JP2001507230A

JP2001507230A - Nucleic acid constructs and their use for direct nucleic acid integration into cells

Info

Publication number: JP2001507230A
Application number: JP52911798A
Authority: JP
Inventors: ディビス，ブリアン; ヤオウ，アゴイング
Original assignee: ジィーン−セル
Priority date: 1996-12-23
Filing date: 1997-12-20
Publication date: 2001-06-05
Also published as: AU733715B2; AU5812198A; EP0946718A1; WO1998028417A1; CA2275892A1

Abstract

(57)【要約】核酸を細胞に組み込む技術が開示されている。関心の対象である望ましい核酸配列を含んだ形質導入遺伝子構成物を蛋白質と共に細胞に注入してその細胞のクロモソームＤＮＡ内にその核酸配列のサイト固有又はランダム組み込みを起こすことができる。この形質導入遺伝子構成物と蛋白質とは組成物中に共に表現されており、蛋白質は形質導入構成物内での問題の核酸配列をサイト固有な状態で細胞の核酸内部に直接組み込まれるようにする。他の実施の形態で、この組成物は形質導入遺伝子構成物と表現構成物を含んでおり、表現構成物は問題の形質導入遺伝子配列の細胞への直接の組込みを促進することができる酵素をコード表現する核酸配列を含んでいる。本発明はさらに顕微注射法を用いて外来物質を細胞に組み込む方法を含んでいる。特殊な実施の形態で、この方法は非着生状態で成長する細胞に外来物質を導入するために用いられる。この応用例で、細胞はフィブロネクチンなどの着生分子を含む基質面上に不動態化される。また、この細胞は保持ピペットを用いて、あるいは細胞自体を刺激してその表面に培養プレートの表面に含まれている化学的物体と結合する分子を表現させるなどの方法で不動態化される。 (57) [Summary] Techniques for incorporating nucleic acids into cells have been disclosed. A transgene construct containing the desired nucleic acid sequence of interest can be injected into a cell along with the protein to cause site-specific or random integration of the nucleic acid sequence into the chromosomal DNA of the cell. The transducing gene construct and the protein are co-expressed in the composition, and the protein allows the nucleic acid sequence of interest in the transducing construct to be incorporated directly into the nucleic acid of the cell in a site-specific manner. . In another embodiment, the composition comprises a transgene component and a phenotypic component, wherein the phenotypic component comprises an enzyme capable of promoting direct integration of the transducing gene sequence of interest into the cell. Contains the nucleic acid sequence to be coded for. The present invention further includes a method of incorporating a foreign substance into cells using microinjection. In a specific embodiment, the method is used to introduce a foreign substance into cells growing in a non-adherent state. In this application, the cells are passivated on a substrate surface containing epigenetic molecules such as fibronectin. The cells are also passivated using a holding pipette or by stimulating the cells themselves to express molecules that bind to chemical entities contained on the surface of the culture plate.

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称核酸構成物及び細胞への直接核酸組み込みのためのその使用本出願は１９９６年１２月２３日出願の米国仮出願Ｎｏ．６０／０３３，８１６のための権利請求のためのものである。発明の背景発明の分野本発明は細胞への核酸組み込みの技術分野に関するものである。本発明は、ここに述べられる技術が特定の遺伝子不良に関連した多数の遺伝子不良を補正及び／又は措置される遺伝子治療手順の一部として用いることができるので、遺伝子治療の分野にも関連している。背景技術造血性幹細胞遺伝子治療は種々の疾患の措置に大きな可能性を提供する。幹細胞遺伝子治療の長期的有効性のためには少なくとも以下の３つの必要条件が満たされねばならない：１）造血性幹細胞の直接遺伝子修正，２）幹細胞及びその後代細胞の形質導入配列の保持、及び３）適切な細胞での形質導入遺伝子の長期的表現。不均一である可能性のある幹細胞コンパートメントは移植された宿主内での完全な造血性システムの長期的な再構成と一定程度の自己更新の両方を行うことができる希少な、寿命の長い、そして基本的に休止した細胞で構成されている［Ｏｇａｗａ，１９９３］．幹細胞は移植後に造血を行えるようになるために数か月かかるので、それらは迅速な移植を可能ならしめるために多数の短期再構成細胞によって補強する必要がある［Ｊｏｎｅｓら、１９９５］。ほとんどの遺伝子治療の応用例において、幹細胞のみを修正するだけで十分であるようで、祖先から誘導されるマークされない細胞の急速な再構成の後に遺伝子的にマークされた幹誘導細胞の長期的な移植が行われる。導入された治療用遺伝子は幹細胞から遺伝子補正を必要としている後代細胞にうまく移送しなければならない。現在利用可能なエピゾーム性プラスミドは一般的に選択的な圧力がないとさらなる開発が待たれている人工的なヒト・クロモソームが不在であると、わずかなレベルの持続性しか示さず［Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９７］、クロモソーム組み込みは現在の段階では遺伝子保持のための最も実行性の高い方式である。遺伝子欠陥の補正には治療用遺伝子がその患者の寿命期間中適切な細胞で表現され続けることを必要としている。リソソーム保存秒に対する遺伝子治療は、それらの病気に可溶性あるいは膜結合酵素が関与しているかどうかには関係なく、モノサイト／マクロファージ内で十分なレベルの補正酵素が一生生産されることを必要とする。不十分な量の酵素の生産は一般的にその病気の再発につながる。幹細胞遺伝子治療の分野では現在大きな問題が存在していることはよく知られている［Ｏｒｋｉｎ及びＭｏｔｕｌｓｋｙ］。１９８０年代の中期にレトロウイルス形質導入が開発されて以後、造血性細胞に対してはこれが標準的な遺伝子治療技術となっている。しかしながら、原始的造血性細胞のレトロウイルスによる形質導入は上に述べた必要条件の１）と３）を満たす上で重大な欠陥が明らかになった。実験室での研究、動物モデル、そして現在では臨床段階の治験で現在用いられているレトロウイルス性ベクターは休止したヒト造血性幹細胞をほとんど形質導入せず、従って上記の第一の条件を満たさないことが明らかにされた［Ｍｉｌｌｅｒら、１９９０；Ｋｏｈｎら、１９９５；Ｄｉｃｋら、１９９６；Ｎｏｌｔａら、１９９６］。このことはヒトでの治験での移植から数か月後に遺伝子でマークされた抹消白血球の出現頻度が極めて低いこと（０．１−１％）によって裏付けられており、これは幹細胞形質導入率が１％以下であることを示している［Ｋｏｈｎら、１９９５；Ｂｏｒｎｎｅｒら、１９９３］。効率的に形質導入された初期ヒト造血性細胞だけが循環性の祖先であり長期的培養開始細胞（ＬＴＣＩＣ）であり［Ｃａｓｓｅｌら、１９９５；Ｈｕｇｈｅｓら、１９８９］、通常未修正幹細胞の後代細胞によって置き換えられる前に、一定期間（約２−１２か月）だけイン・ビボで血液細胞を生産できる。こうした、ヒトの幹細胞での失望させるような結果はマウス・システム内で通常実証されるような幹細胞と後代細胞の両方の効率的なレトロウイルス性形質導入と鮮やかな対照を示している。ヒトの幹細胞を直接形質導入することができないことに関与していると思われる３つの異なった要因とは：ａ）幹細胞の休止的な性格，ｂ）幹細胞上でのレトロウイルス性エンベロープに対する適切な受容体が存在しないこと［Ｃｒｏｏｋｓ及びＫｏｈｎ、１９９５］、そしてｃ）幹細胞のイン・ビボでの循環を必要とするレトロウイルス性形質導入条件が実際には幹細胞機能のかなりのロスを引き起こす可能性があること［Ｎｏｌｔａら、１９９６］である。こうした困難を克服するために種々の技術が試みられているが、これら３つの課題をすべて同時に解決できる保証はいまのところない。例えば、レンティウイルスに基づくベクターはいくつかの非循環性細胞を形質導入することができるが［Ｎａｌｄｉｎｅら、１９９６］、ＨＩＶ−１が休止性一次ＣＤ４⁺リンパ球を感染できないこと［Ｚａｃｋら、１９９０］（つまり、部分的で不安定な逆転写だけを行う）という事実はＧ_O幹細胞も形質導入に対する抵抗性を示す可能性を示唆している。従って、幹細胞の形質導入のために、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの評価に対してかなりの努力が払われている。しかしながら、ＡＡＶが形質導入して安定して休止一次細胞ゲノムに安定して融合する能力に関しては論争と不確定性がある［Ｐｏｄｓａｋｏｆｆら、１９９４：Ｈａｌｂｅｒｔら、１９９５；Ｒｕｓｓｅｌら、１９９４］。これら遺伝子導入に関連した問題が解決されても、長期的な、細胞タイプに固有な表現を達成するための上記第三の必要条件を満たす上で重大な問題が存在する。例えば、レトロウイルスで形質導入された形質導入遺伝子の表現は形質導入されたヒトの後代細胞や霊長類の祖先細胞で、そして形質導入されたマウスの幹細胞／祖先細胞の後代細胞でさえ、しばしば沈黙させられてしまうという問題がある［Ａｋｋｉｎａら、１９９４；Ｃｈａｌｉｔａ及びＫｏｈｎ，１９９４；Ｌｕら、１９９４］。さらに、一定程度の表現を行うこれらの細胞においても、表現のレベルにおいては細胞ごとにかなりの違いがある［Ｓａｄｅｌａｉｎら、１９９５］。調節不良の表現の結果として、造血性細胞は遺伝子的に補正遺伝子で修正されていても、効果的に補正された表現型を表示できない場合がある。興味深いことに、不良調節された表現のこれらと同じ特徴が初期形質導入性マウス表現研究でも観察されている［Ｋｏｌｉａｓ及びＧｒｏｓｖｅｌｄ，１９９２］。その後の研究は長期的な、位置とは無関係で、コピー数に依存した細胞タイプに固有な表現は強力なプロモータ／エンハンサ要素ばかりでなく、ａ）融合された配列を隣接クロマチンの影響から護るために適切なクロマチン構成（つまり、表現細胞におけるオープンなクロマチン立体配座）、例えば座制御領域（ＬＣＲ）状要素［Ｋｏｌｉａｓ及びＧｒｏｓｖｅｌｄ，１９９２；Ｃａｔｅｒｉｎａら、１９９４；Ｔａｌｂｏｔら、１９９０］と恐らくは追加的な要素を優先的に伝達するのに十分なゲノム性配列と、そしてｂ）高レベル表現のためのイントロン／エクソン構造及び配列［Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８８］も必要であることが示された。残念なことに、レトロウイルス性ベクターのための厳しいパッケージ条件（最大８ｋｂの挿入配列）、及びＡＡＶベクター（最大４ｋｂ）のさらに厳しい条件［Ｍｉｌｌｅｒら、１９９４］は十分な調節性配列及び／又はさらに適切に調節された遺伝子表現を必要とする治療的応用のためのイントロン／エクソン構造の取り込みの可能性を排除してしまう可能性がある。例えば、レトロウイルス及びＡＡＶベクターへのＬＣＲ配列の取り込みに関する最近の研究は、形質導入遺伝子の表現のレベルが細胞毎に極端に違っていることを示している［Ｓａｄｃｌａｉｎら、１９９５；Ｅｉｎｅｒｈａｒｄら、１９９５］。強力なスプライシング信号（つまり、イントロン／エクソン構造）あるいは隠されたスプライシング信号が望ましいスプライスされていない全長構成物のレトロウイルスによるパッケージングに干渉することもあり得る［Ｅｉｎｅｈａｎｄら、１９９５］。現在の技術が効率的に幹細胞を形質導入できないということは重大な問題で、形質導入のための別の、新しいアプローチの必要性を示唆している。造血性細胞に対する遺伝子伝達のためのエレクトロポレーション及びリポソーム媒介トランスフェクション技術が報告されている。しかしながら、これらの方法は固有の特徴を有しており幹細胞遺伝子治療に適切かどうかについては問題がある。これらの特徴とは、ａ）いずれの方法もマウス及びヒトの増強された原始一次造血性細胞をかなりの割合でトランスフェクトできないこと［Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏ及びＫｅａｔｉｎｇ、１９８６；Ｈａｒｒｉｓｏｎら、１９９６］，ｂ）トランスフェクトされたＤＮＡ分子の数が細胞によってかなり違っていること、及びｃ）形質導入遺伝子が一時的に保持されるだけで少数の細胞だけが（エレクトロポレーションの場合１０⁴−１０⁵個の細胞で１個だけ）安定的に形質導入されること［Ｐｈｉｌｉｐら、１９９４］である。最近開発された粒子媒介照射技術に関しては入手できる情報が少ないが、最近の一次Ｔ細胞トランスフェクション研究では、１．６ミクロン金粒子／ＤＮＡ復号体の場合照射５日後に２−１０％のトランスフェクション率が報告されている［Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら］。これらの粒子のサイズ範囲における本研究者の針のサイズに関する研究に基づけば、幹細胞の損傷は受け入れがたい程高いであろう。利用可能な非ウイルス性形質導入方法が今後予想される未来の応用例でＤＮＡと蛋白質の共伝達を可能にするかどうかも明らかではない。遺伝子伝達方法には関係なく、幹細胞、特に休止幹細胞が外来のＤＮＡ配列をどのように取扱、対処するかについて理解することが重要である。幹細胞、特に休止幹細胞の核に導入されたＤＮＡの運命［それがクロモソームＤＮＡに統合されるかどうか］についてはほとんど分かっていない。一次あるいは休止細胞のウイルスによる形質導入は融合前にいくつかの点で阻止されるかも知れない（例えば、レトロウイルスの場合、不完全な逆転写あるいは不完全な核への移送［Ｍｉｌｌｅｒら、１９９０；Ｚａｃｋら、１９９０］、ＡＡＶの場合、単鎖ＤＮＡの二重鎖プロウイルス性ＤＮＡへの不完全な転換［Ｒｕｓｓｅｌら、１９９４］。こうしたことは正常なＡＡＶあるいはレトロウイルスのサイフ・サイクルで、幹細胞への形質導入遺伝子融合プロセスに集中させることを非常に困難にしている。顕微注射された配列の融合が循環に依存していることを示す文献は存在しない。休止マクロファージを安定的に形質導入することができる野生種ＨＩＶ −１［Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、１９９１］及び細胞サイクルで捕捉されたＣＤ４ＨｅＬａあるいはリンパ腫細胞［Ｌｅｗｉｓら、１９９２］の能力は非増殖サイクルでの融合は実際に可能であることを示唆している。ＨＩＶ−１プロウイルス性ＤＮＡの融合はインテグラーゼ酵素によって媒介される。いくつかの研究はＭ− Ｍｕｌ配列の融合が細胞***中に起こる必要がないこと［Ｒｏｅら、１９９３］、さらにクロマチンと裸のＤＮＡがイン・ビトロで両方とも融合対象として機能することができること［Ｐｒｙｃｉａｋら、１９９２］を示唆している。野生種ＨＩＶ−１の休止細胞への融合能力に関してはほとんど疑問の余地はないが、ＨＩＶ−１に基づくベクターの場合、このことはまだ結論的に実証されている訳ではない。ＨＩＶ−１に基づくベクターは休止ラット２０８Ｆ線維芽腫内で安定した形質導入媒介を確立できることが知られている［Ｎａｄｉｈｉら、１９９６］。最初の感染から８日後に得られた細胞は循環状態で感染されたものの５０％に相当する安定した形質導入頻度を示した。遺伝子性物質を細胞に導入した場合に細胞の成長可能性を改善してくれる方法の必要性は医療技術の分野で依然として存在している。発明の開示本発明はひとつの側面で形質導入遺伝子、あるいは融合貢租と複合化した形質導入遺伝子を細胞の核に直接伝達することに関係している。それによって細胞のクロモソーム性ＤＮＡへの形質導入遺伝子の組み込み率が増大する。いくつかの実施の形態で、伝達は原始脊髄血液幹細胞を対象として伝達が行われる。この技術はレトロウイルス及びＡＡＶベクターの場合に発生する形質導入のいくつかの障害を克服するであろう。本発明は適切にＬＴＲ側鎖された形質導入遺伝子の休止細胞へのインテグラーゼによって媒介された融合の利用を提案するものである。活性状態の遺伝子のクロモソームに融合する際のレトロウイルスＤＮＡの性向を台わせて考えると、このことは本発明者にはオープンな一時的に活性を有するクロマチンの存在下で融合が増強されることを示唆する。つまり、ＡＶＶベクターとタイプＣレトロウイルスはこれまで休止細胞への確実な融合を達成できることについてはひとつも報告されていない。一般的に述べると、本発明はいくつかの点で蛋白質と形質導入遺伝子構成物を含む具体的に定義された組成物を用いて細胞のクロモソーム核酸へ核酸を導入する方法を提供するものである。形質導入遺伝子構成物はさらに、レトロウイルスＬＴＲなどの長末端反復配列（ＬＴＲ）の末端フラグメントによって側鎖された核酸配列を含むものとして定義することができる。この末端フラグメントは長さが約１０−約３００のヌクレオチド、あるいは約１０−約２５０のヌクレオチド、そしてさらに厳密に定義された実施の形態では長さが約２０−約２００ヌクレオチドである。いくつかの実施の形態で、蛋白質はレトロウイルス性インテグラーゼなどの酵素として定義される。本発明の他の実施の形態では蛋白質はさらに核酸結合蛋白質に融合される酵素など、融合蛋白質として定義される。またさらに別の実施の形態では、伝達は特に原始脊髄液体幹細胞を対象として行われる。（必要な調節要素と有意名イントロン・エクストロン構造を含む）ＤＮＡの、レトロウイルス又はＡＡＶビリオンにパッケージ可能なものより大きな領域を伝達する能力は形質導入された幹／祖先細胞の後代細胞においてしばしば観察される不良表現及び表現の沈黙という結果につながりかねない。本発明は遺伝子性物質を細胞に伝達するためのインタグラーゼを含んだ組成物を提供する。いくつかの実施の形態ではこれらの細胞は造血性幹細胞である。一次造血性細胞に対してはこれまで顕微注射は稀にしか用いられていない。¹³これは顕微注射用に造血性細胞を効果的に不動態化することができないことに大きな原因があるが、標準的な顕微注射用針がずっと小さな造血性細胞に対して与える重大な損壊もそのひとつの理由である。本発明はこれらの技術的な困難を軽減する。この点で、本発明は１つの側面で原始的造血性細胞（ＣＤ３４⁺、ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-、ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／Ｔｈｙ−１¹⁰］を一時的に不動態化して細胞の迅速な顕微注射を可能にし、その後の培養及び／又は移植のために利用できるようにする方法を提供するものである。ここに述べるような核酸注入製剤を用いる本発明のいくつかの実施の形態においては、先端直径が０．０５−０．５ミクロン、あるいは先端外径が０．１２−０．２ミクロンで、制御可能な微量流量を実現でき、顕微注射される細胞（直径６−８ミク口ン）に損傷を与えることが少ない微細マイクロピペットが用いられる。ここで述べられる方法の１つの利点はＤＮＡかあるいは蛋白質のいずれかの少量を顕微注射するだけで多数の細胞が十分に注入されることである。近年まで、ヒト幹細胞表現型の特徴付けの不十分さから幹細胞修正のための方法として顕微注射は妥当な選択ではなかった。しかし、最近原始性ヒト造血性細胞の増強されたッポピュレーションが幹細胞（例えば，ＣＤ３４⁺／Ｔｈｙ−１¹⁰ ¹⁴、ＣＤ３４⁺／ＣＤ４５Ｒａ^-10／ＣＤ７１^-/lo／Ｔｈｙ−１^lo ^15.CD34 ₊ ／ＣＤ３８^-16 ＣＤ３４⁺／ｃ−ｋｉｔ^lo ¹⁷、ＣＤ３４⁺ ・ＣＤ３８^-／ＣＤ３３^-／ＣＤ１９^-／ＣＤ４５Ｒａ^-・ｃ−ｋｉｔ＋¹⁸）を含んでいるらしいことが最近確認されたことから、細胞修正を必要とする細胞の数はひとつの細胞での遺伝子修正が実行可能な方法であるレベルまでに達している。１回に１つの細胞及び複数の細胞への注入に重点を置いたこの新しい方式は現在の細胞修正及び遺伝子治療方式に経済的で実行可能な新しい方法を提供するものである。原始的脊髄血液幹細胞はレトロウイルス及びＡＡＶベクターによるその伝達よりより有効であろう。レトロウイルスあるいはＡＡＶウイルス粒子で伝達可能なものより大きな、例えば必要な調節要素と有意なイントロン／エクソン構造を含んだものなどＤＮＡの大きな領域が本発明の顕微注射方法によって可能であり、形質導入された幹細胞の後代細胞で観察されるような不良表現と表現停止を回避してくれると考えられる。いくつかの実施の形態で、この方法は特定の蛋白質酵素として１つあるいは複数のインテグラーゼの使用を含んでいる。例として、これらのインテグラーゼはＡＡＶＲｅｐ⁷⁸あるいはＭ−ＭｕｌＶ、ＨＩＶ−１，ＳＩＶ，ＦｅＬ、ＲＳＶ、ＡＭＶ、あるいはＥ１ＡＶなどのレトロウイルス性インテグラーゼを含んでいる。これらのインテグラーゼは表現された遺伝子組換え蛋白質（バクテリア、昆虫細胞、あるいは真核細胞のいずれかに表現される）の形態で存在し、野生種インテグラーゼ蛋白質かそのアミノ酸配列内で修正された形で存在する。このアミノ酸配列の修正はａ）精製をしやすくするために別のアミノ酸する方法（例えば、ヒスチジン付加、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）付加、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）蛋白質など），ｂ）特定のＤＮＡ配列への結合を可能にするアミノ酸（ＤＮＡ結合蛋白質）との融合−従ってクロモソーム性ＤＮＡ内の特定のサイトへのサイト優先あるいはサイト固有標的融合、ｃ）より大きなインテグラーゼ蛋白質可溶性を提供し、融合反応を行う上でのより高い効率を提供するなどの目的でのインテグラーゼ・アミノ酸配列におけるサイト固有突然変異、などのいくつかの技術を用いて行うことができる。イン・ビトロでの融合をΔＬＴＲ_HIV-1配列及びインテグラーゼ_HIV-1のみで一定の頻度で達成することができるが、特定の蛋白質（例えばイースト菌転写因子ＳＮＦ−５のヒト相同体［Ｋａｌｐａｎａら、１９９４］及びＤＮＡ結合蛋白質ＨＭＧ１［Ｆａｍｅｔ及びＢｕｓｈｍａｎ、１９９７］など）も組み込み及び融合の効率をさらに高めるために用いることができる。向上した融合効率は従って細胞に伝達されるＤＮＡ／インテグラーゼ混合体内でのそうした細胞性蛋白質によって達成される。本発明はさらにレトロウイルス性融合前複合体内に存在するウイルス蛋白質以外の形質導入遺伝子及びレトロウイルス性インテグラーゼとの共伝達も可能にする。例えば、Ｍ−ＭｕＬＶガス蛋白質はＭ−ＭｕｌＶ融合前複合体内に存在しており、融合反応の効率を増大させる可能性がある。図面の簡単な説明以下の図面は本明細書の一部を構成するものであって、本発明のいくつかの側面をさらに示すために含まれるものである。本発明はここに述べられている具体的な実施の形態についての詳細な説明と合わせてこれら図面のいくつかを参照することでより理解されるであろう。図１：融合をより容易に行わせるように設計された特殊な酵素と共に形質導入遺伝子を導入。レトロウイルス性長末端反復（ＬＴＲ）によって側鎖された混合物をレトロウイルス・インテグラーゼと共に共伝達する。この方法はどのウイルスにも適用可能であろう（例えば、マロニー・マウス白血病ウイルスなどのヒト免疫不全ウイルス・タイプ１又はタイプＣなどのレンティ−ウイルス）などにも適用されるであろう。ＡＡＶ反転末端反復（ＩＴＲ）によって側鎖された混合物をＡＡＶＲｅｐ⁷⁸と共伝達する。この方式は形質導入遺伝子混合物と融合酵素の両方の顕微注射による導入を示しているが、形質導入遺伝子と酵素の両方ともエレクトロポレーション、リポソーム媒介遺伝子伝達、あるいは粒子媒介照射などの他の方法でも伝達可能である。加えて、融合酵素が蛋白質として伝達される必要がない場合もある。むしろ、それは融合の対象とされる形質導入遺伝子と共にＤＮＡ表現混合物として共伝達することも可能であろう。形質導入遺伝子だけがＬＴＲあるいはＩＴＲ配列によって側鎖されており、融合酵素表現混合物の方はそうした側鎖を含んでいない場合、これは望ましい形質導入遺伝子だけの融合を促進するであろう。図２：融合のための基本戦略。形質導入遺伝子及び調節要素の細胞への単純な導入が融合をもたらす場合は、雑多なサイトでの融合が行われ先頭から末端までの乱雑な連鎖が発生する可能性がある。ＡＡＶＩＴＲ配列の添加はより高い融合率を提供することが期待される。この混合物と同様ＩＴＲ配列だけを含んでおりＲｅｐ⁷⁸を含んでいないｒｅｐＡＡＶベクターの場合、高い融合頻度が観察される。融合前のｒｅｐＡＡＶＤＮＡの正確な構造はＩＴＲによって側鎖された線形二重体として存在するか、あるいは融合前に核に巻つけられる可能性がある。従って、本発明は２ＩＴＲ含有混合物の巻き付きから高い融合率がもたらされる可能性があることを提案するものである。ｒｅｐガス生成物が存在していない場合、融合体は一般的にクロモソーム１９のＡＡＶＳ１領域に対する特殊性を示さない。Ｒｅｐ⁷⁸蛋白質を追加すると（次の構成物に示す）Ｒｅｐ⁷⁸はＡＡＶＩＴＲとクロモソーム１９ＡＡＶＳＩ領域の両方でＤＮＡ配列を識別するので、クロモソーム１９に対する優先的融合を増大させることが予想される。次の構造物では、遺伝子構成物がレトロウイルスＬＴＲから誘導される配列が側鎖されている。例えば、イン・ビトロ融合反応で必要とされるＭ−ＭｕｌＶＬＴＲ配列だけが１０−１２ｂｐＬＴＲ末端である。Ｍ−ＭｕＬウイルス性インテグラーゼはこれらの配列と相互作用してイン・ビトロ及びイン・ビボでの融合を容易に行わせる。Ｍ−ＭｕＬＶに基づくベクターの融合に対してはサイト固有性は存在しないように見えるが、ヌクレオソーム性立体配座に対しては一定の優先性が認められる。図の次の部分にはインテグラーゼとＤＮＡ結合蛋白質との間の融合蛋白質のＬＴＲ配列との相互作用が示されている。これはＤＮＡ結合領域が既存のＤＮＡ結合蛋白質から誘導されるか、あるいは新しい蛋白質が特定のゲノム性ＤＮＡ配列に対して高い親和性を有するように設計合成されるのかいずれかの可能性を示唆している。例えば、グロブリン座に対して形質導入遺伝子を個別的に向かわせるとエリスロイド細胞内でのその表現が容易に行われるであろう。図３．顕微注射されたＤＮＡ配列の融合を容易にするために我々の実験室で表現、精製された２つの融合蛋白質を示す。上側にはマルトース結合蛋白質とＡＡＶのＲｅｐ⁷⁸蛋白質との間の融合を示す。これはＭＢＰ−Ｒｅｐ⁷⁸表現構成物から表現されたものである（Ｂａｔｓｕら、１９９５］。同じ方法で精製されたＭＢＰ−Ｒｅｐ⁷⁸融合蛋白質もＡＡＶＩＴＲへのイン・ビトロでの結合、エンドヌクレアーゼ活性及びヘリカーゼ活性を示すことが報告されている。ＭＢＰ配列が（細胞内の）融合活性に干渉するのであれば、それらはファクタ−Ｘａによる切断でＲｅｐ⁷⁸から取り除くことができる（ファクターＸａ切断はＭＢＰとＲｅｐ⁷⁸との間の融合箇所で行われる）。下側の図はＭＢＰとＭ−ＭｕｌＬＶｔｏｎｏ間の同様の融合を示している。Ｍ −ＭｕＬＶインテグラーゼはＪｏｎｓｓｏｎら（１９９３）に述べられている構成物からクローンされたもので、ＭＢＰ−Ｒｅｐ⁷⁸の表現のために用いられるｐＭＡＬｃ２ベクター内にクローンされている。しかしながら、上に述べた戦略は本発明の実施においてＭＢＰ融合蛋白質だけに限定されるものではない。例えば，ＧＳＴ融合、ヒスチジン付加表現及び精製、バクロウイルス表現ｖｓ大腸菌表現、及び真核細胞内での表現なども用いることができる。図４Ａ及び４Ｂ。ＭＢＰ−Ｒｅｐ⁷⁸融合蛋白質の精製。図４Ａ：ＩＰＴＧが存在しないか、あるいは（ＭＢＰ−Ｒｅｐ⁷⁸表現を含めるために）ＩＰＴＧの存在している状態のいずれかで成長されたｐＭＡＬ−Ｒｅｐ⁷⁸バクテリアからのバクテリア溶解物。図４Ｂ：約１２０ＫＤの新しい帯が＋ＩＰＴＧレーンに存在している。ＩＰＴＧの存在下で成長されたバクテリアは超音波処理され、上澄液をアミロース・カラムを２度通過させた。ＭＢＰ−Ｒｅｐ⁷⁸がマルトースの添加によってカラムから流出された。多少低めの分子量に相当する箇所に追加共精製帯が存在している。［Ｂａｔｃｈｕら、１９８５］はこれは全長ＭＢＰ−Ｒｅｐ⁷⁸の優先的蛋白質分解切断によるものか、あるいは優先的早期集結のいずれかの生成物であると考えた。ゲルを走査することにより、この製剤の純度は９０−９５％程度であると推定された。図５：ＭＢＰ−インテグラーゼ融合蛋白質の精製。ＭＢＰ蛋白質をＭ−ＭｕＬＶインテグラーゼ遺伝子をＭ−ＭｕＬインテグラーゼ遺伝子に融合させる表現構成物［Ｊｏｈｎｓｏｎｎら、１９９３］を調製した。表現構成物の配列決定が適切なフレーム内融合を確認した。ＭＢＰ−インテグラーゼ蛋白質はＭＢＰ−Ｒｅｐ⁷⁸に関して図４に述べたのと同様の程度まで表現、精製された。ＩＰＴＧの存在下で成長されたバクテリアを超音波処理して、上澄液をアミロース・カラムを１回通過させた。８５ｋＤ分子量マーカーより多少ゆっくり走っている強力な帯は推定８８ｋＤの融合蛋白質と一致している。この製剤の純度は７０−８０％の範囲と推定される。図６。融合酵素媒介融合の評価において用いられるサンプル構成物。ｐｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴはヒト化赤方変移緑色蛍光蛋白質遺伝子（ＧＦＰ，ＧｉｂｃｏＢＲＬから、ｐＧＲＥＥＮ）とヒトＯ⁶メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子を含んでいる。この構成物及びその後の構成物内のすべての形質導入遺伝子はホスホグリセレート・キナーゼ（ｐｇｋ）プロモータ配列によって駆動される。この特定の構成物は稀少酵素サイトによって側鎖されており［Ｆｓｅ１，Ｐａｃｌ，Ａｓｃｌ，Ｓｆｉｌ），直鎖形質導入遺伝子配列だめを得るためにバクテリア性プラスミド配列の除去を（制限酵素消化及び、必要であれば、予備的アガロース・ゲルから適切なサイズに調整されたフラグメントの溶出によって）可能にしてくれる。ｐｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＩＴＲはｐｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ配列を側鎖しているＡＡＶ２ＩＴＲ配列を含んでいる。この場合も、バクテリア性プラスミド配列を含くまない直線配列はＦｓｅＩ及びＳｆｉ酵素による消化によって得ることができる。また、ＳｆｉサイトをＦｓｅＩサイトに転移し、ＦｓｅＩで消化し、そして結紮して２−ＩＴＲ含有サークルを形成させることによって巻き付けられた形状でのこの構成物を得ることも可能である。これはＡＡＶ融合にとって適切な気質であるから、この巻き付けされた構成物はＲｅｐ⁷⁸が存在していてもいなくても直線化された状態より容易に融合する。この最後の構成物はその５’末端にＨＩＶ−１ＬＴＲ末端に対応する配列の２０塩基を含んでいるプライマーによるＰＣＲ増幅によって得られる直線化ｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ΔＬＴＲ２で構成されている。ＰＣＲ増幅は適切なＨＩＶ−１末端によって側鎖された二重鎖直線構成物を発生させるために用いられた。２０ｂｐの配列が有効な融合にとって十分でない場合は、この戦略は追加ＬＴＲ配列を含むように修正することができる。図７．ｐｇｋ−ｔｋ／ΔＬＴＲ_HIV-1の発生。ヘルペスウイルス・タイプ１チミジン・キナーゼ（ｔｋ）遺伝子とホスホグリセレート・キナーゼ（ｐｇｋ）プロモータの両方を含んだ組成物を示している。ＳＶ４０スプライス・ドナー／アクセプタ及びポリアデニル化配列も示されている。ＰＣＲプライマーはｐｇｋ及びｔｋ配列を含んだ２．７４ｋｂｐ線形フラグメントを発生するように設計され、ＨＩＶ−１ＬＴＲの末端配列で走査されたものである。プライマー（ＨＩＶ３；３６塩基）はＦｓｅＩサイトの上流を用い、Ｕ３領域（下線）の末端に対応する２０個の塩基と最初のｐＣＭＶβベクターの配列に対応する１６個の塩基を含んでいた（５’ＡＣＴＧＧＡＡＧＧＧＣＴＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＧＡＴＣ３’）（配列ＩＤ番号：１）。プライマー（ＨＩＶＵ５；３５塩基）はＳｆｉサイトの下流を用い、Ｕ５領域の末端（下線）に対応する２０個の塩基とｐＣＭＶβ内の配列に対応した１５の塩基とを含んでいた（５’ＡＣＴＧＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧ３’）（配列ＩＤ番号：２）。増幅された線形二重鎖ＤＮＡはＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅の３０サイクル後に得られた）。ＰＣＲ後、ＰＣＲ生成物をクロロホルムで抽出して、酢酸ナトリウム及びアルコールで沈殿させ、ＴＥ内に再懸濁させ、１％アガロース・ゲル内で電気泳動させ、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキット（Ｂｉｏ１０１）を用いてゲル精製し、酢酸セルロースとアルコールで沈殿させ、水に再懸濁させてから０．１ミクロン・フィルターでろ過し、そして使用時まで−２０℃の温度で保存した。図８．ｐｇｋ−ｔｋ／ＩＴＲ。ｐｇｋ−ｔｋ／ＩＴＲを発生させるためにＡＡＶＶＩＴＲで側鎖されたｐｇｋ−ｔｋ組成物が示されている。線形化されたＩＴＲ側鎖ｐｇｋ−ｔｋ配列はＦｓｅ１及びＳｆｉＩによる消化で得られ、バクテリア・プラスミドが形質導入マウスで遺伝子表現に干渉することが示されているので、バクテリア性プラスミド配列を除去するためにゲル精製した。図９．融合を促進するための共有結合閉鎖環の発生。本発明のいくつかの側面で環状二重鎖ＤＮＡとしてｃｉｒ−ｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＩＴＲが用いられる。ＡＡＶＩＴＲを含むプラスミド・バックボーンが構成され、ｐｒｓＧＦＰ− ／ＩＴＲを発生させるためにＭＧＭＴｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ配列がＰａｃＩ及びＡｓｃＩサイトの間に挿入された。線形化ＩＴＲ側鎖ｒｓＧＦＰ−ＭＧＴ配列はＦｓｅＩ及びＳｆｉＩによる消化によって上に述べたように得られた。プラスミド・バックボーンを有さない円形化ｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＩＴＲ配列は図９に示すように発生させられる。ＳｆｉＩサイトはｐｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＩＴＲ内に転移されてＦｓｅＩサイトをつくりだす。これは線形化され、バックボーン・プラスミド配列はＦｓｅＩ消化を通じて取り出され、結紮してＦｓｅＩサイトに巻き付き、顕微注射前にアガロース・ゲルで環状分子を得るために精製した。発明実施のための最良の形態本発明はいくつかの実施の形態では造血性幹細胞（ＨＳＣ）を形質導入する方法、従って：１）顕微注射によるＨＳＣの核へのＤＮＡの直接伝達、２）顕微注射された形質導入遺伝子配列のＨＳＣのクロマチンへの融合と上記ＨＳＣの後代細胞でのそれらの配列の持続、そして３）プロモータ、エンハンサ、及びＬＣＲなどの調節要素と導入された形質導入の適切で長期、細胞タイプに固有の表現のために必要なイントロン／エクソン構造を含む十分に大きな（１５−２５Ｋｂ）形質導入性ＤＮＡ構成物の顕微注射、そして４）遺伝子向標的活性を有する注入サンプル内に含まれる蛋白質と共にＤＮＡ／蛋白質混合体の顕微注射、によるその直接的遺伝子修正のための別の方式を提供するものである。本発明の方法に従って調製された遺伝子修正ＨＤＣは、その修正ＨＳＣを長期的再構成のためにヒトに伝達した場合に、遺伝子治療目的に用いることができる。