JP2001505420A - Liver activin / inhibin nucleotide and protein sequences and methods based thereon - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、成体脊椎動物の生涯において肝臓内で特異的に発現される、明細書中で肝臓アクチビンと称する、アクチビン/インヒビンの新規亜群の発見、同定および特徴付けに関する。この発明は、アクチビンβ_Cおよびβ_Eサブユニットならびに肝臓アクチビン亜群の他の構成員に関する。この発明は、肝臓アクチビンヌクレオチド；肝臓アクチビンの発現を調節する肝臓アクチビンゲノム調節要素；宿主細胞発現系；肝臓アクチビン蛋白質、融合蛋白質、ポリペプチドおよびペプチド；肝臓アクチビン蛋白質に対する抗体；肝臓アクチビンを発現するトランスジェニック動物；肝臓アクチビンを発現しない組換えノックアウト動物；肝臓アクチビンのアンタゴニストおよびアゴニスト；ならびに細胞の成長および/または分化を調節するための、およびそれに関連した異常を診断、治療するための、肝臓アクチビン遺伝子発現活性をモデュレートする他の化合物を含む。この発明はさらに、以下のものに限定されないが、刺激する肝再生、骨成長および造血を含む細胞の成長および/または分化の調節のための方法ならびに組成物を含む。 This invention relates to the discovery, identification and characterization of a novel subgroup of activins / inhibins, referred to herein as liver activins, that are specifically expressed in the liver during the life of an adult vertebrate. . The present invention relates to activin β _C and β _E subunits and other members of the liver activin subgroup. The present invention relates to a liver activin nucleotide; a liver activin genomic regulatory element that regulates the expression of liver activin; a host cell expression system; a liver activin protein, a fusion protein, a polypeptide and a peptide; an antibody against the liver activin protein; Transgenic animals that do not express liver activin; antagonists and agonists of liver activin; and liver activin genes for regulating cell growth and / or differentiation and for diagnosing and treating abnormalities associated therewith. Includes other compounds that modulate expression activity. The invention further includes methods and compositions for regulating cell growth and / or differentiation, including, but not limited to, stimulating liver regeneration, bone growth and hematopoiesis.

Description

【発明の詳細な説明】 肝臓アクチビン/インヒビンのヌクレオチド配列およびタンパク質配列 ならびにそれらに基づく方法 １．序論 本発明は、脊椎動物の成体期の間に肝臓で特異的に発現されるアクチビン/イ ンヒビンの新規のサブグループ(本明細書中において肝臓アクチビンと称する)の 発見、同定、および特性決定に関する。本発明は、アクチビンβ_Cおよびβ_Eサブ ユニットならびに肝臓アクチビンサブグループの他のメンバーに関する。本発明 は、肝臓アクチビンヌクレオチド；肝臓アクチビンの発現を調節する肝臓アクチ ビンゲノム調節要素：宿主細胞発現系；肝臓アクチビンタンパク質、融合タンパ ク質、ポリペプチド、およびペプチド；肝臓アクチビンタンパク質に対する抗体 、肝臓アクチビンを発現するトランスジェニック動物：肝臓アクチビンを発現し ない組換えノックアウト動物；肝臓アクチビンのアンタゴニストおよびアゴニス ト；ならびに肝臓アクチビン遺伝子発現活性を調節して、細胞成長および/また は細胞分化を調節したり、それに関連した異常を診断および治療する他の化合物 を包含する。さらに、本発明は、肝再生、骨成長、および造血を刺激することを 含むがこれに限定されない、細胞成長および/または細胞分化を調節する方法お よび組成物を包含する。 ２．発明の背景 アクチビンおよびインヒビンは、TGF-βスーパーファミリーメンバーに類似し た構造および機能をもつ二量体タンパク質である。(Vale，W.ら、Peptide Growt h Factors and Their Receptors（Part II）Sporn，M.B.およびRoberts，A.B.編 ，Springer-Verlag，Heldelberg.211-248頁)。TGF-βスーパーファミリーメンバ ーと同様、アクチビン/インヒビンは、シグナルペプチド、アミノ末端プロペプ チド、および成熟成長因子ドメインから なる大きい前駆体として合成される。アクチビン(およびTGF-βスーパーファミ リーの他のメンバー)の合成の間、２本の前駆体鎖が会合して、潜在活性を有す るジスルフィド結合した二量体を形成する。完全長二量体をエンドプロテオリテ ィック切断モチーフで切断すると、ジスルフィド結合した前駆体鎖のプロペプチ ドドメインと成熟成長因子ドメインとが分離される。プロペプチド二量体および 成熟成長因子二量体は、典型的に、非共有結合的に会合したままである。アクチ ビンおよび他のTGF-βスーパーファミリーメンバーのプロペプチド二量体は、潜 在性を得るために必要かつ十分であると考えられている。アクチビンの成熟成長 因子ドメインは、TGF-βスーパーファミリーの知られているメンバーにおいて全 て保存されるシステイン残基モチーフを含んでいる(Gray，A.M．ら，1990，Scie nce 247:1328-1330；Huylebroeck，D.ら，1990，Mol．Endocrinol．4:1153-1165 ；Schwall，R.H.ら，1988，Mol．Endocrinol．2:1237-1242)。また、今までのと ころ特性を決定されたアクチビンの成熟成長因子ドメインは、TGF-β１と約30％ のアミノ酸配列相同性を有する。 アクチビン/インヒビンは、様々なタイプの標的細胞の成長および分化を変更 するのに多様な効果を引き出すことが見出されている。細胞成長のこの複雑な調 節は、TGF-βスーパーファミリーメンバー特有のものである。TGF-β効果の包括 的なレビューについては、Roberts，A.B.ら，1990，Handbook of Experimental Pharmacology，95（Part 1）Sporn，M.B.およびRoberts,A.B．eds.，Springer-V erlag，Heldelberg．419-472頁を参照されたい。TGF-βの自己分泌活性および傍 分泌活性は、異なる機構により調節されると考えられている。１つの調節戦略は 、TGF-β遺伝子発現の時間的および空間的な制御を伴う。２つ目の戦略は、特定 の生理学的および病理学的条件下（例えば、組織形態形成下および創傷治癒下） においてのみ活性化される潜在複合体としてTGF-βを作成および保存することを 伴う。例えば、Pircher，R.ら，1986，Biochem．Blophys．Res．Commun．136:30 -37；Miyazono，K.ら，1988，J．Biol．Chem．263:6407-6415；Wakefield，L.M. ら，1988，J．Biol．Chem．263:7646-7654を参照されたい。アクチビン/イ ンヒビン活性は、同様の戦略によって調製されると考えられる。結合タンパク質 (例えば、アクチビン活性を阻害するフォリスタチン)との会合によって、アクチ ビン/インヒビン活性が調節されることを示唆する証拠がある。 アクチビンおよびインヒビンは、αサブユニットおよびβサブユニットとして 知られる構造的に関連性のあるポリペプチド鎖からなる。現在、固有であるが関 連性のある２つのβサブユニットが同定されており(β_Aおよびβ_B)、これらはイ ンヒビンおよびアクチビンの両方に共通する。従って、異なる組み合わせのβサ ブユニット(例えば、β_Aβ_A、β_Bβ_B、およびβ_Aβ_B)からなる３つのアクチビン (Ａ、Ｂ、およびＡＢ)が知られており、ならびにそれぞれ１つのβサブユニット と１つのαサブユニットと(αβ_Aおよびαβ_B)からなる２つのインヒビンが知ら れている(Mason，A.J.ら，1985，Nature 318:659-663；Mason，A.J.ら，1986，B iochem．Biophys．Res.Commun．135:957-964;Forage，R.G.ら，1986，Proc．Nat l．Acad．Sci．U.S.A．83:3091-3095；Esch，F.ら，1987，Mol．Endocrinol．1: 388-396)。 最近、アクチビンβ_Cと称される第３のアクチビンβサブユニットをコードす るcDNAが、ヒト肝臓cDNAライブラリーから単離された。Hottenら，1995，Bioche m．Biophys．Res．Commun.，206:608-613。このクローン産物はまだこれから単 離または組換え的に発現される必要があり、その機能は現在のところ知られてい ない。ヒトアクチビンβ_Cの概念的に成熟部分として解釈される部分と、ヒトア クチビンβ_Aおよびアクチビンβ_Bの対応する領域との間には約50％のアミノ酸同 一性がある；これは、β_CとTGF-βスーパーファミリーの他の公知のメンバーと の間の同一性を有意に上回る。 アクチビンβ_Dと称される第４のアクチビンが、最近、アフリカツメガエル肝 臓cDNAライブラリーから単離された(Oda，S.ら，1995，Biochem．Biophys．Res ．Commun.，210:581-588)。ノーザン分析により、β_Dはアフリカツメガエルの発 生学的発生の初期段階の間に発現されることが示された。アクチビンβ_DcDNAか ら転写された合成mRNAをアフリカツメガエルの胚分割球へマイクロ注入したとこ ろ、第二体軸(secondary body axis)が形成された。一方、mRNAを動物極キャッ プ(animal pole cap)に注入すると、 中胚葉を誘導した。これらの活性は、発生の間のアクチビンβ_Aおよびβ_Bの知ら れている活性と一致する。 ヒトアクチビンβ_Cサブユニットおよびアフリカツメガエルアクチビンβ_Dサブ ユニットが、ホモ二量体、ヘテロ二量体、または両方を形成するか否かはまだ決 定されていない。だが、これらの最近の単離は、アクチビンおよびインヒビンの 両方について、組合わせの可能性の数が比較的大きいかもしれないことを示唆し ている。 インヒビンははじめ、下垂体前葉からの性腺ホルモン(例えば、卵胞刺激ホル モンまたはFSH)の放出を調節する性腺ペプチドとして同定された(例えば、deJon g，F.H.ら，1985，Mol．Cell．Endocrinol.42:95-103；Dubas，M.ら，1983，Mol ．Cell.Endocrinol．31:187-198；Channing，C.P.ら，1985，Proc．Soc．Experi m．Biol．Medicine 178，339-361；Robertson，D.M.，Fouldsら，1985，Biochem ．Biophys．Res．Commun．126:220-226；Rivier，J.ら，1985，Proc．7^ThIntl． Cong．Endocrinol．655:1141-1144；Miyamoto，K.ら，1985，Biochem．Biophys ．Res．Commun．129:396-403；Rivier，J.ら，1985，Eiochem．Biophys．Res．C ommun．133:120-127を参照されたい)。インヒビン合成の主要性腺部位は、セル トリー細胞(精巣)および顆粒(granulosa)細胞(卵巣)である。雄の性腺において 、インヒビンは、性原細胞DNA合成を拮抗し、***の数を減少させる。セルトリ ー細胞によるインヒビン合成は***形成の間変動し、異なる生殖細胞の集団に結 合しているインヒビンは、***形成の様々な段階の間に変化することが示されて いる。従って、セルトリー細胞と生殖細胞との間の相互作用は、インヒビンによ り傍分泌の様式で仲介される。インヒビンはまた(黄体形成ホルモンとともに)、in vitroでのライディヒ細胞によるステロイドホルモン生成を促進する。雌の性 腺において、インヒビンは、卵母細胞減数***を拮抗し、卵巣卵胞数を増加し、 子嚢細胞によるステロイド合成を促進する。マウスの両方の性において、インヒ ビンは、性腺ストロマ細胞成長の重要なネガティブな調節因子と見とめられる(M atzuk,M.M.ら，1992，Nature 360:313-319)、即ち、インヒビン欠失マウスは、 顆粒細胞(雌マウス)およびセルトリー細 胞(雄マウス)からなる、混合または不完全に分化した性腺ストロマ腫瘍を発達す る。最後に、インヒビンは、性腺および下垂体以外の他の組織の機能を調節する (例えば、Sakai,R.ら，1992,Biochem．Biophys．Res．Commun．188:921-926)。 インヒビンＡおよびＢは、発生の間は胎盤にて、成体期の間は脾臓および神経系 にて発現される。インヒビンは、胎盤においてはヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの 重要な調節因子として機能しうる。 また、アクチビンははじめ、性腺下垂体刺激性ホルモンとして同定された。つ まり、本来、アクチビン_A(β_Aβ_A)は、ブタ卵巣液において、下垂体細胞によるF SH放出を刺激する（卵巣卵胞発生および成熟は、下垂体からのFSH分泌により開 始する）分子として同定された(Vale，W.ら，1986，Nature 321:776-779；Ling ，N.ら，1986，Nature 321:779-782；Ling，N.ら，Biochem．Biophys．Res．Com mun．138:1129-1137)。最近の証拠は、アクチビンＡが卵母細胞、顆粒細胞、お よび子嚢細胞に作用できることを示し、この分子が卵巣内自己分泌/傍分泌効果 を有することを示唆している。アクチビンＡおよびＢは、解剖学的に広範囲に分 布しており、卵巣卵胞成熟以外の、例えば以下のような多くの生物学的プロセス において役割を果たすと考えられている：下垂体成長ホルモンおよび副腎皮質刺 激ホルモン分泌(Sadatsuki，M.ら，1993，Hum．Reprod．8:1392-1395)、視床下 部オキシトシン分泌(Sawchenko，P.E.ら，1988，Nature 334:615-617)、ソマト スタチン誘導(Woodruff，T.ら，1995，Annu．Rev．Physiol．57:219-244)、リン パ球増殖(Hedger,M.P.ら，1989，Mol．Cell．Endocrinol．61:133-138)赤血球生 成(1987年2月4日に発行されたEP Publ．No．210,461；Yuら，1987，Nature 330: 765-767：Eto，Y.ら，1987，Biochem．Biophys．Res．Commun．142:1095-1103； Broxmeyer，H.E.ら，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．85:9052-9056；Mur ataら，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA.，85:2334-2438；Schwall，R.H.ら ，1991，Meth．Enzymol．198:340-346；1991年12月10日に発行されたBurtonら， U.S．Patent No．5,071,834；Shiozaki，M.ら，1992，Biochem．Biophys．Res． Commun．183:273-279；Nishimura，M.ら，1991，Biochem．Biophys．Res．Commu n．181:1042-1047)、心臓形態発 生(Olson，E.ら，1996，Science 272:671-672)、神経細胞の生存(Schubert，D. ら，1990，Nature 344:868-870；Hashimoto，M.ら，1990，Biochem．Biophys．R es．Commun．173:193-200)、巨核球分化(Fugimoto，K.ら，1991，Biochem．Biop hys．Res．Commun．174:1163-1168)、***形成(Mather，J.P.ら，1990，Endocri nology 127:3206-3214)、骨形成(Oue，Y.ら，1994，Bone 15:361-366；Inoue,S. ら，1994，Calcif．Tissue Int．55:395-397；Luyten，F.P.ら，1994，Exp．Cel l Res．210:224-229；Ogawa，Y.ら，1992，J.Biol．Chem．267:14233-14237；Ce ntrella，M.ら，1991，Mol．Cell．Biol．11:250-258)、膵臓インスリン分泌、 脊椎動物胚におけるパターニング事象(Wakefieldら,1988,J.Biol.Chem.263:7646 -7654;Gentry,L.E.ら,1987，Molec．Cell Biol．7:3418-3427；Ogawa、Y.ら，19 92、J.Biol.Chem．267:2325-2328)、生殖内分泌学(Pircher，R.ら，1984，Cance r Res．44:5538-55Z13；Gentry L.E.ら，1988，Molec．Cell Biol．8:4162-4168 )、体細胞成長(Sadatsukiら，1993,Hum.Reprod．8:1392-1395;Wakefield，L.M. ら，1989，Growth Factors 1:203-218)、ならびに初期胚発生の間の中胚葉の誘 導(Smith，J.C.ら，1990，Nature 345:729-731；van Den Eijnden-Van Raaij，A .J.M.，1990，Nature 345:732-734；Green，J.B.A.ら，1990，Nature 347:391-3 94；Thomsen，G.ら，1990，Cell 63:485-493；Sokol，S.およびMelton，D.A.，1 991，Nature 351:409-411；Johansson，B.M.およびWlles，M.V.，1995，Mol．Ce ll．Biol．15:141−151))。また、先における研究は、アクチビンＡが、in vitr o における肝細胞DNA合成の自己分泌インヒビターとして機能しうることを示唆し ている(Yasuda，H.ら，19913，J．Clin．Invest．92:1491-1496)およびin vivo での肝再生のインヒビター(Kogure，K.ら，1995，Gastroenterology 108:1136-1 142；およびSchwall，R.H.ら，1993，Hepatology 18:347-356)。これらの研究は 、肝細胞におけるアクチビンＡ合成が、これらの細胞を、上皮成長因子または肝 細胞成長因子のいずれかで処置することによって誘導されることを示している。 これまでに蓄積されたデータから、アクチビンおよびインヒビンがそれ 自体で細胞および組織の生理機能に影響を及ぼすのではなく、他の小さい調節分 子と共働して作用することは明らかである。これに関し、最近の研究は、アクチ ビンＡおよびBMP-4が胚発生において共働的に作用して、哺乳動物中胚葉形成お よび造血を誘導することを示している。性腺タンパク質フォリスタチンは、高親 和性アクチビン結合タンパク質であることが報告されているが、それ自体でアク チビンシグナル伝達に関わるようには見とめられない。， 赤血球生成(erythropoiesis)とは、細胞破壊を補うために脊椎動物の生涯にわ たって継続的に赤血球を生成することであり、これにより、適切な酸素添加に十 分足りる数の赤血球細胞を血液中に存在させることができる。赤血球細胞の生成 は、骨髄中で生じ、ホルモンエリトロポエチンの制御下にある。循環血漿中のエ リトロポエチンの量は、血液血漿中における酸素輸送が減少した状態の間に増加 する。低酸素と称されるこの状態は、例えば出血性貧血により生じる大量の血液 損失、赤血球細胞を破壊する放射能に対する暴露、高い高度での酸素摂取量の減 少、または長時間にわたる意識消失により生じる。 貧血の原因に応じて、貧血を軽減するための多くの異なる種類の医薬(例えば 、鉄調製物(鉄欠乏性貧血)、ビタミンＢ₁₂および葉酸(悪性貧血)、コルチコイド 等の副腎皮質ステロイド(溶血性貧血))が用いられてきた。ステロイドホルモン は、強力なエリトロポエチン刺激作用を有することが知られており、効果的な医 薬品とみなされているが、このようなホルモンは強力な副作用を示し、一般的に 長期にわたる投与には望ましくない。 エリトロポエチンはまた、最近、貧血を緩和するための効果的な薬剤として提 案されている。1987年10月27日に発行されたU.S.Pat.No．4,703,008は、商業的 に実現可能な量のエリトロポエチンの組換え産生を記載している。 アクチビンＡおよびＢは、エリトロポエチン刺激活性を有することが見出され ている。1987年2月4日に発行されたEP．Publ．No．210,461；Etoら，1987，Bioc hem.et Biophys．Res．Commun．142:1095-1103；Murataら，1988， Proc．Natl．Acad．Sci．USA.，85:2334-2438，Yuら，1987，Nature 330:765-76 7を参照されたい、そしてアクチビンＢについては1991年12月10日に発行されたB urtonら、U.S．Patent No:5,071,834を参照されたい。 アクチビン結合部位は、いくつかのアクチビン応答細胞で同定されており、化 学的架橋実験から細胞表面上に多数の結合分子が存在することが示唆されている 。さらに、いくつかのアクチビン受容体が、最近、単離され特性決定された。こ れらの内最初に同定されたのは(Mathews,L.S.ら，1991，Cell 65:973-982)、セ リン/スレオニン特異的プロテインキナーゼの特徴を有する、494アミノ酸残基の 内在性膜タンパク質であった。それ以来、数々のTGF-βタイプIおよびタイプII シグナリング受容体が、アクチビンを結合することが示されている(Attisano，L .ら，Cell 75:671-680；Ebner，R.ら，1993，Science 262:900-902；ten Dijke ，P.ら，Science，264:101-104)。 ３．発明の要旨 本発明は、アクチビン/インヒビンの新規のサブグループ(本明細書中において 肝臓アクチビンと称する)をコードするヌクレオチドの発見、同定、および特性 決定、ならびにこれらのヌクレオチドが、成体期の間に肝臓で特異的に発現され るmRNAに相当するという発見に関する。特に、本発明は、肝臓アクチビンサブグ ループのメンバーに関し、これは本明細書中では成体期の間肝臓で発現され、ア クチビンβ_Cおよび/またはβ_Eの実質的なストレッチにおいてアミノ酸レベルで 約65％の同一性を示すと定義する。 肝臓アクチビンは、他のアクチビンサブファミリーメンバーと同様、ホモ二量 体またはヘテロ二量体として天然に存在し、細胞表面受容体に結合することによ って細胞成長および/または細胞分化を調節する。肝臓アクチビンのアミノ酸配 列組織は他のアクチビンファミリーおよびTGF-βスーパ−ファミリーメンバーに おいて見出され、肝臓アクチビンは、アクチビンβ_Aおよびβ_Bに対して有意な相 同性を示す一方でアクチビンβ_Dと最も密接に関連している。 論点を明確にするために、以下の副節において、本発明を実施例により、 図１に示すアクチビンβ_Cおよび図２(マウス)および図５(ヒト)に示すアクチビ ンβ_Eについて説明する。ただし、この原理は、肝臓アクチビンサブグループの 他のメンバーにも同等に適用される。 それぞれ約2kbおよび3.2kbの長さのアクチビンβ_Cおよびアクチビンβ_EmRNA転 写産物は、成体脊椎動物の肝臓組織において特異的かつ高度に発現される。本明 細書に記載するマウスアクチビンβ_Cおよびβ_EcDNAは、それぞれ352および350の アミノ酸のタンパク質をコードする(図１および図２)。ヒトアクチビンβ_Eは、3 50のアミノ酸のタンパク質をコードする。アクチビンβ_Cおよびβ_Eは、Ｎ末端シ グナルペプチド、それに後続するプロペプチド領域、および９つのシステイン領 域を含む成熟成長因子領域を有する。この空間的配列はTGF-βスーパーファミリ ーメンバーにわたって保存される。 本発明は、(ａ)アクチビンβ_Cおよびβ_E遺伝子産物を含む、脊椎動物の肝臓ア クチビンをコードするヌクレオチド；(ｂ)肝臓アクチビンの機能的ドメインに相 当する部分をコードするヌクレオチド、ならびにこのようなヌクレオチド配列に より特定されるポリペプチド産物(これには、Ｎ末端シグナルペプチド、プロペ プチドドメイン、および/またはアクチビンβ_Cおよびβ_Eの成熟成長因子ドメイ ンが含まれるがこれらに限定されない)；（ｃ）ドメインの内の１つが全てまた は一部欠失または変更されている肝臓アクチビンの変異体をコードするヌクレオ チド、ならびにこのようなヌクレオチド配列によって特定されるポリペプチド産 物(これには、Ｎ末端シグナルペプチド、プロペプチドドメイン、エンドプロテ オリティックモチーフ、または成熟成長因子ドメインの全てまたは一部が欠失さ れている非機能性タンパク質が含まれるがこれに限定されない)；ならびに(ｄ) 別のポリペプチドと融合した肝臓アクチビンまたはそのドメインの内の１つ(例 えば、成熟成長因子領域)を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチドを包 含する。 また、本発明は、マウスアクチビンβ_Cおよびβ_E遺伝子を含むゲノム断片を包 含する。いくつかのゲノムクローンが単離されている。図４Ａに、 マウスゲノム領域の地図を示す。マウスアクチビンβ_C遺伝子とβ_E遺伝子との間 に配置されたもののような、肝臓アクチビン遺伝子の発現を調節するゲノムヌク レオチド配列も本発明に包含される(図４Ｂ)。 また、本発明は、小さい分子、大きい分子、天然肝臓アクチビンと競合する変 異型肝臓アクチビン、および抗体を含む肝臓アクチビンのアゴニストおよびアン タゴニスト；肝臓アクチビン遺伝子発現を阻害するのに使用するヌクレオチド配 列(例えば、アンチセンスおよびリボザイム分子、ならびに遺伝子または調節配 列置換構築物)、または肝臓アクチビン遺伝子発現を増強するのに使用できるヌ クレオチド配列(例えば、肝臓アクチビン遺伝子を強力なプロモーター系の制御 下に置く発現構築物)を包含する。 また、本発明は、肝臓アクチビントランスジーンを過剰発現するトランスジェ ニック動物を包含する。このような動物は、肝臓アクチビンを産生するためのバ イオリアクターとして作られ得る。トランスジェニック家畜を介した肝臓アクチ ビンの発現は、翻訳後に正確に処置および改変されたタンパク質を産生する能力 の点で、組換え細菌および酵母におけるタンパク質産生よりも有利である。肝臓 アクチビンを発現しないトランスジェニック動物も作ることができる(「ノックア ウトマウス」)。 さらに、本発明は、細胞成長障害および/または細胞分化障害の診断的評価、 分類および予後のための、ならびにこのような症状に対する素質をもつ検体を同 定するための方法および組成物を包含する。例えば、肝臓アクチビン核酸を、診 断ハイブリダイゼーションプローブまたは診断PCR分析用のプライマーとして用 いて、肝臓アクチビン遺伝子突然変異、ならびに肝臓アクチビン遺伝子における 調節欠陥、多形性、および異形を同定できる。本発明は、さらに、このような方 法を実行するための診断キットを提供する。 本明細書に開示される肝臓アクチビンタンパク質、ポリペプチド、および誘導 体（断片を含む）は、抗肝臓アクチビン抗体の生成に使用することができ、この 抗肝臓アクチビン抗体は、患者サンプルにおける肝臓アクチビンタンパク質の検 出または測定を行うためのイムノアッセイにおいて診 断目的で使用することができる。抗肝臓アクチビン抗体は、例えば血清または生 体組織検査した細胞および組織における肝臓アクチビンタンパク質の診断検出ま たは測定のために使用することができる。 さらに、本発明は、細胞の成長および/または分化の調節（肝再生、骨成長ま たは造血を刺激することを含むが、これらに限定されない）を行うための方法お よび組成物を包含する。本発明の治療用化合物は、肝臓アクチビンタンパク質、 ポリペプチド、およびその誘導体(断片を含む)；これらに対する抗体；肝臓アク チビンタンパク質、ポリペプチド、および誘導体をコードする核酸；ならびに肝 臓アクチビンアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されない。 さらに、本発明は、肝臓アクチビン遺伝子の発現および/または肝臓アクチビ ン遺伝子産物の活性をモデュレートする（つまりアゴニストまたはアンタゴニス トとして機能する）化合物を同定するための、肝臓アクチビン遺伝子および/ま たは肝臓アクチビン遺伝子産物の使用方法にも関する。このような化合物は、細 胞の成長および/または分化を制御するための試薬、例えば細胞の成長および分 化（肝再生、造血および/または骨成長を含む）を刺激する治療薬として使用す ることができる。 また本発明は、例えば組換え方法による、肝臓アクチビンタンパク質、ポリペ プチド、誘導体および抗体を生成する方法にも関する。 本発明は、部分的に、成体脊椎動物の肝臓で特異的かつ高レベルで発現するア クチビンのサブグループの驚くべき発見、成体脊椎動物肝臓mRNAから調製したラ イブラリーから得た肝臓アクチビンβ_C およびβ_E cDNAの同定およびクローニング 、アクチビンβ_C およびβ_E のヌクレオチド配列の特徴付け、無細胞転写および翻 訳系におけるアクチビンβ_Cの発現、ならびにβ_C産物が肝再生を刺激し、致命的 な欠陥モデルにおける骨成長を刺激し、造血を刺激し、またin vitroにおける潜 在性TGF-β結合タンパク質-3（LTBP-3）に特異的に結合することを決定すること に基づいている。 3.1 定義 本明細書に使用する以下の用語は、単数形で使用されても複数形で使用されて も、以下に示す意味を有する： 肝臓アクチビン遺伝子、ヌクレオチド、またはコード配列： 肝臓アクチ ビン/インヒビンβサブユニットタンパク質、肝臓アクチビン/インヒビンβ サブユニットタンパク質のポリペプチドもしくは誘導体(その断片を含む)、 または肝臓/アクチビンインヒビンβサブユニット融合タンパク質をコード するヌクレオチド配列を意味する。肝臓アクチビンヌクレオチド配列は、ゲ ノムDNA(例えばβ_C またはβ_E 遺伝子)もしくはcDNAを含む肝臓アクチビン/イ ンヒビンDNA、あるいはRNAを包含する。 肝臓アクチビンゲノム断片： 肝臓アクチビンコード領域の近傍、すなわ ちその上流または下流に位置するヌクレオチド配列を含むゲノムDNA断片を 意味する。このようなヌクレオチド配列は、肝臓アクチビン遺伝子の発現を 制御する制御要素、すなわちプロモーターやエンハンサーなどを含むことが できる。 肝臓アクチビン： 肝臓アクチビン/インヒビンβサブユニットタンパク 質を含む単量体または二量体を意昧する。肝臓アクチビン/インヒビンβサ ブユニットタンパク質のポリペプチドまたは誘導体(その断片を含む)は、肝 臓アクチビンポリペプチドまたは肝臓アクチビン誘導体と称される。肝臓ア クチビン/インヒビンβサブユニットタンパク質、または肝臓アクチビン/イ ンヒビンβサブユニットポリペプチドもしくはインヒビンβサブユニット誘 導体（断片を含む）の、非関連タンパク質への融合は、本明細書において、 肝臓アクチビン融合タンパク質と称される。機能的肝臓アクチビンとは、活 性アクチビン/インヒビン単量体、ホモ二量体あるいはヘテロ二量体をin vi ivoまたはin vitroにおいて形成し、細胞の成長および/または分化を制御す ることができる、タンパク質を指す。 4. 図面の説明 図１は、全長マウスアクチビンβ_CcDNA配列。マウスアクチビンβ_Cのヌクレオ チド配列が、そのコード配列の下の推定アミノ酸配列とともに示されている。典 型的なシグナルペプチドは、最初の20アミノ酸残基を含むものと推定される。N 結合グルコシル化の起こり得る４つの部位の位置は、２本の下線で示されている 。塩基性残基のクラスター(アミノ酸残基230〜236位のKHRVRRR)は、推定プロペ プチドおよび成熟成長因子ドメインを画定するエンドプロテオリティック切断部 位（単数または複数）として機能し得る。 図２。全長マウスアクチビンβ_EcDNA配列。マウスアクチビンβ_Eのヌクレオチ ド配列が、そのコード配列の下の推定アミノ酸配列とともに示されている。典型 的なシグナルペプチドは、最初の21アミノ酸残基を含むものと推定される。N結 合グルコシル化の起こり得る１つの部位の位置は、２本の下線で示されている。 塩基性残基のクラスター（アミノ酸残基232〜236位のRARRR）は、推定プロペプ チドおよび成熟成長因子ドメインを画定するエンドプロテオリティック切断部位 （単数または複数）として機能し得る。 図３。推定マウスアクチビンβ_Cおよびβ_Eアミノ酸配列と他のアクチビングル ープのメンバーとの比較。マウスアクチビンβ_Cおよびβ_EのＣ末端酸配列（両方 においてアミノ酸236位から始まる）と、ヒトアクチビンβ_A、ヒトアクチビンβ_B およびアフリカツメガエルアクチビンβ_Dの対応領域との整列。該アクチビンの ９つの不変システイン特性が太線で示される。ダッシュは、該整列を最大にする ために導入したギャップを示す。種は、以下のように示される：ｈ＝ヒト；ｍ＝ マウス；およびｘ＝アフリカツメガエル。 図４Ａ。マウスアクチビンβ_Cおよびマウスアクチビンβ_E遺伝子のゲノム編成 を示すマップ。これら２つの遺伝子座の両方について、5’および3’非翻訳領域 は黒い長方形で示され、推定プロペプチドドメインをコードする配列は白抜きの ボックスで示され、推定成熟成長因子領域をコードする配列は、模様付きボック スで示される。オーバーラップするゲノム、クローンの部分的な制限分析および 部分的なＤＮＡ配列分析は、アクチビンβ_Cの エキソン１と２とを分けるイントロンのサイズが約12-kbpであることを示す。こ れに対し、配列決定により、アクチビンβ_Eのエキソン１と２とを分けるイント ロンのサイズが234-bpであることが分かった。 図４Bおよび４C。マウスアクチビンβ_Cおよびβ_E遺伝子の間に位置するゲノム 領域のヌクレオチド配列。 図４D、図４E、図４Fおよび図４G。マウスアクチビン遺伝子座の配列。該配列 は、アクチビンβ_C遺伝子の上流のヌクレオチド配列、アクチビンβ_C/エキソン １、アクチビンβ_C/イントロン１の一部配列、アクチビンβ_C/エキソン２、アク チビンβ_E調節領域、アクチビンβ_E/エキソン１、アクチビンβ_E/イントロン１ 、アクチビンβ_E/エキソン２、およびアクチビンβ_E遺伝子の３’に位置する配 列を含む。 図５。全長ヒトアクチビンβ_EcDNA配列。ヒトアクチビンβ_Eのヌクレオチド配 列が、そのコード配列の下の推定アミノ酸配列とともに示される。典型的なシグ ナルペプチドは、最初の17アミノ酸残基を含むものと推定される。N結合グルコ シル化の起こり得る１つの部位の位置は、２本の下線で示されている。塩基性残 基のクラスター（アミノ酸残基232〜236位のRARRR)は、推定プロペプチドおよび 成熟成長因子ドメインを画定するエンドプロテオリティック切断部位（単数また は複数）として機能し得る(矢印は２つの推定ドメインを分ける)。推定成熟成長 因子領域中に保存されたシステインは、太線で示される。 図６。特異的アクチビンβ_Cおよびβ_EcDNAプローブ（それぞれ上のパネルおよ び真中のパネル）を用いて評価した、成体マウスの複数組織のノーザンブロット (Clontech)。RNAサンプルを以下のように負荷した：レーン１＝心臓；レーン２ ＝脳；レーン３＝脾臓；レーン４＝肺；レーン５＝肝臓；レーン６＝骨格筋；レ ーン７＝腎臓；およびレーン８＝精巣。RNAサイズは、RNA標準物（9.5、7.5、4. 4、2.4および1.35kb）を用いて製造業社により決定された。関連RNAの負荷は、 グルコース 6-デヒドロゲナーゼcDNAプローブ（一番下のパネル）を用いたハイ ブリダイゼーションにより評価した。 図７。β_Cの免疫沈降法により示された、無細胞転写および翻訳系における、 全長マウスアクチビンβ_Cプラスミド発現構築物の発現。 図８。マウスアクチビンβ_Cが、致命欠陥動物モデルにおける骨の成長を刺激 するという証拠。遺伝子活性化マトリックス(a gene activated matrix)を用い て直接in vivo遺伝子を導入したあと形成された骨の顕微鏡フォーカス(矢印)。 図９。マウスアクチビンβ_Cが、in vitroにおけるヒト骨髄培養の造血を促進す る証拠。 5. 発明の詳細な説明 肝臓アクチビン/インヒビン（本明細書中で初めて記載）は、脊椎動物の成体 期の間、肝臓に特異的かつ高レベルで発現する、アクチビン/インヒビンサブグ ループを含む。肝臓アクチビンは、他のアクチビングループメンバーと同様、細 胞表面のシグナル伝達受容体に結合して細胞の成長および/または分化を制御す る、ホモ二量体もしくはヘテロ二量体として天然に生じる。肝臓アクチビンのア ミノ酸配列組成は、他のアクチビンやTGF-βスーパーファミリーメンバーに見ら れるアミノ酸配列組成と似ており、N末端シグナルペプチドと、これにつづくプ ロペプチド領域および９つのシステイン残基を含む成熟成長因子領域からなり、 そのスペーシングは、TGF-βスーパーファミリーメンバーの間に保存される。エ ンドプロテオリティック切断モチーフは、プロペプチドと成熟成長因子ドメイン とを分ける。肝臓アクチビンは、アクチビンβ_Aおよびβ_Bに対して有意な相同性 を示すが、アクチビンβ_Dに最も深く関係している。 本発明は、肝臓アクチビン遺伝子および遺伝子産物（転写および翻訳の両方） の使用を包含し、これにはDNA、mRNA、アンチセンスRNA、リボザイムおよびタン パク質が含まれるが、これらに限定されない。本発明はさらに、肝臓アクチビン ポリペプチドおよび誘導体の使用；(例えば肝臓アクチビンアゴニストまたはア ンタゴニストとして作用することができる)肝臓アクチビンに対する抗体；およ びアクチビン活性もしくは発現を阻害する アンタゴニスト、あるいは診断、治療、および/または細胞の成長および/または 分化の調節（ヒトを含む脊椎動物における肝再生および/または骨の成長を刺激 することを含むが、これに限定されない）においてアクチビン活性を活性化する かもしくはその発現を増加させるアゴニストを含む。さらに、肝臓アクチビンヌ クレオチドおよび肝臓アクチビンタンパク質は、細胞の成長および/または分化 の調節に有効な化合物の同定を行うのに有用である。 また本発明は、ゲノム中の肝臓アクチビン遺伝子の近傍に見られるもののよう な肝臓アクチビン遺伝子発現を調節するヌクレオチド配列も包含する。このよう なヌクレオチド配列は、例えばアクチビン遺伝子または肝臓特異的発現が望まし いあらゆる対象遺伝子の肝臓特異的発現を促進するための、発現ベクターに使用 することができる。 特に、以下のサブセクションに記載される発明は、肝臓アクチビンタンパク質 、該肝臓アクチビンの機能的ドメインに対応するポリペプチドおよびその誘導体 (例えばN末端シグナルペプチド、プロペプチド、および/または成熟成長因子ド メイン)；突然変異した、トランケートされた、もしくは欠失した肝臓アクチビ ン(例えば、プロペプチドドメイン、エンドプロテオリティック切断モチーフお よび/または成熟成長因子ドメインなどの、１以上の機能ドメインもしくはその 部分が欠失した肝臓アクチビン)；肝臓アクチビン融合タンパク質(例えば、イム ノグロブリン定常領域(即ちIgFc)などの非関連タンパク質もしくはペプチドに融 合された、肝臓アクチビンまたは成熟成長因子ドメインなどの肝臓アクチビンの 機能的ドメイン)；このような産物をコードするヌクレオチド配列；およびこの ような肝臓アクチビン産物を産生することができる宿主細胞発現系、を含む。ま た本発明は、抗体および抗イディオタイプ抗体(Fab断片を含む)、肝臓アクチビ ンのアンタゴニストおよびアゴニスト、ならびに肝臓アクチビン遺伝子の発現を 阻害する化合物もしくはヌクレオチド構築物（転写因子インヒビター、アンチセ ンスおよびリボザイム分子、または遺伝子もしくは調節配列置換構築物）を包含 し、あるいは肝臓アクチビンの発現を促進する化合物もし くはヌクレオチド構築物（例えば、肝臓アクチビンコード配列が、プロモーター や、プロモーター/エンハンサーなどの発現制御要素に動作上結合している、発 現構築物）を含む。また、本発明は、肝臓アクチビン（またはその突然変異体） を発現するように、または動物の内因性肝臓アクチビンの発現を阻害または「ノ ックアウト」するように遺伝子操作された、宿主細胞および動物にも関する。肝 臓アクチビン導入遺伝子を過剰に発現するトランスジェニック動物を開発して、 アクチビン産生のためのバイオリアクターとして使用することができる。 細胞の成長および分化の障害を診断するために突然変異肝臓アクチビンまたは 不適切に発現した肝臓アクチビンを検出する場合、肝臓アクチビンタンパク質、 ポリペプチドまたは誘導体；肝臓アクチビン融合タンパク質；肝臓アクチビンヌ クレオチド配列；抗体；アンタゴニスト；およびアゴニストが有用であろう。肝 臓アクチビンタンパク質、ポリペプチドまたは誘導体；肝臓アクチビン融合タン パク質；肝臓アクチビンヌクレオチド配列；宿主細胞発現系；抗体；アンタゴニ スト；アゴニスト；および遺伝子操作された細胞および動物は、細胞の成長や分 化を調節する薬物についてスクリーニングしたり、および/またはこの調節に関 する障害の治療に使用することもできる。 最後に、肝臓アクチビンタンパク質産物（特に成熟成長因子ドメインに対応す るペプチドなどの誘導体）および融合タンパク質産物(とくに肝臓アクチビン融 合タンパク質、すなわち肝臓アクチビンまたは肝臓アクチビンのドメイン、例え ば成熟成長因子領域の、IgFcへの融合)、抗体および抗イディオタイプ抗体(Fab 断片を含む)、アンタゴニスト、あるいはアゴニストは全て、細胞の成長および/ または分化の調節、および/またはそれに関連する障害の治療ために使用するこ とができる。例えば、有効量の不活性肝臓アクチビン(例えばエンドプロテオリ ティックモチーフが成熟成長因子に対応するポリペプチドの形成を妨げるように 改変されたもの)、または肝臓アクチビンに良く似た抗イディオタイプ抗体（ま たはそのFab）の投与により、肝臓アクチビン受容体に結合してこれをふさぎ、 これにより、 活性状態で使用できるアクチビン受容体を減少させ、あるいはシグナルカスケー ドを妨げるあるいは低減させ、最終的には細胞の成長および/または分化に悪影 響を与える。このような肝臓アクチビン産物をコードするヌクレオチド構築物は 、このような肝臓アクチビン産物をin vivoで発現するよう宿主細胞を遺伝子操 作するために使用することができる。遺伝子操作されたこれらの細胞は、体内で “バイオリアクター”として機能し、肝臓アクチビンタンパク質、ポリペプチド または誘導体の連続的な供給を送達して、アクチビン受容体部位に結合してこれ をふさぐ。機能的肝臓アクチビンタンパク質、ポリペプチド、または誘導体をコ ードするヌクレオチド構築物；突然変異肝臓アクチビン；およびアンチセンスお よびリボザイム分子は全て、“遺伝子治療”方法において、細胞の成長および分 化の調節および/またはそれに関連する障害の治療における肝臓アクチビンの発 現および/または活性の調節のために、使用することができる。本明細書中に記 載される研究は、β_C産物が肝再生、致命欠陥動物モデルにおける骨の成長、お よび造血を刺激することを示す。このような研究は、肝臓アクチビンが、細胞の 成長．および分化を調節するためのサイトカインとしも、および/または生理学 的プロセス（例えば造血および骨の成長）を調節するためのホルモンとしても、 有用であろうことを示している。さらに、これらの研究は、β_Cが潜在性TGF-β 結合タンパク質-3（LTBP-3）にin vitroで特異的に結合することを示す。従って 、本発明は、細胞の成長および分化を調節するためおよび/またはそれに関係す る障害を治療するための薬剤の調合ならびに方法も含有する。 この発明は、脊椎動物の成体期の間に肝臓中に特異的かつ高レベルで発現する アクチビンのサブグループの驚くべき発見に一部基づいている。この発見は、TG F-βスーパーファミリーメンバーである骨形態形成タンパク質-2および-4の中の 保存されたコード配列に基づく合成変性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて マウスゲノムDNAおよびcDNAを増幅することにより、可能となった。これらのPCR 反応の産物をクローン化し、標識し、マウス肝臓cDNAライブラリーをスクリーニ ングするためのプローブとして 使用した。これらのプローブの１つは、TGF-βスーパーファミリーのアクチビン メンバーに相同的なタンパク質を、複合して(in composite)コードするオーバー ラップした一連のcDNAクローンにハイブリダイズした。この遺伝子は、アクチビ ンβ_Cとして示した。複数の成体組織のノーザンブロット分析は、アクチビンβ_C が、約2.0kbの転写産物として肝臓中に高レベルかつ特異的に発現することを示 す(図６を参照)。アクチビンβ_Cをコードする遺伝子を発現ベクターにクローン 化したあと、この構築物を無細胞転写および翻訳系中に発現させた。 マウスアクチビンβ_Cゲノム遺伝子座をクローン化している間に、アクチビン β_C遺伝子の約5.0kb下流に位置するゲノム配列が、低ストリンジェンシー条件下 においてアクチビンβ_CcDNAに対応するプローブにハイブリダイズするのが観察 された。このゲノム配列をサブクローン化し、標識し、高ストリンジェントな条 件下においてマウス肝臓cDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブ として使用した。このスクリーニングにより得たオーバーラップするcDNAクロー ンの複合物の配列分析は、これらが、アクチビンβ_Cと強い配列相同性を示す新 規なアクチビンβサブユニットをコードする遺伝子に対応することを示している 。この遺伝子はアクチビンβ_Eで示した。複数の成体組織のノーザンブロット分 析は、アクチビンβ_Eが、約3.2kbの転写産物として肝臓中に高レベルかつ特異的 に発現することを示す(図６を参照)。 マウスアクチビンβ_EcDNAを標識し、ヒト成人肝臓cDNAライブラリーをスクリ ーニングするためのプローブとして使用した。このプローブは、２つのオーバー ラップするcDNAクローンにハイブリダイズした。配列分析により、推定分子量が 39kDでありN結合グリコシル化の可能性がある１つの部位を有するタンパク質を コードする1050ヌクレオチドからなる推定オープンリーディングフレームが見出 された。配列比較分析は、このタンパク質がマウスアクチビンβ_Eに相同的であ ることを示す。ヒトアクチビンβ_Eの完全ヌクレオチド配列および推定アミノ酸 配列は図５に示されている。 本発明の様々な態様は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記 載される。 5.1 肝臓アクチビン遺伝子 本発明の肝臓アクチビンヌクレオチド配列には、（a）図１、図２および図５ に示したDNA配列、またはアメリカ型微生物株保存機関(American Type Culture Collection,ATCC)に寄託されたような大腸菌株DH5αの中のcDNAクローンであるp bC、pbEまたはpbHEに含まれるDNA配列；（b）図１、図２および図５に示される アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはATCCに寄託されたcDNAクロ ーンであるpbC、pbE、もしくはpbHEによりコードされる肝臓アクチビンアミノ酸 配列をコードするヌクレオチド配列；（c）高ストリンジェント条件（例えば65 ℃での0.5M NaHPO₄、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTA中のフィルタ ー結合DNAへのハイブリダイゼーション、および68℃での0.1xSSC/0.1% SDS中で の洗浄(Ausubel F.M.ら編、1989、Current Protocols in Molecular Biology，V ol．I，Green Publishing Associates，Inc.，and John Wiley & sons，Inc.，N ew York，atp．2.10.3))下において、図１、図２および図５に示されたDNA配列 、またはATCCに寄託されたcDNAクローンであるpbC、pbE、もしくはpbHE中に含ま れるDNA配列の相補配列にハイブリダイズし、および機能的に同等な遺伝子産物 をコードするヌクレオチド配列；および（d）より低いストリンジェント条件(例 えば中程度のストリンジェント条件、例えば42℃における0.2xSSC/0.1% SDS中で の洗浄（Ausubelら、1989、前掲）)下において、図１、図２および図５に示した アミノ酸配列をコードするDNA配列またはATCCに寄託されたcDNAクローンであるp bC、pbE、もしくはpbHE中に含まれるDNA配列の相補配列にハイブリダイズし、か つ機能的に同等な肝臓アクチビン遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列、が 含まれる。肝臓アクチビンの機能的同等物には、同種または他種の中に存在する 天然に生じる肝臓アクチビン、および突然変異肝臓アクチビン（天然に生じるも のであっても遺伝子操作されたものでもよい）が含まれる。また、本発明は、配 列（a）〜（d）の変性変異体も含む。 本発明は、先の段落に記載した(a)〜(d)のヌクレオチド配列にハイブリダイズ し、それゆえそのヌクレオチド配列の相補配列である核酸分子、好ましくはＤＮ Ａ分子も包含する。このようなハイブリダイゼーション条件は、上述したように 、高ストリンジェントであるか、わずかに高ストリンジェントであればよい。核 酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド(「オリゴ」)である場合には、高ストリンジ ェントな条件とは、例えば、6×SSC／0.05％ピロリン酸ナトリウム中、37℃(14 塩基オリゴの場合)、48℃(17塩基オリゴの場合)、55℃(20塩基オリゴの場合)、 および60℃(23塩基オリゴの場合)で洗浄することをいう。これらの核酸分子は、 肝臓アクチビンアンチセンス分子をコードするかまたは肝臓アクチビンアンチセ ンス分子として作用するものであり、例えば、遺伝子調節に有用である(肝臓ア クチビン核酸配列の増副反応におけるアンチセンスプライマーに対しておよび／ またはアンチセンスプライマーとして)。肝臓アクチビン調節に関しては、この ような技術を使用して、例えば細胞の成長および／または分化を調節することが できる。細胞の成長および／または分化としては、肝再生および／または骨成長 の刺激が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、このような配列をリボ ザイムおよび／または三重らせん配列の一部として使用することができ、同様に 肝臓アクチビンの遺伝子調節に有用である。さらに、このような分子は、例えば 、細胞増殖性および／または細胞分化性障害を引き起こす原因となる特定の肝臓 アクチビン対立遺伝子の有無を検出する診断方法の成分として使用することもで きる。 上述の肝臓アクチビンヌクレオチド配列以外にも、同一種に存在する完全長肝 臓アクチビンｃＤＮＡもしくは遺伝子配列、および／または他の種に存在する肝 臓アクチビン遺伝子の同族体を、過度の実験を行うことなく、当該技術分野で周 知の分子生物学的手法によって、同定しかつ容易に単離することができる。近親 の種における肝臓アクチビンの同族体の同定は、薬剤探索のためのヒトにより近 い動物モデル系を開発するのに有用である可能性がある。目的の生物由来のｃＤ ＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを、本明細書に記載のヌクレ オチドをハイブリダイゼーシ ョンプローブまたは増幅プローブとして使用するハイブリダイゼーションによっ てスクリーニングすることができる。例えば、上述の肝臓アクチビンヌクレオチ ド配列は、ヒト細胞から単離されたゲノムＤＮＡから、および／または肝臓アク チビン遺伝子を発現することが判っているかまたは予想されるヒト細胞もしくは 組織（例えば、成体の肝臓組織またはATCCヒト肝細胞系7004、7120、7128、7137 、7154、7274、7284、7290、7297、7503、7705、7821、7837、7859もしくは7864 ）から作製したｃＤＮＡから、別のヒト肝臓アクチビン同族体を同定および単離 するプローブとして用いることができる。さらに、ゲノムに含まれる他の遺伝子 座において、肝臓アクチビン遺伝子産物の１つ以上のドメインに対して高度の相 同性を有するタンパク質をコードする遺伝子を同様の技術によって同定すること もできる。ｃＤＮＡライブラリーの場合、このようなスクリーニング技術によっ て、同一種または異なる種において選択的スプライシングを受けた転写産物に由 来するクローンを同定することができる。 スクリーニングは、二重フィルターを用いるフィルターハイブリダイゼーショ ンによって行うことができる。図１、図２および図５に示すように、標識したプ ローブには肝臓アクチビンヌクレオチド配列の塩基対が少なくとも15〜30個含ま れる。使用するハイブリダイゼーションの洗浄条件は、標識配列を誘導した生物 とは別種の生物からｃＤＮＡライブラリーを誘導した場合には、低ストリンジェ ンシーでなければならない。ヒト肝臓アクチビン同族体のクローニングに関して は、マウス肝臓アクチビンブローブを用いて、例えば、ハイブリダイゼーション を例えばChurch緩衝液（7％SDS、250mM NaHPO₄、2μM EDTA、1％BSA）中で65℃ で一晩行うことができる。洗浄は、2×SSC、0.1％SDSで65℃、次いで0.1×SSC、 0.1％SDSで65℃にて行うことができる。 低ストリンジェンシー条件は当業者には周知であり、予想されるように、ライ ブラリーと標識配列を誘導する特異的な生物に応じて変わるものである。このよ うな条件に関する手引きとしては、例えば、Sambrookら，1989，Molecular Clon ing，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press， N.Y.;およびAusubelら，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Gree n Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.を参照されたい。 あるいは、標識した肝臓アクチビンヌクレオチドプローブを使用して、目的の 生物由来のゲノムライブラリーをスクリーニングしてもよい。その際、適切なス トリンジェント条件を使用する。ヒトゲノムクローンの同定および特性決定は、 細胞の成長および／もしくは分化を制御するための、並びに／またはヒト患者の 細胞増殖性および／もしくは細胞分化性障害を治療するための診断検査法と臨床 プロトコールを設計するのに役立つ。例えば、ヒト遺伝子のイントロン／エキソ ン境界に隣接する領域由来の配列を用いて、エキソン、イントロン、スプライス 部位（例えば、スプライス受容部位および／またはスプライス供与部位）等にお ける突然変異を検出する増幅アッセイで使用するプライマーを設計することがで き、このプライマーは診断で使用することができる。 さらに、本明細書に開示の肝臓アクチビン遺伝子産物に含まれるアミノ酸配列 に基づいて設計された縮重オリゴヌクレオチドプライマーの２つのプールを使用 するPCRを行つて、他の肝臓アクチビンおよび他の遺伝子同族体を目的の生物の 核酸から単離することもできる。このようなブライマーを使用して、任意のＲＮ ＡまたはＤＮＡ起源（好ましくは、ｃＤＮＡライブラリー）から目的の配列を増 幅させてもよい。PCRは、例えば、Perkin-Elmer CetusサーマルサイクラーとTaq ポリメラーゼ(Gene Amp^TM)を使用して行うことができる。増幅させるＤＮＡには 、任意の脊椎動物種から調製したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡが 含まれる。PCR反応で使用するための、複数の異なる縮重プライマーを合成する こともできる。PCR反応を開始させるのに使用するハイブリダイゼーション条件 のストリンジェンシーを変えることも可能であり、これにより、クローニングす べき肝臓アクチビン遺伝子と既知の肝臓アクチビン遺伝子との間のヌクレオチド 配列の相同性を高くも低くもできる。核酸のプライマー依存型増幅のための他の 手段は当業者に公知であり、利用することができる。 PCR産物をサブクローニングおよび配列決定して、ノーザンブロットをプロー ブするのに使用してもよく、これにより、増幅配列が確実に肝臓アクチビン遺伝 子の配列に該当するようになる。次いで、PCR断片を使用して、各種方法に．よ り完全長ｃＤＮＡクローンを単離してもよい。例えば、増幅断片を標識して、バ クテリオファージｃＤＮＡライブラリー等のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ ングに使用してもよい。あるいは、標識断片を使用して、ゲノムライブラリーの スクリーニングによってゲノムクローンを単離してもよい。 PCR技術を利用して完全長ｃＤＮＡ配列を単離することもできる。例えば、標 準的な手順に従って、適当な細胞起源または組織起源（即ち、肝臓アクチビン遺 伝子を発現することが判っているかまたは予想される起源、例えば、胚組織、成 体肝臓組織、またはATCCヒト肝細胞系7004、7120、7128、7137、7154、7274、72 84、7290、7297、7503、7705、7821、7837、7859もしくは7864等）からＲＮＡを 単離することができる。第一鎖の合成を開始させるための、増幅断片の5'末端の 大部分に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＲＮＡ上で逆転写 反応を行うことができる。次いで、得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、標 準的なターミナルトランスフェラーゼ反応を用いてグアニンで「テール化(taile d)」することができる。このハイブリッドをRNAase Hで消化し、次いで第二鎖合 成をポリＣプライマーで開始することができる。このように、増幅断片の上流に あるｃＤＮＡ配列を容易に単離することができる。使用し得るクローニング方法 の総説は、例えば、Sambrookら，1989，前掲を参照されたい。 あるいは、本発明の肝臓アクチビン遺伝子は、ゲノムＤＮＡを用いてエキソン トラッピングシステム(exon trapping system)によって単離ことができる(Nehls ら，1994，Oncogene 9(8):2169-2175;Vernaら，1993，Nucleic Acids Res．21(2 2):5198:5202;Auchら，1990，Nucleic Acids Res．18(22):6743-6744)。 肝臓アクチビン遺伝子配列を補助的に使用して変異体肝臓アクチビン遺伝子対 立遺伝子を単離することができる。例えば、限定するものではない が、細胞増殖性および／または細胞分化性障害に寄与する遺伝子型を有すること が判っているかまたは提案されている個体から、このような変異体対立遺伝子を 単離することができる。次いで、変異体対立遺伝子および変異体対立遺伝子産物 を後述の治療システムおよび診断システムで利用してもよい。さらに、このよう な肝臓アクチビン遺伝子配列を使用して、細胞の成長および／または分化に影響 を及ぼす可能性のある肝臓アクチビン遺伝子調節（例えば、プロモーターまたは プロモーター／エンハンサー）の欠損を検出することができる。 例えば、PCR(当業者に周知の技術)を使用して、変異体肝臓アクチビン遺伝子 のｃＤＮＡを単離することができる。この場合、オリゴ-dTオリゴヌクレオチド を、変異体肝臓アクチビン対立遺伝子を保有すると思われる個体の肝臓組織から 単離されたｍＲＮＡへハイブリダイズさせ、新しい鎖を逆転写酵素で伸長させる ことで、第一のｃＤＮＡ鎖を合成することができる。次いで、ｃＤＮＡの第二鎖 を、正常な遺伝子の5'末端へ特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを 用いて合成する。これらの２つのプライマーを使用して、次いで産物をPCRによ って増幅し、適切なベクターへクローニングして、当業者に周知の方法によって ＤＮＡ配列分析を行う。変異体肝臓アクチビン対立遺伝子のＤＮＡ配列を正常な 肝臓アクチビン対立遺伝子のＤＮＡ配列と比較することにより、変異体肝臓アク チビン遺伝子産物の機能の喪失または改変の原因となる突然変異を確認すること ができる。増幅された肝臓アクチビン遺伝子断片の異常を検出するための別のハ イブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイとしては、サザン分析、単一 鎖配座多型性分析(single stranded conformational polymorphism analysis;SS CP)、変性勾配ゲル分析、およびPCR分析が挙げられるが、これらに限定されない 。 あるいは、ゲノムライブラリーは、変異体肝臓アクチビン対立遺伝子を保有す ることが予想されるかまたは判っている個体から得られたＤＮＡを用いて構築す ることができ、ｃＤＮＡライブラリーは、肝臓由来のまたは変異体肝臓アクチビ ン対立遺伝子を発現することが判っているかもしくは 予想される他の組織由来のＲＮＡを用いて構築することができる。次いで、正常 な肝臓アクチビン遺伝子またはその任意の適切な断片を標識し、プローブとして 使用して、このようなライブラリーにおける対応の変異体肝臓アクチビン対立遺 伝子を同定することができる。次いで、変異体肝臓アクチビン遺伝子配列を含有 するクローンを精製し、当業者に周知の方法に従って配列分析を行うことができ る。 さらに、例えば、変異体肝臓アクチビン対立遺伝子を保有することが予想され るかまたは判っている個体において、このような変異体対立遺伝子を発現するこ とが判っているかまたは予想される胚組織または成体肝臓組織から単離されるＲ ＮＡから合成されるｃＤＮＡ利用して発現ライブラリーを構築することができる 。この方法では、推定される変異体組織によって作製された遺伝子産物は、第5. 3節に後述するように、正常な肝臓アクチビン遺伝子産物に対して産生された抗 体を併用する標準抗体スクリーニング技術を使用して発現およびスクリーニング することができる。（スクリーニング技術については、例えば、Harlow，E．and Lane，eds.，1988，“Antibodies:A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbo r Press，Cold Spring Harbor.を参照されたい。）肝臓アクチビン突然変異によ って機能が改変された発現遺伝子産物が得られる場合(例えば、ミスセンスまた はフレームシフト突然変異の結果として)、肝臓アクチビンに対する抗体のポリ クローナル集団は、変異体肝臓アクチビン遺伝子産物と交差反応する可能性があ る。このような標識抗体との反応によって検出されるライブラリークローンは、 当業者に周知の方法に従って精製および配列分析を行うことができる。 本発明は、変異体肝臓アクチビンタンパク質、ポリペプチド、肝臓アクチビン 誘導体(ペプチド断片を含む)、末端切断された肝臓アクチビン、および肝臓アク チビン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列も包含する。このヌクレオ チド配列としては、限定するものではないが、3'非翻訳領域に相当するヌクレオ チドの全部または一部が欠失している末端切断されたヌクレオチド配列；第5.2 節に記載（後述）の変異体肝臓アクチビン をコードするヌクレオチド配列；肝臓アクチビンのＮ末端シグナルペプチドドメ イン、プロペプチドドメイン、および成熟成長因子ドメインまたはこれらのドメ インの一部に対応するポリペプチドまたはペプチド;並びに１つまたは２つのド メインが欠失している末端切断された肝臓アクチビン(例えば、N末端シグナルペ プチドおよび／またはプロペプチドドメインを欠く成熟成長因子ドメイン、また はエンドプロテアーゼ分解による切断モチーフおよび／またはN末端シグナルペ プチドドメイン、プロペプチドドメイン、および／または成熟成長因子ドメイン の全部または一部を欠く末端切断された非機能性肝臓アクチビン)が挙げられる 。融合タンパク質をコードするヌクレオチドとしては、限定するものではないが 、関連のないタンパク質もしくはペプチド[例えば、成熟成長因子ドメイン配列 、得られる融合タンパク質の血流中における安定性と半減期を増大させるIg Fc ドメイン(例えば肝臓アクチビン-Ig)、またはマーカーとして使用できる酵素、 蛍光タンパク質、もしくは発光タンパク質]と融合した完全長肝臓アクチビン、 末端切断された肝臓アクチビン、ポリペプチドまたは肝臓アクチビン誘導体（断 片を含む）が挙げられる。 本発明は、(a)上述の肝臓アクチビンをコードする配列および／またはその相 補配列（即ち、アンチセンス）のいずれをも含有するＤＮＡベクター、(b)コー ド配列の発現を指示する調節エレメントに機能可能なように結合した上述の肝臓 アクチビンコード配列のいずれをも含有するＤＮＡ発現ベクター、並びに(c)宿 主細胞内でのコード配列の発現を指示する調節エレメントに機能可能なように結 合した上述の肝臓アクチビンコード配列のいずれをも含有する遺伝子工学的に作 製された宿主細胞も包含する。本明細書中、調節エレメントとしては、限定する ものではないが、発現を始動(drive)かつ調節する当業者に公知の誘導性および 非誘導性のプロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび他のエレメントが 挙げられる。このような調節エレメントとしては、限定するものではないが、サ イトメガロウイルスhCMV即時型遺伝子、SV40アデノウイルスの初期または後期プ ロモーター、lac系、trp系、TAC系、TRC系、ファージAの主要なオペレーターお よび プロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナ ーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、並びに酵母α-接合 因子のプロモーターが挙げられる。 さらに、本発明は、肝臓アクチビン遺伝子に隣接することが見出されたゲノム ヌクレオチド配列を包含する。このようなゲノムヌクレオチド配列には、肝臓ア クチビンの発現を始動および調節するように作用する調節エレメントを含有する 配列が含まれる。調節エレメントは、当業者に周知のルーチン技術を使用して同 定することができる。例えば、肝臓アクチビン遺伝子の上流に位置するゲノムヌ クレオチド配列を、CAT遺伝子等のリポーター遺伝子の隣へクローニングするこ とができる。ヌクレオチド配列の転写活性は、リポーター遺伝子活性についてア ッセイを行うことにより判定することができる。調節エレメントをより正確に規 定するためには、欠失変異体を作製してリポーター遺伝子活性について試験を行 えばよい。 5.1.1 アクチビンβ_C遺伝子 マウスアクチビンβ_CのｃＤＮＡ配列(配列番号１)および推定アミノ酸配列(配 列番号２)を図１に示す。マウスアクチビンβ_Cシグナル配列は、図１のアミノ酸 残基１〜約20にわたっている。塩基性残基のクラスター（KHRVRRR、アミノ酸230 〜236）は、予測されるプロペプチドドメインおよび成熟成長因子ドメインを規 定するエンドプロテアーゼ分解による切断部位として機能することができる。プ ロペプチドドメインは、およそ216残基からなり、図１の約アミノ酸残基21〜約2 36にわたっている。成熟成長因子ドメインは、およそ116残基からなり、図１の 約アミノ酸残基237〜約352にわたっている。マウスアクチビンβ_CｃＤＮＡクロ ーンから誘導された配列を使用して、実施例に記載の通り(後述)、マウスのゲノ ムＤＮＡライブラリーと肝臓ｃＤＮＡライブラリーを低ストリンジェンシー条件 下でスクリーニングし、β_Eに対応する遺伝子をクローニングした。 5.1.2 アクチビンβ_E遺伝子 マウスアクチビンβ_EのｃＤＮＡ配列(配列番号３)および推定アミノ酸配列(配 列番号４)を図２に示す。マウスアクチビンβ_Eシグナル配列は、図２のアミノ酸 残基１〜約21にわたっている。塩基性残基のクラスター（RARRR、アミノ酸残基2 32〜236）は、予測されるプロペプチドドメインおよび成熟成長因子ドメインを 規定するエンドプロテアーゼ分解による切断部位として機能することができる。 プロペプチドドメインは、およそ215残基からなり、図２の約アミノ酸残基22〜 約236にわたっている。アクチビンβ_Eサブユニットの成熟成長因子ドメインは、 およそ113残基からなり、図２の約アミノ酸残基237〜約349にわたっている。 5.1.3 ヒトアクチビンβ_E遺伝子 マウスアクチビンβ_EｃＤＮＡクローンを使用してヒト肝臓ｃＤＮＡライブラ リーを低ストリンジェンシー条件下でスクリーニングした。単離したヒトアクチ ビンβ_EのｃＤＮＡ配列(配列番号５)および推定アミノ酸配列(配列番号６)を図 ５に示す。配列分析より、推定分子量39kDのタンパク質をコードする1050ヌクレ オチドからなる予測オープンリーディングフレームが判明した。推定メチオニン 開始コドンはヌクレオチド77に位置する。翻訳終結シグナル(TAG)に先行する規 定CXCX配列も同定した。 ヒトアクチビンβ_Eサブユニットは、他のTGF-βスーパーファミリーメンバー と同様に構成(organized)されている。予測開始Met残基には、約20アミノ酸から なる特徴的なシグナルペプチドが続いている。このシグナルペプチドの下流では 、予測されるプロペプチドドメインおよび成熟成長因子ドメインが同定された。 これらのドメインは、エンドプロテアーゼ分解による推定切断部を１つ以上もた らす塩基性アミノ酸のクラスターによって隔てられていた。これらの切断部位を 実際に使用する場合には、ヒトアクチビンβ_Eサブユニットのプロペプチドドメ インおよび成熟成長因子ドメインは、それぞれ約215および114アミノ酸からなる であろう。 マウスおよびヒトのアクチビンβ_Eの予測カルボキシ末端アミノ酸配列は非常 に相同性が高く、成熟成長因子領域に対して95％よりも高いアミノ 酸同一性を有する。両方のコード配列は、合計９つのシステイン残基を含有する 。本発明者らは、システインが隔てられていることと他の保存アミノ酸が含まれ ることが、アクチビンと、アクチビンほどではないがTGF-β自体の最大の特徴で あることを見出した。成熟成長因子領域内の配列の同一性(％)を表にしたところ 、ヒトアクチビンβ_Eは、ヒトアクチビンβ_Aと45％の同一性を示し、ヒトアクチ ビンβ_Bと47％の同一性を示し、ヒトアクチビンβ_Cと64％の同一性を示し、アフ リカツメガエル・アクチビンβ_Dと62％の同一性を示した。対照的に、ヒトアク チビンβ_EをTGF-βスーパーファミリーの他のメンバーと比較した場合には、わ ずかに20〜40％のアミノ酸配列の同一性が認められただけであった。本発明者ら の知る限りでは、これは、ヒトからのアクチビンβ_Eの単離についての最初の報 告である。 5.1.4 マウスアクチビン遺伝子座 マウスアクチビン遺伝子座の遺伝子地図を図4Aに示す。ゲノムマウスクローン 由来のマウスアクチビン遺伝子座のヌクレオチド配列を図4Cに示す。本発明者ら の研究より、ある点では、アクチビンβ_Cおよびβ_Eは、他の既知のアクチビンよ りも、互いに類似していることが示唆される：(a)これらの遺伝子は、アクチビ ンβ_Cの3’末端をアクチビンβ_Eの5'末端から隔てているわずか5-kbpのゲノムＤ ＮＡで物理的に結合しており、(b)両遺伝子座の構成(organization)は類似して おり、１つの介在配列で隔てられた２つのコードエキソンからなり、(c)両方の アクチビンの予測カルボキシ末端配列が非常に相同が高く、成熟成長因子領域に 対して62％のアミノ酸同一性を有し、(d)両遺伝子とも、成体マウスの肝臓にお いて特異的かつ高度に発現されるようであり、(e)複数のin vitroアッセイの結 果から、アクチビンβ_Cおよびβ_Eのホモ二量体がHepG2細胞の増殖を刺激するこ とが判明した。これらを合わせて考えると、本発明者らのデータからは、アクチ ビンβ_Cおよびβ_Eサブユニット遺伝子が、縦列重複を行った共通の祖先から進化 した可能性が示唆される。これらの構造および機能に関するデータは、アクチビ ンβ_Cおよびβ_Eサブユニットを他の既知のアクチビンから区別し、 これらのサブユニットがTGF-β様分子の特有のサブグループに該当することを示 唆している。 5.2 肝臓アクチビンタンパク質およびポリペプチド 肝臓アクチビンタンパク質、ポリペプチドおよび誘導体(断片を含む)；肝臓ア クチビンの変異体、末端切断体もしくは欠失体；並びに／または肝臓アクチビン 融合タンパク質を様々な用途について調製することができる。例えば、限定する ものではないが、診断アッセイに使用でき、細胞の成長および／もしくは分化の 調節に有用な、並びに／または関連する障害の治療に有用な製剤試薬として使用 できる抗体の作製が挙げられる。 肝臓アクチビンβ_Cおよびβ_Eは、翻訳開始部位と一致するＤＮＡ配列のメチオ ニンから開始し、ペプチド分泌の典型的な疎水性単一配列が続く。マウスアクチ ビンβ_Cおよびβ_Eの予測されるプロペプチドドメインおよび成熟成長因子ドメイ ンは、それぞれ約216および115アミノ酸と215および113アミノ酸である。ヒトア クチビンβ_Eの予測されるプロペプチドドメインと成熟成長因子ドメインは、約2 15および114アミノ酸である。MISを除く全ての既知のTGF-βスーパーファミリー メンバーと同様、アクチビンβ_Cおよびβ_EはC末端から約120アミノ酸の塩基性残 基のクラスターを有し、プロペプチドドメインと成熟成長因子ドメインの接合部 にエンドプロテアーゼ分解による切断部位を形成する。(Roberts B，Sporn MB 1 900，The Transforming Growth Factor-βs in Handbook of Experimental Phar macology，95（Part I）Sporn MB，Roberts AB eds.，Springer-Verlag，Hedelb erg，pp.419-472;Vale W，Hsueth A，River J，Yu J 1990 in Peptide Growth F actors and Their Receptors，95（Part II）Sporn MB，Roberts ABeds，Spring er-Verlag，Heldelberg，pp.211-248;and Centrella et al.，1994，Endocr Rev 15:27-38)。肝臓アクチビンβ_Cおよびβ_Eの成熟成長因子ドメインと他のアクチ ビンおよび他のTGF-βスーパーファミリーメンバーとの間のアライメントを図３ に示す。肝臓アクチビン成熟成長因子ドメインは、TGF-βスーパーファミリーメ ンバー間で保存されている間隔のパ ターンを示す９つのシステイン残基を含有する。肝臓アクチビンβ_Cおよびβ_Eは 、アクチビンβ_Aおよびβ_Bに対して有意な相同性を示すものの、アクチビンβ_D に最も密接に関連している。 図１は、マウス肝臓アクチビンβ_Cサブユニットのアミノ酸配列を示す。シグ ナル配列はアミノ酸１〜20にわたっている。塩基性残基のクラスター（KHRVRRR 、アミノ酸230〜236）は、予測されるプロペプチドドメインおよび成熟成長因子 ドメインを規定するエンドプロテアーゼ分解による切断部位として機能すること ができる。プロペプチドドメインは、およそ216残基からなり、約アミノ酸残基2 1〜約236にわたっている。成熟成長因子ドメインは、およそ115残基からなり、 図１の約アミノ酸残基237〜約352にわたっている。図２は、マウス肝臓アクチビ ンβ_Eタンパク質のアミノ酸配列を示す。シグナル配列はアミノ酸残基１〜21に わたっている。塩基性残基のクラスター（RARRR、アミノ酸残基232〜236）は、 予測されるプロペプチドドメインおよび成熟成長因子ドメインを規定するエンド プロテアーゼ分解による切断部位として機能することができる。プロペプチドド メインは、およそ215残基からなり、約アミノ酸残基22〜約236にわたっている。 成熟成長因子ドメインは、およそ113残基からなり、約アミノ酸残基237〜約349 にわたっている。 図５は、ヒト肝臓アクチビンβ_Eサブユニットのアミノ酸配列を示す。ヒトア クチビンβ_Eサブユニットは、他のTGF-βスーパーファミリーメンバーと同様に 構成されている。予測される開始MET残基には、約20アミノ酸からなる特徴的な シグナルペプチドが続いている。予測されるプロペプチドドメインおよび成熟成 長因子ドメインを規定するエンドプロテアーゼ分解による切断部位をもたらす塩 基性アミノ酸のクラスターを同定した。一旦切断されれば、ヒトアクチビンβ_E のプロペプチドドメインおよび成熟成長因子ドメインは、それぞれ約215および1 14アミノ酸からなるであろう。 可能性のあるN結合型グリコシル化部位（すなわち、アミノ酸配列モチーフN-X -SまたはN-X-T）は、マウスβ_Cおよびβ_E肝臓アクチビンサブユニットならびに ヒトβ_E肝臓アクチビンサブユニットの両方のプロペプチ ドドメインで見出される。図１に示すマウスβ_C配列では４つの可能性のあるＮ 結合型グリコシル化部位が同定でき(アミノ酸残基111、143、161および173から 始まるトリペプチドモチーフを参照のこと)、図２に示すマウスβ_E配列では１つ の可能性のあるＮ結合型グリコシル化部位が同定できる(アミノ酸残基198から始 まるトリペプチドモチーフを参照のこと)。 本発明の肝臓アクチビンのアミノ酸配列は、図１に示すアミノ酸配列(配列番 号２)、図２に示すアミノ酸配列(配列番号４)および図５に示すアミノ酸配列(配 列番号６)、ならびにATCCに寄託されているようなcDNAクローンpbC、ATCCに寄託 されているようなcDNAクローンpbE、およびATCCに寄託されているようなcDNAク ローンpbHEによってコードされるアミノ酸配列を含む。さらに、他のマウスおよ びヒトの肝臓アクチビンおよび肝臓アクチビン相同体も本発明に包含される。実 際には、上記の第5.1節で記載されている肝臓アクチビンヌクレオチド配列によ ってコードされるどのような肝臓アクチビンタンパク質も本発明の範囲内である 。そのような動物は、肝臓アクチビンを生産するための「バイオリアクター」と して使用するために作製され得る。 本発明はまた、いくつかの基準のいずれかによって判定した場合に第5.1節に 記載のヌクレオチド配列によってコードされる肝臓アクチビンと機能的に等価で ，あるタンパク質も包含し、その基準としては、(a)抗原性(すなわち、抗肝臓ア クチビン抗体と結合する能力)、(b)免疫原性(すなわち、肝臓アクチビンタンパ ク質またはポリペプチドと結合できる抗体を産生する能力)、(c)肝臓アクチビン の基質に結合する(または該基質への結合について肝臓アクチビンと競合する)) 能力、(d)肝臓アクチビンと多量体形成(multimerize)する能力、および(e)肝臓 アクチビン受容体と結合する能力、アクチビン受容体に対する結合親和性、その 結果生じるアクチビン受容体に結合することの生物学的影響、例えば、肝臓アク チビン等価物が適当な細胞型に存在する時のシグナル伝達、細胞代謝の変化(例 えば、イオンフラックス(ion flux)、チロシンリン酸化)、または表現型の変化 （例えば、細胞の成長および／または分化の刺激または抑制）が挙げられるが、 これらに限定されない。そのような機能的に等価である肝臓アクチビンタンパク 質には、第5.1節において上記される肝臓アクチビンヌクレオチド配列によって コードされるアミノ酸配列内でのアミノ酸残基の付加または置換であって、しか し結果的にはサイレントな変化となり、そのために機能的に等価な遺伝子産物を 生じる上記の付加または置換が含まれるが、それらに限定されない。アミノ酸の 置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性度、親水性度、および／ま たは両親媒性の類似性の基づいて行われ得る。例えば、非極性の（疎水性の）ア ミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェ ニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられ；極性で中性のアミ ノ酸としてはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラ ギンおよびグルタミンが挙げられ；正に荷電している（塩基性の）アミノ酸とし ては、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられ；負に荷電している（酸 性の）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。 本発明の範囲に含まれるものは、肝臓アクチビンタンパク質、ポリペプチド、 および例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による切断、抗体分子または他の細 胞リガンドへの結合などにより翻訳の間または翻訳後にそれぞれに（differenti ally）修飾された誘導体（断片を含む）である。多数の化学的修飾のいずれもが 、公知の技法によって行うことができ、そのような技法としては、例えば、臭化 シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH₄によ る特異的な化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシン 存在下での代謝合成；などが挙げられるが、それらに限定されない。具体的な実 施形態において、本発明の組成物は、他の分子にコンジュゲートして、該組成物 の水溶解性(例えば、ポリエチレングリコールとのコンジュゲート)、半減期、ま たは標的組織と結合する能力（例えば、該タンパク質を骨部位へターゲッティン グするためのビスホスホネートおよびフルオロクロームとのコンジュゲ ート）を増大させる。 さらに、非古典的なアミノ酸または化学的アミノ酸類似体を上記肝臓アクチビ ン配列中に置換または付加として導入することもできる。非古典的なアミノ酸と しては、通常のアミノ酸のD異性体、α−アミノイソ酪酸；4-アミノ酪酸、Abu； 2-アミノ酪酸、γ-Abu；ε-Ahx、６-アミノヘキサン酸；Aib、2-アミノイソ酪酸 ；3-アミノプロピオン酸；オルニチン；ノルロイシン；ノルバリン；ヒドロキシ プロリン；サルコシン；シトルリン；システイン酸；t-ブチルグリシン；t-ブチ ルアラニン；フェニルグリシン；シクロヘキシルアラニン；β-アラニン；フル オロ-アミノ酸；β-メチルアミノ酸のような「デザイナー」アミノ酸；Cα-メチ ルアミノ酸；Nα-メチルアミノ酸；および一般的なアミノ酸類似体が挙げられる が、これらに限定されない。さらに、このアミノ酸はＤ形（右旋性）であっても Ｌ形（左旋性）であってもよい。 肝臓アクチビンDNAには（当業者に周知の技法を用いて）ランダム突然変異を 適用して、得られた突然変異型肝臓アクチビンを活性について試験することがで きるが、肝臓アクチビンコード配列の部位特異的突然変異を遺伝子工学的に作製 （engineered）し(この場合にも、当業者に周知の技法を用いる)、タンパク質と 結合するためのより高い、またはより低い結合親和性および／または増大した機 能（例えば、肝臓アクチビン受容体に対するより高い結合親和性、および／また はより大きなシグナリング能力）もしくは低下した機能（例えば、肝臓アクチビ ン受容体に対するより低い結合親和性および／または低下したシグナリング能力 ）を有する突然変異型肝臓アクチビンを作製することも可能である。 例えば、肝臓アクチビンおよび他のアクチビン群のメンバーのアライメントを 図３に示す。突然変異型肝臓アクチビンは、アイデンティティー領域は保持され るが、可変残基が（例えば、アミノ酸残基の欠失または挿入によって、または１ 以上の異なるアミノ酸残基の置換によって）改変されるようにして遺伝子工学的 に作製できる。可変位置での保存的改変を遺伝子工学的に作製して、機能（例え ば、肝臓アクチビン受容体結合親和性も しくはシグナリング能力、またはこれらの両方）を保持している突然変異型肝臓 アクチビンを得ることも可能である。これらの可変位置にて非保存的変化を遺伝 子工学的に作製して、機能（例えば、肝臓アクチビン結合親和性もしくはシグナ リング能力、またはこれらの両方）を改変することも可能である。あるいはまた 、機能の改変が望まれる場合には、保存領域の欠失または非保存的改変を遺伝子 工学的に作製してもよい。例えば、マウス肝臓アクチビンβ_Cのアミノ酸残基21 〜236(図１)、マウス肝臓アクチビンβ_Eのアミノ酸残基21〜236(図２)、ヒト肝 臓アクチビンβ_Eのアミノ酸残基17〜ほぼ236(図₅)もしくはマウス肝臓アクチビ ンβ_Cのアミノ酸残基237〜352(図１)、マウスアクチビンβ_Eのアミノ酸残基237 〜349(図２)、またはヒト肝臓アクチビンβ_Eのアミノ酸残基237〜350（図５）の 欠失または非保存的改変（置換または挿入）を遺伝子工学的に作製して、αおよ び／またはβサブユニットを有するダイマーを形成できず、そのために機能的な 構造コンフォメーションを達成できない突然変異型肝臓アクチビン、または肝臓 アクチビン受容体と結合はするが、しかしシグナリング非応答性(signaling-inc ompetent)である突然変異型肝臓アクチビンを得ることが可能である。図３に示 すマウス成長因子ドメインにおけるシステイン残基に対する非保存的改変を遺伝 子工学的に作製して、改変された構造を有し、そのために肝臓アクチビン受容体 に対する改変された結合親和性を有する突然変異型肝臓アクチビンを得ることが できる。 肝臓アクチビンコード配列に対して他の突然変異を行って、選択した宿主細胞 における発現、スケールアップ等にもっと良く適する肝臓アクチビンを作製させ ることができる。例えば、システイン残基を欠失させるかまたは別のアミノ酸と 置換して、ジスルフィド結合をなくすことができ；またはＮ結合型グリコシル化 部位を改変または削除して、Ｎ結合部位を高度グリコシル化(hyperglycosylate) することが知られている酵母宿主からより容易に回収され精製される均一な産物 の発現を達成することがすることができる。この目的のために、肝臓アクチビン プロペプチドドメインに存在するグリコシル化認識配列（N-X-SまたはN-X-T）の いずれ１つまたはそ れ以上の１番目または３番目のアミノ酸位置の一方または両方における様々なア ミノ酸置換によって、該プロペプチドが、修飾を受けたトリペプチド配列におい てグリコシル化されないようになるであろう。例えば、Miyajimaら，1986，EMBO J．5(6):1193-1197を参照されたい。 肝臓アクチビンの１以上のドメイン（例えば、Ｎ末端シグナルペプチド、プロ ペプチド、または成熟成長因子）に対応するペプチド；末端切断または欠失させ た肝臓アクチビン(例えば、シグナルおよび／またはプロペプチドドメインが欠 失している分子)；および全長肝臓アクチビンタンパク質、ポリペプチドもしく は誘導体（断片を含む）または末端切断した肝臓アクチビンが無関係のタンパク 質に融合している融合タンパク質もまた、本発明の範囲に含まれる。改変された アクチビンは、本節および上記の第5.1節に開示されている肝臓アクチビンヌク レオチドおよび肝臓アクチビンアミノ酸配列に基づいて設計できる。この融合タ ンパク質はまた、肝臓アクチビン配列と非肝臓アクチビンタンパク質配列との間 に位置する切断部位を含むように遺伝子工学的に作製して、該肝臓アクチビンタ ンパク質が該非肝臓アクチビン部分からより簡便に切り離されるようにしてもよ い。そのような融合タンパク質としては、IgFc融合物(これは、肝臓アクチビン タンパク質またはペプチドを安定化し、かつinvivoにおける半減期を延長させる )、またはマーカー機能を付与する酵素、蛍光性タンパク質もしくは発光性タン パク質との融合物が挙げられるが、それらに限定されない。 肝臓アクチビンタンパク質、ポリペプチドおよび誘導体（断片を含む）は化学 的に合成できるが(例えば、Creighton，1983，Proteins:Structures and Molecu lar Principles，W.H．Freeman & Co.，N.Y.を参照のこと)、肝臓アクチビンか ら誘導される大きなポリペプチド、および全長肝臓アクチビンそれ自体は、遺伝 子配列および／または核酸コード配列を発現させるための当業界で周知の技法を 用いる組換えDNA技術によって有利に作製できる。そのような方法を用いれば、 第5.1節に記載の肝臓アクチビンヌクレオチド配列ならびに適切な転写および翻 訳調節シグナルを含む発現ベクターが構築できる。これらの方法としては、例え ば、in vitro 組換えDNA法、合成法、およびin vivo遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Samb rookら，1989，前掲;Ausubelら，1989，前掲;Caruthersら，1980，Nuc．Acids R es．Symp．Ser．7:215-233；CreaおよびHorn，1980，Nuc．Acids Res．9(10):23 31；MatteucciおよびCaruthers，1980，Tetrahedron Letters 21:719；およびCh owおよびKempe，1981，Nuc．Acids Res．9(12):2807-2817に記載の技法を参照さ れたい。あるいはまた、例えば合成装置を用いて、肝臓アクチビンヌクレオチド 配列をコードできるRNAを化学的に合成してもよい。例えば、「Oligonucleotide Synthesis」，1984，Galt，M.J.編，IRL Press．Oxford（引用によりその全文を 本明細書に組み入れるものとする）に記載の技法を参照されたい。 本発明の肝臓アクチビンヌクレオチド配列を発現させるために、種々の宿主− 発現ベクター系が利用可能である。肝臓アクチビンタンパク質、ポリペプチドま たは誘導体は、培養物から、すなわち、肝臓アクチビンペプチドまたはポリペプ チドが分泌されない場合には宿主細胞から、そして肝臓アクチビンタンパク質、 ポリペプチドまたは誘導体が宿主細胞によって分泌される場合には培養培地から 回収できる。しかしながら、この発現系には、肝臓アクチビンまたは機能的等価 物をin situで発現する遺伝子工学的に作製された宿主細胞も包含される。 本発明の目的のために使用可能な発現系としては、肝臓アクチビンヌクレオチ ド配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA 発現ベクターで形質転換した細菌細胞系[例えば、大腸菌(E.coli)、B．subtilis ]；肝臓アクチビンヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換 した酵母細胞系(例えば、Saccharomyces、Pichia)；肝臓アクチビン配列を含む 組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細 胞系；肝臓アクチビンヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター［例 えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)、タバコモザイクウイルス(TMV)］ に感染させた、または肝臓アクチビンヌクレオチド配列を含む組換えプラスミド 発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換した植物細胞系；哺乳動物細 胞のゲ ノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳 動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、 ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含む組換え発現構築物を担持する哺乳 動物細胞系（例えば、COS、CHO、BHK、293、293T、3T3）が挙げられるが、それ らに限定されない。 細菌系では、肝臓アクチビン遺伝子産物を発現させようとする使用目的に応じ て幾つかの発現ベクターが有利に選択し得る。大量のかかるタンパク質を産生さ せようとする場合、例えば薬物製造の際または抗体を生じさせようとする場合に は、高レベルの、容易に精製される融合タンパク質産物の発現を指令するベクタ ーが望ましいであろう。そのようなベクターとしては、限定しようとするもので はないが、大腸菌発現ベクターpUR278（Rutherら，1983，EMBO J．2:1791）(こ の発現ベクターでは、肝臓アクチビンコード配列は個別に、融合タンパク質が産 生されるようにlacZコード領域とイン・フレームで該ベクターに連結されていて もよい)；pINベクター(InouyeおよびInouye，1985，Nucleic Acids Res．13:310 1-3109；Van HeekeおよびSchuster，1989，J．Biol．Chem,．264:5503-5509)；p cDNA（Invitrogen）真核性ベクターなどが挙げられる。外来ポリペプチドをグル タチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させるため には、pGEXベクターもまた使用可能である。通常、そのような融合タンパク質は 可溶性であり、溶菌させた細胞から、グルタチオン−アガロース・ビーズへ吸着 させた後で遊離グルタチオン存在下で溶出させることによって容易に精製できる 。このpGEXベクターは、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含んで 、クローニングされた標的遺伝子産物がGST部分から切り離されるように設計さ れる。 昆虫系では、外来遺伝子を発現するためのベクターとして、オートグラファ（ Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）が用いられる。このウ イルスはSpodoptera frugiperda細胞内で成長する。肝臓アクチビン遺伝子コー ド配列は、このウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別に クローニングされ、AcNPVプロモーター（例えば、 ポリヘドリンプロモーター）の制御下におくことができる。肝臓アクチビン遺伝 子コード配列がうまく挿入されると、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、かつ 閉塞結合していない（non-occluded）組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン 遺伝子によりコードされるタンパク質性コートのないウイルス）が生じる。これ らの組換えウイルスは次に、Spodoptera frugiperda細胞に感染させるのに用い られて、この細胞中で挿入遺伝子が発現される。（例えば、Smithら，1983，J． Virol．46:584；Smith，米国特許第4,215,051号を参照されたい。） 哺乳動物宿主細胞では、幾つかのウイルス系発現系が利用可能である。発現ベ クターとしてアデノウイルスが用いられる場合、目的の肝臓アクチビンヌクレオ チド配列は、アデノウイルス転写／翻訳調節複合物（例えば、後期プロモーター および三部分リーダー配列）と連結されてもよい。このキメラ遺伝子は次いで、 in vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入できる。こ のウイルスゲノムを非必須領域（例えば、E1またはE3領域）へ挿入することによ り、生存可能で、しかも感染させた宿主内で肝臓アクチビン遺伝子産物を発現可 能な組換えウイルスが得られる。例えば、LoganおよびShenk，1984，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 81:3655-3659を参照されたい。挿入した肝臓アクチビンヌク レオチド配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要となる場合 がある。これらのシグナルとしては、ATG開始コドンおよび隣接配列が挙げられ る。全肝臓アクチビン遺伝子またはcDNA（それ自体の開始コドンおよび隣接配列 を含む）が適切な発現ベクターに挿入される場合、追加の翻訳調節シグナルは全 く必要ないかもしれない。しかしながら、肝臓アクチビンコード配列の一部だけ が挿入される場合、おそらくはATG開始コドンを含む外因性の翻訳調節シグナル が供給されなければならない。さらに、この開始コドンは、インサート全体の翻 訳を確実にするために、目的のコード配列のリーディングフレームとイン・フェ ーズ(in phase)にしなければならない。これらの外因性の翻訳調節シグナルおよ び開始コドンは、天然起源および合成起源の両方の様々な起源のものあり得る。 発現の効率は、適切な転写 エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含ませることによって増大 させることができる。Bittnerら，1987，Methods in Enzymol．153:516-544を参 照されたい。 さらに、挿入した配列の発現をモジュレートする宿主細胞株、または所望の特 定の様式で遺伝子産物を修飾またはプロセッシングする宿主細胞株を選択しても よい。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グルコシル化）およびプロセ シング（例えば、切断）は該タンパク質の機能にとって重要となり得る。異なる 宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾の ための特有かつ特異的な機構を有する。発現された外来タンパク質の正確な修飾 およびプロセシングを確実にするために、適切な細胞系または宿主系が選択でき る。そのような哺乳動物宿主細胞としては、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK 、293、293T、3T3、WI38、特に胚組織または成体肝臓から得られる細胞系が挙げ られるが、それらに限定されない。 