JP2001505809A - Improved hydrogel for tissue processing - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、架橋の際にヒドロゲルを形成する生分解性、生相容性ポリマーからなる、動物への移植用組成物を提供する。好ましい態様において、そのポリマーは、多価イオン、更に好ましくは多価イオンの可溶性塩及び多価イオンの弱可溶性塩、によって架橋され、これらの成分は、一緒にされて、部分的に硬化した注入可能なヒドロゲルを形成する混合物となり、その混合物のコンシステンシィはその部分硬化、注入可能混合物を動物中へ移植するのに適当であり、そこでその移植された、部分硬化ヒドロゲルがその場で完全硬化ヒドロゲルを形成する。好ましくは、混合物は、多価架橋用イオンの結合のために生相容性ポリマーと競合する生相容性の金属イオン封鎖剤を含む。本組成物は、生細胞を含んでいても、含んでいなくてもよい。また、本発明は、随意に生細胞含有移植剤として、動物中へ、本組成物を移植する方法も提供する。 (57) SUMMARY The present invention provides a composition for implantation into an animal, comprising a biodegradable, biocompatible polymer that forms a hydrogel upon crosslinking. In a preferred embodiment, the polymer is cross-linked by polyvalent ions, more preferably soluble salts of polyvalent ions and weakly soluble salts of polyvalent ions, and the components are combined and partially cured injection The resulting mixture forms a possible hydrogel, and the consistency of the mixture is suitable for implanting the partially cured, injectable mixture into an animal, where the implanted, partially cured hydrogel is fully cured in situ. Form a hydrogel. Preferably, the mixture includes a biocompatible sequestrant that competes with the biocompatible polymer for binding of the polyvalent crosslinking ion. The composition may or may not include living cells. The present invention also provides a method of transplanting the present composition into an animal, optionally as a living cell-containing transplant.

Description

【発明の詳細な説明】 組織処理用の改善されたヒドロゲル 本出願は、米国第０８／７６２，７３３号；第６０／０５１，０８４号；及び 第６０／０５９，５５８号の部分継続であり、それらの各々は、ここに明白に参 考のため編入される。 発明の背景 発明の分野 本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでの新組識の創造のための細胞及び／またはヒドロ ゲル粒子の懸濁物を移植する方法に向けられている。 関連技術の検討 輪郭形状異常は、奇形でも、先天的でもあるいは審美的なものでも、最近は矯 正のために侵入性手術技法を必要とする。さらには、添加物を必要とする形状異 常は、感染及び噴出の問題がある異物形成補綴材をしばしば必要とする。Ｔｅｆ ｌｏｎ（登録商標）ペーストが用いられているように(膀胱尿道還流、声帯麻痺) 、コラーゲンは、ある種の応用において組織バルクを創るのに使用されてきてい る(例えば、内因性括約筋欠失自制不能：Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｓｐｈｉｎｃｔ ｅｒ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｉｎｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅを矯正するのに使用さ れる「Ｃｏｎｔｉｇｅｎ])。しかし、コラーゲンは、生体中で急速に（６−１２ 月）分解することが示されており、バルクを保持するために多重の処理を必要と し、従って、例えば頭蓋及び顔面の形状異常の矯正のためには満足すべきもので ない。同様にその他の処方におけるアルギン酸塩は、生体中で僅か数ヶ月で分解 することが示されている。Ｔｅｆｌｏｎペースト粒子は、注入部位から、おそら く脳へ選択的に、移行することが示されている。 生相容性ポリマー骨組みを用いる組織処理技法は、頭蓋顎顔面手術に最近使用 されている補綴材の代替物、ならびに疾病、欠損、または負傷組織を置きかえる ための器官均等物の形成を創造する手段として、探求されてきている。組織処理 は、単離細胞及び生相容性ポリマーから作られた構成物からの新組識の形態形成 を包含する。細胞は、ポリマーのマトリックスに接合され、軟骨性の構造を形成 するように移植されうる。これは、Ｖａｃａｎｔｉ氏らの米国特許第５，０４１ ，１３８号に記載されるように、移植に先立ってマトリックスを成形して、所望 の解剖構造体とし、そしてその成形マトリックスを外科的に移植することによっ て、達成される。 特定部位及び制御された大きさで頭蓋顔面骨格に追加の自己発生軟骨または骨 を加える簡単な方法は、手術外傷を小さくし、同種移植片または異物形成補綴材 の必要をなくすであろう。もし、所望の部位へ注入または簡単な適用によって移 植し、多数の単離細胞を接合させることができれば、自己発生細胞で、しかし過 度の手術なしで、頭蓋顔面軟骨の骨組みを増加できよう。さらには、単離細胞の 好結果の移植は、細胞の組織培養増加の可能性を作りだすであろう。 発明の要約 本発明の一目的は、手術部位へ注入することができるが、注入後に所望の形状 を受け入れ、維持する組成物を提供することである。殊に、本発明の一目的は、 注入のときに、ＰＯＬＹＴＥＦ（登録商標）と類似のコンシステンシィを有して 、そのコンシステンシィを適切な適用を許容するのに充分な時間保持する移植可 能組成物を提供することである。 所望の部位から移行せず、重力に抗してその形状を維持し、そして注射カニュ ーレを通しての圧送、を含む幾つかの手段によって特定領域に適用できる移植材 を提供することは、本発明の別の目的である。これら及びその他の目的は、以下 の具体例の一つまたはそれ以上に適台しうる。 一面において、本発明は、安定な部分硬化ヒドロゲルを形成する生相容性ポリ マーからなる、動物中へ注入するための組成物を提供する。動物への注入に使用 されるとき、組成物は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでブロックに成形された ときに重力に等しい力の下で流動に抗するペーストである。典型的には、注入可 能ペーストは、３０ミクロンから５００ミクロンの範囲内のリニヤー寸法の不規 則形状のヒドロゲル粒子から主に作られた懸濁物であり、その注入可能ペースト は、少なくとも０．１ｋｇｆ／ｃｍ²のゲル強度を有し、粒子中のヒドロゲルは 少なくとも３ｋｇｆ／ｃｍ²のゲル強度を有する。そのような組成物は、脆いヒ ドロゲルを作り、そのヒドロゲルをオリフィスに通して、ヒドロゲルを破壊させ て、不規則形状の粒子を形成させることにより調製でき；得られる組成物（粒子 を含有する）は、動物中の組織平面を分離させるのに充分なコンシステンシィを 保持するペーストのように見える。 好ましい態様において、本発明の組成物中の生相容性ポリマーは、アルギン酸 塩であり、本組成物は、さらに多価金属カチオンの高度溶解性塩、多価カチオン の弱溶解性塩を含む。高度溶解性塩と弱溶解性塩の両者は、カルシウム塩であっ てよい。あるいは、高度溶解性塩がカルシウム塩で、弱溶解性塩が銅、カルシウ ム、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、錫、及びジ−、 トリ−またはテトラ−官能性有機カチオンからなる群より選択されるカチオンと 、低分子量ジカボン酸イオン、サルフェート及びカーボネートからなる群より選 択されるアニオンとからなりうる。殊に好ましい具体例において、弱溶解性塩は 、塩化カルシウムであり、混合物は、塩化カルシウム／硫酸カルシウムを重量で ０．００１から１００、さらに好ましくは０．００７５から１．０の比で含む。 好ましくは、組成物は、重量ですくなくとも０．５％のアルギン酸塩を、そして アルギン酸塩１グラム当たり少なくとも約０．００１ｇの塩化カルシウムを含む 。別の好ましい態様においては、組成物は、さらに、カルシウムイオンの結合の ためにアルギン酸塩と競合する金属イオン封鎖剤を含み、その金属イオン封鎖剤 はホスフェートアニオンを含んでいてよい。 随意には、ヒドロゲルを形成する生相容性ポリマーをふくむ本発明の注入可能 組成物は、軟骨細胞及び軟骨組織を形成するその他の細胞、骨芽細胞及び骨を形 成するその他の細胞、筋肉細胞、線維芽細胞ならびに器官細胞のような生細胞を も含んでいてよい。典型的には細胞は、解離細胞及び／または細胞集合体であろ う。 他面において、本発明は、方法で使用するためのキットを提供し、そのものは 、ヒドロゲルを形成し得る生相容性ポリマー（または、そのポリマーは既製の弱 く架橋したヒドロゲルの形で与えられてもよい。）を含み、またそのヒドロゲル が強制的に押し通されて、それにより弱架橋ヒドロゲルが破壊されるオリフィス （典型的にはそのオリフィスは、注射針またはカニューレであろう。）をふくむ 。一具体例において、本発明は、動物中へ注入するのに適当であり、ｉｎ ｖｉ ｖｏ（生体内）で充分に硬化することになる、部分硬化ヒドロゲルを調製するた めのキットであって、（１）多価カチオンで架橋結合する時に、ヒドロゲルを形 成しうる生相容性ポリマー、（２）多価カチオンの高度溶解性塩、及び（３）多 価カチオンの弱溶解性塩を含む。好ましい態様において、そのキットは、（１） ２価カチオンにより架橋結合する時にヒドロゲルを形成する、好ましくはアルギ ン酸塩である、ポリマー、（２）２価金属カチオンを含む充分な可溶性の塩、好 ましくは、塩化カルシウム、及び（３）銅、カルシウム、アルミニウム、マグネ シウム、ストロンチウム、バリウム、錫、及びジ−、トリ−またはテトラ−官能 性有機カチオンからなる群より選択されるカチオンと、低分子量ジカルボン酸、 サルフェートイオン及びカーボネートイオンからなる群より選択されたアニオン とを有する弱可溶性塩、好ましくは、硫酸カルシウム、を含む。このキットは、 それらの成分が、任意に哺乳動物細胞を含めて、一緒にされた時に、その一緒に された成分が３０分以内に、注入に適し、１．５％の濃度でポリマー、１．５ｍ ｇ／Ｌの濃度で充分可溶性塩、そして１５ｍｇ／Ｌの濃度で弱可溶性塩を有する 部分硬化費度悪露ゲルを形成するように与えられており、さらには、その部分硬 化ヒドロゲル少なくとも４時間粘度の変化を受けない。 キットの成分は、別々の容器に中にあってよく、あるいは２またはそれ以上の 成分がキットにおいて一緒にされていてよい。随意に、生ポリマー及び少なくと も一方の塩は、粉末状であってよく、好ましい態様においては、生相容ポリマー ふんまつ及び塩粉末は、一つの容器中で一緒にされる。更に好ましくは、弱溶解 性塩及び生相容性ポリマー両者が粉末であり、一つの容器内で一緒にされる。別 態様において、キットは、カルシウムイオンの結合のためにアルギン酸塩と競合 する金属イオン封鎖剤を含み、それは別の容器に入れても、あるいは、一つまた はそれ以上の他の成分と一緒にされていてもよい。 更に別の面において、本発明は、動物内の構造欠陥をその治療の必要に応じて 治療する方法であって、本発明による組成物を欠陥の部位で動物中へ移植するこ とからなる。一態様において、動物内の構造欠陥を、その治療の必要に応じて治 療する方法は、（１）部分効果された生分解性、生相容性のヒドロゲルであって 、任意に生細胞を含む部分硬化ヒドロゲルを調製し、(２)そのヒドロゲルを圧力 下にオリフィス内を通過させて破壊して、ヒドロゲル粒子を含む懸濁物を作り、 そして（３）その懸濁物を欠陥の部位で動物中に移植する、過程からなり、その ヒドロゲルが移植後に、組織を包囲すること及び移植物の脈管化により、繊維形 成応答を誘発する、上記治療方法を提供する。あるいは、動物内の構造欠陥を、 その治療の必要に応じて治療する方法は、(１)バイオポリマーまたは変性バイオ ポリマーからなり、任意に生細胞を含む生相容性ヒドロゲルを調製し、（２）そ のヒドロゲルを圧力下にオリフィス内を通して、組織平面を分離させるのに充分 なコンシステンシィを有する流動性組成物を作り、そして（３）その流動性組成 物を欠陥の部位で動物中へ移植する、過程からなる。 別の態様において、本発明は、動物内の構造欠陥をその治療の必要に応じて治 療する方法であって、部分硬化した生相容性ヒドロゲルの粒子懸濁物を調製し、 そしてそのヒドロゲル懸濁物を欠陥の部位で動物中へ移植することからなり、そ のヒドロゲルが、そのままであるが弱く架橋結合されたゲルとして（例えば、ゲ ル強度＝６．５９ｋｇｆ／ｃｍ²）で与えられ、それが２２−ゲージのかニュー レを通して１０ｍｌ／分の割合で射出された時に、ゲル強度の減少をもたらす（ 例えば、ゲル強度＝０．２３１ｋｇｆ／ｃｍ²）上記方法を提供する。この方法 で使用する組成物は、動物中に注入するのに適当である室温で部分硬化されるヒ ドロゲルを形成し、注入後には、ｉｎ ｖｉｖｏで完全に硬化する。 好ましい態様において、本発明は、一般的には塩化カルシウムの形であり、好 ましくはほぼ１５分で、生相容性アニオンポリマー（例えば、アルギン酸塩）の 架橋結合を開始し、部分架橋結合させるのみに充分な濃度である、容易に入手で きる架橋結合用カチオン源を与える。更に好ましくは、アルギン酸塩は、処方中 の全ての水を、緩く架橋結合したゲル中へ導入するのに充分な量で存在する(典 型的には、約０．５％よりも多くのアルギン酸塩が、そのような注入可能細胞懸 濁物中に存在する)。そのような処方物は、手術室での早急な使用のために迅速 に 固まるが、処置の完結を可能とするように長時間にわたって、良好な「注入可能 」コンシステンシイを維持する。好ましくは、部分架橋結合ヒドロゲルは、２４ 時間を越えてこのコンシステンシイを維持する。なお更に好ましくは、コンシス テンシイは、ヒドロゲルが部分架橋結合状態で調製され、市場販売されるのを可 能とするように、充分な時間にわたり比較的安定である。一般的に、注入される 際の懸濁物は注入された時に組織をより容易に分割し、注入部位からの溢出を受 けることがより少ないような濃厚コンシステンシイを有する。 好ましい具体例において、本発明は、動物中の（解剖学的）構造欠陥を処理す る方法であって、その欠陥部位で、典型的には、好ましくは多価イオンの可溶性 塩及び多価イオンの弱可溶性塩の形である多価イオンによって架橋結合された時 に、ヒドロゲルを形成する生分解性、生相容性ポリマーを含む懸濁物を、動物中 に移植することにより処理する方法を提供し、それらの成分は、一緒にされて、 その混合物が部分硬化、注入可能ヒドロゲルを形成し、そこで部分硬化ヒドロゲ ルがその場で所望の寸法及び形状の移植体を形作り、そして移植後にその寸法及 び形状を維持し、動物の細胞がヒドロゲル移植体に侵入して、硬化されたヒドロ ゲルと実質的に同じ形状を有する繊維細胞マスを形成する。 図面の簡単な説明 図１は、硫酸カルシウム粉末及び塩化カルシウム／硫酸カルシウムでそれぞれ 架橋結合されたアルギン酸塩について２５℃でのゲル形成の時間経過を示す。 図２は、硫酸カルシウム粉末及び塩化カルシウム／硫酸カルシウムでそれぞれ 架橋結合されたアルギン酸塩について３７℃でのゲル形成の時間経過を示す。 図３は、硫酸カルシウム粉末及び塩化カルシウム／硫酸カルシウムでそれぞれ 架橋結合されたアルギン酸塩について５℃でのゲル形成の時間経過を示す。 発明の詳細な説明 本発明は、組織処理応用において、動物中へ移植されうる改善された組成物、 ならびに注入によりそのような組成物を動物中に移植する方法を提供する。本発 明の組成物は、ヒドロゲルの形の生相容性ポリマーを含む。本発明の組成物は、 移植されるべき材料に生細胞を添加せずに使用でき、その場合には、移植体が時 間の経過に伴い、周囲組織の細胞に予って侵入され最初の移植体の形を有する細 胞マスを作り、あるいは生細胞が組成物中に含まれていて、それにより、組成物 が注入により移植された領域に別のタイプの細胞を導入することができる。 本発明の個々の具体例は、長期間持続する組織様バルクを動物中に形成するこ とに向けられており、その組織様物質はある種の軟組織の特性を模倣し得る。本 発明について説明される組成物は、負傷、手術、または継承奇形に起因する組織 ボイドの実用的矯正をなすために充分な期間にわたって持続する持続性バルキン グ物質を形成するために注入され得る。本組成物は切開または注入により適用し 、次いで適用後に整形できる。注入された材料は、形をいじし引き続く繊維細胞 増殖及び緩い結合組織侵入が、存在するボイドを矯正するために及びヒドロゲル をそれが注入で配置された所に保持するために器官化組織を作る。適用されたゲ ル物質は、所望の容積及び形を維持するために緩い結合組織によって侵入される 。この導入された物質及び結果の繊維流入は、ｉｎ ｖｉｖｏで長期間持続する 。 本発明によるゲルは、繊維形成応答を剌激する性質を有している。ここに説明 するように、皮下部分へのアルギン酸塩ゲルの注入は、注入ゲル節片内または周 囲への緩い結合組織の浸入を促進する。この応答を介して、結合組織は最終的に は、ゲル物質の注入で作り出されたバルクの可なりの割合を占めるようになる。 本発明による適当な組成物は、典型的にはヒドロゲルの形の生相容性ポリマーか らなる不規則形状の粒子を含む注入可能なペーストである。懸濁物は、注入され た時に組織を分離し、そして注入部位からの流出を避けるために充分なコンシス テンシイ（粘度）を保持する。繊維形成応答を刺激するゲル懸濁物の特性には、 粒子寸法が含まれ、また粒子のヒドロゲル特性が繊維形成応答の刺激及び注入部 位での移植体の固定の両方のために重要である。 好ましくは、本発明の組成物は、チキソトロピー性である様である。換言すれ ば、ヒドロゲルは部分硬化され(弱く架橋結合され)、結果としてヒドロゲルは、 ある点まで変形に抗する；しかし力が増加するに連れて、組成物は流体挙動を示 す。好ましい態様において、脆いヒドロゲルが作られ、例えばヒドロゲルを適当 な寸法のオリフィスに強制的に通すことにより、破壊して、所望の寸法の不規則 形状の粒子を形成する。得られるヒドロゲルの懸濁物は、重力に抗してその形状 を保持するであろう。懸濁物は、積み重なって他の支持なしで同一形状を維持す るマウンドをを形成することができる。得られるペーストのブロックまたはマウ ンドは平板状の歯磨きペーストの塊のように流動に抗するが、エッジの若干の丸 みが起こりうる。 好ましくは、本発明のヒドロゲルは、注射針またはカニューれのようなオリフ ィス内を強制的に通すと破壊する脆い物質である。硬化されたヒドロゲルのコン システンシイは、条件の変化により、変化し得る。例えば、大きなカルシウムイ オンの濃度は、アルギン酸塩の架橋結合度を増加させ、高い温度はＰＬＵＲＯＮ ＩＣＳ（登録商標）ヒドロゲル、その他の架橋結合を増加させる。一旦それがゲ ル化すると、本発明による部分硬化ヒドロゲルは、安定であり、少なくとも２時 間、さらに好ましくは少なくとも２４時間、そしてしばしば数週間の単位の期間 、重力の効果に等しいか、それよりも小さい力に抗してその形状をたもつ。破壊 されたヒドロゲルは、オリフィスのサイズ及び圧力の関数である寸法をもつ、不 規則形状の粒子の懸濁物である。典型的には、寸法は、３０μｍから５０μｍ、 好ましくは４０μｍから３００μｍの範囲である。適当なオリフィス寸法及び注 入圧力は当業者によって決定され得る、有効な粒子寸法は、実施例６に記載され るように繊維形成応答を監視することにより確認しうる。 ヒドロゲルは、注射器の筒内で硬化させ、次いで注射器プランジャーへの圧力 作用は組成物を注射器から押し出す。典型的な配合において、組成物を注射器か ら押し出す。典型的な処方配合において、組成物は、部分硬化され、次いで２２ ゲージのカニューレ内を１０ｍｌ／分の割合で、高粘度流体として押し通されも 、その組成物中に含まれ得る細胞のひどい損傷がない。適当な処方において、カ ニューレを通過後に、組成物は、ＰＯＬＹＴＥＦ（登録商標）ペ＾ストのコンシ ステンシイを有する。例えば、組成物は、２５℃において１５，０００ｃＰｓの 測定粘度のペーストであり、そして組成物が細胞を含む時には、２２ゲージカニ ューレを介して１０ｍｌ／分の割合での組成物の押し出しは、細胞を実質的には 破損しない(即ち、細胞の生存力２５％以上低減)。 注入及び繊維形成反応後の移植体の細胞持続性及び生存力は、走査電子顕微鏡 、組織学、及びラジオアイソトープでの定量分析によって、測定できる。細胞の 機能は、上記の技法及び機能測定の組み合わせによって測定できる。標識付きグ ルコースを用いての研究、ならびにタンパクアッセイを用いての研究は、ポリマ ーの骨組み上の細胞マスを定量するために実施できる。これらの細胞マスの研究 は、適切な細胞マスがどれであるかをけっていするための細胞機能試験と関係付 けることができる。軟骨細胞の場合に、機能は、周囲の結合した細胞のための適 当な支持体を与え得る軟骨マトリックス成分（例えば、プロテオグリカン類、コ ラーゲン類）の合成として定義される。 本発明のバイオポリマー含有組成物は、またはヒドロゲル粒子の水性懸濁物の 形で調製される。一般に、本発明のヒドロゲル組成物は、水性媒体を含み、その ものは、一種またはそれ以上の薬学的に許容される塩そして任意にその他の成分 を含むのが普通である。例えば、バイオポリマーがアルギン酸塩であるとき、ヒ ドロゲルは、アルギン酸塩（例えば、可溶性アルギン酸ナトリウム）の溶液を、 部分硬化ヒドロゲルを形成するためにアルギン酸塩の架橋結合を開始するのに充 分な量で多価イオンを含む溶液と混合することにより、作られる。塩の量及びタ イプは変わり得るが、普通は溶質及び溶質濃度は、組成物が動物組織中へ注入さ れた時に動物への過度のストレスを避けるように選定される。ヒドロゲルが生細 胞をも含んでいる時には、組成物の他の成分は、生細胞と相容性であり、好まし くは組成物は細胞の生育及び維持のために有利な因子を含む。 ポリマー 本発明による移植体で使用されるポリマー物質は、ヒドロゲルを形成しなけれ ばならない。ヒドロゲルは、有機ポリマー（天然または合成）が共有、イオン性 または水素結合を介して架橋結合して、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元 開口格子構造を作り出す時にできる物質と定義される。ヒドロゲルを形成するの に使用し得る材料の例としては、アルギン酸塩のような多糖類、カラジーナン、 ポリホスファジン、及びイオン的に架橋結合される、ポリアクリレートあるいは 、温度またはｐＨによって、それぞれ架橋結合されるＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録 商標）またはＴｅｔｒｏｎｉｃｓ（登録商標）ポリエチレンオキシド−ポリプロ ピレングリコールブロック共重合体のようなブロック共重合体が含まれる。 一般に、これらのポリマーは、水、緩衝塩溶液または、水性アルコール溶液の ような水性溶液中に少なくとも部分的に可溶でであり、またポリマーは電荷を有 する側鎖、またはその一価イオン塩を含み得る。カチオンと反応しうる酸性側鎖 をもつポリマーの例は、ポリ(ホスファゼン)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタク リル酸)、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、ポリ（酢酸ビニル）及び スルホン化ポリスチレンの様なスルホン化ポリマーが含まれる。アクリルもしく はメタクリル酸及びビニルエーテルモノマーもしくはポリマーの反応で得られる 酸性側鎖を有するコポリマーも使用できる。酸性基の例は、カルボン酸基、スル ホン酸基、ハロゲン化（好ましくは、フッ素化）アルコール基、フェノール性Ｏ Ｈ基及び酸性ＯＨ基である。 アニオンと反応し得る塩基性側鎖をもつポリマーの例は、ポリビニールアミン 、ポリビニールピリジン、ポリビニールイミダゾリン及び若干のイミノ置換ポリ ホスファジンである。ポリマーのアンモニウムまたは四級塩も、主鎖窒素または ペンダントイミノ基から形成され得る。 ポリホスファゼンは、交互にあるシングル及びダブル結合によって分離された 窒素及びリンから構成された主鎖を有するポリマーである。各リン原子は、二つ の側鎖（”Ｒ”）に共有結合されている。ポリホスファゼン中の繰り返し単位は 、一般式（Ｉ）を有する： ここに、ｎは整数である。 架橋結合のために適当なポリホスファゼンは、酸性であり、２または３価カチ オンと塩橋を形成し得る多数の側鎖を有する。好ましい酸性側鎖の例は、カルボ ン酸基、およびスルホン酸基である。加水分解安定性ポリホスファゼンは、Ｃａ²⁺ またはＡｌ³⁺のような２価または３価カチオンによって架橋されるカルボン酸 基を有するモノマーから形成される。イミダゾール、アミノ酸エステルまたはグ リコール側鎖基を有するモノマーを導入することによって、加水分解で分解する ポリマーを合成できる。