本発明の他の実施の形態によれば、外来物質の顕微注射によって修正された造血性幹細胞は、限定ではなく例として示せば、ＡＩＤＳ、地中海性貧血、鎌状細胞貧血、及びアデノシン・デアミラーゼ不全などの種々の生理的不全を措置するために用いることができる。本発明で想定される生理的不全は遺伝子治療に対して反応性を示す。『遺伝子治療に対して反応性を示す』とはそうした不全に罹っている患者が症状の改善などの治療上あるいは臨床的利益を受けるという意味である。上に示したように、本発明の１つの側面は修正ＨＳＣを遺伝子伝達の細胞性媒体としての利用に関係している。遺伝子あるいは形質導入遺伝子は、例えば、治療用あるいはマーカー遺伝子あるいは血液細胞内の遺伝子欠陥（例えば、地中海性貧血や鎌状細胞貧血）を補正する遺伝子など、臨床的な有用性を有するものであればその遺伝子でもよい。いくつかの実施の形態では、一次ヒト細胞は血液細胞である。ここで用いられている『血液細胞』とは、上に述べたようにあらゆる形状の血液細胞と祖先細胞及びその前駆体を意味する。従って、ひとつの実施の形態で、本発明は（ｉ）患者のＨＳＣ内へのヒト一次細胞の治療効果を強化する生成物をコード表現するＤＮＡセグメントの顕微注射、及び（ｉｉ）ステップ（ｉ）から得られた遺伝子的に修正されたＨＳＣを患者に導入するステップで構成されたＨＳＣの治療効果を増強するための方法に向けられている。ＤＮＡは患者の体内で薬剤をつくりだし、そうした実施の形態によれば、そうした薬剤は組織サイト自体で表現される。同様に、上に述べたように、遺伝子的に加工されたＨＳＣは特定のサイトに向けられる必要はなく、本発明によればそうした加工ＨＳＣとその後代細胞は系統的治療として機能し、例えば、望ましい治療剤が細胞から系統的に表現、分泌される。より具体的には、（ｉ）患者のＨＳＣに血液細胞の治療効果を増強する生成物をコード表現するＤＮＡセグメントを顕微注射するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）から得られた細胞をその患者に注入するステップとで構成される、患者の体内に導入されるＨＳＣの治療効果を増強する方法が提供される。修正ＨＳＣの後代細胞であり本発明において用いることができるＨＳＣは、例えば、白血球、顆粒球、単核細胞、マクロファージ、リンパ球、及び真核細胞などである。例えば、適切なヘモグロビン遺伝子で遺伝子的に修正された地中海性貧血あるいは鎌状細胞貧血の患者からの幹細胞は遺伝子的に補正された血液細胞を発生させる。ＨＳＣが保有しているＤＮＡは、例えば細胞の治療効果を直接間接に増強するものであればどのＤＮＡでもよい。またＨＳＣによって保有されるＤＮＡはＨＳＣがそのＨＳＣが通常であれば発揮しない治療効果を発揮させるものであればどのＤＮＡであってもよい。例えば血液細胞を遺伝子的に加工するために用いることができる適切なＤＮＡとしては、腫瘍壊死因子（ＹＮＦ）、インターロイキン（例えば、インターロイキン１−１２）、グロブリン遺伝子、ＤＮＡ修繕遺伝子、薬剤抵抗性遺伝子及びＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）抵抗性遺伝子などのサイトキニンをコード表現するものを含む。ヒト細胞を形質導入するために用いられるＤＮＡはその表現生成物がその細胞から分泌されるものであってよい。また、それは細胞内に保持される遺伝子生成物をコード表現してもよい。ヒトの細胞は後でより詳しく述べるようにマーカーとして機能するＤＮＡで加工してもよい。１つの側面で、挿入される遺伝子はイン・ビボでの形質導入された細胞のトラフィック及び生残の判定を可能にするマーカーである。こうしたマーカー遺伝子の実例としてはネオマイシン抵抗性（ｎｅｏＲ）遺伝子、多重薬剤抵抗性遺伝子、チミジン・キナーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ、ジヒドロフォレート・リダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びクロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼなどである。ＨＳＣはイン・ビトロで加工される。例えば細胞は患者から取り出されて幹細胞が単離され、治療剤をコード表現するＤＮＡによってイン・ビトロで遺伝子的に加工され、そのように遺伝子的に加工されたＨＳＣは治療的に受け入れ可能な基剤と共に患者に再投与される。こうした措置手順はしばしばエクス・ビボ措置と呼ばれる。癌を持っていたり癌を発生する可能性のある患者のための臨床的措置の一部として、修正ＨＳＣの後代細胞がその患者のＨＳＣに顕微注射された遺伝子性外来物質の生成物を表現する一次ヒト細胞のポピュレーションを提供する。治療的に受け入れ可能な基剤は液体基剤（例えば、食塩水溶液）、あるいは固体基剤、例えば移植片などである。液体基剤を用いる場合、加工された細胞は系統的、例えば静脈注射、皮下注射、筋肉内駐車、腹膜内、あるいは患部に直接投与などの方法で導入することができる。本開示では以下の略語が用いられている。ｐＣＭＶ−β サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ／エンハンサ配列の制御下でβ−ガル・レポータを表現するＤＮＡプラスミドＦＩＴＣ−デキストデキストランに結合されたＦＩＴＣランＣＤ３４＋ＣＤ３８ＦＡＣＳで単離されたＣＤ３４⁺細胞のＣＤ３ −Ｔｈｙ−１＋８^-Ｔｈｙ−１^-（実際にＴｈｙ−１^ｌｏ）サブポピュレーションＩＭＤＭＩｓｏｃｏｖｅ修正ダルベッコ培養液上に述べたことは本発明による一定の手順について詳述する以下の実施例を参照することでよりよく理解できるであろう。これらの実施例についての参照は説明を目的とするものである。それらは本発明の範囲及び性質を限定するものではない。実施例１不動態化ＣＤ３４⁺細胞へのＦＩＴＣデキストランの伝達ＣＤ３４⁺細胞の精製と培養単核Ｄ３４キングする。謄帯血液細胞は正常なヒト胎児の謄帯から入手し、単核細胞はＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅでの遠心分離によって精製した。ＣＤ３４⁺細胞は（（１）デキストランを介して免疫磁性粒子に結合された抗ＣＤ３４抗体と共に細胞を培養するステップ、（２）磁石に取りつけられたカラムと通過させることによる磁性的にラベルされた細胞の単離、（３）デキストラーゼを用いての切断による磁性粒子からの細胞の解放、（４）磁石に取りつけられたカラムを通過させることによる磁性粒子からの細胞の分離などのステップを含む）ＭｉｌｔｅｎｙｉＭｉｎｉＭＡＣＳＣＤ３４Ｍｕｌｔｉｓｏｒｔ分離キットも用いての免疫磁性分離によって単離された。その後で行われる異なったＣＤ３４エピトープを認識する別のＣＤ３４抗体を用いてのＦＡＣＳ分析は、それらの細胞がＣＤ３４表現細胞に関して９０％の純度を持っていることを示した。精製された細胞を仔ウシ血清アルブミン（２％、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、インシュリン（１０マイクログラム／ｍｌ）、トランスフェリン（２００マイクログラム／ｍｌ，ＩＣＮ）、２−メルカプトエタノール（０．０５ｍＭ，Ｓｉｇｍａ）、低密度リポプロテイン（４０マイクログラム／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、及び２０ｎｇ／ｍｌヒトＦｉｔ−３リガンド（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２０ｎｇ／ｍｌヒト・インターロイキン−３（ＩＬ−３、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ），及び２０ｎｇ／ｍｌヒト幹細胞因子（ＳＣＦ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）［ＩＭＤＭ／Ｆ−３−Ｆ］を含んだペン− ストレップ（それぞれ１００単位及び５０マイクログラム／ｍｌ）で補強した血清を含まない培養液（Ｉｓｏｃｏｖｅｓ修正ダルベッコ培養液（ＩＭＤＭ，Ｇｉｂｃｏ）内で５％ＣＯ₂の存在下で３７度の温度で一昼夜保持した。フィブロネクチンで被覆した表面の作成６ｍｍガラス・クローニング・リングをベースラインを介して３５ｍｍ組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に取りつけた。クローニングこの皿の表面をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，Ｓｉｇｍａ）に５０マイクログラム／ｍｌのフィブロネクチン溶液（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，＃１０５１−４０７）を解かしたもの３０−５０マイクロリッターを添加することでフィブロネクチンで被覆し、その後、４℃の温度で一昼夜培養する（あるいは室温で４５分間でも可）。過剰なフィブロネクチン含有溶液は細胞添加の前に取り除いた。フィブロネクチンで被覆した皿へのＣＤ３４⁺細胞の取り付け一昼夜の培養の後、細胞をＩＭＤＭ／Ｆ−３−５１ｍｌに８ｘ１０⁴個の細胞の割合の濃度で調節した。この細胞含有培養液（約２０００の細胞を含む２５マイクロリッター）をＴＳ２／１６．２．１ハイブリドーマ細胞株（インテグリン・ベーターヒトＣＤ２９と反応する抗体をつくりだすＡＴＣＣ^♯ＨＢ−２４３）によって２日間調整した培養液（ＩＭＤＭ）２５マイクロリッターと混合した。細胞／抗体混合物５０マイクロリッターをフィブロネクチンで被覆した表現を包む６ｍｍガラウに入れた。細胞は抗体が存在している場合、５％ＣＯ₂の存在下、３７℃の温度で３０分以上フィブロネクチンに取りついた。その後、クローニング・リングの外側に１ｍｌのＩＭＤＭ／Ｆ−３−５を加えて、細胞及びクローニング・リングを含んでいる３５ｍｍプレートを５分間６００ｒｐｍの回転速度で回転させた（Ｂｅｃｋｍａｎ低速ＧＳ−６Ｒ遠心分離装置、振動バケツ・ローター、ブレーキ・オフ）。ＦＩＴＣ−デキストランによるＣＤ３４⁺の顕微注射自動化ピペット・プーラー（Ｓｕｔｔｅｒ、３ｍｍボックス・フィラメント）を用いて薄壁ホウケイ酸ガラス毛管（Ｓｕｔｔｅｒ、１．２ｍｍ外径、０．９４ｍｍ内径）から微細ガラス顕微注射針を作成した。同じ条件でプールされた顕微注射針の外径を判定するために走査電子照射（ＳＥ）顕微鏡を用い、０．１７−０．２２ミクロンの外径が得られた。５０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２／１００ｍＭＫＣｌ／５ｍＭＮａ₂Ｈ₂ＰＯ₄）にＦＩＴＣ−デキストラン（１５０，０００Ｍ．Ｗ．Ｓｉｇｍａ）を０．２５％の割合で混ぜたものを０．０２ミクロン・フィルター（ＷｏｒｌｄＰＯｒｅｃｉｓｉｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を通過させて、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロローダーを用いて顕微注射針に入れる前に高速（１０，０００ｒｐｍ，ＩＥＣＣｅｎｔｒａ−４ｂ）で遠心分離にかけた。顕微注射はＯｌｙｍｐｕｓＯＭＴ−２反転顕微鏡（加熱ステージを備える）上に載せられたＮａｒｉｓｈｉｇｅマイクロマニピュレータを用いて手作業で行われた。流体伝達の圧力はＳＡＳ１０／２スクリュー起動空気顕微注射／吸引用注射器を用いて与えられた。クローニング・リングは顕微注射の直前に取り除かれた。針からの流体の流動が確認された後、約２ −１０フェムトリッターのＦＩＴＣ−デキストランと共に６０個の細胞が（約３０−４５分間の時間をかけて）顕微注射された。物質の伝達は核に向けられたものであったが、一部の物質は細胞質に与えられてしまった。顕微注射された細胞のモニタリングとその後の培養顕微注射後、やや大きめのクローニング・リング（直径８ｍｍ）を顕微注射された細胞の周辺に置いた。ＦＩＴＣ−デキストランの細胞に対する伝達を蛍光を取りつけた（ＦＩＴＣ）ＮｉｋｏｎＤｉａｐｈｏｔ３００反転顕微鏡によってモニタリングした。明るいフィールドと蛍光画像の両方をＨａｍａｍａｔｓｕ冷却ＣＣＤカメラ及びコントロータ、Ｓｏｎｙトリニトロン・モニター、フレーム・グラッバー、及びネットワーク化Ｇａｔｅｗａｙ４８６−２５により捕捉、保存することができる。顕微注射から３０分以内に、約３５のＦＩＴＣ−ポジティブ細胞（全部で６０個のうち、５８−６７％）が明確に識別された。かなりの数の細胞が明らかにゆっくりした蛍光上での核局所化を示し、一部の細胞は核と細胞質の両方の局所化を示し、少数の細胞はサイトプラズマ性蛍光を示しただけだった。顕微注射から２４時間後に、１９個の蛍光細胞（３２％）が依然として識別され、顕微注射から７２時間後には１６個の蛍光細胞（３２％）が識別された。実施例２形質導入遺伝子構成物本実施例は関心の対象となる遺伝子をコード表現する核酸配列を含む形質導入遺伝子構成物を提供し、その治療用遺伝子の細胞への安定した組込みと表現を成功させる上での本発明の有用性を実証するためのものである。その遺伝子は哺乳動物の遺伝子であればどれでもよく、その薬学的に活性を有するフラグメント、特にヒトの遺伝子であればどれでもよい。本実施例は赤方変移緑色蛍光蛋白質（ｒｓＧＦＰ）レポータ遺伝子及びＯ⁶− メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）遺伝子である。ＭＧＭＴ遺伝子は細胞に対して抵抗性を有する化学治療剤を提供するものであり、従って化学治療剤に露出される患者に対して望ましい、そして有益な措置が可能となる。例えば、そうした患者には抗癌治療の一部として化学療法を受けている患者が含まれる。ｒｓＧＦＰレポータは迅速で敏感な表現のアセスメントを可能にしてくれるので、核固有遺伝子伝達及び形質導入遺伝子の持続的存在に関する迅速な判定を可能にしてくれる。ヒトＭＧＭＴ遺伝子が選ばれたのは、マウス幹細胞におけるＭＧＭＴ形質導入遺伝子表現はＢＣＮＵなどのアルキル化剤の毒性効果からそれらを保護するのに十分だからである。本発明はヒト幹細胞におけるＭＧＭＴの向標的表現のための方法を提供し、さらに形質導入された幹細胞のイン・ビボでの増強のための実用性を示す。いくつかの実施の形態で、本発明は原始的脊髄血液の安定した形質導入、及びＳＲＣ活性が増強された未熟脊髄血液ッポピュレーションの調製のための方法を提供する。ＨＩＶ−１ＬＴＶあるいはＡＡＶＩＴＲ配列とＨＩＶ−１インテグラーゼあるいはＡＡＶＲｅｐ⁷⁸の両方で側鎖されている構成物で共伝達された細胞における安定した融合頻度を達成するための改良された方法も提供される。４つの形質導入遺伝子構成物が図６に示されている。すべてはＭＧＭＴを含んでいる。実施例３ヒト遺伝子治療法本実施例はヒトのための遺伝子治療を行う上での本発明の実用性を実証するものである。合理的な推定値を得るためには、長期的再構成のためにヒトに提供されるべき幹細胞の数はをマウス、大型動物、及びヒトの研究から外挿することができる。検討の対象となる遺伝子治療は子供のために行われることが多いので、これらの推定値は患者の体重が小さいことを考慮に入れて決めるべきである。より迅速な移植と高い生残率を実現するために、かなりの数の、マークされない短期的に再構成する細胞を今日伝達することができるが、ここではずっと少数の遺伝子修正長期再構成幹細胞に重点をおいて説明する。ａ）３つの独立したマウスを使っての研究が２０個程度［Ｈａｌｂｅｒｔら、１９９５］、１０個［Ｒｕｓｓｅｌら、１９９４］，あるいはただの１個［Ａｋｋｉｎａら、１９９４］程度の少数の骨髄細胞を用いて長期的再構成を実現したことを報告している。体重だけでの直接的なスケール調節が許されるならば、マウスにとっての平均的な再構成に必要な細胞個数が５個であるということはヒトの子供の場合に５０００個の細胞が必要だということになる。ｂ）ヒトの骨髄移植で、通常提供される最低用量は体重１ｋｇあたり１ｘ１０⁶個の核酸であり［Ｃｈａｌｌｉｔａ及びＫｏｈｎ、１９９４］、これは２５ｋｇの子供の場合２．５ｘ１０⁹個の細胞に相当する。実験データ及びネコでの造血のモデル化は１．７ｘ１０⁶個の骨髄細胞で幹細胞頻度が約１であることを示唆している［Ｌｕら、１９９４］。これと同じ頻度がヒトの骨髄の場合もあてはまり、２．５ｘ１０⁹個の細胞は１４５０個の幹細胞の提供に相当する。ｃ）子供は３０ｍｌ程度の移植血液細胞で再構成を示すが、それは原始的造血性脊髄血液の増殖性の高さによるものらしい［Ｓａｄｅｌａｉｎら、１９９５］。この体積に約１．５−３ｘ１０⁸個の核酸が存在し、幹細胞の頻度は１０⁵−１０⁶で１と仮定すると、これは幹細胞が１５０−３０００個程度の少数でも移植がうまくいくことを示している。ｄ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでのヒト脊髄血液細胞の移植から得られた証拠はＮＯＤ／ＳＣＩＤ再構成細胞（ＳＲＣ）とヒト幹細胞との間の（同等ではないとしても）非常に近い関係性を示唆している。ＳＲＣは１０⁴個のＣＤ３４⁺細胞で最大１の頻度で存在している［Ｋｏｌｌｉａｓ、１９９２；Ｃａｔｅｒｉａｎら、１９９４］。従って、３０ｍｌの脊髄血液（約３ｘ１０⁷個の単核細胞を有し、その１％はＣＤ３４⁺である）は約３０個のＳＲＣを含んでいる。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでのＳＲＣの播種効率が１０％程度に過ぎないとしても、これは３００個のＳＲＣに相当する。従って、４つの計算すべては１５０個程度から５００個程度の数の幹細胞が本発明の実施においては必要であることを示唆している。再構成がうまくいくかどうかは幹細胞の伝達と短期祖先細胞による移植によって影響される。可能であれば、幹細胞の必要数は上のｂ）及びｃ）で計算されたものより下回っていてもよい。この造血性幹細胞に向けた作業は手作業での顕微注射によって行われたが（１時間あたり１００−２００個の細胞を注入）、ここに開示されている方法はさらに高速の（１時間あたり３００−６００個の細胞注入）自動化注入にも適用できると考えられる。この自動化顕微注射システムは臨床的な遺伝子治療目的に十分に使用できるであろう。１時間あたり１５００個の細胞注入を行うことができるコンピュータ自動化システム［Ｐｅｐｐｅｒｋｏｋら、１９９６］もかなりの数の移植用幹細胞を（例えば、安定した形質導入頻度を前提として１０００−１０，０００個の細胞）を顕微注射するのに用いることができるであろう。幹細胞のイン・ビボあるいはイン・ビトロ表現において有用なものを組み合わせれば、マークされた細胞の選択も合わせて、移植用に顕微注射される幹細胞の数をさらに減らすことが可能であろう。実施例４ＤＮＡ構成物及び遺伝子治療イン・ビボで存在する補正された幹細胞のひとつの有用な機能は移植前にマークされた細胞をイン・ビトロで選択し（うまく形質導入された細胞だけが患者に移植されるように）そして／又はその後でマークされた幹細胞を選択することによって（内発性のマークされない幹細胞を犠牲にしてマークされた幹細胞だけを増強するため）達成することができる。このためには通常同じＤＮＡ構成物上に存在する２つの独立した調節遺伝子：幹細胞／後代細胞での表現の目標とされる選択可能な遺伝子及び治療用遺伝子（例えばＡＤＡ又はグロブリン）−必要な細胞タイプでの表現の目標とされる−と共に幹細胞を形質導入することを必要とする。形質導入された幹細胞のイン・ビトロ選択に有用な細胞としてはｒｓＧＦＰ又は先端切断成長因子受容体（ＮＧＦ−Ｒ）などがある。ヒトＯ⁶−メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）遺伝子と共に幹細胞を形質導入すると含窒素尿素クラスのアルキル化剤（例えば１，３−ｂｉｓ（２−クロロエチル）−１−含窒素尿素；ＢＣＮＵ）で患者を簡単に措置するだけで生残しているマークされた幹細胞をイン・ビボで選択することができる。ほとんどの抗腫瘍形成剤（例えば，Ｔａｘｏｌ）は循環性造血性後代細胞に対して毒性を示し、休止造血性幹細胞を台なしにしてしまい、ＢＣＮＵなどの含窒素尿素もＤＮＡ損壊性毒性作用を幹細胞に対して直接発揮する。種々のアルキル化剤によってＤＮＡ内に誘発されるＯ⁶ アルキルグアニンを取り除くＭＧＭＴは通常造血性幹細胞／後代細胞に非常に低いレベルで表現される。しかしながら、細胞内に外来的に表現された場合には、ＭＧＭＴはＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ、デカルバジン、Ｎ−ｍｅｃｈｉｒｕ−Ｎ’ −ニトロ−Ｎ−ニトロソグアジニン、テモゾロミド、及びストレプトゾトキシンに対しての細胞抵抗性を発生させる。例えば、その幹細胞にＭＧＭＴを表現しているマウスはＢＮＣＵ−誘発造血抑制に対して抵抗性を示した［Ｍａｚｅら、１９９６］。ヒト多重薬剤抵抗性遺伝子（ＭＤＲ−１）が形質導入された幹細胞のイン・ビボ選択で使用するために提案されている。ヒト幹細胞はすでに構成的にＭＤＲ−１を表現している［Ｃｈｕｎｄｈａｒｙ及びＲｏｎｉｎｓｏｎ、１９９１］。従って、本発明の実施において用いられるようなＭＤＲ−１抵抗性薬剤（例えば，Ｔａｘｏｌ）によって形質導入された細胞の増強は幹細胞ではなく後代細胞のレベルで起きると予想される。マークされた造血性細胞に関するイン・ビボ選択において提唱されているすべてのものに当てはまることであるが、他の器官に対する毒性は最小限に抑えられるであろう。ＭＧＭＴ形質導入遺伝子表現自体は造血性細胞の抵抗性を乳癌やその他の癌の高用量あるいは反復的化学治療のために用いられるＢＣＮＵなどの薬剤に対する抵抗性を付与すると予想される［Ｍａｚｅら、１９９６］。１つの側面で、幹細胞の顕微注射による遺伝子治療例には以下のような要素が含まれる。約１−１０ｘ１０³の高度に増強された幹細胞が脊髄血液から得られ、一時的に不動態化される。これらの細胞の顕微注射によって、ＤＮＡを含み、いくつかの実施の形態では融合酵素も含んでいる再生可能な量が、細胞１個あたりＤＮＡの１−３コピーがうまく融合するように提供される。サイズが１５−２５ｋｂで、２つの独立的に調節された形質導入遺伝子を含んだ顕微注射されたＤＮＡが再構成なしで融合される。幹細胞での表現の対象とされた１つの形質導入遺伝子は、形質導入された幹細胞のイン・ビトロでの（例えば、ｒｓＧＦＰ、又は先端が切断された神経成長因子受容体；ｔＮＧＦ−Ｒ）又はイン・ビボ（例えばＭＧＭＴ）選択を可能にしてくれる。治療用形質導入遺伝子（例えば、ＡＤＡＳＣＩＤのためのＡＤＡ、ヘモグロビン病態に対するグロブリン、化学抵抗性に対するＭＤＲ−１）が適切な造血性細胞内での表現の対象とされる。顕微注射はまた人工的なヒト・クロモソーム及び／又は持続的な存続が可能なエピソーム性プラスミドの最終的な核伝達のための適切な方法も提供してくれるであろう。いくつかの実施の形態では、顕微注射後の８０％以上の細胞成長性と２５％以上の安定した形質導入頻度の提供が期待できる。実施例５原始脊髄血液細胞の精製及び生物学的アッセイ脊髄血液のＣＤ３４⁺、ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-、及びＣＤ３４⁺／ＣＤ３８⁺／Ｔｈｙ−１^loポピュレーションが提供される。核形成謄帯血液及び骨髄細胞の約０．５−１％ＣＤ３４⁺造血性細胞はすべての測定可能な幹細胞／後代細胞活性を表している。ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８⁺表現型（ＣＤ３４⁺脊髄血液細胞の約５− １０％）はより原始的なサブポピュレーションも備えている。ＬＴＣＩＣ及びコロニー形成細胞よりもっと原始的であると考えられる免疫不全ＮＯＮ／ＳＣＩＤマウス内ヒトの造血細胞を移植することが可能な細胞はＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-ポピュレーションだけに存在している［Ｄｉｃｋら、１９９６；Ｄｉｃｋ，１９９６］。ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-脊髄血液細胞はＭａｙａｎｉらによって確認されたＣＤ３４⁺／ＣＤ４５Ｒａ^-lo／ＣＤ７１^-lo表現型内で高度に増強される［Ｍａｙａｎｉら、１９９３］。ＣＤ３４⁺／ＣＤ４５Ｒａ^-1o／ＣＤ７１^-1oのＴｈｙ−１^loサブセットがより原始的な細胞のポピュレーションを示すというさらなる知見はヒトの肝臓幹細胞がＣＤ３４⁺／ｌｉｎ^-／Ｔｈｙ−１^loであるという知見と一致している。本発明ではＣＤ３４⁺／ＣＤ４５Ｒａ^-lo／ＣＤ７１^-lo細胞（ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-細胞の約２５％）は多数の後代細胞を発生させるコロニー形成細胞をつくりだすＬＴＣＩＣ内でＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／Ｔｈｙ−１^-細胞よりかなり多く増強されることも観察されている。上の考察から、ＣＤ３４⁺、ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-、及びＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／Ｔｈｙ−１^lo表現型はヒト幹細胞の増大するボピュレーションを示している。顕微注射と安定した形質導入アッセイを可能にしてくれるこれら特定の細胞ポピュレーションを精製し機能的に評価する手順も提供される。実施例６ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-及びＣＤ３４⁺／ＣＤ３８／Ｔｈｙ−１^lo細胞臍帯血液細胞をＵＴＭＢでの正常な出産から毎週（１週間あたり２−４サンプル；全部で１００−２５０ｍｌ）を入手して、プールされた単核細胞をＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅで遠心分離して単離する。ＣＤ３４⁺細胞はＭｉｌｔｅｎｙｉＭｉｎｉＭＡＣＳＭｕｌｔｉｓｏｒｔＫｉｔで免疫磁性分離によって単離される。単離された細胞は（デキストラーゼを用いてデキストラン抗体粒子を切断することで）磁化された粒子が取り付いていない状態で得られる。回収率は予想されるＣＤ３４細胞数の７０−９０％であった（１００ｍｌの脊髄血液は通常１−２ｘ１０⁸単核細胞を生み出し、ＣＤ３４単離は１−２ｘ１０⁶個の細胞を与え、９０−９５％の成長可能性と８０−９５％のＣＤ３４陽性を示す）。次に、Ｂｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ装置による蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて特定のＣＤ３４⁺細胞サブポピュレーションを単離した。選別基準を満たしている細胞は全部を一度にチューブに入れるか、あるいは予め決めた数だけを自動化細胞沈着装置（ＣＡＤＵ）を用いて９６ウェル・プレートのそれぞれのウェルに入れる。ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-細胞の精製のためには、増強されたＣＤ３４⁺細胞をＰｅｒＣＰ^-ＣＤ３４及びＰＥ−ＣＤ３８抗体で染色して、ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-及び下側及び前方散乱基準を共に満たす細胞が分離される。ＣＤ３４⁺ ／ＣＤ３８^-細胞は通常全ＣＤ３４⁺細胞の５−１０％程度を構成しており、実際の選別回収率が５０％の場合、１回の選別で２−５ｘ１０⁴ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^- 細胞を得ることができる。選別されたＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-細胞ではその純度が優れていた。選別されたＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-細胞の原始的な性質はそのほとんどがＣＤ４５Ｒａ^-lo／ＣＤ７１^-lo表現型を示すことによって実現されている。ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-ポピュレーションはいくつかの例ではＴｈｙ−１^lo（ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-細胞の訳１０−２５％）とＴｈｙ−１^-（ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-細胞の７５−９０％程度）サブセットにさらに分割される。約２−１０ｘ１０³ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／Ｔｈｙ−１^lo増強細胞を通常そうした選別で回収することができる。これは顕微注射及び機能アッセイにおいて用いられる脊髄血液細胞の原始的（ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-、ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／Ｔｈｙ−１^lo）のポピュレーションを増強する方法を提供してくれる。実施例７形質導入されたＣＤ３４⁺、ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８／ＴＨＹ−１^lo細胞によるｒｓＧＦＰの表現本実施例ではＤＮＡを顕微注射された細胞における一時的なレポータ遺伝子表現が示される。ｒｓＧＦＰレポータは用いられたＤＮＡである。これは追加的な抗体のラベリングや酵素アッセイを行う必要なしで遺伝子表現の迅速な評価を可能にしてくれる。細胞を単離してフィブロネクチンに取り付けた。細胞には一般的に顕微注射用緩衝液にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ／エンハンサの制御下でヒト化ｒｓＧＦＰ蛋白質を表現するプラスミドＤＮＡ１００−２５０ｎｇ／ｍｌ程度の微細滴下溶液を顕微注射用緩衝液に溶かしたもので顕微注射される。０．２＋／−０．０２ミクロン外径の顕微注射用針が現在用いられている。ｒｓＧＦＰ表現はｒｓＧＦＰ検出用に最適化されたフィルター・セットを用いて蛍光顕微鏡によってモニターされる。注入後５−２４時間で、注入された細胞の１０−１５％でｒｓＧＦＰ表現が観察された。この頻度は培養及び観察の時間の経過と共に徐々に減少するが、表現細胞（及び少数の分割、表現細胞）は顕微注射から４− ５日後になっても観察された。ＦＩＴＣ−デキストラン注入の結果は注入された細胞の３０−５０％程度が注入された物質をかなり伝達し（注入２４時間後）、そしてうまく注入された細胞の２０−５０％が注入から５−２４時間後にｒｓＧＦＰを一時的に表現した。一般的に、ｒｓＧＦＰ表現細胞は非常に良好な状態で、形状は正常であるように見える。しかしながら、その状態が時間の経過と共に劣化する表現細胞も存在する。ＣＤ３４⁺、ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-、及びＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／Ｔｈｙ−１^loボピュレーションの間に表現頻度に重大な違いは観察されなかった。このデータは原始性ＣＤ３４⁺／ＣＤ３８^-／Ｔｈｙ−１^lo細胞内での形質導入遺伝子表現にとっての否定的な証拠をもたらす。ｒｓＧＦＰ表現細胞の数が徐々に減っていく傾向を根絶するためにはさらなる研究が必要であろう。しかしながら、ほとんどすべての表現が融合されないＤＮＡコピーからのものであり、表現は非融合コピーが劣化するので、このパターンは予想されないことではない。実施例８ＡＡＶＲｅｐ⁷⁸ Ｍ−ＭｕＬＶインテグラーゼ蛋白質の表現及び精製顕微注射されたＤＮＡ配列の融合は、本発明のいくつかの側面で、それを特殊なＡＡＶ（ＩＲＴ）又はＭ−ＭｕＬ（ＬＴＲ）配列を側鎖し、それを蛋白質（それぞれＡＡＶＲｅｐ⁷⁸又はＭ−ＭｕＬＶインテグラーゼ）と共に共接種することによって容易にされ、それによって、これらの配列と相互作用することによってその融合が増強し、及び／又は容易にする。バクテリア的に表現され精製された蛋白質をこれらの研究を用いた。ＡＡＶＲｅｐ⁷⁸に融合されたマルトース結合蛋白質で構成された融合蛋白質はバクテリア内で表現される。アミロース・カラム（ＭＢＰ−Ｒｅｐ⁷⁸１２０ＫＤ、得られた総蛋白質−１ｍｇ、図４）を２回通過させることでほぼ９０−９５％の純度まで精製された。用いられたＭＢＰ −Ｒｅｐ⁷⁸表現構成物はＢａｔｓｕら（１９９５）に述べられている。同じ方法で精製されたＭＢＰ−Ｒｅｐ⁷⁸融合蛋白質はＡＡＶＩＴＲへのイン・ビボでの結合、エンドヌクレアーゼ活性、及びヘリカーゼ活性を示すことが報告されている［Ｂａｔｓｕら、１９９５］。本研究者達が精製した物質はＡＡＶＩＴＲ配列への結合を示している。別の実験はＭＢＰ−Ｒｅｐ⁷⁸のＡＡＶＩＴＲ配列への結合は配列に固有であり（つまり、比較対象の無関係なＤＮＡ配列にはほとんど結合しない）、ＩＴＲヘアピン構造の予想されるエンドヌクレアーゼ切断をもたらした。これらのデータは精製されたＭＢＰ−Ｒｅｐ⁷⁸蛋白質がＲｅｐ⁷⁸だけの場合と同様のイン・ビトロ活性を有していることを示している。従って、それが顕微注射された細胞内で活性を示すことが予想される。融合したＭＢＰ配列が融合活性に影響を及ぼす場合は、それらは因子Ｘａによる切断でＲｅｐ⁷⁸から取り除かれる（因子Ｘａによる切断サイトはＭＢＰとＲｅｐ⁷⁸との間の融合サイトに存在する）。ＭＢＰ−インテグラーセ融合蛋白質の表現のための同様の構成物が本発明者の研究室でもつくりだされている（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９３に述べられているＭ−ＭｕＬインテグラーゼ配列）。この表現構成物の配列決定によって適切なフレーム内融合が確認された。融合蛋白質はバクテリアですでに過剰表現されており、アミロース上を１回通過させることで７０−８０％の純度までに精製されている（図５。ＭＢＰ−インテグラーゼ、８３ＫＤ）。同様のＧＳＴ −及びヒスチジン−インタグラーゼ融合もイン・ビトロでの融合作用を示すことがすでに表明されている。この場合も、ＭＢＰがイテグラーゼ活性に干渉するのであれば、ＭＢＰを因子Ｘａ切断によって解放する。また、ＧＳＴ−インテグラーゼ融合蛋白質が表現、精製される［Ｄｏｔａら、１９９５］。実施例９線形化ＬＴＲ−ＤＮＡ及びＩＴＲ−ＤＮＡ構成物造血性幹細胞での融合を評価するために、赤方変移緑色蛍光蛋白質（ｒｓＧＦＰ）レポータとヒトＭＧＭＴ遺伝子の両方を表現することができる構成物を用いる。ｒｓＧＦＴレポータ遺伝子は本研究者達によって顕微注射で用いられている。それは追加的な酵素のラベリンや酵素アッセイの必要性なしに形質導入遺伝子表現の迅速なアセスメントを可能にしてくれる。加えて、それはヒトへの移植前にうまく形質導入された幹細胞のイン・ビトロ選択のためにも用いられる。幹細胞でのその表現がそれらを特定のアルキルか剤の毒性効果から護り［例えばＢＣＮＵ，［Ｍａｚｅら、１９９６］）遺伝子修正幹細胞の迅速なイン・ビトロでの選択を可能にしてくれるので、ＭＧＭＴ形質導入遺伝子が用いられる。我々の考えでは選択可能なマーカー遺伝子としてＭＧＭＴを含めると最終的には治療用遺伝子（例えば、グルコセレブロシダーゼ）と共形質導入される幹細胞のイン・ビボでの増強が可能になる。構成物（図６，これらの構成物はすべてすでに作成されている）からのｒｓＧＦＰ及びヒトＭＧＭＴが用いられる。未熟および成熟した造血性細胞と線維芽腫とで高度に活性を示すホスホグリセレート・キナーゼ（ｐｇｋ）プロモータを用いてｒｓＧＦＰ遺伝子とＭＧＭＴ遺伝子の両方の表現を発生させるために用いられる。休止造血性幹細胞の安定したイン・ビトロ形質導入のためには２つの戦略がある。第一の方式はエクス・ビボで休止細胞で直接融合イベントを行わせるものである（『融合−休止』と呼ばれる）。第二の方式はＤＮＡを（融合酵素と共に）休止細胞に伝達して安定した形質導入中間物を発生させ、そのイン・ビボ環境に返されて自己更新細胞***を受けると融合される（『融合休止／循環』）。細胞が循環サイクルに入るとさらに融合できる休止細胞内でのそうした形質導入中間物の存在に関しては証拠が存在する［Ｎａｌｄｉｎｉら、１９９６］。ＡＡＶＩＴＲを含むプラスミド・バックボーンがつくられ、ｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ配列をＰａｃＩ及びＡｓｃＩサイトとの間に挿入してｐｒｓＧＦＰ− ＭＧＭＴ／ＩＴＲを発生させた。線形化ＩＴＲ側鎖ｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ配列はＦｓｅＩ及びＳｆｉＩ消化によって得られる。プラスミド・バックボーンを含んでいない円形化ｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＩＴＲ配列はに図９に示す用に発生された。ＳｆｉＩサイトはｐｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＩＴＲ内に運ばれて第二のＦｓｅＩサイトをつくった。この構成物は線形化され、ＦｓｅＩ消化でバックボーン・プラスミド除去され、ＦｓｅＩサイトで結紮されて円形化され、環状分子は顕微注射前にアガロース・ゲル上で精製された。ＬＴＲ側鎖形質導入遺伝子とインテグラーゼの共伝達及びＩＴＲ側鎖形質導入遺伝子とＲｅｐ⁷⁸の共伝達とは融合の割合を増大させることが予想される。