JP2001508297A

JP2001508297A - ヒトエンドスルフィン遺伝子

Info

Publication number: JP2001508297A
Application number: JP53102598A
Authority: JP
Inventors: ロホ，ジヤン−マルク; スコツト，ビクトリア・イー・エス; アンダーソン，クリステイ・エル; サリバン，ジエイムズ・ピー
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1997-01-07
Filing date: 1998-01-07
Publication date: 2001-06-26
Also published as: WO1998030692A2; US7015015B2; CA2276533A1; WO1998030692A3; EP0970205A2; US20020142432A1

Abstract

(57)【要約】本発明は単離されたもしくは精製された、ヒトエンドスルフィンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ヒトエンドスルフィンのイソフォームも開示される。本発明はまた、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドで形質転換したホスト細胞を用いる組み換えヒトエンドスルフィンの製造方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトエンドスルフィン遺伝子技術分野本発明は全般的にポリヌクレオチド配列とその中にコードされたポリペプチド配列に関すると共に、これらの配列をヒト組織中のエンドスルフィンを検出するために利用する方法に関する。発明の背景細胞内ＡＴＰで阻害される一群のカリウムチャネルを代表するＡＴＰ感受性カリウムチャネル（Ｋ⁺チャネル）が、心臓、膵臓ベーター細胞、骨格筋、平滑筋および中枢神経系を含む様々な組織で発見されている（Ｇ．ＥｄｗａｒｄおよびＡ．Ｈ．Ｗｅｓｔｏｎ著、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．第３３巻、５９７−６３７頁（１９９３年））。これらのＡＴＰ感受性Ｋ⁺ チャネルは、運動能力持続期間の短縮および心臓の代謝阻害中に生じる細胞のカリウムイオン喪失、平滑筋弛緩、骨格筋興奮性の制御、および神経伝達物質の放出等の多様な細胞機能に関連している（Ａ．Ｔｅｒｚｉｃら著、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第２６９巻、Ｃ５２５−Ｃ５４５頁（１９９５年））。例えば、膵臓ベーター細胞（β−細胞）では、ＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャネルは細胞の代謝状況と細胞の興奮性とをつなぐ上で重要な役割を果たしている。インシュリン分泌のための一次生理刺激は、血中グルコース濃度の上昇である。グルコースはβ−細胞に入り、そこで代謝されて細胞内ＡＴＰの上昇とそれに伴う細胞内ＡＤＰの低下をもたらす。ＡＤＰがチャネルの活性を高めるのに対しＡＴＰはそれを阻害するので、これらのヌクレオチドレベルの変化は相乗的に作用し、原形質膜中のＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャネルを閉じる。ＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャネルの閉鎖は、電圧依存性カルシウムチャネルを開き電気的活性を誘発する膜の脱分極を生じさせる。カルシウムの流入は細胞内カルシウムを上昇させ、インシュリン分泌を刺激する（Ｆ．Ｍ．Ａｓｈｃｒｏｆｔ著、Ｎａｔｕｒｅｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２巻、１３０１−１３０２頁（１９９６年））。最近、膵臓のＡＴＰ感受性Ｋ⁺ チャネルは少なくとも２つのサブユニット、カリウムを選択的に通過させるチャネル形成サブユニット（Ｋｉｒ６．２）とスルフォニル尿素レセプターと呼ばれる制御タンパク質（ＳＵＲＩ）、から構成されている複合体であることが示された（Ｎ．Ｉｎａｇａｋｉら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７０巻、１１６６−１１７０頁）。これらの２つのサブユニットが同時に発現すると、予期される薬学的および生物物理学的性質を有する、内向きに整流するＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャネルを構成する。現在ではＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャネルにはさらに多様性があることが知られている。２個のチャネル形成サブユニット（Ｋｉｒ６．１およびＫｉｒ６．２）および３個の制御サブユニット（ＳＵＲ１、ＳＵＲ２ＡおよびＳＵＲ２Ｂ）が最近哺乳動物組織からクローン化されている（Ｓ．Ｉｓｏｍｏｔｏら著、Ｎｅｕｒｏｎ、第１６巻、１０１１−１０１７頁（１９６６年））。この分子が多様であることが分ってきたことは、異なった組織中のＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャネルはアクチベーターおよび阻害剤に対する反応において著しく異なっているという、初期の薬学的研究（Ｇ．Ｅｄｗａｒｄｓ、同上）を支持するものである。ＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャネルは、２つの重要なクラスの薬剤、スルフォニル尿素およびＫ⁺チャネルオープナーの分子標的である。スルフォニル尿素は、インスリン濃度の減少とグルコースに対する損なわれた反応が特徴である非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療に広く使用されている（Ｈ．Ｅ．Ｌｅｂｏｖｉｚ著、「真性糖尿病：理論と実際」、Ｈ．ＲｉｆｋｉｎおよびＤ．Ｐｏｒｔｅ、Ｊｒ．編、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ）、５５４−５７４頁、１９９０年）。膵臓中でスルフォニル尿素剤は、グルコースに対する感受性を部分的に失ったランゲルハンス島においてインスリン分泌を刺激する（Ｅ．Ｃｅｒａｓｉら著、Ｄｉａｂｅｔｅｓ第２１巻、２２４−２３４頁（１９７２年））。このクラスの薬剤は、膵臓β−細胞ＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャネルの制御サブユニット（ＳＵＲＩ）との相互作用によりＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャネルの開口を阻害し、その結果インスリン放出を刺激する（Ｅ．Ｃｅｒａｓｉら著、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、第２１巻、２２４−２３４頁(１９７２年)）。スルフォニル尿素剤の生物学的効果は、Ｖｉｒｓｏｌｖｙ−Ｖｅｒｇｉｎｅらにスルフォニル尿素レセプターに対する内因性リガンドの存在を推測させた（Ａ．Ｖｉｒｓｏｌｖｙ−Ｖｅｒｇｉｎｅら著、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．第２２巻、６５−６９頁（１９８８年））。その後、彼らはヒツジの脳からペプチドを同定し、このペプチドは中枢神経（ＣＮＳ）および膵臓β−細胞双方由来のレセプターに結合し、げっ歯類ベーター細胞腫瘍株（βＴＣ細胞）からの生体外インスリン分泌を誘発することが示された。彼らは、このペプチドがスルフォニル尿素受容体に対する天然リガンドであり、ＣＮＳおよび膵臓の正常な生理において役割をはたしているであろうと結論した。彼らはこのペプチドを「エンドスルフィン」と名付けた（Ａ．Ｖｉｒｓｏｌｖｙ− Ｖｅｒｇｉｎｅら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９巻、６６２９−６６３３頁（１９９２年））。エンドスルフィンの完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列は、どの動物種でも決定されていないが、最近、ウシの組織機からｃＤＮＡ部分配列が得られた（Ｋ．Ｐｅｙｒｏｌｌｅｒら著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．第２２３巻、５８３−５８６頁（１９９６年））。ヒトエンドスルフィンのヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関する情報は報告されていない。ＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャネルが多様性であることがわかってきたことは、組織特異に発現し、ＳＵＲイソフォームとの相互作用が異なる一群のエンドスルフィンが存在する可能性をしている。ウシおよびヒツジエンドスルフィンがスルフォニル尿素受容体と相互作用し、インスリン放出を調節するという報告は、一群のヒトエンドスルフィンを単離し性格付けすることにより、病態の治療のための新しい治療および診断薬を開発できる可能性を与えることを示唆している。このような治療薬には組み換えエンドスルフィン、アンチセンスデオキシリボヌクレオチド、転写レギュレーターおよびエンドスルフィン活性アクチベーターまたは阻害剤が含まれよう。例えば、ヒツジエンドスルフィンで報告されている様に（Ａ．Ｖｉｒｓｏｌｖｙ−Ｖｅｒｇｉｎｅら著、（１９９２年）、同上）ヒトエンドスルフィンがインスリンレベルを調節することが発見された場合、ヒトエンドスルフィンまたはエンドスルフィン活性調節剤は糖尿病治療の別のアプローチとなり得る。さらに、ＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャネルが神経興奮性を調節しているＣＮＳにおいて、エンドスルフィンの調節剤は、癲癇、痛み、鬱病および虚血等の異常な神経興奮を含む疾病の治療の標的となろう。ＳＵＲ２Ａが選択的に発現しＡＴＰ感受性Ｋ⁺ チャネルが活動電位持続に関与している心臓では、エンドスルフィンレベルおよび／または活性の調節は心臓虚血治療へのアプローチとなり得る。骨格筋で発現したＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャネルは、エネルギー状態の変化に応じて細胞の電気活動を変化させ、このＫ⁺チャネルオープナーとの複合体を調節することは、先天性筋緊張症を含む数多くの病態で、また低カリウム性麻痺の患者にとって有益であることが示されている（Ａ．Ｃ．Ｗａｒｅｈａｍ著、「カリウムチャネル調節剤：薬学的、分子的および臨床的特徴」、Ａ．Ｈ．ＷｅｓｔｏｎおよびＴ．Ｃ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ編、１１０−１４３頁（１９９２年））。しかしながらこの場合、この化合物の副作用がその広範囲の使用を阻んでいる。骨格筋で選択的に発現するエンドスルフィンは、骨格筋興奮性を正常化する別のアプローチを提供し、従って多数の骨格筋病に応用し得る。従って、その使用の研究を治療薬の開発に向けさせる、ヒトエンドスルフィンの全長をコードするＤＮＡ配列を単離することは有用である。ＳＵＲ１およびＫｉｒ６．２の突然変異は、幼児の持続性インスリン過剰低血糖症（ＰＨＨＩ）とつながっており（Ｐ．Ｍ．Ｔｈｏｍａｓら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６８巻、４２６−４２９頁（１９９５年）およびＰ．Ｔｈｏｍａｓら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．第５巻、１８０９−１８１２頁(１９９６年)）、最近の報告ではＳＵＲ１の突然変異も非インスリン依存性糖尿病とつながっているかもしれないことが示唆されている（Ｈ．Ｉｎｏｕｅら著、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、第４５巻、８２５−８３１頁（１９９６年））。ヒトエンドスルフィンの単離と性格付けは、エンドスルフィン遺伝子に突然変異が存在するか、突然変異がタンパク質の発現および／または活性を変化させる結果になるか、およびこれらの突然変異が糖尿病、癲癇、鬱病および虚血等の疾病とつながっているかどうかを決定する研究を促進しよう。ヒト細胞における正常および突然変異型を同定することができれば、このような病態に対する診断試験を発達させる機会を提供すると思われる。従って、ヒトエンドスルフィンの異常制御または発現と関連する疾病または状態の診断、段階付け、予知、モニタリングまたは治療の特別の方法と薬剤を提供し、これらの状態に対する可能性ある素質を示すことは有益である。発明の要旨本発明はヒトエンドスルフィンをコードするヌクレオチドおよびその断片または相補体を包含する、単離された、もしくは精製したポリヌクレオチドを提供する。ヌクレオチド配列が配列番号：１および配列番号：２、またはその断片を包含することが好ましい。ヌクレオチド配列がヌクレオチド位置約１０７〜４６０の配列番号：１、またはヌクレオチド位置約１０７〜４７２の配列番号：２であることがより好ましい。本発明はさらに、配列番号：３または配列番号：４を有するヒトエンドスルフィンをコードするヌクレオチド配列を包含するポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、ポリヌクレオチドを組み換え技術で製造することができる。組み換え分子はヒトエンドスルフィンをコードするヌクレオチド配列を包含し、発現ベクター中に含まれている。発現ベクターは真核細胞ベクターまたは原核細胞ベクターいずれであっても良い。好ましい発現ベクターはｐＰｒｏＥｘ１およびｐｃＤＮＡ３．１である。ヒトエンドスルフィンをコードする核酸配列は約１０７〜４６０のヌクレオチド位置の核酸配列配列番号：１または約１０７〜４７２のヌクレオチド位置の核酸配列配列番号：２であることがより好ましい。本発明はさらに上記ベクターで形質転換されたホスト細胞を提供する。ホスト細胞は真核細胞もしくは原核細胞である。本発明はまた、ヒトエンドスルフィンポリペプチドまたはその断片を提供する。好ましい実施形態では、ポリペプチドはアミノ酸配列配列番号：３または配列番号：４を有する。ポリペプチドは組み換え技術で生産され、精製した形で提供される。別の態様では、本発明はヒトエンドスルフィンをコードするヌクレオチド配列を包含する発現ベクターで形質転換されたホスト細胞を培養する、少なくとも１個のヒトエンドスルフィンエピトープを含むポリペプチドの製造方法を提供する。その発現ベクターは配列配列番号：１または配列番号：２を有するヌクレオチド配列、およびその断片および相補体を包含することが好ましい。上記ヌクレオチド配列が約１０７〜４６０のヌクレオチド位置の配列番号：１または約１０７〜４７２のヌクレオチド位置の配列番号：２を有することがより好ましい。上記ヌクレオチド配列が配列配列番号：３または配列番号：４を有するヒトエンドスルフィンをコードすることがさらに好ましい。別の態様では本発明は、（ａ）エンドスルフィンレセプターポリペプチドを発現するホスト細胞を提供すること、（ｂ）試験化合物を細胞と混合すること、および（ｃ）（ｉ）レセプターを発現する細胞に対する試験化合物の効果、または（ｉｉ）試験化合物の細胞またはレセプターへの結合、のいずれかを測定すること、を含むエンドスルフィンレセプター活性の調節方法を提供する。本方法のホスト細胞は原核細胞もしくは真核細胞である。本方法ではステップ（ｃ）（ｉｉ）の測定は信号発生化合物が発生する信号を測定するか、放射線標識イオン、蛍光プローブまたは電流により発生する信号を測定して行われることが好ましい。また別の態様では、本発明は（ａ）エンドスルフィンまたはその断片を発現する細胞を提供すること、（ｂ）試験化合物を細胞と混ぜ合せること、および（ｃ）細胞毒性を示す細胞または細胞機能をモニターすることを含む細胞保護化合物の同定法を提供する。本方法のホスト細胞は原核細胞または真核細胞のいずれかである。好ましくは、本方法は、ポリヌクレオチドの転写を指示する制御配列に機能的に連結されていてそれによりポリヌクレオチドがホスト細胞で発現される、約１０７〜４７２のヌクレオチド位置の配列番号：２のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含する発現ベクターを有する細胞を提供することを含む。より好ましくは、制御配列の一つが誘導可能なプロモーターである。本発明の細胞は、より好ましくは、細胞に対する細胞毒効果を最小にし、または遮断する物質の存在下に維持される。さらに別の態様では、本発明は、薬学的に許容し得る賦形剤中のエンドスルフィンの遺伝子発現を制御する化合物の有効な量を患者に投与することを含む、エンドスルフィン調節に伴う状態を有する患者の治療法を提供する。さらに別の態様では、本発明はアミノ酸配列配列番号：４またはその断片を有するヒトエンドスルフィンに特異的に結合する、モノクローナル抗体を提供する。図面の簡単な説明図１はエンドスルフィンＡおよびエンドスルフィンＢ遺伝子に関するクローン３８４３８７および７００４１５についてのＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇ（ＥＳＴ）の位置を示すダイアグラムである。図２はエンドスルフィンＡ（上の線、配列番号：１）およびエンドスルフィンＢ（下の線、配列番号：２）のｃＤＮＡ配列間の整列（ＧＡＰプログラム、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰａｃｋａｇｅ、バージョン８、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を示す。２つの配列間の縦軸は、これらの位置における同一ヌクレオチドを示す。メチオニン開始コドンおよび停止コドン（上の鎖のＴＡＡおよび下の鎖のＴＧＡ）は太字で示され、下線が引かれている。図３はＭ_γ＝１９，０００のウシｃＡＭＰ制御燐タンパク質（ｂｏｖ．ＡＲＰＰ１９、配列番号：１１）、ウシエンドスルフィン（ｂｏｖ．ｅｎｄｏｓ．、配列番号：１２）、ブタエンドスルフィン（ｐｉｇｅｎｄｏｓ．、配列番号・１３）、ヒトエンドスルフィンＡ（ｈｕｍ．ＥｎｄｏｓＢ、配列番号：３）およびヒトエンドスルフィンＢ（ｈｕｍ．ｅｎｄｏｓＡ、配列番号：４）のアミノ酸配列間の比較最適一致解析を示す。ブタエンドスルフィン配列は、ウシＡＲＰＰ− １９のアミノ酸配列と上記Ａ．Ｖｉｒｓｏｌｖｙ−Ｖｅｒｇｉｎｅら（１９６６年）から得られた４個の部分配列を並べ、ギャップを文字"ｘ"で埋めて作成された（ｘは未知のアミノ酸を現す）。ドットは最良の並びを作成するために配列内に置かれるスペースを現す。図４は生体外転写／翻訳システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）におけるクローン７００４１５（レーンＡ）およびクローン３８４３８７（レーンＢ）から生成した、［³⁵Ｓ］標識エンドスルフィンのオートラジオグラムを示す。オートラジオグラフィーに先立ち、タンパク質を１０％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。分子量はレーンＢの側に示される。図５は、エンドスルフィンＡおよびエンドスルフィンＢ特異的ＰＣＲ産生物を生成するために用いられた、テンプレート（エンドスルフィンＡおよびエンドスルフィンＢｃＤＮＡ）に関する、１個の前方プライマー（配列番号：５）および２個の逆ブライマー（配列番号：６および配列番号：７）の位置を示すダイアグラムである。前方プライマーはエンドスルフィンＡおよびエンドスルフィンＢ遺伝子の同じヌクレオチド配列と相補的である（すなわち、これらの遺伝子のコード領域中の配列と相補的である）。逆行プライマーはエンドスルフィンＡおよびエンドスルフィンＢの３'−非翻訳領域中の異なる配列と相補的である。図６はＴＡＥバッファー中１．２％アガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色したＰＣＲ産生物のコンピュータ作成像を示す。左側の写真は、エンドスルフィンＡ（レーンＡおよびＢ）およびエンドスルフィンＢ（レーンＣおよびＤ）のｃＤＮＡを有するプラスミドを、プライマー対配列番号：５／配列番号：６（レーンＡおよびＣ）および配列番号：５／配列番号：７（レーンＢおよびＤ）を用いるＰＣＲ実験におけるテンプレートとして使用した場合に得られたＰＣＲ産生物を示す。分子量標準はレーンＥに示す。右側の写真は、脳（レーン１および６）、小脳（レーン２および７）、胎児脳（レーン３および８）、膵臓（レーン４および９）、および黒質（レーン５および１０）から調製されたヒトポリＡ⁺ＲＮＡから作成されたｃＤＮＡをテンプレートとして用いて、プライマー対配列番号：５／配列番号：６（レーン１−５）および配列番号：５／配列番号：７（レーン６−１０）により得られたＰＣＲ産生物を示す。図７はヒト心臓（レーン１）、脳（レーン２）、胎盤（レーン３）、肺（レーン４）、肝臓（レーン５）、骨格筋（レーン６）、腎臓（レーン７）、膵臓（レーン８）、脾臓（レーン９）、胸腺（レーン１０）、前立腺（レーン１１）、睾丸（レーン１２）、卵巣（レーン１３）、小腸（レーン１４）、結腸（レーン１５）および白血球（レーン１６）から単離され、エンドスルフィンＡおよびＢの５'−非翻訳領域（５'−ＵＴＲ）の１９０ｂｐＤＮＡ断片（すなわち核酸位置１〜１９０由来の配列番号：１または配列番号：２）でプローブされたポリＡ⁺ＲＮＡのノーザーンブロットのコンピューター作成像を示す。分子量マーカーは各写真の側に示される。図８は１３．５％ＳＤＳＰＡＧＥ上で分離され、Ｃｏｕｍａｓｓｉｅブルーで染色した、バクテリア溶菌物（左側の写真）、精製ｈｉｓタグエンドスルフィンＢ（中央の写真）および精製ｈｉｓタグエンドスルフィンＡおよびＢ（右側の写真）由来のタンパク質のコンピューター作成像を示す。左側の写真は、ヒトエンドスルフィンＢｃＲＮＡを包含するｐＰｒｏＥｘ１発現ベクターで形質転換され、Ｌｕｒｉａブロス＋アンピシリンで増殖させ、細胞の生育中にＩＰＴＧで誘導されたもしくは誘導されない、ＤＨ５∝細胞から調製されたバクテリア溶菌物のタンパク質を示す。ｈｉｓタグヒトエンドスルフィンＢを現す黒いバンドが、１８．８ｋＤＡ分子量マーカーのすぐ上に見える。右側の写真は精製されたｈｉｓタグエンドスルフィンＡおよびＢを示す。Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによる全バクテリア溶菌物からの融合タンパク質の精製は、中央の写真のゲル上に示される。全溶菌物をＮｉ −ＮＴＡカラムにかけ、５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液で洗浄し、０．２Ｍイミダゾールを含む緩衝液で溶出した。レーンＡ：全バクテリア溶菌物からのタンパク質、レーンＢ：５０ｍＭイミダゾール洗浄緩衝液からのタンパク質、レーン１−４：０．２Ｍイミダゾール緩衝液で溶出したフラクションからのタンパク質。分子量マーカーは各写真の側に示される。図９（Ａ）はベクター形質移入およびエンドスルフィンＢ形質移入細胞における［³Ｈ］グリブリド結合のＢ_max値のグラフを示す。実施例１８記載の通り、細胞ホモジェネートを放射性リガンドの濃度を変えて（０．０１〜１．４ｎＭ）インキュベートして結合させた。記号"^*"は未形質移入細胞と有意に異なる値を示す。図９（Ｂ）はベクター形質移入およびエンドスルフィン−Ｂ形質移入細胞ホモジェネートにおける［³Ｈ］グリブリド結合のＳｃａｔｃｈａｒｄプロットを現す。図１０（Ａ）はベクター形質移入およびエンドスルフィン−Ｂ形質移入細胞における［³Ｈ］グリブリドの正味放出％のグラフを示す。