例えば、ポリアニオン性[ビス（カルボキシルアトフェ ノキシ）]ホスファゼン（ＰＣＰＰ）を合成することができ、この者は室温また は それ以下において、水性媒質中の溶解多価カチオンで架橋結合されて、ヒドロゲ ルマトリックスを作る。生分解性ポリホスファゼンは２種の異なるタイプの側鎖 、すなわち、多価カチオンと塩橋を形成し得る酸性側鎖、及びｉｎ ｖｉｖｏ条 件下加水分解する側基、例えばイミダゾール基、アミノ酸エステル、グリセロー ル及びグルコシルである。ここで使用される生分解性なる用語は、所望の応用（ 普通はｉｎ ｖｉｖｏ治療）において、一旦約２５℃−３８℃の温度を有するｐ Ｈ６−８の生理溶液に曝されたときに、許容し得るある期間で溶解または分解す るポリマーを意味し、約５年以下、最も好ましくは、約１年以下で、溶解または 分解するポリマーを意味する。側鎖の加水分解は、ポリマーの崩壊をもたらす。 加水分解性側鎖の例は、非置換または置換のイミジゾール及びアミノ酸エステル であって、基がアミノ結合を介してリン原子に結合しているもの（両Ｒ基がこの ように結合しているポリホスファゼンポリマー）である。ポリイミダゾールホス ファゼンについては、ポリホスファゼン主鎖上のＲ基のいくつかが、環窒素原子 を介して主鎖中のリンに結合されたイミダゾール環である。その他のＲ基は、加 水分解に参加しない有機残基、メチルフェノキシ基、またはＡｌｌｃｏｃｋ等のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １０：８２４−８３０（１９７７）の科学文献に 記載されているその他の基のようなものである。種々のタイプのポリホスファゼ ンの合成及び分析方法は、Ａｌｌｃｏｃｋ Ｈ．Ｒ．等のＩｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ ． １１，２５４８(１９７２)；Ａｌｌｃｏｃｋ等のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓ １６，７１５(１９８３)；Ａｌｌｃｏｃｋ等のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １９，１５０８(１９８６)；ＡｌｌｃｏｃｋらのＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， １９，５００(１９８８)；Ａｌｌｃｏｃｋ等のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２１，１９８０(１９８８)；Ａｌｌｃｏｃｋ等のＩｎｏｒｃｒ．Ｃｈｅｍ．２１ （２)，５１５５２１(１９８２)；Ａｌｌｃｏｃｋ等のＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕ ｌｅｓ ２２，７５(１９８９)；Ａｌｌｃｏｃｋ等の米国特許４、４４０、９２１ 、４、４９５１７４および４、８８０、６２２；Ｍａｇｉｌｌ等の米国特許４、 ９４６、９３８；及びＧｒｏｌｌｅｍａｎ等のＪ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅ ｌｅａｓｅ ３，１４３（１９８６）に記載されており、これらの教示は、参考 として特にここに導入される。 前記のその他のポリマーの合成方法は、当業者に公知である。例えば、Ｃｏｎ ｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ 及びＰｏｌｙｍｅｒｉｃ Ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓａｌｔ ｓ，Ｅ．Ｇｏｅｔｈａｌｓ編集（Ｐｅｒｇａｍｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｌｍｓｆｏ ｒｄ，ＮＹ １９８０）参照。ポリ（アクリル酸）のような多くのポリマーが市 販されている。 電荷のある側鎖を有する水溶性ポリマーは、そのポリマーを、反対電荷の多価 イオンを含む水性溶液と反応させることにより架橋結合され、ポリマーが酸性側 鎖を有するならば、多価カチオンあるいは、ポリマーが塩基性側鎖を有するなら ば、多価アニオンを用いる。ヒドロゲルを形成するのに酸性側鎖を有するポリマ ーの架橋結合のために好ましいカチオンは、銅、カルシウム、アルミニウム、マ グネシウム、ストロンチウム、バリウム、及び錫のような２価及び３価カチオン であり、アルキルアンモニウム塩、例えばＲ₃Ｎ⁺−Ｖ Ｖ Ｖ−⁺ＮＲ₃のような ジ−,トリ−またはテトラ−官能性カチオンも使用できる。これらのアニオンの 水性溶液は、ポリマーに添加されて、柔らかい、高度に膨潤したヒドロゲル及び 膜を形成する。カチオンの濃度が高いほど、あるいは結合価が大きいほど、ポリ マーの架橋結合度が高くなる。０．００５Ｍのような低い濃度で、ポリマーを架 橋結合させることが判明した。 ヒドロゲルを形成するのにポリマーを架橋結合させるのに好ましいアニオンは 、低分子量ジカルボン酸、例えばテレフタル酸、サルフェートイオン、カーボネ ートイオンである。これらのアニオンの塩の水性溶液が、ポリマーに添加されて 、カチオンの場合のように柔らかい、高度に膨潤したヒドロゲル及び膜を形成す る。生相容性ポリマーおよび架橋結合剤は、任意の生理的に相容性の溶媒中に溶 解し得る。例えばここでは共通培地Ｍ−１１９を代表溶媒として用いる。 種々のポリカチオンを、ポリマーヒドロゲルを錯化し、安定化して半透性表面 膜とするために使用できる。３，０００−１００，０００の好ましい分子量を有 するアミンやイミンのような塩基性反応性基を持つポリマーが、使用できる物質 の例であり、例えば、ポリエチレンイミン及びポリリシンである。これらは市販 されている。一つのポリカチオンは、ポリ（Ｌ−リシン）であり、合成ポリアミ ンの例は、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニールアミン）及びポリ（アリルアミ ン）である。また多糖類，チトサンのような天然ポリカチオンもある。 ポリマーヒドロゲル上の塩基性表面基と反応して半透膜を形成するのに使用で きるポリアニオンとしては、アクリル酸、メタクリル酸及びアクリル酸のその他 の誘導体のポリマ一及びコポリマー、スルホン化ポリスチレンのようなペンダン トＳＯ₃Ｈ基を有するポリマー、およびカルボン酸基を有するポリスチレンがあ る。 本発明における移植剤中で使用が意図されているポリマーには、ここに記載さ れているヒドロゲルと同様な粘弾性であるヒドロゲルを適当な条件下で形成する その他の天然、合成または変性バイオポリマーを包含する。適当なバイオポリマ ーとしては、例えば変性アルギン酸塩及びその他のバイオぽりまーがある(例え ば、Ｐｕｔｎａｍ ＡＪ；Ｍｏｏｎｅｙ ＤＪ(１９９６)”Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎ ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｘｔｒａｃｅｌｌａ ｒ ｍａｔｒｉｃｅｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｊｃｉｎｅ，２(７)；８２４− ８２６，(１９９６)；Ｍｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．(１９９６)，”Ｔｉｓｓｕｅ ｅ ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅ ｒ ｍａｔｒｉｘｅｓ”，Ｂａｊｐａｉ，Ｐｒａｐｈｕｌｌａ Ｋ(Ｅｄ)，Ｐｒ ｏｃ．Ｓｏｕｔｈ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．Ｃｏｎｆ.，１５ｔｈ，ＩＥＥＥ， ＮＹ，１９９６；及びＷｏｎｇ，Ｗ．Ｈ．及びＤ．Ｊ．Ｍｏｏｎｅｙ”Ｓｙｎｔ ｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌ ｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍａｔｒｉｃｅ ｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ” Ａｔａｌａ等編集”Ｓ ｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ(Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ)，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，１９９７，ＩＳＢＮ；０ ８１７６３９１９５を参照)。 アルギン酸バイオポリマー組成物 好ましい態様において、本発明方法は、酸性バイオポリマーの多価カチオンに よる架橋結合によりヒドロゲルを形成することを含み、その際に多価カチオンの 有効利用性が弱溶解性塩を溶解させて制御される、可溶性カチオンが架橋結合に よって吸収されるにしたがって、可溶性カチオンを補充するためである。多価カ チオンの一部は充分溶解性塩によって与えられ、自由に利用できる(速架橋結合 イオン)、一方完全架橋結合のために必要な多価カチオンは、弱溶解性塩（遅架 橋結合イオン）によって与えられる。以下の説明においてアルギン酸塩は、任意 な適切なポリマーの代表である。 好ましいポリマー（アルギン酸塩）と使用するために、好ましい多価イオンは 、カルシウムである。 代表例において、生相容性酸性バイオポリマーのアルギン酸塩は、少量の充分 可溶性塩化カルシウム及び多量の弱可溶性硫酸カルシウムによって架橋結合され る。ヒドロゲルが形成される組成物は、リン酸イオンを比較的高濃度で含み、可 溶性カルシウムイオン濃度を緩衝し、アルギン酸塩の完全架橋結合を妨げる。組 成物が所望の部位で注入されると、リン酸イオンは周囲の生体液中へ拡散するこ とにより希釈されてしまい、可溶性カルシウムイオンの濃度が局部的に増加する 。可溶性カルシウムイオンの濃度が増加するにつれて、アルギン酸塩中で更なる 架橋結合をカルシウムが与え、ヒドロゲルが硬化する。 アルギン酸塩は、海草から選られるポリマンヌロネート及びポリグルロネート のストレッチの共合体である。適当なアルギン酸塩が市販されている。個々のア ルギン酸塩調剤はマンヌロネート：グルロネート（ＭＩＧ）比の関数である測定 可能な結合用カルシウム容量を有する。Ｍ及びＧ残基の比の変化からもたらされ る効果は米国特許４，３５２，８８３号に記載されている、これを参考のためこ こに導入する。適当な高精製アルギン酸塩は３５／６５のＭ／Ｇ比を有する。 アルギン酸塩は、室温で、水中において２価イオンによりイオン的に架橋結合 される。このような穏和な条件のために、例えばＬｉｍの米国特許４，３５２， ８８３号に記載されるようにハイブリドーマ細胞カプセル化のために最も一般的 に用いられているポリマーである。 ヒドロゲル態の細胞／ポリマー系は、組織処理（エンジニヤリング）のために 用いられ、例えば、ヒドロゲル形成を開始させるためにカルシウムイオンが添加 されたアルギン酸塩溶液中の軟骨細胞のような細胞懸濁物がある。これらの系の 典型は、軟骨細胞／アルギン酸カルシウム溶液であり、単離された細胞懸濁物を アルギン酸ナトリウム溶液（例えば、０．１Ｍ Ｋ₂ＨＰＯ₃中に、０．１３５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．4)とかき混ぜ１．０％アルギン酸塩溶液中に２０Ｘ１０⁶細 胞／ｍＬの細胞密度を生じさせる。軟骨細胞−アルギン酸ナトリウム懸濁物は使 用するまで４℃で氷上に保存しそして注入前に冷軟骨細胞−アルギン酸塩溶液１ ｍＬあたり０．２ｇの滅菌ＣａＳＯ₄粉末を添加する。 混合物を加熱する必要性及び注射器にフィルターを加える必要性を回避するた め、本発明者は組織処理で使用される注入可能ヒドロゲルのための新処方を開発 した。この処方は、迅速なゲル形成及びゲル懸濁物の長い注入可能性を与え，よ り一層一貫した性能を与える。 冷水及び熱水（１００℃）での硫酸カルシュウム２水塩（ＣａＳＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ）の溶解度は、それぞれ２．４１及び２．２２ｍｇ／ｍＬである。 塩化カルシウムはその高溶解度ゆえに、アルギン酸塩ゲル化を早める一つの速 ”Ｃａ⁺²”源である。同等な溶解度のその他のカルシウム塩も同様に働く。アル ギン酸塩の濃度及び所望のゲル強度に応じて、ＣａＣｌ₂は０．５ｍｇ／ｍＬか ら３．０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。典型的なアルギン酸ナトリウムと理論量 的に反応するのに必要とされるＣａＳＯ₄・２Ｈ₂Ｏの量は、アルギン酸塩ｍｇ当 たり０．３０９ｍｇである。 所要の時間で許容し得るコンシステンシイの均質ゲルを生じさせる比率が好ま しい。 本発明は、架橋の際にヒドロゲルを形成する生分解性、生相容性ポリマー、典 型的には、アルギン酸塩からなる動物への移植用組成物を手興する。好ましい態 様において、そのポリマーは、多価イオン、更に好ましくは多価イオンの可溶性 塩及び多価イオンの弱溶解性塩によって架橋され、これらの成分は、一緒にされ て、部分的に硬化した注入可能なヒドロゲルを形成する混合物となり、その混合 物のコンシステンシイは、その部分硬化、注入可能混合物を動物中へ移植するの に適当であり、そこでその移植された、部分硬化ヒドロゲルがその場で完全硬化 ヒドロゲルを形成する。好ましくは、混合物は、多価架橋用イオンの結合のため に生相容性ポリマーと競合する金属イオン封鎖剤を含む。 細胞源 本発明の組成物は、多数の細胞の効率的な移行のため、及び新組織または組織 均等物の創出の目的で移植体接合の促進のために三次元の骨組み内で、遺伝子変 更細胞を包含する多重細胞タイプを与えるのに使用できる。それは新組織または 組織均等物が生長している間に宿主免疫系を排除することにより、細胞移植体の 免疫保護のためにも使用できる。 ここに記載されているように移植できる細胞の例としては、軟骨細胞及び軟骨 細胞を形成するその他の細胞、骨芽細胞及び骨芽細胞を形成するその他の細胞、 筋肉細胞、繊維芽細胞ならびに器官細胞があり、また単離幹細胞の拡張物も含ま れる。器官細胞とは、肝細胞、小島細胞、腸源細胞、腎臓から誘導された細胞、 ならびに物質を合成し、分泌しまたは代謝する作用を主とするその他の細胞が包 含される。 注入可能ヒドロゲルに含臓されるべき細胞は、ドナーから直接に、ドナーから の細胞の細胞培養から、または確立された細胞培養ラインから得られる。好まし くは態様において、細胞は、ドナーから直接得て、洗浄され、ポリマー物質と組 合せて直接に移植される。細胞物質は、解離された単細胞でも、集塊組織（すな わち集合細胞の塊）または解離細胞から試験管内で生じた細胞集合体であっても よい。細胞は、組織培養の当業者に公知の方法で培養できる。 注入後の細胞持続性及び生存性は、走査電子顕微鏡、組織学、及びラジオアイ ソトープでの定量分析によって測定できる。移植細胞の機能は、上記の技法及び 機能測定の組合せによって測定できる。例えば肝細胞の場合に、生体内肝機能研 究は、患者の共通胆汁ダクト内にカニューレを配置することによって行うことが できる。それにより胆汁は少量づつ捕集できる。胆汁色素は、基本テトラパイロ ールスを観察する高圧液体クロマトグラフィーにより、あるいは、Ｐ−グルクロ ニダーゼでの処理または処理なしで、ジアゾ化アゾジパイロールスエチルアンス ラニレートとの反応によりアソジパイロールスへ転化した後に薄層クロマトグラ フィーにより分析できる。ジコンジュゲート化、またはモノコンジュゲート化ビ リルビンも、結合胆 汁色素のアルカリンメタノリシスの後に薄層クロマトグラフィーにより測定でき る。一般に、機能する移植肝細胞の数が増すにつれて、コンジュゲート化ビリル ビンのレベルが増大する。また簡単な肝機能試験は、血液試料において、アルブ ミン産生のような項目が実施できる。 同様な器官機能試験は、移植後の細胞機能の程度を測定するために、当業者に 公知の技法で実施できる。例えば、膵臓の小島細胞は、糖尿病を治すためにイン スリンの適切な分泌によってグルコース調節を達成するのに、肝細胞を移植する のに特定的に使用するものと同様な方式で分配できる。その他の内分泌組織も移 植できる。標識グルコースを用いての研究、ならびにタンパク分析を用いての研 究はポリマー骨組み上の細胞マスを定量するのに使用できる。これらの細胞マス の研究は、どれが適切な細胞マスであるかを決定するために、細胞機能研究と相 関させうる。 混合プロトコール 部分硬化コンシステンシイを有するヒドロゲルを形成するのに反応させる成分 についての添加の順序は大きく変化されうる。典型的には、任意に金属イオン封 鎖アニオンを含有するアルギン酸塩は、一またはそれ以上の段階でカチオン源と 混合される。一般に、生分解性液体ポリマー、例えば次の多価イオン塩との混合 時に制御された割合で固化させるように設計されたアルギン酸塩が使用される。 個々の成分の濃度及び混合インキュベーションの条件の変化は、（ａ）注入時の 材料のコンシステンシイを制御するため、（ｂ）注入可能コンシステンシイを達 成するのに必要とされる時間を制御するため、そして（ｃ）適切なキメ及び寸法 保持のために受容組織の特定の要件に適合するように生体内最終細胞の性質を制 御するために改変しうる。 個々の成分の濃度は、単独または組合せで、適用の前及び後の両方で配合物の 種々の性質を変更して、（ａ）注入及び適用のため、（ｂ）移植体の良好な接合 ならびに最終ゲル及び交換組織の所要の性質及び機能の創出のため、あるいは（ ｃ）配合物の製造、分配及び患者への適用のために、特定の要件に適合するよう にできる。例えば、詰った組織（例えば筋肉、 皮下）へのヒドロゲル配合物の注入は、材料の流出を防ぐために高粘度を必要と する。粘度の変更は、（１）原料の粘度の選択（例えば、低、中または高粘度ア ルギン酸塩）、（２）ゲルの濃度（例えば、広範囲のゲル粘度を達成するために ０．３％〜３．０％のアルギン酸塩の範囲を使用できる。）、（３）部分架橋結 合度を制御するための多価カチ才ン源の量、または（４）カチオン結合のために アルギン酸塩と競合するために与えられるアニオン濃度、のような多くの機構を 、単独または組合せることにより達成できる。種々の細胞タイプによる移植体へ の良好な侵入、あるいは創出されるべき所望の交換組織の性質は、配合物成分の 変更を必要とする。例えば、硬い詰った組織（例えば肝臓、軟骨）の創出は、よ り大きなポリマー鎖長または濃度（例えば＞１．５％アルギン酸塩及び／または 高グルロン含量アルギン酸塩）を必要とする。 注入可能時間及び注入前の配合物の性質の制御は、本発明による治療物の製造 、分配及び適用の助けとなる。最終配合物の加工時間、または注入可能コンシス テンシイまで配台物を固めるのに必要とされる時間は、多くの方法、例えば与え られる高溶解性カチオンの量及び／またはカチオン結合の競合のために与えられ るアニオンの濃度により、さらには濃度調節により、制御できる。例えば、注入 可能コンシステンシイの時間は、温度によって、数分間の加工時間（３４〜３８ ℃）または１月以上（４〜８℃）を許容するように制御できる。温度は、ゲル形 成速度において、非常に重要な役割を果たす。温度を上昇させると、例えば３７ ℃の温度の組織中へ材料を注入するときに起こるように温度を上げると、材料は 硬化を進行して、完全架橋結合ヒドロゲルになる。実施例１に示されたように０ ．１ｘのＣａＳＯ₄・２Ｈ₂Ｏのレベルにおいて（すなわち配合バッチにおいて２ ０ｍｇ／ｍＬ）、部分硬化ゲルは体温で３２分間で固まり、少なくとも９０分間 注入可能である。この３７℃でのＣａＳＯ₄の最良の場合は、注入可能コンシス テンシイに達するまでになお過大な時間を必要とし、所望されるものよりも繁雑 でありまた所望されるものと矛盾する。 カチオン源は、ゲル化及びゲルの性質を制御するのに選択でき、また分 解を制御するのに組み合わせができる。迅速及び遅延架橋結合源を含む本発明に よる組成物は、硫酸カルシウムのみの配合物と比較して、より迅速な粘度上昇、 及び完全架橋されるまでにより長い時間を与える。殊に好ましい態様において、 部分硬化ヒドロゲルを形成する混合物は、著量のリン酸アニオンも含むであろう 。典型的には、リン酸濃度は約０．１モルであろう。 アルギン酸塩の濃度を増加すると、ゲルがより多くの水を保持する助けとなり 、その結果として、より濃厚なペースト及びより強いゲルが得られ、またゲル形 成を加速する。好ましいアルギン酸塩レベルは、ヒドロゲルを形成する最終細胞 含有懸濁物中で、少なくとも０．７５％、さらに好ましくは１．５％〜２．５％ 、そして３．０％までである。 本発明の好ましい具体例において、酸性バイオポリマーは、アルギン酸ナトリ ウムであり、充分可溶性塩は塩化カルシウムであり、そして弱可溶性塩は硫酸カ ルシウムである。アルギン酸塩は溶液少なくとも７５重量％、好ましくは約１． ５％の量で存在する。自由溶解性塩は１０〜１５ｍＭのカルシウムイオンを与え 、一方弱溶解性塩は、アルギン酸塩溶液中に、もしも完全に溶解されたならば約 ８倍のカルシウムイオンを供給する量で、分散された粉末の状態で与えられる。 換言すれば、二つの塩によって、２価金属架橋結合剤として供給され、すなわち 重量で１部：１０部の重量比の塩化カルシウム及び硫酸カルシウムの二つの塩に よって与えられる。ヒドロゲル懸濁物を製造する好ましい方法において、２％ア ルギン酸塩溶液の９部がＭ−１９９のような適当な細胞懸濁媒体の２部と混合さ れ、次いで１．８％の無水塩化カルシウムを含む同じ細胞懸濁媒体に１８％の硫 酸カルシウムを懸濁させたもの１部と混合される。最終混合物は良く混合され、 組織中への注入のために使用される。粘度の迅速な増加は、全成分を一緒に混合 して１５分以内に起こると予想される。この混合物のコンシステンシイは、混合 物の形成が重力に抗して保持されるように充分であるべきであるが、少なくとも ２４時間は室温において注入可能のままであろう。 注入可能応用のために好ましい粘度は意図された用途によって変るが、 （ａ）配合物容器（例えば注射器寸法、ピストン直径、適切な可触のために必要 とされる抵抗、または適用速度）、（ｂ）適用装置（カテーテルまたは針の長さ 、直径、組成）、（ｃ）受容組織の分離抵抗及び（ｄ）必要とされる分配タイプ （例えば骨または器官表面への局所適用、流出しなでの組織内への注入等）の種 々のパラメーターのバランスである。 本発明の意図の範囲には、本発明の組成物の調製及び注入に使用するキットが ある。そのようなキットは、組成物の成分を一つまたはそれ以上の容器に収容し てあり、処方容器（例えば混合容器または注射器）及び／またはゲル破壊オリフ ィス（例：カニューレまたは注射針）が含まれる。実施例 本発明のより完全な理解を促進するために、以下に幾つかの実施例を示す。し かし、これらの実施例に開示された具体的な実施態様に本発明の範囲は制限され ず、これらの実施例は単に例証の目的のためだけである。 実施例１ 硫酸カルシウム濃度のゲル化時間における影響 この実験は、塩化カルシウムの不存在下で硫酸カルシウム濃度を変化させるこ との影響を示す。０℃、３７℃および室温（２３℃）で、配合物のその他の内容 を変化させないで維持しながら、硫酸カルシウム量を０．０２ｇ／ｍＬ（０．１ ｘ）〜０．２ｇ／ｍＬ（１．０ｘ）に変動させた。アルギン酸ナトリウム（Ｍ／ Ｇ比が３５／６５のＵＰ ＭＶＧ等級、Ｐｒｏｎｏｖａ製）を、０．７９％の塩 化ナトリウムを含有する０．１モルリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．４）の２％溶液 として調製した。アルギン酸ナトリウム溶液をＭ１９９細胞培地で１対１に希釈 し、硫酸カルシウム粉末を２０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲の量で加え た。混合後、試料溶液を、氷浴温度(０℃)、室温(Ｒ．Ｔ.)、または体温（３７ ℃）のいずれかに保った。マイラーシート上に各試料のアリコットを注入するこ とにより周期的にゲル形成について試験した。 表Ａに結果を示す。ゲル形成時間（Ｘとして示した）および注入阻止時間（記 号Ｂ）も示す。表Ａから明らかなように、添加塩化カルシウムの不存在下氷浴上 ではゲル形成が観察されなかった。室温では、７０〜１００分の間でゲル形成が 起こり、ヒドロゲル注入はその時間の２０分以内で阻止された。３７℃では、硫 酸カルシウムの濃度に依存して最初のゲル化が３２分から１６分までに起こり、 注入の阻止が最初のゲル化の１５分以内で概ね起こった。 これらの実験は、０℃で、１２０分後までゲル化が起こらなかった（ｎｃ）こ とを示す。室温では、０．２ｘについて９０分でゲル化が始まり、１．０ｘにつ いて７０分でゲル化が始まった。体温では、１．０ｘ配合について１６分でゲル 化が始まり、ゲル化時間は硫酸カルシウム濃度の減少に伴ってほとんど直線的に 減少する。ヒト体温でこの硫酸カルシウム架橋ヒドロゲル配合物は１６分内にゲ ル化可能性があるが、注入に数分のみしか許されず、それにプラスされて、送達 やゲル化特性におけるロット間のばらつきをなくするために加熱装置およびシリ ンジに装着されるフィルターを加える必要性がある。これらの要求事項の双方と も配合物の臨床用途に複雑性を増しうる。温度はゲル形成速度に非常に重要な役 割を果たす。表Ａから、０．１ｘ、すなわち配合されたバッチ中に６０ｍｇのＣ ａＳＯ₄・２Ｈ₂Ｏの量において、体温で３２分内でゲル化が起こり、少なくとも ９０分間は注入できた。３７℃でＣａＳＯ₄のこの最もよい場合のシナリオは、 注入までに多くの時間がなお必要であり、目標よりもより複雑でありしかもより ばらつきがあることである。 実施例２ 塩化カルシウムと硫酸カルシウムの混合物 好適な配合物では、アルギン酸ナトリウムをｐＨ７．４のＫ₂ＨＰＯ₄緩衝液に 溶解する。Ｍ１９９培地中に細胞を供給し、次いで、アルギン酸塩溶液中に懸濁 させた。１．５ｍｌバイアル中に硫酸カルシウム粉末を貯える。Ｍ１９９培地に 塩化カルシウムを１８ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させ、別のバイアルに貯える。