線形及び環状ＩＴＲ含有構成物の両方を調べることによってどの基質Ｒｅｐ⁷⁸が野生種ＡＡＶ融合のために用いられるのかが示される。裸のＤＮＡ（例えばリポソームなどの伝達媒体内にないＤＮＡ）とインテグラーゼあるいはＲｅｐ⁷⁸の細胞核への共伝達はこれまで試みたことがなく、本発明の一部として、遺伝子的に修正する重要な細胞タイプに対するより改良された方法を提供してくれる。実施例ＬＴＲ／インテグラーゼ及びＩＴＲ／Ｒｅｐ⁷⁸に媒介された融合レトロウイルス（レンティウイルス（例えばＨＩＶ−１）とタイプＣレトロウイルス（例えばＭ−ＭｕＬＶ）の両方）及び野生種ＡＡＶの特性は高い効率で標的細胞のクロモソーム性ＤＮＡ内に組み込む能力である。感染の多重性が十分に高ければ、標的細胞の全部でなくてもそのかなりの部分が融合されたプロウイルス性コピーを獲得する。イン・ビトロ融合反応に必要なレトロウイルス性ＬＴＲ配列だけが１０−１２ｂｐＬＴＲ末端である［Ｇｏｆｆ、１９９２；Ｇｏｏｄａｎｉら、１９９５；Ｒｅｉｃｉｎら、１９９５；ＬａＦｅｎｉｎａら、１９９１］。レトロウイルス性インテグラーゼ酵素はこれらの配列と相互作用してイン・ビトロ及びイン・ビボでの融合を促進する［Ｇｏｆｆ、１９９２；Ｄｏｏｄａｚｉら、１９９５；Ｒｅｉｓｉｎら、１９９５；ＬｅＦｅｍｉｎａら、１９９１］。レトロウイルス・ベクターの融合に関してはサイト固有性はなさそうであるが、転写的に活性な遺伝子のクロマチンへの融合に対する優先性があり［Ｖｉｊａｙａら、１９８６；Ｗｉｔｈｅｒｓ− Ｗａｒｄら、１９９４］、さらにヌクレオソームの立体配座に対する優先性がある［Ｐｒｕｓｓら、１９９４］。野生種のＡＡＶはヒトのゲノムの特定の領域に優先的に融合する点が独特である。ｒｅｐ^-ＡＡＶベクターはｒｅｐ⁺ＡＡＶベクターと同様のサイト固有融合の同じパターンを有していないので、ＡＡＶＲｅｐ⁷⁸ はクロモソーム１９優先融合にとって必要である［Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２］。Ｒｅｐ⁷⁸蛋白質は融合に先立ってＩＴＲ内部の１２ヌクレオチド配列とクロモソーム１９（ＡＡＣＳ１領域）上の同様の配列との間の複合体の形成を媒介したり、ＡＶＳ１内での鎖固有分断の導入など、クロモソーム１９固有ＡＡＶ融合においていくつかの重要な役割を果たしていると考えられる。ＩＴＲ側鎖遺伝子（ＬａｃＺ）とＲｅｐ⁷⁸表現構成物とによる細胞の共感染が安定したＬａｚ表現細胞の数を１０倍増加させたことが最近報告された。加えて、融合物の大多数はクロモソーム１９固有であり、サイズが最大３５ｋｂまでの構成物が融合できた−それらが少なくとも１つの単−ＩＴＲを含んでいた場合−［Ｎａｔｓｏｕｌｉｓら、１９９５］。これらの結果はＩＴＲ側鎖反連絡通路とＲｅｐ⁷⁸蛋白質との単純な伝達で、サイト固有に、あるいはサイト優先で起きるらしい融合を促進することを示唆している。可能であればＮＤＡ／蛋白質複合体として提供されたＤＮＡと精製インテグラーゼあるいはＲｅｐ⁷⁸蛋白質を提供することは表現構成物から細胞内で融合蛋白質をつくりだすよりは有利である。予めΔＬＴＲ／インテグラーゼ又はＩＴＲ／Ｒｅｐ⁷⁸蛋白質複合体を提供することで、表現された蛋白質が細胞質から核に転移して、その後ΔＬＴＲ又はＩＴＲ配列を見つけてそれと複合体を形成する必要性がなくなる。ＨＩＶ−１は休止細胞の核にプロウイルス性ＤＮＡを提供して休止マクロファージを安定して形質導入することができる［Ｗｅｎｂｅｒｇら、１９９１；Ｌｅｗｉｓら、１９９２］。ＨＩＶ−１に基づくベクターがＧ_o細胞に安定して融合できるかどうかはまだ実証されていないが、それらは休止Ｒａｔ２０８Ｆ線維芽腫内で安定した形質導入中間物をつくりだすことができる（融合−休止／サイクリング）［Ｎａｌｄｉｎｉら、１９９６］。最初の感染から８日後の休止状態から得られた細胞はサイクリング状態で感染されたものの５０％に相当する安定した形質導入頻度を有していた。我々は当初（Ｍ−ＭｕＬＶインテグラーゼではなく）ＨＩＶ−１インテグラーゼを選んだ。ＨＨＩＶ−１はイン・ビトロで『フル・サイト』融合を行うこと［Ｇｏｏｄａｚｉら、１９９５］及び休止細胞を安定して形質導入することができることは知られている。野生種Ｍ−ＭｕＬＶとＭ−ＭｕＬＶベクターとを予め複合化しておくと休止細胞の核への移送ができないので［Ｍｉｌｌｅｒら、１９９０］、Ｍ−ＭｕＬＶインテグラーゼが休止状態で融合を達成できるかどうかは不明である［Ｍｉｌｌｅｒら、１９９０］。しかしながら、これまでの研究ではＭ−ＭｕＬＶ配列の実際の融合が細胞***中に起きる必要がないことを示している［Ｒｏｅら、１９９３］。融合の高い頻度はｒｅｐ^-ＡＡｖベクターで形質導入された細胞に対しても観察されている［Ｍｕｚｙｅｓｋａ、１９９２］。融合前にＡＡＶベクターＤＮＡの正確な構造は分かっていないが、それがＩＴＲによって側鎖された線形二重体として存在しているか、あるいは野生種タイプＡＡＶの場合に考えられたように、融合前に核内で環状になっているのかもしれない［Ｌｉｎｄｅｎら、１９９６］。ＡＡＶベクターＤＮＡはＩＴＲ末端を通じてクロモローム性ＤＮＡに結合した１つまたは複数のタンデム・コピーとして細胞のＤＮＡ内に融合する［Ｆｌｏｔｔｅ及びｃａｒｔｅｒ、１９９５］。他の形質導入遺伝子配列に結合されるた場合、ＩＴＲだけで十分に高い割合で融合する［Ｐｈｉｌｉｐら、１９９４］。非循環細胞を直接形質導入するｒｅｐ^-ＡＡＶベクターの能力に関しては論争がある［Ｐｒｏｄｓａｋｏｆｆら、１９９４、Ｒｕｓｓｅｌら、１９９４］。ＡＡＶベクターは形質導入に関して循環細胞を好むが、それらは低い頻度でではあるは非循環細胞にも直接融合する（『融合−休止』）［Ｐｏｄｓａｋｏｆら、１９９４］か、あるいは非循環細胞内で単鎖エピソームとして存在し、その後、その細胞がＳ相を通過する際に二重鎖ＤＮＡとして融合する（『融合−休止／循環』）［Ｒｕｓｓｅｌら、１９９４］。線形化ΔＬＴＲ側鎖ｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ配列の融合を促進するインテグラーゼの能力。ｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ配列はＨＩＶ−１ＬＴＲ配列によってほとんどの末端２０で側鎖されており、ｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ΔＬＴＲによって側鎖される。この線形構成物は、長さがｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ配列に対応する１５塩基及びＨＩＶ−１ＬＴＲ末端と同じ２０塩基のプライマー３５塩基を用いたＰＣＲで発生させられる。細胞はインテグラーゼで予備培養したｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ΔＬＴＲのＰＣＲ発生線形分子か、あるいはｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ΔＬＴＲのＰＣＲ−発生線形分子だけのいずれかで顕微注射される。２０−３９ｋｂ配列は最適化手順を用いてＰＣＲ増幅で発生させることができるので、この方式はより大型の形質導入遺伝子構成物にも一般的に適用できる。ＩＴＲ／Ｒｅｐ⁷⁸ 戦略の評価のために、細胞をＲｅｐ⁷⁸ で予備培養した線形化ｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＩＴＲか、ｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＩＴＲだけのいずれかで細胞を顕微注射する。環状二重鎖プロウイルス性ＤＮＡは正常なＡＡＶ融合のための適切な基剤となる可能性がある。これはｃｉｒ− ｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＩＴＲを用いて評価される。統合酵素が標的ＬＴＲあるいはＩＴＲ配列を場所をつきとめてそれに結合する可能性を最大限化するために、ＤＮＡと多孔質を細胞への顕微注射より前に培養される。融合頻度の最適化には以下の実験パラメータ：つまり、ａ）細胞１個あたりに誘導されるＤＮＡ分子の数、ｂ）ＤＮＡ分子１個あたりのインテグラーゼあるいはＲｅｐ⁷⁸分子の数、及びｃ）インテグラーゼ又はＲｅｐ⁷⁸によるＤＮＡの予備装填の条件。加えて、ｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＩＴＲ融合イベントがＡＡＶとクロモソーム１９配列との間の潜在的結合部にまたがるプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって、野生種ＡＡＶによって優先的に用いられるクロモソーム１９領域内にあるかどうかについての判定が行われる。実施例１１本実施例はインテグラーゼ_HIV-1とΔＬＴＲ_HIV-1配列によって側鎖された形質導入遺伝子構成物との共伝達による安定した形質導入の頻度の向上のための本発明の実用性を示すものである。線形化ΔＬＴＲ_HIV-1側鎖ｐｇｋ−ｔｋ配列の融合を促進するインテグラーゼ_HIV-1の能力もさらに認められた。ほとんどのｐｇｋ−ｔｋ配列はほとんどの末端２０ｂｐＨＩＶ−１ＬＴＲＵ３／ｕ５配列の大部分によって側鎖されて、ｐｇｋ−ｔｋ／ΔＬＴＲ_HIV- ₁ （図７）。この線形構成物は長さがプライマー３５−３６塩基で、１５−１６塩基がｐｇｋ−ｔｋ配列末端に対応しており、２０塩基がＬＴＲ_HIV-1Ｕ３／Ｕ５末端と同じであるＰＣＲによって線形構成物によって作成された。Ｒａｔ−２ｔｋ（−）細胞がインテグラーゼ_HIV-1で予備培養されたｐｇｋ−ｔｋ／ΔＬＴＲ_HIV-1のＰＣＲ発生線形分子かｐｇｋ−ｔｋ／ΔＬＴＲ_HIV-1のＰＣＲ発生線形分子だけのいずれかを用いて顕微注射された。２０−３０ｋｂ配列は最適化手順を用いてＰＣＲ増幅によって発生することができるので、こうした方式は一般的により大型の形質導入構成物に大して適用されるべきである。ＨＩＶ−１_NL4-3 インテグラーゼ酵素が用いられた。このインテグラーゼ酵素はそのイン・ビトロ融合能力に影響を及ぼさずにそれをさらに可溶性にするために２つのアミノ酸の場所で修正されている。こうした一般的技術は当業者には公知であり、Ｊｅｎｋｉｎｓら、１９９６内に述べられている。表現構成物ｐＩＮＤ．Ｈｉｓ．Ｓｏｌを用いて必要に応じてさらに別の酵素を表現、精製してもよい。Ｒａｔ−（ｔｋ−）細胞を１０％仔ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌペニシリン、１００マイクログラム／ｍｌストレプトマイシン、及び２ｍＭグルタミンを含んだダルベッコの修正イーグル培養液（ＤＭＥＭ）内で成長させられた。注入の前日に、細胞を組織培養表面に０．４ｍｍの矩形グリッドを刻み込んだ３５ｍｍ皿１個あたり２０，０００個の細胞の割合で入れた。ＤＮＡあるいはＤＮＡ＋蛋白質は約０．３−０．４５ミクロンの先端外径を有するホウケイ酸を用いて細胞の核に伝達した。ＤＮＡの溶液だけが１０ｍＭＭｇＣｌ₂を含んだ１ｘ顕微注射緩衝液（５０ｍＭＨｅｐｅｓ［ｐＨ７．２］、１００ｍＭＫＣｌ、５ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄）にｐｇｋ−ｔｋ／ΔＬＴＲ_HIV-1（２３ｎＭ）を解かした約４２ｎｇ／マイクロリッターを含んでいた。５−１０フェムトリッターの注入は細胞１個あたり約７０−１５０ＤＮＡ個の分子を提供すると推定されている。ＤＮＡ及び蛋白質の溶液は同じ濃度のＤＮＡと１７ｎｇ／マイクロリッターのインテグラーゼ_HIV-1（４４５ｎＭ）を含んでいた。この値を選んだのは注入されたＤＮＡの１分子あたり注入された分子２０個程度を生み出すためである。ＤＮＡ溶液は０．１ミクロン・フィルターを通過させてＭｇＰＯ₄と考えられるすべての団粒物を除去した。通常、２０−３０個の細胞を３５ｍｍ皿に注入してグリッド化プレートの１グリッドあたりたった１個の注入細胞があるようにした。これが行われたのはＨＡＴ（０．１ｍＭナトリウム・ヒポサンチン、０．４マイクロＭアミノプテリン、１６マイクロＭチミジン）を含んだ培養液内で選択した後に安定した形質導入コロニーのカウントをし易くするために行われた。注入の次の日、培養液を取り出して、ＨＡＴを含んだ培養液を加えた。ＨＡＴ培養液は３−５日毎に交換した。注入から５−７日後、皿を顕微鏡で調べて、安定した形質導入細胞から成長してくる潜在的なコロニーの位置をその皿の底面につけた。コロニーは細胞の増殖に貢献した５０−２００個の細胞で構成されていた。これらのコロニーを３週間にわたり１週間に２度皿を調べることでチェックした。安定したコロニーだけ（例えば、注入３週間後に存在するもの）を分析した。この研究はインテグラーゼ_HVI-1を使う場合と使わない場合に分けてｐｇｋ− ｔｋ／ΔＬＴＲ_HVI-を用いて行われた。その結果を表１に示す。これらのデータはインテグラーゼ_HIV-1を共伝達したｐｇｋ−ｔｋ／ΔＬＴＲ_HIV-1に対する安定した形質導入因子の頻度が４．５％で、ｐｇｋ−ｔｋ／ΔＬＴＲ_HVI-1の場合は１．９％であった。安定した形質導入頻度が２．４倍増大したことはペア化学生テストで有意（Ｐ＜０．０５）であることが示された。例えば、１）ＤＮＡ分子に対するインテグラーゼ分子の相対的割合、２）顕微注射緩衝液の組成、３）顕微注射前にインテグラーゼと共にＤＮＡを予備培養するための条件（例えば温度）などを変えることによってさらに最適化が図られるであろう。本発明の技術を用いることによって安定した形質導入効率のさらなる向上が可能であろう。表１ＨＩＶ−１ ΔＬＴＲ／ＨＩＶ−１インテグラーゼ戦略 PGK-tk/ ΔLTR HIV-1 PGK-tk/ ΔLTR HIV-1+インテグラーゼ HIV-1 2/56(3.6％) 1/47(4.5％) 3/59(5.1％) 5/62(8.1％) 1/50(2％) 3/50(6％) 0/50(0％) 2/50(4％) 0/50(0％) 2/50(4％) 0/50(0 ％) 1/50(2 ％) 6/315(1.9％) 14/309(4.5％) ２．４倍改良表１にデータの統計的分析の結果得られた安定的なＤＮＡ組込を含む細胞の数に統計的に有意な改良が見られることを示す。この分析は統計的な有為な改良を示す（共に行ったスチューデントｔ検定（２−テイル）、ｐ＜．０５）。実施例２ＲＥＰ⁷⁸及びＡＡＶＩＴＲ隣接トランスジーン構築物の共配送を伴う安定的形質導入本実施例は本発明をタンパク質の接合のための使用を提供する。実施例によれば、本発明で使用されるタンパク質は酵素、Ｒｅｐ⁷⁸である。この技術分野のこれらの一般的な技術は本明細書で使用されるものとして与えられた他の多くのタンパク質を評価する。本実施例はＡＡＶＩＴＲ配列によって隣接したトランスジーン構築物を一緒に伴ったＲＥＰ⁷⁸の共配送を伴う安定的形質導の頻度を増加させるために本発明の効用を示す。ＩＴＲ／ＲＥＰ⁷⁸構想を評価するために、細胞はＲＥＰ⁷⁸が共配送された線状、または線状ＰＧＫ−ｔｋ／ＩＴＲのみのいずれかを微量注入された。ＩＴＲを側面配置した線状ｐＧＫ−ｔｋ配列は、ＦｓｅＩ及びＳｆｉＩによる消化によって獲得され、次にバクテリアプラスミド配列を除去するためにゲル精製された。図４に記載された精製ＭＢＰ−Ｒｅｐ⁷⁸が使用された。ＭＢＰ −Ｒｅｐ⁷⁸は発明者により以前に、試験管内においてＩＴＲ結合及びエンドヌクレアーゼ反応を活性化することが観察されていた。実施例１１に記載のように実施されたこれらの研究では、ＤＮＡ溶液がｐＧＫ−ｔｋ／ＩＴＲを５０ｎｇ／ミリリットル（２３ｎＭ）の濃度で含み、また、ＤＮＡ／タンパク質溶液がｐＧＫ −ｔｋ／ＩＴＲを５０ｎｇ／ミリリットル及びＭＢＰ−Ｒｅｐ⁷⁸を５０ｎｇ／ミリリットル（２３ｎＭ）の濃度で含み、またＭｇＣｌ₂が２ｍＭであることが望まれる。これらの値は、注入ＤＮＡ分子あたりおおよそ２０分子の注入タンパク質を生ずるように選択された。細胞あたり配送される正確な容積は不明だが、細胞あたり７０〜１４０のＤＮＡ分子を配送する５〜１０フェムトリットルが注入される。この結果は表２で占めさている。Ｒｅｐ⁷⁸がｐＧＫ−ｔｋ／ＩＴＲと共に含まれる場合には、安定的形質導入が２．３倍増加した頻度で達成される。これらの研究では、ＭＢＰ−Ｒｅｐ⁷⁸タンパク質が微量注入管にＤＮＡ溶液が積載される直前に添加される。ＤＮＡ／タンパク質溶液が微量注入の直前に準備されない初期の実験（未掲載）と比較すると、ＤＮＡへのタンパク質の添加のタイミング重要であることのように思われる。表２ＡＡＶＩＴＲ／Ｒｅｐ⁷⁸戦略 PGK-tk/ITR PGK-tk/ITR＋ReP⁷⁸ 3/72(4.2％) 5/80(6.3％) 4/76(5.3％) 8/66(12.1％) 2/76(2.6 ％) 7/72(8.7 ％) 9/224(4.0％) 20/218(9.2％) ２．３倍改良実施例１３核酸組込に対する環状構築物本実施例は組込を容易にする共有結合により閉じた環状物の発生に対する本発明の効用を示すものである。環状二重鎖プロウイルスＤＮＡは通常のＡＡＶ組込に対する適切な物質であり、レトロウイルス組込が可能であるようなので、トランスジーン構築物の第一の環状化に有用であるようである。このような環状構築物は図９においてｃｉｒ−ｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＩＴＲとして示されている。ＡＡＶＩＴＲｓを含むプラスミドバックボーンが構築され、ｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ配列がｐｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＩＴＲを発生させるようにＰａｃ１及びＡｓｃ１部位の間に挿入された。線状ＩＴＲ側面配置ｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ配列が上記記載のようにＦｓｅＩ及びＳｆｉＩで消化することで獲得された。ｐｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＩＴＲにおけるＳｆｉＩ部位（バックボーンプラスミド配列）は第二のＦｓｅＩ部位を作り出すため転換された。分子はＦｓｅＩ消化によって線状化され、移動させられる。分子はＦｓｅＩ部位環状に再結合される。環状分子は微量注入の前にアガロースゲルによリ精製される。上記実施方法は、トランスジーン構築物のレトロウイルスインテグラーゼ媒介組込を容易にすることに使用することもできると考えられる。図６で示してある ΔＬＴＲ配列（又は完全なＬＴＲ配列でも可能）を含む構築物はすべて線状であるが、環状構築物上のΔＬＴＲ又はＬＴＲ配列に側面配置される示されたトランスジーンは組込の頻度の増加を導くであろう。例えば、レトロウイルス性プロウイルス組込のための物質はＬＴＲで側面配置された線状分子であると思われてはいるが、レトロウイルスに感染された細胞の核に存在する環形プロウイルス分子（ＬＴＲを１又は２個のいずれかを含む）も組込の潜在力のある物質であると考えられる。実際に、このような環形構築物を使用した場合、レトロウイルスインテグラーゼタンパク質を伴う共配送は線状形のものと比較して組込の増加した能力を導くようである。このような環状構築物に含まれるＬＴＲ又はＬＴＲ末端配列は、お互いに並列配置、又はある距離をとった離れた配置のいずれかであると考えられる。実施例では、この距離は核酸塩基の数で定義された。例えば、第１と第２のＬＴＲ末端配列が離れた間の核酸塩基数は２から約２００までの間であることができた。環状核酸のある具体例では、ＬＴＲ末端断片は約１０から約２０ヌクレオチド塩基離れていた。実施例１４タンパク質に融合したレトロウイルスインテグラーゼタンパク質使用によるトランスジーン組込の部位特異的な目標設定野生型ＡＡＶはヒトゲノムの特異的領域に選択的に組み込まれる。ＡＡＶＲｅｐ⁷⁸は染色体１９特異的に組込が要求される、なぜならｒｅｐ−ＡＡＶベクターはｒｅｐ+ＡＡＶベクターと同じ部位特異的な組込の形式を持たないからである（Muzyczka,1992）。Ｒｅｐ⁷⁸タンパク質は染色体１９特異的ＡＡＶ組込にいくつかの本質的な役割をになっていると考えられている−−それは、組込の以前にＩＴＲ内の１２ヌクレオチドの配列及び染色体１９の同様な配列（ＡＡＶＳ１領域）との間の複合体の形成の媒介、及びＡＡＶＳ１内の鎖特異的な切断の誘導である（Linden et al.,1996）。それだけで、Ｒｅｐ⁷⁸はそれ自身特異的ＤＮＡ配列への結合活性、及びインテグラーゼ活性の両方を持つタンパク質として記載されたようである。転写活性遺伝子のクロマチン内での組込に対する選択性（Vijaya et al.,1984；Withers-Ward et al.,1994）及びヌクレオソームの立体配座に関しての選択性はある(Pruss et al.,1994）けれども、レトロウイルスベクターの組込には部位特異性は無いと思われる。しかしながら、結論として高特異性ＤＮＡ結合ドメインと連接するインテグラーゼを使用することにより正確な組込部位に目標設定ことができるようである（図２）（Goulaouic and Chow,1996；Bushman,1994 ）。ＤＮＡ結合ドメインは既存のＤＮＡ結合タンパク質、又は特異的ゲノムＤＮＡ配列に対する高親和結合特異性を持つように考案されて合成された新たなタンパク質のいずれにも由来することができた。例えば、グロビン遺伝子座に対するトランスジーンの特異的目標設定（レトロウイルスインテグラーゼをＧＡＴＡ− １又はＮＦ−Ｅ２赤芽細胞特異的転写因子を融合することにより）が赤芽細胞細胞で特異的なトランスジーンの発現を容易にする。別の可能性のある例は、リポソーム蓄積症のための治療的遺伝子の長期間の発現を容易にする可能性のある単球／マクロファージの「開放」として知られているクロマチンに対する組込の目標設定であろう。特異的なＤＮＡ配列へのＤＮＡ結合タンパク質の親和性及び特異性を、タンパク質及び突然変異が起こされた部位の構造分析（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン及び目標ＤＮＡとの間のＸ線結晶学的及び／又はＮＭＲ分析）増加させることができるようである。例えば、ＤＮＡに対して増加した親和性を有するｃ−ｍｙｃタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの突然変異が報告されている。実施例１５組込酵素を発現する構築物の使用ある具体例においては、本発明は細胞に対する１次及び２次ＤＮＡ配列の共配送を提供する。この１次及び２次核酸配列は二つの分離した構築物、一つはふさわしいＬＴＲ又は配列ＩＴＲにより側面配置された対象トランスジーンを含むもので、もう一方は、タンパク質、特に細胞性染色体ＤＮＡにトランスジーン取り込みを容易にさせることができる酵素（すなわち、レトロウイルスインテグラーゼ又はＲｅｐ⁷⁸）をコードする発現構築物のいずれかとして生産される。微量注入はトランスジーン構築物及びインテグラーゼ発現構築物の両方を遺伝的に修飾される細胞の核に共配送させることができる。細胞質におけるインテグラーゼタンパク質の発現及び翻訳の後、組込を容易にするためにトランスジーン構築物と相互作用する核への転位しなければならないことが不可欠となる。あるレトロウイルスインテグラーゼは細胞での発現の後、核に局在することが以前に記載されている。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンセー配列の支配下でＭ−ＭｕＬＶインテグラーゼを発現する構築物は本発明で調製されている。加えて、ＣＭＶプロモーター／エンハンセー配列の支配下でＡＡＶＲｅｐ⁷⁸ タンパク質を発現する構築物もまた発生した。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Title of the invention Nucleic acid constructs and their use for direct nucleic acid integration into cells This application filed on Dec. 23, 1996 with US Provisional Application No. 60 / 033,81 6 for a claim. Background of the Invention Field of the invention The present invention relates to the technical field of nucleic acid integration into cells. The present invention The techniques described herein correct and correct a number of genetic defects associated with a particular genetic defect. And / or can be used as part of a regulated gene therapy procedure. It is also related to the field of treatment.Background art Hematopoietic stem cell gene therapy offers great potential for the treatment of various diseases. Trunk At least the following three requirements must be met for long-term efficacy of vesicle gene therapy: Must be done: 1) direct gene modification of hematopoietic stem cells, 2) transduction of stem cells and progeny cells Row retention, and 3) long-term expression of the transduced gene in appropriate cells. The stem cell compartment, which may be heterogeneous, is complete within the transplanted host. Perform both long-term reconstitution of the entire hematopoietic system and a degree of self-renewal Rare, lifespan possible Composed of long and basically dormant cells [Ogawa, 1993 ]. Stem cells take months to become hematopoietic after transplantation, Must be augmented with a large number of short-term reconstituted cells to enable rapid transplantation. [Jones et al., 1995]. In most gene therapy applications It seems that modifying only the stem cells seems sufficient, and marks derived from ancestors Prolonged generation of genetically marked stem-derived cells after rapid reconstitution of uncommitted cells A transplant is performed. Introduced therapeutic genes are transferred from stem cells to progeny cells requiring gene correction. You have to transport it well. Currently available episomal plasmids are common Artificial human chromoso is waiting for further development without selective pressure In the absence of a team, it shows only a small level of persistence [Harringto n et al., 1997], Chromosomal integration is at present stage for gene retention. This is the most executable method. Therapeutic genes are expressed in the appropriate cells for the life of the patient to correct for genetic defects You need to keep being. Gene therapy for lysosomal storage seconds Regardless of whether soluble or membrane-bound enzymes are involved in these diseases, Sufficient levels of the corrective enzyme are produced throughout the life of the monocyte / macrophage. Need. Insufficient production of enzymes generally leads to a relapse of the disease. It is well known that major problems currently exist in the field of stem cell gene therapy. [Orkin and Motulsky]. In the mid-1980s, retro ui Since the development of Lus transduction, hematopoietic cells have become Treatment technology. However, primitive hematopoietic cells Transduction reveals significant deficiencies in meeting requirements 1) and 3) above became. Currently used in laboratory research, animal models, and now clinical trials Retroviral vectors are used to transform quiescent human hematopoietic stem cells Did not transduce and thus did not meet the first condition above [M Iller et al., 1990; Kohn et al., 1995; Dick et al., 1996; No. lta et al., 1996]. This means that months after transplantation in human trials, The frequency of appearance of peripheral leukocytes marked with is extremely low (0.1-1%). This indicates that the transduction rate of stem cells is less than 1%. [Kohn et al., 1995; Borner et al., 1993]. Efficient transduction Only isolated human hematopoietic cells are circulating ancestors and long-term culture-initiating cells (LT CIC) [Cassel et al., 1995; Hughes et al., 1989]; Before being replaced by progeny of unmodified stem cells for a period of time (about 2-12 Months) can produce blood cells in vivo. These losses in human stem cells The desired results are obtained with stem cells and later cells as normally demonstrated in a mouse system. Shows efficient retroviral transduction and vivid controls for both progenitor cells . Possibly involved in the inability to directly transduce human stem cells The three different factors are: a) the resting nature of the stem cells, and b) the letto on stem cells. Lack of a suitable receptor for the roviral envelope [Cook s and Kohn, 1995], and c) requires in vivo circulation of stem cells. Retroviral transduction conditions actually result in substantial loss of stem cell function. What could happen [Nolta et al., 1996]. Overcome these difficulties A variety of techniques have been tried to put on clothes, There is no guarantee that can be solved so far. For example, vectors based on Lentivirus Can transduce some non-circulating cells [Naldine et al. HIV-1 is resting primary CD4⁺Inability to infect lymphocytes [ Zack et al., 1990] (ie, perform only partial and unstable reverse transcription). The fact is G_OThis suggests that stem cells may also be resistant to transduction. Follow Evaluation of adeno-associated virus (AAV) vectors for stem cell transduction Considerable effort has been put into However, AAV transduction is Controversy and uncertainty about the ability to stably fuse to the resting primary cell genome [Podsakoff et al., 1994: Halbert et al., 1995; Rus. sel et al., 1994]. Even if the problems associated with gene transfer are resolved, long-term, cell type-specific Significant problems exist in meeting the third requirement above to achieve meaningful expression You. For example, the expression of a transgene transduced with a retrovirus is Human progeny cells or primate ancestral cells, and transduced mouse stems The problem is that even progeny of cells / ancestral cells are often silenced [Akkina et al., 1994; Chalita and Kohn, 1994; u et al., 1994]. In addition, these cells, which express a certain degree of expression, At the current level there are considerable differences from cell to cell [Sadelain et al., 1 995]. As a result