

【００３８】哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨ
ＦＲ）またはチミジンキナーゼである。このようなマーカーは、ノジン核酸を取
り込む能力があった細胞の同定を可能にする。哺乳動物細胞形質転換体は、形質
転換体のみが、マーカーを取り込んだことにより、生存するために独特に適応さ
れる選択圧の下に置かれる。選択圧は、培地における選択因子の濃度が連続して
変化される条件下で、形質転換体を培養することによって強いられる。増幅は、
増殖に重要なタンパク質の産生についてより強く要求される遺伝子が、連続する
世代の組換え細胞の染色体内で縦列に繰り返されるプロセスである。したがって
、増大した量のノギンが、増幅したＤＮＡから合成され得る。

【００３９】例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、最初に、すべての形質
転換体を、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）
を含む培養培地中で培養することによって同定される。この場合において適切な
宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠損する、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞株であり、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．，７７，４２１６（１９８０）によって記載されたように調製しそし
て増殖させる。次いで、形質転換細胞を、増加したレベルのＭｔｘに曝す。この
ことが、ＤＨＦＲ遺伝子の複数コピー、および混入した形で、上記発現ベクター
を含む他のＤＮＡ（例えば、ノギンをコードするＤＮＡ）の複数コピーの合成を
導く。あるいは、ノギンおよびアミノグリコシド３'ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターにより掲出転
換した宿主細胞は、アミノグリコシド抗生物質（例えば、カナマイシン、または
ネオマイシン、またはＧ４１８）を含む培地中での細胞増殖により選択され得る
。真核生物細胞は、通常、内因性ＡＰＨ活性を発現しないので、ＡＰＨタンパク
質をコードする遺伝子（通常、ｎｅｏ耐性遺伝子と呼ばれる）は、広範囲の真核
生物宿主において、優性選択マーカーとして使用され得る。これにより、上記ベ
クターにより形質転換された細胞が、容易に同定され得る。

【００４０】発現ベクターは、クローニングベクターとは異なり、宿主生物により認識され
、そしてノギン核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含むべきである。プ
ロモーターは、その制御下で核酸の転写および翻訳を制御する、構造遺伝子の開
始コドンから上流（一般に、約１００〜１０００ｂｐ以内）に位置する非翻訳配
列である。プロモーターは、代表的には、２つのクラス、誘導性および構成性、
に分類される。誘導性プロモーターは、培養条件のいくらかの変化（栄養素の存
在または非存在、あるいは温度の変化）に応答して、ＤＮＡからの増大したレベルの転写を開始するプロモーターである。現時点で、種々の可能性ある宿主細
胞により認識される多数のプロモーターが公知である。これらプロモーターは、
制限酵素により元の遺伝子からそのプロモーターを取り出し、続いてノギンの開
始コドンに対して５'側に挿入することによって、ノギンコード配列に作動可能に連結され得る。

【００４１】核酸は、その核酸が、別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合、作動可
能に連結されている。例えば、プレ配列または分泌性リーダーのＤＮＡは、ポリ
ペプチドが、そのポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現され
る場合、当該ポリペプチドのＤＮＡと作動可能に連結されている。プロモーター
またはエンハンサーは、それが、コード配列の転写に影響する場合、そのコード
配列に作動可能に連結されている。あるいは、リボソーム結合部位は、それが翻
訳を容易にするように配置されている場合、コード配列と作動可能に連結されて
いる。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されるＤＮＡ配列が、連続し
ていること、そして分泌性リーダーの場合、連続し、かつリーディングフェーズ
にあることを意味する。連結は、従来の制限部位でのライゲーションにより達成
される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドのアダプタ
ーまたはリンカーが、従来の実務に従って使用される。

【００４２】哺乳動物宿主細胞におけるノギンコード配列の転写は、ウイルス（例えば、ポ
リオーマ、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎
ウイルス、および最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノム
、または異種性哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーター）から得
られたプロモーターによって制御される。もちろん、宿主細胞または関連する種
からのプロモーターもまた、本明細書において有用である。

【００４３】本発明の特定の実施態様において、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるノギンの発現は、好
ましくは、以下を含むベクターを使用して実施される：ラクトースオペロンリプ
レッサーにより制御され得るｌａｃＵＶ５プロモーター；強力なリボソーム結
合部位、例えば、バクテリオファージＴ７のリボソーム結合部位；コピー数を増
加させ得る、プラスミドの複製制御領域における変異；および抗生物質耐性タン
パク質の発現を制限する変異。

【００４４】好ましい実施態様において、ノギンは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下で、高コピー数のカナマイシン耐性ｐＢＲ３２２由来プラスミドにおいて発現
される。さらなる好ましい実施態様において、ノギンは、昆虫宿主細胞における
Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核多角体病ウイルスのポリヘ
ドリンプロモーターの制御下でバキュロウイルス中で発現される。

【００４５】本発明の目的は、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）を含むがこれに限定
されない疾患または障害の処置のために、そして股置換手術、外傷、火傷、また
は脊髄損傷後の骨の病的な成長のような異常な骨成長を処置するために、新規の
改変されたノギン分子を提供することである。

【００４６】本発明のさらなる目的は、改善された治療特性を有する、本明細書に具体的に
記載されたもの以外の改変されたノギン分子を産生する方法を提供することであ
る。

【００４７】これらの目的および他の目的は、本発明に従って達成され、これにより、ヒト
ノギンタンパク質におけるアミノ酸欠失は、その治療特性を増強する。

【００４８】本発明は、アミノ酸残基１３８〜１４４の欠失によって改変されたヒトノギン
、およびアミノ酸残基１３３〜１４４の欠失により改変されたヒトノギンを提供
する。本発明はまた、改変されたヒトノギンをコードする、単離された核酸分子
を提供する。この単離された核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結された
、組換えＤＮＡ分子であり得る。本発明はまた、組換えＤＮＡ分子で形質転換さ
れた宿主細胞を提供する。

【００４９】さらに、本発明は、改変されたノギン分子を産生する方法を提供する。この方
法は、（ａ）ＤＮＡ分子を含む組換え宿主細胞を増殖させ、このＤＮＡ分子が、
宿主細胞により発現されて、改変されたノギン分子を産生する、工程；および（
ｂ）発現した、改変されたノギン分子を単離する工程、を包含する。この方法は
、真核生物細胞または原核生物細胞において実施され得る。

【００５０】本発明は、改変されたヒトノギンおよびキャリアを含む組成物、および患者に
有効量の該組成物を投与する工程を包含する処置方法を提供する。処置され得る
疾患または障害には、進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）、および股置換手
術、外傷、火傷、または脊髄損傷後の骨の病的な成長のような異常な骨成長が含
まれるが、これらに限定されない。ノギンおよび改変されたノギンは、ＢＭＰと
結合し、そしてこれに拮抗することが知られているので、本発明の分子は、骨産
生および骨代謝回転に関与するプロセスを調節するために使用され得る。

【００５１】したがって、本発明に従えば、ヒトノギンタンパク質における特定のアミノ酸
欠失が、動物の血清において改善したバイオアベイラビリティーを示すが、骨誘
導因子に結合する能力を保持する、改変されたヒトノギンタンパク質を生じる。
このような改変されたノギンタンパク質は、増強した治療特性を有すると期待さ
れる。

【００５２】さらに、タンパク質のポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は
、安定性およびバイオアベイラビリティーを増強する一方で、免疫原性を最小に
することによって、そのタンパク質のインビボ効力を増大させることが示されて
いる。特定のタンパク質の特性は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー
の付着（これは、そのタンパク質の水力学的体積を増加させ、そのことによって
腎臓濾過によるクリアランスを緩慢にする）によって改変され得る。（例えば、
Ｃｌａｒｋ，Ｒ．ら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１９６９
−２１９７７を参照）。本発明者らは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を改
変されたヒトノギンに共有結合することによって、改善された薬物動態特性を有
する分子を作成した。

【００５３】本発明はまた、本明細書に記載される改変されたノギン分子および適切な薬学
的キャリアを含む薬学組成物を提供する。

【００５４】活性成分（ノギン分子を含み得る）は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉
内、皮下、神経膜、神経周囲、脊髄内、室内、硝子体内、鞘内など）、上皮もし
くは粘膜皮膚の内層を通じての吸収（例えば、口腔粘膜、直腸および小腸粘膜な
ど）、または持続放出移植物（細胞もしくは組織移植物を含む）を含むがこれに
限定されない任意の適切な経路によりインビボで全身的もしくは局所的に投与す
るために、適切な薬学的キャリアに処方されるべきである。

【００５５】投与形態に依存して、活性成分は、リポソーム、マイクロカプセル、ポリマー
、またはワックスベースおよび制御放出調製物中に組み込まれた、生理食塩水の
ような液体キャリアに処方され得るか、あるいは錠剤、丸剤、またはカプセル形
態に処方され得る。

【００５６】処方物中に使用される活性成分の濃度は、必要とされる効果的な用量および使
用される投与形態に依存する。使用される用量は、有効である活性成分の循環血
漿濃度を達成するに十分であるべきである。効果的な用量は、インビトロまたは
動物モデル試験系から導かれる用量−応答曲線から外挿され得る。

【００５７】本発明の実施は、診断的または治療的薬剤の調製および使用を包含する。この
薬剤は、図１４（配列番号２３）、配列番号１０、または配列番号１、あるいは
、バクテリオファージｈｎｏｇλ−９またはｈｎｏｇλ−１０に含まれる核酸配
列のいずれかのすべてもしくは部分に類似する少なくとも約１５ＤＮＡもしくは
ＲＮＡ塩基のヌクレオチド配列を含む。すなわち、ノギン調製物は、放射性ヨウ
素、酵素、蛍光体、スピンラベルなどで標識された場合、ノギンについてのアッ
セイおよび競合型レセプター結合アッセイにおいて標準として有用である。ノギ
ンの治療処方物は、貯蔵のために、所望の程度の純度を有するノギンと、随意の
生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤、または安定化剤とを混合することによ
って、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で調製される。受容可能なキャリア、
賦型剤、または安定化剤は、レシピエントに対して、用いられる投薬量および濃
度で非毒性であり、これには、リン酸、クエン酸および他の有機酸のような緩衝
液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチ
ド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質が含
まれる。他の成分としては、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン
、またはリジン；単糖類、二糖類、および、グルコース、マンノース、もしくは
デキストリンを含む他の糖；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；マンニトール、ソ
ルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；および
/またはＴｗｅｅｎ、ＰｌｕｒｏｎｉｃまたはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が含まれ得る。

【００５８】ノギンは、上記のように、本発明に従って使用され得る。処方物に使用される
活性成分の濃度は、必要とされる効果的な用量および使用される投与形態に依存
する。使用される用量は、有効である、活性成分の循環血漿濃度を達成するに十
分であるべきである。効果的な用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から
導かれる用量−応答曲線から外挿され得る。

【００５９】ノギンに言及することにより、本発明はまた、ノギン分子のフラグメント、誘
導体、ムテイン、アゴニスト、またはアンタゴニストの使用を意図する。

【００６０】ノギンは、任意の薬学的に受容可能なキャリアにおいて投与され得る。投与経
路は、当該分野において公知の任意の投与形態であり得、静脈内、鞘内、皮下、
関与する組織への注射、動脈内、鼻内、経口、または移植されたデバイスを介す
るものを含むが、これらに限定されない。本発明は、ノギンを薬学的に受容可能
なキャリアに含む薬学的組成物を提供する。

【００６１】投与は、身体全体または限局された領域における、ノギンの分布を生じ得る。
例えば、神経系の離れた領域を含むいくつかの条件では、ノギンの静脈内または
鞘内投与が望ましくあり得る。あるいは（そして限定のためではなく）、神経系
の限局された領域が含まれる場合、局所投与が望ましくあり得る。このような状
況では、ノギンを含む移植物が、損傷された領域中または近傍に配置され得る。
適切な移植物には、ゲルフォーム（ｇｅｌｆｏａｍ）、ワックス、または微粒子
ベースの移植物が含まれるが、これらに限定されない。

【００６２】本発明の複合体は、配列番号３〜７のうちの１またはそれ以上により特徴付け
られるリガンドを含む。このリガンドは、タンパク質（例えば、抗体）に結合し
得る。このような抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり
得る。ノギンに対するポリクローナル抗体は、一般に、ノギンおよびアジュバン
トの複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により、動物中で惹起され
る。二官能性または誘導体化薬剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシ
ンイミドエステル（システイン残基による結合）、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイ
ミド（リジン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ₂、またはＲ¹Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを使用して、ノギンまたは標的アミノ酸配列を含むフラグメントを、免疫される種において免疫原性であるタンパク質（例えば、キーホ
ールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または
ダイズトリプシンインヒビター）に結合することが有用であり得る。

【００６３】動物は、１ｍｇまたは１μｇの結合体（それぞれ、ウサギ用またはマウス用）
を、３容量のフロイント完全アジュバントと合わせ、そしてその溶液を、複数の
部位へ皮内注射することによって、免疫原性結合体または誘導体に対して免疫さ
れ得る。１ヵ月後、その動物を、複数の部位での皮下注射による、フロイント完
全アジュバント中の、最初の量の１/５〜１/１０の結合体で追加免疫する。７〜
１４日後、動物から採血し、そして血清を、抗ノギン力価についてアッセイする
。動物を、力価がプラトーになるまで追加免疫する。好ましくは、同じノギンポ
リペプチドの結合体であるが、異なるタンパク質に、そして/または異なる架橋化剤により結合した結合体で、動物を追加免疫する。結合体はまた、タンパク質
融合体として、組換え細胞培養物中で作製され得る。また、ミョウバンのような
凝集化剤を使用して免疫応答を増強させる。

【００６４】モノクローナル抗体は、免疫動物から脾臓細胞を回収し、そしてその細胞を従
来の様式で（例えば、ミエローマ細胞との融合、またはＥＢウイルス形質転換に
より）不死化させ、そして所望の抗体を発現するクローンについてスクリーニン
グすることにより調製される。

【００６５】好ましい実施態様において、組換えヒトノギンでのラットの免疫後に調製され
るラットモノクローナル抗体（ＲＰ５７−１６）は、Ｘｅｎｏｐｕｓおよびヒト
の両方のノギンと特異的に反応するが、ニューロトロフィンＢＤＮＦ、ＮＴ−３
、およびＮＴ−４とは反応しない。

【００６６】ノギン抗体は、ノギンまたはその抗体についての診断アッセイにおいて有用で
ある。レセプター結合アッセイの１つの実施態様において、ノギンファミリー選
択された複数のメンバーのすべてに結合する抗体組成物は、不溶性マトリクスに
固相化され、試験サンプルを、すべてのノギンファミリーメンバーを吸着させる
ために、その固相化抗体組成物と接触させ、次いで、固相化されたファミリーメ
ンバーを、複数の、各メンバーに特異的な抗体と接触させる。ここで、それぞれ
の抗体は、個々に、例えば、独自の標識（例えば、別個の蛍光体）などによって
、所定のファミリーメンバーに特異的であるとして同定可能である。それぞれの
独自の標識の存在および/または量を決定することによって、各ファミリーメンバーの相対的比率および量が決定され得る。

【００６７】ノギン抗体はまた、組換え細胞培養物または天然供給源からのノギンのアフィ
ニティー精製に有用である。他の成長因子と検出可能に交差反応しないノギン抗
体は、これら他のファミリーメンバーを含まないように、ノギンを精製するため
に使用され得る。

【００６８】本発明の局面は、ここで以下の実施例により例示される. （実施例）Ｘｅｎｏｐｕｓ胚の作製ＣｏｎｄｉｅおよびＨａｒｌａｎｄ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０１，９３
−１０５，１９８７）により記載されるプロトコル）によって、Ｘｅｎｏｐｕｓ胚を調製した。胚を、ＮｉｅｕｗｋｏｏｐおよびＦａｂｅｒの表（「アフリカ
ツメガエルの正常表」（Ｄａｕｂｉｎ），Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；ＮｏｒｔｈＨ
ｏｌｌａｎｄ，１９６７）に従ってステージ付けた。腹方化した胚を、Ｓｔａｔ
ａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の照射により作製し、そして特定の「
ｗｎｔ」タンパク質（「Ｘｗｎｔ−８」と呼ばれる）に関する本発明者らの論文
（ＳｍｉｔｈおよびＨａｒｌａｎｄ，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．６７，７５３−７６５
（１９９１）（参考として援用し、場合によっては、以後「Ｓ＆Ｈ（前出）」と
呼ぶ））において本発明者らにより記載されたように、背方化した胚を、ＬｉＣ
ｌでの処理により作製した。

【００６９】（実施例１）ノギンｃＤＮＡの単離および配列決定ステージ１１のＬｉＣｌ処理した胚からサイズ選択したプラスミドｃＤＮＡラ
イブラリーの構築は、以下のとおりであった。ステージ１１のＬｉＣｌ処理した
胚からの６０マイクログラムのポリ（Ａ）ＲＮＡを、水酸化メチル水銀の存在下
で、１０％〜３０％のスクロースグラジエント上でサイズ分画化した。第１鎖ｃ
ＤＮＡを、ＮｏｔＩの認識部位を含むオリゴ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドでプラ
イムした、２μｇのサイズ分画化ポリ（Ａ）ＲＮＡから合成した。第２鎖の合成
後、ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩメチラーゼで処理し、ＥｃｏＲＩリンカーと連結し
、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、そして最後に１２５ｇの改変されたｐＧ
ＥＭ−５Ｚｆ（−）（Ｐｒｏｍｅｇａ）と連結した。本明細書で使用するｐＧＥ
Ｍ−５Ｚｆ（−）は、ＮｓｉＩ部位へオリゴヌクレオチドを付加して、ＥｃｏＲＩ部位を作製することによって改変されていた。ベクターをアルカリホスファ
ターゼで処理しなかったが、切り出したポリリンカー配列を、セファロース４Ｂ
ＣＬカラム上で取り除いた。連結した産物を使用して、ＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換し、そして１０ｃｍプレートあたり１００, ０００コロニーを与えるようにプレートした。プラスミドＤＮＡをプレート培養
物から、アルカリ溶解/ポリエチレングリコール沈澱プロトコルにより単離した。

【００７０】ライブラリー中の背方化活性を、プールしたプラスミドＤＮＡから作製したＲ
ＮＡ転写物を注入することによってアッセイした。単一クローンを、姉妹選択法
のプロセスにより単離した。この手順において,プラスミドライブラリーを、１２プレート上に、プレートあたり１０倍少ないコロニーで再プレートした。ＲＮ
Ａを、各プレートから単離したプールしたプラスミドＤＮＡから合成し、そして
ＵＶ腹方化した胚に注入することによって、背方化活性について試験した。背方
化活性を有するプールを再プレートし、上記のようにスクリーニングした。単一
クローンを単離するまで、このプロセスを繰り返した。

【００７１】インビトロＲＮＡ合成、背側軸レスキューについての注入アッセイ、および姉
妹選択もまた、Ｓ＆Ｈ（前出）において本発明者らにより記載されたとおりに行
った。

【００７２】単離したノギンｃＤＮＡクローンの両鎖のヌクレオチド配列を、改変されたＴ
７ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍ）を用いるジデオキシ終止法に
より決定した。欠失を、配列決定テンプレートに、制限酵素およびエキソヌクレ
アーゼＩＩＩ消化の両方により調製した（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ，１５５，１５６−１６５，１９８７）。

【００７３】インビトロ翻訳１.５μｇのインビトロ合成したノギン、Ｘｗｎｔ−８、およびグースコイドｍＲＮＡを、製造業者の指示に従って³⁵Ｓ−メチオニンを加えた、ヌクレアーゼ
処理したウサギ網赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で翻訳した。翻訳産物を、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％ゲル）、続いて蛍光間接撮影
により可視化した。ノギンタンパク質は、オープンリーディングフレームにより
予測される分子量を有していた。

【００７４】（ＲＮＡ単離および分析）全ＲＮＡを胚および卵母細胞から、ＣｏｎｄｉｅおよびＨａｒｌａｎｄ（前出
）により記載されたとおりの小規模プロトコルによって単離した。背唇を、３０
の非固定のステージ１０.５胚から摘出し、そして全ＲＮＡ調製物用にプールした。２.５胚の全ＲＮＡ等価物または約２μｇのポリＡ＋ＲＮＡのいずれかを含むサンプルを、ノーザンブロッティングにより分析した。ランダムプライムした
ＤＮＡプローブを、ノギンｃＤＮＡの１,３２３ｂｐフラグメント（ヌクレオチド−８３のＥｃｏＲＩ部位からそのベクターにおいてｃＤＮＡの末端の直ぐ３' 側にあるＥｃｏＲＶ部位まで）から調製した。