組換えタンパク質の長期にわたる高収率の産生のためには、安定な発現が好ま しい。例えば、上記の肝臓アクチビン配列を安定に発現する細胞系が遺伝子工学 的に作製可能である。宿主細胞は、ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使 うのではなく、選択マーカーおよび適切な発現調節因子（例えば、プロモーター 、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、など）によっ て調節されるDNAを用いて形質転換できる。外来DNAを導入した後、遺伝子工学的 に操作された細胞は富化培地で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地に切り替え る。組換えプラスミド内の選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、そして細 胞がその染色体内に該プラスミドを安定に組込み、増殖してフォーカスを形成で きるようにする。このフォーカスは次いで、細胞系にクローニングし増殖拡大(e xpand)させてもよい。この方法は、肝臓アクチビン遺伝子産物をin vitroで過剰 発現する細胞系を作製するのに有利に用い得る。 幾つかの選択系が使用可能であり、限定しようとするものではないが、例えば 、tk^-、hgprt^-またはaprt^-細胞では、それぞれ単純ヘルペスウイルス・ チミジンキナーゼ遺伝子(Wiglerら，1977，Cell 11:223)、ヒポキサンチン−グ アニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（SzybalskaおよびSzybalski ，1962，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 48:2026）およびアデニンホスホリボシル トランスフェラーゼ遺伝子（Lowyら，1980，Cell 22:817）が利用可能である。 また、抗代謝剤耐性も以下の遺伝子の選択の基準として利用可能である：dhfr（ メトトレキセートに対する耐性を付与するもの）(Wiglerら，1980，Natl．Acad ．Sci．USA 77:3567；O'Hareら，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:1527) ；gpt（ミコフェノール酸に対する耐性を付与するもの）(MulliganおよびBerg， 1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:2072)；neo（アミノグリコシドG-418に 対する耐性を付与するもの）(Colberre-Garapinら，1981，J．Mol．Biol．150:1 )；およびhygro（ハイグロマイシンに対する耐性を付与するもの）(Santerreら ，1984，Gene 30:147)。 あるいはまた、発現する融合タンパク質に特異的な抗体を用いることによって 、どのような融合タンパク質も容易に精製できる。例えば、Janknechtらが記載 する系は、ヒト細胞系で発現される非変性融合タンパク質の容易な精製を可能に する(Janknechtら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:8972-8976)。この系 では、目的の遺伝子は、該遺伝子のオープン・リーディング・フレームが６個の ヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳段階で(translationally)融合さ れるように、ワクシニア組換えプラスミドにサブクローニングされる。組換えワ クシニアウイルスに感染させた細胞からの抽出物をNi²⁺ニトロ酢酸−アガロース カラムにローディングし、ヒスチジンでタグ付けしたタンパク質をイミダゾール 含有緩衝液で選択的に溶出させる。 肝臓アクチビン遺伝子産物はまた、トランスジェニック動物内で発現させるこ とも可能である。肝臓アクチビン・トランスジェニック動物を作製するためには 、どのような種の動物も使用可能であり、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モ ルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、およびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、サ ルおよびチンパンジー）が挙げられるが、これ らに限定されない。 肝臓アクチビントランスジーンを動物に導入してトランスジェニック動物の創 始系統を作製するためには、当業界で公知のどのような技法を使用してもよい。 そのような技法としては、前核マイクロインジェクション(Hoope，P.C.およびWa gner，T.E.，1989，米国特許第4,873,191号)；生殖系(germ lines)へのレトロウ イルス媒介遺伝子導入(Van der Puttenら，1985，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 82:6148-6152)；胚幹細胞での遺伝子ターゲッティング(Thompsonら，1989，Cel l 56:313-321)；および胚のエレクトロポレーション（Lo，1983，Mol．Cell．Bl ol．3:1803-1814）が挙げられるが、これらに限定されない。そのような技法の 概説としては、Gordon，1989，Transgenic Animals，Intl．Rev．Cytol．115:17 1-229（引用により、その全文を本明細書に組み入れる）を参照されたい。 本発明は、肝臓アクチビントランスジーンを全部の細胞中に担持するトランス ジェニック動物、ならびに該トランスジーンを幾つかの、しかし全部ではない細 胞中に担持する動物（すなわち、モザイク動物）を提供する。このトランスジー ンは単一のトランスジーンとして組込まれてもよく、またはコンカテマー（例え ば、頭−頭タンデムまたは頭−尾タンデム）の形状で組込まれてもよい。このト ランスジーンはまた、例えばLaskoらの教示（Lasko，M.ら，1992，Proc．Natl． Acad．Sci．USA 89:6232-6236）に従って、特定の細胞型に選択的に導入され、 そこで活性化されてもよい。そのような細胞型特異的活性化に必要とされる調節 配列は、対象となる特定の細胞型に応じて決まり、当業者には明らかであろう。 肝臓遺伝子トランスジーンが内因性の肝臓アクチビン遺伝子の染色体部位に組込 まれることが望まれる場合、遺伝子ターゲッティングが好ましい。つまり、その ような技法を用いようとする場合には、組込み（染色体配列を用いた相同的組換 えによる）および内因性の肝臓アクチビン遺伝子産物の機能破壊の目的で、内因 性肝臓アクチビン遺伝子に相同なヌクレオチド配列を含むベクターを設計する。 このトランスジーンはまた、Guらの教示（Guら，1994，Science 265:103-106） に従って、肝臓のような特定の細胞型に選択的に導 入し、それによって内因性肝臓アクチビン遺伝子をその細胞型においてのみ不活 性化することも可能である。そのような細胞型特異的不活性化に必要な調節配列 は、対象となる特定の細胞型に応じて決まるものであり、当業者には明らかであ ろう。 トランスジェニック動物を作製したら、標準的な技術を用いて組換え肝アクチ ビン遺伝子の発現をアッセイすることができる。該導入遺伝子の組込みに関して 動物組識を分析するために、サザンブロット分析またはPCR技術により初期スク リーニングを行なうことができる。また、動物から得た組識サンプルのノーザン ブロット分析、in situハイブリダイゼーション分析、RT-PCRなど（これらに限 定されるものではない）の技術を用いて、導入遺伝子ｍＲＮＡの発現の組識レベ ルを評価することができる。また、肝アクチビン遺伝子を発現する組識のサンプ ルは、肝アクチビン導入遺伝子産物に特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的に評 価することができる。 5.3 肝アクチビンタンパク質に対する抗体 肝アクチビンの１以上のエピトープまたは肝アクチビンの保存変異体のエピト ープまたは肝アクチビンのペプチド断片を特異的に認識する抗体も、本発明に含 まれる。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb) 、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')₂断片、Fab発現ライ ブラリーにより産生された断片、抗イディオタイプ（抗Id）抗体および前記いず れかのエピトープ結合性断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。 本発明の抗体は、例えば、生物学的サンプル中の肝アクチビンの検出に使用す ることが可能であり、したがって、異常な量の肝アクチビンに関して患者を試験 しうる診断または予後評価技術の一部を代表する。また、そのような抗体は、例 えば、肝アクチビン遺伝子産物の発現および／または活性に対する試験化合物の 効果の評価のために、後記第5.5節に記載の化合物スクリーニング法と共に使用 することができる。さらに、例えば、正常な及び／又は操作された肝アクチビン 発現細胞を、それらを患者内に導入する前に評価するために、そのような抗体を 後記第5.6節に記載の遺伝 子治療技術と共に使用することができる。また、そのような抗体は、肝アクチビ ン活性を調節および／または抑制するための方法の一部として使用することがで きる。したがって、そのような抗体は、細胞の成長および／または分化をもたら すための治療方法の一部として使用することができる。 ポリクローナル抗体は、免疫動物の血清に由来する抗体分子の不均一集団であ る。抗体の産生には、肝アクチビンタンパク質；肝アクチビンポリペプチドまた は肝アクチビン誘導体(例えば、成熟成長因子ドメインなどの肝アクチビンの機 能的ドメインに対応するもの)；切断した肝アクチビンポリペプチド(１以上のド メイン、例えば、N末端シグナルペプチドまたはプロペプチドドメインが欠失し ている肝アクチビン)；肝アクチビンの機能的等価体；または肝アクチビンの突 然変異体の注射により、種々の宿主動物を免疫することができる。そのような宿 主動物としては、ウサギ、マウス、ラットなどを少数ながら挙げることができる が、これらに限定されるものではない。免疫学的応答を増強するために、宿主の 種に応じで種々のアジュバントを使用することが可能であり、それらには、フロ イント(完全および不完全)、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物 質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、 油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在 的に有用なヒトアジュバント、例えばBCG（bacille Calmette-Guerin）およびコ リネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）が含まれるが、これら に限定されるものではない。 モノクローナル抗体は、ある特定の抗原に対する抗体の均一集団であり、培養 中の連続継代細胞株により抗体分子を産生させる任意の技術により得ることがで きる。これらには、KohlerおよびMilstein（1975，Nature 256:495-497および米 国特許第4,376,110号）のハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（ Kosborら，1983，Immunology Today 4:72;Coleら，1983，Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 80:2026-2030）およびEBVハイブリドーマ技術（Coleら，1985,Monoclona l Antibodies And Cancer Therapy，Alan R．Liss，Inc.，pp.77-96）が含まれ るが、それらに限定されるもの ではない。そのような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびそれらの任意の サブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであることが可能である。 本発明のmAbを産生するハイブリドーマは、in vitroまたはin vivoで培養するこ とができる。in vivoにおいて高力価のmAbが産生されるため、これは、現在のと ころ好ましい産生方法となっている。 また、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子由来の遺伝子を適当な生物学 的活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることによる 、「キメラ抗体」(Morrisonら，1984，Proc．Natl．Acad．Sci.，81:6851-6855 ；Neubergerら，1984，Nature，312:604-608;Takedaら，1985，Nature，314:452 -454)の産生のために開発された技術を用いることが可能である。キメラ抗体は 、由来する動物種によって異なる部分を有する分子、例えば、マウスmAb由来の 可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する分子である。 あるいは、一本鎖抗体の産生に関して記載されている技術（米国特許第4,946, 778号；Bird，1988，Science 242:423-426;Hustonら，1988，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 85:5879-5883;およびWardら，1989，Nature 334:544-546）を、肝ア クチビン遺伝子産物に対する一本鎖抗体の産生に応用することができる。一本鎖 抗体は、Fv領域の重および軽鎖断片をアミノ酸架橋により結合させて、一本鎖ポ リペプチドを得ることにより生成させる。 特異的エピトープを認識する抗体断片は、公知技術により製造することができ る。例えば、そのような断片には、抗体分子のペプシン消化により得ることがで きるF(ab')₂断片、およびF(ab')₂断片のジスルフィド架橋を還元することにより 得ることができるFab断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。あ るいは、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ簡便な同定が 可能となるよう、Fab発現ライブラリーを構築することができる(Huseら，1989， Science，246:1275-1281)。 肝アクチビンに対する抗体を、今度は、肝アクチビンを「擬態(模擬)」する抗 イディオタイプ抗体を製造するために、あるいは、当業者によく知 られている技術により肝アクチビン細胞表面受容体を同定するために用いること ができる。例えば、Greenspan & Bona，1993，FASEB J 7(5):437-444;およびNis sinoff，1991，J．Immunol．147(8):2429-2438を参照されたい。例えば、成熟成 長因子領域を「擬態」して肝アクチビン受容体に結合しそれを中和する抗イディ オタイプを製造するために、肝アクチビン成熟成長因子ドメインに結合し肝アク チビンに対する肝アクチビン受容体の結合を競合的に阻害する抗体を使用するこ とができる。そのような中和性抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタ イプのFab断片は、細胞の成長および／または分化に対する肝アクチビンの効果 を妨害、刺激または中和する治療方式において使用することができる。 5.4 細胞の成長および／または分化の異常の診断 細胞の成長および／または分化の障害の診断および予後評価のために、ならび にそのような障害に対する素因を有する患者の同定のために、種々の方法を用い ることができる。そのような障害には、造血、赤血球系の分化、卵胞の成熟、下 垂体成長ホルモンおよび副腎皮質刺激ホルモンの分泌、視床下部オキシトシンの 分泌、リンパ球の増殖、ニューロンの生存、***形成、骨および成長形成、肝細 胞ＤＮＡの合成、膵インスリンの分泌、ソマトスタチンの誘導、心臓の形態形成 、巨核球の分化、および初期胚発生中の中胚葉誘導における障害が含まれるが、 これらに限定されるものではない。本発明の方法により診断および予後評価しう る細胞の成長および／または分化の障害には、造血、赤血球産生、卵胞の成熟、 下垂体成長ホルモンおよび副腎皮質刺激ホルモンの分泌、視床下部オキシトシン の分泌、リンパ球の増殖、ニューロンの生存、***形成、骨形成、肝細胞ＤＮＡ の合成、膵インスリンの分泌、および初期胚発生中の中胚葉誘導における障害が 含まれるが、これらに限定されるものではない。 そのような方法では、例えば、第5.1節に記載の肝アクチビンヌクレオチド配 列、第5.3節に記載の肝アクチビン抗体などの試薬を使用することができる。特 に、そのような試薬は、例えば、（1）肝アクチビン遺伝子突然変異の存在を検 出するため、または正常な細胞の成長および／または分 化の状態に対する、肝アクチビンｍＲＮＡの過剰発現または過少発現を検出する ため、（2）非細胞成長および／または非分化障害状態に対する、肝アクチビン 遺伝子産物の過剰な又は過少な存在量を検出するため、および（3）肝アクチビ ンリガンドにより媒介されるシグナル伝達経路における混乱または異常を検出す るために使用することができる。 本明細書に記載の方法は、例えば、本明細書に記載の少なくとも１つの特異的 肝アクチビンヌクレオチド配列または肝アクチビン抗体試薬を含むパック詰めの 診断キットで実施することができる。そのようなキットは、例えば、細胞の成長 および／または分化の障害異常を示す患者を診断するために臨床場面で簡便に使 用することができる。 肝アクチビン遺伝子の突然変異を検出するためには、ゲノムＤＮＡの原料とし て任意の有核細胞を使用することができる。肝アクチビン遺伝子発現または肝ア クチビン遺伝子産物を検出するためには、肝アクチビン遺伝子を発現する任意の 細胞型または組識（例えば、成人肝臓）を使用することができる。 核酸に基づく検出技術は、後記第5.4.1節に記載されている。ペプチドの検出 技術は、後記第5.4.2節に記載されている。 5.4.1. 肝臓アクチビン／インヒビン遺伝子および転写産物の検出 肝臓アクチビン遺伝子内の突然変異は多くの方法を用いて検出できる。任意の 核細胞（nucleated cell）に由来するDNAをこの種のアッセイ技術の出発点とし て使用し得る。DNAは、当業者によく知られている標準的核酸製迭方法に従って 分離し得る。 DNAは、点変異、挿入、欠失、トリヌクレオチド反復膨張（trinucleotide rep eat expansion.）および染色体リアレンジメント(chroaosomal rearrangement) を含む肝臓アクチビン遺伝子構造に関連した異常を検出するために、生物学的サ ンプルのハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで使用し得る。この種のア ッセイは、非限定的具体例として、サザン分折（Southern analysis）、一本鎖 コンフォメーション多型性分析（single stranded conforinational polymorphi smanalysis）（sscp）、変性グラジエントゲル分析（denaturing gradient gela nalysis）およびPCR分析を含み得る。 肝臓アクチビン遣伝子特異的突然変異を検出する診断方法は例えば、あるサン プルから得た核酸（組換えDNA分子、クローン化遺伝子もしくはその縮重変異体 （degenerate variant）を含む）、例えば患者のサンプルまたは他の適当な細胞 源に由来するものを、第5.1節に記載のように、組換えDNA分子、クローン化遺伝 子またはその縮重変異体を含む１つ以上の標識核酸プローブ（fabeled oucleic acid probe）と一緒に、これらの試薬が肝臓アクチビン遺伝子内の相補的配列に 特異的にアニーリングするのに好都合な条件下でインキュベートする操作を含み 得る。これらの核酸試薬の長さは少なくとも15〜30ヌクレオチドであるのが好ま しい。インキュベーション後、全ての非アニーリング（non-annealed）核酸を核 酸：肝臓アニーリング分子ハイブリッドから除去する。次いで、ハイブリダイズ した核駿がいくらかでも存在すれば、それらの分子を検出する。このような検出 技術の１つでは、所期の細胞型（cell type）または組織に由来する核酸を、例 えば、膜のような固体支持体またはマイクロタイタープレートもしくはポリスチ レンビーズのようなプラスチック面に固定させる。この場合は、インキュベーシ ョン後に、第5.1節で述べたような非アニーリング標識核酸試薬が簡単な洗浄操 作で容易に除去される。アニーリングした標識肝臓アクチビン核酸試薬の検出は 、 当業者によく知られている標準的方法を用いて遅成される。肝臓アクチビン遺伝 子突然変異が存在するかどうかを決定するために、核酸試薬がアニーリングした 肝臓アクチビン遺伝子配列の構造および／または発現レベルを、標準（normal) から予測されるアニーリングパターンと比較し得る。 患者のサンプルまたは他の適当な細胞源中に肝臓アクチビン遣伝子特異的核酸 分子を検出する別の診断方法は、これらの分子を例えばPCRで増幅し（Mullis,K. B.,1987,米国特許第4,683,202号に記載の実験例）、次いで増幅した分子を当業 者によく知られている方法を用いて評価する操作を含み得る。得られた増幅配列 は、肝臓アクチビン遺伝子突然変異が存在するか否かを決定するために、例えば 標準と比較し得る。 また、よく知られている遺伝子型決定（genotyping）操作を行って、肝臓アク チビン遺伝子突然変異を有する個体を確認することもできる。このような操作は 例えば、使用する特異的制限酵素の認識部位の１つに配列変異を伴う制限断片長 多型(RFLP)の使用を含む。 また、肝臓アクチビン遣伝子突然変異の同定に使用し得る改良されたDNA多型 性分析方法も開示されている。これらの方法は、制限酵素部位の間における不定 数の短い双頭的に反復した（tandemly repcated）DNA配列の存在を利用している 。例えばWeberは（米国特許第5,075.217号、全体を参照により本明細書に組み入 れる）、(dC-dA)n-(dG-dT)nの短い双頭反復のブロックの長さ多型に基づくDNAマ ーカーを開示している。(dC-dA)n-(dG-dT)nブロックの平均的分離距離は、30,00 0〜60,000bpと推算されている。このように間隔の狭いマーカーは高頻度共同遺 伝（co-inheritance）を示し、例えば肝臓アクチビン遺伝子内の突然変異のよう な遺伝子突然変異の確認、ならびに肝臓アクチビン突然変異に関連した疾患およ び障害の診断に極めて有用である。 また、Caskeyらは（米国特許第5,364,759号、全体を参照により本明細書に組 み入れる）、短いトリおよびテトラヌクレオチド反復配列を検出するためのDNA プロファイリングアッセイを記述している。この方法は、所期のDNA、例えば肝 臓アクチビン遺伝子を抽出し、抽出したDNAを増幅し、反復配列に標識を付けて 個体のDNAの遺伝子型地図を作成する操作を含む。 肝臓アクチビン遺伝子発現のレベルは、肝臓アクチビン転写を検出し測定する ことによってアッセイすることもできる。例えば、成熟肝臓（adult liver）の ような肝臓アクチビン遺伝子を発現することがわかっているか、または発現する と思われる細胞型または組織に由来するRNAを分離し、前述のようなハイブリダ イゼーションまたはPCR技術で検査し得る。分離細胞は細胞培養に由来するか、 または直接患者に由来し得る。培養物から採取した細胞の分析は、細胞ベースの 遺伝子治療法の一部として使用すべき細胞を評価する上で、または肝臓アクチビ ン遺伝子の発現に対する化合物の効果を調べるために必要なステップであり得る 。このような分析は、肝臓アクチビン遺伝子発現の活性化または不活性化を含む 肝臓アクチビン遺伝子発現パターンの定量的および定性的態様の再方を明らかに し得る。 この種の検出方法の具体例の１つでは、所期のRNAからcDNAを合成する（例え ば、RNA分子をcDNAに逆転写する方法で）。次いでcDNA内の配列を、PCR増幅反応 のような核酸増幅反応の鋳型として使用する。逆耘写および核酸増幅用のオリゴ ヌクレオチドプライマーは、第5.1節に記載の肝臓アクチビン核酸試薬の中から 選択する。これらの核酸試薬の長さは少なくとも9〜30ヌクレオチドであるのが 好ましい。増幅産物を検出するためには、放射性または非放射性標識ヌクレオチ ドを用いて核酸増幅を実施し得る。あるいは、サザン分析を実施するか、または 標準的臭化エチジウム染色もしくは他の任意の適当な核酸染色方法を用いて産物 を視覚化できるように十分な増幅産物を産生し得る。 また、核酸精製が不要なように、このような肝臓アクチビン遺伝子発現アッセ イを「in situ」で、即ち生検もしくは切除によって得た患者の組織の組織学的 切片（固定および／または凍結したもの）に対して直接実施することも可能であ る。このようなin situ操作には、第5.1節に記載のようなオリゴヌクレオチドを プローブおよび／またはプライマーとして使用し得る（例えばNuovo.G.J.,1992 ．“PCR In Situ Bybridization：Protocols And Applications”,Ravcn Press, NY参照）。 あるいは、適当な細胞を十分な量で得ることができれば、ノーザン分析を実 施して肝臓アクチビン遺伝子のnRNA発現レベルを決定し得る。 5.4.2 肝臓アクチビン遺伝子産物の検出 第5.3節に記載のように、野生型もしくは突然変異肝臓アクチビン遺伝子産物 またはその保存変異体（conserved variant）もしくはペプチド断片に対する抗 体は、本明細書に記載のような細胞成長および／または分化障害の兆候および前 兆としても使用し得る。このような診断方法は、肝臓アクチビン遺伝子発現レベ ルの異常、または肝臓アクチビンの構造および／または時間的（temporal）組織 、細胞もしくは細胞下の（subcellular）位置の異常を検出するのに使用し得、 また例えば血清または生検組織に対するようにin vivoまたはin vitroで実施し 得る。 例えば、肝臓アクチビン成熟成長因子領域のエピトープに対する抗体は、体内に おける肝臓アクチビンタンパク質の分布およびレベルを検出するためにin vivo で使用できる。このような抗体は、Ｘ線、CATスキャンまたはMRIのような方法を 用いて体内で発現した肝臓アクチビンへの結合を視覚化するために、例えば放射 線不透過性または他の適当な化合物で標識し、次いで被験体内に注入し得る。そ のためには、血液脳関門の通過を促進し脳組織内の肝臓アクチビンの標識付けを 可能にすべく、標識抗体フラグメント、例えばFabまたは最小部の抗原結合領域 を含む一本鎖抗体が好ましい。 あるいは、in vitroで血清および／または剖検サンプルにイムノアッセイを使 用して肝臓アクチビン発現を評価することもできる。このような生検および剖検 アッセイは、種々の肝臓アクチビンエピトープ、例えばＮ末端シグナルペプチド 、プロペプチドおよび／または成熟成長因子領域内のエピトープに対する抗体を 使用し得る。標識抗体の使用は、肝臓アクチビンの翻訳、細胞内輸送および分泌 に関して有用な情報を与え、プロセシングの欠陥を確認し得る。 分析すべき組織または細胞型は通常、例えば成熟肝臓のような肝臓アクチビン 遺伝子を発現することが知られているか、または発現すると思われるものを含む 。ここで使用するタンパク質分離方法は、例えばHarlowおよびLane（Harlow.E.a nd Lane,D.,1988，“Antibodies：A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York）に記載のものであり得る。こ の文献は全体が参照により本明細書に組み入れられる。分離細胞は細胞培養また は患者に由来し得る。培養物から採取した細胞の分析は、細胞ベースの遺伝子治 療プロトコルの開発に向けて、または肝臓アクチビン遺伝子発現および／または 活性に対する化合物の効果を調べるために必要なステップであり得る。 例えば、第5.3節の記載のような抗体または抗体フラグメントを使用して、肝 臓アクチビン遺伝子産物またはその保存変異体もしくはペプチド断片の存在を定 量的または定性的に検出し得る。これは、例えば、光学顕微鏡または蛍光定量検 出と組み合わせた蛍光標識抗体（後述、当該節）を用いる蛍光抗体法（immuno-f luorescence）によって実施し得る。 本発明で有用な抗体（またはそのフラグメント）は更に、肝臓アクチビン遺伝 子産物またはその保存変異体もしくはペプチド断片をin situで検出するために 、蛍光抗体法、免疫電子顕微鏡法または非イムノアッセイにおけるように組織学 的に使用し得る。 in situ検出は、血清をスクリーニングするか、または患者から組織学的試験 片を切除し、これに本発明の標識抗体を適用することによって実施し得る。組織 学的検査の場合は、抗体（またはフラグメント）を標準的イムノヒストケミカル 法によって適用するのが好ましい。この方法を使用すると、肝臓アクチビン遺伝 子産物または保存変異体もしくはペプチド断片の存在、あるいは受容体への肝臓 アクチビンの結合だけでなく、被検組織中の肝臓アクチビンの分布も調べること ができる。当業者には、本発明を使用して、広範におよぶ組織学的方法（例えば 染色方法）のうち任意のものをこのようなin situ検出の実施のために改変でき ることが容易に理解されるであろう。 肝臓アクチビン遺伝子産物またはその保存変異体もしくはペプチド断片のイム ノアッセイは典型的には、生物学的液体、組織抽出物、新しく採取した細胞また は細胞培養でインキュベートした細胞の溶解産物といったようなサンプルを、肝 臓アクチビン遺伝子産物またはその保存変異体もしくはペプチド断片を同定する ことができる検出可能標識抗体の存在下でインキュベートし、当業者に公知の多 くの方法のいずれかで結合抗体を検出することからなる。 生物学的サンプルは、固相支持体もしくは担体、例えばニトロセルロース、ま たは細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定することができる他の固体 支持体と接触させて固定し得る。次いで、支持体を適当なバッファーで洗浄し、 その後標識肝臓アクチビン抗体で処理し得る。次いで、固相支持体をバッファー で２回目の洗浄にかけ、非結合抗体を除去し得る。次いで、固体支持体上の結合 標識の量を一般的な方法で検出し得る。 「固相支持体もしくは担体(solid phase support or carrier）」は、抗原ま たは抗体と結合できる任意の支持体を意味する。よく知られた支持体または担体 としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラ ン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、 はんれい岩及び磁鉄鉱が挙げられる。担体は、本発明の目的のために水性環墳で 溶解性（ある程度）または不溶性のいずれかであり得るという性質を有する。支 持体材料は、結合した分子が抗原又は抗体に結合できる限り、実質的に任意の可 能な構造形態を有し得る。例えば、支持体の形態はビーズのような球形、または 試験官の内面もしくはロッドの外面のような円筒形であり得る。あるいは、シー ト、テストストリップ等のような平らな面でもよい。好ましい支持体としては、 ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者は、抗体もしくは抗原を結合する他の 適当な担体を多数想到し、またはルーチンの実験で確認することができよう。 所与のロットの肝臓アクチビン抗体の結合活性は、公知の方法に従って決定し 得る。当業者はルーチンの実験を使用して、各決定毎に操作及び最適アッセイ条 件を決定することができよう。 肝臓アクチビン抗体を検出可能に標識できる方法の１つは、後でエンザイムイ ムノアッセイ（EIA）で使用するために前記抗体を酵素に結合させることからな る（Voller,A.,“The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(EUSA)”,1978,Diagn ostic Horizons 2：1-7,Microbiological Associates Quarterly Publi-cation, Walkersville,MD）；Voller,A.ら,1978，J.Clin.Pathol.31:507-520;Butler,J.E .,1981,Meth.Enzymol.73:482・523; Maggio,E.(ed.),1980.Enzyme Immunoassay,C RC Press,Boca Raton,FL,;Ishikawa,E.ら,(eds.),1981,Enzyme Immunoassay,Kga ku Shoin,Tokyo)。抗体に結合している酵素は、例えば分光光度測定、蛍光定量 または視覚的手段によって検出できる化学的部分（Chemicalmoiety）を生起させ るように、適当な基質、好ましくは発色基質（chromogenic substrate）と反応する。抗体を検出可能に標識するために使用できる酵素の非 限定的具体例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、staphylococcalヌクレアー ゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、 アルファーグリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメ ラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナ ーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ 、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、 グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。検出は、酵 素に対して発色基質を使用する比色法により実施できる。検出はまた、同様に作 成した標準に対する基質の酵素反応の程度の視覚的比較によっても実施し得る。 検出はまた、他の様々なイムノアッセイのいずれかを用いて実施してもよい。 例えば、抗体または抗体フラグメントを放射性標識すれば、ラジオイムノアッセ イ（RIA）の使用により肝臓アクチビンを検出することが可能である（例えば、W eintraub,B.,Principles of Radioimmunoasays,Seventh Training Course on Ra dioligand Assay Techniqucs,The Endocrine Society,March,1986、参照により 本明細書に組み入れる）。放射性同位体は、ガンマ計数器、シンチレーション計 数器もしくはホスホイメージャー（phohphoimager）のような手段、またはオー トラジオグラフィーによって検出できる。 抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識した抗体を適当な波 長の光に暴露すると、蛍光に起因してその存在を検出することができる。最も一 般的に使用されている蛍光標識用化合物はフルオレセインイソチオシアネート、 ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フ タルデヒドおよびフルオレサミンである。 抗体は、¹⁵²Euのような蛍光発光金属または他のランタニド系列の金属を用い て検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペ ンタ酢酸（DTPA）またはエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）といったような金 属キレート化基（chelating group）を用いて抗体に結合させ得る。 抗体は、これを化学発光化合物に結合させることによって検出可能に標識する こともできる。化学発光標識抗体は、化学反応時に発生する発光（ルミネセンス ） の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光標識用化合物の具 体例としては、、ルミノール、イソルミノール、テロマチック（theromatic）ア クリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びオキサレートエス テルが挙げられる。 本発明の抗体の標識には生物発光化合物も使用し得る。生物発光は、触媒タン パク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的系に見られる一種の化学発光 である。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出することによって決定さ れる。標識のために重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよ びエクオリンである。 5.5 肝臓アクチビンの発現または活性を調節する化合物のスクリーニングアッ セイ 下記のアッセイは、肝臓アクチビン（非限定的に肝臓アクチビンの成熟成長因 子領域を含む）と相互作用する（例えば結合する）化合物、肝臓アクチビンとそ の同系のシグナリング受容体との相互作用に干渉するかもしくは促進する化合物 、ならびに肝臓アクチビン遺伝子の活性を調節する（即ち肝臓アクチビン遺伝子 発現のレベルを調節する）か、もしくは肝臓アクチビン活性のレベルを調節する 化合物を同定するように設計されている。肝臓アクチビン遺伝子調節配列（例え ばプロモーター配列）に結合し、肝臓アクチビン遺伝子発現を調節し得る化合物 を同定するアッセイも使用し得る。例えば、Platt,K.A.,1994.J-Biol.Chem.269: 28558-28562参照。これは全体が参照により本明細書に組み込まれる）。 本発明に従ってスクリーニングし得る化合物の非限定的具体例としては、ペプ チド、抗体およびそのフラグメント、ならびに肝臓アクチビンのプロペプチドも しくは成熟成長因子領域に結合する他の有機化合物（例えばペプチド類似体（pe ptidomimetics））が挙げられる。天然肝臓アクチビン受容体に結合してこれを 「中和(neutralize)」し、それによって肝臓アクチビンにより誘発される活性を 真似る（mimic）(即ちアゴニスト)か、または肝臓アゴニストにより誘発される 活性を阻害する（即ちアンタゴニスト）ペプチド、抗体もしくはそのフラグメン ト、および肝臓アクチビンの成熟成長因子領域（またはその一部）を真似る他の 有機化合物も本発明に従ってスクリーニングし得る。 こうした化合物として、限定するわけではないが、例えば、可溶性ペプチドな どのペプチドが含まれ、限定するわけではないが、ランダムペプチドライブラリ 中に見出されるものが含まれる(Lam,K.S.ら、1991,Nature 354:82-84;Houghten, R.ら、1991,Nature 354:84-86を参照されたい)。こうした化合物は、D-および／ またはL-配置アミノ酸；ホスホペプチド（限定するわけではないが、ランダムま たは部分的に縮重した方向性(directed)ホスホペプチドライブラリを含む。例え ばSongyang,Z.ら、1993,Cell 72:767-778を参照されたい)；抗体(限定するわけ ではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キ メラまたは一本鎖抗体、ならびにFAb、F(ab')₂、およびFAb発現ライブラリ断片 、ならびにそれらのエピトープ結合断片を含む);および有機または無機小分子か らなる組合せ化学から誘導された分子ライブラリ中からも見出すことができる。 肝臓アクチビンに結合し、それによって肝臓アクチビンの発現または活性をモ ジュレートするタンパク質を選択および検出するためには、多数の実験方法を使 用することができるが、これには、限定するわけではないが、タンパク質アフィ ニティクロマトグラフィー、アフィニティブロッティング、免疫沈降、架橋、な らびにタンパク質プロービング、ファージデイスプレーおよびツーハイブリッド システムなどのライブラリに基づく方法が含まれる。全般的には、Phizicky,E． ら、1995,Microbiol.Rev.59:94-123を参照されたい。例を上げると、肝臓アクチ ビンと候補タンパク質との間の相互作用を検出するためにツーハイブリッドシス テムを使用することができる。このために、適切なハイブリッドを構築してリポ ーター遺伝子の活性を試験することによって、その候補タンパク質をコードする 遺伝子を得ることができる。ツーハイブリッド法を使用して相互作用が検出され た場合は、その相互作用する候補タンパク質または肝臓アクチビンタンパク質を コードするＤＮＡ中に欠失を作製して、相互作用の最小ドメインを同定する。あ るいは、ツーハイブリッドシステムを使用して、入手可能な生物および／または 哺乳類組織に特異的な活性化ドメインハイブリッドのライブラリをスクリーニン グすることによって、肝臓アクチビンに結合するタンパク質を同定することがで きる。これらのスクリーニングの結果、同定されたいずれの新規なタンパク質に ついてもクローン化された遺伝子を即時に入手することができる。その上、タン パク質 の重複する領域をコードする複数のクローンが同定されることが多いので、相互 作用の最小ドメインが最初のスクリーニングから容易に明らかになる。 コンピュータによるモデル化および検索技術によって、肝臓アクチビンの発現 若しくは活性をモジュレートすることができる化合物の同定、またはすでに同定 された化合物の改善が可能である。こうした化合物または組成物を同定した後、 その活性部位または領域を同定する。こうした活性部位は典型的には肝臓アクチ ビンのそのシグナルレセプターとの相互作用ドメインなどの、リガンドまたはレ セプター結合部位である。活性部位は、例えば、その概念上のアミノ酸またはヌ クレオチド配列の比較を含む、当分野で既知の方法を使用して同定することがで きる。関連するリガンドおよびレセプターの複合体の研究によっても同定するこ とができる。後者の場合、活性部位を発見するために、化学的方法またはＸ線結 晶解析法を使用することができる。 次に、活性部位の三次元幾何学的構造を決定する。これは、高分解能で完全な 分子構造を決定することができるＸ線結晶解析法を含む既知の方法によって実施 することができる。一方、ある分子内距離を測定するために固相または液相NMR を使用することができる。部分的または完全な幾何学的構造を得るために、その 他の実験方法を使用することができる。この幾何学的構造は、天然または人工の 複合体化したリガンドまたはレセプターを使用することによっても得ることがで き、これによって決定された活性部位の構造の精度が増大する。 不完全または不十分な精度で構造が決定された場合、構造を完全なものにする かまたはその精度を改善するために、コンピュータに基づく数値モデル化の方法 を使用することができる。タンパク質または核酸などの特定の生体高分子に特異 的なパラメーター化したモデルを含む、任意の認知されたモデル化法を使用する ことができる。これらのモデルとして、分子運動の計算に基づく分子動力学モデ ル、熱アンサンブルに基づく統計力学モデル、または複合モデルが含まれる。大 部分の型のモデルについて、構成する原子および基間の力を表す標準分子力場が 必要であり、これは物理化学において既知の力場から選択することができる。不 完全なまたは精度が低い実験構造はこれらのモデル化法によって算出された完全 でより正確な構造を確定するのに役立つ。 実験によって、モデル化によって、またはこの２つを組合せることのいずれか によって、活性部位の構造を決定した後、最後に、その分子構造の情報とともに 化合物が含まれているデータベースを検索することによって、モジュレート化合 物の候補を同定することができる。こうした検索では、決定した活性部位構造に 適合し、そして活性部位を規定する基と相互作用する構造を有する化合物が探索 される。こうした検索は手動でも可能であるが、好ましくはコンピュータを補助 として使用する。この検索で発見されるこれらの化合物は肝臓アクチビンをモジ ュレートする化合物の可能性がある。 あるいは、これらの方法を使用して、例えば、フォリスタチン、潜在TGF-β結 合タンパク質(”LTBP's”)、またはアクチビンレセプターなどの既知のモジュレ ート化合物またはリガンドまたはレセプターから、改善されたモジュレート化合 物を同定することができる。既知の化合物、リガンドまたはレセプターの組成を 改変して、この新規な組成物に適用した上記の実験およびコンピュータモデル化 法を使用して、改変の構造上の影響を決定することができる。次に、変更された 構造を化合物の活性部位構造と比較して、その結果として適合または相互作用の 改善があるかどうかを判定する。この様式によって、側鎖基を変更するなどの、 組成物の系統的な変更を迅速に評価して、改善された特異性または活性がある、 改変されたモジュレート化合物、リガンドまたはレセプターを取得することがで きる。 肝臓アクチビン、アクセサリータンパク質、肝臓アクチビンレセプター、およ び関連する形質導入および転写因子の活性部位の同定に基づくモジュレート化合 物の同定に有用なその他の実験およびコンピュータモデル化方法は当業者にとっ て明らかであろう。 分子モデル化システムの例はCHARMmおよびQUANTAプログラム（Polygen Corpor ation,Waltham,MA）である。CHARMmはエネルギー最少化および分子動力学ファン クションを実施する。QUANTAは分子構造の構築、図式モデル化および分析を実施 する。QUANTAによれば、分子同士の挙動の相互作用性構築、改変、可視化、およ び分析が可能である。 多数の文献が、特定のタンパク質と相互作用する薬剤について(Roti，vinenら 、 1988,Acta Phamaceutical Fennica 97:159-166；Ripka,New Scientist 54-57(Ju ne 16,1988)；McKinaly and Rossmann,1989,Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29:1 11-122;Perry and Davies,OSAR:Quantitative Structure-Activity Relationshi ps in Drug Design pp.189-193(Alan R.Liss,Inc.1989)；Lewis and Dean,1989 Proc.R.Soc.Lond.236:125-140および141-162)、および核酸成分に対するモデル レセプターについて（Askewら、1989,J.Am.Chem.Soc.111:1082-1090）のコンピ ュータモデル化を報告している。化学物質をスクリーニングし、そして図示する その他のコンピュータプログラムが、BioDesign,Inc.(Pasadena,CA.)、Allelix Inc.(Mississauga,Ontario,Canada)、およびHypercube,Inc.(Cambridge,Ontario )などの会社から入手可能である。これらは本来特定のタンパク質に対して特異 的な薬剤に適用するように設計されているが、ＤＮＡまたはＲＮＡの領域に特異 的な薬剤の設計についても、その領域が同定されれば、応用することができる。 結合を変更することができる化合物の設計および産生を参照として上記したが 、肝臓アクチビン阻害剤または活性化剤である化合物として、天然産物または合 成化学物質を含む既知の化合物、およびタンパク質を含む生物学的活性物質のラ イブラリをスクリーニングすることも可能である。 本明細書に記載したようなアッセイによって同定した化合物は、例えば、肝臓 アクチビン遺伝子産物の生物学的機能を解明し、また細胞の成長および／または 分化を調節するのに有用である。 ５．５．１ 肝臓アクチビンに結合する化合物のin vitroスクリーニングアッ セイ （限定するわけではないが、肝臓アクチビンの成熟成長因子ドメインを含む） 肝臓アクチビンと相互作用する（例えばこれに結合する）ことができる化合物を 同定するために、in vitroシステムを設計することができる。同定された化合物 は、例えば、野性型および／または変異肝臓アクチビン遺伝子産物の活性をモジ ユレートまたは妨害するか、あるいは肝臓アクチビンの生物学的機能を解明する のに有用であると考えられる。 肝臓アクチビンに結合する化合物を同定するアッセイの背後にある本質として 、肝臓アクチビンおよび試験化合物が相互作用して結合することができる条件下 でこれら２つの成分の反応混合物を調製し、これによって複合体を形成させ、反 応混合物中でこれを検出し、かつ／または精製することが関与する。使用する肝 臓アクチビンの種類はスクリーニングアッセイの終着点に応じて変更することが できる。例をあげると、天然肝臓アクチビンのアゴニストを探索する場合は、全 長肝臓アクチビンまたは例えば上記のような切断した肝臓アクチビンを利用する ことができる。 スクリーニングアッセイは各種の方法で実施することができる。例えば、こう したアッセイを実施する方法の１つとして、肝臓アクチビンタンパク質、ポリペ プチドまたは融合タンパク質を固相上に固定し、反応終了時にこの固相に固定さ れた肝臓アクチビン／試験化合物複合体を検出するものが含まれる。こうした方 法の１態様において、肝臓アクチビンの反応基を固相上に固定し、試験化合物は 固定しないで、直接または間接的に標識することができる。 実際、固相としてマイクロタイタープレートの使用が便利である。固定された 成分は、非共有結合または共有結合により固定化される。非共有結合は、タンパ ク質溶液で固相表面を単に被覆し乾燥するだけで実施できる。あるいは、固定化 されるタンパク質に特異的な固定化抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を使 用して、タンパク質を固相表面に固定してもよい。表面はあらかじめ調製し、保 存してもよい。 測定を行うために、非固定化成分を、固定成分を含有する被覆表面に加える。 反応が完了後、形成される複合体が固相表面に固定化されて残るような条件下で 、未反応成分を除去（例えば、洗浄により）する。固相表面に固定された複合体 の検出は、いくつかの方法で行うことができる。あらかじめ固定化されていない 成分を前もって標識する場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形 成されたことを示す。あらかじめ固定化されていない成分を前もって標識しない 場合、間接的な標識を使用して、表面上に固定された複合体を検出することがで き、例えば、あらかじめ固定化されていない成分に特異的な標識抗体を使用して 検出することができる（次に、抗体は、標識抗Ｉｇ抗体を用いて直接的または間 接的に標識される）。 あるいは、反応は、液相で行い、反応産物を未反応成分から分離し、そして例 えば肝臓アクチビンタンパク質、ポリペプチド、誘導体または融合タンパク質、 または溶液中で形成される複合体を固定するための試験化合物に特異的な固定化 抗体、および可能な複合体の他の成分に特異的な標識抗体を使用して、固定され た複合体を検出することができる。 ５．６ 肝臓アクチビン抗体、アンタゴニスト、アゴニストまたは遺伝子産物の 使用による細胞増殖および／または分化の治療と調節法 本発明は、細胞増殖および／または分化の調節、および／または細胞増殖およ び／または分化疾患の治療のための方法と組成物を包含する。 肝臓アクチビン活性を中和または増強する任意の方法は、細胞増殖および／ま たは分化を調節するのに使用することができる。 例えば、循環している肝臓アクチビンに結合しかつ「中和する」可溶性ペプチ ド、タンパク質、融合タンパク質、または抗体（抗イディオタイプ抗体を含む） を投与して、細胞増殖および／または分化を調節することができる。このために 、肝臓アクチビン受容体の細胞外ドメインに対応するペプチド、肝臓アクチビン 、ポリペプチドもしくは誘導体の欠失突然変異体、肝臓アクチビンの突然変異体 を含有するポリペプチド、または別のポリペプチド（例えば、ＩｇＦｃ抗体）に 融合した１つまたはそれ以上の肝臓アクチビンドメインを使用することができる 。あるいは、肝臓アクチビンを模倣しアクチビン受容体に結合する抗イディオタ イプ抗体または抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片を使用することができる(前 記第５．３節を参照されたい)。このような肝臓アクチビンタンパク質、ポリペ プチド、誘導体、融合タンパク質、抗イディオタイプ抗体またはＦａｂは、肝臓 アクチビンと肝臓アクチビン受容体との相互作用を中和するのに充分な量で被験 体に投与される。 例えば、アミノ酸残基番号約２１〜約２３６までの図１に示すβ_Cのアミノ酸 配列、アミノ酸残基番号約２２〜約２３６までの図２に示すβ_Eのアミノ酸配列 を有する、プロペプチドドメインに対応する肝臓アクチビンペプチドなどを使用 してもよく、またはアミノ酸残基番号約１８〜約２３６までの図５に示すβ_Eの ア ミノ酸配列を有するものを使用してもよい。あるいは、例えばアミノ酸残基番号 約２３７〜約３５４までの図１に示すβ_Cのアミノ酸配列、またはアミノ酸残基 番号約２３７〜約３５２までの図２に示すβ_Eのアミノ酸配列、またはアミノ酸 残基番号約２３７〜約３５０までの図５に示すβ_Eのアミノ酸配列を有する、成 熟増殖因子ドメインに対応する肝臓アクチビンペプチドなどを使用してもよい。 さらに、プロペプチドドメインおよび／または成熟増殖因子ドメインのすべてま たは一部が欠失している、肝臓アクチビン欠失突然変異体を使用してもよい。肝 臓アクチビン受容体、および肝臓アクチビン受容体の細胞外ドメインのすべてま たは一部を含有する可溶性または結合ポリペプチドを使用してもよい。肝臓アク チビンタンパク質、ポリペプチドまたは誘導体、および肝臓アクチビン受容体タ ンパク質またはポリペプチドはまた、安定性を上昇させるためにおよび／または 肝臓アクチビン活性を上昇または低下させるために、異種タンパク質に融合して もよい。 本発明の方法に従って調節される細胞増殖および／または分化プロセスは、造 血、赤血球分化、卵胞成熟、下垂体成長ホルモンおよび副腎刺激ホルモンの分泌 、視床下部オキシトシン分泌、リンパ球増殖、ニューロン生存、***形成、骨の 成長および形成、肝細胞ＤＮＡ合成、膵臓インスリン分泌、ソマトスタチン誘導 、心臓形態形成、巨核球分化、および初期胚成長期の中胚葉の誘導があるが、こ れらに限定されない。 ５．６．１ 肝臓アクチビン遺伝子産物抗体またはアンタゴニストの使用による 肝臓組織の治療、再生、および増殖方法 肝臓アクチビンを中和するかまたは肝臓アクチビン遺伝子の発現を阻害する任 意の方法が、肝臓組織の増殖または再生を増強するのに使用できる。様々な状況 で肝臓組織の増殖または再生を増強するのに、肝臓アクチビン抗体および肝臓ア クチビン遺伝子産物アンタゴニストを使用できる。ある場合には、患者の肝臓を 傷害してもよい(ただし、修復できる程度に)。例えば(しかしこれに限定されな い)、アルコールの過剰な消費は、肝硬変を招く。アルコール消費をやめること で肝細胞破壊を停止することができるが、回復には肝臓の再生が必要である。そ のような場合、過度の肝障害のために、自然の再生プロセスは傷害されているこ と がある。いずれにしても、肝臓アクチビン抗体または肝臓アクチビン産物アンタ ゴニストを含む後述の第５．８節に記載の薬剤組成物で患者を治療すると、再生 が増強され、従って回復速度が速まるであろう。 ある場合には、治療には、ドナーの肝臓のすべてまたは一部の移植が必要なこ ともある。肝臓アクチビン抗体および／または肝臓アクチビン遺伝子産物アンタ ゴニストを含む、後述の第５．８節に記載の薬剤組成物を投与することにより、 そのような移植治療中の生きているドナーの肝臓と受容者の肝臓の両方の再生が 促進されるであろう。 他の状況では、例えば後述の方法に従って製造される人工肝臓を、肝臓疾患に かかっている患者に移植してもよい。正常な肝臓の生物学的能力を達成していな い段階で、このような人工肝臓を移植することが充分であり必要なこともある。 このような移植物の能力を上昇させるために、肝臓アクチビン抗体および／また は肝臓アクチビン遺伝子産物アンタゴニストを含む後述の第５．８節に記載の薬 剤組成物を投与することにより、増殖速度を上昇させることができる。 患者の自然の肝臓が傷害されているかまたは疾患状態である場合、これをその ままにしておくかまたは部分的に除去してもよいが、移植された人工肝臓組織ま たはドナーから移植された肝臓組織からの補助が必要である。このような場合、 抗体または肝臓アクチビン遺伝子産物アンタゴニストを含む薬剤組成物を使用し て、患者の自然の肝臓組織および移植された肝臓組織の増殖を増強させることが できる。 in vitroの肝臓組織培養物は、多くの用途を有する。肝臓傷害または肝疾患の 患者の治療において、例えば直接移植によりまたは体外肝臓装置の一部として、 自然の肝臓を支持または置換するために、肝臓組織培養物を使用することができ る。肝臓組織培養物の再生能力は、Rhimらが開発したトランスジェニックマウス 系（1995，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:4942-4946）を使用して試験しても よい。このような系では、肝細胞は、トランスジェニック動物の疾患肝臓中に移 植され、その複製能力が評価される。 さらにそのような肝臓組織培養物は、薬剤や他の化合物の毒性を試験するため のモデルとして機能し得る。 機能的なin vitroの肝臓組織は、例えば米国特許第5,266,480号（これは、参 考のためその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の３次元組織培養系（ただ し、これに限定されない）を使用して作成される。この系に従うと肝細胞は、ヒ トの肝臓生検または剖検材料用に適合させた従来法（Berry and Friend，1969， J．Cell Biol．43:506-520）により単離することができる。簡単に説明すると、 門脈または門脈枝にカニューレを挿入し、カルシウムまたはマグネシウムを含ま ない緩衝液で組織が蒼白になるまで肝臓を潅流する。次に、コラゲナーゼ溶液の ようなタンパク質分解酵素を用いて適切な流速で臓器を潅流する。これにより、 結合組織フレームワークが消化される。次に肝臓を緩衝液で洗浄し、細胞を分散 させる。細胞懸濁液を、７０μｍのナイロンメッシュでろ過して破片を除去する 。２回または３回の示差遠心分離により、細胞懸濁液から肝細胞を選択してもよ い。 切り出したヒト肝臓の各々の葉の潅流には、HEPES緩衝液を使用してもよい。H EPES緩衝液中のコラゲナーゼの潅流は、約３０ml／分の速度で行われる。３７℃ で１５〜２０分間さらにコラゲナーゼでさらにインキュベートすることにより、 単一細胞懸濁液が得られる(Guguen-Guillouzo and Gulllouzo編、1986，「単離 および培養肝細胞」、パリ、INSERM、およびロンドン、John Libbey Eurotext， pp．1-12;19:82，Cell Biol．Int．Rep．6:625-628)。 単離された肝細胞は次に、３次元間質に接種するために使用される。接種され た間質は、生理的条件に匹敵する系で、in vitroで肝細胞を複製するために、米 国特許第5、266、480号の教示に従って骨髄および皮膚について記載されたよう に、培養することができる。さらに、３次元肝臓培養物または別の方法で増殖さ せた肝臓組織培養物の増殖速度と成長は、増殖培地に肝臓アクチビン抗体および ／または遺伝子産物アンタゴニストを加えることにより増強してもよい。これに より、肝細胞による機能性発現が上昇する。 ５．６．２ 肝臓アクチビン遺伝子産物の使用による造血の刺激 肝臓アクチビン濃度および／または活性を上昇させる方法はすべて、造血を刺 激するために使用することができる。これらの方法により、第５．１節に記載の 肝臓アクチビン遺伝子およびヌクレオチド配列および上記第５．２節に記載のタ ンパク質、ポリペプチド、および誘導体を使用して、造血を刺激してもよい。 本発明において、本明細書に記載の肝臓アクチビン組成物、ヘマトポエチン療 法のような血液細胞の濃度を上昇させるための治療法。具体例において、本明細 書に記載の肝臓アクチビン組成物は、血液の酸素運搬能を補助することを目的と する、エリスロポエチン療法で使用される。本発明の範囲内である肝臓アクチビ ン治療は、外傷を受けた患者、手術を受けた患者、透析患者のような一般的に輸 血を必要とする患者、および血友病、嚢胞性繊維症、妊娠、生理不順、早産の初 期貧血、脊髄傷害、宇宙飛行、老化、種々の新生物病状などの血液成分に影響を 与える疾患の患者を含むが、これらに限定されない。血液の酸素運搬能の補助を 必要とし本発明の範囲内である患者の症状の例には、脊椎動物の赤血球産生の低 下または欠陥、慢性腎不全に関連する貧血、赤血球応答の刺激、鉄動態作用の進 行(血漿鉄ターンオーバー、および骨髄移行時間作用など)、赤血球量の変化、ヘ モグロビンＣ合成の刺激、およびヘマトクリットレベルの上昇を含むが、これら に限定されない。本発明はまた、酸素濃度の低い環境にある個体などの個体の酸 素運搬能の増強のための治療を提供する。 本発明はまた、第５．１節と５．２節に記載の肝臓アクチビン組成物と他の提 唱されているかまたは従来の造血治療法との組合せを包含する。例えば、肝臓ア クチビンは、単独で造血刺激作用を示す化合物（例えば、エリスロポエチン、テ ストステロン、始原細胞刺激物質、インスリン様増殖因子、プロスタグランジン 、セロトニン、サイクリックＡＭＰ、プロラクチン、およびトリヨードチロニン ）と組合せることができる。また、再生不良性貧血を治療するために一般的に使 用される化合物(例えば、メテノレン、スタノゾロールおよびナンドロロン)；鉄 欠乏性貧血を治療するために一般的に使用される化合物(例えば、鉄製剤)；悪性 貧血を治療するために一般的に使用される化合物(例えば、ビタミンＢ₁₂および ／または葉酸);および溶血性貧血を治療するために一般的に使用される化合物（ 例えば、コルチコイドなどの副腎皮質ステロイド）との組合せも本発明に包含さ れる。例えば、Resegottiら、1981，Panminerva Medica，23:243-248；Kurtz，1 982，FEBS Letters，14a:105-108；McGonigleら、1984，Kidney Int.，25:437-4 44；およびPavlovic-Kantera，1980，Expt．Hematol.，8（supp．8）283-291 を参照されたい。 エリスロポエチンの作用を増強するかまたはこれと相乗作用する化合物もまた 、本明細書において補助剤として有用であり、アドレナリン作用性アゴニスト、 甲状腺ホルモン、アンドロゲン、肝造血因子、エリスロトロピン、およびエリス ロゲニンがあるが、これらに限定されない。例えば、Dunn、「造血の最近の考え 方」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）(Chichester ，England，1983)；Weilandら、1982，Blut，44:173-175；Kalmani，1982，Kidn ey Int.，22:383-391；Shahidi，1973，New Eng．J．Med.，289:72-80；Urabeら 、1979，J．Exp．Med.，149:1314-1325；Billatら、1982，Expt．Hematol.，10: 133-140；Naughtonら、1983，Acta Haemat，69:171-179；Cognoteら、抄録364中 、Proceedings 7th Intl．Cong．of Endocrinology(Quebec City，Quebec，July 1-7，1984)；およびRothmanら、1982，J．Surg．Oncol.，20:105-108を参照さ れたい。 造血を刺激する方法は、肝臓アクチビンを含む造血的に有効量（すなわち、血 液細胞を生成させる量）の薬剤組成物を患者に投与することを含む。肝臓アクチ ビンは、適当な方法（非経口、舌下、局所、肺内、および鼻内投与、およびさら に第５．８節に記載の方法を含むがこれらに限定されない）により、患者に投与 される。薬剤組成物は、エリスロポエチン、テストステロン、始原細胞刺激物質 、インスリン様増殖因子、プロスタグランジン、セロトニン、サイクリックＡＭ Ｐ、プロラクチン、トリヨードチロニン、メテノレン、スタノゾロール、および ナンドロロン、鉄製剤、ビタミンＢ₁₂，葉酸および／または副腎皮質ステロイド よりなる群の１つまたはそれ以上のメンバーを随時含有する。 肝臓アクチビンおよび同時治療薬は、投与法、患者の臨床症状などに依存して 、別の経路または同じ経路で、かつ同じ時間または別の時間に投与するのが適切 である。 ５．６．３ 肝臓アクチビン遺伝子産物を使用して骨の成長を刺激する方法 肝臓アクチビン濃度および／または活性を上昇させる任意の方法は、骨成長（ すなわち、骨量）を増強するのに使用することができる。このようなアプローチ は、骨粗鬆症、骨軟化症、および年齢に関連する骨量の低下などの、骨の弱体化 を引き起こす骨折、異常、および障害を治療するのに使用することができる。本 発明において、骨の成長は、骨形成的に有効な量（すなわち、成熟した骨の形成 と成長を引き起こす量）で、肝臓アクチビンの薬剤組成物を局所的および／また は全身的に投与することにより増強することができる。 前記第５．１節と５．２節に記載の本発明の組成物は、骨形成的に有効な量の 他の骨成長促進化合物（ベータ型トランスフォーミング増殖因子（「ＴＧＦ−β」 ）(例えば、ＴＧＦ−β １，−２、−３、タンパク質、ポリペプチド、誘導体( 断片を含む)、およびその同種タンパク質)、および／または骨形態形成性タンパ ク質（「ＢＭＰ」）(例えば、ＢＭＰ−、−２、−３、−４、−５、−６，または −７タンパク質、ポリペプチド、およびその同種タンパク質)および／または骨 形成性タンパク質(そのポリペプチド、および同種タンパク質を含む)、および／ または副甲状腺ホルモンを含有してもよい。ＢＭＰやＴＧＦ−βは、当該分野で 公知の方法により調製される(例えば、PCT/US87/01537号および4、774、322号を 参照されたい。これらは参考のためその全体が本明細書に組み込まれる)。ある いは、ＴＧＦ−βは、市販品が利用できる(R & D Systems，ミネアポリス、ミネ ソタ州)。 別の実施態様において、本発明の肝臓アクチビン組成物は、他の治療薬を含有 する(例えば、骨粗鬆症の場合は、フッ化物、カルシトニン、ビタミンＤ代謝物 、エストロゲン、および副甲状腺ホルモン)。 局所的骨成長を誘導する方法は、骨形成的に有効な量の肝臓アクチビンをＴＧ Ｆ−β、ＢＭＰ、骨髄、またはここから抽出されたタンパク質と随時組合せて、 薬剤学的に許容される担体中で投与する方法を含む。 本発明の１つの実施態様は、随時ＴＧＦ−β、ＢＭＰ、骨髄、またはここから 抽出されたタンパク質を含む骨形成的に有効な量の肝臓アクチビンを、薬剤学的 に許容される担体中で投与することを含んでなる、全身性の骨成長を誘導する方 法を包含する。 別の実施態様は、最初に有効量のＴＧＦ−βとＢＭＰを投与し、次に有効量の アクチビンを投与することを含んでなる、骨成長を調節する方法を提供する。軟 骨内骨成長を誘導するために、好ましくはＢＭＰとＴＧＦ−βの組合せを局所的 に投与して、軟骨モデリングを誘導する。次にアクチビンを皮下に投与するかお よび／または全身性に投与して、成熟した骨の形成と、ＴＧＦ−βとＢＭＰによ り誘導される軟骨モデルの分化を誘導する。この方法によれば、アクチビンが、 軟骨内骨の無機質化を増強するであろう。この方法により形成される成熟骨の量 は、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ、肝臓アクチビン単独、またはＢＭＰとＴＧＦ−βの組 合せ、または肝臓アクチビンとＢＭＰの組合せにより形成される成熟骨の量より 多いであろう。 骨の成長と成熟を調節する別の非限定的方法は、骨形成的に有効な量のアクチ ビンをＴＧＦ−β、ＢＭＰ、および／または骨髄またはここから抽出されるタン パク質とともに局所的に投与して骨成長を誘導し、次に骨形成的に有効な量の肝 臓アクチビンを全身性に投与することを含んでなる。 ５．７ 肝臓アクチビン遺伝子発現に影響を与えることによる肝臓アクチビン活 性の調節法および／または肝臓疾患の治療法 肝臓アクチビン遺伝子の発現（転写または翻訳）を阻害または活性化する任意 の方法は、肝臓アクチビン遺伝子による影響を受ける細胞増殖および／または分 化活性を調節するのに使用することができる。以下に記載する方法では、細胞の 増殖および／または分化疾患は、前記第５．１節に記載の核酸配列を用いて治療 される。 ある場合には、肝臓アクチビン活性の増加は、肝臓アクチビンが領域する機構 （例えば、肝臓再生および／または骨成長の刺激）を促進するのに好ましい。さ らにいくつかの細胞の増殖および／または分化疾患は、少なくとも一部は、肝臓 アクチビン遺伝子発現レベルの欠如または低下により引き起こされる。従って、 遺伝子発現のレベルの上昇は、この疾患に関連する症状の緩和をもたらすであろ う。肝臓アクチビン遺伝子の発現レベルを上昇させる方法は、後述の第５．７． １節で考察する。 ある場合には、肝臓アクチビン遺伝子産物のレベルおよび／または活性の低下 が、肝臓アクチビンの阻害作用を低下させるかまたは防止し、従って肝臓アクチ ビン遺伝子産物を低下させることが好ましいであろう。肝臓アクチビン遺伝子の 発現レベルを低下させるための方法は、後述の第５．７．２節で考察する。 5.7.1 肝臓アクチビンの発現もしくは活性の修復または増加 正常肝臓アクチビン遺伝子発現および／または肝臓アクチビン遺伝子産物の活 性レベルの増加に関して、細胞成長および／もしくは分化の調節ならびに／また は細胞成長および／もしくは分化異常の治療に、肝臓アクチビン核酸配列が利用 できる。治療としては、例えば遺伝子置換療法の形態で施すことができる。特に 、正常な機能を示す肝臓アクチビン遺伝子産物の生成を命令する、正常肝臓アク チビン遺伝子または肝臓アクチビン遺伝子の一部分の１以上のコピーを、限定さ れるものではないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、 およびヘルペスウイルスベクターを含むベクターや、それに加えて、リポソーム および遺伝子活性化マトリックスのような、DNAを細胞に導入するその他の粒子 を用いて、患者もしくは動物被検体中の適切な細胞に挿入できる。遺伝子活性化 マトリックスを用いて、哺乳動物修復細胞に核酸を導入する方法は、1996年４月 12日提出の米国出願第08/631,334号にさらに詳しく記載されており、その内容は すべて参照により本明細書に組み入れる。 肝臓アクチビン遺伝子は肝臓において発現されるため、かかる遺伝子置換療法 技術は、患者のこの組織中の細胞に肝臓アクチビン遺伝子配列を送達できるべき であり、または、別法として、肝臓アクチビン遺伝子配列が発現される細胞部位 への、かかる肝臓アクチビン遺伝子配列の直接的投与を含むべきである。別法と して、例えば肝臓のような、適切な組織における欠損内因性肝臓アクチビン遺伝 子を修正するために、標的相同組換えを利用することができる。 肝臓アクチビン遺伝子発現および／または肝臓アクチビン活性の全体的なレベ ルを増加させるために利用できる付加的な方法には、細胞成長および／または分 化異常の症状を回復させるに十分な部位と数の、適切な肝臓アクチビン発現細胞 、好ましくは自己細胞の患者への導入が含まれる。かかる細胞は組換えまたは非 組換え細胞のいずれであってもよい。患者における肝臓アクチビン遺伝子発現の 全体的なレベルを増加させるために投与可能な細胞は、肝臓アクチビン遺伝子を 発現する正常細胞である。その細胞は、肝臓中の解剖学的部位、または体内の異 なる部位に局在する組織移植片の一部分として投与できる。かかる細胞に基づく 遺伝子療法技術は当業者に十分周知であり、例えばAndersonら、米国特許第 5,399,349号；Mulligan ＆ Wilson，米国特許第5,460,959号を参照のこと。 5.7.2 肝臓アクチビン発現または活性を低減させる方法 前記の5.1節に記載された配列由来の分子を用いて、肝臓アクチビン遺伝子の 発現を低減または阻害するために、種々の技術が用いられ得る。内因性肝臓アク チビン遺伝子発現のレベルは、例えば、肝臓アクチビンmRNA転写産物の翻訳を阻 害または妨害するためのアンチセンスまたはリボザイムアプローチ、肝臓アクチ ビン遺伝子の転写を阻害するための三重らせんアプローチ；または肝臓アクチビ ン遺伝子またはその内因性プロモーターを不活性化もしくは「ノックアウト」す る、標的化相同性組換えを用いて低減することができる。限定されるものではな いが、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよびヘル ペスウイルスベクター、それに加えてリポソームおよび遺伝子活性化マトリック スのような、核酸を細胞中に導入するその他の粒子を用いて、ヌクレオチド配列 の１以上のコピーを患者もしくは動物被検体中の適切な細胞に挿入できる。 肝臓アクチビン遺伝子は成人肝臓において発現されるため、送達技術は、好ま しくはこの組織を標的にするよう設計されるべきである。別法として、例えば成 人肝のような標的細胞を含む部位に、本明細書に記載のアンチセンス、リボザイ ムもしくはDNA構築体を直接的に投与してよい。 アンチセンスアプローチには、肝臓アクチビンmRNAに相補的なオリゴヌクレオ チド(DNAまたはRNAのいずれか)の設計が包含される。アンチセンスオリゴヌクレ オチドは肝臓アクチビンmRNA転写産物に相補的に結合し、翻訳を妨げる。絶対的 な相補性は、好ましいが、必ずしも要求されない。本明細書において言及される 、RNAの一部分に「相補的な」配列とは、RNAとハイブリダイズ可能で、安定な二 本鎖を形成するに十分な相補性を有する配列を意味する。二本鎖アンチセンス核 酸の場合、かくして二重DNAの一本鎖が試験され、または三重の形成が分析され てよい。ハイブリダイズのための能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸 の長さの両方に依存するであろう。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほ ど、RNAに含まれる可能性のある塩基の誤対合が多く、それでも安定な二本鎖を 形成する(または場合によっては三本鎖)。当業者ならば、 ハイブリダイズされた複合体の融解点を決定するための標準的な方法を用いて、 誤対合の耐用性の程度を確かめることができる。 例えば5'非翻訳配列までで、およびAUG開始コドンを含む、メッセージの5'末 端に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳の阻害に対し、最も有効に働くべきで ある。しかしながら、mRNAの3'非翻訳配列に相補的な配列もまた、mRNAの翻訳を 阻害するのに有効であることが最近示された。一般的には、Wagner,R.，1994，N ature 372:333-335を参照のこと。かくして、5'-または3'-非翻訳-肝臓アクチビ ン遺伝子の非コーディング領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドを、内 因性肝臓アクチビンmRNAの翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチに用い ることができる。mRNAの5'非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、AUG開 始コドンの補体を含むべきである。mRNAコーディング領域に相補的なアンチセン スオリゴヌクレオチドは、翻訳のインヒビターとしてはあまり有効ではないが、 本発明において使用することができる。5'-、3'-または肝臓アクチビンmRNAのコ ーディング領域のどちらとハイブリダイズするために設計されていようが、アン チセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であり、好ましくは６ないし約50 ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドであるべきである。特定の態様にお いては、オリゴヌクレオチドは、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも17ヌク レオチド、少なくとも25ヌクレオチド、または少なくども50ヌクレオチドである 。 標的配列の選択に関係なく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの遺伝子発現を 阻害する能力を定量するために、最初にin vitro試験が行われることが好ましい 。これらの試験においては、アンチセンス遺伝子阻害と、オリゴヌクレオチドの 非特異的な生物学的作用を区別するために、対照を用いることが好ましい。これ らの試験においてはまた、標的RNAまたはタンパク質のレベルを、内部対照RNAま たはタンパク質のそれと比較することが好ましい。これに加えて、アンチセンス オリゴヌクレオチドを用いて得られた結果と、対照オリゴヌクレオチドを用いて 得られた結果を比較することが計画されている。対照オリゴヌクレオチドは、被 検オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであり、オリゴヌクレオチドのヌクレオチ ド配列はアンチセンス配列とは異なることが好ましいが、同様に標的配列の特 定のハイブリダイゼーションを妨害する必要がある。 オリゴヌクレオチドは、DNAまたはRNAまたはキメラ混合物もしくは誘導体もし くはそれらの修飾体、一本鎖または二本鎖であってよい。オリゴヌクレオチドは 、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を改良するために塩基部分、 糖部分もしくはリン酸骨格を修飾することができる。オリゴヌクレオチドはまた 、ペプチド(例えばin vivoで宿主細胞を標的化するための)：細胞膜通過輸送を 容易にする薬剤(例えばLetsingerら,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6553-6 556;Lemaitreら，1987,Proc.Natl.Acad.Sci.84:648-652;PCT公開第WO88/09810号 ,1988年12月15日公開を参照)；または、血液脳関門(例えばPCT公開第WO89/10134 号,1988年４月25日公開を参照)；ハイブリダイゼーション誘発分割薬剤(例えばK rolら，1988，BioTechniques 6:958-976を参照)：および挿入薬剤(例えばZon，1 988，Pharm．Res．5:539-549参照)等の、他の付加的なグループと結合させてよ い。 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定するものではないが、5-フルオロウ ラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサン チン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラ シル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチル アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルクエオシン 、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシ ン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシ トシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノ メチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシ ルクエオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2 -メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(V)、ウイブ トキソシン(wybutoxosine)、擬似ウラシル、クエオシン、2-チオシトシン、5-メ チル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、 ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(V)、5-メチル- 2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、 および2,6-ジアミノプリンを含む群から選択される、少なくとも１つの修飾塩基 部分を含 んでなる。 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、限定されるものではないが、アラビ ノース、2-フルオロアラビノース、キシルロースおよびベキソースを含む群から 選択される、少なくとも１つの修飾糖部分を含んでもよい。 さらに、もう１つの具体例においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホス ホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホ トリエステルおよびホルムアセタル、またはそれらの類似体からなる群から選択 される、少なくとも１つの修飾リン酸骨格を含んでもよい。 さらに、もう１つの具体例においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα -アノマーオリゴヌクレオチドである。α-アノマーオリゴヌクレオチドは、相補 的RNAと共に、特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、それは、通常のβユニッ トとは対照的に、鎖は互いに平行である(Gautierら,1987,Nucl.Acids Res.15:66 25-6641)。そのオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルリボヌクレオチド(Inoueら ，1987，Nucl．Acids Res．15:6131-6148)、またはキメラRNA-DNA類似体(Inoue ら,1987,FEBS Lett.215:327-330)である。 本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば自動DNA合成機(Biosearch、Applied B iosystemsから市販されているような)を用いて、当技術分野の標準的な方法によ り合成できる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinら の方法(1988,Nucl.Acids Res.16:3209)により合成でき、およびメチルホスホネ ートオリゴヌクレオチドは制御多孔性ガラスポリマー担体を用いて調製されてよ い(Sarinら,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:7448-7451)他。 肝臓アクチビンのコーディング領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチド が使用可能であるが、転写非翻訳領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最 も好ましい。例えば、本発明に従って、以下の配列を有するアンチセンスオリゴ ヌクレオチドを利用することができる： a)図１のヌクレオチド134ないし151に相補的である b)図１のヌクレオチド129ないし151に相補的である c)図１のヌクレオチド123ないし151に相補的である d)図１のヌクレオチド117ないし151に相補的である e)図１のヌクレオチド120ないし148に相補的である f)図１のヌクレオチド120ないし142に相補的である g)図１のヌクレオチド120ないし136に相補的である h)図２のヌクレオチド202ないし218に相補的である i)図２のヌクレオチド196ないし218に相補的である j)図２のヌクレオチド190ないし218に相補的である k)図２のヌクレオチド184ないし218に相補的であるl)図２のヌクレオチド187ないし221に相補的である m)図２のヌクレオチド187ないし215に相補的である n)図２のヌクレオチド187ないし209に相補的である o)図２のヌクレオチド187ないし203に相補的である p)図２のヌレオクチド187ないし197に相補的である q)図５のヌクレオチド60ないし78に相補的である r)図５のヌクレオチド55ないし78に相補的である s)図５のヌクレオチド49ないし78に相補的である t)図５のヌクレオチド43ないし78に相補的である u)図５のヌクレオチド47ないし75に相補的であるv)図５のヌクレオチド44ないし71に相補的である w)図５のヌレオクチド4ないし68に相補的である アンチセンス分子は、in vivoで肝臓アクチビンを発現する細胞、例えば、肝 細胞に送達されるはずである。例えば、アンチセンス分子を直接的に組織部位へ 注入すること、または目的の細胞を標的とするよう設計された修飾アンチセンス 分子（例えば、ペプチドに結合したアンチセンス、または受容体と特異的に結合 する抗体、または標的細胞表面で発現する抗原）を体系的に投与することが可能 であるような、アンチセンスDNAまたはRNAを細胞へ送達する多くの方法が開発さ れてきた。 内因性mRNAの翻訳抑制をするのに十分な、アンチセンスの細胞内集中を行うこ とは、しばしば困難である。それゆえに、その中にアンチセンスオリゴヌクレオ チドが強いポルIIIまたはポルIIプロモーターの制御下で置かれる組換えDNAの構 築物を利用する方法が望ましい。患者の標的細胞をトランスフェクトする目的で 、かかる構築物を使用すると、内因性肝臓アクチビン転写産物と相補的塩基対を 形成、それによって肝臓アクチビンmRNAの翻訳を妨害する、十分量の１本鎖RNA の転写をする。例えば、ベクターをin vivoで導入することができ、それが１つ の細胞により取られ、アンチセンスRNAの転 写を命令する。それが転写されて目的のアンチセンスRNAを生成することができ る限り、かかるベクターはエピゾームを維持するかまたは染色体的に組込まれる ようになる。かかるベクターは、当技術分野では通例の組換えDNA技術により構 築することが可能である。ベクターは、プラスミド、ウイルス、または当技術分 野では公知の他のものであってよく、哺乳動物細胞における複製および発現に用 いられる。アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、当技術分野で公知のい かなるプロモーターによって、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞で行われる。か かるプロモーターは誘導可能で、または構成的である。かかるプロモーターは： SV40早期プロモーター領域(BernoistおよびChambon,1981,Nature 290:304-310) 、ラウス肉腫ウイルス(Roussa Lrooma virus)の3'long terminal repeatに含ま れるプロモーター(Yamamotoら,1980,Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナ ーゼプロモーター(Wagnerら,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441-1445)、 メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら,1982,Nature 296:39-42)他を包 含するがこれに限定されない。プラスミド、コスミド、YACまたはウイルスベク ターのいかなるタイプも、例えば肝臓のような組織部位に直接的に導入すること が可能な組換えDNA構築物を調製するのに用いることができる。別法として、選 択的に目的の組織に感染するウイルスベクターを用いることが可能であり(例え ば、脳にはヘルペスウイルスを用いる)、その場合には投与を別の経路で（例え ば、体系的に）行うことができる。 触媒的に肝臓アクチビンmRNA転写産物を切断するよう設計されたリボザイム分 子もまた肝臓アクチビンmRNAの翻訳および肝臓アクチビンの発現を妨害する。( 例えばPCT国際公開WO90l11364，1990年10月４日公開;Sarverら,1990,Science 24 7:1222-1225を参照のこと)。mRNAを特異的な認識配列で切断するリボザイムを肝 臓アクチビンmRNAを破壊するため用いることができるが、ハンマーヘッドリボザ イムを使用することが好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的mRNAと相補 的塩基対を形成する領域にフランキングすることにより、指令される位置でmRNA を切断する。唯一の必要条件は、標的mRNAが２塩基すなわち5'-UG-3'の配列を有 することである。ハンマー ヘッドリボザイムの構築および生成は、当技術分野では十分に公知であり、Hase loffおよびGerlach,1988,Nature,334：585-591により十二分に記載されている。 例えば、マウスβ_Cおよびβ_Eのヌクレオチド配列内のハンマーヘッドリボザイム の潜在的切断部位は、各々、110以上、80以上ある(図１および図２)。好ましく は、リボザイムを操作して、切断認識部位を肝臓アクチビンmRNAの5'末端の近く に配置する、すなわち効率を上げ、さらに非機能的なmRNA転写産物の細胞内蓄積 を最小にする。 例えば、次の配列を有するハンマーヘッドリボザイムを、本発明に従って用い ることができる。 a)図１のヌクレオチド117と118の間を切断する b)図１のヌクレオチド148と149の間を切断する c)図１のヌクレオチド175と176の間を切断する d)図１のヌクレオチド526と527の間を切断する e)図１のヌレオクチド742と743の間を切断する f)図２のヌクレオチド169と170の間を切断するg)図２のヌクレオチド208と209の間を切断する h)図２のヌクレオチド238と239の間を切断する i)図２のヌクレオチド289と290の間を切断する j)図２のヌクレオチド989と990の間を切断する k)図２のヌクレオチド1206と1207の間を切断する l)図５のヌクレオチド75と76の間を切断するm)図５のヌクレオチド88と89の間を切断する n)図５のヌクレオチド123と124の間を切断する o)図５のヌクレオチド139と140の間を切断する p)図５のヌクレオチド158と159の間を切断する 本発明のリボザイムは、テトラヒメナサーモフィラ(Tetrahmena thermophila) (IVSまたはL-19 IVS RNAとして公知)において天然に発生し、Thomas Cechおよび 共同研究者らにより詳細に記載された(Zaugら,1984,Science,224:574-578;Zaug およびCech,1986,Science,231:470-475;Zaugら,1986,Nature,324：429-433,Univ ersity Patent Inc.により公開された国際特許出願第88/04300；BeenおよびCech ,1986,Cell,47：107-216)ものの ような、RNAエンドリボヌクレアーゼをもまた包含する。Cech型リボザイムは、 標的RNA配列へハイブリダイズする８塩基対活性部位を有し、それは後に標的RNA の切断を起こす。本発明は肝臓アクチビンRNAに存在する８塩基対の活性部位配 列を標的とした、それらのCech型リボザイムを含む。 アンチセンス法におけるように、リボザイムは改変オリゴヌクレオチドからな り(例えば、改良安定性、ターゲッティングなどのため)、in vivoで肝臓アクチ ビンを発現する細胞へ送達されるはずである。送達する望ましい方法は、強い構 成的pol IIIまたはpol IIプロモーターの制御下で、リボザイムを「コードする 」DNA構築物を使用することを包含し、これによって、トランスフェクトされた 細胞は内因性肝臓アクチビンメッセージを破壊し、翻訳を阻害するリボザイムを 十分量生成するだろう。リボザイムはアンチセンス分子とは異なり触媒的であり 、効率のためにはより低い細胞内濃度が必要とされる。 内因性肝臓アクチビン遺伝子発現はまた、標的相同組換え(targeted homologo us recombination)を用いて、肝臓アクチビン遺伝子またはそのプロモーターを 不活性化、または「ノックアウトすること」により低減することが可能である。 (例えば、参照によりすべて本明細書に組み入れるSmithiesら,1985,Nature 317 ：230-234;Thomas ＆ Capecchi,1987,Cell 51：503-512;Thompsenら,1989 Cell 5：313-321の各々を参照のこと)。例えば、内因性肝臓アクチビン遺伝子（肝臓 アクチビン遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）に相同なDNAがフラ ンキングした非機能的な肝臓アクチビン変異体（または相補的に関連のないDNA 配列）を、選択マーカーおよび／または陰性選択マーカーとともに、またはなし で用い、in vivoで肝臓アクチビンを発現する細胞をトランスフェクトすること ができる。DNA構築物の挿入は、標的相同組換えによって、肝臓アクチビン遺伝 子の不活性化を起こす。かかる方法は、特にES(胚性幹)細胞への改変を用いて、 不活性肝臓アクチビン（例えば、上記Thomas ＆ Capecchi 1987およびThompson 1989を参照のこと）を有する動物子孫を発生させることが可能な農学分野で適し ている。しかしながら、この方法はヒトでの使用に適合させることが可能であり 、組換えDNA構築物は、適当なウイルスベクターを用いてin vivoでの必要部位に 直接的に投 与され、またはターゲティングとされる。 別法として、内因性肝臓アクチビン遺伝子発現は、肝臓アクチビン遺伝子（例 えば、肝臓アクチビンプロモーターおよび／またはエンハンサー）の調節領域に 相補的なデオキシリボヌクレオチド配列をターゲティングにすることにより低減 し、体内の標的細胞中の肝臓アクチビン遺伝子転写を妨げる三重らせん構造を形 成する(通例、Helene,C.1991,Anticancer Drug Des.,6(6)：569-84;Helene,C.ら ,1992,Ann,N.YAcad.Sci.,660：27-36;およびMaher,L.J.,1992,Bioassays 14(12) :807-15を参照のこと)。 本発明のさらにもう１つの実施形態において、肝臓アクチビンの活性は「優性 陰性（dominant negative）」を用いて減少されうる。このために、エンドプロテ オリティック（endoproteolytic）モチーフの全部または一部および／または成 熟成長因子ドメインを欠いた突然変異体のような、欠陥肝臓アクチビンをコード する構築物が、適当な標的細胞における肝臓アクチビンの活性を減少させる遺伝 子治療法で使用されうる。例えば、前記ペプチドドメイン、エンドプロテオリテ ィックモチーフ、および／または成熟成長因子ドメインの全部または一部が変更 されまたは欠けている肝臓アクチビンの宿主細胞発現を指令するヌクレオチド配 列を、肝臓の細胞内に導入しうる(前記のin vivoまたはex vivo遺伝子治療法の いずれかによって)。あるいは、標的相同組換えを用いて、かかる欠失または変 異を被験者の肝臓の内因性肝臓アクチビン遺伝子へ導入することができる。操作 された細胞は非機能性肝臓アクチビン（すなわち、結合可能であろうがシグナル 導入（signal transduction）を誘発することが不可能なリガンドである）を発 現するであろう。 5.8 医薬製剤および投与方法 肝臓アクチビンタンパク質およびポリペプチド、ならびに肝臓アクチビン遺伝 子発現または遺伝子産物活性に作用する化合物を、治療上有効な用量で患者に投 与して、細胞成長および／または分化障害を調節、治療または改善することがで きる。治療上有効な用量とは、細胞成長および／または分化障害の症状の調節お よび／または改善するのに十分な化合物の量をいう。 5.8.1 有効用量 このような化合物の毒性および治療効力は、例えば、LD₅₀（その集団の50％致 死用量）およびED₅₀（その集団の50％において治療上有効な用量）を決定するた めの細胞培養または実験動物における標準的な製薬手法により決定できる。毒性 作用および治療作用間の用量比が治療指標であり、それはLD₅₀/ED₅₀比で示すこ とができる。高い治療指標を示す化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物 を用いてもよいが、非感染細胞に対する損傷の可能性を最小にするよう、冒され た組織部位に対しかかる化合物をターゲティングする送達系の設計に注意を払う べきであり、それにより副作用が軽減される。 細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトに用いる用量範 囲を処方するのに使用できる。かかる化合物の用量は、毒性がほとんどないか、 または全くないED₅₀を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。この用量は 使用する剤型および利用する投与経路により、この範囲内で変更してもよい。本 発明の方法に用いる化合物のいずれについても、治療上有効な用量は、まず、細 胞培養アッセイから評価できる。動物モデルで用量を処方して、細胞培養で求め たように、IC₅₀（すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を 含む循環中の血漿濃度範囲を達成してもよい。このような情報を用いて、ヒトで 有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高 性能液体クロマトグラフィーにより測定すればよい。 5.8.2 処方および使用 本発明に従う使用のための医薬組成物は、１種以上の生理学上許容される担体 または賦形剤を用いて従来法で処方してよい。 かくして、該化合物および生理学上許容されるそれらの塩および溶媒和物は、 吸入もしくは注入(口腔もしくは鼻腔のいずれかを通じる)、または経口、頬、非 経口もしくは直腸投与による投与用に処方してよい。投与は全身投与であっても 、また局所投与であってもよい。 経口投与のためには、この医薬組成物は、結合剤(例えば、予めゼラチン化し たトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメ チルセルロース)；増量剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロースもしくはリン 酸水素カルシウム)；滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクも しくは珪素)；崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウ ムデンプン)；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの賦形剤 を用い、従来法により製剤した例えば、錠剤またはカプセル剤の形態をとっても よい。