of the expression of dysregulation, hematopoietic cells are genetically modified with correction genes. May not be able to display an effectively corrected phenotype. Interesting thing In addition, these same features of dysregulated expression were identified in early transgenic mouse expression studies. Have also been observed [Kolias and Grosveld, 1992]. Then The study is a long-term, position-independent, copy number-dependent cell type-specific table. Currently not only strong promoter / enhancer elements, but a) Proper chromatin composition to protect against the effects of chromatin (ie, An open chromatin conformation in, for example, the locus control region (LCR) -like element [ Kolias and Grosveld, 1992; Caterina et al., 1994. Talbot et al., 1990] and possibly additional elements. Sufficient genomic sequence to be transmitted in advance, and b) Also required are the intron / exon structure and sequence [Brinster et al., 1988]. Rukoto has been shown. Unfortunately, harsh protocols for retroviral vectors Package conditions (up to 8 kb insertion sequence) and AAV vector (up to 4 kb) More stringent conditions [Miller et al., 1994] may require sufficient regulatory sequences and / or Introns for therapeutic applications requiring more well-regulated gene expression / Excludes the possibility of incorporation of exon structure. For example, Recent studies on LCR sequence incorporation into torovirus and AAV vectors Indicates that the levels of transgene expression are extremely different from cell to cell. [Sadclain et al., 1995; Einerhard et al., 1995]. Powerful Splicing signal (ie, intron / exon structure) or hidden A splicing signal is desired. May interfere with the packaging by Lus [Einehand et al., 1 995]. The inability of current technology to efficiently transduce stem cells is a major issue, This suggests the need for another, new approach to transduction. Electroporation and liposomes for gene transfer to hematopoietic cells Mediated transfection techniques have been reported. However, these people Law has unique characteristics There is a question as to whether it is appropriate for stem cell gene therapy. These features A) both methods use enhanced mouse and human primitive primary hematopoietic cells Cannot be transfected at a reasonable rate [Toneguzzo and Keat ing, 1986; Harrison et al., 1996], b) transfected The number of isolated DNA molecules varies considerably from cell to cell, and c) transduction Only a small number of cells (electroporation Case 10^Four-10^FiveStable transduction [Phil) ip et al., 1994]. Available recently for particle-mediated irradiation technology Although little information is available, recent primary T cell transfection studies 2-10% transfection 5 days after irradiation for micron gold particles / DNA decoder Fraction rates have been reported [Woffendin et al.]. The size range of these particles Based on our research on needle size in the box, stem cell damage was not Will be expensive to put. Available nonviral transduction methods expected in the future It is not clear whether future applications will enable DNA and protein co-transmission Absent. Irrespective of the method of gene transfer, stem cells, especially resting stem cells, It is important to understand how columns are handled and handled. Stem cells, In particular, the fate of DNA introduced into the nucleus of quiescent stem cells [which integrates with chromosomal DNA] Little is known. Primary or paused Viral transduction of vesicles may be arrested at several points prior to fusion (For example, in the case of retroviruses, incomplete reverse transcription or incomplete nuclear transport [Miller et al., 1990; Zack et al., 1990], for AAV, single chain D Incomplete conversion of NA to double-stranded proviral DNA [Russel et al., 199 4]. This is a normal AAV or retrovirus life cycle. Makes it very difficult to focus on the process of gene transduction into stem cells. ing. Literature indicates that fusion of microinjected sequences is circulation-dependent do not do. Wild-type HIV capable of stably transducing resting macrophages -1 [Weinberg et al., 1991] and CD4H captured in the cell cycle The ability of eLa or lymphoma cells [Lewis et al., 1992] to This suggests that fusion at a glance is indeed possible. HIV-1 proviral DNA fusion is mediated by the integrase enzyme. Some studies are M- It is not necessary that fusion of Mul sequences occur during cell division [Roe et al., 1993]. , And chromatin and naked DNA both function as fusion targets in vitro Suggests that [Pryciak et al., 1992]. Wild species There is little doubt about the ability of HIV-1 to fuse to resting cells, For vectors based on IV-1, this is still conclusively demonstrated. There is no. HIV-1 based vector is stable in resting rat 208F fibroblastoma It is known that a suitable transduction mediator can be established [Nadihi et al., 1996]. . Cells obtained 8 days after the initial infection account for 50% of those infected in the circulation The corresponding stable transduction frequency was shown. How to improve the growth potential of cells when introducing genetic material into cells The need still exists in the field of medical technology. Disclosure of the invention In one aspect, the present invention provides a transgene, or a trait complexed with a fusion gene. It is involved in delivering the transgene directly to the nucleus of the cell. Thereby the cells Increases the rate of transgene integration into chromosomal DNA. Several In an embodiment, the transmission is directed to primitive spinal cord blood stem cells. This technique Surgery is a form of transduction that occurs in the case of retroviruses and AAV vectors. Will overcome obstacles. The present invention provides for the transfection of properly transduced LTR side genes. Suggests the use of integrase-mediated fusion to arrested cells . Propensity of retroviral DNA to fuse active genes to chromosomes This is temporarily open to the inventor It suggests that fusion is enhanced in the presence of chromatin. That is, the AVV vector And type C retroviruses can achieve reliable fusion to resting cells. Nothing has been reported. Generally speaking, the present invention relates in several respects to proteins and transgene constructs. Introducing nucleic acids into chromosomal nucleic acids of cells using specifically defined compositions including Provide a way to The transgene construct may further comprise a retrovirus Side chained by a terminal fragment of a long terminal repeat (LTR) such as an LTR It can be defined as including a nucleic acid sequence. This terminal fragment is the length Is about 10 to about 300 nucleotides, or about 10 to about 250 nucleotides And, in a more precisely defined embodiment, from about 20 to about 200 nucleotides in length. It is Ochido. In some embodiments, the protein is an enzyme such as a retroviral integrase. Defined as prime. In another embodiment of the invention, the protein further comprises a nucleic acid binding protein. It is defined as a fusion protein, such as an enzyme fused to a protein. Of yet another implementation In a form, the transmission is particularly directed to primordial spinal fluid stem cells. (Necessary adjustment DNA, including elements and significant names intron-extron structure), retrovirus Or the ability to convey a larger area than can be packaged into an AAV virion Poor expression often observed in progeny of transduced stem / ancestor cells and This can result in silence of expression. The present invention relates to a composition comprising an intagase for transmitting a genetic substance to a cell. I will provide a. In some embodiments, these cells are hematopoietic stem cells. one For secondary hematopoietic cells In the past, microinjection has been rarely used.¹³This is hematopoietic for microinjection This is largely due to the inability to effectively passivate sexual cells. The severe damage that a typical microinjection needle can do to much smaller hematopoietic cells This is the reason. The present invention alleviates these technical difficulties. In this regard, Ming is one aspect of primitive hematopoietic cells (CD34).⁺, CD34⁺/ CD38^-, CD 34⁺/ CD38^-/ Thy-1^Ten] To temporarily passivate cells for rapid microinjection For enabling injection and making it available for subsequent culture and / or transplantation Is provided. The present invention uses a nucleic acid injection formulation as described herein. In some embodiments, the tip diameter is 0.05-0.5 microns, or With a tip outer diameter of 0.12-0.2 micron, a controllable micro flow rate can be realized. Microphone with little damage to injected cells (6-8 micron diameter) A pipette is used. One advantage of the methods described here is that DNA or Is sufficient to inject large numbers of cells by microinjection of any small amount of protein That is. Until recently, stem cell modification due to poor characterization of human stem cell phenotype Microinjection was not a valid choice as a method for However, recently primitive chicks The enhanced population of hematopoietic cells can be used for stem cells (eg, CD34).⁺/ Thy-1^Ten ¹⁴, CD34⁺/ CD45Ra^-Ten/ CD71^{-/ lo}/ Thy-1^lo ^15.CD34 ₊ / CD38^-16 CD34⁺/ C-kit^lo ¹⁷, CD34⁺ ・ CD38^-/ CD33^-/ CD19^-/ CD45Ra^-・ C-kit +¹⁸) The number of cells that need cell correction has recently been confirmed to be Genetic modification in one cell has reached a level that is a viable method. This new method, which focuses on injecting one cell and multiple cells at a time, is currently To provide an economical and viable new method for existing cell modification and gene therapy approaches It is. Primordial spinal cord blood stem cells are not transmitted by retroviruses and AAV vectors. Would be more effective. Can be transmitted by retrovirus or AAV virions Larger than those containing, for example, necessary regulatory elements and significant intron / exon structures. Large areas of DNA, such as DNA, are possible with the microinjection method of the invention, Avoids poor expression and arrest as seen in progeny of transduced stem cells It is thought to do. In some embodiments, the method comprises one or more specific protein enzymes. Includes the use of a number of integrases. As an example, these integrases AAV Rep⁷⁸Or M-Mul V, HIV-1, SIV, FeL, RS Including retroviral integrase such as V, AMV, or E1AV I have. These integrases are expressed recombinant proteins (bacteria, Expressed in either insect cells or eukaryotic cells) The species integrase protein exists in a modified form within its amino acid sequence. this Amino acid sequence modification is a) using another amino acid to facilitate purification (eg For example, histidine addition, glutathione S-transferase (GST) addition, Maltose binding protein (MBP) protein, etc.), b) binding to specific DNA sequences With amino acids (DNA binding proteins) that allow for chromosomal D Site-preferred or site-specific target fusion to specific sites within NA, greater than c) Higher integrase protein solubility and higher efficiency in performing fusion reactions Site-specific collisions in integrase amino acid sequences for the purpose of providing It can be performed using several techniques, such as mutation. ΔLTR for in vitro fusion_HIV-1Sequence and integrase_HIV-1Only one It can be achieved at a fixed frequency, but can be performed for certain proteins (for example, yeast transcription factors). Human homologs of SNF-5 [Kalpana et al., 1994] and DNA binding proteins HMG1 [Famet and Bushman, 1997]) are also incorporated and fused. Can be used to further increase the efficiency of the combination. Improved fusion efficiency is therefore Such cellular proteins in a DNA / integrase mixture transmitted to cells Is achieved. The present invention further relates to viral proteins present in the retroviral prefusion complex. Also enables co-transmission with external transgenes and retroviral integrase You. For example, MM The uLV gas protein is present in the M-Mul V pre-fusion complex and May increase efficiency. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES The following drawings form part of the present specification and illustrate several aspects of the present invention. Included to further illustrate the plane. The invention is not limited to the embodiments described herein. Reference is made to some of these drawings, together with a detailed description of specific embodiments. Will be better understood. Figure 1: Transduction with special enzymes designed to make fusion easier Introduce the gene. Mixing side-chained by retroviral long terminal repeats (LTRs) Is co-transmitted with the retrovirus integrase. Which method is this (For example, humans such as Maloney mouse leukemia virus). Lenti-virus such as immunodeficiency virus type 1 or type C) Will apply. Mixture side-chained by AAV inverted terminal repeat (ITR) AAV Rep⁷⁸Communicate with This method uses a transgene mixture and a fusion enzyme. Of both transduced genes and enzymes Electroporation, liposome-mediated gene transfer, or particle-mediated irradiation It can be communicated in any other way. In addition, the fusion enzyme is transmitted as a protein It may not be necessary. Rather, it is shared with the transgene to be fused. Could also be co-transmitted as a mixture of DNA representations. It's a transgene Injury side-chained by the LTR or ITR sequence and If they do not contain such side chains, this is the only translation of the desired transgene. Will promote cooperation. Figure 2: Basic strategy for fusion. Simple transduction of genes and regulatory elements into cells If the introduction results in fusion, fusion at a variety of sites is performed and May cause messy chains. Addition of the AAV ITR sequence results in higher fusion It is expected to provide a rate. Like this mixture, it contains only the ITR sequence. Rep⁷⁸High frequency of fusion observed for rep AAV vector containing no Is done. The exact structure of the rep AAV DNA before fusion is side-chained by the ITR. May exist as a closed linear duplex, or be wrapped around the nucleus before fusion is there. Thus, the present invention provides a high fusion rate from wrapping of a mixture containing 2ITR. It is suggested that there is a possibility that rep gas product is present In the absence of fusions, fusions are generally specific for the AAVS1 region of chromosome 19. Is not shown. Rep⁷⁸Adding protein (shown in next composition)⁷⁸Is AA Identify DNA sequences in both the V ITR and the chromosome 19 AAVSI region , Is expected to increase preferential fusion to chromosome 19. next In the construct, the sequence derived from the retroviral LTR is the gene construct Have been. For example, M-Mul V LT required for in vitro fusion reaction Only the R sequence is the 10-12 bp LTR end. M-MuL Viral Integer The enzyme interacts with these sequences to permit in vitro and in vivo fusion. Make it easier. Site specificity for M-MuLV based vector fusion Appears to be absent, but has some preference for nucleosomal conformations Sex is recognized. The next part of the figure shows the relationship between integrase and the DNA-binding protein. The interaction of the fusion protein with the LTR sequence is shown. This is because the DNA binding region New proteins derived from existing DNA-binding proteins or specific Designed to have high affinity for DNA sequences Suggests the possibility of For example, individual transgenes for globulin loci Orientation will facilitate its expression in erythroid cells. FIG. Tables in our laboratory to facilitate fusion of microinjected DNA sequences Currently, two purified fusion proteins are shown. Above the maltose binding protein and AA V Rep⁷⁸2 shows a fusion with a protein. This is MBP-Rep⁷⁸Expression construct (Batsu et al., 1995) M purified in the same manner. BP-Rep⁷⁸Fusion protein also binds to AAVITR in vitro, endonucleated It is reported to show creatase activity and helicase activity. MBP sequence If they interfere with (intracellular) fusion activity, they will be cleaved by Factor-Xa. Rep⁷⁸Can be removed from Cut (factor Xa cutting is MBP and Rep⁷⁸And at the fusion point between). The lower panel shows a similar fusion between MBP and M-MulL Vtono. M -MuLV integrase is described in Jonsson et al. (1993). Cloned from the construct, MBP-Rep⁷⁸Used for the expression of It has been cloned into the pMALc2 vector. However, the strategy described above Is not limited to the MBP fusion protein in