実施例１８記載の通り流出実験を行った。記号"^*"は未形質移入細胞と有意に異なる値を示す。図１０（Ｂ）はｐｃＤＮＡ３．１形質移入およびｐＣＭＶ−エンドスルフィンＢ形質移入ＲＩＮｍ５Ｆ細胞における、グリブリドによる２−デオキシグルコース誘発⁸⁶Ｒｂ⁺流出のグラフを示す。発明の詳細な説明本発明はヒトエンドスルフィンコードする単離され精製されたポリヌクレオチド、その断片、これらのポリペプチドを含む発現ベクター、これらの発現ベクターで形質転換されたホスト細胞、これらのポリヌクレオチドおよびベクターを用いるヒトエンドスルフィンの製造法、および単離、精製された組み換えヒトエンドスルフィン、およびそのポリペプチド断片を提供する。本発明はまた、試験試料中のｍＲＮＡからｃＤＮＡの作成すること、およびヒトエンドスルフィン遺伝子の存在の指標としてのｃＤＮＡの検出することを包含する、ヒトエンドスルフィン遺伝子の産生物についての試験試料の分析法を提供する。この方法には、遺伝子またはその断片に対応するｃＤＮＡ部分が増幅される増幅ステップが含まれてもよい。ｍＲＮＡの翻訳産生物の分析方法も提供される。本発明で提供される方法により分析し得る試験試料には組織、細胞、体液および分泌物が含まれる。本発明はまた、これらの方法を実行する上で有用なオリゴヌクレオチドプライマーおよびポリペプチド等の試薬を提供する。本発明に開示された核酸配列の部分は、ＲＮＡの逆転写またはｃＤＮＡ増幅のプライマーとして、または試験試料中にある特定のｃＤＮＡの存在を検知するプローブとして有用である。また、診断用イムノ分析の標準または試薬、薬学的スクリーニング分析の標的および／または様々な治療の成分または標的部位として有用な、コードされたポリペプチド配列を生産し得る核酸配列も開示されている。これらのポリペプチド配列内に含まれる、少なくとも一つのエピトープに対するモノクローンおよびポリクローン抗体は、異常エンドスルフィン生産に伴う疾病または状態の診断試験またはスクリーニングに有用である。目的の遺伝子の他の部分からの配列の単離は、これらの核酸配列由来のプローブまたはＰＣＲプライマーを利用して行われ、目的のゲノムのさらに別のプローブおよびポリペプチドを確立することができる。アミノ酸配列の「類似性」を決定する技法は当業者に公知である。一般的に、「類似性」とは、適当な場所に有る２個以上のポリペプチドの正確なアミノ酸間の比較を意味し、そこではアミノ酸は同一であるか、荷電または疎水性等の類似の化学的および／または物理的性質を有する。いわゆる「類似率」という用語は、比較されるポリペプチド配列間で決定される。核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定する技術も当業者に公知であり、その遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列の決定（通常、ｃＤＮＡ中間体を経て）、およびそれによりコードされたアミノ酸配列の決定、およびこれと第二のアミノ酸配列との比較を含む。一般的に「同一性」とは正確な２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドそれぞれのヌクレオチド間、またはアミノ酸間の対応を言う。「同一性率」を決めることにより、２個またはそれ以上のポリヌクレオチド配列を比較することが出来る。同様に２個のアミノ酸配列を、その「同一性率」を決めることにより比較し得る。例えば、ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ヒトエンドスルフィンのアミノ酸配列に対して約９０％の同一性を有することが好ましく、約９５％の同一性を有することが最も好ましい。さらにポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ヒトエンドスルフィンのポリペプチドのアミノ酸配列に対し好ましくは少なくとも約８５％の類似性、より好ましくは約９０％の類似性、最も好ましくは約９５％の類似性を有する。ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰａｃｋａｇｅ、バージョン８で入手可能なプログラム（ＧｅｎｅｔｉｃＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩより入手可能）、例えばＧＡＰプログラムは、２個のポリヌクレオチド間の同一性と、２個のポリペプチド配列間の同一性および類似性の双方をそれぞれ計算することができる。同一性または類似性を計算するための他のプログラムも公知である。ヒトまたは他の動物で異常エンドスルフィン発現の生理学的な証拠はいまだ知られていないが、我々はエンドスルフィンがその異常発現の結果として病原的な役割を果たすと考えている。例えば、前出のＶｉｔｓｏｌｖｙ−Ｖｅｒｇｉｎｅら（１９９２年）は、膵臓におけるエンドスルフィンの発現および／または分泌不良はＮＩＤＤＭの病理を伴い、脳においては脳虚血を伴うと推定している。また、ある種の体液中の通常存在しないエンドスルフィンの存在が病態を示し、その進展をこのような液体中のエンドスルフィンを分析することによりモニターし得ると推定することは合理的である。同様な役割は、正常な生理条件では膜結合タンパク質であり、従って体液中には見出されないが、多発硬化症等の病気の状態では脳脊髄液中に放出されるミエリン基底タンパク質でも見られる。さらに、存在しないと思われる組織または体液中のエンドスルフィンをコードするポリヌクレオチドまたはその断片存在も、例えば疾病が細胞退化で発病する場合、病状を示すものであろう。従って、ここに記載の試薬および方法は、異常なエンドスルフィン発現の指標としてのある種のマーカーの同定を可能にし、それから得られる情報はこのような発現に伴う疾病または状態の診断、段階付け、モニタリング、予知および／または治療の助けとなり得る。試験方法は、例えば、本発明が提供する配列を利用し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応等の核酸増幅法を利用することもあるプローブ分析、およびハイブリダイゼーションが含まれる。さらに本発明が提供するヌクレオチド配列は、そこから免疫原性エピトープが見出され得るオープンリーディングフレームを含有する。このようなエピトープはエンドスルフィン遺伝子に関連する疾病または状態に固有のものであることが好ましい。エピトープの固有性は、このような遺伝子でコードされるポリペプチド産生物との免疫反応性と、病気でない患者由来の組織との免疫反応性の欠如で決定される。免疫反応性の測定法は公知であり、例えば放射線イムノ分析（ＲＩＡ）、酵素結合イムノ分析（ＥＬＩＳＡ）、血液凝固反応（ＨＡ）、蛍光偏光イムノ分析（ＦＰＬＡ）、ケミルニネッセンスイムノ分析（ＣＬＩＡ）その他を含むが、それに限定されるものではない。適した方法のいくつかの例が本明細書に記載される。定義他に断らない限り、以下の用語は以下の意味を有するものとする。指定した配列「由来」のポリペプチドとは、指定されたヌクレオチド配列と同一、または相補的である、少なくとも約６個、好ましくは少なくとも約８個、より好ましくは少なくとも約１０〜１２個、さらに好ましくは少なくとも約１５〜２０個のヌクレオチドの配列を包含するポリペプチド配列を言う。その配列は、当業者に公知の技術で決定された特定のポリヌクレオチド配列に固有である配列と相補的、もしくは同一である。例えばデータバンク中の配列との比較を、指定された配列の特異性を推測する方法として使用し得る。配列が由来する領域には、特定のエピトープをコードする領域と共に、非翻訳および／または非転写領域も含まれるが、それに限定されるものではない。由来ポリペプチドは、必ずしも研究中の目的ヌクレオチド配列から物理的に由来する必要はなく、化学合成、複製、逆転写または転写を含むがそれに限定されないポリペプチドが誘導される領域中の塩基配列が提供する情報に基づく任意の方法で生成することができる。例えば、最初のポリヌクレオチドのセンスまたはアンチセンスであり得る。さらに、指定された配列に対応する領域を組み合せることにより、意図する用途と一致するように、公知の方法で修飾することができる。「プローブ」という用語は定義された、相補的配列を有する、試料中に存在する特定のＤＮＡまたはＲＮＡを同定するために使用し得る核酸セグメント（またはヌクレオチドアナログセグメント、すなわちペプチド核酸アナログ（ＰＮＡ）またはモルホリノアナログ（ＭＡ））を言う。「プライマー」という用語は、標的ヌクレオチド配列に相補的で、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするために用いられ、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のいずれかで触媒されるヌクレオチド重合の開始点となる特定のオリゴヌクレオチド配列を言う。指定した核酸配列由来の「ポリペプチド」または「アミノ酸」配列とは、配列中にコードされたポリペプチド、または少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、さらに好ましくは１５〜２０アミノ酸で構成され、配列中にコードされたポリペプチドで免疫的に同定し得るその一部と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドのことである。ここで用いる「組み換えポリペプチド」とは、その起源または操作によって、自然界では伴っているポリペプチドの全てまたはその一部を伴っていないポリペプチド、および／または自然界で結合しているポリペプチド以外と結合しているポリペプチドを少なくとも意味する。組み換えまたは由来ポリペプチドは、必ずしも指定した核酸配列から翻訳される必要はなく、化学合成または組み換え発現系の発現を含む任意の方法で生成し得る。本明細書で用いる「合成ペプチド」という用語は、アミノ酸の重合した任意の長さの形を意味し、公知の方法で化学的に合成し得る。合成ペプチドは様々な用途に有用である。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドいずれかのヌクレオチドの重合した任意の長さの形を意味する。この用語は分子の一次構造のみを示す。従って、その用語は二重鎖および一本鎖ＤＮＡと共に二重鎖および一本鎖ＲＮＡも含む。また、メチル化またはキャッピング等の修飾、およびポリヌクレオチドの非修飾型も含む。「ｃＤＮＡに対応する配列」とは、配列が指定したＤＮＡ中の配列と同一または相補的で有るポリヌクレオチド配列を含むことを意味する。ｃＤＮＡに対する同一性または相補性度（または率）は約５０％以上、好ましくは少なくとも約７０％以上、より好ましくは少なくとも約９０％以上である。対応する配列は長さで少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも約６０ヌクレオチド、より好ましくは長さで少なくとも約７０ヌクレオチドである。関連する遺伝子または遺伝子フラグメントとｃＤＮＡ間の対応は当業者に公知の方法で決定され、例えば配列決定した物質と記載されたｃＤＮＡとの直接比較、またはハイブリダイゼーションと１本鎖ヌクレアーゼによる消化後、消化されたフラグメントのサイズ決定等の方法がある。「精製されたポリヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドが天然において伴っているタンパク質を基本的に含まない、すなわち約５０％以下、好ましくは約７０％以下、より好ましくは約９０％以下のタンパク質を含む、目的のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを意味する。ポリヌクレオチドを生成する技術は当業者に公知であり、例えばポリヌクレオチドを含む細胞をカオトロピックイオンで破壊し、ポリヌクレオチドとタンパク質をイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび密度沈殿により分離する方法がある。従って、「精製されたポリペプチド」とは、ポリペプチドと天然において伴っている細胞成分を基本的に含まない、すなわち約５０％以下、好ましくは約７０％以下、より好ましくは約９０％以下の細胞成分を含む目的のポリペプチドまたはそのフラグメントを意味する。精製法は当業者に公知である。「単離された」という用語は、その物質がその元の環境（例えば天然起源であれば天然環境）から取り出されたという意味である。例えば、生きている動物中に存在する天然起源ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系で共存する物質の一部、またはすべてから分離された、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部でもあり得、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部でもあり得、さらにベクターまたは組成物はその天然環境の一部でないので、単離されている。本明細書で用いる「ポリペプチド」とは、アミノ酸の分子鎖を指し、特定の長さの産生物を言うのではない。従って、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質はポリペプチドの定義に含まれる。しかしながら、この用語はポリペプチドの発現後の修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、ホスフォリル化等を意味するものではない。「組み換えホスト細胞」、「ホスト細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」および単細胞類として培養された微生物または高等真核細胞株を示す用語は、組み換えベクターまたは他の導入ＤＮＡのレシピエントとして使用し得る、または使用されている細胞を指し、形質移入された元の細胞の元の子孫を含む。本明細書で使用する「レプリコン」とは、細胞内でのポリヌクレオチド複製の自律性単位として振舞うプラスミド、染色体またはウイルス等の任意の遺伝要素を意味する。「ベクター」とは、例えば結合したセグメントの複製および／または発現をもたらすようにされた、他のポリヌクレオチドセグメントが結合しているレプリコンである。「制御配列」という用語は、連結されたコード配列を発現させるに必要なポリヌクレオチド配列を言う。このような制御配列の性質は、ホスト生物によって異なる。原核細胞では、このような制御配列には一般的にプロモーター、リボソーム結合部位およびターミネーターが含まれ、真核細胞では、このような制御配列には一般的にプロモーター、ターミネーター、ある場合にはエンハンサーが含まれる。「制御配列」という用語は、したがって、その存在が発現に必要である最小限の全ての成分が含まれ、またその存在が有益な例えばリーダー配列である追加の成分も含まれ得る。「機能的に結合した」という用語は、その成分がその意図する方法で機能することができる関係にある状態を言う。従って、例えばコード配列に「機能的に結合した」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と矛盾のない条件で行われる様に連結される。「オープンリーディングフレーム」あるいは「ＯＲＦ」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの領域を示す。この領域は、コード配列の一部、または全体であり得る。「コード配列」は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合、ｍＲＮＡ中転写されポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５'−末端の翻訳開始コドンおよび３'−末端の翻訳停止コドンで終わる。コード配列にはｍＲＮＡ、ｃＲＮＡおよび組み換えポリヌクレオチド配列が含まれるが、それに限定されるものではない。「〜と共に／として免疫的に同定可能」という用語は、指定されたポリペプチド中に存在しまたは指定されたポリペプチドに固有のエピトープおよびポリペプチドの存在を言う。免疫的同一性は、抗体結合および／または結合の競合により決定される。これらの技術は当業者に公知であり、本明細書にも記載される。エピトープの特徴はまた、エピトープをコードするポリヌクレオチド配列に関するＧｅｎＢａｎｋ等の既存のデーターバンクのコンピューター検索、および他の既知のタンパク質とのアミノ酸配列の比較によっても推定できる。本明細書で使用される「エピトープ」とは、ポリペプチドの抗原決定基を意味する。場合によってはエピトープはエピトープに固有の空間的コンフォーメーション中の３個のアミノ酸を包含し得る。一般的にはエピトープは少なくとも５個のアミノ酸で構成され、通常は少なくとも８〜１０個のアミノ酸で構成される。空間的コンフォーメーションを調べる方法は当業者に公知であり、例えばｘ−線結晶学および２次元核磁気共鳴が含まれる。「コンフォーメーションエピトープ」とは、免疫的に認識し得る構造中のアミノ酸の特定の並置であり、このようなアミノ酸は隣接または非隣接順序で同じポリペプチド上に存在するか、または異なったポリペプチド上に存在する。ポリペプチド中に含まれる特定のエピトープの抗体認識によりポリペプチドが抗体に結合する場合、ポリペプチドは抗体と「免疫的に反応性」である。免疫反応性は、抗体との結合により、特に抗体との結合のキネティックにより、および／または、その抗体のエピトープを含む既知ポリペプチドの競合物を用いる結合における競合により、決定できる。ポリペプチドが抗体と免疫的に反応性であるかどうかを決める方法は、当業者に公知である。本明細書で用いる「目的のエピトープを含む免疫原性ポリペプチド」という用語は、目的の天然起源ポリペプチドまたはそのフラグメントを言うと共に、他の手段、例えば化学合成または組み換え生物中でのポリペプチドの発現による方法で調製されたポリペプチドを意味する。「形質転換」という用語は、挿入に用いられる方法の如何に係わらず、外来ポリヌクレオチドを原核または酵母ホスト細胞中に挿入することを言う。一般的には「形質転換」という用語は外来ポリヌクレオチドを真核ホスト細胞中に挿入することに関して用いられる。形質転換および／または形質移入を行う方法は通常の技術を有する当業者に公知であり、直接取り込み、形質導入、ｆ−メーティングおよびエレクトロポーレーション等の技術を含む。外来ポリヌクレオチドは非組み込みベクター、例えばプラスミドとして維持されるか、またはホストゲノム中に組み込まれる。「処置」とは予防および／または治療を言う。本明細書で用いる「個体」という用語は、脊椎動物、特に補乳動物種を言い、家畜、スポーツ用動物、霊長類およびヒトを含むがそれに限定されず、より特定的にはヒトを指す。本明細書で用いる「センス鎖」または「プラス鎖（または“＋”）」という用語は、ポリペプチドをコードする配列を含む核酸を指す。「アンチセンス鎖」または「マイナス鎖（または“−”）」という用語は、「プラス」鎖の配列に対し相補的な配列を含む核酸を言う。「試験試料」という用語は、分析対象物（関連する抗体または抗原）のもとである個体の成分を言う。これらの成分は当業者に公知である。これらの分析試料にはここに記載の本発明の方法により試験され得る生物試料を含み、全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液および気管、腸管および尿生殖器管等の様々な外分泌、涙、唾液、乳汁、白血球、骨髄腫等、細胞培養上澄等の生物液体、固定化組織試料を含む。「精製産生物」とは、産生物が通常は伴っている細胞内容物、および関連する試料内に存在し得る他の型の細胞から単離された産生物調製体を言う。「ＰＮＡ」とは「ペプチド核酸アナログ」のことであり、標的の存在を決定するために本明細書に記載された方法で利用し得る。「ＭＡ」とは「モルホリノアナログ」のことであり、標的の存在を決定するために本明細書に記載された方法で利用し得る。例えば本明細書に参照して取込まれる米国特許第５，３７８，８４１号参照のこと。ＰＮＡはＲＮＡ標的またはＤＮＡを指向し得る天然に荷電した分子部分である。例えば本発明のＤＮＡプローブの代わりに分析に使用されるＰＮＡは、ＤＮＡプローブを使用した場合には得られない利点を提供する。これらの利点には生産性、大量ラベリング、再現性、安定性、イオン強度変化に対する不感受性およびＤＮＡまたはＲＮＡを用いる方法に存在する酵素分解に対する抵抗性がある。これらのＰＮＡはフルオレセイン、放射性ヌクレオチド、ケミルミネッセンス化合物等でラベルすることができる。従ってＰＮＡまたはＭＡ等の他の核酸アナログはＤＮＡまたはＲＮＡの代わりに分析法で使用し得る。本明細書では分析はＤＮＡプローブを用いて記載されているが、分析試薬で必要であるならばＰＮＡまたはＭＡが若干の変更でＲＮＡまたはＤＮＡを代替し得ることは、日常作業者の範囲内にある。本明細書で用いる「被分析物」とは、試験試料中に存在する検出すべき物質である。被分析物は、それに対し天然起源の特定の結合メンバーが存在する、またはそれに対し特定の結合メンバーを調製し得る任意の物質である。従って、被分析物は分析における１個またはそれ以上の特異的結合メンバーと結合し得る物質である。「被分析物」にはまた、任意の抗原性物質、ハプテン、抗体およびそれらの組み合せも含まれる。特定の結合対のメンバーとして、被分析物は、ビタミンＢ１２検出のための特異的結合対のメンバーとして内因子タンパク質の使用、葉酸検出のための葉酸結合タンパク質の使用、または炭水化物検出のための特異的結合対のメンバーとしてレクチンの使用等、天然起源の特定の結合パートナー（対）を利用して検出できる。被分析物にはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、ヌクレオチド標的等が含まれる。「ＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇ」または「ＥＳＴ」とは、組織から抽出されたｍＲＮＡの逆転写により生成し、その後ベクター中へ挿入されたｃＤＮＡ挿入物の部分配列を言う。「転写イメージ」とは、ライブラリー中のＥＳＴの定性的な分布を与える表またはリストのことであり、ライブラリーが作られた組織中で活性である遺伝子を現す。本発明は特異的結合メンバーを利用する分析を提供する。本明細書で使用する「特異的結合メンバー」とは、特異的結合対のメンバーである。すなわち、２個の異なった分子において、一方の分子が化学的または物理的方法で第二の分子に特異的に結合する。従って、通常のイムノ分析の抗体および抗原特異的結合対に加えて、他の特異的結合対はビオチンおよびアビジン、炭水化物およびレクチン、相補性核酸配列、エフェクターおよびレセプター分子、酵素コファクターおよび酵素、酵素阻害剤および酵素等を含むことができる。さらに、特異的結合対は最初の特異的結合メンバーのアナログであるメンバー、例えば被分析物アナログも含むことができる。免疫反応性特異的結合メンバーには抗原、抗原フラグメント、モノクローナルおよびポリクローンナル双方の抗体および抗体フラグメント、およびそれらの複合体（組み換えＤＮＡ分子から生成したものも含む）を含む。本明細書で用いる「ハプテン」という用語は、抗体に結合することができるが、キャリアタンパク質と結合しなければ抗体産生を誘導できない、部分抗原または非タンパク質結合メンバーを言う。本明細書で用いる「捕捉試薬」とは、サンドイッチ分析における被分析物、もしくは競合分析における指示薬または被分析物、もしくは間接分析におけるそれ自身非分析物に対して特異的である補助特異的結合メンバーのいずれか一つに対し特異的な非標識特異的結合メンバーのことである。捕捉試薬は、分析実施前、または分析実施中に、固相材料に直接的または間接的に結合することができ、固定化した複合体を試験試料から分離することが可能である。「指示薬」は、特異的結合メンバーに対合された（「取り付けられた」）、外部手段により検出可能な測定可能信号を発生できる、または発生する「信号発生化合物（「ラベル」）」を包含する。