錠剤は当業者に十分公知な方法によって被覆してもよい。経口投与用の液 体製剤は、例えば、溶液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤の形態をとってもよいし 、またはそれらを使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥 品として提供してもよい。このような液体製剤は、懸濁剤(例えば、ソルビトー ルシロップ、セルロース誘導体もしくは水素化した食用油脂)；乳化剤(例えば、 レシチンもしくはアカシア)；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エ ステル、エチルアルコールもしくは分留植物油）および保存料（例えば、メチル もしくはプロピル-p-ヒドロキシ安息香酸エステル、またはソルビン酸）などの 生理学上許容される添加物を用い、従来法により調製してよい。また、この製剤 は適切であれば、バッファー塩、ならびに香味料、着色料および甘味料を含んで もよい。 経口投与用の製剤は、活性化合物の徐放性が得られるよう適切に処方してよい 。 頬内投与のためには、この組成物は従来法で処方された錠剤またはトローチ剤 の形態をとってもよい。 吸入による投与のためには、本発明に従い使用される化合物は、適切な噴射剤 、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテ トラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスの使用を伴う、加圧パッ クまたは噴霧器からのエアゾルスプレーの形態で送達されれば便利である。加圧 エアゾルの場合、用量単位は、測った量を送達するためのバルブを備えておくこ とにより決定され得る。例えば、吸入器または注入器に使用するゼラチンのカプ セルおよびカートリッジを、該化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な 粉体基剤との混合粉体を含有させて処方してもよい。 該化合物は、注射による、例えば、ボーラス注射または連続的注入による非経 口投与用に処方してもよい。注射用処方は単位投与形、例えばアンプルで、ある いは保存料を添加した複数回投与容器で提供してもよい。該組成物は、油性もし くは水性ビビクル中で懸濁剤、溶液剤または乳剤などの形態をとってよく、さら に、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤を含んでもよい。ある いは、有効成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば発熱物質を含まない滅菌水 で形成する粉剤形態であってもい。さらに、非経口投与用のビヒクルに関する説 明はE.W.Martin,“Remington's Pharmaceutical Sciences”(Mack Pub.社)で見 出されうる。 また、この化合物は、例えばカカオバターまたは他のグリセリドなどのような 従来の坐剤基剤を含有させて、坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物に処方し てもよい。 これまでに記載した処方の他、この化合物はデポー製剤として処方しでもよい 。このような長期作用処方は、移植により(例えば皮下または筋肉内)、あるいは 筋肉内注射により投与してもよい。かくして、例えば、この化合物は適切な重合 物質または疎水性物質（例えば許容される油中の乳剤として）またはイオン交換 樹脂とともに処方してもよいし、あるいは難溶性誘導体として、例えば難溶性塩 として処方してもよい。 所望により、この組成物は有効成分を含有する１以上の単位用量形態を含んで よいパックまたはディスペンサー装置で提供してもよい。このパックは例えば、 ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルからなってもよい。この パックまたはディスペンサー装置は、投与に関する説明書を伴っていてもよい。 １つの実施形態では、本発明の医薬組成物を、治療の必要な領域に局所的に投 与することが望ましい。このことは例えば、限定されるものではないが、外科手 術中に局所注入すること；例えば外科手術後の外傷用医薬材料とともに局所塗布 すること；カテーテルから、坐剤とともに、または移植片（この移植片は多孔性 、非多孔性、もしくはゼラチン様物質であり、sialastic膜もしくは繊維などの 膜を含有する）から注入することにより達成され得る。特殊な具体例では、歯科 用または外科用目的の多孔性の移植片は移植部位に挿入されており、移植装置の 骨への付着を高めるため、肝臓アクチビン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、BMP 、およびTGF-βなどの骨誘導性タンパク質で被覆されていてよい。また、移植片 は、肝臓アクチビン、アクチビンＡ、アクチビンＢ、BMP、およびTGF-βなどの 骨誘導性タンパク質をコードするDNAで被覆されていてもよい。 ６．実施例：アクチビン／インヒビンＢ_Cおよびβ_E遺伝子の同定および特徴づけ ここでは、アクチビンの新規なサブグループの２つのメンバーである、アクチ ビンβ_Cおよびβ_Eサブユニットの同定および特徴づけを記載する。マウスにおい て、トランスフォーミング成長因子(TGF-β)スーパーファミリーの２つのメンバ ーをコードするcDNAクローンを単離し、特徴づけた。両cDNAはアクチビンβサブ ユニットをコードしていることが明らかになり、すなわち１つの遺伝子はヒトア クチビンβ_Cのマウス相同体であると考えられ、一方、２番目のものは新規なも のであり、アクチビンβ_Eで示されている。さらに、ヒトアクチビンβ_EcDNAクロ ーンが同定され、特徴づけられた。発明者らの研究では、ある点ではアクチビン β_Cおよびβ_Eは既知の他のアクチビンより互いによりよく似ており：(a)これら の遺伝子は物理的に連結され、アクチビンβ_Cの3'末端はアクチビンβ_Eの5'末端 から5kbpしか離れておらず；(b)両遺伝子座の構成は同じであり、単一の介在配 列により分断された２つのコーディングエキソンから構成され；(c)両アクチビ ンの推定されるカルボキシ末端配列は高い相同性を首して、成熟成長因子領域に わたって62％のアミノ酸が一致しており；(d)両遺伝子は成体マウスの肝臓で特 異的かつ高度に発現することが明らかであり：さらに、(e)いくつかのin vitro アッセイの結果はアクチビンβ_Cおよびβ_Eのホモ二量体がHepg2細胞の成長を刺 激することを示している。ひとまとめにして考えると、発明者らのデータは、ア クチビンβ_Cおよびβ_Eサブユニット遺伝子は縦列重複を受けた共通の祖先から進 化したことを示唆するものである。これらの構造および機能に関するデータによ り、アクチビンβ_Cおよびβ_Eサブユニットは他の既知のアクチビンから区別され 、このことはこれらサブユニットがTGF-β-様分子の独特のサブグループを表す ことを示唆している。 6.1 材料および方法 PCR ゲノムDNAの鋳型はNIH3T3細胞から標準法を用いて単離した(Sambrookら ，1989，前記)。RNAおよびcDNA鋳型はChenら(1993,J.Biol.Chem.,268:27,381-27 ,389)により記載されたように調製した。プライマー配列は以下の通り：上流プ ライマー(順方向)、5'GT(ACGT)GG(ACGT)TGG AA(CT) GA(CT)TGG AT3'；および下流プライマー(逆方向相補体)、5'CA(A:CGT)CC(AG)CA( ACGT)CC(CT)TC(ACGT)AC(ACGT)AC 3'。それぞれのコドンはスペースにより隔てら れており、その縮重は、括弧で示した、選択されたゆらぎ位置において合成中に ヌクレオチドのカクテルを付加することにより達成された。ゲノムDNAとcDNA鋳 型の双方について、PCRは、変性(94℃、1.5分)、アニーリング(50℃、１分、10 秒)および伸長(72℃、１分、10秒)の35サイクルにより進行させた。cDNA クローニング 50,000プラーク形成単位／プレートのアリコート（成体雄BA LB/c雄マウス由来のLambda gtllにおけるマウス肝5'-Stretch Plus cDNAライブ ラリー,Clonetech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA）および一晩成長させた新 鮮なY1088細胞（10mM MgSO₄中0.2％のマルトースを添加したLB培地中で成長）を 混合し、37℃で15分間インキュベートし、NZY Broth(Gibco-BRL Life Technolog ies Inc.,Grand Island,NY)および0.75％アガロースからなるアガロース上層液8 mlと再び混合し、次いで、新たに注いだ150mm NZY-寒天プレート上に平らに広げ た。標準法を用いてプラークリフトを調製し、フィルターハイブリダイゼーショ ンを行った(50％ホルムアミド、5ｘSSCバッファー、1xデンハートの溶液、10mM トリス、pH7.5、0.1％SDS、および100μg/mlサケ***DNA中42℃)。Sambrookら， 1989，前記。高いストリンジエンシーになるまでフィルターを連続的に洗浄した (0.1ｘSSCバッファー、0.1％SDS、65℃)。cDNAプローブは市販の試薬およびプロ トコールを用い、ランダムプライム法により放射性標識した(Random Primed DNA Labeling Kit,Amersham Life Science,Inc.,Arlington Heights,LL)。精製した ファージクローンはY1088細胞とともに培養し、次いで、ファージDNAをWizard( 商標)Lamda Prepキット(Promega,Madison,WI)によるプロトコールおよび試薬を 用いて抽出した。ファージDNAをEcoRIで消化し、組換えインサートを精製し、標 準的なプロトコールを用いてpBluescriptプラスミドベクター(Stratagene,La Jo lla,CA)中へクローン化し、次いで、このインサートを製造業者のプロトコール に従いSequenase（バージョン2.0，United States Biochemical Company,Clevel and,OH）を用いて配列決定した。配列アライメントと同一性は、Genetics Compu ter Group，Madison，WI製のソフトウエア(GrowTree(商標),バージョン8.1,UPMGS解 析法)を用いて決定した。マウスゲノムクローンの単離および特徴づけ Lamda Fix IIベクターにおけるゲノムライブラリー（マウス系統129SVJ肝DNA から作製,Stratagene）を50,000プラーク／プレートでプレーティングし、標識 β_CcDNAをプローブとして用いて、高ストリンジエンシー下で20個のニトロセル ロースレプリカをスクリーニングした。また、前記のようにフィルターを高いス トリンジェンシーになるまで連続的に洗浄し、オートラジオグラフィーにかけた 。陽性のファージプラークを純化するまで再びスクリーニングし、次いでWizard (商標)Lamda Preキット(Promega)に記載されているようにDNAを調製した。10の 単離物のプールから、各々10kbpより大きなゲノムDNAを有する５つの独特なクロ ーンを単離した。すべての独特なクローンのNotl消化物を、NotIで消化したpBlu escriptプラスミドベクター(Stratagene)へとサブクローニングした。ゲノムイ ンサートは、サザン解析およびDNA配列決定により特徴づけた。 ヒトアクチビンβ_Eクローンの単離および特徴づけ マウスアクチビンＢ_Eプラ スミドpbE#2をプローブとして用いてcDNAライブラリーをスクリーニングした。5 0,000プラーク形成単位／プレートのアリコート(成体マウス肝臓由来のLamda gt llにおけるヒト肝5'-Stretch Plus cDNAライブラリー，Cilonetech Laboratorie s,Inc.,Palo Alto,CA)および一晩成長させた新鮮なY1088細胞（10mM MgSO₄中0.2 ％のマルトースを添加したLB培地中で成長）を混合し、37℃で15分間インキュベ ートし、NZY Broth(Gibco-BRL Life Technologies Inc.,Grand Island,NY)およ び0.75％アガロースからなるアガロース上層液8mlと再び混合し、次いで、新た に注いだ150mm NZY-寒天プレート上に平らに広げた。標準法を用いてプラークリ フトを調製し、フィルターハイブリダイゼーションを行った(50％ホルムアミド 、5xSSCバッファー、１ｘデンハートの溶液、10mMトリス、pH7.5、0.1％SDS、お よび100μg/mlサケ***DNA中37℃)。低いストリンジェンシーになるまでフィル ターを連続的に洗浄した(0.5ｘSSCバッファー、0.1％SDS、55℃)。cDNAプローブ は市販の試薬およびプロトコールを 用い、ランダムプライム法により放射性標識した(Random Primed DNA Labeling Kit,Amersham Life Science,Inc.,Arlington Heights,LL)。精製したファージク ローンはY1088細胞とともに培養し、次いで、ファージDNAをWizard(商標)Lamda Prepキット(Promega,Madison,WI)によるプロトコールおよび試薬を用いて抽出し た。ファージDNAをEcoRIで消化し、組換えインサートを精製し、標準的なプロト コールを用いてpBluescriptプラスミドベクター(Stratagerle,La Jolla,CA)中へ クローン化し、次いで、このインサートを製造業者のプロトコールに従いSequen ase（バージョン2.0，United States Biochemical Company,Cleveland,OH）を用 いて配列決定した。配列アライメントと同一性は、Genetics Computer Group,Ma dison,WI製のソフトウエア(GrowTree(商標),バージョン8.1,UPMGS解析法)を用い て決定した。ノーザン分析． 成体マウス多組織ノーザンブロットをクローンテック（Clon tech）社から購入した。製品情報によれば、該ブロットの各レーンは、ほぼ2μg のポリ（Ａ）ＲＮＡを含有する。アクチビンβ_C（ヌクレオチド1230〜1555）お よびβ_E（ヌクレオチド1822〜2130）の3'非翻訳領域由来の非翻訳配列からなる 特異ｃＤＮＡプローブをサブクローニングにより作製し、その後、ランダムプラ イミングにより³²P-標識して、50％ホルムアミド、5ＸSSPE緩衝液(pH7.4,BioWhi ttaker,Walkersville,MD)、10ＸDenhardt's、2％SDS、100μg/mlサケ***ＤＮＡ 中でのハイブリダイゼーションに使った(42℃、一晩)。ブロットをハイブリダイ ゼーション緩衝液から0.1ＸSSC、0.1％SDS（55℃）へ徐々に洗浄し、その後、Ｘ 線フィルム（X-Omat ARフィルム，Eastman Kodak Co.,Rochester,NY）に対して 、-86℃で指示された時間、増感紙と共に配した。 発現プラスミド． 機能をスクリーンする目的で、アクチビンβ_C、β_E、およ びβ_Aサブユニットに対する発現プラスミドを以下に記載のように調製した。ヘ マグルチニン（「HA」）エピトープ・タグ（Fangら，1996，Proc．Natl．Acad．Sc i．U.S.A，93:5753-5758）をそれぞれの発現プラスミドのコード配列に付加した 。最終構築物の純度を確保するため、３つの全ての発現プラスミドを制限マッピ ングおよびＤＮＡ配列分析にかけた。 マウスアクチビンβ_Cサブユニットをコードする発現プラスミドをｐｃＤＮＡ3 ベクター（Invitrogen Corp.，San Diego，CA）中に組みこんだ。サブクローニ ングの前に、HAエピトープをアクチビンβ_Cをコードする配列の3'末端に、PCRに より付加した。プライマー配列は次のとおりであった：上流プライマー(前方向( forward))、5'CCG AAT TCC ATG GCC TCC TTG CTC CTG GC 3'、および下流プライ マー(逆方向相補体(reverse complement))、5'GGG AAT TCA AGC GTA ATC CGG AA C GTA ACT ACA CCC GCA GGC CTC GAC CAC GGG ATC C 3'。下流プライマーは、PC R産物がHAエピトープをコードし、その3'末端にEcoRI部位をもつように設計され ていることに注意すること。全β_Cコーディング領域を含有するｃＤＮＡクロー ン由来のプラスミドをテンプレートＤＮＡのソースとして使った。PCRは、変性( 94℃、1.0分)、アニール(65℃、１分、10秒)、および伸長（72℃、１分、10秒） を25サイクル 進行させた。PCR産物（1.1-kbp）をEcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳動に より精製し、そしてｐｃＤＮＡ3ベクターにサブクローニングした。 マウスアクチビンβ_Eサブユニットをコードする発現プラスミドもｐｃＤＮＡ3 ベクターに組み込んだ。HAエピトープは、本質的に上記のようにコーディング領 域の3'末端に付加した。プライマー配列は次のとおりであった：上流プライマー (前方向)、5'CCC AAT TCC TGG AGC ATG AAG CTT CCA AA 3'、および下流プライ マー(逆方向相補体)、5'GGG AAT TCA AGC GTA ATC CGG AAC ATC GTA TGG GTA GC T GCA GCC ACA GGC CTC TAC 3'。全β_Eコーディング領域を含有するｃＤＮＡク ローン由来のプラスミドをテンプレートＤＮＡのソースとして使った。PCRは、 本質的に上記のように実施した。PCR産物（1.1-kbp）をEcoRIで消化し、アガロ ースゲル電気泳動により精製し、そしてｐｃＤＮＡ3ベクターにサブクローニン グした。 アクチビンβ_Aサブユニットは、卵巣ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）をテ ンプレートＤＮＡのソースとして使い、PCRにより取得した。プライマー配列は 次のとおりであった：上流プライマー(前方向)、5'GCT GCC AGG ATG CCC TTG CT T 3'、および下流プライマー(逆方向相補体)、5'CTA TGA GCA CCC ACA CTC 3'。 PCRは、変性(94℃、1.5分)、アニール(60℃、１分、10秒)、および伸長（72℃、 １分、10秒）を30サイクル進行させた。PCR産物（1.3-kbp）をアガロースゲル電 気泳動により精製し、そしてその後TAクローニングベクター（Invitrogen Corp. ,San Diego,CA）にクローニングした。その後、マウスアクチビンβ_Aサブユニッ トをコードする発現プラスミドをｐｃＤＮＡ3ベクター中に組みこんだ。HAエピ トープを該コード配列の3'末端に、本質的に上記のように付加した。プラスミド pbE#2をテンプレートＤＮＡのソースとして使い、PCRを本質的に上記のように実 施した。PCR産物をEcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳動により精製し、そし てｐｃＤＮＡ3ベクターにサブクローニングした。 発現プラスミド． 組換えアクチビンβ_C、β_E、およびβ_Aサブユニットのホ モ二量体を得るため、標準プロトコルを使って一過性トランスフェクションを実 施した。Sambrookら，1989，前掲。トランスフェクションの日に、サブコンフル エント（subconfluent）の293T細胞を、10％胎児ウシ血清を補給した新鮮なDulb ecco改変Eagle培地にまいた(試薬類は、Gibco-BRL Life Technologiesから入手 した)。10μgの発現プラスミドＤＮＡを、0.5mlの0.25M CaCl₂溶液に加え、そし て混合液を0.5ml Hepes緩衝生理食塩水（270mM NaCl,1.5mM NaPO₄,50mM Hepes,p H7.05）に滴下した。混合液を室温で10分間放置し、それから、新しくまいた293 T細胞の培地に滴下した。37℃で一晩インキュベーシヨンした後、培地を置き換 え、細胞を更に48時間培養した。プロテアーゼ阻害剤（ロイペプチン、1mg/ml、 アプロチニン、1mg/ml、ダイズトリプシン阻害剤、10mg/ml、およびペプスタチ ン、1mg/ml；シグマ・ケミカル社（試薬類はSigma Chemical Co.,St.Louis,MO） から入手した）の存在下で培地サンプルを採集し、使用まで４℃で貯蔵した。 ６．２ 結果と考察 一対の縮重PCRプライマーは、ヒト骨形態形成タンパク質−２および−４の保 存配列（VGWNDWIおよびVVEGCGC）に基づいて設計した：上流プライマー(前方向) 、5'GT(ACGT)GG(ACGT)TGGAA(CT)GA(CT)TGG AT 3'、および下流プライマー(逆方 向相補体)、5'CA(ACGT)CC(AG)CA(ACGT)CC(CT)TC(ACGT)AC(ACGT)AC 3'。個々のコ ドンはスペースにより分離され、縮重は括弧で示されるように選択されたゆらぎ の位置（wobble position）でヌクレオチドのカクテルを加えて達成されたこと に注意すること。PCR産物は、単一コーディングエキソン内から誘導されると期 待され、そしてｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方がテンプレートとして使用さ れた。PCRは、一連のアニーリング温度を使って、〜300-bpの期待サイズのバン ドが得られるまで実施した。生成したPCR産物をTAクローニングベクター（In Vi trogen）にクローニングし、その後、大腸菌（E.coli）の形質転換に使った。数 千の形質転換大腸菌(E.coli)コロニー形成ユニットがスクリーニングに利用可能 であって、骨形態形成タンパク質−２および−４、アクチビンβ_A、アクチビン β_Bおよび成長／分化因子−６および−７を含むいくつかの公知のTGF-βスーパ ーファミリメンバーを最終的に同定した(示されてない)。 また、これらの努力により、本発明者らがDP-2と称する280ヌクレオチドの明 らかにユニークなPCR断片が単離された。DP-2断片をプローブとして使い、マウ ス肝ｃＤＮＡライブラリー由来の500,000プラーク形成ユニットをスクリーニン グした。20以上のポジティブな単離物のプールから、DP-2と高ストリンジェンシ ー条件下でハイブリダイゼーションする３つのユニークなオーバーラップするｃ ＤＮＡクローンを精製した。ＤＮＡ配列分析（３クローン全て）は、1837ヌクレ オチドｃＤＮＡ配列内に1056ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを明 らかにした(図1)。この推定配列は、39kDの推定分子量（molw）および４つの潜 在的なN-結合グリコシル化部位を有する352アミノ酸からなっていた。翻訳開始 に好都合なMetコドン（ヌクレオチド148）を、仮に翻訳開始部位と称した。この ATGコドンの上流に、本発明者らは４つのフレーム内停止コドンを見出したが、 追加のATGコドンはなかった。また、本発明者らは翻訳停止シグナル（TAG）に先 行する、正準（canonical）TGF-β CXCX配列（Robertsら，1990，The transform ing growth factor betas．In:Sporn MB，Roberts AB(編)HanLdbook of Experim ental Pharmacology，95(Part I)，Springer-Verlag，Heldelberg，pp.419-472 ）も見出した。配列比較に基づいて(以下に記載)、1056ヌクレオチドのオープン リーディングフレーム配列を、仮にマウスアクチビンβ_Cと称する。 マウスアクチビンβ_Cゲノム遺伝子座をクローニングするとき、本発明者らは 、アクチビンβ_C遺伝子の下流にあり、かつサザンブロットにおいて低ストリン ジェンシー条件下でβ_CｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションする300bpの BamHIゲノムＤＮＡ断片を見出した(データは示されてない)。このBamHI断片をプ ラスミドベクターpBluescript（Stratagene）にサブクローニングし、そしてプ ローブどして使ってマウス肝ｃＤＮＡライブラリー由来の追加の500,000プラー ク形成ユニットを高ストリンジェンシー条件下でスクリーニングした。2130-bp の配列を表すユニークな、オーバーラップするｃＤＮＡクローンを、20以上のポ ジティブな単離物のプールから精製した。配列分析（３クローン全て）は、1050 ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム、350アミノ酸の概念配列、39kD の推定分子量（molw）および１つの潜在的なN-結合グリコシル化部位を明 らかにした(図2B)。翻訳開始に好都合なMetコドン（ヌクレオチド216）を、仮に 翻訳開始部位と称した。このATGコドンの上流に、本発明者らは単一のフレーム 内停止コドンを見出したが、更にATGコドンはなかった。翻訳停止シグナル（TAG ）に先行する正準CXCX配列も同定された。以下に記載するように、配列比較分析 は、1050ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム配列が新規のアクチビン βサブユニットをコードすることを示唆し、これをマウスアクチビンβ_Eと称す る マウスアクチビンβ_Cとβ_Eサブユニットは、他のTGF-βスーパーファミリーメ ンバーの様に組織化されている(Robertsら，1990，The transforming growth fa ctor betas．In:Sporn MB，Roberts AB(編)Handbook of Experimental Pharmaco logy，95(Part I)，Springer-Verlag，Heldelberg，pp.419-472;Kingley，D.M. ，1994，Genes Develop 8:133-146)。両事例共に、開始Met残基の後に、〜20ア ミノ酸の特徴的なシグナルペプチドがある。シグナルペプチドの下流で、両配列 は、推定エンドプロテナーゼ切断部位（endoproteolytic clevage site）を持つ プロペプチドおよび成熟成長因子領域（すなわち、クラスター形成塩基性アミノ 酸；図１および図２を参照）に、これら領域の接続部で組織化されているようで ある。もしこれらの切断部位が実際使われると、マウスアクチビンβ_Cサブユニ ットのプロペプチドおよび成熟増殖因子領域は、それぞれほぼ216および116アミ ノ酸からなるであろうし、マウスアクチビンβ_Eサブユニットのプロペプチドお よび成熟増殖因子領域は、それぞれほぼ215および114アミノ酸からなるであろう 。ミュラー管抑制物質（Mullerian inhibitory substance）を除けば、TGF-βス ーパーファミリーの全ての公知のメンバーは、C-末端からほぼ120アミノ酸の塩 基性残基のクラスターを有する。少なくともTGF-β'(Robertsら，1990，The tra nsforming growth factor betas．In:Sporn MB，Roberts AB(編)Harldbook of E xperimental Pharmacology，95(Part I)，Springer-Verlag，Heldelberg，pp.41 9-472；Kingley，D.M.，1994，Genes Develop 8:133-146)、インビビン(Valeら ，1990，The activins and inhibins．In:Sporn MB，Roberts AB(編)Peptide Gr owth Factors and Their Receptors，95(Part II)．Springer-Verlag，Helderbe rg，pp.211-248;Masonら，1985，Nature 318: 659-663)、および骨形態形成タンパク質−２の場合、該タンパク質の成熟形はこ れらの部位のエンドプロテアーゼ切断により作製されることが公知である。 β_C ｃＤＮＡをプローブとして使い、高ストリンジェンシー条件下でマウスゲ ノムライブラリー由来の1,000,000プラーク形成ユニットをスクリーニングして 、いくつかのゲノムクローンが単離された。これらのクローンのオーバーラップ する挿入断片の部分制限およびＤＮＡ配列分析は、〜5-kbpのマウスゲノムＤＮ Ａは、アクチビンβ_Cの3'末端とアクチビンβ_Eの5'末端をアクチビンβ_C下流の アクチビンβ_E遺伝子座で分離していることを示した(図4)。両遺伝子座の組織は 同様で、単一介在配列により分離される２つのコーディングエキソンからなる。 オーバーラップするゲノムクローンの部分制限分析と部分ＤＮＡ配列分析は、ア クチビンβ_Cイントロンのサイズが〜12-kbpであることを示す。対照的に、ＤＮ Ａ配列決定は、アクチビンβ_Eイントロンのサイズは234-kbpであることを示す。 234-kbpアクチビンβ_Eイントロン配列は、GenBank（受理番号）に寄託されてい る。 マウスアクチビンβ_Cおよびβ_Eの予測カルボキシ−末端アミノ酸配列は、成熟 増殖因子領域において61％のアミノ酸同一性があり高い相同性がある。両方のコ ード配列は、全体で９つのシステイン残基を含有し；システインのスペーシング および他の保存アミノ酸の存在はアクチビンサブファミリーの最も特徴的なもの であり、これほどではないがTGF-β1-5の特徴である。成熟増殖因子領域内のパ ーセントアミノ酸配列同一性の表を作ると、マウスアクチビンβ_C（1056ヌクレ オチドコード配列）は、ヒトアクチビンβ_Aと52％の同一性を、ヒトアクチビン β_Bと50％の同一性を、ヒトアクチビンβ_Cと95％の同一性を、アフリカツメガエ ルアクチビンβ_Dと62％の同一性を示した。比較すると、マウスアクチビンβ_E（ 1050ヌクレオチドコード配列）は、ヒトアクチビンβ_Aと45％の同一性、ヒトア クチビンβ_Bと47％の同一性、ヒトアクチビンβ_Cと64％の同一性、アフリカツメ ガエルβ_Dと63％の同一性を示した。対照的に、本発明者らのマウスコード配列 をTGF-βスーパーファミリーの他のメンバーと比較すると、20〜40％アミノ酸配 列同一性しか見出さなかった。これらのデータは、1056ヌクレオチドのコード配 列は、ほとんどヒトアクチビンβ_Cのマウス相同体であることを示唆する。 対照的に、1050ヌクレオチドコード配列は、新規のアクチビンサブユニット遺伝 子であると考えられ、本発明者らはこれをアクチビンβ_Eと称する。本発明者ら の知る限り、これはどの種でもアクチビンβ_E単離の最初の報告である。 この関係はまた、アクチビンβ_Aとβ_Bがお互いに最も関係しているが、アクチ ビンβ_C、β_D、およびβ_Eが関連配列の第二のサブセットを代表することも示唆 する。５つのアクチビンβサブユニットの成熟増殖因子領域のアラインメントを 図３に示す。アクチビンβ_Aとβ_Bは63％のアミノ酸同一性を持つが、アクチビン β_C、β_D、およびβ_Eは62％の同一性を有する。５つのアクチビンβサブユニッ トは全体でほぼ50％の同一性を有する。 マウスアクチビンβ_Cとβ_E遺伝子発現のパターンを、いくつかの成体マウス組 織のノーザン分析により評価した。成体動物とヒトで広く発現するアクチビンＡ およびＢ（例えば、Meunier，H.ら，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:24 7-251）とは対照的に、多組織ノーザンブロットの、アクチビンβ_Cの3'非翻訳領 域からの特異的プローブによるハイブリダイゼーションは、肝組織に〜2.0-kbの 単一主要転写物を確認した(図6)。このバンドはＸ線フィルムへの３時間程度の 少ない露光で確認された。他の組織（心、脳、脾、肺、腎、精巣および骨格筋） によるアクチビンβ_C遺伝子の発現は、ブロットをＸ線フィルムに３日間露光し ても検出されなかった(示されてない)。アクチビンβ_E遺伝子も肝組織で高度に 発現した。同じ多組織ノーザンブロットの、アクチビンβ_Eの_3'非翻訳領域から の特異的プローブによる再ハイブリダイゼーションは、〜3.2-kbの単一の肝転写 物を確認した。このバンドも、Ｘ線フィルムの３時間の少ない露光で確認され、 他の組織での発現は、ｘ線フィルムに３日間露光しても検出されなかった(示さ れてない)。 マウスのアクチビンβ_Eクローンをプローブとして使い、ヒト肝ｃＤＮＡライ ブラリー由来の500,000プラーク形成ユニットを低ストリンジェンシー条件下で スクリーニングした。２つのオーバーラップするｃＤＮＡクローン(1,764-bpの 配列を表す）を、20以上のポジティブな単離物のプールから精製した。配列分析 により、39kDの予測分子量および１つの潜在的N-結合グリコシル化部位をもつタ ンパク質をコードする1050ヌクレオチドの予測オープンリーディングフレー ムを明らかにした(図5)。Met開始コドン（ヌクレオチド77で始まる）は、翻訳開 始部位と考えられる。停止翻訳シグナル（TAG）に先行する正準CXCX配列も確認 された。ポリアデニル化シグナルが更に停止コドンの下流に確認された。配列比 較分析は、1050-bpオープンリーディングフレーム配列がヒトアクチビンβ_Eをコ ードすることを示唆した。 ヒトアクチビンβ_Eサブユニットは、他のTGF-βスーパーファミリーメンバー と同じように組織化されている。予測開始MET残基の後に、〜20アミノ酸の特徴 的なシグナルペプチドが続く。シグナルペプチドの下流で、予測されたプロペプ チドおよび成熟成長因子領域を確認した。該領域は、塩基性アミノ酸のクラスタ ーにより分離され、１つ以上の推定エンドプロテアーゼ切断部位を作製する。こ れらの部位での切断は、それぞれ〜215および114アミノ酸のプロペプチドおよび 成熟増殖因子を産生する。 マウスおよびヒトアクチビンβ_Eの予測カルボキシ−末端アミノ酸配列は、増 殖成長因子領域において＞95％のアミノ酸同一性を有して高度に相同性がある。 両方のコード配列は全体で９つのシステイン残基を含有する。システインのスペ ーシングおよび他の保存アミノ酸の存在はアクチビンに最も特徴的なものであり 、これほどではないがTGF-βの特徴である。成熟増殖因子領域内のパーセントア ミノ酸配列同一性の表を作ると、ヒトアクチビンβ_Eは、ヒトアクチビンβ_Aと45 ％の同一性を、ヒトアクチビンβ_Bと47％の同一性を、ヒトアクチビンβ_Cと64％ の同一性を、アフリカツメガエルアクチビンβ_Dと62％の同一性を示した。対照 的に、ヒトアクチビンβ_EをTGF-βスーパーファミリーの他メンバーと比較する と、20〜40％のアミノ酸配列同一性しか見出されなかった。 この実施例は、TGF-βスーパーファミリーのメンバーをコードする２つのマウ スｃＤＮＡおよび１つのヒトｃＤＮＡの単離と特性付けを報告する。密接に関係 する該ｃＤＮＡは、アクチビンのβサブユニットをコードする。これらのサブユ ニットの一つは、ヒトアクチビンβ_Cのマウス相同体のようであるが、第二およ び第三のサブユニットは新規であり、マウスおよびヒトアクチビンβ_Eサブユニ ットと称する。総合すると、アクチビンβ_Cおよびβ_E間の高度の配列同一性、そ れらのクラスター形成ゲノム組織、およびそれらの成体肝組織における特異的お よび強い発現パターンは、これらの遺伝子が縦列重複化を経た共通の祖先から進 化したことを示唆する。これらのデータはまた、アクチビンβ_Cおよびβ_Eサブユ ニットはTGF-β-様分子のユニークなサブグループを表し得ることを示唆する。 今まで、全部で５つのアクチビン／インヒビンβサブユニットと２つのインヒ ビンαサブユニットが単離され特性付けされている。アクチビンは元々、一次ラ ット前葉下垂体細胞in vitroからのFSH放出制御を測定することにより生殖腺液 （gonadal fluid）から単離されたが(Valeら，1986，Nature 321:776-779:Ling ら，1986，Nature 321:779-782;Lingら，1986，Biochem Biophys ResCommun 138 :1129-1137)、現在、アクチビンは独立して、限定されるものでないが、赤芽球 分化(Yuら，1987，Nature 330:765-767;Etoら，Biochem Biophys Res Commun 14 2:1095-1103)、神経細胞残存（nerve cell survilval）(Schubert，D.,ら，1990 ，Nature 344:868-870)、アフリカツメガエル胚の中胚葉誘導(Slack J.M.，1994 ，Curr Biol 4:116-126)、巨核球分化(Fugimoto，K.，1991，Biochem．Biophys ．Res．Commun．174:1163-1168)、心形態形成(Olson，E.，ら，1996，Science 2 72:671-676)、骨成長(Luyten，F.,ら，1994，Exp．Cell Res．210:224-229;Ogaw a，Y,ら，1992，J．Biol．Chem．267:2325-2328)、およびソマトスタチン誘導（ Woodruff，T．ら，1995，Annu．Rev．Physiol．57:219-244）を含むいくつかの 異なる活性に基づいて精製されている。３つのアクチビン（Ａ、Ｂ、およびAB） が今までによく特性付けされており、それぞれ、ジスルフィド結合二量体を形成 する異なる組合わせのβサブユニット（それぞれβ_Aβ_A、β_B、β_Bおよびβ_Afβ_B 、）からなる。β_C、β_D、およびβ_Eサブユニットがホモ二量体、ヘテロ二量体 、またはそれら両方を形成するかはまだ明らかでない。しかし、これらサブユニ ットの最近の単離は、アクチビンに対するいくつかの組合わせの可能性が事実上 かなり高いことを示唆する。他方、インヒビンは最初、FSH放出を抑制する生殖 腺ペプチドとして、前葉下垂体から確認された(Valeら，1990，The activins an d inhibins．In:Sporn MB，Roberts AB(編)Peptide Growth Factors and Their Receptors，95(Part II)．Springer-Verlag，Heldelberg，pp.211-248;Masonら ，1985，Nature 318:659-663;Rivier，J.,ら，1985，Biochem．Biophys．Res．C ommun．133:120-127)。インヒビン合成の 主な生殖腺部位はセルトリ（Sertoli）および顆粒膜細胞である。インヒビンＡ およびＢはまた、胎盤で、および成体脾臓および神経系でも発現される。マウス の両性においで、インヒビンは、性腺間質細胞（gonadal stromal cell）増殖の 重要なネガティブ調節剤であるらしく、すなわち、インヒビン欠損マウスでは、 顆粒膜細胞（雌マウス）およびセルトリ細胞（雄マウス）からなる混合または不 完全分化性腺間質腫瘍が発生する(Matzuk，M.,ら，1992，Nature 360:313-319) 。 ７．実施例： アクチビンβ_C発現プラスミドＤＮＡの直接の導入および発現が 、in vivoでの新しい骨形成を引き起こす。 直接のin vivoでの遺伝子導入を用いて、アクチビンβ_Cホモダイマーが骨誘導 活性を有するかどうか決定した。プラスミドＤＮＡを含む分解性のマトリックス （遺伝子活性化したマトリックス、またはＧＡＭ）を成体ラット大腿骨の分節間 隙に移植した。アクチビンβ_C発現プラスミドＤＮＡを含むＧＡＭの移植は、間 隙を満たす新たな骨の生物学的応答をもたらした。この実験は、アクチビンβ_C の過剰発現は、新たな骨をin vivoで形成させることを示す。 ７．１ 材料および方法 動物モデル ５mmの骨切り術を行うために、４つの1.2ｍｍ直径のピンを、一般的麻酔下で 、かつ一定の灌注法で、正常な成体Sprague-Dawleyラットの大腿骨幹にねじ込ん だ。外科用テンプレートが、平行なピンの配置を誘導し、これは、蛍光間接撮影 によって確かめた(ピンは、固定器プレートの端から3.5ｍｍの所に2.5ｍｍずつ 離して設置した)。次に、外側の固定器プレート（30×10×5ｍｍ）をピンの上に 固定した。外側の固定器プレートは、高耐性を保証するために、ＣＮＣミルでア ルミニウム合金を用いて組み立てられた。結合した止め座金と糸を通したピンを 有する、予め組み立てられたファスナーはステンレス鋼でできていた。すべての 固定器部品を、手術に先立ちエチレンオキシドガスで滅菌した。５ｍｍの分節欠 損を、Hall Micro 100振動鋸（Zimmer Inc.,Warsaw,IN）を用いて中央の長幹に 作った。凝固した血液に取り囲まれるまで、コラーゲンスポンジを骨切 り術の間隙に保持した(予備的な研究は、この手技が骨切り術部位内にスポンジ を固定させることを示した)。皮膚切開口をステープルで閉じた。固定器は必要 な安定性を与えたので、動物の歩行は制限されなかった。 プラスミドＤＮＡの調製 アクチビンβ_C発現プラスミドを含む樹立された細菌細胞株を、確立されたプ ロトコールに従って、液体培養液で増殖させた。プラスミドを、Oiagen Inc.か らの試薬およびプロトコールを用いて、エンドトキシンを含まないやり方で精製 した。 遺伝子活性化されたコラーゲンスポンジの調製 １．５ｍｌのＰＬＧＡ／クロロホルム溶液（３％w/v）(50／50ポリ乳酸ポリグ リコール酸共重合体、平均MW 90,000、固有粘度1.07）に、アクチビンβ_Cをコー ドする発現プラスミドＤＮＡを含む溶液０．２ｍｌ（１ｍｇのＤＮＡ、10mMのト リス、0.1mMのEDTA、pH7.4）を加えた。溶液を２分間渦巻き撹拌して乳化した後 、マイクロチップ プローブ型超音波処理器を用いて５５ワットの出力にて、約 ０℃で30秒間超音波処理した。Ｘ線撮影 携帯用のＸ線単位（ＧＥ、モデル100）を用いて、動物が目覚めている間に、 毎週、単純Ｘ線写真（背部−腹側の図）を得た。 組織学 組織の固定、脱塩、パラフィン包埋、切片化および染色の標準的方法を用いて 、光学顕微鏡のために組織を調製した。 ７．２ 結果 骨切り術モデル ラットにおける骨切り術の修復は術後９週間までに完了するが、修復のやり方 は、間隙の大きさに依存する：２ｍｍの間隙は骨質の癒合により回復するが、５ ｍｍの間隙は繊維質の非癒合により回復する。術後１３週間までの間保持した対 照動物により、５ｍｍの間隙が典型的に繊維質の非癒合によって回復するという 観察を確認した。毎週の単純Ｘ線写真および組織学は、５ｍｍの骨切り術のみ(n =3)、５１ｍｍの骨切り術＋ＰＬＧＡマトリックス（n=10）または５ｍｍの骨切 り術＋プラスミドＤＮＡを含むＰＬＧＡマトリックス（n=23）のいずれかを受け た動物において、骨が形成しなかったことを示した。すべての36個の対照間隙は 、繊維質組織の堆積によって回復した。対照の大腿骨は、焦点の(focal)骨膜の 新たな骨形成を示した(ピンの配置の複雑化)。間隙の組織において焦点の一過性 の炎症性の応答（リンパ球およびマクロファージ）もまた術後に観察された。 アクチビンβc遺伝子導入 全長マウスアクチビンβ_CｃＤＮＡを、ライブラリースクリーニングによって 単離し、ｐｃＤＮＡ３真核細胞発現ベクター（インビトロゲン）へサブクローン 化した。組換えタンパク質を特異的に検出するために、アクチビンβcをコード する配列の３'末端を、赤血球凝集素（HA）エピトープの添加により修飾した。 組換えアクチビンβcが、この構築物（ｐＧＡＭ３）から、in vitroの転写およ び翻訳プロトコールを用いて発現された。免疫沈降の研究はまた、抗ＨＡポリク ローナル抗体によって認識される前記ＨＡエピトープの活性を確立した。 組換えβcの生合成を、ｐＧＡＭ３プラスミドＤＮＡを用いた、培養した２９ ３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションのあとに評価した：免疫沈降によって証 明されたように、アクチビンβc分子はホモダイマーへと集められ、分泌され、 そして期待されるようにプロセシングされた。図６。 ｐＧＡＭ３ ＤＮＡを含むＰＬＧＡマトリックスを、４〜２４週間保持した３ 匹の成体ラットの間隙中に置いた。外科手術の両縁に由来する新たな骨の、顕微 鏡で観察した焦点を、はやくも術後４週間に観察した。自己誘導による骨形成の 古典的記載に一致して、これらの焦点は、大きな立方体様の骨芽細胞によって表 面を付けられ、多形の紡錘形にされた線維芽細胞およびキャピラリー管から成る 細胞性結合組織によって支持された骨質プレートから成っていた。対側の（操作 されなかった）大腿骨のＸ線写真の様相は、３つの場合すべてにおいて変化なく (示さず)、遺伝子導入およびアクチビンβc過剰発現の効果が、骨切り術の間隙 に限定されることを意味する。これらのデータは、アクチビンβcホモダイマー が骨誘導活性を有することを示す。 ８．実施例： 組換えアクチビンβcホモダイマーはin vivoで造血を刺激する。 ヒト骨髄生検材料を、組換えアクチビンβcで条件づけられた培地の存在中で 培養して、もしあるならば、造血におけるアクチビンβcホモダイマーの効果を 測定した。実験は、アクチビンβcホモダイマーが造血を刺激することができる ことを示した。 ８．１ 材料および方法 アクチビンβc条件付け培地の製造 ｐＧＡＭ３プラスミドＤＮＡ、２９３Ｔ細胞および標準のプロトコールを用い て、記載されたようにして、一過性トランスフェクションを行った。トランスフ ェクションの日に、サブコンフルエント(sub-confluent)な２９３Ｔ細胞は、10 ％ウシ胎児血清を補った、新鮮なダルベッコ修飾イーグル培地を与えられた(試 薬はGibco-BRL Life Technologies,Inc.からのもの)。１０μｇのプラスミドＤ ＮＡを、０．２５ＭのＣａＣｌ₂溶液０．５ｍｌに加え、混合物を０．５ｍｌの ヘペス緩衝化食塩水(Hepes-buffered saline)(２７０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍ ＭのＮａＰＯ₄、５０ｍＭのHepes、pH7.05)に滴下して加えた。この混合物を室 温に１０分間保持した後、新たに栄養を与えた２９３Ｔ細胞の培地に滴下して加 えた。３７℃で一晩インキュベーションした後、培地を取り換え、細胞をさらに ４８時間培養した。代謝標識の研究のために、トランスフェクションした細胞に 、メチオニンおよびシステインを欠き、かつ５％の透析したウシ胎児血清（すべ ての試薬はGibco-BRL Life Technologies,Inc.からのもの）および２００ｍＣｉ ［³⁵Ｓ］Ｍｅｔおよび［³⁵Ｓ］Ｃｙｓ（Translabel Cysand Met,ICN）を補った ダルベッコ修飾イーグル培地を再び与えた。細胞を３７℃でさらに２４時間イン キュベートし、プロテアーゼインヒビター（ロイペプチン、１ｍｇ／ｍｌ、アプ ロチニン、 １ｍｇ／ｍｌ、大豆トリプシンインヒビター、１０ｍｇ／ｍｌおよびペプスタチ ン、１ｍｇ／ｍｌ、シグマ(Sigma)）の存在中で培地サンプルを集め、使用する まで４℃で貯蔵した。 ヒト骨髄培養物 ヒト骨髄吸引物を、インフォームドコンセントの後に、正常なボランティアか ら得た。GartnerおよびKaplan(1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,4756-4759)により 記載されたようにして、正確に、長期骨髄培養を確立した。免疫学的局在決定の ために、２〜３枚のカバーガラスを各培養物に置き、毎週、免疫細胞学のために 除去した。造血始原細胞の頻度および造血始原細胞の総数の測定を、先に記載し たようにして行った(Longら、1990,J.Clin.Invest.86:1387-1395)。アッセイは 三重に行った。 ８．２ 結果 アクチビンβc条件付け培地は造血を刺激する。 アクチビンβ_c条件付け培地をヒト骨髄吸引物培養物に加えたとき、赤血球形 成、顆粒球形成および巨核球形成の強い傾向および統計的に有意な刺激が観察さ れた(図９)。さらに、アクチビンβc条件付け培地は、造血始原細胞の総数に２ 倍増加を引き起こした。これらのデータは、アクチビンβcホモダイマーが造血 を刺激することができることを示す。 ９．実施例： アクチビンβcホモダイマーは、潜伏性のＴＧＦ−β結合タンパ ク質−３を結合する。 潜伏性のＴＧＦ−β結合タンパク質（ＬＴＢＰ）は、血小板および他の細胞に より産生される大きな潜伏性ＴＧＦ−β複合体の成分である。３つのＬＴＢＰを コードする遺伝子が現在までのところ単離されている；２つの遺伝子生産物（Ｌ ＴＢＰ−１およびＬＴＢＰ−２）は、ジスルフィド結合を介して潜伏性ＴＧＦ− βｌを結合することが示されているが、ＬＴＢＰ−３は近年単離されたにすぎず 、その結合能力はまだ測定されていない。この疑問を処理するために、本発明者 ら は、培養した細胞を、マウスＬＴＢＰ−３およびヒトＴＧＦ−βｌをコードする 発現プラスミドを用いて、一時的に同時トランスフェクトし、免疫沈降法、ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを用いて複合体形成を研究した(Yin ら、提出された)。その結果は、ＬＴＢＰ−３がまた、潜伏性複合体の集合中に 潜伏性ＴＧＦ−βｌを共有的に結合することを示した。同時トランスフェクショ ンの戦略はまた、ジスルフィド結合形成の部位が、ＬＴＢＰ−３における８−シ ステインＴＧＦ−ｂｐの構造モチーフであることを初めて示すのに使用された。 これらの結果は、マウスＬＴＢＰ−２からのＴＧＦ−ｂｐ発現プラスミドを使用 したさらなる同時トランスフェクションの研究によって確認され、かつ広げられ た。それと共に、これらの研究は、潜伏性ＴＧＦ−βｌ複合体の集合中のＴＧＦ −ｂｐモチーフのための新たな機能的役割を明らかにする。この結果は、ＴＧＦ −β生合成、貯蔵および標的化のために重要な意昧を有する。 ＬＴＢＰ−３は、３つのＴＧＦ−ｂｐの構造モチーフ全部を有し、そのうちの ２つだけが、親和力でＴＧＦ−βｌを結合する。したがって本発明者らは、第３ の構造モチーフが、関連する分子、すなわちＴＧＦ−βスーパーファミリーの他 の構成員を結合することができるかどうかを決定しようとした。特に、本発明者 らは、システイン残基の数と間隔との保存されたパターンを持つプロペプチドを 有するという特性を有するＴＧＦ−β様の分子がまた、ＬＴＢＰ−３を結合する かどうかを決定しようとした。この疑問を処理するために、同様の実験計画が使 用された：本発明者らは、培養した細胞を、マウスＬＴＢＰ−３およびアクチビ ンβcをコードする発現プラスミドを用いて一時的に同時トランスフェクション し、免疫沈降法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを用いて複合 体形成を研究した。実験は、ＬＴＢＰ−３の第３の８−システインＴＧＦ−ｂｐ 構造モチーフがアクチビンβcを共有的に結合することを示す。この結果は、Ｌ ＴＢＰ−３が、アクチビンＰＣホモダイマーのための結合タンパク質であること を最初に証明し、アクチビンβcホモダイマー集合中にＴＧＦ−ｂｐモチーフの ための機能的役割を広げる。 ９．１ 材料および方法 ｐＬＴＢＰ−３ ｆ１の集合 Yinら（1995）は、マウスＬＴＢＰ−３をコードする哺乳動物の発現ベクター を集め、特徴づけた(ｐＬＴＢＰ−３ ｆ１；表１、＃１参照)。一時的トランス フェクションのあとで、この研究は、マウスＬＴＢＰ−３が、ポリクローナルの 抗血清＃274（マウスＬＴＢＰ−３の上流のプロリンおよびグリシンリッチな配 列内に１２アミノ酸エピトープ（ＧＥＳＶＡＳＫＨＡＩＹＡ）を認識する）によ って沈殿することを示した。 ｐＬＴＢＰ−３／ｐｅｐｔ の集合 Yinらは、ｐＬＴＢＰ−３／ｐｅｐｔ発現ベクターを集め、特徴づけた。この ために、ｐＬＴＢＰ−３ ｆ１を、EcoRIおよびHindIIIで消化して、アガロース ゲル電気泳動によってきれいに分割される２つのＤＮＡ断片を生じた。ＬＴＢＰ −３をコードする配列の不必要な部分からなる１つの断片を捨てた。第２の断片 （無傷のプラスミドバックボーン、ＣＭＶプロモーター、翻訳停止シグナルおよ びポリアデニル化要素を含んでいた）を、ｐＬＴＢＰ−３／ｐｅｐｔと呼んだ( 表１、＃２参照)。HindIII部位を、Ｌｔｂｐ−３イニシエーターＭｅｔコドンの ６４６ｂｐ下流に配置した。したがって、ｐＬＴＢＰ−３／ｐｅｐｔは、正常な コザックのコンセンサスおよびシグナルペプチドを含むマウスＬＴＢＰ−３のア ミノ末端断片；ＬＴＢＰ−３に特有の短いアミノ末端配列；２つのＥＧＦ様の反 復；および上流のプロリンおよびグリシンリッチなドメインの一部をコードする 。後者は、抗体＃274エピトープ（ＧＥＳＶＡＳＫＨＡＩＹＡ）を含む。以下に 記載するように、ｐＬＴＢＰ−３／ｐｅｐｔ発現ベクターは、ｐＬＴＢＰ−３ ｆ１と本質的に同じ方法で、２９３Ｔ細胞において機能した。すなわち、ｐＬＴ ＢＰ−３／ｐｅｐｔを用いて、そのＴＧＦ−βｌを結合する能力を抗体＃274を 用いた免疫沈降によって直接に試験することができる、一連の定義されたＬＴＢ Ｐ−３ペプチド断片を生じた。 ｐＬＴＢＰ−３／ＴＧＦ−ｂｐＡの集合 ｐＬＴＢＰ−３／ｐｅｐｔは、マウスＬＴＢＰ−３の定義された断片をコード するプラスミドの集合を促進した。以下は、いかにこのプラスミド、ｐＬＴＢＰ −３／ＴＧＦ−ｂｐＡを集めたかの詳細な記載である(表１、＃３；また図１参 照)。ＰＣＲを使用して、ＬＴＢＰ−３からのＴＧＦ−ｂｐＡ構造モチーフをコ ードするｃＤＮＡ断片を作成した。上流のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー は、２７４ペプチド（ＫＨＡＩＹＡ）の６／１２コドンを有するフレーム中のＮ ｈｅＩ部位＋ＥＧＦ様の反復をコードするｃＤＮＡ配列の５'部分（配列は、Gen Bank（商標）/EMBL Data Bank accession L40459から得た）を含んでいた。下流 のＰＣＲプライマーは、ＸｈｏＩ部位＋ＴＧＦ−ｂｐＡ ｃＤＮＡ配列の３'部 分を含んでいた。ＰＣＲテンプレートはｐＬＴＢＰ−３ ｆ１プラスミドＤＮＡ からなり、ＰＣＲは記載されたように（Chenら、1993）行った。増幅のあとに、 ＰＣＲ断片をＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によっ て精製し、そして同じ制限酵素で消化し、精製した後のｐＬＴＢＰ−３／ｐｅｐ ｔ発現ベクターを用いてライゲーションした。ＸｈｏＩでの消化は、ベクター内 に翻訳停止およびポリアデニル化の要素を保存した。コンピテント細菌をライゲ ーション混合物によって形質転換し、コロニー形成単位を単離し、かつプラスミ ドＤＮＡを調製するために使用した。完全さ(integrity)を保証するために、ｐ ＬＴＢＰ−３／ＴＧＦ−ｂｐＡをＤＮＡ配列決定によって特徴づけた。 ｐＧＡＭ３の集合およびトランスフェクションを上記したようにして行った。 免疫沈降 免疫沈降のために、１０ｍｌ（正味）の抗体を、１〜５ｍｌの放射能標識した 培地タンパク質に加えた。混合物を室温で２時間振とうしながらインキュベート した。プロテインＡ−セファロース ＣＬ−４Ｂビーズを加え(２００ｍｌ、１ ０％懸濁液)、この混合物を室温で２時間振とうしながらインキュベートした。 免疫沈降したタンパク質を、短時間の遠心によりペレットにし、このペレットを ＰＢＳ−ＴＤ緩衝液（０．３８ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、８．１ｍ ＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、１．５ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄、１％のTriton X-100、０．５％の デオキシコレート）で４回、かつＰＢＳで３回洗浄した。次に、タンパク質を載 せる染料（２ｘ）を、還元剤（１０％の2-メルカプトエタノール）と共にまたは な しで加え、サンプルを５分間煮沸した。次に、サンプルを、４〜１８％の濃度勾 配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分画した(Yinら、1995)。 寒冷分子量マーカー（200-14.3kDa、Rainbow mix,Amersham Corp.）を使用して 、分子量を見積もった。ゲルを乾燥し、室温で示された時間フィルムにさらした 。 ９．２ 結果 ２９３Ｔ哺乳動物細胞を、ｐＬＴＢＰ−３／ＴＧＦ−ｂｐＡおよびｐＧＡＭ３ を用いた一時的同時トランスフェクションによってプログラムし、次いで［³⁵Ｓ ］Ｃｙｓおよび［³⁵Ｓ］Ｍｅｔを用いて１６時間放射能標識した。培地タンパク 質を採取し、免疫沈降の検討を行った。 ＬＴＢＰ−３とアクチビンβcのどちらも、放射能標識されかつ抗ＬＴＢＰ− ３および抗ＨＡ抗体で免疫沈降された、トランスフェクトされていない２９３Ｔ 細胞の条件付け培地において、同定されなかった。抗ＨＡ抗体での免疫沈降のあ とで、ｐＧＡＭ３だけでトランスフェクトされた細胞の条件付け培地は、アクチ ビンプロペプチドおよび成熟成長因子を含んでいたが、ＬＴＢＰ−３ ＴＧＦ− ｂｐＡの反復を含まなかった。還元条件下では、プロペプチドモノマーは、約40 kDaの単一バンドとして移動し、成熟アクチビンβcは、約14kDaの単一バンドと して移動した。抗ＨＡ抗体での免疫沈降のあとで、ｐＬＴＢＰ−３／ＴＧＦ−ｂ ｐＡだけでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の条件付け培地は、ｂｐＡモチ ーフ（約30kDaのペプチド）を含んでいたが、アクチビンβcの潜伏形を含まなか った。対照の最終セットを、「間違った抗体(wrong antibody)」で条件付けた培 地の免疫沈降に基づかせた：条件付け培地が抗ＬＴＢＰ−３抗体で免疫沈降され たなら、アクチビンβcは同定できなかったが、逆に、ｐＬＴＢＰ−３／ＴＧＦ −ｂｐＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の条件付け培地からの培地サン プルが抗ＨＡ抗血清で免疫沈降されたなら、ｂｐＡモチーフは同定できなかった 。一時的同時トランスフェクション系の再現性を証明して、これらの対照データ を独立に３回得た。 同時トランスフェクション実験は、アクチビンβcの潜伏形とＬＴＢＰ−３の ＴＧＦｂｐＡ構造モチーフとの間の特異的相互作用の証拠を提供した。抗ＬＴＢ Ｐ−３および抗ＨＡ免疫沈降物の両方について、ｂｐＡモチーフはまた、約30kD aのバンドとして移動し、アクチビンβcプロペプチドは、約40kDaの分散したバ ンドとして移動し、成熟アクチビンβcは約14kDaの単一バンドとして移動した。 したがって、データは、ＬＴＢＰ−３が、共有還元性架橋、すなわちＳＤＳ中 での煮沸に対して安定なジスルフィド結合を介して、アクチビンβcホモダイマ ーを結合することを確立する。その上、抗ＬＴＢＰ−３および抗ＨＡ抗体の両方 による、免疫共同沈降は、ＬＴＢＰ−３とアクチビンβcとの間の結合相互作用 が特異的であり、したがって、一時的同時トランスフェクション系の人為結果に よらないことの強い証拠を提供する。 １０． 微生物の寄託 以下の微生物を、アメリカン タイプ カルチャー コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)、12301パークローン ドライブ(Parklawn Dri ve)、ロックビル(Rockville)、メリーランド（Meryland）20852で寄託した。菌株の名称 含有するもの 受託番号 ｐｂＨＥ ヒトアクチビンβ_E ｐｂＣ マウスアクチビンβ_C ｐｂＥ マウスアクチビンβ_E 本発明は、例示した実施態様または寄託した微生物（これらは、本発明の一つ の面の説明として意図されている）によって範囲を限定されるべきではなく、か ついかなるクローン、ＤＮＡまたはアミノ酸配列（これらは、機能的に同等であ る）も本発明の範囲内にある。実際に、先の記載および添付の図面から、ここに 記載したものの他に本発明の種々の変形が、当業者には明らかとなろう。そのよ うな変形は、添付した請求の範囲内にあることが意図される。 ヌクレオチドについて与えられたすべての塩基対サイズは近似であり、記載の 目的のために使用されることがまた、理解されるべきである。 国際出願番号：ＰＣＴ／ ＰＣＴ／ＲＯ／１３４（１９８１年１月） 国際出願番号：ＰＣＴ／ ＰＣＴ／ＲＯ／１３４（続き） アメリカン タイプ カルチャー コレクション アメリカ合衆国 ２０８５２ メリーランド州 ロックビル パークローン ドライブ １２３０１受託番号 寄託日 ９７８０５ １９９６年１１月２０日 ９７８０６ １９９６年１１月２０日DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION      Liver activin / inhibin nucleotide and protein sequences                    And methods based on them                                 1.Introduction   The present invention provides for activin / a expressed specifically in the liver during adult vertebrate life. Of a new subgroup of inhibin (referred to herein as liver activin) For discovery, identification, and characterization. The present invention relates to activin β_CAnd β_Esub Unit and other members of the liver activin subgroup. The present invention Is a liver activin nucleotide; a liver activator that regulates the expression of liver activin Bin genome regulatory elements: host cell expression system; liver activin protein, fusion protein Proteins, polypeptides and peptides; antibodies to liver activin protein Transgenic animals expressing liver activin: expressing liver activin No recombinant knockout animals; antagonists of liver activin and agonis Modulates hepatic activin gene expression activity to enhance cell growth and / or Are other compounds that regulate cell differentiation and diagnose and treat abnormalities associated therewith Is included. In addition, the present invention provides for stimulating liver regeneration, bone growth, and hematopoiesis. Methods and methods for regulating cell growth and / or differentiation, including but not limited to And compositions.                              2.Background of the Invention   Activin and inhibin are similar to members of the TGF-β superfamily It is a dimeric protein with a different structure and function. (Vale, W. et al., Peptide Growt h Factors and Their Receptors (Part II) Sporn, M.B. and Roberts, A.B. Springer-Verlag, Heldelberg. 211-248). TGF-β super family member Like activin / inhibin, the activin / inhibin From the tide and mature growth factor domains It is synthesized as a large precursor. Activin (and TGF-β superfamily During the synthesis of (the other members of Lee) the two precursor chains associate and have potential activity To form disulfide-linked dimers. End-proteolite with full-length dimer Cleavage of the disulfide-linked precursor chain by cleavage at the And the mature growth factor domain are separated. Propeptide dimer and Mature growth factor dimers typically remain non-covalently associated. Acti Bins and other propeptide dimers of TGF-β superfamily members It is considered necessary and sufficient to obtain presence. Activin maturity growth The factor domain is present in all known members of the TGF-β superfamily. Cysteine residue motif (Gray, A.M. et al., 1990, Scie nce 247: 1328-1330; Huylebroeck, D. et al., 1990, Mol. Endocrinol. 4: 1153-1165 Schwall, R.H. et al., 1988, Mol. Endocrinol. 2: 1237-1242). Also, until now The mature growth factor domain of activin characterized by roller properties is approximately 30% TGF-β1 Has amino acid sequence homology.   Activin / inhibin alters growth and differentiation of various types of target cells Has been found to elicit a variety of effects. This complex tone of cell growth The clauses are unique to TGF-β superfamily members. Comprehensive TGF-β effect For a comprehensive review, see Roberts, A.B., et al., 1990, Handbook of Experimental. Pharmacology, 95 (Part 1) Sporn, M.B. and Roberts, A.B. eds., Springer-V erlag, Heldelberg. See pages 419-472. TGF-β autocrine activity and para Secretory activity is thought to be regulated by different mechanisms. One regulation strategy is Involves temporal and spatial control of TGF-β gene expression. The second strategy is identification Under physiological and pathological conditions (eg, under tissue morphogenesis and wound healing) To create and store TGF-β as a latent complex activated only in Accompany. See, for example, Pircher, R. et al., 1986, Biochem. Blophys. Res. Commun. 136: 30 -37; Miyazono, K. et al., 1988, J. Mol. Biol. Chem. 263: 6407-6415; Wakefield, L.M. 1988, J. et al. Biol. Chem. See 263: 7646-7654. Activin / I Inhibin activity would be prepared by a similar strategy. Binding protein (E.g., follistatin, which inhibits activin activity). There is evidence to suggest that bin / inhibin activity is modulated.   Activin and inhibin as α and β subunits Consists of known structurally related polypeptide chains. Currently unique but related Two linked β subunits have been identified (β_AAnd β_B), These are Common to both inhibin and activin. Therefore, different combinations of β Unit (for example, β_Aβ_A, Β_Bβ_B, And β_Aβ_B) Three activins (A, B and AB) are known and each one β subunit And one α subunit and (αβ_AAnd αβ_B) (Mason, A.J. et al., 1985, Nature 318: 659-663; Mason, A.J. et al., 1986, B iochem. Biophys. Res.Commun. 135: 957-964; Forage, R.G. et al., 1986, Proc. Nat l. Acad. Sci. U.S.A. 83: 3091-3095; Esch, F. et al., 1987, Mol. Endocrinol. 1: 388-396).   Recently, activin β_CEncodes a third activin β subunit, referred to as CDNA was isolated from a human liver cDNA library. Hotten et al., 1995, Bioche m. Biophys. Res. Commun., 206: 608-613. This clone product is yet to be It must be expressed separately or recombinantly, and its function is currently unknown. Absent. Human activin β_CParts that are conceptually interpreted as mature parts of Cutibin beta_AAnd activin β_BAbout 50% amino acid identity with the corresponding region of There is one thing; this is β_CAnd other known members of the TGF-β superfamily Significantly greater than the identity between   Activin β_DA fourth activin, called Xenopus Liver recently (Oda, S. et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. . Commun., 210: 581-588). By Northern analysis, β_DIs from Xenopus It was shown to be expressed during the early stages of biologic development. Activin β_DcDNA or Microinjected synthetic mRNA transcribed into Xenopus embryo blastomeres Of course, a secondary body axis was formed. On the other hand, mRNA is When injected into the animal pole cap, Mesodermal was induced. These activities are associated with activin β during development._AAnd β_BKnow Activity that is consistent with   Human activin β_CSubunit and Xenopus activin β_Dsub Whether the units form homodimers, heterodimers, or both remains to be determined. Not specified. However, these recent isolations have led to the discovery of activin and inhibin. For both, suggesting that the number of possible combinations may be relatively large. ing.   Inhibin initially begins with gonad hormones from the anterior pituitary gland (e.g., (Mon or FSH) has been identified as a gonadal peptide that modulates the release (e.g., deJon g, F.H. et al., 1985, Mol. Cell. Endocrinol. 42: 95-103; Dubas, M. et al., 1983, Mol. . Cell. Endocrinol. 31: 187-198; Channing, C.P., et al., 1985, Proc. Soc. Experi m. Biol. Medicine 178, 339-361; Robertson, D.M., Foulds et al., 1985, Biochem. . Biophys. Res. Commun. 126: 220-226; Rivier, J. et al., 1985, Proc. 7^ThIntl. Cong. Endocrinol. 655: 1141-1144; Miyamoto, K. et al., 1985, Biochem. Biophys . Res. Commun. 129: 396-403; Rivier, J. et al., 1985, Eiochem. Biophys. Res. C ommun. 133: 120-127). The main gonadal site for inhibin synthesis is the cell Tree cells (testis) and granulosa cells (ovary). In the male gonad Inhibin antagonizes germline DNA synthesis and reduces sperm count. Sertoli -Inhibin synthesis by cells fluctuates during spermatogenesis and leads to different germ cell populations. Inhibin mating has been shown to change during various stages of spermatogenesis I have. Therefore, the interaction between Sertory cells and germ cells is due to inhibin. It is mediated in a paracrine manner. Inhibin also (along with luteinizing hormone)in in vitroPromotes steroid hormone production by Leydig cells in rats. Female sex In the gland, inhibin antagonizes oocyte meiosis, increases the number of ovarian follicles, Promotes steroid synthesis by ascitic cells. Inhibition in both sexes of mice Bin appears to be an important negative regulator of gonadal stromal cell growth (M atzuk, M.M. et al., 1992, Nature 360: 313-319), ie, inhibin-deficient mice Granule cells (female mouse) and cell tree Develop mixed or poorly differentiated gonadal stromal tumors consisting of vesicles (male mice) You. Finally, inhibin regulates the function of gonads and other tissues other than the pituitary (Eg, Sakai, R. et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 188: 921-926). Inhibins A and B are expressed in the placenta during development and during spleen and nervous system during adulthood. Is expressed in Inhibin is a human chorionic gonadotropin in the placenta. It can function as an important regulator.   Activin was also initially identified as a pituitary-stimulating hormone. One Mari, originally activin_A(β_Aβ_A) Indicates F in porcine ovarian fluid by pituitary cells. Stimulates SH release (ovarian follicle development and maturation is triggered by FSH secretion from the pituitary gland) (Vale, W. et al., 1986, Nature 321: 776-779; Ling , N. et al., 1986, Nature 321: 779-782; Ling, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Com mun. 138: 1129-1137). Recent evidence suggests that activin A may be associated with oocytes, granule cells, And can act on ascitic cells, and this molecule has an autocrine / paracrine effect in the ovary Has been suggested. Activins A and B are anatomically extensively distributed. Many biological processes other than ovarian follicle maturation, such as: Is thought to play a role in pituitary growth hormone and adrenocortical stings Intense hormone secretion (Sadatsuki, M. et al., 1993, Hum. Reprod. 8: 1392-1395), hypothalamus Oxytocin secretion (Sawchenko, P.E. et al., 1988, Nature 334: 615-617), somato Statin induction (Woodruff, T. et al., 1995, Annu. Rev. Physiol. 57: 219-244), phosphorus Papillocyte proliferation (Hedger, M.P., et al., 1989, Mol. Cell. Endocrinol. 61: 133-138) Erythropoiesis (Published Feb. 4, 1987, EP Publ. No. 210,461; Yu et al., 1987, Nature 330: 765-767: Eto, Y. et al., 1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 142: 1095-1103; Broxmeyer, H.E. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 9052-9056; Mur ata et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85: 2334-2438; Schwall, R.H., et al. , 1991, Meth. Enzymol. 198: 340-346; Burton et al., Issued December 10, 1991, U.S. Patent No. 5,071,834; Shiozaki, M. et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 183: 273-279; Nishimura, M. et al., 1991, Biochem. Biophys. Res. Commu n. 181: 1042-1047), heart morphology Raw (Olson, E. et al., 1996, Science 272: 671-672), survival of neurons (Schubert, D. Et al., 1990, Nature 344: 868-870; Hashimoto, M. et al., 1990, Biochem. Biophys. R es. Commun. 173: 193-200), megakaryocyte differentiation (Fugimoto, K. et al., 1991, Biochem. Biop. hys. Res. Commun. 174: 1163-1168), spermatogenesis (Mather, J.P. et al., 1990, Endocri nology 127: 3206-3214), bone formation (Oue, Y. et al., 1994, Bone 15: 361-366; Inoue, S. et al. Et al., 1994, Calcif. Tissue Int. 55: 395-397; Luyten, F.P. et al., 1994, Exp. Cel l Res. 210: 224-229; Ogawa, Y. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 14233-14237; Ce ntrella, M. et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11: 250-258), pancreatic insulin secretion, Patterning events in vertebrate embryos (Wakefield et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 7646 -7654; Gentry, L.E. et al., 1987, Molec. Cell Biol. 7: 3418-3427; Ogawa, Y. et al., 19 92, J. Biol. Chem. 267: 2325-2328), Reproductive endocrinology (Pircher, R. et al., 1984, Cancer). r Res. 44: 5538-55Z13; Gentry L.E. et al., 1988, Molec. Cell Biol. 8: 4162-4168 ), Somatic cell growth (Sadatsuki et al., 1993, Hum. Reprod. 8: 1392-1395; Wakefield, L.M. Et al., 1989, Growth Factors 1: 203-218), and the induction of mesoderm during early embryonic development. (Smith, J.C. et al., 1990, Nature 345: 729-731; van Den Eijnden-Van Raaij, A .J.M., 1990, Nature 345: 732-734; Green, J.B.A. et al., 1990, Nature 347: 391-3. 94; Thomsen, G. et al., 1990, Cell 63: 485-493; Sokol, S. and Melton, D.A., 1 991, Nature 351: 409-411; Johansson, B.M. and Wlles, M.V., 1995, Mol. Ce ll. Biol. 15: 141-151)). Also, previous studies have shown that activin Ain vitr o May function as an autocrine inhibitor of hepatocyte DNA synthesis in Escherichia coli (Yasuda, H. et al., 19913, J. Clin. Invest. 92: 1491-1496) andin vivo Inhibitors of liver regeneration in rats (Kogure, K. et al., 1995, Gastroenterology 108: 1136-1) 142; and Schwall, R.H. et al., 1993, Hepatology 18: 347-356). These studies are Activin A synthesis in hepatocytes causes these cells to transform epidermal growth factor or liver Induced by treatment with any of the cell growth factors.   From the data accumulated so far, activin and inhibin Rather than affecting cell and tissue physiology by itself, other minor regulatory components Obviously, it works in concert with the child. In this regard, recent research has shown that Bin A and BMP-4 act synergistically during embryonic development to produce mammalian mesoderm formation and And induce hematopoiesis. The gonadal protein follistatin is a parent Although it is reported to be a soluble activin-binding protein, It does not appear to be involved in tibin signaling. ,   Erythropoiesis is a process in vertebrate life that compensates for cell destruction. And the continuous production of red blood cells, thereby ensuring adequate oxygenation. A sufficient number of red blood cells can be present in the blood. Production of red blood cells Occurs in the bone marrow and is under the control of the hormone erythropoietin. D in circulating plasma Litropoetin levels increase during periods of reduced oxygen transport in blood plasma I do. This condition, called hypoxia, is caused by a large amount of blood, e.g. Loss, exposure to radioactivity that destroys red blood cells, reduced oxygen uptake at high altitudes Caused by low or prolonged loss of consciousness.   Depending on the cause of anemia, many different types of medicines (e.g. , Iron preparations (iron deficiency anemia), vitamin B₁₂And folate (pernicious anemia), corticoids Corticosteroids (hemolytic anemia)) have been used. Steroid hormones Is known to have potent erythropoietin stimulating effects, Although considered a drug, such hormones have powerful side effects and are generally Not desirable for long-term administration.   Erythropoietin has also recently been proposed as an effective drug to alleviate anemia. Is being planned. U.S. Pat. No. issued on October 27, 1987. 4,703,008 is commercial Describe the recombinant production of achievable amounts of erythropoietin.   Activins A and B are found to have erythropoietin stimulating activity ing. EP published on February 4, 1987. Publ. No. 210,461; Eto et al., 1987, Bioc. hem.et Biophys. Res. Commun. 142: 1095-1103; Murata et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85: 2334-2438, Yu et al., 1987, Nature 330: 765-76. 7 and for activin B B published December 10, 1991 urton et al., U.S.A. See Patent No: 5,071,834.   Activin binding sites have been identified in several activin-responsive cells and Cross-linking experiments suggest multiple binding molecules on the cell surface . In addition, several activin receptors have recently been isolated and characterized. This The first of these was identified (Mathews, L.S. et al., 1991, Cell 65: 973-982). 494 amino acid residues characteristic of a phosphorus / threonine-specific protein kinase It was an integral membrane protein. Since then, numerous TGF-β type I and type II Signaling receptors have been shown to bind activin (Attisano, L Et al., Cell 75: 671-680; Ebner, R. et al., 1993, Science 262: 900-902; ten Dijke. , P. et al., Science, 264: 101-104).                              3.Summary of the Invention   The present invention relates to a new subgroup of activin / inhibin (herein referred to as activin / inhibin). Discovery, identification, and characterization of nucleotides encoding liver activin) Determination, and that these nucleotides are specifically expressed in the liver during adulthood The discovery that it corresponds to an mRNA. In particular, the present invention relates to liver activin With respect to members of the loop, it is expressed herein in the liver during adulthood, Cutibin beta_CAnd / or β_EAt the amino acid level in a substantial stretch of It is defined as showing about 65% identity.   Liver activin, like other activin subfamily members, is homodimeric. Naturally occurring as a somatic or heterodimer and binding to cell surface receptors Regulate cell growth and / or cell differentiation. Amino acid sequence of liver activin Row organization to other activin family and TGF-β super-family members Liver activin, activin β_AAnd β_BPhase significant to Activin β while showing same sex_DAnd most closely related.   To clarify the point, in the following subsections, the present invention Activin β shown in FIG._CAnd the activator shown in Figure 2 (mouse) and Figure 5 (human) Β_EWill be described. However, this principle is based on the liver activin subgroup. The same applies to other members.   