【発明の詳細な説明】
抗肥満タンパク質
発明の分野
本発明は、ヒト用医薬の分野、特に肥満および肥満関連障害の治療に関する。
より具体的には、本発明は患者に投与したときに脂肪組織を調節する抗肥満タン
パク質に関する。
発明の背景
肥満および特に上半身肥満は、米国および全世界共通の非常に重大な公衆衛生
上の問題である。最近の統計によれば、米国の人口の２５％以上およびカナダの
人口の２７％が太りすぎである(Kuczmarski,R.J.,Amer.J.of Clin.Nutr.55:495S
−502S(1992);Reeder,B.A.ら、Can.Med.Assoc.J.,146:2009−2019(1992))。上半
身肥満はII型糖尿病の人々において最も強い危険因子であることがわかっており
、循環器疾患や癌の強い危険因子でもある。肥満に対する医療経費に関する最近
の推定値は世界中で１５００億ドルである。米国社会に広がる増加し続けている
肥満と闘うために公衆衛生局長官が主導権をとり始めたほど問題は深刻になって
きている。
この肥満による病状の多くが異脂肪血症（dyslipidemia）、高血圧症、および
インスリン耐性と強い関連があると考えられる。ダイエットと運動による肥満の
減少によってこれらの危険因子が劇的に低下することが多くの研究で示されてい
る。残念なことに、これらの処置の多くは成功せず、その失敗率は９５％に達す
る。この失敗は、該病状が食欲の増加、高カロリー食品の嗜好、身体的活動の低
下、および脂肪形成代謝の増大に関与する遺伝因子と強い関連があるという事実
によるかも知れない。このことはこれらの遺伝的特性を受け継いだ人々は該病状
と戦う努力に関わらず肥満になる傾向があることを示している。したがって、こ
の肥満というハンディキャップを是正し、肥満患者の遺伝的特性に関わらず医師
が該患者をうまく治療することができる薬物が必要である。
生理学者は多年にわたり、哺乳動物が過食すると、過剰な脂肪シグナルが脳に
身体が肥満していることを知らせ、次いで身体の食べる量が減り、燃料をより燃
焼させるようにすると仮定してきた(Hervey,G.R.,Nature 222:629-631(1969))。
この「フィードバック」モデルは肥満を調節する循環ホルモンが関与する併体結
合実験により支持される。
ｏｂ／ｏｂマウスは、６番染色体の突然変異と関連した常染色体劣性特性を持
つことが知られている肥満および糖尿病のモデルである。最近、Zhanq,Y.らはこ
の病状と関連したマウス遺伝子の位置的クローニングについて発表した(Zhanq,Y
．ら、Nature 372:425−432(1994))。この報告は、脂肪組織のみに発現する２１
アミノ酸シグナルペプチドを含む１６７アミノ酸タンパク質をコードする遺伝子
を開示している。その後、ラット肥満遺伝子はクローンされ、発現された(Murak
ami,T.ら、Biochem.Biophys.Res.Comm.209:944-952(1995))。ｏｂ遺伝子がコー
ドしていると思われるタンパク質は、現在、肥満調節ホルモンであると推測され
ている。
ｏｂ遺伝子がコードするタンパク質は薬理活性を有するが、その物理特性は望
ましいものではない。例えば、ヒトタンパク質は製剤でも生理学的条件下でも沈
殿し、凝集する傾向がある。
沈殿物を含むタンパク質製剤、すなわち、投与部位に沈殿を生じるタンパク質
製剤は患者の免疫応答を引き起こす危険性が増し、注射部位に炎症を生じること
がある。洗剤または界面活性剤のような製剤への添加物は毒性の危険性が増すの
で望ましくない。したがって、薬理活性を示し、改善された物理化学的安定性を
有する薬剤の開発が待たれている。
本出願人は、天然のヒトタンパク質にみられる凝集の一部が該タンパク質表面
、特に残基１、２、３、３０、３６、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４
８、４９、５０、７４、８９、９２、９９、１００、１３８、および１４２にお
ける疎水性相互作用によることを発見した。さらに本出願人は、該タンパク質の
これらの位置または領域を荷電または親水性アミノ酸で置換することによりｏｂ
タンパク質の凝集傾向が劇的に減少することを発見した。この凝集の減少により
著しく改良された薬物が得られる。したがって、本発明は生物学的に活性な肥満
タンパク質を提供する。そのような物質は、患者が肥満というハンディキャップ
を克
服し、II型糖尿病、循環器疾患、および癌の危険性をより正常化し、正常な生活
を送るのを可能にする。
発明の要約
本発明は、式（Ｉ）：
［ここで、１位のＸａａは、欠失しているか、Ｖａｌであり、
２位のＸａａは、欠失しているか、Ｐｒｏであり、
２２位のＸａａは、ＡｓｎまたはＳｅｒであり、
２８位のＸａａは、欠失しているか、Ｇｌｎであり、
７２位のＸａａは、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐであり、
７３位のＸａａは、ＶａｌまたはＭｅｔであり、
１００位のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙ
ｓ、Ｈｉｓ、またはＡｒｇであり、
１３８位のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙ
ｓ、Ｈｉｓ、またはＡｒｇである］
で示される、以下の置換の少なくとも１つを有するタンパク質、またはその医薬
的に許容される塩を目的とする。
１位のＸａａがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、またはＡｒ
ｇで置換されているか、
２位のＸａａがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、またはＡｒ
ｇで置換されているか、
３位のＩｌｅがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されてい
るか、
３０位のＶａＩがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
３６位のＶａｌがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
４１位のＰｈｅがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
４２位のＩｌｅがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
４３位のＰｒｏがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
４５位のＬｅｕがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
４６位のＨｉｓがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、またはＬｙｓで置換されているか、
４７位のＰｒｏがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
４８位のＩｌｅがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
４９位のＬｅｕがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
５０位のＴｈｒがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
７４位のＩｌｅがＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、
またはＳｅｒで置換されているか、
８９位のＶａｌがＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、
またはＳｅｒで置換されているか、
９２位のＰｈｅがＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、
またはＳｅｒで置換されているか、
９９位のＰｒｏがＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、
またはＳｅｒで置換されているか、または
１４２位のＬｅｕがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換され
ている。
さらに本発明は、肥満または肥満に関連する病状を治療する方法であって、そ
のような治療を要する哺乳動物に式（Ｉ）のタンパク質を投与することを含む方
法を提供する。
さらに本発明は、所望によりリーダー配列を有する式（Ｉ）のタンパク質を、
１またはそれ以上の医薬的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と共に含む
医薬製剤を提供する。
さらに本発明は、さらに式Ｉのタンパク質のＮ−末端に結合したリーダー配列
を有する式（Ｉ）のタンパク質を提供する。そのようなタンパク質は、その抗肥
満活性を得るのに、そして式（Ｉ）のタンパク質の製造において中間体として有
用である。さらに本発明は、式（Ｉ）のタンパク質、またはリーダー配列を有す
る式（Ｉ）のタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
本発明のさらなる態様は、
（ａ）式（Ｉ）のタンパク質、またはリーダー配列を有する式（Ｉ）のタンパク
質をコードするＤＮＡで宿主細胞を形質転換し、
（ｂ）該タンパク質が発現する条件下で宿主細胞を培養し、
（ｃ）発現したタンパク質を回収し、所望により
（ｄ）該リーダー配列を酵素的に開裂させることを含む式（Ｉ）のタンパク質の
製造方法である。
さらに本発明は、肥満ならびに肥満に関連する病状の治療、および肥満ならび
に肥満に関連する病状を治療するのに用いる医薬の製造に用いるタンパク質を提
供する。
詳細な説明
本明細書に開示し、クレームしている本発明の目的において、下記の用語と略
語を以下のごとく定義する。
塩基対（ｂｐ）はＤＮＡまたはＲＮＡを表す。略語Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴは、
ＤＮＡ分子では、それぞれ、ヌクレオチドの（デオキシ）アデニン、（デオキシ
）シチジン、（デオキシ）グアニン、および（デオキシ）チミンの５'−一リン
酸塩に対応する。略語Ｕ、Ｃ、Ｇ、およびＴは、ＲＮＡ分子では、それぞれ、ヌ
クレオシドのウラシル、シチジン、グアニンおよびチミンの５'−一リン酸塩に
対応する。２本鎖ＤＮＡでは、塩基対はＡとＴ、またはＣとＧのパートナーシッ
プを表すことができる。ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ２本鎖では、塩基対はＴもしくは
ＵとＡ、またはＣとＧのパートナーシップを表すことができる。