【００７５】ＲＮＡアーゼ保護アッセイを、Ｍｅｌｔｏｎら（Ｎｕｃ.ＡｃｉｄＲｅｓ．，１２，７０３５−７０５６，１９８４）により詳述されたプロトコルを若干改
変して使用して行った（Ｃ．Ｋｉｎｔｎｅｒ，ＳａｌｋＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，
ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。ＸｅｎｏｐｕｓノギンｃＤＮＡエ
キソヌクレアーゼＩＩＩ欠失クローン（ＳｍｉｔｈおよびＨａｒｌａｎｄ，Ｃｅ
ｌｌ，７０：８２９−８４０（１９９２）の図２Ａに対応するが、３'末端からヌクレオチド３８３までの欠失を有する）を、合成ＲＮＡプローブ用のテンプレ
ートとして使用した。テンプレートＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ制限酵素消化により直
線化し、そして³²Ｐを組み込んだ４６３塩基アンチセンスＲＮＡを、Ｔ７ＲＮ
Ａポリメラーゼを用いて合成した。３８７塩基アンチセンスＥＦＩαＲＮＡプロ
ーブを、サンプルあたりのＲＮＡの量についてのコントロールとして使用した。
プローブを、使用前にゲル精製した。

【００７６】インサイチュハイブリダイゼーション固定および貯蔵後、胚を検査して、分割腔および原腸が穿刺されていることを
確認した。神経胚の残りの分割腔およびオタマジャクシならびに原腸を注意深く
穿刺した。胚を室温にて１００％エタノール中で２時間再び洗浄して、残りの脂
質を除去した。ハイブリダイゼーション後、染色を一晩発色させ、次いで胚をブ
ワン固定液で固定した。新たに染色した胚は、ピンク染色の高いバックグランド
を有するが、このほとんどが洗い流され、特異的染色が残る。一晩の固定後、胚
を７０％エタノール、ＰＢＳで緩衝化した７０％エタノール、およびメタノール
で十分に洗浄した。胚をマレー混合液中でクリアにし、Ｚｅｉｓｓａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡（焦点合わせを補助するための３×１２Ｂ望遠鏡を備えた２.５または５×対物レンズ）を使用して、ＫｏｄａｋＥｋｔａｒ２５フィルムで写
真撮影した。

【００７７】系統追跡核局在性Ｂ−ガラクトシダーゼをコードするｍＲＮＡを用いる系統追跡（ｌｉ
ｎｅａｇｅｔｒａｃｉｎｇ）は、本発明者らがＳ＆Ｈ（前出）において記載し
たとおりであった。腹方化した胚に、３２細胞ステージで、０.５ｎｇのＢ−ガラクトシダーゼおよび２５ｐｇのノギンΔ５'ｍＲＮＡを同時注入した。約ステージ２２に、胚を固定し、そしてＸ−ｇａｌで染色した。

【００７８】結果ノギンｃＤＮＡは新規なポリペプチドをコードする選択したクローンの１８３３ヌクレオチド配列が、ＳｍｉｔｈおよびＨａｒｌ
ａｎｄ，Ｃｅｌｌ７０：８２９−８４０（１９９２）の図２Ａに示され、そし
て時折「クローンＡ３」とも呼ばれる。この配列は、２６ｋＤａの予測分子量を
有する２２２アミノ酸ポリペプチドをコードする、単一の長いオープンリーディ
ングフレームを含む。アミノ末端のアミノ酸の疎水性ストレッチは、このポリペ
プチドが分泌経路に進入することを示唆する。アミノ酸６１（Ａｓｎ）にＮ結合
グリコシル化の単一の可能性のある部位が存在する。広範な非転写領域は、リー
ディングフレームの５'側および３'側の両方に位置する（それぞれ、５９３ｂｐ
および５７３ｂｐ）。３'非翻訳領域は、反復ｄＡおよびｄＴヌクレオチドが特に豊富であり、ポリＡテールの開始から２４ｂｐ上流に位置するポリアデニル化
シグナル配列に加え、１４７ｂｐさらに上流に、第２の可能性のあるポリアデニ
ル化配列を含む。

【００７９】ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてクローンＡ３から合成したセンスＲＮＡ
を、ウサギ網状赤血球溶解物系において翻訳した。３Ｓ標識産物を、１２％ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル上で分画化し、蛍光間接撮影により可視化した。主
要なタンパク質産物は、約２６ｋＤａの予測分子量を有した。

【００８０】推定ポリペプチドのアミノ酸配列と、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏ
ｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＢＬＡＳＴネット
ワーク（非冗長データベース）との比較は、いかなる類似配列も同定しなかった
。したがって、このクローンは、分泌され、そしてＸｅｎｏｐｕｓにおいて背側
誘導活性を有する、本発明者らが「ノギン」と名付けた新型のタンパク質をコー
ドする。

【００８１】ノギンｍＲＮＡは、完全な背側−腹側軸をレスキューする４細胞ステージのＵＶ腹方化した胚の単一卵割球へのノギンＲＮＡの注入は、
背側構造の完全なスペクトルを保存し得る。軸レスキューの程度は、注入したＲ
ＮＡの量に依存した。低用量を投与された胚は、後方背側構造のみを有した。他
方、より高い用量を投与された胚は、過剰な背側前方組織を有した。２つのノギ
ンプラスミドからのＲＮＡ転写物を試験した。第１は、完全なｃＤＮＡを含んで
いた。第２（ｐＮｏｇｇｉｎΔ５'）は、ＥｃｏＲＩ部位までの５'非翻訳領域の最初の５１３ヌクレオチドを取り除いた欠失を有した。これら２つのプラスミ
ドのＲＮＡ転写物ならびに比較のためのＸｗｎｔ−８ＲＮＡの注入から得られた
胚を、ＲａｏおよびＥｌｉｎｓｏｎ（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２７，６４−７７
，１９８８）の背側前方指標（ＤＡＩ）スケールに従って、スコア付けた。この
スケールにおいて、完全に腹方化した胚を０とし、正常な胚を５とスコア付け、
最も重篤な背方前方化した胚（放射線状の背方前方構造を有するもの）を１０と
スコア付けた。ｐＮｏｇｇｉｎΔ５'から合成したＲＮＡ（ｎｏｇｇｉｎΔ５'）
は、完全なｃＤＮＡから合成した等量のｍＲＮＡより、高いＤＡＩを繰り返し与
えた。ｎｏｇｇｉｎΔ５'ｍＲＮＡによる軸レスキューの用量依存性は、Ｘｗｎｔ−８ｍＲＮＡのそれと非常に類似していた。

【００８２】ＵＶ処理した胚にまた、より高い用量（１,０００ｐｇ）のノギンｍＲＮＡを注入した。４細胞ステージの１つの卵割球への、この用量のノギンｍＲＮＡの注
入は、非常に重篤な過剰背方化（ＤＡＩ＞７）を有する胚を生じた。しかし、こ
れらの胚のほとんどが、後期原腸胚/初期神経胚ステージで死亡した。明らかに過剰に強力な原腸形成移動は、分割腔の上衣（ｒｏｏｆ）の薄化および破裂を生
じた。本発明者らはまた、注入したＸｗｎｔ−８ｍＲＮＡの高用量でこの効果
を観察した。

【００８３】ｎｏｇｇｉｎΔ５'およびＸｗｎｔ−８の両方のｍＲＮＡによる背方発生のレスキューは、漸増量のｍＲＮＡが、レスキューされる、漸次より前方の構造を導
く不変のパターンに続いた。例えば、１ｐｇのＲＮＡを与えられた胚は、主とし
て後方および体幹背方構造をレスキューさせ、そして大部分は、頭部構造を欠い
ていた。より高用量（１０または１００ｐｇ）の両ＲＮＡは、より前方発生を有
する胚を生じ、多くが正常に近い表現型かまたは過剰背方化表現型のいずれかを
有した。

【００８４】ノギン注入した卵割球はニューコープセンターとして作用するノギンｍＲＮＡ注入部位を変える効果を研究した。３２細胞ステージのＵＶ処
理した胚に、０.５ｎｇのＢ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡ単独または２５ｐｇのｎｏｇｇｉｎΔ５'ｍＲＮＡと混合した０.５ｎｇのＢ−ガラクトシダーゼのいず
れかを注入した。植物階層（ｔｉｅｒ）の卵割球へのノギンｍＲＮＡの注入は、
最も強く背方前方化した胚を与えた。植物性の注入胚の両方において、核Ｘ−Ｇ
ａｌ染色は、ほぼ独占的に内胚葉において見出された（このｍＲＮＡは、核へト
ランスロケートするＢ−ガラクトシダーゼをコードし、拡散性のバックグランド
染色との識別を可能にする）。示された胚の１つは、ノギンｍＲＮＡ注入の結果
として強く過剰背方化し（ＤＡＩ約７）、そしてひどく短縮されたテールおよび
肥大した頭部構造を有した。胚はまた、辺縁層へのノギンｍＲＮＡ注入によりレ
スキューされた。これらの胚において、Ｂ−ガラクトシダーゼ染色は、主として
、軸および頭部中胚葉で観察された。動物極へのノギンｍＲＮＡの注入は、軸形
成に対して非常に小さな効果しか有さなかった。同様に、Ｂ−ガラクトシダーゼ
ｍＲＮＡ単独は、効果がなかった。

【００８５】ノギンｍＲＮＡは、母系的および接合生殖的に発現するＸｅｎｏｐｕｓ胚由来のＲＮＡのノーザンブロット分析において、およそのサ
イズ１.８および１.４ｋｂの２つのノギンｍＲＮＡ種を観察した。相対的に低い
レベルのノギンｍＲＮＡが、卵母細胞に検出された。ステージ１１まで、ノギン
ｍＲＮＡのレベルは、有意により高く、接合翻訳に反映した（卵母細胞において
観察された母方に置かれた転写物とは反対に）。ノギンｍＲＮＡは、調べられた
最も遅いステージ（ステージ４５）まで、上昇したレベルで維持された。

【００８６】本発明者らは、本発明者らのライブラリー中の主要な背方化ＲＮＡは、正常も
しくはＵＶ処理した胚と比較して、ＬｉＣｌ処理した胚において上昇していると
予測する。リチウムイオン処理の結果、発現したノギンｍＲＮＡの量が、無処理
胚に比較して、大きく増加した。ＵＶ処理は反対の効果を有した。ノギンｍＲＮ
Ａ発現は、これらの胚からの全ＲＮＡサンプルにおいて、本質的に検出不可能で
あった。したがって、操作された胚におけるノギンｍＲＮＡの豊富さは、レスキ
ュー活性と平行する。

【００８７】本発明者らは、卵母細胞および卵割ステージの胚においてノギンの分布を分析
した。母方に堆積したノギンＲＮＡは非常に低く、インサイチュハイブリダイゼ
ーションが、バックグランドを超えて検出できなかったので、本発明者らは、Ｒ
Ｎアーゼ保護アッセイを使用した。卵母細胞を動物性の半分および植物性の半分
に切断した。全卵母細胞ＲＮＡに対して、いずれの半球でもノギンｍＲＮＡの富
化は見られなかった。４細胞ステージの胚を、背側の半分および腹側の半分、な
らびに動物性の半分および植物性の半分に切断した。ノギン転写物は、背側の半
球と腹側の半球、ならびに動物性の半球および植物性の半球の間で均一に分布し
ていることが見出された。受精直後に９０°傾け、次いで将来の背側を示すため
に最も上側をバイタルダイ（ｖｉｔａｌｄｙｅ）でマークした胚を用いて同じ
結果を得た。より時間を経た（３２細胞ステージ）の胞胚もまた、背側-腹側の半分および動物性−植物性の半分に分割した。いずれの半球においても、全胚に
対して、ノギンｍＲＮＡの富化は認められなかった。さらに、処置は、母系に堆
積したノギンＲＮＡの豊富さを改変なかった。このことは、腹側組織において、
優先的な破壊がないことを示す。既知の量のインビトロ合成されたノギンｍＲＮ
Ａを有するサンプルを、ＲＮアーゼ保護アッセイに含ませた。これらおよび他の
データから、本発明者らは、胞胚ステージの胚あたり約０.１ｐｇのノギンｍＲＮＡが存在し、そして原腸胚ステージの胚あたり１ｐｇのノギンｍＲＮＡが存在
すると予測する。

【００８８】ノギン転写物の局在を、初期原腸胚ステージの胚において研究した。背唇をス
テージ１０.５の胚から摘出した。背唇の摘出後、インタクトな胚、摘出した背唇、および残りの胚からの等量の全ＲＮＡのノーザンブロットを、ノギンプロー
ブとハイブリダイズさせ、次いでサンプルあたりロードされたＲＮＡの量につい
てのコントロールとして、ＥＦＩａプローブと再びハイブリダイズさせた。ブロットのオートラジオグラフは、このステージのノギンｍＲＮＡが、背唇におい
て富化されていることを示した。

【００８９】インサイチュハイブリダイゼーション：シュペーマンオーガナイザーにおける
ノギンの接合発現発生中の胚におけるノギン転写物の局在を、ホールマウントインサイチュハイ
ブリダイゼーションより詳細に検査した。固定した全胚を、ＲＮＡプローブを含
むジゴキシゲニンとハイブリダイズさせた。

【００９０】ハイブリダイズしたＲＮＡプローブを、次いで、アルカリホスファターゼ結合
抗ジゴキシゲニン抗体で可視化した。アンチセンスノギンプローブを用いて観察
されたハイブリダイゼーションの特異性を、胚とセンスノギンプローブとをハイ
ブリダイズさせること、および２つの非重複アンチセンスプローブを使用するこ
とによって試験した。低レベルの発現およびバックグランド染色の両方に起因し
て、ノギンｍＲＮＡは、後期胞胚ステージ以前には、明確に検出され得なかった
。接合転写の活性化後に、ノーザンブロットにより検出された、増加したレベル
のノギンｍＲＮＡは、インサイチュハイブリダイゼーションにおいて、ステージ
９で、胚の背側の染色細胞のパッチとして明らかであった。植物極から望むと、
細胞のこのパッチは、約６００のセクターに限定されていた。同じ胚の側面図か
ら、染色細胞は、辺縁層内（すなわち、動物極と植物極との間で、恐らく背側中
胚葉を形成する領域内）に位置したことが示される。転写物は、大部分、このス
テージで、核に限定される。

【００９１】初期原腸胚ステージ胚３０（ほぼステージ１０.５）の側面図から、主に、背唇で内旋する中胚葉中の特異的ハイブリダイゼーションが示される。同じ胚を植
物極側から望むと（原***が矢印で示される）、ノギンｍＲＮＡは背側で最も豊
富であるが、発現は、より低いレベルで、胚の腹側にまで広がることが示される
。インサイチュハイブリダイゼーションのこの方法は、胚の最も卵黄の内胚葉領
域（ｍｏｓｔｙｏｌｋｙｅｎｄｏｄｅｒｍａｌｒｅｇｉｏｎ）において転
写物を検出しないので、本発明者らは、この図において観察されるものよりさら
に植物性領域における発現を除外し得ない。背唇のサイズに影響することが公知
である処理（ＬｉＣｌ処理、ＵＶ照射）は、ノギンインサイチュハイブリダイゼ
ーションのパターンに対して強い効果を有した。ＬｉＣｌ処理した胚において、
染色は、辺縁層全体を通じて激しい。ＵＶ処理は、ハイブリダイゼーションシグ
ナルを低レベルに減じた。この結果は、ノーザンブロット分析により観察される
ノギンｍＲＮＡの量と一致する。ＵＶ処置した胚はまた、ハイブリダイゼーショ
ンの特異性についてのネガティブコントロールである。

【００９２】原腸形成が進むにつれて、ノギンｍＲＮＡ染色は、内旋中の背側中胚葉に続き
、推定される脊索において最も高い。後期神経胚ステージ（約１８）までに、ノ
ギンｍＲＮＡ発現細胞は、最も背側の中胚葉において最もクリアであった（主と
して脊索であるが、より前方に脊索前方中胚葉にも広がる）。脊索の前方先端に
矢印を付す。尾芽ステージの間、背側中胚葉におけるノギンの発現は減少するが
、脊索における発現は、成長中の尾芽において持続する。ノギンの発現は、いく
つかの新たな部位で開始される。これは、オタマジャクシが成熟するにつれて、
漸次、よりクリアになる。染色された細胞の不連続線が、神経管の上衣板の端か
ら端まで走る。染色はまた、頭部中胚葉、主として顎弓および鰓弓において明ら
かである。本発明者らは、この発現が、体細胞原性の神経堤細胞に対応すると考
える。さらに、これら細胞のサブセットは、頭部神経堤の異なる前方−後方レベ
ルをマークするホメオボックス遺伝子を発現する。例えば、顎弓におけるＥｎ−
２は抗体染色により観察される。星状形態を有する細胞は、尾ヒレのノギンｍＲ
ＮＡから染色された。これらの星状細胞はまた、神経堤に由来する可能性が高い
。これらのパターンのいずれも、センスプローブでも、多くの他のプローブでも
観察されなかった。

【００９３】（実施例２）ＣＯＳ細胞中にトランスフェクトされたノギンｃＤＮＡは、活性
な馴化培地を産生するＣＯＳ細胞のために、ノギンｃＤＮＡをＣＯＳ細胞発現ベクター中に挿入した
。ＣＯＳ細胞をトランスフェクトし、そして導入したノギン遺伝子の発現を可能
にさせた後、培地を回収した。この培地を、動物極キャップアッセイにおいて、
中胚葉誘導活性または背方化活性について試験した。本発明者らは、２つのトラ
ンスフェクションプロトコル、標準的なプロトコルおよび別のプロトコルを試験
した。標準的なプロトコルでは、細胞を回収し、次いで無血清培地に移す。別の
プロトコルでは、細胞を、血清を欠くが、トランスフェリン、インスリン、およ
びＢＳＡを含む規定培地に移す。細胞は、補充した培地において健常なままであ
り、そして同時トランスフェクトされたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、補充し
なかった培地より１００倍高い活性を与える。これらの培地で細胞を処理した結
果を下記の表１に示す。動物極キャップを、腹方化した動物から取り出し、処理
し、そして神経胚形成の終わりに、これらを、延長（通常、脊索または神経組織
が誘導されたというサイン）についてスコア付けした。延長を、表１において、
「＋」で示し、なおさらに強い延長を、「＋＋」で示す。さらに、これらを、ノ
ーザンブロットにより分子マーカーについてスコア付けした。

【００９４】表１のデータが示すように、ノギンｃＤＮＡは、ＣＯＳ細胞馴化培地に対して
大きな効果を有する。しかし、ノギンは、恐らく、その培地において、何か他の
ものと相互作用する。なぜなら、ＣＯＳ細胞馴化培地単独では、いくらかの活性
を有するのみであるからである。ノギンが、細胞に、その細胞が通常には分泌し
ていない何かの分泌を引き起こしているとすることは可能である。しかし、実験
により、ノギンが分泌され、これがその活性のいくらかを担っていることが確か
に示される。

【００９５】

【表１】

【００９６】卵母細胞中に注入されたノギンｍＲＮＡは、活性な分泌ノギンタンパク質を産
生するタンパク質が活性形態で分泌されるかどうかの研究への第２のアプローチは、
卵母細胞にｍＲＮＡを注入し、そしてその卵母細胞が分泌する物質を採取するこ
とである。この方法の特別な利点は、注入されたｍＲＮＡが効率的に翻訳され、
そしてその卵母細胞の翻訳のほとんどが、注入されたｍＲＮＡにより開始される
ことである。新たなタンパク質（その合成は、注入されたノギンｍＲＮＡによっ
て導かれる）は培地中に分泌される。ノギンは明らかに、アクチビンと共同作用
して、上昇したレベルの筋肉アクチンを発現する延長した外植片を産生する。

【００９７】ノギンの生化学的特性注入された卵母細胞にｍＲＮＡを注入し、³⁵Ｓメチオニンで標識する。培地中
に分泌された放射活性タンパク質のほとんどが、注入されたｍＲＮＡに由来する
。次いで、ノギンタンパク質（これは、同位体的にほぼ純粋である）が分析され
得る。この分析から、本発明者らは、ノギンが二量体糖タンパク質であると決定
した。還元条件下で泳動し、そしてＮ−グリカナーゼで処理して糖残基を除去し
た場合、ノギンは、２６ｋＤａの予想分子量より、ほんのわずかに遅く移動する
。糖鎖の除去は、３３ｋＤａの開始の見かけ分子量から約４ｋＤａの損失を生じ
る。非還元条件下で泳動した場合、ノギンはこの値の２倍で移動する。

【００９８】本発明者らは、このタンパク質の二量体が活性種であるかどうかも、活性な、
タンパク質分解的にプロセスされた形態が存在するかどうかも未だ知らない。ア
クチビンｍＲＮＡを用いたコントロール実験において、卵母細胞はアクチビン活
性を生じるが、バルクの放射標識タンパク質は、前駆体形態として移動する。少
量のプロセスされたタンパク質（１５ｋＤａ）のみが、検出された。ノギンを注
入された卵母細胞は、プロセスされていないタンパク質を優勢に分泌し、本発明
者らが検出しなかった極端に活性な、プロセスされたタンパク質は微量にしか発
現しない可能性がある。上記の注意書にもかかわらず、注入された卵母細胞およ
びトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の分析からの主要点は、活性なノギンが、自
由に可溶な、分泌ポリペプチドとして得られ得るということである。このことは
、ノギンを、背方化活性を有する他のグループの遺伝子（ｗｎｔ）と区別する。
ｗｎｔタンパク質は、可溶形態では入手可能でなく、このことは、その生物学的
活性およびそれに結合するレセプターの分析を大いに妨げてきた。