指示薬は、ビオチン−抗ビオチンのようなハプテン−抗ハプテン系、アビジンまたはビオチン、炭水化物またはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターまたはレセプター分子、酵素コファクターおよび酵素、酵素阻害剤または酵素等を含む任意の特異的結合対のメンバーであり得る。免疫反応性特異的結合メンバーは抗体、抗原、またはサンドイッチ分析における目的のポリペプチド、競合分析における捕捉試薬、または間接分析における補助特異的結合メンバーのいずれかに結合し得る抗体／抗原複合体で有り得る。プローブおよびプローブ分析について述べるとき、「レポーター分子」という用語が用いられる。レポーター分子は、カルバゾールまたはアダマンタン等の特異的結合対の特異的結合メンバーに組み込まれた、上記の信号発生化合物を包含する。予想される様々な「信号発生化合物」（ラベル）には発色素、酵素等の触媒、フルオレセインおよびローダミン等の発光化合物、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウムおよびルミノール等の化学発光化合物、放射性元素および直接目にみえるラベルが含まれる。酵素の例にはアルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ等が含まれる。特定のラベルの選択は重要でなく、それ自体で信号を発生し得るか、または一つ以上の他の物質と共同して信号を発生し得るものである。「固相（個体支持体）」は当業者に公知であり、反応トレーのウエルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロース片、膜、ラテックス粒子等の微粒子、ヒツジ（まン酸無水物およびホルムアルデヒドにより「固定化した」赤血球、ＡｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ、ＩＬより市販）、その他が含まれる。「固相」は重要ではなく、当業者により選択し得る。従って、ラテックス粒子、ミクロ粒子、磁性または非磁性ビーズ、膜、プラスチックチューブ、ミクロタイターウエルの壁、ガラスまたはシリコンチップ、ヒツジ（または他の動物の）赤血球、およびＤｕｒａ定化する適当な方法には、イオン的、疎水的、共有結合その他がある。本明細書で用いる「固相」とは、不溶性のあるいはその後の反応で固定化することができる任意の材料のことである。固相は、その捕捉試薬を吸引し固定化する固有の能力によって選ばれる。あるいは、固相は捕捉試薬を吸引し固定化する能力を有する別のレセプターを保持することもできる。別のレセプターには、捕捉試薬それ自体に対し、または捕捉試薬に対合された荷電物質に対し、反対に荷電した荷電物質が含まれる。また別の方法では、レセプター分子は、固相上に固定化され（付着し）、特異的な結合反応により捕捉試薬を固定化する能力を有する、任意の特異的結合メンバーで合ってもよい。リセプター分子は、分析実行前、または分析実行中に捕捉試薬を固相に間接的に結合することができる。従って固相はプラスチック、変性プラスチック、磁性または非磁性金属、試験管のガラスまたはシリコン表面、ミクロタイターウエル、シート、ビーズ、ミクロ粒子、ヒツジ（または他の動物の）赤血球、およびの他の構造で有り得る。固相はまた、抗体検出および適当な表面親和性により抗原を結合し得るに十分な多孔性を有する、任意の適当な多孔性材料を包含し得ると考えられ、本発明の範囲内とされる。微孔性構造が一般的に好ましいが、水和状態にあるゲル構造の材料も使用できる。このような有用な固体支持体にはニトロセルロースおよびナイロンが含まれるが、それに限定されない。本明細書に記載するこのような多孔性個体支持体は、厚さ約０．０１〜０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍのシート状であることが好ましい。ポアサイズは広い範囲で可変であり、好ましくは約０．０２５〜１５ミクロン、特に約０．１５〜１５ミクロンである。このような支持体の表面は、抗原または抗体の支持体への共有結合が起るように化学処理によって活性化される。しかしながら、ほとんど解明されていない疎水性力による多孔性物質上への吸着により、一般的に非可逆的な抗原または抗体の結合が得られる。他の適した固体が当分野では公知である。試薬本発明はヒトエンドスルフィン遺伝子由来のポリヌクレオチド配列、その中にコードされたポリペプチド、およびこれらのポリペプチドから作られる抗体等の試薬を提供する。本発明はまた、開示されたポリヌクレオチドおよび核酸配列由来で、これらのポリヌクレオチドに対し相補性である、オリゴヌクレオチドフラグメント等の試薬も提供する。例えば、選ばれたエンドスルフィン由来ポリヌクレオチドを、正常または変更遺伝子発現のために本明細書に記載された方法に使用することができる。このような方法には本明細書に開示されたエンドスルフィン由来のポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、そのフラグメントまたは誘導体、またはこれらのポリヌクレオチドに対し相補性の核酸配列が使用される。さらに本明細書に開示されたポリヌクレオチド、その相補性配列またはフラグメントのいずれかを、ヒトエンドスルフィンをコードする遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを検出、増幅または定量するための分析に使用し得る。それらはまた、エンドスルフィンポリペプチドをコードする全または部分コード領域を同定するために使用することができる。それらはさらに、個々の容器中分析キットとして提供され、または個々の組成物として提供される。分析用キットとして提供される場合、緩衝液、コンジュゲート等も含まれる。ポリヌクレオチドはｍＲＮＡまたはＤＮＡの形で有り得る。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノム子ＤＮＡおよび合成ＤＮＡの形のポリヌクレオチドは、本発明の範囲内である。ＤＮＡは二重鎖または一本鎖であっても良く、一本鎖の場合、コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖で有り得る。ポリペプチドをコードするコード配列は本明細書で提供されるコード配列と同一であるか、または異なったコード配列であって、遺伝子コードの重複または縮退の結果、本明細書で提供されるものと同じポリペプチドをコードするものであっても良い。このポリヌクレオチドはポリペプチドのみに対するコード配列を含むか、ポリペプチドとリーダーまたは分泌配列またはプロタンパク質配列に対するコード配列を含むか、またはポリペプチドに対するコード配列（および随意に追加コード配列）およびポリペプチドに対するコード配列の５'および／または３'非コード配列のような、非コード配列を含む。さらに、本発明はポリヌクレオチド欠失、置換または付加等の修飾を含む変異ポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチド配列の変異の結果生じる任意のポリペプチド修飾等を含む。本発明のポリヌクレオチドはまた、本明細書に提供されるコード配列の自然発生対立遺伝子変異体であるコード配列を有し得る。さらに、ポリペプチドに対するコード配列は、同一リーディングフレーム内で、ホスト細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば細胞からポリペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダ配列、と融合されてもよい。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、ホスト細胞によって開裂してポリペプチドの形を生成するリーダー配列を有する。ポリヌクレオチドはまた、タンパク質プラス追加５'−アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードする。プロ配列を有するタンパク質はプロタンパク質であり、ある場合はタンパク質の不活性型で有り得る。ひとたびプロ配列が開裂すると、活性タンパク質が残る。従って、本発明のポリヌクレオチドはタンパク質をコードするか、またはプロ配列を有するタンパク質をコードするか、またはプレ配列（リーダー配列）およびプロ配列の双方の配列を有するタンパク質をコードし得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にフレーム内で融合しているコード配列を有し得る。マーカー配列は、ｐＰｒｏＥｘ１（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）ベクターにより供給され、細菌ホスト細胞の場合はマーカーに融合したポリペプチドの精製を可能にする、ヘキサヒスチジンタグであるか、または哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ−７細胞、を使用した場合は、例えばマーカー配列はヘマグルチニン（ＨＡ）タグである。ＨＡタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する。例えばＩ．Ｗｉｌｓｏｎら著、Ｃｅｌｌ、第３７巻、７６７頁（１９８４年）参照。ヒトエンドスルフィンをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと前記配列間に少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性がある場合、その配列とハイブリダイズすると推測される。本発明はまた、ここで提供するポリヌクレオチドから選ばれたエンドスルフィン遺伝子ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの少なくとも一部である、精製エンドスルフィンを用いて生産される抗体を提供する。これらの抗体は、本明細書が提供する方法において、試験試料中のエンドスルフィンポリペプチドの検出用に使用される。抗体はまた、治療目的、例えばエンドスルフィンの発現の変化、または異常な発現に関連する状態におけるエンドスルフィンの活性を中和するために用いられる。本発明はさらに、本明細書で提供する様な推定アミノ酸配列を有するエンドスルフィンポリペプチドの他、このようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体を提供する。本発明のポリペプチドは組み換えポリペプチド、天然精製ポリペプチドまたは合成ポリペプチドで有り得る。エンドスルフィンポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体は、アミノ酸残基の１個以上が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換されたものであり、このような置換アミノ酸残基は遺伝子コードでコードされた、またはコードされないものであっても良く、または１個以上のアミノ酸残基が置換基グループを含むものであっても良く、またはポリペプチドがポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えばポリエチレングリコール）等の他の化合物と融合しているものであって良く、または追加アミノ酸がリーダーまたは分泌配列、またはポリペプチドまたはタンパク質配列の精製に用いられる配列等のポリペプチドに融合しているものであっても良い。このようなフラグメント、誘導体またはアナログは、本発明の範囲内である。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供され、好ましくは精製される。このように、本発明のポリペプチドは、天然起源のポリペプチドの配列と同一、または１個以上のアミノ酸置換によるわずかな変更により異なる配列を有し得る。変更は一般的には約１〜５アミノ酸の範囲の「保存性変化」であり、置換されたアミノ酸は類似の構造的または化学的性質を有し、例えばロイシンのイソロイシンによる置換、またはトレオニンのセリンによる置換等である。対照的に、変更は非保存性変化、例えばグリシンのトリプトファンによる置換を含んでも良い。同様なわずかな変更には、アミノ酸欠失または挿入、またはその双方が含まれ得る。生物的または免疫的活性を変化させずにどのような、およびいくつのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失されているかを決める指針は、当業者に公知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲＩｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて見出すことができる。エンドスルフィンポリペプチドは、上記の通り高度発現細胞株から発現した自然に精製された産生物であるか、または原核または真核ホスト細胞（例えば培養されるバクテリア、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞）から組み換え技術で生産される。組み換え生産法で用いられるホストによって、本発明のポリペプチドは哺乳動物または他の真核炭水化物によってグリコシル化されるか、非グリコシル体である。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含む。また、本発明のポリペプチドは通常のペプチド合成器により合成的に製造されるか、本発明のＤＮＡ構成物由来のＲＮＡを用いて無細胞翻訳系で製造される。プローブ分析本明細書が提供する配列は、試験試料中の核酸検出のための分析に使用できるプローブの生産に使用し得る。例えば、プローブは染色体分析を行うための蛍光原位置ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）技術に使用することが可能であり、また染色体の広がりから見ることができる、またはＰＣＲで製造したおよび／もしくは対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプローブ、対立遺伝子特異性増幅を用いて検出可能もしくは直接配列決定で検出可能な、欠失または転移等の染色体中のエンドスルフィン構造変化を同定するために使用される。プローブはまた、放射性同位元素、直接または間接検出ハプテン、または蛍光分子でラベルすることができ、固定化組織試料または細胞中のポリヌクレオチドを包含するｍＲＮＡ発現を評価するための原位置ハイブリダイゼーション実験に利用される。プローブは目的のポリヌクレオチドの保存ヌクレオチド領域、または目的のポリヌクレオチドの非保存領域から設計される。分析を最適化するためのこのようなプローブの設計は、日常作業者の技術範囲である。一般に、最高の特異性が必要な場合は核酸プローブは非保存または固有領域から開発され、例えば多重遺伝子群のまたはマウスとヒト等の関連する種中の異なったメンバーに密接に関連する、ヌクレオチド領域を分析する場合、核酸プローブは保存領域から開発される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸またはその混合物中に含まれる所望の核酸配列（標的）を増幅する技術である。ＰＣＲにおいては、標的核酸の相補性鎖の外側末端にハイブリダイズするために、プライマー対が過剰に用いられる。プライマーはそれぞれ、標的核酸を鋳型として用いてポリメラーゼにより伸長される。伸長産生物が標的配列それ自体となり、次いで最初の標的鎖から解離される。新しいプライマーは次いで標的配列とハイブリダイズし、ポリメラーゼにより伸長し、そのサイクルが繰り返されて標的配列分子を幾何学的に増加させる。ＰＣＲは米国特許第４、６８３、１９５号および第４，６８３，２０２号に開示され、本明細書に引用して取込む。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は核酸増幅の別法である。ＬＣＲでは、２個の１次（第１および第２）および２次（第３および第４）プローブを含むプローブ対が使用され、その全てが標的に対して過剰モル数で用いられる。第１プローブは標的鎖の第１セグメントとハイブリダイズし、第２プローブは標的鎖の第２セグメントとハイブリダイズする。第１および第２セグメントは、１次プローブが相互に５'−ホスフェート−３'−ヒドロキシル関係で隣接する様に、リガーゼが２個のプローブを共有結合で融合または連結して融合産物を精製する様に、隣接関係にある。さらに第３（２次）プローブは第１プローブの部分に、第４（２次）プローブは第２プローブの部分に同様な隣接関係でハイブリダイズ可能である。もちろん、標的が最初に二重鎖である場合は、２次プローブは先ず標的相補体ハイブリダイズする。１次プローブが連結された鎖が標的鎖からひとたび分離されると、それは第３、第４のプローブとハイブリダイズされ、相補的な２次連結産物を生成する。連結産物は標的またはその相補体と機能的に等価であることを実現することが重要である。ハイブリダイゼーションとライゲーションのサイクルを繰り返すことにより、標的配列の増幅が行われる。この技術は１９８９年６月１６日に公開されたＫ．ＢａｃｋｍａｎのＥＰ−Ａ−３２０３０８、１９９１年７月３１日に公開されたＫ．ＢａｃｋｍａｎらのＥＰ−Ａ−４３９１８２により完全に記載され、本明細書に参照して取込まれる。ｍＲＮＡの増幅では、ｍＲＮＡをｃＤＮＡ中に逆転写し、次いでポリメラーゼ連鎖反応を行うこと（ＲＴ−ＰＣＲ）、または本明細書に参照して取込まれる米国特許第５，３２２，７７０号記載の通り双方のステップに単一酵素を使用すること、または本明細書に参照して取込まれるＲ．Ｌ．Ｍａｒｓｈａｌｌら著、「ＰＣＲ法およびその応用」第４巻、８０−８４頁、（１９９４年）記載の通りｍＲＮＡをｃＤＮＡ中に逆転写し、次いで非対象ギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ −ＡＧＬＣＲ）を行うことは、本発明の範囲内である。ここで利用できる他の既知の増幅法には、ＰＮＡＳＵＳＡ、第８７巻、１８７４−１８７８頁（１９９０年）、およびＮａｔｕｒｅ３５０（第６３１３号）、９１頁（１９９１年）に記載の、いわゆる「ＮＡＳＢＡ」または「３ＳＲ」技術、ヨーロッパ特許出願公開第４５４４６１０号に記載のＱ− ベータ増幅、Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒら著、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．第４２巻、９− １３頁（１９９６年）およびヨーロッパ特許出願第６８４３１５号記載の鎖移動（ｓｔｒａｎｄｄｉｓｐｉａｃｅｍｅｎｔ）増幅、およびＰＣＴ公開ＷＯ９３２２４６１号記載の標的仲介（ｔａｒｇｅｔｍｅｄｉａｔｅｄ）増幅が含まれるが、それに限定されるものではない。一つの実施形態では、本発明は一般的に標的ポリヌクレオチド配列が含まれていると思われる試験試料を、増幅プライマーを包含する増幅反応試薬、およびアンプリコン配列の内部領域と、接触させる工程を包含する。本明細書の方法により用いられるプローブおよびプライマーは、捕捉および検出ラベルでラベルされ、プローブはあるタイプのレベルでラベルされ、プライマーは別のタイプのラベルでラベルされる。さらに、プライマーとプローブは、プローブ配列がプライマー配列より低い融解温度を有するように選ばれる。増幅試薬、検出試薬および試験試料は増幅条件下に置かれ、それにより、標的配列の存在で標的配列のコピー（アンプリコン）が作成される。プライマーは標的配列とその相補鎖を増幅するために提供されるので、通常の場合はアンプリコンは二重鎖である。次いで二重鎖アンプリコンは熱的に変成して一重鎖アンプリコンメンバーを生成する。一重鎖アンプリコンメンバーが生成すると、混合物を冷却してプローブと一重鎖アンプリコンメンバーとの間の複合体を生成させる。一重鎖アンプリコン配列とプローブ配列が冷却されると、プローブ配列は優先的に一重鎖アンプリコンメンバーと結合する。この所見は、プローブ配列が一般的にプライマー配列より短くなるように選ばれ、従ってプライマーより低い融解温度を有するとすれば、直感的でない。従って、プライマーによって作成されたアンプリコンの融解温度も、プローブより高い融解温度を持たなければならない。従って、混合物が冷却すると、二重鎖アンプリコンの再生が期待される。しかしながら前述の通り、これは実際とは異なる。プローブは一重鎖アンプリコンメンバーと優先的に結合することが見出されている。その上、プローブ／一重標準アンプリコン結合のこの優先性は、プライマー配列がプローブより過剰に加えられた場合でも存在する。プローブ／一重鎖アンプリコンメンバーのハイブリッドが生成後、それらは検出される。プライマーおよびプローブ上に存在する検出ラベルおよび捕捉ラベルを用いてハイブリッドを検出するには、標準不均一分析フォーマットが適している。ハイブリッドは捕捉ラベルにより固相試薬に結合することができ、検出ラベルにより検出される。検出ラベルが直接検出可能の場合は、固相上のハイブリッドの存在は、必要あればラベルに検出可能な信号を発生させ、信号を検出することにより検出される。レベルが直接検出できない場合は、捕捉されたハイブリッドは通常は直接検出可能なラベルに付着した結合メンバーを包含するコンジュゲートと接触させ得る。コンジュゲートは複合体に結合し、複合体上のコンジュゲートの存在は直接検出可能なラベルで検出される。従って、固相試薬上のハイブリッドの存在を測定できる。当業者は、洗浄工程がハイブリダイズしないアンプリコンまたはプローブと同時に、未結合コンジュゲートも洗い流すことを認識できる。一般的には、試験試料は標的配列を含むと思われる任意の試料である。個体から試料を得、必要あればその中に含まれるすべての細胞を破壊して標的核酸を放出することにより、公知の方法論を用いて試験試料を調製できる。標的配列は一重鎖であると記載されているが、標的配列が実際には二重鎖であり、しかも増幅プライマー配列とハイブリダイゼーションする前にその相補体から分離されたのみである場合も含まれることは考えられる。この方法でＰＣＲが用いられる場合は、標的配列の末端は通常は既知である。この方法でＬＣＲまたはその変位が用いられる場合は、全体の配列は通常は末知である。一般的には、標的配列は例えばＲＮＡまたはＤＮＡ等の核酸である。ここで提供する方法は、特にＰＣＲおよびＧＬＣＲにおける熱サイクル反応混合物を含む公知の増幅反応で使用できる。一般的には、増幅反応は標的核酸配列を繰り返し作成するためにプライマーを使用し、標的配列は通常より大きい核酸配列の小さな領域である。プライマーそれ自体は標的配列の領域と相補的である核酸配列である。増幅条件下では、プライマーは標的配列の相補領域とハイブリダイズまたは結合する。一般的には標的配列のコピーは、ポリメラーゼまたはリガーゼ活性を有する酵素を単独または組み合せで利用するプライマー伸長および／または連結の過程で作成され、ハイブリダイズプライマーおよび／またはプローブ対に隣接した連結物にヌクレオチドを付加する。モノマーまたは予備形成オリゴマーとしてプライマーまたはプローブに付加されるヌクレオチドもまた、標的配列に相補的である。プライマーまたはプローブが十分に伸長および／または連結されると、反応混合物を「融解温度」、つまり相補核酸鎖が解離する温度に加熱して標的配列から分離される。このようにして標的配列に相補的な配列が生成する。標的配列の数をさらに増幅するために、全ての二重鎖配列を分離しプライマーまたはプローブをそれそれの標的にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズされたプライマーまたはプローブを伸長および／または連結しおよび再分離して、新しい増幅サイクルが行われる。増幅サイクルで生成した相補配列は、プライマー伸長または２個のプローブのギャップを埋める鋳型として働き、標的配列の数をさらに増幅する。