ＦＭＯＣ：９−フルオレニメトキシカルボニの略語。
免疫反応性タンパク質：抗体、抗原と結合することができ、それが誘導される
親抗体分子と同様の性質を有する抗体断片、および一本鎖ポリペプチド結合分子
をまとめて説明するのに用いる用語（Bird,E.R.ら、PCT出願番号PCT/US/87/0220
8、国際公開番号WO88/01649、1988年３月10日公開）。
プラスミド：染色体外自己複製遺伝要素。
ＰＡＭ：４−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチルの略語。
ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルクロリドの略語。
リーディングフレーム（解読枠）：ｔＲＮＡ、リボソーム、および関連因子の
翻訳装置により、それぞれが特定のアミノ酸に対応するトリプレットで翻訳され
る（「読みとり」）ヌクレオチド配列。各トリプレットは明確であり、同じ長さ
であるため、コード配列は３の複数でなければならない。塩基対の挿入または欠
失（フレームシフト突然変異と呼ばれる）により、同じＤＮＡ断片によってコー
ドされる２つの異なるタンパク質を生じることがある。このようにならないよう
にするために、所望のポリペプチドに対応するトリプレットコドンは開始コドン
から３の複数となるように並んでいなければならない。すなわち、正しい「解読
枠」が維持されなければならない。
組換えＤＮＡクローニングベクター：１またはそれ以上のＤＮＡ断片を加える
ことができるか、該断片が加わっているＤＮＡ分子を含むプラスミドやファージ
（これらに限定されない）を含むあらゆる自己複製物質。
組換えＤＮＡ発現ベクター：プロモーターが組み込まれているあらゆる組換え
ＤＮＡクローニングベクター。
レプリコン：プラスミドまたは他のベクターの自己複製を許し、調節するＤＮ
Ａ配列。
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸の略語。
転写：ＤＮＡのヌクレオチド配列に含まれた情報を相補性ＲＮＡ配列に移す過
程。
翻訳：メッセンジャーＲＮＡの遺伝情報を用いてポリペプチド鎖の合成を特定
し、指示する過程。
トリス：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの略語。
治療（処置）：疾病、病状、または障害と闘うために患者を管理し、看護する
ことをいい、症状もしくは合併症の発症を抑えるか、症状もしくは合併症を軽減
させるか、または疾患、病状、もしくは障害を除去するために本発明のタンパク
質を投与することが含まれる。したがって、肥満の治療には、必要とする患者に
おける食物摂取の阻害、体重増加の阻害、および体重減少の誘導が含まれる。
ベクター：適切な制御配列と結合することにより形質転換する宿主細胞に特定
の特性を与える、適切なタンパク質分子に対応するポリヌクレオチド配列を保持
する遺伝子操作において細胞を形質転換するのに用いるレプリコン。プラスミド
、ウイルス、およびバクテリオファージは、それ自身でレプリコンであるため適
切なベクターである。人工的ベクターは制限酵素やリガーゼを用いて種々の供給
源由来のＤＮＡ分子を切り取り、連結することにより構築される。ベクターには
組換えＤＮＡクローニングベクターと組換えＤＮＡ発現ベクターが含まれる。
Ｘ−ｇａｌ：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−ガラクトシドの略
語。
アミノ酸の略語は米国特許商標庁（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２(ｂ)(２)(
１９９３)に記載）により承認されている。特記しない限り、アミノ酸はＬ配置
である。
上記の通り、本発明は式（Ｉ）：
［ここで、１位のＸａａは、欠失しているか、Ｖａｌであり、
２位のＸａａは、欠失しているか、Ｐｒｏであり、
２２位のＸａａは、ＡｓｎまたはＳｅｒであり、
２８位のＸａａは、欠失しているか、Ｇｌｎであり、
７２位のＸａａは、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐであり、
７３位のＸａａは、ＶａｌまたはＭｅｔであり、
１００位のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙ
ｓ、Ｈｉｓ、またはＡｒｇであり、
１３８位のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙ
ｓ、Ｈｉｓ、またはＡｒｇである］
で示される、以下の置換の少なくとも１つを有するタンパク質、またはその医薬
的に許容される塩を提供する。
１位のＸａａがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、またはＡｒ
ｇで置換されているか、
２位のＸａａがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、またはＡｒ
ｇで置換されているか、
３位のＩｌｅがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されてい
るか、
３０位のＶａｌがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
３６位のＶａｌがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
４１位のＰｈｅがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
４２位のＩｌｅがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
４３位のＰｒｏがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
４５位のＬｅｕがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
４６位のＨｉｓがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、またはＬｙｓで置換されているか、
４７位のＰｒｏがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
４８位のＩｌｅがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
４９位のＬｅｕがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
５０位のＴｈｒがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
７４位のＩｌｅがＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、
またはＳｅｒで置換されているか、
８９位のＶａｌがＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、
またはＳｅｒで置換されているか、
９２位のＰｈｅがＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、
またはＳｅｒで置換されているか、
９９位のＰｒｏがＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、
またはＳｅｒで置換されているか、または
１４２位のＬｅｕがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換され
ている。
好ましいタンパク質は、式（Ｉ）で示される、１〜３個の置換、より好ましく
は１または２個の置換を有するものである。
本発明の他の好ましいタンパク質は、
３６位のＶａｌがＡｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されているか、
７４位のＩｌｅがＧｌｕまたはＡｓｐで置換されているか、または
９２位のＰｈｅがＡｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されている配列番号１記
載のタンパク質である。
本発明の他の好ましいタンパク質は、
９２位のＰｈｅがＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＨｉｓで置換されて
いる配列番号１で示されるタンパク質またはその医薬的に許容される塩である。
本発明の他の好ましいタンパク質は、
９２位のＰｈｅがＡｓｐまたはＧｌｕで置換されている配列番号１で示されるタ
ンパク質またはその医薬的に許容される塩である。
本発明の他の好ましいタンパク質は、
１位のＸａａが欠失しているか、Ｖａｌであり、
２位のＸａａが欠失しているか、Ｐｒｏであり、
２２位のＸａａがＡｓｎであり、
２８位のＸａａが欠失しているか、Ｇｌｎであり、
７２位のＸａａがＡｓｎであり、
７３位のＸａａがＶａｌであり、
１００位のＸａａがＴｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ
、またはＡｒｇであり、
１３８位のＸａａがＴｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ
、またはＡｒｇである
配列番号１で示される、以下の置換の少なくとも１つを有するタンパク質、また
はその医薬的に許容される塩である。
４５位のＬｅｕがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
４６位のＨｉｓがＧｌｕ、ＡＳｐ、Ａｒｇ、またはＬｙｓで置換されているか、
４７位のＰｒｏがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
４８位のＩｌｅがＧｌｕ、ＡＳｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、または
１４２位のＬｅｕがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換され
ている。
本発明の他の好ましいタンパク質は、
１位のＸａａがＶａｌであり、
２位のＸａａがＰｒｏであり、
２８位のＸａａが欠失しているか、Ｇｌｎであり、
７２位のＸａａがＡｓｎであり、
１００位のＸａａがＴｒｐ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐであり、
１３８位のＸａａがＴｒｐ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐである配列番号１で示される
、以下の置換の少なくとも１つを有するタンパク質、またはその医薬的に許容さ
れる塩である。