Activin β about 2kb and 3.2kb in length_CAnd activin β_EmRNA translocation The transcript is specifically and highly expressed in adult vertebrate liver tissue. Honcho Mouse activin β described in the detailed description_CAnd β_EcDNAs for 352 and 350, respectively Encodes a protein of amino acids (FIGS. 1 and 2). Human activin β_EIs 3 Encodes a protein of 50 amino acids. Activin β_CAnd β_EIs the N-terminal Gnal peptide followed by a propeptide region and nine cysteine regions Region containing a mature growth factor region. This spatial sequence is the TGF-β superfamily -Saved across members.   The present invention relates to (a) activin β_CAnd β_EVertebrate liver, containing gene products Nucleotides encoding cutivin; (b) a nucleotide corresponding to a functional domain of liver activin; The nucleotides encoding the corresponding parts, as well as the nucleotide sequences More specific polypeptide products (including N-terminal signal peptide, prope Peptide domain and / or activin β_CAnd β_EMature growth factor domain (C) if one of the domains is all or Is a nucleoprotein encoding a partially deleted or altered variant of liver activin And the production of polypeptides identified by such nucleotide sequences (Including N-terminal signal peptide, propeptide domain, endoprotein The olitic motif or all or part of the mature growth factor domain is deleted (D) non-functional proteins, including, but not limited to) Liver activin or one of its domains fused to another polypeptide (eg, (E.g., the mature growth factor region). Include.   The present invention also relates to mouse activin β_CAnd β_EWraps genomic fragments containing genes Include. Several genomic clones have been isolated. In FIG. 4A, 2 shows a map of the mouse genomic region. Mouse activin β_CGene and β_EBetween the gene Genomic nuclei that regulate the expression of liver activin genes, such as those located in Reotide sequences are also included in the invention (FIG. 4B).   In addition, the present invention relates to small molecules, large molecules, and variants that compete with native liver activin. Atypical liver activin, and agonists and antagonists of liver activin including antibodies Agonist; nucleotide sequence used to inhibit hepatic activin gene expression Sequences (e.g., antisense and ribozyme molecules, as well as genes or regulatory Sequence replacement construct), or a nucleic acid that can be used to enhance hepatic activin gene expression. Nucleotide sequences (e.g., controlling the liver activin gene with a strong promoter system) Expression construct placed below).   The present invention also relates to a transgene that overexpresses a liver activin transgene. Nick animals. Such an animal would have a host to produce liver activin. Can be made as an io reactor. Liver actuation via transgenic livestock The expression of the bin is the ability to produce a correctly treated and modified protein post-translationally In that it has advantages over protein production in recombinant bacteria and yeast. liver Transgenic animals that do not express activin can also be made (see Knock A Utmouth ").   Further, the present invention provides diagnostic evaluation of cell growth disorders and / or cell differentiation disorders, Identify specimens for classification and prognosis and with a predisposition to such symptoms. Methods and compositions for the determination. For example, liver activin nucleic acid For use as a cleavage hybridization probe or primer for diagnostic PCR analysis In the liver activin gene mutation, and in the liver activin gene Dysregulation, polymorphisms, and variants can be identified. The present invention further provides Provide a diagnostic kit for performing the method.   Liver activin proteins, polypeptides, and derivatives disclosed herein The body (including fragments) can be used to generate anti-liver activin antibodies, Anti-liver activin antibody is used to detect liver activin protein in patient samples. In immunoassays to perform readings or measurements It can be used for any purpose. Anti-liver activin antibodies can be, for example, serum or Diagnostic detection of liver activin protein in cells and tissues examined Or can be used for measurement.   In addition, the present invention relates to the regulation of cell growth and / or differentiation (liver regeneration, bone growth or Or stimulating hematopoiesis, including, but not limited to) And compositions. The therapeutic compound of the present invention comprises a liver activin protein, Polypeptides and derivatives thereof (including fragments); antibodies thereto; Nucleic acids encoding tibin proteins, polypeptides, and derivatives; and liver Includes but is not limited to visceral activin antisense nucleic acids.   Further, the present invention relates to the expression of liver activin gene and / or Modulate the activity of the gene product (ie, agonist or antagonis) Liver activin gene and / or Or the use of a liver activin gene product. Such compounds are Reagents for controlling cell growth and / or differentiation, e.g., cell growth and differentiation As a therapeutic agent that stimulates aging (including liver regeneration, hematopoiesis and / or bone growth) Can be   The present invention also relates to a liver activin protein, polypeptide, It also relates to methods for producing peptides, derivatives and antibodies.   The present invention is directed, in part, to specific and high levels of expression in adult vertebrate liver. A surprising discovery of the subgroup of cutibin, LA prepared from adult vertebrate liver mRNA Liver activin from Ibraryβ _C andβ _E cDNA identification and cloning , Activinβ _C andβ _E Characterization, cell-free transcription and translation of Activin β in translation_CExpression, and β_CProduct stimulates liver regeneration, lethal Stimulate bone growth, stimulate hematopoiesis, andin vitroSubmarine Determining specific binding to resident TGF-β binding protein-3 (LTBP-3) Based on                                3.1 Definition   The following terms, as used herein, may be used in the singular or plural. Also has the following meaning:       Liver activin gene, nucleotide, or coding sequence: liver activator     Bin / inhibin beta subunit protein, liver activin / inhibin beta     Polypeptides or derivatives of subunit proteins (including fragments thereof),     Or encodes a liver / activin inhibin beta subunit fusion protein     Nucleotide sequence. The liver activin nucleotide sequence is     Nom DNA (e.g.β _C Orβ _E Liver activin / a containing cDNA)     Includes inhibin DNA or RNA.       Liver activin genomic fragment: near the liver activin coding region,     Genomic DNA fragments containing nucleotide sequences located upstream or downstream     means. Such a nucleotide sequence may enhance the expression of the liver activin gene.     May contain control elements, such as promoters and enhancers     it can.       Liver activin: Liver activin / inhibin β subunit protein     A monomer or dimer containing quality is implied. Liver activin / inhibin beta     The polypeptide or derivative of bunit protein (including its fragments) is     Also referred to as visceral activin polypeptide or liver activin derivative. Liver     Activin / inhibin β subunit protein or liver activin / a     Inhibin β subunit polypeptide or inhibin β subunit induction     Fusion of conductors (including fragments) to unrelated proteins is described herein as     It is called liver activin fusion protein. Functional liver activin     Activin / inhibin monomer, homodimer or heterodimer in vitro     Form in vivo or in vitro to control cell growth and / or differentiation     Refers to a protein that can be                              Four. Description of the drawings   FIG. 1 shows full-length mouse activin β_CcDNA sequence. Mouse activin β_CThe nucleo The peptide sequence is shown with the deduced amino acid sequence below the coding sequence. Scripture A typical signal peptide is predicted to contain the first 20 amino acid residues. N The positions of the four possible sites of conjugation glucosylation are indicated by two underlines . The cluster of basic residues (KHRVRRR at amino acid residues 230-236) is Endoproteolitic breaks defining the peptide and mature growth factor domains It can function as a place (s).   FIG. Full-length mouse activin β_EcDNA sequence. Mouse activin β_EThe nucleotchi The nucleotide sequence is shown with the deduced amino acid sequence below the coding sequence. Typical A typical signal peptide is predicted to contain the first 21 amino acid residues. N connection The location of one possible site of glycosylation is indicated by two underlines. The cluster of basic residues (RARRR at amino acid residues 232 to 236) is Endoproteolytic cleavage sites that define the tide and mature growth factor domains It can function as (one or more).   FIG. Putative mouse activin β_CAnd β_EAmino acid sequences and other activators Comparison with members of the group. Mouse activin β_CAnd β_EC-terminal acid sequence (both Starts at amino acid position 236) and human activin β_A, Human activin β_B And Xenopus activin β_DAlignment with corresponding area. Of the activin The nine invariant cysteine properties are shown in bold. Dash maximizes the alignment The gap introduced for this purpose is shown below. Species are indicated as follows: h = human; m = Mouse; and x = Xenopus.   FIG. 4A. Mouse activin β_CAnd mouse activin β_EGenomic organization of genes A map showing The 5 'and 3' untranslated regions for both of these two loci Is shown as a black rectangle, and the sequence encoding the putative propeptide domain is outlined. The sequence shown in boxes and encoding the putative mature growth factor region is Indicated by Overlapping genomes, partial restriction analysis of clones and Partial DNA sequence analysis revealed that activin β_Cof This shows that the size of the intron separating exons 1 and 2 is about 12-kbp. This In contrast, sequencing revealed that activin β_ETo separate exons 1 and 2 Ron was found to be 234-bp in size.   Figures 4B and 4C. Mouse activin β_CAnd β_EGenome located between genes The nucleotide sequence of the region.   4D, 4E, 4F and 4G. Sequence of the mouse activin locus. The array Is activin β_CActivin β, nucleotide sequence upstream of the gene_C/ Exon 1. Activin β_C/ Partial sequence of intron 1, activin β_C/ Exon 2, Ac Tibin β_ERegulatory region, activin β_E/ Exon 1, activin β_E/ Intron 1 , Activin β_E/ Exon 2 and activin β_EA gene located 3 'of the gene Contains columns.   FIG. Full length human activin β_EcDNA sequence. Human activin β_ENucleotide sequence The columns are shown with the deduced amino acid sequence below the coding sequence. Typical sig The null peptide is predicted to contain the first 17 amino acid residues. N-linked gluco The location of one possible site of silation is indicated by two underlines. Basic residue The cluster of groups (RARRR at amino acid residues 232 to 236) is the predicted propeptide and An endoproteolytic cleavage site that defines the mature growth factor domain (single or Can function as multiple) (arrows separate the two putative domains). Estimated maturity growth Cysteines conserved in the factor region are indicated by bold lines.   FIG. Specific activin β_CAnd β_EcDNA probes (top panel and And middle panel), northern blot of multiple tissues of adult mice (Clontech). RNA samples were loaded as follows: lane 1 = heart; lane 2 = Brain; lane 3 = spleen; lane 4 = lung; lane 5 = liver; lane 6 = skeletal muscle; Lane 7 = kidney; and lane 8 = testis. RNA size is determined by RNA standard (9.5, 7.5, 4. 4, 2.4 and 1.35 kb). Loading of related RNA Using a glucose 6-dehydrogenase cDNA probe (bottom panel) It was evaluated by hybridization.   FIG. β_CIn the cell-free transcription and translation system shown by the immunoprecipitation method of Full-length mouse activin β_CExpression of plasmid expression construct.   FIG. Mouse activin β_CStimulates bone growth in lethal animal models Proof of doing. Using a gene activated matrix Microscopic focus on bones formed after direct in vivo gene transfer (arrows). FIG. Mouse activin β_CPromotes hematopoiesis in human bone marrow cultures in vitro Evidence.                           Five. Detailed description of the invention   Liver activin / inhibin (described for the first time herein) is used in adult vertebrates. Activin / inhibin subgroup, which is expressed specifically and at high levels in the liver during the Including loops. Liver activin, like other activin group members, is Binds to cell surface signaling receptors to regulate cell growth and / or differentiation Naturally occurring as homodimers or heterodimers. Liver activin The amino acid sequence composition is found in other activins and members of the TGF-β superfamily. N-terminal signal peptide followed by a peptide A mature growth factor region comprising a lopeptide region and nine cysteine residues, Its spacing is conserved among TGF-β superfamily members. D The proteolytic cleavage motif consists of a propeptide and a mature growth factor domain. And divide. Liver activin is activin β_AAnd β_BSignificant homology to Shows that activin β_DMost closely related to   The present invention relates to liver activin genes and gene products (both transcription and translation) DNA, mRNA, antisense RNA, ribozymes and proteins. Include, but are not limited to, protein. The invention further relates to liver activin. Use of polypeptides and derivatives; (eg, liver activin agonists or Antibodies to liver activin), which can act as antagonists; and And activin activity or expression Antagonists, or diagnostic, therapeutic, and / or cell growth and / or Regulation of differentiation (stimulates liver regeneration and / or bone growth in vertebrates, including humans) Activates activin activity (including, but not limited to) Or an agonist that increases its expression. In addition, liver activin Nucleotide and liver activin proteins are responsible for cell growth and / or differentiation It is useful for identifying a compound that is effective in regulating the concentration of a compound.   In addition, the present invention relates to a gene such as that found near the liver activin gene in the genome. Nucleotide sequences that regulate the expression of various liver activin genes. like this For example, an activin gene or liver-specific expression may be desirable. Use in expression vectors to promote liver-specific expression of any target gene can do.   In particular, the invention described in the following subsections relates to liver activin protein , A polypeptide corresponding to a functional domain of the liver activin and a derivative thereof (E.g., N-terminal signal peptide, propeptide, and / or mature growth factor Main); mutated, truncated or deleted liver activator (E.g., propeptide domains, endoproteolytic cleavage motifs, And / or one or more functional domains, such as mature growth factor domains Liver activin with truncation); liver activin fusion proteins (eg, Fusion to unrelated proteins or peptides, such as the immunoglobulin constant region (i.e., IgFc) A combined liver activin or mature activin domain, such as a mature growth factor domain. A functional domain); a nucleotide sequence encoding such a product; and A host cell expression system capable of producing such a liver activin product. Ma The present invention also provides antibodies and anti-idiotype antibodies (including Fab fragments), Antagonists and agonists, and expression of liver activin gene Inhibiting compounds or nucleotide constructs (transcription factor inhibitors, anti- And ribozyme molecules, or gene or regulatory sequence replacement constructs) Or a compound that enhances the expression of liver activin Alternatively, the nucleotide construct (eg, liver activin coding sequence may be Or operably linked to expression control elements such as promoters / enhancers, Current construct). The present invention also relates to a liver activin (or a mutant thereof). To inhibit the expression of endogenous liver activin in animals or Host cells and animals that have been genetically engineered to "kick out". liver Develop transgenic animals that overexpress the visceral activin transgene, It can be used as a bioreactor for activin production.   Mutated liver activin or to diagnose disorders of cell growth and differentiation When detecting inappropriately expressed liver activin, liver activin protein, Polypeptide or derivative; liver activin fusion protein; liver activin Nucleotide sequences; antibodies; antagonists; and agonists will be useful. liver Liver activin protein, polypeptide or derivative; liver activin fusion tan Protein; liver activin nucleotide sequence; host cell expression system; antibody; Strikers; agonists; and genetically engineered cells and animals To screen for and / or regulate It can also be used to treat disorders that occur.   Finally, liver activin protein products (particularly those corresponding to the mature growth factor Derivatives such as peptides that bind to humans) and fusion protein products (especially liver activin fusions) Synthetic protein, ie, liver activin or a domain of liver activin, such as Fusion of the mature growth factor region to IgFc), antibodies and anti-idiotype antibodies (Fab Fragments (including fragments), antagonists, or agonists, Or to regulate differentiation and / or treat disorders related thereto. Can be. For example, an effective amount of inactive liver activin (e.g., endoproteoli Tick motifs prevent the formation of polypeptides corresponding to mature growth factors Modified) or anti-idiotypic antibodies (similar to liver activin) Or its Fab) administration binds to and blocks the liver activin receptor, This allows Decreases the amount of activin receptor available in the active state, or reduces signal cascade Interfere with or reduce cell growth and ultimately affect cell growth and / or differentiation Affect. The nucleotide construct encoding such a liver activin product is Host cells to express such hepatic activin products in vivo. Can be used to make. These genetically engineered cells Functioning as “bioreactor”, liver activin protein, polypeptide Or deliver a continuous supply of the derivative to bind to and activate the activin receptor site. Close up. Functional liver activin protein, polypeptide, or derivative Nucleotide constructs; mutant liver activin; and antisense and And ribozyme molecules are all used in “gene therapy” methods to grow and distribute cells. Of hepatic activin in the regulation of hyperplasia and / or treatment of disorders related thereto It can be used for regulation of current and / or activity. Note in this specification The research included is β_CThe product is liver regeneration, bone growth in fatal defect animal models, and And stimulate hematopoiesis. Such studies suggest that liver activin may growth. And / or physiology as cytokines to regulate differentiation Hormones to regulate specific processes (eg, hematopoiesis and bone growth) Indicates that it would be useful. Furthermore, these studies show that β_CIs latent TGF-β This shows that the protein specifically binds to binding protein-3 (LTBP-3) in vitro. Therefore The invention relates to regulating and / or relating to cell growth and differentiation. And methods of treating the same for treating disorders.   The present invention expresses specifically and at high levels in the liver during adult vertebrate life Based in part on the surprising findings of the activin subgroup. This discovery was made by TG Among the bone morphogenetic proteins-2 and -4, members of the F-β superfamily Using synthetic degenerate oligonucleotide primers based on conserved coding sequences This became possible by amplifying mouse genomic DNA and cDNA. These PCR Clone and label the products of the reaction and screen the mouse liver cDNA library. As a probe for used. One of these probes is the activin of the TGF-β superfamily. Over-coding a protein homologous to a member in a composite Hybridized to a series of wrapped cDNA clones. This gene is Β_CAs shown. Northern blot analysis of multiple adult tissues revealed activin β_C Shows a high level and specific expression in the liver as a transcript of about 2.0 kb. (See FIG. 6). Activin β_CClone the gene encoding After construction, the construct was expressed in a cell-free transcription and translation system.   Mouse activin β_CWhile cloning the genomic locus, activin β_CThe genomic sequence located about 5.0 kb downstream of the gene Activin β_CObserve hybridization to probe corresponding to cDNA Was done. This genomic sequence is subcloned, labeled, and highly stringent. For screening mouse liver cDNA library Used as Overlapping cDNA clones obtained from this screening Sequence analysis of the conjugates of_CShows strong sequence homology with Corresponding to the gene encoding the normal activin β subunit . This gene is activin β_EIndicated by Northern blot of multiple adult tissues Activin β_EBut high and specific in the liver as a transcript of about 3.2 kb (See FIG. 6).   Mouse activin β_ELabel cDNA and screen human adult liver cDNA library Used as a probe for cleaning. This probe has two Hybridized to the wrapping cDNA clone. Sequence analysis yields estimated molecular weights 39 kD protein with one potential N-linked glycosylation site Putative open reading frame of 1050 nucleotides found Was done. Sequence comparison analysis shows that this protein is mouse activin β_EIs homologous to Indicates that Human activin β_EComplete nucleotide sequence and deduced amino acids for The sequence is shown in FIG.   Various aspects of the invention are described in further detail in the following subsections. Will be posted.                         5.1Liver activin gene   The liver activin nucleotide sequence of the present invention includes (a) FIGS. Or the American Type Culture Collection (American Type Culture Collection, ATCC) as a cDNA clone in E. coli strain DH5α as deposited DNA sequence contained in bC, pbE or pbHE; (b) shown in FIG. 1, FIG. 2 and FIG. A nucleotide sequence encoding an amino acid sequence or a cDNA clone deposited with the ATCC. Liver activin amino acids encoded by pbC, pbE, or pbHE A nucleotide sequence encoding the sequence; (c) high stringency conditions (eg, 65 0.5M NaHPO at ℃_Four, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), filter in 1 mM EDTA -Hybridization to bound DNA and in 0.1xSSC / 0.1% SDS at 68 ° C Washing (Ausubel F.M. et al., Eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, V ol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & sons, Inc., N ew York, atp. 2.10.3)), below, the DNA sequence shown in FIG. 1, FIG. 2 and FIG. Or contained in the cDNA clone pbC, pbE, or pbHE deposited with the ATCC Gene product that hybridizes to the complementary sequence of the DNA sequence to be And (d) lower stringency conditions (eg, For example, in moderately stringent conditions, e.g., 0.2xSSC / 0.1% SDS at 42 ° C. , (Ausubel et al., 1989, supra)). P is a DNA sequence encoding an amino acid sequence or a cDNA clone deposited with the ATCC. hybridizes to the complementary sequence of the DNA sequence contained in bC, pbE, or pbHE; A nucleotide sequence encoding a functionally equivalent liver activin gene product included. Functional equivalents of liver activin exist in the same or other species Naturally occurring liver activin and mutant liver activin (naturally occurring Or genetically engineered). In addition, the present invention Also includes the denatured mutants of columns (a) to (d).   The present invention hybridizes to the nucleotide sequences (a) to (d) described in the previous paragraph. And therefore a nucleic acid molecule that is the complement of its nucleotide sequence, preferably DN A molecule is also included. Such hybridization conditions are as described above. , High stringency or slightly higher stringency. Nuclear If the acid molecule is a deoxyoligonucleotide ("oligo"), high stringency The mild conditions are, for example, in 6 × SSC / 0.05% sodium pyrophosphate at 37 ° C. (14 ° C. 48 ° C (for a 17-base oligo), 55 ° C (for a 20-base oligo), And washing at 60 ° C. (for a 23-base oligo). These nucleic acid molecules are Encoding a liver activin antisense molecule or a liver activin antisense It acts as a sense molecule, for example, useful for gene regulation (liver To antisense primers in the amplification reaction of the cutivine nucleic acid sequence and / or Or as an antisense primer). For liver activin regulation, this Such techniques can be used, for example, to regulate cell growth and / or differentiation. it can. Cell growth and / or differentiation includes liver regeneration and / or bone growth Stimuli, but is not limited thereto. In addition, such sequences are Can be used as part of a zym and / or triple helix sequence, Useful for gene regulation of liver activin. In addition, such molecules are, for example, Specific liver causing cell proliferation and / or cell differentiation disorders It can also be used as a component of diagnostic methods to detect the presence or absence of an activin allele. Wear.   In addition to the above-mentioned liver activin nucleotide sequence, full-length liver Gut activin cDNA or gene sequence, and / or liver present in other species Homologs of the gut activin gene can be cloned in the art without undue experimentation. It can be identified and easily isolated by known molecular biology techniques. Relatives Identification of homologs of liver activin in some species is closer to humans for drug discovery May be useful for developing new animal model systems. CD derived from target organism The NA library or genomic DNA library is Hybridizing Otide Hybridization or amplification probe. Can be screened. For example, the aforementioned liver activin nucleoti Sequence may be obtained from genomic DNA isolated from human cells and / or from liver activity. A human cell known or predicted to express the tibin gene or Tissue (eg, adult liver tissue or ATCC human hepatocyte lines 7004, 7120, 7128, 7137 , 7154, 7274, 7284, 7290, 7297, 7503, 7705, 7821, 7837, 7859 or 7864 Identification and isolation of another human liver activin homologue from cDNA generated from The probe can be used as a probe. In addition, other genes in the genome High loci for one or more domains of the liver activin gene product Identification of genes encoding homologous proteins by similar techniques Can also. In the case of cDNA libraries, such screening techniques Depending on the alternative spliced transcripts in the same or different species. Coming clones can be identified.   Screening is performed by filter hybridization using a double filter. Can be done by As shown in FIG. 1, FIG. 2 and FIG. Lobe contains at least 15-30 base pairs of liver activin nucleotide sequence It is. The washing conditions used for hybridization depend on the organism from which the labeled sequence was derived. If a cDNA library is derived from a different species of organism, Must be Cloning of human liver activin homologues For example, using a mouse liver activin probe, for example, hybridization Using, for example, Church buffer (7% SDS, 250 mM NaHPO_Four65 ° C in 2μM EDTA, 1% BSA) Can be done overnight. Washing was performed at 65 ° C. with 2 × SSC, 0.1% SDS, then 0.1 × SSC, It can be performed at 65 ° C with 0.1% SDS.   Low stringency conditions are well known to those skilled in the art and, as expected, It will vary depending on the specific organism from which the library and labeling sequences are derived. This For guidance on such conditions, see, eg, Sambrook et al., 1989, Molecular Clon. ing, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y .; and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green See n Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.   Alternatively, using a labeled liver activin nucleotide probe, A genomic library derived from an organism may be screened. At that time, Use stringent conditions. Identification and characterization of human genomic clones For controlling cell growth and / or differentiation and / or in human patients Diagnostic tests and clinic for treating cell proliferative and / or cell differentiation disorders Help design the protocol. For example, the intron / exo of the human gene Exons, introns and splices using sequences from regions adjacent to the Site (eg, a splice acceptor and / or splice donor) Primers for use in amplification assays to detect mutations in This primer can then be used in diagnostics.   Further, the amino acid sequence contained in the liver activin gene product disclosed herein Uses two pools of degenerate oligonucleotide primers designed based on Perform PCR to convert other liver activins and other gene homologs into the organism of interest. It can also be isolated from nucleic acids. Using such a primer, any RN A or increase the sequence of interest from a DNA source (preferably a cDNA library). You may let it be wide. PCR is performed, for example, with a Perkin-Elmer Cetus thermal cycler and Taq Polymerase (Gene Amp^TM) Can be performed. DNA to be amplified MRNA or cDNA or genomic DNA prepared from any vertebrate species included. Synthesize different degenerate primers for use in PCR reactions You can also. Hybridization conditions used to initiate the PCR reaction It is also possible to alter the stringency of Nucleotides between the liver activin gene to be obtained and the known liver activin gene Sequence homology can be higher or lower. Other for primer-dependent amplification of nucleic acids Means are known to those skilled in the art and can be utilized.   Subclone and sequence the PCR product and probe the Northern blot. May be used to ensure that the amplified sequence is in the liver activin gene. It will correspond to an array of children. Then, using the PCR fragment, various methods were used. Yo Alternatively, a full-length cDNA clone may be isolated. For example, by labeling the amplified fragment, Screening of cDNA library such as Cterio phage cDNA library It may be used for ringing. Alternatively, using labeled fragments, Genomic clones may be isolated by screening.   The full-length cDNA sequence can also be isolated using PCR technology. For example, According to standard procedures, a suitable cell or tissue source (ie, liver activin remains) Origins known or expected to express the gene, e.g., embryonic tissue, adult Body liver tissue or ATCC human hepatocyte lines 7004, 7120, 7128, 7137, 7154, 7274, 72 84, 7290, 7297, 7503, 7705, 7821, 7837, 7859 or 7864). Can be isolated. 5'-end of the amplified fragment to initiate first strand synthesis Reverse transcription on RNA using mostly specific oligonucleotide primers The reaction can be performed. Then, the obtained RNA / DNA hybrid was labeled `` Tailing with guanine using a standard terminal transferase reaction d) ". This hybrid is digested with RNAase H and then the second strand Synthesis can be initiated with a poly C primer. Thus, upstream of the amplified fragment Certain cDNA sequences can be easily isolated. Possible cloning methods For a review, see, for example, Sambrook et al., 1989, supra.   Alternatively, the liver activin gene of the present invention is obtained by It can be isolated by an exon trapping system (Nehls Et al., 1994, Oncogene 9 (8): 2169-2175; Verna et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21 (2 2): 5198: 5202; Auch et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18 (22): 6743-6744).   Mutant liver activin gene pairs using the liver activin gene sequence as an aid Progeny can be isolated. For example, not limiting Has a genotype that contributes to cell proliferation and / or cell differentiation disorders From such known or proposed individuals, such mutant alleles Can be isolated. Then, the mutant allele and the mutant allele product May be used in the treatment system and the diagnosis system described below. Furthermore, like this Using different liver activin gene sequences to influence cell growth and / or differentiation Liver activin gene regulation (eg, promoter or Promoter / enhancer) can be detected.   For example, using PCR (a technique well known to those skilled in the art), the mutant liver activin gene Can be isolated. In this case, the oligo-dT oligonucleotide From the liver tissue of an individual suspected of carrying the mutant liver activin allele Hybridize to isolated mRNA and extend new strand with reverse transcriptase Thus, the first cDNA strand can be synthesized. Then the second strand of the cDNA An oligonucleotide that specifically hybridizes to the 5 'end of the normal gene. To synthesize. Using these two primers, the product is then And cloned into an appropriate vector, using methods well known to those skilled in the art. Perform DNA sequence analysis. DNA sequence of mutant liver activin allele By comparing the DNA sequence of the liver activin allele, To identify mutations that cause loss of function or alteration of the tibin gene product Can be. Another method to detect abnormalities in the amplified liver activin gene fragment Southern or single analysis for amplification or amplification assays Single stranded conformational polymorphism analysis; SS CP), denaturing gradient gel analysis, and PCR analysis .   Alternatively, the genomic library carries mutant liver activin alleles Using DNA obtained from individuals expected or known to CDNA libraries can be derived from liver or from mutant liver activators. Is known to express the allele It can be constructed using RNA from other expected tissues. Then normal A novel liver activin gene or any suitable fragment thereof and use it as a probe Use the corresponding mutant liver activin allele in such a library using The gene can be identified. Then contains the mutant liver activin gene sequence Clones can be purified and sequenced according to methods well known to those skilled in the art. You.   Further, for example, it is expected to carry a mutant liver activin allele. Expression of such mutant alleles in known or known individuals. Isolated from known or predicted embryonic tissue or adult liver tissue An expression library can be constructed using cDNA synthesized from NA . In this method, the gene product produced by the putative mutant tissue is identified in Section 5. As described below in Section 3, anti-produced antibodies against normal liver activin gene products And screening using standard antibody screening techniques can do. (For screening techniques, see, for example, Harlow, E. and  Lane, eds., 1988, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbo See r Press, Cold Spring Harbor. ) Liver activin mutation When an expressed gene product whose function has been modified is obtained (for example, (As a result of a frameshift mutation), polyclonal antibody to liver activin. Clonal populations may cross-react with mutant liver activin gene products. You. Library clones detected by the reaction with such a labeled antibody, Purification and sequence analysis can be performed according to methods well known to those skilled in the art.   The invention relates to mutant liver activin proteins, polypeptides, liver activins Derivatives (including peptide fragments), truncated liver activin, and liver activin Also encompasses a nucleotide sequence encoding a tibin fusion protein. This nucleo Peptide sequences include, but are not limited to, nucleosides corresponding to the 3 'untranslated region. Truncated nucleotide sequences lacking all or part of the tide; Mutant liver activin described in section (described below) Nucleotide sequence encoding liver activin N-terminal signal peptide domain , Propeptide domains, and mature growth factor domains or their domains. A polypeptide or peptide corresponding to a part of the peptide; and one or two domains. Truncated liver activin lacking the main (e.g., N-terminal signal A mature growth factor domain lacking the peptide and / or propeptide domains; Is a cleavage motif and / or N-terminal signal Peptide domain, propeptide domain, and / or mature growth factor domain Truncated non-functional liver activin lacking all or part of . The nucleotides encoding the fusion protein include, but are not limited to, An unrelated protein or peptide [eg, a mature growth factor domain sequence Increases the stability and half-life of the resulting fusion protein in the bloodstream A domain (e.g., liver activin-Ig), or an enzyme that can be used as a marker, Full-length liver activin fused with fluorescent or photoprotein] Truncated liver activin, polypeptide or liver activin derivative (cut Pieces).   The present invention relates to (a) a sequence encoding the above-mentioned liver activin and / or a phase thereof; A DNA vector containing any of the complementary sequences (ie, antisense); Liver as described above operably linked to regulatory elements that direct the expression of the nucleotide sequence A DNA expression vector containing any of the activin coding sequences; and Operably linked regulatory elements that direct the expression of the coding sequence in the main cell. Genetically engineered containing any of the above mentioned combined liver activin coding sequences The produced host cells are also included. In the present specification, the regulatory element is limited. Although not limiting, the inducibility and drive known to those skilled in the art to drive and regulate expression Non-inducible promoters, enhancers, operators and other elements No. Such regulatory elements include, but are not limited to, Itomegalovirus hCMV immediate-early gene, early or late stage of SV40 adenovirus Motor, lac, trp, TAC, TRC, phage A And Promoter region, fd coat protein control region, 3-phosphoglycerate quina Promoter, acid phosphatase promoter, and yeast α-conjugation Factor promoters.   Furthermore, the present invention relates to a genome found to be flanked by the liver activin gene. A nucleotide sequence. Such genomic nucleotide sequences include Contains regulatory elements that act to trigger and regulate cutibin expression Contains an array. The control elements are synchronized using routine techniques well known to those skilled in the art. Can be specified. For example, genomic DNA located upstream of the liver activin gene The cloning of the nucleotide sequence into a reporter gene such as the CAT gene Can be. The transcriptional activity of the nucleotide sequence is The determination can be made by performing an assessment. More precisely regulating elements In order to determine the activity, a deletion mutant was prepared and tested for reporter gene activity. Just do it.                       5.1.1Activin β <sub>C</sub> gene   Mouse activin β<sub>C</sub>CDNA sequence (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) Column number 2) is shown in FIG. Mouse activin β<sub>C</sub>The signal sequence is the amino acid of FIG. It ranges from residue 1 to about 20. Cluster of basic residues (KHRVRRR, amino acid 230 ~ 236) regulate the predicted propeptide and mature growth factor domains. It can function as a cleavage site by endoproteolysis. Step The lopeptide domain consists of approximately 216 residues, from about amino acid residue 21 to about 2 in FIG. Over 36. The mature growth factor domain consists of approximately 116 residues, It extends from about amino acid residue 237 to about 352. Mouse activin β<sub>C</sub>cDNA cloning Using mouse derived sequences as described in the Examples (described below) using sequences derived from DNA and liver cDNA libraries under low stringency conditions Screen below, β<sub>E</sub>Was cloned.                        5.1.2Activin β <sub>E</sub> gene   Mouse activin β<sub>E</sub>CDNA sequence (SEQ ID NO: 3) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) Column number 4) is shown in FIG. Mouse activin β<sub>E</sub>The signal sequence is the amino acid of FIG. It ranges from residue 1 to about 21. Cluster of basic residues (RARRR, amino acid residue 2 32-236) contain the predicted propeptide domain and mature growth factor domain. It can function as a defined endoproteolytic cleavage site. The propeptide domain consists of approximately 215 residues, from about amino acid residue 22 to about amino acid residue 22 in FIG. About 236. Activin β<sub>E</sub>The subunit mature growth factor domain It consists of approximately 113 residues and extends from about amino acid residue 237 to about 349 in FIG.                      5.1.3Human activin β <sub>E</sub> gene   Mouse activin β<sub>E</sub>Human liver cDNA library using cDNA clones Lees were screened under low stringency conditions. Isolated human acti Bin β<sub>E</sub>Figure 5 shows the cDNA sequence (SEQ ID NO: 5) and deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of It is shown in FIG. From sequence analysis, 1050 nucleotides encoding a protein with an estimated molecular weight of 39 kD A predicted open reading frame consisting of otide has been found. Putative methionine The start codon is located at nucleotide 77. Rules preceding the translation termination signal (TAG) A constant CXCX sequence was also identified.   Human activin β<sub>E</sub>Subunit is a member of another TGF-β superfamily It is organized in the same way as. Predicted start Met residue starts at about 20 amino acids Followed by a characteristic signal peptide. Downstream of this signal peptide A predicted propeptide domain and mature growth factor domain were identified. These domains have one or more putative breaks due to endoprotease degradation. Were separated by clusters of basic amino acids. These cleavage sites In actual use, human activin β<sub>E</sub>Propeptide domain of subunit In and mature growth factor domains consist of approximately 215 and 114 amino acids, respectively Will.   Mouse and human activin β<sub>E</sub>Predicted carboxy terminal amino acid sequence is very Highly homologous to amino acids greater than 95% of the mature growth factor region Has acid identity. Both coding sequences contain a total of 9 cysteine residues . We believe that cysteines are separated and that other conserved amino acids are included. Is the greatest feature of activin and, to a lesser extent, TGF-β itself I found something. Table showing sequence identity (%) within the mature growth factor region , Human activin β<sub>E</sub>Is human activin β<sub>A</sub>With 45% identity to human activ Bin β<sub>B</sub>Shows 47% identity to human activin β<sub>C</sub>And 64% identity, Rikatsuma Frog Activin β<sub>D</sub>And 62% identity. In contrast, human Tibin β<sub>E</sub>When compared to other members of the TGF-β superfamily, Only 20 to 40% amino acid sequence identity was observed. The present inventors To the best of our knowledge, this is activin β from humans.<sub>E</sub>First report on the isolation of It is a notice.                      5.1.4Mouse activin locus   The genetic map of the mouse activin locus is shown in FIG. 4A. Genomic mouse clone The nucleotide sequence of the mouse activin locus from is shown in FIG. 4C. The present inventors Studies show that in some respects, activin β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Is another known activin Suggest that they are similar to each other: (a) These genes Β<sub>C</sub>Activin β at the 3 'end<sub>E</sub>Genome D of only 5-kbp separated from the 5 'end of Physically linked by NA, and (b) the organization of both loci is similar And consists of two coding exons separated by one intervening sequence, and (c) both The predicted carboxy-terminal sequence of activin is highly homologous and (D) both genes are present in adult mouse liver. And (e) results from multiple in vitro assays. From the fruit, activin β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Can stimulate HepG2 cell proliferation It turned out. Considering these together, from the data of the present inventors, Bin β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Subunit genes evolve from a common ancestor with tandem duplication It is suggested that it may have been done. Data on these structures and functions are Β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Distinguish subunits from other known activins, Show that these subunits belong to unique subgroups of TGF-β-like molecules I'm sorry.             5.2Liver activin protein and polypeptide   Liver activin proteins, polypeptides and derivatives (including fragments); Mutants, truncations or deletions of cutibin; and / or liver activin Fusion proteins can be prepared for various uses. For example, to limit Can be used for diagnostic assays, but not for cell growth and / or differentiation Use as a pharmaceutical reagent useful for modulation and / or treatment of related disorders Production of antibodies that can be used.   