こ の応用では、ＣａＣｌ₂溶液をＣａＳＯ₄粉末と混合し、次いで、アルギン酸塩と 混合し、シリンジ中に入れ、約１５分間待ち、この配合物は注入される準備が整 う。 ボルテックス上での試験管混合に加えて、この配合物のシリンジ混合が同じゲ ル化特性を呈したことを示す実験も実施した。配合物中に軟骨細胞を加える実験 も行い、それが室温で１４分に成功裡にゲル化したが、さらに２時間以上にわた って注入可能性を維持した。後の実験は、この配合物は２週間以上にわたってそ の注入可能性を維持できることを示す。表２は、この配合物の成分を列挙する。 実施例３ ゲル化時間における温度の影響 塩化カルシウム／硫酸カルシウム塩混合物と混合したときのアルギン酸塩のゲ ル化に要する時間は温度により変動する。アルギン酸ナトリウム（ＵＰ ＭＶＧ 等級、Ｐｒｏｎｏｖａ製）を、０．７９％の塩化ナトリウムを含有する０．１モ ルリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．４）の２％溶液として調製した。２．２５ｍｌア ルギン酸塩溶液を０．５ｍｌのＭ１９９細胞培養培地と混合した。この混合物に 、 １８ｍｇの塩化カルシウム／ｍｌおよび４５ｍｇの懸濁した硫酸カルシウム粉末 を含有する０．２５ｍｌの細胞培養培地を加えた。混合後、各試料を所定の温度 に保持し、ゲル形成について周期的に試験した。二試料におけるゲル形成が検出 された時間を添付の表に示す。室温で（２０〜３０℃）で、ゲルは１３〜３０分 で形成した。３７℃で、７〜８分ゲル形成にかかった。 実施例４ 注入可能なアルギン酸塩ゲルの形成 混合物中の種々の成分の濃度をわずかに変動させてゲル化形成に要する時間の 感度を以下に記載するように試験した。アルギン酸ナトリウム、塩化カルシウム および硫酸カルシウムの溶液を実施例１および２に記載したとおりにして調製し た。但し、一または別の成分を基準値より１６％までプラスまたはマイナスに変 動させた。混合後試料を室温に保ち、ゲル形成について周期的に試験をした。 表３にゲル形成時間と注入するのに適したコンシステンシーを維持した期間を 示す。表中に、各成分の量について、基準値をＭ、基準値よりも１６％高い値を Ｈ、そして基準値よりも１６％低い値をＬで示す。これらのパラメーターの変動 内で、ゲル化時間が１８分プラスまたはマイナス約１５％は、この範囲内のある 特定の成分の変動にわずかしか影響がないことを示す。これらの溶液のすべては 約２０分以内でゲル化したが、アルギン酸塩ゲルのコンシステンシーは２４時間 後を超えてもなお注入するのに受け入れることができた。同様の方法で調製した この配合物の試料は配合後１ヶ月を超えても適切な注入可能特性を示した。 実施例５ ＣａＳＯ₄粉末のＣａＣｌ₂／ＣａＳＯ₄混合物に対する比較 この実験は２配合物のゲルおよびゲル化プロセスを定量的に特性化し、最終ゲ ルの強度を定性的に決定するために行う。上述の実験の間、ゲル化およびゲル化 するのに要する時間を目視観察により決定した。粘度計を使用することにより、 アルギン酸塩がゲル化を開始するときの粘度変化を直接測定でき、ゲルの相対強 度も定性的に決定できる。 ＣａＳＯ₄粉末によりゲル化したアルギン酸塩を実施例１について記述した通 りにして調製し、そしてＣａＣｌ₂／ＣａＳＯ₄の混合物によりゲル化したアルギ ン酸塩を実施例２について記述した通りにして調製した。ＣａＣｌ₂／ＣａＳＯ₄ 試料をシリンジ混合で調製し、ＣａＳＯ₄粉末試料をボルテックス混合法を用い て調製した。シリンジ混合は、容易に行うことができしかも非常にばらつきのな い生成物を得ることのできる非常に簡便な方法である。それは承認された生物医 学器具の使用もでき、生成物が環境にさらされることから分離するクローズドシ ステムを作り上げる。５℃、２５℃および３７℃の温度におけるこれらの二種類 の系のゲル化の過程に伴う粘度変化を測定し、結果を図１〜図３にプロットする 。 室温では、ＣａＣｌ₂／ＣａＳＯ₄試料がゲル化して１３分で注入できるセット ポイント（注入できるセットポイント：崩壊することなく積み重ねができるゲル のコンシステンシー）となった一方、ＣａＳＯ₄単独試料は５６分までゲルに硬 化しなかった。ゲル化前のＣａＣｌ₂／ＣａＳＯ₄試料の粘度は約６６５ｃＰであ り、ＣａＳＯ₄単独試料は２０２ｃＰであり、前者は後者の約３．３倍程度の濃 さである。アルギン酸塩がゲル化を開始するとき、その粘度は急激に増加し、２ 分以内で１１００ｃＰから３０，０００ｃＰまでとなる非常に高い値（図１）に 達する。ゲル化後、ＣａＣｌ₂／ＣａＳＯ₄試料の粘度は、ＣａＳＯ₄単独試料の 約２倍である(約４０，０００ｃＰ対２０，０００ｃＰ)。 両配合物のゲル化は体温で促進される。ＣａＣｌ₂／ＣａＳＯ₄試料は４分でゲ ル化を開始し、ＣａＳＯ₄単独試料は１３分でゲル化を開始する。ゲル化前の粘 度は、３７℃でＣａＣｌ₂／ＣａＳＯ₄試料およびＣａＳＯ₄単独試料についてそ れぞれ約５２０ｃＰおよび１３５ｃＰである。ゲル化後、ＣａＣｌ₂／ＣａＳＯ₄ 試料の粘度は１６，６００ｃｐに達することができ、ＣａＳＯ₄単独配合物の粘 度より も約１０倍高く(図２)、ＣａＣｌ₂およびＣａＳＯ₄の混合はより強力なゲルを生 成させ、移植用途により良好な組織分離を可能にすることができる。 ゲル化はより低い温度で非常に遅延する。同様に、ＣａＣｌ₂／ＣａＳＯ₄試料 は、５℃のすべての時点においてＣａＳＯ₄単独よりも一層粘度が高い。 ＣａＳＯ₄単独の配合物に比較して、ＣａＣｌ₂およびＣａＳＯ₄の混合物を使 用して、１）３〜４倍より高い最初の粘度；２）注入可能なコンシステンシーに 到達するのにより短い時間；３）ゲル化後より高い粘度を与え、したがって、よ り良好な組織分離を与える。 実施例６ 組織適応性および注入性特性を有するアルギン酸塩ゲルの組成物を示 すために行われた実験 下の表４に列挙した成分を含有する組成物を調製した。この組成物の粘度は混 合直後約１０００Ｃｐだった。混合後約１５分でゲル化が起こり、無傷であるが 弱い架橋ゲルを生成した(モジュラス＝６．５９ｋｇｆ／ｃｍ²)。２２ゲージ針 を通して注入するとき、ゲルは不規則形態片（「クランブル」）に破砕され、ゲル 強度の減少をもたらす(モジュラス＝０．２３１ｋｇｆ／ｃｍ²)。 この物質を正常マウスの皮下部に注入し、６ヶ月間移植組織をモニターした。 移植組織の組織学的評価をすると、５０ミクロン〜５００ミクロンの範囲の寸法 のクランブルを観察した。移植組織の最初の体積は６ヶ月間持続した。経時の組 織学的評価はクランブルを包む宿主から緩い結合組織を示し、皮下部に本明細書 に記載した組成物のアルギン酸塩ゲルの注入は注入したゲルフラグメント中また はその周りの緩い結合組織の湿潤を促進させることを示す。このゲルは繊維形成 応答の特性を示し、この応答により、結合組織は究極的にゲル物質の注入で形成 された量のうち相当割合を占める。 理解を明確にするために、本発明を、具体的な実施態様に関連させて例証およ び実施例により、ある程度詳細に記載したが、その他の態様、利点および修正は 本発明に関連する技術分野の当業者に明かであろう。前述の記載および実施例は 例証することを目的としており、本発明を制限するものではない。本発明を実施 するための上述の態様の修正は、医学、形成外科、組織培養および／または関連 分野の熟達者に明かであり、それもまた本発明の範囲内であるものとし、この範 囲は請求の範囲にのみ制限される。 本明細書に挙げたすべての刊行物、特許出願は本発明に関連する業界の熟達者 の水準を示すものである。すべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物ま たは特許出願を具体的におよび個別に参照として含めると本明細書中に記載した 場合と同一の程度を限度として、参照として本明細書に含める。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION       Improved hydrogel for tissue processing   This application discloses U.S. Ser. Nos. 08 / 762,733; 60 / 051,084; No. 60 / 059,558, each of which is expressly incorporated herein by reference. It is incorporated for consideration. Background of the Invention Field of the invention   The present invention provides cells and / or hydrogels for the creation of new tissues in vivo. It is directed to a method of implanting a suspension of gel particles. Examination of related technologies   Contour abnormalities, whether malformed, congenital or aesthetic, have recently been corrected. Requires invasive surgical techniques to be correct. In addition, shape variations that require additives It often requires a foreign body forming prosthesis that has infection and ejection problems. Tef as lon® paste is used (vesicoureteral reflux, vocal cord paralysis) Collagen has been used to create tissue bulk in certain applications. (Eg, endogenous sphincter deletion incontinence: Intrinsic Sphinct er Definition used to straighten the Inclusion However, collagen rapidly (6-12) in vivo. Mon) has been shown to degrade and requires multiple treatments to retain bulk Therefore, it is satisfactory, for example, for correcting skull and facial malformations. Absent. Alginate in other formulations also degrades in the body in just a few months It is shown to be. The Teflon paste particles are It has been shown to selectively migrate to the brain.   Tissue processing techniques using biocompatible polymer scaffolds recently used for craniofacial surgery Replacements for used prosthetic materials and replace diseased, defective, or injured tissue Has been sought as a means of creating the formation of organ equivalents. Tissue processing Is a new tissue morphogenesis from constructs made from isolated cells and biocompatible polymers Is included. Cells are joined to a polymer matrix to form a cartilage structure Can be implanted. This is described in US Pat. No. 5,041 to Vacanti et al. 138, the matrix is shaped prior to implantation and Anatomical structure, and surgically implanting the shaped matrix Is achieved.   Additional autogenous cartilage or bone to the craniofacial skeleton at specific sites and controlled sizes An easy way to reduce surgical trauma, allograft or xenoplasty prostheses Will eliminate the need for If it is transferred to the desired site by injection or simple application If it can be planted and a large number of isolated cells can be joined, The craniofacial cartilage skeleton could be increased without extensive surgery. Furthermore, isolated cells Successful transplantation will create the potential for increased tissue culture of the cells. Summary of the Invention   An object of the present invention is to allow injection into a surgical site, but after injection the desired shape Is to provide a composition that accepts and maintains In particular, one object of the invention is At the time of infusion, with a consistency similar to POLYTEF® Implantable, retaining its consistency long enough to allow proper application To provide an active composition.   Do not migrate from the desired site, maintain its shape against gravity, and Implants that can be applied to a specific area by several means, including pumping through It is another object of the present invention to provide These and other objectives are: May be suitable for one or more of the embodiments.   In one aspect, the present invention relates to a biocompatible polymer that forms a stable partially cured hydrogel. A composition for injection into an animal, comprising a mer. Used for injection into animals When done, the composition is preferably formed into blocks in vitro A paste that resists flow, sometimes under a force equal to gravity. Typically, injectable Active pastes have irregular linear dimensions in the range of 30 microns to 500 microns. Suspension made mainly from regular shaped hydrogel particles, its injectable paste Is at least 0.1 kgf / cm^TwoHydrogel in the particles has a gel strength of At least 3kgf / cm^TwoIt has a gel strength of Such compositions are fragile Make a drogel and pass the hydrogel through an orifice to break the hydrogel To form irregular shaped particles; the resulting composition (particles Contains sufficient consistency to separate the tissue planes in the animal. Looks like a holding paste.   In a preferred embodiment, the biocompatible polymer in the composition of the present invention is alginate Salt, the composition further comprises a highly soluble salt of a polyvalent metal cation, Containing a slightly soluble salt of Both highly soluble and weakly soluble salts are calcium salts. May be. Alternatively, the highly soluble salt is a calcium salt, and the weakly soluble salt is copper or calcium. Aluminum, magnesium, strontium, barium, tin, and zinc, A cation selected from the group consisting of tri- or tetra-functional organic cations; Selected from the group consisting of low molecular weight dicarbonate ions, sulfates and carbonates. And an anion of choice. In a particularly preferred embodiment, the poorly soluble salt is , Calcium chloride, the mixture is calcium chloride / calcium sulfate by weight It is contained in a ratio of 0.001 to 100, more preferably 0.0075 to 1.0. Preferably, the composition comprises at least 0.5% alginate by weight, and Contains at least about 0.001 g of calcium chloride per gram of alginate . In another preferred embodiment, the composition further comprises binding of calcium ions. Containing a sequestering agent that competes with alginate for the sequestering agent May contain a phosphate anion.   Optionally, the injectable of the present invention comprising a biocompatible polymer forming a hydrogel The composition forms chondrocytes and other cells forming cartilage tissue, osteoblasts and bone. Live cells such as other cells, muscle cells, fibroblasts and organ cells May also be included. Typically, the cells will be dissociated cells and / or cell aggregates. U.   In another aspect, the invention provides a kit for use in the method, which comprises: , A biocompatible polymer capable of forming a hydrogel (or the polymer is a ready-made weak It may be provided in the form of a well-crosslinked hydrogel. ) And hydrogels thereof Orifice that is forced through, thereby breaking the weakly crosslinked hydrogel (Typically, the orifice will be a needle or cannula.) . In one embodiment, the invention is suitable for injection into an animal, To prepare partially cured hydrogels that will cure sufficiently in vo (in vivo) A kit for (1) forming a hydrogel when cross-linking with a polyvalent cation. Biocompatible polymers, (2) highly soluble salts of polyvalent cations, and (3) Contains weakly soluble salts of valent cations. In a preferred embodiment, the kit comprises (1) Forming a hydrogel when cross-linked by divalent cations, preferably A polymer, (2) a sufficiently soluble salt containing a divalent metal cation, Preferably, calcium chloride, and (3) copper, calcium, aluminum, magne Cium, strontium, barium, tin, and di-, tri- or tetra-functional A cation selected from the group consisting of reactive organic cations, and a low-molecular-weight dicarboxylic acid, Anions selected from the group consisting of sulfate ions and carbonate ions And preferably a weakly soluble salt having calcium sulfate. This kit is When the components are combined, optionally including mammalian cells, Within 30 minutes, suitable for injection, 1.5% concentration of polymer, 1.5 m has a sufficiently soluble salt at a concentration of g / L and a weakly soluble salt at a concentration of 15 mg / L Partial cure costs are given to form a dew gel, and Hydrogels undergo no change in viscosity for at least 4 hours.   