【００９９】（実施例３）マウスノギンホモログのクローニング発生中のＸｅｎｏｐｕｓ胚から接合ノギン転写を排除することは、現在、不可
能である。対照的に、マウスにおいてホモ接合のヌル変異を生じさせることは可
能であるはずである。本発明者らは、マウスノギンｃＤＮＡをクローニングした
。これは変異体マウスの作製に有用である。プローブおよび変異体マウスを作製
するためのツールを作製することに加えて、ノギン配列の比較は、保存されたド
メインおよび機能の有用な予言物（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）であるにちがいない。
Ｃ末端８０アミノ酸は、Ｘｅｎｏｐｕｓノギンとマウスノギンとの間で８７％同
一である。

【０１００】マウスノギンを、胚ｃＤＮＡライブラリーから、中程度にストリンジェントな
条件（以前に規定された）下で放射標識したカエルノギンｃＤＮＡでプローブす
ることによって単離した。続いて、高ストリンジェンシー条件（規定されるもの
。しかし、４２℃でハイブリダイズさせ、１５ｍＭＮａＣｌ、１.５ｍＭクエン酸ナトリウムで４０℃にて洗浄した）下でゲノムライブラリーをマウスノギン
ｃＤＮＡでプローブすることによって、ゲノムクローンを単離した。マウスノギ
ンｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列（配列番号１０）および推定アミノ酸配列（
配列番号１１）を、図１３Ａ〜１３Ｂに示す。マウスノギンとヒトノギンとの間
には、わずか２つのアミノ酸が異なる。

【０１０１】（実施例４）ヒトノギンホモログのクローニング材料および方法プローブ調製２つのオリゴヌクレオチドを、マウスノギン配列（上記）に基づいて合成した
。そのオリゴヌクレオチドの配列は、マウスノギンタンパク質のアミノ酸ＱＭＷ
ＬＷＳ（配列番号１９）に対応する、ｎｏｇｇｉｎ５'：５'−ＣＡＧＡＴＧ
ＴＧＧＣＴＧＴＧＧＴＣＡ−３'（配列番号１８）、ならびに、アミノ酸ＥＣＫＣＳＣ（配列番号２１）に対応する、ｎｏｇｇｉｎ３'：５'−ＧＣＡＧＧ
ＡＡＣＡＣＴＴＡＣＡＣＴＣ−３'（配列番号２０）である。

【０１０２】実施例３に記載されたように調製されたマウスｃＤＮＡクローンをテンプレー
トとして使用して、これらのオリゴヌクレオチドを、２６０ヌクレオチドからな
るＤＮＡのセグメントのＰＣＲ増幅に使用した。増幅させたフラグメントは、図
１３に示されるマウス配列（配列番号１０）のヌクレオチド８５６〜１１１６に
対応するヌクレオチド配列を有した。増幅後、ＰＣＲ反応物を、アガロースゲル
において電気泳動し、２６０ｎｔのＤＮＡバンドをＭａｇｉｃＰＣＲ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）により精製し、そしてプローブ標識反応のためのテンプレートとして
使用した。２０ｎｇのＤＮＡテンプレート、および、ｄＣＴＰの代わりの、０.
２ｍＣｕｒｉｅのα３２Ｐ−ｄＣＴＰ（ＤｕＰｏｎｔ３０００Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ）に対して標準的なＰＣＲ反応（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して、プ
ローブを標識した。組み込まれなかった標識を、Ｇ５０ＮＩＣＫカラム（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）上でプローブから分離した。排除容量の反応物は、合計１.８ ×１０８ｃｐｍを含んでいた。

【０１０３】さらに、保存されたマウスおよびＸｅｎｏｐｕｓノギン配列に対応する、１つ
の縮重オリゴヌクレオチド（ｎｏｇｇｉｎＤと呼ばれる）を以下のとおり合成
した：ｎｏｇｇｉｎＤ：５'−ＧＡＲＧＧＩＡＴＧＧＴＩＴＧＹＡＡＲＣＣ− ３'（配列番号２２）。ｎｏｇｇｉｎＤ（配列番号２２）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ３２ＰＡＴＰを使用するキナーゼ反応によって標識し
た。標識したオリゴヌクレオチドを、ＮＡＰ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにより精製し、そしてライブラリーハイブリダイゼーションに使用した。

【０１０４】ライブラリースクリーニングベクターＥＭＢＬ−３中のヒト胎盤ゲノムライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
Ｃａｔ＃ＨＬ１０６７Ｊ，平均挿入物サイズ１５ｋｂ）を、ＮＭ５３８Ｅ．
ｃｏｌｉに、製造業者の仕様書に従ってプレートした。約３百万のプラークを、
３つのレプリカ（Ａ、Ｂ、およびＣと呼ぶ）のニトロセルロースフィルター（Ｂ
Ａ−８５ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ）に移し、そしてＭ
ａｎｉａｔｉｓら［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ
ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬａｂＰｒｅｓｓ、Ｎ
ｅｗＹｏｒｋ（１９８９）］に従ってスクリーニングした。レプリカフィルタ
ーＡおよびＣを、０.５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７.２）、７％ドデシル硫酸ナ
トリウム、１％結晶ＢＳＡ、１ｍＭＥＤＴＡ、４０ｍｇ/ｍｌ変性サケ***ＤＮＡおよび約１×１０６ｃｐｍ/ｍｌのＰＣＲプローブ（上記）を含む緩衝液にてハイブリダイズさせた。６５℃にて１２時間のハイブリダイゼーションの後、
フィルターを、２回、２×ＳＳＣ（３０ｍＭクエン酸ナトリウム、０.３ＭＮａＣｌ）、０.１％ＳＤＳ中で室温にて、次いで２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で
６５℃にて２０分間洗浄し、そしてＫｏｄａｋＸ−ＯＭＡＴＡＲフィルムに
曝露した。フィルターレプリカＢを、５１℃にて１２時間、６×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で標識オリゴヌクレオチドｎｏｇｇｉｎＤとハイブリダイズさせ、
続いて２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで室温にて、そして６×ＳＳＣ、０.１％ＳＤ
Ｓ中で５０℃にて洗浄し、そしてＫｏｄａｋＸ−ＯＭＡＴＡＲフィルムに曝
露した。すべてのレプリカからの陽性プラークを単離し、上記のように再スクリ
ーニングすることによって精製した。精製した陽性プラークを、５００μｌのＳ
Ｍ（１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＳＯ₄ｘ７Ｈ２Ｏ、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７.５）、０.０１％ゼラチン）に懸濁した。１６０μｌのフ
ァージ懸濁物を、０.５ｍｌ飽和ＮＭ５３８培養物と混合し、２０分間３７℃にてインキュベートし、次いで１０ｍＭＭｇＳＯ₄、０.２％マルトースを含む２
５０ｍｌのＬＢ中に接種した。培養物を、細胞溶解（７〜８時間）まで、３７℃
にてインキュベートした。。製造業者の推奨（Ｑｉａｇｅｎ）に従って、Ｑｉ
ａｇｅｎ手順によるファージＤＮＡ精製のために、ファージ溶解物を使用した。

【０１０５】配列決定ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ３７３Ａ自動シーケン
サーおよびＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＴａｑＤｙｅＤｅｏｘｙ ^TM ターミネーターサイクル配列決定キットを使用することによって、配列決定を
行った。

【０１０６】結果ＰＣＲマウスノギンプローブ（配列番号１８および２０）にハイブリダイズし
たフィルターは、ｈｎｏｇλ−９およびｈｎｏｇ−１０と呼ばれるファージプラ
ークに対応する、２つの強いシグナルを示した。縮重オリゴヌクレオチドプロー
ブｎｏｇｇｉｎＤ（配列番号２２）にもハイブリダイズしたこれらのプラークは
、これらのクローンが、ヒトノギン遺伝子に対応することを明らかにした。さら
に、ｈｎｏｇλ−５およびｈｎｏｇλ−７と呼ばれる他の２つのプラークは、Ｐ
ＣＲプローブにハイブリダイズした場合、わずかに弱いシグナルを生じた。これ
らのクローンは、ヒトノギンまたは関連遺伝子のいずれかに対応する。すべての
ヒトＤＮＡインサートが、それぞれの特定のライブラリーに関する文献に記載さ
れるような公知の制限部位を使用してベクターから切り出され得る。

【０１０７】ヒトノギン遺伝子を含むクローンｈｎｏｇλ−９由来の１.６ｋｂＳａｃｌフラグメントをサブクローニングし、そしてそのヌクレオチド配列を図１Ａ〜Ａ
Ｂに記載のように決定した。ヌクレオチド配列から推定されるヒトノギンのアミ
ノ酸配列もまた図１Ａ〜１Ｂに示す。遺伝子またはｃＤＮＡは、種々の真核生物
または原核生物発現系において発現されて、生物学的に活性なヒトノギンタンパ
ク質を産生する。ヒトタンパク質は、Ｘｅｎｏｐｕｓノギンタンパク質が示す活
性と同様な神経栄養活性を示すと予測される。

【０１０８】（実施例５）ヒトのノギンについてのメッセージの組織局在材料および方法プローブの調製プローブを、実施例４に示すように調製した。使用したオリゴは以下の通りで
ある：配列番号８：５’ＧＡＣ．ＴＣＧ．ＡＧＴ．ＣＧＡ．ＣＡＴ．ＣＧＣ．ＡＧＡ．ＴＧＴ．ＧＧＣ．ＴＧＴ．ＧＧＴ．ＣＡＣ配列番号９：５’ＣＣＡ．ＡＧＣ．ＴＴＣ．ＴＡＧ．ＡＡＴ．ＴＣＧ．ＣＡＧ．ＧＡＡ．ＣＡＣ．ＴＴＡ．ＣＡＣ．ＴＣＧ．Ｇ（下線を引いた配列は、マウスのノギン配列を示す；残りの配列はクローニング
のための制限部位を含むテールである。）約３００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、実施例３に記載するように調製したマ
ウスのｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅によって得た。

【０１０９】ＲＮＡの調製およびノーザンブロット選択した組織を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから切除し、そして液
体窒素中ですぐに凍結させた。ＲＮＡを、Ｂｏｔｈｗｅｌｌら、１９９０（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓｏｆＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＥｕｋ
ａｒｙｏｔｉｃＧｅｎｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＳ，ＪｏｎｅｓａｎｄＢａ
ｒｔｌｅｔｔ）に記載されているように、３ＭのＬｉＣｌ、６Ｍの尿素中での組
織のホモジナイゼーションによって単離した。ＲＮＡ（１０μｇ）を、４連の１
％アガロース−ホルムアルデヒドゲル（Ｂｏｔｈｗｅｌｌら、１９９０、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｏｆＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＥｕｋａ
ｒｙｏｔｉｃＧｅｎｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＳ，ＪｏｎｅｓａｎｄＢａｒ
ｔｌｅｔｔ）による電気泳動によって分画し、続いて１０×ＳＳＣ（ｐＨ７）を
用いてナイロンメンブレン（ＭａｇｎａＧｒａｐｈ，ＭｉｃｒｏｎＳｅｐａｒ
ａｔｉｏｎｓＩｎｃ．）にキャピラリー転移させた。ＲＮＡを、紫外線（Ｓｔ
ｒａｔａｌｉｎｋｅｒ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）への暴露によってメン
ブレンにＵＶ架橋させ、そして０．５ＭのＮａＰＯ₄（ｐＨ７）、１％のウシ血清アルブミン（画分Ｖ、Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．）、７％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤ
ＴＡ（Ｍａｈｏｕｄｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７：３３１−３３３（
１９９１））、１００μｇ／ｍｌの超音波処理した変性させたサケ***ＤＮＡの
存在下で、放射標識したプローブと６８℃でハイブリダイズさせた。フィルター
を、３×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで６８℃で洗浄し、そして１日から２週間、
１枚または２枚の増感スクリーン（Ｃｒｏｎｅｘ，ＤｕＰｏｎｔ）およびＸ線フ
ィルム（ＡＲ−５，Ｋｏｄａｋ）を用いて、７０℃にてオートラジオグラフィー
に供した。ゲルのエチジウムブロマイド染色によって、種々のサンプルについて
等しいレベルの全ＲＮＡをアッセイしたことを実証した（Ｍａｉｓｏｎｐｌｅｒ
ｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１４４６−１４５１（１９９０）におけるよ
うに）。ＲＮＡを以下のヒト細胞株から調製した：

【０１１０】

【表２】

【０１１１】結果本発明者らは、マウスのノギンプラスミドから、Ｘｅｎｏｐｕｓとマウスのノ
ギンとの間で保存された領域に対応するＤＮＡフラグメントを増幅した。

【０１１２】約３００ｂｐの増幅されたフラグメントを、成体および胚性組織から、ならび
に種々の細胞株から調製したＲＮＡとともに、ノーザンのハイブリダイズするた
めのプローブとして使用した。約２ｋｂのサイズのノギン転写物を、成体ラット
脳、および細胞株ＳＫＭＥＳ（小細胞肺ガン腫）において検出した。

【０１１３】ノギン転写物の発現を、種々の発生ステージおよび成体で、ラットおよびマウ
スに由来する種々の組織において試験した。マウスにおいては、ノギン転写物は
、Ｅ９からＥ１２までの胚または頭部、ならびに新生仔脳および成体脳において
検出され得る。骨格筋中を除いて、試験した末梢組織においては、検出可能なシ
グナルは存在しなかった。豊富なレベルの発現をまた、出生後のマウスから単離
した海馬星状細胞において見出した。

【０１１４】ラットにおいては、ノギン転写物は、Ｅ９からＥ１８までの胚または頭部にお
いて、ならびにＰ１、Ｐ１９からの脳および成体脳において検出可能であった。
小脳においては、ノギンの発現は、Ｅ１８およびＰ１でより高いようであった；
脊髄においては、ノギンｍＲＮＡの発現はＰ１でピークであった。全てのＣＮＳ
領域中でのノギンの発現の試験は、特に、嗅球、中脳、後脳、および小脳である
。成体においては、ノギンｍＲＮＡは、全てのＣＮＳ領域（特に、嗅球および
小脳）で検出され得た。皮膚においては低いレベルであるようであった。

【０１１５】（実施例６）ノギンによる神経誘導材料および方法ＸｅｎｏｐｕｓノギンＣＨＯ細胞馴化培地の調製ＸｅｎｏｐｕｓノギンＣＨＯ馴化培地を、安定にトランスフェクトされたＣＨ
Ｏ細胞についての選択によって作製した。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ
）欠損ＣＨＯ親細胞（Ｊ．Ｐａｐｋｏｆｆ，．ＳｙｎｔｅｘＲｅｓｅａｒｃｈ
）を、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子とタンデムにノギンを含有する、Ｘｅｎ
ｏｐｕｓノギン発現プラスミドでトランスフェクトした。ヌクレオシドを含ま
ない培地中での増殖を、トランスフェクトに成功した細胞を選択するために使用
した。トランスフェクタントの９個のコロニーを採取し、そして別々に増殖させ
た。これらの細胞中のノギン遺伝子を、ＤＨＦＲのインヒビターであるメトトレ
キセートの用量をゆっくりと増大させることによって増幅させた。ノギン転写物
の存在を、ノーザン分析によって最初に試験した。続いて、２つのクローンＢ３
およびＣ３が、ノギンタンパク質を分泌することを示した。なぜなら、これらの
株に由来する馴化培地が、腹側辺縁層を背方化し得たからである。さらに、３５
Ｓ−メチオニンでＢ３細胞性タンパク質を標識することによって、ノギンタンパ
ク質を、還元性のＳＤＳ−ＰＡＧＥで約３０ｋＤのバンドとして、そして非還元
性のＳＤＳ−ＰＡＧＥで６０ｋＤのバンドとして同定し得た。このことは、これ
が、予想される二量体を形成することを示す。これらの特性は、前出（Ｓｍｉｔ
ｈら、Ｎａｔｕｒｅ３６１，５４７−４９，１９９３）においてＸｅｎｏｐｕ
ｓ卵母細胞中で以前に産生されたノギンタンパク質の特性と一致した。Ｂ３馴化
培地を、１部のαＭＥＭおよび９部のＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（Ｇｉｂｃｏ−Ｂ
ＲＬ）の混合物中に回収した。細胞を、３日間、この培地に馴化させた。親細胞
（ＣＨＯｄｈｆｒ−）に由来するコントロール培地を全く同様に回収した。２
０倍に濃縮した培地を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０濃縮機を使用して作製し、
ここで２０倍の変化を容量によって測定した。

【０１１６】ＣＯＳ細胞からのヒトノギンの精製ヒトノギンタンパク質を、陽イオン交換カラムによって精製した。ＣＯＳ／Ｍ
５細胞を、ヒトノギン発現プラスミドｐＣＡＥ１１で一過性にトランスフェクト
した。細胞をＤＭＥＭ（ＳｐｅｃｉａｌｔｙＭｅｄｉａ）に２から３日間馴化
させ、その後、培地を取り出した。この培地から微粒子を、遠心分離工程および
続く０．２μｍの酢酸セルロースフィルターを通過させることによって除去した
。この明澄化した培地を、数倍の容量の４０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．
３）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡで洗浄したＭｏｎｏＳ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）カラム上にポンプで載せた。次いで、タンパク質を４０ｍＭのリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、１．８ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡでの直
線勾配中に溶出した。ノギンタンパク質は、０．８ＭのＮａＣｌで溶出し、そし
てＳＤＳ−ＰＡＧＥにより９０％以上の純度である。

【０１１７】Ｘｅｎｏｐｕｓｏｔｘの単離ＸｅｎｏｐｕｓＯｔｘクローンを単離するために、オタマジャクシ頭部のｃ
ＤＮＡライブラリー（Ｈａｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕら、Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ１０６，６１１−６１７，１９８９）を、低いストリンジェンシーで
マウスｏｔｘｃＤＮＡ（Ｓ−ＬＡｎｇおよびＲｏｓｓａｎｔ，Ｔｏｒｏｎｔ
ｏ）を用いてスクリーニングした。採取したクローンを２つのクラスに分けた。
１つのクラス（本発明者らがｏｔｘＡと命名した）は、ここで使用したプローブ
ｐＸＯＴ２１．２を含んだ。インサイチュハイブリダイゼーションにより、転写
物は、背側浅層で原腸胚形成の前に最初に検出される。神経胚形成の間には、大
きな前方ドメインが遺伝子を発現し、そして神経組織および非神経組織の両方を
含む。尾芽オタマジャクシ中での発現の低下後、この遺伝子は、脳および眼にお
いて特異的に再度発現される。

【０１１８】腹側の辺縁領域のアッセイ胚の調製Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓの胚を受精させ、そして記載されているように
（ＣｏｎｄｌｅおよびＨａｒｌａｎｄ、１９８７，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１
０１、９３−１０５）解剖の前の晩に常法で脱ゼリー化する。胚を一晩１５℃に
て培養する。それぞれの発生中の胚の周辺の卵黄膜を、翌朝、後期胞胚ステージ
でモニタリングの後に手作業で除去した。解剖まで、胚を、アガロースでコート
したディッシュ中の１／３×の改変したリンゲル中で維持した。

【０１１９】腹側辺縁層の摘出胚を、背側が同定され得るように、それらの卵黄植物性半球を上に向ける。初
期原腸胚の背側は、「背唇」と呼ばれる密度の高い色素の小さな弧線の存在によ
って明らかである。背唇は、背側中胚葉の内旋の開始を示す。腹側辺縁層（ＶＭ
Ｚ）を、背唇の正反対に見出し、そして摘出した。卵黄膜を除去しているので、
胚は平らになる。ワックスでガラスピペット上に取り付けた、眉毛から作製した
特別に構築したナイフを使用して、上に面している植物極から動物極まで、平坦
になった胚を通して２つの切れ目を作製する。切れ目を、これらがより側面の組
織から離れた腹側の約３０〜６０度を単離するように、作製する。最初の２つの
切れ目に対して垂直である第３の切れ目で、腹側辺縁層の組織を、胚の残りから
完全に単離する。この第３の切れ目は、中心から胚の半径の約３分の２のレベル
である。処理の前に、ＶＭＺを培養培地中で１回洗浄する。