Liver activin β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Is the methion of the DNA sequence corresponding to the translation initiation site. Starting at the nin, followed by a typical hydrophobic single sequence of peptide secretion. Mouse acti Bin β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Predicted propeptide domain and mature growth factor domain Are about 216 and 115 amino acids and 215 and 113 amino acids, respectively. Human Cutibin beta<sub>E</sub>The predicted propeptide domain and mature growth factor domain of 15 and 114 amino acids. All known TGF-β superfamilies except MIS Activin β as well as members<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Is a basic residue of about 120 amino acids from the C-terminal With a cluster of groups, at the junction of the propeptide domain and the mature growth factor domain To form a cleavage site due to endoprotease degradation. (Roberts B, Sporn MB 1 900, The Transforming Growth Factor-βs in Handbook of Experimental Phar macology, 95 (Part I) Sporn MB, Roberts AB eds., Springer-Verlag, Hedelb erg, pp. 419-472; Vale W, Hsueth A, River J, Yu J 1990 in Peptide Growth F actors and Their Receptors, 95 (Part II) Sporn MB, Roberts ABeds, Spring er-Verlag, Heldelberg, pp. 211-248; and Centrella et al., 1994, Endocr Rev  15: 27-38). Liver activin β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Mature growth factor domain and other activators Figure 3 shows the alignment between bins and other TGF-β superfamily members. Shown in The liver activin maturation growth factor domain is a member of the TGF-β superfamily Of the interval stored between members Contains nine cysteine residues that represent turns. Liver activin β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Is , Activin β<sub>A</sub>And β<sub>B</sub>Shows significant homology to activin β<sub>D</sub> Most closely related to   FIG. 1 shows mouse liver activin β<sub>C</sub>1 shows the amino acid sequence of a subunit. Sig The null sequence spans amino acids 1-20. Cluster of basic residues (KHRVRRR , Amino acids 230-236) are the predicted propeptide domain and mature growth factor Acts as a cleavage site for endoproteolysis that defines the domain Can be. The propeptide domain consists of approximately 216 residues, with about 2 amino acid residues It ranges from 1 to about 236. The mature growth factor domain consists of approximately 115 residues, It extends from about amino acid residue 237 to about 352 in FIG. Figure 2 shows the mouse liver activator Β<sub>E</sub>1 shows the amino acid sequence of a protein. Signal sequence at amino acid residues 1-21 I am passing. The cluster of basic residues (RARRR, amino acid residues 232 to 236) Ends defining predicted propeptide and mature growth factor domains It can function as a cleavage site due to protease degradation. Propeptide The main consists of approximately 215 residues, ranging from about amino acid residues 22 to about 236. The mature growth factor domain consists of approximately 113 residues, from about amino acid residues 237 to about 349 Over.   FIG. 5 shows human liver activin β.<sub>E</sub>1 shows the amino acid sequence of a subunit. Human Cutibin beta<sub>E</sub>Subunits, like other TGF-β superfamily members, It is configured. The predicted starting MET residue has a characteristic The signal peptide is followed. Predicted propeptide domains and maturation Salts Providing Endoproteolytic Cleavage Sites That Define Long Factor Domains A cluster of basic amino acids was identified. Once cleaved, human activin β<sub>E</sub> The propeptide and mature growth factor domains are approximately 215 and 1 respectively. Will consist of 14 amino acids.   Possible N-linked glycosylation sites (ie, the amino acid sequence motif NX -S or N-X-T)<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Liver activin subunit and Human β<sub>E</sub>Both Propepti in Liver Activin Subunit Found in the domain. Mouse β shown in FIG.<sub>C</sub>The array has four possible N Binding glycosylation sites can be identified (from amino acid residues 111, 143, 161, and 173). (See the starting tripeptide motif), mouse β shown in FIG.<sub>E</sub>One in array Possible N-linked glycosylation sites (starting at amino acid residue 198) See full tripeptide motif).   The amino acid sequence of the liver activin of the present invention is shown in FIG. No. 2), the amino acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) and the amino acid sequence shown in FIG. Column no. 6), and a cDNA clone pbC as deposited with the ATCC, deposited with the ATCC CDNA clone pbE as reported, and cDNA clone as deposited at the ATCC. Contains the amino acid sequence encoded by Lone pbHE. In addition, other mice and And human liver activin and liver activin homologs are also encompassed by the present invention. Real In some cases, the liver activin nucleotide sequence described in Section 5.1 above is used. Any liver activin protein encoded by the invention is within the scope of the invention . Such animals are referred to as "bioreactors" for producing liver activin. Can be made for use.   The invention also provides that Section 5.1 when judged by any of several criteria. Functionally equivalent to liver activin encoded by the described nucleotide sequence , Also includes certain proteins, based on (a) antigenicity (ie, anti-liver (B) immunogenicity (i.e., liver activin protein) The ability to produce antibodies capable of binding to proteins or polypeptides), (c) liver activin (Or competes with liver activin for binding to the substrate)) Ability, (d) ability to multimerize with liver activin, and (e) liver Ability to bind to activin receptor, binding affinity for activin receptor, The resulting biological effects of binding to activin receptors, such as liver Changes in signal transduction and cellular metabolism when tibin equivalents are present in appropriate cell types (e.g., For example, ion flux, tyrosine phosphorylation), or phenotypic changes (Eg, stimulation or suppression of cell growth and / or differentiation), It is not limited to these. Such a functionally equivalent liver activin protein Quality includes the liver activin nucleotide sequence described above in Section 5.1. Addition or substitution of amino acid residues within the encoded amino acid sequence, The result is a silent change, which results in a functionally equivalent gene product. Includes, but is not limited to, the aforementioned additions or substitutions that occur. Amino acid Substitutions depend on the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and / or Or amphipathic similarities. For example, non-polar (hydrophobic) Examples of amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, and feline. Nylalanine, tryptophan and methionine; polar and neutral amino acids; Glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagus Gin and glutamine; positively charged (basic) amino acids Include arginine, lysine and histidine; negatively charged (acid Sexual) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.   Included within the scope of the invention are liver activin proteins, polypeptides, And eg glycosylation, acetylation, phosphorylation, amidation, known protecting groups / Derivatization with blocking groups, proteolytic cleavage, antibody molecules or other (Differentiate) during or after translation, such as by binding to cell ligands. ally) modified derivatives (including fragments). Any of a number of chemical modifications Can be performed by known techniques, such as, for example, bromination Cyan, trypsin, chymotrypsin, papain, V8 protease, NaBH<sub>Four</sub>By Specific chemical cleavage; acetylation, formylation, oxidation, reduction; tunicamycin Metabolic synthesis in the presence; and the like. Concrete fruit In embodiments, the composition of the present invention is conjugated to another molecule to form the composition. Water solubility (e.g., conjugate with polyethylene glycol), half-life, Or the ability to bind to target tissue (eg, targeting the protein to bone sites) Conjugation with bisphosphonates and fluorochromes Increase).   In addition, non-classical amino acids or chemical amino acid analogs can be It can also be introduced as a substitution or addition into the protein sequence. With non-classical amino acids The D isomer of a normal amino acid, α-aminoisobutyric acid; 4-aminobutyric acid, Abu; 2-aminobutyric acid, γ-Abu; ε-Ahx, 6-aminohexanoic acid; Aib, 2-aminoisobutyric acid 3-aminopropionic acid; ornithine; norleucine; norvaline; hydroxy Proline; sarcosine; citrulline; cysteic acid; t-butylglycine; Lualanine; phenylglycine; cyclohexylalanine; β-alanine; full Oro-amino acids; "designer" amino acids such as β-methyl amino acids; Cα-methyl Amino acids; Nα-methyl amino acids; and common amino acid analogs However, it is not limited to these. Furthermore, even though this amino acid is in D-form (dextrorotary) It may be L-shaped (levorotary).   Liver activin DNA contains random mutations (using techniques well known to those skilled in the art). Applying, the resulting mutant liver activin can be tested for activity. Genetically engineered site-specific mutations in the liver activin coding sequence (Engineered) (again, using techniques well known to those skilled in the art), Higher or lower binding affinity and / or increased machine for binding Capacity (eg, higher binding affinity for liver activin receptor, and / or Indicates greater signaling ability or reduced function (eg, liver Binding Affinity and / or Reduced Signaling Ability for Protein Receptors It is also possible to produce a mutant liver activin having   For example, alignment of members of the liver activin and other activins As shown in FIG. Mutant liver activin retains identity region However, if the variable residues are (eg, by deletion or insertion of amino acid residues, or Modified by the substitution of different amino acid residues Can be manufactured. Genetically engineered conservative modifications at variable positions to provide functional (eg, Hepatic activin receptor binding affinity Mutated liver that retains or signaling ability, or both) It is also possible to obtain activin. Inherit non-conservative changes at these variable positions Can be engineered to function (eg, liver activin binding affinity or signal). It is also possible to modify the ring ability, or both. Or also When a function modification is desired, deletion of a conserved region or non-conservative modification It may be made engineering. For example, mouse liver activin β<sub>C</sub>Amino acid residue 21 of ~ 236 (Fig. 1), mouse liver activin β<sub>E</sub>Amino acid residues 21 to 236 (FIG. 2), human liver Visceral activin β<sub>E</sub>Amino acid residues 17 to almost 236 (Figure<sub>Five</sub>) Or mouse liver activator Β<sub>C</sub>Amino acid residues 237-352 (FIG. 1), mouse activin β<sub>E</sub>Amino acid residue 237 of ~ 349 (Figure 2), or human liver activin β<sub>E</sub>Of amino acid residues 237 to 350 (FIG. 5) Genetic engineering of deletions or non-conservative modifications (substitutions or insertions) And / or a dimer having a β subunit cannot be formed, and Mutant liver activin or liver that cannot achieve structural conformation Binds to activin receptors but does not respond to signaling (signaling-inc It is possible to obtain mutant liver activins that are ompetent). Shown in FIG. Inherits nonconservative alterations to cysteine residues in the mouse growth factor domain Has been engineered to have an altered structure, and thus has a hepatic activin receptor Obtaining a mutant liver activin with an altered binding affinity for it can.   Host cells selected by making other mutations to the liver activin coding sequence Liver activin better suited for expression, scale-up, etc. Can be For example, deleting a cysteine residue or adding another amino acid Substitution to eliminate disulfide bonds; or N-linked glycosylation Hyperglycosylate N-linked site by modifying or deleting the site Homogeneous product more easily recovered and purified from yeast hosts known to Expression can be achieved. For this purpose, liver activin Of the glycosylation recognition sequence (N-X-S or N-X-T) present in the propeptide domain Either one or Various amino acids at one or both of the first or third amino acid positions The amino acid substitution causes the propeptide to be modified in the modified tripeptide sequence. Will not be glycosylated. For example, Miyajima et al., 1986, EMBO  J. 5 (6): 1193-1197.   One or more domains of liver activin (eg, N-terminal signal peptide, pro- Peptide, or peptide corresponding to mature growth factor); truncated or deleted Liver activin (eg, lacking a signal and / or propeptide domain) Molecule); and full-length liver activin protein, polypeptide or Are derivatives (including fragments) or truncated liver activin-irrelevant proteins Fusion proteins fused to a protein are also included in the scope of the invention. Modified Activin is a hepatic activin nuclease disclosed in this section and Section 5.1 above. It can be designed based on leotide and liver activin amino acid sequences. This fusion tag Proteins also exist between liver and non-liver activin protein sequences. Genetically engineered to include a cleavage site located at The protein may be more easily separated from the non-liver activin portion. No. Such fusion proteins include IgFc fusions (which are liver activin Stabilizes proteins or peptides and increases half-life in vivo ) Or an enzyme, fluorescent protein or luminescent tan Fusions with, but not limited to, proteins.   Liver activin proteins, polypeptides and derivatives (including fragments) (See, for example, Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecu lar Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y.), liver activin The large polypeptide derived from it, and full-length liver activin itself, Techniques well known in the art for expressing child and / or nucleic acid coding sequences It can be advantageously produced by the recombinant DNA technology used. With such a method, Liver activin nucleotide sequence and appropriate transcription and translation as described in Section 5.1 Expression vectors containing translational control signals can be constructed. These methods include, for example, If in vitro These include recombinant DNA methods, synthetic methods, and in vivo genetic recombination. For example, Samb Rook et al., 1989, supra; Ausubel et al., 1989, supra; Caruthers et al., 1980, Nuc. Acids R es. Symp. Ser. 7: 215-233; Crea and Horn, 1980, Nuc. Acids Res. 9 (10): 23 31; Matteucci and Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21: 719; and Ch ow and Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9 (12): 2807-2817 I want to be. Alternatively, for example, using a synthesizer, liver activin nucleotides RNA that can encode the sequence may be chemically synthesized. For example, "Oligonucleotide Synthesis ”, 1984, Galt, M.J., IRL Press. Oxford (full text by citation (Incorporated herein).   Various hosts may be used to express the liver activin nucleotide sequences of the present invention. Expression vector systems are available. Liver activin proteins, polypeptides Or derivative from culture, i.e., liver activin peptide or polypeptide. If the tide is not secreted from the host cell, and liver activin protein, From the culture medium if the polypeptide or derivative is secreted by the host cell Can be collected. However, this expression system includes hepatic activin or functional equivalents. Also encompassed are genetically engineered host cells that express the product in situ.   Expression systems that can be used for the purposes of the present invention include liver activin nucleoti Recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA or cosmid DNA Bacterial cell lines transformed with expression vectors [eg, E. coli, subtilis ]; Transformation with recombinant yeast expression vector containing liver activin nucleotide sequence Yeast cell lines (eg, Saccharomyces, Pichia); contain liver activin sequences Insect cells infected with a recombinant virus expression vector (eg, baculovirus) Vesicle system; recombinant viral expression vector containing liver activin nucleotide sequence [eg For example, cauliflower mosaic virus (CaMV), tobacco mosaic virus (TMV)] Recombinant plasmid infected with or containing liver activin nucleotide sequence Plant cell line transformed with an expression vector (eg, a Ti plasmid); Vesicle Nome-derived promoters (eg, metallothionein promoter) or mammalian Promoters derived from animal viruses (eg, adenovirus late promoter, Vaccinia carrying a recombinant expression construct comprising a vaccinia virus 7.5K promoter) Animal cell lines (eg, COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3) It is not limited to them.   In bacterial systems, depending on the intended use to express the liver activin gene product Several expression vectors can be advantageously selected. Large quantities of such proteins produced In the case of drug production or when raising antibodies Is a vector that directs the expression of high levels of easily purified fusion protein products Would be desirable. Such vectors are limited However, E. coli expression vector pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791) (this In the expression vector, the liver activin coding sequence is separately produced as a fusion protein. Ligated into the vector in frame with the lacZ coding region to be produced. PIN vector (Inouye and Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 310). 1-3109; Van Heeke and Schuster, 1989, J. Am. Biol. Chem ,. 264: 5503-5509); p cDNA (Invitrogen) eukaryotic vector and the like. Glue the foreign polypeptide To express as a fusion protein with Tathione S-transferase (GST) Alternatively, the pGEX vector can also be used. Usually, such a fusion protein Glutathione-agarose beads from soluble and lysed cells Can be easily purified by elution in the presence of free glutathione . This pGEX vector contains thrombin or factor Xa protease cleavage sites. Designed to allow the cloned target gene product to be cleaved from the GST moiety It is.   In an insect system, an autographer (vector) is used as a vector for expressing a foreign gene. Autographa californica) nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) is used. This c Ils grows in Spodoptera frugiperda cells. Liver activin gene co Coding sequences are individually located in non-essential regions of the virus (eg, the polyhedrin gene). Cloned, AcNPV promoter (eg, Polyhedrin promoter). Liver activin inheritance Successful insertion of the offspring coding sequence inactivates the polyhedrin gene, and Non-occluded recombinant virus (ie, polyhedrin A virus without the proteinaceous coat encoded by the gene) results. this These recombinant viruses were then used to infect Spodoptera frugiperda cells. Then, the inserted gene is expressed in the cell. (See, for example, Smith et al., 1983, J. Am. Virol. 46: 584; Smith, U.S. Patent No. 4,215,051. )   In mammalian host cells, several viral-based expression systems are available. Expression When an adenovirus is used as a vector, the target liver activin nucleo The tide sequence is used by the adenovirus transcription / translation control complex (eg, the late promoter). And a tripartite leader sequence). This chimeric gene is then It can be inserted into the adenovirus genome by in vitro or in vivo recombination. This By inserting the viral genome into non-essential regions (eg, E1 or E3 regions) Viable and capable of expressing the liver activin gene product in the infected host. A viable recombinant virus is obtained. See, for example, Logan and Shenk, 1984, Proc. Natl . Acad. Sci. USA 81: 3655-3659. Liver activin inserted When specific initiation signals are also required for efficient translation of leotide sequences There is. These signals include the ATG start codon and adjacent sequences You. Whole liver activin gene or cDNA (its own start codon and adjacent sequences Are inserted into an appropriate expression vector, the additional translational control signals May not be necessary. However, only part of the liver activin coding sequence Is inserted, an exogenous translational control signal, possibly including the ATG start codon Must be supplied. In addition, this start codon is a translation of the entire insert. To ensure translation, read frame and infe Must be in phase. These exogenous translational control signals and And initiation codons can be of various origins, both natural and synthetic. Efficiency of expression depends on proper transcription Increased by including enhancer elements, transcription terminators, etc. Can be done. Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. See 153: 516-544 I want to be illuminated.   Additionally, host cell strains that modulate the expression of the inserted sequences, or Choosing a host cell strain that modifies or processes the gene product in a Good. Such modifications (eg, glucosylation) of protein products and processing Thing (eg, cleavage) can be important for the function of the protein. different Host cells are responsible for the post-translational processing and modification of proteins and gene products. Has a unique and specific mechanism for Precise modification of expressed foreign protein The appropriate cell line or host system can be selected to ensure You. Such mammalian host cells include CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK , 293, 293T, 3T3, WI38, especially cell lines obtained from embryonic tissue or adult liver But not limited to them.   For long-term, high-yield production of recombinant proteins, stable expression is preferred. New For example, a cell line that stably expresses the above-mentioned liver activin sequence is It is possible to manufacture it. Host cells use an expression vector that contains the viral origin of replication. Instead, a selection marker and appropriate expression control elements (eg, a promoter , Enhancer sequences, transcription terminators, polyadenylation sites, etc.) Can be transformed with a DNA that is regulated by the method. After introducing foreign DNA, Manipulated cells are grown in enriched media for 1-2 days and then switched to selective media You. A selectable marker in the recombinant plasmid confers resistance to selection and The cell stably integrates the plasmid into its chromosome and proliferates to form a focus. To be able to This focus is then cloned into a cell line and expanded xpand). This method results in excess of the liver activin gene product in vitro. It can be used advantageously to create cell lines that express.   Several selection systems are available and are not intended to be limiting, for example, , Tk<sup>-</sup>, Hgprt<sup>-</sup>Or aprt<sup>-</sup>In cells, herpes simplex virus and Thymidine kinase gene (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), hypoxanthine-g Anine phosphoribosyltransferase gene (Szybalska and Szybalski , 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) and adenine phosphoribosyl The transferase gene (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) is available. Antimetabolic drug resistance can also be used as a basis for selection of the following genes: dhfr ( Conferring resistance to methotrexate) (Wigler et al., 1980, Natl. Acad . Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA 78: 1527) Gpt (providing resistance to mycophenolic acid) (Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo (in aminoglycoside G-418) (Collarre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1). ); And hygro (which confers resistance to hygromycin) (Santerre et al.) 1984, Gene 30: 147).   Alternatively, by using antibodies specific for the fusion protein to be expressed Any fusion protein can be easily purified. For example, described by Janknecht et al. System allows easy purification of non-denatured fusion proteins expressed in human cell lines (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976). This system Then, the gene of interest has an open reading frame of 6 genes. Translationally fused to an amino-terminal tag consisting of histidine residues Subcloned into a vaccinia recombinant plasmid as described above. Recombinant Extract from cells infected with Xinia virus<sup>2+</sup>Nitroacetic acid-agarose Immobilized histidine-tagged protein with imidazole Selectively elute with buffer containing.   Liver activin gene product may also be expressed in transgenic animals. Both are possible. How to Make Liver Activin Transgenic Animals Any type of animal can be used, for example, mice, rats, rabbits, Lumots, pigs, minipigs, goats, and non-human primates (eg, baboons, And chimpanzees). It is not limited to them.   Introduction of liver activin transgene into animals to create transgenic animals Any technique known in the art may be used to generate the starting line. Such techniques include pronuclear microinjection (Hoope, PC and Wa). gner, T.E., 1989, U.S. Pat. No. 4,873,191); retrograde to the germ lines Irus-mediated gene transfer (Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA  82: 6148-6152); Gene targeting in embryonic stem cells (Thompson et al., 1989, Cel. l 56: 313-321); and embryo electroporation (Lo, 1983, Mol. Cell. Bl. ol. 3: 1803-1814), but is not limited thereto. Of such techniques For a review, see Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115: 17 See 1-229, the entire text of which is incorporated herein by reference.   The present invention provides a transactivator that carries the liver activin transgene in all cells. Transgenic animals, and some, but not all, of the transgenes. An animal (ie, a mosaic animal) carried in the vesicle is provided. This transgy Can be incorporated as a single transgene, or concatemers (eg, (Head-to-head tandem or head-to-tail tandem). This Lance Gene also describes, for example, the teachings of Lasko et al. (Lasko, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236), selectively introduced into certain cell types, There it may be activated. Regulation required for such cell type-specific activation The sequence will depend on the particular cell type of interest, and will be apparent to those skilled in the art. Liver gene transgene integrates into chromosomal site of endogenous liver activin gene If inclusion is desired, gene targeting is preferred. That is, If such a technique is to be used, integration (homologous recombination using chromosomal sequences) For the purpose of disrupting the function of the endogenous liver activin gene product A vector containing a nucleotide sequence homologous to the sex liver activin gene is designed. This transgene is also described by Gu et al. (Gu et al., 1994, Science 265: 103-106). Selectively to certain cell types, such as the liver And thereby inactivates the endogenous liver activin gene only in that cell type It is also possible to make sex. Regulatory sequences required for such cell type-specific inactivation Will depend on the particular cell type of interest and will be apparent to those skilled in the art. Would.   Once transgenic animals have been produced, recombinant liver activators can be Bin gene expression can be assayed. Regarding integration of the transgene To analyze animal tissues, use initial blots by Southern blot analysis or PCR techniques. Leaning can be performed. In addition, a northern sample of tissue samples obtained from animals Blot analysis, in situ hybridization analysis, RT-PCR, etc. Tissue level of the expression of the transgene mRNA using Can be evaluated. In addition, a sample of a tissue that expresses the liver activin gene Were evaluated immunohistochemically using antibodies specific for the liver activin transgene product. Can be valued.   5.3Antibodies to liver activin protein   Epitopes of one or more epitopes of liver activin or a conserved variant of liver activin Antibodies specifically recognizing peptide fragments of activin or liver activin are also included in the present invention. I will. Such antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies (mAbs) , Humanized or chimeric antibody, single chain antibody, Fab fragment, F (ab ')<sub>Two</sub>Fragment, Fab expression line Fragments produced by Berry, anti-idiotype (anti-Id) antibodies Includes, but is not limited to, any of the epitope binding fragments.   The antibodies of the present invention can be used, for example, to detect hepatic activin in biological samples. Therefore, patients can be tested for abnormal amounts of hepatic activin It represents some of the possible diagnostic or prognostic techniques. Also, such antibodies are For example, a test compound may be tested for expression and / or activity of a hepatic activin gene product. Use with compound screening methods described in Section 5.5 below to evaluate efficacy can do. Further, for example, normal and / or engineered liver activin Such antibodies may be used to evaluate expressing cells before introducing them into a patient. Genetics described in Section 5.6 below Can be used with child therapy techniques. In addition, such antibodies are Can be used as part of a method for regulating and / or inhibiting Wear. Thus, such antibodies result in cell growth and / or differentiation Can be used as part of a treatment regimen.   Polyclonal antibodies are heterogeneous populations of antibody molecules derived from the sera of immunized animals. You. For the production of antibodies, liver activin protein; liver activin polypeptide or Is a liver activin derivative (e.g., a mechanism for liver activin such as the mature growth factor domain). Cleaved liver activin polypeptide (one or more The main, e.g., N-terminal signal peptide or propeptide domain is deleted Liver activin); functional equivalent of liver activin; Naturally, various host animals can be immunized by injection of the mutant. Such an inn Rabbits, mice, rats, etc. can be mentioned in small numbers as main animals However, the present invention is not limited to these. To enhance the immunological response, the host Various adjuvants can be used depending on the species, including Int (complete and incomplete), inorganic gels such as aluminum hydroxide, surfactants Quality, such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, Oily emulsion, keyhole limpet hemocyanin, dinitrophenol and latent Useful human adjuvants such as BCG (bacille Calmette-Guerin) and Includes Corynebacterium parvum, However, the present invention is not limited to this.   Monoclonal antibodies are homogeneous populations of antibodies to a particular antigen, Can be obtained by any technique that allows the production of antibody molecules by continuous cell lines in culture. Wear. These include Kohler and Milstein (1975, Nature 256: 495-497 and US National Patent No. 4,376,110) hybridoma technology, human B cell hybridoma technology ( Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc i. USA 80: 2026-2030) and EBV hybridoma technology (Cole et al., 1985, Monoclona). l Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) But limited to them is not. Such antibodies include IgG, IgM, IgE, IgA, IgD and any of them. It can be of any immunoglobulin class, including subclasses. The hybridoma producing the mAb of the present invention can be cultured in vitro or in vivo. Can be. This is because current production of high titers of mAbs in vivo This is the preferred production method at this time.   In addition, a gene derived from a mouse antibody molecule having appropriate antigen specificity can be By splicing together with a gene derived from a human antibody molecule having a specific activity , “Chimeric antibodies” (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855). Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452. -454) can be used. Chimeric antibodies A molecule having a moiety that differs depending on the animal species from which it is derived, for example, A molecule having a variable region and a human immunoglobulin constant region.   Alternatively, techniques described for the production of single chain antibodies (US Pat. No. 4,946, No. 778; Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad . Sci. USA 85: 5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334: 544-546). The present invention can be applied to the production of a single-chain antibody against a cutibin gene product. Single strand Antibodies bind the heavy and light chain fragments of the Fv region by amino acid crosslinking, resulting in a single-chain Produced by obtaining the repeptide.   Antibody fragments that recognize specific epitopes can be produced by known techniques. You. For example, such fragments can be obtained by pepsin digestion of antibody molecules. Cut F (ab ')<sub>Two</sub>Fragment, and F (ab ')<sub>Two</sub>By reducing the disulfide bridges in the fragment Includes, but is not limited to, Fab fragments that can be obtained. Ah Alternatively, rapid and easy identification of monoclonal Fab fragments with the desired specificity To enable this, a Fab expression library can be constructed (Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281).   Antibodies against liver activin, in turn, mimicking (simulating) liver activin For the production of idiotype antibodies or for those skilled in the art Used to identify hepatic activin cell surface receptors by known techniques Can be. For example, Greenspan & Bona, 1993, FASEB J 7 (5): 437-444; and Nis sinoff, 1991, J.M. Immunol. 147 (8): 2429-2438. For example, mature Anti-idies bind to and neutralize hepatic activin receptors by "mimicking" the long factor region To produce an otype, it binds to the liver activin mature growth factor Use antibodies that competitively inhibit hepatic activin receptor binding to tibin. Can be. Such neutralizing anti-idiotype or such anti-idiota Fab fragment of ip shows the effect of hepatic activin on cell growth and / or differentiation Can be used in treatment regimes that interfere with, stimulate or neutralize.   5.4Diagnosis of abnormal cell growth and / or differentiation   For diagnosis and prognosis of disorders of cell growth and / or differentiation, Various methods to identify patients predisposed to such disorders Can be Such disorders include hematopoiesis, erythroid differentiation, follicle maturation, Pituitary growth hormone and corticotropin secretion, hypothalamic oxytocin Secretion, lymphocyte proliferation, neuronal survival, spermatogenesis, bone and growth formation, liver Synthesis of vesicle DNA, secretion of pancreatic insulin, induction of somatostatin, morphogenesis of heart , Including disorders in megakaryocytic differentiation and mesoderm induction during early embryonic development, It is not limited to these. Assess diagnosis and prognosis by the method of the present invention Disorders of cell growth and / or differentiation include hematopoiesis, erythropoiesis, follicle maturation, Pituitary growth hormone and adrenocorticotropic hormone secretion, hypothalamic oxytocin Secretion, lymphocyte proliferation, neuronal survival, spermatogenesis, bone formation, hepatocyte DNA Impairs synthesis of pancreatic insulin, secretion of pancreatic insulin, and mesoderm induction during early embryonic development Including, but not limited to.   Such methods include, for example, the liver activin nucleotide sequence described in Section 5.1. Reagents such as the liver activin antibodies described in column 5.3, can be used. Special In particular, such reagents may be used, for example, to (1) detect the presence of a liver activin gene mutation. To get out or normal cell growth and / or minutes Detects over- or under-expression of hepatic activin mRNA for hyperplastic conditions Therefore, (2) hepatic activin for non-cell growth and / or non-differentiated disorders To detect excess or underabundance of gene products, and (3) hepatic activators Detect disruptions or abnormalities in signaling pathways mediated by ligands Can be used for   The methods described herein can be used, for example, to generate at least one specific Packed with liver activin nucleotide sequence or liver activin antibody reagent It can be performed with a diagnostic kit. Such kits include, for example, cell growth And / or may be used conveniently in clinical settings to diagnose patients with abnormalities in differentiation. Can be used.   To detect mutations in the liver activin gene, it is necessary to use Any nucleated cell can be used. Liver activin gene expression or liver In order to detect the cutibin gene product, any expression of the liver activin gene is required. Cell types or tissues (eg, adult liver) can be used.   Nucleic acid-based detection techniques are described in Section 5.4.1 below. Peptide detection The technology is described in Section 5.4.2 below.       5.4.1.Liver activin / inhibin gene and transcript detection   Mutations in the liver activin gene can be detected using a number of methods. any DNA from nucleated cells is the starting point for this type of assay technology. Can be used. DNA is prepared according to standard nucleic acid removal methods well known to those skilled in the art. Can be separated.   DNA contains point mutations, insertions, deletions, and trinucleotide rep. eat expansion.) and chromosome rearrangement (chroaosomal rearrangement) Biological assays to detect abnormalities related to liver activin gene structure, including Can be used in sample hybridization or amplification assays. This kind of a Assays include, but are not limited to, Southern analysis, single-stranded Conformational polymorphism analysis (single stranded conforinational polymorphi smanalysis) (sscp), denaturing gradient gela nalysis) and PCR analysis.   Diagnostic methods for detecting liver activin gene-specific mutations include, for example, Nucleic acids obtained from pull (recombinant DNA molecules, cloned genes or degenerate variants thereof) (Including degenerate variants), eg patient samples or other suitable cells From the source, the recombinant DNA molecule, cloned genetic material, as described in Section 5.1. One or more labeled nucleic acid probes (probes or degenerate variants thereof) These reagents, together with the acid probe), bind to complementary sequences in the liver activin gene. Includes incubation under conditions favorable for specific annealing obtain. These nucleic acid reagents are preferably at least 15 to 30 nucleotides in length. New After incubation, remove all non-annealed nucleic acids Acid: Removed from liver annealing molecular hybrid. Then, hybridize If there are any such nuclear hunts, those molecules will be detected. Such detection One technique is to use nucleic acids from the desired cell type or tissue, for example. For example, solid supports such as membranes or microtiter plates or polystyrene Fix to a plastic surface such as renbeads. In this case, incubate After the non-annealing labeled nucleic acid reagent as described in Section 5.1, Easily removed by cropping. Detection of annealed labeled liver activin nucleic acid reagent , Delayed using standard methods well known to those skilled in the art. Liver activin inheritance Nucleic acid reagent annealed to determine if child mutation is present The structure and / or expression level of the liver activin gene sequence was Can be compared with the annealing pattern predicted from   Liver activin gene-specific nucleic acid in a patient sample or other suitable cell source Another diagnostic method for detecting molecules is to amplify these molecules, for example, by PCR (Mullis, K. et al. B., 1987, an experimental example described in U.S. Pat. No. 4,683,202), and Operation using a method well known to a person. The amplified sequence obtained Is used to determine if a liver activin gene mutation is present, for example, Comparable to standard.   In addition, well-known genotyping operations are performed to Individuals having a tibin gene mutation can also be identified. Such operations are For example, a restriction fragment length with a sequence variation at one of the recognition sites of the specific restriction enzyme to be used. Including the use of polymorphism (RFLP).   Also, improved DNA polymorphisms that can be used to identify liver activin gene mutations A gender analysis method is also disclosed. These methods are uncertain between restriction enzyme sites. Utilizes the presence of short, tandemly repcated DNA sequences . For example, Weber (US Pat. No. 5,075.217, which is incorporated herein by reference in its entirety). ), (DC-dA) n- (dG-dT) n short double-headed repeats Maker. The average separation distance of (dC-dA) n- (dG-dT) n blocks is 30,00 It is estimated at 0-60,000bp. Such closely spaced markers are frequently associated Show co-inheritance, such as mutations in the liver activin gene Confirmation of various gene mutations and diseases and diseases associated with liver activin mutations It is extremely useful for diagnosing diseases and disorders.   Also, Caskey et al. (US Pat. No. 5,364,759, incorporated herein by reference in its entirety). DNA for detecting short tri and tetra nucleotide repeats Describes a profiling assay. This method is intended for DNA Extract the gut activin gene, amplify the extracted DNA and label the repetitive sequence Includes operations to create a genotype map of an individual's DNA.   Liver activin gene expression levels detect and measure liver activin transcription Can also be assayed. For example, mature liver Known or expresses a liver activin gene such as Isolate RNA from cell types or tissues that appear to be It can be tested with the aid of an immobilization or PCR technique. The isolated cells are derived from cell culture or Or directly from the patient. Analysis of cells taken from culture is cell-based In assessing cells to be used as part of gene therapy or May be a necessary step to study the effect of a compound on gene expression . Such assays include activation or inactivation of liver activin gene expression Revealing quantitative and qualitative aspects of liver activin gene expression patterns I can do it.   One specific example of this type of detection method is to synthesize cDNA from the desired RNA (eg, For example, by reverse transcription of an RNA molecule into cDNA). Next, the sequence in the cDNA is subjected to a PCR amplification reaction. As a template for a nucleic acid amplification reaction as described above. Oligos for reverse tiling and nucleic acid amplification The nucleotide primer is selected from the liver activin nucleic acid reagents described in Section 5.1. select. These nucleic acid reagents should be at least 9 to 30 nucleotides in length. preferable. To detect amplification products, radioactive or non-radioactive labeled Can be used to perform nucleic acid amplification. Alternatively, perform a Southern analysis, or Produce using standard ethidium bromide staining or any other suitable nucleic acid staining method Sufficient amplification product to be able to be visualized.   In addition, such a liver activin gene expression assay was used so that nucleic acid purification was unnecessary. B) “in situ”, ie, histological analysis of the patient's tissue obtained by biopsy or resection It can also be performed directly on sections (fixed and / or frozen) You. Oligonucleotides as described in Section 5.1 are used for such in situ procedures. It can be used as a probe and / or primer (eg, Nuovo.G.J., 1992). . “PCR In Situ Bybridization: Protocols And Applications”, Ravcn Press, NY).     Alternatively, if appropriate cells can be obtained in sufficient quantities, Northern analysis can be performed. To determine the level of nRNA expression of the liver activin gene.                   5.4.2Detection of liver activin gene product   A wild-type or mutant liver activin gene product as described in Section 5.3. Or anti-conserved variants or peptide fragments thereof The body may show signs and disorders of cell growth and / or differentiation disorders as described herein. It can also be used as a sign. Such a diagnostic method is based on liver activin gene expression levels. Abnormalities in the liver, or liver activin structure and / or temporal tissue Can be used to detect abnormalities in cells or subcellular locations, It may also be performed in vivo or in vitro, for example, on serum or biopsy tissue. obtain. For example, antibodies against epitopes in the liver activin maturation growth factor region can be found in the body. Vivo to detect distribution and levels of liver activin protein in mice Can be used with Such antibodies can be obtained by methods such as X-ray, CAT scan or MRI. To visualize binding to liver activin expressed in the body It may be labeled with radiopacity or other suitable compound and then injected into the subject. So To facilitate the crossing of the blood-brain barrier and to label liver activin in brain tissue Preferably, a labeled antibody fragment, such as a Fab or minimal antigen binding region Are preferred.   