The components of the kit may be in separate containers, or may contain two or more The components may be combined in a kit. Optionally, raw polymer and at least The other salt may be in the form of a powder, and in a preferred embodiment, the biocompatible polymer Manure and salt powder are combined in one container. More preferably, weak dissolution Both the soluble salt and the biocompatible polymer are powders and are combined in one container. Another In embodiments, the kit competes with alginate for binding of calcium ions A sequestering agent, which can be placed in a separate container, or May be combined with further components.   In yet another aspect, the invention provides a method for treating structural defects in an animal as needed for its treatment. A method of treating, comprising implanting a composition according to the present invention into an animal at the site of a defect. Consists of In one aspect, a structural defect in an animal is treated as needed for its treatment. The method of treatment is (1) a partially effected biodegradable, biocompatible hydrogel, Preparing a partially cured hydrogel, optionally containing live cells, and (2) pressing the hydrogel under pressure Break it down through the orifice to create a suspension containing hydrogel particles, And (3) transplanting the suspension into an animal at the site of the defect. After implantation, the hydrogel surrounds the tissue and vascularizes the implant, resulting in a fibrous form. A therapeutic method for eliciting an adult response is provided. Alternatively, structural defects in the animal The method of treating as needed for the treatment includes (1) biopolymer or modified bio A biocompatible hydrogel consisting of a polymer and optionally containing living cells is prepared, and (2) the biocompatible hydrogel is prepared. Enough hydrogel through the orifice under pressure to separate the tissue planes. A flowable composition having good consistency and (3) its flowability composition Implanting the object into the animal at the site of the defect.   In another aspect, the invention provides for the treatment of structural defects in an animal as needed for its treatment. Preparing a partially cured biocompatible hydrogel particle suspension, comprising: And implanting the hydrogel suspension into the animal at the site of the defect. Hydrogels are intact but weakly cross-linked gels (eg, Strength = 6.59 kgf / cm^Two), It is 22-gauge or new When injected at a rate of 10 ml / min through the gel, resulting in a decrease in gel strength ( For example, gel strength = 0.231 kgf / cm^Two) The above method is provided. This way The composition used at room temperature is partially cured at room temperature, which is suitable for injection into animals. It forms drogels and, after injection, hardens completely in vivo.   In a preferred embodiment, the invention is in the form of calcium chloride, Preferably, in about 15 minutes, the biocompatible anionic polymer (eg, alginate) Easy to obtain, at a concentration sufficient to initiate and partially crosslink To provide a cation source for cross-linking. More preferably, the alginate is present in the formulation Is present in an amount sufficient to introduce into the loosely cross-linked gel (reference Typically, more than about 0.5% of alginate is contained in such injectable cell suspensions. Present in suspensions). Such formulations are quick to use for immediate use in the operating room To Solidifies, but is good "injectable" over a long period of time to allow the procedure to be completed "Maintain consistency. Preferably, the partially crosslinked hydrogel is 24 Maintain this consistency over time. Still more preferably, Tensii allows the hydrogel to be prepared in a partially crosslinked state and marketed Relatively stable for a sufficient amount of time to function. Generally, injected The resulting suspension will break up the tissue more easily when injected and undergo extravasation from the injection site. It has a dense consistency that is less susceptible to cracking.   In a preferred embodiment, the present invention addresses (anatomical) structural defects in animals. At the site of the defect, typically at the site of When cross-linked by polyvalent ions in the form of salts and weakly soluble salts of polyvalent ions A suspension containing a biodegradable, biocompatible polymer that forms a hydrogel, To provide a method of treating by transplanting the ingredients, The mixture forms a partially cured, injectable hydrogel where the partially cured hydrogel is formed. Form an implant of the desired size and shape in situ, and after implantation, The animal cells enter the hydrogel implant and maintain the A fibrous cell mass having substantially the same shape as the gel is formed. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 shows calcium sulfate powder and calcium chloride / calcium sulfate, respectively. Figure 4 shows the time course of gel formation at 25 ° C for cross-linked alginate.   FIG. 2 shows calcium sulfate powder and calcium chloride / calcium sulfate, respectively. Figure 3 shows the time course of gel formation at 37 ° C for cross-linked alginate.   FIG. 3 shows calcium sulfate powder and calcium chloride / calcium sulfate, respectively. Figure 3 shows the time course of gel formation at 5 ° C for cross-linked alginate. Detailed description of the invention   The present invention provides improved compositions that can be implanted into animals in tissue processing applications. Also provided are methods of implanting such compositions into animals by injection. Departure The bright compositions comprise a biocompatible polymer in the form of a hydrogel. The composition of the present invention comprises: It can be used without adding live cells to the material to be transplanted, in which case the transplant In the meantime, cells that have previously invaded the cells of the surrounding tissue and have the shape of the first implant A cell mass, or a live cell is included in the composition, whereby the composition Can introduce another type of cell into the implanted area by injection.   A specific embodiment of the present invention provides for the formation of a long-lasting tissue-like bulk in an animal. And the tissue-like substance may mimic the properties of certain soft tissues. Book The compositions described for the invention may be used in tissues resulting from injury, surgery, or inherited malformations. A persistent bulkin that lasts for a period sufficient to make a practical correction of voids Can be injected to form a bulk material. The composition may be applied by incision or injection. , Then can be shaped after application. The injected material messed with the shape, followed by fiber cells Proliferation and loose connective tissue invasion to correct for existing voids and hydrogels Make organised tissue to hold it where it was placed in the infusion. Applied game Material is invaded by loose connective tissue to maintain the desired volume and shape . This introduced substance and the resulting fiber influx is long lasting in vivo .   The gel according to the invention has the property of stimulating a fibrotic response. Explained here Injection of the alginate gel into the subcutaneous area should be within or Facilitates infiltration of loose connective tissue into the perimeter. Through this response, connective tissue eventually Will account for a significant proportion of the bulk created by the injection of the gel material. Suitable compositions according to the present invention are biocompatible polymers, typically in the form of hydrogels. Injectable paste containing irregularly shaped particles. The suspension is injected Enough tissue to separate the tissue at the time of Maintains tensi (viscosity). The properties of the gel suspension that stimulate the fibrogenic response include: The particle size is included and the hydrogel properties of the particles are It is important for both fixation of the implant in position.   Preferably, the compositions of the present invention appear to be thixotropic. Paraphrase If the hydrogel is partially cured (weakly cross-linked), Resists deformation to a certain point; however, as the force increases, the composition exhibits fluid behavior You. In a preferred embodiment, a brittle hydrogel is made, for example, By forcing through orifices of various dimensions, destroying Form particles of shape. The resulting suspension of hydrogel forms its shape against gravity. Will hold. Suspensions stack and maintain the same shape without other support Mound can be formed. The resulting paste block or mau Is similar to a block of toothpaste, but has a slight rounded edge. Only can happen.   Preferably, the hydrogel of the present invention is an orifice such as a needle or cannula. It is a fragile substance that breaks down when forced through a disk. Hardened hydrogel con The stability can be changed by changing the conditions. For example, large calcium The concentration of ON increases the degree of alginate cross-linking, and higher temperatures Increases ICS® hydrogels and other cross-links. Once it is Upon curing, the partially cured hydrogels according to the invention are stable and have at least two hours. Duration, more preferably at least 24 hours, and often on the order of weeks Has its shape against forces equal to or less than the effect of gravity. Destruction The resulting hydrogel has a size that is a function of the orifice size and pressure, It is a suspension of regularly shaped particles. Typically, the dimensions are between 30 μm and 50 μm, Preferably it is in the range of 40 μm to 300 μm. Appropriate orifice size and note The entry pressure can be determined by one skilled in the art; effective particle sizes are described in Example 6. By monitoring the fiber formation response as described above.   The hydrogel is cured in the barrel of the syringe and then pressurized on the syringe plunger. The action pushes the composition out of the syringe. In a typical formulation, the composition is injected into a syringe Push out. In a typical formulation, the composition is partially cured and then It is forced through the cannula of the gauge at a rate of 10 ml / min as a high viscosity fluid. There is no severe damage to the cells that can be included in the composition. In an appropriate formulation, After passing through the neurite, the composition is applied to a POLYTEF® paste It has stiffness. For example, the composition has 15,000 cPs at 25 ° C. A 22 gauge crab is a paste of measured viscosity, and when the composition contains cells. Extrusion of the composition at a rate of 10 ml / min. Does not break (ie, cell viability is reduced by more than 25%).   Cell persistence and viability of the implants after injection and fibrosis reactions were assessed by scanning electron microscopy. , Histology, and quantitative analysis on radioisotopes. Cellular Function can be measured by a combination of the techniques and function measurements described above. Signs Studies using Lucose, as well as studies using protein assays, Can be performed to quantify the cell mass on the bone skeleton. Study of these cell masses Is associated with a cell function test to determine which cell mass is appropriate. Can be opened. In the case of chondrocytes, the function is appropriate for surrounding connected cells. Cartilage matrix components that can provide the proper support (eg, proteoglycans, Lagens).   