the practice of the present invention. example For example, GST fusion, histidine addition expression and purification, baculovirus expression vs E. coli Expression and expression in eukaryotic cells can also be used. Figures 4A and 4B. MBP-Rep⁷⁸Purification of the fusion protein. Figure 4A: IPTG exists Does not exist or (MBP-Rep⁷⁸Presence of IPTG (to include expression) PMAL-Rep grown in one of the growing states⁷⁸Tapir from bacteria Terrier lysate. Figure 4B: A new band of about 120KD exists in + IPTG lane I have. Bacteria grown in the presence of IPTG are sonicated and the supernatant is collected. Passed twice through the mirose column. MBP-Rep⁷⁸Is due to the addition of maltose Out of the column. Additional co-purification zones at locations corresponding to slightly lower molecular weights Existing. [Batchu et al., 1985] reported that this is a full-length MBP-Rep⁷⁸of Generation of either preferential proteolytic cleavage or preferential premature assembly Thought it was a thing. By scanning the gel, this formulation Was estimated to be about 90-95%. FIG. 5: Purification of the MBP-integrase fusion protein. M-MuL for MBP protein Expression of fusing V-integrase gene to M-MuL integrase gene The construct [Johnson et al., 1993] was prepared. Sequencing of expression components Proper in-frame fusion was confirmed. MBP-integrase protein is MBP-R ep⁷⁸Was expressed and purified to a similar extent as described in FIG. IPTG Sonicate the bacteria grown in the presence and transfer the supernatant to an amylose column. Was passed once. Powerful running slightly slower than the 85 kD molecular weight marker The band is consistent with the putative 88 kD fusion protein. The purity of this preparation is 70-80% Range. FIG. Sample constructs used in the evaluation of fusion enzyme-mediated fusion. prsG FP-MGMT is a humanized red-shifted green fluorescent protein gene (GFP, Gibco From BRL, pGREEN) and human O⁶Methylguanine DNA methyltransfer It contains the E. coli gene. All traits in this and subsequent components The transgene is driven by the phosphoglycerate kinase (pgk) promoter sequence. Driven. This particular construct is side-chained by a rare enzyme site [Fs e1, Pacl, Ascl, Sfil), a linear transduction gene sequence Removal of bacterial plasmid sequences (restriction enzyme digestion and, if necessary, Preliminary agarose (By elution of appropriately sized fragments from the gel) It is. prsGFP-MGMT / ITR side chains the prsGFP-MGMT sequence AAV2ITR sequence. Again, bacterial plasmids A linear sequence containing no sequence can be obtained by digestion with FseI and Sfi enzymes. Can be. In addition, the Sfi site was transferred to the FseI site and digested with FseI. And ligated to form a 2-ITR-containing circle It is also possible to obtain this composition in a different shape. This is suitable for AAV fusion. This wound composition is Rep⁷⁸May exist Fusing more easily than straightened even without. This last component is the 5 'end Primer containing at its end 20 bases of the sequence corresponding to the HIV-1 LTR end Linearized rsGFP-MGMT / ΔLTR2 obtained by PCR amplification with It is configured. PCR amplification is a duplex side-chained by the appropriate HIV-1 end Used to generate linear components. A 20 bp sequence is an effective fusion If this is not enough, this strategy can be modified to include additional LTR sequences. Wear. FIG. pgk-tk / ΔLTR_HIV-1Outbreak. Herpes virus type 1 Midine kinase (tk) gene and phosphoglycerate kinase (pgk) gene Figure 2 shows a composition containing both of the motors. SV40 Splice Donor / A The receptor and polyadenylation sequences are also shown. PCR Limer generates a 2.74 kbp linear fragment containing pgk and tk sequences And scanned with the terminal sequence of the HIV-1 LTR. The primer (HIV3; 36 bases) uses the upstream of the FseI site, and uses the U3 region ( Corresponds to 20 bases corresponding to the end of underline and the first pCMVβ vector sequence 16 bases (5 'ACTGGAAGGGCTAATTCAC T GTTGGGGATC3 ') (SEQ ID NO: 1). Primer (HIV5 ; 35 bases) downstream of the Sfi site and corresponds to the end of the U5 region (underlined) It contained 20 bases and 15 bases corresponding to the sequence in pCMVβ (5 ′ACTGCTAGATTTCCACA CAGGAAACAGCTATAG3 ') ( Sequence ID number: 2). The amplified linear double-stranded DNA is a Vent DNA polymer. (Obtained after 30 cycles of PCR amplification with the enzyme). After PCR, generate PCR The product was extracted with chloroform, precipitated with sodium acetate and alcohol, TE And electrophoresed in 1% agarose gel, Geneclean Gel purification using a kit (Bio 101), cellulose acetate and alcohol Settle, resuspend in water, filter through a 0.1 micron filter, and Stored at a temperature of -20 C until use. FIG. pgk-tk / ITR. AA to generate pgk-tk / ITR A pgk-tk composition side chained with V VITR is shown. Linearized I TR side chain pgk-t The k sequence was obtained by digestion with Fse1 and SfiI, and Bacteria have been shown to interfere with gene expression in transduced mice. Gel purification was performed to remove the sex plasmid sequences. FIG. Generation of a covalently closed ring to promote fusion. Some aspects of the invention Uses cir-rsGFP-MGMT / ITR as circular double-stranded DNA . A plasmid backbone containing the AAV ITR was constructed, and prsGFP- The MGMTrsGFP-MGMT sequence contains the PacI and And AscI site. Linearized ITR side chain rsGFP-MGT arrangement Rows were obtained by digestion with Fse I and Sfi I as described above. Rounded rsGFP-MGMT / ITR sequence without plasmid backbone Is generated as shown in FIG. Sfi I site is prsGFP-MGM Transferred into T / ITR to create Fse I site. This is linearized, The backbone plasmid sequence was removed through Fse I digestion and ligated. Wrap around the FseI site and obtain the cyclic molecules on agarose gel before microinjection. For purification. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention relates, in some embodiments, to a method for transducing hematopoietic stem cells (HSC). Method, thus: 1) direct transfer of DNA to the nucleus of HSC by microinjection, 2) microinjection Fusion of the injected transduced gene sequence to chromatin of HSC and progeny of said HSC Persistence of those sequences in cells and 3) promoters, enhancers, and LCRs The appropriate and long-term, cell-type specific expression of transduction introduced with regulatory elements such as Large (15-25 Kb) containing the intron / exon structure required for Microinjection of the transducing DNA construct and 4) injection with gene targeting activity Microinjection of a DNA / protein mixture with the protein contained in the sample. Provides another scheme for direct gene modification of E. coli. Genetically modified HDCs prepared according to the method of the present invention can Can be used for gene therapy purposes when transmitted to humans for targeted reconstitution . According to another embodiment of the present invention, a structure modified by microinjection of a foreign substance. Blood stem cells include, by way of example and not limitation, AIDS, Mediterranean anemia, sickle cells. Treat various physiological deficits such as vesicular anemia and adenosine deamylase deficiency Can be used for The physiological deficiencies envisioned in the present invention are responsive to gene therapy. "gene Responsive to treatment '' means that patients with Which means to receive any therapeutic or clinical benefit. As indicated above, one aspect of the present invention relates to modifying modified HSCs into cellular mediators of gene transfer. Related to use as a body. The gene or transgene is Medical or marker genes or genetic defects in blood cells (eg Mediterranean Genes that have clinical utility, such as genes that correct anaplastic anemia and sickle cell anemia) If so, that gene may be used. In some embodiments, the primary human cells are blood cells. Vesicles. As used herein, the term "blood cells" refers to any Shaped blood cells and ancestral cells and their precursors. Thus, in one embodiment, the present invention provides (i) a human primary into the patient's HSC. Microinjection of DNA segments encoding products that enhance the therapeutic effect of cells And (ii) applying the genetically modified HSC obtained from step (i) to the patient To enhance the therapeutic effect of HSCs comprising the steps of introducing Have been. DNA creates a drug in the patient's body, and according to such an embodiment, The drug is represented on the tissue site itself. Similarly, as mentioned above, HSCs that have been machined need not be directed to a specific site, but according to the present invention. The processed HSCs and progeny cells function as a systematic therapy, for example, The therapeutic agent is systematically expressed and secreted from cells. More specifically, (i) a product that enhances the therapeutic effect of blood cells on a patient's HSC Microinjecting a DNA segment that encodes Injecting the cells obtained from step (i) into the patient. Provided is a method for enhancing the therapeutic effect of HSC introduced into the body of a subject. HSCs that are the progeny of modified HSCs and that can be used in the present invention include, for example, Examples include leukocytes, granulocytes, mononuclear cells, macrophages, lymphocytes, and eukaryotic cells. What is it? For example, a Mediterranean modified genetically with the appropriate hemoglobin gene Stem cells from patients with anemia or sickle cell anemia are genetically corrected blood cells Generate. DNA carried by HSCs, for example, directly or indirectly enhances the therapeutic effect of cells Any DNA may be used. The DNA carried by HSC is HS If C is to exert a therapeutic effect that HSC does not normally exert DNA may be used. For example, it can be used to genetically process blood cells. Suitable DNA that can be used include tumor necrosis factor (YNF), interleukin (Eg, interleukin 1-12), globulin gene, DNA repair gene , Drug resistance gene and HIV (human immunodeficiency virus) resistance gene Includes those that express itokinin in code. The DNA used to transduce a human cell is characterized by the expression product It may be secreted from. Also, it is the gene production that is retained in the cell The thing may be expressed in code. Human cells are markers as described in more detail below. It may be processed with DNA that functions as. In one aspect, the inserted gene is transgenic for the transgenic cells in vivo. Matrix that can determine whether Car. Examples of such marker genes include neomycin resistance (n eoR) gene, multiple drug resistance gene, thymidine kinase gene, β-gal Custosidase, dihydrofolate reductase (DHFR) and chloramph Enicol acetyl transferase and the like. HSCs are processed in vitro. For example, cells are removed from a patient and Vesicles are isolated and genetically modified in vitro by DNA encoding the therapeutic agent. And genetically engineered HSCs are therapeutically acceptable The patient is re-administered with the vehicle. These procedures are often ex-vivo measures Called. Some of the clinical measures for patients who have or may develop cancer The modified HSC progeny cells were then injected into the patient's HSC by microinjection Provided is a population of primary human cells that represent a product of a substance. A therapeutically acceptable carrier can be a liquid carrier (eg, saline solution) or a solid carrier. A body base, for example, an implant. If a liquid base is used, the processed cells Systemic, for example, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular parking, intraperitoneal or direct injection into the affected area It can be introduced by a method such as giving. The following abbreviations are used in this disclosure: pCMV-β cytomegalovirus (CMV) promoter / Β-gal reporter under control of enhancer sequence D that expresses NA plasmid FITC-FITC conjugated to dextran run CD34 + CD38 FACS-isolated CD34⁺Cell CD3 -Thy-1 + 8^-Thy-1^-(Actually, Thy-1^lo)sub Population IMDM Isocover modified Dulbecco's culture What has been described above refers to the following examples which detail certain procedures in accordance with the present invention. This will help you understand better. References to these examples are For the purpose of clarification. They do not limit the scope and nature of the invention. Absent.Example 1 Delivery of FITC dextran to passivated CD34 ⁺ cells Purification and culture of CD34 ⁺ cells Mononuclear D34 King. Banded blood cells were obtained from a band of normal human fetus, and mononuclear cells were obtained from Fi. Purification was performed by centrifugation on a col-hypaque. CD34⁺The cells ( (1) Along with anti-CD34 antibody bound to immunomagnetic particles via dextran Culturing cells, (2) passing the cells through a column attached to a magnet Isolation of magnetically labeled cells, (3) cleavage with dextranase Release of cells from magnetic particles by (4) passing through a column attached to a magnet Including the steps of separating cells from magnetic particles by iMiniMACS CD34 Multisort Separation Kit Isolated by epidemiological separation. Subsequent different CD34 epitopes FACS analysis using another CD34 antibody that recognizes 4 expressed 90% purity. Purified cells Calf serum albumin (2%, StemCell Technology), Insulin (10 microgram / ml), transferrin (200 microgram / ml) G / ml, ICN), 2-mercaptoethanol (0.05 mM, Sigma) a), low density lipop Rotein (40 microgram / ml, Sigma) and 20 ng / ml human Fit-3 ligand (Peprotech), 20 ng / ml human interlo Ikin-3 (IL-3, Peprotech) and 20 ng / ml human stem cells Pen containing factor (SCF, Peprotech) [IMDM / F-3-F] Blood supplemented with strep (100 units and 50 micrograms / ml, respectively) Culture medium containing no clarified medium (Isocoves modified Dulbecco culture medium (IMDM, Gi 5% CO in bco)_TwoAt 37 ° C. overnight.Preparation of surface coated with fibronectin A 6mm glass cloning ring is inserted into the 35mm tissue culture via the baseline. It was mounted on a feeding dish (Corning). Cloning the surface of this dish with phosphate buffer 50 microgram / ml fibronectin in saline (PBS, Sigma) Dissolve the solution (Boehringer Mannheim, # 1051-407) Coated with fibronectin by adding 30-50 microliters Then, the cells are cultured at a temperature of 4 ° C. for 24 hours (or at room temperature for 45 minutes). Excess fibronectin containing solution was removed before cell addition.Attachment of CD34 ⁺ cells to dishes coated with fibronectin Ke After overnight culture, cells were placed in IMDM / F-3-51 ml at 8 × 10^FourIndividual cells Was adjusted at a concentration of This cell-containing culture solution (25 cells containing about 2000 cells) Icloliter) in a TS2 / 16.2.1 hybridoma cell line (integrin) ・ ATCC that produces antibodies that react with beta-human CD29^♯HB-243) Was mixed with 25 microliters of a culture solution (IMDM) prepared for 2 days. Envelop fibronectin-coated expression of 50 microliters of cell / antibody mixture Into a 6 mm Garau. Cells are 5% CO2 if antibodies are present_TwoIn the presence of At 37 ° C. for more than 30 minutes. Then kloni Add 1 ml of IMDM / F-3-5 outside the ring and add cells and claw. Rotation speed of a 35 mm plate containing a ring for 5 minutes at 600 rpm (Beckman low speed GS-6R centrifuge, vibrating bucket low , Brake off).Microinjection of CD34 ⁺ with FITC-dextran Automated pipette puller (Sutter, 3mm box filament) Using a thin-walled borosilicate glass capillary (Sutter, 1.2 mm outer diameter, 0.94 mm inner diameter) to prepare a fine glass microinjection needle. Microscope pooled under the same conditions Scanning electron irradiation (SE) microscope to determine the outer diameter of the injection needle And an outer diameter of 0.17-0.22 microns was obtained. 