Alternatively, use immunoassays on serum and / or autopsy samples in vitro. Can be used to evaluate hepatic activin expression. Such biopsy and autopsy Assays include various liver activin epitopes, such as the N-terminal signal peptide. Antibodies against epitopes within the propeptide and / or mature growth factor regions Can be used. The use of labeled antibodies is important for the translation, intracellular transport and secretion of liver activin. Can provide useful information about and identify processing deficiencies.   The tissue or cell type to be analyzed is usually liver activin, e.g. Includes those known or suspected to express the gene . The protein separation methods used here include, for example, Harlow and Lane (Harlow.E.a. nd Lane, D., 1988, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). This Is hereby incorporated by reference in its entirety. Separated cells can be used in cell culture or May be from the patient. Analysis of cells harvested from culture is based on cell-based gene For the development of therapeutic protocols or for liver activin gene expression and / or This may be a necessary step to determine the effect of the compound on the activity.   For example, using antibodies or antibody fragments as described in Section 5.3, Determine the presence of the gut activin gene product or its conserved variants or peptide fragments It can be detected quantitatively or qualitatively. This includes, for example, light microscopy or fluorimetry. Immunofluorescence using a fluorescently labeled antibody (immuno-f luorescence).   Antibodies (or fragments thereof) useful in the present invention may further comprise a liver activin gene. For in situ detection of offspring products or their conserved variants or peptide fragments Histology, as in immunofluorescence, immunoelectron microscopy or non-immunoassay Can be used for   In situ detection can be done by screening serum or by histological This can be done by excising a piece and applying thereto a labeled antibody of the invention. Organization For immunological testing, the antibody (or fragment) is transferred to a standard immunohistochemical It is preferably applied by a method. Using this method, the liver activin genetics Presence of offspring products or conserved variants or peptide fragments, or liver to the receptor To examine the distribution of liver activin in the test tissue as well as the binding of activin Can be. Those skilled in the art will recognize that a wide variety of histological methods (eg, Any of the staining methods) can be modified to perform such in situ detection. It will be readily understood that   Immunization of a liver activin gene product or a conservative variant or peptide fragment thereof Immunoassays typically involve biological fluids, tissue extracts, freshly harvested cells or Samples such as cell lysates incubated in cell culture Identify the gut activin gene product or a conservative variant or peptide fragment thereof Incubate in the presence of a detectable labeled antibody that can Detecting bound antibody in any of a number of ways.   The biological sample may be a solid support or carrier, such as nitrocellulose, Or other solids capable of immobilizing cells, cell particles or soluble proteins It may be fixed in contact with a support. The support is then washed with a suitable buffer, It can then be treated with a labeled liver activin antibody. Then the solid support is buffered A second wash can remove unbound antibody. Then binding on a solid support The amount of label can be detected by common methods.   "Solid phase support or carrier" refers to antigen or antigen. Or any support capable of binding the antibody. Well-known support or carrier As glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, dextra Nylon, amylase, natural and modified cellulose, polyacrylamide, Gabbro and magnetite. The carrier is an aqueous ring for the purposes of the present invention. It has the property that it can be either soluble (to some extent) or insoluble. Branch The support material can be substantially any material so long as the bound molecule can bind to the antigen or antibody. It can have a functional structure. For example, the form of the support may be spherical, such as beads, or It may be cylindrical, such as the inside surface of a tester or the outside surface of a rod. Or sea Or a flat surface such as a test strip. Preferred supports are Polystyrene beads. One skilled in the art will recognize that antibodies or other Many suitable carriers will be conceived or will be ascertainable by routine experimentation.   The binding activity of a given lot of liver activin antibody was determined according to known methods. obtain. One skilled in the art will use routine experimentation to determine the operating and optimal assay conditions for each decision. The matter could be decided.   One method by which liver activin antibodies can be detectably labeled is by enzyme enzyme This is because the antibody is conjugated to an enzyme for use in the Munoassay (EIA). (Voller, A., “The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (EUSA)”, 1978, Diagn ostic Horizons 2: 1-7, Microbiological Associates Quarterly Publi-cation, Walkersville, MD); Voller, A. et al., 1978, J. Clin. Pathol.31: 507-520; Butler, J.E ., 1981, Meth.Enzymol.73: 482 ・ 523; Maggio, E. (Ed.), 1980.Enzyme Immunoassay, C RC Press, Boca Raton, FL ,; Ishikawa, E. et al., (Eds.), 1981, Enzyme Immunoassay, Kga. ku Shoin, Tokyo). Enzymes bound to antibodies can be used, for example, for spectrophotometric Or generate chemical moieties that can be detected by visual means A suitable substrate, preferably a chromogenic substrate reacts with substrate). An enzyme that can be used to detectably label the antibody Specific examples include malate dehydrogenase, staphylococcal nucleus Ze, delta-5-steroid isomerase, yeast alcohol dehydrogenase, Alpha glycerophosphate, dehydrogenase, triosephosphate isomer Lase, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, asparagina Enzyme, glucose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease , Urease, catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, Glucoamylase and acetylcholinesterase. Detection is yeast It can be carried out by a colorimetric method using a chromogenic substrate for the element. Detection also works similarly. It can also be performed by a visual comparison of the extent of the enzymatic reaction of the substrate against the standard formed.   Detection may also be performed using any of a variety of other immunoassays. For example, radiolabeling an antibody or antibody fragment allows for radioimmunoassay. It is possible to detect hepatic activin by using a (RIA) (for example, W eintraub, B., Principles of Radioimmunoasays, Seventh Training Course on Ra dioligand Assay Techniqucs, The Endocrine Society, March, 1986, by reference. Incorporated herein). Radioisotope, gamma counter, scintillation meter A means such as a number or phohphoimager, or It can be detected by triradiography.   It is also possible to label the antibody with a fluorescent compound. Fluorescently labeled antibody Upon exposure to long light, its presence can be detected due to fluorescence. Most one Commonly used fluorescent labeling compounds are fluorescein isothiocyanate, Rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin,o− Tardaldehyde and fluorescamine.   Antibodies are<sup>152</sup>Using fluorescent metals such as Eu or other lanthanide-based metals And can be detectably labeled. These metals are Gold such as pentaacetic acid (DTPA) or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) A genus chelating group can be used to attach the antibody.   The antibody is detectably labeled by attaching it to a chemiluminescent compound. You can also. Chemiluminescent-labeled antibodies are used to generate luminescence (luminescence) ) Is determined by detecting the presence of Particularly useful compounds for chemiluminescent labeling Examples include luminol, isoluminol, theromatic Clidinium esters, imidazoles, acridinium salts and oxalates Tell.   Bioluminescent compounds can also be used to label the antibodies of the present invention. Bioluminescence is a catalytic tan A type of chemiluminescence found in biological systems where protein increases the efficiency of the chemiluminescent reaction. It is. The presence of a bioluminescent protein is determined by detecting the presence of luminescence It is. Important bioluminescent compounds for labeling are luciferin, luciferase and And aequorin. 5.5Screening for compounds that modulate hepatic activin expression or activity Surname   The following assays are based on liver activin (including but not limited to the mature growth factor of liver activin). Compounds that interact (eg, bind) with hepatic activin and its Interfering with or Promoting the Interaction of Cognate with Its Cognate Signaling Receptor Regulates the activity of the liver activin gene (ie, the liver activin gene) Modulates the level of expression) or modulates the level of liver activin activity Designed to identify compounds. Liver activin gene regulatory sequence (eg, Compound that can regulate liver activin gene expression Assays that identify may also be used. For example, Platt, K.A., 1994.J-Biol. Chem. 269: See 28558-28562. This is incorporated herein by reference in its entirety).   Non-limiting examples of compounds that may be screened according to the present invention include Pride, antibodies and fragments thereof, as well as propeptides of liver activin Or other organic compounds that bind to the mature growth factor region (eg, peptide analogs (pe ptidomimetics)). Binds to and binds to the natural liver activin receptor "Neutralize", thereby reducing the activity induced by liver activin Mimic (ie, agonist) or triggered by liver agonist Peptides, antibodies or fragments thereof that inhibit activity (ie, antagonists) And other mimics of the mature growth factor region (or part thereof) of liver activin Organic compounds can also be screened according to the present invention.   Such compounds include, but are not limited to, for example, soluble peptides. Any peptide, including but not limited to random peptide libraries (Lam, K.S. et al., 1991, Nature 354: 82-84; Houghten, R. et al., 1991, Nature 354: 84-86). These compounds are D- and / or Or L-configuration amino acids; phosphopeptides (including but not limited to random or Or partially degenerate directed phosphopeptide libraries. example For example, see Songyang, Z. et al., 1993, Cell 72: 767-778); But not polyclonal, monoclonal, humanized, anti-idiotype, Mela or single chain antibody, as well as FAb, F (ab ')<sub>Two</sub>, And FAb expression library fragments , And their epitope-binding fragments); and organic or inorganic small molecules. It can also be found in molecular libraries derived from such combinatorial chemistry.   Binds to liver activin and thereby modulates the expression or activity of liver activin. A number of experimental methods are used to select and detect proteins to be durable. Can include, but are not limited to, protein affinity Affinity chromatography, affinity blotting, immunoprecipitation, cross-linking, Laby protein probing, phage display and two-hybrid Includes library-based methods such as systems. Generally, Phizicky, E. et al. See, et al., 1995, Microbiol. Rev. 59: 94-123. For example, liver activator Two-hybrid system to detect interactions between bins and candidate proteins System can be used. To do this, build an appropriate hybrid and Encodes the candidate protein by testing its activity Genes can be obtained. Interactions are detected using a two-hybrid method If so, a candidate interacting protein or liver activin protein Deletions are made in the encoding DNA to identify the minimal domain of interaction. Ah Alternatively, the available organisms and / or Screening library of activation domain hybrids specific for mammalian tissues Can identify proteins that bind to liver activin Wear. As a result of these screenings, any new proteins identified Also, the cloned gene can be obtained immediately. Besides, Tan Park quality Often multiple clones encoding overlapping regions of The minimal domain of action is readily apparent from initial screening.   Liver activin expression by computer modeling and retrieval techniques Or identification of compounds capable of modulating activity or already identified It is possible to improve the compounds obtained. After identifying such compounds or compositions, The active site or region is identified. These active sites are typically Ligand or receptor, such as the interaction domain of a bin with its signal receptor Scepter binding site. The active site may be, for example, a conceptual amino acid or Can be identified using methods known in the art, including nucleotide sequence comparisons. Wear. Identification by studying complexes of related ligands and receptors Can be. In the latter case, chemical methods or X-rays may be used to find the active site. Crystal analysis methods can be used.   Next, the three-dimensional geometric structure of the active site is determined. It is high resolution and complete Performed by known methods, including X-ray crystallography that can determine molecular structure can do. On the other hand, solid-phase or liquid-phase NMR Can be used. In order to obtain a partial or complete geometric structure, Other experimental methods can be used. This geometric structure can be natural or artificial. It can also be obtained by using complexed ligands or receptors. This increases the accuracy of the determined active site structure.   If the structure is determined with incomplete or insufficient accuracy, complete the structure Method of computer-based numerical modeling to improve or improve its accuracy Can be used. Specific to specific biopolymers such as proteins or nucleic acids Use any recognized modeling method, including generic parameterized models be able to. These models include molecular dynamics models based on calculations of molecular motion. Or a statistical mechanics model based on a thermal ensemble, or a composite model. Big For the model of the part type, the standard molecular force field representing the forces between the constituent atoms and groups is Required, which can be selected from force fields known in physical chemistry. Unfortunate Complete or inaccurate experimental structures are calculated using these modeling methods. Helps to determine the more accurate structure.   Either by experiment, by modeling, or by combining the two Finally, after determining the structure of the active site, together with information on its molecular structure By searching the database containing the compound, An object candidate can be identified. In such a search, the determined active site structure Find compounds with structures that fit and interact with groups that define the active site Is done. These searches can be done manually, but are preferably computer assisted. Use as These compounds found in this search modulate liver activin The compound may be a compound that simulates.   Alternatively, using these methods, for example, follistatin, latent TGF-β binding Synthetic proteins ("LTBP's"), or known moduli such as activin receptors Improved modulation compounds from ligand compounds or ligands or receptors Can be identified. The composition of a known compound, ligand or receptor Experimental and computer modeling as described above, modified and applied to this novel composition Methods can be used to determine the structural impact of the modification. Then, changed Compares the structure to the active site structure of the compound, resulting in a match or interaction Determine if there is any improvement. By this style, such as changing the side chain group, Promptly assess systematic changes in the composition and have improved specificity or activity; Modified compounds, ligands or receptors can be obtained Wear.   Liver activin, accessory proteins, liver activin receptor, and Modulation Based on Identification of the Active Site of Transcription and Related Transduction and Transcription Factors Other experimental and computer modeling methods useful for the identification of objects are within the skill of the art. It will be obvious.   Examples of molecular modeling systems are the CHARMm and QUANTA programs (Polygen Corpor ation, Waltham, MA). CHARMm is an energy minimization and molecular dynamics fan Action. QUANTA performs molecular structure construction, schematic modeling and analysis I do. According to QUANTA, the interactive construction, modification, visualization, and And analysis is possible.   Numerous literature has been published on drugs that interact with specific proteins (Roti, vinen et al. , 1988, Acta Phamaceutical Fennica 97: 159-166; Ripka, New Scientist 54-57 (Ju ne 16, 1988); McKinaly and Rossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29: 1 11-122; Perry and Davies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationshi ps in Drug Design pp.189-193 (Alan R.Liss, Inc. 1989); Lewis and Dean, 1989 Proc. R. Soc. Lond. 236: 125-140 and 141-162), and models for nucleic acid components Compilation of receptors (Askew et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111: 1082-1090). Report on computer modeling. Screen chemicals and diagram Other computer programs include BioDesign, Inc. (Pasadena, CA.), Allelix Inc. (Mississauga, Ontario, Canada) and Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario ). These are inherently specific to a particular protein Designed to be applied to typical drugs, but specific to DNA or RNA regions As long as the region is identified, it can be applied to a practical drug design.   As described above with reference to the design and production of compounds capable of altering binding , A compound that is a liver activin inhibitor or activator, Known compounds, including synthetic chemicals, and biologically active It is also possible to screen libraries.   Compounds identified by assays such as those described herein can be, for example, liver Elucidate the biological function of activin gene products, and Useful for regulating differentiation.   5.5.1 In vitro screening for compounds that bind to liver activin Surname   (Including, but not limited to, the mature growth factor domain of liver activin) Compounds that can interact with (eg, bind to) liver activin An in vitro system can be designed to identify. Compound identified For example, the activity of a wild-type and / or mutant liver activin gene product can be Elucidate or interfere with the biological function of liver activin It is thought to be useful for   As the essence behind assays that identify compounds that bind to liver activin , Conditions under which liver activin and test compounds can interact and bind Prepare a reaction mixture of these two components, thereby forming a complex, It involves detecting and / or purifying this in the reaction mixture. Liver to use The type of gut activin can change depending on the endpoint of the screening assay it can. For example, when searching for agonists of natural liver activin, all Utilize long liver activin or truncated liver activin, for example, as described above be able to.   Screening assays can be performed in various ways. For example, One of the ways to carry out the assay is that the liver activin protein, polypeptide The peptide or fusion protein is immobilized on a solid phase and, at the end of the reaction, immobilized on this solid phase. Those that detect hepatic activin / test compound complexes. These people In one embodiment of the method, the reactive group of liver activin is immobilized on a solid phase and the test compound is Instead of being fixed, they can be labeled directly or indirectly.   In fact, it is convenient to use a microtiter plate as the solid phase. fixed The components are immobilized by non-covalent or covalent bonds. Non-covalent bonds are It can be carried out simply by coating and drying the solid phase surface with a carbonaceous solution. Or immobilization Use an immobilized antibody (preferably a monoclonal antibody) specific for the protein to be Alternatively, the protein may be immobilized on a solid surface. Surfaces should be prepared and maintained in advance. May exist.   To perform the measurement, the non-immobilized component is added to the coated surface containing the fixed component. After the reaction is completed, under conditions such that the complex formed is immobilized on the solid phase surface and remains. Remove unreacted components (eg, by washing). Complex immobilized on solid surface Can be detected in several ways. Not pre-fixed If the components are prelabeled, detection of the label immobilized on the surface will result in complex formation Indicates that it has been performed. Do not prelabel components that have not been previously immobilized In some cases, indirect labels can be used to detect complexes immobilized on the surface. For example, using a labeled antibody specific for a component that has not been immobilized beforehand (The antibody may then be directly or intermediary with a labeled anti-Ig antibody. Indirectly labeled).   Alternatively, the reaction is performed in the liquid phase, the reaction products are separated from unreacted components, and For example, liver activin protein, polypeptide, derivative or fusion protein, Or test compound specific immobilization to immobilize complexes formed in solution Immobilized using labeled antibodies specific for the antibody, and other components of the possible complex Complex can be detected. 5.6Liver activin antibodies, antagonists, agonists or gene products Method of treating and regulating cell proliferation and / or differentiation by use   The present invention relates to the regulation of cell proliferation and / or differentiation, and / or And / or compositions and methods for the treatment of differentiating disorders.   Any method of neutralizing or enhancing hepatic activin activity may involve cell proliferation and / or Or can be used to regulate differentiation.   For example, soluble peptides that bind and “neutralize” circulating liver activin Antibodies, proteins, fusion proteins, or antibodies (including anti-idiotype antibodies) Can be administered to regulate cell proliferation and / or differentiation. For this , A peptide corresponding to the extracellular domain of the liver activin receptor, liver activin Mutants of polypeptides or derivatives, mutants of liver activin Or to another polypeptide (eg, an IgFc antibody) One or more fused liver activin domains can be used . Alternatively, anti-idiota that mimic liver activin and bind to activin receptors An Fab fragment of an ip antibody or an anti-idiotype antibody can be used (see See Section 5.3). Such liver activin proteins, polypeptides Peptide, derivative, fusion protein, anti-idiotype antibody or Fab Tested in an amount sufficient to neutralize the interaction between activin and liver activin receptor Administered to the body.   For example, the amino acid residue numbers from about 21 to about 236 shown in FIG.<sub>C</sub>Amino acids The sequence, amino acid residue numbers from about 22 to about 236 shown in FIG.<sub>E</sub>Amino acid sequence of Use liver activin peptide corresponding to the propeptide domain 5 or from amino acid residue number about 18 to about 236 in FIG.<sub>E</sub>of A Those having a amino acid sequence may be used. Or, for example, amino acid residue number 1 from about 237 to about 354 in FIG.<sub>C</sub>Amino acid sequence or amino acid residue The numbers β shown in FIG.<sub>E</sub>The amino acid sequence of The β shown in FIG. 5 from residue number 237 to about 350<sub>E</sub>Having the amino acid sequence of A liver activin peptide corresponding to the mature growth factor domain may be used. In addition, all of the propeptide and / or mature growth factor domains Liver activin deletion mutants, or partially deleted, may be used. liver All of the extracellular domains of the liver activin receptor and of the liver activin receptor. Alternatively, a soluble or binding polypeptide containing a portion may be used. Liver acupuncture Tivin protein, polypeptide or derivative, and liver activin receptor The protein or polypeptide may also be used to increase stability and / or Fused to a heterologous protein to increase or decrease liver activin activity Is also good.   The cell growth and / or differentiation process regulated according to the method of the invention Blood, erythroid differentiation, follicle maturation, pituitary growth hormone and adrenal stimulating hormone secretion Hypothalamic oxytocin secretion, lymphocyte proliferation, neuronal survival, spermatogenesis, bone Growth and formation, hepatocyte DNA synthesis, pancreatic insulin secretion, somatostatin induction There are cardiac morphogenesis, megakaryocyte differentiation, and induction of mesoderm in early embryonic development. It is not limited to these. 5.6.1By the use of liver activin gene product antibodies or antagonists Methods for treating, regenerating, and growing liver tissue   Neutralizes liver activin or inhibits liver activin gene expression Any method can be used to enhance the growth or regeneration of liver tissue. Various situations Liver activin antibodies and liver antigens to enhance the growth or regeneration of liver tissue in Cutibin gene product antagonists can be used. In some cases, the patient's liver May be injured (but can be repaired). For example (but not limited to I), excessive consumption of alcohol leads to cirrhosis. Stopping alcohol consumption Can stop hepatocyte destruction, but recovery requires liver regeneration. So In such cases, the natural regenerative process may be impaired due to excessive liver damage. When There is. In any case, liver activin antibodies or liver activin product Treating a patient with the pharmaceutical composition described below in Section 5.8, including a gonist, results in regeneration Will be enhanced, and thus the recovery rate will be faster.   In some cases, treatment may require transplantation of all or part of the donor's liver. There is also. Liver activin antibody and / or liver activin gene product By administering the pharmaceutical composition described in Section 5.8 below, including a gonist, Regeneration of both living donor and recipient livers during such transplantation treatment Will be promoted.   In other situations, for example, artificial livers manufactured according to the methods described below can be used to treat liver disease. It may be transplanted into patients who have it. Have not achieved normal liver biological performance At an early stage, transplanting such an artificial liver may be sufficient and necessary. To increase the performance of such implants, liver activin antibodies and / or Is a drug described in Section 5.8 below, which includes a liver activin gene product antagonist. By administering the agent composition, the growth rate can be increased.   If the patient's natural liver is injured or diseased, It may be left alone or partially removed, but may not be Or assistance from liver tissue transplanted from a donor. In such a case, Use of a pharmaceutical composition comprising an antibody or a liver activin gene product antagonist Can enhance the growth of the patient's natural and transplanted liver tissue it can.   In vitro liver tissue cultures have many uses. Liver injury or disease In treating patients, for example, by direct transplantation or as part of an extracorporeal liver device Liver tissue culture can be used to support or replace natural liver You. The ability to regenerate liver tissue cultures is based on transgenic mice developed by Rhim et al. System (1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4942-4946). Good. In such a system, hepatocytes are transferred into the diseased liver of the transgenic animal. It is planted and its replication ability is evaluated.   In addition, such liver tissue cultures can be used to test the toxicity of drugs and other compounds. Can function as a model.   Functional in vitro liver tissue is described, for example, in US Pat. No. 5,266,480 (which The three-dimensional tissue culture system described herein (incorporated herein in its entirety) And without limitation). According to this system, hepatocytes Conventional method (Berry and Friend, 1969, J. Cell Biol. 43: 506-520). Briefly, Cannulate portal vein or portal vein, contains calcium or magnesium Perfuse the liver with no buffer until the tissue becomes pale. Next, the collagenase solution The organ is perfused at an appropriate flow rate using such a proteolytic enzyme. This allows The connective tissue framework is digested. Then wash the liver with buffer and disperse the cells Let it. Filter cell suspension through 70 μm nylon mesh to remove debris . Hepatocytes may be selected from the cell suspension by two or three differential centrifugations. No.   HEPES buffer may be used for perfusion of each lobe of the excised human liver. H Perfusion of collagenase in EPES buffer is performed at a rate of about 30 ml / min. 37 ° C By further incubating with collagenase for 15-20 minutes at A single cell suspension is obtained (Guguen-Guillouzo and Gulllouzo eds., 1986, "Isolation And cultured hepatocytes ", Paris, INSERM, and London, John Libbey Eurotext, pp. 1-12; 19: 82, Cell Biol. Int. Rep. 6: 625-628).   The isolated hepatocytes are then used to inoculate the three-dimensional stroma. Inoculated The stroma is a system that is comparable to physiological conditions and is used to replicate hepatocytes in vitro. As described for bone marrow and skin according to the teachings of US Patent No. 5,266,480 Can be cultured. In addition, three-dimensional liver cultures or otherwise grown The growth rate and growth of the exposed liver tissue cultures was determined by adding liver activin antibody and And / or may be enhanced by the addition of a gene product antagonist. to this Thus, the functional expression by hepatocytes increases. 5.6.2Stimulation of hematopoiesis by use of liver activin gene product   Any method of increasing hepatic activin levels and / or activity will stimulate hematopoiesis. Can be used to intensify. By these methods, the method described in Section 5.1 The liver activin gene and nucleotide sequence and the tag described in Section 5.2 above. Proteins, polypeptides, and derivatives may be used to stimulate hematopoiesis.   In the present invention, the hepatic activin composition described herein, the hematopoietin therapy A treatment that increases the concentration of blood cells, such as a method. In a specific example, the present specification The liver activin composition described in the document is intended to assist the oxygen carrying capacity of blood Used in erythropoietin therapy. Liver activators within the scope of the invention Therapy treatment is commonly used for patients with trauma, surgery, and dialysis. Patients in need of blood and the first of hemophilia, cystic fibrosis, pregnancy, irregular menstruation, premature birth Affects blood components such as premature anemia, spinal cord injury, spaceflight, aging, and various neoplastic conditions Including but not limited to patients with the given disease. Helping blood carry oxygen Examples of patient conditions that require and are within the scope of the present invention include low levels of vertebrate erythropoiesis. Lower or defective, anemia associated with chronic renal failure, stimulation of red blood cell response, increased iron kinetics (E.g., plasma iron turnover and bone marrow transit time effects), changes in red blood cell Including stimulation of moglobin C synthesis and increased hematocrit levels It is not limited to. The invention also relates to the acidity of an individual, such as an individual in a low oxygen environment. Provide treatment for enhancing elementary transport capacity.   The present invention also provides a liver activin composition as described in Sections 5.1 and 5.2 and other agents. Includes combinations with advocated or conventional hematopoietic therapies. For example, liver Cutibin is a compound that alone has a hematopoietic stimulating effect (eg, erythropoietin, te) Stosterone, progenitor cell stimulant, insulin-like growth factor, prostaglandin , Serotonin, cyclic AMP, prolactin, and triiodothyronine ) Can be combined. It is also commonly used to treat aplastic anemia. Compounds used (eg methenolene, stanozolol and nandrolone); iron Compounds commonly used to treat deficiency anemia (eg, iron preparations); Compounds commonly used to treat anemia (e.g., vitamin B<sub>12</sub>and And / or folic acid); and compounds commonly used to treat hemolytic anemia ( For example, combinations with corticosteroids such as corticoids) are also included in the present invention. It is. See, eg, Resegotti et al., 1981, Panminerva Medica, 23: 243-248; Kurtz, 1 982, FEBS Letters, 14a: 105-108; McGonigle et al., 1984, Kidney Int., 25: 437-4. 44; and Pavlovic-Kantera, 1980, Expt. Hematol., 8 (supp. 8) 283-291 Please refer to.   Compounds that enhance or synergize with the effects of erythropoietin are also , Useful herein as an adjuvant, an adrenergic agonist, Thyroid hormones, androgens, hepatic hematopoietic factors, erythrotropin, and erythr Include, but are not limited to, logenin. For example, Dunn, "Recent thoughts on hematopoiesis ", John Wiley and Sons (Chichester , England, 1983); Weiland et al., 1982, Blut, 44: 173-175; Kalmani, 1982, Kidn. ey Int., 22: 383-391; Shahidi, 1973, New Eng. J. Med., 289: 72-80; Urabe et al. 1979, J.M. Exp. Med., 149: 1314-1325; Billat et al., 1982, Expt. Hematol., 10: 133-140; Naughton et al., 1983, Acta Haemat, 69: 171-179; Cognote et al., Abstract 364. Proceedings 7th Intl. Cong. of Endocrinology (Quebec City, Quebec, July  1-7, 1984); and Rothman et al., 1982, J. Am. Surg. Oncol., 20: 105-108. I want to be.   Methods of stimulating hematopoiesis include the use of hematopoietically effective amounts (ie, blood (An amount that produces liquid cells) to the patient. Liver acti Bottles may be administered in any suitable manner (parenteral, sublingual, topical, pulmonary, and intranasal, and Including but not limited to the methods described in Section 5.8). Is done. The pharmaceutical composition comprises erythropoietin, testosterone, a progenitor cell stimulant , Insulin-like growth factor, prostaglandin, serotonin, cyclic AM P, prolactin, triiodothyronine, methenolene, stanozolol, and Nandrolone, iron preparation, vitamin B<sub>12</sub>, Folic acid and / or corticosteroids Optionally, it contains one or more members of the group consisting of:   Liver activin and concomitant medications will depend on Suitable for administration by another route or by the same route and at the same or different time It is. 5.6.3Method for stimulating bone growth using liver activin gene product   Any method of increasing hepatic activin concentration and / or activity includes bone growth ( That is, it can be used to enhance bone mass). Such an approach Is a weakening of bone, such as osteoporosis, osteomalacia, and age-related loss of bone mass Can be used to treat fractures, abnormalities, and disorders that cause Book In the invention, bone growth is controlled by an osteogenically effective amount (ie, mature bone formation). And a growth-inducing amount) in a hepatic activin pharmaceutical composition topically and / or Can be enhanced by systemic administration.   The composition of the present invention as described in sections 5.1 and 5.2 above, wherein the composition has an osteogenically effective amount. Other bone growth promoting compounds (beta transforming growth factor (“TGF-β” (For example, TGF-β 1, -2, -3, protein, polypeptide, derivative ( And / or homologous proteins thereof), and / or bone morphogenic tamper Substrate ("BMP") (e.g., BMP-, -2, -3, -4, -5, -6, or -7 proteins, polypeptides and their homologous proteins) and / or bone Forming proteins (including their polypeptides and homologous proteins), and / or Or it may contain parathyroid hormone. BMP and TGF-β are Prepared by known methods (e.g., PCT / US87 / 01537 and 4,774,322 Please refer to. These are incorporated herein by reference in their entirety). is there Alternatively, commercially available TGF-β is available (R & D Systems, Minneapolis, Minneapolis Sota).   In another embodiment, the liver activin composition of the present invention comprises another therapeutic agent. (For example, in the case of osteoporosis, fluoride, calcitonin, vitamin D metabolite , Estrogens, and parathyroid hormone).   A method of inducing local bone growth involves the use of an osteogenically effective amount of hepatic activin in TG. Optionally in combination with F-β, BMP, bone marrow, or proteins extracted therefrom, Includes methods of administration in a pharmaceutically acceptable carrier.   One embodiment of the present invention is directed to TGF-β, BMP, bone marrow, or An osteogenically effective amount of liver activin, including the extracted protein, is administered Inducing systemic bone growth, comprising administering in a pharmaceutically acceptable carrier Law.   Another embodiment is to administer an effective amount of TGF-β and BMP first, and then an effective amount of There is provided a method of regulating bone growth comprising administering activin. Soft Preferably, a combination of BMP and TGF-β is administered locally to induce endosteal bone growth. To induce cartilage modeling. Next, activin is administered subcutaneously. And / or systemically administered to achieve mature bone formation and TGF-β and BMP Induced cartilage model differentiation. According to this method, activin is It will enhance mineralization of endochondral bone. The amount of mature bone formed by this method Is TGF-β, BMP, liver activin alone, or a combination of BMP and TGF-β Or the amount of mature bone formed by the combination of liver activin and BMP There will be many.   Another non-limiting method of regulating bone growth and maturation is the use of an osteogenically effective amount of Bins to TGF-β, BMP, and / or bone marrow or tan extracted therefrom. Locally administered with protein to induce bone growth, then an osteogenically effective amount of liver Administering visceral activin systemically. 5.7Liver activin activity by affecting liver activin gene expression Sex control and / or treatment of liver disease   Any that inhibits or activates the expression (transcription or translation) of the liver activin gene The method of cell proliferation and / or differentiation affected by the liver activin gene. It can be used to regulate chelating activity. In the method described below, Proliferative and / or differentiating diseases are treated with the nucleic acid sequences according to section 5.1 above. Is done.   In some cases, increased liver activin activity is due to the mechanism by which liver activin is localized (Eg, stimulation of liver regeneration and / or bone growth). Sa In addition, some cell proliferation and / or differentiation disorders can occur, at least in part, in the liver. Caused by a lack or decrease in activin gene expression levels. Therefore, Elevated levels of gene expression will result in a reduction in the symptoms associated with this disease U. A method for increasing the expression level of the liver activin gene is described in 5.7. This will be discussed in Section 1.   In some cases, reduced levels and / or activity of hepatic activin gene products Reduce or prevent the inhibitory effect of liver activin, and It may be preferable to reduce the bin gene product. Liver activin gene Methods for reducing expression levels are discussed in Section 5.7.2 below.         5.7.1Restoring or increasing expression or activity of liver activin   Normal liver activin gene expression and / or activity of liver activin gene product Regulation of cell growth and / or differentiation and / or Uses liver activin nucleic acid sequences to treat abnormal cell growth and / or differentiation it can. The treatment can be performed, for example, in the form of gene replacement therapy. In particular Normal liver activator, which commands the production of a liver function activin gene product that exhibits normal function. Limiting one or more copies of the tibin gene or a portion of the liver activin gene Adenovirus, adeno-associated virus, retrovirus, And herpesvirus vectors, plus liposomes And other particles that transfer DNA into cells, such as gene activation matrices Can be used to insert into appropriate cells in a patient or animal subject. Gene activation Methods for introducing nucleic acids into mammalian repair cells using a matrix were described in April 1996. It is described in further detail in U.S. application Ser. All are incorporated herein by reference.   Because the liver activin gene is expressed in the liver, such gene replacement therapy The technology should be able to deliver liver activin gene sequences to cells in this tissue of the patient Or, alternatively, a cell site where the liver activin gene sequence is expressed Should include direct administration of such hepatic activin gene sequences. Alternative Defective endogenous hepatic activin inheritance in appropriate tissues, such as the liver To correct the offspring, targeted homologous recombination can be utilized.   Overall level of liver activin gene expression and / or liver activin activity Additional methods that can be used to increase cell growth include cell growth and / or Proper liver activin-expressing cells in sufficient numbers and sites to reverse the symptoms of dysplasia , Preferably the introduction of autologous cells into the patient. Such cells may be recombinant or non-recombinant. Any of recombinant cells may be used. Of hepatic activin gene expression in patients Cells that can be administered to increase overall levels should have the liver activin gene It is a normal cell that expresses. The cells can be found in anatomical sites in the liver or in the body. Can be administered as part of a tissue graft located at a particular site. Based on such cells Gene therapy techniques are well known to those skilled in the art and are described, for example, in Anderson et al., US Pat. See Mulligan & Wilson, U.S. Patent No. 5,460,959.           5.7.2Methods for reducing hepatic activin expression or activity   Using molecules derived from the sequences described in section 5.1 above, the liver activin gene Various techniques can be used to reduce or inhibit expression. Endogenous liver Levels of tibin gene expression, for example, inhibit translation of liver activin mRNA transcripts. Antisense or ribozyme approach to harm or block, liver activator Triple helix approach to inhibit transcription of bin genes; or liver activators Inactivates or “knocks out” the gene or its endogenous promoter. Can be reduced using targeted homologous recombination. Not limited However, for example, adenovirus, adeno-associated virus, retrovirus and Pesvirus vectors, plus liposomes and gene-activated matrices Using other particles to introduce the nucleic acid into the cell, such as One or more copies can be inserted into appropriate cells in a patient or animal subject.   Because the hepatic activin gene is expressed in the adult liver, delivery techniques are preferred. Or should be designed to target this tissue. Alternatively, for example, The site containing the target cells, such as human liver, may be ligated with the antisense, ribozyme described herein. Or a DNA construct may be administered directly.   