【０１２０】アッセイ約５〜１０のＶＭＺを、１回のアッセイについて使用する。洗浄したＶＭＺを
、アッセイのための所望の処理タンパク質培地を含有するエッペンドルフチュー
ブ中に穏やかに滴下する（液体の移動を最小にするように試みる）。ＶＭＺを、
コントロールの全胚の発生によって評価されるような、後期神経胚または初期尾
芽ステージまで発生させる。この時点で、ＲＮＡをＶＭＺおよびコントロールの
全胚から、記載されているように単離する（ＣｏｎｄｉｅおよびＨａｒｌａｎｄ
，ｉｂｉｄ）。ＶＭＺにおける筋肉アクチンの発現は、背方化事象を示す（Ｌｅ
ｔｔｉｃｅおよびＳｌａｃｋ，１９９３．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１７，２
６３−７２）。各サンプルに由来するＲＮＡを、ホルムアルデヒド−アガロース
ゲル上で泳動し、そして遺伝子スクリーニングするためにブロットする。次いで
、ブロットを、Ｘｅｎｏｐｕｓ筋肉アクチンプローブでハイブリダイズする（Ｄ
ｗｏｒｋｉｎ−Ｒａｓｔｌら、１９８６．Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．ｅｘｐ．Ｍｏｒ
ｐｈ．９１、１５３−６８）。背方化の定量を、偏在して発現されるＥＦ−１α
のシグナルに対して筋肉アクチンのシグナルを規格化することによって行い得る
（Ｋｒｉｅｇら、１９８９．Ｄｅｖｌ．Ｂｉｏｌ．１３３，９３−１００）。定
量を、蛍光体画像化を使用して行う。

【０１２１】ＲＮアーゼ保護アッセイＲＮアーゼ保護を、消化を１０単位／ｍｌのＲＮアーゼＴ１のみ（Ｃａｌｂｉ
ｏｃｈｅｍ５５６７８５）を使用して室温（２２℃）で行う改変をなして、記
載されているように行った（Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉ
ｄｓＲｅｓ１２，７０３５−５６，１９８４）。２０〜３０の動物極キャッ
プを各レーンから回収し、その８０％を、神経のマーカーに、そして１０％を筋
肉アクチンおよびＩＩ型コラーゲンに使用した。グースコイドおよびブラキュリ
については、２０のキャップを使用した。暴露は１２時間から５日間の範囲であ
った。全ての場合において、フィルムを予めフラッシュした。マーカーが発現さ
れなかった場合は、結果を、蛍光体画像化を使用してより大きな感度を有すると
確認した。

【０１２２】結果脊椎動物の胚の発生は、いくつかの誘導性相互作用を必要とする。中胚葉（こ
れは、最終的に組織（例えば、脊索、筋肉、心臓、間葉組織、および血液）を形
成する）は、胚の赤道領域で誘導される（Ｎｉｅｕｗｋｏｏｐ，Ｗｉｌｈｅｌｍ
Ｒｏｕｘ’ Ａｒｃｈ．ＥｎｔｗＭｅｃｈ．Ｏｒｇ，１６２、３４１−３７３
、１９６９）。この誘導性の事象は十分に研究され、そして線維芽細胞増殖因子
（ＦＧＦ）ファミリー、およびアクチビン（ＪｅｓｓｅｌｌおよびＭｅｌｔｏｎ
，Ｃｅｌｌ６８，２５７−７０１９９２；Ｓｉｖｅ，ＧｅｎｅｓＤｅｖ
７，１−１２，１９９３）、およびＴＧＦｂファミリー（Ａｓａｓｈｉｍａら、
Ｒｏｕｘ’ｓＡｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９８，３３０−３３５，１９９
０；Ａｓａｓｈｉｍａら、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ７７，８
，３８９−９１，１９９０；ＧｒｅｅｎおよびＳｍｉｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ３４
７，３９１−３９４，１９９０；Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ３４５，６２７
７，７２９−３１，１９９０；Ｔｈｏｍｓｅｎら、Ｃｅｌｌ６３，４８５−４
９３，１９９０；ｖａｎら、Ｎａｔｕｒｅ３４５，６２７７，７３２−４，１
９９０）のメンバーを含む内因性のインデューサーのいくつかの候補が存在する
。ＦＧＦ（Ａｍａｙａら、Ｃｅｌｌ６６，２５７−２７０，１９９１）および
アクチビン（Ｈｅｍｍａｔｉ−ＢｒｉｖａｎｌｏｕおよびＭｅｌｔｏｎ，Ｎａｔ
ｕｒｅ３５９，６０９−６１４，１９９２）の両方の優性ネガティブレセプタ
ーのＸｅｎｏｐｕｓ胚における使用は、これらの分子によって活性化されたシグ
ナル伝達経路が適切な中胚葉形成に必須であることを強力に示唆する。ｗｎｔ（
Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１１，１０４５−１０５５
，１９９１；ＭｃＭａｈｏｎおよびＭｏｏｎ，Ｃｅｌｌ５８、１０７５−８４
，１９８９；ＳｍｉｔｈおよびＨａｒｌａｎｄ，Ｃｅｌｌ６７，７５３−７６
５，１９９１；Ｓｏｋｏｌら、Ｃｅｌｌ６７，７４１−７５２，１９９１）お
よびノギン（Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ３６１，５４７−４９，１９９３）
のような分子は、中胚葉を直接誘導することなく作製される中胚葉の種類を改変
する。

【０１２３】続く誘導において、シュペーマンオーガナイザーの背側中胚葉は、より背側の
運命になるように、すぐ近くの側部中胚葉にシグナルを送る（ＤａｌｅおよびＳ
ｌａｃｋ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１００，２，２７９−９５，１９８７；Ｌ
ｅｔｔｉｃｅおよびＳｌａｃｋ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１１７，２６３−２
７１，１９９３；ＳｐｅｍａｎｎおよびＭａｎｇｏｌｄ，Ａｒｃｈ．ｍｉｋｒｏ
ｓｋ．Ａｎａｔ．ＥｎｔｗＭｅｃｈ．１００，５９９−６３８，１９２４；Ｓｔ
ｅｗａｒｔおよびＧｅｒｈａｒｔ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１０９，３６３−
３７２，１９９０）。オーガナイザー中で発現され、そしてその背方化活性を模
倣し得る唯一の既知の因子が、ノギンである。

【０１２４】シュペーマンオーガナイザーの背側中胚葉はまた、近くの外胚葉に神経組織に
なるためのシグナルを送る。背側中胚葉による神経誘導が、両生類（Ｄｉｘｏｎ
およびＫｉｎｔｎｅｒ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１０６，７４９−７５７，１
９８９；Ｄｏｎｉａｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７、５０６９，５４２−５，
１９９２；Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ，ＴｈｅＨｅｒｉｔａｇｅｏｆＥｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔａｌＥｍｂｒｙｏｌｏｇｙ：ＨａｎｓＳｐｅｍａｎｎａｎｄ
Ｏｒｇａｎｉｚｅｒ，１９８８；ＫｉｎｔｎｅｒおよびＭｌｔｏｎ，Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔ９９，３１１−２５，１９８７；Ｓｐｅｍａｎｎ，Ａｒｃｈ．ｍ
ｉｋｒｏｓｋ．Ａｎａｔ．ＥｎｔｗＭｅｃｈ．１００，５９９−６３８，１９３
８）、鳥類（ＫｉｎｔｎｅｒおよびＤｏｄｄ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１３
，１４９５−１５０６，１９９１；Ｔｓｕｎｇら、ＡｃｔａＢｉｏｌｅｘｐ
Ｓｉｎｉｃａ１０，６９−８０，１９６５）において、そして最近、マウス
（ＡｎｇおよびＲｏｓｓａｎｔ，Ｄｅｖｅｌｏｐｐｍｅｎｔ１１８，１３９−
１４９，１９９３）において実証されている。１０年間の努力にもかかわらず、
この誘導を担う因子の分子的性質についてはほとんどわかっていない。既知のイ
ンデューサーの中でも、アクチビンは、神経組織の形成を促進し得るが、これは
、アクチビンが誘導する背側中胚葉による二次的な誘導に起因する（Ｇｒｅｅｎ
ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１０８，１，１７３−８３，１９９０；Ｇｒｅｎ
およびＳｍｉｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ３４７，３９１−３９４，１９９０；Ｋｉｎ
ｔｎｅｒおよびＤｏｄｄ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１３，１４９５−１５０
６，１９９１）。従って、アクチビンは、原腸胚外胚葉に添加された場合は、神
経組織の形成を促進し得ない；しかし、このような外胚葉は、原腸胚形成の終わ
りまで、背側中胚葉によって神経形成されることに対してコンピテントのままで
ある（ＳｈａｒｐｅおよびＧｕｒｄｏｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｐｍｅｎｔ１０９，
７６５−７４，１９９０）。

【０１２５】ノギンによる直接神経誘導内因性誘導因子についての候補は、背側中胚葉の不在下で神経組織を誘導する
ことが予期される。後期胞胚ステージ胚（Ｓｔ９）からの反応能を有する動物極
キャップ外胚葉を使用して、ノギンの神経誘導能を試験した。Ｘｅｎｏｐｕｓノ
ギンタンパク質馴化培地を安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から採集し、
そして２０倍濃縮培地を使用して、Ｓｔ９動物極キャップを処理した。ＲＮアー
ゼ保護アッセイにおいて使用されるマーカーは、Ｎ−ＣＡＭ（Ｊａｃｏｂｓｏｎ
およびＲｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ、ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ
１１８，５２４−３１，１９８６；ＫｉｎｔｎｅｒおよびＭｅｌｔｏｎ、Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ９９，３１１−２５，１９８７）、神経細胞接着分子、後
脳および脊髄で発現されるｂ−チューブリンの神経特異的イソ型（Ｇｏｏｄら、
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１７，８０００、１９８９；Ｇｏｏｄら
、ＤｅｖＢｉｏｌ１３７、４１４−８、１９９０；Ｒｉｃｈｔｅｒら、Ｐｒ
ｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８５、８０８６−９０、１９８８
）、およびＸＩＦ３、神経発現中間フィラメント遺伝子（Ｓｈａｒｐｅら，Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１０７，７０１−１４，１９８９）（神経誘導についてア
ッセイするための）であった。これらの全てのマーカーは神経組織に制限される
が、ＮＣＡＭのみが神経系全体にわたって発現される。本発明者らは、Ｘｅｎｏ
ｐｕｓ−ノギン馴化培地が、筋肉アクチン（レーン１３）を誘導することなく、
処理動物極キャップにおいて、高レベルのＮ−ＣＡＭおよびＸＩＦ３発現［図２
；レーン８］を誘導することを見出した（Ｄｗｏｒｋｉｎ−Ｒａｓｔｌら、Ｊ．
Ｅｍｂｒｙｏｌ．ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．９１，１５３−１６８，１９８
６；Ｍｏｈｕｎら、Ｎａｔｕｒｅ３１１、７１６−７２１，１９８４）。コン
トロールＣＨＯ細胞培地は、筋肉組織も神経組織も誘導しない（レーン７、１２
）。Ｓｔ９アクチビン処理動物極キャップは、筋肉アクチン（レーン１１）およ
び３つの全ての神経マーカー（レーン６）を発現し、このことは、アクチビンが
、間接的に神経組織を生成し得ることを実証する。ノギンは、高レベルのＮ−Ｃ
ＡＭを誘導する一方、いくらかはあるが、非常にわずかなｂ−チューブリン発現
しか誘導しないのに対し、アクチビン誘導は、ほとんど逆の効果を有することに
興味深く留意される。

【０１２６】ノギンタンパク質が神経組織を誘導するのに十分であるか否かを決定するため
に、ＣＯＳ細胞をｐＣＡＥ１１、ヒトノギン発現プラスミドでトランスフェクト
し、そして馴化培地をカチオン交換クロマトグラフィーによって精製し、９０％
純粋であるノギン調製物を生じさせた［図３］。このような精製ヒトノギンタン
パク質もまた、動物極キャップにおいて神経組織を誘導させ得る［図４ａ、以下
を参照のこと］。

【０１２７】本発明者らは、ノギンが、後期胞胚ステージ動物極キャップでは筋肉を誘導し
ないことを示しているが、ノギンは、他のタイプの背側中胚葉を誘導することが
考えられる。この関心ごとに取り組むために、本発明者らは、ノギンが、初期中
胚葉マーカーであるグースコイド（Ｂｌｕｍｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５
３、１９４−６，１９９１；Ｃｈｏら、Ｃｅｌｌ６７、１１１１−２０、１９
９１）、オーガナイザー組織のマーカー、および続いて頭部中胚葉またはＸ−ブ
ラキュリ（Ｓｍｉｔｈら、Ｃｅｌｌ６７、７９−８７、１９９１）（これは、
全ての中胚葉前駆体において初期に発現されるようであり、そして続いて後方中
胚葉および脊索で発現される）を誘導し得るか否かを求めた。正常胚でグースコ
イドおよびブラキュリの発現が高いとき、動物極キャップを９ステージで処理し
、１１ステージで採集した。いずれのマーカーも、示された神経誘導活性を有す
る（図６、レーン１５）用量では、精製ヒトノギンによって現れない（図４ｂ、
レーン５）；逆に、アクチビンで同様に処理した動物極キャップは、この中胚葉
誘導因子（Ｃｈｏら、Ｃｅｌｌ６７、１１１１−２０，１９９１；Ｓｍｉｔｈ
ら、Ｃｅｌｌ６７，７９−８７，１９９１）について予期されるように、グー
スコイドおよびＸ−ｂｒａの両発現を示す（図４ｂ、レーン４）。未処理動物極
キャップは、これらの中胚葉マーカーの発現を示さず（レーン３）、そして採集
された動物極キャップにおけるＲＮＡレベルは、ＥＦ−１ａレベルを用いたとき
と匹敵することが示されている（Ｋｒｉｅｇら、ＤｅｖＢｉｏｌ１３３、９
３−１００，１９８９）。

【０１２８】精製ヒトノギンが神経誘導を駆動し得るので、粗馴化培地に存在し得るさらな
る因子は必要とされない。さらに、Ｘｅｎｏｐｕｓおよびヒトノギン（８０％ア
ミノ酸同一性を有する）はともに、Ｘｅｎｏｐｕｓにおいて神経組織を誘導する
ように作用し得、このことは、これらの２つのタンパク質の保存された機能を示
唆する。しかし、ノギンが候補内因性神経誘導因子であるためには、神経誘導が
正常胚全体で生じるステージにおいて、神経組織を誘導できなければならない。
いつ最初の指令的なシグナルが、胚において背側中胚葉から外胚葉まで送られる
かは、不明である。しかし、初期原腸胚ステージまでに、背側外胚葉はすでに、
神経組織になるように特殊化されていることが知られている（Ｊｏｎｅｓおよび
Ｗｏｏｄｌａｎｄ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１０７、７８５−９１、１９８９
）。従って、神経誘導シグナルは、このステージの前に出発すると思われる。動
物極キャップが神経誘導中胚葉に応答するように反応能を有することが示されて
いる最も遅いステージは、初期神経胚（Ｓｔ１３−１４）である（Ｓｈａｒｐｅ
およびＧｕｒｄｅｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１０９，７６５−７４，１９９
０）。従って、候補内因性神経誘導因子は、原腸胚ステージ反応能外胚葉から神
経組織を誘導できるにちがいない。

【０１２９】原腸胚ステージにおける神経誘導ノギンに応答する外胚葉の反応能を評価するために、本発明者らは、胞胚（Ｓ
ｔ８）ステージ胚、後期胞胚（Ｓｔ９）ステージ胚、初期原腸胚（Ｓｔ１０）ス
テージ胚から採取した動物極キャップ、および中期原腸胚（Ｓｔ１０．５）ステ
ージ胚からの腹側動物極キャップを精製ヒトノギンで処理した［図２］。本発明
者らはまた、同様にステージ付けられた動物極キャップをアクチビンで処理し、
その中胚葉誘導活性および二次神経誘導活性を示し、そしてアクチビンの効果を
ノギンの効果と対比させた［図４ａ］。アクチビン処理動物極キャップは、背側
中胚葉の誘導（例えば、筋肉および脊索）と共にのみ神経誘導を示す（レーン３
、６、９）。多数の実験において、本発明者らは、アクチビンが背側中胚葉、お
よび結果として神経組織を誘導する能力は、原腸胚ステージで急速に減少するこ
とを確認した（レーン１２）（Ｇｒｅｅｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１０８
，１７３−８３，１９９０；ＫｉｎｔｎｅｒおよびＤｏｄｄ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ１１３、１４９５−１５０６、１９９１）。ここで示した実験では、通
常より多くの用量のアクチビンが与えられた。これらの条件下では、少量の神経
組織のみが生成される。これは、おそらく、非常に多くの内胚葉が誘導されるた
め、神経化されるべき外稙片に、多くの反応能を有する外胚葉が残らないからで
ある。対照的に、ノギンは、これらのステージの全てから採取された動物極キャ
ップにおいて、脊索および体節マーカー、ＩＩ型コラーゲン（Ａｍａｙａら、Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１８、４７７−８７、１９９３；Ｂｉｅｋｅｒおよび
Ｙａｚｄａｎｉ−Ｂｕｉｃｋｙ、ＪＨｉｓｔｏｃｈｅｍＣｙｔｏｃｈｅｍ
４０、１１１７−２０、１９９２）、または筋肉アクチンを誘導することなく、
神経組織を誘導し得る（レーン４、７、１０、１３）。これは、ノギンが、直接
的な神経誘導因子であるという提唱にさらなる支持を与える。なぜなら、これは
、初期および後期の両方の中胚葉マーカーの不在下で作用し得るからである。さ
らに、本発明者らは、ノギンは、中胚葉誘導因子が不活性である時点で、反応能
を有する外胚葉において、神経組織を誘導し得ることを示している。

【０１３０】いくつかの実験において、原腸胚（胞胚ではない）動物極キャップへのノギン
添加は、筋肉の誘導を生じた。これは、アクチビンが、もはや筋肉を誘導し得な
いステージにおいて生じた。本発明者らは、これを、弱い中胚葉誘導シグナルを
受容した組織におけるノギンによる背方化作用の結果であると解釈する。原腸胚
動物極キャップに伝播されるこの中胚葉誘導シグナルは、中胚葉を誘導するのに
十分ではないが、Ｘｗｎｔ−８またはノギンの存在下では、筋肉が形成される。
筋肉の誘導の１つの興味深い推論は、外稙片で見られる神経組織の性質が改変さ
れることである。筋肉を含まない外稙片における誘導は、通常、Ｎ−ＣＡＭ発現
を生じるが、筋肉が存在すれば、Ｎ−ＣＡＭおよびｂ−チューブリンの両方の発
現が見られる。この現象は、Ｓｔ．９動物極キャップにおけるアクチビンによる
二次神経誘導において［図２］、および腹側辺縁層対動物極キャップにおけるノ
ギンにより誘導された神経組織の比較において［図６］、示される。筋肉が存在
する腹側辺縁層および動物極キャップでは、Ｎ−ＣＡＭおよびｂ−チューブリン
の両方が発現され、一方、筋肉のない誘導された動物極キャップは、Ｎ−ＣＡＭ
発現のみを示す。

【０１３１】ノギンをコードするＤＮＡの注入後の神経誘導別の実験アプローチを使用して本発明者らの結論を確認するために、本発明者
らは、プラスミドｐＣＳＫＡ−ｎｏｇｇｉｎを１細胞ステージ胚の動物極に注入
することにより、原腸胚ステージ動物極キャップにノギン発現を指向させた。こ
のプラスミド（ノギンが、細胞骨格アクチンプロモーターの制御下にある）は、
原腸胚形成の開始時にノギンｍＲＮＡの発現を作動させる（Ｓｍｉｔｈら、Ｎａ
ｔｕｒｅ３６１，５４７−４９，１９９３）。胞胚ステージで、動物極キャッ
プを解剖し、次いで分子分析のために尾芽ステージまで成熟させる。ノギンプラ
スミドを注入した動物極キャップは、筋肉または脊索マーカーの不在下でＮ−Ｃ
ＡＭの発現を示す（図４ｃ、レーン２）。ｌａｃＺの発現を指向するコントロー
ルプラスミドは、予期されるように、神経誘導も中胚葉誘導も示さなかった（レ
ーン１）。この実験は、異所性ノギン発現が、原腸胚ステージ外胚葉（神経誘導
が胚全体において生じているステージ）において神経組織を直接的に誘導し得る
ことを示す。