The biopolymer-containing composition of the present invention can also be used as an aqueous suspension of hydrogel particles. Prepared in form. Generally, the hydrogel compositions of the present invention comprise an aqueous medium, One or more pharmaceutically acceptable salts and optionally other ingredients It is common to include For example, when the biopolymer is alginate, Drogels use a solution of alginate (eg, soluble sodium alginate) Sufficient to initiate alginate cross-linking to form partially cured hydrogels It is made by mixing a small amount with a solution containing polyvalent ions. Salt amount and weight Although the type can vary, usually the solutes and solute concentrations are determined when the composition is injected into animal tissue. Are selected to avoid excessive stress on animals when they are taken. Hydrogel is thin When also containing cells, the other components of the composition are compatible with living cells and are Alternatively, the composition comprises factors that are beneficial for cell growth and maintenance. polymer   The polymeric material used in the implant according to the invention must form a hydrogel. Must. Hydrogels are shared by organic polymers (natural or synthetic), ionic Or three-dimensional cross-linking via hydrogen bonding to capture water molecules and form a gel It is defined as a substance that can be created when creating an open lattice structure. To form a hydrogel Examples of materials that can be used for polysaccharides such as alginate, carrageenan, Polyphosphazines, and polyacrylates which are ionically cross-linked, or Pluronics (registered Trademark) or Tetronics® polyethylene oxide-polypropylene Block copolymers such as pyrene glycol block copolymers are included.   Generally, these polymers are used in water, buffered saline or aqueous alcohol solutions. At least partially soluble in such aqueous solutions, and the polymer is charged. Or a monovalent ionic salt thereof. Acidic side chains that can react with cations Examples of polymers having the following are poly (phosphazene), poly (acrylic acid), poly (methacrylate). Lylic acid), copolymers of acrylic acid and methacrylic acid, poly (vinyl acetate) and Sulfonated polymers such as sulfonated polystyrene are included. Acrylic or Is obtained by the reaction of methacrylic acid and vinyl ether monomer or polymer Copolymers having acidic side chains can also be used. Examples of acidic groups include carboxylic acid groups, sulfo groups Phonic acid group, halogenated (preferably fluorinated) alcohol group, phenolic O H group and acidic OH group.   An example of a polymer having a basic side chain that can react with anions is polyvinylamine , Polyvinyl pyridine, polyvinyl imidazoline and some imino substituted poly Phosphazine. The ammonium or quaternary salt of the polymer may also be a main chain nitrogen or It can be formed from pendant imino groups.   Polyphosphazene separated by alternating single and double bonds It is a polymer having a main chain composed of nitrogen and phosphorus. Each phosphorus atom has two Is covalently linked to the side chain ("R"). The repeating unit in polyphosphazene is Having the general formula (I):     Here, n is an integer.   Suitable polyphosphazenes for cross-linking are acidic, di- or trivalent cations. It has multiple side chains that can form salt bridges with the ON. An example of a preferred acidic side chain is carbo An acid group and a sulfonic acid group. The hydrolytically stable polyphosphazene is Ca²⁺ Or Al³⁺Carboxylic acids cross-linked by divalent or trivalent cations such as It is formed from monomers having groups. Imidazole, amino acid ester or Decomposition by hydrolysis by introducing a monomer having a recall side group A polymer can be synthesized. For example, polyanionic [bis (carboxyl Noxy)] phosphazene (PCPP), which can be synthesized at room temperature or Is Below this, the hydrogen is crosslinked with dissolved polyvalent cations in an aqueous medium Make a matrix. Biodegradable polyphosphazenes have two different types of side chains That is, an acidic side chain capable of forming a salt bridge with a polyvalent cation, and an in vivo condition. Hydrolyzing side groups such as imidazole groups, amino acid esters, glycerol And glucosyl. The term biodegradable as used herein refers to the desired application (eg, Usually in in vivo treatments), p once having a temperature of about 25 ° -38 ° C. Dissolves or decomposes for an acceptable period of time when exposed to physiological solutions of H6-8 Less than about 5 years, most preferably less than about 1 year, Means a polymer that degrades. Side chain hydrolysis results in polymer breakdown. Examples of hydrolysable side chains are unsubstituted or substituted imidizole and amino acid esters Wherein the group is attached to the phosphorus atom via an amino bond (both R groups are Polyphosphazene polymer). Polyimidazole phos For phazenes, some of the R groups on the polyphosphazene backbone are ring nitrogen atoms. Is an imidazole ring bonded to phosphorus in the main chain via Other R groups are Organic residues that do not participate in water splitting, methylphenoxy groups, or AllcockMacromolecules 10: 824-830 (1977) It is like the other groups described. Different types of polyphosphases Synthesizing and analyzing methods are described in Allcock H. et al. R. Etc.Inorg. Chem . 11, 2548 (1972);Macromolecule s 16, 715 (1983); Allcock et al.Macromolecules 19, 1508 (1986); Allcock et al.Biomaterials, 19,500 (1988);Macromolecules, 21, 1980 (1988);Inorcr. Chem. 21 (2), 515521 (1982);Macromolecu les 22,75 (1989); U.S. Patent No. 4,440,921 to Allcock et al. US Pat. No. 4,495,174 and 4,880,622; Magill et al. 946, 938; and Grolleman et al.Controlled Re lease   3,143 (1986), the teachings of which are incorporated by reference. As specifically introduced here.   Methods for synthesizing these other polymers are known to those skilled in the art. For example,Con cise Encyclopedia of Polymer Science as well asPolymeric Amines and Ammonium Salt s, E. Edited by Goethals (Pergamen Press, Elmsfo rd, NY 1980). Many polymers, such as poly (acrylic acid), are Sold.   A water-soluble polymer having a charged side chain is referred to as an oppositely charged multivalent polymer. The polymer is cross-linked by reacting with an aqueous solution containing ions, and the polymer becomes acidic. If it has a chain, it is a polyvalent cation or if the polymer has a basic side chain. For example, a polyvalent anion is used. Polymers having acidic side chains to form hydrogels Preferred cations for the cross-linking of metals include copper, calcium, aluminum, Divalent and trivalent cations such as gnesium, strontium, barium and tin And an alkyl ammonium salt such as R_ThreeN⁺−V V V−⁺NR_Threelike Di-, tri- or tetra-functional cations can also be used. Of these anions The aqueous solution is added to the polymer to form a soft, highly swollen hydrogel and Form a film. The higher the cation concentration or the higher the valency, the more poly The degree of crosslinking of the mer increases. At low concentrations, such as 0.005M, polymer It was found to be bridged.   Preferred anions for crosslinking the polymer to form a hydrogel are , Low molecular weight dicarboxylic acids such as terephthalic acid, sulfate ions, Is a metal ion. An aqueous solution of these anion salts is added to the polymer Forms soft, highly swollen hydrogels and membranes, as in the case of cations You. The biocompatible polymer and crosslinking agent are dissolved in any physiologically compatible solvent. I can figure it out. For example, the common medium M-119 is used here as a representative solvent.   Various polycations are complexed with a polymer hydrogel and stabilized to form a semipermeable surface. Can be used to make a membrane. Has a preferred molecular weight of 3,000-100,000 Polymers with basic reactive groups such as amines and imines that can be used Examples are polyethyleneimine and polylysine. These are commercially available Have been. One polycation is poly (L-lysine), a synthetic polyamide. Examples of poly (ethylene imine) are poly (vinylamine) and poly (allylamine). ). There are also natural polycations such as polysaccharides and chitosan.   Can be used to react with basic surface groups on polymer hydrogels to form semipermeable membranes Polyanions that can be used include acrylic acid, methacrylic acid, and acrylic acid. Derivatives of polymers and copolymers, pendants such as sulfonated polystyrene SO_ThreePolymers having H groups and polystyrenes having carboxylic acid groups You.   Polymers contemplated for use in the implants of the present invention include those described herein. Forms hydrogels that are viscoelastic similar to the hydrogels used under appropriate conditions Includes other natural, synthetic or modified biopolymers. Suitable biopolymer For example, modified alginates and other biomass (e.g., See, for example, Putnam AJ; Mooney DJ (1996) "Tissue en ginering using synthetic extracella r materials ", Nature Medicine, 2 (7); 824- 826, (1996); Mooney, D .; J. (1996), "Tissue e ngineering with biodegradable polymer r matrixes ", Bajpai, Praphrula K (Ed), Pr oc. South. Biomed. Eng. Conf., 15th, IEEE, NY, 1996; H. And D. J. Mooney ”Synt hesis and properties of biodegradable e-polymers used as synthetic matrix s for tissue engineering "Editing Atala etc." S Synthetic Biopolymer Scaffolds (Tissue   Engineering), Birkhauser, 1997, ISBN; 0 817639195).   Alginate biopolymer composition   In a preferred embodiment, the method of the present invention provides Forming a hydrogel by cross-linking by Soluble cations form cross-links, with effective utilization controlled by dissolving weakly soluble salts Therefore, the soluble cations are replenished as they are absorbed. Polyvalent Some of the thione is provided by a sufficiently soluble salt and is freely available (fast crosslinking Ions), while the multivalent cations required for complete cross-linking are weakly soluble salts (slow Bridge ion). In the following description, alginate is optional Of suitable polymers.   For use with the preferred polymer (alginate), preferred polyvalent ions are , Calcium.   In a representative example, the biocompatible acidic biopolymer alginate is used in small quantities of sufficient alginate. Cross-linked by soluble calcium chloride and large amounts of weakly soluble calcium sulfate You. The composition from which the hydrogel is formed contains a relatively high concentration of phosphate ions and is Buffers the soluble calcium ion concentration and prevents complete cross-linking of alginate. set When the product is injected at the desired site, phosphate ions diffuse into the surrounding biological fluids. And the concentration of soluble calcium ions increases locally . As the concentration of soluble calcium ions increases, additional in alginate The calcium provides the crosslinking and the hydrogel hardens.   Alginate is polymannuronate and polyguluronate selected from seaweed Is a union of stretch. Suitable alginates are commercially available. Individual a Luginate preparation is measured as a function of mannuronate: gluronate (MIG) ratio Has a possible binding calcium capacity. Resulting from a change in the ratio of M and G residues The effect is described in U.S. Pat. No. 4,352,883, which is used for reference. Introduce here. Suitable highly purified alginate has an M / G ratio of 35/65.   Alginate is ionically crosslinked by divalent ions in water at room temperature Is done. For such mild conditions, see, for example, Lim U.S. Pat. Most commonly used for hybridoma cell encapsulation as described in US Pat. It is a polymer used for.   