４６位のＨｉｓがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、またはＬｙｓで置換されているか、
４８位のＩｌｅがＡｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されているか、
または
９２位のＰｈｅがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いる。
本発明の他の好ましいタンパク質は、
１位のＸａａがＶａｌであり、
２位のＸａａがＰｒｏであり、
２８位のＸａａが欠失しているか、Ｇｌｎであり、
７２位のＸａａがＡｓｎであり、
１００位のＸａａがＴｒｐ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐであり、
１３８位のＸａａがＴｒｐ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐである配列番号１で示される
、以下の置換の少なくとも１つを有するタンパク質、またはその医薬的に許容さ
れる塩である。
４６位のＨｉｓがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、またはＬｙｓで置換されているか、
４８位のＩｌｅがＡｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されている。
本発明のさらにより好ましいタンパク質は、
１位のＸａａがＶａｌであり、
２位のＸａａがＰｒｏであり、
２８位のＸａａが欠失しているか、Ｇｌｎであり、
７２位のＸａａがＡｓｎであり、
１００位のＸａａがＴｒｐ、またはＡｓｐであり、
１３８位のＸａａがＴｒｐである配列番号１で示される、以下の置換の少なくと
も１つを有するタンパク質、またはその医薬的に許容される塩である。
４６位のＨｉｓがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、またはＬｙｓで置換されているか、
４８位のＩｌｅがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
９２位のｐｈｅがＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いる。
本発明のさらにより好ましいタンパク質は、
１位のＸａａがＶａｌであり、
２位のＸａａがＰｒｏであり、
２８位のＸａａが欠失しているか、Ｇｌｎであり、
７２位のＸａａがＡｓｎであり、
１００位のＸａａがＴｒｐ、またはＡｓｐであり、
１３８位のＸａａがＴｒｐである配列番号１で示される、以下の置換の少なくと
も１つを有するタンパク質、またはその医薬的に許容される塩である。
４６位のＨｉｓがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、またはＬｙｓで置換されているか、
４８位のＩｌｅがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いる。
本発明の他の好ましいタンパク質は、
１位のＸａａが欠失しているか、Ｖａｌであり、
２位のＸａａが欠失しているか、Ｐｒｏであり、
２８位のＸａａが欠失しているか、Ｇｌｎであり、
７２位のＸａａがＡｓｎ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐであり、
１００位のＸａａがＴｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅr、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ
またはＡｒｇであり、
１３８位のＸａａがＴｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ
、またはＡｒｇである配列番号１で示される、以下の置換の少なくとも１つを有
するタンパク質、またはその医薬的に許容される塩である。
１位のＸａａが欠失しているか、またはＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙ
ｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇで置換されているか、
２位のＸａａが欠失しているか、またはＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙ
ｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇで置換されているか、
８９位のＶａｌがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
９２位のＰｈｅがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いる。
他の好ましいタンパク質は、
１位のＸａａが欠失しているか、Ｖａｌであり、
２位のＸａａが欠失しているか、Ｐｒｏであり、
２８位のＸａａが欠失しているか、Ｇｌｎであり、
７２位のＸａａがＡｓｎ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐであり、
１００位のＸａａがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、またはＡｒｇであり、
１３８位のＸａａがＴｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ
、またはＡｒｇである配列番号１で示される、以下の置換の少なくとも１つを有
するタンパク質、またはその医薬的に許容される塩である。
９２位のＰｈｅがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いるか、
９９位のＰｒｏがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓで置換されて
いる。
式Ｉで示される好ましいタンパク質には、以下の配列番号２〜配列番号７で示
されるタンパク質が含まれる。
上記のごとく、本発明は、さらに式Ｉのタンパク質のＮ−末端と結合したリー
ダー配列を有する式（Ｉ）のタンパク質も提供する。そのようなタンパク質はそ
の抗肥満活性を得るのに有用であり、式（Ｉ）のタンパク質の製造において中間
体として有用である。配列番号８−１３を有するタンパク質は、それぞれ配列番
号２−７のタンパク質のＮ−末端と結合したリーダー配列Ｍｅｔ−Ａｒｇを有す
る式（Ｉ）の特に好ましいタンパク質である。
本発明は肥満の有効な治療法となる生物学的に活性なタンパク質を提供する。
本出願人は、該タンパク質表面の疎水性残基に対する特異的な置換により特性が
改善されることを発見した。該残基は一次配列からは予測されないだろう。この
置換を有するタンパク質は薬理学的に活性であり、マウスとヒト両方の該タンパ
ク質に比べて凝集が低下する傾向がある。肥満タンパク質は一般的に用いられる
保存剤と適合性であるため、本発明により肥満タンパク質をより高濃度でより容
易に製剤化することができ、その医薬的洗練性が増す。
本発明のタンパク質は、通常、組換え技術により製造される。既知の配列を有
するＤＮＡ中の予め決定された部位に置換突然変異を生じる技術、例えば、Ｍ１
３プライマー突然変異誘発は良く知られている。本発明の抗肥満タンパク質をコ
ードするＤＮＡ中に生じるかも知れない突然変異は、解読枠中の配列に生じては
ならず、二次ｍＲＮＡ構造を生じる相補性領域を生じないことが好ましいであろ
う（DeBoer,H.A.ら、欧州特許公開番号７５４４４Ａ２（1983年３月３０日公開
）。
本発明のタンパク質は、組換えＤＮＡ技術、または溶液もしくは固相ペプチド
合成法、または通常の溶液法によりカップリングされたタンパク質断片を用いて
開始される溶液中の半合成法といった良く知られた化学的方法により生成するこ
とができよう。
Ａ．固相
本発明のタンパク質の合成は、固相ペプチド合成法または組換え法により進め
ることができよう。ポリペプチドの固相化学合成法の原理は当該分野で良く知ら
れており、Duqas,H.およびPenney,C.，Bioorqanic Chemistry Sprinqer-Verlaq
，New York，(1981)54-59のような当該分野の一般的教科書に見いだすことがで
きよう。例えば、PE-Applied Biosystems 433Aペプチド合成装置(Perkin Elmer-
Applied Biosystems Division，Foster
City，California)およびApplied Biosystemsから提供された合成周期を用いる
固相方法論によりペプチドを合成することができよう。Ｂｏｃアミノ酸または他
の試薬は、PE-Applied Biosystemsおよび他の化学薬品供給会社から市販されて
いる。二重カップルプロトコールを用いる連続Ｂｏｃ化学をＣ−末端カルボキサ
ミドを生成するための出発ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂に適用する。Ｃ
−末端酸を生成するには、対応するＰＡＭ樹脂を用いる。予め形成したヒドロキ
シベンゾトリアゾールエステルを用いてアルギニン、アスパラギン、グルタミン
、ヒスチジン、およびメチオニンをカップリングする。以下の側鎖の保護を用い
ることができよう。
Ａｒｇ、トシル
Ａｓｐ、シクロヘキシルまたはベンジル
Ｃｙｓ、４−メチルベンジル
Ｇｌｕ、シクロヘキシル
Ｈｉｓ、ベンジルオキシメチル
Ｌｙｓ、２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｍｅｔ、スルホキシド
Ｓｅｒ、ベンジル
Ｔｈｒ、ベンジル
Ｔｒｐ、ホルミル
ｔｙｒ、４−ブロモカルボベンズオキシ
Ｂｏｃ脱保護は塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて達成す
ることができよう。Ｔｒｐからのホルミルの除去は、ペプチジル樹脂をジメチル
ホルムアミド中の２０％ピペリジンで４℃で６０分間処理することにより達成さ
れる。Ｍｅｔ（Ｏ）は、ペプチジル樹脂を、ＴＦＡ／ジメチルスルフィド／濃Ｈ
Ｃｌ（９５／５／１）で２５℃で６０分間処理することにより還元することがで
きる。上記の前処理後、さらにペプチドを脱保護し、１０％ｍ−クレゾールもし
くはｍ−クレゾール／１０％ｐ−チオクレゾールもしくはｍ−クレゾール／ｐ−
チオクレゾール／ジメチル−スルフィドの混合物を含む無水フッ化水素で該樹脂
から開裂させることができよう。該樹脂からのペプチドおよび側鎖保護基の開
裂は０℃またはそれ以下、好ましくは−２０℃で３０分間、次いで０℃で３０分
間実施される。ＨＦを除去後、ペプチド／樹脂をエーテルで洗浄する。該ペプチ