【０１３２】背側動物極キャップおよび腹側動物極キャップの間の反応能の差異原腸胚ステージ胚の背側から採取された動物極キャップは、退縮された前方中
胚葉が誘導因子として使用される場合、腹側動物極キャップよりも、神経組織形
成に対してより大きな反応能を示す（ＯｔｔｅおよびＭｏｏｎ、Ｃｅｌｌ６８
、１０２１−２９、１９９２；Ｓｈａｒｐｅら、Ｃｅｌｌ５０，７４９−５８
，１９８７）。しかし、このタイプの中胚葉は、退縮された中胚葉の残りよりも
弱い誘導能を有する（Ｓｉｖｅら、Ｃｅｌｌ５８、１７１−１８０、１９８９
）。さらに、胚の腹側は、オーガナイザーがその側に配置されるとき、完全な二
次軸の形成を支持し得（ＧｉｍｌｉｃｈおよびＣｏｏｋｅ、Ｎａｔｕｒｅ３０
６、４７１−３、１９８３；ＳｍｉｔｈおよびＳｌａｃｋ、Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏ
ｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．７８、２９９−３１７、１９８３；Ｓｐｅｍａ
ｎｎ、Ａｒｃｈ．ｍｉｋｊｒｏｓｋ．Ａｎａｔ．ＥｎｔｗＭｅｃｈ．１０
０、５９９−６３８、１９３８）、このことは、反応能において質的な差異はな
いことを示している。従って、弱い誘導因子が、外胚葉の反応能においてわずか
な差異を暴露し得る一方、強い神経誘導因子は、背側外胚葉および腹側外胚葉に
対するその効果においてほとんど差異を示さないことが示唆されている（Ｓｅｒ
ｖｅｔｎｉｃｋおよびＧｒａｉｎｇｅｒ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１２、１
７７−８８、１９９１）。従って、本発明者らは、初期原腸胚からの背側外胚葉
および腹側外胚葉に対するノギンの効果を試験した。Ｎ−ＣＡＭ発現における差
異は、検出されず（図５、レーン４、６）、ノギンで処理した腹側動物極キャッ
プは、（おそらく低級中胚葉誘導を受容した組織の背方化によって）より多くの
量の筋肉アクチン発現を示す。アクチビン処理背側極キャップは、腹側ノギン処
理極キャップとほぼ同じレベルの筋肉アクチン発現（レーン５）の誘導を示すが
、アクチビン処理は、検出可能な神経特異的転写物を誘導しなかった（レーン３
、５）。このことは、このステージで誘導された筋肉組織は、神経組織を二次誘
導するのに十分でないこと、およびノギンは神経組織を誘導するために存在して
いるに違いないことを示している。

【０１３３】本発明者らは、ノギン仲介神経誘導において背側−腹側差異がなく、このこと
は、ノギンがシュペーマンオーガナイザーの強い神経誘導シグナルと同様に挙動
し、初期前方中胚葉からの弱いシグナルと同様ではないことを示唆すると結論す
る。

【０１３４】用量依存性どのレベルのノギンタンパク質が神経誘導活性に必要とされるかを決定するた
めに、本発明者らは、用量応答実験を実行した。動物極キャップにおいて神経誘
導に必要とされる用量を決定することに加え、本発明者らはまた、これらの２つ
のタイプの誘導に必要とされる用量を比較するために、腹側辺縁層の背方化の用
量応答を実施した。９ステージ動物極キャップまたはＳｔ．１０．５ＶＭＺを
精製ヒトノギンで処理し、そしてＮ−ＣＡＭおよびβ−チューブリンを神経誘導
をアッセイするために使用し、一方筋肉アクチンを、背側中胚葉のマーカーとし
て使用した。この実験は、神経誘導が、１μｇ／ｍｌの用量で生じ、これは、Ｖ
ＭＺの背方化に必要とされるより２０倍高い用量であることを示す［図５］。明
らかに高い用量が必要とされることを説明し得る、いくつかの知見がある。第一
に、背側中胚葉から最大神経応答を得るためには、組織は、神経胚形成のほとん
どと接触して置かれなければならない（ＳｈａｒｐｅおよびＧｕｒｄｏｎ、Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１０９、７６５−７４、１９９０）；逆に、ノギンで処理
した動物極キャップは急速に閉塞し、これは、因子接近を阻害し、そして結果と
してそれら動物極キャップは、短時間有効な用量のみを受容する。第二に、ノギ
ンが、胚において活性である唯一の神経誘導因子ではないと思われる；種々の両
生類において、体節（Ｈｅｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５０，８００−８０２，１９９０；ＪｏｎｅｓおよびＷｏｏｄｌａｎｄ、Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１０７、７８５−９１、１９８９）および神経板が、神
経誘導活性を有し（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ、ＴｈｅＨｅｒｉｔａｇｅｏｆＥ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＥｍｂｒｙｏｌｏｇｙ：ＨａｎｓＳｐｅｍａｎｎ
ａｎｄｔｈｅＯｒｇａｎｉｚｅｒ，１９８８；Ｓｅｒｖｅｔｎｉｃｋおよ
びＧｒａｉｎｇｅｒ、ＤｅｖＢｉｏｌ１４７、７３−８２、１９９１）、そ
してノギン転写物がそこでは検出されないことがことが示されている。従って、
ノギンは、いくつかの神経誘導活性のうちの１つであることが、もっともらしく
思われる。これに関連して、ノギンが、腹側辺縁層において神経組織を誘導する
ことにおいて、それらを背方化して筋肉を生成させることにおいてと、同等に有
効であることに留意する価値がある。多数の他の実験（図５を参照のこと）は、
アクチビンによるこのステージにおける類似の量の筋肉の誘導は、神経誘導を生
じないことを示す。第四に、少ない割合の精製タンパク質のみが活性であること
、およびこの実験は、神経誘導に必要とされるタンパク質の量を過剰評価してい
るようであり得る。最後に、外因的に添加された可溶性ノギンへの接近性は、内
因的に分泌されたノギンタンパク質よりも有意に低いと考えられる。

【０１３５】パターンニング胚神経組織は、種々の脳構造、眼、および脊髄を有する、前後方向（Ａ−Ｐ）
パターンを呈する。Ａ−Ｐ神経パターンは、それが平面構造で応答外胚葉に近接
しているか（ＤｉｘｏｎおよびＫｉｎｔｎｅｒ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１０
６、７４８−７５７、１９８９；Ｄｏｎｉａｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７、
５４２−５、１９９２；ＫｉｎｔｎｅｒおよびＭｅｌｔｏｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ９９、３１１−２５、１９８７；ＲｕｉｚｉＡｌｔａｂａ、Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ１０８、５９５−６０４、１９９０）、または垂直方向の相
互作用で外胚葉の直下にあるか（ＤｉｘｏｎおよびＫｉｎｔｎｅｒ、Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔ１０６、７４９−７５７、１９８９）に関わらず、背側中胚葉の
存在を必要とすると考えられる（Ｈｅｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ２５０、８００−８０２、１９９０；ＳｈａｒｐｅおよびＧｕｒｄ
ｏｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１０９、７６５−７４、１９９０；Ｓｌｖｅら
、Ｃｅｌｌ５８、１７１−１８０、１９８９）。これらの両タイプの相互作用
は、正常な発生を生じ、そしておそらく共に、得られるパターンに寄与する。ノ
ギンが、パターン化された神経組織を誘導するかどうか、そしてもしそうであれ
ば、どの神経領域が表されるかを決定するために、本発明者らは、インサイチュ
ハイブリダイゼーションにおいて、前脳および中脳のマーカーとしてＸｅｎｏｐ
ｕｓｏｔｘ；中脳−後脳境界のマーカーとしてＥｎ−２（Ｈｅｍｍａｔｉ−Ｂ
ｒｉｖａｎｌｏｕら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１１、７１５−７２４、１９
９１）；および後脳の第三および第五の菱脳神経小片のマーカーとしてＫｒｏｘ
−２０（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３７、４６１−４、１９８９
）を使用した（Ｈａｒｌａｎｄ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏ
ｇｙ、３６、６７５−６８５、１９９１）。ＸＩＨｂｏｘ６に対して指向され
た抗体（Ｗｒｉｇｈｔら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１０９、２２５−３４、１
９９０）は、後方後脳構造および脊髄構造をマークする。これらのマーカーの使
用の前に、本発明者らは、ノギン処理動物極キャップにおいてセメント腺の形成
を観察した。セメント腺は、神経板に対して前方に見出される外胚葉起源の誘導
組織であるので、この結果は、ノギンが前方構造を誘導することを示唆する。イ
ンサイチュハイブリダイゼーションは、ノギン処理動物極キャップにはセメント
腺特異的転写物、ＸＡＧ−１（Ｓｉｖｅら、Ｃｅｌｌ５８、１７１−１８０，
１９８９）が存在するが、コントロール処理動物極キャップでは存在しないこと
を示すことにより、これを確認する［図７Ａ−Ｌ］。領域特異的神経マーカーを
用いるインサイチュハイブリダイゼーション［図７Ａ−Ｌ］は、ノギン処理動物
極キャップにおけるｏｔｘの発現によって見られるように、ノギンが前脳タイプ
組織を誘導することを示す。本発明者らは、Ｅｎ−２、Ｋｒｏｘ２０、またはＸ
ＩＨｂｏｘのいずれも検出しておらず、このことは、これらのより後方のマーカ
ーが、ノギンによって誘導されないことを示唆する。

【０１３６】神経抗原の発現本発明者らは、ノギンが、神経特異的転写物の発現を直接的に誘導することを
実証している。さらなる実証は、神経特異的抗原に対する抗体を使用して、ノギ
ン誘導組織が表現型が神経性のものであることを示すことである。このために、
本発明者らは、動物極キャップ組織をノギンで処理し、そして抗体染色のために
それらを後期段階（Ｓｔ３５）まで培養した。本発明者らは、６Ｆ１１抗Ｎ−Ｃ
ＡＭ抗体を使用している。この抗体は、正常胚の神経管全体を染色する。ノギン
処理動物極キャップは、この抗原を発現し［図７Ａ−Ｌ］、コントロール未処理
動物極キャップは、発現しない。このことは、ノギンが、処理動物極キャップで
神経特異的タンパク質の産生を誘導し得ることを示している。本発明者らは、分
化神経細胞の種々のサブクラスに特徴的な多数の他の抗原の発現を検出し得なか
った。これらは、２Ｇ９（大部分の神経組織（末梢神経細胞を含む）を染色する
）、Ｔｏｒ２４．５５（これは、感覚神経細胞を染色する）、およびＴｏｒ
２３（これは、種々の神経細胞（運動神経細胞を含む）を染色する）を含んだ。

【０１３７】（実施例７）Ｅ．ｃｏｌｉおよびバキュロウイルスからの組換えヒトノギンの産生材料および方法遺伝子操作および細胞培養ラクトース誘導性発現プラスミドを、ｐＲＰＮ４０（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉ
ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５７，１００８−１０１２，１９９１）のＳｗ
ａ１／Ｂｓｍ１領域を、ＰＣＲにより得られ、そして同じ制限部位にまたがる、
ヒトノギン遺伝子のＳｗａ１／Ｂｓｍ１領域と置換することにより構築し、プラ
スミドｐＲＧ３０１を生じさせた。ｐＲＧ３０１は、ｌａｃＵＶ５プロモーター
の制御下にあるヒトノギン遺伝子を有するｐＢＲ３２２由来の高コピー数カナマ
イシン耐性プラスミドである。高コピー数のカナマイシン耐性遺伝子を含むプラ
スミドは、ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ（ＮＲＲＬ），Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓに寄託されており、そ
して受託番号Ｂ−１８６００を有する。このプラスミドは、米国特許出願第０７
／４７８，３３８号（これはその全体が本明細書中に参考として援用される）に
記載された。本質的には、記載されるように（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉら、同書
）、ｐＲＧ３０１で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０ｌａｃｌｑ細胞を
３７℃で増殖させ、ラクトースで誘導し、遠心分離によって採取し、１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭＥＤＴＡｐＨ８で１回洗浄し、凍結保存した
。

【０１３８】封入体からの回収Ｅ．ｃｏｌｉ細胞ペースト（３２ｇ）を、１０容量（ｖ／ｗ）の５０ｍＭＴ
ｒｉｓＨＣＩ−ｐＨ８．０−５ｍＭＥＤＴＡ中に懸濁し、８，０００ｐｓｉお
よび８℃でフレンチプレスで溶解し、そして４℃で３０分間８，０００×ｇで遠
心分離した。ノギンを含有するペレットを、元の容量の２Ｍ尿素−２０ｍＭＴ
ｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０中に懸濁し、そして３０分間攪拌した。懸濁液を４℃
で３０分間８，０００×ｇで遠心分離し、ほとんど封入体（ＩＢ）からなるペレ
ットを２０容量（ｖ／ｗ）の６ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ
、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＤＴＴ中に懸濁し、そして室温で１時間攪拌し
た。３０分間８，０００×ｇでの遠心分離後、０．４５〜０．５０ｇの変性およ
び還元型ノギンを含む上清を１０容量の６Ｍ尿素−５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ
４．５−１ｍＭＥＤＴＡ−０．１ｍＭＤＴＴに対してＯｍｅｇａ１０，０
００ＭＷカットオフ膜を用いてダイアフィルトレートした。０．４〜０．４４ｇ
のノギンを含有するダイアフィルトレーション濾過物を、３０ｍｌ／分の流速で
、６Ｍ尿素−５０ｍＭ酢酸ナトリウム−１ｍＭＥＤＴＡ−０．１ｍＭＤＴＴ
ｐＨ４．５で平衡化したＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の２
．６×１０ｃｍカラム上にロードした。カラムをまず同じ緩衝液で、次いで１リ
ットル勾配（０〜１ＭＮａＣｌ）で、３０ｍｌ／分の流速で洗浄した。ノギン
を含有する画分をゲル電気泳動によって同定し、そしてプールした。収量は、０
．２〜０．２５ｇノギンであった。

【０１３９】再折り畳み変性および還元型ノギン溶液を、０．０５〜０．２ｍｇ／ｍｌタンパク質濃度
に調整し、そして４℃でゆっくりと攪拌しながら、１．５〜２．５Ｍグアニジン
ＨＣｌ−０．１ＭＴｒｉｓＨＣｐＨ８．０−０．１ｍＭＥＤＴＡ−０．２
〜２ｍＭ還元型グルタチオン−０．０２〜０．２ｍＭ酸化型グルタチオン（好ま
しくは、１０：１還元型グルタチオン対酸化型グルタチオンの比で）に供した。
２４〜７２時間後、２つの再折り畳みノギンイソ型が、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマト
グラフィーによって同定された（図８）。再折り畳みノギン溶液を、２０容量の
０．０５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．５に対してダイアフィルトレートし、５０ｍ
Ｍリン酸カリウムｐＨ７．２に供し、そして４℃で最少１時間、ゆっくりと攪拌
した。間違って折り畳みされたノギンは沈澱し、そしてこれを８，０００×ｇで
３０分間遠心分離することによって除去した。

【０１４０】逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー再折り畳みノギンは、溶媒Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）で平衡化された１２ｍｍ
Ｃ８、１×２５ｃｍＤｙｎａｍａｘ３００Ａカラム上でクロマトグラフィ
ーによって精製され得る。ローディング後、カラムを溶媒Ａで洗浄し、４ｍｌ／
分の流速で、以下のプロトコルに従って展開させた：（ａ）１０分間、７０％の
溶媒Ａ、３０％の溶媒Ｂ（アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）でイソクラティッ
クに；３０分間、６０％溶媒Ｂおよび４０％溶媒Ａへの線形勾配。正確に再折り
畳みされたノギンは、４４％〜４６％溶媒Ｂでより早く溶出する。収量は、０．
０７〜０．１ｇノギンであった。

【０１４１】バキュロウイルス細胞培養物におけるヒトノギンの産生ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＳＦ２１株を、慣用的に、ラ
クトアルブミン加水分解物およびｙｅａｓｔｏｌａｔｅを添加したグレース昆虫
細胞培地（Ｇｉｂｃｏ）で、細胞単層として維持した。１０％ｖ／ｖ熱失活ウシ
胎児血清（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補完したこの培地を、ＴＭ
ＮＦＨ−１０と同定する。細胞をまた、適応化後に無血清培地（ＳＦ−９００−
ＩＩ；Ｇｉｂｃｏ）において培養した。いずれの培地中の懸濁培養物も、８０ｒ
ｐｍの攪拌速度を使用して、マイクロキャリア培養フラスコ（Ｂｅｌｌｃｏ）中
で上昇させた。全ての培養物は、トリパンブルー排除により判断されるように、
＞９６％生存度で維持された。

【０１４２】組換えバキュロウイルスの構築ヒトノギンに相当する配列を、５’−ＢａｍＨ１−Ｐｓｔｌ−３’フラグメン
トとして、ヒトノギン遺伝子を含有する発現プラスミドから切り出した。このフ
ラグメントを、ＢａｍＨ１−Ｐｓｔ１消化ｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）に挿入した。得られたプラスミドｐＴＲ１００９は、Ａｕｔｒｏｇｒａｐｈ
ａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核多面体ウイルス（ＭｕｌｔｉｐｌｅＮｕｃｌ
ｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓ）（ＡｃＭＮＰＶ）のポリヘド
リン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーターのすぐ下流にヒトノギン配列を有し
、そしてこのプロモーター−異種遺伝子融合は、順に、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリ
ン領域に由来する組換え標的に隣接される。組換えプラスミドＤＮＡをアルカリ
溶解およびＣｓＣｌ遠心分離によって精製した。ＳＦ２１細胞を、プラスミドお
よびウイルスＤＮＡで、以下の方法によって同時トランスフェクトした：プラス
ミドＤＮＡ（３ｍｇ）を０．５ｍｇの線状化した欠失型ウイルスＤＮＡ（Ｂａｃ
ｕｌｏＧｏｌｄ^TM、Ｐｈａｒｍｉｎｉｇｅｎ）と混合し、そしてエタノールで
沈澱させた。乾燥させたＤＮＡを、次いで、水（５０ｍｌ）中に再懸濁し、１．
５ｍｌグレース培地と混合し、そして３０ｍｌＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ^TMカチオ
ン性リポソーム（ＢＲＬ）。ＤＮＡ−リポソーム混合物をボルテックスし、室温
で１５分間静置し、そしてＳＦ２１細胞の単層に滴下により添加した（２×１０ ⁶ 細胞／６０ｍｍプレート）。２７℃で４時間インキュベートした後、２ｍｌのＴＭＮＦＨ−１０を添加し、そして培養物を、５日間インキュベーションに戻し
た。組織培養培地を採取し、そしてプラーク単離のためのウイルスの供給源とし
て使用した。

【０１４３】組換えウイルスを、ＳＦ２１細胞上の多数回のプラーク精製によって単離した
。希釈ウイルス（０．５ｍｌ）を、２７℃で１時間の期間、細胞単層（２×ｌ０ ⁶ 細胞／６０ｍｍプレート）に吸着させ、吸引し、そしてウイルスプラークを、６日間の期間、ＴＭＮＦＨ−１０培地において０．５％アガロースの被覆を用い
て発生させた。ウイルスプラークを、顕微鏡観察後に釣り上げ、そして２ｍｌ
ＳＦ９００−ＩＩ培地に溶出させた。ウイルスストックを、低い感染多重度（０
．１ｐｆｕ／細胞）によって増幅した。ノギンを発現するウイルスクローンを、
感染培養物の３５Ｓ−メチオニンおよび３５Ｓ−システインで代謝標識し、総標
識タンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィー
によって分析することにより同定した。期待見かけ分子量２０，０００〜３０，
０００の標識タンパク質が、この方法によって、候補クローンにおいて検出され
たが、コントロール培養物においては検出されなかった。

【０１４４】バキュロウイルス誘導ノギンの発現および精製ＳＦ２１細胞を、ＳＦ９００−ＩＩ培地において約１．８×１０⁶／ｍｌの密度にまで、懸濁フラスコ中で培養した。培養物（５００ｍｌ）を、１０００×ｇ
で１０分間遠心分離し、そして２０ｍｌの増殖培地（５〜１０ｐｆｕ／細胞の組
換えウイルスを含有する）中に再懸濁した。ウイルスを、室温で１時間、穏やか
に混合させながら吸着させた。次いで、感染細胞を、新鮮な増殖培地でそれらの
もとの容量に希釈し、そして２７℃で３日間インキュベートした。続いて、細胞
および細片を、１０００×ｇで２０分間遠心分離することによって増殖培地から
清澄化した。

【０１４５】細胞上清をｐＨ８．０にし、０．４５ｍｍＭｉｌｌｉｐａｋ６０フィルタ
ーを通過させ、そして５ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８．０で平衡化しておいたＦａ
ｓｔＳカラムに付与した。カラムを同じ緩衝液で洗浄し、線形ＮａＣｌ勾配を
用いて展開し、他の培地成分を除去した。ノギンは、１ＭＮａＣＩで、このカ
ラムから溶出した。

【０１４６】結果Ｅ．ｃｏｌｉおよびバキュロウイルスにおけるヒトノギンの特徴づけ逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーは、再折り畳みされ、Ｅ．ｃｏｌｉから精製
された組換えノギンが、単一の鋭いピークで溶出することを示す。このことは、
１つの優勢なイソ型の存在を示す（図９）。１５％ポリアクリルアミド−ＳＤＳ
還元ゲルは、Ｅ．ｃｏｌｉまたは昆虫細胞のいずれかからのノギンが、９５％よ
り良好に純粋であり、２０〜３０ｋＤのタンパク質に相当する単一のバンドで移
動することを示す。昆虫細胞由来のノギンは、明らかには、単一のコンセンサス
部位におけるＮ結合型グリコシル化に由来するさらなる質量に起因して、わずか
によりゆっくりとした移動度を示す（図１０）。ＥｎｄｏＦでの処理は、昆虫
産生ノギンの移動度を、細菌産生タンパク質の移動度に変換する。

【０１４７】還元剤の不在下では、Ｅ．ｃｏｌｉまたはバキュロウイルスのいずれかで産生
されたノギンは、ジスルフィド結合型オリゴマータンパク質として挙動する（図
１０）。しかし、ゲル濾過分析および質量分析によって、ノギンは、主に、ダイ
マータンパク質である。