Cell / polymer systems in hydrogel form are used for tissue processing (engineering). Used, for example, calcium ions added to initiate hydrogel formation There are cell suspensions such as chondrocytes in alginate solutions. Of these systems Typically, a chondrocyte / calcium alginate solution is used to isolate the isolated cell suspension. Sodium alginate solution (eg, 0.1M K_TwoHPO_ThreeInside, 0.135M NaCl, pH 7.4) and mix in a 1.0% alginate solution.⁶Fine Generate a cell density of vesicles / mL. Use chondrocyte-sodium alginate suspension Store on ice at 4 ° C until use and cold chondrocyte-alginate solution 1 before injection 0.2 g of sterile CaSO per mL_FourAdd powder.   To avoid the need to heat the mixture and add a filter to the syringe Inventors Develop New Formulation for Injectable Hydrogels Used in Tissue Processing did. This formulation provides rapid gel formation and long injectability of the gel suspension. Provides more consistent performance.   Calcium sulfate dihydrate (CaSO4) in cold and hot water (100 ° C)_Four・ 2H_TwoO ) Are 2.41 and 2.22 mg / mL, respectively.   Calcium chloride is one of the fast-acting alginate gels because of its high solubility. "Ca⁺²Other calcium salts of similar solubility will work as well. Depending on the concentration of formate and the desired gel strength, CaCl_TwoIs 0.5mg / mL Can be in the range of 3.0 mg / mL. Typical sodium alginate and stoichiometry CaSO required to react_Four・ 2H_TwoThe amount of O is equivalent to mg of alginate. 0.309 mg.   A ratio that yields a homogeneous gel of acceptable consistency in the time required is preferred. New   The present invention is directed to biodegradable, biocompatible polymers that form hydrogels upon crosslinking. Formally, a composition comprising an alginate for implantation into an animal is provided. Favorable condition In some embodiments, the polymer is soluble in polyvalent ions, more preferably polyvalent ions. Crosslinked by salts and weakly soluble salts of polyvalent ions, these components are brought together Resulting in a mixture that forms a partially cured injectable hydrogel, The consistency of the product is that the partially cured, injectable mixture is implanted into the animal. Where the implanted, partially cured hydrogel is fully cured in situ Form a hydrogel. Preferably, the mixture is for binding of multivalent crosslinking ions. A sequestering agent that competes with the biocompatible polymer. Cell source   The compositions of the present invention may be used for efficient migration of large numbers of cells, and for new tissues or tissues. Gene modification within a three-dimensional framework to promote graft conjugation for the purpose of creating equivalents It can be used to give multiple cell types, including further cells. It is a new organization or By eliminating the host immune system while the tissue equivalent is growing, It can also be used for immunoprotection.   Examples of cells that can be implanted as described herein include chondrocytes and cartilage Other cells forming cells, osteoblasts and other cells forming osteoblasts, Includes muscle cells, fibroblasts, and organ cells, as well as isolated stem cell extensions It is. Organ cells include hepatocytes, islet cells, intestinal cells, cells derived from the kidney, And other cells whose primary function is to synthesize, secrete or metabolize substances. Included.   Cells to be included in the injectable hydrogel are directly from the donor and from the donor. Or from an established cell culture line. Preferred In another embodiment, the cells are obtained directly from the donor, washed, and combined with the polymeric material. It is directly transplanted together. Cellular material can be either dissociated single cells or clumped tissue Cell mass) or cell aggregates generated in vitro from dissociated cells. Good. Cells can be cultured by methods known to those skilled in tissue culture.   Cell persistence and viability after injection was determined by scanning electron microscopy, histology, and radioeye It can be measured by quantitative analysis on a sotope. The function of the transplanted cells depends on the techniques described above and It can be measured by a combination of function measurements. For example, in the case of hepatocytes, This can be accomplished by placing a cannula within the patient's common bile duct. it can. Thereby, bile can be collected little by little. Bile pigment is basic tetrapyro By high pressure liquid chromatography to observe Diazotized azodipyrrole ethyl anth with or without treatment with nidase Thin layer chromatography after conversion to asodipyrroles by reaction with lanylate. Can be analyzed by fee. Diconjugated or monoconjugated Lilvin also binds biliary Can be measured by thin-layer chromatography after alkaline methanolysis of juice pigment. You. In general, as the number of functional transplanted hepatocytes increases, Bin levels increase. A simple liver function test is performed on blood samples. Items such as min production can be performed.   Similar organ function tests can be performed by one of ordinary skill in the art to determine the extent of cell function after transplantation. It can be performed by a known technique. For example, islet cells of the pancreas can be used to cure diabetes. Transplant hepatocytes to achieve glucose regulation by proper secretion of surin Can be distributed in a manner similar to that used specifically for Transfer other endocrine tissues Can be planted. Research using labeled glucose and research using protein analysis The assay can be used to quantify cell mass on a polymer scaffold. These cell masses Research will work with cell function research to determine which is the appropriate cell mass. Can be related. Mixed protocol   A component that reacts to form a hydrogel having a partially cured consistency The order of addition for can vary widely. Typically, optionally a metal ion seal Alginates containing chain anions can be combined with a cation source in one or more stages. Mixed. Generally, mixing with a biodegradable liquid polymer such as the following polyvalent ionic salts: Alginate, sometimes designed to set at a controlled rate, is used. Changes in the concentrations of the individual components and the conditions of the mixed incubations were: (a) To control the consistency of the material, reach (b) injectable consistency To control the time required to produce, and (c) appropriate texture and dimensions Control the properties of end-cells in vivo to meet the specific requirements of the recipient tissue for retention Can be modified to control.   The concentrations of the individual components, alone or in combination, both before and after application of the formulation Various properties have been modified to (a) for injection and application; (b) good bonding of implants And to create the required properties and functions of the final gel and exchanged tissue, or ( c) to meet specific requirements for the manufacture, dispensing and patient application of the formulation Can be. For example, packed tissue (eg muscle, Injection of the hydrogel formulation (subcutaneously) requires high viscosity to prevent material spillage I do. Changing the viscosity can be achieved by (1) selecting the viscosity of the raw material (eg, low, medium or high viscosity Luginate), (2) gel concentration (eg, to achieve a wide range of gel viscosities) A range of 0.3% to 3.0% alginate can be used. ), (3) Partial crosslinking The amount of polyvalent source to control the strength, or (4) for cation binding Many mechanisms, such as the anion concentration given to compete with alginate, , Alone or in combination. Transplantation with various cell types The good penetration of, or the properties of the desired replacement tissue to be created, depend on the formulation components Need change. For example, the creation of hard, compact tissues (eg, liver, cartilage) Higher polymer chain lengths or concentrations (eg> 1.5% alginate and / or High glulon content alginate).   Control of the injectable time and the properties of the formulation prior to infusion is important for the manufacture of therapeutics , Aid in distribution and application. Final compound processing time or pourable consis The time required to consolidate the platform to tensiy can be Provided for the amount of highly soluble cations and / or cation binding competition It can be controlled by the concentration of the anion, and further by adjusting the concentration. For example, injection The possible consistency time depends on the temperature and the processing time of several minutes (34-38). ℃) or one month or more (4-8 ℃). Temperature is in gel form It plays a very important role in the growth rate. When the temperature is increased, for example, 37 Increasing the temperature, as happens when injecting material into tissue at a temperature of ° C, causes the material to The curing proceeds to a fully crosslinked hydrogel. 0 as shown in Example 1 . 1x CaSO_Four・ 2H_TwoAt the level of O (ie 2 in the blended batch) 0 mg / mL), the partially-cured gel sets at body temperature in 32 minutes, at least 90 minutes Injectable. CaSO at 37 ° C_FourIn the best case, injectable Needs too much time to reach tension and is more complicated than desired And is inconsistent with what is desired.   Cation sources can be selected to control gelation and gel properties, and Combinations can be used to control the solution. In accordance with the present invention, including rapid and delayed cross-linking sources The composition according to the present invention has a more rapid viscosity increase compared to a calcium sulfate-only formulation, And give longer time to complete crosslinking. In a particularly preferred embodiment, The mixture that forms the partially cured hydrogel will also contain significant amounts of phosphate anions . Typically, the phosphoric acid concentration will be about 0.1 molar.   Increasing the concentration of alginate will help the gel retain more water As a result, a thicker paste and a stronger gel are obtained, Accelerates growth. The preferred alginate level is the final cell that forms the hydrogel At least 0.75%, more preferably 1.5% to 2.5% in the containing suspension And up to 3.0%.   In a preferred embodiment of the invention, the acidic biopolymer is sodium alginate. Is a sufficiently soluble salt is calcium chloride, and a weakly soluble salt is calcium sulfate. Lucium. Alginate is at least 75% by weight of the solution, preferably about 1. Present in an amount of 5%. Free-soluble salts give 10-15 mM calcium ions On the other hand, a weakly soluble salt can be dissolved in an alginate solution if it is completely dissolved. It is provided in the form of a dispersed powder in an amount that provides 8 times the calcium ions. In other words, the two salts are supplied as divalent metal crosslinkers, ie 1 parts by weight to 10 parts by weight of two salts of calcium chloride and calcium sulfate Given by In a preferred method of making a hydrogel suspension, 2% aqueous 9 parts of the alginate solution is mixed with 2 parts of a suitable cell suspension medium such as M-199. 