ドを氷酢酸で抽出し、凍結乾燥する。アセトニトリル濃度を増加させるグラジエ
ントを用いる０．１％ ＴＦＡ中の逆相Ｃ１８クロマトグラフィ（例えば、２．
２ｃｍ Ｘ ２５ｃｍ Ｖｙｄａｃ（登録商標）カラム(The Separations Group，I
nc.，Hesperia，CA)により精製が達成される。
当業者は、固相合成法はＦＭＯＣ法およびＴＦＡ／スカベンジャー開裂混合物
を用いても達成されるであろうことを認識する。
Ｂ．組換え合成法
本発明のタンパク質は、組換え法によって生成することができよう。高収量ま
たは特異的翻訳後修飾を望む場合は組換え法が好ましい。組換えによりタンパク
質を製造する基本的工程には、
ａ）本発明のタンパク質をコードする合成または半合成ＤＮＡを構築し（または
天然の供給源から単離）、
ｂ）該タンパク質を単独でかまたは融合タンパク質として発現させるのに適した
方法で該コード配列を発現ベクターに統合し、
ｃ）適切な真核生物または原核生物宿主細胞を該発現ベクターで形質転換し、
ｄ）組換えにより製造されたタンパク質を回収および精製することが含まれる。
ａ．遺伝子の構築
合成遺伝子、該タンパク質の産生を生じるであろうそのin vitroまたはin viv
oにおける転写および翻訳は、当該分野で良く知られた技術により構築すること
ができよう。遺伝子コードの天然の縮重により、本発明のタンパク質をコードす
るかなり大きい一定数のＤＮＡ配列を構築することができることを当業者は認識
するであろう。本発明の好ましい実施において、合成は組換えＤＮＡ技術により
達成される。
合成による遺伝子構築の方法論は当該分野で良く知られている(Brown,E.L．ら
、Method in Enzymology，Academic Press，New York，NY，68:109-151(1979))
。本発明の合成タンパク質遺伝子に対応するＤＮＡ配列は、Applied Biosystems
Model 380Aまたは380B ＤＮＡ合成装置（Perkin
Elmer，Applied Biosystems Division，Foster City，California）のような通
常のＤＮＡ合成装置を用いて作製することができよう。
用途によっては、例えば、シグナルペプチドと構造タンパク質の間に、融合タ
ンパク質構築物由来のシグナルペプチドを削除するのを容易に制御するのに好都
合なプロテアーゼ感受性開裂部位を組み込むように本発明のタンパク質のコード
配列を修飾することが望ましいことがある。
本発明のタンパク質をコードする遺伝子はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用
いて作製することもできよう。鋳型は、ｃＤＮＡライブラリー（CLONETECHまた
はSTRATAGENEから市販）またはヒト脂肪組織から単離されたｍＲＮＡであり得る
。そのような方法論は当該分野で良く知られている（例えば、Maniatis,T．ら、
Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第２版,Cold Spring Harbor Press,C
old Sprinq Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York(1989)参照）。
ｂ．直接発現または融合タンパク質
本発明のタンパク質は、直接発現させるか、または本発明のタンパク質を含む
融合タンパク質を得、次いでこれを酵素または化学的に開裂させることにより作
製することができよう。特的部位でポリペプチドを開裂させるか、ペプチド鎖の
アミノもしくはカルボキシ末端からペプチドを消化する（例えば、ジアミノペプ
チダーゼ）種々のペプチダーゼ（例えば、トリプシン）が知られている。さらに
、特定の化学薬品（例えば、臭化シアン）は特定部位でポリペプチド鎖を開裂す
るだろう。当業者は、部位特異的な内在性開裂部位を組み込むのに必要なアミノ
酸配列（組換え法を用いる場合は合成または半合成コード配列）の修飾を認識す
るだろう（例えば、Carter,P.,Protein Purification、第１３章:From Molecula
r Mechanisms to Large-Scale Processes，Ladisch,M.ら編、American Chemical
Soc.,Washington,D.C．(1990)参照）。
ｃ．ベクターの構築
所望のコードおよび制御配列を含む適切なベクターの構築には標準的連結技術
を用いる。単離したプラスミドやＤＮＡ断片を開裂し、調整し、所望のプラスミ
ドを形成するのに望ましい形に再連結される。
所望のタンパク質の翻訳を行うために、適切な制限エンドヌクレアーゼを用い
て、操作した合成ＤＮＡ配列を過剰な適切な組換えＤＮＡ発現ベクターに挿入す
る。合成コード配列は、この発現物ならびに増幅物、および発現プラスミドから
の単離およびそれらへの統合を促進するために転写物のいずれかの末端に制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂部位を持つように設計される。単離されたｃＤＮＡコード
配列は、当該分野で良く知られた技術により該配列を所望のクローニングベクタ
ーに組み込むのを促進するため、合成リンカーを用いて容易に修飾することがで
きよう。用いる特定のエンドヌクレアーゼは、用いる親発現ベクターの制限エン
ドヌクレアーゼ開裂パターンによって決まる。制限部位は、本発明のタンパク質
の正しいインフレームな読みとりと発現を達成するためにコード配列と制御配列
が適切に正しく位置するように選ばれる。
一般的に、宿主細胞と適合する種から得られたプロモーターおよび制御配列を
含むプラスミドベクターは該宿主と共に用いられる。通常、ベクターは複製部位
と形質転換細胞を表現形によって選択できるようにするマーカー配列を保持して
いる。例えば、典型的には、E.coliは、E.coli種から得られたプラスミドである
ｐＢＲ３２２を用いて形質転換される(Bolivar,F．ら、Gene 2:95-113(1977))。
プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を
含むため、形質転換細胞を簡単に同定する手段となる。ｐＢＲ３２２プラスミド
や他の微生物のプラスミドは、組換えＤＮＡ技術において通常用いられるプロモ
ータと他の制御要素を含むか、含むよう修飾されなければならない。所望のコー
ド配列は、発現ベクター中に、タンパク質を発現させる宿主細胞中で機能性であ
るプロモーターとリボソーム結合部位から転写されるように正しい方向に挿入さ
れる。そのような発現ベクターの例には、Belageje,R.M.ら、米国特許第５３０
４４７３号（１９９４年４月１９日発行）（この内容は本明細書の一部を構成す
る）に記載のプラスミドがある。米国特許第５３０４４７３号に記載のＡ−Ｃ−
Ｂプロインスリンをコードする遺伝子は、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを
用いてプラスミドｐＢＲ１８２から除去することができる。本発明のタンパク質
をコードする遺伝子は、プラスミド基本構造(backbone)のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ
制限断片カセットに挿入することができる。
ｄ．原核生物での発現
一般的に、原核生物は、本発明において有用なベクターを構築するＤＮＡ配列
のクローニングに用いられる。例えば、E.coli K12株294（ATCC.No.31446）が特
に有用である。用いることができる他の微生物株には、E.coli BおよびE.coli X
1776(ATCC No.31537)が含まれる。これらの例は例示であり、限定的なものでは
ない。
原核生物は発現にも用いられる。前記の株およびE.coli W3110(原栄養体性、A
TCC No.27325)、Bacillus subtilisのようなバチルス、およびSalmonella typhi
muriumまたはSerratia marcescansのような他の腸内細菌科、および種々のシュ
ードモナス種を用いることができよう。原核生物宿主と用いるのに適したプロモ
ーターには、β−ラクタマーゼ（ベクターｐＧＸ２９０７（ATCC 39344）はレプ
リコンとβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む）とラクトースプロモーター系(Chang,A
.C.Y．ら、Nature,275:617-624(1978)、およびGoeddel,D.V．ら、Nature 281:54
4−548(1979))、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモー
ター系（ベクターｐＡＴＨ１(ATCC 37695)はｔｒｐプロモーターの制御下でｔｒ
ｐＥ融合タンパク質として転写解読枠の発現を促進するように設計される）およ
びｔａｃプロモーター（プラスミドｐＤＲ５４０(ATCC−37282)から単離できる
）のようなハイブリッドプロモーターが含まれる。しかしながら、一般的にヌク
レオチド配列が知られている他の機能性細菌プロモーターにより、当業者は、あ
らゆる必要な制限部位を供給するリンカーまたはアダプターを用いて該タンパク
質をコードするＤＮＡと該プロモーターを連結することができる。細菌系で用い
るプロモーターは、タンパク質をコードするＤＮＡと操作可能に連結したShine-
Dalgarno配列を含むであろう。
ｅ．真核生物での発現
該タンパク質は真核生物発現系において組換えにより製造することができよう
。補乳動物宿主細胞において転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の供
給源、例えば、ポリオーマ、Simian Virus 40(SV40)、アデノウイルス、レトロ
ウイルス、肝炎−Ｂウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスのよ
うなウイルスのゲノム、またはヘテロローガスな哺乳動物プロモーター、例えば
、
β−アクチンプロモーターから得ることができよう。ＳＶ４０ウイルスの初期お
よび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限断片
として好都合に得られる(Fiers,W．ら、Nature,273:113-120(1978))。完全ＳＶ
４０ゲノムはプラスミドｐBRSV(ATCC 45019)から得ることができよう。ヒトサイ
トメガロウイルスの即初期プロモーターはプラスミドｐＣＭＢβ（ATCC 77177）
から得ることができよう。もちろん、本明細書において、宿主細胞または関連種
由来のプロモーターも有用である。