【０１４８】円二色性研究は、再折り畳みされ、Ｅ．ｃｏｌｉから精製された組換えノギン
および昆虫細胞から精製されたノギンは、非常に類似するコンフォメーションを
有することを示す（図１１）。この方法によって決定された二次構造は、ノギン
が４８％α−ヘリックス、０％β−構造、および５２％ランダムコイルからなる
ことを示す。

【０１４９】Ｅ．ｃｏｌｉおよびバキュロウイルスにおいて産生されたヒトノギンの生物学
的活性Ｅ．ｃｏｌｉまたはバキュロウイルスにおいて産生されたヒトノギンの生物学
的活性を、上述のような腹側辺縁層アッセイにおける筋肉アクチン発現のアッセ
イによって決定した。図１２に示される結果は、細菌産生ヒトノギンまたはバキ
ュロウイルス産生ヒトノギンに曝露されたＶＭＺにおける筋肉アクチンｍＲＮＡ
の誘導についてのポジティブな用量応答を示す。

【０１５０】（実施例８）ヒトノギンと反応性のラットモノクローナル抗体ＲＰ５７−１６
の産生および特徴づけ材料および方法抗体の産生組換えヒトおよびＸｅｎｏｐｕｓノギンと反応性のＲＰ５７−１６ラットモノ
クローナル抗体を、雌Ｌｅｗｉｓラットを２ヶ月にわたって精製組換えヒトノギ
ン（Ｅ．ｃｏｌｉで産生された）を４回３５μｇ注射することで免疫化すること
によって産生した。初回免疫のために、タンパク質を、フロイント完全アジュバ
ント中で、後蹠に注射した。引き続く注射を、同じ後蹠に、フロイント不完全ア
ジュバント中で与えた。ラットを４回目の注射の３日後に安楽死させた。

【０１５１】免疫化ラット由来のリンパ節細胞を、ＳＰ２／０−Ｅ．Ｏ．マウス骨髄腫細胞
と、２：１の比で混合した。遠心分離後、細胞混合物を、０．２５ｍｌの４２％
（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３３５０（Ｂａｋｅｒ）（１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホ
キシド（Ｓｉｇｍａ）を有するリン酸緩衝生理食塩水中）中に、３７℃水浴中で
全体で３分間再懸濁した。細胞を、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ３０７
２）において１ウェルあたり５×１０⁴リンパ球の密度で、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）（１０％ＦＢＳ（ストレプトマイシン、ペニ
シリン、ピルビン酸塩、およびグルタミンを添加した）およびＨＭＧＴ（１．６
×１０^-3Ｍチミジン、４．０×１０^-4メトトレキセート、１．３×１０^-3炭酸水
素ナトリウム、および１．０×１０^-2ヒポキサンチン）を含む）中にプレートし
た。培養１０日後、上清を採取し、間接的ＥＬＩＳＡによって組換えヒトノギン
に対する抗体活性についてアッセイした。ヒトノギン遺伝子を含有するプラスミ
ドでトランスフェクトされたＣＯＳ−Ｍ５細胞由来の上清を、Ｐｒｏｂｉｎｄ９
６ウェルアッセイプレート（Ｆａｌｃｏｎ３９１５）において一晩風乾した。
非特異的結合を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いて周囲温度で２時間
インキュベートすることによって除去した。プレートをＰＢＳ／０．０２％Ｔｗ
ｅｅｎ２０で２回洗浄した。次いで、培養上清を添加し、そして周囲温度で１時
間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗
浄した。ＰＢＳ／１％ＢＳＡに１：２０００希釈した二次抗体、ヤギ抗ラットＩ
ｇＧ（Ｈ＋Ｌ）アルカリホスファターゼ結合体（Ｃａｌｔａｇ）を各ウェルに添
加し、そしてプレートを周囲温度で１時間インキュベートした。再度、プレート
をＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。抗体結合を、ジエタノー
ルアミン緩衝液ｐＨ９．８中ｐＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート，Ｓｉ
ｇｍａ）１ｍｇ／ｍｌと共に、暗所で周囲温度で１時間インキュベートすること
によって、可視化した。反応を、等容量の１００ｍＭＥＤＴＡを添加すること
によって停止させた。吸光度を、ＴｈｅｒｍｏｍａｘＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ
Ｒｅａｄｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）において４０５ｎｍで読
み取った。反応を、その吸光度がネガティブコントロール（希釈物単独続いて二
次抗体および基質）の２倍であったとき、ポジティブであるとみなした。ポジテ
ィブクローンを拡大させ、そしてモノクローナル抗体を含有する培養上清を、特
異性分析のために採集した。

【０１５２】ＲＰ５７−１６を、軟寒天においてクローン化した。クローン化されたハイブ
リッド細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）（１０％
ＦＢＳ（ストレプトマイシン、ペニシリン、ピルビン酸塩、およびグルタミンを
添加した）を含む）において拡大した。抗体を含む上清をアリコートに分け、使
用するまで−７０℃で保存した。

【０１５３】特異性分析ＥＬＩＳＡ１００ｎｇの精製化組換えヒトノギン、Ｘｅｎｏｐｕｓノギン、ＢＤＮＦ、Ｎ
Ｔ−３、およびＮＴ４タンパク質を、個々に、ｐＨ９．６の５０ｍＭ重炭酸バッ
ファ中で４℃で一晩インキュベーションすることによってＰｒｏｂｉｎｄの９６
穴アッセイプレートに受動的に吸着させた。ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−
４を使用して、ラットのモノクローナル抗体ＲＰ５７−１６の非特異的結合を評
価した。ヒトノギン遺伝子を含むプラスミドまたはｆｌｇＣ末端タグ化Ｘｅｎｏ
ｐｕｓノギン遺伝子を含むプラスミドのいずれかでトランスフェクトされたＣＯ
Ｓ−Ｍ５細胞からの上清を、Ｐｒｏｂｉｎｄの９６穴プレートに風乾させた。非
特異的結合をＰＢＳ／１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いて周囲温度で２時間イ
ンキュベーションすることによって除去した。ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ
２０を用いてプレートを２度洗浄した。希釈していないＲＰ５７−１６を加え、
周囲温度で１時間インキュベーションした。ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２
０を用いてプレートを４度洗浄した。ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で１：２０００に
希釈した２次抗体、ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）アルカリホスファターゼ結合
体（Ｃａｌｔａｇ）を各穴に加え、そのプレートを周囲温度で１時間インキュベ
ーションした。再度、ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を用いてプレートを
４度洗浄した。抗体結合を、ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）中で１ｍ
ｇ／ｍｌのｐＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルリン酸）とともに暗所において周囲温
度で１時間インキュベーションすることによって、可視化した。反応を、等量の
１００ｍＭＥＤＴＡを加えることによって停止させた。Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ
ＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＲｅａｄｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）
上で、４０５ｎｍの吸光度を読み取った。この吸光度がネガティブコントロール
（希釈液のみに２次抗体および基質を加えたもの）の吸光度の２倍であった場合
に、反応を陽性と考えた。

【０１５４】電気泳動およびウエスタンブロッティングラットのモノクローナル抗体ＲＰ５７−１６をまた、ウエスタンブロッティン
グによって分析した。５０ｎｇの非還元型および還元型の組換えヒトノギンを１
２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、そしてニトロセ
ルロース膜上でエレクトロブロッティングした。膜をＰＢＳ／１％カゼイン／
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いてブロックし、そして次に希釈していないＲ
Ｐ５７−１６培養上清とともに２時間インキュベーションした。ＰＢＳ／０．０
２％Ｔｗｅｅｎ２０中で４回洗浄した後、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中の１：５０００希釈のヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）西洋わ
さびペルオキシダーゼ結合体（Ｐｅｌｆｒｅｅｚｅ）とともに膜をインキュベー
ションした。膜をＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて４回洗浄した。
タンパク質をＥＣＬウエスタンブロッティング試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用い
てその製造者の指示にしたがって可視化した。次に、膜をＸＡＲ５Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃＩｍａｇｉｎｇフィルム（Ｋｏｄａｋ）に５秒間さらした。

【０１５５】結果ラットのモノクローナル抗体ＲＰ５７−１６は、組換えヒトおよびＸｅｎｏｐ
ｕｓノギンの両方のノギン、ならびにＥ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞、およびＣＯＳ−
Ｍ５細胞において生成された組換えヒトノギンと反応する。この抗体は、ニュー
ロトロフィンであるＢＤＮＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４とは反応しない。ウエ
スタンブロッティングは、この抗体が還元されたタンパク質および還元されてい
ないタンパク質の両方を検出することを示した。

【０１５６】（実施例９）ノギン欠失ムテイン本発明はさらに、ネイティブヒトノギンが非常に望ましい特性を有する新規の
化合物を生成するように改変され得るという発見に関する。

【０１５７】Ｘｅｎｏｐｕｓノギンの塩基性領域は、この分子のアミノ酸１２３−１３５（
ＫＫＨＲＬＳＫＫＬＲＲＫＬ）に対応する。（配列については、Ｓｍｉｔｈ、Ｗ
．Ｃ．およびＨａｒｌａｎｄ、Ｒ．Ｍ．Ｃｅｌｌ７０：８２９−８４０（１
９９２）を参照のこと）。ＴＧＦ−βファミリーの分子について公知であること
に基づき、この塩基性領域は、プロセッシング部位であり得るように見える。こ
の塩基性領域の機能をよりよく理解するために、非常によく保存された塩基性領
域（Δ１２３−１３５）、または塩基性領域（Δ９１−１３５）を含むペプチド
のより大きな部分を欠失したＸｅｎｏｐｕｓノギンの構築物を作成した。これら
の欠失変異体の両方は、活性であり、ＲＮＡとして注入した場合に過剰に背方化
された胚を生じた。さらに、予備的な実験は、ノギンがヘパリンに対して親和性
を有する一方、塩基性領域を欠失する改変された形態がこの結合活性を有さない
ことを示した。

【０１５８】ネイティブヒトノギン（ｈＮＧ）は、おそらく細胞外マトリクスへそれが結合
するために、動物血清において低いバイオアベイラビリティを示す。Ｆｃタグ化
ヒトノギン（ｈＮＧ−Ｆｃ）は、非常に高親和性でＢＭＰ４に結合することが示
されてきた。（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ８６：５９９−６
０６（１９９６））。ｈＮＧを改変した結果、骨誘導因子（ＢＭＰ）に結合およ
び拮抗する能力を保持しつつ、改善されたバイオアベイラビリティを示す化合物
が同定されてきた。変化した生物学的特質を生じる特異的改変は、ヘパリン結合
活性をネイティブヒトノギン分子に与える原因として同定されるアミノ酸の欠失
を含む。その結果得られる改変されたノギンは、ヘパリン結合活性を欠くが、予
想外なことに、ＢＭＰ４に結合および拮抗する能力を保持する。

【０１５９】具体的には、出願人は、ｈＮＧΔ１３８−１４４ＦｃおよびｈＮＧΔ１３３−
１４４Ｆｃとして公知の２つの分子を作成した。これらの分子は、ヒトノギンの
、Ｆｃタグ化欠失ムテインであって、アミノ酸１３８〜１４４（ｈＮＧΔ１３８
−１４４Ｆｃについて）または１３３〜１４４（ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃに
ついて）のいずれかを欠き、そしてそのＣ末端にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを
タグ化されたムテインである。Ｆｃタグ化ノギンを構築するために、ＢｓｐＥＩ
−ＮｏｔＩヒトＩｇＧ１フラグメント（Ｄａｖｉｓ、Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６６：８１６−８１９（１９９４）；Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ、Ａ．Ｎ．ら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２７０：１３５１−１３５３（１９９５））が、Ｚｉｍｍｅｒｍ
ａｎ、Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ８６：５９９−６０６（１９９６）に記載される
ようなぺプチド架橋配列をコードするオリゴヌクレオチドを使用して、ヒトノギ
ンに融合され得る。以下に説明されるように、欠失ムテインであるｈＮＧΔ１３
８−１４４ＦｃおよびｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃは、ＢＭＰ４への結合につい
てｈＮＧ−Ｆｃと同一の活性を示し、さらにｈＮＧに比較して、ヘパリンに対す
る親和性が低減し、動物血清中の薬物動態がより優れることを示した。

【０１６０】ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの構築ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃは、アミノ酸１３３〜１４４（番号付けは、アミ
ノ酸番号１である開始メチオニンから始まる）の欠失を有するヒトノギン（ｈＮ
Ｇ）の配列からなり、そのヒトノギンは、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ「架橋」（遺伝子工学
により改変されたＢｓＰＥＩ制限酵素部位によってコードされる）を介してヒ
ト免疫グロブリンＧ１（Ｆｃ）の定常領域に融合されている（図１４）（配列番
号２３）。ｈＮＧΔ１３３−１４４ＦｃをＰＣＲによって構築し、そして標準の
遺伝子工学技術を使用して哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２１中にクローン化した
（ｐＭＴ２１．ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃ）。ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの
配列が正確であることを、配列決定によって確認した。その後、この欠失ムテイ
ンはまた、発現ベクターｐＳＲａに移入され、そしてＦｃタグ化および非タグ化
バージョンのこのｈＮＧムテインの両方を構築した（それぞれ、ｐＳＲａ．ｈＮ
ＧΔ１３３−１４４Ｆｃ、およびｐＳＲａ．ｈＮＧΔ１３３−１４４）。

【０１６１】ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの発現ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃは、まずトランスフェクションプロトコルに基づ
いてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を使用してＣＯＳ７細
胞中で発現させる。ｈＮＧと同様に分泌されるｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを、
ＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通過
させ、そして１００ｍＭの酢酸を用いて溶出し、その後トリスバッファを用いて
ｐＨ７に中和することによって馴化上清から精製した。この調製物の純度は、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後、蛍光色素のＳＹＰＲＯＯｒａｎｇｅ（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．）を用いて染色することによって調べた
。得られた調製物は、この判断基準によると９０％より大きい純度であり、主に
ジスルフィド架橋された二量体の形態であり、非タグ化ｈＮＧおよびｈＮＧ−Ｆ
ｃ（どちらもまたジスルフィド架橋された二量体を形成する）の両方でなされた
以前の観察と一致した。

【０１６２】ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの活性ＢＭＰ４への結合：このｈＮＧムテインが活性がどうかを決定するために、そのｈＢＭＰ４への結
合能力をｈＮＧ−Ｆｃの能力と比較した。ｈＮＧ−Ｆｃは、非タグ化ｈＮＧの親
和性と本質的に同じ親和性でヒト骨誘導因子４（ｈＢＭＰ４）に結合する。ｈＢ
ＭＰ４がＥＬＩＳＡプレートの表面上に捕捉されるＥＬＩＳＡ式アッセイを使用
して、上記２つのタンパク質を比較した。ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃムテイン
は、ｈＮＧ−Ｆｃと同じＢＭＰ４への結合性を示し（図１５）、この２つのタン
パク質が同じ生物学的活性を有することを示す。

【０１６３】ヘパリンへの結合発明者らは、ｈＮＧ−Ｆｃのヘパリン結合プロフィールを調べ、そしてｈＮＧ
Δ１３３−１４４Ｆｃ、および塩基性領域により短い欠失を有する別のｈＮＧ欠
失ムテイン、すなわちｈＮＧΔ１３８−１４４Ｆｃ（ｈＮＧΔＫＫＬＲＲＫ−Ｆ
ｃとも称される）のヘパリン結合プロフィールと比較した。図１６上に示される
ように、ｈＮＧ−Ｆｃは、約０．７５ＭＮａＣｌでヘパリンから溶出し始める
が、ｈＮＧΔ１３３−１４４ＦｃおよびｈＮＧΔ１３８−１４４Ｆｃは、０．２
５ＭＮａＣｌで溶出を開始する。０．５Ｍより大きいＮａＣｌでのヘパリンへ
の結合は、ヘパリンとの親和性相互作用と考えられるが、０．５Ｍより小さいＮ
ａＣｌでのヘパリンへの結合は、イオン性の相互作用によるものと考えられる（
ヘパリンは、負に荷電した硫酸基を含み、そしてｈＮＧは、正に荷電した領域を
有する）。したがって、２つのｈＮＧ欠失ムテインのｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆ
ｃおよびｈＮＧΔ１３８−１４４Ｆｃはイオン性の相互作用を介してヘパリンと
相互作用するが、ｈＮＧ−Ｆｃは、ヘパリンに対する親和性を示す。ＫＫＬＲＲ
Ｋ欠失（すなわち、ｈＮＧΔ１３８−１４４Ｆｃによって実施されるもの）は、
ヘパリンとの相互作用を、イオン性の効果について予想にされる相互作用にまで
低減するのに十分であるので、発明者らは、配列ＫＫＬＲＲＫ（すなわち、ｈＮ
Ｇにおけるアミノ酸１３８〜１４４）がｈＮＧのヘパリン結合領域であるか、ま
たはそれを含むと結論づける。Ｆｃドメインは、ヘパリンに結合しなかった。

【０１６４】発明者らはまた、上記方法によってｈＮＧおよびｈＮＧ−Ｆｃがヘパリンへの
同一の結合性を示すことを見い出してきたが、化学的に改変された形態のｈＮＧ
（シトラコニル−ｈＮＧ）は、ヘパリンに結合しない。発明者らはまた、上記塩
基性領域を超えるより長い欠失を有する別のｈＮＧ欠失ムテイン、すなわちｈＮ
ＧΔ１３３−１７９Ｆｃのヘパリン結合プロフィールを調べてきた。ｈＮＧΔ１
３３−１７９Ｆｃは、ｈＮＧΔ１３３−１４４ＦｃおよびｈＮＧΔ１３８−１４
４Ｆｃと同じヘパリン結合プロフィールを示し、上記塩基性領域の下流の配列を
さらに欠失してもヘパリンへのｈＮＧ結合のイオン成分をさらに低減することは
ないことを示す。このことから、発明者らは、ヘパリンへのｈＮＧ結合のイオン
成分は、ｈＮＧのクニッツ様ドメイン内に位置するに違いないと結論づける。さ
らに、化学的に改変されたシトラコニル−ｈＮＧならびに２つの欠失ムテインで
あるｈＮＧΔ１３８−１４４ＦｃおよびｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃはすべて、
生物学的に活性（すなわち、これらはｈＮＧ−Ｆｃと見かけ上は同じ親和性でＢ
ＭＰ４に結合する）が、欠失ムテインｈＮＧΔ１３３−１７９Ｆｃは、非活性で
ある。まとめると、これらの結果は、ｈＮＧのヘパリンへの結合は、ＢＭＰ４へ
の結合と区別され得ること、およびｈＮＧのヘパリン結合ドメインは、ｈＮＧの
ＢＭＰ４をブロックする活性には必要でないことを示す。

【０１６５】ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの薬物動態プロフィールｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの薬物動態的特性を、マウスおよびラットの両方
において試験した。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そして再び折り畳まれた非
改変ｈＮＧが、静脈投与後のラット血清において、見かけの半減期が６０分より
小さいという非常に低いバイオアベイラビリティしか示さないことが以前に決定
されてきた。ヘパリンに結合しないシトラコニル−ｈＮＧは、バイオアベイラビ
リティにおいて３０倍の改善を示すが、注射後約２時間で循環から消失もする。
発明者らは、ヘパリンに結合しない、そしてまたＦｃタグ化ｈＮＧΔ１３３−１
４４Ｆｃはインビボ中でより長い半減期を有し得ると考えた。この可能性を調べ
るために、発明者らは、マウスおよびラットにｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを注
射し、そして血清におけるバイオアベイラビリティを測定した。

【０１６６】ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃをマウスに腹腔内（ｉｐ）注射した場合、２４時
間という最も遅いサンプルされた時点においても、２μｇ／ｍｌのレベルを達成
し、ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃが検出可能であった（図１７Ａ）。ラットにお
ける静脈注射はまた、好ましい薬物動態を示したが、最も遅い血清サンプルは、
６時間で採取した。この実験において、約１８μｇ／ｍｌのｈＮＧΔ１３３−１
４４Ｆｃを検出した（図１７Ｂ）。同様の結果が、ｈＮＧΔ１３８−１４４Ｆｃ
を用いて得られ、ｈＮＧのヘパリン結合ドメインの欠失が、これらの分子の、ｈ
ＮＧより改善された薬物動態プロフィールの原因であることを示した。腹腔内ま
たは静脈内注射後に動物血清においてｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを検出するた
めに使用したアッセイは、ｈＮＧΔ１３３−１４４ＦｃのＢＭＰ４に結合する能
力に依存するので、発明者らはまた、検出されるｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃが
機能的であり、そしてＢＭＰ４と相互作用し得ることが分かった。さらに、ｈＮ
ＧはＢＭＰ４に対して非常に高い親和性を示すので、発明者らは、これらの実験
において達成されたｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃのレベルが、動物モデルおよび
臨床状況においてＢＭＰ４活性をブロックし得ると予想する。