一般的には、反応混合物は２０〜１００回の間サイクルされ、より一般的には反応混合物は２６〜５０回の間サイクルされるサイクル数は当業者で決定し得る。この方法で、標的配列とその相補配列の何回ものコピーが作成される。このようにして、増幅条件下にある場合はプライマーは標的配列の増幅を開始する。一般的に、標的鎖とその相補体に相補的である２個のプライマーがＰＣＲで用いられる。ＬＣＲでは、その２個が標的配列に相補的であり、２個が標的相補対に同様に相補的である４個のプローブが一般に用いられる。プライマーセットと前述の酵素に加えて、核酸増幅混合物は公知であり、以下を含むがそれに限定されない他の試薬も包含する：マンガン等の酵素コファクター、マグネシウム、塩、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、および例えばデオキシアデニン三燐酸、デオキシグアニン三燐酸、デオキシシトシン三燐酸およびデオキシチミジン三燐酸等のデオキシヌクレオチド三燐酸（ｄＮＴＰ）。増幅プライマーは標的配列の増幅を開始するが、ある場合には、検出（またはハイブリダイゼーション）プローブは増幅に含まれない。検出プローブは一般的には例えば国際特許出願ＷＯ９２／２０７０２号に開示されるペプチド核酸、米国特許第５，１８５，４４４号、第５，０３４，５０６号および第５，１４２，０４７号に開示されるモルホリノアナログ等の核酸配列または非荷電核酸アナログである。プローブが有するラベルのタイプに応じて、ラベルは増幅反応で生成したアンプリコンを捕捉または検出するために用いられる。プローブは標的配列の増幅には関与せず、従って別のｄＮＴＰがプローブに追加されないという点で「非伸長性」と呼ばれることがある。通常、アナログ自体は非伸長性であり、ヒドロキシル基がもはや伸長に関与できないように３'末端を修飾することにより、核酸プローブを非伸長性とすることができる。例えば、プローブの３'末端を捕捉または検出ラベルで活性化し、それによりヒドロキシルグループを消費またはブロックすることができる。あるいは、３'ヒドロキシル基を単に切り取り、置換または修飾することができる。本明細書に参照して取込まれる１９９３年４月１９日受理米国特許第０７／０４９０６１号には、プローブを非伸長性とすることができる修飾が記載されている。従って、このような状況ではプライマーとプローブの比率は重要ではない。つまり、プローブまたはプライマーいずれかを反応混合物に過剰に加え、それにより一方の濃度を他方の濃度より大きくすることができる。また、プライマーとプローブを等濃度で用いることもできる。しかしながら、プライマーをプローブより過剰に反応混合物中に加えることが好ましい。従って、増幅工程にプローブが関与しない場合、好ましいプライマーとプローブの比率は例えば５：１および２０：１である。プライマーとプローブの長さは可変であるが、プローブがプライマーより低い融解温度を持つようにプローブ配列が選ばれる。従って、プライマー配列は一般にプローブ配列より長くなる。プライマー配列は一般的には２０〜５０ヌクレオチド長の範囲、より一般的には２０〜３０ヌクレオチド長の範囲である。あるいは、「ネステッドＰＣＲ」として知られる方法による標的配列の増幅にプローブが関与している。ネステッドＰＣＲでは、プローブは通常増幅に用いられる第１および第２プライマーと良く似た特性（長さ、融解温度等）を有し、それ自体増幅反応のプライマーとなる。ネステッドＰＣＲでは通常、プライマーの第１対（Ｐ₁およびＰ₂）が１次伸長産物を生成するために用いられる。１次プライマーの一つ（例えばＰ₁）は任意に捕捉プライマー（すなわち第１反応対のメンに結合している）であっても良く、一方、もう一方のプライマー（Ｐ₂）はそうではない。次いで２次伸長産物がＰ１プライマーおよびプローブ（Ｐ_2'）を用いて形成され、それもまた５'末端に捕捉タイプのラベル（例えば第２反応対のメンバー）または検出ラベルを有する。プローブは、溶液中に依然ある場合Ｐ₂ の３'末端がハイブリダイズする近傍または隣接している（しかし重複していない）テンプレート上の部位において相補的であり、それとハイブリダイズする。従って、ラベルされたプライマー／プローブセットは、１次伸長産物より短い２次産物を生成する。さらに、２次産物は、そのサイズに基づき、またはそのラベルされた末端により、検出することができる（通常の技術を有する当業者に公知の方法による）。この方法では、プローブとプライマーが一般に同じ濃度で用いられる。プライマーとプローブを合成する様々な方法が公知である。同様に、プライマーまたはプローブにラベルを付ける方法も公知である。例えば、通常の核酸ホスフォルアミダイト化学、およびＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）、Ｄｕｐｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）またはＭｉｌｌｉｇａｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）市販の装置を用いて所望の核酸プライマーまたはプローブを合成することは日常的な事項である。本明細書のプライマーまたはプローブ等のオリゴヌクレオチドをラベルする方法は数多く記載されている。ＥｎｚｏＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ）およびＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）の両社は、プローブラベル技術を発表し商品化している。例えば、１級アミンを３'−Ａｍｉｎｅ−ＯＮＣＰＧ^TM（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）を用いて３'オリゴ端に付加することができる。同様に、ＡｍｉｎｏｍｄｉｆｉｅｒＩＩ^R（Ｃｌｏｎｔｃｈ）を用いて１級アミンを５'オリゴ末端に付加することができる。通常の活性化および結合化学を用いてアミンを様々なハプテンと反応させることができる。さらに、本明細書に参照して取込まれる同時係続出願米国特許第６２５，５６６号（１９９０年１２月１１日受理）および米国特許第６３０，９０８（１９９０年１２月２０日受理）は５'および３'末端それぞれにおいてプローブをラベルする方法を開示している。公報ＷＯ９２／１０５０５号（１９９２年６月２５日）および公報ＷＯ０２／１１３８８号（１９９２年６月９日）は、５'および３'末端それぞれにおいてプローブをラベルする方法を開示している。あるオリゴヌクレオチドをラベルする法によれば、ラベル−ホスフォルアミダイト試薬が調製され、合成中にラベルをオリゴヌクレオチドに付加するために用いられる。例えばＮ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎｇら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ第２９（４６）巻、５９０５−５９０８頁（１９８８年）、またはＪ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎら、公開米国特許出願０７／２４６、６８８号（ＮＴＩＳＯＲＤＥＲ第ＰＡＴ−ＡＰＰＬ−７− ２４６、６８８号（１９８９年））参照のこと。プローブは３'および５'末端でラベルされることが好ましい。捕捉ラベルはプライマーまたはプローブに担持され、固相試薬の特異的結合メンバーとの結合対を形成する特異的結合メンバーとなり得る。プライマーまたはプローブそれ自体が捕捉ラベルとなることは、当然理解される。例えば、固相試薬の結合メンバーが核酸配列である場合、プライマーまたはプローブの相補部分と結合してプライマーまたはプローブを固相に固定化する様に選ばれる。プローブそれ自体が結合メンバーとなる場合は、プローブが一重鎖アンプリコンメンバーに対し相補性でない配列または「テール」を含むことは、当業者に理解され得る。プライマーそれ自体が捕捉ラベルとなる場合は、プローブがプライマー配列と完全に相補性でないようにプローブが選ばれているため、プライマーの少なくとも一部は固相上の核酸とハイブリダイズしない。本発明が供する他の方法は、少なくとも１個のポリヌクレオチドがここで提供される複数のポリヌクレオチドと試験試料を接触させ、試験試料を複数のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を検出することを包含する。ハイブリダイゼーション複合体を同定、定量し、エンドスルフィン発現を示すプロフィルを集める。発現ＲＮＡ配列はさらに逆転写、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む当業者に公知の方法によるＤＮＡ産物の増幅により検出される。薬剤スクリーニングおよび遺伝子治療本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド等のアンチセンスエンドスルフィン遺伝子由来の分子を、エンドスルフィン関連ポリヌクレオチドの異常発現に関連する状態の患者に導入するための遺伝子治療法の使用も含む。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡフラグメントおよびリボザイムを含むこれらの分子は、エンドスルフィンｍＲＮＡの翻訳を阻害する様に設計され、エンドスルフィンポリヌクレオチドの変性または異常発現に関連する状態の処置に治療目的で使用される。また、上記オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡが生体内で発現され、上記の様な方法でエンドスルフィンポリペプチドの生産を阻害する様な技術で、細胞に送達することができる。アンチセンスはエンドスルフィンポリヌクレオチドと対立し、従ってエンドスルフィン転写の作用を取消す。本発明はまた、ヒトエンドスルフィンポリペプチド、またはその任意のフラグメントに特異的に結合する複数の化合物をスクリーニングし、ヒトエンドスルフィンポリペプチドに特異的に結合する少なくとも一つの化合物を同定する方法を提供する。このような方法は、少なくとも１個の化合物を提供する工程、適当な条件下に結合し得る十分な時間、エンドスルフィンポリペプチドをそれぞれの化合物と組み合せる工程、およびそれぞれの化合物と結合したエンドスルフィンポリペプチドを検出する工程を包含する。このような方法により、エンドスルフィンの活性を調節する（すなわち、阻害または活性化する）エンドスルフィン結合化合物を同定することができる。三重ヘリックス生成、またはアンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡにより、遺伝子発現を制御するためにアンチセンス技術を用いることが可能で、双方の方法はポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいている。例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５'コード部分が、長さで１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域と相補的であるように設計され、エンドスルフィン由来のポリペプチドの転写と生産を防止する。三重ヘリックスについてはＬｅｅら著、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．第６巻、３０７３頁（１９７９年）、Ｃｏｏｎｅｙら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４１巻、４５６頁（１９８８年）、Ｄｅｒｖａｎら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５１巻、１３６０頁（１９９１年）参照のこと。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡと生体内でハイブリダイズし、ｍＲＮＡのエンドスルフィンポリペプチド中への翻訳をブロックするか、ｍＲＮＡの輸送またた安定性を変化させる。アンチセンスに関しては例えばＯｋａｎｏ著、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．第５６巻、５６０頁（１９９１年）、および「遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド」、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ＢｏｃａＲａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８８年）参照のこと。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、分子が核酸加水分解開裂に抵抗性を与える人工的ヌクレオチド内結合を含むように修飾された場合、高い効率で作用する。このような人工的ヌクレオチド内結合にはメチルホスフォネート、ホスフォロチオレート、およびホスフォロアミデートヌクレオチド内結合が含まれるが、それに限定されるものではない。このような試験に用いられるポリペプチドまたはペプチドフラグメントは、溶液中で遊離であるか、固体支持体に固定されているか、細胞表面に担持されているか、細胞内に存在する。薬剤スクリーニングのーつの方法は、ポリペプチドまたはペプチドフラグメントを発現し得る組み換え核酸で安定に形質転換される、真核または原核ホスト細胞を利用する。薬剤は、競合結合分析でこのような形質転換細胞に対してスクリーニングされる。例えば、ポリペプチドと試験される試薬間の複合体形成は、生きた細胞または固定化細胞いずれかで測定できる。従って本発明は、ＡＴＰ感受性カリウムチャネルに関連する疾病を処置するために用いられる、薬剤またはその他の任意の試薬に関するスクリーニング法を提供する。これらの方法は、薬剤をポリペプチドまたはそのフラグメントと接触させ、薬剤とポリペプチド間の複合体の存在、またはポリペプチドと細胞間の複合体の存在を分析することを包含する。競合的結合分析では、一般的にはポリペプチドはラベルされる。適当なインキュベーション後、遊離（複合体を形成しない）のポリペプチドまたはそのフラグメントは結合型で存在するものから分離され、遊離または複合体を形成しないラベルの量は、特定の薬剤がポリペプチドに結合する、またはポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の目安となる。本発明はまた、ポリペプチドを結合し得る中和抗体が試験薬剤と、ポリペプチドまたはそのフラグメントへの結合について競合する、競合薬剤スクリーニング分析の使用も含む。この方法では、抗体はここで提供されるポリペプチドが有する１個以上の抗原決定基と同じ抗原決定基を有する、試験試料中の任意のポリペプチドを検出するために使用することができる。薬剤スクリーニングの他の方法は、本明細書に開示された少なくとも１個のポリペプチドに対する結合親和性を有する、適当な結合能を有する化合物用の処理量の大きいスクリーニングを提供する。簡単に言えば、異なった多数の小さいペプチド試験化合物が、プラスチックピンまたは他の表面等の固相上で合成される。ペプチド試験化合物はポリペプチドと反応し、洗浄される。このように固相に結合したポリペプチドは公知の方法で検出される。精製したポリペプチドも、本明細書に記載の薬剤スクリーニング技術で使用するために直接プレート上に塗布される。さらに、非中和性抗体もポリペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するために使用できる。例えば、本明細書に参照して取込まれる欧州特許８４／０３５６４号（１９８４年９月１３日）参照のこと。合理的な薬剤設計のゴールは、目的の生物活性ポリペプチドの、または相互作用するアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の構造アナログを作成することである。このような構造アナログは、ポリペプチドのより活性の高い形である、または生体内でポリペプチドの機能を促進する、またはそれを妨害する薬剤を作製するために使用し得る。本明細書に参照して取込まれるＪ．Ｈｏｄｇｓｏｎ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第９巻、１９−２１頁（１９９１年）参照。一つのアプローチでは、例えばポリペプチドまたはポリペプチド−阻害剤複合体の３次元構造は、Ｘ線結晶学、コンピューターモデリングまたは２つのアプローチの組み合せでで決定される。ポリペプチドの形と荷電の双方が構造を説明し、分子の活性部位を決めるために確認される必要がある。より頻度が少ないが、ポリペプチドの構造に関する有用な情報が、相同タンパク質の構造に基づくモデリングで得られる。双方の場合で、関連する情報が類似のポリペプチド様分子を設計するため、または効率の良い阻害剤を同定するために用いられる。合理的な薬剤設計の有用な例には、Ｓ．Ｂｒａｘｏｎら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３１巻、７７９６−７８０１頁（１９９２年）に示される活性と安定性が改善された分子、またはＳ．Ｂ．Ｏ．Ｐ．Ａｔｈａｕｄａら著、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）、第１１３（６）巻、７４２−７４６頁（１９９３年）に示される天然型ペプチドの阻害剤、アゴニスト、アンタゴニストとして作用する分子が含まれ、本明細書に参照して取込まれる。上記の分析で選ばれた標的特異性抗体を単離し、その結晶構造を決定することも可能である。原理的にこのアプローチは、その後の薬剤設計が立脚するファルマコフォアを生み出す。機能性で薬学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体（「ａｎｔｉ−ｉｄ」）を作成することにより、タンパク質結晶学を迂回することも可能である。鏡面対称体の鏡面対称体として、ａｎｔｉ−ｉｄの結合部位は最初のレセプターのアナログである。従ってａｎｔｉ−ｉｄを化学的または生物学的に作成したペプチドのバンクからペプチドを同定し単離するために使用できる。次いで単離されたペプチドはファルマコフォア（すなわち、プロトタイプ薬学的薬剤）として作用することができる。Ｘ線結晶学等の分析実験を行うに十分な量の本発明の組み換えポリペプチドが得られる。さらに、ここで提供する核酸配列から導かれるポリペプチドアミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学の代わりに、またはそれに加えてコンピューターモデリング技術を応用しようとする人の道標となる。ヒトエンドスルフィンポリペプチドに特異的な抗体は、ポリペプチドに結合させることによりポリペプチドの生物作用を阻害するために使用し得る。この方法では、抗体は治療、例えばＡＴＰ感受性カリウムチャネルに関係する疾病の処置に抗体を使用することが出来る。さらに、このような抗体は、ヒトエンドスルフィンポリペプチドの有無を検出することができ、従ってＡＴＰ感受性カリウムチャネルに関係する疾病の診断用マーカーとして有用である。本発明はまた、本発明のポリペプチドのアンタゴニストおよび阻害剤を目的とする。アンタゴニストおよび阻害剤とは、ポリペプチドの機能を阻害または除去するものである。従って、例えばアンタゴニストは本発明のポリペプチドに結合し、その機能を阻害または除去し得る。アンタゴニストと阻害剤は、緩衝生理食塩水、デキストローズ、水、グリセロール、エタノールおよびその組み合せを含むがそれに限定されない、薬学的に許容し得るキャリアとの組成物として使用できる。組み換え技術本発明は本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターで遺伝子操作されたホスト細胞、および組み換え技術による本発明のポリペプチドの製造を含むベクターを提供する。このような方法は、ヒトエンドスルフィンポリヌクレオチドの発現に適した条件下でホスト細胞を培養すること、およびそこから生産されたポリペプチドを回収することを包含する。ａホスト細胞一つの実施形態では、本発明は以下に記載する組み換え構成体を含むホスト細胞を提供する。ホスト細胞は哺乳動物細胞等の高等真核細胞、または酵母細胞等の下等真核細胞、またはバクテリア細胞等の原核細胞である。適当なホストの代表例にはＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の多様な種等のバクテリア細胞が含まれるが、以下のものも通常の選択対象として用いられる：酵母等のカビ細胞、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＳｆ９等の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓミエローマ細胞等の動物細胞、植物細胞、等。適当なホストの選択は、本発明が提供する所見から当業者の範囲内であるとみなされる。一般的にホスト細胞は、クローンベクターまたは発現ベクターである本発明のベクターで遺伝子操作（形質導入または形質転換または形質移入）される。遺伝子操作されたホスト細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、またはエンドスルフィン遺伝子を増幅するに適するように変更された通常の栄養培地中で培養し得る。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために以前にホスト細胞で用いられたものであり、当業者に自明である。ｂ．ベクターおよび発現系本発明はまた、上記で広く説明した１個以上の配列を包含する組み換え構成体を含む。その構成体は、前向きまたは逆向きの配置で本発明の配列が挿入されているプラスミドまたはウイルスベクター等のベクターを包含する。このようなベクターには染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、すなわちＳＶ４０誘導体、バクテリアプラスミド、ファージＤＮＡ、酵母ＤＮＡ、プラスミドとファージＤＮＡの組み合せ由来のベクター、およびワクチナウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス、といったウイルス性ＤＮＡを含む。好ましい実施形態では、構造体は発現ベクター（下記のとおり）を含む。多数の適したプラスミドおよびベクターは当業者に公知であり、市販されている。以下のベクターを例として挙げる：（ａ）バクテリア性：ＰＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）、ｐＧＥＭＩ（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔａｃｈ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；ｐＵＣ；ｐＳＰＯＲＴ１およびｐＰｒｏＥｘ１（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、ＭＤ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｏｉａｇｅｎ）、ｐＢｓ、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５およびｐＧＥＸ４Ｔ（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、および（ｂ）真核性：ＰＷＬｎｅｏ、ｐＳＶｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＬＶ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。