50 mM Hepes (PH 7.2 / 100 mM KCl / 5 mM Na_TwoH_TwoPO_Four) To FITC-de Kistran (150,000 MW Sigma) was mixed at a rate of 0.25%. Clean 0.02 micron filter (World PORecision I) instruments and pass through the Eppendorf microloader. High speed (10,000 rpm, IEC Centr a-4b). Microinjection is Olympus OMT-2 inverted microscope Narishige micromanifold mounted on microscope (with heating stage) This was done manually using a purator. Fluid transmission pressure is SAS10 / 2 screw Feed-activated air microinjection / aspiration syringe was provided. Cloning Lin The bug was removed immediately before the microinjection. After confirming the flow of fluid from the needle, 60 cells (about 3) with -10 femtoliter FITC-dextran. Microinjection (over a period of 0-45 minutes). Material transmission was directed to the nucleus However, some substances were given to the cytoplasm.Monitoring of microinjected cells and subsequent culture After microinjection, insert a slightly larger cloning ring (8 mm diameter). Placed around the cells. Fluorescence transmission of FITC-dextran to cells (FIT C) Monitored by Nikon Diaphot 300 inverted microscope. . Hamamatsu cooled CCD camera and And controller, Sony Trinitron monitor, frame grabber, and And can be captured and stored by Networked Gateway 486-25 You. Within 30 minutes of microinjection, about 35 FITC-positive cells (6 in total) Of the 0, 58-67%) were clearly identified. Significant number of cells revealed Shows nuclear localization on slow fluorescence, with some cells localized in both the nucleus and cytoplasm And only a few cells showed cytoplasmic fluorescence. Microinjection Twenty-four hours later, 19 fluorescent cells (32%) were still identified and microinjected After 72 hours, 16 fluorescent cells (32%) were identified. Example 2 Transduced gene construct This example demonstrates transduction comprising a nucleic acid sequence encoding a gene of interest. Provide gene constructs for stable integration and expression of the therapeutic gene into cells This is to demonstrate the usefulness of the present invention in making it work. The gene is Any animal gene, its pharmaceutically active fragment, In particular, any human gene may be used. In this example, the red-shifted green fluorescent protein (rsGFP) reporter gene and O⁶− Methylguanine DNA methyltransferase (MGMT) gene. M The GMT gene provides a chemotherapeutic agent having resistance to cells, Thus, desirable and beneficial measures can be taken for patients exposed to chemotherapeutic agents Becomes For example, they are receiving chemotherapy as part of an anticancer treatment Patients are included. rsGFP Reporter allows for quick and sensitive expression assessment Enables rapid determination of nuclear-specific gene transfer and the persistent presence of transduced genes Will do it. The human MGMT gene was selected for the M gene in mouse stem cells. The GMT transgene expression is based on the toxic effects of alkylating agents such as BCNU. Because it is enough to protect The present invention provides a marker for MGMT in human stem cells. Provides a method for dynamic expression and further enhances transduced stem cells in vivo. Shows practicality for strength. In some embodiments, the present invention provides stable transduction of primitive spinal cord blood, and Methods for the preparation of immature spinal cord blood populations with enhanced SRC activity provide. HIV-1 LTV or AAVITR sequence and HIV-1 integration Rase or AAV Rep⁷⁸Was co-transmitted in both side-chained constructs Improved methods for achieving a stable fusion frequency in a cell are also provided. The four transgene constructs are shown in FIG. Everything Includes MGMT. Example 3 Human gene therapy This example demonstrates the utility of the present invention in performing gene therapy for humans. It is. Should be provided to humans for long-term reconstruction in order to obtain reasonable estimates The number of stem cells can be extrapolated from mouse, large animal, and human studies. Because the gene therapy being considered is often done for children, Estimates should be determined taking into account the patient's low weight. Faster To achieve transplantation and high survival rates, a significant number of unmarked short-term The constituent cells can be transmitted today, but here there are far fewer genetic modifications The explanation focuses on long-term reconstituted stem cells. a) Using three independent mice About 20 studies [Halbert et al., 1995], 10 studies [Russel et al. , 1994], or as few as one [Akkina et al., 1994]. We report that long-term reconstitution was achieved using bone marrow cells. Just by weight Required for average reconstruction for mice, if indirect scaling is allowed 5 cells means that 5000 children are required for a human child. It is important. b) For human bone marrow transplants, the lowest dose usually provided is body weight 1x10 per kg⁶Individual nucleic acids [Challita and Kohn, 1994], which is 2 for a 25 kg child . 5x10⁹Cells. Experimental data and modeling of hematopoiesis in cats are 1 . 7x10⁶Suggest that the stem cell frequency is approximately 1 in bone marrow cells [Lu Et al., 1994]. The same frequency applies to human bone marrow, 2.5 x 1 0⁹Cells correspond to a donation of 1450 stem cells. c) About 30ml for children Show reconstitution in transplanted blood cells, which is a highly proliferative factor in primitive hematopoietic spinal cord blood [Sadelain et al., 1995]. About 1.5-3 x10⁸Nucleic acids and the frequency of stem cells is 10^Five-10⁶Assuming 1 at This shows that transplantation is successful even with as few as about 150-3000 stem cells. I have. d) Evidence obtained from transplantation of human spinal cord blood cells in NOD / SCID mice The rationale is that between NOD / SCID reconstituted cells (SRC) and human stem cells (not equivalent). (If at all) suggests a very close relationship. SRC is 10^FourCD34⁺Fine Present at a maximum frequency of 1 in cells [Kollias, 1992; Cateria] n et al., 1994]. Therefore, 30 ml of spinal cord blood (about 3 × 10⁷Single mononuclear cells 1% of which has CD34⁺Contains approximately 30 SRCs. NOD Even if the seeding efficiency of SRC in SCID mice is only about 10%, Corresponds to 300 SRCs. Therefore, all four calculations start from about 150 Suggests that about 500 stem cells are required in the practice of the present invention are doing. Successful reconstitution depends on stem cell transmission and transfer by short-term ancestral cells. Affected by planting. If possible, the required number of stem cells should be calculated in b) and c) above. It may be lower than the calculated one. This work on hematopoietic stem cells was performed by manual microinjection (1). 100-200 cells per hour), the method disclosed herein further High speed (300-600 cells per hour) automated injection It is thought that. This automated microinjection system is sufficient for clinical gene therapy purposes Could be used for Inject 1500 cells per hour Computer automation systems [Pepperkok et al., 1996] Of stem cells for transplantation (for example, 1000-10 (2,000 cells) could be used for microinjection. Stem cell By combining useful things in in vivo or in vitro expression, The number of stem cells to be microinjected for transplantation should be It would be possible to reduce it.Example 4 DNA constructs and gene therapy One useful function of the corrected stem cells that exist in vivo is Cells selected in vitro (only successfully transduced cells To be transplanted) And / or by subsequently selecting the marked stem cells (the endogenous marker). Achieved to enhance only the marked stem cells at the expense of untreated stem cells) can do. For this, two independent, usually present on the same DNA constructs Regulatory genes: selectable genes and targets for expression in stem / progenitor cells And therapeutic genes (eg, ADA or globulin)-expression of the required cell type Targeted-needs to transduce stem cells. Transduced Cells useful for in vitro selection of stem cells include rsGFP or truncated growth factor And offspring receptors (NGF-R). Human O⁶-Methylguanine DNA methyl Transduction of stem cells with the transferase (MGMT) gene leads to nitrogen-containing urea. Class of alkylating agents such as 1,3-bis (2-chloroethyl) -1-nitrogen Marked stem surviving with simple treatment of the patient with elemental urea (BCNU) Cells can be selected in vivo. Most anti-tumorigenic agents (eg, Taxol) is toxic to circulating hematopoietic progenitor cells and induces resting hematopoietic stem cells. Nitrogen-containing urea such as BCNU also has a DNA damaging toxic effect. It exerts directly on the vesicle. O induced in DNA by various alkylating agents⁶ MGMT, which removes alkylguanine, is usually highly recruited to hematopoietic stem / progenitor cells. Expressed at a low level. However, when expressed exogenously in cells , MGMT are BCNU, CCNU, decarbazine, N-mechiru-N ' -Nitro-N-nitrosoguanidine, temozolomide, and streptozotoxin Develop cell resistance to For example, expressing MGMT on the stem cells Some mice showed resistance to BNCU-induced hematopoietic suppression [Maze et al. 996]. Of stem cells transduced with the human multiple drug resistance gene (MDR-1) Suggested for use in in vivo selection. Human stem cells are already constitutive MDR-1 [Chundhary and Roninson, 199 1]. Therefore, MDR-1 resistant drugs (such as used in the practice of the present invention) For example, the enhancement of cells transduced by Taxol is not progeny but stem cells. Expected to occur at the cellular level. In vivo on marked hematopoietic cells The same applies to everything proposed in the selection of bo Government toxicity will be minimized. MGMT transgene expression The body reduces the resistance of hematopoietic cells to high-dose or repeated chemotherapy for breast and other cancers. Is expected to confer resistance to drugs such as BCNU used for Maze et al., 1996]. In one aspect, examples of gene therapy by microinjection of stem cells include the following factors: included. About 1-10x10^ThreeHighly enriched stem cells are obtained from spinal cord blood , Temporarily passivated. By microinjection of these cells, containing DNA, In some embodiments, the renewable amount, which also includes the fusion enzyme, can be increased per cell. 1-3 copies of DNA fuse successfully As provided. 15-25 kb in size, two independently adjusted shapes Microinjected DNA containing the quality transgene is fused without rearrangement. Stem cells One transgene targeted for expression in E. coli was expressed in transduced stem cells. In vitro (eg, rsGFP, or truncated nerve growth factor receptor) TNGF-R) or in vivo (eg, MGMT) selection. Therapeutic transgenes (eg, ADA for ADA SCID, hemoglobin Hemopoietic cells suitable for globulin for cancer and MDR-1) for chemical resistance It is the object of expression in the cell. Microinjection also involves artificial human chromosomes and And / or for the final nuclear transfer of episomal plasmids capable of sustained survival It will also provide an appropriate method. In some embodiments, after microinjection Is expected to provide more than 80% cell growth and more than 25% stable transduction frequency Wear. Example 5 Purification and biological assays of primitive spinal cord blood cells Spinal cord blood CD34⁺, CD34⁺/ CD38^-, And CD34⁺/ CD38⁺/ Thy-1^loA population is provided. About nucleation zone blood and bone marrow cells 0.5-1% CD34⁺Hematopoietic cells have all measurable stem / progenitor cell activity Is represented. CD34⁺/ CD38⁺Phenotype (CD34⁺About 5- of spinal cord blood cells 10%) is a more primitive subpopi It also has a simulation. More primitive than LTCIC and colony forming cells Transplantation of human hematopoietic cells into immunodeficient NON / SCID mice that are believed to be Cells that can be⁺/ CD38^-Exist only in the population [Dick et al., 1996; Dick, 1996]. CD34⁺/ CD38^-Spinal cord Blood cells were CD34 identified by Mayani et al.⁺/ CD45Ra^-lo/ C D71^-loIt is highly enhanced within the phenotype [Mayani et al., 1993]. CD3 4⁺/ CD45Ra^-1o/ CD71^-1oThy-1^loSubset is more primitive The further finding of a cell population suggests that human liver stem cells 4⁺/ Lin^-/ Thy-1^loIs consistent with the finding that In the present invention, CD 34⁺/ CD45Ra^-lo/ CD71^-loCells (CD34⁺/ CD38^-About 2 of cells 5%) is LTCIC which produces colony forming cells that generate a large number of progeny cells Within CD34⁺/ CD38^-/ Thy-1^-Can be much more potent than cells Has been observed. From the above considerations, CD34⁺, CD34⁺/ CD38^-, And CD 34⁺/ CD38^-/ Thy-1^loPhenotype is increasing population of human stem cells Is shown. These specific cell ports enable microinjection and stable transduction assays. Procedures for purifying and functionally evaluating the purification are also provided.Example 6 CD34 ⁺ / CD38 ^- and CD34 ⁺ / CD38 / Thy-1 ^lo cells Umbilical cord blood cells were transferred weekly (2-4 samples per week) from normal delivery at UTMB. 100-250 ml in total) and pooled mononuclear cells with Fico Isolate by centrifugation on 11-hypaque. CD34⁺Cells are Milten By immunomagnetic separation with yi MiniMACS Multisort Kit Isolated. The isolated cells are conjugated with dextran antibody particles using dextranase. (Magnetized particles) are obtained without the magnetized particles attached. Recovery rate Was 70-90% of the expected CD34 cell count (100 ml of spinal cord blood Normal 1-2x10⁸Generates mononuclear cells, CD34 isolation is 1-2 × 10⁶Individual cells And shows 90-95% growth potential and 80-95% CD34 positivity). Next , Using a Becton-Dickinson FACS Vantage device Specific CD34 using fluorescence activated cell sorting (FACS)⁺Cell subport Purification was isolated. Select all cells that meet the selection criteria at once. Or use a pre-determined number of automated cell deposition devices (CADDU). Into each well of a 96-well plate. CD34⁺/ CD3 8^-For cell purification, enhanced CD34⁺PerCP cells^-CD34 and And PE-CD38 antibody to stain CD34.⁺/ CD38^-And cells meeting both the lower and forward scatter criteria are separated. CD34⁺ / CD38^-Cells are usually whole CD34⁺About 5-10% of cells If the sorting recovery rate is 50%, 2-5 × 10^FourCD34⁺/ CD38^- Cells can be obtained. Selected CD34⁺/ CD38^-In cells, its purity Was excellent. Selected CD34⁺/ CD38^-The primitive nature of cells Hand is CD45Ra^-lo/ CD71^-loIs realized by showing the phenotype . CD34⁺/ CD38^-The population is Thy-1 in some cases.^lo(C D34⁺/ CD38^-Cell translation 10-25%) and Thy-1^-(CD34⁺/ CD3 8^-(About 75-90% of the cells). About 2-10x1 0^ThreeCD34⁺/ CD38^-/ Thy-1^loEnhanced cells are usually recovered by such sorting Can be This is the spinal cord blood used in microinjection and functional assays Cell primitive (CD34⁺/ CD38^-, CD34⁺/ CD38^-/ Thy-1^lo) Provides a way to enhance the population of Example 7 Rs by transduced CD34 ⁺ , CD34 ⁺ / CD38 / THY-1 ^lo cells GFP expression In this example, a temporary reporter gene table in cells into which DNA was microinjected The present is shown. rsGFP reporter is for It is the inserted DNA. It performs additional antibody labeling and enzyme assays It allows for quick evaluation of gene expression without the need. Cells were isolated and attached to fibronectin. For cells generally for microinjection The buffer was added under control of the cytomegalovirus (CMV) promoter / enhancer. About 100-250 ng / ml of plasmid DNA expressing torsified rsGFP protein The microinjection is performed by dissolving a fine drop solution in a buffer solution for microinjection. 0.2 Microinjection needles with a +/- 0.02 micron outer diameter are currently used. rsGFP Expression is by fluorescence microscopy using a filter set optimized for rsGFP detection Monitored by 5-15 hours after injection, 10-15 of the injected cells % RsGFP expression was observed. This frequency increases over time in culture and observation. The expression cells (and a small number of divisions, expression cells) gradually decreased, but 4- It was still observed after 5 days. Results of FITC-dextran injection were injected As much as 30-50% of the cells significantly transfer the injected material (24 hours after injection), And 20-50% of the successfully injected cells have rsG 5-24 hours after injection. FP was temporarily expressed. Generally, rsGFP expressing cells are in very good condition , The shape looks normal. However, over time, Some expression cells deteriorate. CD34⁺, CD34⁺/ CD38^-, And CD3 4⁺/ CD38^-/ Thy-1^loDuring the population No significant differences in expression frequency were observed. This data is a primitive CD34⁺/ C D38^-/ Thy-1^loNegative evidence for transgene expression in cells Bring. To eradicate the gradual decrease in the number of rsGFP expressing cells Need further study. However, almost all expressions are fused Expression is from a non-fused DNA copy and the expression is The pattern is not unexpected. Example 8 Expression and purification of AAV Rep ⁷⁸ M-MuLV integrase protein The fusion of microinjected DNA sequences can, in some aspects of the invention, make it unique. AAV (IRT) or M-MuL (LTR) sequence is side-chained and Each AAV Rep⁷⁸Or M-MuLV integrase) By interacting with these sequences. This enhances and / or facilitates the fusion. Bacterially expressed and purified The proteins used were used in these studies. AAV Rep⁷⁸Maltose fused to Fusion proteins composed of binding proteins are expressed in bacteria. Amylose Column (MBP-Rep⁷⁸120 KD, obtained total protein -1 mg, FIG. Purified to approximately 90-95% purity by multiple passes. MBP used -Rep⁷⁸Representational constructs are described in Batsu et al. (1995). The same way MBP-Rep purified by⁷⁸The fusion protein is in vivo into the AAV ITR It has been reported to exhibit binding, endonuclease activity, and helicase activity. [Batsu et al., 1995]. The substances purified by the researchers are AAV ITR distribution Indicates a join to a column. Another experiment was MBP-Rep⁷⁸To AAV ITR sequence Is unique to the sequence (ie, most irrelevant DNA sequences to which Do not bind), but also have the potential endonuclease cleavage of the ITR hairpin structure. I did it. These data are based on purified MBP-Rep.