【０１６７】（実施例１０）ｈＮＧΔＢ２哺乳動物発現プラスミドであるｐＳＲα．ｈＮＧ
ΔＢ２の構築ヒトノギンムテインであるｈＮＧΔ１３３−１４４（Ｆｃタグなし）に対する
ｃＤＮＡを含む哺乳動物発現ベクターを以下のように構築した。以下、ｈＮＧΔ
１３３−１４４はまた、ｈＮＧΔＢ２と称されることがある。同様に、ｈＮＧΔ
１３８−１４４は、ｈＮＧΔＢ１と称されることがある。

【０１６８】哺乳動物発現ベクターｐＳＲα中にサブクローン化された野生型ヒトノギンの
ｃＤＮＡ（ｈＮＧ）を含む、ｐＣＡＥ２９４と名付けられたプラスミドを、制限
酵素であるＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌ
ａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて消化した。こ
の制限消化によって、全ｐＳＲαベクター配列および野生型ヒトノギン（ｈＮＧ
）のＣ末端側の３分の１（２２３ヌクレオチド）を含む４ｋｂのＤＮＡフラグメ
ントが放出された。このフラグメントを、標準的な分子生物技術によってゲル精
製した（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、
ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、ＧｒｅｅｎｅＰｕ
ｂｌ．Ａｓｓｏｃ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照の
こと）。

【０１６９】発現ベクターｐＭＴ２１（ＧｅｎｅｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．
）中にサブクローン化されたｈＮＧΔ１３３−１４４−ＦＣ（実施例９を参照の
こと）のｃＤＮＡを含む、ｐＣＡＥ３０２と名付けられたプラスミドを、制限酵
素であるＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩを用いて消化した。この制限消化によって、
アミノ酸１３３〜１４４をコードする配列の欠失を有するヒトノギンムテインの
Ｎ末端側の３分の２（４３９ヌクレオチド）をコードする５００ｂｐのＤＮＡフ
ラグメントが放出された。このＤＮＡフラグメントをまたゲル精製した。上記５
００ｂｐのＤＮＡフラグメントおよび上記４ｋｂのＤＮＡフラグメントを標準的
な技術に従って連結し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉ
ｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ
Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを
参照のこと）、新しい哺乳動物発現ベクターｐＳＲα．ｈＮＧΔＢ２を作成した
。

【０１７０】（実施例１１）ｈＮＧΔＢ２原核生物発現プラスミドｐＲＧ６２５の構築ヒトノギンムテインｈＮＧΔ１３３−１４４（ｈＮＧΔＢ２）に対するｃＤＮ
Ａを含む原核生物発現ベクターを以下のように構築した。

【０１７１】ヒトノギン（ｈＮＧ）に対するｃＤＮＡをコードするＤＮＡフラグメントを、
ベクターｐＵＣにサブクローン化されたヒトノギンに対するｃＤＮＡを含む、ｐ
ＵＣ−ｈＮｏｇ＃７と名付けられたプラスミドからＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ
反応は、標準的な技術を使用し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏ
ｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒ
ｅｅｎｅＰｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ
、ＮＹを参照のこと）、以下の増幅プライマー：ＥＶＤ−８４（５’−ＴＧＴＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡ
ＣＡＴＣＣＧＴＣＣＧＧＣＡ−３’）（配列番号２４）ＥＤＶ８５（５’−ＣＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＧＡＡＣＡ
ＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＣＧＧＧＴＡＣＴＧＧ−３’）（配列番
号２５）を使用して行われた。

【０１７２】得られたＰＣＲ増幅化１００５ｂｐＤＮＡフラグメントを、制限酵素Ｓｐｈ１
（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓａｃｈ
ｕｓｅｔｔｓ）を用いて消化し、そしてｐＲＧ０９に連結した。ｐＲＧ０９は、
βラクタマーゼ遺伝子およびｌａｃＵＶ５プロモーターを含む低コピー数プラス
ミドであり、そして制限酵素ＳｐｈＩおよびＮｒｕＩを用いた消化による連
結のために調製しておいた。連結および細菌形質転換につづいて、ｌａｃＵＶ５
プロモーターの転写制御下にヒトノギン遺伝子を含むクローンを同定し、そして
ｐＲＧ２９２と名付けた。ｐＲＧ２９２プラスミドを制限酵素ＳｗａＩおよび
ＢｓｍＩを用いて消化し、１０５４ｂｐのＤＮＡフラグメントを放出させた。
このＤＮＡフラグメントを標準的な技術によってゲル精製し、そしてｐＣＰ１４
６中に連結した。ｐＣＰ１４６は、ｋａｎ１遺伝子をコードする高コピー数プラ
スミドであり、制限酵素であるＳｗａ１およびＢｓｍ１を用いた消化による
連結のために調製しておいた。得られたプラスミドをｐＲＧ３０１と名付けた。
ΔＢ２欠失（アミノ酸１３３−１４４をコードする配列の欠失）を構築するため
に、ｐＲＧ３０１を制限酵素ＭｌｕＩおよびＭｓｃＩを用いて消化し、ヒト
ノギン遺伝子内部の２３８ｂｐフラグメント（配列番号１のＮＴ３７８−６１５
）を放出させた。次に、このフラグメントをｐＣＡＥ３０２（実施例９−ｐＭＴ
２１．ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを参照のこと）中で、ｈＮＧΔＢ２内部の２
０２ｂｐフラグメント（ＭｌｕＩおよびＭｓｃＩを用いた消化によって放出させ
た）と置き換えた。得られた原核生物発現プラスミドをｐＲＧ６２５と名付けた
。

【０１７３】（実施例１２）Ｅ．ｃｏｌｉ中のｈＮＧΔＢ２の発現ｈＮＧΔＢ２発現プラスミドｐＲＧ６２５を含むＥ．ｃｏｌｉ宿主株ＲＦＪ１
４１を、６０Ｌのバイオリアクター（ＡＢＥＣ、Ｉｎｃ．、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ
、ＰＡ）中の４０Ｌの培地中で増殖させた。最小グルコース培地は、二塩基リン
酸カリウム（５ｇ／Ｌ）、一塩基リン酸カリウム（１ｇ／Ｌ）、硫酸アンモニウ
ム（０．３５ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム（１ｇ／Ｌ）、硫酸ナトリウム（１
．３ｇ／Ｌ）、ＤｏｗＰ２０００消泡剤（１ｍＬ／Ｌ）、塩化カルシウム（０
．０７５ｇ／Ｌ）、３０ｇ／Ｌのグルコース、および適切な痕跡レベルの硫酸鉄
、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸マンガン、塩化コバルト、およびモリブデン酸ナトリ
ウムを含む３ｍＬ／Ｌの微量元素溶液（３ｍＬ／Ｌ）を含んだ。

【０１７４】３７℃の温度で発酵を行った。この発酵のｐＨは、アンモニアガス、および２
０％の溶解した酸素を使用して、設定点を維持するための漸増する圧力、撹拌、
酸素フローにより７．０に制御した。光学密度が５０に達したとき、タンパク質
合成の誘導が、化学的誘導物質イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）を加えることによって開始された。十分な量のｈＮＧΔＢ２タンパ
ク質が細胞内に蓄積するように、発酵をさらに３時間つづけた。この細胞をＫｏ
ｃｈ５００ＮＭＷＣＯ中空ファイバーフィルタを使用する接線フローろ過に
よって収穫し、そして２０ｍＭトリス、２０ｍＭＥＤＴＡ、および１２０ｍＭ
ＮａＣｌを含む溶解バッファ中へダイアフィルトレーションし、そして−２０
℃に冷凍された。

【０１７５】（実施例１３）ｈＮＧΔＢ２の再折り畳みおよび精製上記発酵からの細胞を解凍し、２０ｍＭトリス、２０ｍＭＥＤＴＡ、１％Ｔ
ｗｅｅｎ８０バッファ中に再懸濁し、そしてＭａｎｔｏｎＧａｕｌｉｎホモジ
ナイザーを用いて８０００ｐｓｉｇで破壊した。０．２ミクロンの公称孔サイズ
を有するＭｉｃｒｏｇｏｎ中空ファイバー膜（Ｍｉｃｒｏｇｏｎ、ＣＡ）を用い
る接線フローろ過システムを使用して、封入体を洗浄し、混入するＥ．ｃｏｌｉ
タンパク質を除去した。この封入体を洗浄するために使用されたバッファは、２
０ｍＭトリス、２０ｍＭＥＤＴＡ、および１％Ｔｗｅｅｎ８０を含んだ。洗浄
された封入体を６Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭＤＴＴ中に可溶化した。そのタ
ンパク質を１００Ｋ限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ）に通過させること
によって部分的に精製し、高分子量混入物および脂質を除去した。このタンパク
質を１０Ｋフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ）を用いて濃縮し、次に再折り
畳みのために、１．５Ｍ塩酸グアニジン、２０％グリセロール、２０ｍＭトリス
、２ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭ酸化グルタチオン、５ｍＭ還元化グルタチオン
を含むバッファ中で最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した。このタンパク質を、
８日間４℃で再折り畳みさせた。再び折り畳まれたタンパク質を、４Ｍ尿素、２
０ｍＭ酢酸ナトリウムを含み、ｐＨ４．０のバッファ中に濃縮およびダイアフィ
ルトレーションし、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０％グリセロール、４Ｍ尿素、
０．０２％ＣＨＡＰＳを用いて平衡化した２．８ＬＳＰセファロースＦＦ樹
脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む直径１０ｃｍのカラムにロードした。このカラ
ムを、３カラム体積の３５０ｍＭＮａＣｌを含む同じバッファを用いて洗浄し
た。このタンパク質を漸増する塩勾配（４００−７５０ｍＭＮａＣｌ）を用い
て１０カラム体積にわたり同じバッファを使用して溶出した。さらなる量のタン
パク質を、２０ｍＭビシン、２０ｍＭアセテート、２０％グリセロール、４Ｍ尿
素、５００ｍＭＮａＣｌを使用して、ｐＨ８．５で溶出した。溶出したタンパ
ク質を、可溶性を維持するために４倍に希釈した。このタンパク質を、４Ｍ尿素
、２０ｍＭビシンを含むｐＨ８．５のバッファ中に濃縮およびダイアフィルトレ
ーションし、そしてバッファＡ（４Ｍ尿素、２０％グリセロール、５０ｍＭビシ
ン、０．０２％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ８．５）を用いて平衡化した２．８ＬＱセ
ファロースＦＦ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む直径１０ｃｍのカラムにロー
ドした。このカラムをバッファＡを用いて洗浄し、そして１００ｍＭから３００
ｍＭＮａＣｌの直線塩勾配を用いて７カラム体積にわたり１００ｍＬ／分で溶
出した。その画分をＳＤＳＰＡＧＥによって分析し、そしてプールされ、１．
８グラムの精製ｈＮＧΔＢ２タンパク質を提供した。

【０１７６】（実施例１４）ｈＮＧΔＢ２のＰＥＧ化上記欠失変異体ｈＮＧΔＢ２を、以下の手順を使用してポリエチレングリコー
ルの共有結合によって改変した。ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ（Ｃ
ａｔ．Ｎｏ．Ｍ−ＡＬＤ−２００００）からのメトキシ−ＰＥＧ−プロピオンア
ルデヒド（ＭＷ＝２０，０００）を、ＰＥＧ試薬対タンパク質が２０：１の化学
量論的比で３００ｍｇのｈＮＧΔＢ２（ＭＷ＝２１，４９５）と反応させた。こ
の反応混合物を、フィルタ滅菌し、そしてその反応を、１００ｍＭビシン、５ｍ
Ｍシアノホウ化水素ナトリウム、２０％グリセロール、４Ｍ精製尿素を含むｐＨ
８．１のバッファ中でアルゴン雰囲気下に１２日間室温で進行させた。この反応
混合物中のｈＮＧΔＢ２の濃度は、０．７５ｍｇ／ｍＬであった。尿素を使用の
前に、陽イオン交換カラムに通して混入アミンを除去することによって予め精製
した。シアノホウ化水素の使用は、シッフ塩基中間体をメトキシキャップ化ＰＥ
Ｇと上記タンパク質の反応したアミノ基との間の２次アミン架橋に還元するため
に必要である。反応生成物は、ＰＥＧ化されていない形態、モノＰＥＧ化された
形態、およびポリＰＥＧ化された形態の混合物を含む。

【０１７７】（実施例１５）ＰＥＧ−ｈＮＧΔＢ２の精製）モノＰＥＧ化ｈＮＧΔＢ２の精製を、陽イオン交換とそれにつづくサイズ排除
を含む２工程クロマトグラフィー手順を使用して行った。第１工程において、反
応混合物を、４Ｍ尿素、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、２０％グリセロール、ｐ
Ｈ５．５を含むバッファＡを用いて５倍に希釈し、そしてＳＰセファロースＨＰ
陽イオン交換樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を詰め込んだ直径５ｃｍ長さ１３ｃｍ
のクロマトグラフィーカラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＸＫ５０）上に４５ｃｍ／
時の直線速度でロードした。ロード後に、このカラムをバッファＡを用いて洗浄
し、そしてＰＥＧ化ｈＮＧΔＢ２を、バッファＡ中の０から５００ｍＭＮａＣ
ｌの直線勾配を使用して、６カラム体積にわたって４５ｃｍ／時の直線速度で溶
出した。ＳＤＳＰＡＧＥゲル分析を、カラム画分について行い、モノＰＥＧ化
されたｈＮＧΔＢ２を含む画分をプールした。このモノＰＥＧ化タンパク質（Ｐ
ＥＧ−ｈＮＧΔＢ２）を、直径７ｃｍのＡｍｉｃｏｎ撹拌セル濃縮器を使用して
０．７６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。このタンパク質を、２Ｍ尿素、１５０ｍＭＮ
ａＣｌ、２０％グリセロール、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５を用
いて平衡化した９５ｃｍのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除樹脂（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）を含む１００ｃｍＸＫ２６カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にロード
した。このタンパク質を３ｍＬ／分のフロー速度で溶出した。その画分をＳＤＳ
ＰＡＧＥによって分析し、そして適切な画分をプールした。プールされたモノ
ＰＥＧ化ｈＮＧΔＢ２を、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０％ｖ／
ｖグリセロール、ｐＨ７．５中に透析した。このタンパク質をアリコートし、そ
して−４０℃で凍結保存した。

【０１７８】（実施例１６）ｈＮＧ、ＰＥＧ−ｈＮＧ、シトラコニル−ｈＮＧ、ｈＮＧΔＢ
１、ｈＮＧΔＢ２、ＰＥＧ−ｈＮＧΔＢ２、およびｈＮＧΔＢ２−Ｆｃのヘパリ
ン結合プロフィールの比較ヘパリンへの低い親和性を示すタンパク質は、ヘパリンへの高い親和性を示す
タンパク質よりも、早くに−すなわち、より低いＮａＣｌ濃度で、親和性カラム
から溶出され得る（Ｌｏｂｂ，ＲＲら、ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ４月１５
４：１−１４（１９９６））。０．１および０．５ＭＮａＣｌの間の塩濃度で
ヘパリンに結合するのは、ヘパリン上に存在する硫酸基とのイオン性の相互作用
によるものであるが、０．５ＭＮａＣｌより高くでの結合は、本物のヘパリン
結合部位によるものである。発明者らは、ヘパリンへの低い結合性は、全身的な
送達用のタンパク質ベースの薬物にとって望ましい性質であるという考えのもと
に、ｈＮＧおよびｈＮＧムテイン、ならびにタグ化されたかまたは化学的に改変
されたｈＮＧおよびｈＮＧムテインの、ヘパリンに結合する能力を、高解像度ヘ
パリン親和性カラムを使用して比較した。高解像度親和性クロマトグラフィーが
選択の方法であった。なぜなら、それが正確かつ非常に再現性のある結果を提供
し、ヘパリン結合性における小さな差違さえも明らかにし得るからである。

【０１７９】ｈＮＧ、ＰＥＧ−ｈＮＧ、シトラコニル−ｈＮＧ、ｈＮＧΔＢ１、ｈＮＧΔＢ
２、ＰＥＧ−ｈＮＧΔＢ２、およびｈＮＧΔＢ２−Ｆｃのヘパリン結合プロフィ
ールを、以下のようにＴＳＫ−５Ｗヘパリンカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ、Ｍｏ
ｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡ）上に順次注入することによって比較した：
それぞれ４０μｇのｈＮＧ、ＰＥＧ−ｈＮＧ、ｈＮＧΔＢ２−Ｆｃ、およびｈＮＧΔＢ２；９μｇのシトラコニル−ｈＮＧ；および１５μｇのＰＥＧ−ｈＮＧ
ΔＢ２、それぞれの体積は５０μｌ。各サンプルを注入した後に、そのサンプル
を、１００ｍＭトリスｐＨ７．６中で１５０ｍＭから２ＭＮａＣｌの塩勾配に
かけ、そして上記タンパク質の溶出プロフィールをＡ₂₈₀によってモニターした。

【０１８０】ｈＮＧは、１．２ＭＮａＣｌで溶出することが分かったが（図１８Ａ〜１８
Ｃ）、これはバッチ溶出方法を使用した以前の実験と一致する。２０，０００Ｍ
Ｗのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてＰＥＧ−ｈＮＧを形成するよう
にｈＮＧを化学的に改変することは、ヘパリンに対するほんのわずかにより低い
親和性を示す分子（約１ＭＮａＣｌ（図１８Ａ）で溶出する）を生じた。対照
的に、接近可能なリジン（ＬＹＳ）の位置でシトラコニル基で化学的に改変し、
これらの（生理学的条件で）正に荷電した残基を負に荷電した残基に効果的に変
化させたｈＮＧであるシトラコニル−ｈＮＧは、ヘパリンに対して極度に低い親
和性を示した（０．１５ＭＮａＣｌで溶出する（図１８Ａ））。このことは、
５つのＬＹＳを含むｈＮＧの塩基性領域（アミノ酸１３３〜１４４；番号１とし
ての開始メチオニンからの番号付け）がヘパリンに対するｈＮＧのヘパリン結合
部位である。

【０１８１】欠失ムテインｈＮＧΔＢ１（上記ｈＮＧΔＫＫＬＲＲＫまたはｈＮＧΔ１３９
−１４４として公知）は、約０．７５ＭＮａＣｌで溶出し（図１８Ｂ）、ヘパ
リンに対する低減された結合性を示す。さらに２つのＬＹＳ残基を欠く欠失ムテ
インｈＮＧΔＢ２は、上記勾配においてさらに早くに、約０．６ＭＮａＣｌ（
図１８Ｂ）で溶出する。さらに、このムテインをｈＮＧΔＢ２二量体あたりＰＥ
Ｇ１分子の化学量論比で１分子のＰＥＧ２０，０００によって化学的に改変する
こと（ＰＥＧ−ｈＮＧΔＢ２）は、ヘパリンへの結合性のさらなる低減を生じる
（０．４５ＭＮａＣｌでの溶出（図１８Ｂ））。このことは、ＰＥＧが、ＰＥ
Ｇが共有結合するタンパク質に増加した可溶性を与えるという考えと合致し、そ
してまたｈＮＧΔＢ２とヘパリンとの間に存在するイオン性相互作用のいくらか
をマスクすることによるとされ得る。興味深いことに、結合における同じタイプ
の低減が、ｈＮＧΔＢ２にヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）をタグ化してキメラ
タンパク質ｈＮＧΔＢ２−Ｆｃを作成することによって達成される（図１８Ｃ）
。

【０１８２】微生物の寄託以下を、ブダペスト条約の条項の下に、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌ
ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ
、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２に寄託した。

【０１８３】

【表３】

【０１８４】本発明は、好ましい特定の実施態様とともに上記されたが、記載および実施例
は、本発明の範囲を例示することを意図されるものであって、それを限定するも
のではない。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】ヒトノギン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）、および推定アミノ酸配
列（配列番号２）。ヘパリンとの相互作用を、イオン効果について予測される相
互作用まで減少させるに適切なように、実施例９に記載されるＫＫＬＲＲＫ欠失
体（ｈＮＧΔ１３８−１４４）は、ヌクレオチド４１５からコードされる（ＡＡ
Ｇ．．．）。

【図１Ｂ】ヒトノギン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）、および
推定アミノ酸配列（配列番号２）。ヘパリンとの相互作用を、イオン効果につい
て予測される相互作用まで減少させるに適切なように、実施例９に記載されるＫ
ＫＬＲＲＫ欠失体（ｈＮＧΔ１３８−１４４）は、ヌクレオチド４１５からコー
ドされる（ＡＡＧ．．．）。

【図２Ａ】実験計画デザイン：コンピテントな動物極キャップ（ＡＣ）外胚葉を、示され
るようにステージ付けられた胚（ｓｔａｇｅｄｅｍｂｒｙｏ）から摘出した。
Ｓｔ１０.５背側および腹側ＡＣならびに腹側辺縁層（ＶＭＺ）もまた示されるように摘出した。外植片を、低Ｃａ/Ｍｇリンゲル（ＬＣＭＲ）溶液中で１回洗浄し、次いでＬＣＭＲ＋０.５％ＢＳＡ中に希釈した因子を含む処理培地中に置いた。後期（Ｓｔ２０＋）まで培養した外植片を、処理開始６〜１６時間後に処
理培地から取り出し、ＬＣＭＲ中に置いた。外植片が所望のステージに到達した
時点で、それらを、ＲＮＡのために回収するか、またはホールマウントインサイ
チュハイブリダイゼーションもしくは抗体染色のために固定した。