Antisense approaches include oligonucleotides complementary to liver activin mRNA. The design of the tide (either DNA or RNA) is included. Antisense oligonuclease Otides bind complementarily to liver activin mRNA transcripts and prevent translation. absolute High complementarity is preferred but not required. Referred to herein A sequence that is “complementary” to a portion of RNA is a stable, hybridizable, A sequence having sufficient complementarity to form a main strand is meant. Double-stranded antisense nucleus In the case of acids, the single strand of the double DNA is thus tested, or triple formation is analyzed. May be. The ability to hybridize depends on the degree of complementarity and the antisense nucleic acid. Will depend on both. Generally, the longer the hybridizing nucleic acid There are many mismatches of bases that may be contained in RNA, and yet stable double-stranded Form (or, in some cases, triplex). If you are skilled in the art, Using standard methods to determine the melting point of the hybridized complex, The degree of durability of the mismatch can be ascertained.   5 'end of message, e.g. up to 5' untranslated sequence and including AUG start codon Oligonucleotides complementary to the ends should work most effectively at inhibiting translation. is there. However, sequences that are complementary to the 3 'untranslated sequence of the mRNA may also cause translation of the mRNA. It has recently been shown to be effective in inhibiting. In general, Wagner, R., 1994, N See ature 372: 333-335. Thus, 5'- or 3'-untranslated-liver activators Oligonucleotides complementary to any of the non-coding regions of the Used in an antisense approach to inhibit translation of causative liver activin mRNA Can be Oligonucleotides that are complementary to the 5 'untranslated region of the mRNA Should include the complement of the start codon. Antisense complementary to mRNA coding region Although oligonucleotides are not very effective as translation inhibitors, It can be used in the present invention. 5'-, 3'- or liver activin mRNA Whether designed to hybridize to either of the loading regions, The antisense nucleic acid is at least 6 nucleotides in length, preferably from 6 to about 50 nucleotides. The oligonucleotide should be in the range of nucleotide length. In certain aspects Oligonucleotides have at least 10 nucleotides and at least 17 nucleotides. Leotide, at least 25 nucleotides, or at least 50 nucleotides .   Regardless of the choice of target sequence, antisense oligonucleotide gene expression Preferably an in vitro test is first performed to quantify the ability to inhibit . In these studies, antisense gene inhibition and oligonucleotide Preferably, a control is used to distinguish non-specific biological effects. this In these studies, the level of target RNA or protein is also measured using internal control RNA or Or that of the protein. In addition to this, antisense Using the results obtained with the oligonucleotide and the control oligonucleotide It is planned to compare the results obtained. Control oligonucleotides are Approximately the same length as the test oligonucleotide and the oligonucleotide Preferably, the nucleotide sequence is different from the antisense sequence, but also like the target sequence. It must interfere with certain hybridizations.   The oligonucleotide may be DNA or RNA or a chimeric mixture or derivative. Or their modifications, single-stranded or double-stranded. Oligonucleotides A base moiety to improve, for example, molecular stability, hybridization, etc. The sugar moiety or phosphate backbone can be modified. Oligonucleotides also , Peptides (eg, for targeting host cells in vivo): Agents that facilitate (e.g., Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6). 556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652; PCT Publication No.WO88 / 09810. , Published December 15, 1988); or the blood-brain barrier (see, eg, PCT Publication No. WO 89/10134). No., published April 25, 1988); a hybridization-inducing splitting agent (eg, K rol et al., 1988, BioTechniques 6: 958-976): and insertion agents (eg, Zon, 1 988, Pharm. Res. 5: 539-549). No.   Antisense oligonucleotides include, but are not limited to, 5-fluorouranium. Lacil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxane Tin, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxymethyl) ura Sil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethyl Aminomethyluracil, dihydrouracil, beta-D-galactosyl eosin , Inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methylguanine, 1-methylinosi 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, 3-methylcysteine Tosin, 5-methylcytosine, N6-adenine, 7-methylguanine, 5-methylamino Methyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-mannosi Luqueosin, 5'-methoxycarboxymethyluracil, 5-methoxyuracil, 2 -Methylthio-N6-isopentenyl adenine, uracil-5-oxyacetic acid (V), wives Toxosin (wybutoxosine), pseudouracil, queosin, 2-thiocytosine, Tyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, Uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil-5-oxyacetic acid (V), 5-methyl- 2-thiouracil, 3- (3-amino-3-N-2-carboxypropyl) uracil, (acp3) w, And at least one modified base selected from the group comprising 2,6-diaminopurine Part I mean.   Antisense oligonucleotides also include, but are not limited to, Arabic From the group containing North, 2-Fluoroarabinose, Xylulose and Bexose Optionally, it may include at least one modified sugar moiety.   Further, in another embodiment, the antisense oligonucleotide comprises: Phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoramidothioate, phos Foramidate, phosphordiamidate, methylphosphonate, alkylphospho Select from the group consisting of triesters and formacetals or their analogs May comprise at least one modified phosphate backbone.   Further, in another embodiment, the antisense oligonucleotide comprises α -An anomeric oligonucleotide. α-anomeric oligonucleotides are complementary Forms a specific double-stranded hybrid with the target RNA, which In contrast, the chains are parallel to each other (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:66 25-6641). The oligonucleotide is a 2'-O-methyl ribonucleotide (Inoue et al. , 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148), or chimeric RNA-DNA analogs (Inoue 1987, FEBS Lett. 215: 327-330).   Oligonucleotides of the present invention, for example, an automatic DNA synthesizer (Biosearch, Applied B (as commercially available from iosystems) using standard methods in the art. Can be combined. As an example, phosphorothioate oligonucleotides are available from Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209) and methylphosphone Plate oligonucleotides may be prepared using controlled-porosity glass polymer supports. (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 7448-7451) and others.   Antisense nucleotides complementary to the coding region sequence of liver activin Can be used, but antisense nucleotides complementary to the transcribed untranslated region are Is also preferred. For example, according to the present invention, an antisense oligo having the following sequence Nucleotides can be used: a) Complementary to nucleotides 134 to 151 of FIG. b) Complementary to nucleotides 129 to 151 of FIG. c) Complementary to nucleotides 123 to 151 of FIG. d) Complementary to nucleotides 117-151 of FIG. e) Complementary to nucleotides 120 to 148 of FIG. f) Complementary to nucleotides 120 to 142 of FIG. g) Complementary to nucleotides 120 to 136 of FIG. h) Complementary to nucleotides 202 to 218 in FIG. i) Complementary to nucleotides 196-218 of FIG. j) Complementary to nucleotides 190-218 of FIG. k) Complementary to nucleotides 184 to 218 of FIG.l) Complementary to nucleotides 187-221 of FIG. m) is complementary to nucleotides 187-215 of FIG. n) Complementary to nucleotides 187-209 of FIG. o) Complementary to nucleotides 187-203 of FIG. p) Complementary to nucleotides 187-197 of FIG. q) is complementary to nucleotides 60-78 of FIG. r) Complementary to nucleotides 55-78 of FIG. s) Complementary to nucleotides 49-78 of FIG. t) Complementary to nucleotides 43-78 of FIG. u) is complementary to nucleotides 47-75 of FIG.v) Complementary to nucleotides 44-71 of FIG. w) Complementary to nucleotides 4 to 68 in FIG.   Antisense molecules can be used to express cells that express liver activin in vivo, such as liver Should be delivered to the cells. For example, direct antisense molecules to tissue sites Modified antisense designed to inject or target cells of interest Molecules (eg, antisense linked to a peptide, or specifically bound to a receptor) Antibody or antigen expressed on the target cell surface) can be administered systematically Many methods have been developed to deliver antisense DNA or RNA to cells, such as I have been.   Intracellular concentration of antisense should be sufficient to suppress translation of endogenous mRNA. And is often difficult. Therefore, it contains antisense oligonucleotides The structure of the recombinant DNA placed under the control of a strong pol III or pol II promoter. A method using a building is desirable. To transfect patient target cells Using such constructs, complementary base pairing with endogenous liver activin transcripts is achieved. Sufficient single-stranded RNA to form, thereby preventing translation of liver activin mRNA Make a transcription. For example, a vector can be introduced in vivo, and Uptake of antisense RNA Order a copy. It can be transcribed to produce the desired antisense RNA As long as such vectors maintain episomal or integrate chromosomally Become like Such vectors are constructed using recombinant DNA techniques common in the art. It is possible to build. Vectors can be plasmids, viruses, or It may be other known in the field and is used for replication and expression in mammalian cells. Can be. Expression of sequences encoding antisense RNA is known in the art. With such a promoter, it takes place in mammalian, preferably human cells. Or Such promoters are inducible or constitutive. Such promoters are: SV40 early promoter region (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310) , Included in the 3 'long terminal repeat of Roussa Lrooma virus Promoter (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797), herpes thymidine quina Ase promoter (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445), Regulatory sequences of the metallothionein gene (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42) Including, but not limited to. Plasmid, cosmid, YAC or virus vector Introducing any type of protein directly into a tissue site, such as the liver Can be used to prepare recombinant DNA constructs that can be used. Alternatively, select Alternatively, a viral vector that infects the target tissue can be used (e.g., (For example, use the herpes virus for the brain), in which case administration may be by another route (eg, (If systematically).   Ribozyme components designed to catalytically cleave liver activin mRNA transcripts Offspring also interfere with the translation of liver activin mRNA and the expression of liver activin. ( See, for example, PCT International Publication WO 90113113, published October 4, 1990; Sarver et al., 1990, Science 24. 7: 1222-1225). Liver ribozyme that cleaves mRNA with specific recognition sequence Can be used to destroy gut activin mRNA It is preferred to use an im. Hammerhead ribozyme complements target mRNA MRNA at the commanded position by flanking the target base pairing region Disconnect. The only requirement is that the target mRNA has a sequence of 2 bases or 5'-UG-3 '. It is to be. hammer The construction and production of head ribozymes is well known in the art and loff and Gerlach, 1988, Nature, 334: 585-591. For example, mouse β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Hammerhead ribozyme in the nucleotide sequence of Are 110 or more and 80 or more, respectively (FIGS. 1 and 2). Preferably Manipulates the ribozyme to place a cleavage recognition site near the 5 'end of liver activin mRNA. In the cell, i.e. to increase efficiency and to accumulate non-functional mRNA transcripts in the cell To a minimum.   For example, a hammerhead ribozyme having the sequence Can be a) Cut between nucleotides 117 and 118 in FIG. b) cut between nucleotides 148 and 149 of FIG. c) cut between nucleotides 175 and 176 in FIG. d) cut between nucleotides 526 and 527 in FIG. e) Cut between nucleotides 742 and 743 in FIG. f) cut between nucleotides 169 and 170 in FIG.g) cut between nucleotides 208 and 209 in FIG. h) cut between nucleotides 238 and 239 in FIG. i) cut between nucleotides 289 and 290 in FIG. 2 j) cut between nucleotides 989 and 990 in FIG. k) cut between nucleotides 1206 and 1207 in FIG. l) cut between nucleotides 75 and 76 in FIG.m) cut between nucleotides 88 and 89 in FIG. n) cut between nucleotides 123 and 124 in FIG. o) cut between nucleotides 139 and 140 in FIG. p) Cleaves between nucleotides 158 and 159 in FIG.   The ribozyme of the present inventionTetrahmena thermophila (Known as IVS or L-19 IVS RNA), Thomas Cech and Described in more detail by co-workers (Zaug et al., 1984, Science, 224: 574-578; Zaug And Cech, 1986, Science, 231: 470-475; Zaug et al., 1986, Nature, 324: 429-433, Univ. International Patent Application No. 88/04300, published by ersity Patent Inc .; Been and Cech 1986, Cell, 47: 107-216) Such RNA endoribonucleases are also included. Cech-type ribozymes are It has an eight base pair active site that hybridizes to the target RNA sequence, Cause disconnection. The present invention relates to an 8-base pair active site sequence present in liver activin RNA. Includes those Cech-type ribozymes targeted to rows.   As in the antisense method, ribozymes consist of modified oligonucleotides. (E.g., for improved stability, targeting, etc.) It should be delivered to cells expressing the bin. The preferred method of delivery is strong Encode a ribozyme under the control of the adult pol III or pol II promoter Using the DNA construct, thereby transfecting Cells break down endogenous liver activin messages and produce ribozymes that inhibit translation Will produce enough. Ribozymes, unlike antisense molecules, are catalytic However, lower intracellular concentrations are required for efficiency.   Endogenous hepatic activin gene expression also results in targeted homologous recombination (targeted homologous recombination). us recombination) using the liver activin gene or its promoter. It can be reduced by inactivation or "knocking out". (For example, Smithies et al., 1985, Nature 317, all of which are incorporated herein by reference. : 230-234; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503-512; Thompsen et al., 1989 Cell. 5: 313-321). For example, the endogenous liver activin gene (liver DNA homologous to either the coding or regulatory regions of the activin gene Non-functional liver activin mutant (or complementary unrelated DNA) Sequence) with or without a selectable and / or negative selectable marker Transfecting cells that express liver activin in vivo Can be. Insertion of the DNA construct allows for hepatic activin Causes inactivation of offspring. Such a method, in particular, using modifications to ES (embryonic stem) cells, Inactive liver activin (eg, Thomas & Capecchi 1987 and Thompson, supra) Suitable for agriculture, capable of generating animal progeny with (see 1989) ing. However, this method can be adapted for human use Recombinant DNA constructs can be placed at the required site in vivo using an appropriate viral vector. Direct throw Given or targeted.   Alternatively, endogenous hepatic activin gene expression can For example, in the regulatory region of the liver activin promoter and / or enhancer) Reduced by targeting complementary deoxyribonucleotide sequences Form a triple helix structure that blocks liver activin gene transcription in target cells in the body. (Usually Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des., 6 (6): 569-84; Helene, C. et al. Sci., 660: 27-36; and Maher, L.J., 1992, Bioassays 14 (12). : 807-15).   In yet another embodiment of the present invention, wherein the activity of liver activin is "dominant" It can be reduced using "dominant negative". Because of this, end All or part of the oritic (endoproteolytic) motif and / or Encodes a defective liver activin, such as a mutant lacking the mature growth factor domain Construct that reduces hepatic activin activity in appropriate target cells Can be used in child therapy. For example, the peptide domain, endoproteolite Motifs and / or all or part of the mature growth factor domain Nucleotide sequences directing host cell expression of deleted or missing liver activin Can be introduced into cells of the liver (as described in the in vivo or ex vivo gene therapy method). By either). Alternatively, such deletions or modifications can be made using targeted homologous recombination. The difference can be introduced into the endogenous liver activin gene of the subject's liver. operation The isolated cells are non-functional liver activin (ie, capable of binding but not signal Is a ligand that cannot induce signal transduction) Will manifest.                       5.8Pharmaceutical formulations and administration methods   Liver activin protein and polypeptide, and liver activin inheritance A compound that affects expression of a gene or gene product activity is administered to a patient at a therapeutically effective dose. To regulate, treat or ameliorate cell growth and / or differentiation disorders. Wear. A therapeutically effective dose refers to the regulation of symptoms of cell growth and / or differentiation disorders and And / or an amount of a compound that is sufficient to improve.                              5.8.1 Effective dose   The toxicity and therapeutic efficacy of such compounds are, for example, LD<sub>50</sub>(50% of the population Death dose) and ED<sub>50</sub>(Therapeutically effective dose in 50% of the population) Can be determined by standard pharmaceutical techniques in cell culture or laboratory animals. toxicity The dose ratio between action and therapeutic action is the therapeutic index, which is LD<sub>50</sub>/ ED<sub>50</sub>Show by ratio Can be. Compounds that exhibit high therapeutic indices are preferred. Compounds with toxic side effects May be used, but should be affected to minimize the potential for damage to uninfected cells. Pay attention to the design of delivery systems that target such compounds to affected tissue sites Should be done, thereby reducing side effects.   Data from cell culture assays and animal studies are used in human dosage ranges. Can be used to prescribe an enclosure. The dose of such compounds should be minimally toxic, Or no ED<sub>50</sub>Is preferably in the range of the circulating concentration containing This dose is It may vary within this range depending on the dosage form employed and the route of administration utilized. Book For any compound used in the method of the invention, the therapeutically effective dose is first determined Can be evaluated from a cell culture assay. Formulate doses in animal models and determine in cell culture IC<sub>50</sub>(Ie, the concentration of test compound that achieves half-maximal inhibition of symptoms) A circulating plasma concentration range that includes may be achieved. Using such information, humans Useful doses can be more accurately determined. Plasma levels, for example, The performance may be measured by liquid chromatography.                          5.8.2 Formulation and use   Pharmaceutical compositions for use according to the invention may comprise one or more physiologically acceptable carriers. Alternatively, they may be formulated in a conventional manner using excipients.   Thus, the compounds and their physiologically acceptable salts and solvates are: Inhalation or infusion (either through the buccal or nasal cavity), orally, buccally, non- It may be formulated for administration by oral or rectal administration. Even if administration is systemic administration Or topical administration.   For oral administration, the pharmaceutical composition may contain a binder (e.g., pregelatinized). Corn starch, polyvinylpyrrolidone or hydroxypropylmeth Fillers such as lactose, microcrystalline cellulose or phosphorus Lubricants (eg, magnesium stearate, talc also) Disintegrants (eg potato starch or sodium glycolate) Or other excipients such as wetting agents (eg, sodium lauryl sulfate) Using, for example, in the form of tablets or capsules formulated by conventional methods Good. Tablets may be coated by methods well known to those skilled in the art. Liquid for oral administration Body preparations may take the form of, for example, solutions, syrups or suspensions. Or drying to make them up with water or other suitable vehicle before use It may be provided as a product. Such liquid preparations may be suspended (e.g., sorbitol). Syrup, cellulose derivatives or hydrogenated edible oils and fats); emulsifiers (eg, Lecithin or acacia); non-aqueous vehicles (eg, almond oil, oily oils) Steal, ethyl alcohol or fractionated vegetable oils) and preservatives (eg, methyl Or propyl-p-hydroxybenzoate, or sorbic acid) It may be prepared by conventional methods using physiologically acceptable additives. Also, this formulation Contains buffer salts, if appropriate, and flavors, colors and sweeteners. Is also good.   Preparations for oral administration may be suitably formulated to give sustained release of the active compound. .   For buccal administration, the composition may comprise tablets or lozenges formulated in conventional manner May be used.   For administration by inhalation, the compounds used according to the invention are suitable propellants For example, dichlorodifluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorote Pressurized packs with the use of trafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas Conveniently, it is delivered in the form of an aerosol spray from a spray or nebulizer. Pressurization In the case of an aerosol, the dosage unit should be equipped with a valve to deliver the metered amount. And can be determined by For example, gelatin capsules used in inhalers or insufflators Cells and cartridges may be combined with the compound and a suitable material such as lactose or starch. It may be formulated so as to contain a mixed powder with a powder base.   The compound may be administered via injection, for example, by bolus injection or continuous infusion. It may be formulated for buccal administration. Formulations for injection are in unit dosage form, for example, in ampoules Alternatively, it may be provided in a multi-dose container to which a preservative has been added. The composition may be oily or In the form of suspensions, solutions or emulsions in aqueous vehicles. In addition, they may contain formulating agents such as suspending, stabilizing and / or dispersing agents. is there Alternatively, the active ingredient may be prepared prior to use in a suitable vehicle, such as sterile pyrogen-free water. The powder may be formed in the form of a powder. In addition, there is a theory regarding vehicles for parenteral administration. Akira was found in E.W.Martin, “Remington's Pharmaceutical Sciences” (Mack Pub.). Can be issued.   The compound may also be used, for example, such as cocoa butter or other glycerides. It contains a conventional suppository base and is formulated into rectal compositions such as suppositories or retention enemas. You may.   In addition to the formulations described previously, the compound may be formulated as a depot preparation . Such long acting formulations may be by implantation (e.g., subcutaneously or intramuscularly) or It may be administered by intramuscular injection. Thus, for example, this compound is suitable for polymerization Substance or hydrophobic substance (eg as an emulsion in an acceptable oil) or ion exchange It may be formulated together with a resin, or as a hardly soluble derivative, for example, a hardly soluble salt May be prescribed.   Optionally, the composition comprises one or more unit dosage forms containing the active ingredient. It may be provided in a good pack or dispenser device. This pack, for example, It may be made of metal or plastic foil, such as a blister pack. this The pack or dispenser device may be accompanied by instructions for administration.   In one embodiment, the pharmaceutical compositions of the invention are topically applied to the area in need of treatment. It is desirable to give. This may include, but is not limited to, a surgical procedure. Local injection during surgery; eg topical application with post-surgical trauma material To do; from a catheter, with a suppository, or an implant (the implant is porous , Non-porous or gelatinous material, such as sialastic membranes or fibers (Containing a membrane). A special example is dental A porous implant for surgical or surgical use is inserted at the implantation site and Liver activin, activin A, activin B, BMP to increase adhesion to bone , And TGF-β. Also graft Include liver activin, activin A, activin B, BMP, and TGF-β It may be coated with DNA encoding an osteoinductive protein. 6. Example:Identification and characterization of activin / inhibin B <sub>C</sub> and β <sub>E</sub> genes   Here, activin, a member of two new subgroups, activin Bin β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Describes the identification and characterization of the subunit. Mouse smell And two members of the transforming growth factor (TGF-β) superfamily A cDNA clone encoding the protein was isolated and characterized. Both cDNAs are activin β sub Units, which means that one gene Cutibin beta<sub>C</sub>Is believed to be a mouse homolog of Activin β<sub>E</sub>Indicated by Furthermore, human activin β<sub>E</sub>cDNA chromatography Were identified and characterized. In our study, in some respects, activin β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Are more similar to each other than other known activins: (a) these Genes are physically linked and activin β<sub>C</sub>Activin β<sub>E</sub>5 'end of (B) the composition of both loci is the same and a single intervening Consists of two coding exons separated by a row; (c) both activators The predicted carboxy-terminal sequence of Over 62% amino acid identity; (d) both genes are characteristic of adult mouse liver. It is evident that it is differentially and highly expressed: in addition, (e) some in vitro The result of the assay is activin β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Homodimer stabs Hepg2 cell growth Indicates that it will be intense. Taken together, the inventors' data Cutibin beta<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Subunit genes proceed from a common ancestor that has received tandem duplication. This suggests that Data on these structures and functions Activin β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Subunits are distinguished from other known activins This indicates that these subunits represent a unique subgroup of TGF-β-like molecules Suggest that.                           6.1Materials and methods PCR  Genomic DNA templates were isolated from NIH3T3 cells using standard methods (Sambrook et al. 1989, supra). RNA and cDNA templates are described in Chen et al. (1993, J. Biol. Chem., 268: 27, 381-27. , 389). The primer sequences are as follows: Limer (forward), 5'GT (ACGT) GG (ACGT) TGG AA (CT) GA (CT) TGG AT3 '; and downstream primer (reverse complement), 5'CA (A: CGT) CC (AG) CA ( ACGT) CC (CT) TC (ACGT) AC (ACGT) AC 3 '. Each codon is separated by a space And the degeneracy during synthesis at the selected wobble position, shown in parentheses. Achieved by adding a cocktail of nucleotides. Genomic DNA and cDNA casting For both types, PCR was performed with denaturation (94 ° C, 1.5 minutes), annealing (50 ° C, 1 minute, 10 minutes). Sec) and extension (72 ° C, 1 minute, 10 seconds).cDNA Cloning   Aliquots of 50,000 plaque forming units / plate (adult male BA Liver 5'-Stretch Plus cDNA of mouse liver in Lambda gtll from LB / c male mouse Larry, Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) and overnight grown new Fresh Y1088 cells (10 mM MgSO<sub>Four</sub>Grown in LB medium supplemented with 0.2% maltose Mix, incubate at 37 ° C for 15 minutes, and mix with NZY Broth (Gibco-BRL Life Technolog ies Inc., Grand Island, NY) and agarose upper layer solution 8 consisting of 0.75% agarose mix again with ml and then spread flat on a freshly poured 150mm NZY-agar plate Was. Prepare plaque lifts using standard methods and filter hybridize (50% formamide, 5 × SSC buffer, 1 × Denhardt's solution, 10 mM Tris, pH 7.5, 0.1% SDS, and 42 ° C. in 100 μg / ml salmon sperm DNA). Sambrook et al. 1989, supra. Filters were washed continuously until high stringency was reached (0.1 × SSC buffer, 0.1% SDS, 65 ° C.). cDNA probes are commercially available reagents and Using the random primed method (Random Primed DNA  Labeling Kit, Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, LL). Purified Phage clones were cultured with Y1088 cells and phage DNA was then transferred to Wizard ( Trademark) Protocols and reagents from the Lamda Prep kit (Promega, Madison, WI) And extracted. The phage DNA is digested with EcoRI, the recombinant insert is purified, The pBluescript plasmid vector (Stratagene, La Jo lla, CA) and then insert this insert into the manufacturer's protocol. According to Sequenase (version 2.0, United States Biochemical Company, Clevel and, OH). Sequence alignments and identities are determined by Genetics Compu ter Group, Madison, WI software (GrowTree (TM), version 8.1, UPMGS solution Analysis method).Isolation and characterization of mouse genomic clones   Genomic library in Lamda Fix II vector (mouse strain 129SVJ liver DNA From Stratagene) plated at 50,000 plaques / plate and labeled β<sub>C</sub>Using cDNA as a probe, 20 nitrocells under high stringency Loin replicas were screened. Also, as mentioned above, the filter is Washed continuously until it became stringent and autoradiographed . Positive phage plaques are screened again until purified and then Wizard DNA was prepared as described in the (trademark) Lamda Pre kit (Promega). 10 of From the pool of isolates, five unique clones each having genomic DNA greater than 10 kbp Was isolated. Notl digests of all unique clones were digested with NotI pBlu It was subcloned into an escript plasmid vector (Stratagene). Genome i The insert was characterized by Southern analysis and DNA sequencing.   Isolation and characterization of human activin beta <sub>E</sub> clone  Mouse activin B<sub>E</sub>Plastic A cDNA library was screened using Smid pbE # 2 as a probe. Five Aliquots of 0,000 plaque forming units / plate (Lamda gt from adult mouse liver) Human Liver 5'-Stretch Plus cDNA Library in CII, Cilonetech Laboratorie s, Inc., Palo Alto, CA) and fresh Y1088 cells (10 mM MgSO 4) grown overnight.<sub>Four</sub>Medium 0.2 % Of maltose in LB medium), and incubate at 37 ° C for 15 minutes. NZY Broth (Gibco-BRL Life Technologies Inc., Grand Island, NY) and Again with 8 ml of agarose supernatant consisting of 0.75% agarose and 0.75% agarose. Spread flat on a 150 mm NZY-agar plate poured into a plate. Plaque using standard methods Were prepared and filter hybridization was performed (50% formamide). 5x SSC buffer, 1x Denhardt's solution, 10mM Tris, pH 7.5, 0.1% SDS, And 100 μg / ml salmon sperm DNA at 37 ° C.). Fill until low stringency The column was washed continuously (0.5 × SSC buffer, 0.1% SDS, 55 ° C.). cDNA probe Uses commercially available reagents and protocols Radiolabeled by the random prime method (Random Primed DNA Labeling Kit, Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, LL). Purified phage protein Lone was cultured with Y1088 cells, then phage DNA was transferred to Wizard® Lamda Extract using protocol and reagents from Prep kit (Promega, Madison, WI). Was. Phage DNA is digested with EcoRI, the recombinant insert is purified, and standard Into a pBluescript plasmid vector (Stratagerle, La Jolla, CA) Clone and then insert this insert into the Sequen according to the manufacturer's protocol. Use ase (version 2.0, United States Biochemical Company, Cleveland, OH) And sequenced. Sequence alignments and identities were determined by Genetics Computer Group, Ma. dison, WI software (GrowTree (TM), version 8.1, UPMGS analysis method) Decided.Northern analysis. Adult mouse multi-tissue Northern blots were cloned using Clontech (Clon tech). According to product information, each lane of the blot was approximately 2 μg Of poly (A) RNA. Activin β<sub>C</sub>(Nucleotides 1230-1555) And β<sub>E</sub>(Nucleotides 1822 to 2130) consisting of an untranslated sequence derived from the 3 'untranslated region A specific cDNA probe is prepared by subcloning, and then By imming<sup>32</sup>P-labeled, 50% formamide, 5X SSPE buffer (pH 7.4, BioWhi ttaker, Walkersville, MD), 10X Denhardt's, 2% SDS, 100 μg / ml salmon sperm DNA (42 ° C., overnight). Hybridize blot Slowly wash from the incubation buffer to 0.1X SSC, 0.1% SDS (55 ° C) Film (X-Omat AR film, Eastman Kodak Co., Rochester, NY) At -86 ° C for the indicated time with intensifying screen.   Expression plasmid. Activin β for screen function<sub>C</sub>, Β<sub>E</sub>, And And β<sub>A</sub>An expression plasmid for the subunit was prepared as described below. F Magglutinin ("HA") epitope tag (Fang et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sc. i. U.S.A., 93: 5753-5758) was added to the coding sequence of each expression plasmid. . To ensure the purity of the final construct, all three expression plasmids should be And DNA sequence analysis.   Mouse activin β<sub>C</sub>The expression plasmid encoding the subunit is called pcDNA3 Vector (Invitrogen Corp., San Diego, CA). Subcloni Before the activation, the HA epitope is<sub>C</sub>At the 3 'end of the sequence encoding More added. The primer sequences were as follows: upstream primer (forward ( forward)), 5 'CCG AAT TCC ATG GCC TCC TTG CTC CTG GC 3', and downstream primer (Reverse complement), 5'GGG AAT TCA AGC GTA ATC CGG AA C GTA ACT ACA CCC GCA GGC CTC GAC CAC GGG ATC C 3 '. The downstream primer is PC The R product encodes an HA epitope and is designed to have an EcoRI site at its 3 'end. Note that All β<sub>C</sub>CDNA clone containing coding region Plasmid was used as a source of template DNA. PCR is performed by denaturing ( 94 ° C, 1.0 minute), annealing (65 ° C, 1 minute, 10 seconds), and elongation (72 ° C, 1 minute, 10 seconds) The 25 cycles Let it go. Digest the PCR product (1.1-kbp) with EcoRI and run on agarose gel It was more purified and subcloned into the pcDNA3 vector.   Mouse activin β<sub>E</sub>The expression plasmid encoding the subunit is also pcDNA3 Incorporated into vector. The HA epitope is essentially coded as described above. At the 3 'end of the region. The primer sequences were as follows: upstream primer (Forward), 5 'CCC AAT TCC TGG AGC ATG AAG CTT CCA AA 3', and downstream ply (Reverse complement), 5'GGG AAT TCA AGC GTA ATC CGG AAC ATC GTA TGG GTA GC T GCA GCC ACA GGC CTC TAC 3 '. All β<sub>E</sub>CDNA clones containing the coding region The lawn-derived plasmid was used as a source of template DNA. PCR is Performed essentially as described above. Digest the PCR product (1.1-kbp) with EcoRI, agarose Purified by gel electrophoresis and subcloned into pcDNA3 vector. I did it.   Activin β<sub>A</sub>The subunit contains an ovarian cDNA library (Clontech). It was used as a source of template DNA and was obtained by PCR. The primer sequence Were: upstream primer (forward), 5'GCT GCC AGG ATG CCC TTG CT T 3 ', and downstream primer (reverse complement), 5' CTA TGA GCA CCC ACA CTC 3 '. PCR consists of denaturation (94 ° C, 1.5 minutes), annealing (60 ° C, 1 minute, 10 seconds), and extension (72 ° C, (1 minute, 10 seconds) for 30 cycles. Transfer the PCR product (1.3-kbp) to agarose gel Purified by electrophoresis and then TA cloning vector (Invitrogen Corp. , San Diego, CA). Then, mouse activin β<sub>A</sub>Sub-unit The expression plasmid encoding the gene was incorporated into the pcDNA3 vector. HA epi A tope was added to the 3 'end of the coding sequence essentially as described above. Plasmid Using pbE # 2 as the source of template DNA, PCR is performed essentially as described above. gave. The PCR product is digested with EcoRI, purified by agarose gel electrophoresis, and And subcloned into the pcDNA3 vector.   Expression plasmid. Recombinant activin β<sub>C</sub>, Β<sub>E</sub>, And β<sub>A</sub>Sub-unit Perform transient transfection using standard protocols to obtain gave. Sambrook et al., 1989, supra. On the day of transfection, subconfluent Subconfluent 293T cells were replaced with fresh Dulb supplemented with 10% fetal bovine serum. Plated in ecco-modified Eagle medium (reagents obtained from Gibco-BRL Life Technologies) did). 10 μg of expression plasmid DNA was added to 0.5 ml of 0.25 M CaCl 2<sub>Two</sub>Add to the solution and To mix 0.5 ml Hepes-buffered saline (270 mM NaCl, 1.5 mM NaPO<sub>Four</sub>, 50mM Hepes, p H7.05). The mixture was left at room temperature for 10 minutes, then freshly soaked 293 It was dropped into the T cell medium. After overnight incubation at 37 ° C, replace the medium. Finally, the cells were cultured for a further 48 hours. Protease inhibitor (leupeptin, 1mg / ml, Aprotinin, 1 mg / ml, soybean trypsin inhibitor, 10 mg / ml, and pepstati 1 mg / ml; Sigma Chemical Co. (reagents are Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) Media samples were collected and stored at 4 ° C. until use.                            6.2Results and discussion   A pair of degenerate PCR primers protect human bone morphogenetic proteins -2 and -4. Designed based on existing sequences (VGWNDWI and VVEGCGC): upstream primer (forward) , 5'GT (ACGT) GG (ACGT) TGGAA (CT) GA (CT) TGG AT 3 ', and downstream primer (reverse 5 ′ CA (ACGT) CC (AG) CA (ACGT) CC (CT) TC (ACGT) AC (ACGT) AC 3 ′. Individual co Dons are separated by spaces and degeneracy is the fluctuation selected as shown in parentheses Achieved by adding a cocktail of nucleotides at the wobble position Note that PCR products are expected to be derived from within a single coding exon. And both cDNA and genomic DNA are used as templates. Was. PCR uses a range of annealing temperatures to generate an expected size band of ~ 300-bp. Until it was obtained. The generated PCR product is transferred to a TA cloning vector (In Vi trogen) and then used to transform E. coli. number Thousands of transformed E. coli colony forming units available for screening Wherein the bone morphogenetic proteins-2 and -4, activin β<sub>A</sub>, Activin β<sub>B</sub>Known TGF-β supercomputers and growth / differentiation factors -6 and -7 Family members were finally identified (not shown).   These efforts also resulted in the identification of a 280 nucleotide, which we termed DP-2. A unique PCR fragment was isolated. Using the DP-2 fragment as a probe, Screening of 500,000 plaque forming units derived from liver cDNA library I did it. DP-2 and high stringency from a pool of more than 20 positive isolates -Three unique overlapping cs hybridizing under conditions The DNA clone was purified. DNA sequence analysis (all three clones) revealed 1837 Defines an open reading frame of 1056 nucleotides in the nucleotide cDNA sequence. I did it (Figure 1). This putative sequence has a putative molecular weight (molw) of 39 kD and four latents. It consisted of 352 amino acids with a potential N-linked glycosylation site. Start translation The convenient Met codon (nucleotide 148) was tentatively designated as the translation initiation site. this We found four in-frame stop codons upstream of the ATG codon, There were no additional ATG codons. In addition, the present inventors preceded the translation termination signal (TAG). To perform a canonical TGF-β CXCX sequence (Roberts et al., 1990, The transform ing growth factor betas. In: Sporn MB, Roberts AB (ed.) HanLdbook of Experim ental Pharmacology, 95 (Part I), Springer-Verlag, Heldelberg, pp.419-472 ) Was also found. Based on sequence comparison (described below), open 1056 nucleotides Assume that the reading frame sequence is mouse activin β<sub>C</sub>Called.   Mouse activin β<sub>C</sub>When cloning the genomic locus, we , Activin β<sub>C</sub>Downstream of the gene and low stringency in Southern blots Β under geniency conditions<sub>C</sub>300bp hybridizing with cDNA probe A BamHI genomic DNA fragment was found (data not shown). Copy this BamHI fragment Subcloning into the plasmid vector pBluescript (Stratagene) Use additional lobes to add 500,000 pullers from mouse liver cDNA library Chromogenic units were screened under high stringency conditions. 2130-bp Unique, overlapping cDNA clones representing more than 20 sequences Purified from a pool of positive isolates. Sequence analysis (all 3 clones) was 1050 Nucleotide open reading frame, 350 amino acid conceptual sequence, 39kD Molecular weight (molw) and one potential N-linked glycosylation site I did it (Figure 2B). If a Met codon (nucleotide 216) convenient for translation initiation It was called the translation start site. Upstream of this ATG codon, we have a single frame An internal stop codon was found, but no further ATG codon. Translation stop signal (TAG ) Was also identified. Sequence comparison analysis as described below Is a novel activin with a 1050 nucleotide open reading frame sequence suggests that it encodes the β subunit,<sub>E</sub>Call To   Mouse activin β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>The subunit is a member of other TGF-β superfamily members. (Roberts et al., 1990, The transforming growth fa ctor betas. In: Sporn MB, Roberts AB (eds.) Handbook of Experimental Pharmaco logy, 95 (Part I), Springer-Verlag, Heldelberg, pp. 419-472; Kingley, D.M. , 1994, Genes Develop 8: 133-146). In both cases, 2020 amino acids after the starting Met residue. There are characteristic signal peptides for amino acids. Downstream of the signal peptide, both sequences Has a putative endoproteolytic clevage site Propeptide and mature growth factor regions (ie, cluster-forming basic amino acids) Acid; see FIGS. 1 and 2), which appear to be organized at the junction of these areas is there. If these cleavage sites are actually used, mouse activin β<sub>C</sub>Sub-uni The propeptide and mature growth factor regions of the Activin β<sub>E</sub>Subunit propeptide and And the mature growth factor region will consist of approximately 215 and 114 amino acids, respectively. . Except for the Mullerian inhibitory substance, TGF-β All known members of the パ ー oper family are salts of approximately 120 amino acids from the C-terminus. It has a cluster of basic residues. At least TGF-β '(Roberts et al., 1990, The tra nsforming growth factor betas. In: Sporn MB, Roberts AB (ed.) Harldbook of E xperimental Pharmacology, 95 (Part I), Springer-Verlag, Heldelberg, pp.41 9-472; Kingley, D.M., 1994, Genes Develop 8: 133-146), Invivin (Vale et al. , 1990, The activins and inhibins. In: Sporn MB, Roberts AB (ed.) Peptide Gr owth Factors and Their Receptors, 95 (Part II). Springer-Verlag, Helderbe rg, pp. 211-248; Mason et al., 1985, Nature 318: 659-663), and bone morphogenetic protein-2, the mature form of It is known that these sites are produced by endoprotease cleavage.   β<sub>C</sub> Using the cDNA as a probe, mouse Screening 1,000,000 plaque forming units from the Nome library Several genomic clones have been isolated. Overlap of these clones Partial restriction and DNA sequence analysis of the insert to be performed is performed using a mouse genome DN of ~ 5-kbp. A is activin β<sub>C</sub>3 'end and activin β<sub>E</sub>Activin β at the 5 'end<sub>C</sub>Downstream Activin β<sub>E</sub>It was shown that they were segregated at the locus (FIG. 4). The tissue at both loci Similarly, it consists of two coding exons separated by a single intervening sequence. Partial restriction analysis and partial DNA sequence analysis of overlapping genomic clones Cutibin beta<sub>C</sub>Indicates that the size of the intron is ~ 12-kbp. In contrast, DN A sequencing was performed by activin β<sub>E</sub>This indicates that the size of the intron is 234-kbp. 234-kbp activin β<sub>E</sub>The intron sequence has been deposited with GenBank (accession number). You.   