⁷⁸Protein is Rep⁷⁸Only Has the same in vitro activity. Therefore, it Is expected to show activity in microinjected cells. The fused MBP sequence If they affect fusion activity, they can be cleaved by Factor Xa⁷⁸From (The cleavage sites by factor Xa are MBP and Rep⁷⁸Fusion site between Exists). Similar constructs for expression of MBP-integrase fusion proteins Has also been created in the inventor's lab (Johnson et al., 1993). M-MuL integrase sequence identified). By sequencing this expression component Thus, proper in-frame fusion was confirmed. Fusion protein is already excessive in bacteria Expressed to 70-80% purity with a single pass over amylose (FIG. 5. MBP-integrase, 83 KD). Similar GST -And histidine-intagase fusions also exhibit in vitro fusion activity Has already been stated. Again, MBP interferes with iteglase activity. If so, release MBP by factor Xa cleavage. GST-Integra The fusion protein is expressed and purified [Dota et al., 1995]. Example 9 Linearized LTR-DNA and ITR-DNA constructs To evaluate fusion in hematopoietic stem cells, red-shifted green fluorescent protein (rsGF P) using a construct capable of expressing both the reporter and the human MGMT gene You. The rsGFT reporter gene has been used by the researchers in microinjection . It transduces genes without the need for additional enzymes, labelin or enzyme assays It enables a quick assessment of expression. In addition, before transplantation into humans It is also used for in vitro selection of successfully transduced stem cells. Trunk Its expression in cells protects them from the toxic effects of certain alkyls or agents [eg BC NU, [Maze et al., 1996]) Rapid in vitro generation of gene-modified stem cells. The MGMT transgene is used because it allows selection. Our thoughts Including MGMT as a selectable marker gene will ultimately result in therapeutic In vivo of stem cells co-transduced with a gene (eg, glucocerebrosidase) Boosting possible become. Components (Figure 6, all of these components have already been created) rsGFP and human MGMT are used. Immature and mature hematopoietic cells and lines Phosphoglycerate kinase (pgk) promoter highly active in fibroblasts To generate expression of both rsGFP gene and MGMT gene using Used. There are two strategies for stable in vitro transduction of resting hematopoietic stem cells. You. The first is to have the fusion event occur directly on resting cells ex vivo. There is (called "fusion-pause"). The second method uses DNA (with fusion enzyme) Transfer to resting cells to generate stable transduction intermediates and create an in vivo environment When returned and undergoes self-renewing cell division, they are fused ("fusion pause / circulation"). cell Transduction in quiescent cells can further fuse as they enter the cycling cycle Evidence exists for the presence of an entity [Naldini et al., 1996]. A plasmid backbone containing the AAV ITR was created and rsGFP-M The GMT sequence was inserted between the Pac I and Asc I sites to insert prsGFP- MGMT / ITR was generated. The linearized ITR side chain rsGFP-MGMT sequence is Obtained by Fse I and Sfi I digestion. Plasmid backbone A rounded rsGFP-MGMT / ITR sequence that does not contain the Was done. The Sfi I site is transported into the prsGFP-MGMT / ITR and Fse I site was created. This construct was linearized and buffered by Fse I digestion. Cookbone plasmid was removed, ligated at the Fse I site and rounded, The cyclic molecules were purified on agarose gel before microinjection. Co-transfer of LTR side chain transgene and integrase and ITR side chain transduction Genes and Rep⁷⁸Is expected to increase the rate of fusion. linear By examining both and cyclic ITR-containing constructs, any substrate Rep⁷⁸But wild It is indicated that it will be used for species AAV fusion. Naked DNA (eg, DNA not in a delivery vehicle such as liposomes) and integra Or Rep⁷⁸No attempt has been made to co-transmit cells to the cell nucleus. Improved methods for important genetically modified cell types as part of Provides the law. Example LTR / integrase and fusion mediated in ITR / Rep ⁷⁸ Retroviruses (Lentiviruses (eg, HIV-1) and type C retroviruses) The characteristics of both irus (eg, M-MuLV) and wild-type AAV are highly efficient. The ability to integrate into the chromosomal DNA of the target cell. Sufficient multiplicity of infection If the target cell is not high enough, a considerable portion, if not all, of the target cells will be fused. Get a lusty copy. In vitro Only the retroviral LTR sequences required for the fusion reaction are 10-12 bp LTR ends [Goff, 1992; Goodani et al., 1995; Reicin et al. 1995; LaFenina et al., 1991]. Retroviral integrase Enzymes interact with these sequences to facilitate in vitro and in vivo fusion [Goff, 1992; Dodazi et al., 1995; Reisin et al., 1 995; LeFemina et al., 1991]. For retrovirus vector fusion Chromatin, a transcriptionally active gene, is unlikely to be site-specific There is a preference for fusion to [Vijaya et al., 1986; Withers- Ward et al., 1994], and there is also a preference for nucleosome conformation. [Pruss et al., 1994]. Wild-type AAV is located in specific regions of the human genome It is unique in that it fuses preferentially. rep^-AAV vector is rep⁺AAV Bek AAVRep, because it does not have the same pattern of site-specific fusions as⁷⁸ Is required for chromosome 19 preferred fusion [Muzyczka, 199 2]. Rep⁷⁸The protein binds to the 12 nucleotide sequence within the ITR prior to fusion. Mediates complex formation with similar sequences on lomosome 19 (AACS1 region) Chromosome 19-specific AAV fusion, such as Are considered to play several important roles in this case. ITR side chain inheritance Child (LacZ) and Rep⁷⁸Laz with stable co-infection of cells with expression constructs It was recently reported that the number of expressing cells was increased by a factor of 10. In addition, a large number of fusion products The number is specific to chromosome 19, and constructs up to 35 kb in size are fused. -If they contained at least one single-ITR-[Natsuou lis et al., 1995]. These results indicate that the ITR side chain anti-communication pathway and Rep⁷⁸protein Simple communication with the site to promote convergence that is likely to occur site-specific or site-first It suggests to proceed. Provided as NDA / protein complex where possible DNA and purified integrase or Rep⁷⁸Providing a protein is an expression This is more advantageous than producing a fusion protein from a product in a cell. ΔLTR / a Integrase or ITR / Rep⁷⁸Expressed by providing a protein complex The protein translocates from the cytoplasm to the nucleus and then finds the ΔLTR or ITR sequence and This eliminates the need to form a complex. HIV-1 provides proviral DNA to the nucleus of resting cells to provide resting macrophages. Can be stably transduced [Wenberg et al., 1991; Le. wis et al., 1992]. The vector based on HIV-1 is G_oStable fusion to cells Although it has not been demonstrated whether they can do so, they show that resting Rat208F fibroblasts A stable transduction intermediate can be created in the tumor (fusion-pause / cycle) Ring) [Naldini et al., 1996]. 8 days after the initial infection The resulting cells were infected in a cycling state % Had a stable transduction frequency. We initially (M-MuLV V HIV-1 integrase (rather than integrase) was chosen. HHIV-1 Performing "full site" fusion in vitro [Goodazi et al., 1995 ] And resting cells can be stably transduced. wild Resting cells can be obtained by previously complexing the seed M-MuLV and the M-MuLV vector. Cannot be transported to the nucleus [Miller et al., 1990]; It is unknown whether integrase can achieve fusion in a quiescent state [Mille r et al., 1990]. However, previous studies have shown that the M-MuLV Has been shown to need to occur during cell division [Roe et al., 199 3]. The high frequency of fusion is rep^-See also cells transduced with AAv vector [Muzieska, 1992]. AAV vector DNA before fusion Is not known, but it is a linear duplex side-chained by the ITR Or as thought in the case of wild-type AAV May be circularized in the nucleus prior to fusion [Linden et al., 1996 ]. AAV vector DNA binds to chromolome DNA through the ITR end. As one or more tandem copies into the DNA of the cell [Flo tte and carter, 1995]. Linked to another transgene sequence In case, ITR only They fuse at a sufficiently high rate [Philip et al., 1994]. Non-circulating cells directly form Rep to introduce quality^-There is controversy over the capabilities of AAV vectors [Prodsa koff et al., 1994, Russel et al., 1994]. AAV vector is transduced Prefer circulating cells for entry, but they also directly, but less frequently, non-circulating cells. Intimate fusion ("fusion-pause") [Podsakof et al., 1994] or Exists as a single-chain episome in non-circulating cells, after which the cells pass through the S phase ("Fusion-pause / circulation") [Russel et al. , 1994]. Integrator promoting fusion of linearized ΔLTR side chain rsGFP-MGMT sequence Ze ability. The rsGFP-MGMT sequence is mostly due to the HIV-1 LTR sequence. Which is side chained at terminal 20 and side chained by rsGFP-MGMT / ΔLTR Is done. This linear construct has 15 salts corresponding to the rsGFP-MGMT sequence in length. Using the same 20-base primer and 35 bases as the HIV-1 LTR end Generated in CR. Cells were rsGFP-MG precultured with integrase MT / ΔLTR PCR generated linear molecule or rsGFP-MGMT / ΔL Microinjected with either the PCR-generated linear molecule of TR alone. 20-39 kb Since the sequence can be generated by PCR amplification using an optimization procedure, Is also generally applicable to larger transgene constructs. ITR / Rep⁷⁸ Rep cells for strategy evaluation⁷⁸ RsGFP-MGMT / ITR or rsGFP-MGMT precultured in Microinject cells with either / ITR alone. Circular double-stranded proviral DN A may be a suitable base for a normal AAV fusion. This is cir- Evaluated using rsGFP-MGMT / ITR. Integral enzyme has target LTR Or to maximize the possibility of locating and binding the ITR sequence to it The DNA and the porosity are cultured prior to microinjection into the cells. For optimization of fusion frequency Are the following experimental parameters: a) DNA molecules induced per cell B) Integrase or Rep per DNA molecule⁷⁸Number of molecules, And c) integrase or Rep⁷⁸Conditions for DNA preloading. in addition, rsGFP-MGMT / ITR fusion event with AAV and chromosome 19 sequence By performing PCR using primers that span the potential junction between Whether it is within the chromosome 19 region used preferentially by wild-type AAV Is determined. Example 11 This example is for integrase_HIV-1And ΔLTR_HIV-1Traits sidechained by sequence The present invention for improving the frequency of stable transduction by co-transmission with a transgene construct It shows the practicality of the light. Linearized ΔLTR_HIV-1Fusion of side chain pgk-tk sequence Integrase that promotes integration_HIV-1Ability is further recognized Was. Most pgk-tk sequences have most terminal 20 bp pHIV-1 LT Pgk-tk / ΔLTR, side chained by the majority of the RU3 / u5 sequence_HIV- ₁ (FIG. 7). This linear construct was 35-36 bases in length, 15-16 Bases correspond to the ends of the pgk-tk sequence, and 20 bases correspond to the LTR_HIV-1U3 / U Generated by the linear construct by PCR which is the same as the 5 end. Rat-2 tk (-) cells are integrase_HIV-1-Tk / ΔLT precultured in R_HIV-1PCR generated linear molecule or pgk-tk / ΔLTR_HIV-1PCR generated linearity Microinjected with either molecule alone. 20-30 kb sequence is an optimization procedure Such schemes are common because they can be generated by PCR amplification using Should be applied to larger transduction constructs. HIV-1_NL4-3 The integrase enzyme was used. This integrase enzyme has its in vitro To make it more soluble without affecting the fusion ability The location has been fixed. Such general techniques are known to those skilled in the art and are described in Jenk. ins et al., 1996. The expression construct pIND. His. Sol May be used to express and purify another enzyme as needed. Rat- (tk-) cells were treated with 10% fetal calf serum (FBS), 100 units / m 1 penicillin, 100 microgram / ml streptomycin, and 2 mM Grown in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) containing glutamine Was. One day before injection, cells are cut into a 0.4 mm rectangular grid on the tissue culture surface The cells were placed at a rate of 20,000 cells per 35 mm dish. DNA or Is borosilicate having a tip outer diameter of about 0.3-0.45 micron for DNA + protein Was used to transfer to the nucleus of the cells. Only the solution of DNA is 10 mM MgCl_TwoIncluding 1x microinjection buffer (50 mM Hepes [pH 7.2], 100 mM KC 1, 5 mM NaH_TwoPO_Four) To pgk-tk / ΔLTR_HIV-1Solve (23nM) About 42 ng / microliter. 5-10 femtolitter Injection is estimated to provide about 70-150 DNA molecules per cell. I have. DNA and protein solutions were prepared at the same concentration of DNA and 17 ng / microliter. Integrase_HIV-1(445 nM). Note that we chose this value This is to produce about 20 injected molecules per DNA molecule. . The DNA solution is passed through a 0.1 micron filter_FourConsidered All aggregates were removed. Typically, 20-30 cells are injected into a 35 mm dish and placed in one grid of a gridded plate. There was only one injected cell per lid. This was done by HA T (0.1 mM sodium hyposanthin, 0.4 microM aminopterin, 16 microM thymidine), and then selected for stable transduction This was done to help Ronnie count. The next day after injection, remove the culture And including HAT Saliva culture was added. The HAT medium was changed every 3-5 days. 5-7 days after injection Examine the dish under a microscope to see potential colonies growing from stable transduced cells. Position was attached to the bottom of the dish. Colonies were 50-20 that contributed to cell growth It consisted of 0 cells. These colonies twice a week for three weeks I checked by examining the dishes. Only stable colonies (eg, 3 weeks after injection) Are present) were analyzed. This study is an integrase_HVI-1Pgk- tk / ΔLTR_HVI-Was performed using Table 1 shows the results. These data Is integrase_HIV-1Pgk-tk / ΔLTR co-transmitted_HIV-1Stability against The transduced factor frequency was 4.5% and pgk-tk / ΔLTR_HVI-1In the case of It was 1.9%. 2.4-fold increase in stable transduction frequency is a paired student The test showed that it was significant (P <0.05). For example, 1) DNA molecule 2) Composition of microinjection buffer, 3) Microscopic Conditions for pre-culture of DNA with integrase before microinjection (eg, temperature ) May be further optimized. The technology of the present invention The use may allow a stable increase in transduction efficiency. Table 1 HIV-1 ΔLTR / HIV-1 integrase strategy PGK-tk / ΔLTR HIV-1 PGK-tk / ΔLTR HIV-1 + integrase HIV-1 2/56 (3.6%) 1/47 (4.5%) 3/59 (5.1%) 5/62 (8.1%) 1/50 (2%) 3/50 (6%) 0/50 (0%) 2/50 (4%) 0/50 (0%) 2/50 (4%) 0/50 (0 %) 1/50 (2 %) 6/315 (1.9%) 14/309 (4.5%) 2.4 times improvement Table 1 shows the number of cells containing stable DNA integration obtained as a result of statistical analysis of the data. Indicates that a statistically significant improvement is seen. This analysis shows a statistically significant improvement (Student's t-test (2-tail), p <.05).Example 2 Stable form with co-delivery of REP ⁷⁸ and AAV ITR flanking transgene constructs Quality introduction This example provides the use of the invention for conjugation of proteins. According to the embodiment If the protein used in the present invention is an enzyme, Rep⁷⁸It is. This technical field These general techniques are described in many of the other tools given as used herein. Evaluate protein. This example combines transgene constructs flanked by AAV ITR sequences. REP associated with⁷⁸Of the present invention to increase the frequency of stable transduction with co-delivery of Shows the utility of ITR / REP⁷⁸To evaluate the concept, cells are⁷⁸Co-distributed A small amount of either the linear or linear PGK-tk / ITR was injected Was. The linear pGK-tk sequence flanked by ITRs consists of FseI and SfiI. To obtain bacterial plasmid sequences Gel purified. The purified MBP-Rep described in FIG.