高等真核生物による本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの転写はベクター
にエンハンサー配列を挿入することにより増大する。エンハンサーは、プロモー
ターに作用してその転写を増大する、通常約１０−３００ｂｐの、ＤＮＡのｃｉ
ｓに作用する要素である。エンハンサーは相対的に方向および位置独立的であり
、転写ユニットの５’側(Laimins,L.A．ら、Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)78:464-
468(1981)、および３’側(Lusky,M.ら、Mol.Cell.Bio．3:1108-1122(1983)、イ
ントロン中(Banerji,J.ら、Cell 33:729−740(1983))、およびそのコード配列中
(Osborne,T.F.ら、Mol.Cell.Bio.4:1293-1305(1984))にみいだされる。現在、哺
乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が知られている(グロビン、ＲＳＶ
、ＳＶ４０、ＥＭＣ、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およ
びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核生物細胞ウイルス由来のエン
ハンサーが用いられようら例としては、ＳＶ４０後期エンハンサー、サイトメガ
ロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエン
ハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞
生物由来の有核細胞）で用いる発現ベクターはｍＲＮＡの発現に影響を与え得る
転写の終了に必要な配列も含むであろう。これら領域はタンパク質をコードする
ｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化断片として転写される。３’非翻
訳領域は転写終止部位も含む。
発現ベクターは選択可能なマーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含んでよい。哺
乳動物細胞の適切な選択可能なマーカーの例には、ジヒドロホーレート還元酵素
（ｐＪＯＤ−１０（ACTT 68815）のBglII／HindIII制限断片から誘導することが
できるDHFR）、チミジンキナーゼ（ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキ
ナーゼは、ｖＰ−５クローン(ATCC 2028)のBamHI断片に含まれる）、またはｐＮ
Ｎ４１４酵母人工的染色体ベクターから得ることができるネオマイシン（Ｇ４１
８）耐性遺伝子（ATCC 37682）がある。そのような選択可能なマーカーが哺乳動
物宿主細胞にうまく伝達されると、選択圧下に置かれてもトランスフェクトされ
た哺乳動物宿主細胞は生き残ることができる。選択の型には広く用いられる２つ
の異なるカテゴリーがある。最初のカテゴリーは、細胞の代謝と、栄養補足培地
でなければ増殖することができない突然変異細胞系を用いることに基づく。例と
して、ＣＨＯ ＤＨＦＲ-細胞（ATCC CRL-9096）とマウスＬＴＫ−細胞（L-M(TK-
)ATCC CCL-2.3）の２つがある。これら細胞はチミジンやヒポキサンチンといっ
た栄養素を加えなければ増殖することができない。これら細胞は、完全なヌクレ
オチド合成経路に必要なある遺伝子を欠くため、欠けているヌクレオチドを栄養
補助培地に加えなければ生存することができない。培地に栄養を補助するかわり
の方法は、ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を欠く細胞中にそれぞれの完全な遺伝子を
導入することによりその成長要求性を変えることである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺
伝子で形質転換されなかった個々の細胞は非栄養補助培地中で生存することがで
きないだろう。
第二のカテゴリーは、あらゆる種類の細胞に用いられる選択計画に関連する、
突然変異細胞系を用いる必要がない優勢選択である。典型的には、この計画では
宿主細胞の増殖を止める薬剤を用いる。新規遺伝子を有する該細胞は薬剤耐性を
与えるタンパク質を発現し、選択を生き残るであろう。そのような優性選択の例
では、ネオマイシン(Southern,P.J．ら、J.Molec.Appl．Genet.1:327-341(1982)
、ミコフェノール酸(Mulligan,R.C．ら、Science 209:1422-1427(1980)、または
ヒグロマイシン(hygromycin)(Suqden,B.ら、Mol Cell.Biol.5:410−413(1985))
などの薬剤を用いる。上記の３例では、真核性制御下で、それぞれＧ４１８、ネ
オマイシン（ジェネチシン(geneticin)）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、ま
たはヒグロマイシンのような適切な薬剤に対する耐性を与える細菌遺伝子を用い
る。
真核性発現の好ましいベクターはｐＲｃ／ＣＭＶである。ｐＲｃ／ＣＭＶはIn
vitrogen Corporation,San Diego,CAから市販されている。構築されたプラスミ
ド中の配列が正しいことを確認するため、ライゲーション混合物を用いてE.coli
K12株DH5a(ATCC 31446)を形質転換し、適切な抗生物質耐性により成功した形質
転換体を選択する。形質転換体からプラスミドを調製し、制限により分析し、そ
して／またはMessing,J．ら、Nucleic Acids Res.9:309-321(1981)の方法により
配列決定する。
宿主細胞を本発明の発現ベクターで形質転換し、プロモーターを導入し、形質
転換体を選択し、または遺伝子を増幅するのに適するように改変した通常の栄養
培地中で培養することができよう。温度、ｐＨなどのような培養条件は発現用に
選んだ宿主細胞と共に先に用いた条件であり、当業者に明らかであろう。前記ベ
クターによる細胞の形質転換技術は当該分野でよく知られており、Maniatis,T．
ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版、Cold Spring Harbor Pre
ss，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1989)、
またはCurrent Protocols in Molecular Bioloqy(1989)および補遺のような一般
的参考書中にみいだすことができよう。
高等真核生物において本発明のタンパク質をコードするベクターを発現する
ための好ましい適切な宿主細胞には、ＳＶ４０で形質転換されたアフリカミドリ
ザル腎細胞系（COS-7，ATCC CRL-1651）、形質転換ヒト初代胚腎細胞系２９３(G
raham，F.L．ら、J.Gen Virol.36:59−72(1977);Harrison,T.ら、Virology 77:3
19−329(1977);Graham,F.L.ら、Virology 86:10-21(1978));赤子ハムスター腎細
胞(BHK-21(C-13)、ATCC CCL-10;Mac Pherson,I.ら、Virology 16:147-151(1962)
);チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-DHFR-(ATCC CRL−9096));マウスセルト
リ細胞(TM4,ATCCCRL−1715;Mather,J.P.，Biol.Reprod.23:243-252(1980));アフ
リカミドリザル腎細胞(VERO 76，ATCC CRL-1587);ヒト類上皮癌細胞(HeLa,ATCC
CCL−2);イヌ腎細胞(MDCK,ATCC CCL-34);バッファローラット肝細胞(BRL3A,ATCC
CRL-1442)；ヒトニ倍体肺細胞(WI-38，ATCC CCL-75);ヒト肝細胞癌細胞(Hep G2
，ATCC HB-8065)、およびマウス乳癌細胞(MMT 060562，
ATCC CCL51)。
ｆ．酵母での発現
原核生物および哺乳動物宿主細胞に加え、酵母のような真核性微生物も宿主細
胞として用いるができよう。一般的なパン酵母であるSaccharomyces cerevisiae
はヘテロローガスなタンパク質を発現させるのに最も普通に用いられる真核性微
生物であるが、他の多くの菌株も普通に利用できる。
Saccharomycesでの発現には、例えばプラスミドＹＲｐ７が普通に用いられる(AT
CC-40053,Stinchcomb,D.T.ら、Nature 282:39-43(1979);Kingsman,A.J.ら、Gene
7:141-152(1979);Tschumper,G.ら、Gene 10:157-166(1980))。このプラスミド
は、すでにトリプトファン中での増殖能力を欠く酵母の突然変異株の選択マーカ
ーを与えるｔｒｐ遺伝子を含んでいる（例えば、ATCC 44076またはPEP4-1;Jones
,E.W.，Genetics 85:23-33(1977))。
酵母宿主と共に用いるのに適したプロモーター配列には、プラスミドｐＡＰ１
２ＢＤ ATCC 53231（Patel,A.C.ら、米国特許第4935350号、1990年６月19日発行
）にみいだされる３−ホスホグリセレートキナーゼ、プラスミドｐＡＣ１(ATCC
39532)にみいだされるエノラーゼのような他の解糖酵素、プラスミドｐＨｃＧＡ
ＰＣ１(ATCC 57090,57091)由来のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼ、zymomonas mobilis（Ingram,L.O.ら、米国特許第5000000号、1991
年３月19日発行）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリ
セレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ
、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのプロモーターが含ま
れる。
増殖条件によって調節される転写のさらなる利点を有する誘導可能なプロモー
ターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチト
クロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、プラスミドベク
ターｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶ(ATCC 39475、Reddy,V.B.ら、米国特許第48408
96号、1989年６月20日発行)に含まれるメタロチオネン、グリセルアル
デヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼのプロモーター領域、およびプラスミ
ドｐＲＹ１２１（ATCC 37658）にみいだされるであろうＧＡＬ１プロモーターの
ようなマルトースならびにガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域
である。酵母での発現に用いるのに適切なベクターおよびプロモーターはさらに
Hitzeman,R.A.ら、欧州特許公開第73657A1号、1983年３月９日公開に記載されて
いる。プラスミドYEpsec--hI1β（ATCC 67024）上のCYC1プロモーターと共にみ
いだされるSaccharomyces cerevisiae由来のUAS Galのような酵母エンハンサー
も酵母プロモーターと一緒に用いるのに有利である。
以下の実施例によりさらに本発明のタンパク質の製造法を例示する。本発明の
範囲は以下の実施例のみからなるものと解釈してはならない。実施例１
ベクターの構築
配列番号１４で示される遺伝子は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドか
ら誘導した〜２２０塩基対および〜２４０塩基対の断片から組み立てられる。
該２２０塩基対断片はコード領域内の２２０位のＮｄｅＩ部位からＸｂａＩ部
位に広がり、長さ３４〜８３塩基の範囲の７つのオーバーラップしたオリゴヌク
レオチドから組み立てられる。ＸｂａＩからＢａｍＨＩ部位に広がる２４０塩基
対断片は長さ５７〜９２塩基の範囲の７つのオーバーラップしたオリゴヌクレオ
チドからも組み立てられる。
これら断片を組み立てるには、各７オリゴヌクレオチドを等モル量、通常、約
１−２ピコモル／μＬの濃度で混合する。組み立てる前に、該断片の５'−未端
のオリゴヌクレオチド以外のすべてをＴ４ ＤＮＡキナーゼを含む標準的キナー
ゼ緩衝液中で、該試薬の供給業者が指定した条件下でリン酸化する。混合物を９
５℃に加熱し、１−２時間かけて徐々に室温に冷却することによりオリゴヌクレ
オチドを確実に正確にアニールさせる。次に、オリゴヌクレオチドを互いに連結
し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９のような適切な
クローニングベクターに連結する。緩衝液および条件は、該酵素の供給業者が推
奨するものである。使用する前に、２２０塩基対断片用のベクターはＮｄｅＩお
よびＸｂａＩで消化し、２４０塩基対断片用のベクターはＸｂａＩおよびＢａｍ
ＨＩで消化する。ライゲーション混合物を用いてE.coli DH10B細胞（ＧＩＢＣＯ
／ＢＲＬ製品の生産者であるLife Technologies,Grand Island,NY,から市販され
ている）を形質転換し、形質転換細胞を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、Ｘ−
ｇａｌおよびＩＰＴＧを含むトリプトン−酵母プレート(TY,Difco,Detroit,MI)
に接種する。一夜増殖させたコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含む液
体ＴＹ培地中で増殖させ、プラスミドの単離およびＤＮＡ配列分析に用いる。正
しい配列を持つプラスミドを完全な遺伝子を組み立てるために維持する。これは
、２２０塩基対および２４０塩基対断片をゲル精製し、これら２つの断片を、Ａ
−Ｃ−Ｂプロインスリンのコード配列を欠失させ、使用前にＮｄｅＩおよびＢａ
ｍＨＩで消化したｐＲＢ１８２のような発現ベクターとライゲーションさせるこ
とにより達成される。
あるいはまた、プラスミドｐＥＴ３０(Novagen,Madison,WI)をＮｄｅＩおよび
ＢａｍＨＩで消化し、本発明のタンパク質をコードする所望のＤＮＡ配列を当該
分野で知られた方法ならびに本明細書に記載の方法により挿入することができる
。ＤＮＡの供給源は当該分野で認められた方法論により組み立てられる、本明細
書に記載の合成オリゴヌクレオチドである。実施例２
配列番号３のタンパク質用の発現ベクター（ｐＨＳ７６７）
プラスミドベクターｐＯＪ７２２(４０μｇ、NRRL No.B−21654)を実施例１と
同様の方法で製造し、３７℃で２時間、「Boerhinger Mannheim媛衝液Ｂ」中の
ＥｃｏＲＶ（Boerhinger Mannheim，Indianapolis，IN）２０単位およ
びＢｇｌＩＩ(Boerhinger Mannheim）20単位で消化した。消化物を１％アガロー
スゲルで精製し、２６７４ｂｐおよび１４２２ｂｐ断片を凍結−圧搾(sqeeze)法
を用いて単離した。
オリゴヌクレオチド１４２５５
(配列番号１６)]を、１ｘキナーゼ緩衝液、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＤＴＴ、およびＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ(GIBCO BRL)５単位の存在下、３７℃で３０分間キナーゼ
処理した。
上記のごとく調製したＥｃｏＲＶ／ＢｇｌＩＩ ２６７４ｂｐならびに１４２
２ｂｐ断片、および１４２５５ならびに１４２５６リンカーを、１ｘキナーゼ緩
衝液、０．５ｍＭ ＡＴＰおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（GIBCO BRL）1単位の存在
下、１６℃で一夜ライゲーションさせた。ライゲーション生成物をE.coli BL21(
DE3)(Novagen)に形質転換し、テトラサイクリン１０μ／ｍＬを添加したＴＹプ
レート上で増殖したコロニーを分析する。プラスミドＤＮＡを単離し、次いでPE
-Applied Biosystems 370 DNAシケンサーによりＤＮＡの配列決定を行う。予想
される〜４００ｂｐ ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を含むプラスミドを保存し、ｐ
ＨＳ７６７で表す。実施例３
配列番号５のタンパク質用の発現プラスミド（ｐＨＳ７８６）
プラスミドベクターｐＨＳ７６７（４０μｇ）を３７℃で２時間、「New Engl
and Biolab緩衝液１」中のＰｍｌＩ（New England Biol-ab,Beverly,MA）２０単
位で消化した。該混合物に緩衝液塩を加えて、「New Enqland Biolab緩衝液３」
の条件に調整する。ＢｓｔＸＩを加え（２０
単位、New England Biolab)、55℃で２時間プラスミドを消化した。その後、消
化物を37℃で30分間、アルカリホスファターゼ(Boehirnqer Mannheim)２０単位
で処理した。消化物を１％アガロースゲルで精製し、41７０ｂｐ断片を凍結−圧
搾法を用いて単離した。
オリゴヌクレオチド１３８２４
（配列番号１８）を、１ｘキナーゼ緩衝液、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭＤＴＴ、およびＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ(GIBCO BRL)5単位の存在下、３７℃で３０分間キナーゼ処
理した。
ＰｍｌＩ／ＢｓｔＸＩ線状化ｐＨＳ７６７ベクター、および１３８２４ならび
に１３８２５リンカーを、１ｘキナーゼ緩衝液、０．５ｍＭＡＴＰおよびＴ４
ＤＮＡリガーゼ（GIBCO BRL）１単位の存在下、１６℃で一夜ライゲーションさ
せた。ライゲーション生成物をE.coli BL21(DE3)(Novaqen)に形質転換し、テト
ラサイクリン１０μ／ｍＬを添加したＴＹプレート上で増殖したコロニーを分析
する。プラスミドＤＮＡを単離し、次いでPE-Applied Biosystems 370 DNA シケ
ンサーによりＤＮＡの配列決定を行う。予想される〜４００ｂｐ ＮｄｅＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片を含むプラスミドを保存し、ｐＨＳ７８６と呼ぶ。実施例４
配列番号２のタンパク質用の発現プラスミド（ｐＨＳ７７５）
プラスミドベクターｐＨＳ７６７（４０ｐｇ）を３７℃で２時間、「Boerhinge
r Mannheim援衝液Ｈ」中のＸｈｏＩ(Boerhinger Mannheim)２０単位およびＮｈ
ｏＩ(Boerhinger Mannheim)２０単位で消化した。消化物を３７℃で３０分間、
アルカリホスフアターゼ（Boehirnger Mannheim）２０単位で処理した。消化物
を１％アガロースゲルで精製し、４２１５ｂｐ断片を凍結−圧搾法を用いて単離
した。
オリゴヌクレオチド１４４０５
（配列番号２０）を、１ｘキナーゼ緩衝液、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＤＴＴ、およびＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ(GIBCO BRL)５単位の存在下３７℃で３０分間キナーゼ処
理した。
ＸｈｏＩ／ＮｃｏＩ線状化ｐＨＳ７６７ベクター、および１４４０５ならびに
１３４０６リンカーを、１ｘキナーゼ緩衝液、０．５ｍＭＡＴＰおよびＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ（GIBCO BRL）１単位の存在下、１６℃で一夜ライゲーションさせ
た。ライゲーション生成物をE.coli BL21(DE3)(Novagen)に形質転換し、テトラ
サイクリン１０μ／ｍＬを添加したＴＹプレート上で増殖したコロニーを分析す
る。プラスミドＤＮＡを単離し、次いでPE-Applied Biosystems 370 DNAシケン
サーによりＤＮＡの配列決定を行う。予想される〜４００ｂｐ ＮｄｅＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片を含むプラスミドを保存し、ｐＨＳ７７５と呼ぶ。実施例５
配列番号４のタンパク質用の発現プラスミド（ｐＨＳ７８５）
プラスミドベクターｐＨＳ７７５（４０μｇ）を３７℃で２時間、「New Engl
and Biolab緩衝液１」中のＰｍｌＩ（New England Biolab）２０単位で消化した
。緩衝液塩を「New England Biolab緩衝液３」に調整し、ＢｓｔＸＩ ２０単位
(New England Biolab)を加え、５５℃で２時間、プラスミドを消化した。その後
、消化物を37℃で３０分間、アルカリホスファターゼ（Boehirnger Mannheim）
２０単位で処理した。消化物を１％アガロースゲルで精製し、４１７０ｂｐ断片