原核および真核用の他の適当なクローニングおよび発現ベクターはＳａｍｂｒｏｏｋら著、「分子クローニング、実験室ガイド」、第２版（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９年）に記載され、本明細書に参照して取込まれる。しかしながら一般にそれがホスト中で複製し活性である限り、任意のプラスミドまたはベクターが使用できる。好ましい実施形態では、構成体は目的の配列に能動的に結合されていて、ｍＲＮＡ合成とポリペプチド生産を指示する制御配列も包含する発現ベクターである。原核および／または真核細胞で作用することが知られる制御配列には、ｍＲＮＡ転写を制御する誘導性および非誘導性プロモーター、リボソーム結合部位、翻訳停止および転写停止のための停止コドンおよび／またはポリアデニル化信号が含まれる。さらに、発現ベクターには発現を増幅するための適当な配列が含まれる（ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子等）。プロモーター領域は任意の所望の遺伝子から選ばれるが、好ましくは高度に発現するものから選ばれる。特定の名前が付けられているバクテリアプロモーターにはｌａｃＺ、ｇｐｔ、ｌａｍｂｄａＰｓｕｂＰ、ＰｓｕｂＬおよびｔｒｐが含まれる。真核プロモーターにはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）直前期、ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、早期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来ＬＴＲ、マウスメタロチオネン−Ｉ、プリオンタンパク質および神経特異性エノラーゼ（ＮＳＥ）が含まれる。適当なプロモータの選択は当業者の通常の技術レベル内である。さらに、組み換え発現ベクターは複製の起源と選択し得るマーカー（抗生物質（ネオマイシン、クロラムフェニコールまたはアンピシリン等）抵抗性を与える遺伝子等またはレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ等））を含み、安定に形質転換または形質移入された細胞を選ぶことができる。好ましい原核または酵母発現ベクターでは、異種構造配列(本発明のポリヌクレオチド等)が翻訳開始および停止配列と、好ましくは翻訳されたタンパク質をペリプラズム空間または細胞外媒体中に分泌可能なリーダー配列と、適切なフェーズで組み込まれる。場合によって、異種配列はＮ−末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし、例えば安定性または発現された組み換え製品の簡単な精製等の所望の特性を与える。好ましい真核発現ベクターはまた、複製の開始点、目的配列に結合して働く適当なプロモーター、および任意の必要な翻訳促進配列、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写停止配列、および５'フランク非転写配列を包含する。例えばＳＶ４０オリジン、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位等のＳＶ４０ウイルス遺伝子由来のＤＮＡ配列が、所望の非転写遺伝子要素を提供するために使用される。このようなベクターはまた、遺伝子の転写を増加させるためのエンハンサーを含む。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写速度を増加させる、通常は約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用要素である。例としては複製起源の後期部上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製領域の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーがある。ｉ．ベクター構成適当なＤＮＡ配列を様々な方法でベクター中に挿入することができる。一般に、部位特異性ＤＮＡ開裂は、ＤＮＡをこれらの市販酵素のメーカーが指定する条件で、適当な制限酵素で処理することによって行われる。通常は、約１マイクログラム(μ ｇ)のプラスミドまたはＤＮＡ配列を、約２０マイクロリッター（μＬ）の緩衝溶液中の１ユニットの酵素を用い、３７℃で１〜２時間で開裂する。制限酵素とインキュベーション後、タンパク質をフェノール／クロロホルム抽出で除去し、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収する。開裂したフラグメントはポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動を用いて、当業者に公知の方法により分離する。（上記Ｓａｍｂｒｏｏｌら参照１）。連結は標準緩衝液および温度を用い、リガーゼ（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等）およびＡＴＰにより行われる。粘着末端連結は、平滑末端連結より少ないＡＴＰとより少ないリガーゼを必要とする。ベクターフラグメントを連結混合物の一部として使用する場合は、ベクターフラグメントはしばしばバクテリアアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）または子牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で処理して５'ホスフェートを除去し、ベクターの連結を阻止する。または、希望しないフラグメントの制限酵素消化を連結を阻止するために用いる。連結混合物はＥ．ｃｏｌｉ等の適当なホスト中に形質転換され、成功した形質転換体を抗生物質抵抗性を含む方法で選択し、正しい構成体をスクリーニングする。ｉｉ．形質転換／形質移入ホストが組み換えポリペプチドを生産する様な、本発明の構成を有する適当なホストの形質転換または形質移入は、様々な方法で行われる。例えば、塩化カルシウム形質転換、塩化リチウムまたは燐酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介形質移入、またはエレクトロポーレーション等により構成体をホスト細胞中に導入し得る。ホスト細胞を形質転換／形質移入するこれらの方法は当業者に公知である（Ｌ．Ｄａｖｉｓら著、「分子生物学における基本方法」、第２版、ＡｐｐｌｅｔｏｎおよびＬａｎｇ、ＰａｒａｍｏｕｎｔＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ＥａｓｔＮｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４年））参照。ｉｉｉ．組み換えホスト細胞から発現タンパク質の回収適当なホスト株を形質転換または形質移入し、ホスト株を適当な細胞濃度に生育後、選ばれたプロモーターを適当な手段(例えば、温度変化または化学誘導)で抑制解除し、細胞を一定期間培養する。一般的には細胞を遠心分離で収穫し、物理的または化学的手段で破壊し（細胞内タンパク質を放出するため）、得られた粗抽出物をその後の精製のために保存する。タンパク質の発現のために用いた微生物細胞は、凍結解凍サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶菌試薬の使用等を含む任意の通常の方法で破壊し得るが、このような方法は当業者に公知である。発現タンパク質が分泌されたら、収穫細胞の上澄から精製できる。エンドスルフィンポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アフィニティークロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスフオセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーまたはレクチンクロマトグラフィーを含む既知の方法で回収・精製される。精製中は低濃度（約０．１〜５ｍＭ）のカルシウムイオンパーセントであることが好ましい（Ｐｒｉｃｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２４４巻、９１７頁（１９６９年））。タンパク質の立体構造を完成するため、必要あればタンパク質の再折り畳み工程を用いることができる。最後に、最終精製のため高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。別の大量の分泌タンパク質の製造方法では、哺乳動物芽細胞の形質転換と、形質移入雌ウシ、ヤギ、ヒツジ等で生産したミルクからの組み換えタンパク質の回収が行われる。ポリペプチドおよび近縁分子は、タンパク質精製を促進する様な方法で組み換えで発現する。一つのアプローチでは、ヒトポリペプチドでは天然では存在しない１種以上の追加ポリペプチドドメインを含むキメラタンパク質の発現が行われる。このような精製促進ドメインには固定化金属上で精製できるヒスチジン−トリプトファンドメイン等の金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上で精製できるプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー系（ＩｍｍｕｎｅｘＣｏｒｐ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）が含まれるが、それに限定されるものではない。ポリペプチド配列と精製ドメインの間にＦａｃｔｏｒＸＡまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入したエンテロキナーゼ等の開裂リンカー配列を組み込むことは、ポリペプチドを回収するために有用である。イムノ分析そのフラグメントまたは誘導体またはアナログを含む本発明のポリペプチド、またはそれらを発現する細胞を、ヒトエンドスルフィンに対する抗体を検出するための様々な分析に用いることが可能で、その多くは本明細書に記載されている。それらはまた、抗体を生産するための免疫源として用いることができる。これらの抗体は例えば、ポリクローンまたはモノクローン抗体、キメラ一本鎖およびヒト化抗体であり、またＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラリーの産物である。公知の様々な方法がこのような抗体およびフラグメントの製造に用いることができる。例えば、本発明の配列に対応するポリペプチドに対して作成した抗体は、動物中へのポリペプチドの直接注入またはマウス、ウサギ、ニワトリ、ヤギ等の動物へのポリペプチド投与により得ることができる。マウス、ウサギまたはヤギが好ましい。このようにして得られた抗体は、ポリペプチドそのものに結合する。この方法で、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でも、天然ポリペプチドと結合する抗体を作成するために使用することができる。このような抗体は、そのポリペプチドを含んでいると思われる組織等の試験試料から、ポリペプチドを単離するために使用することができる。モノクローン抗体調製では、連続細胞株培養により生成した抗体を提供する任意の技術を用いることができる。例としてＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５− ４９７（１９７５）に記載のハイブリドーマ技術；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ４：７２（１９８３）記載のトリオーマ技術、ヒトＢ細胞技術；およびＣｏｌｅら、「モノクローン抗体および癌の治療」、ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ、７７−９６頁（１９８５）記載のヒトモノクローン抗体を生産するためのＥＢＶハイブリドーマ技術が含まれる。一本鎖抗体生産のために記載された技術は、本発明の免疫原性ポリペプチドに対する一本鎖抗体を生産するために採用される。例えば本明細書に参照して取込まれる米国特許番号第４，９４６，７７８参照。サンドイッチイムノ分析およびプローブ分析を含む多くの分析フォーマットで、本発明の抗体を利用し得る。例えば、本発明のモノクローン抗体またはそのフラグメントを、試験試料中のエンドスルフィン由来のポリペプチドの有無を測定するための多くの分析システムで採用できる。例えば、最初の分析フォーマットでは、固体支持体上に塗布されたポリクローンまたはモノクローン抗体、またはそのフラグメント、またはこれらの抗体の組み合せを試験試料と接触させ、第１混合物を生成する。この第１混合物を抗原／抗体複合体を形成するに十分な条件で一定時間インキュベートする。次いで、信号発生化合物を付加したモノクローンまたはポリクローン抗体、またはそのフラグメント、またはこれらの抗体の混合物を抗原／抗体複合体と接触させ第２混合物を形成する。この第２混合物をポリクローンまたはモノクローン抗体、またはそのフラグメントと、抗原／抗体複合体を形成するに十分な条件で一定時間インキュベートする。試験試料中に存在し、固相上に捕捉されるエンドスルフィン由来ポリペプチド抗原の有無は、信号発生化合物により発生する測定可能信号を検出して測定される。試験試料中に存在するエンドスルフィン由来ポリペプチド抗原の量は、発生した信号に比例する。または、固体支持体上に結合したポリクローンまたはモノクローンエンドスルフィン由来ポリペプチド抗体またはそのフラグメント、またはこれらの抗体の組み合せ、試験試料およびエンドスルフィン由来ポリペプチド抗原と特異的に結合するモノクローンまたはポリクローン抗体またはそのフラグメント、信号発生分子が附加したこれらの抗体の組み合せを包含する指示薬が接触して混合物を形成する。混合物を抗体／抗原複合体を形成するに十分な条件で一定時間インキュベートし、抗体／抗原／抗体複合体を形成する。試験試料中に存在し、固相上に捕捉されるエンドスルフィン由来のポリペプチドの有無は、信号発生化合物により発生する測定可能信号を検出して測定される。試験試料中に存在するエンドスルフィン由来のポリペプチドの量は、発生する信号に比例する。別の分析フォーマットでは、本発明のモノクローン抗体の１種または少なくとも２種類の組み合せが、エンドスルフィン由来のポリペプチドタンパク質に対する抗体の検出のための競合プローブとして用いられる。例えば、本明細書に開示される組み換え抗原等のエンドスルフィン由来のポリペプチドタンパク質が、単独または組み合せで固相に塗布される。エンドスルフィン由来のポリペプチドタンパク質に対する抗体が含まれると思われる試験試料が、次に信号発生化合物と少なくとも１個の本発明のモノクローン抗体を包含する指示薬と、一定時間、試験試料と固相に結合した指示薬、または固相に結合した指示薬いずれかの抗原／抗体複合体を形成するに十分な条件でインキュベートされる。モノクローン抗体の固相への結合の減少を定量的に測定する。また別の検出法では、本発明のモノクローンまたはポリクローン抗体のそれぞれを、固定組織切片および固定細胞中のエンドスルフィン由来のポリペプチド抗原の免疫組織化学分析による検出に用いることができる。細胞化学分析では、これらの抗体は直接ラベルされる（例えばフルオレスカイン、コロイド状金、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等で）か、または疾病の組織病理学を追跡するため２次ラベルされた抗種特異的抗体を用いてラベルされ（本明細書に例示した様々なラベルで）、これも本発明の範囲である。さらに、これらのモノクローン抗体はＣＮＢｒ活性セファロース等のマトリックスに結合でき、組み換えおよび天然型エンドスルフィン由来のポリペプチド抗原およびタンパク質を精製するために、細胞培養液または生物組織から特異的エンドスルフィン由来のポリペプチドタンパク質のアフィニティー精製に用いられる。本発明のモノクローン抗体はまた、治療用または他の類似の用途のキメラ抗体を作成するためにも用いられる。モノクローン抗体またはそのフラグメントは、エンドスルフィン由来のポリペプチド抗原を検出するために個別に提供される。本明細書で提供されるモノクローン抗体（およびそのフラグメント）の組み合せもまた、本発明の少なくとも１個のエンドスルフィン由来のポリペプチド抗体と、別のエンドスルフィン由来のポリペプチド領域の抗体との混合物または「カクテル」中の成分として共に用いられ、それぞれが異なった結合特異性を有している。従って、このカクテルはエンドスルフィン由来のポリペプチドタンパク質の異なった抗原決定基を指向するモノクローン抗体を含む。分析フォーマットに使用し得るポリクローン抗体またはそのフラグメントは、分析に使用されるエンドスルフィン由来のポリペプチドタンパク質領域または他のエンドスルフィン由来のポリペプチドタンパク質に特異的に結合しなければならない。用いるポリクローン抗体は好ましくは（ヒト、ヤギ、ウサギまたはヒツジ等からの）哺乳動物起源である。最も好ましくは、ポリクローン抗体はウサギポリクローン抗エンドスルフィン由来のポリペプチド抗体である。分析に用いられるポリクローン抗体は単独またはポリクローン抗体のカクテルとして用いることができる。エンドスルフィン由来のポリペプチドは、組み換え抗原を用いるばかりでなく、エンドスルフィン由来のポリペプチドのアミノ酸配列を含む合成ペプチドまたは精製ペプチドを用いても分析で検出可能であるということは、本発明の範囲にあると考えられる。エンドスルフィン由来のポリペプチドの異なったエピトープを同定する異なった合成、組み換えまたは精製ペプチドを、異常エンドスルフィン生産に関連する診断、評価または予防条件で組み合せて使用できるということも、本発明の範囲にある。この場合、ペプチドはある固相上に被覆されるか、または各分離ペプチドがミクロ粒子等の別の固相上に被覆され、次いで混合して後ほど分析に使用されるペプチド混合物を形成する。さらに、異なったポリペプチドからのエピトープを定義する多重ペプチドは、異常エンドスルフィン生産の診断、評価、または予知を行うために組み合せて使用することができると考えられる。これを行うためには、固相上に被覆された、または検出可能なラベルでラベルされたペプチドは、患者試料と限られた量の抗体に関して競合する。合成、組み換え、または精製ペプチドの抗体（単数または複数）への結合の減少は、存在すると考えられない（例えば脳脊髄液）患者試料中のエンドスルフィン分泌ポリペプチドの存在を示すものである。このような分析フォーマットの変更は、当業者に公知である。別の分析フォーマットでは、エンドスルフィン由来のポリペプチドに対する抗体および／または抗原の存在は、同時分析で以下のように検出される。試験試料は第１検体の捕捉試薬と同時に接触され、ここでその捕捉試薬は第１検体に特異的な、固相に付着した第１結合メンバーと、第２検体に対する捕捉試薬を包含し、ここで捕捉試薬は第２固相に付着した第２検体に対する第１結合メンバーを包含し、混合物を形成する。この混合物は捕捉試薬／第１検体および捕捉試薬／第２検体を形成するに十分な条件で一定時間インキュベートされる。このようにして生成した複合体は次に、信号発生化合物でラベルされた第１検体に特異的な指示薬と、信号発生化合物でラベルされた第２検体に特異的な結合対を包含する指示薬と接触し、第２混合物を形成する。この第２混合物は捕捉試薬／第１検体／指示薬および捕捉試薬／第２検体／指示薬を形成するに十分な条件で一定時間インキュベートされる。１種以上の検体の存在は、いずれか、または双方の固相上に生成した、試験試料中の１種以上の検体の存在を示す複合体と関連して発生する信号を検出して測定される。この分析フォーマットでは、ヒト発現系由来の組み換え抗原と共に、本明細書で開示する哺乳動物発現系由来のタンパク質から製造されたモノクローン抗体が利用される。このような分析しステムは、欧州特許公報第０４７３０６５号により詳細に記載されている。他の分析フォーマットでは、本明細書に開示されたポリペプチドが、試験試料中の抗エンドスルフィン由来ポリペプチドの存在を検出するために利用される。例えば、試験試料は少なくとも１種の組み換えタンパク質が付着した固相と共にインキュベートされる。これらは抗原／抗体複合体を形成するのに十分な条件で一定時間インキュベートされる。インキュベーション後、抗原／抗体複合体が検出される。選ばれた分析系によっては、指示薬を検出を促進するために用いることができる。他の分析フォーマットでは、本明細書に記載とおり製造した組み換えタンパク質が付着した試験試料は固相と接触し、同時にそのタンパク質に特異的な、好ましくは指示薬でラベルされているモノクローンまたはポリクローン抗体と接触する。抗原／抗体複合体を形成するに十分な条件で一定時間インキュベート後、固相を遊離相から分離し、エンドスルフィン由来ポリペプチド抗体の存在の指標としてラベルが固相または遊離相中で検出される。本明細書に開示される組み換え抗原を利用する他の分析フォーマットも考えられる。これらには、試験試料を、少なくとも１種の第１起源の抗原が付着されている固相と接触すること、固相と試験試料を抗原／抗体複合体を形成するに十分な条件で一定時間インキュベートすること、およびその後、固相とラベルされた抗原と接触することが含まれ、その抗原は第１起源とは異なる第２起源由来である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ等の第１起源由来の組み換えタンパク質が固相上の捕捉抗原として用いられ、試験試料がそのようにして調製した固相に加えられ、異なった起源由来（Ｅ．ｃｏｌｉでない）の組み換えタンパク質が指示薬の一部として用いられる。同様に、固相上の組み換え抗原と指示薬相中の合成ペプチドの組み合せも可能である。捕捉抗原としての第１起源からのエンドスルフィン由来のポリペプチドに特異的な抗体と、異なった起源からのエンドスルフィン由来のポリペプチドに特異的な抗体を利用する分析フォーマットも考えられる。従って、組み換え抗原の様々な組み合せ、および合成ペプチド、精製タンパク質等の使用は、本明細書の範囲内である。このような、または他の分析は、同じ所有者の本明細書に参照して取込まれるＵＳ特許Ｎｏ．５，２５４，４５８に記載されている。様々な他の固相を利用する他の実施態様も考えられ、本発明の範囲内である。例えば、負に荷電したポリマーとの固定化可能反応複合体に対するイオン捕捉法（欧州特許公報第０３２６１００号および欧州特許公報第０４０６４７３号）が、高液相免疫化学反応を行うために本発明により用いられる。固定化免疫複合体は残りの反応混合物から、負に荷電したポリアニオン／免疫複合体と、先に処理した正に荷電した多孔性マトリックスとの間のイオン相互作用により分離され、欧州特許公報第０２７３１５号に記載の化学発光信号測定に記載されるものを含む前述の様々な信号発生系を用いて検出される。また、本発明の方法は、固相がミクロ粒子（磁性または非磁性）を包含する自動化および半自動化ミクロ粒子技術を利用するシステムで用いるために採用される。このようなシステムには欧州特許公報第０４２５６３３号および欧州特許第０４２６３４号記載のものがそれぞれ含まれる。イムノ分析に対する走査プローブ顕微鏡法（ＳＭＰ）の使用も、本発明のモノクローン抗体が容易に適用できる技術である。走査プローブ顕微鏡法、特に原子間力顕微鏡法では、捕捉相、例えば少なくとも本発明のモノクローン抗体の一つが固相に付着し、走査プローブ顕微鏡が固相の表面に存在する抗原／抗体複合体を検出するために利用される。走査トンネル顕微鏡法の使用では、多くのイムノ分析法で抗原／抗体複合体を検出するために利用されるラベルの必要がない。特異的結合反応をモニターするためのＳＰＭの使用は、多くの方法で行い得る。一つの実施態様では、特異的結合パートナーの一方のメンバー（本発明のモノクローン抗体である検体特異性物質）が走査に適した表面に付着する。検体特異性物質の付着は、当業者に公知の方法によるプラスチックまたは金属表面の固相試験片への吸着によると思われる。