Mouse activin β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>The predicted carboxy-terminal amino acid sequence of There is 61% amino acid identity and high homology in the growth factor region. Both The nucleotide sequence contains a total of 9 cysteine residues; cysteine spacing And other conserved amino acids are the most characteristic of the activin subfamily And, to a lesser extent, a characteristic of TGF-β1-5. In the mature growth factor region Table of amino acid sequence identity shows that mouse activin β<sub>C</sub>(1056 Nucle Otide coding sequence) is human activin β<sub>A</sub>And 52% identity to human activin β<sub>B</sub>50% identity with human activin β<sub>C</sub>And 95% identity Luactivin β<sub>D</sub>And 62% identity. By comparison, mouse activin β<sub>E</sub>( 1050 nucleotide coding sequence) is human activin β<sub>A</sub>45% identity with human Cutibin beta<sub>B</sub>47% identity to human activin β<sub>C</sub>And 64% identity, African claws Frog β<sub>D</sub>And 63% identity. In contrast, our mouse coding sequence Compared to other members of the TGF-β superfamily, Only column identity was found. These data are based on a 1056 nucleotide coding sequence. Column contains mostly human activin β<sub>C</sub>This is a mouse homolog of In contrast, the 1050 nucleotide coding sequence is a novel activin subunit We consider this to be activin β<sub>E</sub>Called. The present inventors As far as we know, this is activin β<sub>E</sub>This is the first report of isolation.   This relationship is also related to activin β<sub>A</sub>And β<sub>B</sub>Are most related to each other, Bin β<sub>C</sub>, Β<sub>D</sub>, And β<sub>E</sub>Also represent a second subset of related sequences I do. Alignment of the mature growth factor regions of the five activin β subunits As shown in FIG. Activin β<sub>A</sub>And β<sub>B</sub>Has 63% amino acid identity, but activin β<sub>C</sub>, Β<sub>D</sub>, And β<sub>E</sub>Has 62% identity. 5 activin β subunits Have a total identity of almost 50%.   Mouse activin β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Gene expression patterns were determined in several adult mouse The texture was evaluated by Northern analysis. Activin A widely expressed in adult animals and humans And B (for example, Meunier, H. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:24). 7-251), in contrast to multi-tissue Northern blots, activin β<sub>C</sub>3 'untranslated territory Hybridization with a specific probe from the region resulted in ~ 2.0-kb A single major transcript was identified (FIG. 6). This band is about 3 hours on X-ray film Confirmed with less exposure. Other tissues (heart, brain, spleen, lung, kidney, testis and skeletal muscle) Activin β<sub>C</sub>Gene expression was determined by exposing the blot to X-ray film for 3 days. But not detected (not shown). Activin β<sub>E</sub>Genes are also high in liver tissue Expressed. Activin β from the same multi-tissue Northern blot<sub>E</sub>of<sub>3 '</sub>From untranslated domain Rehybridization with a specific probe of ~ 3.2-kb single liver transcription I checked things. This band was also confirmed with a 3 hour light exposure of the X-ray film, Expression in other tissues was not detected after exposure to x-ray film for 3 days (shown Not).   Mouse activin β<sub>E</sub>Using the clone as a probe, a human liver cDNA 500,000 plaque-forming units from Bally under low stringency conditions Screened. Two overlapping cDNA clones (1,764-bp) (Representing the sequence) was purified from a pool of more than 20 positive isolates. Sequence analysis Has a predicted molecular weight of 39 kD and one potential N-linked glycosylation site. Predicted open reading frame of 1050 nucleotides encoding protein System (Fig. 5). The Met start codon (starting at nucleotide 77) is Probable start site. Check canonical CXCX sequence preceding stop translation signal (TAG) Was done. A polyadenylation signal was further confirmed downstream of the stop codon. Array ratio Comparative analysis showed that the 1050-bp open reading frame sequence was human activin β<sub>E</sub>The Suggested to be loaded.   Human activin β<sub>E</sub>Subunit is a member of another TGF-β superfamily Is organized in the same way as ~ 20 amino acid features after predicted start MET residue Signal peptide follows. Downstream of the signal peptide, the predicted propep The tide and mature growth factor regions were identified. The region is a cluster of basic amino acids To create one or more putative endoprotease cleavage sites. This Cleavage at these sites resulted in a propeptide of ~ 215 and 114 amino acids and Produces mature growth factor.   Mouse and human activin β<sub>E</sub>Predicted carboxy-terminal amino acid sequence Highly homologous with> 95% amino acid identity in the growth factor region. Both coding sequences contain a total of nine cysteine residues. Cysteine Lactation and the presence of other conserved amino acids are the most characteristic of activin To a lesser extent, it is a feature of TGF-β. Percentage within the mature growth factor region A table of amino acid sequence identity shows that human activin β<sub>E</sub>Is human activin β<sub>A</sub>And 45 % Activin β<sub>B</sub>With 47% identity to human activin β<sub>C</sub>And 64% Xenopus Lactivin β<sub>D</sub>And 62% identity. Contrast Human activin β<sub>E</sub>Compare to other members of the TGF-β superfamily And only 20 to 40% amino acid sequence identity was found.   This example shows two mice encoding members of the TGF-β superfamily. We report the isolation and characterization of the cDNA and one human cDNA. Closely related The cDNA encodes the activin β subunit. These sub-units One of the knits is human activin β<sub>C</sub>Mouse homologue of And the third subunit are novel, mouse and human activin β<sub>E</sub>Sub-uni It is called a set. Taken together, activin β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>High degree of sequence identity between These clustered genomic tissues and their specificity in adult liver tissue And strong expression patterns indicate that these genes evolved from a common ancestor through tandem duplication. Suggests that These data also indicate that activin β<sub>C</sub>And β<sub>E</sub>Sabyu It suggests that knits may represent a unique subgroup of TGF-β-like molecules.   So far, a total of 5 activin / inhibin β subunits and 2 inhibitors The bin α subunit has been isolated and characterized. Activin was originally a primary la Gonadal fluid by measuring controlled FSH release from anterior pituitary gland cells in vitro (Gonadal fluid) (Vale et al., 1986, Nature 321: 776-779: Ling Et al., 1986, Nature 321: 779-782; Ling et al., 1986, Biochem Biophys ResCommun 138. : 1129-1137) Currently, activin is independent and not limited to erythroblasts Differentiation (Yu et al., 1987, Nature 330: 765-767; Eto et al., Biochem Biophys Res Commun 14 2: 1095-1103), nerve cell survilval (Schubert, D., et al., 1990). , Nature 344: 868-870), Mesodermal induction of Xenopus embryos (Slack J.M., 1994). , Curr Biol 4: 116-126), megakaryocyte differentiation (Fugimoto, K., 1991, Biochem. Biophys. . Res. Commun. 174: 1163-1168), cardiac morphogenesis (Olson, E., et al., 1996, Science 2). 72: 671-676), bone growth (Luyten, F., et al., 1994, Exp. Cell Res. 210: 224-229; Ogaw a, Y, et al., 1992, J. Am. Biol. Chem. 267: 2325-2328), and somatostatin induction ( Woodruff, T.W. Et al., 1995, Annu. Rev. Physiol. 57: 219-244) Purified based on different activities. Three activins (A, B, and AB) Are well characterized to date, each forming a disulfide-linked dimer Different combinations of β subunits (each β<sub>A</sub>β<sub>A</sub>, Β<sub>B</sub>, Β<sub>B</sub>And β<sub>A</sub>fβ<sub>B</sub> )). β<sub>C</sub>, Β<sub>D</sub>, And β<sub>E</sub>Subunit is homodimer, heterodimer It is not yet clear whether or not to form both. However, these sub-units The recent isolation of kits has shown that several possible combinations for activin are virtually Suggests quite high. Inhibin, on the other hand, is initially Gland peptide was identified in the anterior pituitary gland (Vale et al., 1990, The activins an d inhibins. In: Sporn MB, Roberts AB (ed.) Peptide Growth Factors and Their Receptors, 95 (Part II). Springer-Verlag, Heldelberg, pp. 211-248; Mason et al. , 1985, Nature 318: 659-663; Rivier, J., et al., 1985, Biochem. Biophys. Res. C ommun. 133: 120-127). Inhibin synthesis The main gonad sites are Sertoli and granulosa cells. Inhibin A And B are also expressed in the placenta and in the adult spleen and nervous system. mouse In both sexes, inhibin promotes the proliferation of gonadal stromal cells It appears to be an important negative modulator, ie, in inhibin-deficient mice, A mixture of granulosa cells (female mouse) and Sertoli cells (male mouse) A fully differentiated glandular stromal tumor develops (Matzuk, M., et al., 1992, Nature 360: 313-319) . 7. Example: Direct introduction and expression of activin β <sub>C</sub> expression plasmid DNA Causes new bone formation in vivo.   Activin β using direct in vivo gene transfer<sub>C</sub>Homodimer is osteoinductive It was determined whether it had activity. Degradable matrix containing plasmid DNA (Gene activated matrix, or GAM) between the segments of adult rat femur Implanted in the gap. Activin β<sub>C</sub>Transplantation of GAM containing expression plasmid DNA is Filling the gap resulted in a new bone biological response. In this experiment, activin β<sub>C</sub> Overexpression indicates that new bone is formed in vivo.                          7.1 Materials and Methods   Animal model   To perform a 5 mm osteotomy, four 1.2 mm diameter pins are inserted under general anesthesia. Screw into the femoral shaft of a normal adult Sprague-Dawley rat It is. A surgical template guides the placement of the parallel pins, (Pins are 2.5 mm each 3.5 mm from the end of the fixator plate (Set apart). Next, place the outer fixator plate (30 × 10 × 5mm) on the pin Fixed. The outer fixator plate is a CNC milled to ensure high resistance. Assembled using a luminium alloy. The combined lock washer and threaded pin The pre-assembled fasteners were made of stainless steel. All The fixator parts were sterilized with ethylene oxide gas prior to surgery. 5mm segment missing Loss to central long stem using Hall Micro 100 vibrating saw (Zimmer Inc., Warsaw, IN) Had made. Cut the collagen sponge until it is surrounded by clotted blood (Preliminary studies have shown that this procedure could result in a sponge into the osteotomy site. Is fixed). The skin incision was closed with staples. Fixing device required The animal's gait was not restricted because of its great stability.   Preparation of plasmid DNA   Activin β<sub>C</sub>An established bacterial cell line containing the expression plasmid is Propagated in liquid culture according to protocol. Transfer the plasmid from Oiagen Inc. Purify in an endotoxin-free manner using these reagents and protocols did.   Preparation of gene activated collagen sponge   1.5 ml PLGA / chloroform solution (3% w / v) (50/50 polylactic acid polyg Recolic acid copolymer, average MW 90,000, intrinsic viscosity 1.07), activin β<sub>C</sub>The 0.2 ml of a solution containing the expression plasmid DNA to be loaded (1 mg of DNA, 10 mM Squirrel, 0.1 mM EDTA, pH 7.4) was added. After vortexing the solution for 2 minutes to emulsify At a power of 55 watts using a microchip probe-type sonicator, Sonicated at 0 ° C. for 30 seconds.X-ray photography   Using a portable X-ray unit (GE, model 100), while the animal is awake, Weekly plain radiographs (back-ventral view) were obtained.   Histology   Using standard methods of tissue fixation, desalting, paraffin embedding, sectioning and staining The tissue was prepared for light microscopy.                               7.2result Osteotomy model   Repair of osteotomy in rats is completed by 9 weeks after surgery. Depends on the size of the gap: a gap of 2 mm is recovered by bone union, The mm gap is restored by non-union of the fibrous material. Pairs maintained for up to 13 weeks after surgery According to control animals, a 5 mm gap is typically restored by non-union of fibrous material The observation was confirmed. Weekly plain radiographs and histology were for 5 mm osteotomy only (n = 3), 51 mm osteotomy + PLGA matrix (n = 10) or 5 mm osteotomy Or PLGA matrix containing plasmid DNA (n = 23) Animals showed no bone formation. All 36 contrast gaps , Recovered by deposition of fibrous tissue. The control femur is the (focal) periosteal New bone formation was shown (complication of pin placement). Transient focus in interstitial tissue An inflammatory response (lymphocytes and macrophages) was also observed postoperatively.   Activin βc gene transfer   Full-length mouse activin β<sub>C</sub>cDNA is screened by library screening Isolated and subcloned into pcDNA3 eukaryotic expression vector (Invitrogen) It has become. Encodes activin βc for specific detection of recombinant proteins The 3 'end of the corresponding sequence was modified by the addition of a hemagglutinin (HA) epitope. Recombinant activin βc is used for in vitro transcription and transcription from this construct (pGAM3). And expressed using a translation protocol. Immunoprecipitation studies also include anti-HA The activity of the HA epitope recognized by the nal antibody was established.   Biosynthesis of recombinant βc was determined using cultured pGAM3 plasmid DNA. 3T cells were evaluated after transient transfection: evidenced by immunoprecipitation As revealed, activin βc molecules are assembled into homodimers, secreted, It was processed as expected. FIG.   PLGA matrix containing pGAM3 DNA was retained for 4 to 24 weeks. It was placed in the gap of two adult rats. Microscopic view of new bone from both sides of surgery The focus observed with a mirror was observed at least four weeks after the operation. Of self-induced bone formation Consistent with the classical description, these foci are represented by large cube-like osteoblasts. Consists of faceted, polymorphic, spindle-shaped fibroblasts and capillary tubes Consisted of a bone plate supported by cellular connective tissue. Opposite (operation The radiographic appearance of the femur was unchanged in all three cases. (Not shown), the effects of gene transfer and activin βc overexpression It means that it is limited to. These data indicate that the activin βc homodimer Has osteoinductive activity. 8. Example: Recombinant activin βc homodimer stimulates hematopoiesis in vivo.   Human bone marrow biopsy is performed in the presence of a medium conditioned with recombinant activin βc. Culture and, if any, the effect of activin βc homodimer on hematopoiesis. It was measured. Experiment shows that activin βc homodimer can stimulate hematopoiesis That was shown.                          8.1Materials and methods Production of Activin βc Conditioned Medium   Using pGAM3 plasmid DNA, 293T cells and standard protocols Transient transfections were performed as described. Troff On the day of fusion, sub-confluent 293T cells Fresh Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum was The drug is from Gibco-BRL Life Technologies, Inc.). 10 μg of plasmid D NA is 0.25M CaCl<sub>Two</sub>0.5 ml of solution and add the mixture to 0.5 ml Hepes-buffered saline (270 mM NaCl, 1.5 m M NaPO<sub>Four</sub>, 50 mM Hepes, pH 7.05). Put this mixture in the room After 10 minutes at room temperature, the cells were added dropwise to freshly nourished 293T cell culture media. I got it. After overnight incubation at 37 ° C, the medium was changed and the cells were further Culture was performed for 48 hours. Transfected cells for metabolic labeling studies , Methionine and cysteine, and 5% dialyzed fetal bovine serum (all All reagents were from Gibco-BRL Life Technologies, Inc.) and 200 mCi [<sup>35</sup>S] Met and [<sup>35</sup>S] supplemented Cys (Translabel Cysand Met, ICN) Dulbecco's modified Eagle's medium was re-fed. Cells are incubated for an additional 24 hours at 37 ° C. Cuvated, protease inhibitor (leupeptin, 1 mg / ml, app Rotinin, 1 mg / ml, soybean trypsin inhibitor, 10 mg / ml and pepstati Media sample in the presence of 1 mg / ml, Sigma) Stored at 4 ° C.   Human bone marrow culture   After informed consent, human bone marrow aspirate is I got it. Gartner and Kaplan (1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 4756-4759) Long-term bone marrow cultures were established exactly as described. Of immunological localization Place 2-3 coverslips in each culture and weekly for immunocytology Removed. Measurements of the frequency of hematopoietic progenitors and the total number of hematopoietic progenitors are described above. (Long et al., 1990, J. Clin. Invest. 86: 1387-1395). The assay is I went three times.                               8.2result Activin βc conditioned medium stimulates hematopoiesis.   Activin β<sub>c</sub>When conditioned media was added to human bone marrow aspirate cultures, erythroid Strong propensity for formation, granulocyte formation and megakaryocyte formation and statistically significant stimulation were observed. (Figure 9). In addition, activin βc conditioned medium has a total count of hematopoietic progenitor cells of 2 Caused a fold increase. These data indicate that activin βc homodimer Can be stimulated. 9. Example: Activin βc homodimer is a latent TGF-β binding protein Binds protein-3.   Latent TGF-β binding protein (LTBP) is found on platelets and other cells. It is a component of the larger, latent TGF-β complex produced. Three LTBPs The encoding gene has been isolated to date; two gene products (L TBP-1 and LTBP-2) are latent TGF- via disulfide bonds. Although shown to bind β1, LTBP-3 has only recently been isolated. , Its binding capacity has not yet been measured. To address this question, the present inventor La Encodes cultured cells for mouse LTBP-3 and human TGF-βl Temporary co-transfection with expression plasmid, immunoprecipitation, SD Complex formation was studied using S-PAGE and autoradiography (Yin Submitted). The result shows that LTBP-3 also shows that during the assembly of the latent complex It has been shown that latent TGF-βl binds covalently. Simultaneous transfection The strategy also suggests that the site of disulfide bond formation may be an 8-cysteine in LTBP-3. It was used to show for the first time a structural motif of stain TGF-bp. These results were obtained using the TGF-bp expression plasmid from mouse LTBP-2. Confirmed and expanded by further co-transfection studies Was. Together, these studies indicate that TGF in the assembly of the latent TGF-βl complex -Reveal a new functional role for the bp motif. This result indicates that TGF -Has important implications for beta biosynthesis, storage and targeting.   LTBP-3 has all three TGF-bp structural motifs, of which Only two bind TGF-βl with affinity. Therefore, the present inventors consider that the third Of the related molecule, ie, the TGF-β superfamily Tried to determine if the members could be combined. In particular, the inventor Have developed a propeptide with a conserved pattern of cysteine residue numbers and spacing. TGF-β-like molecules with the property of having also bind LTBP-3 Tried to determine if. A similar experimental design was used to address this question. Used: We cultured cultured cells with mouse LTBP-3 and activator. Temporary co-transfection with an expression plasmid encoding βc And combined using immunoprecipitation, SDS-PAGE and autoradiography The body formation was studied. Experiments were performed on the third 8-cysteine TGF-bp of LTBP-3. 2 shows that the structural motif covalently binds activin βc. The result is L TBP-3 is a binding protein for activin PC homodimer And the TGF-bp motif in the activin βc homodimer assembly. To expand the functional role for                          9.1Materials and methods Set of pLTBP-3 f1   (1995) describe a mammalian expression vector encoding mouse LTBP-3. Were collected and characterized (pLTBP-3 f1; see Table 1, # 1). Temporary transformer After transfection, this study demonstrated that mouse LTBP-3 was polyclonal. Antiserum # 274 (proline and glycine rich distribution upstream of mouse LTBP-3) By a 12 amino acid epitope (GESVASKHAIYA) in the sequence. To precipitate.   Set of pLTBP-3 / pept   Yin et al. Collected and characterized the pLTBP-3 / pept expression vector. this For pLTBP-3 f1 digestion with EcoRI and HindIII, agarose Gel electrophoresis yielded two DNA fragments that were cleanly resolved. LTBP One fragment consisting of an unnecessary part of the sequence encoding -3 was discarded. Second fragment (Intact plasmid backbone, CMV promoter, translation termination signal and And containing a polyadenylation element) were designated pLTBP-3 / pept ( See Table 1, # 2). A HindIII site was added to the Ltbp-3 initiator Met codon. It was located 646 bp downstream. Therefore, pLTBP-3 / pept is normal Mouse LTBP-3 containing Kozak consensus and signal peptide A short amino-terminal sequence unique to LTBP-3; two EGF-like counterparts And encodes a portion of the upstream proline and glycine rich domain . The latter contains the antibody # 274 epitope (GESVASKHAIYA). less than As described, the pLTBP-3 / pept expression vector is pLTBP-3 It performed in 293T cells in essentially the same way as f1. That is, pLT Using BP-3 / pept, its ability to bind TGF-βl was determined using antibody # 274. A series of defined LTBs that can be tested directly by immunoprecipitation used A P-3 peptide fragment was generated.   Assembly of pLTBP-3 / TGF-bpA   pLTBP-3 / pept encodes a defined fragment of mouse LTBP-3 Facilitated plasmid assembly. Below is how this plasmid, pLTBP -3 / TGF-bpA is described in detail (Table 1, # 3; see also FIG. 1). See). Using PCR, the TGF-bpA structural motif from LTBP-3 was A cDNA fragment to be loaded was prepared. Upstream PCR oligonucleotide primer N in the frame with the 6/12 codon of the 274 peptide (KHAIYA) The 5 'portion of the cDNA sequence encoding the heI site + EGF-like repeats Bank (TM) / EMBL Data Bank accession L40459). downstream PCR primer of XhoI site + 3 ′ part of TGF-bpA cDNA sequence Minutes. PCR template was pLTBP-3 f1 plasmid DNA And PCR was performed as described (Chen et al., 1993). After amplification, The PCR fragment was digested with NheI and XhoI and analyzed by agarose gel electrophoresis. PLTBP-3 / pep after digestion and purification with the same restriction enzymes Ligation was performed using the t expression vector. XhoI digestion is performed in the vector The elements of translation termination and polyadenylation were preserved. Reige competent bacteria Transformation mixture, isolate colony forming units, and Used to prepare DNA. To guarantee integrity, p LTBP-3 / TGF-bpA was characterized by DNA sequencing.   Assembly and transfection of pGAM3 was performed as described above. Immunoprecipitation   For immunoprecipitation, 10 ml (net) of antibody was radiolabeled with 1-5 ml. Added to media protein. Incubate the mixture at room temperature with shaking for 2 hours did. Protein A-Sepharose CL-4B beads were added (200 ml, 1 ml). 0% suspension), and the mixture was incubated at room temperature with shaking for 2 hours. The immunoprecipitated protein is pelleted by brief centrifugation, and the pellet is PBS-TD buffer (0.38 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 m Na of M<sub>Two</sub>HPO<sub>Four</sub>, 1.5 mM KH<sub>Two</sub>PO<sub>Four</sub>1% Triton X-100, 0.5% (Deoxycholate) four times and PBS three times. Next, put the protein Dye (2x) together with a reducing agent (10% 2-mercaptoethanol) or What The sample was boiled for 5 minutes. Next, the sample is subjected to a concentration gradient of 4-18%. Fractionation was performed using SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (Yin et al., 1995). Using a cold molecular weight marker (200-14.3 kDa, Rainbow mix, Amersham Corp.) , Molecular weight was estimated. The gel was dried and exposed to film at room temperature for the indicated time .                               9.2result   293T mammalian cells were isolated from pLTBP-3 / TGF-bpA and pGAM3 Programmed by transient co-transfection using<sup>35</sup>S ] Cys and [<sup>35</sup>[S] Met was used for 16 hours for radiolabeling. Medium protein Quality was collected and examined for immunoprecipitation.   Both LTBP-3 and activin βc are radiolabeled and anti-LTBP- 293T immunoprecipitated with anti-HA antibody 3 and anti-HA antibody Not identified in cell conditioned media. Immunoprecipitation with anti-HA antibody And the conditioned medium of cells transfected with pGAM3 alone It contained vinpropeptide and mature growth factor, but LTBP-3 TGF- It contained no bpA repeats. Under reducing conditions, the propeptide monomer has about 40 migrating as a single band of kDa, mature activin βc And moved. After immunoprecipitation with anti-HA antibody, pLTBP-3 / TGF-b The conditioned medium of 293T cells transfected with pA alone contains bpA But not the latent form of activin βc. Was. Culture the final set of controls conditioned with `` wrong antibody '' Based on local immunoprecipitation: conditioned media was immunoprecipitated with anti-LTBP-3 antibody If activin βc could not be identified, conversely, pLTBP-3 / TGF Medium from conditioned medium of 293T cells transfected with bpA No bpA motif could be identified if pull was immunoprecipitated with anti-HA antiserum . These control data demonstrate the reproducibility of the transient co-transfection system. Was independently obtained three times.   The co-transfection experiments revealed that the latent form of activin βc and LTBP-3 Evidence for a specific interaction with the TGFbpA structural motif was provided. Anti-LTB For both P-3 and anti-HA immunoprecipitates, the bpA motif is also approximately 30 kD Activin βc propeptide migrates as a band Matured activin βc migrated as a single band of approximately 14 kDa.   Thus, the data show that LTBP-3 shows that covalent reductive crosslinks, Βc homodimer via a disulfide bond that is stable against boiling in To establish a connection. Moreover, both anti-LTBP-3 and anti-HA antibodies By co-immunoprecipitation of the binding interaction between LTBP-3 and activin βc Is specific, and therefore results in an artifact of the transient co-transfection system. Providing strong evidence of not going wrong.                           10.Microbial deposit   The following microorganisms were used in the American Type Culture Collection (American Type Culture Collection) (ATCC), 12301 Park Lawn Drive (Parklawn Dri ve), deposited at Rockville, Maryland 20852.Name of strain What to include Accession number pbHE human activin β_E pbC mouse activin β_C pbE mouse activin β_E   The present invention relates to the exemplified embodiments or the deposited microorganisms (these being one of the present inventions). Should not be limited in scope). Any clone, DNA or amino acid sequence (these are functionally equivalent ) Are also within the scope of the present invention. Indeed, from the preceding description and accompanying drawings, Various modifications of the invention in addition to those described will become apparent to those skilled in the art. That's it Such modifications are intended to fall within the scope of the appended claims.   All base pair sizes given for nucleotides are approximate and It should also be understood that they are used for purposes.                          International application number: PCT / PCT / RO / 134 (January 1981) International application number: PCT / PCT / RO / 134 (continued) American Type Culture Collection United States 20852 Maryland Rockville Park Loan Drive 12301Accession number Deposit date 97805 November 20, 1996 97806 November 20, 1996

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ａ６１Ｐ 1/16 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０５ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/24 Ｇ０１Ｎ 33/53 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，Ｔ Ｊ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ファン，ジアンミング アメリカ合衆国 48105 ミシガン州，ア ン アーバー，ストーン ロード 2566──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 48/00 A61P 43/00 105 A61P 1/16 C07K 14/47 43/00 105 G01N 33/53 D C07K 14/47 C12N 5/00 B C12N 5/10 A61K 37/24 G01N 33/53 37/02 (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH) , KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AU, A , BA, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CU, CZ, EE, GE, GH, HU, ID, IL, IS, JP, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UZ, VN, YU (72 ) Inventor Fan, Jianming United States 48105 Stone Road, Ann Arbor, Michigan 2566

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．肝臓アクチビンβ_E 遺伝子のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。 ２．肝臓アクチビンβ_E またはその断片をコードする単離された核酸分子であっ て、 (a)図２に示すアミノ酸配列、または受託番号 を有するATCCに寄託さ れたものと同じcDNAクローン に含まれるcDNAによってコードされるアミノ 酸配列をコードするか、あるいは (b)ストリンジェント条件下で(a)のヌクレオチド配列またはその相補体とハ イブリダイズする、 ヌクレオチド配列を有する核酸分子。 ３．Ｎ末端シグナルペプチド、プロペプチドまたは成熟成長因子ドメインに相当 する肝臓アクチビンポリペプチド、あるいは該成熟成長因子ドメインが欠失され た肝臓アクチビンポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド配列。 ４．異種ポリペプチドに融合された請求項３に記載のポリペプチドを含むキメラ 蛋白質をコードする単離されたヌクレオチド配列。 ５．請求項１、２、３または４に記載のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドベ クター。 ６．宿主細胞内で請求項１、２、３または４に記載のヌクレオチド配列の発現を 制御するヌクレオチド調節配列と作動可能に結合された該ヌクレオチド配列を含 む発現ベクター。 ７．図１に示すヌクレオチド配列、あるいは図１に示すアミノ酸配列または受託 番号 を有するATCCに寄託されたものと同じcDNAクローン に含まれる cDNAによってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、宿主 細胞内で該ヌクレオチド配列の発現を制御するヌクレオチド調節配列と作動可能 に結合して含む発現ベクター。 ８．前記調節配列は、サイトメガロウイルスhCMV即時型遺伝子、SV40 アデノウイルスの初期または後期プロモーター、lac系、trp系、TAC系、TRC系、 λファージの主要オペレーターおよびプロモーター一領域、fdコート蛋白質の制 御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼ のプロモーター、および酵母α接合因子のプロモーターからなる群から選択され る、請求項６に記載の発現ベクター。 ９．前記調節配列は、サイトメガロウイルスhCMV即時型遺伝子、SV40アデノウイ ルスの初期または後期プロモーター、lac系、trp系、TAC系、TRC系、λファージ の主要オペレーターおよびプロモーター領域、fdコート蛋白質の制御領域、３− ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモータ ー、および酵母α接合因子のプロモーターからなる群から選択される、請求項７ に記載の発現ベクター １０．請求項１、２、３または４に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子操作さ れた宿主細胞。 １１．宿主細胞内で請求項１、２、３または４に記載のヌクレオチド配列の発現 を制御するヌクレオチド調節配列と作動可能に結合された該ヌクレオチド配列を 含む遺伝子操作された宿主細胞。 １２．前記宿主細胞が肝細胞である、請求項11に記載の遺伝子操作された宿主細 胞。 １３.請求項７に記載の発現ベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞。 １４．前記宿主細胞が肝細胞である、請求項13に記載の遺伝子操作された宿主細 胞。 １５．単離された肝臓アクチビン蛋白質。 １６．図１または図２に示すアミノ酸配列、あるいは受託番号 を有するAT CCに寄託されたものと同じcDNAクローン に含まれるcDNAによってコードさ れるアミノ酸配列、あるいは受託番号 を有するATCCに寄託されたものと同 じcDNAクローン に含まれるcDNAによってコードされるアミノ酸配列を有す る単離された肝臓アク チビン蛋白質。 １７．肝臓アクチビン蛋白質のＮ末端シグナルペプチド、プロペプチド、成熟成 長因子ドメイン、あるいは該Ｎ末端シグナルペプチド、プロペプチドまたは成熟 成長因子ドメインが欠失された肝臓アクチビン蛋白質の欠失変異体、に対応する アミノ酸配列を有するポリペプチド。 １８．異種ポリペプチドと融合した請求項17に記載のポリペプチドを含むキメラ 蛋白質。 １９．請求項16または17に記載の肝臓アクチビン蛋白質と免疫特異的に結合する 抗体。 ２０．請求項17に記載のポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体。 ２１．患者サンプル中の肝臓アクチビン遺伝子発現を測定することを含む、脊椎 動物において細胞の成長または分化障害を診断する方法。 ２２.肝臓アクチビン遺伝子のmRNA転写産物を検出することにより発現を測定す る、請求項21に記載の方法。 ２３.肝臓アクチビン遺伝子産物を検出することにより発現を測定する、請求項2 1に記載の方法。 ２４．脊椎動物のゲノム中に含まれる肝臓アクチビン遺伝子突然変異を検出する ことを含む、該脊椎動物において細胞の成長または分化障害を診断する方法。 ２５．脊椎動物に、細胞の成長または分化を刺激する十分の量の肝臓アクチビン 化合物を投与することを含む、該脊椎動物において細胞の成長または分化を調節 する方法。 ２６．前記化合物が、肝臓アクチビンの成熟成長因子ドメインもしくは肝臓アク チビン受容体に結合する成熟成長因子ドメインの一部、エンドプロテオリティッ クモチーフ、プロペプチドもしくは成熟成長因子ドメインを欠く肝臓アクチビン 蛋白質欠失変異体に相当するポリペプチド、あるいは該肝臓アクチビンの成熟成 長因子ドメインを含むキメラ融合蛋白質、あるいは肝臓アクチビン受容体欠失変 異体と結合する、異種ポリペプチドと融合した成熟成長因子ドメインの一部であ る、請求項25に 記載の方法。 ２７．前記化合物が、肝臓アクチビン受容体に結合して該受容体の活性化を阻害 するアンタゴニストである、請求項25に記載の方法。 ２８．前記化合物が、内因性肝臓アクチビンに結合して肝臓アクチビン活性を中 和するものである、請求項25に記載の方法。 ２９．脊椎動物内で前記ポリペプチドまたは融合蛋白質を発現し分泌する遺伝子 操作された宿主細胞を投与することによって該脊椎動物に前記化合物を送達する 、請求項28に記載の方法。 ３０．前記化合物は、前記肝臓アクチビンの成熟成長因子ドメインを模倣しかつ 内因性肝臓アクチビン受容体を中和する抗イディオタイプ抗体またはそのFab部 分である、請求項28に記載の方法。 ３１.脊椎動物において細胞の成長または分化を調節する方法であって、該哺乳 動物に、in vivoで前記肝臓アクチビンの発現を阻害する十分量の化合物を投与 することを含む方法。 ３２．前記化合物が肝臓に送達される、請求項31に記載の方法。 ３３．前記化合物が、前記肝臓アクチビンをコードするmRNA転写産物の翻訳を阻 害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項31に記載の方法。 ３４．前記化合物が、前記肝臓アクチビンをコードするmRNA転写産物の翻訳を阻 害するリボザイムである、請求項31に記載の方法。 ３５．前記化合物が、前記肝臓アクチビン遺伝子の調節領域と三重らせんを形成 して転写を阻害するオリゴヌクレオチドである、請求項31に記載の方法., ３６．前記化合物が、標的相同組換えにより前記肝臓アクチビン遺伝子またはそ の調節領域を不活性化する組換えDNA構築物である、請求項31に記載の方法。 ３７.脊椎動物において細胞の成長または分化を調節する方法であって、該脊椎 動物に、肝臓アクチビンがアクチビン受容体に結合することにより誘発されるシ グナル導入を阻害する十分量の化合物を投与することを 含む方法。 ３８．肝臓障害を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、 有効量の肝臓アクチビン遺伝子産物アンタゴニストを投与することを含む方法。 ３９．細胞の成長または分化を調節する方法であって、脊椎動物に、該脊椎動物 内で肝臓アクチビンの発現をアップレギュレートする十分量の化合物を投与する ことを含む方法。 ４０．前記化合物が肝臓に送達される、請求項42に記載の方法。 ４１.前記脊椎動物が欠陥のある肝臓アクチビンを発現するものであり、また前 記化合物が、脊椎動物内の標的細胞中で機能的肝臓アクチビンの発現を指令する 調節領域によって制御される該機能的肝臓アクチビンをコードするヌクレオチド 構築物を含む、請求項42に記載の方法。 ４２．前記脊椎動物が肝臓アクチビン変異体を発現するものであり、また前記化 合物が、標的相同組換えによって内因性突然変異を補正する野生型肝臓アクチビ ンをコードするヌクレオチド構築物を含む、請求項42に記載の方法。 ４３．肝臓組織の成長または再生を向上させる方法であって、有効量の肝臓アク チビン遺伝子産物アゴニストで該肝臓組織を処理することを含む方法。 ４４．前記肝臓組織が生体外である、請求項39に記載の方法。 ４５．前記肝臓組織が生体内である、請求項39に記載の方法。 ４６．脊椎動物において骨成長を誘発する方法であって、該脊椎動物に、骨形成 有効量の肝臓アクチビン化合物を投与することを含む方法。 ４７．前記化合物は、肝臓アクチビンの成熟成長因子ドメインもしくは肝臓アク チビン受容体に結合する成熟成長因子ドメインの一部、エンドプロテオリティッ クモチーフ、プロペプチドもしくは成熟成長因子ドメインを欠く肝臓アクチビン 蛋白質欠失変異体に相当するポリペプチド、あるいは該肝臓アクチビンの成熟成 長因子ドメインを含むキメラ融合蛋白質、あるいは肝臓アクチビン受容体欠失変 異体と結合する、異種ポリ ペプチドと融合した成熟成長因子ドメインの一部である、請求項46に記載の方法 。 ４８．TGF-β、BMPおよび骨髄からなる群から選択される化合物をさらに含む、 請求項46に記載の方法。 ４９．前記骨成長が全身的である、請求項46に記載の方法。 ５０．前記骨成長が限局的である、請求項46に記載の方法。 ５１．脊椎動物において造血を刺激する方法であって、該脊椎動物に、造血有効 量の肝臓アクチビン化合物を投与することを含む方法。 ５２．前記化合物が、肝臓アクチビンの成熟成長因子ドメインもしくは肝臓アク チビン受容体に結合する成熟成長因子ドメインの一部、エンドプロテオリティッ クモチーフ、プロペプチドもしくは成熟成長因子ドメインを欠く肝臓アクチビン 蛋白質欠失変異体に相当するポリペプチド、あるいは該肝臓アクチビンの成熟成 長因子ドメインを含むキメラ融合蛋白質、あるいは肝臓アクチビン受容体欠失変 異体と結合する、異種ポリペプチドと融合した成熟成長因子ドメインの一部であ る、請求項51に記載の方法。 ５３．鉄製剤、ビタミンB12、葉酸、副腎皮質ステロイド、エリトロポエチン、 テストステロン、前駆体細胞刺激剤、インスリン様成長因子、プロスタグランジ ン、セロトニン、サイクリックAMP、プロラクチン、トリイドチゾニン、メテノ レン、スタノゾロール、ナンドロロン、アンドロゲン、およびエリトロゲニンか らなる群から選択される化合物をさらに含む、請求項51に記載の方法。 ５４．前記化合物がエリトロポエチンを含む、請求項51に記載の方法。 ５５．前記化合物が赤血球形成を刺激する、請求項51に記載の方法。[Claims] 1. An isolated nucleic acid molecule comprising the nucleotide sequence of the liver activin β _E gene. 2. An isolated nucleic acid molecule encoding liver activin β _E or a fragment thereof, comprising: (a) the amino acid sequence shown in FIG. The same cDNA clone deposited with the ATCC Or a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence encoded by the cDNA contained in, or (b) hybridizing under stringent conditions to the nucleotide sequence of (a) or its complement. 3. A liver activin polypeptide corresponding to the N-terminal signal peptide, propeptide or mature growth factor domain, or an isolated nucleotide sequence encoding a liver activin polypeptide lacking the mature growth factor domain. 4. An isolated nucleotide sequence encoding a chimeric protein comprising the polypeptide of claim 3 fused to a heterologous polypeptide. 5. A nucleotide vector comprising the nucleotide sequence according to claim 1, 2, 3, or 4. 6. An expression vector comprising a nucleotide sequence operably linked to a nucleotide regulatory sequence that controls expression of the nucleotide sequence of claim 1, 2, 3 or 4 in a host cell. 7. The nucleotide sequence shown in FIG. 1, or the amino acid sequence or accession number shown in FIG. The same cDNA clone deposited with the ATCC An expression vector comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence encoded by the cDNA contained in the above in operably linked to a nucleotide regulatory sequence controlling the expression of the nucleotide sequence in a host cell. 8. The regulatory sequences include the cytomegalovirus hCMV immediate-early gene, the SV40 adenovirus early or late promoter, the lac , trp , TAC , and TRC systems, the major operator and promoter region of phage λ, and the control region of the fd coat protein. The expression vector according to claim 6, which is selected from the group consisting of a promoter of 3-phosphoglycerate kinase, a promoter of acid phosphatase, and a promoter of yeast α-mating factor. 9. The regulatory sequence is a cytomegalovirus hCMV immediate-early gene, an early or late promoter of SV40 adenovirus, a lac system, a trp system, a TAC system, a TRC system, a major operator and promoter region of phage λ, a control region of fd coat protein, 10. The expression vector according to claim 7, wherein the expression vector is selected from the group consisting of a 3-phosphoglycerate kinase promoter, an acid phosphatase promoter, and a yeast α-mating factor promoter. A genetically engineered host cell comprising the nucleotide sequence of claim 1, 2, 3 or 4. 11. A genetically engineered host cell comprising a nucleotide sequence operably linked to a nucleotide regulatory sequence controlling expression of the nucleotide sequence of claim 1, 2, 3 or 4 in the host cell. 12. 12. The genetically modified host cell of claim 11, wherein said host cell is a hepatocyte. 13. A genetically engineered host cell comprising the expression vector of claim 7. 14． 14. The genetically engineered host cell of claim 13, wherein said host cell is a hepatocyte. 15. Isolated liver activin protein. 16. The amino acid sequence shown in FIG. 1 or FIG. 2, or the accession number Same cDNA clone deposited with ATCC with Amino acid sequence or accession number encoded by cDNA contained in The same cDNA clone deposited with the ATCC An isolated liver activin protein having an amino acid sequence encoded by a cDNA contained in E. coli. 17． Amino acid sequence corresponding to the N-terminal signal peptide, propeptide or mature growth factor domain of liver activin protein, or a deletion mutant of liver activin protein lacking the N-terminal signal peptide, propeptide or mature growth factor domain A polypeptide having the formula: 18. 18. A chimeric protein comprising the polypeptide of claim 17 fused to a heterologous polypeptide. 19. An antibody that immunospecifically binds to the liver activin protein according to claim 16 or 17. 20. An antibody that immunospecifically binds to the polypeptide of claim 17. 21. A method of diagnosing a cell growth or differentiation disorder in a vertebrate, comprising measuring hepatic activin gene expression in a patient sample. 22. The method according to claim 21, wherein the expression is measured by detecting an mRNA transcript of the liver activin gene. 23. The method of claim 21, wherein expression is measured by detecting a liver activin gene product. 24. A method for diagnosing a cell growth or differentiation disorder in a vertebrate, comprising detecting a liver activin gene mutation contained in the vertebrate genome. 25. A method of regulating cell growth or differentiation in a vertebrate, comprising administering to the vertebrate a sufficient amount of a liver activin compound to stimulate cell growth or differentiation. 26. The compound corresponds to a liver activin protein deletion mutant lacking a mature growth factor domain of liver activin or a part of a mature growth factor domain that binds to a liver activin receptor, an endoproteolytic motif, a propeptide or a mature growth factor domain; Or a chimeric fusion protein comprising the liver activin mature growth factor domain, or a part of the mature growth factor domain fused to a heterologous polypeptide, which binds to a liver activin receptor deletion mutant. The method according to 25. 27. 26. The method of claim 25, wherein said compound is an antagonist that binds to a liver activin receptor and inhibits activation of said receptor. 28. 26. The method of claim 25, wherein the compound binds to endogenous liver activin and neutralizes liver activin activity. 29. 29. The method of claim 28, wherein the compound is delivered to the vertebrate by administering a genetically engineered host cell that expresses and secretes the polypeptide or fusion protein in the vertebrate. 30. 29. The method of claim 28, wherein the compound is an anti-idiotype antibody or a Fab portion thereof that mimics the mature growth factor domain of the liver activin and neutralizes an endogenous liver activin receptor. 31. A method of regulating cell growth or differentiation in a vertebrate, comprising administering to the mammal a sufficient amount of a compound that inhibits expression of the liver activin in vivo. 32. 32. The method of claim 31, wherein the compound is delivered to the liver. 33. 32. The method of claim 31, wherein said compound is an antisense oligonucleotide that inhibits translation of an mRNA transcript encoding said liver activin. 34. 32. The method of claim 31, wherein said compound is a ribozyme that inhibits translation of an mRNA transcript encoding said liver activin. 35. 32. The method of claim 31, wherein the compound is an oligonucleotide that forms a triple helix with the regulatory region of the liver activin gene to inhibit transcription. 32. The method of claim 31, wherein said compound is a recombinant DNA construct that inactivates said liver activin gene or its regulatory region by targeted homologous recombination. 37. A method of regulating cell growth or differentiation in a vertebrate, which comprises administering to the vertebrate a sufficient amount of a compound that inhibits signal transduction triggered by binding of liver activin to an activin receptor. A method that includes 38. A method of treating a liver disorder, comprising administering to a patient in need of such treatment an effective amount of a liver activin gene product antagonist. 39. A method of regulating cell growth or differentiation, comprising administering to a vertebrate a sufficient amount of a compound that upregulates expression of hepatic activin in the vertebrate. 40. 43. The method of claim 42, wherein said compound is delivered to the liver. 41. The vertebrate that expresses defective liver activin, and wherein the compound is controlled by a regulatory region that directs the expression of functional liver activin in target cells within the vertebrate 43. The method of claim 42, comprising a nucleotide construct encoding activin. 42. 43.The method of claim 42, wherein said vertebrate expresses a liver activin variant, and wherein said compound comprises a nucleotide construct encoding a wild-type liver activin that corrects for an endogenous mutation by targeted homologous recombination. Method. 43. A method of improving the growth or regeneration of liver tissue, comprising treating the liver tissue with an effective amount of a liver activin gene product agonist. 44. 40. The method of claim 39, wherein said liver tissue is ex vivo. 45. 40. The method of claim 39, wherein said liver tissue is in vivo. 46. A method of inducing bone growth in a vertebrate, comprising administering to the vertebrate an osteogenically effective amount of a liver activin compound. 47. The compound is equivalent to a liver activin protein deletion mutant lacking a mature growth factor domain of liver activin or a part of a mature growth factor domain that binds to a liver activin receptor, an endoproteolytic motif, a propeptide or a mature growth factor domain. Or a chimeric fusion protein comprising the liver activin mature growth factor domain, or a part of the mature growth factor domain fused to a heterologous polypeptide, which binds to a liver activin receptor deletion mutant. 46. The method of claim 46. 48. 47. The method of claim 46, further comprising a compound selected from the group consisting of TGF- [beta], BMP and bone marrow. 49. 47. The method of claim 46, wherein said bone growth is systemic. 50. 47. The method of claim 46, wherein said bone growth is localized. 51. A method of stimulating hematopoiesis in a vertebrate, comprising administering to the vertebrate a hematopoietic effective amount of a liver activin compound. 52. The compound corresponds to a liver activin protein deletion mutant lacking a mature growth factor domain of liver activin or a part of a mature growth factor domain that binds to a liver activin receptor, an endoproteolytic motif, a propeptide or a mature growth factor domain; Or a chimeric fusion protein comprising the liver activin mature growth factor domain, or a part of the mature growth factor domain fused to a heterologous polypeptide, which binds to a liver activin receptor deletion mutant. 51. The method according to 51. 53. Iron preparations, vitamin B12, folate, corticosteroids, erythropoietin, testosterone, progenitor cell stimulants, insulin-like growth factor, prostaglandin, serotonin, cyclic AMP, prolactin, triidthizonin, methenolene, stanozolol, nandrolone, androgen, and 52. The method of claim 51, further comprising a compound selected from the group consisting of erythrogens. 54. 52. The method of claim 51, wherein said compound comprises erythropoietin. 55. 52. The method of claim 51, wherein said compound stimulates erythropoiesis.