18% sulfuric acid in the same cell suspension medium containing 1.8% anhydrous calcium chloride. It is mixed with one part of a suspension of calcium acid. The final mixture is well mixed, Used for injection into tissue. Rapid increase in viscosity mixes all components together Expected to occur within 15 minutes. The consistency of this mixture is It should be sufficient that the formation of the object is held against gravity, but at least 24 hours will remain pourable at room temperature.   Preferred viscosities for injectable applications will vary depending on the intended use, (A) formulation container (eg syringe size, piston diameter, required for proper access) (B) the application device (length of catheter or needle) , Diameter, composition), (c) separation resistance of the recipient tissue and (d) required distribution type Species (eg, topical application to bone or organ surface, injection into tissue without draining, etc.) It is a balance of various parameters.   Within the contemplation of the present invention are kits used for preparing and injecting the compositions of the present invention. is there. Such kits contain the components of the composition in one or more containers. Prescription container (eg, mixing container or syringe) and / or gel breaking orifice (Eg, a cannula or needle).Example   In order to facilitate a more complete understanding of the present invention, some examples are set forth below. I However, the scope of the invention is not limited to the specific embodiments disclosed in these examples. Rather, these examples are for illustrative purposes only. Example 1 Effect of calcium sulfate concentration on gel time   This experiment involved varying the concentration of calcium sulfate in the absence of calcium chloride. The effect is shown. 0 ° C, 37 ° C and other contents of the formulation at room temperature (23 ° C) Was maintained unchanged, and the amount of calcium sulfate was adjusted to 0.02 g / mL (0.1 x) to 0.2 g / mL (1.0x). Sodium alginate (M / UP MVG grade with a G ratio of 35/65, manufactured by Pronova) with 0.79% salt 2% solution of 0.1 M phosphate buffer (pH = 7.4) containing sodium chloride Prepared as Dilute sodium alginate solution 1: 1 with M199 cell culture medium And add calcium sulfate powder in an amount ranging from 20 mg / mL to 200 mg / mL. Was. After mixing, the sample solution was cooled to ice bath temperature (0 ° C), room temperature (RT), or body temperature (37 ° C). C). Inject an aliquot of each sample onto the Mylar sheet. And periodically tested for gel formation.   Table A shows the results. Gel formation time (shown as X) and injection inhibition time (noted No. B) is also shown. As is evident from Table A, on an ice bath in the absence of added calcium chloride No gel formation was observed. At room temperature, gel formation occurs between 70-100 minutes Occurred and hydrogel injection was arrested within 20 minutes of that time. At 37 ° C, The first gelation occurs between 32 minutes and 16 minutes, depending on the concentration of calcium acid, Inhibition of the injection generally occurred within 15 minutes of the first gelation.   These experiments show that at 0 ° C. no gelling occurred until after 120 minutes (nc). And At room temperature, gelation starts in 90 minutes for 0.2x and reaches 1.0x Gelation started in 70 minutes. At body temperature, gel in 16 minutes for 1.0x formulation And the gelation time is almost linear with the decrease in calcium sulfate concentration. Decrease. At human body temperature, this calcium sulfate crosslinked hydrogel formulation But only a few minutes are allowed for infusion, plus Heating equipment and silicide to eliminate lot-to-lot variation in gelling and gelling properties It is necessary to add a filter to be attached to the syringe. With both of these requirements Can also add complexity to the clinical use of the formulation. Temperature plays a very important role in gel formation rate Play a part. From Table A, it can be seen that 0.1x, ie, 60 mg of C in the compounded batch. aSO_Four・ 2H_TwoAt the amount of O, gelation occurs within 32 minutes at body temperature, at least The injection was successful for 90 minutes. CaSO at 37 ° C_FourThis best case scenario for Much time is still required before the injection, more complex than the target and more That is, there is variation. Example 2 Mixture of calcium chloride and calcium sulfate   In a preferred formulation, sodium alginate is converted to K at pH 7.4._TwoHPO_FourIn buffer Dissolve. Feed cells in M199 medium and then suspend in alginate solution I let it. Store calcium sulfate powder in 1.5 ml vial. In M199 medium Dissolve calcium chloride at a concentration of 18 mg / mL and save in a separate vial. This In the application of_TwoThe solution is CaSO_FourMix with powder, then with alginate Mix, place in a syringe, wait about 15 minutes, and the formulation is ready to be injected. U.   In addition to mixing the tubes on a vortex, syringe mixing of this formulation is the same An experiment was also performed to show that the alloy exhibited the oxidation characteristics. Experiment adding chondrocytes to the formulation And it gelled successfully in 14 minutes at room temperature but for more than 2 hours Injectability was maintained. Later experiments showed that this formulation was allowed to It shows that the injectability of can be maintained. Table 2 lists the components of this formulation. Example 3 Effect of temperature on gel time   Of alginate when mixed with a calcium chloride / calcium sulfate mixture The time required for cooling varies depending on the temperature. Sodium alginate (UP MVG Grade, manufactured by Pronova) in 0.1 M containing 0.79% sodium chloride. It was prepared as a 2% solution of ruphosphate buffer (pH = 7.4). 2.25 ml The alginate solution was mixed with 0.5 ml of M199 cell culture medium. To this mixture , 18 mg calcium chloride / ml and 45 mg suspended calcium sulfate powder 0.25 ml of cell culture medium containing was added. After mixing, bring each sample to a predetermined temperature. And tested periodically for gel formation. Gel formation detected in two samples The time taken is shown in the attached table. Gel at room temperature (20-30 ° C) for 13-30 minutes Formed. At 37 ° C., gel formation took 7-8 minutes. Example 4 Formation of Injectable Alginate Gel   By slightly varying the concentration of the various components in the mixture, the time required for gel formation Sensitivity was tested as described below. Sodium alginate, calcium chloride And calcium sulfate solutions were prepared as described in Examples 1 and 2. Was. However, one or another component is changed to plus or minus up to 16% from the reference value. Moved. After mixing, the samples were kept at room temperature and tested periodically for gel formation.   Table 3 shows the gel formation time and the period for maintaining the consistency suitable for injection. Show. In the table, for the amount of each component, the reference value is M, and the value 16% higher than the reference value is M H and the value 16% lower than the reference value are indicated by L. Variation of these parameters Within, the gel time is 18 minutes plus or minus about 15% is within this range Indicates that the variation of a specific component is only slightly affected. All of these solutions Gelled within about 20 minutes, but consistency of alginate gel was 24 hours Beyond the later was still acceptable to inject. Prepared in a similar manner Samples of this formulation showed adequate injectable properties beyond one month after formulation. Example 5 CaSO_FourPowder CaCl_Two/ CaSO_FourComparison against mixtures   This experiment quantitatively characterizes the gel and gelation process of the two formulations and provided the final gel. This is performed to qualitatively determine the intensity of the file. Gelation and gelation during the above experiment The time required to perform was determined by visual observation. By using a viscometer, The change in viscosity when alginate starts to gel can be measured directly, and the relative strength of the gel can be measured. The degree can also be determined qualitatively.   CaSO_FourThe alginate gelled with the powder was prepared as described for Example 1. And CaCl 2_Two/ CaSO_FourArgi gelled with a mixture of The phosphate was prepared as described for Example 2. CaCl_Two/ CaSO_Four Samples were prepared by syringe mixing and CaSO_FourVortex mixing method for powder sample Prepared. Syringe mixing is easy to perform and very consistent. It is a very simple method to obtain a good product. It is an approved biomedicine The use of scientific instruments can also be used, and closed products that separate the product from exposure to the environment Build the stem. These two types at temperatures of 5 ° C, 25 ° C and 37 ° C The change in viscosity during the gelation process of the system was measured, and the results are plotted in FIGS. .   At room temperature, CaCl_Two/ CaSO_FourSample can be gelled and injected in 13 minutes Point (set point that can be injected: gel that can be stacked without collapsing) Of CaSO_FourSingle sample hardens to gel up to 56 minutes Did not convert. CaCl before gelation_Two/ CaSO_FourThe viscosity of the sample is about 665 cP , CaSO_FourThe single sample is 202 cP, and the former is about 3.3 times as concentrated as the latter. That's it. When the alginate begins to gel, its viscosity increases sharply, Very high values from 1100 cP to 30,000 cP within minutes (Figure 1) Reach. After gelation, CaCl_Two/ CaSO_FourThe viscosity of the sample was CaSO_FourSingle sample It is about twice (about 40,000 cP vs. 20,000 cP).   Gelation of both formulations is promoted at body temperature. CaCl_Two/ CaSO_FourSamples are taken in 4 minutes Start, CaSO_FourThe single sample starts to gel in 13 minutes. Viscosity before gelation The degree is CaCl at 37 ° C._Two/ CaSO_FourSample and CaSO_FourFor single samples They are about 520 cP and 135 cP, respectively. After gelation, CaCl_Two/ CaSO_Four The viscosity of the sample can reach 16,600 cp and CaSO_FourViscosity of a single compound Than degree Is about 10 times higher (FIG. 2)._TwoAnd CaSO_FourMixing produces a stronger gel And allows better tissue separation for transplantation applications.   Gelling is greatly delayed at lower temperatures. Similarly, CaCl_Two/ CaSO_Foursample Is CaSO at all times at 5 ° C._FourMore viscous than alone.   CaSO_FourCaCl compared to the single formulation_TwoAnd CaSO_FourUse a mixture of 1) 3 to 4 times higher initial viscosity; 2) to pourable consistency Shorter time to reach; 3) gives higher viscosity after gelling and thus better Gives better tissue separation. Example 6 shows the composition of an alginate gel with tissue adaptability and injectability properties. Experiments performed to   Compositions were prepared containing the components listed in Table 4 below. The viscosity of this composition is mixed It was about 1000 Cp immediately after the combination. Gelation occurs about 15 minutes after mixing, and it is intact A weakly crosslinked gel was produced (modulus = 6.59 kgf / cm^Two). 22 gauge needle When injected through the gel, the gel breaks into irregularly shaped pieces ("crumbles") Causes a decrease in strength (modulus = 0.231 kgf / cm^Two).   