または、特異的結合パートナー（検体特異性物質）の、変成したプラスチック、金属、シリコン、またはガラスを包含する試験片への共有結合による付着も利用できる。共有結合付着法は当業者に公知であり、特異性結合パートナーを試験片に不可逆的にリンクする様々な方法が含まれる。試験片がシリコンまたはガラスである場合、その表面を特異的結合パートナーを付着させる前に活性化しなければならない。また、特異的結合パートナーを試験片表面に固定化するために、技術および化学を用いて高分子電解質相互作用も利用できる。付着の好ましい方法は共有結合である。特異的結合メンバーの付着後、非特異的結合を最小にするため、表面を血清、タンパク質または他のブロック剤等の材料でさらに処理する。また、表面を製造部位または使用点で走査し、分析目的に適していることを証明する。走査工程は試験片の特異的結合性を変えるとは考えられない。本発明は固相使用の有利さを示しているが、本発明の抗体、タンパク質およびペプチド等の試薬は非固相分析系でも利用できると考えられる。これらの分析系は当業者に公知であり、本発明の範囲内であると考えられる。分析に用いられた試薬は、バイアルまたはボトル、試験キット等の１個以上の容器を有するキットの形で提供されることも考えられ、各容器にはプローブ、プライマー、モノクローン抗体またはモノクローン抗体のカクテル、または分析に使用されるポリペプチド（組み換えまたは合成のいずれか）等の別々の試薬が含まれる。当業者に公知の緩衝液、コントロール等の他の成分も試験キット中に含まれ得る。入手できる体液、例えば血液、尿、唾液、糞を包含する試験試料を採集する手段を有する試験キットを提供することも考えられる。これらの採集手段にはランセットおよび血液安定化するための吸収紙または布、唾液を採集し安定化するためのスワッブ、尿または糞試料を採集し安定化するためのカップが含まれる。採集した材料、紙、布、カップ等は、任意には試料の変性または不可逆的吸着を避けるために処理される。採集した材料はまた、保存剤、安定剤または抗菌剤で処理またはそれらが加えられ、試料の不変性を保つ助けとする。外科手術または針バイオプシーで得られた試験試料の採集、安定化および保存用に設計されたキットも有用である。全てのキットは２つの成分に分けられると考えられる。一方は試料の採集と輸送用、他方は試料の分析用である。さらに、試料の採集、安定化および保存用のキットは訓練されない要員による使用のための形をとり、家庭で使用するために商店で入手可能で、試験試料の分析のため実験室へ運ばれる。Ｅ．ｃｏｌｉ（クローン７００４１５および３８４３８７）はＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）− １２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２−に１９９６年１２月２３日にＢｕｄａｐｅｓｔＴｒｅａｔｙの条件下で寄託され、寄託日付から３０年間、または寄託依頼の最後の日付から５年間、またはＵＳ特許有効期限の間、いずれか長い期間保存される。本明細書記載の寄託微生物および他の寄託物は単に便宜上提供されるものであり、本明細書に記載された観点で本発明を実施し得るためには必要とされない。寄託された全材料中のｃＤＮＡ配列は、本明細書に参照して取込まれる。クローン７００４１５および３８４３８７はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号が付けられる。本発明を実施例を挙げて記載するが、それは説明のためであり、本発明の範囲を限定するものではない。実施例実施例１：ヒトエンドスルフィンの全長ｃＤＮＡの単離ブタ脳エンドスルフィンの４個の部分アミノ酸配列(Ａ．Ｖｉｒｓｏｌｖｙ− Ｖｅｒｇｉｎｅら、（１９９６）前出)を、ヒトエンドスルフィン配列に対するＬｉｆｅＳｅｑ^TMヒト発現データベース（ＩｎｃｙｔｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）を検索するための単一コンセンサスアミノ酸配列を作成するために用いた。コンセンサス配列は４個のブタ部分配列をウシＡＲＰＰ１９(Ｊ．Ｇｉｒａｕｔら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：１１２４−１１３３（１９９０）)のアミノ酸配列と並べ、部分配列の間のギャップを文字「ｘ」（ｘは未知のアミノ酸を現す）で埋めて作成した。コンセンサス配列で行った検索（ＢＬＡＳＴおよびＳｍｉｔｈＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて）は、ウシＡＲＰＰ１９およびブタ∝エンドスルフィンに関連する数個のＥＴＳを同定した。ＥＳＴのオーバーラップ領域を並べ、他の同定されたＥＳＴ(すなわちクローン３８４３８７および７００４１５)に対し最も多い５'配列を有する２個のＥＳＴ由来のクローンを、以後の実験のために選んだ（図１参照）。クローン３８４３８７および７００４１５のｃＤＮＡをバクテリア中で増幅し、完全に配列決定した（配列番号：１および配列番号：２）。各クローンの導かれたアミノ酸配列は、クローン７００４１５がポリペプチドの１１７アミノ酸（配列番号：３）をコードし、クローン３８４３８７がポリペプチドの１２１アミノ酸（配列番号：４）をコードすることを示した。さらに、双方のアミノ酸配列は、オーバーラップ領域においてウシエンドスルフィンおよびコンセンサスブタ ∝エンドスルフィンの報告された部分配列と１００％相同性を示した。２つのタンパク質の計算による分子量は１２、９７５および１３、３８９Ｄａであり、ブタエンドスルフィンで得られた値（マススペクトル法で測定して１３、１９６Ｄａ、前出Ｖｉｒｓｏｌｖｙ−Ｖｅｒｇｉｎｅら、（１９９６）参照）と一致した。ヒトエンドスルフィンをコードする２個の全長クローンが同定されたかどうかを決定するため、ｃＤＮＡ挿入部それぞれを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）中にサブクローニングし、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）より購入したＴＮＴカップル網赤血球溶血液転写／翻訳キットを用いて³⁵Ｓ−メチオニンの存在下でタンパク質を製造した。製造したペプチドは、見かけ分子量１８ｋＤＡ（１０％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびオートラジオグラフィーにより測定、図４参照）を有することが分かり、ブタエンドスルフィンについてのＶｉｒｓｏｌｖｙ−Ｖｅｒｇｉｎｅらの結果と一致した（Ｖｉｒｓｏｌｖｙ−Ｖｅｒｇｉｎｅら、（１９９６）、前出）。我々の結果は、配列解析で同定されたＡＴＧ開始コドンは標準エンドスルフィン開始コドンであることを示唆した。実施例２：２個のヒトエンドスルフィン転写産物の同定２個のエンドスルフィンクローンのヌクレオチド配列と、それぞれから導かれたポリペプチドとを相互に比較し、配列の相同性を決定した。導かれたアミノ酸配列の比較に基づき、２個のクローンは、クローン７００４１５がクローン３８４３８７より少ないアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることを除き、基本的に同一のポリペプチドをコードしていることが分かった。ヌクレオチド配列の比較解析は、これらのクローンがクローン３８４３８７（図２の上鎖のヌクレオチド位置１０７（ＡＴＧの"Ａ"）からヌクレオチド位置４５７と、下鎖のヌクレオチド位置１０７からヌクレオチド位置４６９を比較）の最後の４個のアミノ酸をコードする以外は、同一のコード領域を有することを明らかにした。しかしながら、３'非翻訳領域（３'−ＵＴＲ、図２で停止コドン（太字ＴＡＡおよびＴＧＡ）から各配列の末端）は僅か３７％の同一性を示した。これらの観察は、ヒトでエンドスルフィンは、異なったｍＲＮＡでコードされる少なくとも２個の異なったイソフォームで存在し得ることを示唆した。２個のＥＳＴのうちの１個が生来のエンドスルフィンｍＲＮＡであるよりはクローニング人工産物であるということを除外するため、各クローンの存在を生成物のサイズで区別すると思われるプライマーを作成した（逆転写ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）で用いるため）。ｒｔ−ＰＣＲに用いられたプライマーの配列を下の表１に示す。配列番号：５は双方のクローンの同一領域へハイブリダイズするように設計され（すなわち、コード領域内に、図５参照）、配列番号：１および配列番号：２双方のヌクレオチド位置２７１−２９０に相当する。配列番号：６および配列番号：７はクローン７００４１５および３８４３８７の３'−ＵＴＲにハイブリダイズするように設計され（図５参照）、配列番号：１のヌクレオチド位置９０４ −９２３、および配列番号：２のヌクレオチド位置６１７−６３５に対応する。このような設計の結果、３６５ｂｐのヌクレオチド産物が配列番号：５および配列番号：７プライマーによるクローン３８４３８７の増幅から生成すると期待された。それと対照的に、配列番号：５および配列番号：６によるクローン７００４１５ｃＤＮＡの増幅は６５３ｂｐのヌクレオチド産物を生成すると期待された。プライマーセットが実際にこれらのサイズのＰＣＲ産物を生成するかどうかを確認するため、ＰＣＲ反応を最初に対応する鋳型ＤＮＡを有するプライマーセットを用いて、標準ＰＣＲ条件で行った（全反応容積５０μＬ中、２００μＭの各ｄＮＴＰ（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ）、０．４μＭの各プライマー（０．４μＭの配列番号：６または配列番号：７を有する０．４μＭの配列番号：５）、２５０ｎｇの鋳型ＤＮＡおよび１ユニットのｐｆｕ酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を含む）。ＰＣＲ反応開始前に鋳型ＤＮＡを９４℃で５分間変成させた。増幅は全体で４０サイクル行い（１サイクル＝９４℃、３０秒、５５℃ 、４５秒および７２℃、２分）、最後に７２℃で２分間の１回の伸長工程を行った。陰性コントロールとして、各プライマーを上記のように増幅したが、鋳型として反対のクローンを用いた。期待通り、プライマー配列番号：５および配列番号：７を用いる配列３８４３８７の増幅は、約３６５ｂｐの産生物を生成した（図６、左側の写真、レーンＤ）が、プライマー配列番号：５およびプライマー配列番号：６を用いる配列７００４１５ｃＤＮＡの増幅は、約６５３ｂｐの産生物を生成した（図６、左側の写真、レーンＡ）。対照的に、プライマー配列番号：５およびプライマー配列番号：７を用いて配列７００４１５ｃＤＮＡを増幅した場合、またはプライマー配列番号：５およびプライマー配列番号：６を用いて配列３８４３８７ｃＤＮＡを増幅した場合は産生物は得られなかった（図６、左側の写真、レーンＢおよびＣ）。これらの結果は、各プライマーセットが特異的にその対応する鋳型にハイブリダイズし、他の鋳型にはハイブリダイズしないことを示す。次に様々な脳領域および腎臓からのヒトｐｏｌｙＡ⁺ＲＮＡによるｒｔ−ＰＣＲ実験に２個のプライマー対を用い、２個の転写体が検出可能かどうかを調べた。試験した全ての組織につき、ｐｏｌｙＡ⁺ＲＮＡを８０℃で５分間変成させ、次いでランダム６量体（プライマー）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて３７℃で１時間、逆転写した。双方のプライマーセットに対する鋳型として各組織からのＤＮＡを用い、上記の通りＰＶＲを行った。ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−アセテート−ＥＤＴＡ）緩衝液中の１．２％アガロースゲル電気泳動でＰＣＲ産物を分離し、エチジウムブロマイド／ＴＡＥ（０．５μｇ／Ｌ）溶液で染色後ＵＶ蛍光で検出した。図６の右側の写真が示す様に、脳（レーン１および６）、小脳（レーン２および７）、胎児脳（レーン３および８）、膵臓（レーン４および９）および黒質（レーン５および１０）からのｃＤＮＡを増幅すると３６５ｂｐ（レーン６−１０）および６５３ｂｐ（レーン１−５）産生物が生成した。このデータから、これらの組織中に少なくとも２個のヒトエンドスルフィンに対する転写産物の存在が確認された。Ｐｅｐｔｉｄｅｓｏｒｔプログラム（ウィスコンシンＧＣＧプログラム、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉ）を用いて、予想される等電点はより短い形で８．９（クローン７００４１５でコード）、より長い形で７．５（クローン３８４３８７でコード）であることが分かった。より短い形はエンドスルフィンＡ、より長い形はエンドスルフィンＢと名付けられた。実施例３：ヒト組織中でのエンドスルフィン転写産物の存在位置公知の技術ノーザーンブロッティングによりメッセンジャーＲＮＡが検出され、特定の組織内でそのサイズの合理的な見積りと定常状態でのレベルが得られる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。ＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｅｒｎＢｌｏｔｓＣｌｏｎｔｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）より購入し、エンドスルフィンｃＤＮＡの最初の１９０ヌクレオチド(ヌクレオチド位置１〜ヌクレオチド位置１９０)に対応するエンドスルフィンｃＤＮＡとプローブした。フラグメントを、市販ラベルキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ）を用いるランダムプライミングにより、比活性１．１×１０⁹ｃｐｍ／ｍｇＤＮＡで∝³²Ｐ−ｄＣＴＰでラベルした。ブロット（膜）を６０℃で１時間、発現Ｈｙｂ溶液（キット付属）中でプレハイブリダイズし、２×１０⁶ｃｐｍ／ｍＬの変性プローブの存在下に同じ温度で２時間ハイブリダイズ（同様に発現Ｈｙｂ溶液中で）した。プローブを２回、２×ＳＣＣ＋０．５％ＳＤＳ中で洗浄（各洗浄は２０分）、厳密な条件で２回（各洗浄０．１×ＳＣＣ＋０．０１％ＳＤＳ、５０℃、２０分）洗浄後、フィルターをホスフォリマーガースクリーンに暴露した。適当なサイズ１．５および３．５ｋｂの２個のメッセージが検出された（図７参照）。小さなメッセージ（１．５ｋｂ）が測定した全ての組織中に存在したが、肝臓と皐丸では極端に低いレベル、肺ではほとんど検出できなかった。大きなメッセージ（３．５ｋｂ）が測定したほとんどの組織でより低いレベルで発現していたが、骨格筋（最高発現レベル）と睾丸歯例外で、白血球、肺および肝臓では検出できなかった。これらの結果は、エンドスルフィンに対するｍＲＮＡ種が多様な組織に存在することを示唆した。さらに、異なる組織中の２種のメッセージの相対量の差は、転写が異なって制御されていることを示唆した。実施例４：リボヌクレアーゼ保護分析また、実施例記載の通りノーザーンブロットを行う代わりに、またはそれに加えて、リボヌクレアーゼ保護分析を以下のように行った。Ａ．相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブのラベルラベルされたセンスおよびアンチセンスリボプローブを、ＳＰ６またはＴ７等のＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＥＳＴ配列から転写する。配列は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含む適当なＥＳＴ挿入部を含有するベクター、またはＰＣＲプライマーを用いる挿入部のＰＣＲ生成産物由来である。転写産物を１μｇのＤＮＡ鋳型。２μＬの１００ｍＭジチオトレイトール、０．８μＬのＲＮａｓｉｎ（１０−４０Ｕ）、各５００μＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、５μ Ｌの（α³²Ｐ）ＵＴＰまたは１００−５００ｐＭのビオチン化ＵＴＰ、および転写緩衝液（４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、６ｍＭＭｇＣｌ₂、２ｍＭスペルミジンＨＣｌ、５ｍＭＮａＣｌ、中の１μＬのＲＮＡポリメラーゼを含む反応容積２０μＬで調製する。３７℃で１時間インキュベート後、転写産物をＤＮａｓｅ（１５Ｕ）でさらに３０分間処理し鋳型を消化する。次にプローブを公知のスピンカラム、塩析または電気泳動法で単離する。最後に、プローブを溶菌緩衝液中に溶解する（５Ｍグアニジンチオシアネート、０．１ＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）。Ｂ．ラベルプローブの標的へのハイブリダイゼーションＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）記載通り調製した約２０μｇの抽出全細胞ＲＮＡを１０μＬの溶菌緩衝液中に入れ、それぞれ２μＬの溶菌緩衝液中の（ｉ）１×１０⁵ｃｐｍの放射性ラベルプローブまたは（ｉｉ）２５０ｐｇの非放射性同位元素ラベルプローブと混合する。混合物を６０℃で５分間インキュベートし、室温で終夜インキュベートする。Ｔ．Ｋａａｂａｃｈｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２：２２５−２３０（１９９５）参照。Ｃ．ＲＮａｓｅ消化１ｍＭＥＤＴＡ、３００ｍＭＮａＣｌ、３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４中の４０μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡおよび６２５Ｕ／ｍＬのＲＮａｓｅＴ１を含む溶液３８０μＬと室温で４５〜６０分インキュベートしてハイブリダイゼーションを停止する。ＲＮａｓｅ消化を３．３％ＳＤＳを含む６０μＬのプロテアーゼ−Ｋ（１。７ｍｇ／ｍＬ）を加えて停止し、次いで３７℃で３０分間インキュベートする。消化混合液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出してタンパク質を除く。ｍＲＮＡ：ｃＲＮＡハイブリッドを水相から４μｇの酵母ｔＲＮＡおよび８００μＬのエタノールを加え、−８０℃で３０分間インキュベートして沈殿させる。沈殿を遠心で集める。Ｄ．フラグメント解析沈殿を５μＬの変性ゲルローディング染料（８０％ホルムアミド、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１ｍｇ／ｍｌキシレンシアノール、１ｍｇ／ｍＬブロモフェノールブルー）に溶解し、６％ポリアクリルアミドＴＢＥ、８Ｍ尿素変性ゲル中で電気泳動する。ゲルを真空で乾燥しオートラジオグラフィーを行う。試料から得られたカウントを、センス鎖である補正用試料を用いて作成された補正曲線と比較して定量を行う。非放射同位元素ラベルを用いた場合は、ブロティングによりハイブリッドをゲルから膜（ナイロンまたはニトロセルロース）に転写し、ストレプタビジン−アルカリホスファターゼ複合体およびケミルミネッセンスまたはケミフルオレッセンス試薬を用いる検出システムを用いて分析する。ここでも、特定の組織中でラベルプローブをもちいて検出できるｍＲＮＡの発現は、エンドスルフィンが組織中で生成されることを示唆している。実施例５：エンドスルフィンファミリーの追加メンバーの同定上記実施例３記載のノーザーンブロット法は、メッセージが大きく異なるサイズ（１００〜２００ヌクレオチド以上）を有する場合のみ明瞭なメッセージを検出可能で、メッセージサイズの差が小さい場合（コード領域における交互スプライシングから生じる様な）はこの方法では検出されない。その代わりに、エンドスルフィンメッセージの可能な突然変異体を検出するために異なった戦略が用いられ、その定常状態レベルが測定される。コード領域のスプライス突然変異体は、小さいサイズの生成物を与えるように設計されたｒｔ−ＰＣＲで検出し得る。エンドスルフィンの場合は、コード領域は十分に小さく（３５１〜３６３ｂｐ）、１回の実験で各末端のプライマーでカバーできる。３'ＵＴＲにおける突然変異体もｒｔ−ＰＣＲで検出できる。ｒｔ−ＰＣＲでは、今までに知られる全てのメッセージ突然変異体に共通であるＯＲＦ領域で、停止コドンに出来るだけ近く前方プライマーが選ばれる。逆プライマーは、特異性のためにジヌクレオチドでアンカーされたオリゴｄＴである。アンカーの第１ヌクレオチドはＡ、ＣまたはＧであるので、第２ヌクレオチドはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれかであり、１２組のアンカーされたプライマーの組み合わせが必要である。従って各逆プライマーは、１２組の異なった反応中の独自の前方プライマーと共に使用される。ＰＣＲ産生物はアガロースゲル中で展開し、エチジウムブロマイド染色後ＵＶ蛍光で検出される。その高い感度と選択性のため、この方法により３'ＵＴＲ中の小さなサイズおよび配列変化検出でも検出可能である。実施例６：ドットブロット／スロットブロットドットおよびスロット分析は、核酸の複雑な混合物中の特異性核酸配列を評価する迅速法である。実施する場合は、２０μｇまでのＲＮＡが５０μＬの５０％ホルムアミド、７％ホルムアルデヒド、１×ＳＳＣと混合し、６８℃でインキュベートし氷上で冷却される。次いで１００μＬの２０×ＳＣＣをＲＮＡ混合物に加え、真空で調整済みニトロセルロースまたはナイロン膜を有するマニホールド装置に設置される。膜を水、２０×ＳＣＣに１時間浸し、２枚の２０×ＳＣＣプレウエットＷｈａｔｍａｎ＃３濾紙の上に置き、スロットブロットまたはドットブロット真空マニホールド装置中に設置する。スロットブロットは調製済みプローブで解析し上記実施例４と同様にラベルされる。実施例３−５に特に詳細に述べられなかった他の方法と緩衝液は、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されている。実施例７：原位置ハイブリダイゼーションこの方法は検出可能ハイブリダイゼーションプローブを用いて、細胞中の特異性標的核酸を直接検出するのに有用である。細胞ＲＮＡを最大限に保持するため、組織をパラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド等の架橋固定試薬を用いて調製する。Ｌ．Ａｎｇｅｒｅｒら、ＭｅｔｈｏｄｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌ．３５：３７−７１（１９９１）参照。簡単に言えば、組織を５容積以上の５０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ７．５の１％グルタルアルデヒド中に４℃で３０分間置く。３０分間以上の固定を行うためには、溶液を新しい液と交換する。固定液は約０．３７５％ＮａＣｌの浸透圧を有する必要がある。組織を等張ＮａＣｌで１回洗い燐酸塩を除去する。固定した組織を以下のようにパラフィンに埋め込む。組織を一連のエタノール濃度で脱水する：５０％で２回、７０％で２回、８５％、９０％および１００％で２回。次に組織をキシレンを２回交換して室温でそれぞれ２０分ずつ浸し、次いで６０℃で２０分間、キシレンに１回、パラインに１回、合計２回交換して浸し、次いで最終的にパラフィンを３回交換してそれぞれ１５分間ずつ浸す。次に組織を標準のミクロトームを用いて５μｍの切片に切り、組織接着剤３− アミノプロピルトリエトキシシランであらかじめ処理したスライド上に置く。キシレンに１０分間浸してパラフィンを組織から除去し、一連のエタノール濃度で再水和する：９９％２回、９５％、８５％、７０％、５０％、３０％および蒸留水２回。切片を０．２ＭＨＣｌで１０分間前処理し、２μｇ／ｍＬプロテアーゼＫで３７℃、１５分間処理し浸透性にする。