【図２Ｂ】筋肉の非存在下でのノギンによる神経誘導。レーン１〜３はそれぞれ、全Ｓｔ
２４胚ＲＮＡにおいて、Ｎ−ＣＡＭ、β−チューブリン、およびＸＩＦ−３プロ
ーブにより保護された特定のフラグメントを示す。レーン４〜８は、これら３つ
のプローブの混合物による保護を示す。他方、レーン９〜１３は、５０ｐＭアク
チビン（Ａ）、２５％の２０倍濃縮コントロールＣＨＯ細胞培地（Ｃ）もしくは
２５％の２０倍濃縮ノギン馴化ＣＨＯ細胞培地（Ｎ）で処置したＳｔ９ＡＣか
ら回収したｔＲＮＡ（ｔ）、Ｓｔ２４胚ＲＮＡ（Ｅ）、およびＲＮＡに対するア
クチンプローブによる保護を示す。ローディングコントロールとして使用した、
偏在して発現した細胞骨格アクチンは、ＲＮＡレベルが、すべての処置において
匹敵していることを示す（レーン１１〜１３）。

【図３】還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）ラン。銀染色によりタンパク質を
可視化した。レーン１は分子サイズ標準を示す。レーン２〜７は、０.０、０.１
、０.２、０.５、１.０、および２.０μｇの精製ヒトノギンを示す。

【図４Ａ】精製ノギンで処理した動物極キャップ対アクチビンで処理した動物極キャップ
の時間経過；直接神経誘導対間接神経誘導。動物極キャップを、図２Ａに示され
るように摘出し、そしてＬＣＭＲ＋０.５％ＢＳＡ（Ｕ）、アクチビン馴化ＣＯＳ細胞培地の２０％希釈物（Ａ）、または１μｇ/ｍｌ精製ヒトノギン（Ｎ）で処理した。処理した動物極キャップから単離したＲＮＡ（レーン２〜１３）なら
びにＳｔ２２全胚ＲＮＡ（レーン１）およびｔＲＮＡ（レーン１４）を、Ｎ−Ｃ
ＡＭ、β−チューブリン、筋肉および細胞骨格アクチン、II型コラーゲン、およ
びＥＦ−１ａについてプローブした。

【図４Ｂ】ノギン誘導性ではなくアクチビン誘導性の動物極キャップにおける初期中胚葉
マーカーの発現。動物極キャップをＳｔ８胚から摘出し、図４Ａに記載のように
処理し、そしてＳｔ１１で採集した。レーン１および２はそれぞれ、Ｓｔ１０. ５全胚ＲＮＡによるｇｏｏｓｅｃｏｉｄおよびＸｂｒａプローブ保護を示す。レ
ーン３〜６は、これら２つのプローブの混合物による保護を示す。相対的ＲＮＡ
レベルを、別個のＥＦ−１αプローブ保護により示す。

【図４Ｃ】プラスミド特異的原腸胚期ノギン発現は、神経組織を直接誘導する。１細胞ス
テージの胚に、２０ｐｇのｐＣＳＫＡｌａｃＺまたはｐＣＳＫＡｎｏｇｇｉｎを
動物極に注入した。注入した胚からの動物極キャップを、Ｓｔ８〜９に摘出し、
Ｓｔ２０まで培養した。これらを、Ｓｔ２０で、ＲＮアーゼ保護により、分析の
ために採集した。

【図５】ノギンによる神経誘に対する導背側および腹側の動物極キャップの反応性。Ｓ
ｔ１０.５腹側および背側の動物極キャップを、図２Ａ〜２Ｂに示されるように摘出した。背側および腹側の動物極キャップを、アクチビン培地（ＤＡ、ＶＡ）
または１μｇ/ｍｌヒトノギン（ＤＮ、ＶＮ）で処理し、そしてＳｔ２６に、プローブとしてＮ−ＣＡＭ、β−チューブリン、およびアクチンを使用するＲＮア
ーゼ保護分析のために採集した。

【図６】ヒトノギンタンパク質に対する腹側辺縁層および動物極キャップの用量応答。
Ｓｔ１０.５ＶＭＺおよびＳｔ９動物極キャップを、図２Ａに示されるように摘出し、０、１、１０、５０、２００、および１０００μｇ/ｍｌのヒトノギンで処理した（それぞれ、レーン３〜８および１０〜１５）。次いで、処理した外植
片およびＳｔ２６期のコントロール全胚からのＲＮＡを、プローブとしてＮ−Ｃ
ＡＭ、β−チューブリン、アクチン、およびII型コラーゲンを使用するＲＮアー
ゼ保護により分析した。この実験において、１ｎｇ/ｍｌの用量での筋肉誘導は、１０ｎｇ/ｍｌより強く、そして非誘導ＶＭＺでは筋肉アクチン発現は低レベルである。これは実験的変動に起因し得る。なぜなら、反復実験において、本発
明者らは、５０ｎｇ/ｍｌ以上の用量でのみ筋肉誘導を観察したからである。

【図７Ａ】インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を
示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭＲＮＡは、神
経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンにつ
いて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１
抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるよう
に、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノ
ギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因
する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７
Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ
〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。

【図７Ｂ】インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を
示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭＲＮＡは、神
経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンにつ
いて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１
抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるよう
に、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノ
ギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因
する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７
Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ
〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。

【図７Ｃ】インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を
示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭＲＮＡは、神
経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンにつ
いて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１
抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるよう
に、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノ
ギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因
する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７
Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ
〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。

【図７Ｄ】インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を
示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭＲＮＡは、神
経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンにつ
いて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１
抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるよう
に、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノ
ギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因
する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７
Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ
〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。

【図７Ｅ】インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を
示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭＲＮＡは、神
経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンにつ
いて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１
抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるよう
に、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノ
ギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因
する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７
Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ
〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。

【図７Ｆ】インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を
示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭＲＮＡは、神
経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンにつ
いて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１
抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるよう
に、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノ
ギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因
する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７
Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ
〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。

【図７Ｇ】インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を
示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭＲＮＡは、神
経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンにつ
いて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１
抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるよう
に、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノ
ギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因
する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７
Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ
〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。

【図７Ｈ】インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を
示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭＲＮＡは、神
経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンにつ
いて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１
抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるよう
に、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノ
ギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因
する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７
Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ
〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。

【図７Ｉ】インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を
示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭＲＮＡは、神
経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンにつ
いて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１
抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるよう
に、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノ
ギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因
する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７
Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ
〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。

【図７Ｊ】インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を
示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭＲＮＡは、神
経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンにつ
いて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１
抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるよう
に、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノ
ギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因
する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７
Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ
〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。

【図７Ｋ】インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を
示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭＲＮＡは、神
経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンにつ
いて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１
抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるよう
に、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノ
ギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因
する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７
Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ
〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。

【図７Ｌ】インサイチュハイブリダイゼーションおよび抗体染色。側面図および背側図を
示すＮＣＡＭについて染色した尾芽胚（７Ａ、７Ｂ）。ＮＣＡＭＲＮＡは、神
経管でのみ検出され、体節では検出されない。比較のための、筋肉アクチンにつ
いて染色した尾芽胚の体節（背側図、７Ｃ）。Ｓｔ３０での神経特異的６Ｆ１１
抗体染色（７Ｄ〜７Ｆ）。いくつかのセメント腺色素が、７Ｄに観察されるよう
に、脱色後のこれらの胚中に維持されるが、この色素は抗体染色とは異なる。ノ
ギン処理した動物極キャップにおける染色の内部塊は、６Ｆ１１抗体検出に起因
する。全胚（７Ｄ、７Ｇ、７Ｊ）、ヒトノギン処理（１μｇ/ｍｌ）した動物極キャップ（７Ｅ、７Ｈ、７Ｋ）、および非処理動物極キャップ（７Ｆ、７Ｉ、７
Ｌ）において、セメント腺特異的ＸＡＧ−１転写物はＳｔ２３で検出され（７Ｇ
〜７Ｉ）、そして前方脳ｏｔｘＡ転写物Ｓｔ３５で検出された（７Ｊ〜７Ｌ）。

【図８】ノギンの２つの再折り畳みイソフォームの逆相ＨＰＬＣプロフィール。再折り
畳みノギン溶液を、ＢｒｏｗｎｌｅｅＡｑｕａｐｏｒｅＡＸ−３０００. ４６×２２ｃｍＨＰＬＣカラムに、１ｍｌ/分の流速で適用した。カラムを、水中０.１％のＴＦＡを含む溶媒Ａで平衡化した。溶媒Ｂは、アセトニトリル中０.１％のＴＲＡであった。カラムを以下のプロトコルに従って展開した：ａ）９５％の溶媒Ａ−５％の溶媒Ｂに平等に２分；６５％の溶媒Ｂおよび３５％の溶
媒Ａまでの線形グラジエント６０分。正確に再折り畳みされたノギンは、４４％
〜４６％の溶媒Ｂに早期に溶出する。

【図９】Ｅ．ｃｏｌｉから再折り畳みされ、そして精製された組換えノギンの逆相ＨＰ
ＬＣクロマトグラフィー特徴付け。図８の説明文と同様な条件。

【図１０】１２.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された、Ｅ．ｃｏｌｉおよび昆虫細胞において産生された組換えノギン。レーンＨ、Ｌ：それぞれ示されたサイズの高
分子量および低分子量マーカー。レーン１、２：電気泳動の前に２−メルカプト
エタノールで処理された、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉおよび昆虫細胞において産生
された組換えノギン。昆虫細胞由来のノギンのより遅い移動度は、単一コンセン
サス部位でのＮ結合グリコシル化に起因して生じるサイズ増加に対応する。レー
ン３、４：電気泳動の前に２−メルカプトエタノールで処理されなかった、それ
ぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉおよび昆虫細胞において産生された組換えノギン。

【図１１】Ｅ．ｃｏｌｉ（−−）および昆虫細胞（−）において産生された組換えノギン
の円偏光二色性スペクトル。

【図１２】バキュロウイルスにおいて産生されたヒトノギン（０.０１、０.０５、０.２ μｇ/ｍｌ）、バキュロウイルスの偽トランスフェクトした培養物（０.０２、１
μｇ/ｍｌ）、またはＥ．ｃｏｌｉにおいて産生されたヒトノギン（０.１、０. ５、２、もしくは１０μｇ/ｍｌ）への暴露後の筋肉アクチンｍＲＮＡの誘導を示す、腹側辺縁層アッセイ。

【図１３Ａ】マウスノギン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０）および推定アミノ酸
配列（配列番号１１）。

【図１３Ｂ】マウスノギン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１０）および推定アミノ酸
配列（配列番号１１）。

【図１４】ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃのアミノ酸配列。ヒトノギン（ｈＮＧ）の推定シ
グナルペプチド配列をイタリック体で示す。（†）は下記を除いてシステインの位置を示す。（￥）はＮ結合グリコシル化部位の位置を示す。（Δ）はΔ１３３−１４４欠失が作成された位置を示す。野生型ｈＮＧにおける
アミノ酸１３３〜１４４の配列は、ＫＫＱＲＬＳＫＫＬＲＲＫであり、ｈＮＧの
「塩基領域」と呼ばれ得る。ｈＮＧにおいて鎖間ジスルフィド架橋に関与するＣＹＣは、太字で示される（．
．．ＳＥＫＣＳＣ．．．）。ｈＮＧΔ１３３−１４４配列をヒトＩｇＧ１（Ｆｃ）の定常領域と接続するＳｅ
ｒ−Ｇｌｙ架橋の位置を、太字で示す（ＳＧ）。Ｆｃドメインの配列を下線を付
して示す。（◇）は、ヒトＩｇＧ１の２つのＦｃドメインを連結する鎖間ジスルフィド架橋
を形成する、Ｆｃに先行するＩｇＧヒンジの２つのシステイン（アミノ酸番号３
７１および３７４）を示す。（●）は停止コドンの位置を示す。

【図１５】ｈＮＧΔ１３３−１４４ＦｃはヒトＢＭＰ４に結合する。ｈＮＧまたはｈＮＧ
Δ１３３−１４４Ｆｃのいずれかの活性を、ヒト骨誘導因子４（ｈＢＭＰ４）へ
結合する能力を比較することによって試験した。ｈＢＭＰ４（２μｇ/ｍｌ）を、受動結合によりＥＬＩＳＡプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）上にコートした。ＰＢ
Ｓで４回洗浄することによって、非結合ｈＢＭＰ４を取り除き、そしてプレート
を、ＰＢＳ中１％のＢＳＡでブロックした。ｈＢＭＰ４へのｈＮＧ−Ｆｃの用量依存的結合を示すために、ｈＮＧ−Ｆｃの標準曲線を行い、そして同量のｈＮ
ＧΔ１３３−１４４Ｆｃと比較した。１時間のインキュベーション後、ＰＢＳで
４回洗浄することによって、非結合ｈＮＧ−ＦｃまたはｈＮＧΔ１３３−１４４
Ｆｃを取り出し、そして０.５μｇ/ｍｌ抗ヒトＩｇＧ・アルカリホスファターゼ
結合体（抗Ｆｃ・ＡＰ）を各ウェルに加えた。１時間のインキュベーション後、
ＴＢＳ＋０.１％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄することによって、非結合抗Ｆｃ・ＡＰを取り除き、、次いでアルカリホスファターゼ基質（パラニトロフェニルホスフ
ァターゼ；Ｓｉｇｍａ）を加えた。アルカリホスファターゼは、この基質を、そ
の産生が４０５ｎｍの吸光度を測定することによりモニターされ得る産物に変換
する。ｈＮＧまたはｈＮＧΔ１３３−１４４ＦｃがＢＭＰ４に結合する能力を、
Ａ４０５単位を比較することによって視覚化した。注記：ｈＢＭＰ４を省略した場合、プレートへのｈＮＧ−ＦｃもしくはｈＮＧΔ
１３３−１４４Ｆｃの結合は存在しない。

【図１６】ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃは、ヘパリンに、減少した親和性で結合する。それぞれ約１μｇのｈＮＧ−Ｆｃ、ｈＮＧΔ１３８−１４４Ｆｃ、またはｈＮＧ
Δ１３３−１４４Ｆｃを、１ｍｌのＰＢＳ中１％ＢＳＡにおいて、５０μｌヘパ
リン・アガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）とともにインキュベートした。室温での１時
間のインキュベーション後、ヘパリン・アガロースビーズを、遠心分離により沈
澱させ、ＰＢＳ中に懸濁し、そして新しいチューブに移した。その後、各ペレッ
トを、１００μｌの０.１、０.２５、０.５、０.７５、および１.０ＭＮａＣｌで続けて洗浄し、そしてこれらの工程のそれぞれからの上清を、還元条件下で
の４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ/ＭＥＳゲル（Ｎｏｖｅｘ）にロードするために維持した。各上清の１/５および再懸濁したヘパリン・アガロースペレットを、ゲルにロードした。Ｆｃタグ化ｈＮＧを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒト
ＩｇＧｇ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｉｎｃ．）を用いるウェスタンブロッティン
グ、続いて化学発光検出（Ｐｉｅｒｃｅ）により視覚化した。

【図１７Ａ】マウスにおけるｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの薬物動態。０.１ｍｇのｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを、６週齢のＢａｌｂ/ｃ雄性マウス（
２匹のマウス、０.１ｍｇ/マウス）に、腹腔内（ｉｐ）注射した。注射の前に、
各マウスから血液サンプルを採取した（「ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ」）。その後、注
射後１、３、６、および２４時間で、マウスから血液を取り出した。標準的な血
清学的手順に従うことにより、これらのサンプルから血清を調製し、そしてｉｐ
注射後のＢａｌｂ/ｃマウスの血清において利用可能な、生物学的に活性なｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃのレベルを、機能的ＥＬＩＳＡを使用することによって
決定した。ｈＢＭＰ４（２μｇ/ｍｌ）を、ＥＬＩＳＡプレート（ＤｙｎａｔｅｃｈのＩｍｍｕｌｏｎ４）に受動結合によりコートした。ＰＢＳでの４回の洗浄により非結
合ｈＢＭＰ４を取り除き、そしてプレートをＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロックした
。ｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの標準曲線を行った。１時間のインキュベーショ
ン後、ＰＢＳでの４回の洗浄により、非結合ｈＮＧ−ＦｃまたはｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを取り除き、そして０.５μｇ/ｍｌの抗ヒトＩｇＧ・アルカリホ
スファターゼ結合体（抗Ｆｃ・ＡＰ）をプレートに加え、上記（図１６）のよう
にプロセスした。各時点で採取した血清中のｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃのレベ
ルを、ｈＢＭＰ４コードＥＬＩＳＡプレート上で各血清サンプルの系列希釈を実
行し、そして上記のアッセイを使用してＦｃ免疫反応性を検出することによって
決定した。次いで、Ａ４０５単位をｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの濃度に変換し
、そして時間の関数としてプロットした。注記：これらのアッセイ中に存在する血清タンパク質の量は、ｈＮＧΔ１３３−
１４４Ｆｃの結合および検出を妨げなかった。

【図１７Ｂ】ラットにおけるｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃの薬物動態。１.０ｍｇのｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃを、２５０グラムの生体雄性ラットに、静脈内（ｉｖ）注射した。注射の前に血液サンプルを採取した（「ｐｒｅ−ｂ
ｌｅｅｄ」）。その後、注射後１０、３０、６０、１２０、および２４０分で、
ラットから血液を取り出した。標準的な血清学的手順に従うことにより、これら
のサンプルから血清を調製し、そして血清サンプルにおいて利用可能な、生物学
的に活性なｈＮＧΔ１３３−１４４Ｆｃのレベルを、図１７Ａに記載の機能的Ｅ
ＬＩＳＡを使用することによって決定した。

【図１８】ヒトノギン（ｈＮＧ）および改変されたヒトノギン分子の薬物動態プロフィール
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人ザリージェントオブザユニバーシティオブカリフォルニアアメリカ合衆国カリフォルニア 94612 −3350，オークランド，レイクサイドドライブ 300， 22エヌディーフロアー (72)発明者スタール，ネイルアメリカ合衆国ニューヨーク 10512, カーメル，ケントショアドライブ，アールディーナンバー10 (72)発明者ハーランド，リチャードエム. アメリカ合衆国カリフォルニア 94556, モラガ，バーチウッドドライブ 402 (72)発明者エコノマイデス，アリスエヌ. アメリカ合衆国ニューヨーク 10027, ニューヨーク，マウントモリスパークウエスト 12 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA21 CA04 DA02 DA05 DA11 EA04 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA01 AA02 AA06 AA07 CA53 DC50 ZA962 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 DA01 EA20 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトノギンポリペプチド（配列番号２）または実質的に同様
なノギンポリペプチドであって、少なくともアミノ酸配列ＫＫＬＲＲＫの欠失に
よって改変されており、かつ背方発生を誘導しそして脊椎動物において骨誘導因
子（ＢＭＰ）活性をブロックする、ポリペプチド。
【請求項２】アミノ酸残基１３８〜１４４の欠失により改変された、ヒト
ノギン（配列番号２）。
【請求項３】アミノ酸残基１３３〜１４４の欠失により改変された、ヒト
ノギン（配列番号２）。
【請求項４】請求項１、２、または３に記載の改変されたポリペプチドを
コードする、単離された核酸分子。
【請求項５】発現制御配列に作動可能に連結された組換えＤＮＡ分子であ
る、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】請求項５に記載の組換えＤＮＡで形質転換された宿主細胞。
【請求項７】改変されたノギンポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）請求項６に記載のＤＮＡ分子を含む組換え宿主細胞を増殖させ、その結果
、該宿主細胞に該ＤＮＡ分子を発現させて、該改変されたノギンポリペプチドを
産生する工程；および（ｂ）発現した、改変されたノギンポリペプチドを単離する工程を包含する、方法。
【請求項８】前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項７に記載の方法
。
【請求項９】前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項７に記載の方法
。
【請求項１０】請求項１、２、または３に記載の改変されたノギンポリペ
プチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１１】ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合した、請求項１
、２、または３に記載の改変されたノギン。
【請求項１２】請求項１１に記載の改変されたノギン、および薬学的に受
容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１３】ヒト身体を処置する方法または診断方法における使用のた
めの、請求項１、２、３、または１１に記載の改変されたノギン、請求項４に記
載の核酸分子、あるいは請求項１０または１２に記載の組成物。
【請求項１４】骨に影響する疾患もしくは障害を処置するための医薬の製
造における、請求項１、２、３、または１１に記載の改変されたノギンの使用。
【請求項１５】有効量の、請求項１０または１２に記載の組成物を、患者
に投与する工程を包含する、処置方法。
【請求項１６】進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）を処置するための
、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】異常な骨成長を含む疾患もしくは障害を処置するための、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】前記異常な骨成長が、股置換手術、外傷、火傷、または脊
髄損傷後の、骨の病的成長である、請求項１７に記載の方法。