This substance was injected subcutaneously into normal mice, and the transplant was monitored for 6 months. Histological evaluation of the transplanted tissue revealed that the dimensions ranged from 50 microns to 500 microns. Observed the crumble. The initial volume of the implant lasted for 6 months. Aging group Weaving assessment shows loose connective tissue from the host wrapping the crumble, Injection of the alginate gel of the composition described in Indicates that it promotes wetting of the loose connective tissue around it. This gel is fiber forming Characterizes the response, which results in connective tissue ultimately forming upon injection of gel material It accounts for a considerable proportion of the amount given.   For purposes of clarity, the invention has been illustrated and described in connection with specific embodiments. And some embodiments have been described in some detail, but other aspects, advantages and modifications may be It will be apparent to those skilled in the art to which the present invention pertains. The foregoing description and examples It is intended to be illustrative and not limiting of the invention. Implement the invention Modifications of the above-described embodiments may be used in medicine, plastic surgery, tissue culture and / or related It is obvious to a person skilled in the art that it is also within the scope of the present invention and The enclosure is limited only to the claims.   All publications and patent applications cited herein are those skilled in the art to which this invention pertains. It indicates the level of All publications and patent applications are numbered in their respective publications. Or the patent application is specifically and individually included herein by reference. To the same extent as possible, it is included herein by reference.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６０／０５９，５５８ (32)優先日 平成９年９月19日(1997．9．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ネルソン，ゴードン・ピー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02760, ノース・アッテンボロ，マウント・ホー プ・ストリート 939 (72)発明者 オムステッド，ダニエル・アール アメリカ合衆国マサチューセッツ州07120, アクトン，ジェイ・レイン ２────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (31) Priority claim number 60 / 059,558 (32) Priority date September 19, 1997 (September 19, 1997) (33) Priority country United States (US) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, M W, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY) , KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM , AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, E S, FI, GB, GE, GH, HU, IL, IS, JP , KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, M W, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD , SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU (72) Inventors Nelson, Gordon P             United States Massachusetts 02760,             North Attenboro, Mount Ho             Pu Street 939 (72) Inventor Omstead, Daniel Earl             United States Massachusetts 07120,             Acton, Jay Lane 2

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 生相容性ポリマーからなる、動物中へ注入するための組成物であって、 その生相容性ポリマーが安定な、部分硬化ヒドロゲルを形成することを特徴とす る組成物。 ２． 組成物が、ブロックに成型されたといきに、重力に等しい力の下での流 れに抵抗するペーストであり、そのペーストが動物中への注入に適当である、請 求の範囲１の組成物。 ３． 注入可能ペーストが、不規則な形のヒドロゲル粒子の懸濁物から主とし てなり、それらの粒子が３０ミクロンから５００ミクロンの直径を有する請求の 範囲２の組成物。 ４． 注入可能ペーストが少なくとも０．１ｋｇｆ／ｃｍ²のゲル強度を有し 、粒子中のヒドロゲルが少なくとも３ｋｇｆ／ｃｍ²のゲル強度を有する請求の 範囲３の組成物。 ５． 脆いヒドロゲルを作り、そのヒドロゲルをオリフィスに通して、それに よりヒドロゲルが破壊されて不規則な形の粒子を形成することにより、組成物が 作られ、その組成物が動物中の組織平面を分離するのに充分なコンシステンシィ を維持している粒子を含んでいる、請求の範囲１の組成物。 ６． 生相容性ポリマーがアルギン酸塩である請求の範囲１−５のいずれかの 組成物。 ７． 多価金属カチオンの高度溶解性塩、多価カチオンの弱溶解性塩をさらに 含む請求の範囲６の組成物。 ８． 高度溶解性塩及び弱溶解性塩が共にカルシウム塩である請求の範囲７の 組成物。 ９． 高度溶解性塩が塩化カルシウムであり、弱溶解性塩が銅、カルシウム、 アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、錫及びジ−、トリ− またはテトラー官能性有機カチオンからなる群より選択されるカチオンと、低分 子量ジカルボン酸イオン、サルフェート及びカーボネートからなる群より選択さ れるアニオンと、を含む請求の範囲７の組成物。 １０． 弱溶解性塩が硫酸カルシウムであり、混合物が塩化カルシウム／硫酸カ ルシウムを重量基準で０．００７５ないし１．０の比で含む請求の範囲９の組成 物。 １１． 混合物が重量で少なくとも０．５％のアルギン酸塩、及びアルギン酸塩 グラム当たり少なくとも約０．００１ｇの塩化カルシウムを含む請求の範囲９の 組成物。 １２． カルシウムイオンの結合のためにアルギン酸塩と競合する金属イオン封 鎖剤を更に含む請求の範囲９の組成物。 １３． 金属イオン封鎖剤がホスフェートアニオンを含む請求の範囲１２の組成 物。 １４． 組成物が生細胞をも含む請求の範囲１−１３のいずれかの組成物。 １５． 細胞が軟骨細胞及び軟骨組織を形成するその他の細胞、骨芽細胞及び骨 を形成するその他の細胞、筋肉細胞、線維芽細胞ならびに器官細胞からなる群よ り選択される請求の範囲１４の組成物。 １６． 細胞が解離細胞及び細胞集合体からなる群より選択される請求の範囲１ ４−１５のいずれかの組成物。 １７． 動物内の構造欠陥を、その治療の必要に応じて治療する方法であって、 請求の範囲１−１６のいずれかによる組成物を欠陥の部位で動物中へ移植するこ とからなる該方法。 １８． 動物内の構造欠陥を、その治療の必要に応じて治療する方法であって、 部分硬化された生分解性、生相容性のヒドロゲルであって、任意に生 細胞を含む部分硬化ヒドロゲルを調製し、 そのヒドロゲルを圧力下にオリフィス内を通過させて破壊して、ヒド ロゲル粒子を含む懸濁物を作り、 その懸濁物を欠陥の部位で動物中に移植する、 ことからなり、そのヒドロゲルが移植後に、組織を包囲すること及び 移植物の脈管化により、繊維形成応答を誘発する、上記治療方法。 １９． 動物内の構造欠陥を、その治療の必要に応じて治療する方法であって、 バイオポリマーまたは変性バイオポリマーからなり、任意に生細胞を 含む生相容性ヒドロゲルを調製し、 そのヒドロゲルを圧力下にオリフィス内を通して、組織平面を分離さ せるのに充分なコンシステンシィを有する流動性組成物を作り、そして、 その流動性組成物を欠陥の部位で動物中へ移植する、 ことからなる上記方法。 ２０． 動物中へ注入するのに適当であり、ｉｎ ｖｉｖｏで十分に硬化するこ とになる、部分硬化ヒドロゲルを調製するためのキットであって、 ２価カチオンにより架橋結合する時にヒドロゲルを形成する、好まし くはアルギン酸塩である、ポリマー、 ２価の金属カチオンを含む充分な可溶性の塩、好ましくは塩化カルシ ウム、及び、 銅、カルシウム、アルミニウム、マグネシウム、ストロンチウム、バ リウム、錫、及びジ−、トリ−またはテトラ−官能性有機カチオンからなる群よ り選択されるカチオンと、低分子量ジカルボン酸、サルフェートイオン及びカー ボネートイオンからなる群より選択されたアニオンとを、有する弱可溶性塩、好 ましくは硫酸カルシウム、 からなり、それらの成分が、哺乳動物細胞の懸濁物と一緒にされた時に３０分以 内に、注入に適し、１．５％の濃度でポリマー、１．５ｍｇ／Ｌの濃度で充分可 溶性塩、そして１５ｍｇ／Ｌの濃度で弱可溶性塩を有する部分硬化ヒドロゲルを 形成するように、与えられており、かつ部分硬化ヒドロゲル少なくとも４時間粘 度の変化を受けない、上記キット。 ２１． 請求の範囲１−１６のいずれかによる動物注入用組成物を調製するため のキットであって、(ａ)多価カチオンで架橋結合された時にヒドロゲルを形成す ることができる生相容性ポリマー、（ｂ）多価金属カチオンの高度溶解性塩、及 び（ｃ）多価カチオンの弱溶解性塩、からなる、上記キット。 ２２． 請求の範囲６−１１のいずれかによる動物注入用組成物を調製するため のキットであって、(ａ)多価カチオンで架橋結合された時にヒドロゲルを形成す ることができる生相容性ポリマー、（ｂ）多価金属カチオンの高度溶解性塩、及 び（ｃ）多価カチオンの弱溶解性塩、からなり、その生相容性ポリマー及び弱溶 解 性塩が粉末状であり、任意に単一の容器中にある、上記キット。 ２３． カルシウムイオンの結合のためにアルギン酸塩と競合する金属イオン封 鎖剤を更に含む請求の範囲２２のキット。[Claims] 1. A composition comprising a biocompatible polymer for injection into an animal, wherein the biocompatible polymer forms a stable, partially cured hydrogel. 2. 2. The composition of claim 1, wherein the composition is a paste that resists flow under a force equal to gravity as molded into a block, the paste being suitable for injection into an animal. 3. 3. The composition of claim 2, wherein the injectable paste is composed primarily of a suspension of irregularly shaped hydrogel particles, the particles having a diameter of 30 microns to 500 microns. 4. Injectable paste has a gel strength of at least 0.1 kgf / cm ^2, the composition in the range 3 claims hydrogel having a gel strength of at least 3 kgf / cm ² in the particles. 5. A composition is created by creating a brittle hydrogel and passing the hydrogel through an orifice, thereby breaking up the hydrogel and forming irregularly shaped particles, which separates the tissue planes in the animal 2. The composition of claim 1, comprising particles maintaining sufficient consistency to achieve the above. 6. The composition according to any one of claims 1 to 5, wherein the biocompatible polymer is alginate. 7. 7. The composition according to claim 6, further comprising a highly soluble salt of a polyvalent metal cation and a weakly soluble salt of a polyvalent cation. 8. 8. The composition according to claim 7, wherein the highly soluble salt and the weakly soluble salt are both calcium salts. 9. A cation selected from the group consisting of copper, calcium, aluminum, magnesium, strontium, barium, tin and di-, tri- or tetra-functional organic cations, wherein the highly soluble salt is calcium chloride; 8. The composition of claim 7, comprising a low molecular weight dicarboxylate ion, an anion selected from the group consisting of sulfates and carbonates. 10. 10. The composition of claim 9 wherein the poorly soluble salt is calcium sulfate and the mixture comprises calcium chloride / calcium sulfate in a ratio of 0.0075 to 1.0 by weight. 11. 10. The composition of claim 9, wherein the mixture comprises at least 0.5% alginate by weight, and at least about 0.001 g calcium chloride per gram alginate. 12. 10. The composition of claim 9, further comprising a sequestering agent that competes with alginate for binding of calcium ions. 13. 13. The composition of claim 12, wherein the sequestering agent comprises a phosphate anion. 14． 14. The composition of any of claims 1-13, wherein the composition also includes living cells. 15. 15. The composition of claim 14, wherein the cells are selected from the group consisting of chondrocytes and other cells forming cartilage tissue, osteoblasts and other cells forming bone, muscle cells, fibroblasts and organ cells. 16. The composition according to any one of claims 14 to 15, wherein the cells are selected from the group consisting of dissociated cells and cell aggregates. 17． 17. A method of treating a structural defect in an animal as needed for its treatment, comprising implanting a composition according to any of claims 1-16 into the animal at the site of the defect. 18. A method of treating a structural defect in an animal as needed for the treatment thereof, comprising preparing a partially cured biodegradable, biocompatible hydrogel, optionally containing partially viable cells. Breaking the hydrogel under pressure through an orifice to create a suspension containing the hydrogel particles and implanting the suspension into an animal at the site of the defect. Such a method of treatment, wherein after the transplant, a fibrogenic response is elicited by surrounding the tissue and vascularizing the transplant. 19. A method of treating a structural defect in an animal as needed for the treatment, comprising preparing a biocompatible hydrogel comprising a biopolymer or a modified biopolymer, optionally containing living cells, and subjecting the hydrogel to pressure. Creating a flowable composition having sufficient consistency to separate tissue planes through an orifice and implanting the flowable composition into an animal at the site of the defect. 20. A kit for preparing a partially cured hydrogel that is suitable for injection into an animal and that cures well in vivo, wherein the kit forms a hydrogel when crosslinked by a divalent cation, preferably Alginate, a polymer, a sufficiently soluble salt containing divalent metal cations, preferably calcium chloride, and copper, calcium, aluminum, magnesium, strontium, barium, tin, and di-, tri- or tetra- A weakly soluble salt, preferably calcium sulfate, having a cation selected from the group consisting of functional organic cations and an anion selected from the group consisting of low molecular weight dicarboxylic acids, sulfate ions and carbonate ions, 30% when the components are combined with a suspension of mammalian cells Within, to provide a partially cured hydrogel suitable for injection and having a polymer at a concentration of 1.5%, a sufficiently soluble salt at a concentration of 1.5 mg / L, and a weakly soluble salt at a concentration of 15 mg / L. The above-described kit, wherein the partially cured hydrogel is not changed in viscosity for at least 4 hours. 21. A kit for preparing a composition for animal injection according to any of claims 1-16, comprising: (a) a biocompatible polymer capable of forming a hydrogel when cross-linked with a polyvalent cation; The above kit comprising (b) a highly soluble salt of a polyvalent metal cation, and (c) a weakly soluble salt of a polyvalent cation. 22. A kit for preparing a composition for animal injection according to any of claims 6-11, comprising: (a) a biocompatible polymer capable of forming a hydrogel when cross-linked with a polyvalent cation; (B) a highly soluble salt of a polyvalent metal cation, and (c) a weakly soluble salt of a polyvalent cation, wherein the biocompatible polymer and the weakly soluble salt are in powder form, The kit as described above, which is in a container. 23. 23. The kit of claim 22, further comprising a sequestering agent that competes with alginate for binding of calcium ions.