エンドスルフィンｃＤＮＡフラグメントを含むｐＳＰＯＲＴ１プラスミドから転写したラベルリボプローブを、２×標準生理食塩水抽出物と５０％ホルムアミド中、５６℃で終夜、調製した組織切片にハイブリダイズする。過剰のプローブを２×標準生理食塩水クエン酸および５０％ホルムアルデヒドで洗浄して除去し、次いで１００μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅＡで３７℃、３０分間消化する。ＵＶ光で照射すると顕微鏡下で蛍光プローブが見える。細胞質中の蛍光はｍＲＮＡ産生を示している。核中の蛍光は遺伝子材料の存在を検出する。また、切片をオートラジオグラフィーで見ることもできる。実施例８：エンドスルフィンＡおよびＢのバクテリア発現および精製Ａ．エンドスルフィンＡおよびＢをコードするＤＮＡフラグメントを含む発現ベクターの構築：エンドスルフィンＡおよびＢをコードするＤＮＡフラグメントを、クローン７００４１５および３８４３８７を鋳型ＤＮＡとして用い、以下のプライマーを用いて原核細胞発現ベクターｐＰｒｏＥｘＩ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、ＭＤ）中に導入するためＰＣＲで作成した。フレーム内翻訳および方向性ライゲーションを行うため、５’前方プライマー（配列番号：８）を合成してＡＴＧ開始コドンのすぐ上流にＥｈｅＩ制限部位を作成した（太字および下線で示す）。同様に、各逆プライマー（エンドスルフィンＡ用に配列番号：９およびエンドスルフィンＢ用に配列番号：１０）を合成してＴＴＡおよびＴＣＡ停止コドンそれぞれのすぐ下流にＳａｌＩ反応部位（同様に太字および下線で示す）を作成した。実施例と同様にＰＣＲを行った。増幅後、ＰＣＲ産物をＥｈｅＩおよびＳａｌＩで消化、ゲル精製、および標準ライゲーション技術（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出参照）を用いてｐＰｒｏＥｘＩにライゲートした（同じ制限酵素で前もって消化）。Ｅ．ｃｏｌｉ∝細胞をライゲーション混合物で形質転換し、アンピリンを含む培地で選択した。プラスミドＤＮＡを個々のクローンから調製し、エンドスルフィンＡおよびＢが正しい配置であることを確認するためＰｖｕＩＩを用いて制限酵素分析を行った。Ｂ．Ｈｉｓ−タグエンドスルフィンＡおよびＢの精製：ｐＰｒｏＥｘＩ発現系で、所望の部分をタンパク質の上流に融合した６個のヒスチジン残基残基のタグを用いて作成した。従って、クローン化エンドスルフィンＡおよびＢ遺伝子を含むｐＰｒｏＥｘＩベクターは、ニッケル錯体樹脂に対するアフィニティークロマトグラフィーで精製できるｈｉｓ−タグエンドスルフィンＡまたはＢの融合タンパク質を製造すると期待される。精製のための融合タンパク質を作成するため、組み換えバクテリア（エンドスルフィンＡまたはＢ発現ベクターを有する）を２２５ｒｐｍのロータリーシェーカー上、３７℃で、５０μｇ／Ｌアンピシリン（ＬＢ＋ａｍｐ）を含むＬｕｒｉａブロス中で終夜生育させ、新鮮なＬＢ＋ａｍｐ（３００ｍＬ）を１：１０の希釈で接種するために用いた。新鮮な培養液を２２５ｒｐｍで振とうし３７℃で１時間インキュベートしイソプロピルβ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、１ｍＭ）で誘導し、さらに３時間再インキュベートした。培養液を５０００ｒｐｍで遠心しバクテリアをペレットにした。ペレットを１％ＴＲＩＴＯＮ−Ｘを含む１０ｍＬの溶菌緩衝液（５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、０．３ＭＮａＣｌ、１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）および０．２ｍＭベンズアミド）に４℃ で再懸濁し、９０％以上の細胞が溶菌するまで（ＯＤ₅₉₀で測定して）氷上で超音波処理した。超音波処理後、細胞破片および未溶菌細胞を４℃で１０分間、１０、０００ｒｐｍで延伸して除去した。得られた上澄液を、０．１％のＴＲＩＴＯＮ−Ｘ１００を含む１０倍ベッド容積の溶菌緩衝液で前もって平衡した、３ｍＬベッド容積のニッケル−トリ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）カラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）に載せた。カラムを１０倍ベッド容積の洗浄緩衝液（５０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ６．０、０．３ＭＮａＣｌおよび０．１％ＹＲＩＴＯＮ−Ｘ１００）および同じ緩衝液中の１０倍ベッド容積の５０ｍＭイミダゾールで順次洗浄した（非特異的に結合したタンパク質を除去するため）。ｈｉｓ−タグエンドスルフィン融合タンパク質を、０．２Ｍイミダゾールを含む５倍カラム容積の洗浄用緩衝液でカラムから溶出し、２ｍＬフラクションで集めた。溶出した各融合タンパク質の純度を、Ｃｏｏｍａｓｉｅブルーで染色した１３．５％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に評価した（図８）。各組み換え融合タンパク質の相対吸光度を測定後、タンパク質濃度を２８０ｎｍの吸光度で測定した。実施例９：真核細胞中へのエンドスルフィンＡおよびＢのクローニングと発現エンドスルフィンＡおよびＢｃＤＮＡをその母体ベクター（ｐＳＰＯＲＴ１、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤおよびＰＢＳ−ＳＫ＋、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏ１ｌａ、ＣＡ）からＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩによる消化し（エンドスルフィンＡ用）およびＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ（エンドスルフィンＢ用）で切断し、それぞれ１．１５ｋｂおよび１．２５ｋｂのフラグメントを作成した。各フラグメントをゲルで精製し、あらかじめ同じ酵素で切断した哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）中へライゲートした。ライゲートされたＤＮＡはＥ．ｃｏｌｉＤＨ∝細胞中へ形質移入し、組み換えクローンをアンピシリン耐性について選択した。プラスミドＤＮＡをそれぞれのクローンから調製し、正しい配向のエンドスルフィンＡおよびＢ挿入ＤＮＡを含む組み換えクローンを同定するために制限酵素分析を行った。２個のこのようなクローンが見出され、ｐＣＭＶＥｓＡ２（エンドスルフィンＡ用）およびｐＣＭＶＥｓＢ５（エンドスルフィンＢ用）と名付けられた。哺乳動物細胞中のエンドスルフィンＡおよびＢの発現は、リポフェクション等の公知の方法で行われる。リポフェクションを行うためには、細胞（ＨＥＫ２９３等）を１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび０．２５ｍｇ／ｍＬのアンホテリシンＢを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの変更Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ１６４０培地等（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の適当な生育培地中の組織培養プレート中で、生育に適した条件下（３７℃で５％ＣＯ₂を含む加湿雰囲気）で約５０％〜６０％集密度まで生育させた。その後、約１〜２×１０⁶細胞を５ｍＬＯｐｔｉｍｅｎ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中のＤＮＡ（１．５ｍｇ）およびリポフェクタミン（２０ｍｇ）の混合物で１００ｍｍのディッシュ内で形質移入し、４８時間インキュベートした。細胞は新鮮な生育培地中で１：１０または１：２０に***し、上記の通り再度インキュベートした。細胞がプレートに付着した後、ネオマイシン耐性クローンを選択するため生育培地を選択培地（４００〜５００μｇ／ｍＬの抗生物質ゲネクチンを含む生育培地）と交換した。次いで細胞を上記標準生育条件下に２〜３週間、選択培地を定期的に交換しインキュベートし、その後抗生物質耐性クローンをその後の展開と分析のため取り上げた。実施例１０：エンドスルフィンＡおよびＢの合成ペプチドの製造合成ペプチド配列を、アミノ酸１−２７を含むヒトエンドスルフィンＡおよびＢの保存Ｎ−末端領域から選択した。ペプチドはＡＢＩペプチド合成器（ＡｐｐｌｌｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡより市販）モデル４３１Ａで合成した（例えばＳｔｅｗａｒｔ、Ｊ．Ｍ．およびＹｏｕｎｇ、Ｄ．Ｊ．、「固相ペプチド合成」、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎＣｏ．、ＳａｎＦｒａｎｓｉｓｃｏ、１９６３年参照）。簡単に言えば、ペプチド配列を、生長しつつあるペプチド鎖に１個以上のアミノ酸または適当に保護したアミノ酸を順序カップリングすることにより、樹脂（クロモメチルポリスチレン−ジビニルベンゼン）上で合成した。樹脂からペプチドの切り出し、および最終的なペプチドの脱保護は、樹脂を２０ｍＬのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、０．３ｍＬの水、０．２ｍＬのエタンジオール、０．２ｍＬのチオアニソールおよび１００ｍｇのフェノールに加え、室温で１．５時間攪拌して行われた。ついで樹脂を吸引濾過し、ＴＦＡ溶液のエーテル沈殿および濾過でペプチドを得た。水／アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ勾配と凍結乾燥を用いて各ペプチドを逆相調製ＨＰＬＣで精製した。生成物をマススペクトルで確認した。実施例１１：エンドスルフィンＡおよびＢに対するポリクローン抗体の製造Ａ．免疫化抗原の調製：精製された合成ペプチドを実施例１０記載通り調製した。免疫用の抗原を作成するため、精製ペプチドをＩｍｊｅｃｔ活性免疫源コンジュゲートキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌ）を用い、メーカーの指示書に従ってＫｅｙｈｏｌｅＬｉｍｐｔｅｔＨｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とコンジュゲートした。Ｂ．免疫化プロトコル：ポリクローン抗血清をＢｅｒｋｅｌｅｙＡｎｔｉｂｏｄｙＣｏｍｐａｎｙ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）のプロトコルを用いて作成した。最初の免疫化を行う前に、免疫前血液（５ｍＬ）の試料を少なくとも２匹のウサギそれぞれから採血した。その後、各ウサギに一定量の完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中のＫＬＨ−コンジュゲートペプチド（２００〜５００μｇ）を皮下注射した。２１日後、免疫反応は２回目の不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中のＫＬＨ−コンジュゲートペブチド（１００〜２５０μｇ）の注射で急上昇した。３１日目に血液（５０ｍＬ）を採血し、ＢＳＡ−カップルペプチドに対する血清の反応性を酵素リンク免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）を用いて試験した。ＫＨＬ−コンジュゲートペプチドによるその後の上昇は、４２日、６３日、および８４日目に得られ（注射後＃１）、生産血液（５０ｍＬ）を５２、７３および９４日目に採血し、上記の方法でＥＬＩＳＡで試験した。血清を使用するまで−２０℃で保存した。実施例１２：エンドスルフィンＡおよびＢによるＡＴＰ感受性カリウムチャネルの調節Ａ．精製エンドスルフィンＡおよびＢによる［³Ｈ］−グリブリド結合の阻害：スルフォニル尿素レセプターとエンドスルフィンＡおよびＢとの間の相互作用を調べるため、実施例８で調製したｈｉｓ−タグエンドスルフィンＡおよびＢ融合タンパク質を用いて競合実験を行った。一定量（１５０μｇ）の脳Ｐ２膜（ＡＢＳＩｎｃ．（Ｗｉｌｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）より入手、）を２２℃で６０分間、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２中で０．３２ｎＭの［³Ｈ］−グリブリドの存在下、非ラベル組み換えエンドスルフィンＡおよびＢの濃度を増加させて（０．０１ｎＭ−１０ｍＭ）インキュベートした。結合［³Ｈ］−グリブリドをＳｋａｔｒｏｎＣｅｌｌＨｅｒｖｅｓｔｅｒ（ＳｋａｔｒｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）上のＧＦ／Ｂフィルターによる濾過で測定し、ＬＫＢＷａｌｌａｃＩｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）シンチレーションカウンターモデル番号１２０５でシンチレーション計数した。Ｂ．ルビジウム流出分析：エンドスルフィンＡおよびＢが⁸⁶Ｒｂ⁺流出調節能を組み換え体ＳＵＲ／Ｋｉｒ組を安定に発現する細胞株またはＡＴＰ感受性Ｋ＋チャネルを発現することが既に知られている細胞株（ＲＩＮ５ｍＦ、βＴＣまたはＨＩＴ細胞等）で測定する。エンドスルフィンＡまたはＢがＡＴＰ感受性Ｋ＋チャネルの阻害剤であるか活性剤であるかを決定するため、細胞に⁸⁶ＲｂＣｌ₂を負荷し、⁸⁶ＲｂＣｌ₂の流出の阻害または誘導を分析する。双方の場合、細胞培養および⁸⁶ＲｂＣｌ₂の負荷は同じ方法でおこなわれる。簡単に言えば、細胞（一般的にはＲＩＮ５ｍＦ細胞；Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．より入手、１２３０ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を２４ウエルプレートにプレートし、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン／０．２５ｍｇ・ｍＬアンフォテリシンおよび２ｍＭＬ−グルタミンを補充した適当な培地中（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）に３７℃で１０％ＣＯ２の加湿雰囲気中に維持した。細胞が分化し集密単層を形成したとき、古い培地を０．１μＣｉ⁸⁶ＲｂＣｌ₂（ＮＥＮ−Ｄｕｐｏｎｔ、Ｗｉｌｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）／ウエルを含む培地と交換し、３７℃で５時間インキュベートした。１．エンドスルフィンＡまたはＢによる⁸⁶Ｒｂ⁺流出の活性化： ⁸⁶ＲｂＣｌ₂含有培地を吸引で除去し、細胞単層を取り込まれない⁸⁶ＲｂＣｌ₂を除くため２０ｍＭのＨｅｐｅｓＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１２０ｍＭＮａＣｌ、７ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ₂、１ｍＭＭｇＣｌ₂、３０ｍＭウアバイン（）を含む緩衝液で２回洗浄する。エンドスルフィンＡおよびＢを含む同じ緩衝液を２１０μＬの容積で単層に加え、加湿雰囲気で３０分間インキュベートする。細胞上澄に存在する放射線活性を１４４０Ｗｉｚａｒｄ自動ガンマ線カウンター（Ｗａｌｌａｃ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、ＭＤ）によるガンマ線計数で１分間定量する。結果を対照試料に対し解析する。２． ⁸⁶ Ｒｂ⁺ 流出の阻害：６ｍＭグルコースの存在で細胞を⁸⁶ＲｂＣｌ₂ に負荷し、代謝阻害剤−１ｍＭ２−デオキシグルコースまたはオリゴマイシン（０．２４μｇ／ｍＬ）−で処理しエンドスルフィンＡおよびＢの存在、または不在下に⁸⁶ＲｂＣｌ₂流出を３０分間誘発する。流出をガンマ線計数で上記の通り定量する。実施例１３：エンドスルフィンＡまたはＢによるグルタメート処理ニューロンのニューロプロテクションＡ．１次細胞培養：海馬および皮質一次培養を妊娠１８日のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット胎児（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から調製する。胎児を子宮から摘出し、頭部を切断しその頭部をＬｅｉｂｏｖｉｚＬ−１５培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を含む１００ｍｍ解剖皿に置く。各頭部から脳を摘出し、血管と脳膜を除去する。皮質培養調製物では、脳から皮質のみを摘出しその後の処理に用いる。海馬培養では、大脳半球を間脳および脳幹から分離し、各半球から海馬を摘出する。組織を１５ｍＬの円錐試験管に移し、等容量のトリプシン（０．２５％、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を加え、溶液を３７℃で１５分間インキュベートする。細胞を２００ｇで１５分間ペレット化し上澄をデカントしてトリプシンを除く。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）／２５ｍＬグルコース／４ｍＭグルタミン／５０ユニット／ｍＬペニシリン：ストレプトマイシン／Ｂ２７を補充した５ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ変更Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）を加えた後、ペレット化した細胞を砕いて分散させる。次に細胞懸濁液を１４３ｍｍナイロン膜を通し、トリパンブルー染色細胞を数えて細胞濃度を測定する。次に細胞を５０，０００細胞／ウエルの密度で９６ウエルマイクロタイタープレート（使用前にポリＬ −リジン（０．０３３ｍｇ／ｍＬ）プレコートおよび滅菌水洗浄）にプレートし、１０％ＣＯ₂の加湿雰囲気中に３７℃で維持する。２４時間後、ＦＣＳ補充ＤＭＥＭを除去しＦＣＳのない補充ＤＭＥＭと交換する。Ｂ．ニューロプロテクション分析：生体外に５〜６日置いてから培地を除去し、１ｆＭ〜１ｍＭの範囲の濃度の試験化合物（エンドスルフィンＡまたはＢ等）を含む補充ＤＭＥＭ／Ｎ２で置換する（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。２時間インキュベート後、７．２ｍＭのＣａＣｌ₂と１ｍＭのＬ−グルタミンを含む等容積の補充ＤＭＥＭ／Ｎ２を各ウエルに加え（最終濃度＝ＣａＣｌ₂ ３．６ｍＭおよびＬ−グルタミン５００μＭ）、細胞を１５分間再インキュベートする。溶液を除き、補充ＤＭＥＭ／２Ｎで置換し、細胞を２４時間再インキュベートする。神経の死を、培地に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の量を測定するＣｏｙｔｏｔｏｘ９６^TM 分析キット（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて定量する。この酵素はテトラゾリウム塩を、溶菌した細胞の数に比例する量の赤いフォルマゼン生成物（４９０ｎｍでスペクトロフォトメーターで測定可能）に変換する。基礎ＬＤＨ放出量は、１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による細胞溶解に伴うＬＤＨ放出率として計算され、通常は全ＬＤＨ放出の５〜１０％となる。細胞のグルタメート処理は通常、基礎レベルに対して２〜３倍の増加となる。試験化合物に暴露した細胞に対して測定した全てのＬＤＨ放出値を、各プレート上の最大値（１００％）としての５００μＭグルタメート誘発死に対して正規化する。グルタメートの影響からニューロンを保護する化合物に暴露したＬＤＨ値は、対照ＬＤＨ値より低くなる。実施例１４：ヒトエンドスルフィンＡまたはＢによるインスリン放出の調節エンドスルフィンＡまたはＢのインスリン放出調節能を、まず、有為の量のインスリンを放出することが既に知られている細胞で評価した（例えば形質移入マウスインスリノーマ由来のβＴＣ細胞（Ａ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．、１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ））。第２に、エンドスルフィンＡまたはＢのインスリン分泌刺激能を、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞（ラットインスリノーマ由来）等の低レベルのインスリンを分泌する細胞で評価する。最後に、アンチセンスを用いてこれらの細胞中に発現するエンドスルフィンＡまたはＢのレベルを減少させて、βＴＣ細胞からのインスリン分泌におけるエンドスルフィンＡまたはＢの役割をさらに評価する（実施例１６参照）。Ａ．細胞培養：双方の名前の細胞株は、２５ｍＭのグルコース、を含み１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ変更Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で日常的に生育する。密集した細胞を毎週１：４の継代培養に分け、培地を週に２回交換する。Ｂ．インスリン分泌細胞を１２ウエル培養ディッシュ（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）中にプレートする。細胞が７０〜９０％密集する、プレート後４〜６日に実験を行う。培地を新鮮な培地に交換してから１６時間後に分泌実験を行う。実験を行うため、培地を除き、細胞をＨＥＰＥＳ−緩衝Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ（１１９ｍＭＮａＣｌ、４。７４ｍＭＫＣｌ，２．５４ｍＭＣａＣｌ₂、１．１９ｍＭＭｇＳＯ₄、１．１９ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、２５ｍＭＮａＨＣＯ₃、１０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４、および０．１％ＢＳＡ、５％ＣＯ２でバブリング、インキュベーション緩衝液）で２回洗う。細胞を同じ緩衝液で３７℃で１時間プレインキュベートし、その後緩衝液を除去する。エンドスルフィンＡまたはＢを添加、または添加せずインキュベーションを３ｍＬインキュベーション緩衝液中で行う。インキュベーション時間の終わりに緩衝液を除き、４００×ｇで遠心して付着した細胞を除き、上澄液のインスリンを分析する。培地中のレベルをモルモット抗インスリン血清を用い、モノヨード化ブタインスリンをトレーサーとしラットインスリンを標準として放射線イムノ分析（ＲＩＡ）で分析する。分析を行う条件と試薬（細胞生育条件、培地、緩衝液等）は最適化するか変更し得ることが分かる。実施例１５：ヒトエンドスルフィンＡまたはＢによる神経伝達物質放出の調節ドパミンおよびアセチルコリンを含むがそれに限定されない、様々な神経伝達物質の放出を調節するエンドスルフィンの能力を、哺乳動物組織から調製した組織切片またはシナプトソーム調製物で測定することができる。本明細書で提供する実施例は、ラット線状体切片からのドパミン放出測定法を詳細に述べる。アセチルコリン、セレトニン、ノルアドレナリンおよびヒスタミンを含む他の神経伝達物質の放出を評価するために、当業者は同様な方法論を利用し得ることが理解される。Ａ．