を凍結−圧搾法を用いて単離した。
オリゴヌクレオチド１３８２４
（配列番号２２）を、１ｘキナーゼ緩衝液、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、およびＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ(GIBCO BRL)５単位の存在下でキナーゼ処理した。
ＰｍｌＩ／ＢｓｔＸＩ線状化ｐＨＳ７７５ベクター、および１３８２４ならび
に１３８２５リンカーを、１ｘキナーゼ緩衝液、０．５ｍＭＡＴＰおよびＴ４
ＤＮＡリガーゼ（GIBCO BRL）１単位の存在下、１６℃で一夜ライゲーションさ
せた。ライゲーション生成物をE.coli BL21(DE3)(Novagen)に形質転換し、テト
ラサイクリン１０μ／ｍＬを添加したＴＹプレート上で増殖したコロニーを分析
する。プラスミドＤＮＡを単離し、次いでpE-App1ied Biosystems 370 DNAシケ
ンサーによりＤＮＡの配列決定を行う。予想される〜４００ｂｐ ＮｄｅＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片を含むプラスミドを保存し、ｐＨＳ７８５と呼ぶ。実施例６
発現プラスミドによるE.coliの形質転換
発現プラスミドをE.coli細胞中に形質転換した。コンピテントE.coli細胞（１
００μＬ）を前述の発現プラスミド１０ｎｇで形質転換した。形質転換混合物を
テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）を含むＴＹ−寒天プレートに接種した。形
質転換体を選び、これを用いて１０Ｌ培養に増殖させた。
所望のタンパク質のための発現プラスミドを保持する細胞をテトラサイクリン
（１０μｇ／ｍＬ）を含む２ｘＴＹ培地１Ｌ中で３７℃で一夜増殖させた。一夜
増殖させた後、培養１００ｍＬを１０Ｌの培地に接種した。培養の光学密度が０
．６Ｏ．Ｄ．に達したら、濃度１０μＭのＩＰＴＧを加えて特定のタンパク質の
発現を誘導した。３時間後、E.coli細胞を回収し、タンパク質精製のために顆粒
を単離した。
前記ベクターによる細胞の形質転換技術は当該分野でよく知られている（Mani
atis,T.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Ha
rbor Press，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold
Spring Harbor，New York(1988),前述、Current protocols in Molecular Biolo
qy(1989),および補遺）。本明細書に例示するように、本発明の好ましい実施に
用いるE.coli細胞の形質転換に関する技術は当該分野でよく知られている。形質
転換E.coli細胞を培養する正確な条件はE.coli宿主細胞系の性状と、用いる発現
もしくはクローニングベクターに依存する。例えば、ｃ１８５７熱誘導性λ−フ
ァージプロモーター−オペレーター領域のような熱誘導性プロモーター−オペレ
ーター領域を組み込むベクターはタンパク質合成を誘導するため培養条件におい
て約３０℃から約４０℃の温度変化が必要である。
本発明の好ましい態様では、E.coli K12 RV308細胞を宿主細胞として用いるが
、限定されるものではないがE.coli K12 L201、L687、L693、L507、L640、L641
、L695、L814(E.coli B)のような多くの他の細胞系が利用できる。次に、形質転
換宿主細胞を、発現プラスミドに存在する耐性遺伝子に対応する抗生物質の選択
圧下で適切な培地に接種する。次に、用いる宿主細胞系に適した時間と温度で培
養をインキュベーションする。
高レベルの細菌発現系で発現するタンパク質は、高レベルの過剰発現タンパク
質を含む顆粒または封入体中で特徴的に凝集する(Kreuger,J.K.ら、Protein Fol
ding中,Gierasch,L.M.およびKing,J.編、Ameri Can Association for the Advan
cement of Science Publication No.89−18S,Washinqton,D.C.，136−142(1990)
)。そのようなタンパク質凝集物を溶解し、所望のクンパク質生成物をさらに精
製および単離しなければならない(Kreuqer,J.K.ら、上記)。グアニジニウム−Ｈ
Ｃｌのような強変性溶液および／または尿素のような弱変性溶液を用いる種々の
技術を用いて該タンパク質を可溶化する。変性剤を除去することにより変性タン
パク質はその天然の構造をとることができる。変性およびホールディングのため
の特定の条件は、特定のタンパク質発現系および／または該タンパク質によって
決定される。
好ましくは、本発明のタンパク質はリーダー配列とともに発現する。当業者は
多くのリーダー配列が操作可能であると認識するであろう。しかしながら、発現
タンパク質がカテプシンＣおよび他の適切なアミノペプチダーゼを用いて本発明
のタンパク質に容易に変換されるように、該リーダー配列はＭｅｔ−Ｒ1−であ
ることが好ましい（ここで、Ｒ1はＰｒｏを除くあらゆるアミノ酸であるかまた
は欠失している）。好ましくはＲ1はＡｒｇ、ＡＳｐ、またはＴｙｒであり、最
も好ましくは、該タンパク質はＭｅｔ−Ａｒｇリーダー配列とともに発現する。
興味深いことに、該リーダー配列は該タンパク質の安定性や活性に有意な影響を
及ぼさない。それにも関わらずリーダー配列は該タンパク質から開裂することが
好ましい。このように、式：Ｍｅｔ−Ｒ1−配列番号１のタンパク質は生物学的
物質および好ましくは中間体として有用である。実施例７
式：Ｍｅｔ−Ａｒｇ−配列番号４のタンパク質
Ｍｅｔ−Ａｒｇリーダー配列を含む配列番号４のタンパク質を前述のようにE.
coliで発現させた。５ｍＭシステインを含む８Ｍ尿素に顆粒を可溶化した。５ｍ
Ｍシステインを含む８Ｍ尿素中の陰イオン交換でタンパク質を精製し、８Ｍ尿素
（５ｍＭシステイン含有）で希釈し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で徹底的
に透析してホールディングさせた。タンパク質凝集物はほとんどまたは全くみら
れなかった。サイズ排除クロマトグラフィでタンパク質を最終精製し、次いでタ
ンパク質をＰＢＳ中３〜３．５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。実施例８
式：配列番号３のタンパク質
Ｍｅｔ−Ａｒｇリーダー配列を含む配列番号３のタンパク質をE.coli中で発現
させ、単離し、先の実施例と同様の技術によりホールディングさせた。タンパク
質溶液のｐＨはｐＨ２．８に低下した。Ｍｅｔ−Ａｒｇリーダー配列はタンパク
質１ｍｇあたりｄＤＡＰ６−１０ミリ単位を加えることにより開裂させた（ｄＤ
ＡＰは、Atkinson,P.R.ら、来国特許第5565330号、1996年10月15日発行に記載の
粘菌、Dicteostelium descoidiumから単離したジペプチジルアミノペプチダーゼ
の略語である）。変換反応は室温で２−８時間継続した。高性能逆相クロマトグ
ラフィで反応の進行をモニターした。ＮａＯＨでｐＨを８に調整して反応を止め
た。７−８Ｍ尿素の存在下の陽イオン交換クロマトグラフィおよびＰＢＳ中のサ
イ、ズ排除クロマトグラフィによりｄｅｓ(Ｍｅｔ−Ａｒｇ）タンパク質をさら
に精製した。サイズ排除クロマトグラフィでタンパク質を最終精製し、
次いで該タンパク質をＰＢＳ中、３−３．５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。実質的にど
のタンパク質の凝集もみられなかった。本発明のタンパク質の精製は当該分野で
知られた技術により、逆相クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、
イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィが含まれる。
本発明のタンパク質は２個のシステイン残基を含む。すなわち、ジスルフィド
結合を形成し、タンパク質を安定させることができよう。本発明には、９６位の
Ｃｙｓが１４６位のＣｙｓと架橋している式(Ｉ)のタンパク質とそのようなジス
ルフィド結合がない式(Ｉ)のタンパク質が含まれる。好ましくは９６位のｃｙｓ
は１４６位のＣｙｓとジスルフィド結合している。さらに、本発明のタンパク質
は特に製剤化したときに二量体、三量体、四量体、および他の多量体として存在
することができよう。そのような多量体は本発明の範囲内に含まれる。
本発明は、肥満の治療方法を提供する。該方法は用量約１〜１０００μｇ／ｋ
ｇの有効量の抗肥満タンパク質を生物に投与することが含まれる。好ましい用量
は活性タンパク質約１０〜１００μｇ／ｋｇである。成人に対する典型的な１日
血用量は、約０．５〜１００ｍｇである。この方法の実施において、式（Ｉ）の
タンパク質を１日に単用量または複数用量で投与することができる。治療計画で
は長期にわたる投与が必要なことがある。投与される用量あたりの量または投与
される全量は、疾病の性状と重症度、患者の年齢と一般健康状態、および患者の
タンパク質に対するトレランスといつた要因に応じて医師が決定するであろう。
さらに本発明は本発明のタンパク質を含む医薬製剤を提供する。好ましくは医
薬的に許容される塩の形の該タンパク質を、肥満の治療または予防的処置のため
の非経口投与用に製剤化することができる。例えば、式(Ｉ)のタンパク質は通常
の医薬担体および賦形剤と混合することができる。本発明のタンパク質を含有す
る組成物は、好ましくは可溶形の活性タンパク質を約０．１〜９５重量％、より
一般的には約１０〜３０％含む。さらに、本発明のタンパク質は単独で投与され
るか、または他の抗肥満薬もしくは糖尿病の治療に有用な物質と組み合わせて投
与することができよう。静脈内(i.v.)使用では、該タンパク質は通常用いられる
静脈内用の液体を用いて投与され、輸液により投与される。そのような液、例え
ば、生理食塩液、リンゲル溶液または５％デキストロース溶液を用いることが
できる。筋肉内用製剤では、無菌製剤、好ましくは式(Ｉ)のタンパク質の適切な
可溶性塩、例えば塩酸塩を溶解し、発熱物質を含まない蒸留水、生理的食塩液、
または５％グルコース溶液のような医薬的希釈剤を用いて投与することができる
。適切な不溶性タンパク質を製造し、水性基剤、または医薬的に許容される油基
剤、例えばオレイン酸エステルのような長鎖脂肪酸のエステル中の懸濁液として
投与することができよう。
多用量使用ができるように、アルキルパラベン、特にメチルパラベン、エチル
パラベン、プロピルパラベン、またはブチルパラベン、またはクロロブタノール
のような医薬的に許容される保存剤を製剤に加えることが好ましい。重要なこと