⁷⁸Was used. MBP -Rep⁷⁸Has been previously described by the inventor as ITR binding and endonucleus in vitro. Activating the lease reaction was observed. As described in Example 11, In these studies performed, the DNA solution provided 50 ng / m of pGK-tk / ITR. And a DNA / protein solution containing pGK. -50 ng / ml of tk / ITR and MBP-Rep⁷⁸50 ng / m Containing at a concentration of 23 nM and MgCl_TwoIs expected to be 2 mM I will. These values represent approximately 20 injected protein molecules per injected DNA molecule. Selected to produce quality. The exact volume delivered per cell is unknown, but 5-10 femtoliters deliver 70-140 DNA molecules per cell Is done. This result is occupied in Table 2. Rep⁷⁸Included with pGK-tk / ITR If so, stable transduction is achieved with a 2.3-fold increased frequency. these In the study, MBP-Rep⁷⁸The protein is loaded on the microinjection tube with the protein Added just before. DNA / protein solution not ready immediately before microinjection Timing of addition of protein to DNA It seems to be important. Table 2 AAV ITR / Rep⁷⁸strategy PGK-tk / ITR PGK-tk / ITR ＋ ReP⁷⁸ 3/72 (4.2%) 5/80 (6.3%) 4/76 (5.3%) 8/66 (12.1%) 2/76 (2.6 %) 7/72 (8.7 %) 9/224 (4.0%) 20/218 (9.2%) 2.3 times improvementExample 13 Circular constructs for nucleic acid integration This embodiment is directed to the generation of covalently closed rings that facilitate incorporation. It shows the utility of light. Circular double-stranded proviral DNA integrates with normal AAV Because it is a suitable substance for retroviruses and retroviral integration is possible. It appears to be useful for the first circularization of the transgene construct. Such a circular construction The thing is shown as cir-rsGFP-MGMT / ITR in FIG. A plasmid backbone containing AAV ITRs was constructed and rsGFP-MG Pac 1 and so that the MT sequence generates prsGFP-MGMT / ITR Inserted between Asc 1 sites. Linear ITR side surface arrangement rsGFP-MGMT arrangement Column as described above Was obtained by digestion with Fse I and Sfi I. prsGFP-MG The Sfi I site (backbone plasmid sequence) in the MT / ITR is a second Converted to create an Fse I site. Molecule is linear by Fse I digestion And moved. The molecule is recombined into a Fse I site circular. Cyclic molecule Is purified by agarose gel prior to microinjection. The above-described method comprises retroviral integrase-mediated transgene construction. It is contemplated that it could be used to facilitate incorporation. Shown in FIG. All constructs containing the ΔLTR sequence (or even the complete LTR sequence) are linear. However, the indicated transcript flanked by the ΔLTR or LTR sequence on the circular construct Genes will lead to an increase in the frequency of integration. For example, retroviral plows The material for incorporation of ils is thought to be a linear molecule flanked by LTRs. But a circular proviral molecule present in the nucleus of retrovirus-infected cells (Including either one or two LTRs) are also considered as potential for incorporation. available. Indeed, using such a circular construct, retroviral Co-delivery with teglase protein has increased integration capacity compared to the linear form It seems to guide the power. The LTR or LTR terminal sequence contained in such a circular construct Rows can be either side by side with each other or separated by some distance. Conceivable. In the example, this distance is defined by the number of nucleobases. Was. For example, the number of nucleobases between the first and second LTR terminal sequences may be two to about two. Could be up to 00. In certain embodiments of the circular nucleic acid, the LTR terminal fragment Was about 10 to about 20 nucleotide bases apart.Example 14 Tiger using retroviral integrase protein fused to protein Site-specific target setting for integration into transgenes Wild-type AAV selectively integrates into specific regions of the human genome. AAV R ep⁷⁸Requires integration specific for chromosome 19, because the rep-AAV vector -Does not have the same site-specific integration format as the rep + AAV vector. (Muzyczka, 1992). Rep⁷⁸The protein is involved in chromosome 19-specific AAV integration It is believed that it has played several essential roles- Shows a sequence of 12 nucleotides in the ITR and a similar sequence on chromosome 19 (AAVS1 Mediates the formation of a complex between the AAVS1 and the chain-specific cleavage in AAVS1 (Lindenet al., 1996). By itself, Rep⁷⁸Is itself a specific DNA Described as a protein that has both sequence-binding and integrase activities It seems to have been done. Selectivity of transcriptionally active genes for integration within chromatin. (Vijayaet al., 1984; Withers-Wardet al., 1994) and nucleosome stereoscopy There is selectivity for conformation (Prusset al., 1994) But retroviruses For installation of There appears to be no site specificity. However, the conclusion is that high specificity DNA binding Use the integrase linked to the main to target the correct integration site (Goulaouic and Chow, 1996; Bushman, 1994) ). The DNA binding domain can be an existing DNA binding protein, or a specific genomic DN. A novel tandem designed and synthesized with high affinity specificity for the A sequence It could be derived from any of the proteins. For example, for the globin locus Specific targeting of transgenes (retroviral integrase with GATA- 1 or NF-E2 erythroblast-specific transcription factor). Facilitates expression of specific transgenes in cells. Another possible example is the lipo Potentially facilitate long-term expression of therapeutic genes for somal storage disease Eyes of incorporation into chromatin known as "open" of spheres / macrophages It will be a target setting. Affinity and characteristics of DNA binding proteins for specific DNA sequences The isomerism can be determined by analyzing the structure of the protein and the site of the mutation (eg, DNA X-ray crystallographic and / or NMR analysis between the binding domain and the target DNA) Seems to be able to. For example, with increased affinity for DNA Mutations in the DNA binding domain of the c-myc protein have been reported.Example 15 Use of constructs expressing integrative enzymes In certain embodiments, the present invention relates to the co-ordination of primary and secondary DNA sequences to cells. Offer to send. The primary and secondary nucleic acid sequences contain two separate constructs, one Also include a transgene of interest flanked by a suitable LTR or sequence ITR The other is to transgene into proteins, especially cellular chromosomal DNA. Enzymes that facilitate integration (ie, retroviral integrators) Ze or Rep⁷⁸) Are produced as any of the expression constructs. Micro injection Input genetically modifies both transgene and integrase expression constructs Can be co-delivered to the nucleus of the cell to be harvested. Integrase in the cytoplasm After expression and translation of the protein, a transgene construct is used to facilitate integration. It is essential that they have to translocate to interacting nuclei. A retrow It has been previously described that ils integrase localizes to the nucleus after expression in cells. ing. Cytomegalovirus (CMV) promoter / enhancer sequence support A construct that expresses M-MuLV integrase under control has been prepared in the present invention. . In addition, AAV Rep under the control of the CMV promoter / enhancer sequence⁷⁸ Constructs expressing proteins also developed.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, M W, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY) , KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM , AT, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, G B, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR , KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, P T, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ , TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞の染色体核酸の内部に目的とする遺伝子の裸の核酸配列を組み込ませるための方法、でこれには以下の事項を含む：タンパク質及び長末端反復配列又はその断片に側面配置された目的の核酸配列を持つトランスジーン構築物を含んだ複合成分の調製、及び細胞の核への複合成分の導入。ここにおいて、細胞の染色体核酸の内部に目的とする核酸の安定的な組み込みは、タンパク質の不在の状態での目的核酸の組み込みに比較して、タンパク質の存在下で促進される。２．タンパク質がインテグラーゼ酵素としてさらに定義れる請求項１の方法。３．長末端反復配列がレトロウイルス長末端反復配列又はその断片であるとさらに定義される、請求項１の方法。４．酵素がレトロウイルスインテグラーゼとさらに定義される請求項１の方法。５．タンパク質が核酸結合タンパク質に融合した酵素を含む融合タンパク質であるとさらに定義される、請求項１の方法。６．タンパク質がグロブリン遺伝子座内の配列に結合することができるＧＡＴＡ１及びＮＦＥ２のＤＮＡ結合ドメインと融合した酵素を含むとさらに定義される、請求項５の方法。７．酵素がレトロウイルスインテグラーゼ酵素であるとさらに定義される請求項６の方法。８．レトロウイルスインテグラーゼ酵素が組み換えレトロウイルスインテグラーゼタンパク質である請求項４又は６の方法。９．組み換えレトロウイルスインテグラーゼタンパク質がＨＩＶ−１、Ｍ−ＭｕＬＶ、ＳＩＶ、ＦｅＬＶ又はＥＩＡＶである請求項８の方法。１０．細胞が哺乳類の細胞である請求項１の方法。１１．哺乳類の細胞が繊維芽細胞、造血幹細胞、内皮細胞、間葉細胞、上皮細胞又はグリア細胞である請求項１０の方法。１２．トランスジーン構築物がｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＬＴＲと定義される請求項１の方法。１３．核酸結合タンパク質が核酸配列とさらに定義される請求項６の方法。１４．複合成分が微量注入によって細胞の核に導入される請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３の方法。１５．トランスジーン構築物がＭＧＭＴ／ＭＤＲ−１である請求項１の方法。１６．細胞の染色体核酸内部に目的とする核酸配列を組み込みを増加させる方法、これにはで以下の事項を含む。酵素及びアデノ会合ウイルス逆位末端反復配列又はその断片に側面配置された核酸配列を持つトランスジーン構築物を含んだ複合成分の調製、複合成分の細胞への導入。１７．組込酵素がＲｅｐ⁷⁸である請求項１６の方法。１８．トランスジーン構築物がｐｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＩＴＲである請求項１６の方法。１９．複合成分が微量注入によって細胞に導入される請求項１６の方法。２０．細胞が哺乳類の細胞である請求項１６の方法。２１．以下のものが含まれる複合成分：長末端反復又はその断片に側面配置された核酸配列を持つトランスジーン構築物；及び細胞の核酸内部への核酸の組込を容易にすることができる酵素。２２．長末端反復配列が約１０から約２０までの塩基対の長さを含む請求項２１の方法。２３．トランスジーン構築物がｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＬＴＲである請求項２１の方法。２４．以下のものが含まれる複合成分：アデノ会合ウイルス逆位末端反復配列又はその断片に側面配置された目的の核酸配列を持つトランスジーン構築物；及びインテグラーゼタンパク質。２５．インテグラーゼタンパク質がＲｅｐ⁷⁸である請求項２４の複合成分。２６．トランスジーン構築物がｒｓＧＦＰ−ＭＧＭＴ／ＬＴＲである請求項２４の構築物。２７．環状核酸構築物、これは以下のものを含む：一次インテグラーゼ認識配列及び二次インテグラーゼ認識配列（ＩＲＳ）で側面配置された目的の核酸配列。ここにおいて、一次ＩＲＳ及び二次ＩＲＳはお互いに並列配置又は一方から約２から約２０ヌクレオチドの位置に配置されている。２８．組込認識配列がＡＡＶ逆位末端反復領域又はその断片である請求項２７の環状核酸構築物。２９．ＩＲＳがＬＴＲ又はその断片である請求項２７の環状核酸構築物。３０．ＬＴＲがさらにＨＩＶ−１と定義される請求項２８の環状核酸構築物。３１．細胞の染色体核酸内部への目的とする核酸配列の組込を増加させる方法、これは以下のものを含む：長末端反復配列の末端断片で側面配置された目的の核酸配列を含んだトランスジーン構築物を含んだ一次核酸配列；及び細胞の染色体核酸内部へ目的の配列の組込を促進することができるタンパク質をコードする二次核酸配列。３２．二次核酸配列が組込酵素をコードする請求項３１の方法。３３．トランスジーン構築物の長末端反復配列がレトロウイルス長末端反復配列とさらに定義される請求項３２の方法。３４．細胞が哺乳類の細胞である請求項３３の方法。３５．一次核酸配列及び二次核酸配列がもう一方と共存しない請求項３１の方法。[Claims] 1. A method for incorporating the naked nucleic acid sequence of a gene of interest into the chromosomal nucleic acid of a cell, including: a protein and a nucleic acid of interest flanked by long terminal repeats or fragments thereof Preparation of a composite component containing the transgene construct with the sequence, and introduction of the composite component into the nucleus of the cell. Here, the stable incorporation of the target nucleic acid into the chromosomal nucleic acid of the cell is promoted in the presence of the protein as compared with the integration of the target nucleic acid in the absence of the protein. 2. 2. The method of claim 1, wherein the protein is further defined as an integrase enzyme. 3. 2. The method of claim 1, wherein the long terminal repeat is further defined as a retroviral long terminal repeat or a fragment thereof. 4. 2. The method of claim 1, wherein the enzyme is further defined as a retroviral integrase. 5. 2. The method of claim 1, wherein the protein is further defined as a fusion protein comprising an enzyme fused to a nucleic acid binding protein. 6. 6. The method of claim 5, wherein the protein is further defined as comprising an enzyme fused to the DNA binding domains of GATA1 and NFE2 capable of binding to sequences within the globulin locus. 7. 7. The method of claim 6, wherein the enzyme is further defined as a retroviral integrase enzyme. 8. The method of claim 4 or 6, wherein the retroviral integrase enzyme is a recombinant retroviral integrase protein. 9. 9. The method of claim 8, wherein the recombinant retroviral integrase protein is HIV-1, M-M uLV, SIV, FeLV or EIAV. 10. 2. The method of claim 1, wherein the cells are mammalian cells. 11. The method according to claim 10, wherein the mammalian cell is a fibroblast, a hematopoietic stem cell, an endothelial cell, a mesenchymal cell, an epithelial cell, or a glial cell. 12. 2. The method of claim 1, wherein the transgene construct is defined as rsGFP-MGMT / LTR. 13. 7. The method of claim 6, wherein the nucleic acid binding protein is further defined as a nucleic acid sequence. 14． 14. The method of claim 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 or 13 wherein the complex component is introduced into the nucleus of the cell by microinjection. 15. 2. The method of claim 1, wherein the transgene construct is MGMT / MDR-1. 16. Methods for increasing the integration of a nucleic acid sequence of interest within a cell's chromosomal nucleic acid, including the following: Preparation of a complex component comprising a transgene construct having a nucleic acid sequence flanked by enzymes and adeno-associated virus inverted terminal repeats or fragments thereof, introducing the complex component into cells. 17． 17. The method of claim 16, wherein the incorporation enzyme is Rep ⁷⁸ . 18. 17. The method of claim 16, wherein the transgene construct is prsGFP-MGMT / ITR. 19. 17. The method of claim 16, wherein the complex component is introduced into the cells by microinjection. 20. 17. The method of claim 16, wherein the cells are mammalian cells. 21. A complex component comprising: a transgene construct having a nucleic acid sequence flanked by long terminal repeats or fragments thereof; and an enzyme capable of facilitating incorporation of the nucleic acid into the nucleic acid of a cell. 22. 22. The method of claim 21, wherein the long terminal repeat comprises a length of about 10 to about 20 base pairs. 23. 22. The method of claim 21, wherein the transgene construct is rsGFP-MGMT / LTR. 24. A complex component comprising: a transgene construct having a nucleic acid sequence of interest flanked by an adeno-associated virus inverted terminal repeat or a fragment thereof; and an integrase protein. 25. Composite component according to claim 24 integrase protein is Rep ^78. 26. 25. The construct of claim 24, wherein the transgene construct is rsGFP-MGMT / LTR. 27. Circular nucleic acid constructs, which include: A nucleic acid sequence of interest flanked by primary and secondary integrase recognition sequences (IRS). Here, the primary IRS and the secondary IRS are arranged in parallel with each other or at a position of about 2 to about 20 nucleotides from one. 28. The circular nucleic acid construct according to claim 28, wherein the integration recognition sequence is an AAV inverted terminal repeat region or a fragment thereof. 29. 28. The circular nucleic acid construct of claim 27, wherein the IRS is an LTR or a fragment thereof. 30. 29. The circular nucleic acid construct of claim 28, wherein the LTR is further defined as HIV-1. 31. Methods for increasing the integration of a nucleic acid sequence of interest into the chromosomal nucleic acid of a cell, including: A transgene construct comprising the nucleic acid sequence of interest flanked by terminal fragments of long terminal repeats And a secondary nucleic acid sequence encoding a protein capable of facilitating the integration of the sequence of interest into the chromosomal nucleic acid of the cell. 32. 32. The method of claim 31, wherein the secondary nucleic acid sequence encodes an integration enzyme. 33. 33. The method of claim 32, wherein the long terminal repeat of the transgene construct is further defined as a retroviral long terminal repeat. 34. 34. The method of claim 33, wherein the cells are mammalian cells. 35. 32. The method of claim 31, wherein the primary and secondary nucleic acid sequences are not coexistent with the other.