エンドスルフィンＡおよびＢによる線状体［３Ｈ］ドパミン放出の刺激：エンドスルフィンＡおよび／またはエンドスルフィンＢで誘発される［環状２，５，６³Ｈ］ドパミン（２４．４Ｃｉ／ｍｍｏｌ）がスーパー融合ラット線状体切片で測定される。線状体は２匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから摘出され、ＭｃｌｌｗａｎＴｉｓｓｕｅＣｈｏｐｐｅｒ(ＢｒｉｎｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣｏ.、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ)により０．３５ ×０．２５ｍｍにスライスされる。１０μＭパーグリシンおよび１０μＭアスコルビン酸を含むＫｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（１３７ｍＭＮａＣｌ、４．７ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＳＯ₄、２．５ｍＭＣａＣｌ₂、１．２５ｍＭＮａＨ２ＰＯ₄、１０ｍＭグルコース、１５ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４）で２回洗浄後、切片を９５％．５％Ｏ２／ＣＯ２下で３７℃、１０分間プレインキュベートする。緩衝液を置換後、Ｋｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ中３７℃で２５分間、切片を１００ｎｍ［³Ｈ］ドパミンでラベルする。一定量の切片をＢｒａｎｄｅｌＳＰ２０００スーパー融合装置（Ｂｒａｎｄｅｌ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）１８スーパー融合チャンバー内に置く。４７分間の洗浄後、切片をエンドスルフィンＡおよび／またはエンドスルフィンＢ（１ＰＭ〜１００μＭ）に４分間暴露する。採集した分画を５ｍＬのシンチレーション液中で計数する。スーパー融合チャンバーから組織を回収し、１ｍＬのＳｏｌｖｂｌｅ^TM （ＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で可溶化し１５ｍＬのシンチレーション液中で計数する。［³Ｈ］ドパミンの放出分画をベースラインより上の放射線活性から、全放射線活性分画として計算する。相対潜在能力を１００ｎＭ（−）ニコチンにより誘発した放出を標準として用いて計算する。ＥＣ₅₀値をＩｎｐｌｏｔ^TM（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて非線型最小２乗回帰解析により決定する。Ｂ．エンドスルフィンＡおよびＢによるカリウム誘発［³Ｈ］ドパミン放出：［環状２、５、６−³Ｈ］ドパミン（２４．４Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をスーパー融合ラット線状体切片で測定する。２匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから線状体を摘出しＭｃＩｌｗａｎＴｉｓｓｕｅＣｈｏｐｐｅｒ（ＢｒｉｎｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣｏ．、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）により０．３５×０．２５ｍｍにスライスする。１０μＭパーグリシンおよび１０μＭアスコルビン酸を含むＫｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（１３７ｍＭＮａＣｌ、４．７ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＳＯ₄、２．５ｍＭＣａＣｌ₂、１．２５ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、１０ｍＭグルコース、１５ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４）で２回洗浄後、切片を９５％．５％Ｏ₂ ／ＣＯ₂下で３７℃、１０分間プレインキュベートする。緩衝液を置換後、切片を１００ｎＭ［³Ｈ］ドパミンで２５分間、Ｋｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ中３７℃でラベルする。一定量の切片をＢｒａｎｄｅｌＳＰ２０００スーパー融合装置（Ｂｒａｎｄｅｌ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）１８スーパー融合チャンバー内に置く。４７分間の洗浄後、切片を２０ｍＭのカリウムに暴露する。エンドスルフィンの阻害効果を評価するため、エンドスルフィンＡ（１ｐＭ〜１００μＭ）および／またはエンドスルフィンＢ（１ｐＭ〜１００μＭ）を２０ｍＭカリウムの前にチャンバー内に加える。採集した分画を５ｍＬシンチレーション液中で計数する。組織をスーパー融合チャンバーから回収し、１ｍＬのＳｏｌｖａｃ^TM （ＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮ）で可溶化し、１５ｍＬのシンチレーション液中で計数する。 [³Ｈ]ドパミンの放出分画をベースラインより上の放射線活性から、全放射線活性分画として訃算する。相対潜在能力を１００ｎＭ（−）ニコチンにより誘発した放出を標準として用いて計算する。ＥＣ₅₀値をＩｎｐｌｏｔ^TM（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて非線型最小２乗回帰解析により決定する。手法が実行される条件と試薬は、最適化され得ることが理解される。実施例１６：エンドスルフィンによる心臓血管の性質の調節ＡＴＰ感受性カリウムチャネルアクチベータは、虚血と心臓穿孔から生じる損傷を保護し、血液動力学変数を調節する。ＳＵＲ２Ａが選択的に心臓で発現するという最近の発見は、心臓組織で選択的に発現したエンドスルフィンが心臓血液動力学を設定し調節する上である役割を果たし、心臓虚血の治療の別のアプローチを提供するという可能性をもたらす。環状、腎臓、腸間膜およびヒンドクオーター血管ベッド中の血流を同時に測定するために装備された、ラットにおけるエンドスルフィンの合理的な血液動力学効果を評価する方法論により、心臓血管の機能に対するエンドスルフィンの効果を評価することを可能にする。装置：全ての実験は、ＡｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ動物飼育および使用委員会に承認され、実験動物の使用と飼育に対するＮＩＨガイドラインに合致するプロトコルに従って行われた。３５０〜４００ｇの雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを１００ｍｇ／ｋｇのＩＰＩｎａｃｔｉｎ（ＢＹＫ−Ｇｕｌｄｅｎ）で麻酔し、以下の様に装備した。動脈圧力を測定し、化合物を投与するため、するためカテーテルを大腿動脈および静脈に挿入する。気道開通性を確保し機械的陽圧を排気させるため、気管切開を行う。動物を１００ｇ体重当たり１ｍＬの室内空気で６０サイクル／分のベンチレーター上に置く。心臓を肋間接近で露出し、心膜を静かに摘出する。吸引カップタイプミニチュアパルスドップラープローブを、左主冠状動脈の上方の心筋上に置く。中央線腹部切開により、右腎臓および上腸間膜動脈および腹部大動脈を露出する。次いで腎臓、腸管膜およびヒンドクオーター血流測定のため、カフスタイプミニチュアパルスドップラー流プローブを各血管上に置く。切開部を８ｍｍ傷口クリップで閉じ、動物を３０〜４５分間安静にさせる。４個所の血管ベッドからの動脈圧力とドップラー変移をポリグラフ上に記録する。動脈圧力と血流からのコンピューター処理データ取り込みにより、以下の測定パラメーターが得られる：平均動脈圧力、心拍、および血流。これらの値を実験期間中、５秒置きに集める。血流と抵抗測定は対照からの変化率または対照の割合として表される。次いで動物を３０〜４５分間安静にさせる。安静後、エンドスルフィンを投与しエンドスルフィンの局部血液動力学効果を上記の方法で測定する。エンドスルフィンの局部血液動力学効果を評価するための方法論を実行する条件は、試験動物に応じて最適化し得ることが理解される。実施例１７：内因性エンドスルフィン発現の阻害アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡは、タンパク質のエンドスルフィン合成を減少させる、またはブロックするために、現在広く用いられている戦略である。アンチセンス分子は内因性メッセージの特定領域を標的にするオリゴヌクレオチドであるか、または標的遺伝子に対するｃＤＮＡがアンチセンス配向でライゲートされる発現ベクターから形質移入することができる。エンドスルフィンの場合は、翻訳開始部位を標的にするアンチセンス分子は、エンドスルフィンＡおよびＢイソフォーム双方の合成を阻害すると予想される。３'ＵＴＲを標的にするオリゴヌクレオチドはエンドスルフィンＡまたはＢの合成を選択的に阻害するために使用し得る。挿入用オリゴヌクレオチドが培養細胞の培地に直接加えられる。第一段階として、１μＭ〜１ｍＭの濃度範囲が試験される。アンチセンスに暴露する時間を変えた後（１０時間〜５日）、エンドスルフィンの合成と定常状熊のレベルがエンドスルフィン特異性抗体とのイムノブロットで評価される（実施例１０参照）。最適濃度と暴露時間が一度確立すると、このエンドスルフィン合成減少の効果がルビジウムフラックス、ニューロ保護インスリンの分泌、神経伝達物質放出、および心臓血管の性質の調節等で評価される（実施例１２−１６参照）。実施例１８：ＡＴＰ感受性カリウムチャネルのエンドスルフィンＢによる調節Ａ．細胞焙養およびエンドスルフィンＢｃＤＮＡのＲＩＮｍ５Ｆ細胞中への形質移入：膵臓インスリノーマＲＩＮｍ５Ｆ細胞株（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＴｉｓｓｕｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび０．２５ｍｇ／ｍＬのアンホテリシンＢを補充したＲＰＭＩ１６４０培地で、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で生育させた。安定に形質移入された細胞を作成するため、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞をプラスミドｐＣＭＶ−ｅｎｄｏＢ用い、またはｐｃＤＮＡ３．１親ベクターでリポフェクション法により形質移入した。細胞（２×１０⁶細胞／１００ｍｍディッシュ）を約５０％密集度まで生育し、ＤＮＡ（１．５ｍｇ）とリポフェクタミン（２０ｍｇ）の混合物で形質移入した。４８時間ポスト形質移入で、細胞を１：１０に分割し、ネオマイシン耐性クローンを選択するため抗生物質ジェネティシン（５００μＬ）を培地に加えた。抗生物質耐性クローンが出現するまでに、安定に形質移入された細胞を４〜５週間生育した。数個のプレートからのコロニーをプールし、７５ｃｍ²フラスコに再プレートし密集状態に生育させ、これらの細胞を実験を通じて使用した。Ｂ．ＲＮＡ調製および分析：真核発現ベクターｐｃＤＮ３．１−Ｎｅｏ中のエンドスルフィンＢまたはベクター形質移入細胞からの全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて単離した。逆転写ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）を行うため、一定量のＤＮａｓｅＩ処理全ＲＮＡ(１−２μｇ)を最初にランダム６量体と７０℃で１０分間インキュベートし、次いで１×ＰＣＲ緩衝液、１ｍＭＭｇＣｌ₂、および１０ｍＭＤＴＴで２５℃、５分間インキュベートした。逆転写をＳｕｐｅｒｓｃｒｐｔＩＩＲＴ（２００Ｕ）の２５℃、１０分および４２℃、５０分のインキュベーションで開始した。氷上で冷却前に反応を７０℃、１５分で停止した。次いでＰＣＲを、各０．４ｍＭの配列番号：５および配列番号：７、各２００ｍＭのＮＴＰ、および２．５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含む５０ｍＬ反応液中の２〜４ｍＬのｃＤＮＡを用いて行った。サイクル条件は３５サイクルにつき９４℃／３０秒、５５℃／３０秒、７２℃／６０秒であった。一定量（２５ｍＬ）のｒｔＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分析した。エンドスルフィンＢを３６５ｂｐのバンドとして検出した。Ｃ．［³Ｈ］グリブリド結合：エンドスルフィンＢ形質移入またはベクター形質移入ＲＩＮｍ５Ｆ細胞をホモジェナイズし、ホモジェネートを[³Ｈ]グリブリド結合分析に直接使用した（Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ、Ｍ．、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｄ．Ｅ．、Ｊａｎｉｓ，．Ｒ．Ａ．、およびＴｒｉｇｇｌｅ、Ｄ．Ｊ．（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５７：１１６２−１１７１）。簡単に言えば、５０ｍｇの細胞膜ホモジェネートと［³Ｈ］グリブリドの濃度を変えて室温６０分でインキュベーションを最終容積５００ｍＬ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｌ、ｐＨ７．４）中で行った。特異的結合は、１０ｍＭ未ラベルグリブリドを試験管の複製セットに加えて測定した。ＧＦ／Ｂグラスフィルター上の急速真空濾過によりインキュベーションを終了し、フィルターを１．５ｍＬの氷冷緩衝液で３回洗った。結合［³Ｈ］グリブリドを効率４５％で液体シンチレーションスペクトロスコピー（ＬＳ５０００ＴＤ、ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ）で定量した。結合パラメーター（Ｋ_dおよびＢ_max）を、非線型曲線一致プログラム（ＬＩＧＡＮＤ：ＭｕｎｓｏｎおよびＲｏｄｂａｒｄ、１９８０）を用いて飽和結合等温曲線の解析から求めた。特に指定しない限り、値は平均±Ｓ．Ｅ．で表される。Ｄ． ⁸⁶ ルビジウム流出分析：同位体元素ルビジウム流出分析をＫ_ATPチャネルの機能活性を評価するために行った。Ｓｃｈｍｉｄ−Ａｂｔｏｍａｒｃｈｉら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１５８４０−１５８４４記載通り、２４ウエル培養ディッシュ（Ｎｕｎｃ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）に付着生育した細胞を用いて分析を行った。簡単に言えば、細胞を直径１５．５ｍｍのウエルに２．５×１０⁵細胞／ウエルの密度でプレートした。密集状態になったとき、細胞を⁸⁶Ｒｂ⁺（０．２ｍＣｉ／ウエル；ＮＥＮ −ＤｕＰｏｎｔ、Ｗｉｌｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を含む培地に負荷し、３７℃ で４時間インキュベートした。負荷した培地を除き、細胞を２００ｍＬの分析培地（２０ｍＭＨｅｐｅｓ．ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１２０ｍＭＮａＣｌ、７ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ₂、１ｍＭＭｇＣｌ₂、および３０ｍＭウアバイン）で２回洗浄し、次いで２−デオキシグルコース（１００ｍＭ）およびオリゴマイシン（０．２μｇ／ｍＬ）を含む２００ｍＬのグリブリドを含む、または含まない培地に暴露した。分析培地の放射線活性をガンマ線計数（Ｇａｍｍａ５００、ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｕｉｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）で測定した。データは含まれる全放射線活性に対する流出％で表される（ネット放出）。Ｅ．エンドスルフィンＢ形質移入ＲＩＮｍ５Ｆ細胞の分析：ＲＩＮｍ５Ｆ細胞を、ＣＭＶ初期プロモーターの形質移入制御下にエンドスルフィンＢの合成を駆動するプラスミドｐＣＭＶ−ｅｎｄｏＢで形質移入した。細胞をネオマイシン耐性で選択し、エンドスルフィンＢｍＲＮＡの存在をｒｔＰＣＲで調べた。エンドスルフィンＢｍＲＮＡをｐＣＭＶ−ｅｎｄｏＢで形質移入した３６５ｂｐｒｔＰＣＲ産物として検出したが、ｐｃＤＮＡ３．１形質移入細胞およびＲＩＮｍ５Ｆ親細胞では検出されなかった。逆転写がない（−レーン）対照実験を行って、信号が汚染ＤＮＡのためでないことを示した。ＲＩＮｍ５Ｆ細胞で内因的に発現したエンドスルフィンＢ発現のＫ_ATPチャネルに対する効果を、［³Ｈ］グリブリド結合およびカチオン流出技術で調べた。［³Ｈ］グリブリド結合の研究は、細胞質成分を失わない様に細胞ホモジェネートを用いて行った。ベクター形質移入細胞由来の細胞ホモジェネートを用いるを［³Ｈ］グリブリドによる飽和実験では、Ｋ_D値は０．１２±０．０１ｎＭ、Ｂ_ma _x 値は３９１±４０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質（ｎ＝３）であった。対照的に、ベクターのみで安定に形質移入される細胞（図４Ｂ、ｎ＝７）に比較し、エンドスルフィンＢを安定して発現するＲＩＮｍ５Ｆ細胞は、［³Ｈ］グリブリド結合（２６３±３０ｆｍｏｌ／ｍｇ）のＢ_max値で有為の（ｐ＜０．０５）３５％減少を示した。ベクター形質移入細胞（ＫＤ＝０．１０±０．０１ｎＭ、図９）に比ベリガンド親和性に有為の差はなかった（ｐ＜０．０５）。これは、一連のスルホニル尿素アナログ−グリブリド、グリピチジド、クロロパミド、およびトルブタミド−を用いて行われた置換実験でも支持され、形質移入およびベクター形質移入細胞双方で類似のＫ_I値を示す（データは示されない）。形質移入再防備おけるＫ_ATPチャネルの機能性を⁸⁶Ｒｂ⁺流出技術で評価した。Ｓｃｈｍｉｏｄ−Ａｎｔｏｍａｒｃｈｉらによる先の研究（１９８７年、前出）は、２−デオキシグルコースおよびオリゴマイシンによる代謝阻害は、ＲＩＮｍ５Ｆ細胞からのグリブリド感受性カチオン流出を活性化することを示している。２−デオキシグルコース（１００μＭ）およびオリゴマイシン（０．２μｇ／ｍＬ）による処理、細胞内ＡＴＰレベルを少なくとも１０倍下げる条件は、ベクター形質移入細胞からの⁸⁶Ｒｂ⁺流出を刺激した。カチオン流出はグリブリドによる阻害に鋭敏であり、これらの効果がＡＴＰ感受性Ｋ＋チャネルで仲介されていることを示している。ベクターのみで形質移入されたＲＩＮｍ５Ｆ細胞における流出のグリブリド阻害に対するＩＣ₅₀値は、０．９８±０．２ｎＭであった（ｎ＝４）。エンドスルフィンＢで安定に形質移入されたＲＩＮｍ５Ｆ細胞では、代謝阻害で引金が引かれる⁸⁶Ｒｂ⁺流出は、ベクター形質移入細胞（放出％、７１±３％、図１０）に比較して有意（Ｐ＜０．０５）に減少した（放出％、４８ ±２％）。しかしながら、グリブリドによる⁸⁶Ｒｂ⁺流出阻害に対するＩＣ₅₀値（０．５±０．１、ｎ＝４）は、ベクター形質転換細胞に比較して有為の差はなかった（図１０）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者スコツト，ビクトリア・イー・エスアメリカ合衆国、イリノイ・60201、エバンストン、メイプル・アベニユー・ナンバー・303・2216 (72)発明者アンダーソン，クリステイ・エルアメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレイズレイク、ベル・ヘイブ・ドライブ・ 1830 (72)発明者サリバン，ジエイムズ・ピーアメリカ合衆国、イリノイ・60015、デイアフイールド、デイミイーデール・ドライブ・705

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトエンドスルフィンおよびフラグメントまたはその相補体をコードするヌクレオチド配列を包含する、単離されたまたは精製されたポリヌクレオチド。２．該ヌクレオチドが配列番号：１、配列番号：２、ヌクレオチド位置約１０７からヌクレオチド位置約４６０の配列番号：１、およびヌクレオチド位置約１０７からヌクレオチド位置約４７２の配列番号：２からなる群より選ばれる、請求項１記載のポリヌクレオチド。３．該ヌクレオチド配列が配列番号：３またはそのフラグメント、および配列番号：４またはそのフラグメントからなる群より選ばれるアミノ酸配列をコードする請求項１記載のポリヌクレオチド。４．請求項２記載のポリヌクレオチドを包含する組み換え発現ベクター。５．ｐＰｒｏＥｘ１およびｐｃＤＮＡ３．１からなる群より選ばれる請求項４記載の発現ベクター。６．請求項４記載の発現ベクターで形質転換されたホスト細胞。７．該ホスト細胞が原核細胞または真核細胞である請求項６記載のホスト細胞。８．ヒトエンドスルフィンの単離されたまたは精製されたポリペプチド。９．配列番号：３またはそのフラグメントおよび配列番号：４またはそのフラグメントからなる群より選ばれる請求項８記載のポリペプチド。１０．発現ベクターで形質転換されたホスト細胞を培養する工程を包含する少なくとも１種のヒトエンドスルフィンエピトープを含むポリペプチドの製造方法であって、該発現ベクターはヒトエンドスルフィンをコードするヌクレオチド配列を包含する、ポリペプチドの製造方法。１１．ヒトエンドスルフィンをコードするヌクレオチド配列が、配列配列番号：２、そのフラグメントまたはその相補体を有する請求項１０記載の方法。１２．ヒトエンドスルフィンをコードするヌクレオチド配列は、配列番号：２およびヌクレオチド位置約１０７からヌレオチド位置約４７２の配列番号：２からなる群より選ばれる請求項１０記載の方法。１３．該ヌクレオチド配列が配列番号：３および配列番号：４からなる群より選ばれるヒトエンドスルフィンをコードする請求項２３記載の方法。１４．エンドスルフィンレセプター活性を調節する化合物を同定する方法であって、（ａ）該エンドスルフィンレセプターポリペプチドを発現するホスト細胞を提供する工程；（ｂ）試験化合物を該細胞と混合する工程：および（ｃ）試験化合物のレセプターを発現する細胞に対する効果、あるいは試験化合物の細胞またはレセプターへの結合のいずれかを測定する工程；を包含する同定方法。１５．工程（ｃ）（ｉｉ）の該測定が信号発生化合物により発生する信号を測定することにより行われる、請求項１４記載の方法。１６．細胞保護化合物を同定する方法であって、（ａ）エンドスルフィンポリペプチドまたはフラグメントを発現する細胞を提供する工程；（ｂ）試験化合物を細胞と混合する工程；および（ｃ）細胞毒性の徴候について細胞または細胞機能をモニターする工程；を包含する同定方法。１７．該細胞が原核細胞または真核細胞である請求項１４または請求項１６記載の方法。１８．該細胞が、ポリペプチドの転写を指示する配列に機能的に結合しているヌクレオチド位置約１０７からヌクレオチド位置約４７２の配列番号：２を包含する、それによりポリペプチドがホスト細胞で発現する発現ベクターを包含する、請求項１７記載の方法。１９．少なくとも１個の制御配列が誘導可能なプロモータを包含する、請求項１８記載の方法。２０．該細胞が該細胞への細胞毒性効果を最小にする、または遮断するような物質の存在で維持される、請求項１９記載の方法。２１．エンドスルフィン調節に関連する状態を有する個体を処置する方法であって、該個体にエンドスルフィンの遺伝子発現を制御するのに有効量の化合物を薬学的に許容し得る賦形剤中にて投与することを包含する処置方法。２２．アミノ酸配列配列番号：４またはそのフラグメントを有するヒトエンドスルフィンに特異的に結合するモノクローン抗体。