は、１００位にＡｓｐまたはＧｌｕを有する本発明のタンパク質はｍ−クレゾー
ルまたはフェノールのようなフェノール性保存剤の存在下でもきわめて安定であ
ることである。そのため、これら置換の１つを有するタンパク質がきわめて好ま
しい。フェノール性保存剤の存在下における該タンパク質の安定性は、保存剤の
有効性を増大させることを含む医薬的供給における利点をもたらす。該製剤は、
そのイオン強度を最小限にするため、塩の非存在下で製造するのが好ましい。
本発明のタンパク質の肥満治療能は以下のごとくin vivoで証明される。生物学的試験
併体結合試験は、タンパク質が末梢脂肪組織により放出され、該タンパク質が
正常および肥満マウスの体重増加を調節することができることを示唆する。した
がって、最も密接に関連した生物学的試験は、種々の投与経路（例えば、ｉ．ｖ
．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．またはミニポンプもしくはカニューレによる）により試
験タンパク質を注射し、次いで食物ならびに水摂取量、体重増加、およびグルコ
ース、インスリン、ＡＣＴＨ、コルチコステロン、ＧＨ、またはＴ４のような血
漿中化学物質またはホルモンを種々の期間でモニターする。適切な試験動物には
、正常マウス（ＩＣＲなど）および肥満マウス(ｏｂ／ｏｂ、Ａｖｙ／ａ、ＫＫ
−Ａｙ、tubby(ずんぐりした)、fat(肥った))が含まれる。肥満および糖尿病の
ｏｂ／ｏｂマウスモデルは一般に肥満の病状を示すものと当該分野で認められて
いる。これら注射剤の非特異的効果の調節は、同じ動物モデルに該タンパク質を
含まないビークルを投与し、同じパラメータをモニターすることにより達成され
る。ある
いはまた、該タンパク質はそれ自身、ｄｂ／ｄｂマウスまたはｆａ／ｆａもしく
はｃｐ／ｃｐラットのようなタンパク質レセプターを欠くと考えられる動物に投
与される。これらモデルにおいて活性が証明されるタンパク質は他の哺乳動物、
特にヒトで同じ活性を示すであろう。
標的組織は食物摂取と脂肪生成状態を調節する視床下部であると予想されるの
で、別の試験にはタンパク質を試験動物の脳内に、例えば、側もしくは第三脳室
を介したｉ．ｃ．ｖ．注射によるかまたは弓状核、室傍核、またはペリホルニカ
ル(perifornical)核のような特定の視床下部核内に直接注射することによりタン
パク質を直接注射することが含まれる。上記と同じパラメーターを測定するか、
摂食または代謝を調節することが知られている神経伝達物質の放出をモニターす
ることができよう（例えば、ＮＰＹ、ガラニン、ノルエピネフリン、ドーパミン
、β−エンドルフィン放出）。
同様の試験は還流または組織浴システム中の単離された視床下部組織を用いて
in vitroで達成される。この状況では、神経伝達物質の放出または電気生理学的
変化がモニターされる。
実施例９および１０に記載の試験を実施するのに用いるタンパク質は本明細書
に記載の開示内容および実施例に従って製造された。タンパク質のアミノ酸配列
は質量分析法および／またはアミノ酸分析法によって確認した。該タンパク質は
試験時ジスルフィド結合により架橋したＣｙｓ残基によりホールディングした。実施例９
雄のｏｂ／ｏｂマウスを用いる配列番号２および３のタンパク質の試験
雄のｏｂ／ｏｂマウス(Harlan,Ltd.,Blackthorn,England)を各５匹に群分けし
て収容し、Purina 5008餌および水を自由に与えた。マウスを逆照明計画（９：
００Ａ．Ｍ．に消灯、９：００Ｐ．Ｍ．に点灯）で維持した。マウスの体重を毎
日８：３０Ａ．Ｍ．に測定した。餌および水の消費量を同じ時間に測定した。下
記に示すように処置は、朝の体重測定後の消灯直前に行った。マウスは４日間、
１日１回処置した。
食物摂取量および累積体重変化に対するこれら処置の影響を、本発明の代表的
タンパク質について表１および２に示す。表１
．ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量および累積体重変化に対する配列番号２の
タンパク質の影響 表２．ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量および累積体重変化に対する配列番号３の
タンパク質の影響
第１群：コントロール（ＰＢＳ）、第２群：タンパク質３０μｇ／日、
第３群：タンパク質３００μｇ／日実施例１０
ダイナミックライトスキャタリング（ＤＬＳ）による凝集の分析、
本発明のタンパク質の物理特性は以下の通りである。物質の有効性に基づいて
ＤＬＳにより分析した溶液を２つの方法の１つで調整した。ＰＢＳ中、約１．５
ｍｇ／ｍＬの、最後のサイズ排除クロマトグラフィ精製工程からの物質を透析に
より約３または５ｍｇ／ｍＬに濃縮するか、または水で透析し、凍結乾燥し、次
いで約３または５ｍｇ／ｍＬに再構成した。
最初の方法において、約１．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液を、Amicon YM10,
25-mm膜を用い、小容量攪拌セル（１０ｍＬ）中で約３または５ｍｇ／ｍＬ以上
に濃縮した。これを冷蔵室条件下（約５℃）で行った。タンパク質濃度をＵＶ吸
収により測定し、溶液をＰＢＳで約３．０ｍｇ／ｍＬまたは５ｍｇ／ｍＬに希釈
した(Ｃａ／Ｍｇ不含１０ｘ ＰＢＳの１０倍水希釈液、GIBCO BRL)。
凍結乾燥が可能な場合に用いる第二の別の方法は、約４℃で３〜５回、水を交
換する水に対するタンパク質溶液の透析からなった。典型的な透析膜はSpectra/
Por-7透析膜、2000分子量カットオフ膜(Spectrum Medical Industries，Los Anq
eles,CA)であった。物質を上記のごとく３〜４ｍｇ／ｍＬに濃縮し、典型的には
２ｍｇ量を５ｍＬバイアルに凍結乾燥した。ＤＬＳ分析にはこの部分を水で３．
３ｍｇ／ｍＬ以上または５ｍｇ／ｍＬ以上に再構成した。通常、数本のバイアル
をプールした。タンパク質濃度を極大ピークのＵＶ（典型的には２８０−ｎｍ）
により測定した。タンパク質濃度を、水および１０ｘＰＢＳ(Ｃａ／Ｍｇ不含、G
IBCO BRL)の混合物（最終ＰＢＳ濃度１ｘ）で約３または５ｍｇ／ｍＬに希釈し
た。
１ｘＰＢＳ中の３．０ｍｇ／ｍＬまたは５ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液をＨＣ
ｌ／ＮａＯＨで７．４に調整し、０．１μｍ Anotop(登録商標)-１０フィルター
(Whatman International,Ltd.,Maidstone,England)を通してＤＬＳセルに入れた
。平均累積粒子サイズをLexelアルゴンレーザーを備えたBrookhaven BI-9000 DL
S器械(Brookhaven Instruments,
Holtsville,NY)を用い、角度９０°、持続時間３０秒で１５分間毎に測定した。
４００ｐｍのピンホールがある４８８−ｎｍフィルターを取り付けた。インキュ
ベーション温度３７℃で、粘度０．６９１５センチポイズ（ｃＰ）および屈折率
１．３３３を用いた。自動相関ベースライン測定値を用いる累積法により軽量の
平均粒子サイズを計算した。
３７℃のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中の種々の抗肥満タンパク質の平均軽量粒
子サイズが５０ｎｍに達するのに必要な推定時間を表３に示す。平均軽量粒子サ
イズは、単量体の、より高いオーダーの凝集物ポピュレーションを含むバイノー
ド分布の累積分析から決定した。凝集物の平均サイズが５０ｎｍに達するのに要
する時間は、サイズを時間の関数としてプロットすることにより推定した。該タ
ンパク質は試験時にジスルフィド結合により架橋したＣｙｓ残基によりホールデ
ィングされた。表３
．３７℃のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中の種々の抗肥満タンパク質の平均軽
量粒子サイズが５０ｎｍに達するのに必要な推定時間（分）
表３のデータは本発明のタンパク質の凝集傾向の劇的な減少を示す。
本発明のタンパク質は、上記生物学的試験の少なくとも１つにおいて活性であ
り、抗肥満物質である。該タンパク質はそれ自体、肥満および肥満関連障害の治
療に有用である。当業者は該タンパク質が診断に用いる抗体の生産に有用であり
、またタンパク質として、動物用飼料添加物として有用であることを認識してい
る。
さらに、該タンパク質は哺乳動物の美容(cosmetic)目的で体重を調節するのに有
用である。しかしながら、該タンパク質は治療物質として有用なだけではない。
美容目的では哺乳動物の体重を調節して身体的外見を改善することが求められる
。該哺乳動物は必ずしも肥満ではない。そのような美容的使用は本発明の一部を
形成する。
本発明の原理、好ましい態様、および操作方法は、先に明細書中に記載した。
開示した特定の形は例示であって制限的なものではないため、保護を意図した本
発明はそれらに限定されない。当業者は本発明の精神から離れることなく変化や
変更を行うことができよう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ
Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ
，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ
，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，
ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ
Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ
，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，
ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ
Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ
，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，
ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ
Ｎ，ＹＵ，ＺＷ
(72)発明者 クライン，アレン・ディ
アメリカ合衆国46106インディアナ州バー
ガーズビル、トレモント・サークル3060番
(72)発明者 シェビッツ，リチャード・ダブリュー
アメリカ合衆国46220インディアナ州イン
ディアナポリス、ハーフムーン・レイン
6053番
(72)発明者 ザン，ファミン
アメリカ合衆国46033インディアナ州カー
メル、スプリングブルック・ラン12429番